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特表2023-508223マグノロールとスルフォラファン接合物及びその製造方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-01

(54)【発明の名称】マグノロールとスルフォラファン接合物及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

C07C 331/20 20060101AFI20230221BHJP

A61K 31/26 20060101ALI20230221BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20230221BHJP

【ＦＩ】

C07C331/20 CSP

A61K31/26

A61P35/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022539765

(86)(22)【出願日】2020-12-24

(85)【翻訳文提出日】2022-06-27

(86)【国際出願番号】 CN2020139058

(87)【国際公開番号】W WO2021129747

(87)【国際公開日】2021-07-01

(31)【優先権主張番号】201911370139.4

(32)【優先日】2019-12-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522257643

【氏名又は名称】シェンチェンチェンシンバイオメディシンリサーチセンターカンパニーリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000604

【氏名又は名称】弁理士法人共立特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チョンチーウー

(72)【発明者】

【氏名】チョンタオ

(72)【発明者】

【氏名】チエンチェン

(72)【発明者】

【氏名】ヨンチャンツォン

(72)【発明者】

【氏名】チエレンリィウ

(72)【発明者】

【氏名】リーミンリー

【テーマコード（参考）】

4C206

4H006

【Ｆターム（参考）】

4C206AA01

4C206AA02

4C206AA03

4C206AA04

4C206JA70

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA05

4C206NA14

4C206ZB26

4H006AA01

4H006AA02

4H006AA03

4H006AB28

4H006AC60

4H006TN90

(57)【要約】

本発明はマグノロールとスルフォラファン接合物、その製造方法及び使用を開示し、前記マグノロールとスルフォラファン接合物は、Ｃ_２５Ｈ_２９ＮＯ_２Ｓ_２（ＣＴ－１）、Ｃ_２５Ｈ_２９ＮＯ_４Ｓ_２（ＣＴ－２）、Ｃ_２５Ｈ_２９ＮＯ_３Ｓ_２（ＣＴ－３）を含む。本発明は、薬物の組み合わせの原理を利用して、始めてマグノロールとスルフォラファン接合物（ＣＴ－１、ＣＴ－２、ＣＴ－３）を合成している。生物学的評価の結果、前記接合物は、抗腫瘍効果がマグノロール及びスルフォラファンよりも明らかに優れ、広域スペクトルの抗腫瘍活性及び高い創薬性を有し、開発が期待できる抗腫瘍化合物であり、新型抗腫瘍薬を開発するために新しいアイデアや手段を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の構造を有する、ことを特徴とするマグノロールとスルフォラファン接合物。

【化1】

、

【化2】

又は、

【化3】

【請求項2】

マグノロールをテトラヒドロフランに溶解し、水素化ナトリウム及び１,２－ジブロモエタンを加えて、６０℃で３時間反応させ、水を加えて抽出し、有機相を乾燥させた後濃縮させ、分離して化合物２を得るステップと、
化合物２をＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、硫化ナトリウムを加えて、２５℃で２時間反応させ、ＰＨを１に調整し、静置した後、ろ過し、沈殿を収集して、沈殿をＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、炭酸カリウム及び４－ブロモ－１－ブチルアミンを加えて、２５℃で１２時間反応させ、反応液を濃縮させたものを、テトラヒドロフランに溶解し、０℃でトリエチルアミン及び二硫化炭素を加えて、次に、２５℃で２時間反応させ、水を加えて抽出し、有機相を乾燥させた後濃縮させ、分離して化合物ＣＴ－１を得るステップとを含む、ことを特徴とするマグノロールとスルフォラファン接合物の製造方法。

【請求項3】

化合物ＣＴ－１をジクロロメタンに溶解し、ｍ－クロロペルオキシ安息香酸を加えて、２５℃で１時間反応させ、重炭酸ナトリウム飽和水溶液を加えて抽出し、有機相を乾燥させた後濃縮させ、分離して化合物ＣＴ－２及び化合物ＣＴ－３を得るステップをさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。

【請求項4】

請求項１に記載のマグノロールとスルフォラファン接合物の抗癌薬の製造における使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は薬物の技術分野に関し、特にマグノロールとスルフォラファン接合物、その製造方法及び使用に関する。

【背景技術】

【0002】

悪性腫瘍はすでに人間の第２位の死因となっており、現在人間の健康を脅かす重大な疾患の一つである。中国では、天然薬用資源は豊富で、伝統的な漢方薬から活性モノマーをスクリーニングし、そして薬物化学手段を利用して構造修飾と改造を行うことは、新型抗腫瘍薬の発見に対して重大な意義を持つ。

【0003】

マグノール（Ｍａｇｎｏｌｏｌ）は、漢方薬である厚朴の主要な成分の一つであり、中度の抗腫瘍活性を有する（非特許文献１）。近年、マグノコールの抗腫瘍機序の研究はこの方面の研究の焦点になり、薬物化学者もマグノコールの構造修飾を行うことによって更にその抗腫瘍活性を増強した（非特許文献２）。

【0004】

スルフォラファン（Ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ）は主にアブラナ科植物に存在し、これまでに発見された自然界で最も高い抗がん・抗がん能を有するイソチオシアネート化合物である（非特許文献３）。両者とも優れた薬用価値を有する。そのため、この２種類の化合物をリード化合物として構造修飾と改造を行い、新型抗腫瘍薬を開発することは、重要な理論的意義と現実的価値がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Lin, S.Y.; Liu, J.D.; Chang, H.C. Magnolol Suppresses Proliferation of Cultured Human Colon and Liver Cancer Cells by Inhibiting DNA Synthesis and Activating Apotosis [J]. J. Cell Biochem., 2002, 84, 532-544

【非特許文献2】Tang, H.; Zhang, Y.; Li, D. Discovery and Synthesis of Novel Magnolol Derivatives with Potent Anticancer Activity in Non-Small Cell Lung Cancer [J]. Eur. J. Med. Chem., 2018, 156, 190-20

【非特許文献3】Springer T.A. Traffic Signals for Lymphocyte Recirculation and Leukocyte Emigration: the Multistep Paradigm [J]. Cell, 1994, 76, 301-314

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従来技術の問題を解決するために、本発明の実施例はマグノロールとスルフォラファン接合物、その製造方法及び使用を提供する。前記技術的解決手段は以下のとおりである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

第１態様では、マグノロールとスルフォラファン接合物であって、以下のいずれかの構造を有する。

【化1】

【化2】

【化3】

【0008】

第２態様では、マグノロールとスルフォラファン接合物の製造方法であって、
マグノロールをテトラヒドロフランに溶解し、水素化ナトリウム及び１,２－ジブロモエタンを加えて、６０℃で３時間反応させ、水を加えて抽出し、有機相を乾燥させた後濃縮させ、分離して化合物２を得るステップと、
化合物２をＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、硫化ナトリウムを加えて、２５℃で２時間反応させ、ＰＨを１に調整し、静置した後、ろ過し、沈殿を収集して、沈殿をＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解し、炭酸カリウム及び４－ブロモ－１－ブチルアミンを加えて、２５℃で１２時間反応させ、反応液を濃縮させたものを、テトラヒドロフランに溶解し、０℃でトリエチルアミン及び二硫化炭素を加えて、次に、２５℃で２時間反応させ、水を加えて抽出し、有機相を乾燥させた後濃縮させ、分離して化合物ＣＴ－１を得るステップとを含む。

【0009】

さらに、前記方法は、
化合物ＣＴ－１をジクロロメタンに溶解し、ｍ－クロロペルオキシ安息香酸を加えて、２５℃で１時間反応させ、重炭酸ナトリウム飽和水溶液を加えて抽出し、有機相を乾燥させた後濃縮させ、分離して化合物ＣＴ－２及び化合物ＣＴ－３を得るステップをさらに含む。

【0010】

第３態様では、上記の第１態様に記載のマグノロールとスルフォラファン接合物の抗癌薬の製造における使用である。

【発明の効果】

【0011】

本発明の実施例で提供される技術的解決手段の有益な効果は以下のとおりである。本発明は、薬物の組み合わせの原理を利用して、始めてマグノロールとスルフォラファン接合物（ＣＴ－１、ＣＴ－２、ＣＴ－３）を合成する。生物学的評価の結果、前記接合物は、抗腫瘍効果がマグノロール及びスルフォラファンよりも明らかに優れ、広域スペクトルの抗腫瘍活性及び高い創薬性を有し、開発が期待できる抗腫瘍化合物であり、新型抗腫瘍薬を開発するために新しいアイデアや手段を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の目的、技術的解決手段及び利点をより明確にするために、以下、実施例を利用して本発明の実施形態についてさらに詳細に説明する。

【実施例】

【0013】

実施例１．マグノロールとスルフォラファン接合物の製造

【化4】

【化5】

【化6】

【0014】

（１）マグノロール（２．６６ｇ）１０ｍｍｏｌをテトラヒドロフラン１００ｍＬに溶解し、系に６０％水素化ナトリウム４０ｍｍｏｌ及び１,２－ジブロモエタン４０ｍｍｏｌを加えて、６０℃で３時間反応させ、次に、系に水３０ｍＬを加えて、酢酸エチル１００ｍＬで抽出し、抽出した有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた後濃縮させ、最後に、濃縮させた有機相をシリカゲルカラムにより分離し、淡黄色液体として化合物２（２．４ｇ）６．５ｍｍｏｌを得て、収率は６５％であった。

【0015】

化合物２：R_f = 0.8 (石油エーテル/EtOAc, 10:1); ¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.14 (dd, J = 6.5, 2.2 Hz, 2H), 7.11-7.02 (m, 2H), 6.94 (dd, J = 8.6, 4.3 Hz, 2H), 6.07 (s, 1H), 6.04-5.87 (m, 2H), 5.12-5.02 (m, 4H), 4.22 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.45 (t, J= 6.2 Hz, 2H), 3.39-3.30 (m,4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 152.6, 151.6, 137.7, 137.1, 134.7, 132.5, 132.2, 131.1, 129.3, 129.1, 127.9, 125.8, 117.4, 115.9, 115.4, 114.2, 114.2, 69.6, 39.3, 39.2, 28.6; HRMS (ESI): m/z calcd for C₂₀H_2IBrNaO₂[M+Na]⁺: 395.0623, found: 395.0706。

【0016】

（２）化合物２（３．７２ｇ）１０ｍｍｏｌをＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミド１００ｍＬに溶解し、硫化ナトリウム２５ｍｏｌを加えて、２５℃で２時間反応させ、次に、塩酸２ｍｏｌ／Ｌを加えてＰＨを１に調整し、静置してろ過し、沈殿を収集して、沈殿をＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミド５０ｍＬに溶解し、炭酸カリウム２５ｍｏｌ及び４－ブロモ－１－ブチルアミン２５ｍｍｏｌを加えて、２５℃で１２時間反応させ、反応液を濃縮させ、反応液をテトラヒドロフラン３０ｍＬに溶解し、０℃でトリエチルアミン１５ｍｏｌ及び二硫化炭素５ｍｏｌを加えて、２５℃で２時間反応させ、水３０ｍＬを加えて、次に、酢酸エチル５０ｍＬで抽出し、抽出した有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた後濃縮させ、最後に、濃縮させた有機相をシリカゲルカラムにより分離し、淡黄色液体として化合物ＣＴ－１（２．６ｇ）６ｍｍｏｌを得て、収率は６０％であった。

【0017】

化合物CT-１: R_f= 0.2 (石油エーテル/EtOAc, 5:1); ¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.24-7.03 (m, 4H), 6.98 (dd, J = 8.2, 4.7 Hz, 2H), 6.01 (dddd, J = 14.6, 10.2, 7.0, 3.3 Hz, 2H), 5.21-4.99 (m, 4H), 4.20 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.49 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.83 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.48 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.75-1.66 (m, 2H), 1.66-1.56 (m, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 153.0, 151.9, 137.8, 137.3, 134.3, 132.6, 132.4, 131.2, 129.3, 129.2, 127.6, 126.2, 117.4, 115.9, 115.5, 113.4, 69.7, 44.6, 39.4, 39.3, 31.7, 30.9, 29.6, 28.7, 26.3; HRMS(ES1): m/z calcd for C₂₅H₂₉NNaO₂S₂[M+Na]⁺: 462.1537, found:462.1770。

【0018】

（３）化合物ＣＴ－１（４．３９ｇ）１０ｍｍｏｌを２５℃（室温）でジクロロメタン１００ｍＬに溶解し、ｍ－クロロペルオキシ安息香酸１１ｍｏｌを加えて、２５℃で１時間反応させ、次に、反応液に重炭酸ナトリウム飽和水溶液３０ｍＬを加えて、ジクロロメタン５０ｍＬで抽出し、抽出した有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた後濃縮させ、最後に、濃縮させた有機相をシリカゲルカラムにより分離し、淡黄色液体として化合物ＣＴ－２（１．８ｇ）３．９ｍｍｏｌを得て、収率は３９％であり、淡黄色液体として化合物ＣＴ－３（２．７ｇ）６ｍｏｌを得て、収率は６０％であった。

【0019】

化合物 CT-2: R_f = 0.6 (石油エーテル/EtOAc, 1:1): ¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.22 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H), 7.13 (dd, J= 8.0, 2.2 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.93 (dd, J = 16.4, 8.3 Hz, 2H), 6.02-5.88 (m, 2H), 5.16-5.01 (m, 4H), 4.42 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.45-3.34 (m, 6H), 3.30 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.66 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 1.72-1.65 (m, 2H), 1.60-1.52 (m, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCI₃) δ 152.9, 151.5, 137.5, 137.1, 134.6, 132.5, 132.4, 131.1, 129.7, 129.2, 126.1, 125.2, 116.1, 115.8, 112.5, 63.0, 53.5, 53.3, 44.5, 39.3, 39.2, 29.7, 28.4, 18.7; HRMS (ESI): m/z calcd for C₂₅H₂₉NNaO₄S₂ [M+Na]⁺: 494.1436, found : 494.1854。

【0020】

化合物 CT-3: R_f = 0.2 (石油エーテル/EtOAc, 1:1); ¹H NMR (400 MHz) クロロホルム-d) δ 7.20 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H), 7.16-7.07 (m, 2H), 7.06-6.96 (m, 2H), 6.91 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.04-5.92 (m, 2H), 5.17-5.04 (m, 4H), 4.55-4.32 (m, 2H), 3.49 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.44-3.31 (m, 4H), 3.13 (ddd, J = 13.0, 8.5, 4.2 Hz, 1H), 2.95 (ddd, J = 13.9, 5.5, 3.4 Hz, 1H), 2.71-2.57 (m, 1H), 2.49 (dt, J = 13.3, 7.5 Hz, 1H), 1.81-1.62 (m, 4H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 153.1, 151.8, 137.7, 137.2, 134.5, 132.3, 132.1, 131.1, 129.3, 129.2, 127.4, 125.8, 116.7, 116.0, 115.6, 113.4, 61.7, 51.6, 51.4, 44.5, 39.4, 39.3, 28.8, 20.2; HRMS (ESI): m/z calcd for C₂₅H₂₉NNaO₃S₂[M+Na]⁺: 478.1487, found: 478.2287。

【0021】

実施例２．マグノロールとスルフォラファン接合物によるヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０の増殖への影響
１．実験材料
１．１細胞株
ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０
１．２生薬、試薬及び器具
ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＳＯ（Sｉｇｍａ）、ＣＣＫ８キット（大連美崙生物技術有限公司）、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）、低速遠心分離機（安徽中科中佳科学儀器有限公司）、クリーンベンチ（上海博迅実業責任有限公司医療設備場）、倒立顕微鏡（Mike Audi）。

【0022】

２．実験方法
２．１ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を培養し、対数成長期まで成長させると、０．２５％トリプシンで消化し、１０００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞沈殿を１０％ＦＢＳ含有１６４０培地で再懸濁させ、５０００個／ウェルの密度で９６ウェル培養板に接種し、次に、３７℃、５％ＣＯ_２及び飽和湿度の条件下で一晩培養した。

【0023】

２．２群ごとに６個のマルチウェルを設置し、ウェルごとに以下の条件で薬剤を加えて、次に、２４ｈ培養した。
対照群：薬剤無添加群
マグノロール群：マグノロール添加、最終濃度２０μＭ。
ＣＴ－１群：ＣＴ－１添加、最終濃度２０μＭ。
ＣＴ－２群：ＣＴ－２添加、最終濃度２０μＭ。
ＣＴ－３群：ＣＴ－３添加、最終濃度２０μＭ。

【0024】

以上の細胞を２４ｈ処置した後、ＣＣＫ８キットを用いて薬物の腫瘍細胞増殖への影響を検出した。具体的な操作は以下のとおりである。ウェルごとにＣＣＫ８溶液１０μＬを加えて、２ｈ培養し続け、マイクロプレートリーダ４５０ｎｍ波長で吸光度（ＯＤ）の値を測定し、対照群細胞の生存率を１００％として、他の群の細胞生存率を算出した。

【0025】

３．実験結果
表１．マグノロールとスルフォラファン接合物のヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０の増殖への影響

【表1】

【0026】

表１に示す結果から明らかなように、マグノロールとスルフォラファン接合物ＣＴ－１、ＣＴ－２及びＣＴ－３は全てヒト肺癌細胞ＮＣＩ－Ｈ４６０の増殖を顕著に阻害し、かつ、阻害効果が陽性対照薬物であるマグノロールよりも明らかに優れており、その中でも、ＣＴ－３は抗腫瘍活性が最も高い。

【0027】

実施例３．ＣＴ－３の７種類のヒト癌細胞株の増殖への影響
１．実験材料
１．１細胞株
ヒト神経膠腫細胞株Ｕ２５１、ヒト肺癌細胞株Ｈ１６５０、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ヒト胃癌細胞株ＡＧＳ、ヒト結腸癌細胞株ＬＯＶＯ、ヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ３。
１．２生薬、試薬及び器具
ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＳＯ（Sｉｇｍａ）、ＣＣＫ８キット（大連美崙生物技術有限公司）、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）、低速遠心分離機（安徽中科中佳科学儀器有限公司）、クリーンベンチ（上海博迅実業責任有限公司医療設備場）、倒立顕微鏡（Mike Audi）。

【0028】

２．実験方法
２．１上記の７種類の癌細胞を培養し、対数成長期まで成長させると、０．２５％トリプシンで消化し、１０００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞沈殿を１０％ＦＢＳ含有１６４０培地で再懸濁させ、５０００個／ウェルの密度で９６ウェル培養板に接種し、次に、３７℃、５％ＣＯ_２及び飽和湿度の条件下で一晩培養した。

【0029】

２．２群ごとに６個のマルチウェルを設置し、ウェルごとに以下の条件で薬剤を加えて、次に、２４ｈ培養し続けた。
対照群：薬剤無添加群。
陽性対照群：マグノロール群及びスルフォラファンごとに３群。
陽性対照群１：マグノロール添加、最終濃度５．０μＭ。
陽性対照群２：マグノロール添加、最終濃度１０．０μＭ。
陽性対照群３：マグノロール添加、最終濃度２０．０μＭ。
陽性対照群４：スルフォラファン添加、最終濃度５．０μＭ。
陽性対照群５：スルフォラファン添加、最終濃度１０．０μＭ。
陽性対照群６：スルフォラファン添加、最終濃度２０．０μＭ。
ＣＴ－３群：ＣＴ－３群は３群に分けられる。
ＣＴ－３群１：ＣＴ－３添加、最終濃度５．０μＭ。
ＣＴ－３群２：ＣＴ－３添加、最終濃度１０．０μＭ。
ＣＴ－３群３：ＣＴ－３添加、最終濃度２０．０μＭ。

【0030】

以上の細胞を２４ｈ処置した後、ＣＣＫ８キットを用いて薬物の腫瘍細胞の増殖への影響を検出した。具体的な操作は以下のとおりである。ウェルごとにＣＣＫ８溶液１０μＬを加えて、２ｈ培養し続け、マイクロプレートリーダ４５０ｎｍ波長で吸光度（ＯＤ）の値を測定し、対照群細胞の生存率を１００％として、他の群の細胞生存率を算出した。

【0031】

３．実験結果
表２．ＣＴ－３による７種類のヒト癌細胞株の半分の阻害濃度（ＩＣ５０）（μＭ）

【表2】

【0032】

表２に示す結果から明らかなように、ＣＴ－３は７種類のヒト癌細胞の増殖を顕著に阻害し、そのＩＣ_５０は５．１０～８．０２μＭの間であり、陽性対照薬物であるマグノロール＞４５μＭ及びスルフォラファンの１８．４１～２２．４７μＭよりも明らかに低い。ＣＴ－３の抗腫瘍活性は陽性対照薬物であるマグノロール及びスルフォラファンよりも明らかに優れたことを示す。

【0033】

実施例４．ＣＴ－３によるヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０アポトーシスへの影響
１．実験材料
１．１細胞株
ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０
１．２生薬、試薬及び器具
ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＳＯ（Sｉｇｍａ）、ＣＣＫ８キット（大連美崙生物技術有限公司）、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）、低速遠心分離機（安徽中科中佳科学儀器有限公司）、クリーンベンチ（上海博迅実業責任有限公司医療設備場）、倒立顕微鏡（Mike Audi）、細胞アポトーシス検出キット及びフローサイトメータ（ＢＤ）。

【0034】

２．実験方法
２．１ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を培養し、対数成長期まで成長させると、０．２５％トリプシンで消化し、１０００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞沈殿を１０％ＦＢＳ含有の１６４０培地で再懸濁させ、３．０×１０５個／ウェルの密度で９６ウェル培養板に接種し、次に、３７℃、５％ＣＯ_２及び飽和湿度の条件下で一晩培養した。

【0035】

２．２群ごとに３個のマルチウェルを設置し、ウェルごとに以下の条件で薬剤を加えて、次に、２４ｈ培養し続けた。
対照群：薬剤無添加群。
マグノロール群：マグノロール添加、最終濃度１０．０μＭ。
スルフォラファン群：スルフォラファン添加、最終濃度１０．０μＭ。
ＣＴ－３群：ＣＴ－３添加、最終濃度１０．０μＭ。

【0036】

以上の細胞を２４ｈ処置した後、細胞アポトーシス検出キット及びフローサイトメトリーを用いて、ＣＴ－３による腫瘍細胞アポトーシスへの影響を検出した。

【0037】

３．実験結果
表３．ＣＴ－３によるヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ４６０アポトーシスへの影響

【表3】

【0038】

表３に示す結果から明らかなように、ＣＴ－３はヒト肺癌細胞ＮＣＩ－Ｈ４６０のアポトーシスを顕著に誘導し、かつ効果が陽性対照薬物であるマグノロール及びスルフォラファンよりも明らかに優れている。

【0039】

実施例５．ＣＴ－３によるヒト結腸癌細胞株ＳＷ４８０の増殖への影響
１．実験材料
１．１細胞株
ヒト結腸癌細胞株ＳＷ４８０
１．２生薬、試薬及び器具
ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＳＯ（Sｉｇｍａ）、ＣＣＫ８キット（大連美崙生物技術有限公司）、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ社）、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）、低速遠心分離機（安徽中科中佳科学儀器有限公司）、クリーンベンチ（上海博迅実業責任有限公司医療設備場）、倒立顕微鏡（Mike Audi）、細胞アポトーシス検出キット及びフローサイトメータ（ＢＤ）。

【0040】

２．実験方法
２．１ＳＷ４８０細胞を培養し、対数成長期まで成長させると、０．２５％トリプシンで消化し、１０００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞沈殿を１０％ＦＢＳ含有１６４０培地で再懸濁させ、３．０×１０５個／ウェルの密度で６ウェル培養板に接種し、次に、３７℃、５％ＣＯ_２及び飽和湿度の条件下で一晩培養した。

【0041】

【0042】

以上の細胞を２４ｈ処置した後、細胞アポトーシス検出キット及びフローサイトメトリーを用いてＣＴ－３による腫瘍細胞アポトーシスへの影響を検出した。

【0043】

３．実験結果
表４．ＣＴ－３によるヒト結腸癌細胞株ＳＷ４８０アポトーシスへの影響

【表4】

【0044】

表４に示す結果から明らかなように、ＣＴ－３は、ヒト結腸癌細胞株ＳＷ４８０のアポトーシスを顕著に誘導し、かつ、効果が陽性対照薬物であるマグノロール及びスルフォラファンよりも明らかに優れている。

【0045】

実施例６．ＣＴ－３による正常なヒト肝細胞の細胞株ＬＯ２アポトーシスへの影響
１．実験材料
１．１細胞株
正常なヒト肝細胞の細胞株ＬＯ２
１．２生薬、試薬及び器具
ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＳＯ（Sｉｇｍａ）、ＣＣＫ８キット（大連美崙生物技術有限公司）、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）、低速遠心分離機（安徽中科中佳科学儀器有限公司）、クリーンベンチ（上海博迅実業責任有限公司医療設備場）、倒立顕微鏡（Mike Audi）、細胞アポトーシス検出キット、及びフローサイトメータ（ＢＤ）。

【0046】

２．実験方法
２．１上記の癌細胞を培養し、対数成長期まで成長させると、０．２５％トリプシンで消化し、１０００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞沈殿を１０％ＦＢＳ含有１６４０培地で再懸濁させ、３．０×１０５個／ウェルの密度で６ウェル細胞培養板に接種し、次に、３７℃、５％ＣＯ_２及び飽和湿度の条件下で一晩培養した。

【0047】

【0048】

【0049】

３．実験結果
表５．ＣＴ－３による正常なヒト肝細胞の細胞株ＬＯ２アポトーシスへの影響

【表5】