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特表2023-508401ジスルフィド結合の再配列を有するヒトＶＥＧＦ－Ａの変異型を含むポリペプチド及びそれを含む組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-02

(54)【発明の名称】ジスルフィド結合の再配列を有するヒトＶＥＧＦ－Ａの変異型を含むポリペプチド及びそれを含む組成物

(51)【国際特許分類】

C07K 14/475 20060101AFI20230222BHJP

A61K 39/00 20060101ALI20230222BHJP

A61K 39/39 20060101ALI20230222BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20230222BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20230222BHJP

A61P 37/06 20060101ALI20230222BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20230222BHJP

A61P 27/02 20060101ALI20230222BHJP

A61P 3/10 20060101ALI20230222BHJP

A61P 19/02 20060101ALI20230222BHJP

A61P 7/10 20060101ALI20230222BHJP

A61P 37/02 20060101ALI20230222BHJP

C12N 15/12 20060101ALN20230222BHJP

【ＦＩ】

C07K14/475

A61K39/00 H

A61K39/39

A61P29/00

A61P9/00

A61P37/06

A61P35/00

A61P27/02

A61P3/10

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P7/10

A61P37/02

C12N15/12 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022538974

(86)(22)【出願日】2020-12-21

(85)【翻訳文提出日】2022-08-22

(86)【国際出願番号】 CU2020050011

(87)【国際公開番号】W WO2021129898

(87)【国際公開日】2021-07-01

(31)【優先権主張番号】CU-2019-0111

(32)【優先日】2019-12-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】304012895

【氏名又は名称】セントロデインジエニエリアジエネテイカイバイオテクノロジア

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ベケットロメロ、モニカ

(72)【発明者】

【氏名】モレーラディアス、ヤネリス

(72)【発明者】

【氏名】アヤラアヴィラ、マルタ

(72)【発明者】

【氏名】ガヴィロンドコウリー、ホルヘヴィクトール

(72)【発明者】

【氏名】サンチェスラミレス、ハヴィエル

(72)【発明者】

【氏名】ヘルナンデスベルナール、フランシスコ

(72)【発明者】

【氏名】ゴンザレスブランコ、ソニア

(72)【発明者】

【氏名】エスピノーサロドリゲス、ルイスアリエル

(72)【発明者】

【氏名】ベサダぺレス、ウラジミールアルマンド

(72)【発明者】

【氏名】ペレスデライグレシア、マリエラ

(72)【発明者】

【氏名】トリミーニョロレンゾ、リアン

(72)【発明者】

【氏名】リモンタフェルナンデス、ミラディス

(72)【発明者】

【氏名】ウビエタゴメス、ライムンド

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA03

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF01

4C085FF14

4C085FF21

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA45

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

非天然再配列で折り畳まれたヒト血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）のアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドであって、変異体のポリペプチド鎖の第２及び第４のシステインは分子内架橋のみを形成しており、第７及び第８のシステインは分子間結合の一部のみであるポリペプチド。本発明は、これらのポリペプチドの少なくとも１つを含有する抗原調製物、並びにそのような抗原調製物及びワクチンアジュバントを含む医薬組成物を更に含む。本発明による抗原調製物は、血管新生、炎症及び免疫抑制の増加に関連する疾患の治療、並びに免疫系の回復のために、薬物の製造において使用される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）のアイソフォームの機能的変異型を含むことを特徴とするポリペプチドであって、変異体のポリペプチド鎖の第２及び第４のシステインが分子内架橋の一部としてのみ見出され、変異体の第７及び第８のシステインが分子間結合を形成していることのみが見出されるジスルフィド架橋の非天然配置で折り畳まれる、ポリペプチド。

【請求項2】

機能的変異体が、２型受容体（ＶＥＧＦＲ２）への結合に関与するＶＥＧＦ－Ａのアミノ酸の変異から得られることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記ヒトＶＥＧＦ－Ａアイソフォームが、ＶＥＧＦ－Ａ^１２１、ＶＥＧＦ－Ａ^１４５、ＶＥＧＦ－Ａ^１６５、ＶＥＧＦ－Ａ^１８９及びＶＥＧＦ－Ａ^２０６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

第１のシステインが第２のシステインに連結され、第３のシステインが第４のシステインに連結され、第５のシステインが第６のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の再配列、並びに２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン、２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステインが連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項5】

第１のシステインが第２のシステインに連結され、第３のシステインが第４のシステインに連結され、第５のシステインが第６のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の分子内ジスルフィド架橋再配列、及びポリペプチド鎖の第７のシステインが別のポリペプチド鎖の第８のシステインと連結され、２つのポリペプチド鎖の最後のシステインが連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項6】

第１のシステインが第２のシステインに連結され、第３のシステインが第５のシステインに連結され、第４のシステインが第６のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の分子内ジスルフィド架橋再配列、並びに２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン、２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステインが連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項7】

第１のシステインが第２のシステインに連結され、第３のシステインが第５のシステインに連結され、第４のシステインが第６のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の分子内ジスルフィド架橋再配列、及びポリペプチド鎖の第７のシステインが別のポリペプチド鎖の第８のシステインと連結され、２つのポリペプチド鎖の最後のシステインが連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項8】

第１のシステインが第２のシステインに連結され、第３のシステインが第６のシステインに連結され、第４のシステインが第５のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の分子内ジスルフィド架橋再配列、並びに２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン、２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステインが連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項9】

【請求項10】

第１のシステインが最後のシステインに連結され、第２のシステインが第３のシステインに連結され、第４のシステインが第５のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の分子内ジスルフィド架橋再配列、並びに２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン、及び２つのポリペプチド鎖の第８のシステインが連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項11】

第１のシステインが最後のシステインに連結され、第２のシステインが第３のシステインに連結され、第４のシステインが第５のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の分子内ジスルフィド架橋再配列、及びポリペプチド鎖の第７のシステインが別のポリペプチド鎖の第８のシステインと連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項12】

第１のシステインが最後のシステインに連結され、第２のシステインが第４のシステインに連結され、第３のシステインが第５のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の再配列、及び２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン及び２つのポリペプチド鎖の第８のシステインが連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項13】

第１のシステインが最後のシステインに連結され、第２のシステインが第４のシステインに連結され、第３のシステインが第５のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の再配列、及びポリペプチド鎖の第７のシステインが別のポリペプチド鎖の第８のシステインと連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項14】

第１のシステインが最後のシステインに連結され、第２のシステインが第５のシステインに連結され、第３のシステインが第４のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の再配列、並びに２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン及び２つのポリペプチド鎖の第８のシステインが連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項15】

第１のシステインが最後のシステインに連結され、第２のシステインが第５のシステインに連結され、第３のシステインが第４のシステインと連結される分子内ジスルフィド架橋の再配列、及びポリペプチド鎖の第７のシステインが別のポリペプチド鎖の第８のシステインと連結されて分子間ジスルフィド架橋を形成することを含むことを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項16】

細菌におけるその発現を増加させるためのアミノ末端セグメントと、精製を容易にするカルボキシ末端セグメントとを含む、請求項４から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項17】

細菌におけるその発現を増加させるための前記アミノ末端セグメントが、配列番号２４からなるアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載のポリペプチド。

【請求項18】

そのアミノ酸配列が、配列番号１８～配列番号２３の配列からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載のポリペプチド。

【請求項19】

請求項４から１８のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤とを含む、抗原調製物。

【請求項20】

請求項１９に記載の抗原調製物と、薬学的に許容されるワクチンアジュバントとを含む、医薬組成物。

【請求項21】

前記ワクチンアジュバントが、オイルアジュバント、アルミニウム塩、プロテオリポソーム、及びガングリオシドにコンジュゲートされたプロテオリポソームからなる群から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

進行が血管新生、炎症及び免疫抑制の増加に関連する疾患を治療するための医薬品を製造するための、請求項４から１８のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む抗原調製物の使用。

【請求項23】

進行が血管新生、炎症及び免疫抑制の増加に関連する前記疾患が、がん、黄斑変性症、糖尿病、関節リウマチ及び浮腫からなる群から選択される、請求項２２に記載の使用。

【請求項24】

免疫系の回復のための医薬品を製造するための、請求項４から１８のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む抗原調製物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジー及びヒトの健康の分野に関する。本発明は、ジスルフィド架橋の非天然配置で折り畳まれたヒト血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）の機能的変異体を含むポリペプチドを提供する。本発明は、血管新生、炎症、及び免疫抑制の増加を介して進行する病態の予防及び治療薬に使用される、これらのポリペプチドを含む組成物を生成するための基礎を提供する。

【背景技術】

【0002】

ＶＥＧＦ－Ａ系及びその受容体は分子複合体であり、それらの相互作用は、内皮細胞の増殖、透過性、可塑性及び運動性を特異的に調節し、病理学的血管新生にプラスの効果をもたらす。ＶＥＧＦ－Ａ発現及びそれらの受容体の調節不全は、腫瘍細胞及び間質の両方で起こり、そこでＶＥＧＦ－Ａは特に発現され、内皮細胞の機能を調節する。腫瘍周囲の内皮細胞に対する腫瘍ＶＥＧＦ－Ａのパラクリン作用、並びに腫瘍細胞及びそれらの受容体を発現する間質に対するこの増殖因子の自己分泌作用は、主に過去２０年間に報告されている（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，ＮａｔＭｅｄ，２００３：９：６５３－６０、Ｍａｓｈｒｅｇｈｉ，ｅｔａｌ．，ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１８：２３３：２９４９－６５）。

【0003】

ＶＥＧＦ－Ａは、内皮細胞において増殖、運動性及び組織化の増加を誘導し、ＶＥＧＦ－Ａ及びそのアイソフォームの濃度勾配、並びに他の血管新生促進因子及びそれらの受容体の存在に依存する配置及び成熟を有する新しい血管の形成をもたらす（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，ＮａｔＭｅｄ，２００３：９：６５３－６０）。この主要な機能に加えて、骨髄起源の細胞における１型ＶＥＧＦ－Ａ受容体及び２型ＶＥＧＦ－Ａ受容体並びに共受容体の発現に関する証拠の一部は、炎症プロセス及び免疫抑制プロセスにおける主要なメディエータとしてこの因子を指摘している。例えば、ＶＥＧＦ－Ａが樹状細胞においてその１型受容体と相互作用し、ＮＦκＢを介してそれらの成熟を低下させることが知られている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，ｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｄ，１９９６：２：１０９６－１０３、Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９８：９２：４１５０－６６）。更に、ＶＥＧＦ－Ａは、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）分泌を阻害する制御機構として、エフェクターＴ細胞上で誘導されるその２型受容体（ＶＥＧＦＲ２）に結合する（Ｚｉｏｇａｓ，ｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ，２０１２：１３０：８５７－６４）。ＶＥＧＦ－Ａはまた、炎症プロセスの必須メディエータであり、とりわけ腫瘍性現象及び関節炎現象に関連する病変の微小環境でマクロファージ及び好中球の表現型変化を誘導する（Ｖｏｒｏｎ，ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＯｎｃｏｌ，２０１４：４：７０）。

【0004】

これに関連して、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質ファミリー及びそれらの受容体は、既に記載されたプロセスを経て進行する疾患における能動免疫療法及び受動免疫療法の標的である。標的としてのＶＥＧＦ－Ａ及びそれらの受容体の使用は、複数の腫瘍型並びに加齢黄斑変性（ＡＭＤ）に対する第一選択の治療として、アバスチン、ソラフェニブ及びスニチニブを用いた受動免疫療法の包含の承認によって検証された（Ｗｅｎｔｉｎｋ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，２０１５：１８５５：１５５－７１）。自己免疫応答の誘導に関与するこの増殖因子による能動免疫療法は、よりゆっくりとした展開となる。２００２年まで、標的としてＶＥＧＦ－ＶＥＧＦＲを使用した研究はわずかしか報告されていない。これらの努力のほとんどは、異種変異体（Ｗｅｉ，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００１：９８：１１５４５－５０）、又はＶＥＧＦＡに対して高い構造的及び機能的相同性を有するタンパク質（国際公開第９９／４５０１８号及び国際公開第００／５３２１９号）の免疫原性、抗血管新生及び抗腫瘍効果の研究に充てられた。異種変異体の使用は、細胞応答が存在しない場合に高い中和及び特異的抗体力価を誘導するが、相同分子の使用は、抗腫瘍効果又は抗転移効果の証拠のかけらもない、わずかな免疫応答をもたらす。これらの戦略のいずれも臨床診療に移された。

【0005】

この因子に特異的な能動免疫におけるＶＥＧＦ－Ａの機能的変異体の使用は、裸のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はアジュバントとして使用される免疫賦活性配列に融合した組換えタンパク質のいずれかを使用して、２００２年に記載された（特許出願番号ＰＣＴ／ＣＵ０３／００００４）。

【0006】

ＶＥＧＦ－Ａ変異体（Ａｒｇ８２、Ｌｙｓ８４、Ｈｉｓ８６→Ａｌａ８２、Ａｌａ８４、Ａｌａ８６、又はＡｒｇ８２、Ｌｙｓ８４、Ｈｉｓ８６→Ｇｌｕ８２、Ｇｌｕ８４、Ｇｌｕ８６）の投与は、裸のＤＮＡベースの免疫化（Ｂｅｑｕｅｔ－Ｒｏｍｅｒｏ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００７：１０：２３－３４））、又はタンパク質＋アジュバントベースの免疫化（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００８：１１：３８１－９３）を使用した場合、Ｔ特異的抗腫瘍応答の誘導をもたらす。タンパク質ベースの製剤により、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２へのその結合を阻害するＶＥＧＦ－Ａ特異的抗体の誘導が達成された（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００８：１１：３８１－９３、Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１２：３０：３６８－７７）。ＶＥＧＦＲ－２へのタンパク質結合を妨害する、ＶＥＧＦ－Ａに導入された変異にもかかわらず、この相互作用を中和する抗体を誘導することが可能であった。このワクチン戦略の使用は、メラノーマ（ＭＢ１６Ｆ１０）、肺癌（３ＬＬＤ１２２ｙＴＣ１）、乳癌（Ｆ３ＩＩ）及び結腸直腸癌（ＣＴ２６）のマウスモデルにおいて関連する抗腫瘍効果及び抗転移効果をもたらす。この変異体について、ＶＥＧＦ－Ａ）とのインキュベーション後のＩＦＮ－γの分泌を伴う、同系腫瘍細胞に対する直接的な細胞応答が実証された（Ｂｅｑｕｅｔ－Ｒｏｍｅｒｏ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１２：３０：１７９０－９）。他の戦略とは異なり、これは、ＶＥＧＦ－Ａ二量体の形成に関与するシステイン残基が除去されていないＶＥＧＦ－Ａアイソフォーム１２１の代表である、細菌において産生される組換え抗原を使用する。研究された種におけるこの戦略の使用は、優れた免疫応答の潜在的予備能の存在を実証した（ＳａｎｃｈｅｚＲａｍｉｒｅｚ，ｅｔａｌ．，ＢＭＣＩｍｍｕｎｏｌ，２０１７：１８：３９）。

【0007】

アジュバントの変更及びそれらの濃度のような戦略を使用し、また、投与される抗原の量を変更することによって、前臨床モデル及び診療所においてより高い免疫応答が達成され、同時に利益が得られた（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００８：１１：３８１－９３、Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１４：３２：２２４１－５０、ＰｅｒｅｚＳａｎｃｈｅｚ，ｅｔａｌ．，ＨｕｍＶａｃｃｉｎＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１５：１１：２０３０－７、ＳａｎｃｈｅｚＲａｍｉｒｅｚ，ｅｔａｌ．，ＢＭＣＩｍｍｕｎｏｌ，２０１７：１８：３９）。これらのより高い免疫応答は、応答の自己調節された特徴を維持しながら、研究された種の生理学的パラメータを損なうことなく起こる。免疫化スケジュール下で得られた抗体レベルは、治療抗体のボーラス投与後に達成されたものよりも有意に低かった。以前に論じられた要素は、有害作用を誘発することなくワクチンに対する応答を改善する可能性が残っていることを示している。

【0008】

したがって、抗血管新生効果、抗腫瘍効果、抗転移効果、抗炎症効果、又は免疫回復効果を増加させるヒトＶＥＧＦ－Ａの変異体であって、そのような変異体を含む抗原調製物で免疫された個体に対して免疫応答の改善が達成される変異体を得ることに依然として関心がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、ジスルフィド架橋の非天然再配列で折り畳まれたヒトＶＥＧＦ－Ａアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドを提供することによって前述の問題を解決し、ここで、第２及び第４のシステインは分子内結合のみを形成し、同じ分子の第７及び第８のシステインは分子間架橋の一部としてのみ見出される。

【0010】

本発明の場合、ＶＥＧＦ－Ａの機能的変異体は、天然変異体と比較して９５％の配列同一性を有するが、ＶＥＧＦＲ２へのその結合、及び受容体結合に関連するシグナル伝達を誘導しないという事実が前者とは異なる分子である。

【0011】

本明細書に記載のポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦのタンパク質、特にＶＥＧＦ－Ａ及びそのアイソフォームに関連しており、これまでには記載されていない。それらは、主に、配列番号２によって定義されるポリペプチドの精製プロセスを変更することによって生成された（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００８：１１：３８１－９３）。それらの分析は、元の抗原調製物ＰＶＭと比較して、安定性、免疫原性及び抗腫瘍効果の増加を示した（例１、２、３、４及び５）。

【0012】

ヒトＶＥＧＦ－Ａアイソフォームの機能的変異型を含む本発明関連ポリペプチドを得るために、ＶＥＧＦＲ２結合に関与するアミノ酸を変異させた。本発明の実施形態の１つでは、ポリペプチドは、ＶＥＧＦ－Ａ^１２１、ＶＥＧＦ－Ａ^１４５、ＶＥＧＦ－Ａ^１６５、ＶＥＧＦ－Ａ^１８９及びＶＥＧＦ－Ａ^２０６を含む群から選択されるヒトＶＥＧＦ－Ａアイソフォームを特徴とする。本発明で特許請求される免疫原性を増加させるシステイン配置は、ＶＥＧＦ－Ａ^１２１（図１）について記載される標準的なシステイン構造を共有し、同じ治療効果を示すアイソフォームにまで及ぶ。したがって、同じクローニング及び発現系を使用して、ＶＥＧＦ－Ａ^１４５、ＶＥＧＦ－Ａ^１６５、ＶＥＧＦ－Ａ^１８９及びＶＥＧＦ－Ａ^２０６に対応する配列を挿入した。システインノットを保存する産物と保存しない産物との間の比較評価は、この標準的な構造の非存在下で、ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉについて記載された免疫原性の増加が複製され得ることを示す（例２）。

【0013】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び第２のシステイン、第３及び第４のシステイン、並びに第５及び第６のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン、２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン、及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステインの間に形成される。

【0014】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び第２のシステイン、第３及び第４のシステイン、並びに第５及び第６のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つの異なるポリペプチド鎖の第７と第８のシステイン、及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステイン間に形成される。

【0015】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び第２のシステイン、第３及び第５のシステイン、並びに第４及び第６のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン、２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン、及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステインの間に形成される。

【0016】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び第２のシステイン、第３及び第５のシステイン、並びに第４及び第６のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つの異なるポリペプチド鎖の第７と第８のシステイン、及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステイン間に形成される。

【0017】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び第２のシステイン、第３及び第６のシステイン、並びに第４及び第５のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン、２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン、及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステインの間に形成される。

【0018】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び第２のシステイン、第３及び第６のシステイン、並びに第４及び第５のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つの異なるポリペプチド鎖の第７と第８のシステイン、及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステイン間に形成される。

【0019】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び最後のシステイン、第２及び第３のシステイン、並びに第４及び第５のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン、及び２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン間に形成される。

【0020】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び最後のシステイン、第２及び第３のシステイン、並びに第４及び第５のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つの異なるポリペプチド鎖の第７及び第８のシステイン間に形成される。

【0021】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び最後のシステイン、第２及び第４のシステイン、並びに第３及び第５のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン、及び２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン間に形成される。

【0022】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び最後のシステイン、第２及び第４のシステイン、並びに第３及び第５のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つの異なるポリペプチド鎖の第７及び第８のシステイン間に形成される。

【0023】

一実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び最後のシステイン、第２及び第５のシステイン、並びに第３及び第４のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン、及び２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン間に形成される。

【0024】

他の実施形態では、ヒトＶＥＧＦアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、第１及び最後のシステイン、第２及び第５のシステイン、並びに第３及び第４のシステインの間のジスルフィド分子内架橋の再配列を含み、分子間結合は、２つの異なるポリペプチド鎖の第７及び第８のシステイン間に形成される。

【0025】

本発明の特定の実施形態では、ヒトＶＥＧＦ－Ａアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドは、更に、細菌におけるその発現を増加させるアミノ末端セグメント及び精製プロセスを容易にするカルボキシ末端断片を含む。

【0026】

本発明の範囲を制限することなく、好ましい実施形態では、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のタンパク質Ｐ６４Ｋのアミノ末端断片（配列番号２４）の４６アミノ酸を含む組換えタンパク質異性体混合物が使用される。当該キメラタンパク質では、ＶＥＧＦアイソフォーム１２１の言及されたアミノ末端セグメント及びアミノ末端部分は、これらの２つのセグメントを連結する１３個のアミノ酸によって分離されている。更に、タンパク質は、抗原産生に有用なカルボキシ末端６ヒスチジン配列を有する。天然ＶＥＧＦ－Ａ（図１）中のＣｙｓ５１及び６０に相当するＣｙｓ１１０及び１１９の融合ポリペプチド内での保存は、タンパク質の二次構造の変化を伴ういくつかの構造異性体の形成を促進する可能性がある。Ｂｅｑｕｅｔ－Ｒｏｍｅｒｏら及びＭｏｒｅｒａらの以前の研究のみが、これらのシステインを含むＶＥＧＦ－Ａ変異体を使用した。それにもかかわらず、それらのいずれにおいても、ポリペプチド鎖中のシステイン２とシステイン４との間に分子内ジスルフィド架橋が検出された。これらの２つのＣｙｓの存在並びにＣｙｓ２及び４が分子内結合のみを形成する抗原産生のためのプロセスは、ワクチン目的でのタンパク質の産生に対する新しいアプローチを構成する。全体として、この戦略により、免疫学的応答を高める部位を露出させることができる。前者は、ＶＥＧＦ－Ａのその２型受容体への結合を中和する抗体による認識、又はプロテアソームによる抗原消化が促進され、したがって抗原提示細胞によって新しいペプチドを提示することができるという事実に起因する可能性がある。

【0027】

本発明の特定の実施形態は、配列番号１８～配列番号２３を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドである。それらは、ＶＥＧＦ－Ａアイソフォーム１２１について記載された三次構造を保存するポリペプチドと比較して、免疫原性特性が増加している。これらのポリペプチドでは、所望の優れた効果を説明する三次構造の修飾が検出された。この優れた免疫原性は、これまでのところ、二次構造の変化がヒトＶＥＧＦ－Ａに対する有効な免疫応答の生成に最適ではないと記載されているので、驚くべきことであった（Ｗｅｎｔｉｎｋ，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１６：１１３：１２５３２－７）。

【0028】

配列番号２によって同定されるポリペプチドについて確立された精製プロセスでは、野生型分子のものに類似する、Ｃｙｓ－ノット構造を有するＶＥＧＦ－Ａの構造異性体が例１に示すように産生される。予想外にも、精製プロセスの変更は、天然に分子間架橋を形成するＶＥＧＦ－Ａ由来のＣｙｓ５１及び６０に対応するＣｙｓ１１０及び１１９を含む分子内ジスルフィド結合を提示する異性体ファミリーの濃縮をもたらす。本明細書でＰＶＭ－Ｉと呼ばれる抗原調製物では、ジスルフィド架橋によって安定化されたオリゴマー構造の産生に関連する事実であるＣｙｓ１６１、１６３及び１７５を含む他の分子間結合が観察された。本明細書に記載の折り畳みの形成、安定化、及び順序に関する先行技術の情報はない。これは、実際にＶＥＧＦ－Ａ組換え産生を扱うあらゆる研究が、天然ＶＥＧＦ－ＡのＣｙｓ５１及び６０に相当するＣｙｓ残基の配列を保存したという事実に関連する。これらのシステインが一次配列で保存された場合、再天然化プロセスを使用して天然のジスルフィド架橋を再生成した（Ｐｉｚａｒｒｏ，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２０１０：７２：１８４－９３）。したがって、天然結合の非存在下での新規な非標準的な結合の検出、並びにＰＶＭ－Ｉ調製物の安定性及び生物学的活性の増加とのそれらの関係は、本発明の予想外の驚くべき発見である。

【0029】

本発明は、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉ中に存在する構造異性体の産生のための特定の形態に限定されない。例７に示すように、これらの異性体は、他の手順を用いて得られ、分離することができる。同様に、この例では、同定された異性体の等しい寄与が免疫原性の増分に関して示されている。いくつかの構造アイソフォームが、トリプシンベースの消化に対する耐性がより低いタンパク質画分内に共存し、それらは、特異的免疫応答の増大について同様の能力を示す。

【0030】

ＰＶＭ－Ｉ調製物は、異性体混合物から構成されるか、又は１２種の異性体変異体を効率的に分離することができる逆相クロマトグラフィを使用して単離された特定の異性体によって構成される。分離された異性体の投与は、それらの全てを含有する調製物について観察された効果が免疫学的レベルまで再現されるため、異性体混合物のいずれも潜在的に有効である（例７）。これは、全ての場合において、トリプシンのようなエンドプロテアーゼによるペプチドの生成が好まれ、トリプシンが、ＭＨＣ分子の枠内で免疫系に提示されるペプチドの生成を担うプロテアソーム系の必須成分の１つであるという事実に関連し得る（Ｐａｍｅｒ，ｅｔａｌ．，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１９９８：３２３－３５８）。

【0031】

また、本発明の主題は、ジスルフィド架橋の非天然再配列で折り畳まれたＶＥＧＦ－Ａアイソフォームの機能的変異体の少なくとも１つのポリペプチドを含む抗原調製物であって、ポリペプチド鎖の第２及び第４のシステインが分子内結合のみを形成しており、ポリペプチド鎖の第７及び第８のシステインが分子間架橋のみを形成している抗原調製物である。抗原調製物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤を含む。免疫原用量は、毒性がなく、固有の治療効果を示さない、薬学的使用のために認められているビヒクル中で投与することができる。これらのビヒクルとしては、イオン交換体、ミョウバン、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物起源の脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩及び電解質、ポリビニルピロリドン、セルロース及びポリエチレングリコールに基づく物質が挙げられる。本発明では、ワクチン調製物のビヒクルとして塩化トリス緩衝液が優先的に用いられる。

【0032】

本発明の主な目的は、天然に見られるものとは有意に異なる二次／三次構造を有するポリペプチドであるため、本発明は所与の手順によって得られる抗原調製物に限定されない。

【0033】

ＶＥＧＦ－Ａアイソフォームの変異体を含むポリペプチドから構成される異性体ファミリーは、とりわけ、逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用した構造異性体の精製又は不均衡に存在する変性剤での制御された再天然化を含む他の戦略を使用して、均一な組成物中で得ることができる。例７に示すように、構造アイソフォームは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して分離することができ、同一濃度でのそれらの独立した使用は、既に記載された混合物（ＰＶＭ－Ｉ）と比較して、免疫原性、抗腫瘍効果及び抗転移効果に関して同様の効果をもたらす。

【0034】

ＰＶＭ－Ｉ調製物は、フロイントアジュバントを用いた予備研究（例１）によるより高い免疫原性及び安定性を有する抗原変異体である。これらの研究は、非ヒト哺乳動物（例２～５、及び９～１３）及びヒト（例１４及び１５）における治療シナリオに関連するアジュバント及びスキームに拡張された。より高い安定性の抗原変異体の使用は、生産的及び商業的状況に関連するが、免疫原性の増加により、優れた治療的解決策が提供される（例２～５、９～１５）。

【0035】

好ましい実施形態では、本発明はまた、ジスルフィド架橋の非天然再配列で折り畳まれるヒトＶＥＧＦ－Ａの機能的変異体を含む医薬組成物を記載し、ポリペプチド配列の第２及び第４のシステインは分子内結合のみを形成し、第７及び第８のシステインは分子間架橋のみを形成する。

【0036】

本発明に関連する組成物は、少なくとも薬学的に許容されるアジュバントを含有する。免疫応答を増加させるために、本発明に記載される構造異性体は、既に記載された免疫賦活剤と組み合わせることができる。それらの中には、無機塩、サイトカインのような免疫刺激剤、分子アジュバント（ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＭＨＣＩ型の不変鎖、ＬＦＡ３）、サポニン、ムラミルジペプチド誘導体、オリゴヌクレオチドＣｐＧ、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡ及びポリホスフェターゼ、脂質粒子（すなわち、フロイントアジュバント、ＭＦ５９及びＭｏｎｔａｎｉｄｅ）、リポソーム、ナノ粒子、ビロソーム、ＩＳＣＯＭＳ、コイル状物質、微粒子アジュバント、ポロキサマー、ウイルス及び細菌抗原がある。また、粘膜アジュバントが含まれる。特定の実施形態では、アジュバントは、オイルベースアジュバント、アルミニウム塩、プロテオリポソーム、及びガングリオシドにコンジュゲートされたプロテオリポソームからなる群から選択される。

【0037】

薬学的に許容されるアジュバントと共に抗原を投与することは、他の抗腫瘍剤と併用して又は併用せずに第一選択又は第二選択の治療として、新たな転移の出現を回避すること、並びに原発腫瘍の減少及び更には除去に寄与することができる（例２～５、９～１２、及び１４）。また、このタイプの免疫療法は、とりわけ、急性及び慢性炎症過程（喘息、呼吸促迫、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症、組織浮腫）、感染症（肝炎、カポジ肉腫）、自己免疫疾患（糖尿病乾癬、関節リウマチ）、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、血管新生緑内障、血管腫、及び血管線維腫の治療に有用であり得る（例１２、１３及び１５）。

【0038】

特に、本発明は、ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰの名称でアジュバントの群に製剤化された場合、週に１回のスケジュールで、ワクチン抗原を投与することを記載した。これらのアジュバントは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の外膜小胞への、ガングリオシドＮ－アセチルＧＭ３の天然又は合成形態のコンジュゲーションから得ることができる（米国特許第６１４９９２１号、国際公開第２０１９８６０５６号、Ｒｅｇａｌａｄｏ，ｅｔａｌ．，ＯｒｇａｎｉｃＰｒｏｃｅｓｓＲｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２０１３：１７：５３－６０）。本明細書から、ＶＳＳＰ（超小型プロテオリポソーム）としても知られているこれらのアジュバント変異体は、ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰと呼ばれる。合成Ｎ－ＡｃｅｔｙｌＧＭ３を組み込んだものは、ガングリオシドに付加される脂肪酸の長さがそれぞれ異なる。一般に、ステアリン酸を含む変異体（ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ）又はオレイン酸を含む変異体（ｏＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ）の使用は、免疫原性、抗腫瘍効果及び抗転移効果に関してガングリオシドの天然変異体を使用して得られた結果を再現する。これらの製剤条件の全てにおいて、ＰＶＭ－Ｉを抗原として使用した場合、ＰＶＭと比較して、優れた抗腫瘍、抗転移性、抗炎症性、及び免疫回復効果が得られた（例４～１２）。

【0039】

組織病理学的研究は、全ての場合において、原発腫瘍における機能性血管の数の減少、腫瘍細胞密度の減少、及び有糸分裂／アポトーシス比の減少に対する有意な傾向を明らかにし、これらは腫瘍成長と逆相関した。がんに関連する致死が主に転移事象に関連することを考慮して、抗原調製物を肺への自発的及び実験的転移の積極的モデルにおいて更に評価した。全ての場合において、ＰＶＭ－Ｉベースの調製物は、ワクチン抗原ＰＶＭを用いて得られたものよりも有意に良好な抗転移プロファイルを示した。

【0040】

処置された動物における転移巣の分析は、発見された転移の数と相関する壊死巣の数の増加と平行して、血管密度及び有糸分裂／アポトーシスのバランスが低下し、処置された原発腫瘍について記載された特徴と同様の特徴を示した。興味深いことに、ワクチンベースの処置は、転移の数を減少させることができただけでなく、そのサイズ及び増殖能も減少させることができ、転移プロセスに対する治療的介入の二重の効果である病巣の移植及びその増殖を示した（例９）。

【0041】

注目すべきことに、本発明の抗原調製物は、リン酸アルミニウムに製剤化される場合、２週間ごとに投与される。このアジュバントにより、ＰＶＭ－Ｉを抗原として使用した場合、ＰＶＭと比較して、優れた抗腫瘍、抗転移性、抗炎症性及び免疫回復効果が得られた。

【0042】

同様の濃度で、全ての試験されたアジュバントにおいて、ＰＶＭ－Ｉ調製物は、達成された特異的抗体応答及び血清の中和能に関して、ＰＶＭよりも有意に優れている。これらの効果は、使用した両方のマウス系統で観察され、多様なハプロタイプの状況で処置によって達成可能な広いスペクトルの応答を示した。同様に、ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰベースの製剤についてＰＶＭ－Ｉは、同系腫瘍細胞を直接排除する細胞応答の誘導のための優れた抗原選択である。新規抗原調製物はまた、ヒト霊長類のように天然ＶＥＧＦ－Ａについてより高い相同性を共有する種でアッセイした場合、より高い免疫原性を証明した。

【0043】

治療適用のために、本発明からのワクチンは、当業者に公知の経路を使用して、薬学的に許容される投与量で哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。記載された抗原調製物は、他の処置と同時又は連続スケジュールで投与することができる。

【0044】

新規抗原調製物ＰＶＭ－Ｉの投与は、黒色腫、肺癌、乳癌、及び結腸癌を含む多様な起源の腫瘍の成長を有意に減少させ、これらの結果は、他の抗腫瘍治療の臨床診療への転換に関連する腫瘍モデルで得られたものであり、このワクチン戦略ががん治療における臨床場面に適用可能であることを示している。抗原投与量の増加は、免疫応答に関連する生物学的効果の増加に関連し、したがって、各用途に使用される抗原の量は所望の効果に依存する。

【0045】

本発明はまた、血管新生、炎症及び免疫抑制の増加に関連する疾患を治療するための薬物の製造における、ジスルフィド架橋の非天然再配列で折り畳まれたヒトＶＥＧＦ－Ａアイソフォームの機能的変異体を含むポリペプチドの使用を初めて明らかにする。特定の実施形態では、治療される疾患は、がん、黄斑変性症、糖尿病、関節リウマチ、及び浮腫を含む群から選択される。

【0046】

新規抗原調製物ＰＶＭ－Ｉは、ヒトにおけるがんの能動免疫療法に有用である。腫瘍性疾患の治療と同じものの使用は、前臨床段階で記載された免疫学的効果を再現する。免疫された患者では、ＶＥＧＦ－Ａ特異的抗体、並びにＶＥＧＦ－Ａ刺激に応答してＩＦＮ－γを分泌するＴリンパ球のクローンが検出された。この免疫応答の存在は、生存の有意な増加と関連していた。長期の免疫応答が、完全応答を有する患者群において認められた。これは、がんワクチンにとって珍しい発見である。更に、治療の成功は、血漿中のＶＥＧＦ－Ａを完全に除去することとは関係がないことも興味深い。この要素は、前臨床及び臨床の両方の場面でＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２系を標的とする他の治療代替物について記載されているものと同様の副作用がないことに関連している可能性がある。同様に、循環ＶＥＧＦ－Ａの減少、及びＶＥＧＦ－ＡがＶＥＧＦＲ２に結合する能力の全身中和を達成することによって、薬学的に許容されるアジュバント中で投与される新規抗原調製物は、過剰な血管新生に関連する病態の別の群の治療に使用することができる。

【0047】

本発明は、本明細書中に開示される抗原調製物の使用を特定の疾患に限定するものではなく、治療がそれらの状況においてどのように有効であるかを例示する。したがって、リン酸アルミニウム又はｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰの存在下で本発明の抗原調製物を投与することにより、担癌動物の免疫系を救済する（例１１）。抗原調製物ＰＶＭ－Ｉはまた、ＤＢＡ／Ｉマウスにおけるコラーゲン誘導性関節炎モデルの状況において、本明細書でＰＶＭと呼ばれる抗原調製物と比較して、抗炎症効果が増加することが示されている（例１２）。同様に、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉは、角膜損傷の動物モデル及びヒトの加齢黄斑変性においてより大きな抗血管新生効果を有していた（例１３及び１５）。これは、非腫瘍性疾患の治療におけるこの戦略の潜在的有用性を示している。このコンパートメントにおけるＶＥＧＦ－Ａの投与の結果としての、角膜における血管新生の減少は、ＶＥＧＦ－Ａの局所レベルの増加を示し、本発明のポリペプチドを含む調製物による能動免疫を誘導する免疫応答から制御することができる疾患である、加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症を治療するための戦略の可能性を示す。

【0048】

別の態様では、本発明は、免疫系を回復させる際に、ジスルフィド架橋の非天然再配列に折り畳まれる、ヒトＶＥＧＦ－Ａのアイソフォームの機能的変異体を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む抗原調製物を含む医薬組成物の使用を明らかにする。新規抗原調製物は、より良好な免疫原性特性を示すことに加えて、免疫系の優れた回復をもたらす。サプレッサー骨髄性及び制御性Ｔ細胞の分析を、本発明の抗原調製物で処置した動物の原発性病変及び転移性病変において行った。この分析は、ワクチン調製物を異なるアジュバント及びスケジュールで投与すると、これらのサプレッサー細胞の数が減少することを示した。サプレッサー細胞の機能性、並びに全身レベルでのその数も影響を受ける（例１０）。

【0049】

本発明で開示される抗原調製物のアジュバント効果は、オボアルブミン抗原（ＯＶＡ）を発現する実験モデルで実証された。アジュバント中のＰＶＭ－Ｉワクチン抗原をＯＶＡと共に逐次投与又は併用投与すると、ＯＶＡ特異的細胞性及び体液性免疫応答が有意に増加した。更に、クラスＩ提示分子に関連して、ＶＥＧＦ－ＡとＯＶＡとの交差提示に対するＰＶＭ－Ｉによるワクチン接種の効果が観察された（例１１）。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1A】アイソフォーム１２１、１４５、１６５、２０６及び１８９における天然ＶＥＧＦ－Ａ由来のアミノ酸配列と、抗原調製物ＰＶＭ中に存在するアミノ酸配列との配列アラインメントである。濃いＣ（Ｃ）で表されるシステインは分子内架橋に関与するものであり、更に下線が引かれたもの（Ｃ）は分子間結合を形成する。

【図1B】天然ＶＥＧＦ－Ａ変異体におけるジスルフィド結合配置の概略図である。

【図2】抗原調製物ＰＶＭ－Ｉで検出されたジスルフィド結合の概略図である。

【図3】ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ジチオスレイトール又はβ－メルカプトエタノールの非存在下）を使用した、ＶＥＧＦ－Ａからの標準的な「シスチンノット」の存在の評価を示す図である。

【図3A】トリプシン消化後のＰＶＭ、ＣＨＯ－ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＭタンパク質の分析を示す図である。

【図3B】トリプシン消化後の２つのロットのＰＶＭ－Ｉ調製物（レーン２～５）及び対照としてのＰＶＭ（レーン６～７）におけるタンパク質の分析を示す図である。分子量マーカを、ＰＭ１及びＰＭ２としてマークしたレーンに流した。

【図4】ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰアジュバント（Ｉ）又はリン酸アルミニウム（ＩＩ）中で投与した、ＰＶＭ－Ｉで免疫した進行がん患者における体液性及び細胞性応答の評価を示す図である。

【図4A】免疫した患者に対するＶＥＧＦ－Ａ特異的ＩｇＧ力価を示す図である。

【図4B】ＶＥＧＦ－ＶＥＧＦＲ２相互作用をブロックする免疫化患者血清の能力の研究を示す図である。

【図4C】ＩＮＦ－γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したＶＥＧＦ特異的細胞応答の評価を示す図である。全ての場合において、値は、処置開始時の値と比較して見出された差を表す。

【図5】抗原調製物ＰＶＭ－Ｉで免疫した患者の生存に対する免疫応答及びその影響の分析を示す図である。生存時間は、ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰアジュバント（Ｉ）又はリン酸アルミニウム（ＩＩ）のいずれかで抗原を投与された群について検出された陽性免疫応答の関数として示される。

【0051】

例
例１．ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉ抗原調製物の精製及び特性決定。
アミノ酸８２、８４及び８６がグルタミン酸によって変異されたヒトＶＥＧＦ－Ａのアイソフォーム１２１をコードするＤＮＡをベクターＰＭ２３８にクローニングした（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００８：１１：３８１－９３）。ＤＮＡ配列の１００％を確認し、配列番号１と命名した。この遺伝子構築では、アンピシリン耐性遺伝子は、発現レベルの変化なしに、カナマイシン耐性に対応する遺伝子によって中断された。プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＢＬ２１株に形質転換し、最も高い発現レベルを有する形質転換体を化学的に定義された培地中で選択した。この培地は、動物起源の成分の非存在下で、組換えタンパク質の発現を最大化するように設計された。このタンパク質を、Ｍｏｒｅｒａら（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００８：１１：３８１－９３）によって記載されたものに従って精製した。簡単に説明すると、タンパク質を５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、３００ｍＭＮａＣｌ、６Ｍ尿素、ｐＨ７．８中で４℃で１６時間抽出し、製造業者の説明書（ＱＩＡＧＥＮ）に従って精製した。緩衝液を、マトリックスＧ２５（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィにおいてｐＨ７．４の１０ｍＭのＴｒｉｓに変更した。

【0052】

得られたタンパク質調製物を質量分析によって評価して、そのアミノ酸配列を検証した。ＥＳＩ－ＭＳ及びＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化質量分析及びエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析）は、Ｚ－スプレーエレクトロスプレーイオン化源（ｎａｎｏＥＳＩ）を備えたＱＴＯＦ－２直交ハイブリッド構成分光計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国）で得た。還元されたタンパク質調製物の分子量（２１５６９．１３Ｄａ）は、アミノ末端で細菌タンパク質Ｐ６４Ｋの断片に融合され、これらのポリペプチド間の架橋として機能する１３個のアミノ酸によってそれから分離され、カルボキシル末端にヒスチジンテールも組み込んだヒトＶＥＧＦ－Ａのアイソフォーム１２１の理論的推定値（２１５６９．３１Ｄａ）に相当した。ヒトＶＥＧＦ－Ａ配列に導入された変異を確認し、位置１４１、１４３及び１４５の天然ＶＥＧＦ－Ａ配列に対応するアミノ酸、それぞれアルギニン、リジン及びヒスチジンの代わりにグルタミン酸を検出した。

【0053】

Ｇｌｕ－Ｃエンドプロテイナーゼによる消化から得られたペプチドの混合物から、試料中のアミノ末端の完全性を検証した。ＥＳＩ－ＭＳスペクトルでは、ペプチド^１ＶＤＫＲＭＡＬＶＥ^９（二重荷電、理論値ｍ／ｚ５３０．７８）に対応するシグナルが確認された。このペプチドをＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによって配列決定し、配列はタンパク質のアミノ末端について予想される配列と同一であった。

【0054】

還元されたインタクトなタンパク質のＥＳＩ－ＭＳスペクトルでは、質量分析計の入力コーンの電圧を増加させることによって、供給源で断片化が引き起こされ、Ｃ末端に対応するシグナルが検出された。結果の分析は、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによる配列決定後のペプチド^１７７ＫＰＲＲＧＳＲＡＨＨＨＨＨＨ^１９０（二重荷電、ｍ／ｚ８７５．４６）と一致し、カルボキシル末端配列を確認した。全体として、配列決定の結果により、本発明者らは抗原調製物中に存在するポリペプチドの一次構造を検証することができた（配列番号２）。以下、配列番号２で定義されるタンパク質調製物をＰＶＭと呼ぶ。

【0055】

発酵及び精製条件の研究は、発酵中の増殖条件を変更し、抽出時間を短縮し、ニッケルアフィニティクロマトグラフィにおける特定のタンパク質負荷を調整し、洗浄工程に洗剤を組み込むことによって、以前に記載された方法（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００８：１１：３８１－９３）よりも優れた回収率を示した。簡単に説明すると、発酵プロセス中に、増殖相の発酵温度を２８℃に変更し、化学誘導剤を必要とせずに、温度を３７℃に上昇させるだけで発現を誘導した。６Ｍ尿素中のバイオマスからのタンパク質抽出時間も１６時間から２時間に短縮され、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１１４を用いたニッケルアフィニティクロマトグラフィに洗浄工程を導入した。更に、分子排除クロマトグラフィから得られた調製物を、マンニトール（４０ｍｇ／ｍＬ）、スクロース（１０ｍｇ／ｍＬ）及び１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．４に製剤化した。この最終的なタンパク質調製物は、ＰＶＭ－Ｉと呼ばれ、以下、最初のプロセスで得られた調製物、ＰＶＭ調製物と比較する。

【0056】

両方の調製物において、総タンパク質の濃度を、二重波長（６２０及び４５０ｎｍ）でマイクロクーマシー法、及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）での純度パーセントを使用して評価した。免疫同定は、抗原中に存在する異なるセグメントを認識するモノクローナル抗体を用いた免疫ブロット法によって行った。これらの研究では、ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉ調製物は同一であった。

【0057】

これらの凍結乾燥タンパク質調製物の立体配座及び安定性の分析は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＸＫ１０／３００カラム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析規模の分子排除クロマトグラフィを使用して行った。緩衝液Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ１０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ｐＨ７．４を０．５ｍＬ／分の流速で移動相として使用した。凍結乾燥タンパク質調製物を１ミリリットルの水に懸濁し、比較データは、再構成時に、ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉがこのタイプのクロマトグラフィにおいて同じ保持プロファイルを示すことを示した。どちらの場合も、使用される分子量標準に従って、６７０ｋＤａを超える分子量を有する可溶性凝集体が形成される。しかし、ＰＶＭ－Ｉからの再構成溶液は、添加された組成物の経時的な安定性に関して差次的な特性を示し、その構造組成の変動を示した。ＰＶＭ－Ｉ調製物は、再構成された後、分子排除クロマトグラフィにおいて、４℃で３０日間、その保持時間プロファイルを維持するが、ＰＶＭ調製物は、７２時間で安定性を有意に失い始める（表１）。クロマトグラフィチャートの曲線下面積の分析によると、７２時間でのＰＶＭタンパク質質量の１４％を超える立体配座変化は、３０日目に有意に増加し、このとき、元の立体配座は４５％を超えて失われる。

【表1】

【0058】

ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉタンパク質調製物の免疫原性を評価するために、マウスにおいて産生された体液性免疫応答を評価した。２つのマウス系統（Ｃ５７Ｂｌ／６及びＢＡＬＢ／ｃ）から、１群あたり１０匹の動物を使用し、１００μｇのタンパク質調製物を、２５０μＬの総体積（タンパク質／アジュバント比１：１ｖ／ｖ）で、１回目の投与では完全フロイントアジュバント（ＳＩＧＭＡ）上で、２回目の投与では不完全フロイントアジュバント（ＳＩＧＭＡ）上で、週間隔で投与した。動物由来の血清は、２回目の免疫の１週間後に収集した。血清中に存在するヒトＶＥＧＦ－Ａに対する特異的抗体力価、及びＶＥＧＦ－Ａとその２型受容体との相互作用を中和するそれらの能力を、以前に記載されたようにＥＬＩＳＡによって評価した（Ｂｅｑｕｅｔ－Ｒｏｍｅｒｏ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１２：３０：１７９０－９）。力価の結果は、ＶＥＧＦ－Ａに対する特異的抗体の存在が検出される最大希釈として表される。中和能は、血清中に存在する抗体が除去することができる最大ＶＥＧＦ－Ａ／ＶＥＧＦＲ２結合のパーセンテージとして表される。

【0059】

免疫原性を比較すると、新規抗原調製物（ＰＶＭ－Ｉ）で免疫した場合に達成される血清転換レベルの有意な増加が、表２に示すように、これらの等量が投与された場合でさえ、以前のもの（ＰＶＭ）と比較して証明された。

【表2】

【0060】

ジスルフィド架橋の形成は、（ａ）これらのタンパク質調製物のモノマーが同一の一次配列（配列番号２）を有すること、（ｂ）それらが９個のシステイン残基を有すること、並びに（ｃ）ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉポリペプチド配列の６３％を構成する）の免疫原性、熱及び立体配座安定性が、野生型タンパク質及びそのファミリーについて広く特徴付けられている標準的なシステイン構造の形成に関連することを考慮して、両方の調製物で研究した。

【0061】

タンパク質調製物内のジスルフィド架橋の順序付けを、トリプシンによるタンパク質分解の研究を介して事前に評価し、非変性条件下での電気泳動によって、及び移動相として２００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いて、０．５ｍＬ／分でＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＸＫ１０／３００カラムでの分子排除クロマトグラフィによって分析した。

【0062】

天然ＶＥＧＦ－Ａ中のシステインの特徴的な配置により、トリプシン消化に対して耐性となることが知られており（Ｋｅｃｋ，ｅｔａｌ．，ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ，１９９７：３４４：１０３－１３）、したがって、本発明者らは、この酵素によるＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉの消化の比較を行う。この目的のために、最終精製緩衝液を２００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０に交換し、タンパク質をトリプシンの存在下又は非存在下、５０：１の比（タンパク質：トリプシン）で３７℃で１６時間インキュベートした。その後、試料を採取して、非変性ネイティブ電気泳動によりトリプシン消化の効率を評価した（図３）。以下の試料をＶＥＧＦ－Ａ分子中の架橋の正しい立体配座の対照として使用した：１）ＶＭタンパク質：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムから産生されたＥに対するＲ８０、Ｋ８２、及びＨ８４変異を有するヒトＶＥＧＦ－Ａのアイソフォーム１２１（Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１４：３２：２２４１－５０）、及び２）ＣＨＯ－ＶＥＧＦタンパク質：真核細胞株ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）のトランスフェクションから得られたヒトＶＥＧＦ－Ａのアイソフォーム１２１（ＳａｎｃｈｅｚＲａｍｉｒｅｚ，ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，２０１６：３７：６３６－５８）。これらのＶＥＧＦ－Ａ変異体を、還元剤の非存在下での非変性プロセスによって精製した。図３は、細菌ペリプラズムからの調製物がトリプシンによる消化にどの程度耐性であるかを示し、これは、その９０％は未消化タンパク質の分子量よりも低い分子量で移動する画分に回収され、推定分子量及びＰ６４Ｋセグメント（１９．９０２ｋＤａ）を有するか又は有さない変異体の二量体型における「システインノット」としても知られる標準的なシステイン構造の存在と一致するためである（図３Ａ）。

【0063】

ＰＶＭ調製物の分析は同様の現象を示したが、これはＰＶＭ－Ｉ調製物では観察されず、システインノットに対応するペプチドは現れない（図３Ｂ）。これを考慮して、トリプシン又はＧｌｕＣによるＰＶＭ－Ｉ調製物の消化から生じるペプチドを、ＰＶＭについて記載されるように、試料を還元プロセスに供することなく質量分析によって分析した。表３は、検出されたジスルフィド結合を示す。

【表3】

【0064】

上記のジスルフィド結合の存在の一貫性を分析し、合計８ロットの最終生成物で検証した。同定された構造は、活性医薬成分と最終製剤の両方で見られる。ＰＶＭ－Ｉについて見出されたジスルフィド架橋の特定のアレイは、ＶＥＧＦ－Ａ１２１の野生型分子及びこのタンパク質の他のアイソフォームについて記載されたものとは有意に異なる。それらはまた、多様な原核生物及び真核生物発現系における組換え技術によって得られる場合、タンパク質について記載されるアレイとは異なる（Ｋｅｃｋ，ｅｔａｌ．，ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ，１９９７：３４４：１０３－１３）。天然ＶＥＧＦ－Ａの２番目及び４番目のシステインに対応する、システイン１１０と１１９との間の分子間架橋について徹底的な探索を行った。野生型分子においてこれらのシステイン残基が分子内結合を形成する場合でも、それらに対応するペプチドは、いずれの実験条件においてもトリプシン又はＧｌｕ－Ｃ消化ＰＶＭ－Ｉ調製物では検出されなかった。

【0065】

従来技術によれば、ＶＥＧＦ－Ａの最も安定した構造は、いわゆる「システインノット」を維持する構造に相当する。しかし、タンパク質調製物ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉを用いて行われた研究は、それらが精製される条件では、より高い安定性が天然構造を欠く変異体に関連することを示した。同様に、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎらのデータ（米国特許出願公開第２０１２／０２３１０００号）にもかかわらず、フロイントアジュバントにおけるＰＶＭ－Ｉ免疫原性のＰＶＭと比較した比較分析は、図２の異性体混合物を含むフロイントアジュバントがより免疫原性であることを示している。

【0066】

この研究は、ＰＶＭと比較してＰＶＭ－Ｉ調製では、ジスルフィド結合の配置の変化が起こり、抗原産生のための新しいプロトコルに従ってより高い安定性及び再現性をもたらすことを示している。図２は、ＰＶＭ－Ｉのポリペプチド配列中に検出された９つのシステインの中で安定な形態で確立された架橋の１２個の変異体を示す。

【0067】

例２．ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ中で投与された抗原調製物ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉの免疫原性の比較。
抗原チャレンジに対する体液性又は細胞性免疫応答を生成する能力が異なるマウス株Ｃ５６ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃを使用した。両方の場合において、１００μｇの抗原調製物を、ａ）天然ガングリオシドを組み込んだ１００μｇのＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ、ｂ）ガングリオシドをステアリン酸と組み込んだ１００μｇのｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ、又はｃ）ガングリオシドをオレイン酸と組み込んだ１００μｇのｏＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰにおいて、用量あたり投与した。１群あたり１０匹の動物を、週に１回のスケジュールで８週間免疫した。各免疫の１週間後、３回目の後、及び８回目まで、動物の血清を収集した。ヒトＶＥＧＦ－Ａに特異的な抗体力価及びＶＥＧＦ－Ａとその２型受容体との相互作用を中和するそれらの能力を、記載されるようにＥＬＩＳＡによって評価した（Ｂｅｑｕｅｔ－Ｒｏｍｅｒｏ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１２：３０：１７９０－９）。

【0068】

特異的ＩｇＧ力価は免疫回数の増加と共に増加し、８回目の免疫後１週間で最大に達した。この実験点に対応する結果を表４に示す。図から分かるように、両株において、８回目の免疫後、特異的力価及びＶＥＧＦ－Ａのその受容体への結合の阻害の両方に関して、ＰＶＭ－Ｉ抗原調製物について有意に優れた結果が得られる。アジュバントＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰの３つの変異体の比較分析は、ワクチン調製物が同等に免疫原性であることを示している。

【表4】

【0069】

例３．リン酸アルミニウム中で投与された抗原調製物ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉの免疫原性の比較。
マウス系統Ｃ５６ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃを使用した。１用量あたり１００マイクログラムの抗原調製物を、０．７ｍｇ当量のＡｌ３＋（リン酸アルミニウム）中に投与した。１０匹の動物を、１群あたり、２週に１回の頻度で合計４回の免疫化のために免疫化した。２回目及び４回目の免疫の１週間後に動物の血清を採取した。ヒトＶＥＧＦ－Ａ特異的抗体力価、及びＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦＲ２との相互作用を中和するそれらの能力を、記載されるようにＥＬＩＳＡによって評価した（Ｂｅｑｕｅｔ－Ｒｏｍｅｒｏ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１２：３０：１７９０－９）。

【0070】

両方の抗原タイプ及び両方のマウス系統について、投与された用量の数が増加するにつれて、力価の増加が観察された。４回目の免疫後に得られた血清試料についての結果を表５に示す。両方の株について、４回目の免疫後、特異的抗体力価及びその受容体へのＶＥＧＦ－Ａ結合の阻害に関して、ＰＶＭ－Ｉ抗原調製物について有意に優れた結果が得られる。

【表5】

【0071】

例４．ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ中で投与されたＰＶＭ又はＰＶＭ－Ｉの抗原調製物による免疫化によって誘導された細胞応答の評価。
細胞応答を、Ｂｅｑｕｅｔ－Ｒｏｍｅｒｏら（Ｂｅｑｕｅｔ－Ｒｏｍｅｒｏ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００７：１０：２３－３４、Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１２：３０：３６８－７７）に記載されているように分析した。この場合、応答はアジュバントＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰの状況でのみ評価した。動物（ｎ＝１０、１群あたり）を例２でこのアジュバントについて記載されるスキームで免疫化し、最後の免疫化の１週間後に屠殺し、マウス脾臓から単離した細胞を、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）フルオロフォアで標識した同系腫瘍細胞と１００：１の比（エフェクター細胞：標識腫瘍細胞）で共インキュベートした。

【0072】

Ｃ５６ＢＬ／６株と同系のメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４リンパ腫及び肺癌３ＬＬ－Ｄ１２２、並びにＢＡＬＢ／ｃ株と同系の結腸癌株ＣＴ２６、乳癌Ｆ３ＩＩ及び腎ＲＥＮＣＡをこの研究のために選択した。共インキュベーション後の生細胞のフローサイトメトリー（ＳｐａｃｅＭＬ－ＰＡＲＴＥＣ）による分析により、両方のマウス株において、２つの抗原調製物の同様の用量を投与した場合でさえ、ＰＶＭ－Ｉ調製物の投与がより強い直接的な細胞応答をもたらすことが示された。表６は、免疫化動物のリンパ球と遭遇した際に死滅する腫瘍細胞のパーセンテージに対応する結果を示し、賦形剤による処置に対応する細胞の平均値を１００％生存率として採用している。両方のマウス系統（Ｃ５７Ｂｌ／６及びＢＡＬＢ／ｃ）において、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉの投与（全ての場合において群ＩＶに対応する）は、有効な細胞応答の誘導の点でＰＶＭ製剤の使用よりも優れている。

【表6】

【0073】

例５．マウスにおける固形腫瘍の治療のためのＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉベースの免疫化の有効性。
全ての場合において、１２匹のマウスの群を免疫した。ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ又はリン酸アルミニウムによる免疫化の結果を２つの腫瘍モデルについて記載する。アジュバントｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰを使用する場合、動物を、対応する抗原１００μｇ及びアジュバント１００μｇを含有する合計２００μＬの週に１回の用量で８週間皮下免疫した。リン酸アルミニウムについては、動物を２週に１回のスケジュールで４回免疫した。毎回、１００μｇの抗原を、０．７ｍｇ当量のリン酸アルミニウムの形態のＡｌ３＋を含有する２００μｌの総体積で投与した。

【0074】

マウスＣ５７ＢＬ／６株において、黒色腫モデルＢ１６Ｆ１０を評価した。４回目の免疫（ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰの存在下）又は２回目の免疫（リン酸アルミニウムの存在下）の３日後、マウスの皮下に、１００μＬのＤＭＥＭ培養培地中、合計２００００個の細胞を接種した。表７は、腫瘍チャレンジの２５日後の、安楽死させた動物から手術によって除去された原発腫瘍の重量を示す。

【表7】

【0075】

表７で観察されるように、両方のアジュバントにおいて、抗原調製物による動物の処置は、腫瘍チャレンジ後２５日目に向かって腫瘍成長を有意に減少させるが、より有意な阻害を示すのは新規抗原調製物（ＰＶＭ－Ｉ）の使用である。この抗腫瘍応答は、体液性及び細胞性の両方のＶＥＧＦ－Ａに対する特異的免疫応答の存在と相関していた（ｐ＜０．０５、ピアソン試験）。

【0076】

同様に、抗腫瘍効果を、同じ免疫スキームを使用して、マウス系統ＢＡＬＢ／ｃにおいて評価した。腫瘍チャレンジはまた、この株を有するＣＴ２６同系結腸癌の２５０００個の細胞による４回目の免疫（ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰの存在下）又は２回目の免疫（リン酸アルミニウムの存在下）の３日後にも行われた。チャレンジの３０日後の腫瘍成長の比較分析により、ＰＶＭ調製物の使用と比較して、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉによる免疫化による優れた抗腫瘍効果が示された（表８）。

【表8】

【0077】

以前の研究と同様に、この結果は、ＶＥＧＦ－Ａに特異的な体液性及び細胞性免疫応答の両方の存在と相関し、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉの使用の場合に優れていた（ｐ＜０．０５、試験ピアソン）。両方の研究において、抽出された腫瘍の連続切片の組織学的分析により、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉの使用にとって有意により好ましいワクチン接種の抗血管新生、アポトーシス促進及び抗増殖効果が示された（ｐ＜０．０５、全ての分析においてダネット）。

【0078】

例６．ＶＥＧＦ－Ａ由来のアイソフォーム１４５、１６５、１８９及び２０６に基づくポリペプチド変異体の調製及び特性決定。
図１のアラインメントが示すように、ＶＥＧＦ－Ａの全てのアイソフォームは、アイソフォーム１２１に存在するシステイン残基を共有しているので、免疫原性を増加させるために使用される戦略は、タンパク質ファミリー全体に有効であり得る。この仮説を検証するために、アイソフォーム１４５、１６５、１８９及び２０６をＨｅＬａ腫瘍細胞のｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）からクローニングした。自動配列決定は、２０１８年６月の更新（２０１９年１２月２３日参照）に従って、ＣＣＤＳデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＣＤＳ／ＣｃｄｓＢｒｏｗｓｅ．ｃｇｉＲｅｌｅａｓｅ２２）に報告されているものに従って配列を検証した。

【0079】

簡単に説明すると、ＶＥＧＦ－Ａの全てのアイソフォームを単一の増幅反応で得ることができ、それらはそれらの異なるサイズのために完全に分離可能であるので、例１に記載された戦略を使用した。全ての場合において、ＶＥＧＦＲ２活性化の誘導を排除するために、例１に記載される変異を抗原調製物の投与から導入した。タンパク質変異体ＰＶＭ１４５、ＰＶＭ１６５、ＰＶＭ１８９、ＰＶＭ２０６を生成したタンパク質に対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６と命名した。

【0080】

記載されているようにベクターｐＭ２３８中で当該タンパク質変異体をクローニングした後、２つの戦略であるａ）Ｍｏｒｅｒａらによって記載されている方法（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００８：１１：３８１－９３）、及びｂ）例１に記載されている方法を使用してタンパク質を得た。２つの精製変異体のトリプシン消化に対する耐性を各アイソフォームについて比較した。消化物の分析は、分子排除クロマトグラフィによって行った。結果により、ＰＶＭ－Ｉについて記載されるように、ＶＥＧＦ－Ａアイソフォームの変異体が第２の精製戦略（ＰＶＭ１４５－Ｉ、ＰＶＭ１６５－Ｉ、ＰＶＭ１８９－Ｉ、ＰＶＭ２０６－Ｉ）に従って得られる場合、トリプシン消化に対する耐性が総タンパク質質量の５％未満で観察されることが示された。この耐性は、「システインノット」の二量体に対応するシグナルの存在下で反映され、これは、ジスルフィド架橋が自然界に存在する配置に従って確立された場合にのみ得られる（２３～２５分のシグナル）（表９）。したがって、タンパク質調製物が例１に記載される方法に従って得られる場合、タンパク質調製物は、表９に示されるように、Ｍｏｒｅｒａらによって記載される最初の方法で製造された対応物と比較して、トリプシンとのインキュベーションによって９５％超消化される。表３（例１）に詳述されている、標準的なシステインノットが存在しないことを確認するペプチドまた、抗原調製物ＰＶＭ１４５－Ｉ、ＰＶＭ１６５－Ｉ、ＰＶＭ１８９－Ｉ、ＰＶＭ２０６－Ｉのトリプシンによる消化についてＥＳＩ－ＭＳ／Ｓによって確認され、調製物ＰＶＭ１４５、ＰＶＭ１６５、ＰＶＭ１８９、ＰＶＭ２０６では検出することができなかった。

【0081】

フロイントアジュバント中のこれらの変異体の免疫原性の比較分析を、例１に記載したように行った。この研究により、その変異体ＰＶＭ１４５、ＰＶＭ１６５、ＰＶＭ１８９、ＰＶＭ２０６と比較した場合、トリプシン消化に対する耐性が低い変異体（ＰＶＭ１４５－Ｉ、ＰＶＭ１６５－Ｉ、ＰＶＭ１８９－Ｉ、ＰＶＭ２０６－Ｉ）で処置した動物の血清による、ＶＥＧＦ－ＡのＶＥＧＦＲ２への結合の優れた中和が示された（表９）。

【表9】

【0082】

これらのタンパク質を、皮下経路によって１００００個のＣＴ２６細胞でチャレンジしたＢＡＬＢ／ｃ動物における、例５に記載されるものと同様の免疫化及び用量スケジュールで使用した。結果により、腫瘍接種の２８日後、アジュバントｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰと共に抗原変異体を使用すると、調製物ＰＶＭ１４５、ＰＶＭ１６５、ＰＶＭ１８９、ＰＶＭ２０６と比較して、変異体ＰＶＭ１４５－Ｉ、ＰＶＭ１６５－Ｉ、ＰＶＭ１８９－Ｉ、ＰＶＭ２０６－Ｉの場合に優れた抗腫瘍効果が誘導されることが示された（表１０）。

【表10】

【0083】

使用されるＶＥＧＦ－Ａアイソフォームにかかわらず、トリプシンによる消化に対する耐性を示さない変異体は、最も高い免疫原性及び抗腫瘍効果を有する変異体であることが観察された。

【0084】

例７．トリプシン感受性変異体の酸化及び選択を用いたＰＶＭ－Ｉの調製。
複数のジスルフィド結合の形成により、いくつかの立体配座がＰＶＭ－Ｉタンパク質調製物に共存する。これらは、酸化剤の存在下で、制御された変性及び再生工程を含む、例１に既に記載されているものとは異なる方法によって得られ、分離することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＶＥＧＦ－Ａのより小さなアイソフォーム（配列番号２）については、封入体を６Ｍ塩化グアニジウムに可溶化し、この変性剤の存在下で、製造業者の推奨事項（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してニッケルに対する親和性によってタンパク質を精製した。次いで、溶出結果を、分取Ｃ１８カラムで、緩衝液が（Ａ）水中トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．０８８％ｖ／ｖ）と（Ｂ）水中０．０８４％ＴＦＡ、９０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）との間の直線勾配によって、逆相クロマトグラフィ（ＲＰ）で分離した。目的のタンパク質が溶出した画分では、タンパク質調製物の変性及び還元状態と一致して、予想通りトリプシンによる消化に対する耐性は観察されなかった。次いで、タンパク質を、塩化グアニジウム及びβ－メルカプトエタノール（０．２ｍＭ）の存在下又は非存在下、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．６中で、２２℃で２０時間、酸化的再天然化プロセスに供した。緩衝液を１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．４に変更した後、Ｇ２５セファロースでのサイズ排除クロマトグラフィにより、ジスルフィド架橋の形成を評価した。例１に記載するように、２００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中、５０：１の比（タンパク質：トリプシン）で、トリプシンを用いて１６時間消化することによって、「システインノット」の形成を分析した。これによれば、塩化グアニジウムの非存在下での再天然化タンパク質は、９０％の消化抵抗性を示したが（ＰＶＭ－ＩＡ）、変性剤の存在下での再天然化は、異なるパーセンテージの消化抵抗性をもたらし、これは塩化グアニジウムのモル濃度の増加と共に減少した。

【0085】

６Ｍ塩化グアニジウムを使用した場合、トリプシン消化に耐えられないフラクションが最も多く得られ、いずれもＰＶＭ－ＩＯと呼ばれた。これらの画分をＣ１８分取カラムでＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラフィで分離した。合計１５個の画分を分離し、これをＲＰクロマトグラフィ（Ｆ１～Ｆ１５、表１１）における溶出順序に従って番号付けした。

【0086】

１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．４に緩衝液交換した後、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた研究において、ＰＶＭ－ＩＡ、ＰＶＭ－ＩＯ調製物、及び後者の画分をＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉと比較した。タンパク質の投与は、１００μｇのｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ中に２００μｇのタンパク質調製物の割合で、１週間間隔で８回投与する従来のスキームで評価した。表１１は、マウスＶＥＧＦ－Ａに対する特異的ＩｇＧの力価、ＶＥＧＦＲ２へのその結合の阻害、リンパ節及び脾臓の両方における細胞傷害性細胞応答の誘導、並びに皮下ＣＴ２６腫瘍成長に対する免疫化の効果を比較分析した結果を示す。

【表11】

【0087】

表１１は、ＰＶＭ調製物と比較して、ＰＶＭ－Ｉ調製物の優れた効果を示し、これはフロイントアジュバントにおける例１に示す結果を裏付けている。この研究は、既に記載された免疫に対する効果、並びに効果的な体液性及び細胞性応答の誘導に直接関係する抗腫瘍効果を説明する。還元剤の非存在下での再天然化タンパク質調製物（ＰＶＭ－ＩＡ）の分析の結果は、ＰＶＭ－Ｉよりも、更にはＰＶＭよりも７～１０倍免疫原性が低く、抗腫瘍効果が低いことを示している。しかし、６Ｍ塩化グアニジウムの存在下での再天然化調製物（ＰＶＭ－ＩＯ）の使用により、ＰＶＭ－Ｉについて記載されたものと有意に異ならない結果が得られる。更に、ＰＶＭ－ＩＯ調製物の画分の評価は、これらの少なくとも１２個（Ｆ４～Ｆ１５）が、特異的な体液性及び細胞性免疫応答の誘導、並びに抗腫瘍応答の生成において等能であることを示す。

【0088】

エドマン分解（Ｍａｒｔｉ，Ｔ．，Ｒｏｓｓｅｌｅｔ，ＳＪ，Ｔｉｔａｎｉ，Ｋ．，ａｎｄＷａｌｓｈ，ＫＡ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６，８０９９－８１０９）を伴う、例１に記載されているように開発されたトリプシン消化及び質量分析によるこれらの画分の分析により、画分Ｆ４～Ｆ１５において、システインノットの標準的な構造のシステイン２及び４が分子内架橋を形成していることが見出され、一方、画分Ｆ１～Ｆ３の場合、Ｃ２－Ｃ２、Ｃ４－Ｃ４、Ｃ２－Ｃ４、Ｃ２－Ｃ９、及びＣ４－Ｃ９のいずれかの分子間結合が検出されることを確認することができた。

【0089】

システインが画分Ｆ４～Ｆ１５に関与する結合の順序は、以下に詳述するように、配列番号１８～配列番号２３として配列表で同定されたポリペプチドに対応する。
－Ｆ４は、配列番号１８に対応し、ここで、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）、２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン（１６３位）、及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステイン（１７５位）は分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ５は、配列番号１８に対応し、ここで、ポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）と別のポリペプチド鎖第８のシステイン（１６３位）及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステインは分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ６は、配列番号１９に対応し、ここで、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）、２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン（１６３位）、及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステイン（１７５位）は分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ７は、配列番号１９に対応し、ここで、ポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）と別のポリペプチド鎖第８のシステイン（１６３位）及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステインは分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ８は、配列番号２０に対応し、ここで、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）、２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン（１６３位）、及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステイン（１７５位）は分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ９は、配列番号２０に対応し、ここで、ポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）と別のポリペプチド鎖第８のシステイン（１６３位）及び２つのポリペプチド鎖の最後のシステインは分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ１０は、配列番号２１に対応し、ここで、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）及び２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン（１６３位）は分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ１１は、配列番号２１に対応し、ここで、ポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）が別のポリペプチド鎖の第８のシステイン（１６３位）と連結して分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ１２は、配列番号２２に対応し、ここで、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）及び２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン（１６３位）は連結して分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ１３は、配列番号２２に対応し、ここで、ポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）が別のポリペプチド鎖の第８のシステイン（１６３位）と連結して分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ１４は、配列番号２３に対応し、ここで、２つのポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）及び２つのポリペプチド鎖の第８のシステイン（１６３位）は連結して分子間ジスルフィド架橋を形成している。
－Ｆ１５は、配列番号２３に対応し、ここで、ポリペプチド鎖の第７のシステイン（１６１位）が別のポリペプチド鎖の第８のシステイン（１６３位）と連結して分子間ジスルフィド架橋を形成している。

【0090】

例８．免疫原性構造の生成におけるシステイン２及び４の関連性の分析。
例１、９及び１０に記載される結果から、ＰＶＭ－Ｉのより免疫原性の高い構造に共通する特徴は、ＶＥＧＦ－Ａの分子内結合が一次配列のシステイン２及び４（ＰＶＭ－ＩのＣｙｓ１１０及びＣｙｓ１１９）を含むことであることが見出された。これらの残基は、タンパク質の二量体凝集を回避するので、ＶＥＧＦ－Ａを得るために検討された研究では高頻度で変異しているようである（Ｊｉａｎｇ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０：４９：６５５０－６、Ｗｅｎｔｉｎｋ，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１６：１１３：１２５３２－７）。天然の立体配座では、これらは、ＶＥＧＦ－Ａ二量体を生成するための鎖間架橋を形成するアミノ酸である。Ｂｅｑｕｅｔ－Ｒｏｍｅｒｏら及びＭｏｒｅｒａらによる以前の研究のみ、これらのシステインを含むＶＥＧＦ－Ａの一次配列変異体を使用するが、これらのいずれにおいても、観察された配列のシステイン２とシステイン４との間の鎖内ジスルフィド結合の形成はない。抗原を生成するために使用される配列中のこれらのアミノ酸の存在及び言及されるシステインが鎖内結合のみを形成するようにそれらが得られるプロセスは、ワクチン接種目的のためにタンパク質を得るための新規なアプローチを構成する。抗原調製物の免疫原性に対するこれらの残基の関連性をより良好に特性決定するために、本発明者らは、一次配列にシステインからアラニンへの以下の変化を含む変異体を（部位特異的変異誘発によって）得ることを進めた。
ａ）ＰＶＭ－Ｉ^{Ａｌａ１１０}：Ａｌａ１１０によるＣｙｓ１１０の変化
ｂ）ＰＶＭ－Ｉ^{Ａｌａ１１９}：Ａｌａ１１９によるＣｙｓ１１９の変化
ｃ）ＰＶＭ－Ｉ^{Ａｌａ１１０、１１９}：Ａｌａ１１０によるＣｙｓ１１０及びＡｌａ１１９によるＣｙｓ１１９の変化

【0091】

この目的のために、表１２に示されるオリゴヌクレオチド対を使用して、（Ｂｅｑｕｅｔ－Ｒｏｍｅｒｏ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００７：１０：２３－３４））に記載されるように、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって変異を導入した。簡単に説明すると、配列番号２をコードする配列を含むプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ１及び２を行った。ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）及び表１２に示すオリゴヌクレオチドの混合物を使用した。各反応における増幅されたＤＮＡを、反応鋳型からアガロースゲルで分離した後に精製した。得られた２本のＤＮＡ鎖を、表１２に記載の各分子のＰＣＲ３の鋳型として使用した。２５サイクルのＰＣＲを実施し、得られたＤＮＡをアガロースゲルで分離した後、製造業者の指示に従って酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。消化したＤＮＡを、記載されているように（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００８：１１：３８１－９３）、ベクターｐＭ２３８にクローニングした。得られたＤＮＡの自動配列決定により、導入された変異を検証した。これらの変異タンパク質をコードするＤＮＡをＢＬ２１株（ＤＥ３）に形質転換し、ＰＶＭ－Ｉについて例１に記載の方法に従ってポリペプチドを産生した。配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７の配列に対応するポリペプチドにより、調製物ＰＶＭ－Ｉ^{Ａｌａ１１０}、ＰＶＭ－Ｉ^{Ａｌａ１１９}及びＰＶＭ－Ｉ^{Ａｌａ１１０、１１９}が得られる。

【表12】

【0092】

システイン１１０及び１１９に変異を有するタンパク質を含有する調製物を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける研究においてＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉと比較し、それらの投与を、１００μｇのアジュバントｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ中に２００μｇの抗原調製物の割合で、１週間間隔で分離した８回の投与のスキームで評価した。比較試験は、皮下ＣＴ２６結腸癌モデルにおいて、１群あたり１０匹の動物を用いて実施した。表１３は、ＰＶＭと比較してＰＶＭ－Ｉ調製物の優れた免疫原性を示し、これは例１に示す結果を裏付けている。システイン１１０及び１１９における変異体のタンパク質調製物の分析の結果により、それらがＰＶＭ－Ｉ、更にはＰＶＭよりも約２倍免疫原性が低く、抗腫瘍効果が低いことが示された。

【表13】

【0093】

例９．マウスの肺転移の治療における抗原調製物ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉの前臨床使用の比較評価。
転移は、あらゆる起源のがんによる根本的な死因である。これらのうち、肺にあるものは、患者が引き起こす呼吸器合併症、腫瘍による肺組織の置き換わり、及び胸水の蓄積に起因して、患者の死亡に至ることが最も多い疾患である。肺における転移は、ＶＥＧＦ－Ａ受容体を伝達するリガンド又はシグナルサプレッサーを除去する薬剤の単回投与に基づく抗血管新生介入にとって、最も抵抗性の高い状況の１つを構成する。これに関連して、免疫応答の細胞分枝をワクチンによる免疫化に対する応答の武器に組み込むことが、決定的な役割を果たす可能性がある。

【0094】

分析中のワクチン調製物の有効性を評価するために、マウスの肺転移の治療について、１２匹のマウスの群をこれらの調製物で免疫し、腫瘍チャレンジを全てのモデルの要件に従って実施した。アジュバントとしてのｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰによる免疫化の結果を、３つの転移モデルについて以下に記載する。動物を、対応する抗原１００μｇ及びアジュバント１００μｇを含有する総体積２００μＬの週に１回の用量で８週間皮下免疫した。

【0095】

マウスＣ５７Ｂｌ／６株における研究のために、３ＬＬ転移性肺癌（クローンＤ１２２）の２５０，０００個の細胞を、４回目の免疫の３日後に足蹠に接種した。原発腫瘍を移植の２０日後に手術によって除去し、動物を１５日後に屠殺して肺転移を計数し特性決定した。転移負荷の分析は、肺の重量及び巨大転移の数を評価することによって評価した。有糸分裂指数研究は、動物あたり、一切断あたり１０視野で、視野あたりの有糸分裂数を測定することによって行った。同様に、アポトーシスの数値を視野ごとに定量し、有糸分裂／アポトーシス比を計算した。

【0096】

表１４は、処置に供した動物の肺重量の比較を示す。両抗原間で差次的な効果が観察され、天然ＶＥＧＦ－Ａに存在するジスルフィド結合を完全に欠く構造異性体のファミリーが豊富な抗原調製物ＰＶＭ－Ｉが有利であった。ヘマトキシリン－エオシン染色を使用した転移性病変の組織病理学的特性決定、及び連続切片の分析により、ＶＥＧＦ－Ａに対する特異的免疫応答もまた、転移巣で観察される有糸分裂／アポトーシスのバランスの有意な減少につながることが示された。

【表14】

【0097】

マウス系統ＢＡＬＢ／ｃでは、２０，０００個のＣＴ２６がん細胞の静脈内接種後に実験的肺転移の確立を評価した。４回目の免疫の３日後に、後眼窩神経叢を通して抗原刺激を行った。腫瘍チャレンジの３０日後に動物を屠殺し、肺組織の連続切片の組織病理学的分析において、肺における腫瘍負荷量、並びに形態、細胞密度、血管新生及び有糸分裂／アポトーシスのバランスを評価した。表１５に示すように、分析した切片（動物あたり１０個）において、転移の数及び占める面積の両方が、ＰＶＭによる免疫化によって減少する。最も有意な効果は、ＰＶＭ－Ｉ調製物で免疫した場合に観察された（ｐ＜０．０５、ダネットの事後検定）。興味深いことに、有糸分裂指数（１視野あたりの有糸分裂数）は、このモデルによって引き起こされる肺の転移性病変について非常に高く、ワクチン調製物を投与した場合に約４倍減少した。以前の分析と同様に、抗原変異体ＰＶＭ－Ｉで処置した群で最良の効果が観察された。

【表15】

【0098】

ＢＡＬＢ／ｃマウス系統では、自発的に肺に転移するＦ３ＩＩ転移性乳癌モデルも評価した。この場合、２週に１回のスキームの使用が含まれ、追加の群としてリン酸アルミニウムアジュバントを使用した。４回目の免疫（ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ存在下）又は２回目の免疫（リン酸アルミニウム存在下）の３日後に、１００μＬのＤＭＥＭ培養培地中、合計２０００００個の細胞を皮下接種した。

【0099】

表１６は、腫瘍移植の２８日後の原発腫瘍の重量の分析を示す。両方の抗原変異体による動物の処置、並びにアジュバント及び投与スキームの両方における動物の処置は、腫瘍成長を有意に減少させるが、より有意な阻害を示すのは抗原調製物ＰＶＭ－Ｉである（ｐ＜０．０５、ダネットの事後検定）。同じ表は、肺の巨大転移数の結果を示す。見て分かるように、腫瘍成長が減少することで、移植される転移の数も有意に減少する。更に、これらの研究では、有糸分裂／アポトーシスのバランスの減少が観察され、転移病変に関連する壊死巣の数の増加が検出された。これらの効果は全て、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉで処置した群においてより有意に検出される。

【表16】

【0100】

全体として、結果により、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉが原発腫瘍の転移能及び肺における転移細胞の移植能力を低下させるのにより有効であることが示された。更に、転移表現型の変化において、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉによるワクチン接種の優れた効果が観察され、有糸分裂／アポトーシスバランスの低下、壊死のより高い発生率、及び血管新生の有意な減少を伴う細胞病巣が観察された。

【0101】

例１０。腫瘍誘導免疫抑制に対する抗原調製物ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉによる免疫化の効果。
ＢＡＬＢ／ｃ株の１５匹の動物群を使用し、これを以下の変異体で皮下免疫した。
１．ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ中のＰＶＭ（８回の免疫、週に１回の頻度）
２．ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ中のＰＶＭ－Ｉ（８回の免疫、週に１回の頻度）
３．ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（８回の免疫、週に１回の頻度）
４．リン酸アルミニウム中のＰＶＭ（４回の免疫、２週に１回の頻度）
５．リン酸アルミニウム中のＰＶＭ－Ｉ（４回の免疫、２週に１回の頻度）
６．リン酸アルミニウム（４回の免疫、２週に１回の頻度）

【0102】

全ての場合において、免疫化を、総体積２００μＬで皮下的に行った。最後の免疫化の３日後、１群あたり５匹の動物をランダムに選択し、安楽死させて、それらの免疫学的状態及び実験対照の免疫学的状態を分析した（群３及び６）。この評価は、全血試料、脾臓細胞、リンパ節及び骨髄において、フローサイトメトリーによって行った。

【0103】

各群の残りの動物には、右側腹部に２００００個のＣＴ２６結腸癌細胞を皮下投与した。腫瘍細胞の注射の１４及び２１日後、１群あたり５匹のマウスを安楽死させ、評価したが、この場合は、解離した腫瘍組織の分析を追加した。

【0104】

肉眼レベルでの毒性事象の発生はいずれの動物についても証明されず、組織病理学的分析は、最後の免疫化の７日後に分析した器官のいずれにおいても損傷の存在を明らかにしなかった。免疫学的評価は、（１）マウスＶＥＧＦ－Ａの血清濃度の分析、（２）全血、原発腫瘍を排出するリンパ節及び腫瘍自体のＴリンパ球の濃度の評価、（３）変異型ＶＥＧＦ－Ａの代表的抗原に曝露した場合の腫瘍内リンパ球によるＩＦＮ－γ分泌の研究からなった。

【0105】

非処置動物では、マウスＶＥＧＦ－Ａレベルは、腫瘍サイズの増加と一致して腫瘍への曝露時間と共に増加する。抗原変異体で免疫した群では、ＶＥＧＦ－Ａレベルの有意な低下（ｐ＜０．００１ＡＮＯＶＡ、ダネットの事後検定）が観察され、腫瘍チャレンジ後３０日間も持続した（表１７）。腫瘍コンパートメントに向かっても、同様の現象が観察された。

【表17】

【0106】

各時点での屠殺した動物の免疫系の状態を、Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら（ＧａｂｒｉｌｏｖｉｃｈＤｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ１９９８，９２：４１５０）によって報告されているように、リンパ節及び腫瘍自体に存在する細胞集団の割合の研究を通して分析した。これらの研究では、フルオレセインイソチオシアナート、フィコエリトリン、及びフィコエリトリン－Ｃｙ７で標識した、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８に対するモノクローナル抗体を使用し、フローサイトメーター（ＳｙｓｍｅｘＰａｒｔｅｃ）を使用して細胞集団を可視化した。得られた結果を表１８に示す。

【表18】

【0107】

腫瘍チャレンジの１４日後の動物におけるリンパ系細胞集団の分析により、ワクチン調製物の投与に直接関係する、３つの分析されたコンパートメントにおけるＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞コンパートメントの増加が示された。抗原変異体ＰＶＭ－Ｉでは、これらの免疫系細胞の濃度が有意に高くなった（試験後、ｐ＜０．０５ボンフェローニ）。更に、皮下腫瘍に浸潤したＣＤ８Ｔリンパ球におけるＰＤ１マーカの研究により、これらの増加が、抗原で処置された動物において、ＰＶＭ－Ｉ抗原を受けた場合により高いパーセンテージで、陰性ＰＤ１表現型と関連することが示された（表１８）。ＣＤ４及びＣＤ８細胞の浸潤物の増加は、腫瘍量の減少と正に有意に関連していた（ｒ＝０．７１４７、ｐ＜０．００２）。

【0108】

腫瘍由来の白血球を、ＣＤ４５に特異的な抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）でコーティングされた磁気ビーズを使用してカラムでの陽性選択プロセスによって単離し、ＩＦＮ－γ分泌を、ＥＬＩＳＰＯＴタイプシステム（ＭＡＢＴＥＣＨ）を使用して、培地中で変異したＶＥＧＦ－Ａの添加に応答して評価した。抗原をワクチン接種した動物の場合にのみ、このサイトカインの分泌の増加が観察され、ＰＶＭ－Ｉ抗原を投与された群では両方のアジュバントについてより高かった（ｐ＜０．０５、試験後のボンフェローニ）（表１９）。これは、細胞浸潤が増加しただけでなく、これらの浸潤白血球がワクチン調製物の投与に関連してより高い活性を有することが示された。

【表19】

【0109】

例１１．別の抗原チャレンジに対して生成される免疫原性に対するＰＶＭ－Ｉによる免疫化のアジュバント効果の評価。
免疫回復の可能性を考慮して、ＰＶＭ－Ｉによる免疫化が、ＶＥＧＦ－Ａだけでなく無関係な抗原にも特異的な体液性及び細胞性応答の増加を伴うアジュバント効果を誘導し得るかどうかを調べた。この潜在的な効果は、腫瘍中に存在する抗原及びワクチンと同時投与された抗原に対する特異的免疫の程度を評価することによって試験した。

【0110】

卵巣腫瘍モデルＩＤ８－ＯＶＡを、インビトロ溶解試験におけるＣ５７Ｂｌ／６動物及び親系統ＩＤ８の腫瘍チャレンジに使用した。動物（ｎ＝１０／群）に、以下に記載されるように、２５０万個の細胞の腫瘍チャレンジを腹腔内投与し、３日後に免疫化スケジュールを開始した。
ａ）ＰＶＭ－Ｉ（２００μｇ）、ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（１００μｇ）：８週間にわたって週に１回皮下投与
ｂ）ＯＶＡ（１ｍｇ）、ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（１００μｇ）：２週間にわたって週に１回皮下投与。ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（１００μｇ）：残り６週間にわたって週に１回皮下投与
ｃ）ＰＶＭ－Ｉ（２００μｇ）、ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（１００μｇ）、ＯＶＡ（１ｍｇ）：２週間にわたって週に１回皮下投与、及びＰＶＭ－Ｉ（２００μｇ）、ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（１００μｇ）：残りの６週間にわたって週に１回皮下投与。
ｄ）ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（１００μｇ）：８週間にわたって週に１回皮下投与
ｅ）ＯＶＡ（１ｍｇ）：２週間にわたって毎週皮下投与。ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（１００μｇ）：残りの６週間にわたって週に１回皮下投与。

【0111】

８回目の免疫化の１週間後、及び腫瘍移植の６０日後、動物を安楽死させた。この腫瘍モデルでは、動物の体重は腫瘍の成長と相関する。表２０は、観察された抗腫瘍効果を示し、これは、ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ中のＰＶＭ－Ｉの存在下でＯＶＡを投与することによって協調的に増加する。

【0112】

ＶＥＧＦ－Ａ及びＯＶＡについての体液性応答の分析は、例１、２及び３に記載されているように、採取した血清中のＥＬＩＳＡ型システムを使用して行った。特異的細胞応答を、特異的細胞溶解試験腫瘍を使用して、脾臓細胞とＩＤ８及びＩＤ８－ＯＶＡ腫瘍細胞株とのインビトロ共インキュベーションによって分析した（例４に記載）。更に、７２時間の特異的刺激（ペプチドＯＶＡ_{２５７－２６４}又はＶＥＧ_{ＦＫＤＲ－}）の添加に応答して、免疫化動物から単離した脾臓細胞の上清中のＩＦＮ－γの分泌を調べた。後者の場合、ＥＬＩＳＡ型アッセイを、製造者の説明書（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に従ってＩＦＮ－γの検出のために使用した。結果を表２０及び２１に要約する。

【表20】

【表21】

【0113】

体液性（表２０）及び細胞性（表２１）応答は、ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰの状況で投与した場合、両方の抗原に対して誘導される。ＯＶＡとＰＶＭ－Ｉを含む免疫療法との同時投与は、免疫原としてＯＶＡを投与された動物だけでなく、ＰＶＭ－Ｉのみを投与された動物においても、ＯＶＡに対する特異的応答の有意な増加をもたらす。この事実は、この抗原調製物を用いたワクチン戦略が、ワクチン調製物内には見られないが腫瘍によって発現される抗原に対して増幅された応答を誘導する可能性を示している。両方の抗原で処置した群における体液性応答、並びにＩＦＮ－γ分泌及びＩＤ８－ＯＶＡ細胞溶解は、併用が相加的効果を有するだけでなく、優れた効果を誘導する協調があることを示している。この要素は、他の腫瘍関連抗原に対する免疫応答を増加させる際にこの戦略を使用する可能性を示している。

【0114】

例１２．２つのアジュバント中のＰＶＭ又はＰＶＭ－Ｉによる免疫化によるコラーゲン誘導性関節炎モデルにおけるインビボ保護実験。
コラーゲン誘導性関節炎にかかりやすい２０匹のＤＢＡ／１マウス（Ｈ－２ｑハプロタイプ）の群を免疫した。リン酸アルミニウム又はｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ中にアジュバント化された試験抗原調製物（ＰＶＭ又はＰＶＭ－Ｉ）を動物に投与した。ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰの場合、１００μｇの抗原及び１００μｇのアジュバントを週に１回の間隔で８回投与するスキームを使用し、リン酸アルミニウムの場合、０．７ｍｇ当量のＡｌ^３＋中の１００μｇの抗原を２週に１回で４回投与した。処置群を以下のように定義した。
Ｉ．ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ注のＰＶＭ
ＩＩ．ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ注のＰＶＭ－Ｉ
ＩＩＩ．ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ
ＩＶ．リン酸アルミニウム中のＰＶＭ
Ｖ．リン酸アルミニウム中のＰＶＭ－Ｉ
ＶＩ．リン酸アルミニウム

【0115】

ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰによる４回目の免疫又はリン酸アルミニウムによる２回目の免疫の３日後に、以前に記載されたモデル（ＣａｍｐｂｅｌｌＩＫｅｔａｌＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１５６８，２０００）に従って、ニワトリコラーゲンＩＩ（Ｓｉｇｍａ）による免疫による自己免疫性関節炎の誘導を開始した。この免疫化を２６日目に繰り返して、自己免疫応答の誘導を完了させた。マウスの４つの脚を、各脚について０～３のスコアを確立する関節炎指数に従って、検査における紅斑（１）、炎症（２）又は関節硬直（３）の徴候の存在について毎日評価し、最大値は１２であった。マウスは、誘導後２３日で関節炎の発症の臨床症状を示し始め、５０日で最大発生率に達した。表２２は、異なる実験群の動物における関節炎の発生率の分析を示す。４０日目及び５５日目に、対応するアジュバント中にプラセボを投与した対照群ＩＩＩ及びＶＩと比較して、ワクチン接種群（Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、及びＶ）で関節炎の発生率の有意な減少が観察された。

【表22】

【0116】

例１３．非ヒト霊長類におけるＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉの免疫原性の評価並びに実験的レーザ誘導脈絡膜新生血管に対する免疫化の効果の分析。
抗原調製物ＰＶＭ及びＰＶＭ－Ｉが関連する免疫応答を誘導する能力を、より自己的な状況で、非ヒト霊長類（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓａｅｔｈｉｏｐｓｓａｂａｅｕｓ）において評価した。１群あたり４匹の動物を使用した。４００μｇの抗原調製物ＰＶＭ又はＰＶＭ－Ｉを、２００μｇのＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ又は０．７ｍｇのリン酸アルミニウムの形態のＡｌ^３＋当量で投与した。投与スケジュールは、ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰの場合は週に１回で８回、リン酸アルミニウムの場合は２週に１回で４回とした。ＶＥＧＦ－Ａに対する特異的ＩｇＧ抗体力価、及び２型受容体への結合の中和を、免疫化８週目（ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ）又は免疫化４週目（リン酸アルミニウム）に評価した。結果を表２３に示す。図から分かるように、両方の抗原調製物はＶＥＧＦ－Ａに対する特異的力価の誘導をもたらし、ＰＶＭ－Ｉで誘導されたものは両方のアジュバントにおいてより高かった。これらの力価は、同様に、血清の中和能の増加と相関していた。

【表23】

【0117】

体液性応答の誘導と並行して、細胞性応答の活性化が達成される程度を評価するために、従来の遅延型皮膚反応（ＤＴＨ）試験を、記載されるように行った（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１０：２８：３４５３－６１）。４８時間で、デジタルバーニアキャリパーを用いて硬結の２回の垂直測定を行った。病変の面積を計算し、それらの幾何平均を報告した。紅斑又は炎症は、この反応の一部とはみなされなかった。直径０．５ｍｍを検出可能な反応の限界とみなした。結果は、以下の条件、（＋＋）＞５ｍｍ^２、（＋）＝０．５～４．９９ｍｍ^２、（－）反応が検出できないに従って表された。その結果を表２４に示す。更に、感作点で６ｍｍ^２のパンチ（動物１匹あたり６つ）を作製し、ヘマトキシリン／エオシン染色試験によって分析した。各生検からの少なくとも２つの切片を分析して、単核細胞、好中球又は好酸球の存在に関して、浸潤物の性質を決定した。

【0118】

抗原の皮内注射は十分に忍容され、水疱又は潰瘍などの有害事象はなかった。ワクチン調製物で処置した全ての群のサルは、アジュバントとの異なる組み合わせで、ヒトＶＥＧＦ－Ａに対して反応した。生理食塩水を注射した部位では、対照として、免疫群のいずれにおいても反応は報告されなかった。組織病理学的評価により、ＶＥＧＦ－Ａ接種に対する強いＤＴＨ型反応の存在が裏付けられた。ヒトＶＥＧＦ－Ａの注射部位から得られた生検は、マクロファージ及びリンパ球の豊富な浸潤を伴うＤＴＨシーンと一致していた。

【表24】

【0119】

免疫化動物由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、以前に報告されたようにＦｉｃｏｌｌ勾配によって単離し、ＶＭと共に予めインキュベートし、ＣＦＳＥでマークされた同系細胞の特異的細胞溶解について分析した。表２５は、フローサイトメトリーによる、ＣＦＳＥで標識した「帯電」細胞の生存の分析に対応する結果を示す。動物あたり少なくとも３回の反復の分析により、誘導期間に対応する最後の免疫化後の週に、ワクチン調製物が、細胞傷害能を有する抗原に対する特異的細胞免疫を誘導することが示された。見て分かるように、両方のアジュバントにおいて、ワクチンの効果は、ＰＶＭ－Ｉ抗原を使用した場合に有意に大きかった（Ｐ＜０．０５、ダネット）。

【表25】

【0120】

これらの動物では、非ヒト霊長類における実験的レーザ誘導性脈絡膜新生血管形成の予防も評価した。モデルとしては、Ｋｒｚｙｓｔｏｌｉｋら（ＫｒｚｙｓｔｏｌｉｋＭ．Ｇ．，ｅｔａｌ．２００６．ＡｃｔａＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ，１２０：３３８－３４６）によって報告されたものを使用した。実験群あたり４匹のサルを使用した。全ての手順について、塩酸ケタミン、マレイン酸アセプロマジン及び硫酸アトロピンの筋肉内注射を用いて動物を麻酔した。局所の塩酸プロパラカイン麻酔も使用した。最後の免疫化の１週間後、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の形成が、アルゴンレーザによる熱傷で黄斑部において誘導された。写真撮影及び蛍光血管造影を使用して、病変の程度を検出及び測定し、病変の特徴を評価した。ＣＮＶ病変の発生を、レーザ処置の前後並びにその後１５、２０及び２９日目に評価した。病変は、実験計画外の専門家によって、以下のスケールを使用して分析し、グレード１は過蛍光なし、グレード２は滲出を伴わない過蛍光、グレード３は初期又は中間通過の過蛍光及び後期漏出、グレード４は初期又は中期通過の過蛍光が非常に明るく、レーザスポットの縁を越えて広がる後期漏れを有する。任意の眼異常を含む動物の臨床状態を評価するために、動物を毎日観察した。

【0121】

レーザ処置に割り当てられた４つのグレードのうち、グレード４は臨床的に有意な漏出状態に相当する。病変は、レーザ処置領域を超えて成長したか、又はフルオレセインが血管を超えて著しく広がっているほど激しく漏出している新しい脈絡膜血管の存在を反映していると考えられる。プラセボ群におけるグレード４病変の平均数は、レーザ処置領域の４５．４％～５０．２％の範囲であった。対照群におけるグレード４病変の平均パーセンテージは、ＣＮＶのこの動物モデルを使用した他の著者によって報告されたものと同様であった。対照的に、ワクチン調製物で処置した全ての群は、使用したアジュバントにかかわらず、グレード４の病変が著しく減少又は完全に消失した。表２６は、処置群についての２９日目の全ての傷害の程度の分布パーセンテージを示す。興味深いことに、ワクチン調製物ＰＶＭ－Ｉの使用により、より高い階調の病変の顕著により大きな減少が得られることは（ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニ事後検定、ｐ＜０．０５）。

【表26】

【0122】

例１４．抗原調製物ＰＶＭ－Ｉ及びアジュバントから構成されるワクチンの投与によるヒトにおける固形腫瘍の処置。
この研究は、ヒトにおける腫瘍病理の状況において、関連する特異的免疫応答を誘導する新しい抗原調製物の可能性を評価することを目的とした。進行期の固形腫瘍を有し、他の治療選択肢がなく、投与開始前少なくとも４週間の他の治療がない期間を有する患者を選択した。（ａ）８週間にわたる週に１回の接種スキーム、その後１ヶ月に１回投与で、ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ中、又は（ｂ）２週に１回で４回の投与スケジュール、その後は月に１回投与で、アルミニウムのリン酸塩中、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉを８００μｇの用量で投与した。

【0123】

体液性及び細胞性免疫応答を、免疫スケジュールの開始前及び最後の免疫の１週間後の両方の場合に採取した血清及びＰＢＭＣにおいて評価した。ＶＥＧＦ－Ａに対する特異的抗体価、及びＶＥＧＦＲ２受容体との結合を中和する能力という２つの基本的なパラメータを血清で評価した。このパラメータは、２つのＥＬＩＳＡ型システムを使用して決定した（Ｍｏｒｅｒａ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１２：３０：３６８－７７、ＳａｎｃｈｅｚＲａｍｉｒｅｚ，ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，２０１６：３７：６３６－５８）。１：５００を超える力価及び１０％を超える中和パーセンテージを陽性結果と定義した。

【0124】

記載されるように（Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，ｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１４：３２：２２４１－５０）、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴによってＰＢＭＣ試料において細胞応答を評価した。低応答者は、ＩＦＮ－γ分泌が陽性であるクローンの数がＣＤ３陽性細胞１００万個あたり２９～３９個である患者と定義され、中応答者は、シグナル数が４０～７９個である患者、高応答者は、シグナル数が８０を超える患者と定義される。

【0125】

両方のアジュバントにおけるＰＶＭ－Ｉの投与により、特異的抗体（図４Ａ）、及び増殖因子とＶＥＧＦＲ２との相互作用を中和するそれらの能力（図４Ｂ）に関して、ＶＥＧＦ－Ａに対する特異的免疫応答の確立がもたらされた。この応答は、使用したアジュバントのいずれかで処置した患者の７０％で観察された。同様に、ヒトＶＥＧ－Ａの変異体（ＶＭ）による刺激に対するＰＢＭＣの応答性の有意な増加が観察された（図４Ｃ）。これらの結果により、新規抗原変異体ＰＶＭ－Ｉのヒトにおける使用がヒトＶＥＧＦ－Ａに対する特異的免疫応答を誘導することが示された。

【0126】

図５は、要約として、各アジュバントについて、全患者数とそのうちの何人がいずれかの検査で陽性を示したかを示したものである。対照として免疫前の値を使用した場合に、有意に高い結果を有する試験の数を考慮して、結果を層別化した。グラフ中、各患者には、ワクチン調製物の投与開始後に生存した月数も割り当てられている（２４ヶ月での分析）。これにより、特異的免疫応答が、別の腫瘍特異的処置の非存在下で、どの程度生存の増加に寄与するかを関連付けることが可能になる。より多数の陽性応答を有する患者では、生存が有意に増加したことが観察される（ｐ＜０．０５、カプラン・マイヤー）。

【0127】

例１５．ヒトの加齢黄斑変性の治療における抗原調製物ＰＶＭ－Ｉの臨床使用
この研究は、ヒトにおける加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の状況において、関連する特異的免疫応答を誘導する抗原調製物ＰＶＭ－Ｉの潜在性を評価することを目的とした。患者は、硝子体内経路で、５０μＬ中１２５μｇのベバシズマブを月１回、３ヶ月連続で投与された。診断後の最初の３ヶ月間の本剤又はアフリベルセプト、ラニビズマブ若しくはラムシルマブなどの他の抗血管新生薬の投与は、この疾患の初期制御のための従来の治療として確立されているものである。これらの投与後、患者は、視力検査及び網膜の構造の表現型変異に体系的に注意し、これらの変化に応じて、抗血管新生薬の新たな硝子体内注射の適応となるか否かが判断される。治療の成功は、硝子体内投与の必要性の減少によって大きく決定される。

【0128】

この処置は、抗原調製物ＰＶＭ－Ｉと同時又は非同時に、４００μｇの用量で、（群２）ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ存在下で週１回のスケジュールで８週間の投与、その後は月１回の再投与、又は（群３）リン酸アルミニウム存在下で２週に１回で４回の投与、その後の月に１回投与で実施された。群１は、３ヶ月連続して毎月投与することからなる従来の処置のみを受けた。ベバシズマブの最初の３回の投与後、患者は、以前の眼科的分析と比較した場合、病変が悪化した場合にのみベバシズマブが再投与された。この悪化は、視力低下、網膜厚の増加、網膜内液の存在、又は網膜下液の増加（２００μｍ超又は前回の診察時の値）として定義された。

【0129】

抗原調製物を示されたアジュバント及びレジメンで投与することにより、患者の視力の質及び黄斑の完全性を維持又は改善するために必要なベバシズマブの硝子体内注射の回数を有意に減少させた。表２７は、要約として、ベバシズマブの３回目の投与後に必要となった患者あたりのベバシズマブ注射の数と、免疫を誘導するＶＥＧＦ－Ａに対する特異的抗体力価とを示す。抗原調製物ＰＶＭ－Ｉによる免疫療法の使用により、従来のスキーム（群１）と比較して、患者に適用されるバシズマブの硝子体内注射の回数が有意に減少する（両方の場合でｐ＜０．０５、ダネットの検定）。両方の場合において、群２は４回目の免疫の１週間後（ピアソンｒ＝－０．８７８８、ｐ＝０．０００８）、及び群３は８回目の免疫後から（ピアソンｒ＝－０．７８９４、ｐ＝０．００６６）、硝子体内投与回数の減少と患者の血清中のヒトＶＥＧＦ－Ａの特異的抗体のレベルとの間に有意な相関が観察された。

【表27】

【0130】

研究に含まれた患者の約３０％が活動性の中心窩外ポリープを有していた。これは、従来の硝子体内投与療法に応答した患者の回復の予後を悪化させる要因である。これは、ポリープ状病変が網膜のより深い層に由来するためである。興味深いことに、脈絡膜ポリープ状血管新生を示した患者の分析では、処置を開始してから１年後に、活動性病変の数が有意に減少し、この効果は、従来の処置が行われた群の患者の２０％（５人に１人）ついてのみ認められた（表２８）。

【表28】

【配列表フリーテキスト】

【0131】

配列表１＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドをコードする核酸
配列表２＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチド
配列表３＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドアイソフォーム１４５
配列表４＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドアイソフォーム１６５
配列表５＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドアイソフォーム１８９
配列表６＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドアイソフォーム２０６
配列表７＜２２３＞人工配列の記載：オリゴヌクレオチド
配列表８＜２２３＞人工配列の記載：オリゴヌクレオチド
配列表９＜２２３＞人工配列の記載：オリゴヌクレオチド
配列表１０＜２２３＞人工配列の記載：オリゴヌクレオチド
配列表１１＜２２３＞人工配列の記載：オリゴヌクレオチド
配列表１２＜２２３＞人工配列の記載：オリゴヌクレオチド
配列表１３＜２２３＞人工配列の記載：オリゴヌクレオチド
配列表１４＜２２３＞人工配列の記載：オリゴヌクレオチド
配列表１５＜２２３＞人工配列の記載：Ｃｙｓ１１０がＡｌａに変更された変異ポリペプチド
配列表１６＜２２３＞人工配列の記載：Ｃｙｓ１１９がＡｌａに変更された変異ポリペプチド
配列表１７＜２２３＞人工配列の記載：Ｃｙｓ１１０及び１１９がＡｌａに変更された変異ポリペプチド
配列表１８＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドの再配列１
配列表１８＜２２３＞Ｃｙｓ１６１、Ｃｙｓ１６３及びＣｙｓ１７５は、分子間結合の一部である
配列表１９＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドの再配列２
配列表１９＜２２３＞Ｃｙｓ１６１、Ｃｙｓ１６３及びＣｙｓ１７５は、分子間結合の一部である
配列表２０＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドの再配列３
配列表２０＜２２３＞Ｃｙｓ１６１、Ｃｙｓ１６３及びＣｙｓ１７５は、分子間結合の一部である
配列表２１＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドの再配列４
配列表２１＜２２３＞Ｃｙｓ１６１及びＣｙｓ１６３は、分子間結合の一部である
配列表２２＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドの再配列５
配列表２２＜２２３＞Ｃｙｓ１６１及びＣｙｓ１６３は、分子間結合の一部である
配列表２３＜２２３＞人工配列の記載：変異ポリペプチドの再配列６
配列表２３＜２２３＞Ｃｙｓ１６１及びＣｙｓ１６３は、分子間結合の一部である

【図1】