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特表2023-508411血液試料からセルフリー核酸を抽出するための方法、自動化システムおよびカートリッジ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-02
(54)【発明の名称】血液試料からセルフリー核酸を抽出するための方法、自動化システムおよびカートリッジ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20230222BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20230222BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230222BHJP
C12M 1/26 20060101ALI20230222BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20230222BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z
C12N15/10 Z
C12M1/00 A
C12M1/26
C07K1/22
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022538992
(86)(22)【出願日】2020-12-23
(85)【翻訳文提出日】2022-08-09
(86)【国際出願番号】 FI2020050866
(87)【国際公開番号】W WO2021130415
(87)【国際公開日】2021-07-01
(31)【優先権主張番号】20196132
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522250574
【氏名又は名称】バイオプセンス オサケユキチュア
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＰＳＥＮＳＥ ＯＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】マリア ティーロラ
(72)【発明者】
【氏名】ユッシ ペンナネン
(72)【発明者】
【氏名】ヴェリ－ミッコ プッポネン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA09
4B029AA27
4B029BB15
4B029BB20
4B029CC01
4B029DG08
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4B029GA08
4B029GB10
4B029HA06
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4B063QQ42
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4H045AA20
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4H045CA40
4H045DA75
4H045EA50
4H045GA10
4H045GA20
(57)【要約】
本発明は、がんの診断、予後およびモニタリング、ならびに出生前スクリーニングを容易にするために、血液試料からセルフリー核酸断片を抽出する方法を対象とする。本発明は、血液試料から血漿を濾過し、好ましくは収率を改善するための細胞の固定および細胞のすすぎも行う第１区画と、核酸の分離を行う第２区画とを含むカートリッジであって、第１区画は中空繊維膜を含み、第２区画は核酸を結合するための物質または電気泳動用ゲルを含む、カートリッジを提供する。本発明は、カートリッジを受けるように適合されたドッキング部位を有する装置を含む自動化システムであって、装置は、カートリッジにおいて血漿濾過プロセスを操作するように適合された手段と、カートリッジにおいて核酸の分離を操作するように適合された手段とを含む、自動化システムを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血液試料から核酸断片を抽出するための方法であって、ａ）個人から採取した血液試料を提供するステップと、
ｂ）好ましくは固定試薬で試料中の血球を安定化させるステップと、
ｃ）前記血液試料から血漿を分離するために、中空繊維フィルタを用いることにより前記血液試料を濾過するステップと、
ｄ）好ましくはステップｃ）から得られた血球を含む画分を洗浄液で洗浄し、ウォッシュアウトを回収するステップと、
ｅ）血漿試料中に存在する核酸断片を精製するために、ステップｂ）で得られた血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを、核酸に特異的な結合物質と接触させるか、または代わりに前記血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを分離媒体中で電気泳動に付すステップであって、前記分離媒体は、核酸断片が媒体中で移動可能かつサイズにより前記媒体中で分離可能であるように調製されている、ステップと、
ｆ）前記結合物質に結合した、または前記分離媒体中を移動した核酸断片を回収するステップと、
ｇ）ステップｆ）で回収された核酸断片を保存剤または安定化剤と混合するステップと、を含み、
ステップｂ）～ｇ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、ステップｃ）で得られた血漿試料を核酸に特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジ上でで行われるか、または代わりに前記第２区画は電気泳動を行うための手段を含む、方法。
【請求項2】
ステップｅ）において、前記核酸断片と前記保存剤または安定化剤の得られた混合物は、着脱式容器に保存される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記混合物は前記結合物質に結合した核酸断片を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記核酸断片の長さは４００塩基対未満である、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。
【請求項5】
ステップａ）で得られた血液試料は、試料を濾過ステップｂ）に付す前に抗凝固剤と混合される、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記中空繊維フィルタは中空繊維膜である、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
【請求項7】
ステップｃ）において、血漿試料は核酸に特異的な結合物質と接触する、請求項１～６の何れか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記結合物質は磁性ビーズを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記結合物質に結合した核酸断片を核酸結合色素と接触させるステップと、回収された核酸断片の量を測定するステップとをさらに含む、請求項１～８の何れか一項に記載の方法。
【請求項10】
ステップｃ）における分離媒体は、核酸断片のサイズ選択媒体である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記分離媒体はアガロースゲル等の電気泳動用ゲルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ステップｂ）～ｅ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、電気泳動を行うための第２区画とを含むカートリッジ上で行われ、前記第２区画は電気泳動用ゲルを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、血漿試料を核酸に特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジであって、前記第１区画は中空繊維フィルタを含み、前記第２区画は核酸精製のためのチャンバを含み、前記カートリッジは、該カートリッジ内に封入された核酸に特異的な結合物質を含み、前記結合物質は好ましくは磁性ビーズを含む、カートリッジ。
【請求項14】
前記第１区画は血液試料を受ける手段を含む、請求項１３に記載のカートリッジ。
【請求項15】
前記第１区画は、前記血液試料を前記第１区画に封入された細胞固定試薬と混合する手段を含み、前記第１区画は、好ましくは前記血液試料から濾過された細胞を洗浄する手段を含み、洗浄バッファは好ましくは前記カートリッジに封入される、請求項１４に記載のカートリッジ。
【請求項16】
前記第１区画は、前記血液試料から中空繊維膜において分離された血漿試料を、前記第１区画に封入された酵素または化学試薬と混合する手段を含む、請求項１３～１５の何れか一項に記載のカートリッジ。
【請求項17】
前記第１区画は、前記酵素または化学試薬と混合された分離血漿を、前記第１区画から前記第２区画に移送する手段を含む、請求項１３～１６の何れか一項に記載のカートリッジ。
【請求項18】
前記カートリッジに封入された保存剤または安定化剤と、該保存剤または安定化剤を前記結合物質に結合した核酸断片と混合する手段と、前記核酸断片と前記保存剤または安定化剤の混合物を保存するための着脱式容器とを含む、請求項１３～１７の何れか一項に記載のカートリッジ。
【請求項19】
核酸結合色素が封入されている、請求項１３～１８の何れか一項に記載のカートリッジ。
【請求項20】
前記第２区画は、光学的手段により色素に結合した単離核酸の量を測定するために、前記試料または混合物に光線を導くように配置された透明窓を含む、請求項１９に記載のカートリッジ。
【請求項21】
請求項１３～２０の何れか一項に記載のカートリッジを受けるように適合されたドッキング部位を有する装置を含む、血液試料から核酸断片を抽出するための自動化システムであって、前記装置は、前記カートリッジにおいて血漿濾過プロセスを操作するように適合された手段と、核酸に特異的な結合物質を用いて前記カートリッジにおいて核酸精製を操作するように適合された手段とを含む、自動化システム。
【請求項22】
血液試料から血漿を濾過するための第１区画とゲル電気泳動を行うための第２区画とを含むカートリッジであって、前記第１区画は中空繊維膜を含み、前記第２区画は電気泳動用ゲルを含む、カートリッジ。
【請求項23】
前記第２区画における電気泳動用ゲルはアガロースゲルである、請求項２２に記載のカートリッジ。
【請求項24】
前記第１区画は血液試料を受ける手段を含む、請求項２２または２３に記載のカートリッジ。
【請求項25】
前記第１区画は、前記血液試料を前記第１区画に封入された細胞固定試薬と混合する手段を含む、請求項２４に記載のカートリッジ。
【請求項26】
前記第１区画は、中空繊維膜において前記血液試料から分離された血漿試料を、前記第１区画に封入された酵素または化学試薬と混合する手段を含む、請求項２２～２５の何れか一項に記載のカートリッジ。
【請求項27】
前記第１区画は、前記酵素または化学試薬と混合された分離血漿を、前記第１区画から前記第２区画に移送する手段を含む、請求項２２～２６の何れか一項に記載のカートリッジ。
【請求項28】
前記カートリッジに封入された保存剤または安定化剤と、該保存剤または安定化剤を核酸断片と混合する手段と、前記核酸断片と前記保存剤または安定化剤の混合物を保存するための着脱式容器とを含む、請求項２２～２７の一項に記載のカートリッジ。
【請求項29】
核酸結合色素が封入されている、請求項２２～２８の何れか一項に記載のカートリッジ。
【請求項30】
請求項２２～２９の一項に記載のカートリッジを受けるように適合されたドッキング部位を有する装置を含む血液試料から核酸断片を抽出するための自動化システムであって、前記装置は、前記カートリッジにおいて血漿濾過プロセスを操作するように適合された手段と、前記カートリッジにおいてゲル電気泳動を操作するように適合された手段とを含む、自動化システム。
【請求項31】
血液試料からタンパク質バイオマーカーを抽出するための方法であって、ａ）個人から採取した血液試料を提供するステップと、
ｂ）好ましくは、固定試薬で試料中の血球を安定化させるステップと、
ｃ）前記血液試料から血漿を分離するために、中空繊維フィルタを用いることにより前記血液試料を濾過するステップと、
ｄ）好ましくは、分離された細胞画分を洗浄試薬で洗浄し、ウォッシュアウトを回収するステップと、
ｅ）血漿試料中に存在するバイオマーカーを常に精製するために、ステップｃ）で得られた血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを、タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるステップと、
ｆ）前記結合物質に結合したタンパク質を回収するステップと、
ｇ）ステップｆ）で回収されたタンパク質を保存剤または安定化剤と混合するステップと、
を含み、
ステップｂ）～ｇ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、ステップｃ）で得られた血漿試料を前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジ上で行われる、方法。
【請求項32】
ステップｅ）において、前記タンパク質と前記保存剤または安定化剤の得られた混合物は、着脱式容器に保存される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記混合物は、前記結合物質に結合したタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
ステップａ）で得られた血液試料は、試料を濾過ステップｂ）に付す前に抗凝固剤と混合される、請求項３１～３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記中空繊維フィルタは中空繊維膜である、請求項３１～３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項36】
ステップｃ）において、血漿試料は前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触する、請求項１～３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記結合物質は磁性ビーズを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記磁性ビーズは、前記タンパク質バイオマーカーに特異的な抗体でコーティングされている、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、血漿試料をタンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジであって、前記第１区画は中空繊維フィルタを含み、前記第２区画はタンパク質精製のためのチャンバを含み、前記カートリッジは、該カートリッジ内に封入された、前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質を含み、前記結合物質は好ましくは磁性ビーズを含む、カートリッジ。
【請求項40】
前記磁性ビーズは、前記タンパク質バイオマーカーに特異的な抗体でコーティングされている、請求項３９に記載のカートリッジ。
【請求項41】
前記カートリッジに封入された保存剤または安定化剤と、該保存剤または安定化剤を前記結合物質に結合した核酸断片と混合する手段と、前記核酸断片と前記保存剤または安定化剤の混合物を保存するための着脱式容器とを含む、請求項３９または４０に記載のカートリッジ。
【請求項42】
タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質を含む請求項４０または４１に記載のカートリッジを受けるように適合されたドッキング部位を有する装置を含む、血液試料から核酸断片を抽出するための自動化システムであって、前記装置は、前記カートリッジにおいて血漿濾過プロセスを操作するように適合された手段と、前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質を用いて前記カートリッジにおいてタンパク質精製を操作するように適合された手段とを含む、自動化システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リキッドバイオプシ診断の分野に関するものである。特に、血流中の循環腫瘍由来の低分子核酸の検出によって促進されるがんの診断、予後およびモニタリングに関するものである。本方法は、母体血液の出生前検査（すなわち、非侵襲的出生前検査、ＮＩＰＴ）のための試料調製にも有用である。
【背景技術】
【0002】
血液から精製される血漿および血清には、自己および非自己（胎盤、腫瘍、移植片）組織に由来する分子が可変量含まれている。例えば、妊娠中、母親の血液には母体ＤＮＡおよび胎盤に由来する胎児ＤＮＡの両方が含まれている。一方、腫瘍は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、エクソソーム、血小板、マイクロＲＮＡおよびタンパク質マーカーを連続的に血流中に流している。血液試料または他の体液中のこれらの分子シグネチャを検出するプロセスは、リキッドバイオプシと呼ばれる。
【0003】
血液セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、ヘルスケア、胎児の状態（性別および異数性）の研究、がんの診断およびモニタリングの補助、心血管および自己免疫疾患の示唆、ならびに身体運動、移植、さらには敗血症を示すための貴重で低侵襲なツールである（非特許文献１）。ｃｆＤＮＡの遺伝的およびエピジェネティックな変化ならびに断片化および単純に量が、ｃｆＤＮＡ解析から収集される貴重な情報である（非特許文献１）。
【0004】
しかし、血流中のセルフリー核酸の非自己分率は低く、ｃｆＤＮＡ／セルフリーＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）は通常の血液試料中では長期間安定しておらず、自己ＤＮＡが混入するか、または分解される可能性がある。出生前スクリーニングでは、妊娠１１～１３週において、絨毛栄養膜細胞層のアポトーシスに由来する胎児画分が、母体血漿セルフリーＤＮＡの４％未満を形成する（非特許文献２）。がん患者では、アポトーシスおよびネクローシス細胞の溶解、マクロファージによる腫瘍細胞の消化、または生きた腫瘍細胞によるＤＮＡの直接分泌によってｃｔＤＮＡが放出され（非特許文献３）、全ｃｆＤＮＡ画分の０．０１から９０％の間で変動する（非特許文献４）。このレベルは、腫瘍ステージ、血管新生、負荷、アポトーシス率等の生物学的特徴、およびがん細胞の転移能に依存し、濃度は、患者の血液量に影響する要因に影響を受ける（非特許文献５）。肺がん手術後２日目には早くもｃｔＤＮＡ変異頻度（％ＶＡＦ、変異アレル頻度）の変化が観察された（非特許文献６）。また、変異頻度だけでなく、ｃｔＤＮＡの総量も、治療応答評価のツール、または一次手術後の再発の早期発見のための追跡マーカーとして使用することが可能である。例えば、術後のｃｔＤＮＡの所見から９３％の患者における再発が予測され、そのリードタイムの中央値は放射線学的確認の６０日前であった（非特許文献７）。また、がん細胞のメチル化状態は正常細胞とは異なり、がん由来のｃｆＤＮＡの特性に影響を与える可能性がある（非特許文献８）。ｃｔＤＮＡの血流中での半減期は１６分～２．５時間であり、ｃｔＤＮＡは腫瘍量を反映する「リアルタイム」なバイオマーカーとなる（非特許文献４、９）。リキッドバイオプシは、組織生検と比較して、完全な不均一性（空間的および時間的の両方で）に関する情報を提供し、サンプリング手順が低侵襲性または完全非侵襲性であり、ならびに治療効果、耐性発現、およびがんの進行を追跡するためにサンプリングを繰り返すことが可能であるという顕著な利点を有する。さらに、リキッドバイオプシは、より安価および迅速な試料調製を形成可能であることが予測されている（非特許文献１０）。
【0005】
血液試料からｃｆＤＮＡを調製するための最初の分析前ステップは、分析の妨げとなり得る赤血球および白血球の分離である。臨床研究では血清が一般的な物質であるが、白血球から放出される野生型ＤＮＡの腫瘍以外のバックグラウンドが低いため、ｃｆＤＮＡは通常、血漿から抽出される（非特許文献１１）。血漿の分離がリキッドバイオプシ分析を行う際に重要なステップであることはよく知られている（非特許文献１２）。血漿試料中に白血球が存在すると、それらは野生型ＤＮＡを放出し、ｃｆＤＮＡ試料の希釈を引き起こす。現在のｃｆＤＮＡ抽出手順では、血漿の分離は、安定化血液の遠心分離を使用して行われる。血液試料の輸送および保存条件が不適切な場合、細胞が損傷し、ＤＮＡおよびＤＮＡヌクレアーゼが放出され、ゲノム野生型ＤＮＡの混入およびｃｔＤＮＡ含有量の損失または減少をもたらし得る（非特許文献１３）。後の血漿単離および処理のために血液試料を輸送するための１つの商業化された解決策は、特定のセルフリーＤＮＡ採血管（例えば、Ｓｔｒｅｃｋ Ｉｎｃ．、ＲｏｃｈｅおよびＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸによって提供される）の使用であり、これにより室温（室温；１５～２５℃）で保存した場合で最大７～１４日間試料の安定性を保持できる。しかし、温湿度が管理された輸送は高価であり、凍結により繊細な試料が完全に破壊される可能性がある亜寒帯地域および北極圏では特に重要である。より温暖な地域では、冷却パックを使用することができるが、迅速な輸送がしばしば必要であり、温度の変動が依然としてリスクとなる。さらに、血漿分離のための血液試料の遠心分離は、試料採取の現場でも分析室でも、時間がかかる。血球の破壊により細胞核酸の試料への漏出が引き起されるため、これを避けるため特に注意が必要である。血液の遠心分離は、試料の安定化試薬（ＥＤＴＡまたはアルデヒド等）および抽出プロトコルによっては、しばしば２つの異なる遠心力で２回行う必要がある。管間の液体移送のたびに、人的エラー、試料の交差汚染、および患者が血液媒介疾患を有する場合、職員に対する潜在的なバイオハザードのリスクが高まる。血漿分離後、試料は下流のバイオマーカー単離のために凍結保存することが可能である。
【0006】
米国臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ）パネルは、Ｋ２ＥＤＴＡ安定化リキッドバイオプシ管の処理は、ｃｔＤＮＡが通常の白血球ＤＮＡで希釈され、ＤＮＡヌクレアーゼが放出される可能性がある白血球の溶解を避けるため、採取から６時間以内で、できるだけ便宜的であるべきであると報告している（非特許文献１４）。白血球安定化管を使用することで、ｃｔＤＮＡの検出または定量に妥協することなく、処理までの時間について最大４８時間、またはいくつかの管ではより長くと、より大きな柔軟性を得ることが可能となる。さらに、ＡＳＣＯパネルは、採取、取り扱い変数、保存条件、および患者関連の生物学的要因のすべてが、リキッドバイオプシ診断を妨げる要因であると考えられると批判的に述べている。
【0007】
循環ｃｆＤＮＡ断片のサイズ分布はしばしば矛盾しており、悪性条件はｃｆＤＮＡ全体のサイズの増加（非特許文献１５）および減少（非特許文献１６）の両方をもたらすと報告されている。実際、Mouliereら（非特許文献１６）は、大腸がん患者のｃｔＤＮＡの最大９８％が＜４００塩基対の断片で構成されていることを示した。非腫瘍由来ｃｆＤＮＡのサイズ分布はより均一であり、＜４００塩基対の断片がこれらの核酸の約６５％を構成していた。したがって、４００塩基対未満の短い循環腫瘍由来核酸分子（ＤＮＡ／ＲＮＡ）は、がんの診断およびがん治療における薬物応答のモニタリングに有用である可能性がある。
【0008】
ＣＬＩＡに認証された商業的に利用可能なリキッドバイオプシ検査で観察される低い一致度（非特許文献１７）の一部は、試料の取り扱いの問題によるものであり得、これは自動化を用いることで回避できる可能性がある。自動化は現在、試料が順番待ち可能な実験プロセスにおいて、または回収された試料数が、連続的なハイスループット処理が可能なものである場合は、可能である。赤血球および白血球からの血漿の分離は遠心分離によって行われ、これはサンプリングロボットを有する大規模な中心的研究所では自動化が可能であるが、小規模の研究所では正確な手作業および訓練された人員を必要とする。核酸（およびタンパク質）は、例えば磁性粒子または固相フィルタカラムを用いた精製によってさらに単離可能である。このステップは自動または半自動の試料処理装置を用いて行うことが可能だが、かなり高価であり、経済的に使用するためにはバッチ処理が必要である。半自動の血漿分離／核酸抽出の組み合わせは、いくつかの高価なハイスループットシステム（例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＶａｎａｄｉｓ Ｅｘｔｒａｃｔ）においてバッチモードで利用可能であるが、依然として外部での血液遠心分離が必要である。
【0009】
商業化された完全自動の解決策、特に「試料数が少ない」患者側の状況で使用するためのものはまだ存在しないが、いくつかの実装が文献に記載されている。しかし、これらは依然として手作業による試料の充填および分析物の採取に依存しており、訓練された実験人員を必要とし、試料汚染、損失、取り違えおよび血液媒介疾患の伝播という不要なリスクをもたらす。さらに、これらの方法は限られた量の試料（＜５ｍＬ血液、＜２ｍＬ血漿）しか処理できず（例：非特許文献１８）、これは希少な変異の検出を考慮すると厳しい制限である。理想的には、リキッドバイオプシの試料処理は完全に自動化され、再現性があり、大量の試料をサポートし、採血後即時の非同期処理開始が可能であるべきである。
【0010】
核酸およびタンパク質の抽出装置には、表面化学のカスタマイズが可能で、流動的または非流動的な磁性処理が簡単であることから、機能化カラムまたは磁性ビーズがしばしば使用される。したがって、磁性ビーズを使用する核酸精製方法は、当技術分野で周知である。自動化装置は、典型的にはプレートまたはチップをベースとし、外部磁石を使用してビーズをプレート内で静止させるか、またはビーズもしくは流体のいずれかをアレイを通じて移動させるかのいずれかである。これらの装置は、複雑な流体移送システムまたは移動可能なロボットのいずれかを必要とし、現在、大量のバッチベースの処理にのみ最適である。
【0011】
先行技術である米国特許第６，８０２，８２０号（特許文献１）および第６，８０２，９７１号（特許文献２）では、繊維の外面を全血に露出し、繊維壁を通じて血漿を導くことにより、生体内で全血から血漿を分離することが可能な、ユニークで高効率な非対称繊維壁特徴を有する特殊中空繊維膜が開示されている。老廃物、過剰な液体、毒素、および／または他の有害な血漿タンパク質を除去するために血漿を処理した後、処理された血漿は戻されて、患者の血流に再導入される。
【0012】
国際公開第２０１９／１８５８７４号（特許文献３）は、血液および血漿のような血液誘導体から血液由来の細胞外小胞、特に微小小胞ならびにエクソソームおよびエクソマーを枯渇させる、ための中空繊維、特に２０ｎｍ超の多孔性を有するポリエーテルスルホン中空繊維の使用、ならびに重力濾過を用いてかかる枯渇試料を取得し分析する方法に関するものである。
【0013】
国際公開第２０１９／１３６０８６号（特許文献４）では、生体液から細胞およびその一部、細菌、ウイルス等を分離するための中空繊維膜を有する、単純な接線流濾過ユニットが開示されている。このユニットは、濾過ユニットと流体連通している回収チャンバを含み、真空により装置に生体液が引き込まれ、生体液に含まれる選択された生体物質が生体液の残部から分離される。
【0014】
米国特許出願公開第２００４００５０６９９号明細書（特許文献５）には、固体基板上の核酸の電気泳動分離を行う際に使用するカセットが開示されている。このカセットは、バッファを流すためのリザーバと、電流を受けるための電極と、基板支持体とを含む。カセットは、外部の流体および電源と接続できるように設計される。電気泳動分離を行う際に使用する装置も開示されている。この装置は、カセットを受けるためのドッキングステーションを有するモジュール構造である。
【0015】
米国特許第５８６３８０１号明細書（特許文献６）には、核酸に親和性のある常磁性粒子を用いて、複数の生体試料から核酸を並行操作で自動抽出するためのカセットが開示されている。このカセットは、試料充填用の中空針と、バルブ、ビーズ、洗浄液および核酸抽出液用のリザーバと、分離可能な試料移送ストリップとを含む。カセットは、カセットのためのドッキングスロットを提供する関連装置で操作されるように設計される。
【0016】
欧州特許第２３１５８４９号明細書（特許文献７）では、患者の血漿および糞便試料中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を定量化する手法が開示されている。この方法では、血漿を分離するために、血液試料を遠心分離に付す。ｃｔＤＮＡの測定が、がんを有する対象、特に手術または化学療法を受けている対象における腫瘍の動態を確実にモニタするために使用可能であることが開示されている。
【0017】
しかしながら、当技術分野において、がんを有する対象の疾患を評価し治療するための個別化された手法を容易にする新規の方法に対するニーズは依然として高まっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0018】
【特許文献1】米国特許第６８０２８２０号明細書
【特許文献2】米国特許第６８０２９７１号明細書
【特許文献3】国際公開第２０１９１８５８７４号
【特許文献4】国際公開２０１９１３６０８６号
【特許文献5】米国特許出願公開第２００４００５０６９９号明細書
【特許文献6】米国特許第５８６３８０１号明細書
【特許文献7】欧州特許第２３１５８４９号明細書
【非特許文献】
【0019】
【非特許文献1】Meddeb, R., Pisareva, E., Thierry A.R. Guidelines for the Preanalytical Conditions for Analyzing Circulating Cell-Free DNA. Clinical Chemistry (2019) 65 (5) 623-633;
【非特許文献2】Ashoor, G. Syngelaki, A. Poon, L. C. Y. Rezende, J. C., Nicolaides K. H. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-13 weeks' gestation: relation to maternal and fetal characteristics. Ultrasound Obstet Gynecol. (2013) 41(1): 26-32.
【非特許文献3】Diaz LA Jr, Bardelli A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J Clin Oncol. (2014) 32:579-86. doi: 10.1200/JCO.2012.45.2011
【非特許文献4】Diehl F, Schmidt K, Choti MA, Romans K, Goodman S, Li M, et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med. (2008) 14:985-90. doi: 10.1038/nm.1789
【非特許文献5】Kidess E, Jeffrey SS. Circulating tumor cells versus tumor-derived cell-free DNA: rivals or partners in cancer care in the era of single-cell analysis? Genom Med. (2013) 5:70. doi: 10.1186/gm474
【非特許文献6】Mouliere, Florent & Piskorz, Anna & Chandrananda, Dineika & Moore, Elizabeth & Morris, James & Smith, Christopher & Goranova, Teodora & Heider, Katrin & Mair, Richard & Supernat, Anna & Gounaris, Ioannis & Ros, Susana & Wan, Jonathan & Jimenez-Linan, Mercedes & Gale, Davina & Brindle, Kevin & Parkinson, Christine & Brenton, James & Rosenfeld, Nitzan. (2017). Selecting Short DNA Fragments In Plasma Improves Detection Of Circulating Tumour DNA. 10.1101/134437.
【非特許文献7】Abbosh C, Birkbak NJ, Wilson GA, et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature (2017) 545:446-51.
【非特許文献8】Sina, A.A.I., Carrascosa, L.G., Liang, Z. et al. Epigenetically reprogrammed methylation landscape drives the DNA self-assembly and serves as a universal cancer biomarker. Nat Commun 9, 4915 (2018) doi:10.1038/s41467-018-07214-w
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【非特許文献10】Saarenheimo, J., Eigeliene, N., Andersen, H., Tiirola, M., Jekunen, A. The value of liquid biopsies for guiding therapy decisions in non-small cell lung cancer. Frontiers in Oncology (2019) 9:129.
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【非特許文献16】Mouliere, F., B. Robert, E. Arnau Peyrotte, M. Del Rio, M. Ychou, F. Molina, C. Gongora, and A.R. Thierry High fragmentation characterizes tumour-derived circulating DNA. PLoS One. (2011) 6:e23418.
【非特許文献17】Torga G, Pienta KJ. Patient-paired sample congruence between 2 commercial liquid biopsy tests. JAMA Oncol. (2018) 4:868-870.
【非特許文献18】Hu F., Li J., Peng N., Li Z., Zhang Z., Zhao S., Duan M., Tian H., Lia L. and Zhanga P. Rapid isolation of cfDNA from large-volume whole blood on a centrifugal microfluidic chip based on immiscible phase filtration. Analyst, (2019) 144, 4162-4174 doi:10.1039/C9AN00493A
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0020】
本発明によって提供される解決策は、使い捨てカートリッジに基づいており、そこでは、中空繊維膜を用いた圧力補助血漿濾過のための手段およびその後のバイオマーカー抽出のための手段の組み合わせによって、完全に自動化された血液バイオマーカーの単離が可能になる。本発明では、カートリッジに含まれ、細胞分離前に試料に加えられる細胞固定試薬により、細胞ゲノムＤＮＡの血漿への漏出を効果的に最小化する。さらに、分離された細胞画分に対して行われる洗浄ステップにより、ｃｆＤＮＡの収率が最大化される。精製された試料から単離されたセルフリーバイオマーカー（ｃｆＤＮＡ、ｃｆＲＮＡ、およびセルフリータンパク質）がさらに分析可能であるか、または試料を診断サービスプロバイダに通常郵便で安全に送ることが可能である。バイオマーカーの精製および濃縮においては、磁性ビーズの使用等の結合剤に基づく核酸抽出が好適な方法である。ゲル電気泳動およびフィルタ抽出が代替の実施形態となる。この方法およびカートリッジは、完全に自動化されており、訓練された実験スタッフの必要をなくし、「試料数が少ない」状況において個々の血液試料を安全に処理することを可能にする。その結果、この方法は、即時の試料処理を可能にし、凍結および高温を含むすべての輸送条件に耐える、封入され安定した濃縮核酸試料を提供する。さらに、本方法の再現性は手動サンプリングよりも優れており、一定の高い収率が達成される。
【0021】
したがって、一態様において、本発明は血液試料から核酸断片を抽出するための方法であって；
ａ）個人から採取した血液試料を提供するステップと；
ｂ）好ましくは、固定試薬で試料中の血球を安定化させるステップと；
ｃ）前記血液試料から血漿を分離するために、中空繊維フィルタを用いることにより前記血液試料を濾過するステップと；
ｄ）好ましくは、ステップｃ）から得られた血球を含む画分を洗浄液で洗浄し、ウォッシュアウトを回収するステップと；
ｅ）血漿試料中に存在する核酸断片を精製するために、ステップｂ）で得られた血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを、核酸に特異的な結合物質と接触させるか、または代わりに前記血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを分離媒体中で電気泳動に付すステップであって、前記分離媒体は、核酸断片が媒体中で移動可能かつサイズにより前記媒体中で分離可能であるように調製されている、ステップと；
ｆ）前記結合物質に結合した、または前記分離媒体中を移動した核酸断片を回収するステップと；
ｇ）ステップｆ）で回収された核酸断片を保存剤または安定化剤と混合するステップとを含み；
ステップｂ）～ｇ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、ステップｃ）で得られた血漿試料を核酸に特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジ上で行われるか、または代わりに前記第２区画は電気泳動を行うための手段を含む、方法を提供する。好ましい実施形態において、カートリッジは、血液試料に由来する小胞、タンパク質または他の生体分子もしくは細片からｃｆＤＮＡを分離または精製するために、血漿、洗浄した細胞またはステップｄ）において回収したウォッシュアウトに酵素等の試薬を加える手段を含む、方法を提供する。
ａ）個人から採取した血液試料を提供するステップと；
ｂ）好ましくは、固定試薬で試料中の血球を安定化させるステップと；
ｃ）前記血液試料から血漿を分離するために、中空繊維フィルタを用いることにより前記血液試料を濾過するステップと；
ｄ）好ましくは、ステップｃ）から得られた血球を含む画分を洗浄液で洗浄し、ウォッシュアウトを回収するステップと；
ｅ）血漿試料中に存在する核酸断片を精製するために、ステップｂ）で得られた血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを、核酸に特異的な結合物質と接触させるか、または代わりに前記血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを分離媒体中で電気泳動に付すステップであって、前記分離媒体は、核酸断片が媒体中で移動可能かつサイズにより前記媒体中で分離可能であるように調製されている、ステップと；
ｆ）前記結合物質に結合した、または前記分離媒体中を移動した核酸断片を回収するステップと；
ｇ）ステップｆ）で回収された核酸断片を保存剤または安定化剤と混合するステップとを含み；
ステップｂ）～ｇ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、ステップｃ）で得られた血漿試料を核酸に特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジ上で行われるか、または代わりに前記第２区画は電気泳動を行うための手段を含む、方法を提供する。好ましい実施形態において、カートリッジは、血液試料に由来する小胞、タンパク質または他の生体分子もしくは細片からｃｆＤＮＡを分離または精製するために、血漿、洗浄した細胞またはステップｄ）において回収したウォッシュアウトに酵素等の試薬を加える手段を含む、方法を提供する。
【0022】
特定の態様において、本発明は、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、血漿試料を核酸に特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジであって、前記第１区画は中空繊維フィルタを含み、第２区画は核酸精製のためのチャンバを含み、前記カートリッジは、該カートリッジ内に封入された核酸に特異的な結合物質を含み、前記結合物質は好ましくは磁性ビーズを含む、カートリッジを提供する。
【0023】
特定の態様において、本発明は、上記で定義されたカートリッジを受けるように適合されたドッキング部位を有する装置を含む、血液試料から核酸断片を抽出するための自動化システムであって、前記装置は、前記カートリッジにおいて血漿濾過プロセスを操作するように適合された手段と、核酸に特異的な結合物質を用いて前記カートリッジにおいて核酸精製を操作するように適合された手段とを含む、自動化システムを提供する。
【0024】
特定の態様において、本発明は、血液試料から血漿を濾過するための第１区画とゲル電気泳動を行うための第２区画とを含むカートリッジであって、前記第１区画は中空繊維膜を含み、前記第２区画は電気泳動用ゲルを含む、カートリッジを提供する。
【0025】
特定の態様において、本発明は、電気泳動用ゲルを含む上記に定義されたカートリッジを受けるように適合されたドッキング部位を有する装置を含む、血液試料から核酸断片を抽出するための自動化システムであって、前記装置は、前記カートリッジにおいて血漿濾過プロセスを操作するように適合された手段と、前記カートリッジにおいてゲル電気泳動を操作するように適合された手段とを含む、自動化システムを提供する。
【0026】
特定の態様において、本発明は血液試料からタンパク質バイオマーカーを抽出するための方法であって；
ａ）個人から採取した血液試料を提供するステップと；
ｂ）好ましくは、固定試薬で試料中の血球を安定化させるステップと；
ｃ）前記血液試料から血漿を分離するために、中空繊維フィルタを用いることにより前記血液試料を濾過するステップと；
ｄ）好ましくは、分離された細胞画分を洗浄試薬で洗浄し、ウォッシュアウトを回収するステップと；
ｅ）血漿試料中に存在するバイオマーカーを常に精製するために、ステップｃ）で得られた血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを、タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるステップと；
ｆ）前記結合物質に結合したタンパク質を回収するステップと；
ｇ）ステップｆ）で回収されたタンパク質を保存剤または安定化剤と混合するステップとを含み；
ステップｂ）～ｇ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、ステップｃ）で得られた血漿試料を前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジ上で行われる、方法を提供する。
ａ）個人から採取した血液試料を提供するステップと；
ｂ）好ましくは、固定試薬で試料中の血球を安定化させるステップと；
ｃ）前記血液試料から血漿を分離するために、中空繊維フィルタを用いることにより前記血液試料を濾過するステップと；
ｄ）好ましくは、分離された細胞画分を洗浄試薬で洗浄し、ウォッシュアウトを回収するステップと；
ｅ）血漿試料中に存在するバイオマーカーを常に精製するために、ステップｃ）で得られた血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを、タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるステップと；
ｆ）前記結合物質に結合したタンパク質を回収するステップと；
ｇ）ステップｆ）で回収されたタンパク質を保存剤または安定化剤と混合するステップとを含み；
ステップｂ）～ｇ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、ステップｃ）で得られた血漿試料を前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジ上で行われる、方法を提供する。
【0027】
特定の態様において、本発明は、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、血漿試料をタンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジであって、前記第１区画は中空繊維フィルタを含み、前記第２区画はタンパク質精製のためのチャンバを含み、前記カートリッジは、該カートリッジ内に封入された、前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質を含み、前記結合物質は好ましくは磁性ビーズを含む、カートリッジを提供する。
【0028】
特定の態様において、本発明は、タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質を含む上記に定義されたカートリッジを受けるように適合されたドッキング部位を有する装置を含む、血液試料からタンパク質バイオマーカーを抽出するための自動化システムであって、前記装置は、前記カートリッジにおいて血漿濾過プロセスを操作するように適合された手段と、前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質を用いて前記カートリッジにおいてタンパク質精製を操作するように適合された手段とを含む、システムを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【発明を実施するための形態】
【0030】
本発明が解決する課題は、血流からセルフリー核酸またはタンパク質バイオマーカーを単離および保存する効率的かつ簡便な方法を提供することである。本発明は、血漿分離、ならびに好ましくは細胞固定、および細胞洗浄／溶出を、電気泳動分離または固相結合物質の非機械的流体操作による核酸抽出と組み合わせることによって、血液試料から循環核酸／タンパク質バイオマーカーを抽出するための小規模自動化カートリッジで実行可能なプロセスを設計することが可能であることを初めて開示するものである。本方法は、便利な試料採取、自動定量、輸送、保存、ならびに大量の試料からの高収率および単離された核酸の良好な安定性を提供することにより、先行技術における欠点を緩和することを意図する。
【0031】
特に、本発明は；
ａ）個人から採取した血液試料を提供するステップと；
ｂ）好ましくは、固定試薬で試料中の血球を安定化させるステップと；
ｃ）前記血液試料から血漿を分離するために、中空繊維フィルタを用いることにより前記血液試料を濾過するステップと；
ｄ）好ましくは、ステップｃ）から得られた血球を含む画分を洗浄液で洗浄し、ウォッシュアウトを回収するステップと；
ｅ）血漿試料中に存在する核酸断片を精製するために、ステップｂ）で得られた血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを、核酸に特異的な結合物質と接触させるか、または代わりに前記血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを分離媒体中で電気泳動に付すステップであって、前記分離媒体は、核酸断片が媒体中で移動可能かつサイズにより前記媒体中で分離可能であるように調製されている、ステップと；
ｆ）前記結合物質に結合した、または前記分離媒体中を移動した核酸断片を回収するステップと；
ｇ）ステップｆ）で回収された核酸断片を保存剤または安定化剤と混合するステップとを含み；
ステップｂ）～ｇ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、ステップｃ）で得られた血漿試料を核酸に特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジ上で行われるか、または代わりに前記第２区画は電気泳動を行うための手段を含む、方法を提供する。
ａ）個人から採取した血液試料を提供するステップと；
ｂ）好ましくは、固定試薬で試料中の血球を安定化させるステップと；
ｃ）前記血液試料から血漿を分離するために、中空繊維フィルタを用いることにより前記血液試料を濾過するステップと；
ｄ）好ましくは、ステップｃ）から得られた血球を含む画分を洗浄液で洗浄し、ウォッシュアウトを回収するステップと；
ｅ）血漿試料中に存在する核酸断片を精製するために、ステップｂ）で得られた血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを、核酸に特異的な結合物質と接触させるか、または代わりに前記血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを分離媒体中で電気泳動に付すステップであって、前記分離媒体は、核酸断片が媒体中で移動可能かつサイズにより前記媒体中で分離可能であるように調製されている、ステップと；
ｆ）前記結合物質に結合した、または前記分離媒体中を移動した核酸断片を回収するステップと；
ｇ）ステップｆ）で回収された核酸断片を保存剤または安定化剤と混合するステップとを含み；
ステップｂ）～ｇ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、ステップｃ）で得られた血漿試料を核酸に特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジ上で行われるか、または代わりに前記第２区画は電気泳動を行うための手段を含む、方法を提供する。
【0032】
好ましい実施形態において、カートリッジは、血液試料に由来する小胞、タンパク質または他の生体分子もしくは細片からｃｆＤＮＡを分離または精製するために、血漿、洗浄した細胞またはステップｄ）において回収したウォッシュアウトに酵素等の試薬を加える手段を含む。血漿調製物中のセルフリーＤＮＡは、そのほとんどがヒストンタンパク質と結合しており、細胞外小胞に含まれる。ＤＮＡの効果的な回収を促進するためには、核酸を放出させるために、適切なバッファ（溶解バッファ）条件下で、タンパク質分解酵素、例えばプロテイナーゼＫ、または他の無差別性の高いプロテイナーゼでの前処理が必要である。血漿から完全なタンパク質マーカーを回収および精製する用途の場合、適切な界面活性剤および他のカオトロピック剤の形でマイルドな変性条件を適用することが適切である。
【0033】
好ましくは、上記方法のステップｄ）において回収される核酸断片の長さは、４００塩基対未満であり、より好ましくは１００～２００塩基対である。これは、瀕死細胞からのアポトーシスおよびネクローシスを含む、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）放出に関与することが開示されている生物学的プロセスに合致するものである。断片化されたセルフリーＤＮＡのサイズは、主に約１６６塩基対の長さであることが示されている。
【0034】
好ましい実施形態において、上記方法のステップａ）において得られた血液試料は、試料を濾過ステップｂ）に付す前に抗凝固剤と混合される。好ましい抗凝固剤は、ヘパリンおよびその誘導体、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ならびにワルファリン等のクマリン誘導体からなる群から選択することが可能である。
【0035】
好ましい実施形態において、血漿からの細胞の分離を増進し、細胞核酸の血漿への漏出を防ぐために、ステップｂ）において血液試料に細胞固定試薬が加えられる。「細胞固定」とは、本明細書では、細胞および／または細胞小器官（例えば核）等の細胞内構成要素の構造を維持する技術を指す。固定により、例えば、細胞内構成要素を架橋することによって、その化学的または生物学的構造が修飾される。固定によって、細胞全体および細胞小器官が溶解されにくくなり得る。本明細書において特に興味深いのは、固定によって、細胞核酸も周囲の媒体に放出されにくくなり得ることである。例えば、固定は、白血球からの核ＤＮＡが、全血の遠心分離中に血漿画分に放出されるのを防ぐことができる。「細胞固定試薬」または「固定剤」は、本明細書では、細胞核酸を固定し、それによって細胞が斯かる核酸を周囲の媒体へ放出しにくくなる化学的または生物学的試薬等の薬剤を指す。細胞固定試薬は、細胞タンパク質分解酵素およびヌクレアーゼを無効化し得る。固定剤の例としては、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド）、アルコール類、および酸化剤が挙げられる。好ましい細胞固定試薬には、アルデヒド類およびその誘導体（例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド）、アジン類（例えば１，３，５－トリアクリロイル－ヘキサヒドロ－ｓ－トリアジン）またはヘミアセタール類（例えば２，３－ジメトキシトラヒドロフラン）からなる群から選択される架橋固定剤が含まれる。
【0036】
好ましくは、ステップｃ）で利用される中空繊維膜は、単一の物質相で構成され、その物質は、酢酸セルロース、ポリプロピレンまたはＰＶＤＦ等の核酸またはタンパク質結合能の低い鎖状の高分子であり、高分子を紡ぐことによって繊維を形成することが可能である。中空繊維膜の製造については、例えば、米国特許第４２３４４３１号明細書に開示されている。別の態様では、中空繊維は、混合セルロースエステル、ポリスルホン、プラスチックポリマーまたはそれらの組合せを含んでもよい。別の態様において、中空繊維は、疎水性物質、親水性物質、低核酸結合性物質、または低タンパク質結合性物質のうちの少なくとも１つを含んでもよい。それらは、意図された用途に応じて、約０．５ミクロン～約５ミクロンの範囲の孔径を含んでもよい。それらは、５０～５００の範囲の多様な密度を有してもよい。
【0037】
別の好ましい実施形態において、上記方法のステップｅ）における前記分離媒体は、核酸断片のサイズ選択媒体である。媒体の濃度により、ＤＮＡの移動に影響を与える媒体の孔径は決定される。媒体の濃度を上げると、移動速度が低下し、より小さなＤＮＡ分子の分離が改善される。上記方法のステップｅ）における任意の電気泳動は、好ましくは、ランニングバッファを充填した容器、容器内に構成される電気泳動用ゲルマトリクス部分、および分離媒体内に構成されるローディングウェル内で行われる。分離媒体は、容器を横切って横方向に延びていてもよい。分離媒体は、アガロースであることが可能であり、またはデンプン、寒天、アガロース、およびポリアクリルアミドのうちの少なくとも１つであってもよい。ランニングバッファは、ｐＨ７～ｐＨ９のｐＨを有してもよく、キレート剤としてＥＤＴＡを含んでもよい。容器はまた、少なくとも１つの正電極および少なくとも１つの負電極を含んでいてもよい。ＤＮＡの移動速度は、印加された電圧に比例し、すなわち、電圧が高いほど、ＤＮＡは速く移動する。電気泳動核酸試料調製のための装置およびシステムは、例えば、国際公開第２０１６０６１４１６号に開示されている。上記の方法の好ましい実施形態のプロセスステップは、図１に概略的に示されている。
【0038】
本発明はさらに、カートリッジに電力、圧力（圧縮空気もしくはガス等）および／または真空を提供する外部装置と組み合わせて上記方法を行うように適合された手段を含むカートリッジを対象とする。カートリッジは、好ましくは、２つのコンパートメントまたは層を含み、第１は、血漿分離および好ましくは細胞固定および細胞のすすぎ／洗浄のための、流体工学および液体試薬を含む。第２層は、核酸精製用チャンバまたは電気泳動用ゲル、ランニングバッファ溶液および関連電極を含む。カートリッジはさらに、単離された核酸試料を保持するための手段を含む。ケーシングは、カートリッジを上部、下部および側面から覆い、バルブ、電源、ポンプおよび血液試料管のための開口部を含む。カートリッジまたはケーシングのスケールは、体積が好ましくは１５０～１５００ｃｍ３または１５０～１０００ｃｍ３、より好ましくは１５０～５００ｃｍ３、最も好ましくは１５０～２５０ｃｍ３であるようなスケールとされる。スケールの例は、幅１０ｃｍ、深さ８ｃｍ、および高さ２．５ｃｍのケーシング（体積は２００ｃｍ３）である。
【0039】
カートリッジの好ましい構造は、図２、３、２１および２２に概略的に示されている。ここで、ソケット６２または５０３は、採血管１０を受け入れることが可能である。流体区画１７０および１７１は、血漿分離のための、およびいくつかの実施形態においては磁性ビーズ核酸抽出のための、構成要素を含む。図２において、３１は、電気泳動用ゲルを指す。抽出プロセスの後、核酸試料は、カートリッジケーシング（例えば６１または６５）に接続された着脱式の部分６０またはマイクロチューブ５０２で容器１４に移される。
【0040】
カートリッジの流体工学には、好ましくは、工場充填の密閉された試薬タンクまたは容器、分析計およびプローブ、中空繊維フィルタ／膜、ミキサー、バルブ、ポンプ、ならびに血液試料管を受けるように適合された部位が含まれる。性能上、カートリッジは外部装置から供給される電源および圧力／真空を必要とする。流体工学の好ましい設計を図４～７に示し、以下に説明する。
【0041】
図４～７に示す全ての設計に共通して、コネクタ１は大気圧を指し、コネクタ２は装置によって提供される調整可能な真空圧を指し、５１は圧縮ガスまたは濾過空気の形態での調整可能な正圧を指す。さらに、いくつかの実施形態においては、現在模式図において別個の構成要素によって表されている流体バルブが、別個の構成要素として実装されてもよいが、他の実施形態においては、同じタイプのいくつかのバルブが、単一のマルチポジションおよび／またはマルチパスバルブに組み合わされてもよい。一例として、図７の模式図では、次のグループを３つのマルチポジションバルブに組み合わせることが可能である：ａ）７、２２、３３、３４、３５、３６、４６、４９、７１，８０、８１、８２、１３０、１３１、１３２、ｂ）４６、４９、１３１、１３２、ｃ）４９、１３２。この手法により、カートリッジおよび装置のフットプリントおよび複雑性をさらに低減することが可能である。
【0042】
別の構成では（図２１および２２を参照）、すべての空気圧バルブ（２２、４６、４９、１３１、１３２）を支持外部装置に組み込むことが可能であり、バルブ１３０、８５および５０は１つのマルチポジションバルブに組み合わせることが可能である。試薬空気バルブ（７、３３、３４、３５、３６、７１、８０、８１、８２、８３）は、試薬タンク（１５、３７～４３）の密閉機構に組み合わせた単回使用膜穿孔バルブとして実装することができる。インデックス付きバルブローターヘッド（５０６）を使用することにより、マルチポジションバルブを操作するための信頼性の高いインタフェースを、カートリッジと装置の間に形成することが可能である。
【0043】
カートリッジへの血液試料管の挿入後、流体工学は以下のように続く（図４参照）：外部装置は、カートリッジの置換用空気バルブ７３および３を開く。試薬容器１１は、細胞固定用の試薬Ｒ２を含む。容器１９内にはバルブ８を通じて真空があり、それによって血液が管１０から流れ、血液試料容器１９に移動する間に試薬Ｒ２がミキサー１６内で血液に加えられる。試料の全容量が１９に移送されると（血液管１０とミキサー１６の間のダクトからの流れは光学的にモニタ可能である）、バルブ７２を閉じ、バルブ８を通じて容器１９への通常の大気圧を戻す。続いて、中空繊維フィルタ２１を用いて血漿を分離する。フィルタ２１を通じた容器１９の試料の循環は、蠕動ポンプ１８によって促進される。バルブ２２が閉じられ、２３がバルブ９によって真空状態にされた血漿容器２０に対して開かれる。したがって、再循環させると、放出された血漿は連続的に容器２０に流れる。初めに、最良の濾過条件は、１０～１５本の平行繊維配列を通して８０～１８０ｍＬ／ｈ、繊維の外部真空が２０～４０ｍｂａｒであることが発見された。再循環血漿の量が３～４試料量に相当するか、または濾過された細胞が十分に濃縮されている場合（細胞密度は光学フィルタによりフィルタの入力から、血漿品質は出力チャネルの外側から測定される）、収率を増やし、細胞により強く結合した小胞およびバイオマーカーを放出させるために細胞をすすいでもよい。このために、容器７０内の試薬Ｒ１（２～３ｍＬ）が使用される。試薬Ｒ１は、バルブ７１および７２を開くことにより、濾過を続けながら加えることが可能である。
【0044】
濾過およびすすぎの後、ポンプ１８はオフにされ、バルブ２２は開かれ、バルブ９の真空入口の圧力は１００～１５０ｍｂａｒのレベルまで上昇し、それによって流れる空気が分離された血漿を容器２０の中に引き込む。フィルタ２１とバルブ２３の間のチャネル中に位置する光学センサーにより、空気が絶えずフィルタを流れることが確認されると、バルブ９から血漿容器２０内の真空は解放され、バルブ２２が閉じられる。次のステップでは、血漿を前処理試薬に必要な温度（例えば、３７～５５℃、カートリッジは外部装置の温度制御部に対するインタフェースを含む）まで容器２０内で加熱する。次に、容器１２内の試薬Ｒ３（例えばプロテイナーゼＫ）を空気バルブ４およびバルブ２７を開くことによって加え、その後、ポンプ２６によって試薬を血漿中に送ることが可能である。試薬が移送された時点で、バルブ２７は、血漿および試薬の混合物をバルブ２５およびミキサー２４を経由してポンプ２６により閉ループで容器へと再循環させることが可能な位置にセットされる。再循環により、試薬および血漿の効果的な相互作用が保証される。前処理が完了すると、容器１３内の試薬Ｒ４（例えば、バッファ、ＳＤＳ、マーカーおよび他の賦形剤）を、バルブ２７を経由してポンプにより加えることができる。第２試薬処理（任意に異なる温度で）が完了した時点で、バルブ２５はフィルタ２８に向けられ、それを通って前処理された血漿がポンプで送られ、カートリッジの下部区画上の電気泳動用ゲル充填ウェル２９に充填される。
【0045】
電気泳動が完了した際、精製され濃縮核酸試料は、回収ウェルにおいてランニングバッファ中にある。そこから、バルブ６によって容器１４を減圧状態にすることにより、回収することが可能である（真空度５０～２００ｍｂａｒ）。しかし、バルブ６が開かれる前に、空気バルブ７も開かれ、それによって試料は混合チャネル３２内で安定化試薬と混ざって核酸試料の室温での保存をサポートする（例えば、緩衝化ＥＤＴＡ、エタノール、プロパノール、ＰＥＧ等）。実行の終了時に、核酸試料を含む容器ＣＤ１４を、カートリッジから取り外すことが可能である。
【0046】
核酸抽出に磁性ビーズ技術を使用する別の実施形態において、プロセスは以下のステップに従って行われる：カートリッジへの血液試料管の挿入後、流体工学は以下のように続く（図５参照）：外部装置により調節された真空圧を接続部２に供給し、カートリッジの置換空気バルブ７３および３を開く。試薬容器１１は、細胞固定用の試薬Ｒ２を含む。容器１９内にはバルブ８によって真空が存在し、バルブ７２は管１０に対して開かれており、それによって血液が管１０から流れ、血液が試料容器１９に移動する間に試薬Ｒ２がミキサー１６内で血流に加えられる。試料の全容量が容器１９に移送された時点で（血液管１０とミキサー１６の間のダクトからの流れは光学的にモニタ可能である）、バルブ７２を閉じ、バルブ８によって容器１９へ通常の大気圧を戻す。これに続いて、中空繊維膜フィルタ２１を用いて血漿を分離する。フィルタ２１を通じた容器１９内の試料の循環は、蠕動ポンプ１８によって促進される。バルブ２２は閉じられ、バルブ２３が、バルブ９によって真空状態にされた血漿容器２０に開かれる。したがって、再循環させると、放出された血漿が連続的に容器２０に流入する。はじめに、最良の濾過条件は、１０～１５本の平行繊維の配列を通して８０～１８０ｍＬ／ｈ、繊維の外部真空が２０～４０ｍｂａｒであることが発見された。再循環血漿の量が３～４試料容積に相当するか、または濾過された細胞が十分に濃縮されている場合（細胞密度は光学フィルタによりフィルタの入力から、血漿品質は出力チャンネルの外側から測定される）、収率を増やし、細胞により強く結合した小胞およびバイオマーカーを放出させるために細胞をすすいでもよい。このために、容器７０内の試薬Ｒ１（２～３ｍＬ）が使用される。試薬Ｒ１は、バルブ７１および７２を開くことにより、濾過を続けながら加えることが可能である。
【0047】
濾過およびすすぎの後、ポンプ１８はオフにされ、バルブ２２は開かれ、バルブ９の真空入口の圧力は１００～１５０ｍｂａｒのレベルまで上昇し、それによって流れる空気が分離された血漿を容器２０の中に引き込む。フィルタ２１とバルブ２３との間のチャネルに位置する光学センサーにより、空気が常にフィルタを通じて流れていることが確認されると、バルブ９から血漿容器２０内の真空が解放され、バルブ２２が閉じられる。次のステップでは、血漿を前処理試薬に必要な温度（例えば、３７～５５℃、カートリッジは外部装置の温度制御部に対するインタフェースを含む）まで容器２０内で加熱する。次に、容器３７内の試薬Ｒ６（例えばプロテイナーゼＫ）を空気置換バルブ３３および試薬バルブ４４を開くことによって加え、その後、ポンプ２６によって試薬を血漿中に送ることが可能である。試薬容器３８、３９および４０からの追加の試薬Ｒ７、Ｒ８およびＲ９（例えば溶解バッファ、結合バッファおよび磁性ビーズ）は、置換空気バルブ９を開いたまま、各試薬についてバルブ３４、３５および３６をそれぞれ開き、バルブ４４を適切な流れのために調整することによって、ポンプ２６の助けを得て順次加えられる。試薬が移送された時点で、バルブ４４および４５は、血漿および試薬の混合物をバルブ４４および４５を経由しミキサー２４を通ってポンプ２６により閉ループで容器へと循環させることが可能な位置にセットされる。再循環により、試薬および血漿の効果的な相互作用が保証される。前処理および核酸結合ステップが完了すると、反応容器２０の内容物は、まずバルブ８２および９を周囲圧力まで開き、次にバルブ４５を調整することにより、ポンプ２６で廃棄物容器４３に移送される。核酸分子は、永久磁石または電磁石との磁性相互作用を通じて容器２０または隣接チャンバ８７に保持される静止磁性ビーズ相に結合している。
【0048】
廃棄物除去後、ミキサー２４へ流れを導くようにバルブ４５を変更し、空気置換バルブ８０および９を開くことによって容器４１から洗浄試薬Ｒ１０を導入し、ポンプ２６で試薬バルブ４４を通じて容器２０内に移送する。洗浄試薬の導入後、バルブ４４を戻して容器２０とミキサー２４の間の循環による磁性ビーズの洗浄を可能にし、磁場を除去してビーズを洗浄試薬に再懸濁させる。洗浄後、ビーズは再びチャンバ８７または容器２０に磁場で保持され、使用済みの洗浄液は、空気置換バルブ９および８２を開いた後、ポンプ２６でバルブ４５を通じて廃棄物容器４３に移送される。この試薬Ｒ１０を用いた洗浄ステップは、同様に１～３回繰り返すことが可能である。次に、バルブ４５を廃棄物に対して閉じ、置換空気バルブ８１および９を開き、バルブ４４を調整して試薬Ｒ１１を容器４２から容器２０に流すことにより、第２洗浄試薬Ｒ１１を容器２０に導入する。洗浄試薬Ｒ１１の導入後、バルブ４４を容器２０に戻して容器２０とミキサー２４の間の循環による洗浄を可能にし、磁場を除去してビーズを洗浄試薬に再懸濁させる。洗浄の完了後、ビーズ含有溶液のシステム内循環中に磁場をかけることにより、ビーズをチャンバ８７または容器２０内に保持する。次に、洗浄試薬は、まずバルブ４５を開き、次に置換空気バルブ９および８２を開くことによって、ポンプ２６で廃棄物容器４３に移送される。第２洗浄試薬Ｒ１１を用いた洗浄は、精製プロトコルの必要に応じて、同様の方法で１～３回繰り返すことが可能である。
【0049】
Ｒ１０およびＲ１１の両試薬による洗浄が終了した後、磁場によってチャンバ８７または容器２０内に保持されている磁性ビーズを核酸安定化試薬Ｒ１２に懸濁させることにより回復させる。この溶液は、まず置換空気置換バルブ７および９を開き、次に試薬バルブ４４を開いた後、ポンプ２６によって容器１５から容器２０に移送される。Ｒ１２が容器２０に移送されると、バルブ４４を調整してミキサー２４と容器２０の間を循環させ、磁場を除去して磁性ビーズを溶液に完全に再懸濁させる。次に、置換空気バルブ８３および５０が開かれて、安定化試薬Ｒ１２に懸濁したビーズが容器２０を出て最終試薬容器１４内へ流れることを可能にする。実行の終了時に、保存試薬Ｒ１２中に核酸試料を含む容器１４は、カートリッジの残りの部分から分離することが可能である。
【0050】
核酸抽出に磁性ビーズを使用する別の実施形態において、血漿分離ステップにおけるポンプは、ガス圧送システムに置き換えられる。ここで、抽出プロセスは以下のステップに従って行われる：カートリッジへの血液試料管の挿入後、流体システムは以下のように動作する（図６参照）：外部装置により、調節された真空圧を接続部２に、正ガス圧を接続部５１に供給し、カートリッジの置換空気バルブ１３０を開く。試薬容器１１は、細胞固定用の試薬Ｒ２を含む。容器４７内にはバルブ４６によって真空が存在し、バルブ１５０は管１０に対して開かれており、それによって血液が管１０から流れ、血液が試料容器４７に移動する間に試薬Ｒ２がミキサー１６内で流れに混合される。試料の全容量が容器４７に移送された時点で（血液管１０とミキサー１６の間のダクトからの流れは光学的にモニタ可能である）、バルブ１５０を閉じ、バルブ４６を通じて容器４７へ通常の大気圧を戻す。これに続いて、中空繊維膜フィルタ２１を用いて血漿を分離する。ここで、バルブ２２は閉じられ、２３が、バルブ５０によって真空状態にされた血漿容器２０に対して開かれる。したがって、再循環させると、放出された血漿が連続的に容器２０に流入する。フィルタ２１を通じた容器４７からの血液の移送は、バルブ４９を大気圧に開き、調節源５１からバルブ４６を通じて容器４７に正ガス圧（当初は１５０～２５０ｍｂａｒ）をかけることによって促進される。これにより、血液試料は、容器４７からフィルタ２１を通じて第２容器４８に移送される。このプロセスの完了は、容器４７とフィルタ２１の間のラインへの空気の導入を検出することによってモニタすることが可能である。フィルタを通した試料の第１移送が完了した時点で、バルブ４６を大気圧に開き、バルブ４９を通じて調節されたガス圧を入れることにより容器４８を加圧する（２００～３８０ｍｂａｒの範囲の圧力での第２濾過）。これにより、繊維フィルタ２１を通じた血液試料の第２移送が促進される。容器４８とフィルタ２１との間に直列した光学空気センサーによって検出されるこの逆移送の完了後、バルブ４９を大気圧に開き、その直後にバルブ４６を調節ガス源に対して開くことで容器４７を加圧する（３００～４５０ｍｂａｒの圧力を使用する第３濾過）。この順序により、フィルタ２１を通じた容器４８への第３血液の移送が生じる。バルブ４６を大気に開いて容器４７内の圧力を解放すると流れが止まり、置換空気バルブ７１、試薬バルブ８５を開き、バルブ４９により容器４８内に真空を入れることにより、容器７０から細胞すすぎ試薬Ｒ１を容器４８に加えることができる。残存血液および洗浄試薬の両方が容器４８に入った後、バルブ８５および７１を閉じ、バルブ４６を大気に開き、バルブ４９によって容器４８を加圧して（すすぎ濾過２６０～５００ｍｂａｒ）、フィルタ２１を通じた血液の第４循環を駆動させる。
【0051】
濾過およびすすぎステップの完了後、チャンバ４７および４８の両方が排気されて大気圧にされ、最後にバルブ４６および４９が閉じられて血液試料のいかなる流れも止められる。次に、バルブ２２が開かれ、バルブ９の真空入口の圧力は１００～１５０ｍｂａｒのレベルまで上昇し、それによって流れる空気が分離された血漿を容器２０内に引き込む。フィルタ２１とバルブ２３の間のチャネルに位置する光学センサーにより、空気が常にフィルタを通じて流れていることが確認されると、バルブ９によって血漿容器２０内の真空が解放され、バルブ２２および２３が閉じられる。次のステップでは、血漿を前処理試薬に必要な温度（例えば、３７～５５℃、カートリッジは外部装置の温度制御部に対するインタフェースを含む）まで容器２０内で加熱する。次に、容器３７内の試薬Ｒ６（例えばプロテイナーゼＫ）を置換空気バルブ３３およびバルブ４４を開くことによって加え、その後、ポンプ２６によって試薬を血漿中に送ることが可能である。試薬容器３８、３９および４０からの追加の試薬Ｒ７、Ｒ８およびＲ９（例えば溶解バッファ、結合バッファおよび磁性ビーズ）は、置換空気バルブ９ならびに各試薬についてバルブ３４、３５および３６をそれぞれ開き、バルブ４４を適切な流れのために調整することによって、ポンプ２６の助けを得て順次加えられる。試薬が移送された時点で、バルブ４４は、血漿および試薬の混合物をバルブ４５およびミキサー２４を経由してポンプ２６により閉ループで容器へと循環させることが可能な位置にセットされる。再循環により、試薬および血漿の効果的な相互作用が保証される。前処理および核酸結合ステップが完了すると、反応容器２０の内容物は、まず置換空気バルブ８２および５０を開き、次にバルブ４５を調整することによって、ポンプ２６で廃棄物容器４３に移送される。核酸分子は、試薬の最後の循環ラウンドの間に可能になった永久磁石または電磁石との磁性相互作用を通じて、容器２０または隣接チャンバ８７に保持される静止磁性ビーズ相に結合する。捕捉プロセスの長さは、試薬溶液の粘度およびビーズとの化学的相互作用によって決定される。
【0052】
廃棄物除去後、ミキサー２４へ流れを導くようにバルブ４５を変更し、空気置換バルブ８０および５０を開いて容器４１から洗浄試薬Ｒ１０を導入し、ポンプ２６でバルブ４４を通じて容器２０内に移送する。洗浄試薬の導入後、バルブ４４を戻して容器２０とミキサー２４の間の循環による洗浄を可能にし、磁場を除去してビーズを洗浄試薬に再懸濁させる。洗浄後、ビーズは再び容器２０またはチャンバ８７に磁場で保持され、溶液は置換空気バルブ８２および５０を開いた後、ポンプ２６でバルブ４５を通じて廃棄物容器４３に移送される。この試薬Ｒ１０を用いた洗浄ステップは、同様の方法で１～３回繰り返すことが可能である。次に、置換空気バルブ８１および５０を開き、バルブ４４を調整して試薬Ｒ１１を容器４２から容器２０に流すことにより、ポンプ２６で第２洗浄試薬Ｒ１１を容器２０に導入する。洗浄２試薬Ｒ１１の導入後、バルブ４４を容器２０に戻して容器２０とミキサー２４の間の循環による洗浄を可能にし、磁場を除去してビーズを洗浄試薬に再懸濁させる。洗浄の完了後、ビーズ溶液の循環中に磁場をかけることにより、再びビーズを容器２０またはチャンバ８７内に保持する。次に、洗浄試薬は、まずバルブ４５、８２および５０を開くことにより、ポンプ２６で廃棄物容器４３に移送される。第２洗浄試薬Ｒ１１を用いた洗浄は、精製プロトコルの必要に応じて、同様の方法で１～３回繰り返すことが可能である。
【0053】
Ｒ１０およびＲ１１の両試薬による洗浄が終了した後、磁場によって容器２０またはチャンバ８７内に保持されている磁性ビーズを、今度は、まず置換空気バルブ７および５０、次に試薬バルブ４４を開いた後、ポンプ２６によって容器１５から移送される核酸安定化試薬Ｒ１２に懸濁させることにより回復させる。Ｒ１２が容器２０内に移ると、バルブ４４を調整してミキサー２４と容器２０の間を循環させ、そこで磁場を除去して磁性ビーズを溶液に完全に再懸濁させる。次に、置換空気バルブ８３および５０が開かれ、安定化試薬Ｒ１２中のビーズが容器２０から出て最終試薬容器１４へ流れることを可能にする。実行の終了時に、保存試薬Ｒ１２中に核酸試料を含む容器１４は、カートリッジの残りの部分から分離することが可能である。
【0054】
核酸抽出に磁性ビーズを使用する別の実施形態において、流体操作はすべて真空とガス圧を用いて行われる。ここで、抽出プロセスは以下のステップに従って行われる：カートリッジへの血液試料管の挿入後、流体システムは以下のように動作する（図７参照）：外部装置により、調節された真空圧を接続部２に、正ガス圧を接続部５１に供給し、カートリッジの置換空気バルブ１３０を開く。試薬容器１１は、細胞固定用の試薬Ｒ２を含む。容器４７内にはバルブ４６によって真空が存在し、バルブ１５０は管１０かれに対して開ており、それによって血液が管１０から流れ、血液が試料容器４７に移動する間に試薬Ｒ２がミキサー１６内で流れに加えられる。試料の全容量が容器４７に移送された時点で（血液管１０と容器４７の間のダクトからの流れは光学的にモニタ可能である）、バルブ１５０を閉じ、バルブ４６を通じて容器４７へ通常の大気圧を戻す。これに続いて、中空繊維膜フィルタ２１を用いて血漿を分離する。ここで、バルブ２２は閉じられ、１３３はバルブ１３２によって真空状態にされた血漿容器２０に対して開かれる。したがって、再循環させると、放出された血漿が連続的に容器２０に流入する。ミキサー１３５、８４およびフィルタ２１を通じた容器４７からの血液の移送は、バルブ４９を大気圧に開き、調節源５１からバルブ４６を通じて容器４７に正ガス圧（当初は１５０～２５０ｍｂａｒ）をかけることによって促進される。これにより、血液試料は、容器４７からフィルタ２１を通じて第２容器４８に移送される。このプロセスの完了は、容器４７とフィルタ２１の間のラインへの空気の導入を検出することによってモニタすることが可能である。フィルタを通した試料の第１移送が完了した時点で、バルブ４６を大気圧に開き、バルブ４９を通じて調節されたガス圧を入れることにより容器４８を加圧する（２００～３８０ｍｂａｒの範囲の圧力での第２濾過）。これにより、繊維フィルタ２１を通じた血液試料の第２移送が駆動される。容器４８とフィルタ２１の間に直列した光学空気センサーによって検出される逆移送の完了後、バルブ４９を大気圧に開き、その直後にバルブ４６を調節ガス源に対して開くことで容器４７を加圧する（３００～５００ｍｂａｒの圧力を使用する第３濾過）。この順序により、フィルタ２１を通じた容器４８への血液の第３移送が生じ、続いて、容器４８からフィルタ２１を通じて再び容器４７への、先に記載した順序での別の移送が行われる（４００～５５０ｍｂａｒの圧力を使用する第４濾過）。バルブ４９を大気に開いて容器４８内の圧力を解放すると流れが止まり、置換空気バルブ７１、試薬バルブ８５を開き、バルブ４６により容器４７内に真空を入れることにより、容器７０から細胞すすぎ試薬Ｒ１を容器４７に加えることができる。残存血液および洗浄試薬の両方が容器４７に入った後、バルブ８５を閉じ、バルブ４６によって容器４７を加圧して（すすぎ濾過圧２５０～５００ｍｂａｒ）、フィルタ２１を通じた血液の第４循環を駆動させる。
【0055】
濾過およびすすぎステップの完了後、チャンバ４７および４８の両方が排気されて大気圧にされ、最後にバルブ４６および４９が閉じられて血液試料のいかなる流れも止められる。次に、バルブ２２が開かれ、バルブ９の真空入口の圧力は１００～１５０ｍｂａｒのレベルまで上昇し、それによってバルブ２２から流入する空気が分離された血漿を容器２０内に引き込む。フィルタ２１とバルブ１３３の間のチャネルに位置する光学センサーにより、空気が常に濾液側のフィルタ２１を通じて流れていることが確認されると、バルブ１３２によって血漿容器２０内の真空が解放され、バルブ２２および１３３が閉じられる。次のステップでは、血漿を前処理試薬に必要な温度（例えば、３７～５５℃、カートリッジは外部装置の温度制御部に対するインタフェースを含む）まで容器２０内で加熱する。次に、容器３７から試薬Ｒ６（例えばプロテイナーゼＫ）を置換空気バルブ３３およびバルブ１３２を真空に開くことによって加え、その後、試薬バルブ１３３を予め規定された時間開くことにより容器２０内の血漿に試薬を移送する。試薬容器３８、３９および４０からの追加の試薬Ｒ７、Ｒ８およびＲ９（例えば溶解バッファ、結合バッファおよび磁性ビーズ）は、各試薬について置換空気バルブ３４、３５、３６をそれぞれ開き、バルブ１３２により反応容器２０を真空にし、バルブ１３３を適切な試薬の流れのために調整することによって同様の方法で順次加えられる。試薬が移送された時点で、バルブ１３３を閉じたままにして、ミキサー２４を通じて血漿および試薬の混合物を容器２０と１３４の間で循環させる。これは、バルブ１３２により容器２０を大気圧にし、バルブ４５を開き、バルブ１３１により容器１３４を真空圧にすることによって達成される。逆移送は、バルブ１３１により容器１３４を大気圧に開き、バルブ１３２で容器２０を真空にすることによって行われる。混合は、移送ステップを繰り返すことにより、プロトコルで必要とされる限り続けることが可能である。最後の移送の後、試料は容器２０内に残る。前処理および核酸結合ステップが完了すると、反応容器２０の内容物は、まず置換空気バルブ８２、試薬バルブ１３３を開き、次にバルブ１３２によって容器２０を正ガス圧に調整することによって、ガス圧で廃棄物容器４３に移送される。核酸分子は、永久磁石または電磁石との磁性相互作用を通じて、容器２０または隣接チャンバ８７に保持される静止磁性ビーズ相に結合する。
【0056】
廃棄物除去後、ミキサー２４へ流れを導くようにバルブ１３３を変更し、置換空気バルブ８０を開き、バルブ１３２により容器２０を真空圧にし、試薬バルブ１３３を予め規定された時間開くことにより、容器４１から洗浄試薬Ｒ１０を導入する。洗浄試薬の導入後、バルブ１３３を再び閉じ、磁場を除去してビーズを洗浄試薬に再懸濁させる。洗浄は、ミキサー２４を通じて容器２０と１３４の間で溶液を循環させることによって行われる。これは、バルブ１３２により容器２０を大気圧にし、バルブ４５を開き、バルブ１３１により容器１３４を真空圧にすることによって達成される。逆移送は、バルブ１３１により容器１３４を大気圧に開き、バルブ１３２で容器２０を真空にすることによって行われる。洗浄は、２つの移送ステップを連続して繰り返すことにより、必要とされる限り続けることが可能である。最後の移送サイクルの間、ビーズは磁場をかけることにより容器２０またはチャンバ８７に回収される。最後の移送の後、溶液は容器２０内に残る。
【0057】
洗浄後、ビーズは磁場に保持され、試薬バルブ１３３、置換空気バルブ８２を開き、バルブ１３２から容器２０内にガス圧を入れることにより、洗浄液が廃棄物容器４３に移送される。この試薬Ｒ１０を用いた洗浄ステップは、同様の方法で１～３回繰り返すことが可能である。次に、空気置換バルブ８１を開き、バルブ１３２で容器２０を真空圧にし、試薬バルブ１３３を予め規定された時間容器４２に対して開くことにより、第２洗浄試薬Ｒ１１を容器２０内に導入する。洗浄２試薬Ｒ１１の導入後、バルブ１３３を閉じ、磁場を除去してビーズを洗浄試薬に再懸濁させる。洗浄は、ミキサー２４を通じて容器２０と１３４の間で溶液を循環させることによって行われる。これは、バルブ１３２を通じて容器２０に大気圧を入れ、バルブ４５を開き、バルブ１３１によって容器１３４を真空圧に調整することにより達成される。逆移送は、バルブ１３１によって容器１３４を大気圧に開き、バルブ１３２で容器２０を真空にすることによって行われる。洗浄は、移送ステップを繰り返すことにより、必要とされる限り続けることが可能である。最後の移送サイクルの間、ビーズは磁場をかけることにより容器２０またはチャンバ８７に回収される。最後の移送の後、溶液は容器２０内に残る。
【0058】
洗浄後、反応容器２０からの溶液は、まず置換空気バルブ８２、試薬バルブ１３３を開き、次にバルブ１３２で容器２０を正ガス圧に調整することによって、ガス圧で廃棄物容器４３に移送される。第２洗浄試薬Ｒ１１を用いた洗浄は、精製プロトコルの必要に応じて、同様の方法で１～３回繰り返すことが可能である。
【0059】
Ｒ１０およびＲ１１の両試薬による洗浄の終了後、磁場によって容器２０またはチャンバ８７に保持されている磁性ビーズを、核酸安定化試薬Ｒ１２に懸濁させることにより回収する。この溶液は、置換空気バルブ７を開き、バルブ１３２により容器２０を真空にし、試薬バルブ１３３を予め規定された時間開くことにより容器１５から移送される。Ｒ１２が容器２０内に移ると、バルブ１３３を閉じ、バルブ４５を開いてバルブ１３１および１３２により過小および過大圧力を調節することにより、容器２０と１３４の間での試料移送を可能にする。磁場が除去されると、バルブ１３１を真空に、およびバルブ１３２を大気圧に開くことにより、容器２０から容器１３４へ流れる溶液にビーズを懸濁させる。ビーズを有する保存溶液が容器１３４に移ると、バルブ１３２を真空に、およびバルブ１３１を大気圧に開くことによって、再び容器２０に移送される。最後のステップにおいて、置換空気バルブ８３、試薬バルブ１３３およびバルブ１３２を正ガス圧に開くことによって、ビーズ溶液は最終試料容器１４へ移送される。実行の終了後、保存試薬Ｒ１２中に核酸試料を含む容器１４は、カートリッジの残りの部分から分離することが可能である。この容器は、通常のマイクロチューブ、または図１４に記載されるような追加の特徴を組み合わせたより高度な設計の形態をとることが可能である。
【0060】
好ましい実施形態において、走行チャンバ（３１）内の電気泳動用ゲル（５５）の形態は、円のセクターに相当し（図８を参照）、そのため、広い方の端が、ゲル内で精製および濃縮される５～７ｍＬの血漿試料のための充填ウェル（２９）を含む。セクターの形態は、ゲルに対して不均一な電場を作り出し、分子の層流パターンを補償し、それによって移動帯がその形状を保持し、サイズ分離が可能となる。同様の効果は、例えば長方形または三角形のゲルでは、移動帯の形状が著しく広がり、サイズ分離および収率が制限されるため、容易に達成できない。
【0061】
好ましくは、ゲルセクターの先端は、ゲルが、３００～６００μＬの容量を有する、ランニングバッファで満たされた２つのフィルタの間の空間がある回収容器（３０）内で終わるように切り詰められる（図８を参照）。回収容器のゲル側には、核酸分子が通過可能なフィルタ（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ Ｄｕｒａｐｏｒｅ、０．４５μｍ、ＰＶＤＦ）がある。その反対側には、核酸の通過を防ぎ、ランニングバッファに含まれる小サイズのイオンを透過させる別のフィルタがある。このようなフィルタ物質としては、例えば、１５ｎｍのフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ、０．０１５μｍ、ＰＣ）、サイズ選択範囲２０～７０ｋＤａのＰＶＤＦ限外濾過膜またはイオン置換膜（例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｉｏｎ、Ｘ３７－５０）が挙げられる。
【0062】
電気泳動用ゲル中の核酸の平均移動距離は約４０ｍｍ、好ましいゲルアガロース濃度は０．５～１％、好ましいゲル容量は５０～１００ｍＬ、および好ましいランニングバッファ容量は約２００ｍＬである。ゲル上では、１５０～２５０Ｖ（１０～１７Ｖ／ｃｍ）の電圧が好ましくは維持され、ランニング時間は３０から６０分以下である。電気泳動中、ランニングバッファ（５３）はｐＨの変化を防ぐため、ゲルの両端間で再循環される。これを達成するため、オリフィス５６と５７との間で液体を移送するために蠕動ポンプが使用され、このためにポンプはランニングバッファを再循環させるために試料チャネルの隣に第２ホースを有する。バッファの流量は１０～３０ｍＬ／分とすることが可能である。適切な活性ランニングバッファの成分には、５～２５ｍＭの濃度のホウ酸塩、リン酸塩およびグリシンが含まれる。主に、１０～２０ｍＭのホウ酸塩バッファが試験に使用されている。再循環バッファまたはゲルはまた、電気泳動中に冷却することが可能であり、それによって、ランニング時間が短縮されるように維持電圧を上昇させることが可能である。
【0063】
ゲル中の核酸の移動は、回収容器の前でゲルを通じて蛍光または吸光度を測定する光学センサーによってモニタされる。実行が完了すると、ゲルの極性が２から２００秒間反転し、それによって核酸分子が回収容器の後部フィルタから回収容器内のランニングバッファへと除去され、そこから核酸試料がゲルから汲み出される。
【0064】
特定の実施形態において、本発明は、したがって、血液試料から循環核酸を抽出するためのカートリッジを対象とし、該カートリッジは、無細胞で最小量の細胞核酸を有する血漿を調製するために、血液試料から血漿を濾過するための第１区画を含む。好ましくは、血漿は、細胞核酸の漏出を最小にするために、濾過の前に第１区画内で細胞を固定することによって得られる。また、カートリッジは、核酸抽出を行うための第２区画を含み、ここで第１区画は中空繊維フィルタを含み、第２区画は核酸抽出用チャンバおよび磁性ビーズ等の固相結合物質を含む。好ましくは、前記第１区画は、血液試料を受ける手段も含む。前記第１区画において、好ましくは、カートリッジは、前記血液試料と前記第１区画に封入された細胞固定試薬を混合する手段を含む。
【0065】
別の好ましい実施形態において、前記第１区画は、中空繊維膜において前記血液試料から分離された血漿試料と、前記第１区画に封入された酵素または化学試薬を混合する手段を含む。
【0066】
別の好ましい実施形態において、前記第１区画は、前記酵素または化学試薬と混合された分離血漿を、前記第１区画から前記第２区画に移送する手段を含む。
【0067】
別の好ましい実施形態において、前記カートリッジ、より好ましくは第２区画は、前記カートリッジに、より好ましくは前記第２区画に封入された保存剤または安定化剤と、該保存剤または安定化剤および前記固相結合物質に結合した核酸断片を混合する手段と、前記核酸断片と前記保存剤または安定化剤の混合物を保存するための着脱式容器とを含む。
【0068】
好ましくは、混合の手段は、いかなる機械的な作動も必要としない低コストの受動的流体構造を含み、むしろ、パターン化されたチャネルにおける液体－固体懸濁液の乱流様流動特性を利用するものである。図９は、試薬溶液の臨界レイノルズ数（Ｒｅ）を克服するために必要な流量を減少させ、中～高粘度の流体における効率的な乱流混合を可能にするために使用可能な代替流体チャネル上面図構成（２４ａ～ｄ）を示す。これらのうち、構成２４ｃおよび２４ｄが最も低い臨界Ｒｅを提供するが、その形状はチャネルからの液体および固体試薬の除去効率を低下させる可能性があるため、この点では構造２４ｃが好ましい。構成２４ａおよび２４ｂは、既存の試薬の除去の容易さの点で妥協点を提供するが、効率的な混合のためにより高い流量を必要とする。
【0069】
さらに、動的な機械的混合を使用することも可能である。回転性撹拌機ブレードを使用する好ましい一構成を図１２に示す。ここで、ブレード１１４は、上部ピース１１２および下部ピース１１６を連結することによって形成された閉鎖液体チャンバ２０ａ（図４～７を参照）内で回転させることが可能である。液体はオリフィス１１７および１１８を通じて、空気圧は接続部１１３を通じて移動することが可能である。チャンバは、保持板１１０によってチャンバ上部エレメントに対して加圧されるエラストマーローターシールディスク１１１によって環境から密閉されて、囲まれたシステムを提供する。シール１１１の円形内面は、ブレード１１４の上部軸受として機能し、容器２０ａ内で回転することを可能にする。ブレード１１４を保持するシャフトの下端は、チャンバ２０ａ底部の球状凹部１１５において第２軸受として機能するように球状の突出を有する。ブレードの回転は、シャフト１１８の上部を通じた装置内のアクチュエータへの機械的な接続によって提供される。
【0070】
あるいは、液体試薬に懸濁された固相物質を操作することによって、動的混合を提供することが可能である。この用途に特に適切であるのは常磁性粒子であり、核酸の固相可逆結合剤として機能するようにコーティング層を含むことも可能である。図１３は、好ましいミキサー構成２０ｂ（図４～７を参照）を実証しており、永久磁石または電磁石１２０および１２５が、液体が接続部１２３および１２４を通じて流れることが可能な、板１２１および１２２によって形成された容器２０ｂ内の粒子含有液相を操作するのに使用される。永久磁石１２０および１２５を用いた操作では、一度に磁石の１つを上板または下板１２１および１２２上の外側凹部に持ってきて、溶液中の粒子をチャンバ２０ｂの磁石側に引き寄せる。効率的な混合を行うために、磁石１２０および１２５を交互にしながら、同時にもう一方の磁石をチャンバから動かすという移動ステップを数回繰り返す。電磁石では、電流が印加される磁石を交互にすることで同様の動作を行うことが可能である。液体および磁性粒子の動的特性に基づいて、混合動作のサイクル速度を調整して、各サイクル中に効率的な物質移送ができるようにすることが可能である。板状磁石１２０または１２５との相互作用はまた、液相の置換を可能にするために磁性粒子を容器２０ｂ内に保持するための効率的な手段も含む。
【0071】
好ましい一構成において、カートリッジはまた、懸濁相の置換を可能にするために磁性粒子を捕捉および保持するための流体固定具を含むことも可能である。図１０は、ビーズ捕捉固定具８７（図５～７を参照）の代替上面図構成（ａ～ｆ）を示し、図１１は、固定具８７の代替側面図構成（ｇ～ｋ）を示す。図１１はまた、磁極の好ましい相対的配向を定義する磁力線の部分図も含む。図１０および１１からの上面図および側面図の構成の任意の組は、異なる動的特性を有する流体試薬および粒子のための効率的な捕捉形状を形成するために、互いに組み合わせることが可能である。図１１のこれらの構成のうち、８７ｊはレイノルズ数の高い流れに最も適用可能であり、８７ｋ、８７ｉ、８７ｈおよび８７ｇは、Ｒｅが減少する流れに対しこの順で適用可能である。図１０でも同様に、構成８７ｃは高Ｒｅの流れにより適切であり、構成８７ｅ、８７ｆ、８７ｂ、８７ｄおよび８７ａは低Ｒｅの流れの状態のために調整されている。指定された捕捉形状は、固定具への距離を作動させる機構を有する電磁石または永久磁石と組み合わせて使用することが可能である。磁場の除去後の捕捉された物質の放出は、流量を増加させ、および／または固定具を通る流れの方向を繰り返し変更することによって強化することが可能である。
【0072】
カートリッジの好ましい実施形態において、試料物質を含む採取管に直接接続するためのソケットがある（図２１および図２２の５０３）。より詳細には（図２２参照）、このソケットは、試料の流出を可能にし、同時に管内の圧力変化を補償するために空気の制御された流入を可能にするために試料管セプタムシールを穿刺する針５０４および５０５を含む。
【0073】
カートリッジ内の流体チャネルは、任意の適切な設計であってよく、１つまたは複数の相互接続された層中に配置することが可能である。図２２に示すように、流体システムの高密度設計および低コスト製造を容易にするために、２つの別個の積層物質層（５０７および５０９）を使用してチャネルを形成してもよい。部分的に光学的透明性を有する物質を組み込み、カートリッジ外部ケーシング（５０８）に適切な切り込みを配置することにより、チャネル内の試料吸光度を測定することによって流体プロセスを観察して、正確なプロセス制御を可能にすることができる。あるいは、非接触型容量性電子センシングを使用して、任意の容器またはタンク（例えば、２０、４７、４８、１３４）内の試料の現在の容積を測定し、現在のプロセス状態を推測することができる。
【0074】
別の好ましい実施形態において、前記カートリッジ、より好ましくは第２区画は、前記カートリッジに、より好ましくは前記第２区画に封入された核酸特異的色素と、前記色素と前記固相結合物質に結合した、または前記結合物質から洗浄された核酸断片を混合する手段とを含む。好ましくは、前記核酸特異的色素は、二本鎖ＤＮＡ特異的色素である。この実施形態において、カートリッジおよび／または図１４に記載の前記着脱式容器は、好ましくは、色素に結合した単離核酸の量を測定するために、試料または混合物に光線を導くように配置された透明窓（１４３）を含む。着脱式容器はまた、図２１のカートリッジ構成で実証されるように、適切なコネクタインタフェース（５０１）において通常の実験用マイクロチューブ（５０２）の形態をとることもできる。ここで、蛍光測定は、片側に透明な窓を備える磁性ビーズ保持領域（８７）において同様の方法で行ってもよい。
【0075】
より詳細には、本発明の一実施形態に従えば、着脱式試料移送容器６０（図１４を参照）は、入口（１４２）および出口（１４９）の２つの常開の単動バルブ、液体試料を保存するための容器１４ならびに分析のために容器から試料を回収するための２つの針セプタム（１４４および１４８）からなる。さらに、試料情報を記録するために、試料容器は、装置と接続するための電気コネクタ面１４５を有する書き込み可能なデジタルメモリチップ１４６および手動試料情報のためのペン書き込み領域１４７を有し、離脱面１４１に沿ってカートリッジ外部ケーシング（１４０）から分離可能である。ここで、１４０は、いくつかの実施形態において、部品６１もしくは１７０（図２）または６５もしくは１７１（図３）を指すことが可能である。
【0076】
試料はカートリッジ内で処理された後、バルブ１４２を通り測定領域１４３を横切って容器１４内移送される。一実施形態において、試料は液体形態であり、抽出された核酸の濃度は、保存容器への試料移送の流れの間に測定される。別の実施形態において、試料は磁性ビーズに吸着されたままであり、処理装置によって磁石が回収領域１４３または８７の上に配置され、流れの中のビーズがその領域に回収される。その後、蛍光強度測定を行うことが可能である。
【0077】
ここで図１５に示す構成によれば、磁石１５０は測定領域１４３においてビーズ（１５１）を保持する。液相試料の場合、１５１は測定固定具領域１４３内の体積を指す。次に対物レンズ１５２が、光源１５７からの励起光ビームをコリメータレンズ１５６およびダイクロイックスプリッタミラー１５５を通じて、エリア１４３に移送する。得られた試料蛍光は、集束レンズ１５４によって集光する光検出器１５３によって電気信号に変換される。適切な励起源としては、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー光源、エキシマランプおよびガス放電電球が挙げられる。発光光子は、フォトダイオード、フォトトランジスタ、単一光子アバランシェ検出器、電荷結合素子（ＣＣＤ）、相補型金属酸化膜半導体検出器（ＣＭＯＳ）または光電子増倍管（ＰＭＴ）で回収することが可能である。
【0078】
本発明はさらに、上記の任意の実施形態で定義されたカートリッジを受けるように適合されたドッキング部位またはスロットを有する装置を含む血液試料から核酸断片を抽出するための自動化システムを対象とし、前記装置は、前記カートリッジにおいて血漿濾過プロセスを操作するように適合された手段と、ａ）核酸に特異的な結合物質を用いて前記カートリッジにおいて核酸精製を操作するように適合された手段またはｂ）前記カートリッジにおいてゲル電気泳動を操作するように適合された手段とを含む。カセットまたはカートリッジに／から、バッファまたは他の試薬を供給および除去する自動化システムと、電気泳動のための電圧の制御された印加については、例えば特許文献５に記載されている。
【0079】
当業者には、本発明の原理は血液試料からのタンパク質バイオマーカーの精製および保存に適用可能であることも理解されるであろう。したがって、本発明はまた、血液試料からタンパク質バイオマーカーを抽出するための方法であって：
ａ）個人から採取した血液試料を提供するステップと；
ｂ）好ましくは、固定試薬で試料中の血球を安定化させるステップと；
ｃ）前記血液試料から血漿を分離するために、中空繊維フィルタを用いることにより前記血液試料を濾過するステップと；
ｄ）好ましくは、分離された細胞画分を洗浄試薬で洗浄し、ウォッシュアウトを回収するステップと；
ｅ）血漿試料中に存在するバイオマーカーを常に精製するために、ステップｃ）で得られた血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを、タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるステップと；
ｆ）前記結合物質に結合したタンパク質を回収するステップと；
ｇ）ステップｆ）で回収されたタンパク質を保存剤または安定化剤と混合するステップとを含み；
ステップｂ）～ｇ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、ステップｃ）で得られた血漿試料を前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジ上で行われる、方法も対象とする。
ａ）個人から採取した血液試料を提供するステップと；
ｂ）好ましくは、固定試薬で試料中の血球を安定化させるステップと；
ｃ）前記血液試料から血漿を分離するために、中空繊維フィルタを用いることにより前記血液試料を濾過するステップと；
ｄ）好ましくは、分離された細胞画分を洗浄試薬で洗浄し、ウォッシュアウトを回収するステップと；
ｅ）血漿試料中に存在するバイオマーカーを常に精製するために、ステップｃ）で得られた血漿試料、および好ましくはステップｄ）で回収されたウォッシュアウトを、タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるステップと；
ｆ）前記結合物質に結合したタンパク質を回収するステップと；
ｇ）ステップｆ）で回収されたタンパク質を保存剤または安定化剤と混合するステップとを含み；
ステップｂ）～ｇ）は、自動化システムにおいて、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、ステップｃ）で得られた血漿試料を前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッジ上で行われる、方法も対象とする。
【0080】
一実施形態において、本発明は、血液試料から血漿を濾過するための第１区画と、血漿試料をタンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質と接触させるための第２区画とを含むカートリッであって、第１区画は中空繊維フィルタを含み、第２区画はタンパク質精製のためのチャンバおよび前記カートリッジに封入されタンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質を含み、前記結合物質は好ましくは磁性ビーズを含む、カートリッジを対象とする。より好ましい実施形態において、磁性ビーズは、タンパク質バイオマーカーに特異的な抗体でコーティングされている。
【0081】
一実施形態において、本発明は、タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質を含む、上記に定義されたカートリッジを受けるように適合されたドッキング部位を有する装置を含む血液試料から核酸断片を抽出するための自動システムを対象とし、前記装置は、前記カートリッジにおいて血漿濾過プロセスを操作するように適合された手段と、前記タンパク質バイオマーカーに特異的な結合物質を用いて前記カートリッジにおいてタンパク質精製を操作するように適合された手段とを含む。
【0082】
本発明の背景を照らすために、特に、その実施に関して追加の詳細を提供するために本明細書で使用される刊行物および他の資料は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【0083】
実施例１
異なるポンピングモードで中空繊維濾過を用いて調製した血漿の比較
２名からＫ２ＥＤＴＡ採血管に血液を採取し、２１℃で最大４時間保存した。合計フィルタ表面積１８００ｍｍ２のポリプロピレン（平均孔径＜５００ｎｍ）中空繊維フィルタのセットに試料を通過させることによって、全血から血漿分離を行った。繊維は１０本ずつ並列に配置し、繊維の全長は１７００ｍｍであった。繊維の外側の血漿区画の圧力は、大気に対して－４０ｍｂａｒであった。全血試料（８～９ｍＬ）をフィルタに１または３回通過させ、分離した血漿を回収した。参照分離は、遠心分離（２０００ｇ、１０分、２１℃）により行った。血漿品質は、吸光値（５７６ｎｍで、ＥＤＴＡ中のＨｂＯ２について）を測定し、遠心分離の試料と比較することにより評価した。血液流量は、蠕動ポンプ、シリンジポンプおよびガス圧ポンプ（濾過サイクル数に応じて２４０～５００ｍｂａｒの正圧）とも１２０ｍＬ／時間であった。分離した血漿の平均収率は、フロースルー試料の細胞間隙に残存するＤＮＡを回収するために使用したその後の任意のすすぎ試薬の量を除くと、遠心分離で血液量の４７％、シリンジポンプ（シングルサイクル、比較不可）で１６％、蠕動ポンプで４１％、およびガス圧ポンピングで４２％であった。血漿中の平均Ａ５７６値は、遠心分離、シリンジポンプ、蠕動ポンプおよびガス圧ポンプで、それぞれ０．８９０、１．２８３、２．９７０および２．２４２であった。
異なるポンピングモードで中空繊維濾過を用いて調製した血漿の比較
２名からＫ２ＥＤＴＡ採血管に血液を採取し、２１℃で最大４時間保存した。合計フィルタ表面積１８００ｍｍ２のポリプロピレン（平均孔径＜５００ｎｍ）中空繊維フィルタのセットに試料を通過させることによって、全血から血漿分離を行った。繊維は１０本ずつ並列に配置し、繊維の全長は１７００ｍｍであった。繊維の外側の血漿区画の圧力は、大気に対して－４０ｍｂａｒであった。全血試料（８～９ｍＬ）をフィルタに１または３回通過させ、分離した血漿を回収した。参照分離は、遠心分離（２０００ｇ、１０分、２１℃）により行った。血漿品質は、吸光値（５７６ｎｍで、ＥＤＴＡ中のＨｂＯ２について）を測定し、遠心分離の試料と比較することにより評価した。血液流量は、蠕動ポンプ、シリンジポンプおよびガス圧ポンプ（濾過サイクル数に応じて２４０～５００ｍｂａｒの正圧）とも１２０ｍＬ／時間であった。分離した血漿の平均収率は、フロースルー試料の細胞間隙に残存するＤＮＡを回収するために使用したその後の任意のすすぎ試薬の量を除くと、遠心分離で血液量の４７％、シリンジポンプ（シングルサイクル、比較不可）で１６％、蠕動ポンプで４１％、およびガス圧ポンピングで４２％であった。血漿中の平均Ａ５７６値は、遠心分離、シリンジポンプ、蠕動ポンプおよびガス圧ポンプで、それぞれ０．８９０、１．２８３、２．９７０および２．２４２であった。
【0084】
実施例２
ｃｆＤＮＡ抽出のための繊維濾過を使用した、抗凝固剤で処理した全血からの血漿の分離
２名からＫ２ＥＤＴＡ採血管に血液を採取し、２１℃で最大４時間保存した。合計フィルタ表面積１８００ｍｍ２のポリプロピレン（平均孔径＜５００ｎｍ）中空繊維フィルタのセットに試料を通過させることによって、全血から血漿分離を行った。繊維は１０本ずつ並列に配置し、繊維の全長は１７００ｍｍであった。繊維の外側の血漿区画の圧力は、大気に対して－４０ｍｂａｒであった。全血試料（８～９ｍＬ）をフィルタに３回通過させ、分離した血漿を回収した。参照分離は、遠心分離（２段階、１９００ｇ、１０分および１６０００ｇ、１０分、２１℃、ならびに１段階遠心分離、２０００ｇ、１０分、２１℃の間でｃｆＤＮＡ品質を比較）により行った。血液流量は、蠕動ポンプおよびガス圧ポンプ（濾過サイクル数に応じて２４０～５００ｍｂａｒの正圧）で１２０ｍＬ／時間であった。調製した血漿試料から市販の抽出キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮｅｘｔＰｒｅｐ－Ｍａｇ）を用いてセルフリーＤＮＡを２．５ｍＬ試料スケールで単離した。１００～３５０塩基対のサイズのｃｆＤＮＡの平均収量は、遠心分離、蠕動ポンプ濾過およびガス圧作動濾過で、それぞれ４．５０、２．３４（５２％）および３．６０（８０％）ｎｇ／ｍＬ（血漿量に対する相対量）であった。図１６の電気泳動図は、濾過試料および遠心分離参照で抽出したＤＮＡの代表的なサイズ分画を示し、下部および上部と表示したピークは装置対照である。ここで、処理間の同様のサイズ分布および類似の濃度から、提案された濾過法は、ｃｆＤＮＡ抽出のための２段階遠心分離によって回収したものと同等の品質の血漿を生成することが可能であることを確認するものである。さらに、１段階遠心分離（２０００ｇ、１０分、２１℃）で得られた血漿から抽出したｃｆＤＮＡを図１７の電気泳動図に参照として示すが、下部および上部と表示したピークは装置対照である。このプロットでは、１００～３５０塩基対のＤＮＡ濃度が著しく減少しており、１１００塩基対付近の余分な断片が明らかである。このことは、抽出プロトコルによってはゲノムＤＮＡの混入および本来のセルフリー核酸の損失につながる可能性がある白血球のキャリーオーバーを防ぐために、２段階の遠心分離プロトコルが必要であることを実証する。
ｃｆＤＮＡ抽出のための繊維濾過を使用した、抗凝固剤で処理した全血からの血漿の分離
２名からＫ２ＥＤＴＡ採血管に血液を採取し、２１℃で最大４時間保存した。合計フィルタ表面積１８００ｍｍ２のポリプロピレン（平均孔径＜５００ｎｍ）中空繊維フィルタのセットに試料を通過させることによって、全血から血漿分離を行った。繊維は１０本ずつ並列に配置し、繊維の全長は１７００ｍｍであった。繊維の外側の血漿区画の圧力は、大気に対して－４０ｍｂａｒであった。全血試料（８～９ｍＬ）をフィルタに３回通過させ、分離した血漿を回収した。参照分離は、遠心分離（２段階、１９００ｇ、１０分および１６０００ｇ、１０分、２１℃、ならびに１段階遠心分離、２０００ｇ、１０分、２１℃の間でｃｆＤＮＡ品質を比較）により行った。血液流量は、蠕動ポンプおよびガス圧ポンプ（濾過サイクル数に応じて２４０～５００ｍｂａｒの正圧）で１２０ｍＬ／時間であった。調製した血漿試料から市販の抽出キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮｅｘｔＰｒｅｐ－Ｍａｇ）を用いてセルフリーＤＮＡを２．５ｍＬ試料スケールで単離した。１００～３５０塩基対のサイズのｃｆＤＮＡの平均収量は、遠心分離、蠕動ポンプ濾過およびガス圧作動濾過で、それぞれ４．５０、２．３４（５２％）および３．６０（８０％）ｎｇ／ｍＬ（血漿量に対する相対量）であった。図１６の電気泳動図は、濾過試料および遠心分離参照で抽出したＤＮＡの代表的なサイズ分画を示し、下部および上部と表示したピークは装置対照である。ここで、処理間の同様のサイズ分布および類似の濃度から、提案された濾過法は、ｃｆＤＮＡ抽出のための２段階遠心分離によって回収したものと同等の品質の血漿を生成することが可能であることを確認するものである。さらに、１段階遠心分離（２０００ｇ、１０分、２１℃）で得られた血漿から抽出したｃｆＤＮＡを図１７の電気泳動図に参照として示すが、下部および上部と表示したピークは装置対照である。このプロットでは、１００～３５０塩基対のＤＮＡ濃度が著しく減少しており、１１００塩基対付近の余分な断片が明らかである。このことは、抽出プロトコルによってはゲノムＤＮＡの混入および本来のセルフリー核酸の損失につながる可能性がある白血球のキャリーオーバーを防ぐために、２段階の遠心分離プロトコルが必要であることを実証する。
【0085】
実施例３
動的混合システムにおいて磁性ビーズを使用した血漿からのｃｆＤＮＡの抽出
血漿は遠心分離（２段階、１９００ｇ、１０分および１６０００ｇ、１０分、いずれも２１℃）により調製し、新鮮なまま使用、または－２０℃で短期保存もしくは－８０℃で長期保存した。核酸抽出プロトコルは、８分間の溶解ステップ（３ｍＬ血漿、５３℃の１００μＬ溶解バッファ、３０μＬプロテイナーゼＫ（＞６００Ｕ／ｍＬ））および１０分間の結合ステップ（結合バッファは試料に対し比率１．５倍、４０μＬ高カルボキシル化常磁性ビーズ）を含んでいた。１．５ｍＬのＷ１試薬を用いた第１洗浄を４分間、２回行い、１ｍＬのＷ２試薬による第２洗浄を２分間、２回行った。混合システムからのビーズの回収は、Ｗ２溶液で行った。溶出は流体システムの外側で行った。使用した溶液の組成は以下の通りである：溶解バッファ: １０％ＳＤＳ水溶液、結合バッファ：３．５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３５％ＰＥＧ６０００、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ８．５）、Ｗ１：３０%塩酸グアニジン６０％エタノール溶液、Ｗ２：８０%エタノール水溶液、溶出液：水。混合および抽出流体システムは、試薬バルブ、ポンプおよび磁性混合固定具からなっていた（図１３、システム２０ｂ）。抽出収量を、手動試料処理による同じ抽出化学と比較した。血漿の場合、平均収量は、手動および流体抽出についてそれぞれ、血漿に対して１．６０および１．２４（７８％）ｎｇ／ｍＬであった。
動的混合システムにおいて磁性ビーズを使用した血漿からのｃｆＤＮＡの抽出
血漿は遠心分離（２段階、１９００ｇ、１０分および１６０００ｇ、１０分、いずれも２１℃）により調製し、新鮮なまま使用、または－２０℃で短期保存もしくは－８０℃で長期保存した。核酸抽出プロトコルは、８分間の溶解ステップ（３ｍＬ血漿、５３℃の１００μＬ溶解バッファ、３０μＬプロテイナーゼＫ（＞６００Ｕ／ｍＬ））および１０分間の結合ステップ（結合バッファは試料に対し比率１．５倍、４０μＬ高カルボキシル化常磁性ビーズ）を含んでいた。１．５ｍＬのＷ１試薬を用いた第１洗浄を４分間、２回行い、１ｍＬのＷ２試薬による第２洗浄を２分間、２回行った。混合システムからのビーズの回収は、Ｗ２溶液で行った。溶出は流体システムの外側で行った。使用した溶液の組成は以下の通りである：溶解バッファ: １０％ＳＤＳ水溶液、結合バッファ：３．５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３５％ＰＥＧ６０００、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ８．５）、Ｗ１：３０%塩酸グアニジン６０％エタノール溶液、Ｗ２：８０%エタノール水溶液、溶出液：水。混合および抽出流体システムは、試薬バルブ、ポンプおよび磁性混合固定具からなっていた（図１３、システム２０ｂ）。抽出収量を、手動試料処理による同じ抽出化学と比較した。血漿の場合、平均収量は、手動および流体抽出についてそれぞれ、血漿に対して１．６０および１．２４（７８％）ｎｇ／ｍＬであった。
【0086】
実施例４
受動的混合システムにおいて磁性ビーズを使用した血漿からのｃｆＤＮＡの抽出
血漿は遠心分離（２段階、１９００ｇ、１０分および１６０００ｇ、１０分、いずれも２１℃）により調製し、新鮮なまま使用、または－２０℃で短期保存もしくは－８０℃で長期保存した。核酸抽出プロトコルは、８分間の溶解ステップ（３ｍＬ血漿、５３℃の１００μＬ溶解バッファ、３０μＬプロテイナーゼＫ（＞６００Ｕ／ｍＬ））および１０分間の結合ステップ（結合バッファは試料に対し比率１．５倍、４０μＬ高カルボキシル化常磁性ビーズ）を含んでいた。１．５ｍＬのＷ１試薬を用いた第１洗浄を２分間、２回行い、１ｍＬのＷ２試薬を用いた第２洗浄を４分間、２回行った。混合システムからのビーズの回収は、Ｗ２溶液で行った。溶出は流体システムの外側で行った。使用した溶液の組成は以下の通りである：溶解バッファ：１０％ＳＤＳ水溶液、結合バッファ：３．５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３５％ＰＥＧ６０００、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ８．５）、Ｗ１：３０％塩酸グアニジン６０％エタノール溶液、Ｗ２：８０％エタノール水溶液、溶出液：水。混合および抽出流体システムは、試薬バルブ、ポンプおよび混合固定具（図９構成２４ｂ）ならびに３Ｄ捕捉構造（上面図図１０、構成８７ｄ、および側面図図１１、構成８７ｊ）からなっていた。流体チャネルの外形は、これらの構造の外側にＶ字型に切り取られたものであった。抽出収量を、手動試料処理による同じ抽出化学と比較した。血漿の場合、平均収量は、手動および流体抽出についてそれぞれ、血漿に対して１．６０および２．１５（１３４％）ｎｇ／ｍＬであった。
受動的混合システムにおいて磁性ビーズを使用した血漿からのｃｆＤＮＡの抽出
血漿は遠心分離（２段階、１９００ｇ、１０分および１６０００ｇ、１０分、いずれも２１℃）により調製し、新鮮なまま使用、または－２０℃で短期保存もしくは－８０℃で長期保存した。核酸抽出プロトコルは、８分間の溶解ステップ（３ｍＬ血漿、５３℃の１００μＬ溶解バッファ、３０μＬプロテイナーゼＫ（＞６００Ｕ／ｍＬ））および１０分間の結合ステップ（結合バッファは試料に対し比率１．５倍、４０μＬ高カルボキシル化常磁性ビーズ）を含んでいた。１．５ｍＬのＷ１試薬を用いた第１洗浄を２分間、２回行い、１ｍＬのＷ２試薬を用いた第２洗浄を４分間、２回行った。混合システムからのビーズの回収は、Ｗ２溶液で行った。溶出は流体システムの外側で行った。使用した溶液の組成は以下の通りである：溶解バッファ：１０％ＳＤＳ水溶液、結合バッファ：３．５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３５％ＰＥＧ６０００、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ８．５）、Ｗ１：３０％塩酸グアニジン６０％エタノール溶液、Ｗ２：８０％エタノール水溶液、溶出液：水。混合および抽出流体システムは、試薬バルブ、ポンプおよび混合固定具（図９構成２４ｂ）ならびに３Ｄ捕捉構造（上面図図１０、構成８７ｄ、および側面図図１１、構成８７ｊ）からなっていた。流体チャネルの外形は、これらの構造の外側にＶ字型に切り取られたものであった。抽出収量を、手動試料処理による同じ抽出化学と比較した。血漿の場合、平均収量は、手動および流体抽出についてそれぞれ、血漿に対して１．６０および２．１５（１３４％）ｎｇ／ｍＬであった。
【0087】
実施例５
品質管理のための蛍光定量を用いたカルボキシル化粒子上に結合した核酸の濃度測定
高カルボキシル化Ｍ－ＰＶＡ磁性粒子（名目直径１μｍ）を、１１９塩基対の対照ＤＮＡ断片を異なる濃度（ＤＮＡ：ＣＯＯＨの比率１．５＊１０－６～２．４＊１０－５、ｄｓＤＮＡ：ビーズ５０～９００ｎｇ／ｍｇ）でコーティングし、得られた粒子の蛍光を８０％エタノール水溶液核酸保存溶液中で測定した。使用した蛍光色素はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ１１４９６、試料中の最終希釈度１：２００）であり、励起フィルタＢＰ４７０／４０ｎｍおよび発光フィルタＢＰ５２５／５０ｎｍを用いて、マイクロプレート蛍光光度計またはＣＭＯＳカメラ付き蛍光顕微鏡をリニアイメージングモードで使用して、強度を記録した。ビーズは永久磁石を用いて測定領域構造に回収した（配置についてはは図１４細部１４３を、代表的な蛍光画像については図１８を参照）。蛍光強度は、変性溶液条件下でカルボキシル化ビーズ表面に吸着した抽出核酸の濃度を定量化するのに好適な方法であることがわかった（図１９）。
品質管理のための蛍光定量を用いたカルボキシル化粒子上に結合した核酸の濃度測定
高カルボキシル化Ｍ－ＰＶＡ磁性粒子（名目直径１μｍ）を、１１９塩基対の対照ＤＮＡ断片を異なる濃度（ＤＮＡ：ＣＯＯＨの比率１．５＊１０－６～２．４＊１０－５、ｄｓＤＮＡ：ビーズ５０～９００ｎｇ／ｍｇ）でコーティングし、得られた粒子の蛍光を８０％エタノール水溶液核酸保存溶液中で測定した。使用した蛍光色素はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ１１４９６、試料中の最終希釈度１：２００）であり、励起フィルタＢＰ４７０／４０ｎｍおよび発光フィルタＢＰ５２５／５０ｎｍを用いて、マイクロプレート蛍光光度計またはＣＭＯＳカメラ付き蛍光顕微鏡をリニアイメージングモードで使用して、強度を記録した。ビーズは永久磁石を用いて測定領域構造に回収した（配置についてはは図１４細部１４３を、代表的な蛍光画像については図１８を参照）。蛍光強度は、変性溶液条件下でカルボキシル化ビーズ表面に吸着した抽出核酸の濃度を定量化するのに好適な方法であることがわかった（図１９）。
【0088】
実施例６
セクターゲル電気泳動を使用した低分子核酸の濃縮およびサイズ選択
１１９塩基対のＤＮＡ対照断片、ホウ酸ナトリウムランニングバッファ（４．９ｍＭホウ酸ナトリウム、１６．４ｍＭホウ酸、ｐＨ８．３）およびグリセロール（５％ｖ／ｖ）から、予め濾過した血漿（例えば、架橋デキストラン、セファデックスＧ－１０およびＧ－５０を使用した濾過）を表す合成試料を調製した。最大１．５ｍＬの試料を１％アガロースゲルに充填した（図８に記載の通り構築したゲルランニング装置）。溶出液（１５００μＬ、ランニングバッファと同じ組成）を含む回収ウェルを、陰極側および陽極側にそれぞれ０．４５μｍ Ｄｕｒａｐｏｒｅ ＰＶＤＦおよび５０ｋＤａ ＰＶＤＦ限外濾過膜を使用してゲルから単離した。ゲルに１２Ｖ／ｃｍ（２１０Ｖ）の電界、平均電流２７ｍＡで１時間泳動を行った。濃縮物の回収前に、陽極および陰極の電位を３～８秒（２１０Ｖ）または低電圧（５Ｖ）で４～９分間反転させた。ＤＮＡ断片の回収率は６５～７４％であった。
セクターゲル電気泳動を使用した低分子核酸の濃縮およびサイズ選択
１１９塩基対のＤＮＡ対照断片、ホウ酸ナトリウムランニングバッファ（４．９ｍＭホウ酸ナトリウム、１６．４ｍＭホウ酸、ｐＨ８．３）およびグリセロール（５％ｖ／ｖ）から、予め濾過した血漿（例えば、架橋デキストラン、セファデックスＧ－１０およびＧ－５０を使用した濾過）を表す合成試料を調製した。最大１．５ｍＬの試料を１％アガロースゲルに充填した（図８に記載の通り構築したゲルランニング装置）。溶出液（１５００μＬ、ランニングバッファと同じ組成）を含む回収ウェルを、陰極側および陽極側にそれぞれ０．４５μｍ Ｄｕｒａｐｏｒｅ ＰＶＤＦおよび５０ｋＤａ ＰＶＤＦ限外濾過膜を使用してゲルから単離した。ゲルに１２Ｖ／ｃｍ（２１０Ｖ）の電界、平均電流２７ｍＡで１時間泳動を行った。濃縮物の回収前に、陽極および陰極の電位を３～８秒（２１０Ｖ）または低電圧（５Ｖ）で４～９分間反転させた。ＤＮＡ断片の回収率は６５～７４％であった。
【0089】
実施例７
ｃｆＤＮＡ抽出のための細胞洗浄ステップを含む繊維濾過を使用した、保存剤で処理した全血からの血漿の分離
４名から保存剤入り採血管（Ｓｔｒｅｃｋ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ）に血液を採取した。合計フィルタ表面積１８００ｍｍ２のポリプロピレン（平均孔径＜５００ｎｍ）中空繊維フィルタのセットに試料を通過させることによって、全血から血漿分離を行った。繊維は２０本ずつ並列に配置し、繊維の全長は１７００ｍｍであった。繊維の外側の血漿区画の圧力は、大気に対して－４０ｍｂａｒであった。全血試料（８～９ｍＬ）をフィルタに４回通過させ、分離した血漿を回収した。血液流量は、ガス圧ポンピングのために１２０ｍＬ／ｈとした（濾過サイクル数に応じて１００～４００ｍｂａｒの正圧）。さらに、濃縮血球画分を洗浄液（１×ＰＢＳ中３０％グリセロール、ｐＨ７．４、容量２．５ｍＬ）と混合した後、５回目の分離サイクル、すなわち洗浄ステップを行った。調製した血漿濾液および洗浄画分から、市販の抽出キット化学（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮｅｘｔＰｒｅｐ－Ｍａｇ）を使用してセルフリーＤＮＡを全試料スケールで単離した。洗浄物中のｃｆＤＮＡのサイズ分画（すなわちサイズ分布）が、細胞洗浄ステップの前に調製した試料画分と一致するようにゲル電気泳動を使用して確認した。無作為に選択した４つの試料の収率を図２０に示すが、ここで、細胞洗浄ステップを利用した場合の平均合計ｃｆＤＮＡ収率は、このステップなしで処理した試料の画分に対して１５５％であり、試料回収率が改善されたことが実証された。
ｃｆＤＮＡ抽出のための細胞洗浄ステップを含む繊維濾過を使用した、保存剤で処理した全血からの血漿の分離
４名から保存剤入り採血管（Ｓｔｒｅｃｋ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ）に血液を採取した。合計フィルタ表面積１８００ｍｍ２のポリプロピレン（平均孔径＜５００ｎｍ）中空繊維フィルタのセットに試料を通過させることによって、全血から血漿分離を行った。繊維は２０本ずつ並列に配置し、繊維の全長は１７００ｍｍであった。繊維の外側の血漿区画の圧力は、大気に対して－４０ｍｂａｒであった。全血試料（８～９ｍＬ）をフィルタに４回通過させ、分離した血漿を回収した。血液流量は、ガス圧ポンピングのために１２０ｍＬ／ｈとした（濾過サイクル数に応じて１００～４００ｍｂａｒの正圧）。さらに、濃縮血球画分を洗浄液（１×ＰＢＳ中３０％グリセロール、ｐＨ７．４、容量２．５ｍＬ）と混合した後、５回目の分離サイクル、すなわち洗浄ステップを行った。調製した血漿濾液および洗浄画分から、市販の抽出キット化学（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＮｅｘｔＰｒｅｐ－Ｍａｇ）を使用してセルフリーＤＮＡを全試料スケールで単離した。洗浄物中のｃｆＤＮＡのサイズ分画（すなわちサイズ分布）が、細胞洗浄ステップの前に調製した試料画分と一致するようにゲル電気泳動を使用して確認した。無作為に選択した４つの試料の収率を図２０に示すが、ここで、細胞洗浄ステップを利用した場合の平均合計ｃｆＤＮＡ収率は、このステップなしで処理した試料の画分に対して１５５％であり、試料回収率が改善されたことが実証された。
【0090】
〔参考文献〕
米国特許第４２３４４３１号明細書
国際公開２０１６０６１４１６号
米国特許第４２３４４３１号明細書
国際公開２０１６０６１４１６号
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【国際調査報告】