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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-02
(54)【発明の名称】溶液工程でのＰＮＡオリゴマーの製造方法
(51)【国際特許分類】
C07K 2/00 20060101AFI20230222BHJP
【ＦＩ】
C07K2/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022539282
(86)(22)【出願日】2020-12-22
(85)【翻訳文提出日】2022-07-14
(86)【国際出願番号】 KR2020018912
(87)【国際公開番号】W WO2021133033
(87)【国際公開日】2021-07-01
(31)【優先権主張番号】10-2019-0174492
(32)【優先日】2019-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522253210
【氏名又は名称】シーサンバイオ マテリアルズ
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】弁理士法人一色国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パク，ヒ ギョン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヨンテ
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ジュヒョン
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ジンウ
(72)【発明者】
【氏名】ホン，イン ソク
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA54
4H045FA32
4H045FA57
4H045GA01
(57)【要約】
本発明は、ＰＮＡオリゴマーを製造する方法を提供する。より具体的には、ＰＮＡブロックとＰＮＡブロックを溶液相で反応させてＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含み、簡単な溶液工程におり、驚くべき向上した純度および収率で目的のＰＮＡオリゴマーを製造することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＮＡブロックとＰＮＡブロックを溶液相で反応させ、ＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含み；前記ＰＮＡブロックは、異なるかもしくは同一である２つ以上のＰＮＡ単量体が結合されたものである、ＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項2】
カップリング試薬および溶媒の存在下で、下記化学式１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６で表される第２ＰＮＡ四量体を混合した後、アミン化合物を添加して、下記化学式７～９で表されるＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含む、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
Ａ１～Ａ９およびＡ１１～Ａ１４は、互いに独立して、互いに異なるかもしくは同一の核酸塩基を含むＰＮＡ単量体であり；
Ｐ１～Ｐ１８は、互いに独立して、水素、または互いに異なるかもしくは同一の保護基であり、Ｐ１とＰ２、Ｐ３とＰ４、Ｐ５とＰ６、Ｐ１１とＰ１２、Ｐ１３とＰ１４、Ｐ１５とＰ１６、およびＰ１７とＰ１８のそれぞれが同時に水素である場合は除き、
ａおよびｂは、互いに独立して、１の整数であり、ｃおよびｄは、互いに独立して、０または１の整数である。）
【請求項3】
ａ）カップリング試薬および溶媒の存在下で、下記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体を添加して混合液を得るステップと、
ｂ）前記ステップの混合液にアミン化合物を添加して、前記化学式７～９の化合物を製造するステップと、を含む、請求項２に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
Ａ１～Ａ９およびＡ１１～Ａ１４は、互いに独立して、互いに異なるかもしくは同一の核酸塩基を含むＰＮＡ単量体であり；
Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ９、およびＰ１１は、互いに独立して、水素、または互いに異なるかもしくは同一の保護基であり；
Ｘ１～Ｘ３は、互いに独立して、酸性塩であり；
ａおよびｂは、互いに独立して、１の整数であり、ｃおよびｄは、互いに独立して、０または１の整数である。）
【請求項4】
前記アミン化合物がＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである、請求項２または３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項5】
前記ｂ）ステップで得られた生成物をさらに出発物質として用いて、ａ）ステップおよびｂ）ステップを繰り返して行うステップをさらに含む、請求項３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項6】
前記混合液中の出発物質と溶媒の体積比が１：１０以上である、請求項３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項7】
前記核酸塩基は、アデニン、シトシン、５－メチルシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、プリン、２，６－ジアミノプリン、Ｎ４Ｎ４－エタノシトシン、Ｎ６Ｎ６－エタノ－２，６－ジアミノプリン、５－（Ｃ３－Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（Ｃ３－Ｃ６）－アルキニル－シトシン、５－（１－プロパルギルアミノ）ウラシル、５－（１－プロパルギルアミノ）シトシン、フェノキサジン、９－アミノエトキシフェノキサジン、５－フルオロウラシル、シュードイソシトシン、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－アミノウラシル、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキルウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル－シトシン、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－フルオロシトシン、５－クロロウラシル、５－クロロシトシン、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、８－アザプリン、７－デアザ－７－置換されたプリン、チオウラシル、または人工核酸塩基である、請求項２または３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項8】
前記保護基は、フルオレニルメトキシカルボニル、３級－ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、Ｂｈｏｃ（Benzhydryloxycarbonyl）、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、ｐ－メトキシベンジル、３，４－ジメトキシベンジル、ｐ－メトキシフェニル、トシル、トリクロロエチルクロロホルメート、スルホンアミド、またはイソブチリルである、請求項２または３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項9】
前記第１ＰＮＡ二量体または第２ＰＮＡ二量体は、下記化学式１１で表され、前記第１ＰＮＡ三量体または第２ＰＮＡ三量体は、下記化学式１２で表され、
前記第１ＰＮＡ四量体または第２ＰＮＡ四量体は、下記化学式１３で表される、請求項２に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
Ｒ１～Ｒ１８は、互いに独立して、水素、アミノ酸の残基または置換基を有するアミノ酸残基であり；
Ｔ１～Ｔ３は、互いに独立して、アミン保護基であり；
Ｚ１～Ｚ３は、互いに独立して、ヒドロキシ保護基であり；
Ｂ１～Ｂ９は、互いに独立して、アミン保護基を含むかもしくは含まない核酸塩基である。）
【請求項10】
前記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、前記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または前記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体１当量に対して、前記化学式４－１で表される第１ＰＮＡ二量体、前記化学式５－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または前記化学式６－１で表される第１ＰＮＡ四量体が１：０．８～１．２モルで用いられる、請求項３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項11】
前記カップリング試薬が、HBTU、PyBop、またはこれらの混合物である、請求項２または３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項12】
前記ｂ）ステップは、－１０～５℃で１０～６０分間行われる、請求項３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項13】
前記溶媒が、クロロ化（Ｃ１－Ｃ４）アルカン、ＤＭＦ、およびＤＩＥＡの混合溶媒である、請求項２または３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項14】
前記製造された化学式７～９の化合物に水を添加して分離精製するステップをさらに含む、請求項２に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、溶液工程でのＰＮＡオリゴマーの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸は、公知されているように、生物の遺伝情報を担当するＤＮＡおよびＲＮＡである。
【0003】
これに対し、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、核酸の糖リン酸骨格をＮ－（２－アミノエチル）グリシン骨格に変換させた核酸である。
【0004】
ＤＮＡ／ＲＮＡの糖リン酸骨格は、中性条件で負電荷を帯びているため相補鎖（complementary chains）間の静電気的な反発があるが、ＰＮＡの骨格構造（backbone structure）は元々電荷を有さないため、静電気的な反発がない。
【0005】
すなわち、ＰＮＡ主鎖が実質的に電荷を全く有さないが、これは、ＰＮＡの非常に重要な特徴であり、かかる特徴により、天然オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が使用されにくい多くの用途に用いられることができる。
【0006】
さらには、ＰＮＡは、天然オリゴヌクレオチドより高い親和性によりＤＮＡまたはＲＮＡと結合し、天然ＤＮＡに比べて血清中で非常に安定的であるという利点を有する。
【0007】
しかし、ＰＮＡの活用に対する関心と研究は多様となり、高くなっているが、ＰＮＡオリゴマーの合成方法についての研究は不十分な状態である。
【0008】
通常、ＰＮＡオリゴマーの合成方法としては固相（solid－phase）ペプチド合成法が用いられているため、ＰＮＡ単量体ユニット（unit）をＰＮＡの骨格構造によって分類すると、Ｆｍｏｃ型ＰＮＡ単量体ユニットとＢｏｃ型ＰＮＡ単量体ユニットの２種類に分類され得る。
【0009】
Ｆｍｏｃ型ＰＮＡ単量体ユニットの合成方法は既に確立されているが、大量生産が容易ではないだけでなく、低い収率および純度が問題となっている。
【0010】
例えば、ＷＯ２００５－００９９９８Ａ１に、高い収率で容易にＰＮＡを合成できる単量体が公知されているが、多数の工程により、大量生産において経済的ではない。
【0011】
したがって、目的とするＰＮＡを単純な工程により、高い純度および収率で効率的に製造することができる溶液工程でのＰＮＡオリゴマーの製造方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、簡単な溶液工程により、驚くべき向上した純度および収率で目的のＰＮＡオリゴマーを製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、単純な工程、容易な溶液工程で、極めて向上した純度および収率でＰＮＡオリゴマーを製造することができる方法を提供するものであって、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、
ＰＮＡブロックとＰＮＡブロックを溶液相で反応させてＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含み；
前記ＰＮＡブロックは、異なるかもしくは同一である２つ以上のＰＮＡ単量体が結合されていることを特徴とする。
ＰＮＡブロックとＰＮＡブロックを溶液相で反応させてＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含み；
前記ＰＮＡブロックは、異なるかもしくは同一である２つ以上のＰＮＡ単量体が結合されていることを特徴とする。
【0014】
好ましくは、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、
カップリング試薬および溶媒の存在下で、
下記化学式１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６で表される第２ＰＮＡ四量体を混合した後、アミン化合物を添加し、下記化学式７～９で表されるＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含む。
カップリング試薬および溶媒の存在下で、
下記化学式１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６で表される第２ＰＮＡ四量体を混合した後、アミン化合物を添加し、下記化学式７～９で表されるＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含む。
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
Ａ１～Ａ９およびＡ１１～Ａ１４は、互いに独立して、互いに異なるかもしくは同一の核酸塩基を含むＰＮＡ単量体であり；
Ｐ１～Ｐ１８は、互いに独立して、水素、または互いに異なるかもしくは同一の保護基であり、Ｐ１とＰ２、Ｐ３とＰ４、Ｐ５とＰ６、Ｐ１１とＰ１２、Ｐ１３とＰ１４、Ｐ１５とＰ１６、およびＰ１７とＰ１８のそれぞれが同時に水素である場合は除き、
ａおよびｂは、互いに独立して、１の整数であり、ｃおよびｄは、互いに独立して、０または１の整数である。）
【0024】
好ましくは、本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーの製造方法は、
ａ）カップリング試薬および溶媒の存在下で、
下記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体を添加して混合液を得るステップと、
ｂ）前記ステップの混合液にアミン化合物を添加し、前記化学式７～８で表される化合物を製造するステップと、を含む。
ａ）カップリング試薬および溶媒の存在下で、
下記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体を添加して混合液を得るステップと、
ｂ）前記ステップの混合液にアミン化合物を添加し、前記化学式７～８で表される化合物を製造するステップと、を含む。
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
Ａ１～Ａ９およびＡ１１～Ａ１４は、互いに独立して、互いに異なるかもしくは同一の核酸塩基を含むＰＮＡ単量体であり；
Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ９、およびＰ１１は、互いに独立して、水素、または互いに異なるかもしくは同一の保護基であり；
Ｘ１～Ｘ３は、互いに独立して、酸性塩であり；
ａおよびｂは、互いに独立して、１の整数であり、ｃおよびｄは、互いに独立して、０または１の整数である。）
【0031】
好ましくは、本発明の一実施形態に係るアミン化合物は、これに制限されるものではないが、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであってもよい。
【0032】
好ましくは、本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーの製造方法は、ｂ）ステップで得られた生成物をさらに出発物質として用いて、ａ）ステップおよびｂ）ステップを繰り返して行うステップをさらに含んでもよい。
【0033】
より好ましくは、混合液中の出発物質と溶媒の体積比は１：１０以上であってもよい。
【0034】
本発明の一実施形態に係る核酸塩基は、アデニン、シトシン、５－メチルシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、プリン、２，６－ジアミノプリン、Ｎ４Ｎ４－エタノシトシン、Ｎ６Ｎ６－エタノ－２，６－ジアミノプリン、５－（Ｃ３－Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（Ｃ３－Ｃ６）－アルキニル－シトシン、５－（１－プロパルギルアミノ）ウラシル、５－（１－プロパルギルアミノ）シトシン、フェノキサジン、９－アミノエトキシフェノキサジン、５－フルオロウラシル、シュードイソシトシン、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－アミノウラシル、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキルウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル－シトシン、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－フルオロシトシン、５－クロロウラシル、５－クロロシトシン、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、８－アザプリン、７－デアザ－７－置換されたプリン、チオウラシル、または人工核酸塩基であってもよい。
【0035】
本発明の一実施形態に係る保護基は、フルオレニルメトキシカルボニル、３級－ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、Ｂｈｏｃ（Benzhydryloxycarbonyl）、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、ｐ－メトキシベンジル、３，４－ジメトキシベンジル、ｐ－メトキシフェニル、トシル、トリクロロエチルクロロホルメート、スルホンアミド、またはイソブチリルであってもよい。
【0036】
好ましくは、本発明の一実施形態に係る第１ＰＮＡ二量体または第２ＰＮＡ二量体は、下記化学式１１で表され、
前記第１ＰＮＡ三量体または第２ＰＮＡ三量体は、下記化学式１２で表され、
前記第１ＰＮＡ四量体または第２ＰＮＡ四量体は、下記化学式１３で表されるＰＮＡオリゴマーの製造方法。
前記第１ＰＮＡ三量体または第２ＰＮＡ三量体は、下記化学式１２で表され、
前記第１ＰＮＡ四量体または第２ＰＮＡ四量体は、下記化学式１３で表されるＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【0037】
【0038】
【0039】
Ｒ１～Ｒ１８は、互いに独立して、水素、アミノ酸の残基、または置換基を有するアミノ酸残基であり；
Ｔ１～Ｔ３は、互いに独立して、アミン保護基であり；
Ｚ１～Ｚ３は、互いに独立して、ヒドロキシ保護基であり；
Ｂ１～Ｂ９は、互いに独立して、アミン保護基を含むかもしくは含まない核酸塩基である。）
【0040】
本発明の一実施形態に係る化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、前記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または前記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体１当量に対して、前記化学式４－１で表される第１ＰＮＡ二量体、前記化学式５－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または前記化学式６－１で表される第１ＰＮＡ四量体が１：０．８～１．２モルで用いられてもよい。
【0041】
好ましくは、本発明の一実施形態に係るカップリング試薬は、HBTU、PyBop、またはこれらの混合物であってもよく、ｂ）ステップは、－１０～５℃で１０～６０分間行われてもよい。
【0042】
本発明の一実施形態に係る溶媒は、クロロ化（Ｃ１－Ｃ４）アルカン、ＤＭＦ、およびＤＩＥＡの混合溶媒であってもよい。
【0043】
本発明の一実施形態に係る化学式７～９の化合物に水を添加し、分離精製するステップをさらに含んでもよい。
【発明の効果】
【0044】
本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、ＰＮＡブロックを製造し、ＰＮＡブロックとＰＮＡブロックを反応させてＰＮＡオリゴマーを製造することで、ＰＮＡの製造ステップを画期的に減少させて非常に経済的であるとともに、高い純度でＰＮＡオリゴマーを製造することができる。
【0045】
具体的に、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、ＰＮＡ二量体、ＰＮＡ三量体、またはＰＮＡ四量体を用いて製造することで、ＰＮＡ単量体を用いて製造する従来の方法に比べてより簡単な工程によりＰＮＡオリゴマーの製造が可能であるだけでなく、目的とするＰＮＡオリゴマーをより正確に製造することができる。
【0046】
したがって、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、ＰＮＡ単量体を用いて製造する従来の方法に比べて、より短い工程ステップにより製造され、副産物からの分離が非常に容易であるため、製造されるＰＮＡオリゴマーの収率および純度が極めて高い。
【0047】
さらに、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、全ての工程が溶液相で製造可能であるため、大量生産が可能であって、商業化に非常に有利である。
【0048】
また、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、ＰＮＡブロック、具体的に、ＰＮＡ二量体、ＰＮＡ三量体、またはＰＮＡ四量体を用いて製造することで、従来の方法に比べて非常に少量のＰＮＡ二量体、ＰＮＡ三量体、またはＰＮＡ四量体を用いるため非常に経済的であり、高い収率で高純度のＰＮＡオリゴマーを容易に大量生産および製造が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【発明を実施するための形態】
【0050】
以下、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法およびこれにより製造されたＰＮＡオリゴマーについて詳述するが、この時に用いられる技術用語および科学用語において別に定義されない限り、この発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が通常理解している意味を有し、下記説明において本発明の要旨を不明瞭にする可能性のある公知機能および構成についての説明は省略する。
【0051】
本明細書に記載されたアミノ酸は、最も広義で用いられ、天然アミノ酸、例えば、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体および誘導体のような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、Ｌ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体および誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチンなど、生体内でタンパク質の構成材料にならないアミノ酸；および当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解することができる。非天然アミノ酸の例として、スレオニン誘導体Ａの他に、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニンなど）、Ｄ－アミノ酸、ヒスチジン類似アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジン、およびα－メチル－ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、および側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。
【0052】
本明細書に記載された「置換基を有するアミノ酸残基」は、アミノ酸残基が置換基を有するものであって、例えば、アセチル基で置換されたアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシンを含んでもよく、アミノ酸が結合されたペプチドであってもよい。
【0053】
本発明に記載された「保護基」は、有機反応で特定の官能基、例えば、アミンまたはヒドロキシ基などを保護するための官能基であって、有機合成分野の当業者が認識できる範囲の官能基であれば何れも可能であり、アミン保護基の具体例として、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｂｏｃ（３級－ブチルオキシカルボニル）、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）、Ｂｈｏｃ、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、ｐ－メトキシベンジル、３，４－ジメトキシベンジル、ｐ－メトキシフェニル、トシル、トリクロロエチルクロロホルメート、スルホンアミド（Bts、Nosyl&Nps）、イソブチリルが挙げられる。
【0054】
本発明に記載された「クロロ化アルカン」は、アルカンの１つ以上の水素がクロロで置換されたものを意味し、アルカンは、直鎖状または分岐状を両方とも含み、特に記載された場合を除き、アルカンは１～１０個の炭素原子、好ましくは１～７の炭素原子、より好ましくは１～４の炭素原子を有する。
【0055】
本明細書に記載された「置換された」、「置換基を有する」、および置換体に関連して別の記載がない限り、本発明の任意に置換された置換体としては、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボン酸基、ニトロ、シアノ、（低級）アルキル、ハロアルキル、モノ－またはジ－アルキルアミノ、アルコキシ、チオアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、－ＮＯ２、－ＮＲａ１Ｒｂ１、－ＮＲａ１Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂ１、－ＮＲａ１Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ１Ｒｂ１、－ＮＲａ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ１、－ＮＲａ１ＳＯ２Ｒｂ１、－ＯＲａ１、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ１Ｒｂ１、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａ１、－ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲａ１、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ１Ｒｂ１、－ＮＲａ１ＳＯ２Ｒｂ１、－ＰＯ３Ｒａ１、－ＰＯ（ＯＲａ１）（ＯＲｂ１）、－ＳＯ２Ｒａ１、－Ｓ（Ｏ）Ｒａ１、－ＳＯ（ＮＲａ１）Ｒｂ１（例えば、スルホキシイミン）、－Ｓ（ＮＲａ１）Ｒｂ１（例えば、スルフィルイミン）、および－ＳＲａ１が使用でき、ここで、Ｒａ１とＲｂ１は同一でも異なっていてもよく、互いに独立して、ハイドロジェン、ハロゲン、アミノ、アルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、アリール、またはヘテロ環であり、または、付着された窒素原子とともにＲａ１とＲｂ１はヘテロ環の形態になってもよい。ここで、Ｒａ１とＲｂ１は、結合された原子によって複数個であってもよく、好ましくは、前記アルキルはＣ１－６アルキルであってもよく、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルはＣ３－１２であってもよく、アリールはＣ６－１２であってもよく、ヘテロ環およびヘテロアリールはＣ３－１２であってもよい。
【0056】
本発明に記載されたＰＮＡ単量体は、ＰＮＡ基本骨格、具体的に、Ｎ－（２－アミノエチル）グリシン（化合物５）または化合物８のＮ位にアミンまたはヒドロキシ基保護基を有するか有さない核酸塩基を何れも含むものを意味する。
【0057】
具体的に、ヒドロキシ基を有さないかアミン基を有さないなどの、下記の構造も何れも含む。
【0058】
本発明に記載されたＰＮＡ二量体は、ＰＮＡの基本骨格であるＮ－（２－アミノエチル）グリシン（化合物５）または化合物８のＮ位に核酸塩基が結合されたＰＮＡ単量体が２個連結されたものであり、ＰＮＡ二量体に含まれる核酸塩基は互いに異なるかもしくは同一であり、具体的に、前記化学式１１で表されることができる。
【0059】
本発明に記載されたＰＮＡ三量体は、ＰＮＡの基本骨格であるＮ－（２－アミノエチル）グリシン（化合物５）または化合物８のＮ位に核酸塩基が結合されたＰＮＡ単量体が３個連結されたものであり、ＰＮＡ三量体に含まれる核酸塩基は互いに異なるかもしくは同一であり、具体的に、前記化学式１２で表されることができる。
【0060】
本発明に記載されたＰＮＡ四量体も、ＰＮＡ三量体と同様にＰＮＡ単量体が４個連結された構造を意味し、具体的に、前記化学式１３で表されることができる。
【0061】
本明細書に記載された「ＰＮＡブロック」は、２つ以上のＰＮＡ単量体が結合されたものを意味し、ＰＮＡ二量体、ＰＮＡ三量体、ＰＮＡ四量体などを意味する。
【0062】
本発明は、溶液工程で高い純度および収率でＰＮＡオリゴマーを製造することができる方法を提供し、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、
ＰＮＡブロックとＰＮＡブロックを溶液相で反応させてＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含み；
前記ＰＮＡブロックは、異なるかもしくは同一である２つ以上のＰＮＡ単量体が結合されていることを特徴とする。
ＰＮＡブロックとＰＮＡブロックを溶液相で反応させてＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含み；
前記ＰＮＡブロックは、異なるかもしくは同一である２つ以上のＰＮＡ単量体が結合されていることを特徴とする。
【0063】
本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、支持体にＰＮＡ単量体を一々連結して製造する従来の方法と異なって、溶液相ＰＮＡ単量体が２つ以上結合されたＰＮＡブロックを製造し、これらのＰＮＡブロックを反応させてＰＮＡオリゴマーを製造することで、より短い工程ステップにより目的のＰＮＡオリゴマーを正確に製造することができる。
【0064】
さらに、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、ＰＮＡブロックを用いることで、より高い純度および収率でＰＮＡオリゴマーが製造可能であり、溶液工程で全ての反応が進行されるため、製造がより容易であり、大量生産が可能である利点を有する。
【0065】
好ましくは、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、
カップリング試薬および溶媒の存在下で、下記化学式１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６で表される第２ＰＮＡ四量体を混合した後、アミン化合物を添加し、下記化学式７～９で表されるＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含む。
カップリング試薬および溶媒の存在下で、下記化学式１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６で表される第２ＰＮＡ四量体を混合した後、アミン化合物を添加し、下記化学式７～９で表されるＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含む。
【0066】
【0067】
【0068】
【0069】
【0070】
【0071】
【0072】
【0073】
【0074】
Ａ１～Ａ９およびＡ１１～Ａ１４は、互いに独立して、互いに異なるかもしくは同一の核酸塩基を含むＰＮＡ単量体であり；
Ｐ１～Ｐ１８は、互いに独立して、水素、または互いに異なるかもしくは同一の保護基であり、Ｐ１とＰ２、Ｐ３とＰ４、Ｐ５とＰ６、Ｐ１１とＰ１２、Ｐ１３とＰ１４、Ｐ１５とＰ１６、およびＰ１７とＰ１８のそれぞれが同時に水素である場合は除き、
ａおよびｂは、互いに独立して、１の整数であり、ｃおよびｄは、互いに独立して、０または１の整数である。）
【0075】
本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーの製造方法は、従来の支持体（レジン）にＰＮＡ単量体を結合させ、それを洗浄し、さらにＰＮＡ単量体を結合させてＰＮＡオリゴマーを製造していた方法と異なって、ＰＮＡブロックであるＰＮＡ二量体、ＰＮＡ三量体、およびＰＮＡ四量体を用いて製造することで、合成ステップが短縮されて非常に経済的であり、固相での製造方法に比べて高い収率および純度でＰＮＡオリゴマーを製造することができる。
【0076】
さらに、本発明のＰＮＡ二量体、ＰＮＡ三量体、またはＰＮＡ四量体を用いてＰＮＡオリゴマーを製造することで、工程ステップが減少して経済的であり、溶液相で特定の化合物であるアミン化合物を出発物質およびカップリング試薬の混合物に追加することで、副産物の生成が低く、高い収率で高純度のＰＮＡオリゴマーが製造可能である。
【0077】
すなわち、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、出発物質、カップリング試薬、およびアミン化合物を混合してＰＮＡオリゴマーを製造していたことと異なって、出発物質およびカップリング試薬を混合した混合液にアミン化合物を滴下することで、副産物の生成を画期的に低め、高い収率および純度でＰＮＡオリゴマーを製造することができる。
【0078】
さらには、これにより製造されるＰＮＡオリゴマーの分離精製も非常に容易である。
【0079】
具体的に、本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーの製造方法は、溶液工程により合成可能なＰＮＡ二量体、ＰＮＡ三量体、またはＰＮＡ四量体を用いることで、ｎ個の核酸塩基を有するＰＮＡオリゴマーの製造時に、ｎ－１個の核酸塩基を有するＰＮＡオリゴマーまたはｎ－２個の核酸塩基を有するＰＮＡオリゴマーが副産物として製造されず、他の副産物などの不純物からのＰＮＡオリゴマーの分離が非常に容易であるため、分離されたＰＮＡオリゴマーの純度が非常に高い。
【0080】
より好ましくは、本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーの製造方法は、
ａ）カップリング試薬および溶媒の存在下で、
下記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体を添加して混合液を得るステップと、
ｂ）前記ステップの混合液にアミン化合物を添加し、前記化学式７～９の化合物を製造するステップと、を含む。
ａ）カップリング試薬および溶媒の存在下で、
下記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体を添加して混合液を得るステップと、
ｂ）前記ステップの混合液にアミン化合物を添加し、前記化学式７～９の化合物を製造するステップと、を含む。
【0081】
【0082】
【0083】
【0084】
【0085】
【0086】
Ａ１～Ａ９およびＡ１１～Ａ１４は、互いに独立して、互いに異なるかもしくは同一の核酸塩基を含むＰＮＡ単量体であり；
Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ９、およびＰ１１は、互いに独立して、水素、または互いに異なるかもしくは同一の保護基であり；
Ｘ１～Ｘ３は、互いに独立して、酸性塩であり；
ａおよびｂは、互いに独立して、１の整数であり、ｃおよびｄは、互いに独立して、０または１の整数である。）
【0087】
好ましくは、化学式１－１、２－１、および３－１のアミン塩をfreeアミンに転換させるとともに、化学式４－１、５－１、および６－１のヒドロキシとの反応性を高める点から、特定のアミン化合物であるＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを用いることで、より向上した収率および純度でＰＮＡオリゴマーを製造することができる。
【0088】
好ましくは、本発明の一実施形態に係るアミン化合物は、前記化学式１－１、２－１、および３－１の化合物１モルに対して、５～４０モルで用いられてもよく、より好ましくは１０～３０モルで用いられてもよい。
【0089】
また、本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーの製造方法は、ｂ）ステップで得られた生成物をさらに出発物質として用いて、ａ）ステップおよびｂ）ステップを繰り返して行うステップをさらに含んでもよい。
【0090】
本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーの製造方法は、ＰＮＡ二量体、ＰＮＡ三量体、またはＰＮＡ四量体を用いることで、従来の方法と異なって、未反応の官能基を保護するためのキャッピング（capping）ステップが不要であるため、製造ステップを画期的に減少させることができる利点があって、大量生産が可能である。
【0091】
本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーは、目的の個数を有する核酸塩基を容易に製造することができるが、好ましくは４個以上の核酸塩基を含んでもよく、より好ましくは４～４０個の核酸塩基を含んでもよい。
【0092】
本発明の一実施形態に係る前記混合液中の出発物質と溶媒の体積比は、１：１０以上であってもよく、好ましくは１：１０～２５０であり、より好ましくは１：１０～１００であってもよい。
【0093】
本発明の一実施形態に係る混合液中の出発物質と溶媒の体積比が１：１０以上である場合、より高い収率および純度でＰＮＡオリゴマーを製造することができる。
【0094】
本発明の一実施形態に係る核酸塩基は、アデニン、シトシン、５－メチルシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、プリン、２，６－ジアミノプリン、Ｎ４Ｎ４－エタノシトシン、Ｎ６Ｎ６－エタノ－２，６－ジアミノプリン、５－（Ｃ３－Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（Ｃ３－Ｃ６）－アルキニル－シトシン、５－（１－プロパルギルアミノ）ウラシル、５－（１－プロパルギルアミノ）シトシン、フェノキサジン、９－アミノエトキシフェノキサジン、５－フルオロウラシル、シュードイソシトシン、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－アミノウラシル、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキルウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル－シトシン、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－フルオロシトシン、５－クロロウラシル、５－クロロシトシン、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、８－アザプリン、７－デアザ－７－置換されたプリン、チオウラシル、または人工核酸塩基であってもよい。
【0095】
本発明の一実施形態に係る保護基は、フルオレニルメトキシカルボニル、３級－ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、Ｂｈｏｃ（Benzhydryloxycarbonyl）、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、ｐ－メトキシベンジル、３，４－ジメトキシベンジル、ｐ－メトキシフェニル、トシル、トリクロロエチルクロロホルメート、スルホンアミド、またはイソブチリルであってもよく、好ましくは、アミン保護基は、３級－ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、Ｂｈｏｃ（Benzhydryloxycarbonyl）、アセチル、ベンゾイル、またはベンジルであってもよく、ヒドロキシ基の保護基は、（Ｃ１－Ｃ４）アルキルであってもよい。
【0096】
具体的に、本発明の一実施形態に係る前記第１ＰＮＡ二量体または第２ＰＮＡ二量体は、下記化学式１１で表され、
前記第１ＰＮＡ三量体または第２ＰＮＡ三量体は、下記化学式１２で表され、
前記第１ＰＮＡ四量体または第２ＰＮＡ四量体は、下記化学式１３で表されることができる。
前記第１ＰＮＡ三量体または第２ＰＮＡ三量体は、下記化学式１２で表され、
前記第１ＰＮＡ四量体または第２ＰＮＡ四量体は、下記化学式１３で表されることができる。
【0097】
【0098】
【0099】
Ｒ１～Ｒ１８は、互いに独立して、水素、アミノ酸の残基または置換基を有するアミノ酸残基であり；
Ｔ１～Ｔ３は、互いに独立して、アミン保護基であり；
Ｚ１～Ｚ３は、互いに独立して、ヒドロキシ保護基であり；
Ｂ１～Ｂ９は、互いに独立して、アミン保護基を含むかもしくは含まない核酸塩基である。）
【0100】
本発明の一実施形態に係る前記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、前記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または前記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体１モルに対して、前記化学式４－１で表される第１ＰＮＡ二量体、前記化学式５－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または前記化学式６－１で表される第１ＰＮＡ四量体は１：０．８～１．２モル、好ましくは１：０．９～１．１モルで用いられてもよい。
【0101】
本発明の一実施形態に係るカップリング試薬は、これに制限されるものではないが、HBTU、PyBop（（Benzotriazol－１－yloxy）tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate）、またはこれらの混合物であってもよく、好ましくは、HBTU（N,N,N’,N’－Tetramethyl－O－（１H－benzotriazol－１－yl）uronium hexafluorophosphate）であってもよい。
【0102】
カップリング試薬の使用量も限定されないが、前記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、前記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または前記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体１モルに対して１．２～２．５モル、好ましくは１．２～２．０モルで用いられてもよい。
【0103】
本発明の一実施形態に係るｂ）ステップはカップリング反応が起こるステップであり、－１０～５℃で１０～６０分間行われてもよく、より好ましくは－５～５℃で１０～４０分間行われてもよい。
【0104】
本発明の一実施形態に係る溶媒は、クロロ化（Ｃ１－Ｃ４）アルカン、ＤＭＦ、およびＤＩＥＡの混合溶媒であってもよく、好ましくはＤＭＦであってもよい。
【0105】
この時に用いられる溶媒は、クロロ化（Ｃ１－Ｃ４）アルカン、ＤＭＦ（Dimethylformamide）、およびＤＩＥＡ（N,N－Diisopropylethylamine）の混合溶媒であってもよく、クロロ化（Ｃ１－Ｃ４）アルカンは、卜リクロロメタン、ジクロロメタン、クロロメタン、１，１，２－トリクロロエタン、１，１，１－トリクロロエタン、１，２－ジクロロエタン、１，１－ジクロロエタン、およびクロロエタンから選択される１つまたは２つ以上であってもよい。
【0106】
本発明の一実施形態に係る溶媒としてＤＭＦ、ＤＩＥＡ、またはクロロ化アルカンを用いることで、カップリング反応時に反応物の溶解度が適切に調節されることにより、高い収率および純度で生成物を得ることができ、このような点から、より好ましくはＤＭＦであってもよい。
【0107】
本発明の一実施形態により製造された化学式７～９のＰＮＡオリゴマーは、当業者が認識できる多様な方法により分離精製することができるが、好ましくは、水を添加して分離精製することができる。
【0108】
また、本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーの製造方法は、全工程が溶液相で行われ、ＰＮＡ二量体、ＰＮＡ三量体、またはＰＮＡ四量体を用いることで、支持体（レジン）を用いる固相でＰＮＡ単量体からＰＮＡオリゴマーを製造する従来の方法に比べて、驚くべき向上した収率および純度でＰＮＡオリゴマーを製造することができ、非常に効率的且つ経済的な方法である。
【0109】
すなわち、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、第１ＰＮＡ二量体、第１ＰＮＡ三量体、第１ＰＮＡ四量体、第２ＰＮＡ二量体、第２ＰＮＡ三量体、第２ＰＮＡ四量体、およびＰＮＡオリゴマーを何れも溶液相で製造可能であるため、優れた純度および収率のＰＮＡオリゴマーを単純な工程により製造することで、大量生産が可能である利点を有する。
【0110】
本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーは、下記条件での高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析結果、７０％以上の純度を有することができ、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上であることができる。
【0111】
（展開溶媒：ＴＦＡ ０．１％ in Water、ＴＦＡ ０．１％ in ＭｅＣＮ、gradient condition UV デテクター ２６０nm、カラム ２５０mm*４．６mm）
【0112】
また、本発明のＰＮＡオリゴマーの製造方法は、キャッピング過程なしに合成され、製造されたＰＮＡオリゴマーが、上記の条件での高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析結果、７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上の純度を有するＰＮＡオリゴマーを提供する。
【0113】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、下記の実施例によって本発明の範疇が本発明を限定するのではない。
【0114】
反応に使用された物質および有機溶媒は、Novabiochem、Alfa aesar、SAMCHUN CHEMICALS、純正化学株式会社、DUKSAN reagents chemicalなどから購入して使用し、別途の追加精製なしに使用した。合成された化合物の１H－NMR分析は、常温で、Bruker ４００または５００MHzを用いて行い、ＨＰＬＣ（waters １５２５ Binary hplc pump）の展開溶媒として、ＴＦＡ０．１％が含まれたＭｅＣＮと、ＴＦＡ０．１％が含まれた水との割合が５：９５である溶媒を使用し、徐々に展開溶媒の割合を変化させて、ＴＦＡ０．１％が含まれたＭｅＣＮと、ＴＦＡ０．１％が含まれた水との割合を２０：８０に２０分にわたって変化させた後、１０分間は、ＴＦＡ０．１％が含まれたＭｅＣＮとＴＦＡ０．１％が含まれた水との割合が９５：５である溶媒を使用し、column heater ６０℃の方法により分析した。
【0115】
下記化合物１～４の核酸塩基またはアミン保護基を有する核酸塩基は、韓国特許登録第１０－０４６４２６１号と同様の方法により製造した。
【0116】
［製造例１］化合物５（Ｂｏｃ－ａｅｇ－ＯＥｔ）の製造
５００ｍＬの三角フラスコに、１１．０ｇのエチレンジアミン（１８３ｍｍｏｌ）を入れ、ＭＣに溶かした。５．０ｇのＢｏｃ２Ｏ（２２．９ｍｍｏｌ）をＭＣ（メチレンクロリド）に溶かして滴下し、常温で１２時間撹拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、水を入れてＭＣ層のみを抽出してｓａｔ．ＮａＣｌで洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で処理した後、濾過して濃縮した。濃縮した溶液にＭＣを入れ、６．４ｍＬのトリエチルアミン（４５．８ｍｍｏｌ）を添加した。２．４ｍＬのブロモ酢酸エチル（ethyl bromoacetate）（２２．０ｍｍｏｌ）をＭＣに溶かしてゆっくりと滴下し、常温で１２時間撹拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、水を入れてＭＣ層のみを抽出した。Ｎａ２ＳＯ４で水を除去した後、濃縮し、シリカカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＥＡ：Ｈｅｘ＝１：１ｖ／ｖ）により精製することで、透明なオイル状の生成物である化合物５を得た（３．７９ｇ、７０％）。
【0117】
［製造例２］化合物８（Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｚ）－ＯＭｅ）の製造
化合物６の製造
窒素下で、２５０ｍＬの二口丸底フラスコに、５．４０ｇのＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｚ）－ＣＯＯＨ（１４．２ｍｍｏｌ）を入れ、１００ｍＬのドライＴＨＦに溶かした。９．２１ｇの１，１’－カルボニルジイミダゾール（５６．８ｍｍｏｌ）を一度に入れ、常温で１０分間撹拌させた。気泡がそれ以上発生しない時に、０℃で２．６８ｇのＮａＢＨ４（７１．０ｍｍｏｌ）を蒸留水３０ｍＬに溶かしてからゆっくりと入れ、３０分間撹拌させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、溶媒を濃縮させた。２００ｍＬのＥＡを入れた後、分液漏斗に移して１ＭのＨＣｌで洗浄した後、飽和塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム（Sodium sulfate）で水を除去して濃縮させた。シリカカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＥＡ：ＨＥＸ＝１：１ｖ／ｖ）により精製することで、透明な黄色のオイル状の生成物である化合物６を得た（５．０ｇ、９６．２％）。
化合物６の製造
【0118】
化合物７の製造
窒素下で、２５０ｍＬの二口丸底フラスコに、８．７１ｍＬのOxayl Chloride（１７．４ｍｍｏｌ）をシリンジを用いて入れ、２０ｍＬのドライＭＣを入れた。ＮａＣｌと氷、メタノールを用いて温度を－２０℃に５分かけて下げ、１００ｍＬの丸底フラスコに２．４７ｍＬのドライＤＭＳＯ（３４．８ｍｍｏｌ）と５ｍＬのドライＭＣを混合した溶液を滴下した。５分後、５．８０ｇのＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨ（１５．８ｍｍｏｌ）をドライＭＣ２０ｍＬに溶かした後、反応液に添加した。１５分後、１５．２ｍＬのＤＩＥＡ（８７．１ｍｍｏｌ）を添加した後、５分間撹拌させ、氷浴を除去してＴＬＣを確認（ＥＡ only、ｐ－Anisaldehyde）した。反応終了後、ＮａＨＣＯ３で洗浄した後、溶媒を濃縮させて透明なオイル状の化合物７を得た（５．５ｇ、９５．３％）。
【0119】
化合物８の製造
化合物８は、FILBERT TOTSINGAN et．Al．CHIRALITY，２００９，２１，２４５－２５３を参照して同様の方法により製造し、これから化合物８が合成されたことを確認した。
【0120】
２５０ｍＬの丸底フラスコに、５．５０ｇのＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＣＨＯ（１５．１ｍｍｏｌ）を入れてメタノール５０．０ｍＬを入れ、２．８４ｇのＧｌｙ－ＯＭｅ（２２．６ｍｍｏｌ）を入れた。０℃で１．３０ｍＬの酢酸（２２．６ｍｍｏｌ）と３．９４ｍＬのＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２２．６ｍｍｏｌ）を添加した後、９．６０ｇのナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（４５．３ｍｍｏｌ）を入れ、０℃で２時間撹拌した後、常温で一晩撹拌した。ＴＬＣ（展開液：ＥＡ only、ｐ－anisaldehyde）により確認して出発物質の反応有無を確認した後、終了時に溶液を濃縮した後、ＥＡを入れてＮａＨＣＯ３で洗浄してから濃縮させ、シリカカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＥＡ：ＨＥＸ＝１：１ｖ／ｖ）により精製することで、透明なオイル状の生成物を得た（４．５ｇ、６８．２％）。
【0121】
［製造例３］化合物１１（Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－ＯＭｅ）の製造
化合物９の製造
５００ｍＬの一口丸底フラスコに、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－ＣＯＯＨ２０．０ｇ（６０．７ｍｍｏｌ）を入れ、１５０ｍＬのドライＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かした。HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetramethyluroniumhexafluorophosphate）］２２．３ｇ（５８．３ｍｍｏｌ）を入れた。０℃でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２３．３ｍＬ（１３３．６ｍｍｏｌ）を加えた後、Ｎ－メトキシ－Ｎ－メチルアミンヒドロクロリド７．１１ｇ（７２．９ｍｍｏｌ）を入れ、常温で一晩撹拌させた。ＴＬＣ（展開液：３％ＡｃＯＨ、５％ＭｅＯＨ／ＭＣ、Ninhydrin）により確認して出発物質の反応有無を確認した後、終了時に溶液を濃縮した後、エチルアセテート（ＥＡ）１５０ｍＬを入れ、０．５ＮのＨＣｌ、飽和されたＮａＨＣＯ３と１ＮのＫＨＳＯ４で洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを投入し、有機層の水を除去した後に濃縮して、透明な無色オイル状の生成物である化合物９を得た（２１ｇ、９２．９％）。
化合物９の製造
【0122】
化合物１０の製造
窒素下で、１Ｌの三口丸底フラスコに、２１．０ｇ（５６．４ｍｍｏｌ）の化合物９を入れ、ドライテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２１０ｍＬに溶かした。－７８℃で２．３７Ｍのリチウムアルミニウムヒドリド２６．２ｇ（６２．０ｍｍｏｌ）を２０分かけて投入した後、１時間撹拌させた。ＴＬＣ（展開液：ＥＡ：Ｈｅｘ＝１：１、Ninhydrin）により確認して出発物質の反応有無を確認した後、終了時にエチルアセテート６００ｍＬを入れ、１ＭのＫＨＳＯ４ ２１０ｍＬを１０分かけて投入した後、１０分間撹拌させた。有機層を１ＭのＫＨＳＯ４、飽和されたＮａＨＣＯ３で洗浄し、硫酸ナトリウムで水を除去した後に濃縮して、透明な黄色のオイル状の生成物である化合物１０を得た（１８．５ｇ、８８．１％）。
【0123】
化合物１１の製造
５００ｍＬの丸底フラスコに、１８．５ｇ（５９．０ｍｍｏｌ）の化合物１０を入れ、ジクロロエタン１３０ｍＬを入れて、グリシンメチルエステルヒドロクロリド（ＨＣｌ．Ｇｌｙ－ＯＭｅ）を入れた。０℃で酢酸３．３８ｍＬ（５９．０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン１５．４ｍＬ（８８．５ｍｍｏｌ）を添加した後、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド１８．８ｇ（８８．５ｍｍｏｌ）を入れ、３０分撹拌させた。ＴＬＣ（展開液：ＥＡ：Ｈｅｘ＝１：４、２回展開、Ninhydrin）により確認して出発物質の反応有無を確認した後、終了時に、０℃で飽和ＮａＨＣＯ３ １３０ｍＬを投入してから１０分間撹拌させた。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３、飽和塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで水を除去した後に濃縮させ、シリカカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＥＡ：Ｈｅｘ＝１：１ｖ／ｖ）により精製することで、透明なオイル状の生成物１１（Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－ＯＭｅ）を得た（１４ｇ、６１．４％）。
【0124】
［製造例４］化合物１２（Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｚ）－ＮＨ２）の製造
化合物１２の製造
１Ｌの丸底フラスコに、Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＣＯＯＨ２０．０ｇ（５２．６ｍｍｏｌ）を入れ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００ｍＬに溶かした。HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetramethyluroniumhexafluor ophosphate）］２９．９ｇ（７８．９ｍｍｏｌ）を入れ、ＮＨ４Ｃｌ５．６２ｇ（１０５．１ｍｍｏｌ）を入れた後、０℃でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３６．６ｍＬ（２１０．３ｍｍｏｌ）を滴下した。約３０分程度撹拌した後、ＴＬＣにより反応終了を確認し、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を入れ、分液漏斗を用いて５％のＮａＨＣＯ３で１回、０．５ＭのＨＣｌで１回洗浄した。有機層が徐々に濁り、solidが生成されて、濾過して化合物１２（Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｚ）－ＮＨ２）を得た（１９．９ｇ、９９．９％）。
１Ｌの丸底フラスコに、Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＣＯＯＨ２０．０ｇ（５２．６ｍｍｏｌ）を入れ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００ｍＬに溶かした。HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetramethyluroniumhexafluor ophosphate）］２９．９ｇ（７８．９ｍｍｏｌ）を入れ、ＮＨ４Ｃｌ５．６２ｇ（１０５．１ｍｍｏｌ）を入れた後、０℃でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３６．６ｍＬ（２１０．３ｍｍｏｌ）を滴下した。約３０分程度撹拌した後、ＴＬＣにより反応終了を確認し、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を入れ、分液漏斗を用いて５％のＮａＨＣＯ３で１回、０．５ＭのＨＣｌで１回洗浄した。有機層が徐々に濁り、solidが生成されて、濾過して化合物１２（Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｚ）－ＮＨ２）を得た（１９．９ｇ、９９．９％）。
【0125】
［実施例１］ＰＮＡ単量体の製造
化合物１３－３（Ｂｏｃ－ａｅｇ－Ａ（Ｚ）－ＯＥｔ）の製造
３Ｌの丸底フラスコに、２０．０ｇ（６１．１ｍｍｏｌ）の化合物３を入れ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１Ｌに溶かした。HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetramethyluroniumhexafluorophosphate）］３４．８ｇ（１２２ｍｍｏｌ）を入れ、１５．１ｇ（６１．１ｍｍｏｌ）の化合物５を入れた後、０℃でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３１．９ｍＬ（１８３ｍｍｏｌ）を滴下した後、３０分間撹拌した。ＴＬＣ（展開液：５％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応終了を確認し、ジクロロメタン（ＭＣ）１Ｌを入れた。有機層を飽和されたＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＨＣｌで洗浄した後、硫酸ナトリウムを投入して水を除去して濃縮した。シリカカラムクロマトグラフィー（溶離液：５％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により精製することで、白色の固体生成物である化合物１３（Ｂｏｃ－Ａ（Ｚ）－ＯＥｔ）を得た。（３０．０ｇ、８８．４％）
化合物１３－３（Ｂｏｃ－ａｅｇ－Ａ（Ｚ）－ＯＥｔ）の製造
【0126】
化合物１４－３（Ｂｏｃ－ａｅｇ－Ａ（Ｚ）－ＯＨ）の製造
５００ｍＬの丸底フラスコに、１５．０ｇ（２７．０ｍｍｏｌ）の化合物１３－３を入れ、０．５ＮのＬｉＯＨ２７０ｍＬ（１３５ｍｍｏｌ）に溶かし、約３０分程度撹拌した後、ＴＬＣ（展開液：５％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応終了を確認した。０℃で０．５ＭのＨＣｌでｐＨ２～３まで下げた後、生成された固体をガラスフィルターで濾過し、水で複数回洗浄した後、Ｐ２Ｏ５で乾燥させて、白色の固体状の生成物である化合物１４－３（Ｂｏｃ－Ａ（Ｚ）－ＯＨ）を得た（１４．１ｇ、９９．０％）。
【0127】
化合物１５－１（ＮＨ２－ａｅｇ－Ａ（Ｚ）－ＯＥｔ）の製造
２５０ｍＬの丸底フラスコに、１５．０ｇ（２７．０ｍｍｏｌ）の化合物１３－３を入れ、０℃で５０％のＴＦＡ／ＭＣ１３５ｍＬに溶かし、３０分間撹拌した。ＴＬＣ（展開液：５％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応終了を確認した。過量のジエチルエーテルに溶液を滴下して沈殿させてからガラスフィルターで濾過し、ジエチルエーテルで複数回洗浄してから乾燥させ、白色の固体状の生成物である化合物１５－１（ＮＨ２－Ａ（Ｚ）－ＯＥｔ）を得た（１４．５ｇ、９４．３％）。
【0128】
［実施例２］ＰＮＡ単量体の製造
実施例１の化合物１３－３の製造において、化合物３に代えて化合物１を使用したことを除き、実施例１と同様に行ってＰＮＡ単量体１４－１（Ｂｏｃ－ａｅｇ－Ｔ－ＯＨ）およびＰＮＡ単量体１５－１（ＮＨ２－ａｅｇ－Ｔ－ＯＥｔ）を製造した。
実施例１の化合物１３－３の製造において、化合物３に代えて化合物１を使用したことを除き、実施例１と同様に行ってＰＮＡ単量体１４－１（Ｂｏｃ－ａｅｇ－Ｔ－ＯＨ）およびＰＮＡ単量体１５－１（ＮＨ２－ａｅｇ－Ｔ－ＯＥｔ）を製造した。
【0129】
［実施例３］ＰＮＡ単量体の製造
実施例１の化合物１３－３の製造において、化合物３に代えて化合物２または４をそれぞれ使用したことを除き、実施例１と同様に行ってＰＮＡ単量体１４－２（Ｂｏｃ－ａｅｇ－Ｃ（Ｚ）－ＯＨ）、ＰＮＡ単量体１４－４（Ｂｏｃ－ａｅｇ－Ｇ（Ｚ）－ＯＨ）、およびＰＮＡ単量体１５－４（ＮＨ２－ａｅｇ－Ｇ（Ｚ）－ＯＥｔ）を製造した。
実施例１の化合物１３－３の製造において、化合物３に代えて化合物２または４をそれぞれ使用したことを除き、実施例１と同様に行ってＰＮＡ単量体１４－２（Ｂｏｃ－ａｅｇ－Ｃ（Ｚ）－ＯＨ）、ＰＮＡ単量体１４－４（Ｂｏｃ－ａｅｇ－Ｇ（Ｚ）－ＯＨ）、およびＰＮＡ単量体１５－４（ＮＨ２－ａｅｇ－Ｇ（Ｚ）－ＯＥｔ）を製造した。
【0130】
［実施例４］ＰＮＡ単量体の製造
実施例１の化合物１３－３の製造において、化合物５に代えて化合物８を使用し、化合物３に代えて化合物２を使用したことを除き、実施例１と同様に行ってＰＮＡ単量体１４－５（Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｚ）－Ｃ（Ｚ）－ＯＨ）およびＰＮＡ単量体１５－６（ＮＨ２－Ｌｙｓ（Ｚ）－ＮＨ２）を製造した。
実施例１の化合物１３－３の製造において、化合物５に代えて化合物８を使用し、化合物３に代えて化合物２を使用したことを除き、実施例１と同様に行ってＰＮＡ単量体１４－５（Ｂｏｃ－Ｌｙｓ（Ｚ）－Ｃ（Ｚ）－ＯＨ）およびＰＮＡ単量体１５－６（ＮＨ２－Ｌｙｓ（Ｚ）－ＮＨ２）を製造した。
【0131】
［実施例５］ＰＮＡ単量体の製造
実施例１の化合物１３－３の製造において、化合物５に代えて化合物１１を使用し、化合物３に代えて化合物１を使用したことを除き、実施例１と同様に行ってＰＮＡ単量体１５－３（ＮＨ２－Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－Ｔ－ＯＭｅ）を製造した。
実施例１の化合物１３－３の製造において、化合物５に代えて化合物１１を使用し、化合物３に代えて化合物１を使用したことを除き、実施例１と同様に行ってＰＮＡ単量体１５－３（ＮＨ２－Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－Ｔ－ＯＭｅ）を製造した。
【0132】
［実施例６］ＰＮＡ単量体の製造
実施例５において、化合物１に代えて化合物２または４をそれぞれ使用したことを除き、実施例５と同様に行ってＰＮＡ単量体１５－４（ＮＨ２－Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－Ｃ（Ｚ）－ＯＭｅ）、ＰＮＡ単量体１５－５（ＮＨ２－Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－Ｇ（Ｚ）－ＯＭｅ）をそれぞれ製造した。
実施例５において、化合物１に代えて化合物２または４をそれぞれ使用したことを除き、実施例５と同様に行ってＰＮＡ単量体１５－４（ＮＨ２－Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－Ｃ（Ｚ）－ＯＭｅ）、ＰＮＡ単量体１５－５（ＮＨ２－Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－Ｇ（Ｚ）－ＯＭｅ）をそれぞれ製造した。
【0133】
［実施例７］ＰＮＡ二量体１７－１（Ｂｏｃ－ＡＡ－ＯＨ）の製造
化合物１６－１（Ｂｏｃ－ＡＡ－ＯＥｔ）の製造
２Ｌの丸底フラスコに、１３．０ｇ（２４．６ｍｍｏｌ）の化合物１４－３を入れ、ドライＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６５０ｍＬに溶かし、HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetramethyluroniumhexa fluorophosphate）］１４．０ｇ（３７．０ｍｍｏｌ）を入れた。１４．０ｇ（２４．６ｍｍｏｌ）の化合物１５－１を入れた後、０℃でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２１．５ｍＬ（１２３ｍｍｏｌ）を滴下し、３０分間撹拌させた。ＴＬＣ（展開液：１５％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応終了を確認し、ジクロロメタン（ＭＣ）６５０ｍＬを入れた。有機層を飽和されたＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＨＣｌで洗浄した後、硫酸ナトリウムを投入し、水を除去して濃縮した。シリカカラムクロマトグラフィー（溶離液：１０％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により精製することで、白色の固体生成物Ｂｏｃ－ＡＡ－ＯＥｔを得た（２１．０ｇ、８７．９％）。
化合物１６－１（Ｂｏｃ－ＡＡ－ＯＥｔ）の製造
【0134】
化合物１７－１（Ｂｏｃ－ＡＡ－ＯＨ）の製造
５００ｍＬの丸底フラスコに、２１．０ｇ（２１．７ｍｍｏｌ）の化合物１６－１を入れ、０℃で０．５ＮのＬｉＯＨ２１７ｍＬ（１０８ｍｍｏｌ）に溶かし、３０分間撹拌した。ＴＬＣ（展開液：１０％ＭｅＯＨ／ＭＣ）によりモニタリングして反応を終了させた。０℃で１ＭのＨＣｌでｐＨ２～３まで下げ、生成された固体をガラスフィルターで濾過し、水で複数回洗浄した後、ＭｅＯＨ／エーテルで再結晶し、白色の生成物である化合物１７－１（Ｂｏｃ－ＡＡ－ＯＨ）を得た（１９．７ｇ、９６．６％）。
【0135】
［実施例８］ＰＮＡ二量体の製造
実施例７において、化合物１４－３および１５－３に代えてＰＮＡ単量体をそれぞれ変更し、実施例７と同様に製造することで、ＰＮＡ二量体１６－２（Ｂｏｃ－Ｃ’’Ａ－ＯＥｔ）、ＰＮＡ二量体１７－２（Ｂｏｃ－ＣＣ＾－ＯＨ）、ＰＮＡ二量体１７－３（Ｂｏｃ－ＴＴ＾－ＯＨ）、およびＰＮＡ二量体１７－４（Ｂｏｃ－ＧＧ－ＯＨ）をそれぞれ製造した。この際、base’’はＮＨ２－γＬｙｓ（Ｚ）－base－ＯＭｅであり、base＾はＮＨ２－γＧｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－base－ＯＭｅである。
実施例７において、化合物１４－３および１５－３に代えてＰＮＡ単量体をそれぞれ変更し、実施例７と同様に製造することで、ＰＮＡ二量体１６－２（Ｂｏｃ－Ｃ’’Ａ－ＯＥｔ）、ＰＮＡ二量体１７－２（Ｂｏｃ－ＣＣ＾－ＯＨ）、ＰＮＡ二量体１７－３（Ｂｏｃ－ＴＴ＾－ＯＨ）、およびＰＮＡ二量体１７－４（Ｂｏｃ－ＧＧ－ＯＨ）をそれぞれ製造した。この際、base’’はＮＨ２－γＬｙｓ（Ｚ）－base－ＯＭｅであり、base＾はＮＨ２－γＧｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－base－ＯＭｅである。
【0136】
［実施例９］ＰＮＡ二量体１８－１（ＮＨ２－Ｃ’’Ａ－ＯＥｔ）の製造
２５０ｍＬの丸底フラスコに、２０．０ｇ（１７．４ｍｍｏｌ）の１６－２（Ｂｏｃ－Ｃ’’Ａ－ＯＥｔ）を入れ、０℃で５０％ＴＦＡ／ＭＣ１８０ｍＬに溶かした後、３０分間撹拌した。ＴＬＣ（展開液：７％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応を終了させた。過量のジエチルエーテルに溶液を滴下して沈殿させた後、ガラスフィルターを用いて濾過し、ジエチルエーテルで洗浄して白色の固体生成物であるＮＨ２－Ｃ’’Ａ－ＯＥｔを得た（１９．２ｇ、９４．９％）。
【0137】
［実施例１０］ＯＫリンカー（化合物１８－２、ＮＨ２－ＯＫ－ＮＨ２）の製造
化合物１６－６（Ｂｏｃ－ＯＫ－ＮＨ２）の製造
２Ｌの丸底フラスコに、３，６，１１－トリオキサ－９－アザトリデカン酸、１２，１２－ジメチル－１０－オキソ－９７％（Ｂｏｃ－Ｏ－ＯＨ）を１３．０ｇ（４９．４ｍｍｏｌ）入れ、ドライＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６５０ｍＬに溶かし、HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetra methyluroniumhexa fluorophosp hate）］２２．５ｇ（５９．３ｍｍｏｌ）を入れた。１９．４ｇ（４９．４ｍｍｏｌ）の化合物１５－６を入れた後、０℃でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２１．５ｍＬ（１２３ｍｍｏｌ）を滴下し、３０分間撹拌させた。ＴＬＣ（展開液：７％ＭｅＯＨ／ＥＡ）により反応終了を確認し、ジクロロメタン（ＭＣ）６５０ｍＬを入れた。有機層を飽和されたＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＨＣｌで洗浄した後、硫酸ナトリウムを投入し、水を除去して濃縮した。シリカカラムクロマトグラフィー（溶離液：７％ＭｅＯＨ／ＥＡ）により精製することで、透明な無色オイル状のＢｏｃ－ＯＫ－ＮＨ２を得た（２１．０ｇ、８１．１％）。
化合物１６－６（Ｂｏｃ－ＯＫ－ＮＨ２）の製造
【0138】
化合物１８－２（ＮＨ２－ＯＫ－ＮＨ２）の製造
２５０ｍＬの丸底フラスコに、化合物１６－６（Ｂｏｃ－ＯＫ－ＮＨ２）２１．０ｇ（４０．０ｍｍｏｌ）を入れ、０℃で５０％ＴＦＡ／ＭＣ１８０ｍＬに溶かした後、３０分間撹拌した。ＴＬＣ（展開液：７％ＭｅＯＨ／ＥＡ）により反応を終了させた。過量のジエチルエーテルに溶液を滴下して沈殿させた後、遠心分離（Centrifuge）により得たオイル状の生成物をジクロロメタンに溶かし、溶媒を濃縮して、無色透明なオイル状の生成物であるＮＨ２－ＯＫ－ＮＨ-２を得た（１９．２ｇ、８９．１％）。
【0139】
［実施例１１］ＰＮＡ三量体１９－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ＾－ＯＭｅ）の製造
２Ｌの丸底フラスコに、１５．２ｇ（１６．２ｍｍｏｌ）の化合物１７－１を入れ、ドライＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）７５０ｍＬに溶かした。PyBOP（benzotriazole－１－yl－oxytripyrrolidinophosphate）１２．６ｇ（２４．２ｍｍｏｌ）を加えた後、１１．７ｇ（１６．２ｍｍｏｌ）の化合物１５－５を入れた。０℃でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）５６．３ｍＬ（３２３ｍｍｏｌ）を入れ、３０分程度撹拌させた後、ＴＬＣ（展開液：２０％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応終了を確認した。ジクロロメタンを３００ｍＬ投入した後、飽和されたＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＨＣｌ溶液で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで水を除去してから濃縮して、透明な黄色のオイル状の生成物を得た。この生成物をＭｅＯＨ／エーテルで再結晶し、白色の固体化合物である化合物１９－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ^－ＯＭｅ）を得た（２１．３ｇ、８５．９％）。
【0140】
［実施例１２］ＰＮＡ三量体１９－２（Ｂｏｃ－ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）の製造
実施例１１において、ＰＮＡ二量体１７－１およびＰＮＡ単量体１５－５に代えてＰＮＡ単量体１４－２、ＰＮＡ二量体１８－１を使用したことを除き、実施例１１と同様に行ってＰＮＡ三量体１９－２（Ｂｏｃ－ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）を製造した。この際、Base’’はＮＨ２－γＬｙｓ（Ｚ）－base－ＯＭｅである。
実施例１１において、ＰＮＡ二量体１７－１およびＰＮＡ単量体１５－５に代えてＰＮＡ単量体１４－２、ＰＮＡ二量体１８－１を使用したことを除き、実施例１１と同様に行ってＰＮＡ三量体１９－２（Ｂｏｃ－ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）を製造した。この際、Base’’はＮＨ２－γＬｙｓ（Ｚ）－base－ＯＭｅである。
【0141】
［実施例１３］ＰＮＡ三量体２０－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ^－ＯＨ）の製造
１Ｌの丸底フラスコに、２０．３ｇ（１３．２ｍｍｏｌ）の化合物１９－１を入れ、１，４－ジオキサン１００ｍＬに溶かした。０℃で０．５ＭのＬｉＯＨ１３２ｍＬ（６６．１ｍｍｏｌ）を滴下し、約３０分程度撹拌させた。ＴＬＣ（展開液：２０％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応終了を確認した。０℃で０．５ＭのＨＣｌでｐＨ２～３まで下げ、生成された固体をガラスフィルターで濾過し、水で洗浄した後、ＭｅＯＨ／エーテルで再結晶して、白色の固体生成物である化合物２０－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ^－ＯＨ）を得た（１８．３ｇ、９０．８％）。
【0142】
［実施例１４］ＰＮＡ三量体２１－１（ＮＨ２－ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）の製造
２５０ｍＬの丸底フラスコに、２５．３ｇ（１６．５ｍｍｏｌ）の１９－２を入れ、０℃で５０％ＴＦＡ／ＭＣ２３０ｍＬに溶かした後、３０分間撹拌させ、ＴＬＣ（展開液：２０％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応を終了させた。過量のジエチルエーテルに溶液を滴下して沈殿させた後、ガラスフィルターを用いて濾過し、ジエチルエーテルで洗浄して、白色の固体生成物である化合物２１－１（ＮＨ２－ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）を得た（２３．８ｇ、９３．２％）。
【0143】
［実施例１５］ＰＮＡ２３－１（ＮＨ２－ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
化合物２２－１（Ｂｏｃ－ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
１Ｌの丸底フラスコに、１３．８ｇ（１４．２ｍｍｏｌ）の化合物１７－４を入れ、ドライＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６５０ｍＬに溶かした。PyBOP（benzotriazole－１－yl－oxytripyrrolidinophosphate）１１．１ｇ（２１．４ｍｍｏｌ）を加えた後、７．６７ｇ（１４．２ｍｍｏｌ）の化合物１８－２を入れた。０℃でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４９．６ｍＬ（２８５ｍｍｏｌ）を入れ、３０分程度撹拌させた後、ＴＬＣ（展開液：２０％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応終了を確認した。ジクロロメタン（ＭＣ）を６５０ｍＬ投入した後、飽和されたＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＨＣｌ溶液で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで水を除去してから濃縮した透明な無色オイル状の生成物をＭｅＯＨ／エーテルで再結晶し、白色の固体化合物である化合物２２－１（Ｂｏｃ－ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を得た（１７．７ｇ、９０．４％）。
化合物２２－１（Ｂｏｃ－ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
【0144】
化合物２３－１（ＮＨ２－ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
２５０ｍＬの丸底フラスコに、１６．７ｇ（１２．１ｍｍｏｌ）の２２－１を入れ、０℃で５０％ＴＦＡ／ＭＣ１４０ｍＬに溶かした後、３０分間撹拌し、ＴＬＣ（展開液：２０％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応を終了させた。過量のジエチルエーテルに溶液を滴下して沈殿させた後、ガラスフィルターを用いて濾過し、ジエチルエーテルで洗浄して、白色の固体生成物である化合物２３－１（ＮＨ２－ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を得た（１６．０ｇ、９４．８％）。
【0145】
［実施例１６］ＰＮＡ五量体２５－１（Ｂｏｃ－ＣＣ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＨ）の製造
化合物２４－１（Ｂｏｃ－ＣＣ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）の製造
１Ｌの丸底フラスコに、６．１３ｇ（５．８８ｍｍｏｌ）の化合物１７－２を入れ、ドライＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３００ｍＬに溶かした。PyBOP（benzotriazole－１－yl－oxytripyr rolidinophosphate）４．５９ｇ（８．８２ｍｍｏｌ）を入れ、９．０８ｇ（５．８８ｍｍｏｌ）の化合物２１－１を入れた後、０℃でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２０．５ｍＬ（１１８ｍｍｏｌ）を滴下した。約３０分程度撹拌した後、ＴＬＣ（展開液：５％ＡｃＯＨ、１０％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応終了を確認し、ジクロロメタン（ＭＣ）３００ｍＬを入れ、飽和されたＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＨＣｌで有機層を洗浄した。硫酸ナトリウムで有機層から水を除去してから濃縮して得た生成物をＭｅＯＨ／エーテルで再結晶して、白色の固体生成物である化合物２４－１（Ｂｏｃ－ＣＣ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）を得た（１３．２ｇ、９１．４％）。
化合物２４－１（Ｂｏｃ－ＣＣ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）の製造
【0146】
化合物２５－１（Ｂｏｃ－ＣＣ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＨ）の製造
５００ｍＬの丸底フラスコに、１３．０ｇ（５．２９ｍｍｏｌ）の化合物２４－１を１，４－ジオキサン７１．５ｍＬに溶かした。０℃で０．５ＮのＬｉＯＨ５２．９ｍＬ（２６．５ｍｍｏｌ）を入れ、約３０分程度撹拌させた。ＴＬＣ（展開液：５％ＡｃＯＨ、２０％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応終了を確認し、０．５ＭのＨＣｌでｐＨ２～３まで下げ、生成された固体をガラスフィルターで濾過し、水で洗浄した後、ＭｅＯＨ／エーテルで再結晶した。生成された固体をガラスフィルターで濾過し、ジエチルエーテルで洗浄してから乾燥させ、白色の固体状の生成物である化合物２５－１（Ｂｏｃ－ＣＣ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＨ）を得た（１２．１ｇ、９４．２％）。
【0147】
［実施例１７］ＰＮＡ六量体２７－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＨ）の製造
化合物２６－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）の製造
２Ｌの丸底フラスコに、１１．７ｇ（７．６６ｍｍｏｌ）の化合物２０－１をドライＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５５０ｍＬに溶かした。HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetramethyluroniumhexa fluorophosphate）］４．３６ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）を加えた後、１１．８ｇ（７．６６ｍｍｏｌ）の化合物２１－１を入れた。０℃でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２６．７ｍＬ（１５３ｍｍｏｌ）を入れ、３０分間撹拌させた。ＴＬＣ（展開液：５％ＡｃＯＨ、１５％ＭｅＯＨ／ＭＣ）により反応終了を確認した後、ジクロロメタンを５５０ｍＬ投入し、飽和されたＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＨＣｌ溶液で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで水を除去してから濃縮して、透明な黄色のオイル状の生成物を得た。この化合物をＭｅＯＨ／エーテルで再結晶し、白色の固体化合物である化合物２６－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）を得た（収率：１８．２ｇ、８１．０％）。
化合物２６－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＥｔ）の製造
【0148】
化合物２７－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ＾ＣＣ’’Ａ－ＯＨ）の製造
５００ｍＬの丸底フラスコに、１８．２ｇ（６．２０ｍｍｏｌ）の化合物２６－１を入れた後、１，４ジオキサン１８２ｍＬに溶かした。０℃で０．５ＮのＬｉＯＨ６２．０ｍＬを滴下した後、３０分間撹拌させた。ＴＬＣ（展開液：５％ＡｃＯＨ、１５％ＭｅＯＨ／ＭＣ）によりモニタリングして反応を終了させた。０℃で１ＭのＨＣｌでｐＨ２～３まで下げ、生成された固体を濾過した後、水で洗浄してから乾燥させた固体をＭｅＯＨ／エーテルで再結晶して、白色の化合物である化合物２７－１を得た（１５．１ｇ、８３．８％）［Prep精製を進行した。］。
【0149】
［実施例１８］ＰＮＡ四量体リンカー化合物２８－１（ＴＦＡ．ＮＨ２－ＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
化合物２６－２（Ｂｏｃ－ＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
実施例１７において、ＰＮＡ三量体２０－１およびＰＮＡ三量体２１－１に代えて１７－３、２３－１を使用したことを除き、実施例１７と同様に行って２６－２（Ｂｏｃ－ＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を製造した。この際、Base＾はＮＨ２－γＧｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－base－ＯＭｅである。
化合物２６－２（Ｂｏｃ－ＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
実施例１７において、ＰＮＡ三量体２０－１およびＰＮＡ三量体２１－１に代えて１７－３、２３－１を使用したことを除き、実施例１７と同様に行って２６－２（Ｂｏｃ－ＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を製造した。この際、Base＾はＮＨ２－γＧｌｕ（ＯｃＨｅｘ）－base－ＯＭｅである。
【0150】
化合物２８－１（ＴＦＡ．ＮＨ２－ＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
２５０ｍＬの丸底フラスコに、１５．５ｇ（７．５２ｍｍｏｌ）の化合物２６－２を入れ、０℃で５０％ＴＦＡ／ＭＣ１４０ｍＬに溶かした後、３０分間撹拌させた。ＴＬＣ（展開液：２０％ＭｅＯＨ／ＭＣ）によりモニタリングして反応を終了させた。反応終了後、０℃で過量のジエチルエーテルに溶液を滴下して沈殿させた。濾過後、白色の固体状の生成物である化合物２８－１（ＴＦＡ．ＮＨ２－ＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を得た（１４．６ｇ、９４．３％）。
【0151】
［実施例１９］ＰＮＡ十量体リンカー化合物３０－１（ＮＨ２－ＣＣ＾ＣＣ’’ＡＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
化合物２９－１（Ｂｏｃ－ＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
１Ｌの丸底フラスコに、５．７６ｇ（２．３７ｍｍｏｌ）の化合物２５－１をドライＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２５０ｍＬに溶かし、PyBOP（benzotriazole－１－yl－oxytri pyrrolidinophosphate）１．８５ｇ（３．５６ｍｍｏｌ）を投入した。４．９２ｇ（２．３７ｍｍｏｌ）の化合物２８－１を投入した後、０℃でジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）１２．０ｍＬ（６８．８ｍｍｏｌ）を滴下し、３０分間撹拌した。製造された粗（crude）ＰＮＡオリゴマーに対して、ＨＰＬＣ（Agilent １１００、１０％ ＭｅＣＮ ７０％ for ２０mins １００％ for ２５mins）により反応終了とCrude purityを測定した。ＭＣ２５０ｍＬを入れ、飽和されたＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＨＣｌ溶液で有機層を洗浄した後、硫酸ナトリウムで水を除去して濃縮して得た透明な黄色のオイル状である生成物をＭｅＯＨ／エーテルで再結晶して、白色の固体状の化合物２９－１（Ｂｏｃ－ＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を製造した（８．３２ｇ、８０．３％）
化合物２９－１（Ｂｏｃ－ＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
１Ｌの丸底フラスコに、５．７６ｇ（２．３７ｍｍｏｌ）の化合物２５－１をドライＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２５０ｍＬに溶かし、PyBOP（benzotriazole－１－yl－oxytri pyrrolidinophosphate）１．８５ｇ（３．５６ｍｍｏｌ）を投入した。４．９２ｇ（２．３７ｍｍｏｌ）の化合物２８－１を投入した後、０℃でジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）１２．０ｍＬ（６８．８ｍｍｏｌ）を滴下し、３０分間撹拌した。製造された粗（crude）ＰＮＡオリゴマーに対して、ＨＰＬＣ（Agilent １１００、１０％ ＭｅＣＮ ７０％ for ２０mins １００％ for ２５mins）により反応終了とCrude purityを測定した。ＭＣ２５０ｍＬを入れ、飽和されたＮａＨＣＯ３、０．５ＭのＨＣｌ溶液で有機層を洗浄した後、硫酸ナトリウムで水を除去して濃縮して得た透明な黄色のオイル状である生成物をＭｅＯＨ／エーテルで再結晶して、白色の固体状の化合物２９－１（Ｂｏｃ－ＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を製造した（８．３２ｇ、８０．３％）
【0152】
化合物３０－１（ＴＦＡ．ＮＨ２－ＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
２５０ｍＬの丸底フラスコに、８．３２ｇ（１．９０ｍｍｏｌ）の化合物３０－１を入れ、０℃で５０％ＴＦＡ／ＭＣ１４０ｍＬに溶かした後、３０分間撹拌させた。製造された粗ＰＮＡオリゴマーに対して、ＨＰＬＣ（Agilent １１００、１０％ ＭｅＣＮ ７０％ for ２０mins １００％ for ２５mins）により反応終了とCrude purityを測定した。反応終了後、０℃で過量のジエチルエーテルに溶液を滴下し、沈殿させた。濾過後、白色の固体状の生成物である化合物３０－１（ＴＦＡ．ＮＨ２－ＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を得た（７．３１ｇ、８７．６％）。［Prep精製を進行した。］
２５０ｍＬの丸底フラスコに、８．３２ｇ（１．９０ｍｍｏｌ）の化合物３０－１を入れ、０℃で５０％ＴＦＡ／ＭＣ１４０ｍＬに溶かした後、３０分間撹拌させた。製造された粗ＰＮＡオリゴマーに対して、ＨＰＬＣ（Agilent １１００、１０％ ＭｅＣＮ ７０％ for ２０mins １００％ for ２５mins）により反応終了とCrude purityを測定した。反応終了後、０℃で過量のジエチルエーテルに溶液を滴下し、沈殿させた。濾過後、白色の固体状の生成物である化合物３０－１（ＴＦＡ．ＮＨ２－ＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を得た（７．３１ｇ、８７．６％）。［Prep精製を進行した。］
【0153】
［実施例２０］ＰＮＡ十五量体３１－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ＾ＣＣ’’ＡＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
５００ｍＬの丸底フラスコに、３．５４ｇ（１．２２ｍｍｏｌ）の化合物２０－１をドライジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３５０ｍＬに溶かした後、HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetramethyluronium hexafluorophosphate）］０．６９３ｇ（１．８３ｍｍｏｌ）を投入した。５．３４ｇ（１．２２ｍｍｏｌ）の化合物３０－１を投入した後、０℃でジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４．２４ｍＬ（２４．４ｍｍｏｌ）を投入して３０分間撹拌した。製造された粗ＰＮＡオリゴマーに対してＨＰＬＣ（Agilent １１００、１０％ ＭｅＣＮ ７０％ for ２０mins １００％ for ２５mins）によりCrude purityを測定し、その結果を図１に示した。
５００ｍＬの丸底フラスコに、３．５４ｇ（１．２２ｍｍｏｌ）の化合物２０－１をドライジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３５０ｍＬに溶かした後、HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetramethyluronium hexafluorophosphate）］０．６９３ｇ（１．８３ｍｍｏｌ）を投入した。５．３４ｇ（１．２２ｍｍｏｌ）の化合物３０－１を投入した後、０℃でジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４．２４ｍＬ（２４．４ｍｍｏｌ）を投入して３０分間撹拌した。製造された粗ＰＮＡオリゴマーに対してＨＰＬＣ（Agilent １１００、１０％ ＭｅＣＮ ７０％ for ２０mins １００％ for ２５mins）によりCrude purityを測定し、その結果を図１に示した。
【0154】
図１に示されたように、測定されたcrude purityは８７％であった。
【0155】
［比較例１］化合物３１－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ＾ＣＣ’’ＡＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）の製造
５００ｍＬの丸底フラスコに、１．００ｇ（０．３４４ｍｍｏｌ）の化合物２０－１をドライジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍＬに溶かした後、HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetramethyluronium hexafluorophosphate）］０．１９６ｇ（０．５１６ｍｍｏｌ）を投入し、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）０．６ｍＬ（３．４４ｍｍｏｌ）を常温で１０分間撹拌させた。１．５１ｇ（０．３４４ｍｍｏｌ）の化合物３０－１をドライジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍＬに溶かした後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）０．６ｍＬ（３．４４ｍｍｏｌ）を投入し、０℃で１０分間撹拌させた。製造された溶液を０℃で混合し、３０分間撹拌させた後、ＨＰＬＣ（Agilent １１００、１０％ ＭｅＣＮ ７０％ for ２０mins １００％ for ２５mins）によりCrude purityを測定し、その結果を図２に示した。
５００ｍＬの丸底フラスコに、１．００ｇ（０．３４４ｍｍｏｌ）の化合物２０－１をドライジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍＬに溶かした後、HBTU［O－（１H－Benzotriazol－１－yl－N,N,N’,N’－tetramethyluronium hexafluorophosphate）］０．１９６ｇ（０．５１６ｍｍｏｌ）を投入し、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）０．６ｍＬ（３．４４ｍｍｏｌ）を常温で１０分間撹拌させた。１．５１ｇ（０．３４４ｍｍｏｌ）の化合物３０－１をドライジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍＬに溶かした後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）０．６ｍＬ（３．４４ｍｍｏｌ）を投入し、０℃で１０分間撹拌させた。製造された溶液を０℃で混合し、３０分間撹拌させた後、ＨＰＬＣ（Agilent １１００、１０％ ＭｅＣＮ ７０％ for ２０mins １００％ for ２５mins）によりCrude purityを測定し、その結果を図２に示した。
【0156】
図２に示されたように、アミン化合物の添加順序によって、Crude purityに著しい差があることが分かる。
【0157】
［実施例２１］ＰＮＡオリゴマーの製造
実施例２０において、ドライジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍＬを使用したことを除き、実施例２０と同様に行ってＰＮＡオリゴマー３１－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ＾ＣＣ’’ＡＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を製造した。
実施例２０において、ドライジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍＬを使用したことを除き、実施例２０と同様に行ってＰＮＡオリゴマー３１－１（Ｂｏｃ－ＡＡＧ＾ＣＣ’’ＡＣＣ＾ＣＣ’’ＡＴＴ＾ＧＧＯＫ－ＮＨ２）を製造した。
【図1】
【図2】
【手続補正書】
【提出日】2022-07-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0024】
好ましくは、本発明の一実施形態に係るＰＮＡオリゴマーの製造方法は、
ａ）カップリング試薬および溶媒の存在下で、
下記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体を添加して混合液を得るステップと、
ｂ）前記ステップの混合液にアミン化合物を添加し、前記化学式７～９で表される化合物を製造するステップと、を含む。
ａ）カップリング試薬および溶媒の存在下で、
下記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体を添加して混合液を得るステップと、
ｂ）前記ステップの混合液にアミン化合物を添加し、前記化学式７～９で表される化合物を製造するステップと、を含む。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0039】
Ｒ１～Ｒ１８は、互いに独立して、水素、アミノ酸の残基、または置換基を有するアミノ酸残基であり；
Ｔ１～Ｔ３は、互いに独立して、アミン保護基であり；
Ｚ１～Ｚ３は、互いに独立して、ヒドロキシ保護基であり；
Ｂ１～Ｂ９は、互いに独立して、アミン保護基を含むかもしくは含まない核酸塩基である。）
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0040】
本発明の一実施形態に係る化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、前記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または前記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体１当量に対して、前記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、前記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または前記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体が１：０．８～１．２モルで用いられてもよい。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0099】
Ｒ１～Ｒ１８は、互いに独立して、水素、アミノ酸の残基または置換基を有するアミノ酸残基であり；
Ｔ１～Ｔ３は、互いに独立して、アミン保護基であり；
Ｚ１～Ｚ３は、互いに独立して、ヒドロキシ保護基であり；
Ｂ１～Ｂ９は、互いに独立して、アミン保護基を含むかもしくは含まない核酸塩基である。）
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0100】
本発明の一実施形態に係る前記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、前記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または前記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体１モルに対して、前記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、前記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または前記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体は１：０．８～１．２モル、好ましくは１：０．９～１．１モルで用いられてもよい。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0118】
化合物７の製造
窒素下で、２５０ｍＬの二口丸底フラスコに、８．７１ｍＬのOxalyl Chloride（１７．４ｍｍｏｌ）をシリンジを用いて入れ、２０ｍＬのドライＭＣを入れた。ＮａＣｌと氷、メタノールを用いて温度を－２０℃に５分かけて下げ、１００ｍＬの丸底フラスコに２．４７ｍＬのドライＤＭＳＯ（３４．８ｍｍｏｌ）と５ｍＬのドライＭＣを混合した溶液を滴下した。５分後、５．８０ｇのＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）－ＯＨ（１５．８ｍｍｏｌ）をドライＭＣ２０ｍＬに溶かした後、反応液に添加した。１５分後、１５．２ｍＬのＤＩＥＡ（８７．１ｍｍｏｌ）を添加した後、５分間撹拌させ、氷浴を除去してＴＬＣを確認（ＥＡ only、ｐ－Anisaldehyde）した。反応終了後、ＮａＨＣＯ３で洗浄した後、溶媒を濃縮させて透明なオイル状の化合物７を得た（５．５ｇ、９５．３％）。
【手続補正7】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＮＡブロックとＰＮＡブロックを溶液相で反応させ、ＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含み；前記ＰＮＡブロックは、異なるかもしくは同一である２つ以上のＰＮＡ単量体が結合されたものである、ＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項2】
カップリング試薬および溶媒の存在下で、下記化学式１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６で表される第２ＰＮＡ四量体を混合した後、アミン化合物を添加して、下記化学式７～９で表されるＰＮＡオリゴマーを製造するステップを含む、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
Ａ１～Ａ９およびＡ１１～Ａ１４は、互いに独立して、互いに異なるかもしくは同一の核酸塩基を含むＰＮＡ単量体であり；
Ｐ１～Ｐ１８は、互いに独立して、水素、または互いに異なるかもしくは同一の保護基であり、Ｐ１とＰ２、Ｐ３とＰ４、Ｐ５とＰ６、Ｐ１１とＰ１２、Ｐ１３とＰ１４、Ｐ１５とＰ１６、およびＰ１７とＰ１８のそれぞれが同時に水素である場合は除き、
ａおよびｂは、互いに独立して、１の整数であり、ｃおよびｄは、互いに独立して、０または１の整数である。）
【請求項3】
ａ）カップリング試薬および溶媒の存在下で、下記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、下記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または下記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体に、下記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、下記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または下記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体を添加して混合液を得るステップと、
ｂ）前記ステップの混合液にアミン化合物を添加して、前記化学式７～９の化合物を製造するステップと、を含む、請求項２に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
Ａ１～Ａ９およびＡ１１～Ａ１４は、互いに独立して、互いに異なるかもしくは同一の核酸塩基を含むＰＮＡ単量体であり；
Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ９、およびＰ１１は、互いに独立して、水素、または互いに異なるかもしくは同一の保護基であり；
Ｘ１～Ｘ３は、互いに独立して、酸性塩であり；
ａおよびｂは、互いに独立して、１の整数であり、ｃおよびｄは、互いに独立して、０または１の整数である。）
【請求項4】
前記アミン化合物がＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである、請求項２または３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項5】
前記ｂ）ステップで得られた生成物をさらに出発物質として用いて、ａ）ステップおよびｂ）ステップを繰り返して行うステップをさらに含む、請求項３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項6】
前記混合液中の出発物質と溶媒の体積比が１：１０以上である、請求項３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項7】
前記核酸塩基は、アデニン、シトシン、５－メチルシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、プリン、２，６－ジアミノプリン、Ｎ４Ｎ４－エタノシトシン、Ｎ６Ｎ６－エタノ－２，６－ジアミノプリン、５－（Ｃ３－Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（Ｃ３－Ｃ６）－アルキニル－シトシン、５－（１－プロパルギルアミノ）ウラシル、５－（１－プロパルギルアミノ）シトシン、フェノキサジン、９－アミノエトキシフェノキサジン、５－フルオロウラシル、シュードイソシトシン、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－アミノウラシル、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキルウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキル－シトシン、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－フルオロシトシン、５－クロロウラシル、５－クロロシトシン、５－ブロモウラシル、５－ブロモシトシン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、８－アザプリン、７－デアザ－７－置換されたプリン、チオウラシル、または人工核酸塩基である、請求項２または３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項8】
前記保護基は、フルオレニルメトキシカルボニル、３級－ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、Ｂｈｏｃ（Benzhydryloxycarbonyl）、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、ｐ－メトキシベンジル、３，４－ジメトキシベンジル、ｐ－メトキシフェニル、トシル、トリクロロエチルクロロホルメート、スルホンアミド、またはイソブチリルである、請求項２または３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項9】
前記第１ＰＮＡ二量体または第２ＰＮＡ二量体は、下記化学式１１で表され、前記第１ＰＮＡ三量体または第２ＰＮＡ三量体は、下記化学式１２で表され、
前記第１ＰＮＡ四量体または第２ＰＮＡ四量体は、下記化学式１３で表される、請求項２に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
Ｒ１～Ｒ１８は、互いに独立して、水素、アミノ酸の残基または置換基を有するアミノ酸残基であり；
Ｔ１～Ｔ３は、互いに独立して、アミン保護基であり；
Ｚ１～Ｚ３は、互いに独立して、ヒドロキシ保護基であり；
Ｂ１～Ｂ９は、互いに独立して、アミン保護基を含むかもしくは含まない核酸塩基である。）
【請求項10】
前記化学式１－１で表される第１ＰＮＡ二量体、前記化学式２－１で表される第１ＰＮＡ三量体、または前記化学式３－１で表される第１ＰＮＡ四量体１当量に対して、前記化学式４－１で表される第２ＰＮＡ二量体、前記化学式５－１で表される第２ＰＮＡ三量体、または前記化学式６－１で表される第２ＰＮＡ四量体が１：０．８～１．２モルで用いられる、請求項３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項11】
前記カップリング試薬が、HBTU、PyBop、またはこれらの混合物である、請求項２または３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項12】
前記ｂ）ステップは、－１０～５℃で１０～６０分間行われる、請求項３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項13】
前記溶媒が、クロロ化（Ｃ１－Ｃ４）アルカン、またはＤＭＦを含む、請求項２または３に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【請求項14】
前記製造された化学式７～９の化合物に水を添加して分離精製するステップをさらに含む、請求項２に記載のＰＮＡオリゴマーの製造方法。
【国際調査報告】