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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-02
(54)【発明の名称】多発性硬化症の治療のための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 33/242 20190101AFI20230222BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230222BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20230222BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20230222BHJP
【ＦＩ】
A61K33/242
A61P25/00
A61K47/54
A61K47/62
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022539309
(86)(22)【出願日】2019-12-27
(85)【翻訳文提出日】2022-08-24
(86)【国際出願番号】 CN2019129264
(87)【国際公開番号】W WO2021128292
(87)【国際公開日】2021-07-01
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521313935
【氏名又は名称】武漢広行科学研究有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＷＵＨＡＮ ＶＡＳＴ ＣＯＮＤＵＣＴ ＳＣＩＥＮＣＥ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ５０６， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １， Ｏｐｔｉｃｓ Ｖａｌｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ， Ｎｏ． ３８８ Ｇａｏｘｉｎ ２ｎｄ Ｒｏａｄ， Ｄｏｎｇｈｕ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｗｕｈａｎ， Ｈｕｂｅｉ ４３００７０ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】スゥン、タオレイ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA16
4C076BB11
4C076CC01
4C076CC41
4C076DD56
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF43
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA01
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA02
(57)【要約】
本開示は、対象の多発性硬化症を治療するための金クラスターの医薬使用である。前記金クラスターが、金コアと、前記金コアに結合したリガンドとを含む。
【選択図】図１０
【選択図】図１０
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多発性硬化症を有する対象を治療する方法であって、多発性硬化症を有する対象に有効量で医薬組成物を投与することを含み、
前記医薬組成物は、金クラスター（ＡｕＣ）を含み、前記ＡｕＣが、
金コアと、
前記金コアに結合したリガンドと、
を含む、方法。
【請求項2】
前記金コアの直径が３ｎｍ未満である、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記金コアの直径が０．５～２．６ｎｍの範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項4】
前記リガンドは、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、請求項１記載の方法。
【請求項5】
前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして、前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる、請求項４記載の方法。
【請求項6】
前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチドまたはシステイン含有テトラペプチドである、請求項４記載の方法。
【請求項7】
前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項8】
前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リシン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項9】
前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項10】
前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、請求項４記載の方法。
【請求項11】
対象の多発性硬化症を治療するための医薬の製造における金クラスター（ＡｕＣ）の使用であって、前記ＡｕＣが、金コアと、
前記金コアに結合したリガンドと、
を含む、使用。
【請求項12】
前記金コアの直径が３ｎｍ未満である、請求項１１記載の使用。
【請求項13】
前記金コアの直径が０．５～２．６ｎｍの範囲にある、請求項１１記載の使用。
【請求項14】
前記リガンドは、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、請求項１１記載の使用。
【請求項15】
前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして、前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる、請求項１４記載の使用。
【請求項16】
前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチドまたはシステイン含有テトラペプチドである、請求項１４記載の使用。
【請求項17】
前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる、請求項１６記載の使用。
【請求項18】
前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リシン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる、請求項１６記載の使用。
【請求項19】
前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる、請求項１６記載の使用。
【請求項20】
前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、請求項１４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多発性硬化症の技術分野に関し、特に多発性硬化症の治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
多発性硬化症（ＭＳ）は、「複数の領域での瘢痕組織」を意味し、免疫系が中枢神経系（ＣＮＳ）の神経線維の周囲を取り囲んで保護する髄鞘を攻撃し、炎症を引き起こす自己免疫疾患である。髄鞘または神経線維がＭＳにより損傷または破壊されると、ＣＮＳの領域への損傷は、ＭＳ患者にタイプと重症度が異なるさまざまな神経症状を引き起こす可能性がある。ＭＳには、最初のエピソードからなる症候群（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＣＩＳ）、再発寛解型ＭＳ（ｒｅｌａｐｓｅ－ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ＭＳ、ＲＲＭＳ）、一次性進行型ＭＳ（ｐｒｉｍａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＭＳ、ＰＰＭＳ）、二次性進行型ＭＳ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＭＳ、ＳＰＭＳ）の４種類がある。一般的な症状には、筋力低下、しびれとうずき、レルミット徴候、膀胱の問題、腸の問題、倦怠感、めまいと回転性めまい、性機能障害、痙性と筋肉のけいれん、震え、視力の問題、歩きぶりと可動性の変化、感情的変化と憂鬱、学習と記憶の問題、ならびに痛みが含まれる。
【0003】
多発性硬化症の原因はまだ不明であるが、遺伝的感受性、免疫系の異常、および環境要因が組み合わさってこの病気を引き起こすと考えられている。
【0004】
従来の薬は、免疫系の働きを変えることによって進行を遅らせたり、症状が悪化するフレア中に症状を和らげたりするのに有効であるが、ＭＳの治療のための新しい薬物と方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、対象の多発性硬化症の治療のための医薬組成物および方法を提供することにある。
【0006】
特定の実施形態では、多発性硬化症を有する対象を治療する方法は、多発性硬化症を有する対象に有効量で医薬組成物を投与することを含み、前記医薬組成物は、金クラスター（ＡｕＣ）を含み、前記ＡｕＣが、金コアと、前記金コアに結合したリガンドとを含む。
【0007】
前記方法の特定の実施形態では、前記金コアの直径が３ｎｍ未満である。特定の実施形態では、前記金コアの直径が０．５～２．６ｎｍの範囲にある。
【0008】
前記方法の特定の実施形態では、前記リガンドは、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。
【0009】
前記方法の特定の実施形態では、前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。
【0010】
前記方法の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチドまたはシステイン含有テトラペプチドである。
【0011】
前記方法の特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。
【0012】
前記方法の特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リシン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。
【0013】
前記方法の特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。
【0014】
前記方法の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。
【0015】
本発明の特定の実施形態は、対象の多発性硬化症を治療するための医薬の製造における金クラスター（ＡｕＣ）の使用であって、前記ＡｕＣが、金コアと、前記金コアに結合したリガンドとを含む、使用である。
【0016】
前記使用の特定の実施形態では、前記金コアの直径が３ｎｍ未満である。特定の実施形態では、前記金コアの直径が０．５～２．６ｎｍの範囲にある。
【0017】
前記使用の特定の実施形態では、前記リガンドは、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。
【0018】
前記使用の特定の実施形態では、前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。
【0019】
前記使用の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチドまたはシステイン含有テトラペプチドである。
【0020】
前記使用の特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。
【0021】
前記使用の特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リシン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。
【0022】
前記使用の特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。
【0023】
前記使用の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン（Ｄ－３－ｔｒｏｌｏｖｏｌ）、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。
【0024】
本発明の目的および利点は、添付の図面に関連する好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
次に、本発明による好ましい実施形態を、同様の参照番号が同様の要素を示す図を参照して説明する。
【0026】
【図1】様々な粒子サイズを有するリガンドのＬ－ＮＩＢＣで修飾された金ナノ粒子（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓ）の紫外線可視（ＵＶ）スペクトル、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像および粒子サイズ分布図を示す。
【0027】
【図2】様々な粒子サイズを有するリガンドのＬ－ＮＩＢＣが結合した金クラスター（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）の紫外線可視（ＵＶ）スペクトル、ＴＥＭ画像および粒子サイズ分布図を示す。
【0028】
【図3】様々な粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの赤外線スペクトルを示す。
【0029】
【図4】リガンドのＣＲが結合した金クラスター（ＣＲ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0030】
【図5】リガンドのＲＣが結合した金クラスター（ＲＣ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0031】
【図6】リガンド１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン（即ち、Ｃａｐ）結合金クラスター（Ｃａｐ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0032】
【図7】リガンドのＧＳＨが結合した金クラスター（ＧＳＨ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0033】
【図8】リガンドのＤ－ＮＩＢＣが結合した金クラスター（Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0034】
【図9】リガンドのＬ－システインが結合した金クラスター（Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0035】
【図10】ＥＡＥの臨床的評点を示すグラフである。
【0036】
【図11】脊髄における（ａ）ＴＮＦ－α、（ｂ）ＩＬ－１７および（ｃ）ＩＦＮ－γのレベルを示し、ここで、１がナイーブ(ｎａｉｖｅ)群であり、２が食塩水治療群であり、３がプレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）治療群であり、４が５０ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群であり、５が２０ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群であり、および６が５ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群である。
【0037】
【図12】（ａ）は脊髄への免疫細胞の浸潤を示す脊髄のＨＥ染色の写真であり、（ｂ）は炎症の組織学的スケールを示す棒グラフであり、ここで、１がナイーブ群であり、２が食塩水治療群であり、３がプレドニゾン治療群であり、４が５０ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群であり、５が２０ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群であり、および６が５ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明は、以下の本発明の特定の実施形態に対する詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。
【0039】
本出願全体において、刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術の現状をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【0040】
金クラスター（ＡｕＣｓ）は、金原子と金ナノ粒子の間にある特殊な形態の金である。ＡｕＣｓは、サイズが３ｎｍ未満であり、数個から数百個の金原子で構成されているため、金ナノ粒子の面心立方積層構造が崩壊する。その結果、ＡｕＣｓは、金ナノ粒子の連続又は準連続エネルギー準位とは異なり、違うＨＯＭＯ－ＬＵＭＯギャップを持つ分子のような離散化した電子構造を示す。これにより、従来の金ナノ粒子が持つ表面プラズモン共鳴効果と、ｕｖ－ｖｉｓスペクトルでの対応するプラズモン共鳴吸収帯（５２０±２０ｎｍ）が消失する。
【0041】
本発明は、リガンド結合ＡｕＣを提供する。
【0042】
特定の実施形態では、前記リガンド結合ＡｕＣは、リガンドと、金コアとを含み、前記リガンドが前記金コアに結合している。特定の実施形態では、前記金コアの直径は、０．５～３ｎｍの範囲にある。特定の実施形態では、前記金コアの直径は、０．５～２．６ｎｍの範囲にある。
【0043】
特定の実施形態では、前記リガンド結合ＡｕＣの前記リガンドは、チオール含有化合物またはオリゴペプチドである。特定の実施形態では、前記リガンドは、Ａｕ－Ｓ結合を介して金コアに結合してリガンド結合ＡｕＣを形成する。
【0044】
特定の実施形態では、前記リガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、またはシステイン誘導体であるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、前記システイン誘導体は、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、またはＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）である。
【0045】
特定の実施形態では、前記リガンドは、システイン含有オリゴペプチドとその誘導体であるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドは、システイン含有ジペプチドである。特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、またはＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）である。特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドは、システイン含有トリペプチドである。特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、またはＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）である。特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドは、システイン含有テトラペプチドである。特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）またはグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）である。
【0046】
特定の実施形態では、前記リガンドは、チオール含有化合物である。特定の実施形態では、チオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、またはドデシルメルカプタンである。
【0047】
本発明は、対象の多発性硬化症の治療のための医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、前記対象は、人である。特定の実施形態では、前記対象は、犬のようなペット動物である。
【0048】
特定の実施形態では、前記医薬組成物は、上文で開示されたリガンド結合ＡｕＣと、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。特定の実施形態では、前記賦形剤は、リン酸緩衝液、または生理食塩水である。
【0049】
本発明は、対象の多発性硬化症の治療のための医薬の製造における上文で開示されたリガンド結合ＡｕＣｓの使用を提供する。
【0050】
本発明は、対象の多発性硬化症の治療のための上文で開示されたリガンド結合ＡｕＣｓの使用、または上文で開示されたリガンド結合ＡｕＣｓを使用して対象の多発性硬化症を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、前記治療方法は、前記対象に薬学的に有効な量のリガンド結合ＡｕＣｓを投与することを含む。前記薬学的に有効な量は、通常の体内研究によって確認することができる。
【0051】
以下の実施例は、単に本発明の原理を説明することを目的として提供されたものである。それらは、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【0052】
実施例
【0053】
１． リガンド結合ＡｕＣｓの製造
【0054】
１．１ ＨＡｕＣｌ４をメタノール、水、エタノール、ｎ－プロパノール、又は酢酸エチルに溶解して、ＨＡｕＣｌ４濃度０．０１～０．０３Ｍの溶液Ａが得られた。
【0055】
１．２ リガンドを溶媒に溶解して、リガンド濃度０．０１～０．１８Ｍの溶液Ｂが得られた。前記リガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、及び、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）等のその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体（Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システイン－Ｌ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等の、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない）；及び１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうちの一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。前記溶媒は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ－プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、酢酸ブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２－メチル－１－プロパノール及び酢酸プロピルのうちの一つ又は複数であった。
【0056】
１．３ ＨＡｕＣｌ４とリガンドとのモル比が１：（０．０１～１００）となるように、溶液Ａと溶液Ｂを混合して、氷浴において０．１～４８時間撹拌し、０．０２５～０．８Ｍ ＮａＢＨ４の水、エタノール又はメタノール溶液を加えて、氷水浴において引き続き撹拌し、０．１～１２時間反応させた。ＮａＢＨ４とリガンドとのモル比は、１：（０．０１～１００）であった。
【0057】
１．４ 反応終了した後、ＭＷＣＯが３Ｋ～３０Ｋの限外ろ過チューブを使用して、８０００～１７５００ｒ／分の勾配で反応溶液を１０～１００分間遠心することにより、異なる平均粒子サイズを有するリガンド結合ＡｕＣｓ沈殿を得た。異なるＭＷＣＯの限外ろ過チューブのろ過メンブレンの孔は、直接的に、前記メンブレンを通過できるリガンド結合ＡｕＣｓのサイズを決定した。当該ステップは、任意に省略されてもよい。
【0058】
１．５ ステップ（１．４）で得られた異なる平均粒子サイズを有するリガンド結合ＡｕＣｓ沈殿を水に溶解し、透析バッグに投入し、そして水において室温で１～７日間透析した。
【0059】
１．６ 透析後、リガンド結合ＡｕＣｓを１２～２４時間凍結乾燥して、粉末状又は凝集状物質であるリガンド結合ＡｕＣｓを得た。
【0060】
測定からわかるように、前記方法により得られた粉末状又は凝集状物質の粒子サイズは、３ｎｍ未満であった（全体的に、０．５～２．６ｎｍにわたって分布した）。５２０ｎｍで明らかな吸収ピークはなかった。得られた粉末又は凝集体がリガンド結合ＡｕＣｓであったことがわかった。
【0061】
２． 異なるリガンドが結合されたＡｕＣｓの調製及び同定
【0062】
２．１ Ｌ－ＮＩＢＣ結合ＡｕＣｓ、即ち、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの調製
【0063】
リガンドであるＬ－ＮＩＢＣを例とし、Ｌ－ＮＩＢＣが結合したＡｕＣｓの調製及び確認について以下で詳細に説明する。
【0064】
２．１．１ １．００ｇのＨＡｕＣｌ４を量り、１００ｍＬのメタノールに溶解して、０．０３Ｍの溶液Ａを得た。
【0065】
２．１．２ ０．５７ｇのＬ－ＮＩＢＣを量り、１００ｍＬの氷酢酸（酢酸）に溶解して、０．０３Ｍの溶液Ｂを得た。
【0066】
２．１．３ １ｍＬの溶液Ａを量り、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、又は５ｍＬの溶液Ｂとそれぞれ混合し（すなわち、ＨＡｕＣｌ４とＬ－ＮＩＢＣとのモル比が、それぞれ、１：０．５、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５であった。）、氷浴において撹拌しながら２時間反応させ、溶液が明るい黄色から無色になると、速やかに１ｍＬの新たに調製された０．０３Ｍ（１１．３ｍｇのＮａＢＨ４を量り、１０ｍＬのエタノールに溶解することにより調製された。）のＮａＢＨ４エタノール溶液を加えて、溶液が濃褐色になった後、引き続き３０分間反応し、そして１０ｍＬのアセトンを加えて反応を停止した。
【0067】
２．１．４ 反応後、反応溶液に対して勾配遠心を行い、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ粉末を得た。具体的な方法は以下のとおりである。即ち、反応完了後、反応溶液を３０ＫのＭＷＣＯ及び５０ｍＬの体積を有する限外ろ過チューブに転移し、１００００ｒ／分で２０分間を遠心し、そして内チューブ中の保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を超純水に溶解して、約２．６ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。その後、外チューブ中の混合液を５０ｍＬの体積及び１０ＫのＭＷＣＯを有する限外ろ過チューブに転移し、１３,０００ｒ／分で３０分間を遠心した。内チューブ中の保持液を超純水に溶解して、約１．８ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。その後、外チューブ中の混合液を５０ｍＬの体積及び３ＫのＭＷＣＯを有する限外ろ過チューブに転移し、１７,５００ｒ／分で４０分間を遠心した。内チューブ中の保持液を超純水に溶解して、約１．１ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。
【0068】
２．１．５ 勾配遠心により得られた３つの異なる粒子サイズでの粉末を沈殿させ、それぞれ溶媒を除去し、粗生成物をＮ２でブロー乾燥させ、５ｍＬの超純水に溶解し、透析バッグ（ＭＷＣＯが３ＫＤａ）に置き、透析バッグを２Ｌの超純水に置き、一日おきに水を交換し、７日間透析し、凍結乾燥し、そして将来の使用のために保持した。
【0069】
２．２ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの同定
【0070】
上記で得られた粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣ）に対して同定実験が行われた。同時に、リガンドであるＬ－ＮＩＢＣにより修飾した金ナノ粒子（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓ）は、対照として使用された。前記リガンドがＬ－ＮＩＢＣである金ナノ粒子の製造方法は、参考文献（Ｗ．Ｙａｎ、Ｌ．Ｘｕ、Ｃ．Ｘｕ、Ｗ．Ｍａ、Ｈ．Ｋｕａｎｇ、Ｌ．Ｗａｎｇ及びＮ．Ａ．Ｋｏｔｏｖ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１２、１３４、１５１１４；Ｘ．Ｙｕａｎ、Ｂ．Ｚｈａｎｇ、Ｚ．Ｌｕｏ、Ｑ．Ｙａｏ、Ｄ．Ｔ．Ｌｅｏｎｇ、Ｎ．Ｙａｎ及びＪ．Ｘｉｅ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１４、５３、４６２３）に参照する。
【0071】
２．２．１ 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるモルフォロジーの観察
【0072】
試験粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプル及びＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプル）を超純水に２ｍｇ／Ｌになるまで溶解してサンプルとし、そして懸滴法により試験サンプルを製造した。より具体的に、５μＬのサンプルを超薄型カーボンフィルムに滴下し、水滴がなくなるまで自然蒸発させ、そしてＪＥＭ－２１００Ｆ ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出形高分解能ＴＥＭによりサンプルのモルフォロジーを観察した。
【0073】
【0074】
図２中の画像で示されるように、各Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルは、均一な粒子サイズ及び良好な分散性を有し、かつ、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの平均直径（金コアの直径と指す）がそれぞれ１．１ｎｍ、１．８ｎｍ及び２．６ｎｍであり、図２のＣ、Ｆ及びＩ中の結果とよく一致した。これに対して、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプルは、より大きい粒子サイズを有した。これらの平均直径（金コアの直径と指す）がそれぞれ３．６ｎｍ、６．０ｎｍ、１０．１ｎｍ及び１８．２ｎｍであり、図１のＣ、Ｆ、Ｉ及びＬ中の結果とよく一致した。
【0075】
２．２．２ 紫外線（ＵＶ）－可視光（ｖｉｓ）吸収スペクトル
【0076】
試験粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプル及びＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプル）を超純水に濃度が１０ｍｇ・Ｌ－１になるまで溶解し、室温でＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルが測定された。走査範囲が１９０～１１００ｎｍであり、サンプルセルが光路長１ｃｍの標準石英キュベットであり、参照セルが超純水により充填された。
【0077】
異なるサイズを有する４つのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプルのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルは、図１のＡ、Ｄ、Ｇ及びＪに示され、粒子サイズの統計学的分布は、図１のＣ、Ｆ、Ｉ及びＬに示され、異なるサイズを有する３つのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルは、図２のＡ、Ｄ及びＧに示され、粒子サイズの統計学的分布は、図２のＣ、Ｆ及びＩに示される。
【0078】
図１で示されるように、表面プラズモン作用により、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓは、約５２０ｎｍで吸収ピークを有した。吸収ピークの位置は、粒子サイズに関連した。粒子サイズが３．６ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５１６ｎｍで現れ、粒子サイズが６．０ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５１７ｎｍで現れ、粒子サイズが１０．１ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５２０ｎｍで現れ、そして、粒子サイズが１８．２ｎｍである場合、吸収ピークが５２３ｎｍで現れた。４つのサンプルは、いずれも５６０ｎｍ以上で吸収ピークを有しなかった。
【0079】
図２で示されるように、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルのＵＶ吸収スペクトルでは、５２０ｎｍでの表面プラズモン作用による吸収ピークがなくなり、５６０ｎｍ以上で２つの明らかな吸収ピークが現れ、吸収ピークの位置がＡｕＣｓの粒子径によって僅かな相違があった。これは、ＡｕＣｓが面心立方構造の崩壊により分子のような特性を示し、その結果、ＡｕＣｓの状態密度の不連続性、エネルギー準位の分裂、プラズモン共鳴効果の消失、及び長波方向の新しい吸収ピークの現れを引き起こすためである。上記で得られた異なる粒子サイズの３つの粉末サンプルは、いずれもリガンド結合ＡｕＣｓであったと結論付けることができる。
【0080】
２．２．３ フーリエ変換赤外線分光法
【0081】
赤外線スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ製のＶＥＲＴＥＸ８０Ｖフーリエ変換赤外線分光計を利用して固体粉末高真空全反射モードで測定された。走査範囲は、４０００～４００ ｃｍ－１であり、走査回数が６４であった。Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルを例とし、試験サンプルは、３つの異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ乾燥粉末であり、対照サンプルは、純粋なＬ－ＮＩＢＣ粉末であった。結果は、図３に示した。
【0082】
図３は、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの赤外線スペクトルを示す。純粋なＬ－ＮＩＢＣ（下部の曲線）と比較すると、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓのＳＨ伸縮振動は、全て、２５００～２６００ｃｍ－１で完全に消失したが、Ｌ－ＮＩＢＣの他の特徴的なピークは、依然として残っていて、Ｌ－ＮＩＢＣ分子がＡｕ－Ｓ結合を介してＡｕＣｓの表面に成功に結合されたことが証明された。この図は、リガンド結合ＡｕＣｓの赤外スペクトルがそのサイズとは無関係であることも示した。
【0083】
溶液Ｂの溶媒、ＨＡｕＣｌ４とリガンドとの仕込み比、反応時間及び添加されたＮａＢＨ４の量をわずかに調整した以外、上記方法と同じように、その他のリガンドが結合したＡｕＣｓを製造した。例えば、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）又はＮ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）がリガンドとして使用された場合、溶媒として酢酸が選択され、ジペプチドＣＲ、ジペプチドＲＣ又は１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリンがリガンドとして使用された場合、溶媒として水が選択されることなど、その他のステップについても同じようにするため、更なる詳細はここで省略する。
【0084】
本発明は、前述の方法により、一連のリガンド結合ＡｕＣｓを製造した。リガンドと製造プロセスのパラメーターを表１に示す。
【0085】
表１.本発明において異なるリガンドが結合したＡｕＣｓの製造パラメーター
【0086】
表１に挙げられたサンプルは、前記方法により確認された。５つの異なるリガンド結合ＡｕＣｓの特性を図４（ＣＲ－ＡｕＣｓ）、図５（ＲＣ－ＡｕＣｓ）、図６（Ｃａｐ－ＡｕＣｓ）（Ｃａｐは１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリンである）、図７（ＧＳＨ－ＡｕＣｓ）、及び図８（Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）に示す。図４～図８は、ＵＶスペクトル（Ａ）、赤外線スペクトル（Ｂ）、ＴＥＭ画像（Ｃ）、及び粒子サイズ分布（Ｄ）を示す。
【0087】
その結果、表１から得られた異なるリガンドが結合したＡｕＣｓの直径は、いずれも、３ｎｍ未満であることがわかった。紫外線スペクトルは、５２０±２０ｎｍでのピークの消失、及び他の位置での吸収ピークの出現も示した。この吸収ピークの位置は、リガンド、粒子サイズ、及び構造によって異なった。特定の状況で、特殊な吸収ピークが形成されないが、主な原因は、粒子径や構造の異なるＡｕＣｓの混合物の形成、または、ある特殊なＡｕＣｓにより吸収ピークの位置が紫外線可視スペクトルの範囲外に移動されたことである。一方、フーリエ変換赤外スペクトルでは、リガンドのチオールの赤外吸収ピーク（図４～８のＢの点線の間）が消失したが、他の赤外特性ピークはいずれも保持されていることから、全てのリガンド分子がＡｕＣｓの表面に成功に固定されていて、本発明が表１に記載されるリガンドの結合したＡｕＣｓを取得することに成功したことを示した。
【0088】
３． 動物試験
【0089】
３．１ 材料および動物
【0090】
３．１．１ 試験サンプル
【0091】
金コアの直径が０．５～１．５ｎｍ（１．０±０．５ｎｍ）の範囲にあるＬ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓを試験サンプルとして使用し、製造方法は、上記の方法にわずかな変更を加えたものに従った。図９は、リガンドであるＬ－システインが結合した金クラスター（Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0092】
３．１．２ 陽性対照サンプル
【0093】
プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｙｕａｎｙｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．,Ｌｔｄ）。
【0094】
３．１．３ 投与製剤
【0095】
必要量のプレドニゾンを量り、適切な量の生理食塩水を加え、製剤を穏やかに撹拌して適切な混合を保証した。Ｌ-Ｃｙｓ-ＡｕＣｓを秤量し、適切な量の生理食塩水を加え、攪拌して懸濁液を完全に混合した。すべての化合物は、毎日作りたてであった。
【0096】
３．１．４ 実験用の動物
【0097】
７～９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウスを使用した。動物は、規則に従って飼育され、維持された。
【0098】
【0099】
３．１．６ 流れ
【0100】
０日目に、マウスを体重によってランダムに群分けし、次に、完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ、ＣＦＡ）中の２００μｇのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＯＧ）ペプチドを、部位あたり１００μｌで、左右の側面に皮下注射した。ＭＯＧ免疫の０時間後と４８時間後に腹腔内投与によって百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ、ＰＴＸ）を注射した。表２により、化合物を１日目から２８日目まで与えた。動物（ｎ＝１０）を、ＥＡＥの臨床的徴候について毎日採点した。実験の最後、脊髄をＨＥ染色（ｎ＝５）し、ＥＬＩＳＡキットによるＴＮＦ-α、ＩＬ-１７、ＩＦＮ-γの分析を行った。
【0101】
３．２ 結果
【0102】
動物は、ＥＡＥの臨床採点基準に従ってＥＡＥの臨床的徴候について毎日採点した（表３）。図１０に示すように、５０ｍｇ／ｋｇ（５０ｍｐＫ）、２０ｍｇ／ｋｇ（２０ｍｐＫ）および５ｍｇ／ｋｇ（５ｍｐＫ）のＬ-Ｃｙｓ-ＡｕＣｓは、１７日目からＥＡＥマウスの麻痺を予防した。プレドニゾンは陽性対照であり、１３日目からＥＡＥの臨床的徴候を有意に減少させた。
【0103】
【0104】
ＥＬＩＳＡキットによる脊髄のＴＮＦ-α、ＩＬ-１７およびＩＦＮ-γ分析。ＴＮＦ-α、ＩＬ-１７およびＩＦＮ-γは、炎症の指標である。５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇのＬ-Ｃｙｓ-ＡｕＣｓは、ＥＡＥマウスにおけるこれらの炎症性因子の産生を有意に減少させた（図１１）。
【0105】
脊髄のＨＥ染色は、脊髄への免疫細胞の浸潤を研究するために使用された。ＥＡＥの誘導中、単核炎症細胞が脊髄に浸潤し、ＥＡＥマウスの麻痺に寄与し、ＨＥ染色により、ＥＡＥマウスの炎症細胞の有意な増加を示し、５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇのＬ-Ｃｙｓ-ＡｕＣｓは免疫細胞浸潤を減少させ（図１２（ａ））、炎症の組織学的スケールを有意に低減した（図１２（ｂ））。
【0106】
その他のサイズのＬ-Ｃｙｓ-ＡｕＣｓおよび異なるサイズの他のリガンド結合ＡｕＣｓも、ＥＡＥの抑制に効果があり、その効果はある程度異なる。ここでは詳しく説明しない。
【0107】
【産業上の利用可能性】
【0108】
リガンド結合ＡｕＣｓは、多発性硬化症の治療に使用できる。それらは、産業上の利用に適する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【手続補正書】
【提出日】2022-08-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多発性硬化症を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、金クラスター（ＡｕＣ）を含み、前記ＡｕＣが、金コアと、
前記金コアに結合したリガンドと、
を含む、医薬組成物。
【請求項2】
前記金コアの直径が３ｎｍ未満である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記金コアの直径が０．５～２．６ｎｍの範囲にある、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記リガンドは、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして、前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチドまたはシステイン含有テトラペプチドである、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リシン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、請求項４記載の医薬組成物。【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多発性硬化症の技術分野に関し、特に多発性硬化症の治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
多発性硬化症（ＭＳ）は、「複数の領域での瘢痕組織」を意味し、免疫系が中枢神経系（ＣＮＳ）の神経線維の周囲を取り囲んで保護する髄鞘を攻撃し、炎症を引き起こす自己免疫疾患である。髄鞘または神経線維がＭＳにより損傷または破壊されると、ＣＮＳの領域への損傷は、ＭＳ患者にタイプと重症度が異なるさまざまな神経症状を引き起こす可能性がある。ＭＳには、最初のエピソードからなる症候群（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＣＩＳ）、再発寛解型ＭＳ（ｒｅｌａｐｓｅ－ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ＭＳ、ＲＲＭＳ）、一次性進行型ＭＳ（ｐｒｉｍａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＭＳ、ＰＰＭＳ）、二次性進行型ＭＳ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＭＳ、ＳＰＭＳ）の４種類がある。一般的な症状には、筋力低下、しびれとうずき、レルミット徴候、膀胱の問題、腸の問題、倦怠感、めまいと回転性めまい、性機能障害、痙性と筋肉のけいれん、震え、視力の問題、歩きぶりと可動性の変化、感情的変化と憂鬱、学習と記憶の問題、ならびに痛みが含まれる。
【0003】
多発性硬化症の原因はまだ不明であるが、遺伝的感受性、免疫系の異常、および環境要因が組み合わさってこの病気を引き起こすと考えられている。
【0004】
従来の薬は、免疫系の働きを変えることによって進行を遅らせたり、症状が悪化するフレア中に症状を和らげたりするのに有効であるが、ＭＳの治療のための新しい薬物と方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、対象の多発性硬化症の治療のための医薬組成物を提供することにある。
【0006】
本発明の特定の実施形態は、多発性硬化症を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、金クラスター（ＡｕＣ）を含み、前記ＡｕＣが、金コアと、前記金コアに結合したリガンドとを含む、医薬組成物である。
【0007】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記金コアの直径が３ｎｍ未満である。特定の実施形態では、前記金コアの直径が０．５～２．６ｎｍの範囲にある。
【0008】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記リガンドは、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。
【0009】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。
【0010】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチドまたはシステイン含有テトラペプチドである。
【0011】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。
【0012】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リシン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。
【0013】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。
【0014】
前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン（Ｄ－３－ｔｒｏｌｏｖｏｌ）、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、およびドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。
【0015】
本発明の目的および利点は、添付の図面に関連する好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
次に、本発明による好ましい実施形態を、同様の参照番号が同様の要素を示す図を参照して説明する。
【0017】
【図1】様々な粒子サイズを有するリガンドのＬ－ＮＩＢＣで修飾された金ナノ粒子（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓ）の紫外線可視（ＵＶ）スペクトル、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像および粒子サイズ分布図を示す。
【0018】
【図2】様々な粒子サイズを有するリガンドのＬ－ＮＩＢＣが結合した金クラスター（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）の紫外線可視（ＵＶ）スペクトル、ＴＥＭ画像および粒子サイズ分布図を示す。
【0019】
【図3】様々な粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの赤外線スペクトルを示す。
【0020】
【図4】リガンドのＣＲが結合した金クラスター（ＣＲ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0021】
【図5】リガンドのＲＣが結合した金クラスター（ＲＣ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0022】
【図6】リガンド１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン（即ち、Ｃａｐ）結合金クラスター（Ｃａｐ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0023】
【図7】リガンドのＧＳＨが結合した金クラスター（ＧＳＨ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0024】
【図8】リガンドのＤ－ＮＩＢＣが結合した金クラスター（Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0025】
【図9】リガンドのＬ－システインが結合した金クラスター（Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0026】
【図10】ＥＡＥの臨床的評点を示すグラフである。
【0027】
【図11】脊髄における（ａ）ＴＮＦ－α、（ｂ）ＩＬ－１７および（ｃ）ＩＦＮ－γのレベルを示し、ここで、１がナイーブ(ｎａiｖｅ)群であり、２が食塩水治療群であり、３がプレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）治療群であり、４が５０ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群であり、５が２０ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群であり、および６が５ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群である。
【0028】
【図12】（ａ）は脊髄への免疫細胞の浸潤を示す脊髄のＨＥ染色の写真であり、（ｂ）は炎症の組織学的スケールを示す棒グラフであり、ここで、１がナイーブ群であり、２が食塩水治療群であり、３がプレドニゾン治療群であり、４が５０ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群であり、５が２０ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群であり、および６が５ｍｇ/ｋｇ Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ治療群である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明は、以下の本発明の特定の実施形態に対する詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。
【0030】
本出願全体において、刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術の現状をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【0031】
金クラスター（ＡｕＣｓ）は、金原子と金ナノ粒子の間にある特殊な形態の金である。ＡｕＣｓは、サイズが３ｎｍ未満であり、数個から数百個の金原子で構成されているため、金ナノ粒子の面心立方積層構造が崩壊する。その結果、ＡｕＣｓは、金ナノ粒子の連続又は準連続エネルギー準位とは異なり、違うＨＯＭＯ－ＬＵＭＯギャップを持つ分子のような離散化した電子構造を示す。これにより、従来の金ナノ粒子が持つ表面プラズモン共鳴効果と、ｕｖ－ｖｉｓスペクトルでの対応するプラズモン共鳴吸収帯（５２０±２０ｎｍ）が消失する。
【0032】
本発明は、リガンド結合ＡｕＣを提供する。
【0033】
特定の実施形態では、前記リガンド結合ＡｕＣは、リガンドと、金コアとを含み、前記リガンドが前記金コアに結合している。特定の実施形態では、前記金コアの直径は、０．５～３ｎｍの範囲にある。特定の実施形態では、前記金コアの直径は、０．５～２．６ｎｍの範囲にある。
【0034】
特定の実施形態では、前記リガンド結合ＡｕＣの前記リガンドは、チオール含有化合物またはオリゴペプチドである。特定の実施形態では、前記リガンドは、Ａｕ－Ｓ結合を介して金コアに結合してリガンド結合ＡｕＣを形成する。
【0035】
特定の実施形態では、前記リガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、またはシステイン誘導体であるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、前記システイン誘導体は、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、またはＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）である。
【0036】
特定の実施形態では、前記リガンドは、システイン含有オリゴペプチドとその誘導体であるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドは、システイン含有ジペプチドである。特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドは、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、またはＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）である。特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドは、システイン含有トリペプチドである。特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、またはＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）である。特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドは、システイン含有テトラペプチドである。特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）またはグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）である。
【0037】
特定の実施形態では、前記リガンドは、チオール含有化合物である。特定の実施形態では、チオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、またはドデシルメルカプタンである。
【0038】
本発明は、対象の多発性硬化症の治療のための医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、前記対象は、人である。特定の実施形態では、前記対象は、犬のようなペット動物である。
【0039】
特定の実施形態では、前記医薬組成物は、上文で開示されたリガンド結合ＡｕＣと、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。特定の実施形態では、前記賦形剤は、リン酸緩衝液、または生理食塩水である。
【0040】
本発明は、対象の多発性硬化症の治療のための医薬の製造における上文で開示されたリガンド結合ＡｕＣｓの使用を提供する。
【0041】
本発明は、対象の多発性硬化症の治療のための上文で開示されたリガンド結合ＡｕＣｓの使用、または上文で開示されたリガンド結合ＡｕＣｓを使用して対象の多発性硬化症を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、前記治療方法は、前記対象に薬学的に有効な量のリガンド結合ＡｕＣｓを投与することを含む。前記薬学的に有効な量は、通常の体内研究によって確認することができる。
【0042】
以下の実施例は、単に本発明の原理を説明することを目的として提供されたものである。それらは、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【0043】
実施例
【0044】
１． リガンド結合ＡｕＣｓの製造
【0045】
１．１ ＨＡｕＣｌ４をメタノール、水、エタノール、ｎ－プロパノール、又は酢酸エチルに溶解して、ＨＡｕＣｌ４濃度０．０１～０．０３Ｍの溶液Ａが得られた。
【0046】
１．２ リガンドを溶媒に溶解して、リガンド濃度０．０１～０．１８Ｍの溶液Ｂが得られた。前記リガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、及び、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）等のその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体（Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システイン－Ｌ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等の、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない）；及び１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうちの一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。前記溶媒は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ－プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、酢酸ブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２－メチル－１－プロパノール及び酢酸プロピルのうちの一つ又は複数であった。
【0047】
１．３ ＨＡｕＣｌ４とリガンドとのモル比が１：（０．０１～１００）となるように、溶液Ａと溶液Ｂを混合して、氷浴において０．１～４８時間撹拌し、０．０２５～０．８Ｍ ＮａＢＨ４の水、エタノール又はメタノール溶液を加えて、氷水浴において引き続き撹拌し、０．１～１２時間反応させた。ＮａＢＨ４とリガンドとのモル比は、１：（０．０１～１００）であった。
【0048】
１．４ 反応終了した後、ＭＷＣＯが３Ｋ～３０Ｋの限外ろ過チューブを使用して、８０００～１７５００ｒ／分の勾配で反応溶液を１０～１００分間遠心することにより、異なる平均粒子サイズを有するリガンド結合ＡｕＣｓ沈殿を得た。異なるＭＷＣＯの限外ろ過チューブのろ過メンブレンの孔は、直接的に、前記メンブレンを通過できるリガンド結合ＡｕＣｓのサイズを決定した。当該ステップは、任意に省略されてもよい。
【0049】
１．５ ステップ（１．４）で得られた異なる平均粒子サイズを有するリガンド結合ＡｕＣｓ沈殿を水に溶解し、透析バッグに投入し、そして水において室温で１～７日間透析した。
【0050】
１．６ 透析後、リガンド結合ＡｕＣｓを１２～２４時間凍結乾燥して、粉末状又は凝集状物質であるリガンド結合ＡｕＣｓを得た。
【0051】
測定からわかるように、前記方法により得られた粉末状又は凝集状物質の粒子サイズは、３ｎｍ未満であった（全体的に、０．５～２．６ｎｍにわたって分布した）。５２０ｎｍで明らかな吸収ピークはなかった。得られた粉末又は凝集体がリガンド結合ＡｕＣｓであったことがわかった。
【0052】
２． 異なるリガンドが結合されたＡｕＣｓの調製及び同定
【0053】
２．１ Ｌ－ＮＩＢＣ結合ＡｕＣｓ、即ち、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの調製
【0054】
リガンドであるＬ－ＮＩＢＣを例とし、Ｌ－ＮＩＢＣが結合したＡｕＣｓの調製及び確認について以下で詳細に説明する。
【0055】
２．１．１ １．００ｇのＨＡｕＣｌ４を量り、１００ｍＬのメタノールに溶解して、０．０３Ｍの溶液Ａを得た。
【0056】
２．１．２ ０．５７ｇのＬ－ＮＩＢＣを量り、１００ｍＬの氷酢酸（酢酸）に溶解して、０．０３Ｍの溶液Ｂを得た。
【0057】
２．１．３ １ｍＬの溶液Ａを量り、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、又は５ｍＬの溶液Ｂとそれぞれ混合し（すなわち、ＨＡｕＣｌ４とＬ－ＮＩＢＣとのモル比が、それぞれ、１：０．５、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５であった。）、氷浴において撹拌しながら２時間反応させ、溶液が明るい黄色から無色になると、速やかに１ｍＬの新たに調製された０．０３Ｍ（１１．３ｍｇのＮａＢＨ４を量り、１０ｍＬのエタノールに溶解することにより調製された。）のＮａＢＨ４エタノール溶液を加えて、溶液が濃褐色になった後、引き続き３０分間反応し、そして１０ｍＬのアセトンを加えて反応を停止した。
【0058】
２．１．４ 反応後、反応溶液に対して勾配遠心を行い、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ粉末を得た。具体的な方法は以下のとおりである。即ち、反応完了後、反応溶液を３０ＫのＭＷＣＯ及び５０ｍＬの体積を有する限外ろ過チューブに転移し、１００００ｒ／分で２０分間を遠心し、そして内チューブ中の保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を超純水に溶解して、約２．６ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。その後、外チューブ中の混合液を５０ｍＬの体積及び１０ＫのＭＷＣＯを有する限外ろ過チューブに転移し、１３,０００ｒ／分で３０分間を遠心した。内チューブ中の保持液を超純水に溶解して、約１．８ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。その後、外チューブ中の混合液を５０ｍＬの体積及び３ＫのＭＷＣＯを有する限外ろ過チューブに転移し、１７,５００ｒ／分で４０分間を遠心した。内チューブ中の保持液を超純水に溶解して、約１．１ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。
【0059】
２．１．５ 勾配遠心により得られた３つの異なる粒子サイズでの粉末を沈殿させ、それぞれ溶媒を除去し、粗生成物をＮ２でブロー乾燥させ、５ｍＬの超純水に溶解し、透析バッグ（ＭＷＣＯが３ＫＤａ）に置き、透析バッグを２Ｌの超純水に置き、一日おきに水を交換し、７日間透析し、凍結乾燥し、そして将来の使用のために保持した。
【0060】
２．２ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの同定
【0061】
上記で得られた粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣ）に対して同定実験が行われた。同時に、リガンドであるＬ－ＮＩＢＣにより修飾した金ナノ粒子（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓ）は、対照として使用された。前記リガンドがＬ－ＮＩＢＣである金ナノ粒子の製造方法は、参考文献（Ｗ．Ｙａｎ、Ｌ．Ｘｕ、Ｃ．Ｘｕ、Ｗ．Ｍａ、Ｈ．Ｋｕａｎｇ、Ｌ．Ｗａｎｇ及びＮ．Ａ．Ｋｏｔｏｖ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１２、１３４、１５１１４；Ｘ．Ｙｕａｎ、Ｂ．Ｚｈａｎｇ、Ｚ．Ｌｕｏ、Ｑ．Ｙａｏ、Ｄ．Ｔ．Ｌｅｏｎｇ、Ｎ．Ｙａｎ及びＪ．Ｘｉｅ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１４、５３、４６２３）に参照する。
【0062】
２．２．１ 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるモルフォロジーの観察
【0063】
試験粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプル及びＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプル）を超純水に２ｍｇ／Ｌになるまで溶解してサンプルとし、そして懸滴法により試験サンプルを製造した。より具体的に、５μＬのサンプルを超薄型カーボンフィルムに滴下し、水滴がなくなるまで自然蒸発させ、そしてＪＥＭ－２１００Ｆ ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出形高分解能ＴＥＭによりサンプルのモルフォロジーを観察した。
【0064】
【0065】
図２中の画像で示されるように、各Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルは、均一な粒子サイズ及び良好な分散性を有し、かつ、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの平均直径（金コアの直径と指す）がそれぞれ１．１ｎｍ、１．８ｎｍ及び２．６ｎｍであり、図２のＣ、Ｆ及びＩ中の結果とよく一致した。これに対して、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプルは、より大きい粒子サイズを有した。これらの平均直径（金コアの直径と指す）がそれぞれ３．６ｎｍ、６．０ｎｍ、１０．１ｎｍ及び１８．２ｎｍであり、図１のＣ、Ｆ、Ｉ及びＬ中の結果とよく一致した。
【0066】
２．２．２ 紫外線（ＵＶ）－可視光（ｖｉｓ）吸収スペクトル
【0067】
試験粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプル及びＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプル）を超純水に濃度が１０ｍｇ・Ｌ－１になるまで溶解し、室温でＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルが測定された。走査範囲が１９０～１１００ｎｍであり、サンプルセルが光路長１ｃｍの標準石英キュベットであり、参照セルが超純水により充填された。
【0068】
異なるサイズを有する４つのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプルのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルは、図１のＡ、Ｄ、Ｇ及びＪに示され、粒子サイズの統計学的分布は、図１のＣ、Ｆ、Ｉ及びＬに示され、異なるサイズを有する３つのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルは、図２のＡ、Ｄ及びＧに示され、粒子サイズの統計学的分布は、図２のＣ、Ｆ及びＩに示される。
【0069】
図１で示されるように、表面プラズモン作用により、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓは、約５２０ｎｍで吸収ピークを有した。吸収ピークの位置は、粒子サイズに関連した。粒子サイズが３．６ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５１６ｎｍで現れ、粒子サイズが６．０ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５１７ｎｍで現れ、粒子サイズが１０．１ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５２０ｎｍで現れ、そして、粒子サイズが１８．２ｎｍである場合、吸収ピークが５２３ｎｍで現れた。４つのサンプルは、いずれも５６０ｎｍ以上で吸収ピークを有しなかった。
【0070】
図２で示されるように、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルのＵＶ吸収スペクトルでは、５２０ｎｍでの表面プラズモン作用による吸収ピークがなくなり、５６０ｎｍ以上で２つの明らかな吸収ピークが現れ、吸収ピークの位置がＡｕＣｓの粒子径によって僅かな相違があった。これは、ＡｕＣｓが面心立方構造の崩壊により分子のような特性を示し、その結果、ＡｕＣｓの状態密度の不連続性、エネルギー準位の分裂、プラズモン共鳴効果の消失、及び長波方向の新しい吸収ピークの現れを引き起こすためである。上記で得られた異なる粒子サイズの３つの粉末サンプルは、いずれもリガンド結合ＡｕＣｓであったと結論付けることができる。
【0071】
２．２．３ フーリエ変換赤外線分光法
【0072】
赤外線スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ製のＶＥＲＴＥＸ８０Ｖフーリエ変換赤外線分光計を利用して固体粉末高真空全反射モードで測定された。走査範囲は、４０００～４００ ｃｍ－１であり、走査回数が６４であった。Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルを例とし、試験サンプルは、３つの異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ乾燥粉末であり、対照サンプルは、純粋なＬ－ＮＩＢＣ粉末であった。結果は、図３に示した。
【0073】
図３は、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの赤外線スペクトルを示す。純粋なＬ－ＮＩＢＣ（下部の曲線）と比較すると、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓのＳＨ伸縮振動は、全て、２５００～２６００ｃｍ－１で完全に消失したが、Ｌ－ＮＩＢＣの他の特徴的なピークは、依然として残っていて、Ｌ－ＮＩＢＣ分子がＡｕ－Ｓ結合を介してＡｕＣｓの表面に成功に結合されたことが証明された。この図は、リガンド結合ＡｕＣｓの赤外スペクトルがそのサイズとは無関係であることも示した。
【0074】
溶液Ｂの溶媒、ＨＡｕＣｌ４とリガンドとの仕込み比、反応時間及び添加されたＮａＢＨ４の量をわずかに調整した以外、上記方法と同じように、その他のリガンドが結合したＡｕＣｓを製造した。例えば、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）又はＮ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）がリガンドとして使用された場合、溶媒として酢酸が選択され、ジペプチドＣＲ、ジペプチドＲＣ又は１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリンがリガンドとして使用された場合、溶媒として水が選択されることなど、その他のステップについても同じようにするため、更なる詳細はここで省略する。
【0075】
本発明は、前述の方法により、一連のリガンド結合ＡｕＣｓを製造した。リガンドと製造プロセスのパラメーターを表１に示す。
【0076】
表１.本発明において異なるリガンドが結合したＡｕＣｓの製造パラメーター
【0077】
表１に挙げられたサンプルは、前記方法により確認された。５つの異なるリガンド結合ＡｕＣｓの特性を図４（ＣＲ－ＡｕＣｓ）、図５（ＲＣ－ＡｕＣｓ）、図６（Ｃａｐ－ＡｕＣｓ）（Ｃａｐは１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリンである）、図７（ＧＳＨ－ＡｕＣｓ）、及び図８（Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）に示す。図４～図８は、ＵＶスペクトル（Ａ）、赤外線スペクトル（Ｂ）、ＴＥＭ画像（Ｃ）、及び粒子サイズ分布（Ｄ）を示す。
【0078】
その結果、表１から得られた異なるリガンドが結合したＡｕＣｓの直径は、いずれも、３ｎｍ未満であることがわかった。紫外線スペクトルは、５２０±２０ｎｍでのピークの消失、及び他の位置での吸収ピークの出現も示した。この吸収ピークの位置は、リガンド、粒子サイズ、及び構造によって異なった。特定の状況で、特殊な吸収ピークが形成されないが、主な原因は、粒子径や構造の異なるＡｕＣｓの混合物の形成、または、ある特殊なＡｕＣｓにより吸収ピークの位置が紫外線可視スペクトルの範囲外に移動されたことである。一方、フーリエ変換赤外スペクトルでは、リガンドのチオールの赤外吸収ピーク（図４～８のＢの点線の間）が消失したが、他の赤外特性ピークはいずれも保持されていることから、全てのリガンド分子がＡｕＣｓの表面に成功に固定されていて、本発明が表１に記載されるリガンドの結合したＡｕＣｓを取得することに成功したことを示した。
【0079】
３． 動物試験
【0080】
３．１ 材料および動物
【0081】
３．１．１ 試験サンプル
【0082】
金コアの直径が０．５～１．５ｎｍ（１．０±０．５ｎｍ）の範囲にあるＬ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓを試験サンプルとして使用し、製造方法は、上記の方法にわずかな変更を加えたものに従った。図９は、リガンドであるＬ－システインが結合した金クラスター（Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ）のＵＶスペクトル、赤外線スペクトル、ＴＥＭ画像、および粒子サイズ分布図を示す。
【0083】
３．１．２ 陽性対照サンプル
【0084】
プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｙｕａｎｙｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．,Ｌｔｄ）。
【0085】
３．１．３ 投与製剤
【0086】
必要量のプレドニゾンを量り、適切な量の生理食塩水を加え、製剤を穏やかに撹拌して適切な混合を保証した。Ｌ-Ｃｙｓ-ＡｕＣｓを秤量し、適切な量の生理食塩水を加え、攪拌して懸濁液を完全に混合した。すべての化合物は、毎日作りたてであった。
【0087】
３．１．４ 実験用の動物
【0088】
７～９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウスを使用した。動物は、規則に従って飼育され、維持された。
【0089】
【0090】
３．１．６ 流れ
【0091】
０日目に、マウスを体重によってランダムに群分けし、次に、完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ、ＣＦＡ）中の２００μｇのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＯＧ）ペプチドを、部位あたり１００μｌで、左右の側面に皮下注射した。ＭＯＧ免疫の０時間後と４８時間後に腹腔内投与によって百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ、ＰＴＸ）を注射した。表２により、化合物を１日目から２８日目まで与えた。動物（ｎ＝１０）を、ＥＡＥの臨床的徴候について毎日採点した。実験の最後、脊髄をＨＥ染色（ｎ＝５）し、ＥＬＩＳＡキットによるＴＮＦ-α、ＩＬ-１７、ＩＦＮ-γの分析を行った。
【0092】
３．２ 結果
【0093】
動物は、ＥＡＥの臨床採点基準に従ってＥＡＥの臨床的徴候について毎日採点した（表３）。図１０に示すように、５０ｍｇ／ｋｇ（５０ｍｐＫ）、２０ｍｇ／ｋｇ（２０ｍｐＫ）および５ｍｇ／ｋｇ（５ｍｐＫ）のＬ-Ｃｙｓ-ＡｕＣｓは、１７日目からＥＡＥマウスの麻痺を予防した。プレドニゾンは陽性対照であり、１３日目からＥＡＥの臨床的徴候を有意に減少させた。
【0094】
【0095】
ＥＬＩＳＡキットによる脊髄のＴＮＦ-α、ＩＬ-１７およびＩＦＮ-γ分析。ＴＮＦ-α、ＩＬ-１７およびＩＦＮ-γは、炎症の指標である。５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇのＬ-Ｃｙｓ-ＡｕＣｓは、ＥＡＥマウスにおけるこれらの炎症性因子の産生を有意に減少させた（図１１）。
【0096】
脊髄のＨＥ染色は、脊髄への免疫細胞の浸潤を研究するために使用された。ＥＡＥの誘導中、単核炎症細胞が脊髄に浸潤し、ＥＡＥマウスの麻痺に寄与し、ＨＥ染色により、ＥＡＥマウスの炎症細胞の有意な増加を示し、５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇのＬ-Ｃｙｓ-ＡｕＣｓは免疫細胞浸潤を減少させ（図１２（ａ））、炎症の組織学的スケールを有意に低減した（図１２（ｂ））。
【0097】
その他のサイズのＬ-Ｃｙｓ-ＡｕＣｓおよび異なるサイズの他のリガンド結合ＡｕＣｓも、ＥＡＥの抑制に効果があり、その効果はある程度異なる。ここでは詳しく説明しない。
【0098】
【産業上の利用可能性】
【0099】
リガンド結合ＡｕＣｓは、多発性硬化症の治療に使用できる。それらは、産業上の利用に適する。
【国際調査報告】