特表 2023-508616 治療部位での免疫系応答性を刺激し維持するためのナノ粒子システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-02

(54)【発明の名称】治療部位での免疫系応答性を刺激し維持するためのナノ粒子システム

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20230222BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230222BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20230222BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20230222BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230222BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230222BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230222BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20230222BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230222BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230222BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230222BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230222BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALN20230222BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7088

A61K48/00

A61K31/7105

A61P35/00

A61K47/26

A61K9/127

A61K9/14

A61K45/00

A61K47/32

A61K47/34

A61K47/28

A61K47/24

A61K39/395 N

C12N15/13 ZNA

C12N15/12

C12N15/54

C12N5/10

C12N15/63 Z

C07K16/28

C07K19/00

C12N5/0786

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022565737

(86)(22)【出願日】2020-12-31

(85)【翻訳文提出日】2022-08-26

(86)【国際出願番号】 US2020067729

(87)【国際公開番号】W WO2021138600

(87)【国際公開日】2021-07-08

(31)【優先権主張番号】62/956,033

(32)【優先日】2019-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522256406

【氏名又は名称】フレッド ハッチンソン キャンサー センター

(71)【出願人】

【識別番号】522261019

【氏名又は名称】タイダル・セラビューティクス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シュテファン，マティアス

(72)【発明者】

【氏名】ニールセン，ウルリク

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA19

4C076AA31

4C076AA95

4C076CC27

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE13

4C076EE24

4C076EE25

4C076EE26

4C076EE30

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA24

4C084MA41

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA14

4C085BB11

4C086AA01

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4C086EA16

4C086MA02

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4C086MA05

4C086MA24

4C086MA41

4C086MA56

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA06

4C086ZB26

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

単球／マクロファージをインビボで遺伝的に改変して、（１）追加の免疫細胞を治療部位に動員する；（２）治療部位で活性化されたままで他の免疫細胞に進行中の刺激シグナルを出す；及び（３）治療部位で目的の細胞上の抗原に結合し動員された免疫細胞にも結合してこれを活性化し結合した細胞を破壊する二重特異的免疫細胞結合分子を分泌するナノ粒子システム。システムは、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）の活性も阻害することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

専門食細胞に結合するターゲティングリガンド；並びに
第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを少なくとも有するタンパク質分子をコードする核酸
を含むナノ粒子であって、
第１の結合ドメインが、免疫細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的であり、
第２の結合ドメインが、がん細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的である、ナノ粒子。

【請求項2】

ターゲティングリガンドが、単球、マクロファージ、又は両方により発現される細胞表面タンパク質に結合する、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項3】

ターゲティングリガンドがジマンノースを含む、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項4】

核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項5】

ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項４に記載のナノ粒子。

【請求項6】

ｍＲＮＡが、合成ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）を含む、請求項５に記載のナノ粒子。

【請求項7】

第１の結合ドメインが、リンパ球の細胞表面タンパク質に特異的である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項8】

リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞からなる群から選択される、請求項７に記載のナノ粒子。

【請求項9】

第１の結合ドメインが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞からなる群から選択されるＴ細胞の細胞表面タンパク質に特異的である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項10】

第１の結合ドメインがＣＤ３に特異的である、請求項９に記載のナノ粒子。

【請求項11】

タンパク質分子が二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項12】

タンパク質分子が、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項１１に記載のナノ粒子。

【請求項13】

第２の結合ドメインが、がん細胞により発現される抗原に特異的である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項14】

１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項15】

腫瘍細胞増殖インヒビター又は腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項16】

核酸が、抗体、又は抗体の抗原結合断片をコードする、請求項１５に記載のナノ粒子。

【請求項17】

ナノ粒子が、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌインヒビター又はＴＧＦβインヒビターをコードする核酸を含む、請求項１５に記載のナノ粒子。

【請求項18】

ナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項19】

第１の複数のナノ粒子のそれぞれが、
専門食細胞に結合するターゲティングリガンド
を含む第１の複数のナノ粒子と；
免疫細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第１の結合ドメイン、及びがん細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを有するタンパク質分子をコードする核酸と
を含む組成物。

【請求項20】

ターゲティングリガンドが、単球、マクロファージ、又は両方により発現される細胞表面タンパク質に結合する、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

ターゲティングリガンドがジマンノースを含む、請求項１９に記載の組成物。

【請求項22】

核酸がＲＮＡを含む、請求項１９に記載の組成物。

【請求項23】

ＲＮＡがｍＲＮＡを含む、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

ｍＲＮＡが、合成ＲＮＡ又はＩＶＴ ＲＮＡを含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

第１の結合ドメインが、リンパ球の細胞表面タンパク質に特異的である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項26】

リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＴＩＬ細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

第１の結合ドメインが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞からなる群から選択されるＴ細胞の細胞表面タンパク質に特異的である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項28】

第１の結合ドメインがＣＤ３に特異的である、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

タンパク質分子が二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項１９に記載の組成物。

【請求項30】

タンパク質分子がＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項２９に記載の組成物。

【請求項31】

第２の結合ドメインが、がん細胞により発現される抗原に特異的である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項32】

薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。

【請求項33】

第１の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、及び（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１９～３２のいずれかに記載の組成物。

【請求項34】

第２の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、及び（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸のうちの１つ以上を含む、第２の複数のナノ粒子
をさらに含む、請求項１９～３２のいずれかに記載の組成物。

【請求項35】

腫瘍細胞増殖インヒビターをさらに含む、請求項１９～３４のいずれかに記載の組成物。

【請求項36】

第１又は第２の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸をさらに含む、請求項１９～３５のいずれかに記載の組成物。

【請求項37】

第１又は第２の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、腫瘍細胞増殖インヒビターの抗体の抗原結合断片をコードする核酸をさらに含む、請求項３４のいずれかに記載の組成物。

【請求項38】

第３の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、腫瘍細胞増殖インヒビターの抗体の抗原結合断片をコードする核酸を含む、第３の複数のナノ粒子をさらに含む、請求項１９又は３４～３６のいずれかに記載の組成物。

【請求項39】

腫瘍細胞増殖インヒビターが、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌインヒビター又はＴＧＦβインヒビターである、請求項３５～３８のいずれかに記載の組成物。

【請求項40】

第２の複数のナノ粒子の非存在下で、第１の複数のナノ粒子及び第３の複数のナノ粒子を含む、請求項３８に記載の組成物。

【請求項41】

第１、第２、及び／又は第３の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、請求項３８に記載の組成物。

【請求項42】

ヒト対象においてがんを治療するための組成物であって、
複数のナノ粒子のそれぞれが、
（ｉ）単球、マクロファージ、又は両方に結合するターゲティングリガンド；並びに
（ｉｉ）リンパ球により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第１の結合ドメイン、及びがん細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを少なくとも有するタンパク質分子をコードするｍＲＮＡ
を含む、第１の複数のナノ粒子
を含み、
第１の複数のナノ粒子が、ヒト対象において免疫応答を刺激又は増強し、それによってがんを治療する、組成物。

【請求項43】

ターゲティングリガンドがジマンノースを含む、請求項４２に記載の組成物。

【請求項44】

ｍＲＮＡが、合成ＲＮＡ又はＩＶＴ ＲＮＡを含む、請求項４２に記載の組成物。

【請求項45】

第１の結合ドメインがリンパ球の細胞表面タンパク質に特異的である、請求項４２に記載の組成物。

【請求項46】

リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びＴＩＬ細胞からなる群から選択される、請求項４２に記載の組成物。

【請求項47】

第１の結合ドメインが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞からなる群から選択されるＴ細胞の細胞表面タンパク質に特異的である、請求項４２に記載の組成物。

【請求項48】

第１の結合ドメインがＣＤ３に特異的である、請求項４７に記載の組成物。

【請求項49】

タンパク質分子が二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項４２に記載の組成物。

【請求項50】

タンパク質分子がＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項４９に記載の組成物。

【請求項51】

第２の結合ドメインが、がん細胞により発現される抗原に特異的である、請求項４２に記載の組成物。

【請求項52】

薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項４２に記載の組成物。

【請求項53】

第１の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするｍＲＮＡ、（ｂ）ＩＫＫβをコードするｍＲＮＡ、又は（ｃ）１つ以上のＩＲＦをコードするｍＲＮＡ及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡ、並びに（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードするｍＲＮＡのうちの１つ以上をさらに含む、請求項４２～５２のいずれかに記載の組成物。

【請求項54】

第２の複数のナノ粒子のそれぞれが、
単球、マクロファージ、又は両方に結合するターゲティングリガンド、並びに
（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするｍＲＮＡ、（ｂ）ＩＫＫβをコードするｍＲＮＡ、及び（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードするｍＲＮＡのうちの１つ以上を含む、第２の複数のナノ粒子
をさらに含む、請求項４２～５３のいずれかに記載の組成物。

【請求項55】

第２の複数のナノ粒子が、腫瘍細胞増殖インヒビターの抗体の抗原結合断片をコードするｍＲＮＡを含む、請求項５４に記載の組成物。

【請求項56】

瘍細胞増殖インヒビターが、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌインヒビター又はＴＧＦβインヒビターである、請求項５３～５５のいずれかに記載の組成物。

【請求項57】

第１及び／又は第２の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、請求項５４に記載の組成物。

【請求項58】

ヒト対象においてがんを治療するための方法であって、第１の複数のナノ粒子を含む組成物をヒト対象に投与することを含み、
第１の複数のナノ粒子のそれぞれが、
（ｉ）単球、マクロファージ、又は両方に結合するターゲティングリガンド；並びに
（ｉｉ）リンパ球により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第１の結合ドメイン、及びがん細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを少なくとも有するタンパク質分子をコードするｍＲＮＡ
を含み、
複数のナノ粒子が、ヒト対象において免疫応答を刺激又は増強し、それによってがんを治療する、方法。

【請求項59】

ターゲティングリガンドがジマンノースを含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

ｍＲＮＡが、合成ＲＮＡ又はＩＶＴ ＲＮＡを含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項61】

リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＴＩＬ細胞からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。

【請求項62】

第１の結合ドメインが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞からなる群から選択されるＴ細胞の細胞表面タンパク質に特異的である、請求項５８に記載の方法。

【請求項63】

第１の結合ドメインがＣＤ３に特異的である、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

タンパク質分子が二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項５８に記載の方法。

【請求項65】

タンパク質分子がＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

第２の結合ドメインが、がん細胞により発現される抗原に特異的である、請求項５８に記載の方法。

【請求項67】

組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項68】

第１の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸、及び（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸のうちの１つ以上をさらに含む、請求項５８～６７のいずれかに記載の方法。

【請求項69】

第２の複数のナノ粒子のそれぞれが、
単球、マクロファージ、又は両方に結合するターゲティングリガンド、並びに
（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするｍＲＮＡ、及び（ｂ）ＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを含む、第２の複数のナノ粒子を含む組成物をヒト対象に投与することをさらに含む、請求項５８～６８のいずれかに記載の方法。

【請求項70】

第１又は第２の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、腫瘍細胞増殖インヒビターをコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項６８又は６９に記載の方法。

【請求項71】

第３の複数のナノ粒子のそれぞれが、
単球、マクロファージ、又は両方に結合するターゲティングリガンド、及び
腫瘍細胞増殖インヒビターをコードするｍＲＮＡ
を含む、第３の複数のナノ粒子を含む組成物をヒト対象に投与することをさらに含む、請求項５８～７０のいずれかに記載の方法。

【請求項72】

腫瘍細胞増殖インヒビターをコードするｍＲＮＡが、腫瘍細胞増殖インヒビターの抗体の抗原結合断片をコードする、請求項７０又は７１に記載の方法。

【請求項73】

腫瘍細胞増殖インヒビターが、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌインヒビター又はＴＧＦβインヒビターである、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

第１、第２、及び／又は第３の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、請求項７１に記載の組成物。

【請求項75】

第１の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップ及び第２の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップが同時に又は逐次実施される、請求項５８又は６９に記載の方法。

【請求項76】

第１の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップが、第２の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップ後に実施される、請求項５８又は６９のいずれかに記載の方法。

【請求項77】

第３の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップが、第１の複数のナノ粒子を投与するステップと同時に又は逐次実施される、請求項７１に記載の方法。

【請求項78】

第３の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップが、第２の複数のナノ粒子を投与するステップと同時に又は逐次実施される、請求項７１に記載の方法。

【請求項79】

第２の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップなしで第１の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップ及び第３の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップを含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項80】

免疫細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第１の結合ドメイン及びがん細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを少なくとも有するタンパク質分子をコードする核酸が積載されたナノ粒子を含み、
ナノ粒子が食細胞の表面に付着しているか、又は食細胞により内在化されている、改変された専門食細胞。

【請求項81】

食細胞が単球又はマクロファージである、請求項８０に記載の改変された専門食細胞。

【請求項82】

食細胞が腫瘍関連マクロファージである、請求項８０に記載の改変された専門食細胞。

【請求項83】

核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、請求項８０に記載の改変された専門食細胞。

【請求項84】

ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項８３に記載の改変された専門食細胞。

【請求項85】

ｍＲＮＡが、合成ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）を含む、請求項８４に記載の改変された専門食細胞。

【請求項86】

第１の結合ドメインがリンパ球の細胞表面タンパク質に特異的である、請求項８０に記載の改変された専門食細胞。

【請求項87】

リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＴＩＬ細胞からなる群から選択される、請求項８６に記載の改変された専門食細胞。

【請求項88】

第１の結合ドメインが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞からなる群から選択されるＴ細胞の細胞表面タンパク質に特異的である、請求項８０に記載の改変された専門食細胞。

【請求項89】

第１の結合ドメインがＣＤ３に特異的である、請求項８０に記載の改変された専門食細胞。

【請求項90】

タンパク質分子が二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項８０に記載の改変された専門食細胞。

【請求項91】

タンパク質分子がＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、請求項８０～９０のいずれかに記載の改変された専門食細胞。

【請求項92】

ナノ粒子が、（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸、及び（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸のうちの１つ以上をさらに積載されている、請求項８０～９１のいずれかに記載の改変された専門食細胞。

【請求項93】

（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸、及び（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸のうちの１つ以上が積載されている第２のナノ粒子をさらに含み、
第２のナノ粒子が食細胞の表面に付着しているか、又は食細胞により内在化されている、請求項８０～９２のいずれかに記載の改変された専門食細胞。

【請求項94】

第１又は第２のナノ粒子が、腫瘍細胞増殖インヒビターの抗体又は抗体の抗原結合断片をコードする核酸が積載されている、請求項９２又は９３に記載の改変された専門食細胞。

【請求項95】

腫瘍細胞増殖インヒビターが、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌインヒビター又はＴＧＦβインヒビターである、請求項９４に記載の改変された専門食細胞。

【請求項96】

（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸、又は（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸のうちの１つ以上が積載された第２のナノ粒子のうちの少なくとも１つ、及び
腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸が積載された第３のナノ粒子、
をさらに含み、
第２及び第３のナノ粒子のそれぞれが、食細胞の表面に付着しているか、又は食細胞により内在化されている、請求項８０に記載の改変された専門食細胞。

【請求項97】

第１、第２、及び／又は第３のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、請求項９６に記載の改変された専門食細胞。

【請求項98】

正電荷ポリマーコア、及びポリマーコアの周囲の中性又は負電荷被覆を含み、正電荷ポリマーコアが、免疫細胞活性化エピトープに結合する少なくとも１つの結合ドメイン及び／又はがん抗原に結合する少なくとも１つの結合ドメインをコードするヌクレオチドをカプセル化している、ナノ粒子。

【請求項99】

ナノ粒子が１３０ｎｍ未満である、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項100】

正電荷ポリマーが、ポリ（β－アミノエステル）、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アミン－コ－エステル）、ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、又はポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項101】

正電荷ポリマーがポリ（β－アミノエステル）を含む、請求項１００に記載のナノ粒子。

【請求項102】

中性又は負電荷被覆が、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸、又はコレステリルヘミスクシナート／１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンを含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項103】

中性又は負電荷被覆がポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、請求項１０２に記載のナノ粒子。

【請求項104】

中性又は負電荷被覆が双性イオンポリマーを含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項105】

中性又は負電荷被覆がリポソームを含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項106】

リポソームが、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’、Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシル－アミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項１０５に記載のナノ粒子。

【請求項107】

ヌクレオチドがリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項108】

ＲＮＡが合成ＲＮＡを含む、請求項１０７に記載のナノ粒子。

【請求項109】

ＲＮＡがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、請求項１０７に記載のナノ粒子。

【請求項110】

ヌクレオチドが組み込み又は非組み込み二本鎖ＤＮＡを含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項111】

ヌクレオチドが、プラスミド、ミニサークルプラスミド、又は閉鎖末端線状ｃｅＤＮＡの形態である、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項112】

がん抗原が、卵巣がん細胞、黒色腫細胞、神経膠芽腫細胞、多発性骨髄腫細胞、黒色腫細胞、前立腺がん細胞、乳がん細胞、幹細胞がん細胞、中皮腫細胞、腎細胞癌細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、胆管細胞癌細胞、膀胱がん細胞、神経芽細胞腫細胞、結腸直腸がん細胞、又はメルケル細胞癌細胞により発現される、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項113】

がん抗原が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、カルボキシ－アンヒドラーゼ－ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ジシアロガングリオシド、ＥｐＣａｍ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＲＢＢ２、葉酸受容体（ＦＯＬＲ）、ＧＤ２、グリピカン－２、ＨＥＲ２、ルイスＹ、Ｌ１－ＣＡＭ、メソセリン、ＭＵＣ１６、ＰＤ－Ｌ１、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＲＯＲ１、ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５、ＳＶ４０ Ｔ、又はＷＴ－１を含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項114】

がん抗原に結合する結合ドメインが、抗体アデカトゥマブ、アネツマブ、ラブタンシン、アマツキシマブ、ＨＮ１、オレゴボマブ、オバレックス、アバゴモマブ、エドレコロマブ、ファルレツズマブ、フランボツマブ、ＴＡ９９、２０Ｄ７、セツキシマブ、ＦＭＣ６３、ＳＪ２５Ｃ１、ＨＤ３７、Ｒ１１、Ｒ１２、２Ａ２、Ｙ３１、４Ｄ５、３Ｇ１０、アテゾリズマブ、アベルマブ、若しくはデュルバルマブの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項115】

がん抗原に結合する結合ドメインがタンパク質分子である、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項116】

ナノ粒子内の異なるタンパク質分子が、異なるがん抗原に結合する結合ドメインを含む、請求項１１５に記載のナノ粒子。

【請求項117】

異なるがん抗原が同じがんタイプにより発現される、請求項１１６に記載のナノ粒子。

【請求項118】

がんタイプが卵巣がん、黒色腫、又は神経膠芽腫である、請求項１１７に記載のナノ粒子。

【請求項119】

異なるがん抗原が、
ＥｐＣａｍ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＭＵＣ１６、葉酸受容体（ＦＯＬＲ）、ルイスＹ、ＲＯＲ１、メソセリン、ＷＴ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、及びＣＤ５６から選択される少なくとも２つのがん抗原；
チロシン関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５）；ＧＤ２、ＰＤ－Ｌ１、及びＥＧＦＲから選択される少なくとも２つのがん抗原；又はＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）及びＩＬ１３Ｒａ２から選択される２つのがん抗原
を含む、請求項１１６に記載のナノ粒子。

【請求項120】

タンパク質分子の少なくとも１つの結合ドメインが、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープに結合する、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項121】

免疫細胞活性化エピトープがＴ細胞により発現される、請求項１２０に記載のナノ粒子。

【請求項122】

Ｔ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＢ７－Ｈ３を含む、請求項１２１に記載のナノ粒子。

【請求項123】

Ｔ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢを含む、請求項１２２に記載のナノ粒子。

【請求項124】

免疫細胞活性化エピトープに結合する結合ドメインがタンパク質分子を含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項125】

ナノ粒子内の異なるタンパク質分子が、異なる免疫細胞活性化エピトープに結合する結合ドメインを含む、請求項１２４に記載のナノ粒子。

【請求項126】

異なる免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ３及びＣＤ２８又はＣＤ３及び４－１ＢＢを含む、請求項１２５に記載のナノ粒子。

【請求項127】

少なくとも１つの結合ドメインが、抗体ＯＫＴ３、２０Ｇ６－Ｆ３、４Ｂ４－Ｄ７、４Ｅ７－Ｃ９、１８Ｆ５－Ｈ１０、ＴＧＮ１４１２、９Ｄ７、９．３、ＫＯＬＴ－２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、ＥＸ５．３Ｄ１０、ＯＫＴ８又はＳＫ１のＣＤＲを含む、請求項１２６に記載のナノ粒子。

【請求項128】

免疫細胞活性化エピトープがＮＫ細胞により発現される、請求項１２０に記載のナノ粒子。

【請求項129】

ＮＫ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、又はＤＮＡＭ－１を含む、請求項１２８に記載のナノ粒子。

【請求項130】

少なくとも１つの結合ドメインが、抗体５Ｃ６、１Ｄ１１、ｍＡｂ ３３、Ｐ４４－８、ＳＫ１、又は３Ｇ８のＣＤＲを含む、請求項１２９に記載のナノ粒子。

【請求項131】

結合ドメインが、タンパク質リンカーを通じて連結されている、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項132】

タンパク質リンカーがＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む、請求項１３１に記載のナノ粒子。

【請求項133】

タンパク質リンカーがプロリンリッチなリンカーを含む、請求項１３１に記載のナノ粒子。

【請求項134】

タンパク質分子が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１２４に記載のナノ粒子。

【請求項135】

タンパク質分子が、
ＣＥＡに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＥＧＦＲに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＥｐＣａｍに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＨＥＲ２に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＰＤ－Ｌ１に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＰＳＭＡに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；又は
［ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５］に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン
を含む、請求項１２４に記載のナノ粒子。

【請求項136】

タンパク質分子が、カツマキソマブ、ＭＴ１１０、エルツマキソマブ、ＭＤＸ－４４７、ＭＭ－１４１、ＡＭＧ２１１、ＲＯ６９５８６８８、ＲＯ６８９５８８２、ＴＦ２、ＢＡＹ２０１０１１２、ＡＭＧ７０１、ソリトマブ、又はブリナツモマブを含む、請求項１３５に記載のナノ粒子。

【請求項137】

正電荷ポリマーコアが、１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするヌクレオチドをさらにカプセル化している、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項138】

１つ以上のＩＲＦが機能的自己阻害ドメインを欠く、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項139】

１つ以上のＩＲＦが機能的核外移行シグナルを欠く、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項140】

１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合体から選択される、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項141】

１つ以上のＩＲＦが、配列番号１～１７に示される配列に対し９０％よりも大きい、９５％よりも大きい、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項142】

１つ以上のＩＲＦが、配列番号１～７に示される配列から選択されるＩＲＦ５を含む、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項143】

ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号１又は配列番号３に示される配列を含む、請求項１４２に記載のナノ粒子。

【請求項144】

ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ、及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２に示される配列を含む、請求項１４２に記載のナノ粒子。

【請求項145】

ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ、及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号４に示される配列を含む、請求項１４２に記載のナノ粒子。

【請求項146】

１つ以上のＩＲＦが、配列番号８又は１２に示される配列を含むＩＲＦ１を含む、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項147】

１つ以上のＩＲＦが、配列番号１１、１６、又は１７に示される配列を含むＩＲＦ８を含む、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項148】

ＩＲＦ８が、Ｋ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号１１に示される配列を含む、請求項１４７に記載のナノ粒子。

【請求項149】

１つ以上のＩＲＦが、構成的活性ドメインであるＮ末端ＩＲＦ７ ＤＮＡ結合ドメイン、及びＣ末端ＩＲＦ３核外移行シグナルを含むＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質を含む、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項150】

ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が、配列番号１５に示される配列を含む、請求項１４９に記載のナノ粒子。

【請求項151】

１つ以上のＩＲＦがＩＲＦ４を含む、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項152】

ナノ粒子の少なくともサブセットがＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含む、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項153】

ＩＫＫβが、配列番号１８～２２から選択される配列に示される配列に対し９０％よりも大きい、９５％よりも大きい、又は９８％よりも大きい同一性を有する配列から選択される、請求項１５２に記載のナノ粒子。

【請求項154】

ＩＫＫβが、配列番号１８～２２から選択される配列に示される配列を含む、請求項１５２に記載のナノ粒子。

【請求項155】

ヌクレオチドが配列番号２３～４４から選択される配列に示される配列を含む、請求項１５２に記載のナノ粒子。

【請求項156】

１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子内にカプセル化されている、請求項１５２に記載のナノ粒子。

【請求項157】

１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子コア内にカプセル化されている、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項158】

１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが異なるナノ粒子にカプセル化されている、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項159】

少なくとも１つ以上の結合ドメインをコードするヌクレオチドが、１つ以上のＩＲＦ及び／又はＩＫＫβをコードするヌクレオチドと同じナノ粒子内にカプセル化されている、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項160】

少なくとも１つ以上の結合ドメインをコードするヌクレオチドが、１つ以上のＩＲＦ及び／又はＩＫＫβをコードするヌクレオチドをカプセル化するナノ粒子とは異なるナノ粒子内にカプセル化されている、請求項１３７に記載のナノ粒子。

【請求項161】

形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）インヒビターをさらに含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項162】

ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβインヒビターをコードするヌクレオチドを含む、請求項１６１に記載のナノ粒子。

【請求項163】

ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβの活性を抑制する抗体のＣＤＲを含む、請求項１６１に記載のナノ粒子。

【請求項164】

ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβの活性を抑制する抗体を含む、請求項１６１に記載のナノ粒子。

【請求項165】

抗体が、トラベデルセン、ジシテルチド、メテリムマブ、フレソリムマブ、ＬＹ２３８２７７０、ＳＩＸ－１００、アボタミン、及び／又はＩＭＣ－ＴＲ１を含む、請求項１６３又は１６４に記載のナノ粒子。

【請求項166】

ナノ粒子が、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）をコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項167】

ナノ粒子が、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ－２、ＭＤＲ－１、ｐ２１、ｐ１６、ｂａｘ、ｂｃｌ－ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ－Ｉ ＶＥＧＦ、アンギオスタチン、オンコスタチン、エンドスタチン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα及び／又はＨＳＶ－ｔｋから選択される抗がん遺伝子を含むヌクレオチドをさらに含む、請求項９８に記載のナノ粒子。

【請求項168】

ナノ粒子の少なくともサブセットが、１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするヌクレオチドを含み、
ナノ粒子の少なくともサブセットが、少なくとも２つの結合ドメインを有するタンパク質分子をコードするヌクレオチドを含み、
１つの結合ドメインが、腫瘍部位でがん細胞により発現される抗原に結合し、
１つの結合ドメインが、免疫細胞活性化エピトープに結合する、
ナノ粒子を含むシステム。

【請求項169】

ナノ粒子が１３０ｎｍ未満である、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項170】

ナノ粒子が、正電荷コア及びコアの外部表面上に中性又は負電荷被覆を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項171】

正電荷コアが、正電荷脂質及び／又は正電荷ポリマーを含む、請求項１７０に記載のシステム。

【請求項172】

正電荷ポリマーが、ポリ（β－アミノエステル）、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アミン－コ－エステル）、ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、又はポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、請求項１７１に記載のシステム。

【請求項173】

正電荷ポリマーがポリ（β－アミノエステル）を含む、請求項１７２に記載のシステム。

【請求項174】

中性又は負電荷被覆が、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸、又はコレステリルヘミスクシナート／１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンを含む、請求項１７０に記載のシステム。

【請求項175】

中性又は負電荷被覆がポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、請求項１７４に記載のシステム。

【請求項176】

中性又は負電荷被覆が双性イオンポリマーを含む、請求項１７０に記載のシステム。

【請求項177】

中性又は負電荷被覆がリポソームを含む、請求項１７０に記載のシステム。

【請求項178】

リポソームが、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’、Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシル－アミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項１７７に記載のシステム。

【請求項179】

ヌクレオチドがリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項180】

ＲＮＡが合成ＲＮＡを含む、請求項１７９に記載のシステム。

【請求項181】

ＲＮＡがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、請求項１７９に記載のシステム。

【請求項182】

ヌクレオチドが組み込み又は非組み込み二本鎖ＤＮＡを含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項183】

ヌクレオチドが、プラスミド、ミニサークルプラスミド、又は閉鎖末端線状ｃｅＤＮＡの形態である、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項184】

ヌクレオチドが正電荷コア内にカプセル化されている、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項185】

１つ以上のＩＲＦが機能的自己阻害ドメインを欠く、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項186】

１つ以上のＩＲＦが機能的核外移行シグナルを欠く、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項187】

１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合体から選択される、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項188】

１つ以上のＩＲＦが、配列番号１～１７に示される配列に対し９０％よりも大きい、９５％よりも大きい、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項189】

１つ以上のＩＲＦが、配列番号１～７に示される配列から選択されるＩＲＦ５を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項190】

ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号１又は配列番号３に示される配列を含む、請求項１８９に記載のシステム。

【請求項191】

ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ、及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２に示される配列を含む、請求項１８９に記載のシステム。

【請求項192】

ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ、及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号４に示される配列を含む、請求項１８９に記載のシステム。

【請求項193】

１つ以上のＩＲＦが、配列番号８又は１２に示される配列を含むＩＲＦ１を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項194】

１つ以上のＩＲＦが、配列番号１１、１６、又は１７に示される配列を含むＩＲＦ８を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項195】

ＩＲＦ８が、Ｋ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号１１に示される配列を含む、請求項１９４に記載のシステム。

【請求項196】

１つ以上のＩＲＦが、構成的活性ドメインであるＮ末端ＩＲＦ７ ＤＮＡ結合ドメイン、及びＣ末端ＩＲＦ３核外移行シグナルを含むＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項197】

ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が、配列番号１５に示される配列を含む、請求項１９６に記載のシステム。

【請求項198】

１つ以上のＩＲＦがＩＲＦ４を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項199】

ナノ粒子の少なくともサブセットがＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項200】

ＩＫＫβが、配列番号１８～２２から選択される配列に示される配列に対し９０％よりも大きい、９５％よりも大きい、又は９８％よりも大きい同一性を有する配列から選択される、請求項１９９に記載のシステム。

【請求項201】

ＩＫＫβが、配列番号１８～２２から選択される配列に示される配列を含む、請求項１９９に記載のシステム。

【請求項202】

ヌクレオチドが、配列番号２３～４４から選択される配列に示される配列を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項203】

１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子内にカプセル化されている、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項204】

１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子コア内にカプセル化されている、請求項１９９に記載のシステム。

【請求項205】

１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが異なるナノ粒子にカプセル化されている、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項206】

タンパク質分子の少なくとも１つの結合ドメインが、卵巣がん細胞、黒色腫細胞、神経膠芽腫細胞、多発性骨髄腫細胞、黒色腫細胞、前立腺がん細胞、乳がん細胞、幹細胞がん細胞、中皮腫細胞、腎細胞癌細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、胆管細胞癌細胞、膀胱がん細胞、神経芽細胞腫細胞、結腸直腸がん細胞、又はメルケル細胞癌細胞により発現されるがん抗原に結合する、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項207】

がん抗原が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、カルボキシ－アンヒドラーゼ－ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ジシアロガングリオシド、ＥｐＣａｍ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＲＢＢ２、葉酸受容体（ＦＯＬＲ）、ＧＤ２、グリピカン－２、ＨＥＲ２、ルイスＹ、Ｌ１－ＣＡＭ、メソセリン、ＭＵＣ１６、ＰＤ－Ｌ１、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＲＯＲ１、ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５、ＳＶ４０ Ｔ、又はＷＴ－１を含む、請求項２０６に記載のシステム。

【請求項208】

タンパク質分子の少なくとも１つの結合ドメインが、抗体アデカトゥマブ、アネツマブ、ラブタンシン、アマツキシマブ、ＨＮ１、オレゴボマブ、オバレックス、アバゴモマブ、エドレコロマブ、ファルレツズマブ、フランボツマブ、ＴＡ９９、２０Ｄ７、セツキシマブ、ＦＭＣ６３、ＳＪ２５Ｃ１、ＨＤ３７、Ｒ１１、Ｒ１２、２Ａ２、Ｙ３１、４Ｄ５、３Ｇ１０、アテゾリズマブ、アベルマブ、又はデュルバルマブの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項209】

システム内の異なるタンパク質分子が、異なるがん抗原に結合する結合ドメインを含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項210】

異なるがん抗原が同じがんタイプにより発現される、請求項２０９に記載のシステム。

【請求項211】

がんタイプが卵巣がん、黒色腫、又は神経膠芽腫である、請求項２１０に記載のシステム。

【請求項212】

異なるがん抗原が、
ＥｐＣａｍ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＭＵＣ１６、葉酸受容体（ＦＯＬＲ）、ルイスＹ、ＲＯＲ１、メソセリン、ＷＴ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、及びＣＤ５６から選択される少なくとも２つのがん抗原；
チロシン関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５）；ＧＤ２、ＰＤ－Ｌ１、及びＥＧＦＲから選択される少なくとも２つのがん抗原；又は
ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）及びＩＬ１３Ｒａ２から選択される２つのがん抗原
を含む、請求項２０９に記載のシステム。

【請求項213】

タンパク質分子の少なくとも１つの結合ドメインが、Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープに結合する、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項214】

免疫細胞活性化エピトープがＴ細胞により発現される、請求項２１３に記載のシステム。

【請求項215】

Ｔ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＢ７－Ｈ３を含む、請求項２１４に記載のシステム。

【請求項216】

Ｔ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢを含む、請求項２１５に記載のシステム。

【請求項217】

システム内の異なるタンパク質分子が、異なる免疫細胞活性化エピトープに結合する結合ドメインを含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項218】

異なる免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ３及びＣＤ２８又はＣＤ３及び４－１ＢＢを含む、請求項２１７に記載のシステム。

【請求項219】

少なくとも１つの結合ドメインが、抗体ＯＫＴ３、２０Ｇ６－Ｆ３、４Ｂ４－Ｄ７、４Ｅ７－Ｃ９、１８Ｆ５－Ｈ１０、ＴＧＮ１４１２、９Ｄ７、９．３、ＫＯＬＴ－２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、ＥＸ５．３Ｄ１０、ＯＫＴ８又はＳＫ１のＣＤＲを含む、請求項２１８に記載のシステム。

【請求項220】

免疫細胞活性化エピトープがＮＫ細胞により発現される、請求項２１３に記載のシステム。

【請求項221】

ＮＫ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、又はＤＮＡＭ－１を含む、請求項２２０に記載のシステム。

【請求項222】

少なくとも１つの結合ドメインが、抗体５Ｃ６、１Ｄ１１、ｍＡｂ ３３、Ｐ４４－８、ＳＫ１、又は３Ｇ８のＣＤＲを含む、請求項２２１に記載のシステム。

【請求項223】

タンパク質分子の結合ドメインが、タンパク質リンカーを通じて連結されている、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項224】

タンパク質リンカーがＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む、請求項２２３に記載のシステム。

【請求項225】

タンパク質リンカーがプロリンリッチなリンカーを含む、請求項２２３に記載のシステム。

【請求項226】

タンパク質分子が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項227】

タンパク質分子が、
ＣＥＡに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＥＧＦＲに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＥｐＣａｍに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＨＥＲ２に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＰＤ－Ｌ１に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＰＳＭＡに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；又は
［ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５］に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン
を含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項228】

タンパク質分子が、カツマキソマブ、ＭＴ１１０、エルツマキソマブ、ＭＤＸ－４４７、ＭＭ－１４１、ＡＭＧ２１１、ＲＯ６９５８６８８、ＲＯ６８９５８８２、ＴＦ２、ＢＡＹ２０１０１１２、ＡＭＧ７０１、ソリトマブ、又はブリナツモマブを含む、請求項２２７に記載のシステム。

【請求項229】

少なくとも２つの結合ドメインをコードするヌクレオチドが、１つ以上のＩＲＦ及び／又はＩＫＫβをコードするヌクレオチドと同じナノ粒子内にカプセル化されている、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項230】

少なくとも２つの結合ドメインをコードするヌクレオチドが、１つ以上のＩＲＦ及び／又はＩＫＫβをコードするヌクレオチドと同じナノ粒子コア内にカプセル化されている、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項231】

少なくとも２つの結合ドメインをコードするヌクレオチドが、１つ以上のＩＲＦ及び／又はＩＫＫβをコードするヌクレオチドをカプセル化するナノ粒子とは異なるナノ粒子内にカプセル化されている、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項232】

形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）インヒビターをさらに含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項233】

ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβインヒビターをコードするヌクレオチドを含む、請求項２３２に記載のシステム。

【請求項234】

ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβの活性を抑制する抗体のＣＤＲを含む、請求項２３２に記載のシステム。

【請求項235】

ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβの活性を抑制する抗体を含む、請求項２３２に記載のシステム。

【請求項236】

抗体が、トラベデルセン、ジシテルチド、メテリムマブ、フレソリムマブ、ＬＹ２３８２７７０、ＳＩＸ－１００、アボタミン、及び／又はＩＭＣ－ＴＲ１を含む、請求項２３４又は２３５に記載のシステム。

【請求項237】

ナノ粒子が、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）をコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項238】

ナノ粒子が、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ－２、ＭＤＲ－１、ｐ２１、ｐ１６、ｂａｘ、ｂｃｌ－ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ－Ｉ ＶＥＧＦ、アンギオスタチン、オンコスタチン、エンドスタチン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα及び／又はＨＳＶ－ｔｋから選択される抗がん遺伝子を含むヌクレオチドをさらに含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項239】

薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１６８に記載のシステム。

【請求項240】

請求項１６８に記載のシステムのヌクレオチドを発現するように遺伝的に改変された単球又はマクロファージ。

【請求項241】

対象内の腫瘍部位でマクロファージ活性化状態を調節し、免疫細胞を腫瘍部位に動員し、動員された免疫細胞を活性化する方法であって、請求項１６８に記載のシステムを対象に投与し、それによって対象内の腫瘍部位でマクロファージ活性化状態を調節し、免疫細胞を腫瘍部位に動員し、動員された免疫細胞を活性化することを含む、方法。

【請求項242】

投与が静脈内投与を含み、ナノ粒子が血流内の単球により取り込まれる、請求項２４１に記載の方法。

【請求項243】

単球が腫瘍部位に遊走してマクロファージに分化する、請求項２４２に記載の方法。

【請求項244】

分化したマクロファージが腫瘍抑制に対して抵抗性である、請求項２４３に記載の方法。

【請求項245】

投与が腫瘍部位での局所的投与を含み、ナノ粒子が腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）により取り込まれる、請求項２４１に記載の方法。

【請求項246】

局所的投与が、腹腔内投与又は脳内投与を含む、請求項２４５に記載の方法。

【請求項247】

ＴＡＭが、抑制状態から活性化状態へ表現型転換を受ける、請求項２４５に記載の方法。

【請求項248】

腫瘍部位が、卵巣がん腫瘍部位、神経膠芽腫腫瘍部位、又は黒色腫がん腫瘍部位を含む、請求項２４５に記載の方法。

【請求項249】

動員され活性化された免疫細胞がＴ細胞又はＮＫ細胞である、請求項２４１に記載の方法。

【請求項250】

少なくとも２つの結合ドメインをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を投与する前に、１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を投与することを含む、請求項２４１に記載の方法。

【請求項251】

少なくとも２つの結合ドメインをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を投与する少なくとも２４時間前に、１つ以上のＩＲＦをコードする核酸を含むナノ粒子を投与することを含む、請求項２４１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は２０１９年１２月３１日に提出された米国特許仮出願第６２／９５６，０３３号の優先権を主張するものであり、前記特許文献は、あたかも本明細書に完全に明記されているかのように参照によりその全体を本明細書に組み込む。

【0002】

本開示は、単球／マクロファージをインビボで遺伝的に改変して、（１）追加の免疫細胞を治療部位に動員する；（２）治療部位で活性化されたままで他の免疫細胞に進行中の刺激シグナルを出す；及び（３）治療部位で標的細胞上の抗原に結合し動員された免疫細胞にも結合してこれを活性化し結合した細胞を破壊する多特異的免疫細胞結合分子を分泌するナノ粒子システムを提供する。システムは、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）の活性も阻害することができる。

【背景技術】

【0003】

マクロファージは、がん組織に多数浸潤する鍵となる免疫エフェクター細胞である。しかし、腫瘍微小環境において、マクロファージは活性化殺腫瘍性状態から、実際に腫瘍成長及び転移を促進する免疫抑制表現型への切り替えを受ける。Ｐｏｌｌａｒｄ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４、７１～７８頁（２００４）；Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１７）。

【0004】

腫瘍微小環境内の免疫抑制されたマクロファージががん成長及び転移を促進することを理解すると、免疫抑制腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を標的にする療法を開発することに多くの努力が捧げられてきた。ＴＡＭに取り組む数多くの努力は、ＴＡＭを殺滅して腫瘍微小環境において免疫抑制を緩和することに焦点を合わせてきた。しかし、このアプローチを用いると、ＴＡＭは腫瘍微小環境において新たに到着したマクロファージに取って代わられるだけである。さらに、一部のＴＡＭを殺滅することに成功した場合でも、現在までに開発された大半の治療薬は、腫瘍微小環境中に十分に浸透することができずにいた。一部の小分子薬物及び抗体はある程度の成功を見せてきたが、これらのアプローチは、危険な副作用を含めて身体においてすべてのマクロファージを抑制してきた。Ｂｏｗｍａｎ＆Ｊｏｙｃｅ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ６、６６３～６６６頁（２０１４）。したがって、がんに冒されたすべての人が理解しているように、副作用がより少ないより効果的な治療戦略が大いに必要とされている。

【0005】

免疫系のＴ細胞を遺伝子操作してがん細胞などの目的の細胞型を標的にして殺滅することが著しく進歩してきた。これらのＴ細胞の多くは遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。ＣＡＲは、遺伝的に改変されたＴ細胞にがん細胞を認識し殺滅させるいくつかの異なる小成分を含むタンパク質である。小成分は、少なくとも細胞外成分及び細胞内成分を含む。細胞外成分は、目的の細胞の表面に優先的に存在するマーカーに特異的に結合する結合ドメインを含む。結合ドメインがそのようなマーカーに結合すると、細胞内成分がＴ細胞にシグナル伝達して結合している細胞を破壊させる。ＣＡＲは、細胞外成分を細胞内成分に連結させることができる膜貫通ドメイン、及びＣＡＲの機能を高めることができる他の小成分をさらに含む。例えば、スペーサー領域などの、１つ以上のリンカー配列を含むことにより、ＣＡＲは追加の構造的柔軟性を有し、標的細胞マーカーに結合する結合ドメインの能力を増やせることが多くなる。

【0006】

ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を用いた臨床試験では、従来の治療が失敗した場合に、抵抗性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を有する患者での肯定応答が示された（Ｎｅｅｌａｐｕら、２０１７年 Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：２５３１～２５４４頁）。しかしながら、遺伝子操作ＣＡＲ－Ｔ細胞はがん細胞破壊をもたらすけれども、いくつかの適応症に対してインビボで長期の抗がん活性を提供できなかった。この失敗の１つの理由は、腫瘍微小環境の免疫抑制効果に基づいている可能性がある。

【0007】

二重特異性Ｔ細胞誘導抗体は、がん細胞上のがん抗原とＴ細胞活性化エピトープの両方に結合し、Ｔ細胞をがん細胞に運んでがん細胞を破壊させる目標を有する。例えば、ＵＳ２００８／０１４５３６２を参照されたい。現在の二重特異性Ｔ細胞誘導抗体治療薬の大半が、対になった単一特異性抗体由来結合ドメインを含む。一部の人は、２つの異なるＴ細胞活性化エピトープ（例えば、ＣＤ３及びＣＤ２８）を標的にするような抗体を組み合わせての使用を調査した。しかし、これらの抗体の多くのインビボ半減期が短いので、投薬が依然として難問である。

【0008】

いくつかのグループが、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体の投与に関連する難問のいくつかを克服するための道を調査した。例えば、Ｓｔａｄｌｅｒら、（Ｎａｔｕｒｅ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３、８１５～８１７頁）は、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体をコードする核酸を送達するナノキャリアーを注射することを記載した。これらの抗体をインビボで発現することにより、このアプローチは、循環する二重特異性Ｔ細胞誘導抗体の維持されたレベルを達成し、それによって連続送達のための輸液ポンプを回避することができた。にもかかわらず、循環する二重特異性Ｔ細胞誘導抗体は、固形腫瘍に効率的に浸透せず、腫瘍微小環境に動員され進入するＴ細胞の活性は骨髄系サプレッサー細胞により抑制される。

【0009】

Ｃｈｏｉら、（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３７、１０４９～１０５８頁、２０１９年）は、Ｔ細胞を遺伝子操作して二重特異性Ｔ細胞誘導抗体を産生し分泌させることを調査した。実際、Ｃｈｏｉら、はＴ細胞を遺伝子操作してＣＡＲを発現させ、並びに二重特異性Ｔ細胞誘導抗体を分泌させることを調査した。しかし、これらのＴ細胞には、エクスビボ遺伝子操作が必要であった。さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞も固形腫瘍に効率的に浸潤して腫瘍部位に拡大しない（多くの場合、骨髄系サプレッサー細胞の結果として）。したがって、がん治療戦略は著しく進歩してきたが、にもかかわらず重大な難問が残っている。

【0010】

さらに、タンパク質因子の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）ファミリーが固形腫瘍において高レベルで見つかり、腫瘍微小環境において免疫機能不全の一因になっている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００８／０１４５３６２号明細書

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｐｏｌｌａｒｄ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４、７１～７８頁（２００４）

【非特許文献2】Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１７）

【非特許文献3】Ｂｏｗｍａｎ＆Ｊｏｙｃｅ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ６、６６３～６６６頁（２０１４）

【非特許文献4】Ｎｅｅｌａｐｕら、２０１７年 Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：２５３１～２５４４頁

【非特許文献5】Ｓｔａｄｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３、８１５～８１７頁

【非特許文献6】Ｃｈｏｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３７、１０４９～１０５８頁、２０１９年

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

本開示は腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の免疫抑制腫瘍支援状態を逆転させて、これらのＴＡＭを高度に活性化された腫瘍細胞を殺滅するマクロファージに変えるシステム及び方法を提供する。したがって、本明細書で開示されるシステム及び方法は、単にＴＡＭを殺滅することを狙いとするのではなく、代わりにその活性を腫瘍促進から腫瘍破壊に向け直すことである。特定の実施形態において、このシステム及び方法は、がん細胞の殺滅を誘導し及び／又は新しいがん細胞の成長若しくは発生を減少する若しくは予防するための治療法として使用される。本明細書に開示されるデータから、これらのシステム及び方法が、制御するのが悪名高いほど困難であるがんタイプである卵巣がんを完全に根絶し抑制することができることが明らかにされる。

【0014】

本明細書で開示されるＴＡＭ活性化戦略の使用により、免疫細胞が腫瘍部位へ動員されることが明らかにされた。しかし、動員された免疫細胞の多くが腫瘍により発現されるがん抗原に結合せず、したがって、これらの動員された細胞が抗がん応答に与える利益は他の方法で達成できるよりも少ない。この問題に取り組むため、本開示は、活性化されたＴＡＭを遺伝子操作して多特異性免疫細胞結合分子を発現させることを提供する。次に、活性化されたＴＡＭは、本明細書に記載されるがん療法の成功に３つの決定的な局面を提供する。活性化されたＴＡＭは、（１）免疫細胞を腫瘍部位に動員する；（２）腫瘍部位で活性化されたままで他の免疫細胞に進行中の刺激シグナルを出す；及び（３）腫瘍部位でがん抗原に結合し動員された免疫細胞にも結合してこれを活性化し結合したがん細胞を破壊する多特異的免疫細胞結合分子を分泌する。がん細胞を殺滅するために記載されたアプローチは、いくつか例を挙げると、疾患のある細胞、自己反応性細胞、感染細胞、及び微生物細胞などの目的の他の細胞型にも適用可能である。

【0015】

特定の実施形態は、転写因子などの活性化制御因子をコードするヌクレオチドを送達するナノ粒子システムを利用することによりマクロファージの活性化状態をインビボで変更又は維持する。特に有用なナノ粒子は、正電荷コア及び中性又は負電荷表面を有し、（ｉ）マクロファージの活性化状態を生み出す及び／若しくは維持する転写因子；（ｉｉ）キナーゼ、並びに／又は（ｉｉｉ）多特異性免疫細胞結合分子をコードするヌクレオチドを送達する。好ましい実施形態では、システムは、これらの成分のそれぞれをコードするヌクレオチドを送達するナノ粒子を含む。ナノ粒子サイズが１３０ｎｍ未満であれば、腫瘍浸潤が確実になる。ナノ粒子は、任意選択的に、ＴＡＭによるナノ粒子のもっと選択的な取込みを指示するＴＡＭターゲティングリガンドを含むことができる。一例として、ＴＡＭは、ナノ粒子の表面にマンノースを含むことにより標的にすることができる細胞表面受容体であるＣＤ２０６を発現する。

【0016】

特定の実施形態は、径が１３０ｎｍ未満であり、正電荷ポリマーコア及び中性又は負電荷被覆を有するナノ粒子を含む。インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）；キナーゼ；ＩＫＫβ；多特異性抗体；及び任意選択的にＴＧＦβインヒビターをコードするヌクレオチドは、正電荷ポリマーコア内にカプセル化される。この例では、二重特異性抗体は、ＥｐＣａｍ又はチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５）から選択されるがん抗原及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢから選択される免疫細胞活性化エピトープに結合する。

【0017】

本明細書で開示されるシステムは、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）インヒビターをさらに含むことができる。

【0018】

本明細書で提出される図の一部はカラーでのほうがよく理解される場合がある。出願は元の提出物の一部として図のカラー版を検討し、後の手続きにおいて図のカラー画像を提示する権利を保留する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】標的化されたｍＲＮＡナノ粒子を使用して腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を殺腫瘍性細胞に遺伝的に変換する模式図を示す。全身毒性を引き起こすことなく治療目的でＴＡＭを合理的に再プログラムする新しい方法としてＭ１極性化転写因子をコードするインビトロで転写されたｍＲＮＡを送達するための注射可能なナノ粒子が開発された。ｍＲＮＡナノ粒子の繰り返される腹腔内注入を用いて卵巣がん患者を治療するように設計され、初めて計画された臨床適用が図解されている。

【図1B】標的化されたｍＲＮＡナノ粒子を使用して腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を殺腫瘍性細胞に遺伝的に変換する模式図を示す。標的化されたｍＲＮＡナノ粒子を使用して脳内ＴＡＭを殺腫瘍性マクロファージに遺伝的に再プログラムする模式図を示す。

【図1C】標的ｍＲＮＡナノ粒子を使用して腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を殺腫瘍性二重特異性抗体分泌細胞に遺伝的に形質転換する模式図を示す。Ｍ１極性化転写因子及びＴ細胞を腫瘍抗原に向け直す抗体をコードするインビトロ転写されたｍＲＮＡを同時送達する注射可能なナノ粒子は、全身毒性を引き起こさずに治療目的のためＴＡＭを合理的に再プログラムし宿主適応性免疫応答を活性化する新たな方法を提供する。

【図1D】Ｆｃ及び非Ｆｃフォーマットでの二重特異性結合分子の例示的フォーマットを示している。

【図2A】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。マクロファージ極性化の重要な制御因子をコードするｍＲＮＡを用いて組み立てられたマクロファージ標的化ポリマーＮＰの設計を示す。ナノ粒子は、ＰＧＡジマンノースの層で被覆されたＰｂＡＥ－ｍＲＮＡポリプレックスコアからなり、ＰＧＡジマンノースはナノ粒子をＭ２様マクロファージが発現するマンノース受容体（ＣＤ２０６）に向ける。ＮＰにカプセル化された合成ｍＲＮＡも描かれており、この合成ｍＲＮＡは再プログラミング転写因子をコードするように操作されている。

【図2B】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。ＮＰの集団（スケールバー２００ｎｍ）及び単一ＮＰ（挿入図、スケールバー５０ｎｍ）の透過型電子顕微鏡。

【図2C】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。ＮＰのサイズ分布、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００装置を使用して測定。

【図2D】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。ＮＰは、１時間曝露後骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の高トランスフェクション（４６％）を示した。

【図2E】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。ナノ粒子トランスフェクションの２４時間後フローサイトメトリーにより測定された骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）中への遺伝子移入効率。

【図2F】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。ＮＰトランスフェクトされた及び非トラスフェクトマクロファージの相対的生存率（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＰＩを用いて染色することにより評価した）。Ｎ．ｓ．；有意でない。

【図2G】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定したコドン最適化ＩＲＦ５ ｍＲＮＡ（青色、左Ｙ軸）及び内在性ＩＲＦ５ ｍＲＮＡ（黒色、右Ｙ軸）の発現動態。時点ごとにｎ＝３。

【図2H】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。ＮＰトランスフェクションプロトコール及び図２Ｉ～２Ｋで使用されるＢＭＤＭの培養条件を描くタイムライン。

【図2I】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。Ｔｏｌｌ様受容体６アゴニストＭＰＬＡで刺激されたシグネチャーＭ１細胞と比べたＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ－トランスフェクトされたマクロファージの遺伝子発現プロファイル。結果は、遺伝子発現における倍率変化の分布を示す火山プロットとして描かれている。Ｍ１シグネチャー遺伝子が示されている。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ－トランスフェクトされたマクロファージとＭ１シグネチャー遺伝子セットの間の重複のＰ値はＧＳＥＡにより決定した。

【図2J】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。ＩＬ－４において培養されたマクロファージ対ＩＬ－４において培養されＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰをトランスフェクトされた細胞でのＭ１シグネチャー遺伝子発現のヒートマップ。

【図2K】ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。指示された遺伝子についての平均カウント及びＳ．Ｅ．Ｍを示す箱ひげ図。

【図3】マウスマクロファージの表現型に対するインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）ファミリーの異なるメンバー（その活性化キナーゼと組み合わせて又はなしで送達される）の効果のインビトロスクリーニング。Ｃ５７ＢＬ／６由来のＢＭＤＭをＭ－ＣＳＦ条件付け培地でインキュベートし、（１）対照ＧＦＰ、（２）マウスＩＲＦ５、（３）ＩＲＦ５をリン酸化するマウスＩＲＦ５及びＩＫＫβキナーゼ、（４）マウスＩＲＦ８及びＩＫＫβキナーゼ、（５）Ｌｙｓ－３１０からＡｒｇ（Ｋ３１０Ｒ）変換したＩＲＦ８の突然変異体であるマウスＩＲＦ８ Ｋ３１０Ｒ（Ｗｈｉｔｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１６年６月２４日）、又は（６）マウスＩＲＦ７／３（５Ｄ）をコードする、合成ｍＲＮＡを担持するｍＲＮＡ－ＰＢＡＥ ＮＰで、トランスフェクトした。この融合タンパク質は、ＩＲＦ－７のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び構成的活性ドメイン（ＣＡＤ）並びにＩＲＦ３の核外移行シグナル（ＮＥＳ）及びＩＲＦ会合ドメインを含む（Ｌｉｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１８．５、１９９８年）。ＮＰトランスフェクションの２日後、細胞を、ＴＡＭ関連マクロファージマーカーＥｇｒ２及び活性化マクロファージマーカーＣＤ３８についてのフローサイトメトリー分析のために収集した。このインビトロスクリーニングに基づいて、ｍＩＲＦ５及びＩＫＫβキナーゼをコードするｍＲＮＡを同時送達するＮＰを、本明細書に記載される残りのインビトロ及び治療インビボ実験のために選択した。

【図4A】ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。タイムライン及び投与計画。矢印は、Ｉ．Ｐ．注射の時間を示している。

【図4B】ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。対照及び治療マウスにおける腫瘍成長の連続生物発光イメージング。

【図4C】ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。治療対対照マウスについてのカプラン・マイヤー生存曲線。統計解析は対数順位検定を使用して実施した。

【図4D】ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。対照としてＧＦＰ ｍＲＮＡを担持するＤ－マンノース被覆ＮＰの単回ｉ．ｐ．投与の４８時間後、異なる免疫細胞亜集団におけるインビボトランスフェクション率のフローサイトメトリー定量化：マクロファージ（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ－、Ｌｙ６Ｃ－／ｌｏｗ、Ｌｙ６Ｇ－）、単球（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ－、Ｌｙ６Ｃ＋、Ｌｙ６Ｇ－）、好中球（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ－、Ｌｙ６Ｇ＋）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋、ＴＣＲ－β鎖＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８－）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋、ＴＣＲ－β鎖＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋）、及びナチュラルキラー細胞（ＣＤ４５＋、ＴＣＲ－β鎖－、ＣＤ４９ｂ＋）を測定した。

【図4E】ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。播種性ＩＤ８卵巣がんを抱えたマウスの腹膜におけるマクロファージ表現型のフローサイトメトリー分析。動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの４回投与又はＰＢＳで治療した。

【図4F】ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。Ｌｙ６Ｃ－、Ｆ４／８０＋、及びＣＤ２０６＋（Ｍ２様）マクロファージの相対的パーセント（左パネル）及び絶対数（右パネル）をまとめる箱ひげ図。

【図4G】ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。Ｌｙ６Ｃ－、Ｆ４／８０＋、及びＣＤ２０６－（Ｍ１様）マクロファージについての対応する数。

【図4H】ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。ＰＢＳ対照（上パネル）又はＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療動物（下パネル；スケールバー１００μｍ）から単離した卵巣腫瘍浸潤腸間膜の代表的ヘマトキシリン及びエオシン染色切片。代表的悪性病変の１０倍拡大図が右側に示されている（スケールバー５０μｍ）。

【図4I】ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。それぞれの治療群から単離した腹膜マクロファージにより産生されたサイトカインを測定するＬｕｍｉｎｅｘアッセイ。ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージは蛍光活性化細胞選別により単離し、エクスビボで培養した。２４時間後、細胞培養上澄みを収集した。パラレル実験において、ＦＡＣＳ選別ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージはｐＲＴ－ＰＣＲにより直接分析して、マクロファージ表現型の４つの主要制御因子（セルピンＢ２、Ｒｅｔｎｌａ、Ｃｃｌ１１、及びＣｃｌ５）の発現レベルを決定した。

【図4J】ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。それぞれの治療群から単離した腹膜マクロファージにより産生されたサイトカインを測定するＬｕｍｉｎｅｘアッセイ。ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージは蛍光活性化細胞選別により単離し、エクスビボで培養した。２４時間後、細胞培養上澄みを収集した。パラレル実験において、ＦＡＣＳ選別ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージはｐＲＴ－ＰＣＲにより直接分析して、マクロファージ表現型の４つの主要制御因子（セルピンＢ２、Ｒｅｔｎｌａ、Ｃｃｌ１１、及びＣｃｌ５）の発現レベルを決定した。その結果を、図４Ｊに箱ひげ図としてまとめている。

【図5A】マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。ｉ．ｐ．投与に続くマクロファージ標的化ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰのインビボ生体内分布。ＮＰ－送達された（コドン最適化）ｍＲＮＡは、５０μｇのｍＲＮＡを含有するナノ粒子の単回注射の２４時間後ｑＰＣＲにより検出した。

【図5B】マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。実験タイムラインの模式図。最後の投与の^＊２４時間後、マウスはＣＯ_２吸入により安楽死させた。血液は、血清化学及び全血球計算のために後眼窩出血を通じてヘパリン被覆チューブ中に収集した。死体解剖は、肝臓、脾臓、膵臓、腸間膜及び網、胃、並びに膀胱の組織学的分析のために実施した。

【図5C】マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。対照又はＮＰ治療動物から単離された種々の臓器の代表的なヘマトキシリン及びエオシン染色切片。スケールバー、１００μｍ。ＮＰ治療動物において見出された病変は比較病理医による分析に基づいて示されここに記載されている。番号が付いた画像ごとに関連する所見は、［１］少数の顆粒球と混ざり合った単核細胞で大部分構成された細胞浸潤物の別々の病巣；軽い骨髄外造血発生。［２］少数の局所的広い領域において、肝細胞は軽度から中等度に腫大している。［３］赤色髄内の中等度の骨髄性（優勢な）、赤血球及び巨大核細胞過形成。［４］白色髄の軽い低細胞性。［５］腸間膜内において、マクロファージ、リンパ球、血漿細胞及び顆粒球の中等度の多巣性浸潤物が存在する。［６］リンパ球、血漿細胞及び顆粒球と混ざり合ったマクロファージの軽度から中等度浸潤物；腺房の軽度の解離及び腺房消失；腺房細胞からのチモーゲン顆粒の軽度のびまん性消失。［７］脂肪組織周辺のマクロファージと混ざり合ったリンパ球の濃い凝集体。［８］胃粘膜内の主及び壁細胞の軽度の多巣性空胞変性。

【図5D】マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図５Ｄ）血清化学及び血球数。

【図5E】マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの単回ｉ．ｐ．注射の４又は８日後の血清ＩＬ－６サイトカインのＬｕｍｉｎｅｘアッセイ測定。

【図5F】マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの単回ｉ．ｐ．注射の４又は８日後の血清ＴＮＦ－αサイトカインのＬｕｍｉｎｅｘアッセイ測定。

【図6A】静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。ｉ．ｖ．投与に続くマクロファージ標的化ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰのインビボ生体内分布。コドン最適化ｍＲＮＡは、５０μｇのｍＲＮＡを含有するナノ粒子の単回ｉ．ｖ．注射の２４時間後にｑＰＣＲにより測定した。

【図6B】静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０^６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。タイムライン及び投与計画。

【図6C】静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０^６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。健康な肺（左パネル）及びＢ１６Ｆ１０腫瘍浸潤肺（右パネル）の共焦点顕微鏡。浸潤性マクロファージ集団は緑色の蛍光を発する。

【図6D】静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０^６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。連続生物発光腫瘍イメージング。

【図6E】静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０^６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。治療群ごとのカプラン・マイヤー生存曲線。ｍｓは生存期間中央値を示す。統計解析は対数順位検定を使用して実施し、Ｐ＜０．０５は有意と見なした。

【図6F】静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０^６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。２週間の治療に続くそれぞれの群を表すＢ１６Ｆ１０メラノーマ転移を含有する肺の代表的写真（上の列）及び顕微鏡写真。

【図6G】静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０^６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。肺腫瘍病巣の数。

【図6H】静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０^６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。それぞれの治療群由来の気管支肺胞洗浄中の単球／マクロファージ集団の表現型特徴付け。

【図6I】静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。抑制性及び活性化されたマクロファージの相対的パーセンテージのまとめ。

【図7A】マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。誘導後２１日目のＲＣＡＳ－ＰＤＧＦ－Ｂ／Ｎｅｓｔｉｎ－Ｔｖ－ａ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－；Ｐｔｅｎ－／－トランスジェニックマウスにおけるＰＤＧＦβ駆動神経膠腫の開始に続くＴ２ ＭＲＩスキャン、及び組織学的染色。

【図7B】マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。神経膠腫縁を浸潤するＣＤ６８＋ＴＡＭの共焦点顕微鏡。スケールバー、３００μｍ。

【図7C】マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。健康な脳組織対神経膠腫におけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋）集団のフローサイトメトリー分析。

【図7D】マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。単独療法としてＩＲＦ５／ＩＫＫβ治療を受けた、確立した神経膠腫を抱えたマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。タイムライン及び投与計画は上に示されている。ｍｓ、生存期間中央値。統計解析は対数順位検定を使用して実施し、Ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なした。

【図7E】マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。脳腫瘍放射線療法と組み合わせたＩＲＦ５／ＩＫＫβ治療を受けた、確立した神経膠腫を抱えたマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。タイムライン及び投与計画は上に示されている。ｍｓ、生存期間中央値。統計解析は対数順位検定を使用して実施し、Ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なした。

【図7F】マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。腫瘍進行の連続生物発光イメージング。

【図8A】ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。ヒトＴＨＰ－１単核球細胞株を抑制性Ｍ２様マクロファージに分化させるタイムライン及び培養条件。

【図8B】ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。２４ウェルにおいて培養され、ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡ対対照ＧＦＰ ｍＲＮＡを担持するＮＰの指示された濃度をトランスフェクトされたＭ２－分化ＴＨＰ１－Ｌｕｃｉａ細胞の生物発光イメージング。ＩＲＦ誘導Ｌｕｃｉａルシフェラーゼのレベルは、Ｑｕａｎｔｉ－Ｌｕｃを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。

【図8C】ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。生物発光数のまとめ。

【図8D】ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。ＩＬ－１βサイトカイン分泌におけるＭ１－マクロファージマーカーＣＤ８０の差。

【図8E】ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。表面発現におけるＭ１－マクロファージマーカーＣＤ８０の差。

【図9】実施例１に記載される骨髄及びリンパ球免疫表現型パネルにおいて使用される抗体の一覧表。

【図10A】Ｔ細胞が、マクロファージプログラミングナノ粒子を用いて達成される抗腫瘍効果に寄与することを示している。ナノ粒子媒介マクロファージプログラミングは腫瘍病変中へのＴ細胞動員を増やす。腸間膜でのＩＤ８卵巣がん細胞の腹膜転移の代表的な共焦点画像が示される。ＰＢＳ又はＩＲＦ５／ＩＫＫβＮＰ （５０μｇ ｍＲＮＡ／用量）の６回の週２回腹腔内注射後に組織は収集され、指示されたリンパ球－及び骨髄マーカーについて染色された（ａ、ｃ）。Ｔｕ＝腫瘍。Ｍｅｓ＝腸間膜。スケールバー：１００μｍ。

【図10B】Ｔ細胞が、マクロファージプログラミングナノ粒子を用いて達成される抗腫瘍効果に寄与することを示している。Ｈａｌｏ（商標）画像解析ソフトウェアを使用してそれぞれの表現型マーカーについての蛍光シグナルを示すボックス図である。Ｎ＝５。ボックスは平均値を表し、ボックス中の線は中央値を表す。ボックスを横切るバーは最小及び最大値を表す。ウィスカーは９５％信頼区間を表す。Ｎ＝５つの生物学的に独立した試料。

【図11-1】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-2】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-3】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-4】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-5】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-6】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-7】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-8】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-9】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-10】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-11】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-12】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-13】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-14】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-15】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-16】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-17】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-18】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-19】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-20】本開示を支持する例示的配列である。

【図11-21】本開示を支持する例示的配列である。

【図12-1】タンパク質／コード配列組合せ、注記付きである。

【図12-2】タンパク質／コード配列組合せ、注記付きである。

【発明を実施するための形態】

【0020】

マクロファージは、がん性組織を多数で浸潤する鍵となる免疫エフェクター細胞である。しかし、免疫抑制性腫瘍環境において、マクロファージは活性化殺腫瘍性状態から、腫瘍成長及び転移を促進する免疫抑制表現型への切り替えを受ける。これらの腫瘍関連免疫抑制されたマクロファージ（ＴＡＭ）は予後不良と関連している（Ｋｏｍｏｈａｒａ Ｙら、（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ １０５（１）：１～８頁）。ＴＡＭは、血管新生、リンパ球新生、及び間質リモデリングを誘導する。ＴＡＭは、酵素プラスミン、ｕＰＡ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びカテプシンＢの分泌を通じて腫瘍浸潤及び転移を促進するのに重要な役割も果たしている（Ｋｏｍｏｈａｒａ、Ｙら、（２０１６）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ ９９：１８０～１８５頁；Ｇｏｃｈｅｖａ Ｖら、（２０１０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２４：２４１～２５５頁；Ｗａｎｇ Ｒら、（２０１１）Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ７４：１８８～１９６頁）。腫瘍成長及び進行を媒介することとは別に、ＴＡＭは他の免疫細胞と相互作用をして自然及び適応抗腫瘍免疫応答を抑制することができる。

【0021】

いくつかの小分子薬物は、細胞動員又は増殖に関与する経路を標的にすることにより、ＴＡＭ前駆体細胞の腫瘍への局在化を遮断することに焦点を合わせている（すなわち、ＣＳＦ－１／ＣＳＦ－１Ｒ経路（Ｐｙｏｎ；ｔｅｃｋら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １９、１２６４～１２７２頁（２０１３）；Ｔａｐら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７３、４２８～４３７頁（２０１５））又はＣＣＬ２経路（Ｎｙｗｅｎｉｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １７、６５１～６６２頁（２０１６））の阻害剤）。これらのアプローチには、小分子薬物の高用量への繰り返し全身曝露が必要である。さらに、これらの薬物の臨床試験は、細胞減少療法と組み合わされていなければ、示す応答は低かった。Ｎｙｗｅｎｉｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １７、６５１～６６２頁（２０１６）；Ｂｕｔｏｗｓｋｉら、Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ １８、５５７～５６４頁（２０１６）。さらに、これらの小分子アプローチは、マクロファージ抗腫瘍活性を活発に促進しない。

【0022】

リポソームなどの従来のナノ担体は、ビスホスホネート又は腫瘍内のマクロファージを全身的に破壊する他の抗増殖剤（すなわち、リポソームクロドロネート）で処方されてきた（Ｆｒｉｔｚら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５、５８７（２０１４））。腫瘍溶解性ウイルスも、ｓｉＲＮＡを送達し、腫瘍内の免疫回避経路を発現停止させＴＡＭの食作用を間接的に促進するのに使用されてきた（Ｃｈａｏら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４、２２５～２３２頁（２０１２））。しかし、これらのアプローチを使用して破壊されるマクロファージは、新たに到着するマクロファージで自然に取って代わられ、これは同様に免疫抑制性になる。

【0023】

ＴＡＭの機能的活性化を誘導する抗体が、開発されている。これらのアプローチは、腫瘍内の限定された抗原タイプを標的にする抗体を利用する。Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１７）。しかし、これらの抗体の成功は、その低い腫瘍浸透及び不均質な分布により制限される。Ｔｈｕｒｂｅｒら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６０、１４２１～１４３４頁（２００８）。彼らはまた、抗体により標的にされる抗原を欠く腫瘍エスケープ変異体にも取り組んでいない。

【0024】

本明細書で開示されるように、記載されているアプローチで、ＴＡＭを、活性化された殺腫瘍性マクロファージのままでいるか又はそうなるように直接的に効果的にプログラム又は再プログラムするアプローチは一つもない。本明細書に開示されるシステム及び方法は、著しく革新的である。なぜならば、本明細書に開示されるシステム及び方法は、腫瘍促進ＴＡＭ負荷を同時に減らしつつ、ＴＡＭを腫瘍除去マクロファージになるように再プログラムするのを可能にするからである。現在、医師が、これらの治療目的のためにＴＡＭを合理的に再プログラムすることを、可能にする他の方法は、存在しない。Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１７）；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ＆Ｎａｇａｒａｊ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９、１６２～１７４頁（２００９）。本方法は、本方法自体においてかつ本方法自体が、腫瘍の治療において治療効果を与えることができる。実際、本明細書で開示されるアプローチの有効性は、卵巣がん、メラノーマ、及び神経膠芽腫のモデルにおいて実証されている。より詳しくは、インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）をその活性化キナーゼＩＫＫβと組み合わせてコードするヌクレオチドで処方されたナノ粒子を注入すると、ＴＡＭの免疫抑制腫瘍支援状態を逆転させ、ＴＡＭを、抗腫瘍免疫を誘導し腫瘍退縮を促進する表現型に再プログラムした。

【0025】

１つの興味深い所見は、Ｔ細胞が、マクロファージプログラミングナノ粒子を用いて達成される抗腫瘍効果に寄与することであった。実際、新生物を取り囲む宿主Ｔ細胞の多巣性密集クラスターがＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子治療動物すべてで見い出されており、免疫刺激マクロファージの遺伝的プログラミングがリンパ球輸送及び固形腫瘍中への浸潤を回復させることを示している（ＮＰは腫瘍中へのＴ細胞浸潤を平均１０．６倍（ＣＤ８）及び３．５倍（ＣＤ４）増加させた；図１０Ａ、１０Ｂ参照）。

【0026】

しかし、腫瘍中に動員されるＴ細胞の大半が腫瘍部位でがん抗原に結合すると考えられる治療的に関連するＴ細胞受容体を欠くために、本開示は、マクロファージプログラミング転写因子及びＴ細胞向け直しマクロ分子（二重特異性抗体などの）をコードするヌクレオチドを送達して自然及び適応免疫細胞をさらに活性化するナノ粒子の使用を提供する（図１Ｃに図解されている）。

【0027】

既存の二重特異性分子技術と比べて一つの鍵となる優れている点は、これらの分子がＴＡＭにより直接分泌され、したがって、腫瘍病変内で最高濃度に到達する（全身曝露を最小限に抑える）ことである。二重特異性抗体の急速なクリアランス速度（例えば、ヒト血清中で２時間）を考慮すると、従来の二重特異性抗体療法は、持続静脈内注入により投与する必要があり、用量規制毒性と関連している。このアプローチは、固形腫瘍の治療についてはほとんど臨床成功を見せておらず、この腫瘍は、骨髄系由来サプレッサー細胞でＴ細胞攻撃から防御されている。本開示に記載されるアプローチを使用すれば、医師は単球／マクロファージをインビボで遺伝的に改変して、（１）追加の免疫細胞を腫瘍部位に動員する；（２）腫瘍部位で活性化されたままで、進行中の刺激シグナルを他の免疫細胞に提供する；及び（３）腫瘍部位でがん抗原に結合し動員された免疫細胞にも結合して活性化し結合したがん細胞を破壊する多特異性免疫細胞結合分子を分泌することができる。重要なことに、この療法は、腫瘍内部から働き、これは免疫恒常性を破壊することがある既存の併用治療とは対照的である。

【0028】

特定の実施形態は、ナノ粒子を利用して細胞に、転写因子（例えば、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ））及び／又はキナーゼ（例えば、ＩＫＫβ）などの活性化制御因子をコードする遺伝子をコードするヌクレオチドを提供する。これらの活性化制御因子は、マクロファージ極性化を調節する。マクロファージ極性化は、マクロファージの生理的活性が変化する際に通過する、高度に動的なプロセスである。示されるように、大半の腫瘍において、ＴＡＭは、「Ｍ２」表現型が可能である免疫抑制された表現型を示す。これとは対照的に、活性化されたマクロファージは、腫瘍細胞の殺滅をもたらす「Ｍ１」表現型を示すことができる。本明細書で開示される特定の実施形態は、腫瘍促進ＴＡＭの極性化を、腫瘍を殺滅するマクロファージへと逆転する。本明細書で開示される特定の実施形態は、マクロファージが腫瘍部位で免疫抑制されないように、単球を遺伝的に改変して後にマクロファージに分化したら活性化された状態を維持する。これらの効果は、炎症性サイトカインを誘導し、他の免疫細胞を活性化し、腫瘍細胞を貪食することにより腫瘍内の免疫抑制性環境を回復する。

【0029】

「マクロファージ活性化（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」とは、マクロファージの表現型又は機能を（ｉ）不活性化状態（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）から活性化状態（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）へ；（ｉｉ）非活性化状態から活性化状態へ；（ｉｉｉ）活性化状態からさらに活性化された状態へ；又は（ｉｖ）不活性化状態から非活性化状態へ変更するプロセスのことである。不活性化状態とは、腫瘍成長及び転移を促進する免疫抑制された表現型を意味する。非活性化状態とは、マクロファージが腫瘍成長又は転移を促進せず、腫瘍細胞の殺滅を促進もしないことを意味する。活性化状態は、マクロファージが殺腫瘍活性を示すことを意味する。特定の実施形態において、活性化状態により、下でより完全に説明されるＭ１表現型が生じる。特定の実施形態において、不活性化状態によりＭ２表現型が生じ、これも下でより完全に説明される。

【0030】

特定の実施形態において、開示されたシステム及び方法の１つの利点は、治療により誘導される炎症が治療部位に局在化したままになるがゆえに、患者を全身的毒性から救うことである。この利点を達成するため、局所的に注入されたナノ粒子は、腫瘍環境中のＴＡＭを標的にし、マクロファージ極性化を制御するシグナル伝達経路を選択的に再プログラムするヌクレオチドを送達し、局所的に生理的経路により完全に分解可能になる（Ｓａｈｉｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １３、７５９～７８０頁（２０１４））。本明細書に記載されるナノ粒子は、血流内の単球が取り入れることができる場所で静脈内に投与することもできる。

【0031】

固形腫瘍中で外因性ヌクレオチドの高発現を達成するのは、インビボにおいて難問である。本開示以前、ウイルス又はリポソームなどの従来のナノ担体に基づくヌクレオチド送達システムは、腫瘍組織内においてその制限された拡散により限定された、Ｊａｉｎ＆Ｓｔｙｌｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ７、６５３～６６４頁（２０１０）。この障壁を回避するため、特定の実施形態は、ＮＰが腫瘍内のＴＡＭの大集団にヌクレオチドを送達するように、増強された拡散率を有するナノ粒子（本明細書ではＮＰとも呼ばれる）を利用する。特定の実施形態は、中性表面電荷を担うサイズが１３０ｎｍ未満のＮＰを利用する。

【0032】

特定の実施形態は、ＮＰの表面に結合されたターゲティングリガンドをさらに任意選択的に含むことができる。例えば、マクロファージマンノース受容体１（ＭＲＣ１）は、ＣＤ２０６としても知られるが、マクロファージが発現するＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ２０６は、ＴＡＭにおいて高発現レベルも示す。したがって、特定の実施形態では、ジマンノースをＮＰ表面に結合させて、ＴＡＭ細胞表面で発現されるマンノース受容体（ＣＤ２０６）へのより選択的なターゲティングを可能にすることができる。ＣＤ２０６結合及びターゲティングリガンドに関するさらに多くの情報は、Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１０、３９７４頁（２０１９）を参照されたい。標的にすることができる他のＴＡＭ細胞表面受容体は、初期増殖応答タンパク質２（Ｅｇｒ２）、ＣＤ１６３、ＣＤ２３、インターロイキン（ＩＬ）２７ＲＡ、ＣＬＥＣ４Ａ、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ９３、ＣＤ１１５、ＣＤ１９２、ＣＤ２２６、ＩＬ１３－Ｒａ１、ＩＬ－４ｒ、ＩＬ－１Ｒ ＩＩ型、デコイＩＬ－１Ｒ ＩＩ型、ＩＬ－１０ｒ、マクロファージスカベンジャー受容体Ａ及びＢ、Ｙｍ－１、Ｙｍ－２、低密度受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、ＩＬ－６ｒ、ＣＸＣＲ１／２、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、及びＰＤ－Ｌ１を含む。

【0033】

特定の実施形態において、本明細書に開示されるシステム及び方法は、粒子の投与を必要とする対象にナノ粒子を投与することを含む。ナノ粒子は、対象の血流中の単球及び／又は腫瘍中に存在するマクロファージに向けられ、単球／マクロファージにより内在化されるように設計されている。内部移行された後、ナノ粒子は、ＩＲＦ５とＩＫＫβをコードする配列を有する１つ以上のヌクレオチドをさらに送達する。１つ以上のヌクレオチドは、ＩＲＦ５とＩＫＫβを発現するように単球／マクロファージを改変する。理論に縛られることはなく、ＩＫＫβキナーゼはリン酸化によりＩＲＦ５転写因子を活性化する。次に、活性化されたＩＲＦ５は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）遺伝子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ－６、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３を含む炎症性サイトカイン、並びに、腫瘍抑制因子の発現を引き起こす。ＩＲＦ５とＩＫＫβをコードする１つ以上のヌクレオチドを内部移行させたＭ２マクロファージにおいて、ＩＲＦ５作用を通じた前述の遺伝子の発現は、マクロファージのＭ２表現型からＭ１表現型への表現型又は機能的転換をもたらし、これによりマクロファージが腫瘍細胞を殺滅する又は腫瘍細胞の破壊を他の方法でトリガーさせ、それによって、がんを治療することが可能になる。特定の実施形態において、ナノ粒子は食作用により単球／マクロファージに内部移行される。特定の実施形態において、ナノ粒子は、リガンド媒介エンドサイトーシス（例えば、ＣＤ－２０６媒介エンドサイトーシス）により単球／マクロファージに内部移行される。特定の実施形態において、ＩＲＦ５とＩＫＫβ遺伝子を含むナノ粒子のマクロファージ中への送達は、例えば、（１）マクロファージへの結合、（２）マクロファージによるナノ粒子の内部移行、（３）内部移行後の細胞内小胞から細胞質中への逃避、（４）１つ以上のヌクレオチドの放出、（５）このヌクレオチドはマクロファージの核中に輸送することができ、（６）転写されてＩＲＦ５とＩＫＫβを発現するための遺伝子を送達する。

【0034】

以前示されたように、本明細書で開示されるシステム内のナノ粒子は単球／マクロファージをさらに遺伝的に改変して、二重特異性免疫細胞活性化分子を産生し分泌する。このアプローチは図１Ｃに描かれており、そこでは転写因子及び二重特異性抗体をコードするヌクレオチドを有するナノ粒子は正電荷コア内にカプセル化されている。図１Ｃに描かれているアプローチでは、ナノ粒子は血流内の単球により取り込まれる。次に、これらの単球は血流を離れて腫瘍部位に到達する。ナノ粒子取込みに基づいて、細胞は、核に入り活性化されたマクロファージ状態の創造又は維持を可能にする転写因子を発現する。活性化されたマクロファージ状態は、免疫細胞を腫瘍部位に引き付け、そこで二重特異性抗体も分泌する。二重特異性抗体は腫瘍部位でがん抗原に結合し、並びに動員された免疫細胞上でエピトープを活性化する。

【0035】

タンパク質因子の形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）ファミリーは、幅広い異なる細胞及び組織型での幅広い制御経路に並びに正常な及び病理過程の異なる段階で関与する。がん内部では、ＴＧＦ－βは固形腫瘍中において高レベルで見い出される多面的サイトカインである。ＴＧＦβは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導して腫瘍微小環境においてＣＤ８＋及びＴＨ１細胞を阻害し、免疫機能不全を駆動する。例えば、Ｒａｖｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９、７４１頁（２０１８）を参照されたい。したがって、本明細書で開示される特定の実施形態は、腫瘍微小環境においてＴＧＦ－βを低減又は中和する。例えば、本明細書に記載されるナノ粒子は、ＴＧＦβ抗体などのＴＧＦβインヒビターをコードするヌクレオチドを送達することができる。

【0036】

本開示の態様は、この時点で、以下のような追加の詳細及び選択肢を用いて記載される：（１）マクロファージ及びマクロファージ表現型；（２）マクロファージ極性化に影響を及ぼす細胞経路；（３）標的化された抗原及び関連結合ドメイン；（４）免疫細胞活性化エピトープ及び関連結合ドメイン；（５）二重特異性分子フォーマット；（６）ＴＧＦβインヒビター；（７）ヌクレオチド；（８）ナノ粒子；（９）投与用の組成物；（１０）使用方法；（１１）例示的実施形態；（１２）実験例；並びに（１３）締め括りのパラグラフ。これらの見出しは、本開示の解釈を限定せず、組織的目的のためだけに提供される。

【0037】

（１）マクロファージ及びマクロファージ表現型。「マクロファージ」とは、骨髄由来単球から分化した免疫系の白血球のことである。マクロファージは、その食細胞活動及びその抗原提示能力により特徴付けられる。マクロファージは、自然及び適応免疫応答の両方において重要な役割を担う。表現型的には、マクロファージは表面マーカーＦ４／８０（Ｌｙ７１）を発現し、ＣＤｌｌｂ（Ｍａｃｌ）、ＣＤｌｌｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４０又はＣＤ６８などの他の表面マーカーを発現することもある。

【0038】

マクロファージは、Ｔリンパ球を活性化することにより、自然及び適応免疫の両方において重要な役割を果たす。がんにおいて、マクロファージは、固体腫瘍に関連する浸潤性白血球の大集団の１つである（Ｇｏｒｄｏｎ Ｓ＆Ｔａｙｌｏｒ ＰＲ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（１２）：９５３～９６４頁）。マクロファージは、周辺組織から又は走化性分子の分泌を通じて腫瘍そのものにより腫瘍部位へ動員することができる。マクロファージは、その表現型に応じて、極性化した様式で腫瘍に対する免疫応答に関与する。「表現型」は、遺伝子型と環境の相互作用の結果としての細胞の物理的属性又は生化学的特徴を指すのに本明細書において使用され、細胞の機能を含むことができる。

【0039】

Ｔｈ１ Ｔリンパ球を活性化するマクロファージは、炎症応答を与え、Ｍ１極性化又は「古典的活性化」表現型を有するとして表されることが多い。活性化状態のマクロファージ（すなわち、Ｍ１マクロファージ又はＭ１表現型を有するマクロファージ）は、「キラーマクロファージ」とも呼ばれるが、細胞増殖を阻害し、組織損傷を引き起こし、病原体に対する抵抗を媒介し、強力な殺腫瘍活性を有する。これらのマクロファージは、抗原提示及び同時刺激の原因であるメディエーターの発現を増加することができ；腫瘍領域への好中球の浸潤が促進されると、好中球標的化腫瘍退縮がもたらされる。Ｍ１表現型は、適切な対照状態と比べると抗原提示の増加により証明することもできる。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、活性酸素種（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）のＭ１マクロファージ生成により証明することができる。ＮＯは、病原体及び腫瘍細胞のような異常な細胞に対する防御に不可欠な抗増殖効果を有する。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、ＩＬ－１２などのサイトカインの産生を通じてＴｈ１免疫を誘導する炎症誘発性状態により証明することができる。特定の実施形態において、活性化状態のマクロファージは、古典的には、病原体を貪食することができる活性化マクロファージである。

【0040】

機能以外に、Ｍ１表現型は、マクロファージにより発現される表面マーカー；極性化によりマクロファージにより産生される因子、タンパク質、若しくは化合物；又は極性化の時にマクロファージにより誘導される遺伝子により証明することもできる。Ｍ１極性化は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ｉＮＯＳ、サイトカインシグナル伝達抑制因子３（ＳＯＣＳ３）、ＴＮＦα、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、Ｉ型ＩＦＮ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０の発現により証明される表現型をもたらすことができる。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、ＣＤ８０の発現の増加を含む。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、ＣＤ２０６－、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ－、及びＣＤ１１ｂ＋を含む。

【0041】

一方、Ｔｈ２ Ｔリンパ球を活性化するマクロファージは抗炎症応答を与え、「Ｍ２」表現型を有すると示されることが多い。不活性化状態であるマクロファージ（すなわち、Ｍ２マクロファージ又はＭ２表現型を有するマクロファージ）は、「修復マクロファージ」とも呼ばれるが、メタゾア寄生体封じ込め、細胞増殖、組織修復、腫瘍進行、抗炎症経路、及び免疫抑制に関与している。Ｍ２表現型は、適切な対照状態と比べると抗原提示を減らし、食作用を減少することができる。Ｍ２表現型は、例えば、アルギナーゼ１（Ａｒｇ１（アルギナーゼ活性は増殖促進性効果及び組織修復応答に関連している）、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＰＰＡｒγ、ＫＬＦ４、ＣＤ２０６（ＭＲＣ１）、デクチン－１（シグナル伝達非ＴＬＲパターン認識受容体）、ＤＣ－ＳＩＧＮ（Ｃ型レクチン）、スカベンジャー受容体Ａ、スカベンジャー受容体Ｂ－１、ＣＤ１６３（ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体に対する高親和性スカベンジャー受容体）、ケモカイン受容体ＣＣＲ２、ＣＸＣＲ１、及びＣＸＣＲ２、ＹＭ１（キチナーゼ３様３）、及びＦｉｚｚ１の１種以上の発現；並びに、ケモカインＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４の分泌により証明することもできる。特定の実施形態において、不活性化状態のマクロファージは転移及び／又は化学療法に対する抵抗を促進する。特定の実施形態において、Ｍ２表現型は、ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＣＤ１１ｂ^ｌｏｗを含む。

【0042】

表１は、Ｍ１表現型とＭ２表現型（Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ及びＭ２ｄと命名されるサブ表現型を含む）を区別するのに使用することができる基準の特定の組合せを提供する。

【0043】

【表1】

【0044】

マクロファージ表現型を評価するためのアッセイは、Ｍ１又はＭ２表現型に特有の異なる分子シグネチャーを利用することができる。Ｍ１マクロファージについて一般的に認められたマーカープロファイルはＣＤ８０＋であり、Ｍ２－マクロファージはＣＤ１６３＋と見なすことができる。したがって、フローサイトメトリーを実施すれば、これらのマーカーについて評価することができる。マクロファージをＭ１タイプのほうに近づけＭ２タイプから遠ざけることは、ＩＬ－１２／ＩＬ－１０比又はＣＤ１６３－／ＣＤ１６３＋マクロファージ比の増加を測定することにより、評価することもできる。特定の実施形態において、Ｍ１対Ｍ２形態は、光学顕微鏡により評価することができる。特定の実施形態において、食作用アッセイは、マクロファージがＭ１タイプなのかＭ２表現型なのかを評価する他のアッセイと併せて使用してもよい。異なるマクロファージ集団の食作用アッセイは、貪食される実体をマクロファージと一緒に細胞あたりの正規化された全表面積と一致する濃度でインキュベートすることにより実施してもよい。貪食される実体をマクロファージ培養物に添加してもよい。貪食される実体は、例えば、蛍光ラベルで標識してもよい。食作用インデックスは、マクロファージあたり測定された全蛍光強度中央値により決定してもよい。食作用の定量化は、例えば、フローサイトメトリーによって行ってもよい。腫瘍細胞殺滅アッセイを利用してもよい。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、セルピンＢ２（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の阻害剤）、ＣＣＬ２（Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド２）、ＣＣＬ１１（Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１１）、及びＲｅｔｎｌａ（レジスチン様アルファ；Ｆｉｚｚ１）を含むシグネチャーＭ２マクロファージ遺伝子の発現の減少を含む。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、ＣＣＬ５（Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド５）を含むＭ１分化遺伝子の発現の増加を含む。

【0045】

遺伝子発現（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６及び／又は上記の他の遺伝子のＭ１発現）は当業者には周知であるアッセイによって測定することができる。遺伝子発現を測定する方法は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）発現アッセイ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、及び定量的ＲＴ－ＰＣＲを含む。遺伝子発現産物、例えば、タンパク質レベルを測定する方法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチアッセイ、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織染色、免疫電気泳動、免疫沈澱、及び抗体又はタンパク質結合剤などの検出試薬を使用する免疫蛍光を含む。

【0046】

本明細書で開示される実施形態を使用すれば、多形核好中球、単球、単球由来マクロファージ、組織常在性マクロファージ、上皮細胞、線維芽細胞、及び樹状細胞などの食作用細胞を遺伝的に改変することができる。食作用細胞は専門であってもよいし、又は非専門であってもよい。専門食細胞は、多形核好中球、単球、単球由来マクロファージ、及び組織常在性マクロファージを含む。特定の実施形態では、専門食作用細胞の主要な機能は食作用である。非専門食細胞は、食作用を実施することができる他のあらゆる細胞型を含むが、食作用が細胞の主要な機能とは考えられていない。非専門食細胞の例は、上皮細胞、線維芽細胞、及び樹状細胞を含む。専門及び非専門食細胞に関するさらに多くの情報は、Ｌｉｍ、Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎ、ａｎｄ Ｒｏｔｈ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１７年５月、第７巻、Ａｒｔｉｃｌｅ １９１頁を参照されたい。

【0047】

（２）マクロファージ極性化に影響を及ぼす細胞経路。活性化又は不活性化表現型に向かうマクロファージの極性化は、マクロファージといくつかの異なる分子又は環境との相互作用から生じる。例えば、Ｍ１マクロファージ極性化は、トール様受容体（ＴＬＲ）リガンド（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド、リポテイコ酸、イミキモド、ＣｐＧ）、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含む刺激によりトリガーされる。Ｍ２極性化マクロファージは、極性化を惹起する刺激に応じて、サブセットに分割することができ：Ｍ２ａサブセットはＩＬ－４、ＩＬ－１３又は真菌及び蠕虫感染により誘発され；Ｍ２ｂはＩＬ－１受容体リガンド、免疫複合体及びＬＰＳにより誘発され；Ｍ２ｃはＩＬ－１０、ＴＧＦ－β及びグルココルチコイドにより誘発され；Ｍ２ｄはＩＬ－６及びアデノシンにより誘発される。Ｍ２マクロファージ極性化は、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、補体成分、及びアポトーシス細胞によりトリガーされる場合もある。マクロファージ極性化は、低酸素などの局所的微小環境状態によっても調節される。

【0048】

前述の分子及び環境は、転写因子を含む異なる細胞内シグナル伝達経路をトリガーさせることによりマクロファージ極性化に影響を及ぼす。Ｍ１とＭ２極性化の両方に関与している転写因子は、ＩＲＦ、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）、ＳＯＣＳ３タンパク質、及び活性化Ｂ細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦκＢ）を含む。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）も、マクロファージ機能をＭ１又はＭ２表現型のほうに向けるのに役割を果たしている。

【0049】

ＩＲＦ／ＳＴＡＴ経路は、上で考察したＩＦＮ及びＴＬＲシグナル伝達などの刺激により活性化されるが、マクロファージを、ＳＴＡＴ１を経てＭ１活性状態に極性化する。一方、ＩＬ－４及びＩＬ－１３などの刺激は、マクロファージを、ＳＴＡＴ６を経てＭ２活性状態のほうにそらす（Ｓｉｃａ Ａ＆Ｂｒｏｎｔｅ Ｖ（２００７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：１１５５～１１６６頁）。したがって、これらのシグナル伝達イベントは、Ｍ１マクロファージ極性化の場合、炎症性免疫応答及び殺腫瘍活性を促進する、又はＭ２マクロファージ極性化の場合、免疫抑制性腫瘍促進応答を促進する。

【0050】

Ｍ１表現型の誘導に関係するいくつかの細胞内分子は、Ｇタンパク質共役型受容体、Ｐ２Ｙ（２）Ｒ、これはＮＯＳ２を経てＮＯを誘導するのに役割を果たし（Ｅｕｎ ＳＹら、（２０１４）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ １８：２７０～２７６頁）；ＳＯＣＳ３、これはＮＦκＢ／ＰＩ－３キナーゼ経路を活性化してＮＯを生成し（Ａｒｎｏｌｄ ＣＥら、（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４１：９６～１１０頁）；並びに成長及び分化因子アクチビンＡ、これはＭ１マーカーを促進しＩＬ－１０を下方調節する（Ｓｉｅｒｒａ－Ｆｉｌａｒｄｉ Ｅら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７：５０９２～５１０１頁）、を含む。

【0051】

Ｍ１表現型の誘導に関与する他の細胞内分子はＩＲＦを含む。ＩＲＦは、ＩＦＮのウイルス媒介活性化、並びに細胞成長、分化、アポトーシス、及び免疫系活性の調節を含む、多様な役割を有する転写因子のグループである。ＩＲＦファミリーのメンバーは、トリプトファン（Ｗ）リピートを含有する保存されたＮ末端ＤＮＡ結合ドメインを特徴とする。

【0052】

ＩＲＦ５は、ヘリックスターンヘリックスＤＮＡ結合モチーフを有しウイルス－及びＩＦＮ誘導シグナル伝達経路を媒介する転写因子である。ＩＲＦ５は、マクロファージが炎症を促進する又は阻害するかを制御する分子スイッチとして作用する。ＩＲＦ５は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２及びＩＬ－２を含む炎症性サイトカイン、及び腫瘍抑制因子、並びにＴｈ１及びＴｈ１７応答を活性化する。ＩＲＦ５は、染色体７ｑ３２に位置するヒトＩＲＦ５遺伝子（ＯＭＩＭ ＩＤ ６０７２１８）によりコードされている。ＩＲＦ５のいくつかのアイソフォーム／転写変異体が存在することが認識されている。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ５のアイソフォームは、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８－１、配列番号１）、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８－２、配列番号２）、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８－３、配列番号３）、アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８－４、配列番号４）、アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８－５、配列番号５）及びアイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１３５６８－６、配列番号６）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ５のアイソフォームは、配列番号２３に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム１、配列番号２４に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム２、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム３、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム４、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム５、及び配列番号２８に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム６を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ５は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ５は配列番号２９に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。Ｍ１マクロファージはＩＲＦ５を上方調節することが明らかにされている。

【0053】

ＩＲＦ１及びＩＲＦ８も、ＩＦＮγなどの炎症誘発性シグナルによるマクロファージの活性化を含む、骨髄系細胞の発生及び機能に極めて重要な役割を果たす、Ｄｒｏｒ Ｎら、（２００７）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４（４）：３３８～３４６頁。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ１は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ１は、配列番号３０に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ１は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ１は、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ８は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ８は、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ８は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ８は、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。

【0054】

ＩＲＦ３はＩＲＦ１及びＩＲＦ２の相同体である。ＩＲＦ３は、ＮＥＳ、ＤＢＤ、Ｃ末端ＩＲＦ会合ドメイン及びいくつかの調節リン酸化部位を含む、いくつかの機能的ドメインを含有する。ＩＲＦ３は、セリン／スレオニンリン酸化すると、転写共役因子であるＣＲＥＢ結合タンパク質と複合体を形成する不活性細胞質形態で見出される。この複合体は核に移動し、ＩＦＮ－α及び－β、並びに他のインターフェロン誘導遺伝子の転写を活性化する。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ３のアイソフォームは、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３－１）、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３－２）、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３－３）、アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３－４）、及びアイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３－５）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１は、配列番号３１に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ３は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ３は、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。

【0055】

ＩＲＦ７は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の転写活性化において役割を果たすことが明らかにされている。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ７のアイソフォーム１は、アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５－１）、アイソフォームＢ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５－２）、アイソフォームＣ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５－３）、及びアイソフォームＤ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５－４）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡは、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ７は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ７は、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。

【0056】

ＩＲＦ活性化に寄与する１つ以上のＩＲＦ突然変異体も使用してもよい。例えば、アミノ酸残基Ｓ４２５、Ｓ４２７、Ｓ４３０、Ｓ４３６をアスパラギン酸残基などのリン酸化を模倣する残基で置換するＩＲＦ５（アイソフォーム４、配列番号４）のヒト変異体３／変異体４のリン酸化模倣突然変異体（Ｃｈｅｎ Ｗら、（２００８）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１５（１１）：１２１３～１２２０頁）；アミノ酸残基Ｔ１０、Ｓ１５８、Ｓ３０９、Ｓ３１７、Ｓ４５１、及び／又はＳ４６２をアスパラギン酸残基などのリン酸化を模倣する残基で置換するＩＲＦ５（アイソフォーム２、配列番号２）のヒト変異体５のリン酸化模倣突然変異体（Ｃｈａｎｇ Ｆｏｒｅｍａｎ Ｈ－Ｃら、上記参照）；ＩＲＦ５の構成的核集積のための、ヒトＩＲＦ５アイソフォームａ（変異体１、アイソフォーム３、配列番号３）及びアイソフォームｂ（変異体２、アイソフォーム１、配列番号１）残基Ｓ１５６、Ｓ１５８及びＴ１６０からアスパラギン酸残基などのリン酸化を模倣する残基への突然変異（Ｌｉｎ Ｒら、（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（４）：３０８８～３０９５頁）；並びにＩＲＦ３のアミノ酸残基Ｓ３９６をアスパラギン酸などのリン酸化を模倣する残基で置換するＩＲＦ３リン酸化模倣突然変異体（Ｃｈｅｎ Ｗら、上記参照）。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ７／ＩＲＦ３の融合タンパク質は、ＩＲＦ３会合ドメイン（配列番号１５）において４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ（Ｄ）突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位置を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記参照；Ｌｉｎら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：６３４２～６３５３頁）。特定の実施形態において、ＩＲＦ３会合ドメインにおいて４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＤ突然変異を含むマウスＩＲＦ７／ＩＲＦ３の融合タンパク質は、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列によりコードされている。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ８突然変異体は、アミノ酸残基３１０のリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）での置換を含む（配列番号１７）。特定の実施形態において、アミノ酸残基３１０のＫのＲでの置換を含むマウスＩＲＦ８突然変異体は、配列番号３９に示されるヌクレオチド配列によりコードされている。主にＫ３１０でＩＲＦ８に結合している低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）は、ＩＲＦ８応答性遺伝子の活性化を阻害する。セントリン特異的プロテアーゼ１（ＳＥＮＰ１）はＳＵＭＯ２／３を標的にする。ＳＥＮＰ１の活性は、ＩＲＦ８（及び他のタンパク質）を「脱ＳＵＭＯ化し」、ＩＲＦ８にＭ１マクロファージ分化の抑制因子から活性化因子に（直接的に及びトランスアクチベーション活性を通じて）進ませる。Ｋ３１０残基の突然変異によりＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げると、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写が２～５倍増加する（Ｃｈａｎｇ Ｔ－Ｈら、（２０１２）上記参照）。

【0057】

本開示の特定の実施形態は、操作されたＩＲＦ転写因子を含む。特定の実施形態において、操作されたＩＲＦ転写因子は、機能する自己抑制的ドメインを欠き、したがって、フィードバック不活性化に非感受性であるＩＲＦを含む（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：２６２２頁）。例えば、活性の増加が２～３倍であるヒトＩＲＦ５は、ヒトＩＲＦ５タンパク質のアミノ酸４８９～５３９を欠失させることにより得ることができる（Ｂａｒｎｅｓら、（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２：５７２１～５７４０頁）。特定の実施形態において、Ｍ２表現型を促進する転写因子である、ＩＲＦ４の自己抑制的ドメインを欠失させる又は突然変異させると、自己免疫疾患を治療するという文脈においてさらに活性なＩＲＦ４を作成することができる。特定の実施形態において、ＩＲＦの自己抑制的ドメインは、ＩＲＦタンパク質のカルボキシ末端で見出せる。特定の実施形態において、操作されたＩＲＦ転写因子は、核においてＩＲＦを捕捉し、したがって、転写を増強する１つ以上の機能する核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠くＩＲＦを含む。例えば、ヒトＩＲＦ５の核集積は、２つのロイシン残基をアラニンで置き換える（Ｌ１５７Ａ／Ｌ１５９Ａ）ことによってヒトＩＲＦ５のＮＥＳを突然変異することにより達成可能である（Ｌｉｎら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：６３４２～６３５３頁）。特定の実施形態において、操作されたＩＲＦ転写因子は、１つ以上のＩＲＦの融合体、１つ以上のＩＲＦの断片の融合体、及び突然変異したＩＲＦの融合体を含む。

【0058】

ＮＦκＢも、マクロファージＭ１活性化に関係する重要な転写因子である。ＮＦκＢは、ＴＮＦα、ＩＬ１Ｂ、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ－２）、ＩＬ－６、及びＩＬ１２ｐ４０を含む多数の炎症性遺伝子の発現を調節する。ＮＦκＢ活性は、カッパＢキナーゼ（ＩＫＫ）三量体複合体（２つのキナーゼ、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、及び調節タンパク質、ＩＫＫγ）の阻害因子の活性化を経て調節される。上流シグナルがＩＫＫ複合体で収束すると、これらのシグナルは先ずリン酸化を経てＩＫＫβキナーゼを活性化し、活性化されたＩＫＫβはカッパＢの阻害因子（Ｉ－κＢ）である、阻害性分子をさらにリン酸化する。これにより、Ｉ－κＢがプロテアソーム分解され、ＮＦκＢ／Ｉ－κＢ複合体からＮＦκＢ ｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体が放出される。次に、ＮＦκＢ ｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体は核に移動されて、炎症性遺伝子のプロモーターに結合する。

【0059】

ＩＫＫβは、ＮＦκＢ並びにＩＲＦ５などの他の転写因子に対する活性化キナーゼである。ＩＫＫβは同様に、ＦＯＸＯ３、ＮＣＯＡ３、ＢＣＬ１０、ＩＲＳ１、ＮＥＭＯ／ＩＫＢＫＧ、ＮＦκＢサブユニットＲＥＬＡ及びＮＦＫＢ１を含む他のいくつかのシグナル伝達経路成分、並びにＩＫＫ関連キナーゼＴＢＫ１及びＩＫＢＫＥをリン酸化する。特定の実施形態において、ヒトＩＫＫβのアイソフォームは、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｏ１４９２０－１、配列番号１８）、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｏ１４９２０－２、配列番号１９）、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｏ１４９２０－３、配列番号２０）、アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｏ１４９２０－４、配列番号２１）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＫＫβのアイソフォームは、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム１、配列番号４１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム２、配列番号４２に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム３、配列番号４３に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム４を含む。特定の実施形態において、マウスＩＫＫβは配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＫＫβは配列番号４４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。

【0060】

示されるように、低酸素も、低酸素誘導性因子ＨＩＦ－１α及びＨＩＦ－２αを通じてマクロファージ極性化に影響を及ぼす。ＨＩＦ－１αは、ＮＯＳ２発現を調節しＭ１表現型の出現を支援し、ＨＩＦ－２αはＡｒｇ１発現を調節してＭ２表現型の出現を支援する（Ｔａｋｅｄａ Ｎら、（２０１０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２４：４９１～５０１頁）。

【0061】

【表2】

【0062】

本開示は、ＩＲＦを活性化して、腫瘍殺滅のための活性化状態へのＴＡＭ再プログラミングをもたらすことができる１種以上の分子と一緒のＩＲＦ転写因子の共発現を提供する。特定の実施形態において、共発現戦略は、ＩＲＦ５とＩＫＫβの共発現；ＩＲＦ５とＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ－１）、ＴＮＦ受容体会合因子６（ＴＲＡＦ６）アダプター、受容体相互作用タンパク質２（ＲＩＰ２）キナーゼ、及び／又はＮＦκＢキナーゼε（ＩＫＫε）の共発現（Ｃｈａｎｇ Ｆｏｒｅｍａｎ Ｈ－Ｃら、（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（３）：ｅ３３０９８）；ＩＲＦ５とタンパク質キナーゼＤＮＡ－ＰＫの共発現（Ｒｙｚｈａｋｏｖ Ｇら、（２０１５）Ｊ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ＆Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ３５（２）：７１～７８頁）；ＩＲＦ５とタンパク質キナーゼチロシンキナーゼＢＣＲ－ＡＢＬの共発現（Ｍａｓｓｉｍｏ Ｍら、（２０１４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３５（５）：１１３２～１１４３頁）；並びにＩＲＦ５又はＩＲＦ８とＣＯＰ９シグナロソームの１つ以上の成分の共発現（Ｋｏｒｃｚｅｎｉｅｗｓｋａ Ｊら、（２０１３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３３（６）：１１２４～１１３８頁；Ｃｏｈｅｎ Ｈら、（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（５０）：３９０８１～３９０８９頁）を含む。

【0063】

（３）標的化された抗原及び関連結合ドメイン。本明細書で使用される場合、抗原とは目的の細胞型により発現されるタンパク質のことである。目的の細胞又は目的の細胞型は、免疫系により認識され破壊されることができる任意の予め定義された細胞型を含む。一部の実施形態では、本発明の目的の細胞型は、対象の健康、生存率、又は福祉に対して有害な、害を及ぼす又は他の点で望ましくない効果を有する（又はそのような効果を有する素因になる）細胞型である。目的の細胞は、例えば、（ｉ）がん性の又はウイルスなどの病原体に感染している真核細胞、及び（ｉｉ）ある特定の細菌、真菌又は酵母などの原核細胞を含むことができる。目的の細胞は、害を及ぼす及び／又は自己免疫を引き起こす場合がある自己反応性細胞も含む。目的のそのような自己反応性細胞は、例えば、自己反応性免疫細胞、自己反応性リンパ球、自己反応性Ｔ細胞、自己反応性Ｂ細胞を含む。目的の自己反応性細胞は、制御性Ｔ細胞などの免疫応答を制御するように発生中にプログラムされる自己反応性細胞でもよい。自己反応性細胞は、例えば、不適切な自己抗原を認識し結合することにより対象中での自己免疫状態に寄与する。一部の実施形態では、局在性の又は循環している細胞集団で大きな比率を占めると害を与える場合がある細胞型は、本発明に従った目的の細胞型でもよい。例えば、炎症性反応は免疫細胞の過剰出現を生じることがあり、その場合、目的の細胞は、例えば、好中球又はマスト細胞を含んでもよい。さらに、一部の例では、目的の細胞は、治療の一部として以前投与された細胞、例えば、遺伝的に改変された細胞（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞）でもよい。

【0064】

特定の実施形態では、抗原は目的の細胞により優先的に発現される。「優先的に発現される」とは、他の細胞型と比べた場合、目的の細胞上でのほうが抗原が高いレベルで見い出されることを意味する。一部の例では、抗原は目的の細胞によってのみ発現される。他の例では、抗原は目的の細胞上で他の細胞型よりも少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％多く発現される。

【0065】

以下は、異なるがんタイプと関連するがん細胞抗原の例を提供する。

【0066】

【表3】

【0067】

がん細胞抗原に対する例示的結合ドメインは、新規に作製するか、又は選択されたがん抗原に特異的である既知の抗体若しくは結合ドメインから導き出すことができる。

【0068】

上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ；ＥＧＰ－４０、Ｔｒｏｐ－１、１７－１Ａ、ＫＳＡ、ＫＳ１／４、ＡＵＡ１、ＧＡ７３３－２、及びＣＤ３２６とも呼ばれる）は、卵巣がんを含むある特定のがんで過剰発現される。上皮細胞接着分子は、２つのＥＧＦ様リピートのある細胞外ドメインを有する４０ｋｄ表面糖タンパク質である。ＥｐＣａｍを標的にする抗体は市販されている（Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２０１０年、２０３（６）：５８２．ｅ１－５８２ｅ７）。ＥｐＣａｍに結合する例示的抗体は、ＭＴ２０１（アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ））及びエドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）を含む。

【0069】

チロシン関連タンパク質１又はｇｐ７５糖タンパク質（ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５）は、悪性メラニン細胞及び黒色腫進行に関与しているメラノソームタンパク質である（Ｇｈａｎｅｍら、Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２０１１年４月；５（２）：１５０～１５５頁）。ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５に結合する例示的抗体は、ＴＡ９９（Ｓａｅｎｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６８（２３）：９８８４～９８９１頁、２００８年）、２０Ｄ７（Ｐａｔｅｌら、ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ、１６（３－４）：１２７～１０３６頁、２００７年）、及びフランボツマブ（ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）（ＩＭＣ－２０Ｄ７Ｓ）（Ｋｈａｌｉｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２（２１）：５２０４～５２１０頁、２０１６年）を含む。

【0070】

特定の実施形態では、ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５に結合する抗体は、米国特許第７９５１３７０号に記載されている。特定の実施形態では、ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５に結合する抗体は、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号８４）、ＤＡＳＮＲＡＴを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号８５）、ＱＱＲＳＮＷＬＭＹＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号２５３）、ＧＹＴＦＴＳＹＡＭＮを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２５４）、ＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２５５）、ＲＹＳＳＳＷＹＬＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２５６）を含む。

【0071】

特定の実施形態では、ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５に結合する抗体は、ＲＡＳＧＮＩＹＮＹＬＡを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号２５７）、ＤＡＫＴＬＡＤを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号２５８）、ＱＨＦＷＳＬＰＦＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号２５９）、ＧＦＮＩＫＤＹＦＬＨを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２６０）、ＷＩＮＰＤＮＧＮＴＶＹＤＰＫＦＱＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２６１）、ＤＹＴＹＥＫＡＡＬＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２６２）を含む。

【0072】

特定の実施形態では、ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５結合抗体は、配列：

【0073】

【化1】

を含む可変軽鎖及び配列

【0074】

【化2】

を含む可変重鎖又は配列

【0075】

【化3】

を含む可変重鎖を含む。

【0076】

メソセリンに結合する結合ドメインのある例示的抗体は、アネツマブ（ａｎｅｔｕｍａｂ）、ラブタンシン（ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、アマツキシマブ（Ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）、及びＨＮ１を含む。

【0077】

特定の実施形態では、ＨＮ１抗体は、ＲＡＳＥＧＩＹＨＷＬＡを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号５５）、ＫＡＳＳＬＡＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号５８）、ＱＱＹＳＮＹＰＬＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号６１）、ＴＹＹＭＱを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号６４）、ＶＩＮＰＳＧＶＴＳＹＡＱＫＦＱＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号７１）、及びＷＡＬＷＧＤＦＧＭＤＶを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号７３）を含む。

【0078】

米国特許第８２０６７１０号は、配列

【0079】

【化4】

を含む可変軽鎖
及び配列

【0080】

【化5】

を含む可変重鎖を含むメソセリン結合抗体並びに配列

【0081】

【化6】

を含む可変軽鎖及び配列

【0082】

【化7】

を含む可変重鎖を有する抗体を記載している。

【0083】

追加のメソセリン結合抗体は、米国特許第８９１１７３２号、米国特許第７０８１５１８号、米国特許第８３５７７８３号及び米国特許第８４２５９０４号に記載されている。

【0084】

ＭＵＣ１６結合ドメインは、抗体オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、オバレックス（ｏｖａｒｅｘ）、及びアバゴモマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）から導き出すことができる。米国特許第７７２３４８５号は、配列

【0085】

【化8】

を含む可変軽鎖及び配列

【0086】

【化9】

を含む可変重鎖を含むＭＵＣ１６結合抗体を記載している。

【0087】

国際公開第２０１６１４９３６８号は、ＳＥＤＩＹＳＧを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１１７）、ＧＡＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＧＹＳＹＳＳＴＬを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１１８）を含む可変軽鎖、ＴＬＧＭＧＶＧを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１１９）、ＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＮＰＡＬＫＳを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１２０）、及びＩＧＴＡＱＡＴＤＡＬＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１２１）を含む可変重鎖を含むＭＵＣ１６結合抗体を記載している。

【0088】

葉酸受容体結合抗体はファルレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）を含む。特定の実施形態では、ファルレツズマブは米国特許第９１３３２７５号に記載されている。特定の実施形態では、ファルレツズマブは、ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１２２）、ＲＡＳＮＬＥＡを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号１２３）、及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１２４）を含む可変軽鎖、並びにＧＹＦＭＮを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１２５）、ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１２６）、及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１２７）を含む可変重鎖を含む。追加のＦＯＬＲ結合抗体は、米国特許第１０１０１３４３号、米国特許第８３８８９７２号、及び米国特許第８７０９４３２号に記載されている。

【0089】

例示的ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）を含む。特定の実施形態では、セツキシマブは米国特許第７５９８３５０号に記載されている。特定の実施形態では、セツキシマブは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号８４）、ＤＡＳＮＲＡＴを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号８５）、及びＨＱＹＧＳＴＰＬＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１３０）を含む可変軽鎖、並びにＳＧＤＹＹＷＳを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１３１）、ＹＩＹＹＳＧＳＴＤＹＮＰＳＬＫＳを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１３２）、及びＶＳＩＦＧＶＧＴＦＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１３３）を含む可変重鎖を含む。

【0090】

追加のＥＧＦＲ結合ドメインは、米国特許第７２４７３０１号、米国特許第７７２３４８４号、米国特許第７１３２５１１号、及び米国特許第５８４４０９３号に記載されている。米国特許第７７２３４８４号は特に、配列

【0091】

【化10】

を含む可変軽鎖及び配列

【0092】

【化11】

を含む可変重鎖を含むＥＧＦＲ結合抗体を記載している。

【0093】

ＣＤ１９結合ドメインは、抗体ＦＭＣ６３、ＳＪ２５Ｃ１及びＨＤ３７内に見い出される（ＳＪ２５Ｃ１：Ｂｅｊｃｅｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５年、ＰＭＩＤ ７５３８９０１；ＨＤ３７：Ｐｅｚｕｔｔｏら、ＪＩ １９８７年、ＰＭＩＤ ２４３７１９９）。特定の実施形態では、ＦＭＣ６３ ＣＤＲは、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１３６）、ＳＲＬＨＳＧＶを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号１３７）、ＧＮＴＬＰＹＴＦＧを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１３８）、ＤＹＧＶＳを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１３９）、ＶＴＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１４０）、及びＹＡＭＤＹＷＧを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１４１）を含む。

【0094】

ＲＯＲＩに特異的ないくつかの抗体も当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際公開第２００８０７６８６８号、国際公開第２００８１０３８４９号、国際公開第２０１００８０６９号、国際公開第２０１０１２４１８８号、国際公開第２０１１０７９９０２号、国際公開第２０１１０５４００７号、国際公開第２０１１１５９８４７号、国際公開第２０１２０７６０６６号、国際公開第２０１２０７６７２７号、国際公開第２０１２０４５０８５号、及び国際公開第２０１２０９７３１３号を参照されたい。

【0095】

ＲＯＲ１に結合する抗体の特定の例は、Ｒ１１、Ｒ１２、２Ａ２、及びＹ３１を含む。

【0096】

Ｒ１１抗体は、ＱＡＳＱＳＩＤＳＮＬＡを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１４２）、ＲＡＳＮＬＡＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号１４３）、ＬＧＧＶＧＮＶＳＹＲＴＳを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１４４）、ＤＹＰＩＳを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１４５）、ＦＩＮＳＧＧＳＴＷＹＡＳＷＶＫＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１４６）、及びＧＹＳＴＹＹＣＤＦＮＩを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１４７）を含む。

【0097】

Ｒ１２抗体は、ＴＬＳＳＡＨＫＴＤＴＩＤを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１４８）、ＧＳＹＴＫＲＰを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号１４９）、ＧＡＤＹＩＧＧＹＶを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１５０）、ＡＹＹＭＳを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１５１）、ＴＩＹＰＳＳＧＫＴＹＹＡＴＷＶＮＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１５２）、及びＤＳＹＡＤＤＧＡＬＦＮＩを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１５３）を含む。

【0098】

２Ａ２抗体は、ＫＡＳＱＮＶＤＡＡＶＡを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１５４）、ＳＡＳＮＲＹＴを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号１５５）、ＱＱＹＤＩＹＰＹＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１５６）、ＤＹＥＭＨを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１５７）、ＡＩＤＰＥＴＧＧＴＡＹＮＱＫＦＫＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１５８）、及びＹＹＤＹＤＳＦＴＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１５９）を含む。

【0099】

Ｙ３１抗体は、ＱＡＳＱＳＩＧＳＹＬＡを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１６０）、ＹＡＳＮＬＡＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号１６１）、ＬＧＳＬＳＮＳＤＮＶを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１６２）、ＳＨＷＭＳを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１６３）、ＩＩＡＡＳＧＳＴＹＹＡＮＷＡＫＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１６４）、及びＤＹＧＤＹＲＬＶＴＦＮＩを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１６５）を含む。

【0100】

Ｈｅｒ２結合ドメインは４Ｄ５抗体から導き出すことができる。４Ｄ５抗体は、ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１６６）、ＹＳＡＳＦＬＥＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号１６７）、ＱＱＨＹＴＴＰＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１６８）、ＳＧＦＮＴＫＤＴＹＩＨＷを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１６９）、ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１７０）、及びＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＶを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１７１）を含む。

【0101】

ＰＤ－Ｌ１結合抗体は３Ｇ１０抗体及び米国特許出願公開第２０１６／０２２２１１７号に記載される抗体を含む。特定の実施形態では、３Ｇ１０抗体に由来する結合ドメインは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１７２）、ＤＡＳＮＲＡＴを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号８５）、ＱＱＲＳＮＷＰＲＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１７３）、ＤＹＧＦＳを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１７４）、ＷＩＴＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１７５）、及びＤＹＦＹＧＭＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１７６）を含む。

【0102】

ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１７７）、ＳＡＳＦＬＹＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号１７８）、ＱＱＹＬＹＨＰＡＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１７９）、ＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１８０）、ＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１８１）、及びＲＨＷＰＧＧＦＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１８２）又は（ｉｉ）ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１８３）、ＤＶＳＮＲＰＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号１８４）、ＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１８５）、ＳＧＦＴＦＳＳＹＩＭＭを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１８６）、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１８７）、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１８８）も含むことができる。

【0103】

ＰＤ－Ｌ１結合ドメインのある追加の抗体は、アテゾレイツマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、及びデュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）を含む。

【0104】

特定の実施形態では、抗原はウイルス感染細胞により発現される。例示的ウイルスは、アデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、ハンタウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、ロタウイルス、海綿状ウイルス（ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓｅｓ）又はトガウイルスを含む。追加の実施形態では、ウイルス抗原は、ＣＭＶ、かぜウイルス、エプスタインバーウイルス、フルウイルス、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、はしかウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス又は西ナイルウイルスにより発現されるペプチドを含む。

【0105】

さらなる特定の例として、コロナウイルス抗原はスパイク（Ｓ）タンパク質を含み、サイトメガロウイルス抗原は外被糖タンパク質Ｂ及びＣＭＶ ｐｐ６５を含み；エプスタインバー抗原はＥＢＶ ＥＢＮＡＩ、ＥＢＶ Ｐ１８、及びＥＢＶ Ｐ２３を含み；肝炎抗原は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、及びＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのプレ－Ｓ抗原、ＨＢＣＡＧ ＤＥＬＴＡ、ＨＢＶ ＨＢＥ、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ、ＨＣＶ ＮＳ３並びにＨＣＶ ＮＳ４を含み；単純ヘルペスウイルス抗原は初期タンパク質及び糖タンパク質Ｄを含み；ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ ｇｐ３２、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ｇｐ１６０、ＨＩＶ Ｐ１７／２４、ＨＩＶ Ｐ２４、ＨＩＶ Ｐ５５ ＧＡＧ、ＨＩＶ Ｐ６６ ＰＯＬ、ＨＩＶ ＴＡＴ、ＨＩＶ ＧＰ３６、Ｎｅｆタンパク質及び逆転写酵素などのｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物を含み；インフルエンザ抗原はヘマグルチニン及びノイラミニダーゼを含み；日本脳炎ウイルス抗原はタンパク質Ｅ、Ｍ－Ｅ、Ｍ－Ｅ－ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１－ＮＳ２Ａ及び８０％Ｅを含み；はしか抗原は、はしかウイルス融合タンパク質を含み、狂犬病抗原は、狂犬病糖タンパク質及び狂犬病核タンパク質を含み；呼吸器多核体ウイルス抗原はＲＳＶ融合タンパク質及びＭ２タンパク質を含み；ロタウイルス抗原はＶＰ７ｓｃを含み；風疹抗原はタンパク質Ｅ１及びＥ２を含み；並びに水痘帯状疱疹ウイルス抗原はｇｐＩ及びｇｐＩＩを含む。ウイルス抗原のさらなる例についてはＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、編者Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．及びＫｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年）を参照されたい。

【0106】

特定の実施形態では、抗原は細菌感染に関連する細胞により発現される。例示的細菌は、炭疽菌；グラム陰性杆菌、クラミジア、ジフテリア、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ菌、マラリア、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、百日咳毒素、肺炎球菌、リケッチア、ブドウ球菌、連鎖状球菌及び破傷風を含む。

【0107】

細菌抗原の特定の例として、炭疽菌抗原は炭疽防御抗原を含み；グラム陰性杆菌抗原はリポ多糖を含み；ヘモフィリス・インフルエンザ抗原は莢膜多糖を含み；ジフテリア抗原はジフテリア毒素を含み；マイコバクテリウム・ツベルクローシス抗原は、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質及び抗原８５Ａを含み；百日咳毒素抗原は、ヘマグルチニン、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３及びアデニル酸シクラーゼを含み；肺炎球菌抗原はニューモリシン及び肺炎球菌莢膜多糖を含み；リケッチア抗原はｒｏｍｐＡを含み；連鎖球菌抗原はＭタンパク質を含み；並びに破傷風抗原は破傷風毒素を含む。

【0108】

スーパーバグ。特定の実施形態では、リンパ球は改変されて多剤耐性「スーパーバグ」を標的にする。スーパーバグの例は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クリブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）菌種を含む）を含む。

【0109】

特定の実施形態では、抗原は真菌感染に関連する細胞により発現される。例示的真菌は、カンジダ（ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコックス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、リーシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、プラスモディウム属（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、原生生物（ｐｒｏｔｏｚｏａ）、寄生生物（ｐａｒａｓｉｔｅｓ）、シストソーマ属（ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｅ）、ティニア（ｔｉｎｅａ）、トキソプラズマ（ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、及びトリパノソーマ・クルーズ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）を含む。

【0110】

真菌抗原のさらなる特定の例として、コクシジオイデス属抗原は、スフェルール抗原を含み；クリプトコックス抗原は莢膜多糖を含み；ヒストプラズマ属抗原は熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）を含み；リーシュマニア抗原はｇｐ６３及びリポホスホグリカンを含み；プラスモディウム・ファルスィパラム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原はメロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、ガメトサイト／ガメート表面抗原、血液段階抗原ｐｆ １５５／ＲＥＳＡを含む原生生物及び他の寄生生物抗原を含み；シストソーマ属抗原は、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ及びパラミオシンを含み；ティニア真菌抗原はトリコフィチンを含み；トキソプラズマ抗原はＳＡＧ－１及びｐ３０を含み；並びにトリパノソーマ・クルーズ抗原は７５～７７ｋＤａ抗原及び５６ｋＤａ抗原を含む。

【0111】

特定の実施形態では、抗原は、自己免疫又はアレルギー状態に関連する細胞により発現される。例示的自己免疫状態は、急性壊死性出血性脳疾患、アレルギー性喘息、円形脱毛症、貧血症、アフタ性潰瘍、関節炎（関節炎リウマチ、若年性関節炎リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、喘息、自己免疫性甲状腺炎、セリアック病、結膜炎、クローン病、皮膚エリテマトーデス、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、糖尿病、真性糖尿病、らい性結節性紅斑、角結膜炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含むスティーブンスジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、膣炎及びウェゲナー肉芽腫症を含む。

【0112】

自己免疫抗原の例は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、未変性ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、サイログロブリン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体を含む。アレルギー抗原の例は、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ドクムギ花粉抗原などの花粉抗原、動物由来抗原（イエダニ抗原及びネコ抗原などの）、組織適合性抗原、並びにペニシリン及び他の治療薬を含む。

【0113】

目的の細胞により発現される抗原に対する結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）由来でも可能である。結合ドメインとしての使用のために特定のＴＣＲを同定し選択する方法は数多く存在する。例えば、特定の抗原断片に結合する数多くのＴＣＲの配列は公知であり公開されている。

【0114】

有用なＴＣＲは、特定の抗原に結合するＴ細胞を単離しＴＣＲ鎖をシーケンシングすることにより同定することもできる。例として、抗原特異的Ｔ細胞は、抗原／ＭＨＣ複合体の存在下で単離されたヒトＴ細胞をインビトロ培養することにより誘導してもよい。抗原／ＭＨＣ複合体に結合するＴＣＲをコードするＴＣＲ遺伝子は、例えば、ＴＣＲα－鎖遺伝子及びＴＣＲβ－鎖遺伝子に特異的である配列に対応するプライマーを使用する５’ＲＡＣＥ手順により容易にクローニングすることができる。

【0115】

特定の実施形態では、シーケンシングに続いてＴＣＲ鎖を対にする（すなわち、対合鎖分析を実施する）ことが必要な場合がある。単離されたα及びβ鎖を対にするためには種々の方法を利用できる。特定の実施形態では、例えば、α及びβ鎖対合情報が、仮に単細胞からシーケンシングする場合などの手順で失われていない実施形態では、シーケンシング後対合は不必要であるか、又は比較的簡単である場合がある。鎖対合は、マルチウェルシーケンシングを使用して実施してもよい。ＰａｉｒＳＥＱ（登録商標）（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）などのアッセイも開発されている。

【0116】

本開示の文脈内で使用することができるＴＣＲの特定の例は、例えば、国際公開第２０１８／１２９２７０号；国際公開第２０１７／１１２９４４号；国際公開第２０１１／０３９５０７号；米国特許第８，００８，４３８号；米国特許出願公開第２０１６／００８３４４９号；米国特許出願公開第２０１５／０２４６９５９号；Ｓｔｒｏｍｎｅｓら、（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ２８（５）：６３８～６５２頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９：１５４２～１５４６頁）；Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａら、（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１４（１２）：１３９０～１３９５頁）；及びＲｏｂｂｉｎｓら、（２００８）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８０（９）：６１１６～６１３１頁を参照されたい。

【0117】

（４）免疫細胞活性化エピトープ及び関連結合ドメイン。局所的活性化のために標的にすることができる免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。

【0118】

Ｔ細胞活性化は、２つの異なるシグナル：抗原依存性一次活性化を開始しＴ細胞受容体様シグナルを提供するシグナル（一次細胞質シグナル伝達配列）及び抗原非依存性的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供するシグナル（二次細胞質シグナル伝達配列）により媒介することができる。二重特異性抗体の組合せは、結合するとＴ細胞活性化を誘導するＴ細胞活性化エピトープのいかなる組合せでも標的にすることができる。そのようなＴ細胞活性化エピトープの例は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、４－１ＢＢ（ＣＤ １３７）、ＯＸ４０、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、及びＢ７－Ｈ３を含むＴ細胞マーカー上にある。遮断することができるＴ細胞抑制受容体は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、及びＣＤ２００を含む。ＰＤ－１結合ドメインのある抗体は、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）及びニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）を含み、ＣＴＬＡ－４ブロッキング抗体はイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）を含む。

【0119】

ＣＤ３はＴ細胞受容体の一次シグナル伝達エレメントであり、すべての成熟Ｔ細胞上で発現される。ＣＤ３に対する結合ドメインは、例えば、ＯＫＴ３、２０Ｇ６－Ｆ３、４Ｂ４－Ｄ７、４Ｅ７－Ｃ９、及び１８Ｆ５－Ｈ１０から導き出すことができる。

【0120】

ＯＫＴ３は米国特許第５，９２９，２１２号に記載されている。ＯＫＴ３抗体は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１８９）、ＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号１９０）、ＱＱＷＳＳＮＰＦＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１９１）、ＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１９２）、ＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１９３）、及びＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号１９４）を含む。

【0121】

以下の配列：

【0122】

【化12】

は、ＣＤ３に結合する能力を保持しているＯＫＴ３由来のｓｃＦｖである。この配列はＣＤ３結合ドメインとして使用してもよい。

【0123】

２０Ｇ６－Ｆ３抗体は、ＱＳＬＶＨＮＮＧＮＴＹを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号１９６）、ＫＶＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＧＱＧＴＱＹＰＦＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１９７）、ＧＦＴＦＴＫＡＷを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号１９８）、ＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号１９９）、及びＲＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２００）を含む。

【0124】

４Ｂ４－Ｄ７抗体は、ＱＳＬＶＨＤＮＧＮＴＹを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号２０１）、ＫＶＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＧＱＧＴＱＹＰＦＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１９７）、ＧＦＴＦＳＮＡＷを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２０２）、ＩＫＡＲＳＮＮＹＡＴを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２０３）、及びＲＧＴＹＹＡＳＫＰＦＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２０４）を含む。

【0125】

４Ｅ７－Ｃ９抗体は、ＱＳＬＥＨＮＮＧＮＴＹを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号２０５）、ＫＶＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＧＱＧＴＱＹＰＦＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号１９７）、ＧＦＴＦＳＮＡＷを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２０２）、ＩＫＤＫＳＮＮＹＡＴを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２０６）、及びＲＹＶＨＹＧＩＧＹＡＭＤＡを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２０７）を含む。

【0126】

１８Ｆ５－Ｈ１０抗体は、ＱＳＬＶＨＴＮＧＮＴＹを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号２０８）、ＫＶＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＧＱＧＴＨＹＰＦＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号２０９）、ＧＦＴＦＴＮＡＷを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２１０）、ＫＤＫＳＮＮＹＡＴを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２１１）、及びＲＹＶＨＹＲＦＡＹＡＬＤＡを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２１２）を含む。

【0127】

抗ＣＤ３抗体、結合ドメイン、及びＣＤＲの追加の例は、国際公開第２０１６／１１６６２６号に見い出すことができる。ＴＲ６６を使用してもよい。

【0128】

ＣＤ２８はヒトの末梢Ｔ細胞の８０％上に存在する表面糖タンパク質であり、休止Ｔ細胞と活性化Ｔ細胞の両方上に存在する。ＣＤ２８はＢ７－１（ＣＤ８０）及びＢ７－２（ＣＤ８６）に結合し、既知の共刺激分子のなかで最も強力である（Ｊｕｎｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １５：３２１頁（１９９４）；Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１９１頁（１９９３））。

【0129】

特定の実施形態では、ＣＤ２８結合ドメインは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又は抗体ＴＧＮ１４１２、９Ｄ７、９．３、ＫＯＬＴ－２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、及びＥＸ５．３Ｄ１０から導き出すことができる。

【0130】

特定の実施形態では、ＴＧＮ１４１２由来の結合ドメインは、ＨＡＳＱＮＩＹＶＷＬＮを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号２１３）、ＫＡＳＮＬＨＴを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号２１４）、ＱＱＧＱＴＹＰＹＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号２１５）、ＳＹＹＩＨを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２１６）、ＣＩＹＰＧＮＶＮＴＮＹＮＥＫＦＫＤを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２１７）、及びＳＨＹＧＬＤＷＮＦＤＶを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２１８）を含む。

【0131】

特定の実施形態では、ＣＤ８０／ＣＤ８６結合ドメインは、米国特許第７，５３１，１７５号に記載される１つ以上のモノクローナル抗体に由来する。特定の実施形態では、ＣＤ８０／ＣＤ８６結合ドメインは、ＳＶＳＳＳＩＳＳＳＮＬＨを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号２１９）、ＧＴＳＮＬＡＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号２２０）、ＱＱＷＳＳＹＰＬＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号２２１）、ＤＹＹＭＨを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２２２）、ＷＩＤＰＥＮＧＮＴＬＹＤＰＫＦＱＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２２３）、及びＥＧＬＦＦＡＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２２４）を含む。

【0132】

活性化Ｔ細胞は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を発現する。４－１ＢＢは、ＣＤ１３７又はＴＮＦＳＦ９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ０７０１１）とも呼ばれるが、Ｔ細胞共刺激受容体である。

【0133】

４－１ＢＢ結合ドメインは、米国特許第９，３８２，３２８Ｂ２号に記載されるモノクローナル抗体から導き出すことができる。

【0134】

特定の実施形態では、４－１ＢＢ結合ドメインは、ＲＡＳＱＳＶＳを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号２２５）、ＡＳＮＲＡＴを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号２２６）、ＱＲＳＮＷＰＰＡＬＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号２２７）、ＹＹＷＳを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２２８）、ＩＮＨを含むＣＤＲＨ２配列、及びＹＧＰＧＮＹＤＷＹＦＤＬを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２２９）を含む。

【0135】

特定の実施形態では、４－１ＢＢ結合ドメインは、ＳＧＤＮＩＧＤＱＹＡＨを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号２３０）、ＱＤＫＮＲＰＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号２３１）、ＡＴＹＴＧＦＧＳＬＡＶを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号２３２）、ＧＹＳＦＳＴＹＷＩＳを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２３３）、ＫＩＹＰＧＤＳＹＴＮＹＳＰＳを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２３４）、及びＧＹＧＩＦＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２３５）を含む。

【0136】

細胞傷害性Ｔ細胞は腫瘍細胞を破壊する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するのでＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。これらの細胞は、ＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによりその標的を認識し、ＭＨＣクラスＩは身体のほぼすべての細胞の表面に存在する。

【0137】

特定の実施形態では、ＣＤ８結合ドメインはＯＫＴ８抗体から導き出すことができる。ＯＫＴ８抗体は、ＲＴＳＲＳＩＳＱＹＬＡを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号２３６）、ＳＧＳＴＬＱＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号２３７）、ＱＱＨＮＥＮＰＬＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号２３８）、ＧＦＮＩＫＤを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２３９）、ＲＩＤＰＡＮＤＮＴを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２４０）、及びＧＹＧＹＹＶＦＤＨを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２４１）を含む。

【0138】

特定の実施形態では、免疫細胞は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ及び／又はＣＤ２００などの抑制性エピトープの活性を抑制することにより活性化することができる。

【0139】

ＰＤ－１は、ＣＤ２７９（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ１５１１６）とも呼ばれるが、Ｔ細胞免疫応答を制御することに関与する阻害性細胞表面受容体である。特定の実施形態では、ＰＤ－１結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１１／０２７１３５８号に記載されるモノクローナル抗体から導き出すことができる。特定の実施形態では、ＰＤ－１結合ドメインは、ＲＡＳＱＳＶＳＴＳＧＹＳＹＭＨを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号２４２）、ＦＧＳＮＬＥＳを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号２４３）、ＱＨＳＷＥＩＰＹＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号２４４）、ＳＳＷＩＨを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２４５）、ＹＩＹＰＳＴＧＦＴＥＹＮＱＫＦＫＤを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２４６）、及びＷＲＤＳＳＧＹＨＡＭＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２４７）を含む。

【0140】

特定の実施形態では、ＰＤ－１結合ドメインは、米国特許出願公開第２００９０２１７４０１号に記載されるモノクローナル抗体から導き出すことができる。特定の実施形態では、ＰＤ－１結合ドメインは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡを含むＣＤＲＬ１配列（配列番号８４）、ＤＡＳＮＲＡＴを含むＣＤＲＬ２配列（配列番号８５）、ＱＱＳＳＮＷＰＲＴを含むＣＤＲＬ３配列（配列番号２４８）、ＮＳＧＭＨを含むＣＤＲＨ１配列（配列番号２４９）、ＶＬＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧを含むＣＤＲＨ２配列（配列番号２５０）、及びＮＤＤＹを含むＣＤＲＨ３配列（配列番号２５１）を含む。

【0141】

ＬＡＧ３は、ＣＤ２２３（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ１８６２７）とも呼ばれるが、ＨＬＡクラスＩＩ抗原に結合し、リンパ球の活性化に関与している。特定の実施形態では、ＬＡＧ３結合ドメインは、国際公開第２０１４／００８２１８号に記載されるモノクローナル抗体から導き出すことができる。

【0142】

ＴＩＭ－３は、ＨＡＶｃｒ－２又はＴＩＭＤ－３（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ９ＴＤＱ０）としても知られるが、先天性及び適応免疫応答で抑制性の役割を果たす細胞表面受容体である。特定の実施形態では、ＴＩＭ－３結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号に記載されるモノクローナル抗体から導き出すことができる。

【0143】

ＢＴＬＡは、ＣＤ２７２（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ７Ｚ６Ａ９）としても知られるが、リンパ球の免疫応答を阻害する抑制性受容体である。特定の実施形態では、ＢＴＬＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、米国特許出願公開第２０１２／０２８８５００号に記載される１つ以上のモノクローナル抗体から導き出すことができる。

【0144】

ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ１５２（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ１６４１０）としても知られるが、Ｔ細胞応答の主要な負の制御因子である抑制性受容体である。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ－４結合ドメインは、米国特許第６，９８４，７２０号に記載されるモノクローナル抗体から導き出すことができる。

【0145】

ＣＤ２００（ｏｘ－２膜糖タンパク質としても知られる、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ４１２１７）は、抑制シグナルを免疫細胞に送達することができるタンパク質である。特定の実施形態では、ＣＤ２００結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１３／０１８９２５８号に記載される１つ以上のモノクローナル抗体から導き出すことができる。

【0146】

特定の実施形態では、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞、Ｋ細胞、及びキラー細胞としても知られる）は、二重特異性抗体により局所的活性化のための標的にされる。ＮＫ細胞は、細胞膜を破壊し他の免疫細胞を動員するサイトカインを分泌することができる顆粒を放出することによりアポトーシス又は細胞溶解を誘導することができる。

【0147】

ＮＫ細胞の表面で発現される活性化タンパク質の例は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ及び天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）ファミリーのいくつかのメンバーを含む。リガンド結合するとＮＫ細胞を活性化するＮＣＲの例は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、及びＤＮＡＭ－１を含む。

【0148】

ＮＫ細胞受容体に結合しＮＫ細胞の活性化を誘導する及び／又は増強する市販の抗体の例は、５Ｃ６及び１Ｄ１１、これらはＮＫＧ２Ｄに結合して活性化する（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（商標）Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）；ｍＡｂ３３、これはＫＩＲ２ＤＬ４に結合して活性化する（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（商標）から入手可能）；Ｐ４４－８、これはＮＫｐ４４に結合して活性化する（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（商標）から入手可能）；ＳＫ１、これはＣＤ８に結合して活性化する；及びＣＤ１６に結合して活性化する３Ｇ８を含む。追加のＮＫ細胞活性化抗体は、国際公開第２００５／０００３１７２号及び米国特許第９，４１５，１０４号に記載されている。

【0149】

ＣＤＲ配列及びセグメントとの関連で、天然に存在する抗体構造単位はテトラマーを含む。それぞれのテトラマーは、２対のポリペプチド鎖を含み、それぞれの対は１本の軽鎖及び１本の重鎖を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、抗原認識及びエピトープ結合を担当する可変領域を含む。可変領域は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの高頻度可変領域により結合されている同じ一般的構造を示す。それぞれの対の２本の鎖由来のＣＤＲはフレームワーク領域により整列されており、そのせいで特定のエピトープへの結合が可能になる。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖と重鎖可変領域の両方がドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。それぞれのドメインへのアミノ酸の割り当ては典型的には、免疫学的に関心のあるタンパク質のＫａｂａｔ配列（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７及び１９９１））、又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１～９１７頁（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７８～８８３頁（１９８９）の定義に従っている。

【0150】

（５）多特異性分子フォーマット。示されるように、多特異性免疫細胞結合分子は、治療部位での抗原（例えば、腫瘍部位でのがん抗原）と免疫細胞活性化エピトープの両方に結合し、免疫細胞を目的の細胞まで運びそれを破壊する目標を持つ。二重特異性抗体は、目的の細胞上の１つの抗原及び１つの免疫細胞活性化エピトープに結合する。三重特異性抗体は、目的の細胞上の２つの抗原及び１つの免疫細胞活性化エピトープ又は目的の細胞上の１つの抗原及び２つの免疫細胞活性化エピトープ（例えば、一次活性化シグナル（例えば、ＣＤ３）及び共刺激活性化シグナル（例えば、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ））に結合する。四重特異性抗体は、目的の細胞上の抗原と免疫細胞活性化エピトープの間の複数の組合せに分けられる、４つの異なる結合パートナーに結合することができる。特定の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。

【0151】

例示的二重特異性抗体フォーマットは、例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載されている。使用できる追加の二重特異性フォーマットの概説は、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ＆Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ｍＡｂｓ、２０１７年．９：２、１８２～２１２頁、ＤＯＩ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１６．１２６８３０７を参照されたい。Ｙｕら、（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１７）１０、１５５頁）は、Ｆｃフォーマット（クアドローマ、ノブイントゥホール（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、ＳｃＦｖ－ＩｇＧ、（ＩｇＧ）２、ナノボディ、及びＳｃＦｖ－Ｆｃ）で提供されるフォーマット及び非Ｆｃフォーマット（Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ－ＨＡＳ－ｓｃＦｖ、ＴａｎｄｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＩｍｍＴＡＣ、ドックアンドロック（ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋｓ）、及びＴａｎｄＡｂ）で提供されるフォーマットなどの、固形腫瘍の治療において特に有用な追加のフォーマットを記載している。

【0152】

上記のセクション（３）又は（４）では提供されない範囲では、追加の異なる結合ドメインは、抗体、ＴＣＲ、フィブロネクチン、アフィボディ、天然リガンド（例えば、ＣＤ２８に対するＣＤ８０及びＣＤ８６）、等などの複数の供給源から導き出すことができる。特定の実施形態では、結合ドメインは、全抗体又は抗体の結合断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｃ、及び一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又はがん抗原若しくは免疫細胞活性化エピトープ（例えば、Ｔ細胞受容体）に特異的に結合する免疫グロブリンの任意の生物学的に効果的な断片から導き出すことができる。抗体又は抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニ抗体、及び線状抗体のすべて又は一部を含む。

【0153】

ヒト起源又はヒト化抗体由来の結合ドメインを含む多特異性抗体は、ヒトにおいて免疫原性を低下させており、非ヒト抗体と比べて、非免疫原性エピトープの数が少ない。結合ドメインは一般には、ヒト対象において低減した抗原性を有するように選択される。結合ドメインは特に、選択されたがん抗原又は免疫細胞活性化エピトープに特異的に結合するいかなるペプチドでも含むことができる。結合ドメインの供給源は、種々の種由来の抗体可変領域（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖベースのグラバボディ、又は可溶性ＶＨドメイン若しくはドメイン抗体の形態が可能である）を含む。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成することができる、すなわち、これらの機能的抗体は重鎖のみのホモダイマーである（「重鎖抗体」と呼ばれる）（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１１６１頁、２００４年；Ｃｏｒｔｅｚ－Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：２８５３頁、２００４年；Ｂａｒａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１２：５８０頁、２００６年；及びＢａｒｔｈｅｌｅｍｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：３６３９頁、２００８年）。

【0154】

部分的に又は完全に合成抗体のファージディスプレイライブラリーは入手可能であり、選択されたエピトープに結合することができる抗体又はその断片を求めてスクリーニングすることができる。例えば、結合ドメインは、目的の標的に特異的に結合するＦａｂ断片を求めてＦａｂファージライブラリーをスクリーニングすることにより同定しうる（Ｈｏｅｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４頁、２００５年参照）。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーも利用可能である。さらに、便利な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウス（商標）、ＫＭマウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ、等）において免疫原として目的の標的を使用するハイブリドーマ開発のための従来の戦略を使用すれば、結合ドメインを開発することができる。特定の実施形態では、結合ドメインは、標的化がん細胞及び／又はＴ細胞により発現される選択されたエピトープに特異的に結合し、非特異的成分又は無関係な標的とは交差反応しない。同定された後は、結合ドメイン内のＣＤＲをコードするアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を単離する及び／又は決定することができる。

【0155】

結合ドメインの代替の供給源は、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列又は代替の非抗体スキャフォールドのループ領域の操作された多様なアミノ酸をコードする配列、例えば、ｓｃＴＣＲ（例えば、Ｌａｋｅら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７４５頁、１９９９年；Ｍａｙｎａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６：５１頁、２００５年；米国特許第８，３６１，７９４号参照）、ｍＡｂ^２又はＦｃａｂ（商標）（例えば、国際公開第２００７／０９８９３４号；国際公開第２００６／０７２６２０号参照）、アフィボディ、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、フィノーマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、細胞傷害性Ｔ－リンパ球関連タンパク質－４（Ｗｅｉｄｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｐｒｏｔｅｏ．１０：１５５頁、２０１３年）、及び同類の物（Ｎｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：６０１頁、１９９５年；Ｎｏｒｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７７２頁、１９９７年；Ｎｏｒｄら、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：４２６９頁、２００１年；Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７頁、２００５年；Ｂｏｅｒｓｍａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９頁、２０１１年）を含む。

【0156】

特定の実施形態では、抗体断片は多特異性抗体において１つ以上の結合ドメインとして使用される。「抗体断片」は、エピトープに結合する能力を保持する完全な又は完全長抗体の一部を意味する。抗体断片の例は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；及び線状抗体を含む。

【0157】

一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、短いリンカーペプチドで接続された免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを含む。Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬとＶＨは、別々の遺伝子でコードされているが、例えば、２つのドメインを、ＶＬとＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））として作製することを可能にする合成リンカーによる、組換え方法を使用して結合させることができる。Ｆｖ及びｓｃＦｖに関する追加の情報は、例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２（１９８８）４２３～４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１９８８）５８７９～５８８３頁；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、（１９９４）２６９～３１５頁；国際公開第１９９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。

【0158】

Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを含む一価抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である。増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片についての考察は、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価になり得る２つのエピトープ結合部位を含む。例えば、欧州特許第０４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；及びＨｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）６４４４～６４４８頁を参照されたい。デュアルアフィニティリターゲティング抗体（ＤＡＲＴ（商標）；ダイアボディフォーマットを基盤とするがさらなる安定化のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特色とする（Ｍｏｏｒｅら、Ｂｌｏｏｄ １１７、４５４２～５１頁（２０１１）））も使用することができる。抗体断片は、単離されたＣＤＲも含むことができる。抗体断片の概説は、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９～１３４頁を参照されたい。

【0159】

特定の実施形態では、多特異性抗体は、結合ドメインとしてエピトープに対する天然の受容体又はリガンドも含むことができる。例えば、結合のための標的がＰＤ－Ｌ１を含む場合、結合ドメインはＰＤ－１（例えば、ＰＤ－１／抗ＣＤ３融合体を含む）を含むことができる。結合のための受容体融合体の一例はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ）である。天然の受容体又はリガンドは、結合を増強するために改変することもできる。例えば、ベラタセプトはアバタセプトの改変版である。特定の実施形態では、多特異性抗体は、食作用を誘導する天然の受容体又はリガンドを含むことができる。カルレティキュリン（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ２７７９７）は、健康な細胞の小胞体に局在しているタンパク質であるが、瀕死の細胞では、このタンパク質は細胞表面に移動し、マクロファージなどの免疫細胞による食作用を誘導する。特定の実施形態では、結合ドメインはカルレティキュリン又は食作用を誘導することができるカルレティキュリンの一部を含むことができる。

【0160】

特定の実施形態では、多特異性抗体は、軽鎖のＣ末端に結合している一本鎖抗体を含むことができる（例えば、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７年；６（３）：ｅ１２６７８９１参照）。このフォーマットは、Ｆｃ領域の存在はタンパク質半減期を保存する一助となれるので、有用になれる。Ｆｃ領域の存在も、Ｆｃがいくつかの受容体と相互作用して免疫応答に寄与することができるので、有用になれる。抗体－ｓｃＦｖ融合体も有用になれる。なぜならば、抗体部分はそのエピトープに二量体様式で結合し、これが結合力を増強し、ｓｃＦｖ部分はそのエピトープに単量体様式で結合して、これが、例えば、Ｔ細胞エピトープに結合して標的の存在下で多量体化を可能にするだけでも有用になれるからである。これらの実施形態は、「三重特異性」が可能である。

【0161】

示されるように、多特異性抗体の結合ドメインはリンカーを通じて結合させうる。リンカーは、多特異性の結合ドメイン間の立体構造運動に柔軟性及び余地を与えることができるアミノ酸配列である。いかなる適切なリンカーでも使用しうる。リンカーの例は、Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７～１３６９頁に見い出せる。リンカーは、標的への所望の機能ドメイン提示に応じて柔軟である、強剛性、又は半剛性が可能である。一般的に使用される柔軟なリンカーは、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２５２）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＳＧ（配列番号６３）、及びＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号６５）などのＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む。追加の例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９０）；ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１２８）；及びＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２９）を含む。１つ以上の抗体ヒンジ領域及び／又はＣＨ３単独若しくはＣＨ２ＣＨ３配列などの免疫グロブリン重鎖定常領域を含むリンカーも使用できる。

【0162】

一部の状況では、柔軟なリンカーは、特定の使用に必要な距離を維持することも結合ドメインを配置することもできない場合がある。こうした例では、強剛性又は半剛性のリンカーが有用である場合がある。強剛性又は半剛性のリンカーの例は、プロリンリッチなリンカーを含む。特定の実施形態では、プロリンリッチなリンカーは、偶然のみに基づいて予想されるよりも多くのプロリン残基を有するペプチド配列である。特定の実施形態では、プロリンリッチなリンカーは、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４８％、少なくとも５０％、又は少なくとも５１％のプロリン残基を有するリンカーである。プロリンリッチなリンカーの特定の例は、プロリンリッチな唾液タンパク質（ＰＲＰ）の断片を含む。

【0163】

二重特異性抗体の特定の例は、Ｙｕら、（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１７）１０、１５５頁）に記載されており、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）（ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３；トリオマブ（Ｔｒｉｏｍａｂ）フォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ００１８９３４５で評価されている）；ＭＴ１１０（ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３；ＢｉＴＥ（Ａｍｇｅｎ）フォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ００６３５５９６で評価されている）；エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）（ＨＥＲ２／ＣＤ３；トリオマブフォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ００４５２１４０で評価されている）；ＭＤＸ－４４７（ＥＧＦＲ／ＣＤ６４；２（Ｆａｂ’）フォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ００００５８１３で評価されている）；ＭＭ－１４１（ＨＥＲ３／ＩＧＦ－ＩＲ；ｓｃＦｖ－ＩｇＧフォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ０１７３３００４で評価されている）；ＡＭＧ２１１（ＣＥＡ／ＣＤ３；ＢｉＴＥフォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ０２７６０１９９で評価されている）；ＲＯ６９５８６８８（ＣＥＡ／ＣＤ３；ＩｇＧベースのフォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ０２３２４２５７で評価されている）；ＲＯ６８９５８８２（ＣＥＡ／ＩＬ２；ＳｃＦｖ－ＩｇＧフォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ０２００４１０６で評価されている）；ＴＦ２（ＣＥＡ／ＨＳＧ；ドック及びロックフォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ００８６０８６０で評価されている）；抗ＣＥＡｘａｎｔｉ－ＤＴＰＡ（ＣＥＡ／ｄｉ－ＤＴＰＡ－１３１；ｓｃＦｖ－ＩｇＧフォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ００４６７５０６で評価されている）；ＢＡＹ２０１０１１２（ＰＳＭＡ／ＣＤ３；ＢｉＴＥで及び臨床試験ＮＣＴ０１７２３４７５で評価されている）；及びＭＯＲ２０９／ＥＳ４１４（ＰＳＭＡ／ＣＤ３；ＳｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖフォーマットで及び臨床試験ＮＣＴ０２２６２９１０で評価されている）を含む。ＡＭＧ７０１（ＢＣＭＡ－ターゲティング）及びソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）も使用できる。ＥｐＣａｍ結合二重特異性分子に関するさらなる情報は、Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６年；４３：１１２９～１１４３頁及びＳｃｈｌｅｒｅｔｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年；６５ ２８８２～２８８９頁を参照されたい。Ｈｏｒｎら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、２０１７年８月２９日 ８（３５）に記載されるＰＤ－Ｌ１／ＣＤ３二重特異性も使用できる。二重特異性抗体の追加の特定の例は、国際公開第２０１４／１６７０２２号；米国特許出願公開第２０１６／０２０８００１号、米国特許出願公開第２０１４／０３０２０３７号、及び米国特許出願公開第２０１４／０３０８２８５号に記載されている。１つの最後の例はブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）を含む。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーに関するさらなる情報はＥｌｌｅｒｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５４（２０１９）１０２～１１７頁を参照されたい。

【0164】

（６）ＴＧＦβインヒビター。ＴＧＦβの３つの高度に相同なアイソフォーム：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３がヒトには存在する。数多くの抑制性ＴＧＦβペプチド及び抗体が利用可能である。特定の実施形態では、単球／マクロファージを再プログラムすれば、抑制性ＴＧＦβペプチド又は抗体を発現させることができる。ＴＧＦβインヒビターの例は、トラベデルセン（ＡＰ１２００９；臨床試験ＮＣＴ００４３１５６１、ＮＣＴ００８４４０６４、及びＮＣＴ００７６１２８０において評価されたアンチセンスオリゴ）；ジシテルチド（Ｄｉｓｉｔｅｒｔｉｄｅ）（臨床試験ＮＣＴ００５７４６１３及びＮＣＴ００７８１０５３で評価されたペプチド）；レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）（ヒト化抗体）：メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）（臨床試験ＮＣＴ０００４３７０６で評価されたヒト化抗体）；フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）（臨床試験ＮＣＴ００４６４３２１、ＮＣＴ０１２８４３２２、及びＮＣＴ０１２９１７８４で評価されたヒト化抗体）；ＬＹ２３８２７７０（臨床試験ＮＣＴ０１１１３８０１で評価されたヒト化抗体）；ＳＩＸ－１００（臨床試験ＮＣＴ０１３７１３０５で評価された抗体）；アボタミン（Ａｖｏｔｅｒｍｉｎ）（臨床試験ＮＣＴ００４３２２１１１及びＮＣＴ００６５６２２７で評価された組換えタンパク質）；及びＩＭＣ－ＴＲ１（臨床試験ＮＣＴ０１６４６２０３で評価されたヒト化抗体）を含む。

【0165】

Ｒａｖｉら、（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９、７４１頁（２０１８））は、標的細胞微小環境において自己分泌／パラ分泌ＴＧＦβを同時に無効にするＴＧＦβ受容体ＩＩ外部ドメイン配列に融合しているＣＴＬＡ－４又はＰＤ－Ｌ１（ａ－ＣＴＬＡ４－ＴＧＦβＲＩＩｅｃｄ及びａ－ＰＤＬ１－ＴＧＦβＲＩＩｅｃｄ）を標的にする抗体を含む二機能性抗体－リガンドトラップ（Ｙ－トラップ）を記載している。Ｒａｖｉらの図２Ｂは、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインのリガンド結合配列を含むａ－ＣＴＬＡ４－ＴＧＦβＲＩＩの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を提供している。Ｃｕｅｎｄｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１５年４月、７（２８４）は、ＴＧＦβをインビボで阻害する抗体の産生をさらに記載しており；例えば、抗ＧＡＲＰモノクローナル抗体ＭＨＧ－８及びＬＨＧ－１０は活性なＴＧＦ－β１の産生を遮断する。

【0166】

追加のＴＧＦβインヒビターの例は、トラニラスト、ピルフェニドン、Ｌｅｆｔｙ－１（１１０５Ｉ受託番号：ＮＭ＿０１００９４（マウス）、及びＮＭ＿０２０９９７（ヒト））、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－２０２１９０、及びＳＢ－５０５１２４（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ、２００３年、２：２０頁；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＳＭ１６（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ２１５７２９９（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ－８３－０１（国際公開第２００９／１４６４０８号）、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ（２－［３－［６－メチルピリジン－２－イル］－１Ｈ－ピラゾール－４イル］－１，５－ナフチリジン）、ＴＧＦβＲＩキナーゼインヒビターＶＩＩＩ（６－［２－ｔ－ブチル－５－［６－メチル－ピリジン－２－イル］－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－キノキサリン）及びその誘導体を含む。

【0167】

（７）ヌクレオチド。本開示内では、活性化状態を制御する遺伝子並びに多特異性分子及び任意選択的にＴＧＦβインヒビターの発現をもたらす遺伝子をコードするヌクレオチドが、単球及び／又はマクロファージなどの免疫細胞に送達される。「遺伝子」とは、コードされた分子をコードするヌクレオチド配列のことである。この定義は、種々の配列多形、突然変異、及び／又は配列バリアントを含み、そのような変更はコードされた分子の機能に影響を及ぼさない。用語「遺伝子」は、コード配列だけでなく、プロモーター、エンハンサー、及び終結領域などの調節領域も含んでいてよい。この用語は、ｍＲＮＡ転写物からスプライスされたすべてのイントロン及び他のＤＮＡ配列を、選択的スプライシング部位から生じる変異体と共にさらに含むことができる。コードされた分子をコードするヌクレオチド配列は、コードされた分子の発現を指示するＲＮＡが可能である。これらのヌクレオチド配列は、特定の実施形態で、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列を含む。特定の実施形態において、当業者であれば、チミン（Ｔ）塩基を含むＤＮＡ配列は、Ｔ塩基がウラシル（Ｕ）塩基で置き換えられることを除いて、同じ配列を有するｍＲＮＡ配列と等価であることが可能であることを認識できる。ヌクレオチド配列は、完全長ヌクレオチド配列並びに完全長タンパク質に由来する非完全長配列の両方を含む。配列は、特定の免疫細胞においてコドン選択を提供するように導入しうる天然の配列（単数又は複数）の縮重コドンも含むことができる。本明細書に記載される分子をコードする遺伝子配列は、公開されているデータベース及び出版物で入手可能である。「コードしている」とは、活性化制御因子、多特異性抗体、及び／又はＴＧＦβインヒビターの合成のための鋳型の役割を果たすプラスミド、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのヌクレオチドの配列の特性のことである。

【0168】

特定の実施形態において、ヌクレオチドは合成ｍＲＮＡを含む。特定の実施形態において、合成ｍＲＮＡは、５’－キャッピングを使用して細胞内安定性を増やすように操作される。複数の異なる５’－キャップ構造を使用すれば、合成ｍＲＮＡ分子の５’－キャップを作成することができる。例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは５’－５’－三リン酸グアニン－グアニン結合を含有し、そこでは１つのグアニンがＮ７メチル基並びに３’－Ｏ－メチル基を含有する。合成ｍＲＮＡ分子は、５’－キャップ構造を作成する原因となる酵素を使用して転写後にキャップしてもよい。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの最も５’側の末端ヌクレオチドとグアニンヌクレオチドの間に標準的な５’－５’－三リン酸結合を生み出すことができ、そこにおいてグアニンはＮ７メチル化を含有し最後の５’－ヌクレオチドはＣａｐ１構造を生み出す２’－Ｏ－メチルを含有する。これにより、さらに高い翻訳能力及び細胞安定性を有するキャップが生じ、並びに細胞炎症性サイトカインの活性化が低下する。

【0169】

特定の実施形態において、免疫原性を減し、ｍＲＮＡの安定性を促進し、及び／又はｍＲＮＡの翻訳を促進するための合成ｍＲＮＡの他の改変は、５’－及び３’－末端非翻訳領域（ＵＴＲ）、５’ＵＴＲにおけるコザック翻訳開始配列、改変されたリボヌクレオシド、及び／又はポリＡテイルを含むことができる。特定の実施形態において、改変されたリボヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、２－チオウリジン（２ｓＵ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、及びＮ－１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含むことができる。特定の実施形態において、ＵＴＲはアルファ－及び／又はベータグロビンＵＴＲを含むことができる。

【0170】

合成ｍＲＮＡを作成する特定の実施形態は、対応するＤＮＡプラスミドからＰＣＲ増幅により５’Ｔ_{１００～２５０}オーバーハングを有する所望のタンパク質のコードＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ鋳型を作成することを含む。次に、ＤＮＡ鋳型を使用すれば、インビトロ転写反応によりｍＲＮＡを作成することができる。インビトロ転写中、５’キャップ構造（例えば、ＡＲＣＡ）、改変されたリボヌクレオシド、及び／又は３’ポリ（Ａ）テイルを組み込むことができる。例えば、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（商標） Ｓｙｓｔｅｍ Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標） Ｔ７高収率転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、及びＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標） Ｔ７インビトロ転写キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）からを含むいくつかのインビトロ転写システムが市販されている。特定の実施形態では、合成ｍＲＮＡは、ヌクレオチドを合成する企業（例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により合成されることができる。

【0171】

合成ｍＲＮＡ又は他のヌクレオチドは環状にしてもよい。そのようなヌクレオチドは環状化する又はコンカテマー化して、ポリＡ結合タンパク質と５’－末端結合タンパク質の間の相互作用を支援する翻訳能力のある分子を作成してもよい。環状化又はコンカテマー化の機構は、少なくとも３つの異なる経路：１）化学的、２）酵素的、又は３）リボザイム触媒された、を通じて起こりうる。新たに形成された５’－／３’－結合は、分子内でも分子間でもよい。

【0172】

第１の経路において、ヌクレオチドの５’－末端及び３’－末端は、互いに接近すると分子の５’－末端と３’－末端の間に新たな共有結合を形成する化学反応性基を含有してよい。有機溶媒中でヌクレオチド分子の３’－末端の３’－アミノ末端ヌクレオチドが５’－ＮＨＳエステル部分に求核攻撃を受け新たな５’－／３’－アミド結合を形成するように、５’－末端はＮＨＳエステル反応性基を含有してよく、３’－末端は３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有してよい。

【0173】

第２の経路において、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用して５’－リン酸化ヌクレオチド分子をヌクレオチドの３’－ヒドロキシル基に酵素的に連結させて新たなホスホジエステル結合を形成してもよい。例となる反応では、１μｇのヌクレオチド分子を、１～１０ユニットのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）と製造業者のプロトコールに従って３７℃で１時間インキュベートすることができる。ライゲーション反応は、並置した５’－と３’－領域の両方と塩基対合して酵素的ライゲーション反応を支援することができるスプリットオリゴヌクレオチドの存在下で起こりうる。

【0174】

第３の経路において、ｃＤＮＡ鋳型の５’－又は３’－末端は、インビトロ転写中に、得られるヌクレオチド分子が、ヌクレオチド分子の５’－末端をヌクレオチド分子の３’－末端にライゲートすることができる活性なリボザイム配列を含有できるように、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイム由来でもよく、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化）により選択してもよい。リボザイムリガーゼ反応は０～３７℃の温度で１～２４時間かかる可能性がある。

【0175】

特定の実施形態では、ヌクレオチドは、コードされた分子を発現するために含むことができるプラスミド、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡ、例えば、配列（例えば、遺伝子）を含む。適切なプラスミドは、遺伝子を単球／マクロファージに移動させるのに使用することができる標準的プラスミドベクター及びミニサークルプラスミドを含む。ヌクレオチド（例えば、ミニサークルプラスミド）は、改変された細胞における一過性発現を促進するための任意の追加的配列情報をさらに含むことができる。例えば、ヌクレオチドは、ジェネラルプロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、及び／又は細胞質に特異的なプロモーターなどのプロモーターを含むことができる。示されるように、プロモーター及びプラスミド（例えば、ミニサークルプラスミド）は、当技術分野において一般に周知であり、従来の技法を使用して調製することができる。

【0176】

本開示の実施形態内で使用できるヌクレオチドに関するさらなる情報は、Ｈａｒｄｅｅら、Ｇｅｎｅｓ（２０１７）、８、６５頁を参照されたい。Ｈａｒｄｅｅらは、プラスミド、ミニサークル、及びミニベクターを含む非ウイルスＤＮＡ遺伝子療法ベクターの方法を概説している。プラスミドベクター及び最小化ＤＮＡベクターは、がんに対する遺伝子療法を送達するのに使用されて成功してきた。ミニサークルは、Ｔ細胞にＢ細胞リンパ腫を殺滅させるためにＴ細胞を操作して二重特異性抗体を送達するのにもっと最近に使用された（Ｈａｒｄｅｅら、Ｇｅｎｅｓ（２０１７）、８、６５頁）。特定の実施形態は、二本鎖ＤＮＡ（組み込み及び／又は非組み込み）、従来のプラスミド、ミニサークル、及び／又は閉鎖末端線状ｃｅＤＮＡの使用を含む（Ｌｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１３年８月１日 ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９参照）。ｃｅＤＮＡは、共有結合閉鎖末端を有する非ウイルスＡＡＶ由来ベクターＤＮＡである（Ｌｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１３年、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９）。

【0177】

特定の実施形態では、マクロファージ活性化制御因子をコードするヌクレオチドは、他の活性化制御因子をコードする１つ以上の追加のヌクレオチドと組み合わせて使用される（例えば、ＩＲＦ、多特異性抗体及び／又はＴＧＦβインヒビターの組合せ）。特定の実施形態では、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、他のＩＲＦをコードする１つ以上の追加のヌクレオチドと及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドと組み合わせて使用される。特定の実施形態では、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、ＩＫＫβ、多特異性抗体及び／又はＴＧＦβインヒビターをコードするヌクレオチドと０．５対１、１対１、２対１、３対１、４対１、又は５対１の比で組み合わせて使用される。特定の実施形態において、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドと、３対１の比で組み合わせて使用される。

【0178】

特定の実施形態は、遺伝子編集システム内にヌクレオチドを送達することができる。遺伝子編集システムは、細胞の内在性ゲノムの特定の配列を改変する又はこれに影響を及ぼす。ゲノム編集システムは、標的化ゲノム編集、例えば、遺伝子破壊、相同組換えによる遺伝子編集、及びヒトゲノム内の適切な染色体標的部位に治療遺伝子を挿入する遺伝子療法に有用である。

【0179】

特定の実施形態は、遺伝子編集システムとして転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を利用する。ＴＡＬＥＮとは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインを含む融合タンパク質のことである。ＴＡＬＥＮを使用して、ＤＮＡ中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することにより遺伝子及びゲノムを編集し、この切断により細胞において修復機構が誘導される。一般的に、２つのＴＡＬＥＮは、二量体化してＤＳＢを誘導するためにＤＮＡ切断ドメインのための標的ＤＮＡ部位のそれぞれの側に結合して隣接しなければならない。ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により又は外来性二本鎖ドナーＤＮＡ断片との相同組換え（ＨＲ）により細胞内で修復される。

【0180】

示されるように、ＴＡＬＥＮは、例えば、内在性ゲノムの標的配列に結合し、標的配列の位置でＤＮＡを切断するように操作されてきた。ＴＡＬＥＮのＴＡＬＥは、サンドモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌により分泌されるＤＮＡ結合タンパク質である。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、高度に保存された３３又は３４個のアミノ酸リピートを含み、それぞれのリピートの１２番目及び１３番目位には多様な残基を抱えている。これら２つの位置は、リピート可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）と呼ばれるが、特定のヌクレオチド認識と強い相関関係を示す。したがって、ターゲティング特異性は、ＲＶＤにおいてアミノ酸を変え従来にないＲＶＤアミノ酸を組み込むことにより改善することができる。

【0181】

ＴＡＬＥＮ融合体において使用可能なＤＮＡ切断ドメインの例は、野生型及び変異Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼである。Ｆｏｋｌドメインは、標的配列上の部位のための独特のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする二量体として機能する。Ｆｏｋｌ切断ドメインは、２つの逆位半部位を分離する５つ又は６つの塩基対スペーサー配列内で切断する。

【0182】

特定の実施形態は、遺伝子編集システムとしてＭｅｇａＴＡＬを利用する。ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥがメガヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインと融合している一本鎖希少切断ヌクレアーゼ構造を有する。メガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られるが、同じドメインにおいてＤＮＡ認識とヌクレアーゼ機能の両方を有する単一ペプチド鎖である。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｍｅｇａＴＡＬは機能的活性のために単一ペプチド鎖の送達だけを必要とする。

【0183】

特定の実施形態は、遺伝子編集システムとして亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を利用する。ＺＦＮは、特定の位置でＤＮＡに結合して切断するように操作された部位特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＺＦＮは、ＺＦＮが種々の異なる細胞においてゲノム内の独特の配列を標的にすることを可能にするＤＮＡ配列中の特定の部位にＤＳＢを導入するのに使用される。さらに、二本鎖切断に続いて、相同組換え又は非相同末端結合が起きてＤＳＢを修復し、こうしてゲノム編集を可能にする。

【0184】

ＺＦＮは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより合成される。ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子である３～６つの亜鉛フィンガータンパク質を含む。ＤＮＡ切断ドメインは、例えば、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含む。

【0185】

ガイドＲＮＡは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなどの遺伝子編集システムと一緒に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲリピート及びＣＲＩＳＰＲ会合遺伝子（Ｃａｓ）のセットを含む。

【0186】

一般に、送達されたヌクレオチドの機能的発現をもたらすことができるいかなるシステムも、本開示内で使用することができる。しかし、特定の実施形態において、ウイルスベクターを利用する送達は排除される。

【0187】

（８）ナノ粒子。ある特定の例では、本明細書で開示されるシステム及び方法内で使用されるナノ粒子は、凝縮してヌクレオチドを酵素的分解から防御するように機能することができる。この目的のためにナノ粒子内で使用するのに特に有用な材料は、ポリ（β－アミノエステル）（ＰｂＡＥ）を含む、正電荷脂質及び／又はポリマーを含む。

【0188】

本開示のナノ粒子内で使用できる正電荷ポリマーの例は、ポリアミン；ポリ有機アミン（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレンイミンセルロース）；ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）；ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン）；多糖（例えば、セルロース、デキストリン、ＤＥＡＥデキストラン、デンプン）；スペルミン、スペルミジン、ポリ（ビニルベンジルトリアルキルアンモニウム）、ポリ（４－ビニル－Ｎ－アルキル－ピリジニウム）、ポリ（アクリロイル－トリアルキルアンモニウム）、及びＴａｔタンパク質を含む。

【0189】

正電荷脂質の例は、ジパルミトイルホスファチジル酸又はジステアロイリホスファチジル酸とヒドロキシエチレンジアミンのエステルなどの、ホスファチジル酸とアミノアルコールのエステルを含む。正電荷脂質のさらに詳細な例は、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－ｃｈｏｌ）；Ｎ，Ｎ’－ジメチル－Ｎ，Ｎ’－ジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）；Ｎ，Ｎ’－ジメチル－Ｎ，Ｎ’－ジオクタデシルアンモニウムクロライド（ＤＤＡＣ）；１，２－ジオレオイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＲＩ）；１，２－ジオレオイルオキシ－３－［トリメチルアンモニオ］－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；１，２－ジオクタデシルオキシ－３－［トリメチルアンモニオ］－プロパン（ＤＳＴＡＰ）；及び、例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ２００５年、１１、３７５～３９４頁に記載されるカチオン性脂質を含む。

【0190】

脂質とポリマーの混合物も、いかなる濃度でも及びいかなる比でも使用可能である。種々の等級を使用して異なるポリマータイプを異なる比で混合すると、寄与ポリマーのそれぞれから借りてくる特徴をもたらすことができる。種々の末端基化学も採用することができる。

【0191】

本明細書で開示される特定の実施形態は、多孔質網を形成することができるいかなる材料から構築される多孔質ナノ粒子も利用可能である。例示的な材料は、金属、遷移金属及びメタロイドを含む。例示的な金属、遷移金属及びメタロイドは、リチウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム及びシリカを含む。特定の実施形態において、多孔質ナノ粒子はシリカを含む。メソ多孔質シリカの並外れた高表面積（１，０００ｍ^２／ｇを上回る）により、リポソームなどの従来のＤＮＡ担体を上回るレベルでのヌクレオチド積載が可能になる。

【0192】

粒子は、楕円体の、立方状の、ピラミッド形の、長方形の、円柱状の、ドーナツ形の、及び同類の物を含む、種々の異なる形状で形成することができる。ヌクレオチドは、種々のやり方でナノ粒子の孔に含むことができる。例えば、ヌクレオチドは多孔質ナノ粒子にカプセル化することができる。他の態様において、ヌクレオチドは、多孔質ナノ粒子の表面又は表面のすぐ下付近と会合する（例えば、共有結合的に及び／又は非共有結合的に）ことができる。特定の実施形態において、ヌクレオチドは、例えば、多孔質ナノ粒子の材料に組み込んで多孔質ナノ粒子に取り込むことができる。例えば、ヌクレオチドは、ポリマーナノ粒子のポリマーマトリックス中に取り込むことができる。

【0193】

特定の実施形態において、本明細書に開示されるナノ粒子はコーティングを含む。コーティングはカプセル化されたヌクレオチドを遮蔽する及び／又はオフターゲット結合を減らす若しくは妨げる働きをすることができる。オフターゲット結合は、ナノ粒子の表面電荷を中性又は負に下げることにより減らされる又は妨げられる。本明細書の別の場所でさらに詳細に開示されているように、コーティングは、中性又は負電荷ポリマー－及び／又はリポソームベースのコーティングを含むことができる。特定の実施形態において、コーティングは、カプセル化されたヌクレオチドが免疫細胞中に放出される前に環境に曝露されることを防ぐのに十分に親水性の及び／又は中性電荷親水性ポリマーの高密度表面コーティングである。特定の実施形態において、コーティングは、ナノ粒子の表面の少なくとも８０％又は少なくとも９０％を覆う。特定の実施形態において、コーティングは、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む。特定の実施形態において、ＰＧＡは、ターゲティングリガンドをナノ粒子に結合させるリンカーとしての役割を果たす。特定の実施形態において、ＰＧＡは、ジマンノースをナノ粒子に結合させるリンカーとしての役割を果たす。特定の実施形態において、コーティングはヒアルロン酸を含む。

【0194】

本開示の実施形態内でコーティングとして使用可能な中性電荷ポリマーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリ（プロピレングリコール）；及びポリアルキレンオキシド共重合体（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ、ＮＪ）を含む。

【0195】

中性電荷ポリマーは双性イオンポリマーも含む。双性イオンとは、正電荷と負電荷の両方を有しつつ全体的な電荷的中性という特性のことである。双性イオンポリマーは、細胞及びタンパク質接着に抵抗する細胞膜の領域のような振る舞いができる。

【0196】

双性イオンポリマーは、ペンダント基（すなわち、ポリマー骨格から垂れ下がった基）を双性イオン基と一緒に含む双性イオン構成単位を含む。例示的な双性イオンペンダント基は、カルボキシベタイン基（例えば、－Ｒａ－Ｎ＋（Ｒｂ）（Ｒｃ）－Ｒｄ－ＣＯ_２－、Ｒａはポリマー骨格をカルボキシベタイン基のカチオン窒素中心に共有結合的に連結させるリンカー基であり、Ｒｂ及びＲｃは窒素置換基であり、Ｒｄはカチオン窒素中心をカルボキシベタイン基のカルボキシ基に共有結合的に連結させるリンカー基である）。

【0197】

負電荷ポリマーの例は、アルギン酸類；カルボン酸多糖類；カルボキシメチルセルロース；カルボキシメチルセルロースシステイン；カラゲナン（例えば、ＧＥＬＣＡＲＩＮ（登録商標）２０９、ＧＥＬＣＡＲＩＮ（登録商標）３７９、ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；コンドロイチン硫酸；グリコサミノグリカン；ムコ多糖類；負電荷多糖類（例えば、デキストラン硫酸）；ポリ（アクリル酸）；ポリ（Ｄ－アスパラギン酸）；ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）；ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）ナトリウム塩；ポリ（Ｄ－グルタミン酸）；ポリ（Ｌ－グルタミン酸）；ポリ（Ｌ－グルタミン酸）ナトリウム塩；ポリ（メタクリル酸）；アルギン酸ナトリウム（例えば、ＰＲＯＴＡＮＡＬ（商標）ＬＦ １２０Ｍ、ＰＲＯＴＡＮＡＬ（商標）ＬＦ ２００Ｍ、ＰＲＯＴＡＮＡＬ（商標）ＬＦ ２００Ｄ、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｄｒａｍｍｅｎ、Ｎｏｒｗａｙ）；カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）；硫酸化多糖類（ヘパリン、アガロペクチン）；ペクチン、ゼラチン及びヒアルロン酸を含む。

【0198】

特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリマーは、「星型ポリマー」を含むことができ、これは２つ以上のポリマー枝がコアから伸びている分岐ポリマーのことである。コアは、２つ以上の官能基を有する原子団であり、そこから分岐鎖を重合により伸ばすことができる。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子は星型ポリマーを含む。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子は星型ポリマー及びコーティングを含む。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子は星型ポリマー及びＰＧＡを含むコーティングを含む。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子は星型ポリマー及びヒアルロン酸を含むコーティングを含む。

【0199】

特定の実施形態において、分岐鎖は双性イオン又は負電荷ポリマー分岐鎖である。星型ポリマーは、分岐鎖前駆体を、加水分解、紫外線照射、又は熱により双性イオン又は負電荷ポリマーに変換することができる。ポリマーも、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、光重合、開環重合（ＲＯＰ）、濃縮、マイケル付加、分岐生成／成長反応、又は他の反応を含む、不飽和単量体の重合に効果的ないかなる重合法によって得てもよい。

【0200】

リポソームは、少なくとも１つの同心脂質二重層を含む微細小嚢である。小嚢形成脂質は、最終複合体の流動性又は強剛性の指定度を達成するように選択される。特定の実施形態では、リポソームは、水性コアを取り囲む脂質組成物を提供する。ある特定の例では、リポソームの構造を使用すれば、ナノ粒子をそのコア内にカプセル化することができる（すなわち、リポソームナノ粒子）。特定の実施形態では、本開示のナノ粒子は、リポソームナノ粒子内のナノ粒子として利用される。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、リポソームに特徴的な連続脂質二重層を欠くリポソーム様構造体である。固形脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、室温及び体温で固形であるＬＮＰである。

【0201】

先行するパラグラフに記載されるリポソーム及び類似する構造体は、中性（コレステロール）又は双極性が可能であり、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）などのリン脂質並びにジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む他のタイプの双極性脂質を含み、炭化水素鎖長は１４～２２の範囲で飽和しているか、又は１つ以上の二重Ｃ＝Ｃ結合を有する。単独で、又は他の脂質成分と組み合わせて安定なリポソームを作成することができる脂質の例は、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及び、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミド－メチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）などのリン脂質である。リポソーム中に組み込むことができる追加のリンを含有しない脂質は、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ミリスチン酸イソプロピル、トリエタノールアミンラウリル硫酸、アルキルアリール硫酸、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステアレート、両性アクリルポリマー、ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ＤＤＡＢ、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ＤＯＰＧ、及びリン酸ジセチルを含む。特定の実施形態において、本明細書に開示されるリポソームを作り出すのに使用される脂質は、コレステロール、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及び誘導体化小嚢形成脂質ＰＥＧ－ＤＳＰＥを含む。

【0202】

リポソームを形成する方法は、例えば、米国特許第４，２２９，３６０号、米国特許第４，２２４，１７９号、米国特許第４，２４１，０４６号、米国特許第４，７３７，３２３号、米国特許第４，０７８，０５２号、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号、及び米国特許第４，８３７，０２８号に、並びにＳｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７頁（１９８０）及びＨｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９頁（１９８６）に記載されている。ナノ粒子に関するさらなる情報は、Ｙｅｔｉｓｇｉｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０２０年、２５、２１９３頁を参照されたい。

【0203】

粒子のサイズは広い範囲にわたって変動することがあり、異なる方法で測定可能である。示されるように、好ましい実施形態では、粒子はサイズが１３０ｎｍ未満のナノ粒子である。しかし、本開示のＮＰは、５００ｎｍに等しい若しくはそれ未満、１５０ｎｍ未満、１４０ｎｍ未満、１２０ｎｍ未満、１１０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、又は１０ｎｍ未満の最小寸法を有することも可能である。特定の実施形態において、ナノ粒子はサイズがＮＰ９０～１３０ｎｍである。

【0204】

特定の実施形態において、ＮＰは、５ｎｍ～５００ｎｍ、１０ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～９０ｎｍ、３０ｎｍ～８０ｎｍ、４０ｎｍ～７０ｎｍ、及び４０ｎｍ～６０ｎｍの範囲に及ぶ最小寸法を持つことができる。特定の実施形態において、寸法は、ＮＰ又は被覆ＮＰの径である。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子の集団は、５００ｎｍに等しい若しくはそれ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、又は１０ｎｍ未満の平均最小寸法を有することも可能である。特定の実施形態において、本開示の組成物中のＮＰの集団は、５ｎｍ～５００ｎｍ、１０ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～９０ｎｍ、３０ｎｍ～８０ｎｍ、４０ｎｍ～７０ｎｍ、及び４０ｎｍ～６０ｎｍ、７０ｎｍ～１３０ｎｍ又は７５ｎｍ～１２５ｎｍの範囲に及ぶ平均径を持つことができる。ナノ粒子の寸法は、例えば、動的光散乱及び／又は電子顕微鏡などの従来の技法を使用して決定することができる。好ましくはないが、特定の実施形態において、微小粒子も使用できると考えられる。

【0205】

特定の実施形態において、ＰｂＡＥポリマーは、ヌクレオチド（例えば、インビトロ転写されたｍＲＮＡ）と、２０対１、３０対１、４０対１、５０対１、６０対１、７０対１、８０対１、９０対１、１００対１、又はそれよりも多い比で混合させ、ＰｂＡＥ－ヌクレオチドポリプレックスを作成する。特定の実施形態において、ＰｂＡＥポリマーは、ヌクレオチド（例えば、インビトロ転写されたｍＲＮＡ）と６０対１の比で混合させ、ＰｂＡＥ－ヌクレオチドポリプレックスを作成する。特定の実施形態において、ＰｂＡＥ－ヌクレオチドポリプレックスはＰＧＡ／Ｄｉ－マンノースと組み合わせて最終ＮＰを形成することができる。

【0206】

特定の実施形態では、正電荷ポリマーコアは、１，４－ブタンジオールジアクリレートを４－アミノ－１－ブタノールと、ジアクリレート対アミンモノマーの１対１モル比で組み合わせることにより形成されるＰｂＡＥである。ポリマーは、ピペラジンキャッピングされた４４７ポリマーが可能である。ジマンノースにコンジュゲートされる場合、α－Ｄ－マンノピラノシル－（１→２）－α－Ｄ－マンノピラノース（Ｄｉ－ｍａｎｎｏｓｅ、Ｏｍｉｃｒｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ）は、ＰＧＡにコンジュゲートする前にグリコシルアミンに改変することができる。

【0207】

コドン最適化ｍＲＮＡは、アンチリバースキャップアナログ３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＡＲＣＡ）でキャッピングし、改変リボヌクレオチドシュードウリジン（Ψ）及び５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で完全に置換することができる。

【0208】

ナノ粒子を形成するため、ＰｂＡＥ－４４７ポリマーを６０対１（ｗ対ｗ）の比でｍＲＮＡに付加し、直ちに中速度で１５秒間ボルテックスすることができる。次に、混合物を室温で５分間インキュベートしてＰｂＡＥ－ｍＲＮＡポリプレックスを形成させることができる。次のステップにおいて、ＮａＯＡｃバッファー中１００μｇ／ｍＬのＰＧＡ／ジマンノースをポリプレックス溶液に添加し、中速度で１５秒間ボルテックスし、室温で５分間インキュベートすることができる。この工程で、ＰＧＡ／ジマンノースがＰｂＡＥ－ｍＲＮＡポリプレックスの表面を被覆して最終ＮＰを形成する。長期貯蔵のため、Ｄ－スクロース（６０ｍｇ／ｍＬ）を凍結保護物質としてＮＰ溶液に添加することができる。ナノ粒子はドライアイスで瞬間凍結させ、次に凍結乾燥することができる。乾燥ＮＰは、使用するまで－２０℃又は－８０℃で貯蔵できる。インビボ使用では、凍結乾燥させたＮＰは１対２０（ｗ対ｖ）比で水に再懸濁することができる。

【0209】

特定の実施形態では、ＮＰはサイズ９９．８±ＳＥ／２４．５、多分散０．１８３、及びほぼ中性の表面電荷（３．４０±ＳＥ／２．１５ｍＶ ζ電位）を有する。ＮＰのこれらの物理化学的特性は、２５℃でＺｅｔａｐａｌｓ装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して特徴付けることができる。動的光散乱に基づいて流体力学半径及び多分散を測定するため、ＮＰを２５ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５．２）中に５倍に希釈することができる。ζ電位を測定するため、ＮＰは１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で１０倍に希釈することができる。ＮＰの安定性を評価するため、新たに調製されたナノ粒子は１０ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）に希釈することができる。ＮＰの流体力学半径及び多分散は１０分ごとに５時間測定し、そのサイズ及び粒子濃度は、Ｎａｎｏｓｉｔｅ ３００装置（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して粒子トラッキング解析から導き出された。新たに作製したＮＰ（ｍＲＮＡ０．８３μｇを含有する２５μＬ）を、グロー放電処理２００メッシュ炭素／ホルムバール被覆銅グリッドに沈着させた。３０秒後、グリッドは、５０％のカルノフスキー固定液、０．１Ｍのカコジル酸バッファー、ｄＨ２Ｏ、次に１％（ｗ／ｖ）の酢酸ウラニルで順次処理した。試料は、１２０ｋＶで操作するＪＥＯＬ ＪＥＭ－１４００透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ）で撮像した。

【0210】

特定の実施形態では、ナノ粒子は任意選択的に、単球及び／又はマクロファージの表面に存在する細胞マーカーに結合するリガンドを標的にする結合ドメインを含むことができる。

【0211】

Ｍ２結合ドメイン。Ｅｇｒ２はＭ２マクロファージにより発現される。Ｅｇｒ２についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；ａｎｄ Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。抗Ｅｇｒ２抗体の産生は、例えば、Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｋら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８（６）：１５５９～１５６６頁で考察されている。抗Ｅｇｒ２抗体は：ウサギモノクローナル抗Ｅｇｒ２抗体クローンＥＰＲ４００４；マウスモノクローナル抗Ｅｇｒ２抗体クローン１Ｇ５；マウスモノクローナル抗Ｅｇｒ２抗体クローンＯＴＩ１Ｂ１２；ヒトＥｇｒ２のＡＡ残基２００～３００を認識するウサギポリクローナル抗Ｅｇｒ２抗体；ヒトＥｇｒ２のＡＡ残基３４０～４２０を認識するウサギポリクローナル抗Ｅｇｒ２抗体；及びヒトＥｇｒ２のＡＡ残基３７０～４２０を認識するウサギポリクローナル抗Ｅｇｒ２抗体を含む。結合ドメインはこれらの抗体及び本明細書に開示される他の抗体由来が可能である。

【0212】

特定の実施形態では、ターゲティングリガンドは、ＳＧＮＩＦＳＩＮＡＩＧを含むＣＤＲ１配列（配列番号４５）、ＴＩＴＬＳＧＳＴＮを含むＣＤＲ２配列（配列番号４６）、ＮＴＹＳＤＳＤＶＹＧＹを含むＣＤＲ３配列（配列番号４７）を含む結合ドメインを含むナノボディが可能である。これらは、ＣＤ２０６に結合するＣＤＲ配列を反映している。

【0213】

特定の実施形態では、ターゲティングリガンドは、ＰＧＦＫＬＤＹＹＡＩＡを含むＣＤＲ１配列（配列番号４８）、ＳＩＮＳＳＧＧＳＴを含むＣＤＲ２配列（配列番号４９）、及びＬＲＲＹＹＧＬＮＬＤＰＧＳＹＤＹを含むＣＤＲ３配列（配列番号５０）を含むナノボディが可能である。これらは、ＣＤ２０６に結合するＣＤＲ配列を反映している。

【0214】

特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＦＰＦＮＩＹＰＭＳ（配列番号５１）を含むＣＤＲ１配列、ＹＩＳＨＧＧＴＴＴ（配列番号５２）を含むＣＤＲ２配列、及びＧＹＡＲＬＭＴＤＳＥＬＶ（配列番号５３）を含むＣＤＲＨ３配列を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ナノボディ）を含む。これらは、ＣＤ２０６に結合するＣＤＲ配列を反映している。

【0215】

ＣＤ２０６に特異的ないくつかの追加の抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際特許第２０１４／１４０３７６号パンフレット、国際特許第２０１３／１７４５３７号パンフレット、米国特許第７，５６０，５３４号を参照されたい。ＣＤ２０６についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｒｏｓｅｍｏｎｔ、ＩＬ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ；及びＢｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０６抗体は、ラットモノクローナル抗マウスＣＤ２０６モノクローナル抗体クローンＣ０６８Ｃ２（カタログ＃１４１７３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む。

【0216】

特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＡＳＱＳＶＳＨＤＶ（配列番号５４）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＴＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＱＤＹＳＳＰＲＴ（配列番号５６）を含むＣＤＲＬ３配列、ＧＹＳＩＴＳＤＹ（配列番号５７）を含むＣＤＲＨ１配列、ＹＳＧを含むＣＤＲＨ２配列、及びＣＶＳＧＴＹＹＦＤＹＷＧ（配列番号５９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む結合ドメインを含む。これらは、ＣＤ１６３に結合するＭａｃ２－４８抗体のＣＤＲ配列を反映している。

【0217】

特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＡＳＱＳＶＳＳＤＶ（配列番号６０）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＡＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＱＤＹＴＳＰＲＴ（配列番号６２）を含むＣＤＲＬ３配列、ＧＹＳＩＴＳＤＹ（配列番号５７）を含むＣＤＲＨ１配列、ＹＳＧを含むＣＤＲＨ２配列、及びＣＶＳＧＴＹＹＦＤＹＷＧ（配列番号５９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む結合ドメインを含む。これらは、ＣＤ１６３に結合するＭａｃ２－１５８抗体のＣＤＲ配列を反映している。

【0218】

ＣＤ１６３に特異的ないくつかの追加の抗体又は結合ドメインは当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際特許第２０１１／０３９５１０号パンフレット、国際特許第２００２／０３２９４１号パンフレット、国際特許第２００２／０７６５０１号パンフレット、及び米国特許出願公開第２００５／０２１４８７１号参照を参照されたい。ＣＤ１６３についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；及びＲＤＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ１６３抗体は、マウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローン３Ｄ４；マウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローンＢｅｒ－Ｍａｃ３；マウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローンＥＤＨｕ－１；及びマウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローンＧＨＩ／６１を含むことができる。

【0219】

特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＲＳＳＫＳＬＬＹＫＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号６６）を含むＣＤＲＬ１配列、ＬＭＳＴＲＡＳ（配列番号６７）を含むＣＤＲＬ２配列、ＱＱＬＶＥＹＰＦＴ（配列番号６８）を含むＣＤＲＬ３配列、ＧＹＷＭＳ（配列番号６９）を含むＣＤＲＨ１配列、ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号７０）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＦＩＤを含むＣＤＲＨ３配列を含む結合ドメインを含む。これらは、ＣＤ２３に結合するＣＤＲ配列を反映している。

【0220】

ＣＤ２３に特異的ないくつかの追加の抗体又は結合ドメインは当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、米国特許第７，００８，６２３号、米国特許第６，０１１，１３８号（５Ｅ８、６Ｇ５、２Ｃ８、Ｂ３Ｂ１及び３Ｇ１２を含む抗体）、及び米国特許出願公開第２００９／０２５２７２５号、Ｒｅｃｔｏｒら、（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４８１～４８８頁；Ｆｌｏｒｅｓ－Ｒｕｍｅｏら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０３８～１０４６頁；Ｓｈｅｒｒら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：４８１～４８９頁；及びＰｅｎｅら、（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：６８２０～６８２４頁を参照されたい。ＣＤ２３についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｂｉｏｓｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；及びＢｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ２３抗体は、マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＴｕ１；ウサギモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＳＰ２３；ウサギモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＥＰＲ３６１７；マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローン５Ｂ５；マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローン１Ｂ１２；マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＭ－Ｌ２３．４；及びマウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローン３Ａ２を含むことができる。

【0221】

Ｍ１結合ドメイン。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＳＳＮＩＧＤＮＹ（配列番号７２）を含むＣＤＲＬ１配列、ＲＤＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳ（配列番号７４）を含むＣＤＲＬ３配列、ＧＦＴＦＤＤＹＧ（配列番号７５）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＳＷＮＧＧＫＴ（配列番号７６）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＡＲＧＳＬＦＨＤＳＳＧＦＹＦＧＨ（配列番号７７）を含むＣＤＲＨ３配列を含む結合ドメインを含む。これらは、ＣＤ３８に結合するＡｂ７９抗体のＣＤＲ配列を反映している。

【0222】

特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＮＳＮＩＧＳＮＴ（配列番号７８）を含むＣＤＲＬ１配列、ＳＤＳを含むＣＤＲＬ２配列、ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＲ（配列番号８０）を含むＣＤＲＬ３配列、ＧＦＴＦＮＮＹＧ（配列番号８１）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＳＹＤＧＳＤＫ（配列番号８２）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＡＲＶＹＹＹＧＦＳＧＰＳＭＤＶ（配列番号８３）を含むＣＤＲＨ３配列を含む結合ドメインを含む。これらは、ＣＤ３８に結合するＡｂ１９抗体のＣＤＲ配列を反映している。

【0223】

特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号８４）を含むＣＤＲＬ１配列、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号８５）を含むＣＤＲＬ２配列、ＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦ（配列番号８６）を含むＣＤＲＬ３配列、ＳＦＡＭＳ（配列番号８７）を含むＣＤＲＨ１配列、ＡＩＳＧＳＧＧＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８８）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＤＫＩＬＷＦＧＥＰＶＦＤＹ（配列番号８９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む結合ドメインを含む。これらは、米国特許第７，８２９，６９３号に記載されるＣＤ３８に結合するダラツムマブ抗体のＣＤＲ配列を反映している。

【0224】

ＣＤ３８に特異的ないくつかの抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際公開第２００５／１０３０８３号パンフレット、国際公開第２００６／１２５６４０号パンフレット、国際公開第２００７／０４２３０９号パンフレット、国際公開第２００８／０４７２４２号パンフレット、国際公開第２０１２／０９２６１２号パンフレット、国際公開第２００６／０９９８７５号パンフレット、国際公開第２０１１／１５４４５３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３０７２８号パンフレット、米国特許第７，８２９，６９３号、及び米国特許出願公開第２０１６／０２００８２８号を参照されたい。ＣＤ３８についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ２３抗体は、ウサギモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＧＡＤ－３；マウスモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＨＩＴ２；マウスモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＡＴ１；マウスモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＡＴ１３／５；ラットモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＮＩＭＲ－５；及びラットモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗ＣＤ３８抗体クローン９０／ＣＤ３８（カタログ＃ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を含むことができる。

【0225】

特定の実施形態において、Ｇタンパク質共役受容体１８（Ｇｐｒ１８）はＭ１マクロファージ上で標的にされる。Ｇｐｒ１８についての市販の抗体は、Ａｓｓａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ；及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。特定の実施形態において、抗Ｇｐｒ１８抗体は、ヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１～５０の一部を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体；ヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１６０～２４０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体；ヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１００～１８０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体；ウサギモノクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体クローンＥＰＲ１２３５９；及びヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１４０～１９０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体を含む。

【0226】

特定の実施形態において、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）はＭ１マクロファージ上で標的にされる。Ｆｐｒ２についての市販の抗体は、Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ；Ｂｉｏｒｂｙｔ、ＬＬＣ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．、Ｋａｔｙ、ＴＸ；ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｌｅｍ、ＭＡ；及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。特定の実施形態において、抗ｆｐｒ２抗体は、マウスモノクローナル抗ｆｐｒ２抗体クローンＧＭ１Ｄ６；マウスモノクローナル抗ｆｐｒ２抗体クローン３０４４０５；組換え抗ｆｐｒ２抗体クローンＲＥＡ６６３；及びｆｐｒ２のアミノ酸３００～３５０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗ｆｐｒ２抗体を含む。

【0227】

特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号８４）を含むＣＤＲＬ１配列、ＤＡＳＳＲＡＴ（配列番号９１）を含むＣＤＲＬ２配列、ＱＬＲＳＮＷＰＰＹＴ（配列番号９２）を含むＣＤＲＬ３配列、ＧＹＧＭＨ（配列番号９３）を含むＣＤＲＨ１配列、ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９４）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＤＴＧＤＲＦＦＤＹ（配列番号９５）を含むＣＤＲＨ３配列を含む結合ドメインを含む。これらは、ＣＤ６４に結合するＣＤＲ配列を反映している。

【0228】

（９）投与のための組成物。本明細書に開示されるナノ粒子は、対象への投与のために処方される組成物の一部として提供することができる。組成物は、本明細書に開示されるナノ粒子及び薬学的に許容される担体を含む。

【0229】

例示的な一般に使用される薬学的に許容される担体は、ありとあらゆる充填剤若しくはフィラー、溶媒若しくは共溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、保存剤、等張化剤、吸収遅延剤、塩、安定化剤、緩衝剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、ゲル、結合剤、崩壊剤、及び／又は潤滑剤を含む。

【0230】

例示的な緩衝剤は、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、グルコン酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤及び／又はトリメチルアミン塩を含む。

【0231】

例示的な保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンザルコニウムハロゲン化物、塩化ヘキサメトニウム、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３－ペンタノールを含む。

【0232】

例示的な等張剤は、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトールなどの三価又は高級糖アルコールを含む多価糖アルコールを含む。

【0233】

例示的な安定化剤は、有機糖、多価糖アルコール、ポリエチレングリコール、硫黄含有還元剤、アミノ酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、免疫グロブリン、親水性ポリマー又は多糖を含む。

【0234】

特定の実施形態において、組成物は、腹腔内、静脈内、又は頭蓋内注射用に処方される。本明細書に開示される組成物は、さらに動脈内、リンパ節内、リンパ内、腫瘍内、筋肉内、経口、及び／又は皮下投与用に処方することができ、さらに詳細には、動脈内、リンパ節内、リンパ内、腫瘍内、筋肉内、及び／又は皮下注射による。本明細書に開示される組成物は、注入、灌流、又は経口摂取による投与用に処方することができる。

【0235】

注射に関して、組成物は、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水を含む緩衝液などの水溶液として処方可能である。水溶液は、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。あるいは、製剤は、使用前に、適切な溶媒、例えば、減菌発熱性物質除去水で構成するための凍結乾燥及び／又は粉末形態が可能である。

【0236】

組成物はデポ製剤としても処方することができる。デポ製剤は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中の乳剤として）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として処方することができる。

【0237】

さらに、組成物は、ナノ粒子を含有する固体ポリマーの半透性マトリックスを利用して徐放性製剤として処方することができる。種々の徐放性材料が確立されており、当業者には周知である。徐放性製剤は、その化学的性質に応じて、投与に続いて数週間から１００日を超えるまでの間ナノ粒子を放出しうる。

【0238】

経口投与に関して、組成物は、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液及び同類の物として処方することができる。

【0239】

がんを治療するために処方される場合、開示された組成物は、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ－２、ＭＤＲ－１、ｐ２１、ｐ１６、ｂａｘ、ｂｃｌ－ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ－Ｉ ＶＥＧＦ、アンジオスタチン、オンコスタチン、エンドスタチン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα及び／又はＨＳＶ－ｔｋから選択される１種以上の抗がん遺伝子を担持するヌクレオチドも含むことができる。

【0240】

本明細書に開示されるいかなる組成物製剤も、研究のためであれ、予防的治療であれ、及び／又は治療的処置であれ、投与の効果を凌ぐ著しく有害な、アレルギー性の又は他の都合の悪い反応を生じない担体を含む他のいかなる薬学的に許容される担体でも有利に含むことができる。例示的な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年に開示されている。さらに、製剤は、米国食品医薬品局生物製剤基準局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）及び／又は他の関連する外国規制当局により要求される無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度基準を満たすように調製することができる。

【0241】

特定の実施形態において、ナノ粒子は、例えば、少なくとも０．１％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも１％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも１０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも２０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも３０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも４０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも５０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも６０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも７０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも８０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも９０％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；少なくとも９５％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子；又は少なくとも９９％ ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗナノ粒子を含むことができる組成物の一部として提供される。

【0242】

（１０）使用方法。本明細書に開示される方法は、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子をマクロファージ中に導入することにより、マクロファージの活性状態を不活性化状態から活性化状態に変更することを含む。特定の実施形態において、変更により、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で治療したマクロファージの集団において不活性化状態のマクロファージ（例えば、Ｍ２マクロファージ）のパーセンテージは、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で治療されたことがない不活性化状態のマクロファージのパーセンテージと比べて、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く減少する。特定の実施形態において、変更により、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で治療したマクロファージの集団において不活性化状態のマクロファージ（例えば、Ｍ２マクロファージ）の数は、１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子で治療されたことがない不活性化状態のマクロファージの数と比べて、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれよりも多く減少する。

【0243】

特定の実施形態では、マクロファージ中に１つ以上のＩＲＦ及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を導入することによりマクロファージの活性化状態を不活性状態から活性化された状態に変更することにより：固形腫瘍などの治療部位又は感染若しくは炎症の部位中へのリンパ球遊走及び浸潤を回復させる；ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＦＮγ、及び／又はＴＮＦαを含む炎症促進性（抗腫瘍）サイトカインの放出を１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く増やす；ＩＬ－６を含むＭ２マクロファージ表現型に関連するサイトカインの放出を１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、又はそれよりも多く低減する。

【0244】

特定の実施形態において、マクロファージの活性状態を不活性化状態から活性化状態に変更することは、ＩＲＦ５及びＩＲＦ８をコードするヌクレオチドを含むナノ粒子をマクロファージ中に導入することを含む。特定の実施形態において、マクロファージの活性状態を不活性化状態から活性化状態に変更することは、構成的に活性である又はその野生型の対応物ＩＲＦよりも活性である突然変異ＩＲＦをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子をマクロファージ中に導入することを含む。

【0245】

本明細書で開示される方法は、遺伝的に改変された単球／マクロファージからの多特異性分子（例えば、二重特異性分子）並びに任意選択的にＴＧＦβインヒビターの分泌をさらにもたらす。

【0246】

本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される組成物で対象（ヒト、獣医動物、家畜及び研究動物）を治療することを含む。対象を治療することは、治療有効量を送達することを含む。治療有効量は、有効量、予防的治療及び／又は治療的処置を提供することができる。

【0247】

「有効量」は、対象において所望の生理的変化を生じるのに必要な化合物の量である。有効量は、研究目的で投与されることも多い。本明細書に開示される有効量は、対象において細胞を免疫調節する。特定の実施形態において、免疫調節される細胞は免疫抑制された細胞である。特定の実施形態において、免疫調節される細胞はマクロファージである。特定の実施形態において、マクロファージの免疫調節は、免疫抑制されたマクロファージを活性化マクロファージに切り替えることを含む。特定の実施形態において、マクロファージの免疫調節は、Ｍ２マクロファージをＭ１マクロファージに切り替えることを含む。特定の実施形態において、免疫調節される細胞は、ＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ、ＤＣｒｅｇ、好中球、Ｔｈ１７、Ｂｒｅｇ、及び／又はＭＳＣを含む免疫抑制された細胞を含む。特定の実施形態において、免疫抑制された細胞の免疫調節は、腫瘍促進性（ｐｒｏｔｕｍｏｒ）から抗腫瘍への免疫抑制された細胞の表現型的及び／又は機能的切り替えを含む。

【0248】

「予防的治療」は、疾患又は状態をさらに発症するリスクを縮小する、予防する、又は減少する目的で治療が施されるように、疾患若しくは状態の徴候若しくは症状を示さない又は疾患若しくは状態の初期徴候若しくは症状のみを示す対象に施される治療を含む。したがって、予防的治療は、疾患又は障害に対する予防治療として機能する。例えば、特定の実施形態では、予防治療は、再発の発生を低減又は遅延させる目的で治療が施されるように、がんを有していたが寛解期にある対象への本明細書で開示される組成物の投与を含む。

【0249】

「治療的処置」は、疾患又は状態の症状又は徴候を示す対象に施される治療を含み、疾患又は状態の徴候又は症状を縮小する又は取り除く目的で対象に施される。例えば特定の実施形態において、治療的処置は、腫瘍及び／又は転移を縮小する又は取り除くためにがんを抱えた対象に本明細書に開示される組成物を投与することを含む。

【0250】

特定の実施形態において、治療有効量は、対象において抗ガン効果を提供する。がん（医学用語：悪性新生物）とは、細胞の群が制御されない成長（正常な限界を超えた分裂）、浸潤（隣接する組織への侵入及びこの破壊）、及び時に転移を示す疾患のクラスのことである。「転移」とは、その最初の増殖部位から身体の別の部分へのがん細胞の広がりのことである。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外マトリックスの侵襲、内皮基底膜を貫入し体腔及び血管への進入、次に、血液により運ばれた後、標的臓器への浸潤に依存する。最終的に、標的部位での新しい腫瘍、すなわち、二次腫瘍又は転移腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍転移は原発腫瘍を切除後でさえ起こることが多い。なぜならば、腫瘍細胞又は成分が残っていて転移能を身に着けることがあるからである。

【0251】

特定の実施形態において、治療有効量は対象において抗腫瘍効果を提供する。「腫瘍」とは、細胞の異常な成長により形成される腫脹又は病変（新生細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる）である。「腫瘍細胞」は、急速な制御されない細胞増殖により分裂し、新たな分裂を開始させた刺激が止んだ後分裂し続ける異常な細胞である。腫瘍は、構造組織及び正常細胞との機能的な協調の部分的又は完全な欠如を示し、通常は、異なった組織塊を形成するが、これは良性、前悪性又は悪性の場合がある。

【0252】

抗腫瘍効果とは生物学的効果のことであり、これは、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、腫瘍量の減少、平均寿命の増加、がん細胞のアポトーシスの誘導、がん細胞死の誘導、がん細胞の化学受容性又は放射線感受性の誘導、がん細胞近辺の血管新世の阻害、がん細胞増殖の阻害、腫瘍成長の阻害、転移の防止、対象の寿命の延長、がんに伴う疼痛の減少、転移の数の縮小、及び／又は治療に続くがんのぶり返し若しくは再発の減少により明らかにすることができる。したがって、本明細書に開示される組成物は、種々のがんを治療するのに使用することができ、転移を予防する若しくは著しく遅延させることができ、及び／又は再発を予防する若しくは著しく遅延させることができる。特定の実施形態において、がんを本明細書に開示されるナノ粒子組成物で治療した対象の全生存期間は、同じがんがナノ粒子で治療されていない対照の対象と比べた場合、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、又はそれよりも多く改善される。特定の実施形態において、がんを本明細書に開示されるナノ粒子組成物で治療した対象の転移の数は、同じがんがナノ粒子で治療されていない対照の対象と比べた場合、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれよりも多く減少する。

【0253】

特定の実施形態において、治療的処置は、腫瘍を縮小する又は取り除くために、がんを抱えた対象への本明細書に開示される組成物の他の療法と組み合わせての投与を含む。特定の実施形態において、本明細書に開示される組成物と組み合わせて使用する療法は、がんワクチン、ＣＡＲ免疫療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ免疫療法）、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、シグナル伝達阻害剤、遺伝子発現調節剤、アポトーシス誘導剤、血管新生阻害剤、及び毒性分子を送達するモノクローナル抗体を含む。特定の実施形態において、がんを抱えた対象への本明細書に開示されるナノ粒子組成物の放射線療法と組み合わせての投与により、全生存期間は、同じがんが放射線療法と組み合わせてナノ粒子組成物を投与されていない対照の対象と比べた場合、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、又はそれよりも多く改善される。

【0254】

本明細書に開示されるシステム及び方法で治療することができるがんは、卵巣がん、乳がん、脳がん、黒色腫、肺転移、精上皮腫、奇形腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、副腎がん、甲状腺がん、皮膚がん、子宮頸がん、腸がん、肝臓がん、結腸がん、胃がん、頭頚部がん、胃腸がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵臓がん、耳、鼻及び喉（ＥＮＴ）がん、前立腺がん、子宮のがん、肺がん、並びにこれらの転移を含む。

【0255】

特定の実施形態では、治療有効量は抗病原体効果を与える。抗病原体効果は、抗感染効果を含むことができる。抗感染効果は、感染症の発生の減少、感染症の重症度の減少、感染症の期間の減少、感染細胞の数の減少、感染組織の体積の減少、平均寿命の増加、免疫クリアランスに対する感染細胞の誘導された感受性、低減した感染関連疼痛、及び／又は治療された感染に関連する症状の低減若しくは除去を含むことができる。

【0256】

特定の実施形態では、治療有効量は抗炎症性効果を与える。抗炎症性効果は、低減した炎症関連疼痛、熱、発赤、腫脹及び／又は機能の消失を含むことができる。

【0257】

特定の実施形態では、治療有効量は、抗クローン病効果又は抗潰瘍性大腸炎効果を与える。抗クローン病効果又は抗潰瘍性大腸炎効果は、低減した下痢、低減した直腸出血、低減した不可解な体重減少、低減した発熱、低減した腹痛及び筋痙攣、低減した疲労及び活力低下感、並びに／又は回復した食欲を含むことができる。

【0258】

特定の実施形態では、治療有効量は抗関節炎効果を与える。抗関節炎効果は、関節での低減した疼痛、凝り、腫脹、発赤及び／又は回復した可動域を含むことができる。関節炎のタイプは、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎、及び乾癬性関節炎を含む。

【0259】

特定の実施形態では、治療有効量は抗尋常性乾癬効果を与える。抗尋常性乾癬効果は、低減した赤い斑点、鱗屑斑点（ｓｃａｌｉｎｇ ｓｐｏｔｓ）、掻痒、熱さ（ｂｕｒｎｉｎｇ）、ひりひりする痛み、爪床異常及び／又は腫大した若しくは強張った関節を含むことができる。

【0260】

投与に関して、治療有効量（本明細書において用量とも呼ばれる）は、インビトロアッセイ及び／又は動物モデル研究からの結果に基づいて最初に評価することができる。例えば、用量は、特定の標的に対する細胞培養において決定されるＩＣ_５０を含む循環濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報を使用すれば、目的の対象における有用な用量をより的確に決定することができる。

【0261】

特定の対象に投与される実際の服用量は、医師、獣医師又は研究者により、標的、体重、状態の重症度、疾患の種類、以前の又は同時の治療介入、対象の特発性及び投与経路を含む身体的及び生理的要因などのパラメータを考慮に入れて決定することができる。

【0262】

有用な用量は、０．１～５μｇ／ｋｇ又は０．５～１μｇ／ｋｇの範囲に及ぶことが多い。特定の実施形態において、用量は、１μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、８５μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、９５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、０．１～５ｍｇ／ｋｇ又は０．５～１ｍｇ／ｋｇを含むことができる。特定の実施形態において、用量は、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍμｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ又はそれよりも多く含むことができる。

【0263】

治療有効量は、治療計画の進行中に単回又は複数回用量を投与することにより達成することができる（例えば、毎日、１日おき、３日毎に、４日毎に、５日毎に、６日毎に、毎週、２週間毎に、３週間毎に、毎月、２カ月毎に、３カ月毎に、４カ月毎に、５カ月毎に、６カ月毎に、７カ月毎に、８カ月毎に、９カ月毎に、１０カ月毎に、１１カ月毎に、１年毎に）。特定の実施形態において、治療有効量は、治療計画の進行中に反復用量を投与することにより達成することができる。

【0264】

本明細書に記載されるナノ粒子組成物は、注射、吸入、注入、灌流、洗浄又は経口摂取により投与することができる。投与経路は、静脈内、皮内、動脈内、非経口内、鼻腔内、リンパ節内、リンパ内、腹腔内、頭蓋内、病巣内、前立腺内、膣内、直腸内、局所的、くも膜下腔内、腫瘍内、筋肉内、小胞内、経口、皮下、及び／又は舌下投与、さらに詳細には、静脈内、腫瘍内、腹腔内、及び／又は頭蓋内注射によりを含むことができる。局所投与は、本明細書に開示される組成物の治療有効量を身体の特定の領域、器官、又は腔に投与することを含む。例えば、腹腔内注射を使用すれば、卵巣がんを治療する治療薬を送達することができる、又は頭蓋内注射を使用すれば、神経膠腫を治療する治療薬を送達することができる。腫瘍部位での治療薬の投与は、上記のターゲティングリガンドを使用する腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞への治療薬（例えば、ナノ粒子組成物）のリガンド媒介ターゲティングを含むことができ、この治療薬は健康な組織には向かわない。腫瘍部位での治療薬の投与は、腫瘍細胞及び／又は腫瘍支持細胞への治療薬（例えば、ナノ粒子組成物）の受動的ターゲティングを含むことができ、この治療薬は健康な組織には向かわない。受動的ターゲティングの特定の実施形態は、ナノ粒子のサイズ範囲並びに腫瘍組織の漏れ穴のある脈管構造及びリンパ排出障害に基づく亢進された浸透性及び保持（ＥＰＲ）現象を含むことができる。これとは対照的に、全身投与は全身に及び、典型的には、循環中への組成物又は治療薬の静脈内注射により達成される。治療薬の全身投与は、転移してしまったがんなどの局在性の少ない形態のがんに有用であることが可能である。

【0265】

（１１）例示的な実施形態。

【0266】

１．専門食細胞に結合するターゲティングリガンド；並びに
第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを少なくとも有するタンパク質分子をコードする核酸
を含むナノ粒子であって、
第１の結合ドメインが、免疫細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的であり、
第２の結合ドメインが、目的の細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的である、ナノ粒子。

【0267】

２．目的の細胞が、がん細胞、感染細胞、自己反応性細胞、又は原核細胞である、実施形態１のナノ粒子。

【0268】

３．ターゲティングリガンドが、単球、マクロファージ、又は両方により発現される細胞表面タンパク質に結合する、実施形態１又は２のナノ粒子。

【0269】

４．ターゲティングリガンドがジマンノースを含む、実施形態１～３のいずれかのナノ粒子。

【0270】

５．核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、実施形態１～４のいずれかのナノ粒子。

【0271】

６．ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、実施形態５のナノ粒子。

【0272】

７．ｍＲＮＡが、合成ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）を含む、実施形態６のナノ粒子。

【0273】

８．第１の結合ドメインがリンパ球の細胞表面タンパク質に特異的である、実施形態１～７のいずれかのナノ粒子。

【0274】

９．リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞を含む群から選択される、実施形態８のナノ粒子。

【0275】

１０．第１の結合ドメインが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞を含む群から選択されるＴ細胞の細胞表面タンパク質に特異的である、実施形態１～９のいずれかのナノ粒子。

【0276】

１１．第１の結合ドメインがＣＤ３に特異的である、実施形態１～１０のいずれかのナノ粒子。

【0277】

１２．タンパク質分子が多特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、実施形態１～１１のいずれかのナノ粒子。

【0278】

１３．タンパク質分子がＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、実施形態１～１２のいずれかのナノ粒子。

【0279】

１４．第２の結合ドメインが目的の細胞により発現される抗原に特異的である、実施形態１～１３のいずれかのナノ粒子。

【0280】

１５．１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする第２の核酸をさらに含む、実施形態１～１４のいずれかのナノ粒子。

【0281】

１６．腫瘍細胞増殖インヒビター又は腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸をさらに含む、実施形態１～１５のいずれかのナノ粒子。

【0282】

１７．核酸が、抗体、又は抗体の抗原結合断片をコードする、実施形態１～１６のいずれかのナノ粒子。

【0283】

１８．ナノ粒子が、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌインヒビター又はＴＧＦβインヒビターをコードする核酸を含む、実施形態１～１７のいずれかのナノ粒子。

【0284】

１９．ナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子である、実施形態１～１８のいずれかのナノ粒子。

【0285】

２０．第１の複数のナノ粒子のそれぞれが、
専門食細胞に結合するターゲティングリガンド
を含む第１の複数のナノ粒子と；
免疫細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第１の結合ドメイン、及び目的の細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを有するタンパク質分子をコードする核酸と
を含む組成物。

【0286】

２１．目的の細胞が、がん細胞、感染細胞、自己反応性細胞、又は原核細胞である、実施形態２０の組成物。

【0287】

２２．ターゲティングリガンドが、単球、マクロファージ、又は両方により発現される細胞表面タンパク質に結合する、実施形態２０又は２１の組成物。

【0288】

２３．ターゲティングリガンドがジマンノースを含む、実施形態２０～２２のいずれかの組成物。

【0289】

２４．核酸がＲＮＡを含む、実施形態２０～２３のいずれかの組成物。

【0290】

２５．ＲＮＡがｍＲＮＡを含む、実施形態２４の組成物。

【0291】

２６．ｍＲＮＡが、合成ＲＮＡ又はＩＶＴ ＲＮＡを含む、実施形態２５の組成物。

【0292】

２７．第１の結合ドメインがリンパ球の細胞表面タンパク質に特異的である、実施形態２０～２６のいずれかの組成物。

【0293】

２８．リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＴＩＬ細胞を含む群から選択される、実施形態２７の組成物。

【0294】

２９．第１の結合ドメインが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞を含む群から選択されるＴ細胞の細胞表面タンパク質に特異的である、実施形態２０～２８のいずれかの組成物。

【0295】

３０．第１の結合ドメインがＣＤ３に特異的である、実施形態２０～２９のいずれかの組成物。

【0296】

３１．タンパク質分子が二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、実施形態２０～３０のいずれかの組成物。

【0297】

３２．タンパク質分子がＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、実施形態２０～３１のいずれかの組成物。

【0298】

３３．第２の結合ドメインが目的の細胞により発現される抗原に特異的である、実施形態２０～３２のいずれかの組成物。

【0299】

３４．薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態２０～３３のいずれかの組成物。

【0300】

３５．第１の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、及び（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸のうちの１つ以上をさらに含む、実施形態２０～３４のいずれかの組成物。

【0301】

３６．第１の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態２０～３５のいずれかの組成物。

【0302】

３７．第２の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、及び（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸のうちの１つ以上を含む、第２の複数のナノ粒子
をさらに含む、実施形態２０～３６のいずれかの組成物。

【0303】

３８．腫瘍細胞増殖インヒビターをさらに含む、実施形態２０～３７のいずれかの組成物。

【0304】

３９．第１又は第２の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸をさらに含む、実施形態２０～３８のいずれかの組成物。

【0305】

４０．第１又は第２の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、腫瘍細胞増殖インヒビターの抗体の抗原結合断片をコードする核酸をさらに含む、実施形態２０～３９のいずれかの組成物。

【0306】

４１．第２の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態３７～４０のいずれかの組成物。

【0307】

４２．第３の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが腫瘍細胞増殖インヒビターの抗体の抗原結合断片をコードする核酸を含む、第３の複数のナノ粒子をさらに含む、実施形態２０～４１のいずれかの組成物。

【0308】

４３．腫瘍細胞増殖インヒビターが、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌインヒビター又はＴＧＦβインヒビターである、実施形態３８～４２のいずれかの組成物。

【0309】

４４．第２の複数のナノ粒子の非存在下で、第１の複数のナノ粒子及び第３の複数のナノ粒子を含む、実施形態４２又は４３の組成物。

【0310】

４５．第３の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態４２～４４のいずれかの組成物。

【0311】

４６．ヒト対象において状態を治療するための組成物であって、
複数のナノ粒子のそれぞれが、
（ｉ）単球、マクロファージ、又は両方に結合するターゲティングリガンド；並びに
（ｉｉ）リンパ球により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第１の結合ドメイン及び目的の細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを少なくとも有するタンパク質分子をコードするｍＲＮＡ
を含む、第１の複数のナノ粒子
を含み、
第１の複数のナノ粒子が、ヒト対象において免疫応答を刺激又は増強し、それによって状態を治療する、組成物。

【0312】

４７．目的の細胞が、がん細胞、感染細胞、自己反応性細胞、又は原核細胞である、実施形態４６の組成物。

【0313】

４８．ターゲティングリガンドがジマンノースを含む、実施形態４６又は４７のいずれかの組成物。

【0314】

４９．ｍＲＮＡが、合成ＲＮＡ又はＩＶＴ ＲＮＡを含む、実施形態４６～４８のいずれかの組成物。

【0315】

５０．第１の結合ドメインがリンパ球の細胞表面タンパク質に特異的である、実施形態４６～４９のいずれかの組成物。

【0316】

５１．リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びＴＩＬ細胞を含む群から選択される、実施形態５０の組成物。

【0317】

５２．第１の結合ドメインが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞を含む群から選択されるＴ細胞の細胞表面タンパク質に特異的である、実施形態４６～５１のいずれかの組成物。

【0318】

５３．第１の結合ドメインがＣＤ３に特異的である、実施形態４６～５２のいずれかの組成物。

【0319】

５４．タンパク質分子が二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、実施形態４６～５３のいずれかの組成物。

【0320】

５５．タンパク質分子がＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、実施形態４６～５４のいずれかの組成物。

【0321】

５６．第２の結合ドメインが目的の細胞により発現される抗原に特異的である、実施形態４６～５５のいずれかの組成物。

【0322】

５７．薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態４６～５６のいずれかの組成物。

【0323】

５８．第１の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするｍＲＮＡ、（ｂ）ＩＫＫβをコードするｍＲＮＡ、又は（ｃ）１つ以上のＩＲＦをコードするｍＲＮＡ及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡ、並びに（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードするｍＲＮＡのうちの１つ以上をさらに含む、実施形態４６～５７のいずれかの組成物。

【0324】

５９．第１の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態４６～５８のいずれかの組成物。

【0325】

６０．第２の複数のナノ粒子のそれぞれが、
単球、マクロファージ、又は両方に結合するターゲティングリガンド、並びに
（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、（ｂ）ＩＫＫβをコードするｍＲＮＡ、及び（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードするｍＲＮＡのうちの１つ以上を含む、第２の複数のナノ粒子
をさらに含む、実施形態４６～５９のいずれかの組成物。

【0326】

６１．第２の複数のナノ粒子が、腫瘍細胞増殖インヒビターの抗体の抗原結合断片をコードするｍＲＮＡを含む、実施形態６０の組成物。

【0327】

６２．腫瘍細胞増殖インヒビターが、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌインヒビター又はＴＧＦβインヒビターである、実施形態６０又は６１の組成物。

【0328】

６３．第２の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態６０～６２のいずれかの組成物。

【0329】

６４．ヒト対象において状態を治療するための方法であって、第１の複数のナノ粒子を含む組成物をヒト対象に投与することを含み、
第１の複数のナノ粒子のそれぞれが、
（ｉ）単球、マクロファージ、又は両方に結合するターゲティングリガンド；並びに
（ｉｉ）リンパ球により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第１の結合ドメイン及び目的の細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを少なくとも有するタンパク質分子をコードするｍＲＮＡ
を含み、
複数のナノ粒子が、ヒト対象において免疫応答を刺激又は増強し、それによって状態を治療する、方法。

【0330】

６５．目的の細胞が、がん細胞、感染細胞、自己反応性細胞、又は原核細胞である、実施形態６４の方法。

【0331】

６６．ターゲティングリガンドがジマンノースを含む、実施形態６４又は６５の方法。

【0332】

６７．ｍＲＮＡが、合成ＲＮＡ又はＩＶＴ ＲＮＡを含む、実施形態６４～６６のいずれかの方法。

【0333】

６８．リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びＴＩＬ細胞を含む群から選択される、実施形態６４～６７のいずれかの方法。

【0334】

６９．第１の結合ドメインが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞を含む群から選択されるＴ細胞の細胞表面タンパク質に特異的である、実施形態６４～６８のいずれかの方法。

【0335】

７０．第１の結合ドメインがＣＤ３に特異的である、実施形態６４～６９のいずれかの方法。

【0336】

７１．タンパク質分子が二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、実施形態６４～７０のいずれかの方法。

【0337】

７２．タンパク質分子がＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、実施形態６４～７１のいずれかの方法。

【0338】

７３．第２の結合ドメインが目的の細胞により発現される抗原に特異的である、実施形態６４～７２のいずれかの方法。

【0339】

７４．組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態６４～７３のいずれかの方法。

【0340】

７５．第１の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸、及び（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸のうちの１つ以上をさらに含む、実施形態６４～７４のいずれかの方法。

【0341】

７６．第１の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態６４～７５のいずれかの組成物。

【0342】

７７．第２の複数のナノ粒子のそれぞれが、
単球、マクロファージ、又は両方に結合するターゲティングリガンド、並びに
（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするｍＲＮＡ、及び（ｂ）ＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを含む、第２の複数のナノ粒子を含む組成物をヒト対象に投与することをさらに含む、実施形態６４～７６のいずれかの方法。

【0343】

７８．第１又は第２の複数のナノ粒子の少なくともサブセットが、腫瘍細胞増殖インヒビターをコードするｍＲＮＡをさらに含む、実施形態７５～７７のいずれかの方法。

【0344】

７９．第２の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態７７又は７８の組成物。

【0345】

８０．第３の複数のナノ粒子のそれぞれが、
単球、マクロファージ、又は両方に結合するターゲティングリガンド、及び
腫瘍細胞増殖インヒビターをコードするｍＲＮＡ
を含む、第３の複数のナノ粒子を含む組成物をヒト対象に投与することをさらに含む、実施形態６４～７９のいずれかの方法。

【0346】

８１．腫瘍細胞増殖インヒビターをコードするｍＲＮＡが、腫瘍細胞増殖インヒビターの抗体の抗原結合断片をコードする、実施形態７５～８０のいずれかの方法。

【0347】

８２．腫瘍細胞増殖インヒビターが、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌインヒビター又はＴＧＦβインヒビターである、実施形態７５～８１のいずれかの方法。

【0348】

８３．第３の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態８０～８２のいずれかの組成物。

【0349】

８４．第１の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップ及び第２の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップが同時に又は逐次実施される、実施形態７７～８３のいずれかの方法。

【0350】

８５．第１の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップが、第２の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップ後に実施される、実施形態７７～８３のいずれかの方法。

【0351】

８６．第３の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップが、第１の複数のナノ粒子を投与するステップと同時に又は逐次実施される、実施形態８０～８５のいずれかの方法。

【0352】

８７．第３の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップが、第２の複数のナノ粒子を投与するステップと同時に又は逐次実施される、実施形態８０～８５のいずれかの方法。

【0353】

８８．第２の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップなしで第１の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップ及び第３の複数のナノ粒子を含む組成物を投与するステップを含む、実施形態８０～８５のいずれかの方法。

【0354】

８９．免疫細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第１の結合ドメイン及び目的の細胞により発現される細胞表面タンパク質に特異的な第２の結合ドメインを少なくとも有するタンパク質分子をコードする核酸が積載されたナノ粒子を含み、
ナノ粒子が食細胞の表面に付着しているか、又は食細胞により内在化されている、改変された専門食細胞。

【0355】

９０．目的の細胞が、がん細胞、感染細胞、自己反応性細胞、又は原核細胞である、実施形態８９の改変された専門食細胞。

【0356】

９１．食細胞が単球又はマクロファージである、実施形態８９又は９０のいずれかの改変された専門食細胞。

【0357】

９２．食細胞が腫瘍関連マクロファージである、実施形態８９～９１のいずれかの改変された専門食細胞。

【0358】

９３．核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、実施形態８９～９２のいずれかの改変された専門食細胞。

【0359】

９４．ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、実施形態９３の改変された専門食細胞。

【0360】

９５．ｍＲＮＡが、合成ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）を含む、実施形態９４の改変された専門食細胞。

【0361】

９６．第１の結合ドメインがリンパ球の細胞表面タンパク質に特異的である、実施形態８９～９５のいずれかの改変された専門食細胞。

【0362】

９７．リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴＩＬ細胞を含む群から選択される、実施形態９６の改変された専門食細胞。

【0363】

９８．第１の結合ドメインが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞を含む群から選択されるＴ細胞の細胞表面タンパク質に特異的である、実施形態８９～９７のいずれかの改変された専門食細胞。

【0364】

９９．第１の結合ドメインがＣＤ３に特異的である、実施形態８９～９８のいずれかの改変された専門食細胞。

【0365】

１００．タンパク質分子が二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、実施形態８９～９９のいずれかの改変された専門食細胞。

【0366】

１０１．タンパク質分子がＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである、実施形態８９～１００のいずれかの改変された専門食細胞。

【0367】

１０２．ナノ粒子が、（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸、及び（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸のうちの１つ以上をさらに積載されている、実施形態８９～１０１のいずれかの改変された専門食細胞。

【0368】

１０３．ナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態８９～１０２のいずれかの改変された専門食細胞。

【0369】

１０４．（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸、及び（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸のうちの１つ以上が積載されている第２のナノ粒子をさらに含み、
第２のナノ粒子が食細胞の表面に付着しているか、又は食細胞により内在化されている、実施形態８９～１０３のいずれかの改変された専門食細胞。

【0370】

１０５．第２の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態１０４の改変された専門食細胞。

【0371】

１０６．第１又は第２のナノ粒子が、腫瘍細胞増殖インヒビターの抗体又は抗体の抗原結合断片をコードする核酸が積載されている、実施形態１０４又は１０５の改変された専門食細胞。

【0372】

１０７．腫瘍細胞増殖インヒビターが、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌインヒビター又はＴＧＦβインヒビターである、実施形態１０２～１０６のいずれかの改変された専門食細胞。

【0373】

１０８．（ａ）１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードする核酸、（ｂ）ＩＫＫβをコードする核酸、又は（ｃ）腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸のうちの１つ以上が積載された第２のナノ粒子、
腫瘍細胞増殖インヒビターをコードする核酸が積載された第３のナノ粒子、
のうちの少なくとも１つをさらに含み、
第２及び第３のナノ粒子のそれぞれが、食細胞の表面に付着しているか、又は食細胞により内在化されている、実施形態８９～１０７のいずれかの改変された専門食細胞。

【0374】

１０９．第３の複数のナノ粒子が、リポソーム、リポソームナノ粒子、脂質ナノ粒子、又は固形脂質ナノ粒子を含む、実施形態１０８の改変された専門食細胞。

【0375】

１１０．正電荷ポリマーコア、及びポリマーコアの周囲の中性又は負電荷被覆を含み、正電荷ポリマーコアが、免疫細胞活性化エピトープに結合する少なくとも１つの結合ドメイン及び／又は目的の細胞上の抗原に結合する少なくとも１つの結合ドメインをコードするヌクレオチドをカプセル化している、ナノ粒子。

【0376】

１１１．ナノ粒子が１３０ｎｍ未満である、実施形態１１０のナノ粒子。

【0377】

１１２．正電荷ポリマーが、ポリ（β－アミノエステル）、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アミン－コ－エステル）、ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、又はポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、実施形態１１０又は１１１のナノ粒子。

【0378】

１１３．正電荷ポリマーがポリ（β－アミノエステル）を含む、実施形態１１０～１１２のいずれかのナノ粒子。

【0379】

１１４．中性又は負電荷被覆が、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸、又はコレステリルヘミスクシナート／１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンを含む、実施形態１１０～１１３のいずれかのナノ粒子。

【0380】

１１５．中性又は負電荷被覆がポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、実施形態１１０～１１４のいずれかのナノ粒子。

【0381】

１１６．中性又は負電荷被覆が双性イオンポリマーを含む、実施形態１１０～１１５のいずれかのナノ粒子。

【0382】

１１７．中性又は負電荷被覆がリポソームを含む、実施形態１１０～１１６のいずれかのナノ粒子。

【0383】

１１８．リポソームが、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＭＡ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’、Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシル－アミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、実施形態１１７のナノ粒子。

【0384】

１１９．ヌクレオチドがリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、実施形態１１０～１１８のいずれかのナノ粒子。

【0385】

１２０．ＲＮＡが合成ＲＮＡを含む、実施形態１１９のナノ粒子。

【0386】

１２１．ＲＮＡがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、実施形態１１９又は１２０のナノ粒子。

【0387】

１２２．ヌクレオチドが組み込み又は非組み込み二本鎖ＤＮＡを含む、実施形態１１０～１２１のいずれかのナノ粒子。

【0388】

１２３．ヌクレオチドが、プラスミド、ミニサークルプラスミド、又は閉鎖末端線状ｃｅＤＮＡの形態である、実施形態１１０～１２２のいずれかのナノ粒子。

【0389】

１２４．目的の細胞上の抗原が、卵巣がん細胞、黒色腫細胞、神経膠芽腫細胞、多発性骨髄腫細胞、黒色腫細胞、前立腺がん細胞、乳がん細胞、幹細胞がん細胞、中皮腫細胞、腎細胞癌細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、胆管細胞癌細胞、膀胱がん細胞、神経芽細胞腫細胞、結腸直腸がん細胞、又はメルケル細胞癌細胞により発現されるがん抗原である、実施形態１１０～１２３のいずれかのナノ粒子。

【0390】

１２５．がん抗原が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、カルボキシ－アンヒドラーゼ－ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ジシアロガングリオシド、ＥｐＣａｍ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＲＢＢ２、葉酸受容体（ＦＯＬＲ）、ＧＤ２、グリピカン－２、ＨＥＲ２、ルイスＹ、Ｌ１－ＣＡＭ、メソセリン、ＭＵＣ１６、ＰＤ－Ｌ１、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＲＯＲ１、ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５、ＳＶ４０ Ｔ、又はＷＴ－１を含む、実施形態１１０～１２４のいずれかのナノ粒子。

【0391】

１２６．がん抗原に結合する結合ドメインが、抗体アデカツムマブ、アネツマブ、ラブタンシン、アマツキシマブ、ＨＮ１、オレゴボマブ、オバレックス、アバゴモマブ、エドレコロマブ、ファルレツズマブ、フランボツマブ、ＴＡ９９、２０Ｄ７、セツキシマブ、ＦＭＣ６３、ＳＪ２５Ｃ１、ＨＤ３７、Ｒ１１、Ｒ１２、２Ａ２、Ｙ３１、４Ｄ５、３Ｇ１０、アテゾリズマブ、アベルマブ、若しくはデュルバルマブの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する、実施形態１１０～１２５のいずれかのナノ粒子。

【0392】

１２７．がん抗原に結合する結合ドメインがタンパク質分子である、実施形態１１０～１２６のいずれかのナノ粒子。

【0393】

１２８．ナノ粒子内のヌクレオチドが、異なるがん抗原に結合する結合ドメインを含む異なるタンパク質分子をコードする、実施形態１２７のナノ粒子。

【0394】

１２９．異なるがん抗原が同じがんタイプにより発現される、実施形態１２８のナノ粒子。

【0395】

１３０．がんタイプが卵巣がん、黒色腫、又は神経膠芽腫である、実施形態１２９のナノ粒子。

【0396】

１３１．異なるがん抗原が、
ＥｐＣａｍ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＭＵＣ１６、葉酸受容体（ＦＯＬＲ）、ルイスＹ、ＲＯＲ１、メソセリン、ＷＴ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、及びＣＤ５６から選択される少なくとも２つのがん抗原；
チロシン関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５）；ＧＤ２、ＰＤ－Ｌ１、及びＥＧＦＲから選択される少なくとも２つのがん抗原；又はＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）及びＩＬ１３Ｒａ２から選択される２つのがん抗原
を含む、実施形態１２８～１３０のいずれかのナノ粒子。

【0397】

１３２．タンパク質分子の少なくとも１つの結合ドメインが、ウイルス抗原、細菌抗原、スーパーバグ抗原、真菌抗原、又は自己免疫若しくはアレルギー抗原に結合する、実施形態１１０～１３１のいずれかのナノ粒子。

【0398】

１３３．ウイルス抗原が、アデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、ハンタウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、ロタウイルス、海綿状ウイルス又はトガウイルスにより発現され；
細菌抗原が、炭疽菌；グラム陰性杆菌、クラミジア、ジフテリア、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ菌、マラリア、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、百日咳毒素、肺炎球菌、リケッチア、ブドウ球菌、連鎖状球菌又は破傷風により発現され；
スーパーバグ抗原が、エンテロコッカス・フェシウム、クロストリジウム・ディフィシル、アシネトバクター・バウマニ、シュードモナス・エルギノーザ、又はエンテロバクター科により発現され；
真菌抗原が、カンジダ、コクシジオイデス属、クリプトコックス、ヒストプラズマ属、リーシュマニア、プラスモディウム属、原生生物、寄生生物、シストソーマ属、ティニア、トキソプラズマ、又はトリパノソーマ・クルーズにより発現され；
自己免疫又はアレルギー抗原が、急性壊死性出血性脳疾患、アレルギー性喘息、円形脱毛症、貧血症、アフタ性潰瘍、関節炎、喘息、自己免疫性甲状腺炎、結膜炎、クローン病、皮膚エリテマトーデス、皮膚炎、糖尿病、真性糖尿病、らい性結節性紅斑、角結膜炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含む、スティーブンスジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、膣炎及び／若しくはウェゲナー肉芽腫症を有する対象により発現され；
並びに／又は抗原に対する結合ドメインがＴＣＲに由来する、
実施形態１３２のナノ粒子。

【0399】

１３４．タンパク質分子の少なくとも１つの結合ドメインが、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープに結合する、実施形態１１０～１３３のいずれかのナノ粒子。

【0400】

１３５．免疫細胞活性化エピトープがＴ細胞により発現される、実施形態１１０～１３４のいずれかのナノ粒子。

【0401】

１３６．Ｔ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＢ７－Ｈ３を含む、実施形態１３５のナノ粒子。

【0402】

１３７．Ｔ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢを含む、実施形態１３５のナノ粒子。

【0403】

１３８．免疫細胞活性化エピトープに結合する結合ドメインがタンパク質分子を含む、実施形態１１０～１３７のいずれかのナノ粒子。

【0404】

１３９．ナノ粒子内のヌクレオチドが、異なる免疫細胞活性化エピトープに結合する結合ドメインを含む異なるタンパク質分子をコードする、実施形態１３８のナノ粒子。

【0405】

１４０．異なる免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ３及びＣＤ２８又はＣＤ３及び４－１ＢＢを含む、実施形態１３９のナノ粒子。

【0406】

１４１．少なくとも１つの結合ドメインが、抗体ＯＫＴ３、２０Ｇ６－Ｆ３、４Ｂ４－Ｄ７、４Ｅ７－Ｃ９、１８Ｆ５－Ｈ１０、ＴＧＮ１４１２、９Ｄ７、９．３、ＫＯＬＴ－２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、ＥＸ５．３Ｄ１０、ＯＫＴ８又はＳＫ１のＣＤＲを含む、実施形態１１０～１４０のいずれかのナノ粒子。

【0407】

１４２．免疫細胞活性化エピトープがＮＫ細胞により発現される、実施形態１１０～１３４のいずれかのナノ粒子。

【0408】

１４３．ＮＫ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、又はＤＮＡＭ－１を含む、実施形態１４２のナノ粒子。

【0409】

１４４．少なくとも１つの結合ドメインが、抗体５Ｃ６、１Ｄ１１、ｍＡｂ ３３、Ｐ４４－８、ＳＫ１、又は３Ｇ８のＣＤＲを含む、実施形態１１０～１４３のいずれかのナノ粒子。

【0410】

１４５．結合ドメインが、タンパク質リンカーを通じて連結されている、実施形態１１０～１４４のいずれかのナノ粒子。

【0411】

１４６．タンパク質リンカーがＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む、実施形態１４５のナノ粒子。

【0412】

１４７．タンパク質リンカーがプロリンリッチなリンカーを含む、実施形態１４５又は１４６のナノ粒子。

【0413】

１４８．タンパク質分子が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、実施形態１１０～１４７のいずれかのナノ粒子。

【0414】

１４９．タンパク質分子が、
ＣＥＡに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＥＧＦＲに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＥｐＣａｍに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＨＥＲ２に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＰＤ－Ｌ１に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＰＳＭＡに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；又は
［ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５］に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン
を含む、実施形態１１０～１４８のいずれかのナノ粒子。

【0415】

１５０．タンパク質分子が、カツマキソマブ、ＭＴ１１０、エルツマキソマブ、ＭＤＸ－４４７、ＭＭ－１４１、ＡＭＧ２１１、ＲＯ６９５８６８８、ＲＯ６８９５８８２、ＴＦ２、ＢＡＹ２０１０１１２、ＡＭＧ７０１、ソリトマブ、又はブリナツモマブを含む、実施形態１４９のナノ粒子。

【0416】

１５１．正電荷ポリマーコアが、１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするヌクレオチドをさらにカプセル化している、実施形態１１０～１５０のいずれかのナノ粒子。

【0417】

１５２．１つ以上のＩＲＦが機能的自己阻害ドメインを欠く、実施形態１５１のナノ粒子。

【0418】

１５３．１つ以上のＩＲＦが機能的核外移行シグナルを欠く、実施形態１５１又は１５２のナノ粒子。

【0419】

１５４．１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合体から選択される、実施形態１５１～１５３のいずれかのナノ粒子。

【0420】

１５５．１つ以上のＩＲＦが、配列番号１～１７に示される配列に対し９０％よりも大きい、９５％よりも大きい、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態１５１～１５４のいずれかのナノ粒子。

【0421】

１５６．１つ以上のＩＲＦが、配列番号１～７に示される配列から選択されるＩＲＦ５を含む、実施形態１５１～１５５のいずれかのナノ粒子。

【0422】

１５７．ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号１又は配列番号３に示される配列を含む、実施形態１５４～１５６のいずれかのナノ粒子。

【0423】

１５８．ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ、及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２に示される配列を含む、実施形態１５４～１５７のいずれかのナノ粒子。

【0424】

１５９．ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ、及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号４に示される配列を含む、実施形態１５４～１５８のいずれかのナノ粒子。

【0425】

１６０．１つ以上のＩＲＦが、配列番号８又は１２に示される配列を含むＩＲＦ１を含む、実施形態１５１～１５９のいずれかのナノ粒子。

【0426】

１６１．１つ以上のＩＲＦが、配列番号１１、１６、又は１７に示される配列を含むＩＲＦ８を含む、実施形態１５１～１６０のいずれかのナノ粒子。

【0427】

１６２．ＩＲＦ８が、Ｋ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号１１に示される配列を含む、実施形態１５４～１６１のいずれかのナノ粒子。

【0428】

１６３．１つ以上のＩＲＦが、構成的活性ドメインであるＮ末端ＩＲＦ７ ＤＮＡ結合ドメイン、及びＣ末端ＩＲＦ３核外移行シグナルを含むＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質を含む、実施形態１５１～１６２のいずれかのナノ粒子。

【0429】

１６４．ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が、配列番号１５に示される配列を含む、実施形態１６３のナノ粒子。

【0430】

１６５．１つ以上のＩＲＦがＩＲＦ４を含む、実施形態１５１～１６４のいずれかのナノ粒子。

【0431】

１６６．ナノ粒子の少なくともサブセットがＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含む、実施形態１１０～１６５のいずれかのナノ粒子。

【0432】

１６７．ＩＫＫβが、配列番号１８～２２から選択される配列に示される配列に対し９０％よりも大きい、９５％よりも大きい、又は９８％よりも大きい同一性を有する配列から選択される、実施形態１６６のナノ粒子。

【0433】

１６８．ＩＫＫβが、配列番号１８～２２から選択される配列に示される配列を含む、実施形態１６６又は１６７のナノ粒子。

【0434】

１６９．ヌクレオチドが配列番号２３～４４から選択される配列に示される配列を含む、実施形態１６６～１６８のいずれかのナノ粒子。

【0435】

１７０．１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子内にカプセル化されている、実施形態１６６～１６９のいずれかのナノ粒子。

【0436】

１７１．１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子コア内にカプセル化されている、実施形態１５１～１７０のいずれかのナノ粒子。

【0437】

１７２．１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが異なるナノ粒子にカプセル化されている、実施形態１５１～１７０のいずれかのナノ粒子。

【0438】

１７３．少なくとも１つ以上の結合ドメインをコードするヌクレオチドが、１つ以上のＩＲＦ及び／又はＩＫＫβをコードするヌクレオチドと同じナノ粒子内にカプセル化されている、実施形態１５１～１７２のいずれかのナノ粒子。

【0439】

１７４．少なくとも１つ以上の結合ドメインをコードするヌクレオチドが、１つ以上のＩＲＦ及び／又はＩＫＫβをコードするヌクレオチドをカプセル化するナノ粒子とは異なるナノ粒子内にカプセル化されている、実施形態１５１～１７２のいずれかのナノ粒子。

【0440】

１７５．形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）インヒビターをさらに含む、実施形態１１０～１７４のいずれかのナノ粒子。

【0441】

１７６．ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβインヒビターをコードするヌクレオチドを含む、実施形態１７５のナノ粒子。

【0442】

１７７．ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβの活性を抑制する抗体のＣＤＲを含む、実施形態１７５又は１７６のナノ粒子。

【0443】

１７８．ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβの活性を抑制する抗体を含む、実施形態１７５～１７７のいずれかのナノ粒子。

【0444】

１７９．抗体が、トラベデルセン（ｔｒａｂｅｄｅｒｓｅｎ）、ジシテルチド（ｄｉｓｉｔｅｒｔｉｄｅ）、メテリムマブ、フレソリムマブ、ＬＹ２３８２７７０、ＳＩＸ－１００、アボタミン（ａｖｏｔｅｒｍｉｎ）、及び／又はＩＭＣ－ＴＲ１を含む、実施形態１７７又は１７８のナノ粒子。

【0445】

１８０．ナノ粒子が、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）をコードするヌクレオチドをさらに含む、実施形態１１０～１７９のいずれかのナノ粒子。

【0446】

１８１．ナノ粒子が、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ－２、ＭＤＲ－１、ｐ２１、ｐ１６、ｂａｘ、ｂｃｌ－ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ－Ｉ ＶＥＧＦ、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、オンコスタチン（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα及び／又はＨＳＶ－ｔｋから選択される抗がん遺伝子を含むヌクレオチドをさらに含む、実施形態１１０～１８０のいずれかのナノ粒子。

【0447】

１８２．ナノ粒子の少なくともサブセットが、１つ以上のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）をコードするヌクレオチドを含み、
ナノ粒子の少なくともサブセットが、少なくとも２つの結合ドメインを有するタンパク質分子をコードするヌクレオチドを含み、
１つの結合ドメインが、治療部位で目的の細胞により発現される抗原に結合し、
１つの結合ドメインが、免疫細胞活性化エピトープに結合する、
ナノ粒子を含むシステム。

【0448】

１８３．目的の細胞が、がん細胞、感染細胞、自己反応性細胞、又は原核細胞である、実施形態１８２のシステム。

【0449】

１８４．目的の細胞ががん細胞であり治療部位が腫瘍部位である、実施形態１８２又は１８３のシステム。

【0450】

１８５．ナノ粒子が１３０ｎｍ未満である、実施形態１８２～１８４のいずれかのシステム。

【0451】

１８６．ナノ粒子が、正電荷コア及びコアの外部表面上に中性又は負電荷被覆を含む、実施形態１８２～１８５のいずれかのシステム。

【0452】

１８７．正電荷コアが、正電荷脂質及び／又は正電荷ポリマーを含む、実施形態１８６のシステム。

【0453】

１８８．正電荷ポリマーが、ポリ（β－アミノエステル）、ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アミン－コ－エステル）、ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、又はポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、実施形態１８６又は１８７のシステム。

【0454】

１８９．正電荷ポリマーがポリ（β－アミノエステル）を含む、実施形態１８６～１８８のいずれかのシステム。

【0455】

１９０．中性又は負電荷被覆が、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸、又はコレステリルヘミスクシナート／１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンを含む、実施形態１８６～１８９のいずれかのシステム。

【0456】

１９１．中性又は負電荷被覆がポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、実施形態１８６～１９０のいずれかのシステム。

【0457】

１９２．中性又は負電荷被覆が双性イオンポリマーを含む、実施形態１８６～１９１のいずれかのシステム。

【0458】

１９３．中性又は負電荷被覆がリポソームを含む、実施形態１８６～１９２のいずれかのシステム。

【0459】

１９４．リポソームが、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＭＡ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’、Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシル－アミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、実施形態１９３のシステム。

【0460】

１９５．ヌクレオチドがリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、実施形態１８２～１９４のいずれかのシステム。

【0461】

１９６．ＲＮＡが合成ＲＮＡを含む、実施形態１９５のシステム。

【0462】

１９７．ＲＮＡがインビトロ転写ｍＲＮＡを含む、実施形態１９５又は１９６のシステム。

【0463】

１９８．ヌクレオチドが組み込み又は非組み込み二本鎖ＤＮＡを含む、実施形態１８２～１９７のいずれかのシステム。

【0464】

１９９．ヌクレオチドが、プラスミド、ミニサークルプラスミド、又は閉鎖末端線状ｃｅＤＮＡの形態である、実施形態１８２～１９８のいずれかのシステム。

【0465】

２００．ヌクレオチドが正電荷コア内にカプセル化されている、実施形態１８２～１９９のいずれかのシステム。

【0466】

２０１．１つ以上のＩＲＦが機能的自己阻害ドメインを欠く、実施形態１８２～２００のいずれかのシステム。

【0467】

２０２．１つ以上のＩＲＦが機能的核外移行シグナルを欠く、実施形態１８２～２０１のいずれかのシステム。

【0468】

２０３．１つ以上のＩＲＦが、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合体から選択される、実施形態１８２～２０２のいずれかのシステム。

【0469】

２０４．１つ以上のＩＲＦが、配列番号１～１７に示される配列に対し９０％よりも大きい、９５％よりも大きい、又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態１８２～２０３のいずれかのシステム。

【0470】

２０５．１つ以上のＩＲＦが、配列番号１～７に示される配列から選択されるＩＲＦ５を含む、実施形態１８２～２０４のいずれかのシステム。

【0471】

２０６．ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号１又は配列番号３に示される配列を含む、実施形態２０５のシステム。

【0472】

２０７．ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ、及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２に示される配列を含む、実施形態２０５又は２０６のシステム。

【0473】

２０８．ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ、及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号４に示される配列を含む、実施形態２０５～２０７のいずれかのシステム。

【0474】

２０９．１つ以上のＩＲＦが、配列番号８又は１２に示される配列を含むＩＲＦ１を含む、実施形態１８２～２０８のいずれかのシステム。

【0475】

２１０．１つ以上のＩＲＦが、配列番号１１、１６、又は１７に示される配列を含むＩＲＦ８を含む、実施形態１８２～２０９のいずれかのシステム。

【0476】

２１１．ＩＲＦ８が、Ｋ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号１１に示される配列を含む、実施形態１８２～２１０のいずれかのシステム。

【0477】

２１２．１つ以上のＩＲＦが、構成的活性ドメインであるＮ末端ＩＲＦ７ ＤＮＡ結合ドメイン、及びＣ末端ＩＲＦ３核外移行シグナルを含むＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質を含む、実施形態１８２～２１１のいずれかのシステム。

【0478】

２１３．ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が、配列番号１５に示される配列を含む、実施形態２１２のシステム。

【0479】

２１４．１つ以上のＩＲＦがＩＲＦ４を含む、実施形態１８２～２１３のいずれかのシステム。

【0480】

２１５．ナノ粒子の少なくともサブセットがＩＫＫβをコードするヌクレオチドを含む、実施形態１８２～２１４のいずれかのシステム。

【0481】

２１６．ＩＫＫβが、配列番号１８～２２から選択される配列に示される配列に対し９０％よりも大きい、９５％よりも大きい、又は９８％よりも大きい同一性を有する配列から選択される、実施形態２１５のシステム。

【0482】

２１７．ＩＫＫβが、配列番号１８～２２から選択される配列に示される配列を含む、実施形態２１５又は２１６のシステム。

【0483】

２１８．ヌクレオチドが、配列番号２３～４４から選択される配列に示される配列を含む、実施形態１８２～２１７のいずれかのシステム。

【0484】

２１９．１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子内にカプセル化されている、実施形態１８２～２１８のいずれかのシステム。

【0485】

２２０．１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが同じナノ粒子コア内にカプセル化されている、実施形態２１９のシステム。

【0486】

２２１．１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチド及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドが異なるナノ粒子にカプセル化されている、実施形態１８２～２１８のいずれかのシステム。

【0487】

２２２．タンパク質分子の少なくとも１つの結合ドメインが、卵巣がん細胞、黒色腫細胞、神経膠芽腫細胞、多発性骨髄腫細胞、黒色腫細胞、前立腺がん細胞、乳がん細胞、幹細胞がん細胞、中皮腫細胞、腎細胞癌細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、胆管細胞癌細胞、膀胱がん細胞、神経芽細胞腫細胞、結腸直腸がん細胞、又はメルケル細胞癌細胞により発現されるがん抗原に結合する、実施形態１８２～２２１のいずれかのシステム。

【0488】

２２３．がん抗原が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、カルボキシ－アンヒドラーゼ－ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ジシアロガングリオシド、ＥｐＣａｍ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＲＢＢ２、葉酸受容体（ＦＯＬＲ）、ＧＤ２、グリピカン－２、ＨＥＲ２、ルイスＹ、Ｌ１－ＣＡＭ、メソセリン、ＭＵＣ１６、ＰＤ－Ｌ１、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＲＯＲ１、ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５、ＳＶ４０ Ｔ、又はＷＴ－１を含む、実施形態２２２のシステム。

【0489】

２２４．タンパク質分子の少なくとも１つの結合ドメインが、抗体アデカトゥマブ、アネツマブ、ラブタンシン、アマツキシマブ、ＨＮ１、オレゴボマブ、オバレックス、アバゴモマブ、エドレコロマブ、ファルレツズマブ、フランボツマブ、ＴＡ９９、２０Ｄ７、セツキシマブ、ＦＭＣ６３、ＳＪ２５Ｃ１、ＨＤ３７、Ｒ１１、Ｒ１２、２Ａ２、Ｙ３１、４Ｄ５、３Ｇ１０、アテゾリズマブ、アベルマブ、若しくはデュルバルマブの相補性決定領域（ＣＤＲ）又はＴＣＲを含む、実施形態１８２～２２３のいずれかのシステム。

【0490】

２２５．システム内の異なるタンパク質分子が、異なるがん抗原に結合する結合ドメインを含む、実施形態１８２～２２４のいずれかのシステム。

【0491】

２２６．異なるがん抗原が同じがんタイプにより発現される、実施形態２２５のシステム。

【0492】

２２７．がんタイプが卵巣がん、黒色腫、又は神経膠芽腫である、実施形態２２６のシステム。

【0493】

２２８．異なるがん抗原が、
ＥｐＣａｍ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＭＵＣ１６、葉酸受容体（ＦＯＬＲ）、ルイスＹ、ＲＯＲ１、メソセリン、ＷＴ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、及びＣＤ５６から選択される少なくとも２つのがん抗原；
チロシン関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５）；ＧＤ２、ＰＤ－Ｌ１、及びＥＧＦＲから選択される少なくとも２つのがん抗原；又は
ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）及びＩＬ１３Ｒａ２から選択される２つのがん抗原
を含む、実施形態２２５～２２７のいずれかのシステム。

【0494】

２２９．タンパク質分子の少なくとも１つの結合ドメインが、ウイルス抗原、細菌抗原、スーパーバグ抗原、真菌抗原、又は自己免疫若しくはアレルギー抗原に結合する、実施形態１８２～２２８のいずれかのシステム。

【0495】

２３０．ウイルス抗原が、アデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、ハンタウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、ロタウイルス、海綿状ウイルス又はトガウイルスにより発現され；
細菌抗原が、炭疽菌；グラム陰性杆菌、クラミジア、ジフテリア、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ菌、マラリア、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、百日咳毒素、肺炎球菌、リケッチア、ブドウ球菌、連鎖状球菌又は破傷風により発現され；
スーパーバグ抗原が、エンテロコッカス・フェシウム、クロストリジウム・ディフィシル、アシネトバクター・バウマニ、シュードモナス・エルギノーザ、又はエンテロバクター科により発現され；
真菌抗原が、カンジダ、コクシジオイデス属、クリプトコックス、ヒストプラズマ属、リーシュマニア、プラスモディウム属、原生生物、寄生生物、シストソーマ属、ティニア、トキソプラズマ、又はトリパノソーマ・クルーズにより発現され；
自己免疫又はアレルギー抗原が、急性壊死性出血性脳疾患、アレルギー性喘息、円形脱毛症、貧血症、アフタ性潰瘍、関節炎、喘息、自己免疫性甲状腺炎、結膜炎、クローン病、皮膚エリテマトーデス、皮膚炎、糖尿病、真性糖尿病、らい性結節性紅斑、角結膜炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含む、スティーブンスジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、膣炎及び／若しくはウェゲナー肉芽腫症を有する対象により発現される；
実施形態２２９のシステム。

【0496】

２３１．タンパク質分子の少なくとも１つの結合ドメインが、Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープに結合する、実施形態１８２～２３０のいずれかのシステム。

【0497】

２３２．免疫細胞活性化エピトープがＴ細胞により発現される、実施形態２３１のシステム。

【0498】

２３３．Ｔ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＢ７－Ｈ３を含む、実施形態２３２のシステム。

【0499】

２３４．Ｔ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢを含む、実施形態２３３のシステム。

【0500】

２３５．システム内の異なるタンパク質分子が、異なる免疫細胞活性化エピトープに結合する結合ドメインを含む、実施形態１８２～２３４のいずれかのシステム。

【0501】

２３６．異なる免疫細胞活性化エピトープが、ＣＤ３及びＣＤ２８又はＣＤ３及び４－１ＢＢを含む、実施形態２３５のシステム。

【0502】

２３７．少なくとも１つの結合ドメインが、抗体ＯＫＴ３、２０Ｇ６－Ｆ３、４Ｂ４－Ｄ７、４Ｅ７－Ｃ９、１８Ｆ５－Ｈ１０、ＴＧＮ１４１２、９Ｄ７、９．３、ＫＯＬＴ－２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、ＥＸ５．３Ｄ１０、ＯＫＴ８又はＳＫ１のＣＤＲを含む、実施形態１８２～２３６のいずれかのシステム。

【0503】

２３８．免疫細胞活性化エピトープがＮＫ細胞により発現される、実施形態２３１のシステム。

【0504】

２３９．ＮＫ細胞により発現される免疫細胞活性化エピトープが、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、又はＤＮＡＭ－１を含む、実施形態２３８のシステム。

【0505】

２４０．少なくとも１つの結合ドメインが、抗体５Ｃ６、１Ｄ１１、ｍＡｂ ３３、Ｐ４４－８、ＳＫ１、又は３Ｇ８のＣＤＲを含む、実施形態１８２～２３９のいずれかのシステム。

【0506】

２４１．タンパク質分子の結合ドメインが、タンパク質リンカーを通じて連結されている、実施形態１８２～２４０のいずれかのシステム。

【0507】

２４２．タンパク質リンカーがＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む、実施形態２４１のシステム。

【0508】

２４３．タンパク質リンカーがプロリンリッチなリンカーを含む、実施形態２４１又は２４２のシステム。

【0509】

２４４．タンパク質分子が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、実施形態１８２～２４３のいずれかのシステム。

【0510】

２４５．タンパク質分子が、
ＣＥＡに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＥＧＦＲに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＥｐＣａｍに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＨＥＲ２に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＰＤ－Ｌ１に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；
ＰＳＭＡに結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン；又は
［ＴＹＲＰ１／ｇｐ７５］に結合する少なくとも１つの結合ドメイン、及びＣＤ３、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢに結合する少なくとも１つの結合ドメイン
を含む、実施形態１８２～２４４のいずれかのシステム。

【0511】

２４６．タンパク質分子が、カツマキソマブ、ＭＴ１１０、エルツマキソマブ、ＭＤＸ－４４７、ＭＭ－１４１、ＡＭＧ２１１、ＲＯ６９５８６８８、ＲＯ６８９５８８２、ＴＦ２、ＢＡＹ２０１０１１２、ＡＭＧ７０１、ソリトマブ、又はブリナツモマブを含む、実施形態１８２～２４５のいずれかのシステム。

【0512】

２４７．少なくとも２つの結合ドメインをコードするヌクレオチドが、１つ以上のＩＲＦ及び／又はＩＫＫβをコードするヌクレオチドと同じナノ粒子内にカプセル化されている、実施形態１８２～２４６のいずれかのシステム。

【0513】

２４８．少なくとも２つの結合ドメインをコードするヌクレオチドが、１つ以上のＩＲＦ及び／又はＩＫＫβをコードするヌクレオチドと同じナノ粒子コア内にカプセル化されている、実施形態２４７のシステム。

【0514】

２４９．少なくとも２つの結合ドメインをコードするヌクレオチドが、１つ以上のＩＲＦ及び／又はＩＫＫβをコードするヌクレオチドをカプセル化するナノ粒子とは異なるナノ粒子内にカプセル化されている、実施形態１８２～２４６のいずれかのシステム。

【0515】

２５０．形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）インヒビターをさらに含む、実施形態１８２～２４９のいずれかのシステム。

【0516】

２５１．ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβインヒビターをコードするヌクレオチドを含む、実施形態２５０のシステム。

【0517】

２５２．ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβの活性を抑制する抗体のＣＤＲを含む、実施形態２５０又は２５１のシステム。

【0518】

２５３．ＴＧＦβインヒビターが、ＴＧＦβの活性を抑制する抗体を含む、実施形態２５０～２５２のいずれかのシステム。

【0519】

２５４．抗体が、トラベデルセン、ジシテルチド、メテリムマブ、フレソリムマブ、ＬＹ２３８２７７０、ＳＩＸ－１００、アボタミン、及び／又はＩＭＣ－ＴＲ１を含む、実施形態２５２又は２５３のシステム。

【0520】

２５５．ナノ粒子が、グルココルチコイド誘導ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）をコードするヌクレオチドをさらに含む、実施形態１８２～２５４のいずれかのシステム。

【0521】

２５６．ナノ粒子が、ｐ５３、ＲＢ、ＢＲＣＡ１、Ｅ１Ａ、ｂｃｌ－２、ＭＤＲ－１、ｐ２１、ｐ１６、ｂａｘ、ｂｃｌ－ｘｓ、Ｅ２Ｆ、ＩＧＦ－Ｉ ＶＥＧＦ、アンギオスタチン、オンコスタチン、エンドスタチン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα及び／又はＨＳＶ－ｔｋから選択される抗がん遺伝子を含むヌクレオチドをさらに含む、実施形態１８２～２５５のいずれかのシステム。

【0522】

２５７．薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態１８２～２５６のいずれかのシステム。

【0523】

２５８．実施形態１８２～２５７のいずれかのシステムのヌクレオチドを発現するように遺伝的に改変された単球又はマクロファージ。

【0524】

２５９．対象内の治療部位でマクロファージ活性化状態を調節し、免疫細胞を治療部位に動員し、動員された免疫細胞を活性化する方法であって、実施形態１８２～２５７のいずれかのシステムを対象に投与し、それによって対象内の治療部位でマクロファージ活性化状態を調節し、免疫細胞を治療部位に動員し、動員された免疫細胞を活性化することを含む、方法。

【0525】

２６０．治療部位が腫瘍部位である、実施形態２５９の方法。

【0526】

２６１．投与が静脈内投与を含み、ナノ粒子が血流内の単球により取り込まれる、実施形態２５９又は２６０の方法。

【0527】

２６２．単球が腫瘍部位に遊走してマクロファージに分化する、実施形態２６１の方法。

【0528】

２６３．分化したマクロファージが腫瘍抑制に対して抵抗性である、実施形態２６２の方法。

【0529】

２６４．投与が腫瘍部位での局所的投与を含み、ナノ粒子が腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）により取り込まれる、実施形態２５９～２６３のいずれかの方法。

【0530】

２６５．局所的投与が、腹腔内投与又は脳内投与を含む、実施形態２６４の方法。

【0531】

２６６．ＴＡＭが、抑制状態から活性化状態へ表現型転換を受ける、実施形態２６４又は２６５の方法。

【0532】

２６７．腫瘍部位が、卵巣がん腫瘍部位、神経膠芽腫腫瘍部位、又は黒色腫がん腫瘍部位を含む、実施形態２６４～２６６のいずれかの方法。

【0533】

２６８．動員され活性化された免疫細胞がＴ細胞又はＮＫ細胞である、実施形態２５９～２６７のいずれかの方法。

【0534】

２６９．少なくとも２つの結合ドメインをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を投与する前に、１つ以上のＩＲＦをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を投与することを含む、実施形態２５９～２６８のいずれかの方法。

【0535】

２７０．少なくとも２つの結合ドメインをコードするヌクレオチドを含むナノ粒子を投与する少なくとも２４時間前に、１つ以上のＩＲＦをコードする核酸を含むナノ粒子を投与することを含む、実施形態２５９～２６９のいずれかの方法。

【実施例】

【0536】

（１２）実験的実施例。
［実施例１］ 材料及び方法。ＰｂＡＥ合成。ポリマーを合成するのに使用する方法はすでに記載されていた（Ｍａｎｇｒａｖｉｔｉ Ａら、（２０１５）ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９：１２３６～１２４９頁）。１，４－ブタンジオールジアクリレートは、ジアクリレート対アミン単量体の１対１モル比で４－アミノ－１－ブタノールと組み合わせた。アクリレート端末ポリ（４－アミノ－１－ブタノール－１，４－ブタンジオールジアクリレート共重合体）は、混合物を２４時間攪拌しながら９０℃まで加熱することにより形成した。このポリマーの２．３ｇを２ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。ピペラジンキャップド４４７ポリマーを形成するため、１３ｍＬのＴＨＦ中７８６ｇの１－（３－アミノプロピル）－４－メチルピペラジンをポリマー／ＴＨＦ溶液に添加し、室温（ＲＴ）で２時間攪拌した。キャップドポリマーは５容積のジエチルエーテルで沈澱させ、２容積の新しいエーテルで洗浄し、１日真空下で乾燥させた。純ポリマーはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１００ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解し、－２０℃で保存した。

【0537】

ジマンノースへのＰＧＡコンジュゲーション。α－Ｄ－マンノピラノシル－（１→２）－α－Ｄ－マンノピラノース（Ｄｉ－ｍａｎｎｏｓｅ、Ｏｍｉｃｒｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）をポリグルタミン酸（ＰＧＡ）にコンジュゲートする前にグルコシルアミンに改変した。先ず、ジマンノース（１５７ｍｇ）を１０．５ｍＬの飽和水性炭酸アンモニウムに溶解し、室温で２４時間攪拌した。２日目、さらに多くの固体炭酸アンモニウムを、ジマンノースが反応液から沈澱するまで添加した。混合物はＴＬＣにより測定した場合、完了するまで攪拌し、続いて凍結乾燥して過剰な炭酸アンモニウムを取り除いた。揮発性塩の完全な除去は、固体をメタノールに再溶解することにより達成した。これらの手順により、今後のＰＧＡとのコンジュゲーションのためにアノマー炭素上にアミンが作り出された。

【0538】

アミノ化ジマンノースをＰＧＡにコンジュゲートするため、基質を３０ｍｇ／ｍＬまで水に溶解し、次に１０分間超音波処理した。水中エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ＨＣＬ（４ｍｇ／ｍＬ、３０当量）を、室温で４分間混合しながら添加した。水中Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（３０ｍｇ／ｍＬ、３５当量）を、ＰＧＡ／ＥＤＣ液と一緒に１分間インキュベートした。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中アミノ化ジマンノースは、得られた活性化ＰＧＡと４４対１のモル比で組み合わせ、室温で６時間混合した。過剰な試薬は、２４時間水に対して透析することにより取り除いた。

【0539】

ｍＲＮＡ合成．ｅＧＦＰ、ＩＲＦ５、及びＩＫＫ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）についてのコドン最適化ｍＲＮＡは、アンチリバースキャップアナログ３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＡＲＣＡ）でキャップし、修飾リボヌクレオチドプソイドウリジン（ψ）及び５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で完全に置換した。

【0540】

ナノ粒子調製。ＩＲＦ５及びＩＫＫβ ｍＲＮＡは３対１（ｗ対ｗ）比で組み合わせ、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）バッファー（ｐＨ＝５．２）中１００μｇ／ｍＬまで希釈した。ＤＭＳＯ（上記の通り調製）中ポリ（β－アミノアステル）－４４７（ＰｂＡＥ－４４７）ポリマーを、やはりＮａＯＡｃバッファー中１００μｇ／μＬから６μｇ／μＬまで希釈した。ナノ粒子を形成するため、ＰｂＡＥ－４４７ポリマーを６０対１（ｗ対ｗ）の比でｍＲＮＡに添加し、直ちに中速度で１５秒間ボルテックスし、次に混合物は室温で５分間インキュベートして、ＰｂＡＥ－ｍＲＮＡポリプレックスを形成させた。次のステップにおいて、ＮａＯＡｃバッファー中１００μｇ／ｍＬのＰＧＡ／ジマンノースをポリプレックス溶液に添加し、中速度で１５秒間ボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。この工程において、ＰＧＡ／ジマンノースがＰｂＡＥ－ｍＲＮＡポリプレックスの表面を被覆して最終ＮＰを形成した。長期貯蔵のため、Ｄ－スクロース（６０ｍｇ／ｍＬ）を凍結保護物質としてＮＰ溶液に添加した。ナノ粒子はドライアイスで瞬間凍結し、次に凍結乾燥した。乾燥ＮＰは使用するまで－２０℃又は－８０℃で貯蔵した。インビボ実験において、凍結乾燥したＮＰは１対２０（ｗ対ｖ）比で水に再懸濁した。

【0541】

ナノ粒子サイズ分布及びζ電位の特徴付け。ＮＰの物理化学的特性（流体力学半径、多分散、ζ電位及び安定性を含む）は、２５℃でＺｅｔａｐａｌｓ器具（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して特徴付けた。動的光散乱に基づいて流体力学半径及び多分散を測定するため、ＮＰを２５ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５．２）中に５倍希釈した。ζ電位を測定するため、ＮＰを１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）に１０倍希釈した。ＮＰの安定性を評価するため、新たに調製したナノ粒子を１０ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）に希釈した。ＮＰの流体力学半径及び多分散は１０分ごとに５時間測定し、そのサイズ及び粒子濃度は、Ｎａｎｏｓｉｔｅ ３００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して粒子トラッキング解析から導き出した。透過型電子顕微鏡を使用してＮＰを特徴付けるため、以前記載されたプロトコールに従った（Ｓｍｉｔｈ ＴＴら、（２０１７）Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １２：８１３～８２０頁）。新たに作成したＮＰ（０．８３μｇのｍＲＮＡを含有する２５μＬ）を、グロー放電処理２００メッシュ炭素／Ｆｏｒｍｖａｒ被覆銅グリッド上に沈着させた。３０秒後、グリッドは、５０％のＫａｒｎｏｖｓｋｙ定着液、０．１Ｍのカコジル酸バッファー、ｄＨ_２Ｏ、次に１％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルで順次処理した。試料は、１２０ｋＶで作動するＪＥＯＬ ＪＥＭ－１４００透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ）で撮像した。

【0542】

骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）及び他の細胞株。ＢＭＤＭを調製するため、確立したプロトコール（Ｚｈａｎｇ Ｘら、（２００８）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １４：Ｕｎｉｔ １４ １１）に従って骨髄前駆細胞をマウス大腿骨から収集した。これらの細胞は完全培地［４．５ｇ／ＬのＤ－グルコース、Ｌ－グルタミン、１０％の熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを補充したＤＭＥＭ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ＃３１５－０２）を補充した、１００μｇ／ｍＬ、Ｇｌｕｔａｍａｘ５０ｍＬ／５００ｍＬ］において播種密度０．５～１．０ ｅ６／ｍｌで培養した。細胞は、エクスビボで７日間、５％ＣＯ_２下、３７℃でＢＭＤＭ中に分化させておいた。次に、細胞は、マクロファージ条件付け培地［２０ｎｇ／ｍＬのＭＰＬＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｌ６８９５）又は２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ４（ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ、カタログ＃３４－８０４１）を補充したマクロファージ完全培地］で条件付けした。ＢＭＤＭはエクスビボで７～２１日間使用した。マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８は、Ｄｒ．Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｒｏｂｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＫＳ）からの寄贈であるが、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、５μｇ／ｍＬのインスリン、５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、及び５ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム（すべてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭにおいて培養した。より侵襲性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現ＩＤ８株を作成するため、ＩＤ８腫瘍細胞に、マウスＶＥＧＦをブラストサイジン耐性遺伝子と一緒にコードするｐＵＮＯ１プラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを得るため、腫瘍細胞は、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を含有する完全培地において３週間培養した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞株（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関）を、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、２ｍＭ／Ｌ－グルタミン、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び０．０５ｍＭの２－メルカプトエタノールを有する完全ＲＰＭＩ １６４０培地において培養した。インビボ生物発光イメージングにおいて、ＩＤ８－ＶＥＧＦとＢ１６Ｆ１０細胞株の両方にホタルルシフェラーゼをレトロウイルス性に形質導入した。ＲＡＣＳ－ＰＤＧＦβ又はＲＣＡＳ－ｃｒｅレトロウイルスを担持するＤＦ－１細胞株は、１０％のＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを補充した完全培地において５％のＣＯ_２下、３９℃で培養した。

【0543】

ＢＭＤＭのｍＲＮＡトランスフェクション。トランスフェクションに１日先立って、ＢＭＤＭは、マクロファージ完全培地において２４ウェルプレート上に２５０，０００／ウェルの濃度で再播種した。トランスフェクション前、完全培地は３００μＬの非補充ＤＭＥＭで置き換えた。これらの細胞にトランスフェクトするため、２μｇのｍＲＮＡを含有するＮＰを基本培地中に添加し、３７℃でＢＭＤＭと共培養した。１時間後、ＮＰを含有する培地は取り除き、細胞は、トランスフェクション効率及び細胞生存率を評価する前にさらに２４時間培養した。

【0544】

マクロファージシグネチャー遺伝子分析のためのＢＭＤＭのトランスフェクション。ＢＭＤＭはトランスフェクション２４時間前に条件付け培地で２４ウェルプレート上に再播種し、細胞をその表現型に形質転換させておいた。次に、上記のトランスフェクションプロトコールに従って、Ｍ２様マクロファージを、レポーターとして２５％のｅＧＦＰ ｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ又は２μｇのｍＲＮＡを担持するｅＧＦＰ ＮＰ（対照）に曝露した。２４時間後、高度にトランスフェクトしたＢＭＤＭの上から１０％（ｅＧＦＰ発現により測定した）をトランスフェクション後２４時間で選別し、ＲＮＡ単離前さらに４８時間、低用量（１０ｎｇ／ｍＬ）ＩＬ４培地において再チャレンジした。これらの細胞から抽出されたＲＮＡは、ＩＲＦ５－ＮＰ治療に関連するシグネチャー遺伝子を同定できるように、標準Ｍ１又はＭ２様マクロファージ由来のＲＮＡと比較した。

【0545】

ＲＮＡ単離及び調製。ＲＮＡを収集するため、ＢＭＤＭはＴｒｉｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）に溶解し、全ＲＮＡを抽出して、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｉｎｉ－Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。試料ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して定量化し、次にＡｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ）でＦＨＣＲＣゲノム共用資源により実施される品質管理を受けさせた。

【0546】

ナノストリング技術によるマクロファージシグネチャー遺伝子分析。刺激を受けたＢＭＤＭ培養物からの遺伝子発現値は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）骨髄自然免疫パネル（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して測定し、この装置は１９の異なる経路に存在する７７０の遺伝子を分析し、７つの異なる骨髄細胞型にわたり遺伝子を処理する。試料は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して試験した。生データは、Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＱＣＰｒｏソフトウェアパッケージ（Ｎｉｃｋｌｅｓ Ｄ、Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｔ、Ｚｉｍａｎ Ｒ ａｎｄ Ｂｏｕｒｇｏｎ Ｒ（２０１８）ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＱＣＰｒｏ：Ｑｕａｌｉｔｙ ｍｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｄａｔａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ．Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．１０．０．）を使用して処理し、品質について点検した。発現値は、ハウスキーピング遺伝子の幾何平均に正規化され、ｎＳｏｌｖｅｒ ４．０ソフトウェア（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用してｌｏｇ２変換した。比例データについての偽陽性率は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｙｅｋｕｔｉｅｌｉ法を使用するｔ－検定により戻されたｐ値から計算した。

【0547】

フローサイトメトリー及び細胞選別。脾臓、血液、腹膜灌流、及び気管支肺胞洗浄から得た細胞は、図９に収載されている抗マウス抗体プローブを使用して骨髄及びリンパ系免疫表現型検査パネルでフローサイトメトリーにより分析した。データは、ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を実行するＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ分析器を使用して収集した。ＣＤ１１ｂ＋及びＦ４／８０＋腹腔マクロファージは、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ ＩＩを使用して選別した。収集したデータはすべてＦｌｏｗＪｏ １０．０ソフトウェアを使用して解析した。

【0548】

サイトカイン分析。サイトカインレベルは、ＦＨＣＲＣ免疫モニタリング共用資源センターでＬｕｍｉｎｅｘ ２００システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して評価した。エクスビボ研究において、細胞培養上澄みを、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＮＦγ、及びＴＮＦα濃度の測定のために収集した。インビボ研究において、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＮＦγ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－６、及びＴＮＦαの血漿濃度を測定した。

【0549】

ｑＲＴ－ＰＣＲ分析。遺伝子発現レベルはｑＲＴ－ＰＣＲにより決定した。選択されたマクロファージシグネチャー遺伝子（セルピンＢ２、Ｒｅｔｎｌａ、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ１１、コドン最適化ＩＲＦ５、内在性ＩＲＦ５、及びハウスキーピングＧＡＰＤ遺伝子）を測定するため、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ－ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用いて単離した。ｃＤＮＡは、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ）を使用して合成した。試料ごとに、ＲｏｃｈｅのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＵＰＬ）由来の遺伝子特異的プローブ及びＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）により最適化されたＰＣＲプライマーを使用するＰｅｒｆｅＣＴａ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｌｏｗ ＲＯＸ（Ｑｕａｎｔａ）を経て３通りに実施した：セルピンＢ２、ＵＰＬ－０４９、Ｆ－ＡＣＴＧＧＧＧＣＡＧＴＴＡＴＧＡＣＡＧＧ（配列番号９６）、Ｒ－ＧＡＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＴＧ（配列番号９７）；Ｒｅｔｎｌａ、ＵＰＬ－０７８、Ｆ－ＴＴＧＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＴ（配列番号９８）、Ｒ－ＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡ（配列番号９９）；Ｃｃｌ５、ＵＰＬ－１０５、Ｆ－ＣＣＴＡＣＴＣＣＣＡＣＴＣＧＧＴＣＣＴ（配列番号１００）、Ｒ－ＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧＣＴＧＴ（配列番号１０１）；Ｃｃｌ１１、ＵＰＬ－０１８、Ｆ－ＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧＣＧＣＴＴＣ（配列番号１０２）、Ｒ－ＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＡ（配列番号１０３）；コドン最適化ＩＲＦ５、ＵＰＬ－０２２、Ｆ－ＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＡＧＡＡＣＡＧＴ（配列番号１０４）、Ｒ－ＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＣ（配列番号１０５）；内在性ＩＲＦ５、ＵＰＬ－０１１、Ｆ－ＧＣＴＧＴＧＣＣＣＴＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣ（配列番号１０６）、Ｒ－ＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＣＡＴＧＴＣＴ（配列番号１０７）。シグネチャー遺伝子ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤ、ＵＰＬ－０６０、Ｆ－ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ（配列番号１０８）及びＲ－ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ（配列番号１０９）の増幅に基づいて正規化した。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応はすべて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を実行するＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５ ＲＴ－ＰＣＲ装置を使用して実施した。増幅プロットが閾値を通過せずＣｔ値が得られない（「未決定の」）場合、アッセイでの最高のサイクル数（４０サイクル）に等しいＣｔ値を相対的発現の比較のために使用した。

【0550】

マウス及びインビボ腫瘍モデル。脳腫瘍モデル関連の実験を除いて、これらの実験で使用するマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、その他のマウスはＦＨＣＲＣ動物施設で繁殖させ収容した。マウスはすべて、センターの動物実験委員会が承認したプロトコールに照らして使用した。卵巣腫瘍をモデル化するため、５×１０^６の血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦＰ）発現ＩＤ８細胞を、生後４～６週間のメスのアルビノＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｙｒ＜ｃ－２Ｊ＞）マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、２週間確立させておいた。生存研究に関して、動物は、５０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５ ＮＰ／ｅＧＦＰ ＮＰでｉ．ｐ．治療した（９週間の間、週当たり２用量で、又は健康な状態が安楽死要件に達するまで）。機序研究に関して、１、２、又は３週間の治療を使用し、続いて、最後の用量に続く４８時間で安楽死させた。腹膜灌流を実施して腹腔細胞を収集した。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰと現状のマクロファージターゲティング療法の効率を比べるため、マウスの１つの群は、週当たり２用量で３週間の間、５０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰでの治療を受け、第２の群は、３週間毎日、溶媒（ポリエチレングリコール４００中５％の１－メチル－２－ピロリジノン）で処方した１５ｍｇ／ｋｇのＰＩ３Ｋγ阻害剤ＩＰＩ－５９４（ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）の経口投与を受け；第３の群は、３週間毎日、同じ溶媒で処方した３０ｍｇ／ｋｇのＣＳＦ１Ｒ阻害剤ペキシダルチニブ（ＰＬＸ３３９７、ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）のｉ．ｐ．注射を受けた。

【0551】

転移性肺がんをモデル化するため、Ｆ－ｌｕｃを形質導入し２００μＬのＲＰＭＩ培養液に懸濁された２．５×１０^４の１６Ｆ１０細胞を、生後４～６週間のメスのアルビノＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｙｒ＜ｃ－２Ｊ＞）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に注射し、１週間確立させておいた。生存研究に関して、マウスは、ＰＢＳ中に懸濁された３０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ又はｅＧＦＰ ＮＰで（又はなしで）後眼窩に治療した。マウスは、３週間の間、週当たり３用量で、又は健康な状態が安楽死要件に達するまで治療した。機序研究に関して、マウスは２週間、同じ治療を受けた。気管支肺胞洗浄を実施して分析のために肺胞細胞を収集した。

【0552】

神経膠腫を抱えたマウスを、公表されているプロトコール（Ｕｈｒｂｏｍ Ｌら、（２００４）Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：１２５７～１２６０頁）に従って作成した。ＲＣＡＳ－ＰＤＧＦβ及びＲＣＡＳ－ｃｒｅレトロウイルスを産出しているトリＤＦ－１細胞を、生後４～６週間でＮｅｓｔｉｎ－ｔｖ－ａ／Ｉｎｋ４ａ－ａｒｆ－／－；Ｐｔｅｎ－／－マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の両方の脳半球（座標：前頂から１ｍｍ尾側、２ｍｍ側部、硬膜表面から２ｍｍの深さ）の頭蓋内に注射した。腫瘍は２週間確立させておいた。１５日目、マウスは１つの半球に１０Ｇｙの放射線を受け、その間未照射半球は鉛で遮蔽した。次の日、マウスは、３０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの後眼窩注射を受ける（３週間の間、週当たり３用量）、又はＰＢＳ対照群に割り当てられた。

【0553】

インビボ生物発光イメージング。ＰＢＳ中Ｄ－ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）（１５ｍｇ／ｍＬ）を、ホタルルシフェラーゼイメージングのための基質として使用した。生物発光画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で収集した。マウスは、イメージング前及び最中に２％のイソフルラン（Ｆｏｒａｎｅ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で麻酔にかけた。ＩＤ８－ＶＥＧＦ卵巣腫瘍に関して、それぞれのマウスは、３００μｇのＤ－ルシフェリンをｉ．ｐ．注射し、画像は１０分後に収集した。Ｂ１６Ｆ１０肺転移性腫瘍に関して、マウスは、３ｍｇのＤ－ルシフェリンをｉ．ｐ．注射し、画像は１５分後に収集した。脳腫瘍モデルに関して、マウスは、７５ｍｇ／体重ｋｇのＤ－ルシフェリンの後眼窩注射を受け、画像は４分後に収集した。捕捉時間は１０秒～５分の範囲に及んだ。

【0554】

体内分布分析。ＩＤ８－ＶＥＧＦ卵巣腫瘍モデルにおけるＩＲＦ５ ＮＰの体内分布を決定するため、７～８群のマウスが、５０μｇのｍＲＮＡを担持するＮＰのｉ．ｐ．又は後眼窩用量を受けた。注射２４時間後、全血を収集し、マウスはＣＯ_２で安楽死させ、臓器（肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、腸、膵臓、及び横隔膜）を回収した。すべての組織はＲＮＡｌａｔｅｒで安定化し、次に、ドライアイス上で凍結した。それぞれの臓器におけるコドン最適化ＩＲＦ５ ｍＲＮＡレベルはＲＴ－ｑＰＣＲを使用して測定した。

【0555】

毒性分析。繰り返し注入マクロファージターゲティングＮＰの潜在的なインビボ毒性を測定するため、３週間の経過にわたり５０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ又はｅＧＦＰ ＮＰの６連続用量をマウス（５／群）の静脈内に注射した。対照は治療を受けなかった。最終注入の２４時間後、マウスに麻酔をかけ、血液を後眼窩出血により収集し、全血球数を決定した。血液は、血清化学及びサイトカインプロファイル分析のためにも収集した（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｕｋｉｌｔｅｏ、ＷＡにより実施した）。次に、動物はＣＯ_２で安楽死させ、臓器を回収し、４％のパラホルムアルデヒドに固定する前に脱イオン水で洗浄した。組織はルーチン処理し、切片はヘマトキシリン－エオジンで染色した。検体は、委員会認定の局員病理学者のＤｒ．Ｓｍｉｔｈａ Ｐｉｌｌａｉ ＭＶＳｃ、ＰｈＤ、ＤＡＣＶＰにより、盲検様式で解釈された。

【0556】

サイトカインアッセイ。サイトカインレベルは、ＦＨＣＲＣ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓにおいてルミネックス２００システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して評価した。エクスビボ研究に関して、細胞培養上澄みを、ＩＬ－６、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＮＦγ、及びＴＮＦαの濃度の測定のために収集した。インビボ研究に関して、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＮＦγ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－６、及びＴＮＦαの血漿濃度を測定した。

【0557】

統計解析。観察された相違の統計的有意は、独立両側一元配置分散分析検定を使用して分析した。測定ごとのＰ値は、図又は図説明文に収載されている。生存データは、対数順位検定を使用して特徴付けた。統計解析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０又はＲソフトウェアを使用して実施した。

【0558】

結果。ＴＡＭのＩＶＴ ｍＲＮＡトランスフェクションを構成するためにＮＰを設計する．陽イオンポリ（βアミノエステル）（ＰｂＡＥ）ポリマーと陰イオンｍＲＮＡの間の静電相互作用を利用することにより、標的化細胞における頑強な遺伝子発現を導入することができる標的化ｍＲＮＡ送達システムを開発した（図２Ａ）。得られたナノ担体にカプセル化されたｍＲＮＡの安定性及び翻訳を改善するため、改変リボヌクレオチドプソイドウリジン（ψ）（Ｋａｒｉｋｏ Ｋら、（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６：１８３３～１８４０頁）及び５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を組み込み、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）（Ｑｕａｂｉｕｓ ＥＳら、（２０１５）Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２：２２９～２３５頁）でキャップされたメッセージの合成バージョンを使用した。ｍＲＮＡは、ＰｂＡＥ骨格においてエステル結合の加水切断により細胞内でｍＲＮＡ－ＰｂＡＥ複合体から放出される。効率的なインビボＴ細胞トランスフェクションは、このシステムを使用して以前実証されていた（Ｓｍｉｔｈ ＴＴら、（２０１７）Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）。ナノ粒子を標的のＴＡＭに向け並びにナノ粒子が含有するｍＲＮＡ－ＰｂＡＥ複合体をさらに安定化するため、ジマンノース部分は、リンカーとしてポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を使用してその表面上に操作した（図２Ａ）。ＮＰは、単純な２ステップ電荷駆動自己組織化工程を利用して製造した。第１に、合成ｍＲＮＡは正電荷ＰｂＡＥポリマーと複合体化し、これによりｍＲＮＡはナノサイズ複合体中に凝縮される。このステップに続いて、ジマンノース官能基を持たされたＰＧＡを添加し、これは正電荷のＰｂＡＥ－ｍＲＮＡナノ粒子を遮蔽して、マクロファージ－ターゲティングを与える。得られたｍＲＮＡナノ担体は、９９．８±２４．５ｎｍのサイズ、０．１８３の多分散性、及び中性表面電荷（３．４０±２．１５ｍＶのζ電位、図２Ｂ～２Ｃ）有していた。トランスフェクション効率は、先ず、緑色蛍光タンパク質コードｍＲＮＡで処方されたＮＰ（ＧＦＰ－ＮＰ）を使用してマウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）において試験した。手短に言えば、５０，０００のＢＭＤＭを１μｇのｍＲＮＡを含有するＮＰに１時間曝露し、続いて次の日、ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー測定を行った。単一ＮＰ適用に続いて、我々は、これら初代マクロファージの３１．９％（±８．５％）をそれらの生存率を減らすことなくルーチンにトランスフェクトした（図２Ｅ～２Ｆ）。ジマンノースを用いたナノ粒子の表面修飾は適切であった。なぜならば、非標的化（しかし、ＰＧＡ被覆された）ナノ担体でのトランスフェクション率はこの固有の食作用性細胞型において平均で２５％（±２．１％）まで低下したからであった。ＮＰは、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋マクロファージ集団を選択的に標的にし、マクロファージの４６％がトランスフェクトされ高レベルのｅＧＦＰを発現した（図２Ｄ）。この高度なトランスフェクション効率は、ＴＡＭへのｍＲＮＡの標的化送達において開示されたシステム及び方法の効力を実証している。マクロファージ極性化を誘導する転写因子候補を求めてのインビトロスクリーニングの結果に基づいて、ＮＰに包含するための２つのｍＲＮＡを選択し：第１のｍＲＮＡは、Ｍ１表現型に向かうマクロファージの極性化に有利に働くＩＲＦファミリーのキーとなるメンバーである、ＩＲＦ５をコードし、第２のｍＲＮＡはＩＲＦ５をリン酸化し活性化するキナーゼである、ＩＫＫβをコードする。

【0559】

免疫抑制性マクロファージを炎症促進性表現型にプログラムする。マクロファージ極性化を誘導するため、ＮＰに包含するための２つのｍＲＮＡを選択し：第１のｍＲＮＡは、Ｍ１表現型に向かうマクロファージの極性化に有利に働くインターフェロン制御因子ファミリーのキーとなるメンバーである、ＩＲＦ５をコードし（Ｋｒａｕｓｇｒｕｂｅｒ Ｔら、（２０１１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：２３１～２３８頁）；第２のｍＲＮＡは、ＩＲＦ５をリン酸化し活性化するキナーゼである、ＩＫＫβをコードする（Ｒｅｎ Ｊら、（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１：１７４３８～１７４４３頁）。３ ＩＲＦ５ ｍＲＮＡ対１ ＩＫＫβ ｍＲＮＡの比を使用した。ＮＰ送達（及びコドン最適化）ＩＲＦ５ ｍＲＮＡに特異的なリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して、マクロファージにおけるｍＲＮＡ発現は１日目が最大であり、内在性因子レベルと比べてＩＲＦ５の１５００倍の増加がもたらされることが見出された（図２Ａ）。予想通り、遺伝子発現は一過性であるが、ＩＲＦ５レベルは、ベースラインに戻る前、３日目（５８１倍の増加）から５日目（８７倍の増加）を通じて強く上方調節されたままであった。

【0560】

ＩＲＦ５／ＩＫＫβコードＮＰがＭ２マクロファージを治療的に望ましい抗がんＭ１表現型に再プログラムできるかどうかを判定するため、ナノストリング遺伝子発現分析を使用した。ＢＭＤＭは、先ず、インターロイキン－４（ＩＬ－４）の存在下で培養して、抑制性Ｍ２表現型を誘導した（図２Ｈ）。対照ＧＦＰ－ｍＲＮＡナノ粒子又はＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡ含有ＮＰでのトランスフェクションに続いて、遺伝子発現プロファイルを分析し炎症性マクロファージと比較した。この炎症性マクロファージは、ＢＭＤＭをＴＬＲ４アゴニストモノホスホリスリピドＡに曝露することにより別々に作成した。抑制性ＩＬ－４含有培地で培養されたが、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡ ＮＰをトランスフェクトされたマクロファージは、炎症性マクロファージに類似する遺伝子発現プロファイルを示す（図２Ｉ）。セルピンｂ２及びＣｃｌ２などのシグネチャーＭ２マクロファージ遺伝子（Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ Ｋら、（２０１５）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １０：ｅ０１４５３４２；Ｖａｒｇａ Ｔら、（２０１６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：４７７１～４７８２頁）は、強く下方調節されており、Ｃｃｌ５などのキーとなるＭ１分化遺伝子（Ｓｉｃａ Ａら、（２０１２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２２：７８７～７９５頁）は上方調節されていた（図２Ｊ、２Ｋ）。これらのデータにより、ＩＲＦ５及びそのキナーゼのＮＰ媒介発現は抑制性マクロファージを炎症促進性表現型のほうに歪めることが立証される。

【0561】

［実施例２］ 播種性卵巣がんに対するＮＰ送達ｐｒｏ－Ｍ１遺伝子の治療効果。臨床関連インビボ試験システムにおいてこの治療アプローチを評価するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて後期切除不能卵巣腫瘍を再現するモデルを使用し；これらの動物には、腫瘍成長の連続生物発光イメージングを可能にするようにルシフェラーゼでタグ付けされたＩＤ８卵巣がん細胞を注射する（Ｌｉａｏ ＪＢら、（２０１５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ３：１６頁；Ｓｔｅｐｈａｎ ＳＢら、（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３：９７～１０１頁）。腫瘍は２週間確立させておいた。この段階まで、マウスは腹膜壁全体に及び腸の腸間膜に小結節を発症していた。動物は、９週間の間１００μｇのｍＲＮＡ／マウス／週のｉ．ｐ．用量での、ＰＢＳ（対照）、ＧＦＰＮＰ（ニセ）、又はＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療を受ける３つの群に分けた（図４Ａ）。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療群において、疾患が退行しており、最後には動物の４０％で除去されていることが観察された（全体で１４２日生存期間中央値対６０日対照；図４Ｂ～４Ｃ）。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ媒介抗腫瘍効果の下にある機序を理解するため、マンノース受容体ターゲティングがＮＰ相互作用をどのようにして排他的に食細胞に限定するのかを先ず調べた。ジマンノースで標的化されたＮＰの最初の投与の２４時間後に収集された腹膜灌流液のフローサイトメトリーにより、マクロファージ及び単球中への優先的遺伝子移入（それぞれ、平均３７．１％及び１５．３％、図４Ｄ）が明らかにされ、オフターゲット細胞中へのトランスフェクションは低い又は検出されなかった。３週間にわたる（毎週２回注射）ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子又はＰＢＳを用いた治療に続く確立した卵巣がんを抱えたマウスの腹膜におけるマクロファージ／単球集団の詳細な表現型及び機能分析を次に行った。フローサイトメトリー分析によれば、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰは免疫抑制性マクロファージの集団（Ｌｙ６Ｃ－、Ｆ４／８０＋、ＣＤ２０６＋）を平均２．６％±２．１％対対照においては４３％±１５．６％まで減少させることが明らかになった（図４Ｅ～４Ｆ）。反対に、Ｍ１様マクロファージの割合は０．５％±０．２％から１０．２％±４．１％まで増えた（図４Ｅ、４Ｇ）。ＩＲＦ５遺伝子療法は他の免疫細胞の集団にも影響を及ぼした。特に、炎症性単球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｃ＋、Ｌｙ６Ｇ－）がより豊富であった（非治療マウスでの４．５％±１．９％と比べて７３．４％±３．６％）。すべてのＩＲＦ５ ＮＰ治療マウスにおける１つの興味深い所見は、新生物内又は周辺に存在するリンパ球の多巣性密集クラスターであり（図４Ｈ）、免疫刺激性マクロファージの遺伝的プログラミングが固体腫瘍中へのリンパ球遊走及び浸潤を復活させる可能性があることを示している。

【0562】

腹膜マクロファージは蛍光活性化細胞選別により単離して、それらのサイトカイン分泌を分析し、炎症促進性（抗腫瘍）サイトカインＩＬ－１２（３．４倍高い）、ＩＦＮ－ｇ（８．４倍高い）、及びＴＮＦ－α（１．５倍高い）の放出の頑強な増加を検出し、一方、選択的に活性化される（Ｍ２様）マクロファージへの分化に関連する制御サイトカインであるＩＬ－６のレベルは９７倍減少した；図４Ｉ）。ゲノム発現プロファイリングにより、ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子治療マウスにおいてＭ１様マクロファージ表現型のほうに向かう分化が確認された。ＭＰＬＡ又はＩＬ－４においてエクスビボで培養されたマクロファージの遺伝子発現レベルは、それぞれ古典的Ｍ１様又はＭ２様マクロファージについての参照値を提供するために含まれた（図４Ｊ）。

【0563】

生体分布及び安全性。ナノ粒子送達（コドン最適化）ＩＲＦ５のみを検出するように設計されたＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを使用して腹腔内注射の２４時間後に種々の臓器におけるナノ粒子の分布を次に定量化した。ＩＶＴ ｍＲＮＡの最高濃度は、肝臓、脾臓、腸、膵臓、及び横隔膜を含む、腹膜に位置する臓器において見出された（図５Ａ）。腹膜の外側に位置する臓器（心臓、肺、腎臓）における粒子送達ｍＲＮＡは少量が検出され、ｉ．ｐ．注射されたナノ担体の一部が全身循環に入ったことが示唆される。分布データに導かれて、次に我々は、これらのナノ試薬が生体適合性であり、繰り返し投与は安全であるかどうかを評価した。マウスに、全部で８用量のＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰを注射した（４週間の間、２回の５０μｇのｍＲＮＡ用量／週、図５Ｂ）。マウスは最終用量の２４時間後に安楽死させ、体重を記録し、血清化学のために血液を後眼窩出血により収集し、完全肉眼部検を実施した。群間には体重差はなかった。以下の組織：肝臓、脾臓、腸間膜、膵臓、胃、腎臓、心臓、及び肺は、委員会認定の局員病理学者により評価された。病理組織学的評価により、すべての症例で、腫瘍病変内又は周辺に存在するリンパ球の多巣性密集クラスターが明らかにされたが、炎症又は明らかな壊死の証拠は、新生物細胞が存在しない組織において観察されなかった（図５Ｃ）。その上、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療マウスの血清化学は、ＰＢＳ対照の血清化学と匹敵しており、全身的な毒性は起きていないことを示していた（図５Ｄ）。生体分布研究において少量のＩＲＦ５－ｍＲＮＡが全身的に検出されたので、末梢血中の炎症性サイトカインを定量化するための並列実験を設計した。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの単回ｉ．ｐ．注射に続いて、インターロイキン－６（ＩＬ－６）の平均２６．８ｐｇ／ｍＬまでの（図５Ｅ）及び腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）の平均９４．７ｐｇ／ｍＬまでの（図５Ｆ）血清レベルの中程度で一過性の増加が測定された。以前の報告に基づいて、これらのレベルは、病理学的所見に関連するレベルの５００分の１であり、したがって安全と見なすことができる（Ｔａｒｒａｎｔ Ｊ．Ｍ．（２０１０）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ １１７：４～１６頁；Ｃｏｐｅｌａｎｄ Ｓら、（２００５）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：６０～６７頁）。

【0564】

ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子の静脈内注入で全身性腫瘍転移を制御する。腹膜全体に広がった腫瘍病変を治療するために腹膜腔中に直接投与されたＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰにより達成された治療応答に基づいて、問われた次の問題は、静脈内注入ｍＲＮＡナノ担体が伝播した疾患を制御するようにマクロファージを全身的にプログラムすることができるかどうかであった。ＲＴ－ｑＰＣＲ生体分布研究によれば、ｉ．ｖ．注入ナノ担体はそれらのｍＲＮＡカーゴを高レベルの常在性マクロファージ／食細胞のある臓器、大部分が脾臓、肝臓、及び肺に優先的に送達することが明らかにされた（図６Ａ）。臨床関連インビボ試験システムにおいて抗腫瘍応答を測定するため、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡを含有するナノ粒子を、播種性肺黒色腫転移のあるマウス中に投与した（図６Ｂ）。最近の研究は、この疾患により引き起こされる転移を確立する際の単球及びマクロファージの基本的役割を記載しており（Ｂｕｔｌｅｒ ＫＬら、（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：４５５９３頁；Ｎｉｅｌｓｅｎ ＳＲら、（２０１７）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ ２０１７年：９６２４７６０頁）、腫瘍移植は肺における食細胞蓄積と同調していることが共焦点顕微鏡により確かめられた（図６Ｃ）。腫瘍量は生物発光イメージングにより決定し、検出可能な腫瘍のあるマウスは適合するレベルを有する群に選別された。次に、群は無作為に、治療を受けない（ＰＢＳ）、又はＧＦＰ－若しくはＩＲＦ５／ＩＫＫβカプセル化ナノ粒子の静脈内注射を受ける治療条件を割り当てられた。ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子療法のみが肺において腫瘍量を実質的に減らし；実際、ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子療法は全生存を平均で１．３倍改善した（図６Ｄ～６Ｅ）。並列実験において、マウスは腫瘍接種２２日後に屠殺されて、肺転移のカウントで生物発光腫瘍シグナルを確認し、フローサイトメトリーによりマクロファージ極性化を評価した。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療動物の肺における全転移数は、ＰＢＳ対照（平均４１９±１３９転移；図６Ｆ～６Ｇ）と比べて８．７倍減少した（平均４０±１６転移）。気管支肺胞洗浄液細胞のフローサイトメトリーにより、免疫抑制性（ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ－、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂｌｏｗ）マクロファージから活性化（ＣＤ２０６－、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ－、ＣＤ１１ｂ＋）食細胞への強い移行が明らかにされた（図６Ｈ～６Ｉ）。

【0565】

神経膠腫を治療するために腫瘍抑制食細胞をプログラムする。第３のインビボ試験システムに関して、神経膠腫を調べたが、これは、Ｍ２様マクロファージが非新生物細胞の大多数を表し腫瘍成長及び侵襲を促進する管理するのが困難ながんタイプである（Ｈａｍｂａｒｄｚｕｍｙａｎ Ｄら、（２０１６）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９：２０～２７頁）。現在、この疾患の標準治療は放射線療法であり、この療法は不運なことに、症状の一時的な安定化及び減少のみを提供し、生存期間中央値を３カ月延ばす（Ｍａｎｎ Ｊら、（２０１７）Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｌ ８：７４８頁）。この疾患の遺伝的事象及びそれに続く分子進化を再現するため、ＰＤＧＦβ駆動神経膠腫のＲＣＡＳ－ＰＤＧＦ－Ｂ／Ｎｅｓｔｉｎ－Ｔｖ－ａ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ－／－；Ｐｔｅｎ－／－トランスジェニックマウスモデル（ＰＤＧマウス（Ｈａｍｂａｒｄｚｕｍｙａｎ Ｄら、（２００９）Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｃｏｌ ２：８９～９５頁；Ｑｕａｉｌ ＤＦら、（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２：ａａｄ３０１８））を使用した。脳組織は、ＲＣＡＳ－ＰＤＧＦβ又はＲＣＡＳ－ｃｒｅレトロウイルスをトランスフェクトしたＤＦ－１細胞の混合物（１対１混合物、２μＬ）を定位的に注射した。神経膠腫前駆細胞におけるＰＤＧＦβがん遺伝子の過剰発現及び腫瘍抑制遺伝子Ｉｎｋ４ａ－ａｒｆ及びＰｔｅｎの非存在のせいで、２１日以内にほぼ完全な浸透率を有する４～５ｍｍ直径の腫瘍が形成された（図７Ａ）（以前確立された通りに（Ｈａｍｂａｒｄｚｕｍｙａｎ Ｄら、（２００９）Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｃｏｌ ２：８９～９５）。免疫蛍光を使用して、腫瘍浸潤（ＣＤ６８＋）マクロファージの存在（図７Ｂ、左から３番目のパネルに示されている）が確立した神経膠腫（左から２番目のパネルに示されている）において確かめられた。フローサイトメトリーにより、Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージ集団が腫瘍中の全細胞の３２．８％を占めており、この数字は同年齢の健康な対照マウス（３．７％）に見られる９倍高いことが明らかにされている（図７Ｃ）。実験におけるＰＤＧマウスは、キーとなるがん遺伝子プロモーターに連結されたホタルルシフェラーゼを発現する。このレポーター由来の生物発光は、腫瘍悪性度と正の相関関係があることが実証されており（Ｕｈｒｂｏｍ Ｌら、（２００４）Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：１２５７～１２６０頁）、したがって、この生物発光を使用して、治療開始後４日毎に腫瘍成長をモニターした。単独療法としてのＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰを先ず試験し：ＰＤＧマウスは、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡを積載したＮＰ、又は対照群においてＰＢＳの９用量の静脈内注入を受けた（３週間の間、３用量／週）。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ治療は腫瘍進行をわずかに抑制した（非治療の対照と比べて平均で５日の生存優位性を生じただけであった；図７Ｄ）。しかし、標準治療としての放射線療法とＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ注射を組み合わせると、ＰＢＳ対照群と比べて治療マウスの腫瘍成長を実質的に減らし生存期間を２倍以上にした（それぞれ、５２日対２５日、図７Ｅ～７Ｆ）。

【0566】

結論として、３つの前臨床固体腫瘍モデルからのインビボ結果によれば、ナノ粒子は、局所的に又は全身的に投与されるが、マクロファージ極性化のマスター制御因子をコードする遺伝子を送達して免疫抑制性マクロファージを腫瘍除去表現型に再プログラムすることができることが実証されている。

【0567】

マウスからヒトマクロファージへの置き換え。マウスで得られたデータがヒト疾患を治療することに適用可能性があることを確かめるため、ヒトＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡを送達するＮＰ（ｈｕＩＲＦ５ ＮＰ）を製作した。ヒト単球細胞株ＴＨＰ－１を確立したＭ１及びＭ２マクロファージ極性化モデルとして使用して、これらのナノ担体を試験した（Ｌｉ Ｃら、（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２１０４４頁；Ｓｕｒｄｚｉｅｌ Ｅら、（２０１７）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １２：ｅ０１８３６７９）。Ｍ２タイプのマクロファージは、ＴＨＰ－１細胞をＰＭＡで治療し、ＩＬ－４及びＩＬ－１３で極性化することにより作成した（図８Ａ）。ｈｕＩＲＥ５ ＮＰが機能的でありＩＲＦ経路を活性化することを確かめるため、ＴＨＰ１－Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ細胞に、ｈｕＩＲＦ５／ＩＫＫβ又はＧＦＰ対照ｍＲＮＡを積載したナノ粒子をトランスフェクトした。ＴＨＰ１－Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ細胞は、ＩＲＦ誘導性プロモーターの制御下で蛍光Ｌｕｃｉａレポーターを分泌する。この複合プロモーターは、ＩＳＧ５４ミニマルプロモーターに融合された５つのＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）を含み、このミニマルプロモーターはＮＦ－κＢ又はＡＰ－１経路の活性化因子に無応答性である。その結果、ＴＨＰ１－Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ細胞は、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼの活性を決定することによりＩＲＦ経路のモニタリングを可能にする。ｈｕＩＲＦ５ ＮＰは、Ｍ２極性化ＴＨＰ－１細胞においてルシフェラーゼ発現を強く上方調節することが見出され、ｍＲＮＡ構築物がヒト細胞において機能的であることが示される（図８Ｂ～８Ｃ）。ＩＲＦ５経路活性化がＭ２極性化ＴＨＰ－１細胞をＭ１様表現型のほうに再プログラムできるかどうかを判定するため、ＮＰトランスフェクションに続く炎症促進性サイトカインＩＬ－１βの分泌を測定した。ＩＬ－１βの産生は、ｈｕＩＲＦ５ ＮＰをトランスフェクトしたＴＨＰ－１細胞対非トランスフェクト対照において有意に増加しており（平均２１倍；Ｐ＜０．０００１、図８Ｄ）、Ｍ１マクロファージ細胞表面マーカーＣＤ８０の頑強な上方調節（１０．９倍に増加したＭＦＩ、Ｐ＜０．０００１）と相関していた（図８Ｅ）。

【0568】

［実施例３］ ＩＲＦ５／ＩＫＫｂ及びＥｐＣＡＭ－ＣＤ３ 二重特異性抗体ｍＲＮＡを送達するナノ粒子は、播種性ステージ４卵巣がんの前臨床マウスモデル及び４Ｔ１乳がん肺転移モデルにおいて投与される。根底にある機構（腫瘍微小環境の組成の変化）及び二重特異性抗体血清レベル（対直接に腫瘍部位での二重特異性抗体の濃度）が評価される。インサイツ生成対静脈内投与された二重特異性タンパク質の対照比較も実施される。

【0569】

（１３）締め括りのパラグラフ。本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に定義される通りに、ヌクレオチド塩基についての標準文字省略形を使用して示される。それぞれのヌクレオチド配列の１つの鎖のみが示されるが、相補鎖はそれが適切であると考えられる実施形態に含まれているとして理解されている。

【0570】

本明細書で開示され言及される配列のバリアントも含まれる。生物活性を消失せずにどのアミノ酸残基を置換する、挿入する、又は欠失させることができるかを決定するガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアなどの当技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見つけることができる。好ましくは、本明細書で開示されるタンパク質バリアントでのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、類似する電荷又は非電荷のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、その側鎖での関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を含む。

【0571】

ペプチド又はタンパク質では、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者には公知であり、一般に、得られた分子の生物活性を変更せずに行うことができる。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非必須領域での単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変更しないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、第４版、１９８７年、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，２２４頁参照）。天然に存在するアミノ酸は一般に以下の保存的置換ファミリーに分割される：グループ１：アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、及びスレオニン（Ｔｈｒ）；グループ２：（酸性）：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）；グループ３：（酸性；極性、負電荷残基及びそのアミドとしても分類される）：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、Ａｓｐ、及びＧｌｕ；グループ４：Ｇｌｎ及びＡｓｎ；グループ５：（塩基性；極性、正電荷残基としても分類される）：アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ）；グループ６：（大きな脂肪族、非極性残基）：イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）及びシステイン（Ｃｙｓ）；グループ７（非電荷極性）：チロシン（Ｔｙｒ）、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒ；グループ８（大きな芳香族残基）：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、及びＴｙｒ；グループ９（非極性）：プロリン（Ｐｒｏ）、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、及びＴｒｐ；グループ１１（脂肪族）：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ；グループ１０（小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性残基）：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；並びにグループ１２（硫黄含有）：Ｍｅｔ及びＣｙｓ。追加の情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに見い出せる。

【0572】

そのような変化を加える際には、アミノ酸のハイドロパシー指標を考量するのがよい。タンパク質に相互作用生物学的機能を与える際のハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野では一般に理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）、１０５～３２頁）。それぞれのアミノ酸には、その疎水性及び電荷特徴に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。これらの値は、Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（－０．４）；Ｔｈｒ（－０．７）；Ｓｅｒ（－０．８）；Ｔｒｐ（－０．９）；Ｔｙｒ（－１．３）；Ｐｒｏ（－１．６）；Ｈｉｓ（－３．２）；グルタメート（－３．５）；Ｇｌｎ（－３．５）；アスパルテート（－３．５）；Ａｓｎ（－３．５）；Ｌｙｓ（－３．９）；及びＡｒｇ（－４．５）である。

【0573】

ある特定のアミノ酸は類似するハイドロパシー指標又はスコアを有する他のアミノ酸で置換して、それでも類似する生物活性のあるタンパク質をもたらす、すなわち、それでも生物学的な機能的に等価なタンパク質を得ることは当技術分野では公知である。そのような変化を加える際には、そのハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のハイドロパシー指標のアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内のハイドロパシー指標のアミノ酸ならなおさら特に好ましい。類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づけば効果的に行うことができることも当技術分野では理解されている。

【0574】

米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；Ｓｅｒ（＋０．３）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｔｈｒ（－０．４）；Ｐｒｏ（－０．５±１）；Ａｌａ（－０．５）；Ｈｉｓ（－０．５）；Ｃｙｓ（－１．０）；Ｍｅｔ（－１．３）；Ｖａｌ（－１．５）；Ｌｅｕ（－１．８）；Ｉｌｅ（－１．８）；Ｔｙｒ（－２．３）；Ｐｈｅ（－２．５）；Ｔｒｐ（－３．４）。アミノ酸は類似する親水性値を有する別のアミノ酸で置換して、それでも生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なタンパク質を得ることができることは理解されている。そのような変化では、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸ならなおさら特に好ましい。

【0575】

上で概要を述べたように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ、及び同類の物に基づいていてよい。他の場所で示したように、遺伝子配列のバリアントは、コドン最適化バリアント、配列多型、スプライスバリアント、及び／又はコードされた産物の機能に統計的に有意な程度に影響を及ぼさない突然変異を含むことができる。

【0576】

本明細書で開示されるタンパク質、ヌクレオチド、及び遺伝子配列のバリアントは、本明細書で開示されるタンパク質、ヌクレオチド、及び遺伝子配列に少なくとも７０％配列同一性、８０％配列同一性、８５％配列同一性、９０％配列同一性、９５％配列同一性、９６％配列同一性、９７％配列同一性、９８％配列同一性、又は９９％配列同一性を有する配列も含む。

【0577】

「％配列同一性」とは、配列を比較することにより決定される場合、２つ以上の配列間の関係のことである。当技術分野では、「同一性」は、そのような配列の一続き間の適合により決定した場合、タンパク質、ヌクレオチド、又は遺伝子配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」（「類似性」と呼ばれることも多い）は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、Ｇ．、ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９２）に記載されている方法を含む、既知の方法により容易に計算することができる。試験されている配列間に最良の適合を与えるため、同一性を決定する好ましい方法が考案されている。同一性及び類似性を決定する方法は公開されているコンピュータプログラムに成文化されている。配列アラインメント及びパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピュータスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施しうる（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。配列のマルチプルアライメントは、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いるアライメントのクラスタル法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ、５、１５１～１５３頁（１９８９））を使用して実施することもできる。関連するプログラムは、プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁（１９９０）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んでいるＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２年、１１１～２０頁．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ、Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹも含む。本開示の文脈内において、解析に配列解析ソフトウェアが使用される場合、解析の結果は参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解される。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」とは、任意のセットの値又はパラメータを意味し、これは最初に初期化する場合、元々ソフトウェアにロードされているものである。

【0578】

バリアントは、本明細書で開示される配列に厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド分子も含み、参照配列と同じ機能を与える。例示的厳密なハイブリダイゼーション条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％のデキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの変性、剪断サーモン精液ＤＮＡを含む溶液中４２℃での一晩インキュベーション、続いて５０℃、０．１×ＳＳＣでのフィルターの洗浄を含む。ハイブリダイゼーション及びシグナル検出の厳密性の変化は、主にホルムアミド濃度（ホルムアミドの百分率が低いほど厳密性は低くなる）；塩条件、又は温度の操作を通じて達成される。例えば、適度に高い厳密性条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３ＭのＮａＣｌ；０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４；０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサーモン精液ブロッキングＤＮＡを含む溶液中３７℃での一晩インキュベーション、続いて５０℃、１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳでの洗浄を含む。さらに、はるかに低い厳密性を達成するためには、厳密なハイブリダイゼーションに続いて実施される洗浄はもっと高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行うことができる。上記条件の変動は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するのに使用される代替のブロッキング試薬の包含及び／又は置換を通じて成し遂げうる。典型的なブロッキング試薬は、デンハート試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サーモン精液ＤＮＡ、及び市販されている専売製剤を含む。特定のブロッキング試薬の包含は、互換性の問題のせいで、上記のハイブリダイゼーション条件の修正を必要とする場合がある。

【0579】

「特異的に結合する」とは、関連する環境試料中の他のいかなる分子又は成分とも有意に会合せずに、結合ドメイン（例えば、ＣＡＲ結合ドメイン又はナノ粒子選択細胞ターゲティングリガンドの）のその同族結合分子との１０^５Ｍ^－１に等しい又はそれよりも大きな親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）での会合のことである。「特異的に結合する」は、本明細書では「結合する」とも呼ばれる。結合ドメインは、「高親和性」又は「低親和性」として分類される場合がある。特定の実施形態では、「高親和性」結合ドメインとは、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１、又は少なくとも１０^１３Ｍ^－１、のＫａを有する結合ドメインのことである。特定の実施形態では、「低親和性」結合ドメインとは、最大で１０^７Ｍ^－１までの、最大で１０^６Ｍ^－１までの、最大で１０^５Ｍ^－１までのＫａを有する結合ドメインのことである。代わりに、親和性は、Ｍの単位（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ）での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義してもよい。ある特定の実施形態では、結合ドメインは「増強された親和性」を有する場合があり、これは、同族結合分子への野生型（又は親）結合ドメインよりも強い結合を有する選択された又は操作された結合ドメインのことである。例えば、増強された親和性は、参照結合ドメインよりも高い同族結合分子に対するＫａ（平衡会合定数）による又は参照結合ドメインのＫｄよりも低い同族結合分子に対するＫｄ（解離定数）による、又は参照結合ドメインのオフレートよりも低い同族結合分子に対するオフレート（Ｋｏｆｆ）による場合がある。特定の同族結合分子に特異的に結合する結合ドメインを検出する並びに結合親和性を決定するための、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、及びＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析などの種々のアッセイが公知である（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、１９４９年、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０頁；及び米国特許第５，２８３，１７３号、米国特許第５，４６８，６１４号、又は同等のものも参照）。

【0580】

別段指示されなければ、本開示の実行は、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来の技法を用いることができる。これらの方法は、以下の出版物に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９８７）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＩＮ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、編、ＰＣＲ ２：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、（１９９５）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）；及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）を参照されたい。

【0581】

当業者であれば理解するように、本明細書に開示されるそれぞれの実施形態は、その特定の述べられた要素、ステップ、成分又は構成要素を含む、本質的にからなる又はからなることが可能である。したがって、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）、又はから本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を列挙すると解釈されるべきである。転換語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は有するを意味するがこれに限定されず、不特定の要素、ステップ、構成要素、又は成分を大量にでさえ包含することを許す。移行句「からなる」は、明記されていないいかなる要素、ステップ、成分又は構成要素も排除する。移行句「本質的にからなる」は、実施形態の範囲を明記された要素、ステップ、成分、又は構成要素に、及び実施形態に物理的に影響を及ぼさない要素、ステップ、成分、又は構成要素に限定する。物質効果は、本開示に記載される関連する実験方法に従って主張される効果を得る能力の統計的に有意な低減を引き起こすと考えられる。

【0582】

別段示されなければ、明細書及び特許請求の範囲で使用されている分子量、反応条件、その他などの成分の量、特性を表す数字はすべて、すべての例において用語「約」により修飾されていると理解するべきである。したがって、反対だと示されていなければ、明細書及び添付の特許請求の範囲で表明される数のパラメータは、本発明が得ようとしている所望の特性に応じて変動することがある近似値である。最低でも、及び特許請求の範囲の等価物の学説の適用を限定しようとする試みとしてではなく、それぞれの数のパラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、及び普通の四捨五入法を適用することにより解釈するべきである。さらなる明快さが求められる場合、用語「約」は、記述されている数値又は範囲と併せて使用される場合に当業者がその用語が持つと合理的に考える意味を有し、すなわち、記述されている値又は範囲よりもいくぶん多い又はいくぶん少ない、記述されている値の±２０％；記述されている値の±１９％；記述されている値の±１８％；記述されている値の±１７％；記述されている値の±１６％；記述されている値の±１５％；記述されている値の±１４％；記述されている値の±１３％；記述されている値の±１２％；記述されている値の±１１％；記述されている値の±１０％；記述されている値の±％９；記述されている値の±８％；記述されている値の±７％；記述されている値の±６％；記述されている値の±５％；記述されている値の±４％；記述されている値の±３％；記述されている値の±２％；又は記述されている値の±１％の範囲内までを表す。

【0583】

本発明の広い範囲を示している数の範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例で示されている数値はできる限り正確に報告されている。しかし、いかなる数値も、それぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含有する。

【0584】

本発明を記載する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」及び類似する指示対象は、本明細書で別段指示されなければ又は文脈と明白に矛盾しなければ、単数形と複数形の両方を含むものと解釈されるべきである。本明細書での値の範囲の列挙は、その範囲内に収まるそれぞれ別々の値に個別に言及するという簡単な方法としての働きをすることだけを意図されている。本明細書において別段指示されなければ、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書において個別に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で別段指示されなければ又は別段文脈とはっきり矛盾しなければ、任意の適切な順番で実施することができる。ありとあらゆる実施例の使用、又は本明細書で提供される例示的言語（例えば、「などの」）は、本発明をよりよく明らかにすることだけを意図されており、別の方法で請求される本発明の範囲を限定しない。明細書のいかなる言語も、本発明の実行に不可欠な任意の請求されていない要素も指示していると解釈されるべきである。

【0585】

本明細書に開示される本発明の別の要素又は実施形態のグループ分けは限定と解釈されるべきではない。それぞれのグループのメンバーは、個別に又はそのグループの他のメンバー若しくは本明細書に見出される他の要素との任意の組合せで言及され請求されてもよい。グループの１つ以上のメンバーは、都合上及び／又は特許性という理由でグループに含まれる又はグループから削除される場合があることは予想されている。いかなるそのような包含又は削除が起きた場合でも、明細書は、修正され、したがって、添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュグループの書面による記述を満たすグループを含有すると見なされる。

【0586】

本発明を実行するために発明者らに知られている最良の態様を含む、本発明のある特定の実施形態は本明細書に記載されている。当然のことながら、これらの記載されている実施形態の変形は、前の記述を読めば当業者には明らかになる。本発明者は、当業者がそのような変形を必要に応じて用いると予想しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載される以外の方法で実行されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法によって許されるように、ここに添付される特許請求の範囲に列挙される主題のすべての修正物及び等価物を含む。さらに、この考えられるあらゆる変形における上記要素のいかなる組み合わせも、本明細書で別段指示されなければ又は別段文脈とはっきり矛盾しなければ、本発明に包含される。

【0587】

さらに、本明細書全体で、特許、出版物、雑誌論文及び他の文書が数多く参照されてきた（本明細書の参照材料）。参照材料のそれぞれが個々に、その参照される教えのために参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。

【0588】

最後にあたって、本明細書に開示される本発明の実施形態が本発明の原理を例証していることは理解されるべきである。用いることができる他の修正物は本発明の範囲内である。したがって、例として、しかし限定ではなく、本発明の別の構成を本明細書の教えに従って利用してもよい。したがって、本発明は示され記載されている通りの発明に限定されない。

【0589】

本明細書に示される特色は、例としてであり、本発明の好ましい実施形態を実証的に考察することのみを目的とするものであり、本発明の種々の実施形態の原理及び概念面の最も有用ですぐに理解される記述であると考えられるものを提供するために示されている。これに関して、本発明の構造的詳細を本発明の基本的理解に必要である以上に詳細に示そうとは試みておらず、説明は、本発明のいくつかの形態を実際にどのようにして用いればよいのかを当業者が明らかにする図面及び／又は実施例と一緒に行われている。

【0590】

実施例において明白に明確に修正されていなければ将来のいかなる解釈においても、又は意味の適用がいかなる解釈も無意味にする若しくは本質的に無意味にする場合、本開示において使用される定義及び説明が支配的であることが意味され意図されている。用語の解釈がその用語を無意味にする若しくは本質的に無意味にすると考えられる場合、定義は、ウェブスター辞典第３版又は生化学及び分子生物学のオックスフォード辞典（編者、Ａｔｔｗｏｏｄ Ｔら、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００６年）などの当業者には公知である辞書から採用するべきである。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図6I】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図11-5】

【図11-6】

【図11-7】

【図11-8】

【図11-9】

【図11-10】

【図11-11】

【図11-12】

【図11-13】

【図11-14】

【図11-15】

【図11-16】

【図11-17】

【図11-18】

【図11-19】

【図11-20】

【図11-21】

【図12-1】

【図12-2】

【配列表】

2023508616000001.app

【国際調査報告】