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特表2023-508624ＮＫ細胞上で受容体を結合させるための複数のリガンドとコンジュゲートしたナノ粒子を使用したがん処置のための方法及び組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-03
(54)【発明の名称】ＮＫ細胞上で受容体を結合させるための複数のリガンドとコンジュゲートしたナノ粒子を使用したがん処置のための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 9/51 20060101AFI20230224BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230224BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230224BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230224BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20230224BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20230224BHJP
【ＦＩ】
A61K9/51
A61K39/395 T
A61P35/00
A61K9/14
A61K47/69
A61K31/704
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022523117
(86)(22)【出願日】2020-10-15
(85)【翻訳文提出日】2022-06-03
(86)【国際出願番号】 US2020055818
(87)【国際公開番号】W WO2021076780
(87)【国際公開日】2021-04-22
(31)【優先権主張番号】62/923,060
(32)【優先日】2019-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522154261
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ノース キャロライナ アット チャペル ヒル
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＮＯＲＴＨ ＣＡＲＯＬＩＮＡ ＡＴ ＣＨＡＰＥＬ ＨＩＬＬ
【住所又は居所原語表記】１０９ Ｃｈｕｒｃｈ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ２７５１６ （ＵＳ）
(74)【代理人】
【識別番号】100180781
【弁理士】
【氏名又は名称】安達 友和
(74)【代理人】
【識別番号】100182903
【弁理士】
【氏名又は名称】福田 武慶
(72)【発明者】
【氏名】ワン，アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】アウ，キン マン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA31
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE23
4C076EE24
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB41
4C085BB43
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA10
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA38
4C086MA41
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA13
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、ＮＫ細胞表面上の第１の標的に結合する少なくとも１種類の第１の標的化剤、及びがん細胞表面上の第２の標的に結合する少なくとも１種類の第２の標的化剤を含む粒子を含み、第２の標的化剤は第１の標的化剤とは異なる、方法及び組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナノ粒子であって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面上の第１の標的に結合する少なくとも１種類の第１の標的化剤と、
がん細胞表面上の第２の標的に結合する少なくとも１種類の第２の標的化剤と、を含み、前記第２の標的化剤が前記第１の標的化剤とは異なる、ナノ粒子。
【請求項2】
少なくとも２種類の第１の標的化剤を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項3】
前記少なくとも２種類の第１の標的化剤が、前記ＮＫ細胞表面上の異なる標的に結合する、請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項4】
前記ＮＫ細胞表面上の前記第１の標的が、ＣＤ１６、４－１ＢＢ、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＫＩＲ、ＮＫＧ２ａ、ｄｎａｍ－１、２ｂ４、ＮＫｐ３０ａ、ＮＫｐ３０ｂ、ＮＫｐ３０ｃ、抗体Ｆｃ成分、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項5】
前記ＮＫ細胞表面上の前記第１の標的が、ＣＤ１６及び／又は４－１ＢＢである、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項6】
前記がん細胞が、腺がん、胸腺腫、肉腫、脳がん、頭頸部がん、食道がん、胃がん、肺がん、膀胱がん、腎がん、肝臓がん、膵臓がん、子宮がん、卵巣がん、子宮頸がん、肛門がん、メラノーマ、前立腺がん、乳がん、血液細胞がん、大腸がん、又はこれらのいずれかの組合せに由来する細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項7】
前記がん細胞表面上の前記第２の標的が、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ムチン、ＨＥＲ－２、ＣＤ３０、ＣＤ２２、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項8】
前記がん細胞表面上の前記第２の標的がＥＧＦＲである、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項9】
前記第１の標的化剤及び／又は前記第２の標的化剤が抗体又はその活性断片である、請求項１～８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項10】
前記抗体又はその活性断片が、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´－ＳＨ断片、ＦＶ断片、ｓｃＦｖ断片、（Ｆａｂ´）２断片、Ｆｃ－融合タンパク質、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載のナノ粒子。
【請求項11】
治療薬を更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項12】
前記治療薬が、エピルビシン（ＥＰＩ）、ドキソルビシン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、タキソール、ドセタキセル、ゲムシタビン、５－フルオロウラシル、マイトマイシン、シタラビン、シトキサン、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される化学療法薬である、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項13】
前記化学療法薬がエピルビシン（ＥＰＩ）である、請求項１２に記載のナノ粒子。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項15】
ＮＫ細胞を活性化させる方法であって、前記第１の標的化剤が前記ＮＫ細胞表面上の前記第１の標的に結合するような条件下で、前記ＮＫ細胞を、請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子、及び／又は請求項１４に記載の組成物に接触させることを含む、方法。
【請求項16】
ＮＫ細胞免疫応答を誘発させる方法であって、前記第１の標的化剤が前記ＮＫ細胞表面上の前記第１の標的に結合するような条件下で、前記ＮＫ細胞を、請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子、及び／又は請求項１４に記載の組成物に接触させることを含む、方法。
【請求項17】
がん細胞で細胞傷害性を誘発させる方法であって、前記第２の標的化剤が前記がん細胞表面上の前記第２の標的に結合するような条件下で、前記がん細胞を、請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子、及び／又は請求項１４に記載の組成物に接触させることを含む、方法。
【請求項18】
前記ナノ粒子又は前記組成物が治療薬を更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
治療薬をがん細胞に送達する方法であって、前記第２の標的化剤が前記がん細胞表面上の前記第２の標的に結合し、それにより治療薬を前記がん細胞に送達するような条件下で、前記がん細胞を、前記治療薬を含む請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子、及び／又は請求項１４に記載の組成物に接触させることを含む、方法。
【請求項20】
ＮＫ細胞免疫応答を誘発させる必要がある対象においてこれを誘発させる方法であって、前記第１の標的化剤が前記ＮＫ細胞表面上の前記第１の標的に結合するような条件下で、有効量の請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子、及び／又は請求項１４に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項21】
前記ナノ粒子及び／又は前記組成物が少なくとも２種類の第１の標的化剤を含み、前記少なくとも２種類の第１の標的化剤が結合する前記ＮＫ細胞が同じＮＫ細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
ＮＫ細胞を活性化させる必要がある対象においてこれを活性化させる方法であって、前記第１の標的化剤が前記ＮＫ細胞表面上の前記第１の標的に結合するような条件下で、有効量の請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子、及び／又は請求項１４に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項23】
前記ナノ粒子及び／又は前記組成物が少なくとも２種類の第１の標的化剤を含み、前記少なくとも２種類の第１の標的化剤が結合する前記ＮＫ細胞が同じＮＫ細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記対象ががんであると診断されている、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
がん細胞を処置する必要がある対象においてこれを処置する方法であって、前記第２の標的化剤が前記がん細胞表面上の前記第２の標的に結合するような条件下で、有効量の請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子、及び／又は請求項１４に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項26】
がん細胞を処置する必要がある対象においてこれを処置する方法であって、前記第１の標的化剤が前記ＮＫ細胞表面上の前記第１の標的に結合し、それにより前記第２の薬剤が前記がん細胞表面上の前記第２の標的に結合するような条件下で、有効量の請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子、及び／又は請求項１４に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項27】
治療薬をがん細胞に送達する必要がある対象においてこれをがん細胞に送達する方法であって、前記第２の標的化剤が前記がん細胞表面上の前記第２の標的に結合し、それにより前記対象において前記治療薬を前記がん細胞に送達するような条件下で、前記治療薬を含む、有効量の請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子、又は請求項１４に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項28】
前記がんが、神経膠芽腫、頭頸部がん、食道がん、胃がん、肺がん、膀胱がん、腎細胞がん、肝細胞がん、膵臓がん、子宮頸がん、肛門がん、メラノーマ、前立腺がん、乳がん、非ホジキンリンパ腫又は大腸がん、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記ナノ粒子又は前記組成物が、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、眼内、硝子体内、眼窩内、鼻腔内、埋め込み、吸入、腫瘍組織内、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される経路を介して投与される、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
有効量の治療薬を前記対象に投与する工程、及び／又は放射線療法の工程を更に含む、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記治療薬が、エピルビシン（ＥＰＩ）、ドキソルビシン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、タキソール、ドセタキセル、ゲムシタビン、５－フルオロウラシル、マイトマイシン、シタラビン、シトキサン、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される化学療法薬である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記化学療法薬がエピルビシン（ＥＰＩ）である、請求項３１に記載の方法
【請求項33】
前記対象が哺乳動物である、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子及び／又は請求項１４に記載の組成物、及び取扱説明書を含む、キット。
【請求項36】
ＮＫ細胞を活性化させることにおける請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子及び／又は請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項37】
がん細胞に細胞傷害性を誘発させることにおける請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子及び／又は請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項38】
治療薬をがん細胞に送達させることにおける請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子及び／又は請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項39】
がんを処置することにおける請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子及び／又は請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項40】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のナノ粒子及び／又は請求項１４に記載の組成物を含む、使用のための薬物の調製。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（優先権の陳述）
本出願は、米国特許法第１１９条の下で、２０１９年１０月１８日に出願された米国仮出願第６２／９２３，０６０号の優先権を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、米国特許法第１１９条の下で、２０１９年１０月１８日に出願された米国仮出願第６２／９２３，０６０号の優先権を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【0002】
（政府支援に関する陳述）
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたグラント番号ＣＡ１９８９９９の下で、政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、免疫調節及びがん免疫療法に関する。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたグラント番号ＣＡ１９８９９９の下で、政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、免疫調節及びがん免疫療法に関する。
【背景技術】
【0003】
がん免疫療法は、がんを処置するために患者自身の免疫系を利用することであり、がん処置において有力な新規戦略として登場してきた。がん免疫療法における進歩のほとんどが、がんを根絶するため適応免疫系を利用することに着目しているが、抗腫瘍免疫を形成するために自然免疫応答の能力を利用することについて関心が高まっている。初期の相関研究は、適応免疫系に対する耐性メカニズムでは、腫瘍細胞は、適応免疫系を無効にする変異によって適応免疫系を逃れる可能性があることを実証している。自然免疫系における重要な因子（ａｃｔｏｒ）は、ナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ、ＮＫ）細胞であり、これは防御の最前線として働く。適応免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞）とは異なり、ＮＫ細胞はネオアンチゲンを必要とすることなく、がん細胞に対して自発的な細胞溶解反応を示す。
【0004】
ＮＫ細胞活性化は多くの場合、２つ以上の共刺激分子（例えば、ＣＤ１６及び４－１ＢＢ）の活性化に関与しており、ＮＫ細胞介在抗がん免疫は多くの場合、ＮＫ細胞活性化リガンドの不十分な発現、及びがん細胞上のＭＨＣクラスＩ及び他の共抑制分子の過剰発現であることによって妨害される。近年、ＮＫ細胞及び腫瘍細胞を標的とするいくつかの二重特異性抗体は、会合及び細胞傷害性を促進させるように効果的に操作されているが、この抗体の翻訳は、正常細胞への傷害性有害事象により妨げられる。より重要な点として、これらの二重特異性は１つのＮＫ活性化リガンドのみを含むため、ＮＫ活性化を制限する。
【0005】
本発明は、ＮＫ細胞表面上の標的に結合する少なくとも１種類の第１の標的化剤、及びがん細胞表面上の標的に結合する少なくとも１種類の第２の標的化剤を有するナノ粒子、並びにこれを使用する方法を提供することにより、当該技術分野における欠点を克服する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、がんを処置し、がん細胞において細胞傷害性を誘発させ、ＮＫ細胞免疫応答を誘発させ、ＮＫ細胞を活性化させ、及び／又はがん細胞に治療薬を送達するための方法並びに組成物を提供する。
【0007】
したがって、本発明の一態様は、ＮＫ細胞表面上の第１の標的に結合する少なくとも１種類の第１の標的化剤、及びがん細胞表面上の第２の標的に結合する少なくとも１種類の第２の標的化剤を含むナノ粒子を提供する。この場合、第２の標的化剤は第１の標的化剤と異なる。
本発明のナノ粒子を含む組成物（例えば、医薬組成物）も、本明細書にて更に提供される。
本発明のナノ粒子を含む組成物（例えば、医薬組成物）も、本明細書にて更に提供される。
【0008】
本発明の更なる態様は、ＮＫ細胞を活性化させる方法であって、第１の標的化剤がＮＫ細胞表面上の第１の標的に結合するような条件下で、ＮＫ細胞と本発明のナノ粒子及び／又は組成物とを接触させることを含む方法を提供する。
【0009】
本発明の別の態様は、ＮＫ細胞免疫応答を誘発させる方法であって、第１の標的化剤がＮＫ細胞表面上の第１の標的に結合するような条件下で、ＮＫ細胞と本発明のナノ粒子及び／又は組成物とを接触させることを含む方法を提供する。
【0010】
本発明の追加の態様は、がん細胞において細胞傷害性を誘発させる方法であって、第２の標的化剤ががん細胞表面上の第２の標的に結合するような条件下で、がん細胞と本発明のナノ粒子及び／又は組成物とを接触させることを含む方法を提供する。
【0011】
本発明の更なる態様は、治療薬をがん細胞に送達する方法であって、第２の標的化剤ががん細胞表面上の第２の標的に結合し、それにより治療薬をがん細胞に送達するような条件下で、がん細胞と、治療薬を含む本発明のナノ粒子及び／又は組成物とを接触させることを含む方法を提供する。
【0012】
本発明の更なる態様は、その必要がある対象においてＮＫ細胞免疫応答を誘発させる方法であって、第１の標的化剤がＮＫ細胞表面上の第１の標的に結合するような条件下で、有効量の本発明のナノ粒子及び／又は組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0013】
本発明の更なる態様は、その必要がある対象においてＮＫ細胞を活性化させる方法であって、第１の標的化剤がＮＫ細胞表面上の第１の標的に結合するような条件下で、有効量の本発明のナノ粒子及び／又は組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0014】
本発明の更なる態様は、その必要がある対象においてがんを処置する方法であって、第２の標的化剤ががん細胞表面上の第２の標的に結合するような条件下で、有効量の本発明のナノ粒子及び／又は組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0015】
本発明の更なる態様は、その必要がある対象においてがんを処置する方法であって、第１の標的化剤がＮＫ細胞表面上の第１の標的に結合し、それにより第２の薬剤ががん細胞表面上の第２の標的に結合するような条件下で、有効量の本発明のナノ粒子及び／又は組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0016】
本発明の更なる態様は、その必要がある対象において治療薬をがん細胞に送達する方法であって、第２の標的化剤ががん細胞表面上の第２の標的に結合し、それにより治療薬を対象のがん細胞に送達するような条件下で、治療薬を含む有効量の本発明のナノ粒子及び／又は組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0017】
本発明のナノ粒子及び／又は組成物を含むキット、ＮＫ細胞を活性化し、がん細胞において細胞傷害性を誘発し、治療薬をがん細胞に送達し、及び／又はがんを処置する上で、本発明のナノ粒子及び／又は組成物を使用する方法、並びに本発明の粒子及び／又は組成物を含む使用するための薬物の調製を、本明細書にて追加的に提供する。
本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下に記載される本発明の説明においてより詳細に対処される。
本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下に記載される本発明の説明においてより詳細に対処される。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1B】ＥＧＦＲ標的化三価ナノエンゲージャの作用機序及び特性を示す。図１Ｂ代表的な透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）画像（図１Ｂ）、並びにＥＧＦＲ標的化薬物非含有ナノエンゲージャ及びＥＧＦＲ標的化ＥＰＩ封入ナノエンゲージャ（α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ）の数平均粒子（ＤＮ）分布曲線（図１Ｃ）を示す。
【図1C】ＥＧＦＲ標的化三価ナノエンゲージャの作用機序及び特性を示す。図１Ｃは、代表的な透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）画像（図１Ｂ）、並びにＥＧＦＲ標的化薬物非含有ナノエンゲージャ及びＥＧＦＲ標的化ＥＰＩ封入ナノエンゲージャ（α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ）の数平均粒子（ＤＮ）分布曲線（図１Ｃ）を示す。
【図1D】ＥＧＦＲ標的化三価ナノエンゲージャの作用機序及び特性を示す。図１Ｄは、抗体非含有ＥＰＩ ＮＰ及びα－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰ（ｎ＝３）の、ｐＨ依存性インビトロ薬物放出動態を示す。
【図2】異なる薬物を含まない、ＥＰＩ封入ＮＰの代表的なＴＥＭ画像を示す。
【図3-1】図３は、０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）中のナノ粒子分散液におけるナノ粒子トラッキング解析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＮＴＡ）により決定された、異なる薬物を含まないＮＰ及びＥＰＩ封入ＮＰの数平均粒子径（ＤＮ）分布曲線を示す。全ての測定は、５つの別々の測定の平均に基づいていた。
【図3-2】図３は、０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）中のナノ粒子分散液におけるナノ粒子トラッキング解析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＮＴＡ）により決定された、異なる薬物を含まないＮＰ及びＥＰＩ封入ＮＰの数平均粒子径（ＤＮ）分布曲線を示す。全ての測定は、５つの別々の測定の平均に基づいていた。
【図4A】異なる生理学的条件下での非標的化ＥＰＩ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ ＥＰＩ ＮＰ及びα－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰのインビトロ薬物放出動態を示す。
【図4B】異なる生理学的条件下での非標的化ＥＰＩ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ ＥＰＩ ＮＰ及びα－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰのインビトロ薬物放出動態を示す。図４Ａは、ｐＨ６．０～７．０（３７℃）である大過剰量の０．１Ｍ ＰＢＳ中でインキュベートした後の、官能化されていない及び異なる抗体で官能化されたＥＰＩ封入ＮＰについて記録した時間依存性ＵＶ可視スペクトルを示す。ナノ粒子濃度は２ｍｇ／ｍＬであった。全ての測定は、３つの別々の測定の平均に基づいていた。図４Ｂは、標的化されていない異なるＥＧＦＲ標的化ＥＰＩ ＮＰのインビトロ薬物放出プロファイルを示す。
【図5A】ＥＧＦＲ標的化トリ官能化ナノエンゲージャの物理化学的特性を示す。図５Ａは、ＦＩＴＣ標識した（ｉ）α－ＣＤ１６ ＮＰ、（ｉｉ）α－４－１ＢＢ ＮＰ、（ｉｉｉ）α－ＥＧＦＲ ＮＰ、（ｉｖ）α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ、及び（ｖ）α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰでインキュベートした後の、ＣＤ３－ＣＤ４９ｂ＋増幅マウスＮＫ細胞の代表的なＣＬＳＭ画像（図５Ａ）及びＦＡＣＳヒストグラム（図５Ｂ）を示す。
【図5B】ＥＧＦＲ標的化トリ官能化ナノエンゲージャの物理化学的特性を示す。図５Ｂは、ＦＩＴＣ標識した（ｉ）α－ＣＤ１６ ＮＰ、（ｉｉ）α－４－１ＢＢ ＮＰ、（ｉｉｉ）α－ＥＧＦＲ ＮＰ、（ｉｖ）α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ、及び（ｖ）α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰでインキュベートした後の、ＣＤ３－ＣＤ４９ｂ＋増幅マウスＮＫ細胞の代表的なＣＬＳＭ画像（図５Ａ）及びＦＡＣＳヒストグラム（図５Ｂ）を示す。
【図5C】ＥＧＦＲ標的化トリ官能化ナノエンゲージャの物理化学的特性を示す。図５Ｃは、ＦＩＴＣ標識したα－ＥＧＦＲ ＮＰ、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ、及びα－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（ｎ＝３）でインキュベートした後の、ＥＧＦＲが過剰発現したＨＴ２９細胞、ＭＢ４６８細胞、及びＡ４３１細胞の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを示す。
【図5D】ＥＧＦＲ標的化トリ官能化ナノエンゲージャの物理化学的特性を示す。図５Ｄは、ＦＡＣＳとして定量され、ＥＧＦＲ陰性Ｒａｊｉ細胞に対し、異なる抗体で官能化されたＦＩＴＣ標識したＮＰの結合親和性を示す。
【図5E】ＥＧＦＲ標的化トリ官能化ナノエンゲージャの物理化学的特性を示す。図５Ｅは、初期処置の３日後にＭＴＳアッセイにより評価した場合の、（ｉ）ＨＴ２９細胞、（ｉｉ）ＭＢ４６８細胞、及び（ｉｉｉ）Ａ４３１細胞に対する、遊離ＥＰＩ、非標的化ＥＰＩ ＮＰ、及び異なる抗体で官能化されたＥＰＩ ＮＰの直接的なインビトロ毒性を示す。
【図5F】ＥＧＦＲ標的化トリ官能化ナノエンゲージャの物理化学的特性を示す。図５Ｆは、異なるＥＰＩ処置により誘発されたＤＮＡ損傷を示す。５００ｎＭの異なるＥＰＩ製剤で１時間処理した後のα－γ－Ｈ２ＡＸ（ＰＥ標識）染色されたＨＴ２９細胞、ＭＢ４６８細胞、及びＡ４３１細胞の代表的なＦＡＣＳヒストグラム。処理した細胞を洗浄し、更に２４時間培養した後に、ＦＡＣＳに供した。ＤＮＡ損傷を定量化するため、処理した細胞を固定して透過処理した後、ＰＥ標識したα－γ－Ｈ２ＡＸで染色した。
【図6A】ナノエンゲージャによりＮＫ細胞を活性化させ、インビトロでがん細胞を攻撃することを示す。図６Ａは、α－ＣＤ１６、α－４－１ＢＢ、α－ＣＤ１６ＮＰ、α－４－１ＢＢ ＮＰ、及びこれらの１：１の組合せ、及びα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰで前処理したＮＫ細胞のインビトロ細胞傷害性を示す。標的細胞に対するエフェクター細胞（Ｅ／Ｔ）の比率は１：１であった。細胞傷害性は処理の２４時間後に決定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表されている。統計的有意性は、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキーのＨＳＤ事後検定により算出した（＊ｐ＜０．０５）。
【図6B】ナノエンゲージャによりＮＫ細胞を活性化させ、インビトロでがん細胞を攻撃することを示す。図６Ｂは、抗体で前処理したＮＫ細胞と２４時間にわたり共培養された後の（放射線非照射）Ｂ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ細胞のバイオルミネセンスの定量化を示す。ＮＫ細胞は、３７℃で３０分間、（１×１０６個のＮＫ細胞あたり１μｇである各抗体の濃度で）遊離α－ＣＤ１６及び／若しくはα－４－１ＢＢ又はＮＰコンジュゲートαＣＤ－１６及び／若しくはα－４－１ＢＢで前処理し、１度洗浄した後に、１：１のエフェクター／標的比で播種されたＢ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ細胞（ウェルあたり２×１０４個の細胞）で共培養した。生細胞は、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬（ｎ＝６）でインキュベートした後、強いバイオルミネセンスシグナルを示す。
【図6C】ナノエンゲージャによりＮＫ細胞を活性化させ、インビトロでがん細胞を攻撃することを示す。図６Ｃは、２４時間にわたる抗体で前処理したＮＫ細胞との共培養後の（照射）Ｂ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ細胞のバイオルミネセンスの定量化を示す。Ｂ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ細胞は、３時間５Ｇｙのセシウム－１３７照射に供された後、抗体で前処理したＮＫ細胞と共培養した。ＮＫ細胞は、３７℃で３０分間、１×１０６個のＮＫ細胞あたり１μｇである各抗体の濃度で遊離α－ＣＤ１６及び／若しくはα－４－１ＢＢ又はＮＰコンジュゲートα－ＣＤ１６及び／若しくはα－４－１ＢＢで前処理し、１度洗浄した後に、１：１のエフェクター／標的比で播種されたＢ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ細胞（ウェルあたり２×１０４個の細胞）で共培養した。生存細胞は、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬（ｎ＝６）でインキュベートした後、強いバイオルミネセンスシグナルを示す。
【図6D】ナノエンゲージャによりＮＫ細胞を活性化させ、インビトロでがん細胞を攻撃することを示す。図６Ｄは、α－ＣＤ１６及びα－４－１ＢＢ、α－ＣＤ１６ ＮＰ、α－４－１－ＢＢ ＮＰ、及びα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰで前処理したＮＫ細胞でインキュベートした後の、放射線非照射Ｂ１６Ｆ１０細胞及び５Ｇｙ放射線照射されたＢ１６Ｆ１０細胞の代表的な位相感応型光学画像を示す。Ｅ／Ｔ比は１：１であった。未結合のＮＫ細胞は、撮像前に洗浄することで除去された。
【図6E】ナノエンゲージャによりＮＫ細胞を活性化させ、インビトロでがん細胞を攻撃することを示す。図６Ｅは、α－ＣＤ１６、α－４－１ＢＢ、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（遊離α－ＥＧＦＲ又は遊離α－ＥＧＦＲ ＮＰを含む又は含まない）、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（遊離ＥＰＩ又は遊離ＥＰＩ ＮＰを含む又は含まない）、及びα－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰで前処理したＨＴ２９－Ｌｕｃ２細胞に対する、ＮＫ細胞のインビトロ細胞傷害性を示す。細胞傷害性は、処理の２４時間後に定量した。Ｅ／Ｔ比は１：１であった。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表されている。統計的有意性は、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキーのＨＳＤ事後検定により算出した（＊ｐ＜０．０５）。
【図6F】ナノエンゲージャによりＮＫ細胞を活性化させ、インビトロでがん細胞を攻撃することを示す。図６Ｆは、Ｅ／Ｔ＝１：１で増幅されたＮＫ細胞で共培養する前に異なる免疫療法で処理された後のＨＴ２９－Ｌｕｃ２細胞のバイオルミネセンスの定量化を示す。左パネル：異なる免疫療法で１時間処理し、洗浄し、その後完全培地（ＮＫ細胞は含まれない）中で３日間更に培養した後のＨＴ２９－Ｌｕｃ２細胞のバイオルミネセンス。免疫療法薬の用量は、６００ｎＭの遊離ＥＰＩ／封入ＥＰＩでの同時処置の有無に関わらず、１×１０４個の細胞（各ウェル中）あたり１０ｎｇの各抗体であった。細胞生存率は、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬で定量した。生細胞は、ルシフェラーゼアッセイ（ｎ＝６）でインキュベートした後、強いバイオルミネセンスシグナルを示す。右パネル：異なる免疫療法で１時間処理し、洗浄し、その後Ｅ／Ｔ＝１：１で３時間ＮＫ細胞と共培養した後のＨＴ２９－Ｌｕｃ２細胞のバイオルミネセンス画像。免疫療法薬の用量は、６００ｎＭの遊離ＥＰＩ／封入ＥＰＩでの同時処置の有無に関わらず、１×１０４個の細胞（各ウェル中）あたり１０ｎｇの各抗体であった。細胞生存率は、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬で定量した。生細胞は、ルシフェラーゼアッセイ（ｎ＝６）でインキュベートした後、強いバイオルミネセンスシグナルを示す。
【図6G】ナノエンゲージャによりＮＫ細胞を活性化させ、インビトロでがん細胞を攻撃することを示す。図６Ｇは、ＮＫ細胞が存在する又は存在しない（１：１のエフェクター／標的比）、薬物非含有α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ又はＥＰＩ封入α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（６００ｎＭの封入ＥＰＩ又は同量の薬物非含有ＮＰを含有する）で処理した３日後に記録されたＨＴ２９細胞、ＭＢ４６８細胞、及びＡ４３１細胞の生存率を示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）として表されている。統計的有意性は、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキーのＨＳＤ事後検定により算出した（＊ｐ＜０．０５）。
【図6H】ナノエンゲージャによりＮＫ細胞を活性化させ、インビトロでがん細胞を攻撃することを示す。図６Ｈは、ＮＫ細胞による共培養前に、治療用量以下のＥＰＩ封入トリ官能化ナノエンゲージャ（α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ）で前処理したＨＴ２９細胞、ＭＢ４６８細胞、及びＡ４３１細胞の生存率を示す。細胞（ＭＢ４６８細胞及びＨＴ２９細胞についてはウェルあたり１×１０４個の細胞、又はＡ４３１細胞についてはウェルあたり５×１０３個の細胞）は、薬物非含有又はＥＰＩ封入した１．２μｇのα－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰで１時間処理され、洗浄され、次いでＥ／Ｔ＝１：１の比でＮＫ細胞と共培養された。ＭＴＳアッセイの添加後、ＨＴ２９細胞（パネルａ）、ＭＢ４６８細胞（パネルｂ）及びＡ４３１細胞（パネルｃ）の吸光度（４９０ｎｍ）。ＮＫ細胞は、サイトカインを含まない培地では生存性を失うため、４９０ｎｍにてわずかな吸光度を示すのみであった。したがって、ＮＫ細胞により共培養された処置群の吸光度（４９０ｎｍ）は、ＮＫ細胞により悪影響を及ぼされることはない。
【図7A】ＮＫ細胞におけるＣＤ１６及び４－１ＢＢ共刺激分子の空間時間的な同時活性化は、インビボでマウスの腫瘍増殖を遅延させることを示す。図７Ａは、異なる免疫療法薬（ｎ＝６マウス／群）で処置を受けた後のＢ１６Ｆ１０担がんマウスの平均腫瘍増殖曲線（ｉ）、（ｉｉ）、及び生存曲線（ｉｉｉ）、（ｉｖ）を示す。
【図7B】ＮＫ細胞におけるＣＤ１６及び４－１ＢＢ共刺激分子の空間時間的な同時活性化は、インビボでマウスの腫瘍増殖を遅延させることを示す。図７Ｂは、異なる免疫療法薬（ｎ＝６マウス／群）で処置を受けた後のＢ１６Ｆ１０担がんマウスの平均腫瘍増殖曲線（ｉ）、（ｉｉ）、及び生存曲線（ｉｉｉ）、（ｉｖ）を示す。
【図7C】ＮＫ細胞におけるＣＤ１６及び４－１ＢＢ共刺激分子の空間時間的な同時活性化は、インビボでマウスの腫瘍増殖を遅延させることを示す。免疫細胞を除去したＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、摂取５日後、８日後、１０日後、１２日後、１５日後、及び１８日後のα－ＣＤ２０、α－ＮＫ１．１、α－ＣＤ４、及びα－ＣＤ８（３００μ／注射）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により除去した。マウスＩｇＧ ２ａ（３００μｇ／注射）をアイソタイプコントロールとして投与した。α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（各抗体１００μｇを含有する）を、摂取６日後、７日後、及び８日後に静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。１００μｇのα－ＣＤ１６及び／又は１００μｇのα－４－１ＢＢ（遊離又はＮＰコンジュゲート）を含有する免疫療法薬を、摂取６日後、７日後、及び８日後に尾静脈に静脈内投与した。免疫刺激群におけるマウスの異種移植腫瘍は、免疫療法薬の投与４時間前に５Ｇｙの放射線の単回照射に供され、がん細胞中のＮＫ細胞活性化リガンドを上方制御した。図７Ｃは、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（ｎ＝７マウス／群）で処置を受けた後のＢ１６Ｆ１０担がん免疫細胞を除去したマウスの平均腫瘍増殖曲線（ｉ）、及び生存曲線（ｉｉ）を示す。データは平均±ＳＥＭとして表されている（＊ｐ＜０．０５）。腫瘍増殖曲線の統計的有意性は、１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキーの事後検定により算出した（＊ｐ＜０．０５）。生存曲線の統計的有意性を、ログランク（マンテル－コックス）検定により算出した（＊ｐ＜０．０５）。
【図8A】ＣＤ１６及び４－１ＢＢ受容体の空間時間的な同時活性化が、インビボにて放射線非照射Ｂ１６Ｆ１０異種移植腫瘍の成長を遅延させることを示す。線は、放射線照射なしに異なる免疫療法薬で処置を受けた後の、Ｂ１６Ｆ１０担がんマウスの個々の腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝６マウス／群）。
【図8B】５Ｇｙのセシウム－１３７照射が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおけるα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰの抗がん活性を相乗的に改善させることを示す。図８Ｂの上部パネル：α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰで異なる処置を行った後の放射線非照射及び放射線照射Ｂ１６Ｆ１０担がんマウスの平均腫瘍曲線。摂取１９日後に、５ＧｙのＩＲ後にα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰでの最初の処置をすることで、５Ｇｙ ＩＲを受けたものと比較すると平均腫瘍体積が約６０％減少した。対照的に、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（ＩＲなし）での処置により、未処置群と比較すると約４０％だけ平均腫瘍体積が減少した。これは、５ＧｙのＩＲは、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰの抗がん活性を相乗的に（しかし相加的に）改善させることを示す。図８Ｂの底部パネル：α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰで異なる処置を行った後の放射線非照射及び放射線照射Ｂ１６Ｆ１０担がんマウスの生存曲線。未処置群についての平均生存期間は１９±１日間であった。α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰによる処置（免疫刺激なし）は、平均３日間生存期間を増加させた（すなわち、平均生存期間＝２２±２日間）。更なる処置なしでの５Ｇｙの放射線照射により、平均３日間生存期間を増加させた（すなわち、平均生存期間＝２２±１日間）。５ＧｙのＩＲに続きα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ処置することで、１４日間生存期間が増加した（すなわち、平均生存期間＝３２±１日間）。これは、放射線照射がα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰの抗がん活性を相乗的に増加させたことを示す。
【図8C】ＣＤ１６及び４－１ＢＢ受容体の空間時間的な同時活性化が、インビボにて放射線照射Ｂ１６Ｆ１０異種移植腫瘍の成長を遅延させることを示す。線は、最初の処置前に５Ｇｙの放射線照射を行い、異なる免疫療法薬で処置を受けた後の、Ｂ１６Ｆ１０担がんマウスの個々の腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝６マウス／群）。
【図8D】α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰが効果的にＮＫ細胞を同時活性化させ、インビボでのがん免疫療法を改善させることを示す。線は、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰでの処置を受けた又は５ＧｙのＩＲを受けた後の、免疫細胞を除去したＢ１６Ｆ１０担がんマウスの個々の腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝７マウス／群）。
【図8E-1】図８Ｅは、Ｔ細胞欠損ＮｕマウスにおけるＢ１６Ｆ１０腫瘍に対する、遊離α－ＣＤ１６＋遊離α－４－１ＢＢ及びα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰの抗がん活性を示す。図８ＥのパネルＡは、Ｔ細胞欠損ＮｕマウスにおけるＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルについての実験スキームを示す。摂取６日後、７日後及び８日後に、１００μｇの各抗体を含む３種類の用量の免疫療法薬を尾静脈内注射により投与した。免疫刺激群におけるマウスは、免疫療法薬の最初の投与の３時間前に、５Ｇｙのセシウム－１３７の単回照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ、ＩＲ）を受けた。インビボ有効性研究は、摂取２１日後に終了した。Ｂ１６Ｆ１０担がんマウスの個々の腫瘍増殖曲線（図８ＥのパネルＢ）及び平均腫瘍増殖曲線（図８ＥのパネルＣ）は、異なる免疫療法薬で処置した後に記録した。腫瘍増殖抑制率（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＴＧＩ）は、摂取１９日後に記録された処置群及び未処置のコントロール群の平均腫瘍体積に基づき算出された。免疫刺激なしの場合（５ＧｙのＩＲ）、α－ＣＤ１６＋α－４－１ＮＮ又はα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰのいずれも腫瘍増殖を抑制しなかった（未処置群に対しｐ＝０．６４２３）。５ＧｙのＩＲは、３６％のＴＧＩで腫瘍増殖を遅延させた。５ＧｙのＩＲに続き、α－ＣＤ１６＋α－４－１ＢＢによる処置は、６１％のＴＧＩで腫瘍増殖を遅延させた。５ＧｙのＩＲに続き、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰによる処置は、７８％のＴＧＩで腫瘍増殖を遅延させた（５ＧｙのＩＲに続き、α－ＣＤ１６＋α－４－１ＢＢによる処置に対してｐ＝０．０１８１）。全群に対してｎ＝６マウス。統計的有意性は、テューキーの事後検定と共に１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により算出した。
【図8E-2】図８Ｅは、Ｔ細胞欠損ＮｕマウスにおけるＢ１６Ｆ１０腫瘍に対する、遊離α－ＣＤ１６＋遊離α－４－１ＢＢ及びα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰの抗がん活性を示す。図８ＥのパネルＡは、Ｔ細胞欠損ＮｕマウスにおけるＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルについての実験スキームを示す。摂取６日後、７日後及び８日後に、１００μｇの各抗体を含む３種類の用量の免疫療法薬を尾静脈内注射により投与した。免疫刺激群におけるマウスは、免疫療法薬の最初の投与の３時間前に、５Ｇｙのセシウム－１３７の単回照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ、ＩＲ）を受けた。インビボ有効性研究は、摂取２１日後に終了した。Ｂ１６Ｆ１０担がんマウスの個々の腫瘍増殖曲線（図８ＥのパネルＢ）及び平均腫瘍増殖曲線（図８ＥのパネルＣ）は、異なる免疫療法薬で処置した後に記録した。腫瘍増殖抑制率（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＴＧＩ）は、摂取１９日後に記録された処置群及び未処置のコントロール群の平均腫瘍体積に基づき算出された。免疫刺激なしの場合（５ＧｙのＩＲ）、α－ＣＤ１６＋α－４－１ＮＮ又はα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰのいずれも腫瘍増殖を抑制しなかった（未処置群に対しｐ＝０．６４２３）。５ＧｙのＩＲは、３６％のＴＧＩで腫瘍増殖を遅延させた。５ＧｙのＩＲに続き、α－ＣＤ１６＋α－４－１ＢＢによる処置は、６１％のＴＧＩで腫瘍増殖を遅延させた。５ＧｙのＩＲに続き、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰによる処置は、７８％のＴＧＩで腫瘍増殖を遅延させた（５ＧｙのＩＲに続き、α－ＣＤ１６＋α－４－１ＢＢによる処置に対してｐ＝０．０１８１）。全群に対してｎ＝６マウス。統計的有意性は、テューキーの事後検定と共に１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により算出した。
【図9A】ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャは、インビボでＥＧＦＲが過剰発現した腫瘍増殖を効果的に抑制することを示す。図９Ａは、Ｔ細胞欠損ＮｕマウスにおけるＡ４３１及びＭＢ４６８腫瘍モデルについての実験スキームを示す。摂取６日後、８日後及び１０日後に、１００μｇのα－ＥＧＦＲ、１００μｇのα－ＣＤ１６及び１００μｇのα－４－１ＢＢ（１６０μｇの遊離ＥＰＩ／封入ＥＰＩを含む／含まない）を含む３つの用量の免疫療法薬／化学免疫療法薬を尾静脈内投与した。
【図9B】ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャは、インビボでＥＧＦＲが過剰発現した腫瘍増殖を効果的に抑制することを示す。図９Ｂは、異なる処置を受けた後、Ａ４３１を有するＮｕマウスについて記録された、平均腫瘍増殖曲線（ｉ）、生存曲線、及び生存期間中央値（ＭＳ）（ｉｉ）を示す（ｎ＝６マウス／群）。
【図9C】ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャは、インビボでＥＧＦＲが過剰発現した腫瘍増殖を効果的に抑制することを示す。図９Ｃは、異なる処置を受けた後のＭＢ４６８異種移植腫瘍を有するＮｕマウスについて記録された、平均腫瘍増殖曲線及び腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）を示す（ｎ＝６マウス／群）。ＴＧＩは、研究のエンドポイント（摂取１２５日後）での未処置群に関連した処置群における平均腫瘍体積の変化を比較することにより算出した。
【図9D】ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャは、インビボでＥＧＦＲが過剰発現した腫瘍増殖を効果的に抑制することを示す。図９Ｄは、Ｔ細胞欠損ＮｕマウスにおけるＥＧＦＲ＋ＨＴ２９及びＥＧＦＲ－Ｒａｊｉ二重異種移植腫瘍モデルについての実験スキームを示す。摂取６日後、８日後及び１０日後に、３種類の用量の免疫療法薬／化学免疫療法薬を尾静脈内投与した。インビボ有効性研究は、摂取２０日後に終了した。この時、Ｒａｊｉ腫瘍の最大直径は１０ｍｍに達していた。異なる処置を受けた後の、ＨＴ２９（ｉ）及びＲａｊｉ（ｉｉ）異種移植腫瘍の平均腫瘍増殖曲線（未処置のコントロール群についてはｎ＝５、その他全ての処置群についてはｎ＝７）。ＴＧＩは、研究のエンドポイント（摂取２０日後）での未処置群に関連する処置群における平均腫瘍体積の変化を比較することにより算出した。データは平均±ＳＥＭとして表されている。統計的有意性平均腫瘍増殖曲線は、１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキーの事後検定により算出した（＊ｐ＜０．０５）。統計的有意性生存曲線を、ログランク（マンテル－コックス）検定により算出した（＊ｐ＜０．０５）。
【図10A-1】図１０Ａは、ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャ（α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ）は、インビボにてＥＧＦＲが過剰発現したＡ４３１腫瘍の増殖を効果的に抑制することを示す。線は、異なる処置を受けた後にＡ４３１を有するＮｕマウスについて記録された個々の腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝６マウス／群）。
【図10A-2】図１０Ａは、ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャ（α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ）は、インビボにてＥＧＦＲが過剰発現したＡ４３１腫瘍の増殖を効果的に抑制することを示す。線は、異なる処置を受けた後にＡ４３１を有するＮｕマウスについて記録された個々の腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝６マウス／群）。
【図10B】α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰが、Ｔ細胞欠損ＮｕマウスにおけるＡ４３１異種移植腫瘍の増殖を効果的に抑制することを示す。図１０Ｂの左パネル：薬物非含有α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ＋遊離ＥＰＩで処置した後の、Ａ４３１腫瘍を有するマウスの平均腫瘍曲線。統計的有意性は、テューキーの事後検定と共に１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により算出した（＊ｐ＜０．０５）。図１０Ｂの右パネル：薬物非含有α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ＋遊離ＥＰＩで処置した後の、Ａ４３１腫瘍を有するマウスの生存曲線（群あたりｎ＝６）。統計的有意性を、ログランク（マンテル－コックス）検定により算出した（＊ｐ＜０．０５）。
【図10C-1】図１０Ｃは、ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャ（α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ）が、インビボにてＥＧＦＲが過剰発現しているＭＢ４６８腫瘍の増殖を効果的に抑制することを示す。線は、異なる処置を受けた後にＭＢ４６８を有するＮｕマウスについて記録された個々の腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝６マウス／群）。
【図10C-2】図１０Ｃは、ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャ（α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ）が、インビボにてＥＧＦＲが過剰発現しているＭＢ４６８腫瘍の増殖を効果的に抑制することを示す。線は、異なる処置を受けた後にＭＢ４６８を有するＮｕマウスについて記録された個々の腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝６マウス／群）。
【図10D】α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰが、Ｔ細胞欠損ＮｕマウスにおけるＭＢ４６８異種移植腫瘍の増殖を効果的に抑制することを示す。薬物非含有α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ＋遊離ＥＰＩで処置した後の、ＭＢ４６８腫瘍を有するマウスの平均腫瘍曲線が示されている。統計的有意性は、テューキーの事後検定と共に１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により算出した（＊ｐ＜０．０５）。
【図10E-1】図１０Ｅは、ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャが、インビボでＥＧＦＲが過剰発現した腫瘍を攻撃するようＮＫ細胞を誘導することにより化学免疫療法を改善させることを示す。線は、異なる処置を受けた後のＴ細胞欠損Ｎｕマウスにおいて、ＨＴ２９及びＲａｊｉ二重異種移植腫瘍モデルの個々の腫瘍増殖曲線を示す（未処置のコントロール群についてはｎ＝５、その他全ての処置群についてはｎ＝７）。
【図10E-2】図１０Ｅは、ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャが、インビボでＥＧＦＲが過剰発現した腫瘍を攻撃するようＮＫ細胞を誘導することにより化学免疫療法を改善させることを示す。線は、異なる処置を受けた後のＴ細胞欠損Ｎｕマウスにおいて、ＨＴ２９及びＲａｊｉ二重異種移植腫瘍モデルの個々の腫瘍増殖曲線を示す（未処置のコントロール群についてはｎ＝５、その他全ての処置群についてはｎ＝７）。
【図10F】Ａ４３１担がんＮｕマウスにおいて、異なる抗体で官能化されたＣｙ５標識ＮＰの体内分布を示す。図１０ＦパネルＡは、注入された異なる濃度のＣｙ５標識ＮＰのエクスビボＮＩＲ蛍光画像及び異なるＣｙ５標識ＮＰの濃度依存光量子効率のプロットを示す。光量子効率は、注入されたＣｙ５標識ＮＰの濃度に伴い、直線状に増加する。図１０ＦのパネルＢは、Ａ４３１異種移植腫瘍、並びに未処置のマウス、及びＣｙ５標識α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（マウスあたり１００μｇの各抗体を含有した、６ｍｇのＮＰ）を加えたα－ＥＧＦＲ（マウスあたり１００μｇ）、Ｃｙ５標識α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（マウスあたり１００μｇの各抗体を含有した、４ｍｇ）を加えたＣｙ５標識α－ＥＧＦＲ ＮＰ（マウスあたり１００μｇのコンジュゲートα－ＥＧＦＲを含有した、２ｍｇのＮＰ）、並びにＣｙ５標識α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（マウスあたり１００μｇの各抗体を含有した、６ｍｇのＮＰ）を投与されたマウスから保存された主要な器官のエクスビボ蛍光画像を示す。左から右に向かって保存した組織：Ａ４３１異種移植腫瘍、肝臓、膵臓、腎臓、肺、及び心臓。画像は、６０５±２０ｎｍで励起された光源を使用して記録された。蛍光の発光は、６９０±２０ｎｍで記録された。
【図11A】ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャが、ＮＫ細胞を腫瘍に動員し、ｄｓＤＮＡ切断を増加させることで化学免疫療法を改善することを示す。図１１Ａは、異なる免疫療法薬／化学免疫療法薬の尾静脈内投与の４０時間後に記録された、ＮｕマウスにおけるＡ４３１腫瘍モデルにおけるＣｙ５標識ナノエンゲージャ及びＥＰＩ封入ナノエンゲージャの体内分布を示す（Ｃｙ５標識α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰ、及びα－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ＋遊離ＥＰＩを投与された群についてはｎ＝６、並びにα－ＥＧＦＲ ＥＰＩ ＮＰを投与された群についてはｎ＝４であるのを除き、コントロール群及び試験群の全てに関してはｎ＝５）。データは平均±ＳＥＭを表す。統計的有意性は、テューキーの事後検定と共に２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により算出した（＊ｐ＜０．０５）。
【図11B】ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャが、ＮＫ細胞を腫瘍に動員し、ｄｓＤＮＡ切断を増加させることで化学免疫療法を改善することを示す。図１１Ｂは、α－ＮＫ１．１及びα－ＥＧＦＲが同時染色されたＡ４３１腫瘍区分（図１１Ｂ）及びα－γ－Ｈ２ＡＸ染色され（図１１Ｄ）、処置後４０時間保存されたＡ４３１腫瘍区分の免疫蛍光画像の定量化を示す。
【図11C】ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャが、ＮＫ細胞を腫瘍に動員し、ｄｓＤＮＡ切断を増加させることで化学免疫療法を改善することを示す。図１１Ｃは、α－ＮＫ１．１及びα－ＥＧＦＲが同時染色されたＡ４３１腫瘍区分（図１１Ｂ）及びα－γ－Ｈ２ＡＸ染色され（図１１Ｄ）、処置後４０時間保存されたＡ４３１腫瘍区分の免疫蛍光画像の定量化を示す。
【図11D】ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャが、ＮＫ細胞を腫瘍に動員し、ｄｓＤＮＡ切断を増加させることで化学免疫療法を改善することを示す。図１１Ｄは、異なる免疫療法薬／化学免疫療法薬の静脈内投与の４０時間後、Ａ４３１担がんＮｕマウスについて記録された血清ＴＮＦ－α及びＩＮＦ－γレベルを示す。
【図11E】Ａ４３１担がんＮｕマウスにおいて、異なる抗体で官能化されたＥＰＩ封入ＮＰの体内分布を示す。図１１ＥのパネルＡは、異なる濃度の注入されたＥＰＩのエクスビボＮＩＲ蛍光画像及び遊離ＥＰＩの濃度依存光量子効率のプロットを示す。光量子効率は、注入されたＥＰＩの濃度に伴い、直線状に増加する。図１１ＥのパネルＢは、Ａ４３１異種移植腫瘍、並びに未処置のマウス、及び遊離ＥＰＩ（マウスあたり１６０μｇのＥＰＩ）、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰ（マウスあたり１００μｇの各抗体を含有した、６ｍｇの総ＮＰあたり１６０μｇの封入ＥＰＩ）、遊離ＥＰＩ（マウスあたり１６０μｇのＥＰＩ）に加えたα－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（マウスあたり１００μｇの各抗体を含有した６ｍｇのＮＰ）、α－ＥＧＦＲ ＥＰＩ ＮＰ（マウスあたり１００μｇのコンジュゲートα－ＥＧＦＲを含有した６ｍｇのＮＰあたり１６０μｇのＥＰＩ）、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（マウスあたり１００μｇの各抗体を含有した４ｍｇのＮＰ）に加えたα－ＥＧＦＲ ＥＰＩ ＮＰ（マウスあたり１００μｇのコンジュゲートα－ＥＧＦＲを含有した６ｍｇのＮＰあたり１６０μｇのＥＰＩ）を投与されたマウスから保存された主要な器官のエクスビボ蛍光画像を示す。左から右に向かって保存した組織：Ａ４３１異種移植腫瘍、肝臓、膵臓、腎臓、肺、及び心臓。画像は、４６５±２０ｎｍで励起された光源を使用して記録された。蛍光の発光は、５９０±２０ｎｍで記録された。
【発明を実施するための形態】
【0019】
（定義）
本主題は、本明細書にて開示される主題の代表的な実施形態が示されている添付の実施例を参照して以下に完全にここに記載されるだろう。ただし、本明細書にて開示される主題は異なる形態で具体化可能であり、本明細書に記載の実施形態に限定されるものであると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完全かつ完璧であり、本明細書にて開示される主題の範囲を当業者に完全に伝えるために提供される。
本主題は、本明細書にて開示される主題の代表的な実施形態が示されている添付の実施例を参照して以下に完全にここに記載されるだろう。ただし、本明細書にて開示される主題は異なる形態で具体化可能であり、本明細書に記載の実施形態に限定されるものであると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完全かつ完璧であり、本明細書にて開示される主題の範囲を当業者に完全に伝えるために提供される。
【0020】
特段定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により、一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書にて本発明の説明で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、本発明を限定しようと意図するものではない。
【0021】
特段文脈が示さない限り、本明細書にて記載の本発明の様々な特徴は、任意の組合せで使用され得ることが特に意図されている。更には、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかの特徴又はそれらの組合せを除外又は省略可能であることも企図する。説明のため、本明細書は、複合体が成分Ａ、Ｂ、及びＣを含むと述べる場合、Ａ、Ｂ、又はＣのいずれか、又はこれらの組合せは単独で、又は任意の組合せで除外又は放棄される可能性があることを特に意図している。
【0022】
ヌクレオチド配列は、特段具体的に指示しない限り、５´から３´方向に左から右へ、一本鎖のみによって本明細書では提示される。ヌクレオチド及びアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されている様式で、又は米国連邦規則法典第３７巻§１．８２２及び定例の両方にある三文字コードにて、本明細書では表されている。
【0023】
別段支持された場合を除き、当業者に公知の標準方法は、遺伝子のクローニング、核酸分子の増幅及び検出などに使用されてもよい。こうした技術は、当業者には公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【0024】
本明細書にて言及される全ての刊行物、特許出願、特許、アクセッション番号及び他の参考文献は、それらの全体が本明細書に参照として組み入れられる。
【0025】
定義
以下の用語は、当業者によって十分理解されていると考えられるが、本明細書にて開示される主題の説明を容易にするため、以下の定義を記載する。
以下の用語は、当業者によって十分理解されていると考えられるが、本明細書にて開示される主題の説明を容易にするため、以下の定義を記載する。
【0026】
長年の特許法の慣例に従い、用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、１つ又は複数を指す可能性がある。
【0027】
特段指示しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用されるサイズ、バイオマーカの濃度、確率、割合などの量を表現する全ての数は、全ての場合において、用語「約」により修飾されるものであると理解されるべきである。例えば、量は約１０％、約５％、約１％、又は約０．５％ずつ変動し得る。従って、特段記載しない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本明細書にて開示される主題により得ようと試みる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。
【0028】
２つ以上の項目又は条件を記載する際に使用される用語「及び／又は」は、全ての指名された項目若しくは条件が存在若しくは適用可能である状況、又は項目若しくは条件の１つのみ（若しくは全てのものより少ない）が存在若しくは適用可能である状況を指す。本明細書でも使用される場合、「及び／又は」は、列挙された関連項目のうち１つ以上のいずれか、及び全ての考えられる組合せ、並びに代案（「又は」）で解釈される場合の組合せの欠如を指し、かつこれらを包含する。
【0029】
更には、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度などの量といった測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される用語「約」は、特定の量のうち±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、又は更には±０．１％の変動を包含することを意味する。
【0030】
本明細書で使用される場合、用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及び「により特徴付けられる」と同義である用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的又はオープンエンド形式であり、追加の列挙されていない要素及び／又は方法の工程を排除しない。「を含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、指定の要素及び／又は工程が存在するが、他の要素及び／又は工程を加えることが可能であり、更には関連する手段の範囲内にあることを意味する技術用語である。
【0031】
本明細書で使用される場合、語句「からなる（ｃｏｎｓｉｎｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求の範囲で明記されていない任意の要素、工程、又は成分を排除する。語句「からなる（ｃｏｎｓｉｎｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｎｔ ｏｆ）」は、プリアンブル直後ではなく請求項の特徴部分の条項に表れる場合、これは条項に記載の要素のみに限定し、他の要素は全体として請求項から除外されない。
【0032】
本明細書で使用される場合、語句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｎｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、請求された主題の基本的な１つ以上の特徴及び新規の１つ以上の特徴に実質的に悪影響を及ぼすことがない材料又は工程に加え、特定の材料又は工程に請求項の範囲を限定する。
【0033】
本明細書に使用される３つの用語である、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｎｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｎｔｉｎｇ ｏｆ）」に関しては、本明細書にて開示される主題は他の用語のうちいずれかの使用を含み得る。
【0034】
本明細書で使用される場合、用語「対象」及び「患者」は本明細書では互換可能に使用され、ヒトとヒト以外の動物の両方を指す。本発明の対象は、本発明の方法及び組成物により利益を受け得る障害に対して感受性がある任意の対象であり、並びに／又は本発明の方法及び組成物により障害に関して処置され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法のうち、いずれかの方法の対象は、哺乳動物である。本明細書で使用される用語「哺乳動物」としては、ヒト、霊長類、ヒト以外の霊長類（例えば、サル及びヒヒ）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスターなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。ヒト対象としては、新生児、幼児、若年層、及び成人が挙げられる。更なる選択肢として、対象は実験動物及び／又は疾患の動物モデルであり得る。好ましくは、対象はヒトである。
対象は、任意の生物、任意の民族及び任意の年齢の対象であってもよい。
対象は、任意の生物、任意の民族及び任意の年齢の対象であってもよい。
【0035】
「その必要がある対象」又は「必要がある対象」は、本発明の方法及び組成物により処置され得る、又は本明細書に記載のものを含む粒子及び／若しくは組成物の送達により利益があるであろう障害を有することが知られている対象であり、又はこうした障害を有する若しくは発症すると疑われる、又はこうした障害を有する若しくは発症するリスクがある対象である。
【0036】
本明細書で使用される用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」又は「投与された（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」は、局所投与、非経口投与、及び／又は経口投与、本明細書に記載の投与全てを含むと意味する。非経口投与としては、静脈内投与、皮下投与、及び／又は筋肉内投与（例えば、骨格筋又は心筋への投与）が挙げられるがこれらに限定されない。実際の投与方法及び投与の順番は、とりわけ、利用されている１つ以上の化合物の特定の合剤、及び利用されている他の１つ以上の化合物の１つ以上の特定の製剤によって変化することが理解されるであろう。所与の一連の病状に関する本発明の組成物の最適な投与方法及び投与の順番は、従来の技術を使用し、かつ本明細書に提示される情報を考慮し、当業者によって確認され得る。
【0037】
用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」又は「投与された（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」はまた、経口経路、舌下経路、頬側経路、経皮経路、直腸経路、筋肉内経路、静脈内経路、動脈内（冠内）経路、脳室内経路、くも膜下腔内経路、及び皮下経路を指すが、これらに限定されない。良好な臨床実務に従い、即時化合物は過度の害を及ぼす作用又は有害な副作用を引き起こすことなしに効果的で有益な作用を生み出す、すなわち、投与に関連する利益が有害作用を上回る用量で投与され得る。
【0038】
本明細書でも使用される場合、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、病状、障害、疾患又は病気に苦しんでいる対象に、例えば、有益な効果及び／又は治療効果といった調節効果を与える任意の種類の作用を示す。この作用とは例えば、当該技術分野で周知されているように、患者の病状（例えば、１つ以上の症状）における改善、障害、疾患、若しくは疾病の進行の遅延、及び／又は病状、障害、疾患若しくは疾病などの臨床パラメータにおける変化を含む。
【0039】
追加的に本明細書で使用される場合、用語「予防（ｐｒｏａｃｔｉｖｅ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」又は「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、対象における疾患、障害、及び／若しくは１つ以上の臨床症状の非存在、回避、並びに／又はこれらの発症及び／若しくは進行の遅延、並びに／又は本発明の方法が存在しないことで生じうるようなものに関連する疾患、障害、及び／若しくは１つ以上の臨床症状の発症の重症度の低減をもたらす、任意の種類の作用を指す。予防は完全なものであり得る。例えば、疾患、障害及び／又は１つ以上の臨床症状は完全に存在しない。予防は部分的なものであり得、その結果、対象における疾患、障害、及び／若しくは１つ以上の症状の発生、並びに／又は発症の重症度は、本発明が存在しなかった場合よりも小さい。
【0040】
「有効量」又は「治療有効量」は、治療効果及び／又は有益な効果であり得る所望の効果を生み出すのに十分な本発明の化合物又は組成物の量を指す。一般には、「治療有効量」又は「処置有効量」は、所望の効果を達成するための、十分ではあるが非毒性である活性成分（すなわち、本発明の粒子）の量を指す。例えばこの所望の効果は、症状の重症度及び／若しくは頻度における低減若しくはその排除、又は損傷の改善若しくは治療であり得、それ以外の場合では疾患若しくは任意の他の望ましくない症状の進行を予防、妨害、遅延又は反転させ得るものである。有効量は対象の年齢、全身状態、処置されている病状の重症度、投与される特定の薬剤、処置期間、任意の併用処置の性質、使用される薬学的に許容される担体、並びに当業者の知識及び専門知識の範囲内にある同様の因子によって変動する。必要に応じて、任意の個々の場合における有効量又は治療有効量は、関連のテキスト及び文献を参照することにより、並びに／又はルーチンの実験を使用することにより、当業者により決定され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照されたい）。本明細書で使用される用語「生物学的に活性」は、天然起源分子の構造的、制御的、又は生化学的機能を有する酵素又はタンパク質を意味する。
【0041】
本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で特段指示しない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順番で実施され得る。本明細書で提供されるあらゆる例及び全ての例、又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく例示しようと意図するものであり、特段請求しない限り、本発明の範囲を限定するものではない。
【0042】
「アミノ酸配列」並びに「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」などの用語は本明細書で互換可能に使用され、アミノ酸配列を、列挙されたタンパク質分子に関連する完全な天然アミノ酸配列（すなわち、自然に生じたタンパク質中に見られる天然アミノ酸のみを含む配列）に限定することを意味するものではない。本明細書にて開示される主題のタンパク質及びタンパク質断片は、組換えアプローチにより産生され得る。又は天然起源の源から単離され得る。タンパク質断片は任意のサイズであり得る。また、例えば４つのアミノ酸残基から、１つのアミノ酸を減じた全体アミノ酸配列といったサイズの範囲であり得る。
【0043】
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｃ、Ｆｄ断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、並びに抗体の抗原結合部分及び非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含むがこれらに限定されない、任意のアイソタイプの抗体又は免疫グロブリン、抗原への特異的結合を保持する抗体の断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば放射性同位元素、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、例えばビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対の一員）といった特異的結合対の一員などといった他の部分に更にコンジュゲートすることができる。Ｆａｂ´、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ´）２及び抗原への特異的結合を保持する他の抗体断片（例えば、少なくとも１つのパラトープを含む任意の抗体断片）もまた、これらの用語に包含される。
【0044】
抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及び（Ｆａｂ´）２、並びに二官能性（すなわち、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８７を参照されたい）を含み、一本鎖中（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が本明細書に組み入れられる）の他の様々な形態で存在し得る。Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９８４及びＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ＆Ｈｏｏｄ，１９８６を一般に参照されたい。語句「検出分子」は、本明細書では最も広範な意味で使用され、特定のバイオマーカの検出を可能とするバイオマーカに対し、十分な特異性で結合可能な任意の分子を含む。検出を可能にするということは、特定のバイオマーカメンバーが存在するか、又はこれが存在していないかを決定することを意味し得る。またいくつかの実施形態では、特定のバイオマーカの量を決定することを意味する。検出分子は、抗体、抗体断片、及び核酸配列を含み得る。
【0045】
本明細書で使用される場合、用語「標的」は、例えば「マーカ」など、目的の内因性分子又は外因性分子を含む。標的は、１つ若しくは少数の組織の種類、１つ若しくは少数の細胞の種類、１つ若しくは少数の疾患、及び／又は１つ若しくは複数の発症段階に排他的又は主に関連するマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的はタンパク質（例えば、細胞表面受容体、膜貫通タンパク質、糖タンパク質など）、炭水化物（例えば、グリカン部分、グリコカリックスなど）、脂質（例えば、ステロイド、リン脂質など）及び／又は核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、標的はＮＫ細胞標的（例えば、「第１の標的」）であってもよい。いくつかの実施形態では、標的（すなわち、マーカ）は、例えば腫瘍抗原（例えば、「第２の標的」）などの悪性細胞において排他的な量で、又はより多量で存在する分子であってもよい。いくつかの実施形態では、標的は前立腺がんマーカであってもよい。ある特定の実施形態では、前立腺がんマーカは、前立腺特異的膜抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＰＳＭＡ）であり、ほとんどの前立腺組織で発現するが、正常組織よりも前立腺がん組織でより高度に発現する、１００ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は乳がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は大腸がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は直腸がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は肺がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は膵臓がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は卵巣がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は骨がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は腎がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は肝臓がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は神経がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は胃がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は精巣がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は頭頸部がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は食道がんマーカであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は子宮頸がんマーカであってもよい。
【0046】
本明細書で使用される場合、用語「ナノ粒子」及び／又は「ナノスフェア」は、ナノメートルサイズの範囲のポリマー粒子又は球体を記載する。本明細書で使用される用語「マイクロ粒子」又は「マイクロスフェア」は、マイクロメートルサイズの範囲の粒子又は球体を記載する。粒子又は球体のどちらの種類も、薬物、造影剤、及び／若しくは抗原が、固溶体若しくは固体分散体の形態で中に組み込まれ得る薬物担体、又はこれらの物質がその上に吸収され、封入され、及び／若しくは化学結合され得る薬物担体として使用され得る。
【0047】
本明細書で使用される用語「標的化剤」は、特異マーカ（すなわち、標的）に結合する薬剤を含む。本発明の標的化剤（例えば、標的部分）は、核酸（例えば、アプタマー）、ポリペプチド（例えば、抗体）、糖タンパク質、小分子、炭水化物、脂質などであってもよい。例えば標的化剤は一般に、例えばポリペプチドなどの特定の標的に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらのアナログ、又はそれらの誘導体）である、アプタマーであり得る。いくつかの実施形態では、標的化剤はペプチド、又はポリペプチド（例えば、腫瘍マーカ（例えば、がん細胞表面上の標的）を特異的に認識する抗体又は抗体の一部分）であってもよい。いくつかの実施形態では、標的化剤は抗体又はその断片であってもよい。いくつかの実施形態では、標的化剤は抗体のＦｃ断片であってもよい。
【0048】
（粒子及び組成物）
本開示は、単一粒子中にＮＫ細胞結合標的及びがん細胞結合標的を含むナノ粒子の利用を記載し、ＮＫ細胞免疫応答活性化及びがん細胞の直接処置と、任意選択的には治療薬とを組み合わせたアプローチに関する。
本開示は、単一粒子中にＮＫ細胞結合標的及びがん細胞結合標的を含むナノ粒子の利用を記載し、ＮＫ細胞免疫応答活性化及びがん細胞の直接処置と、任意選択的には治療薬とを組み合わせたアプローチに関する。
【0049】
したがって、一実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞表面上の第１の標的に結合する少なくとも１種類の第１の標的化剤（例えば、第１の標的化剤はそのそれぞれの第１の標的に結合する）、及びがん細胞表面上の第２の標的に結合する少なくとも１種類の第２の標的化剤（例えば、第２の標的化剤はそのそれぞれの第２の標的に結合する）を含む粒子（例えば、ナノ粒子）を提供し、この場合第２の標的化剤は、第１の標的化剤と異なる（例えば、それぞれの第１の標的及びそれぞれの第２の標的は異なる標的である）。いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、例えば少なくとも２種類の第１の標的化剤（２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類などを含む）の、２つ以上の第１の標的化剤を含み得る。この場合、少なくとも２種類の第１の標的化剤は、ＮＫ細胞表面上の異なる第１の標的に結合する。例えば、少なくとも２種類の第１の標的化剤は、２種類の異なる第１の標的化剤である。いくつかの実施形態では、第１の標的化剤は、例えば、約５個、約１０個、約５０個、約１００個、約５００個、約１０００個、約２０００個、約５０００個、約１０，０００個以上の同じ第１の結合剤、又はその中の任意の数値、若しくはその範囲といった多数の同じ第１の結合剤を含んでもよい。
【0050】
本発明の粒子の種類としては、ＰＬＧＡベース、ＰＬＡベース、多糖ベース（デキストラン、シクロデキストリン、キトサン、ヘパリン）、デンドリマー、ヒドロゲルなどのポリマーナノ粒子；脂質ナノ粒子、脂質ハイブリッドナノ粒子、リポソーム、ミセルなどの脂質ベースのナノ粒子；超常磁性酸化鉄ナノ粒子、金属ナノ粒子、プラチンナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、量子ドットなどの無機物ベースのナノ粒子；フラーレン、炭素ナノチューブなどの炭素ベースのナノ粒子；及びナノスケールのタンパク質ベースの複合体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマイクロ粒子の種類としては、当該技術分野で公知である、マイクロメートルスケールでのサイズを有し、ＰＬＧＡベース、ＰＬＡベース、多糖ベース（デキストラン、シクロデキストリン、キトサン、ヘパリン）、デンドリマー、ヒドロゲルなどを含むがこれらに限定されないポリマーマイクロ粒子；脂質マイクロ粒子、ミセルなどの脂質ベースのマイクロ粒子；超常磁性酸化鉄マイクロ粒子、プラチンマイクロ粒子などの無機物ベースのマイクロ粒子である粒子が挙げられるが、これらに限定されない。これらの粒子は、Ａｕ ｅｔ ａｌ．２０１９ ＡＣＳ Ｃｅｎｔ．Ｓｃｉ．５（１）：１２２－１４４及びＡｕ ｅｔ ａｌ．２０１８ ＡＣＳ Ｎａｎｏ １２（２）：１５４４－１５６３に記載され、それらの開示は、それらの全体が参照として本明細書に組み入れられるもののように、当該技術分野で公知の機構により生成されてもよく、及び／又はこれは吸収され、封入され、若しくは化学結合される物質を有してもよい。
【0051】
本発明の粒子は、ＮＫ細胞表面上の第１の標的に結合する少なくとも１種類の第１の標的化剤、及びがん細胞表面上の第２の標的に結合する少なくとも１種類の第２の標的化剤を含み、例えばマイクロ粒子、ナノ粒子といった任意のサイズの粒子であってもよい。いくつかの実施形態では、粒子はナノ粒子であり得る。例えばこの場合、粒子（例えば、ナノ粒子）の直径は１μｍ以下であり、例えばナノ粒子の直径は、１ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１２５ｎｍ、１５０ｎｍ、１７５ｎｍ、２００ｎｍ、２２５ｎｍ、２５０ｎｍ、２７５ｎｍ、３００ｎｍ、３２５ｎｍ、３５０ｎｍ、３７５ｎｍ、４００ｎｍ、４２５ｎｍ、４５０ｎｍ、４７５ｎｍ、５００ｎｍ、５２５ｎｍ、５５０ｎｍ、５７５ｎｍ、６００ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６７５ｎｍ、７００ｎｍ、７２５ｎｍ、７２５ｎｍ、７５０ｎｍ、７７５ｎｍ、８００ｎｍ、８２５ｎｍ、８５０ｎｍ、８７５ｎｍ、９００ｎｍ、９２５ｎｍ、９５０ｎｍ、９６０ｎｍ、９７０ｎｍ、９８０ｎｍ、９９０ｎｍ、９９５ｎｍ、９９６ｎｍ、９９７ｎｍ、９９８ｎｍ、又は９９９ｎｍ、又は任意の数値、又はその範囲である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の直径は、約５ｎｍ～約７５０ｎｍ、約１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５ｎｍ～約９９９ｎｍ、又は約５０ｎｍ～約９００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、粒子の直径は粒子の集団の平均直径であり得る。例えばこの場合、ナノ粒子の平均直径は、例えば約５ｎｍ～約７５０ｎｍ、約１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５ｎｍ～約９９９ｎｍ、又は約５０ｎｍ～約９００ｎｍ、又は任意の数値、又はその範囲であり得る。本発明のナノ粒子又はナノスフェアは、１００ｎｍ以下（例えば、約１ｎｍ～約１００ｎｍの範囲）の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、１００ｎｍを超える直径を有する粒子は、依然としてナノ粒子と呼ばれ得る。したがって、ナノ粒子の上限は約１μｍであり得、いくつかの実施形態では、これは５００ｎｍであり得る。本発明のマイクロ粒子又はマイクロスフェアは、約０．５マイクロメートル～約１００マイクロメートルの直径を有し得る。
【0052】
本発明の第１の標的化剤は、ＮＫ細胞表面上の標的に結合する任意の標的化剤であり得る。ＮＫ細胞表面上の標的は、本明細書において「第１の標的」と呼ばれてもよい。各第１の標的化剤は、それぞれの第１の標的（例えば、第１の標的化剤の結合パートナー）に結合する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞表面上の第１の標的は、ＣＤ１６、４－１ＢＢ、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＫＩＲｓ、ＮＫＧ２ａ、ｄｎａｍ－１、２ｂ４、ＮＫｐ３０ａ、ＮＫｐ３０ｂ、ＮＫｐ３０ｃ、抗体Ｆｃ成分、又はこれらのいずれかの組合せ、並びに現在知られており、又は後に同定されるＮＫ細胞表面上の他のマーカであり得る。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞表面上の標的はＣＤ１６及び／又は４－１ＢＢであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の粒子はＣＤ１６に結合する第１の標的化剤（例えば、第１の標的化剤のそれぞれの第１の標的）を含んでよく、４－１ＢＢに結合する別の異なる第１の標的化剤（例えば、異なる第１の標的化剤のそれぞれの第１の標的）を更に含む。したがって、本発明の実施形態では、本発明のナノ粒子は互いに異なる複数の第１の標的化剤（例えば、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類など）を含み得る。
【0053】
本明細書で使用される場合、「それぞれの第１の標的」は、特定の第１の標的化剤により認識されるであろう特異的な第１の標的である。例えば、第１の標的Ｘに対する特異性を有する第１の標的化剤は、第１の標的Ｘを認識してこれに結合する。したがって第１の標的Ｘは、第１の標的化剤のそれぞれの第１の標的である。
【0054】
本発明の第２の標的化剤は、がん細胞表面上の標的に結合する任意の標的化剤であり得る。がん細胞表面上の標的は、本明細書において「第２の標的」と呼ばれてもよい。各第２の標的化剤は、それぞれの第２の標的（例えば、第２の標的化剤の結合パートナー）に結合する。非限定的で例示的ながん及び腫瘍細胞の抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１（１９９１））に記載される。他の実例となるがん及び腫瘍抗原としては、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、Ｃａｓｐａｓｅ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ、（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号明細書）、ＣＡ １２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ，（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）；ムチン抗原（国際特許出願公開番号第９０／０５１４２号）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；及び／又は以下のがん：腺がん、胸腺腫、肉腫、脳がん（例えば、神経膠芽腫）、頭頸部がん、食道がん、胃がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、膀胱がん、腎がん（例えば、腎細胞がん）、肝臓がん（例えば、肝細胞がん）、膵臓がん、子宮がん、卵巣がん、子宮頸がん、肛門がん、メラノーマ、前立腺がん、乳がん、血液細胞がん（例えば、白血病、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫）、大腸がん、及び現在知られている、若しくは後に同定される他のがん若しくは悪性の病状（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１－９１を参照されたい）を含むがこれらに限定されないがんに関連すると現在知られており、又はそれであると後に判明する抗原を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、がん細胞表面上の標的は、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ムチン、ＨＥＲ－２、ＣＤ３０、ＣＤ２２、又はこれらのいずれかの組合せであり得るがこれらに限定されない。したがって、本発明の実施形態では、本発明のナノ粒子は互いに異なる複数の第２の標的化剤（例えば、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類など）を含み得る。
【0055】
本明細書で使用される場合、「それぞれの第２の標的」は、特定の第２の標的化剤により認識されるであろう特異的な第２の標的である。例えば、第２の標的Ｘに対する特異性を有する第２の標的化剤は、第２の標的Ｘを認識してこれに結合する。したがって第２の標的Ｘは、第２の標的化剤のそれぞれの第２の標的である。
【0056】
本発明のがん細胞は、任意のがん由来の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、がん細胞は、腺がん、胸腺腫、肉腫、脳がん（例えば、神経膠芽腫）、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、扁平上皮がん、皮膚がん、唾液腺がん、食道がん、胃がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、膀胱がん、腎がん（例えば、腎細胞がん）、肝臓がん（例えば、肝細胞がん）、膵臓がん、子宮がん、卵巣がん、子宮頸がん、肛門がん、メラノーマ、前立腺がん、精巣がん、乳がん、血液細胞がん（例えば、白血病、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫）、大腸がん、及び現在知られている、若しくは後に同定される他のがん若しくは悪性の病状に由来する細胞であり得る。
【0057】
いくつかの実施形態では、本発明の粒子は、例えば第３の標的化剤、第４の標的化剤、第５の標的化剤など、ＮＫ細胞表面及び／又はがん細胞表面上にて発現していない追加の標的（例えば、それぞれの第３の標的、それぞれの第４の標的、それぞれの第５の標的など）に結合する更なる標的化剤を含んでもよい。
【0058】
本発明のいくつかの実施形態では、標的化剤は抗体又はその活性断片であってもよい。いくつかの実施形態では、第１の標的化剤及び／又は第２の標的化剤は、抗体又はその活性断片であってもよい。いくつかの実施形態では、標的化剤のそれぞれは抗体又はその活性断片である。いくつかの実施形態では、抗体又はその活性断片は、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´－ＳＨ断片、ＦＶ断片、ｓｃＦｖ断片、（Ｆａｂ´）２断片、Ｆｃ－融合タンパク質、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。
【0059】
いくつかの実施形態では、本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）は、ＣＤ１６に特異的に結合する抗体若しくはその活性断片、４－１ＢＢに特異的に結合する抗体若しくはその活性断片、及び／又はＥＧＦＲに特異的に結合する抗体若しくはその活性断片を含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）は、治療薬を更に含んでもよい。非限定的で例示的な治療薬としては、小分子（例えば、細胞傷害性薬物）、核酸（例えば、ＲＮＡｉ薬剤）、タンパク質（例えば、抗体）、ペプチド、脂質、炭水化物、ホルモン、金属、放射活性要素及び化合物、薬物、ワクチン、免疫学的薬剤など、並びに／又はこれらの組合せが挙げられる。
【0061】
いくつかの実施形態では、治療薬は例えば化学療法薬といった、がんの処置に有用な薬剤であってもよい。化学療法薬の非限定的な例としては、ダウモマイシン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ベラパミル、シトシンアラビノシド、アミノプテリン、デメコルシン、タモキシフェン、アクチノマイシンＤ、アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア及びトリアゼンを含むがこれらに限定されない）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標））、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレン－メラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、及びテモゾロミド；代謝拮抗薬（葉酸拮抗薬、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、及びアデノシンデアミナーゼ阻害薬）：メトトレキサート、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、フルダラビンリン酸エステル、ペントスタチン（Ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎｅ）、及びゲムシタビン、天然産物及びそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、酵素、リンホカイン及びエピポドフィロトキシン）：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、Ａｒａ－Ｃ、パクリタキセル（パクリタキセルはタキソール（登録商標）として市販されている）、ドセタキセル、ミスラマイシン、デオキシコ－ホルマイシン、マイトマイシン－Ｃ、Ｌ－アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ－ａ）、エトポシド、及びテニポシドが挙げられるがこれらに限定されず、他の抗増殖性細胞傷害性薬剤は、ナベルベン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ－１１、アナストロゾール、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イホスアミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、及びドロロキサフィンである。追加の抗増殖性細胞傷害性薬剤としては、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、イダトレキサート（ｉｄａｔｒｅｘａｔｅ）、トリメトレキサート、ダカルバジン、Ｌ－アスパラギナーゼ、カンプトテシン、トポテカン、ビカルタミド、フルタミド、リュープロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン、インターロイキン、構造色性細胞傷害性薬剤（ＥＧＦＲ阻害薬、Ｈｅｒ－２阻害薬、ＣＤＫ阻害薬、及びトラスツズマブを含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、治療薬は、エピルビシン（ＥＰＩ）、ドキソルビシン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、タキソール、ドセタキセル、ゲムシタビン、５－フルオロウラシル、マイトマイシン、シタラビン、シトキサン、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される化学療法薬である。
【0062】
いくつかの実施形態では、本発明は本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、生物学的に望ましくないわけではない、又はそれ以外の理由で望ましくないわけではない物質を意味する。すなわち、この物質は、実質的に有害な生物学的効果を引き起こすことなく、かつ中に含まれる組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、本発明の組成物と共に対象に投与され得る。物質は、当業者に周知であるように、活性成分の何らかの分解を最小限にし、かつ対象における何らかの有害な副作用を最小限にするように自然に選択されることになる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ；最新版を参照されたい）。本発明の組成物にとって例示的な薬学的に許容される担体としては、当該技術分野で周知されているように、無菌パイロジェンフリー水及び無菌パイロジェンフリー生理食塩水、並びに特にヒト対象といった本発明の対象に注入及び／又は送達するのに好適な他の担体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0063】
本発明はまた、本発明の粒子（例えばナノ粒子）を、治療目的で又は研究目的のためにインビトロ、エクスビボ、及び／又はインビボで細胞又は対象に送達するための方法を提供する。
【0064】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞を活性化させる方法であって、第１の標的化剤がＮＫ細胞表面上の第１の標的（例えば、第１の標的化剤のそれぞれの標的）に結合するような条件下で、ＮＫ細胞と本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）又は組成物とを接触させることを含む方法を提供する。
【0065】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞免疫応答を誘発させる方法であって、第１の標的化剤がＮＫ細胞表面上の第１の標的（例えば、第１の標的化剤のそれぞれの標的）に結合するような条件下で、ＮＫ細胞と本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）又は組成物とを接触させることを含む方法を提供する。
【0066】
いくつかの実施形態では、本発明は、がん細胞において細胞傷害性を誘発させる方法であって、第２の標的化剤ががん細胞表面上の第２の標的（例えば、第２の標的化剤のそれぞれの標的）に結合するような条件下で、がん細胞と本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）又は組成物とを接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子又は組成物は治療薬を更に含んでもよく、がん細胞と粒子及び／又は組成物を接触させ、それにより治療薬をがん細胞に送達する。
【0067】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療薬をがん細胞に送達する方法であって、第２の標的化剤ががん細胞表面上の第２の標的（例えば、第２の標的化剤のそれぞれの標的）に結合し、それにより治療薬をがん細胞に送達するような条件下で、がん細胞と、治療薬を含む本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）又は組成物とを接触させることを含む方法を提供する。
【0068】
いくつかの実施形態では、本発明は、その必要がある対象においてＮＫ細胞免疫応答を誘発させる方法であって、第１の標的化剤がＮＫ細胞表面上の第１の標的（例えば、第１の標的化剤のそれぞれの標的）に結合するような条件下で、有効量の本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）又は組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、粒子及び／又は組成物は少なくとも２種類の第１の標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２種類の第１の標的化剤が結合するＮＫ細胞は同じＮＫ細胞である。
【0069】
いくつかの実施形態では、本発明は、その必要がある対象においてＮＫ細胞を活性化させる方法であって、第１の標的化剤がＮＫ細胞表面上の第１の標的（例えば、第１の標的化剤のそれぞれの標的）に結合するような条件下で、有効量の本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）又は組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、粒子及び／又は組成物は少なくとも２種類の第１の標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２種類の第１の標的化剤が結合するＮＫ細胞は同じＮＫ細胞である。
【0070】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法のうち、いずれかの方法の対象は、がんであると診断されている。いくつかの実施形態では、がんは、腺がん、胸腺腫、肉腫、脳がん（例えば、神経膠芽腫）、頭頸部がん、食道がん、胃がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、膀胱がん、腎がん（例えば、腎細胞がん）、肝臓がん（例えば、肝細胞がん）、膵臓がん、子宮がん、卵巣がん、子宮頸がん、肛門がん、メラノーマ、前立腺がん、乳がん、血液細胞がん（例えば、白血病、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫）、大腸がん、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。
【0071】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象（例えば、その必要がある対象）においてがん細胞を処置する方法であって、第２の標的化剤ががん細胞表面上の第２の標的（例えば、第２の標的化剤のそれぞれの標的）に結合するような条件下で、有効量の本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）又は組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0072】
いくつかの実施形態では、本発明は、その必要がある対象においてがんを処置する方法であって、第１の標的化剤がＮＫ細胞表面上の第１の標的（例えば、第１の標的化剤のそれぞれの標的）に結合し、それにより第２の標的化剤ががん細胞表面上の第２の標的（例えば、第２の標的化剤のそれぞれの標的）に結合するような条件下で、有効量の本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）又は組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0073】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療薬をその必要がある対象におけるがんのがん細胞に送達する方法であって、第２の標的化剤ががん細胞表面上の第２の標的（例えば、第２の標的化剤のそれぞれの標的）に結合し、それにより治療薬を対象のがん細胞に送達するような条件下で、治療薬を含む本発明の有効量の粒子（例えば、ナノ粒子）又は組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0074】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）又は組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、眼内、硝子体内、眼窩内、鼻腔内、埋め込み、吸入、腫瘍組織内、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される経路を介して投与されてもよい。
【0075】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、有効量の治療薬（例えば、化学療法薬）を対象に投与する工程及び／又は放射線療法の工程を更に含んでもよい。本発明の粒子及び／又は組成物の投与と併用されて投与されてもよい非限定的で例示的な治療薬としては、小分子（例えば、細胞傷害性薬物）、核酸（例えば、ＲＮＡｉ薬剤）、タンパク質／ペプチド（例えば、抗体）、脂質、炭水化物、ホルモン、金属、放射活性要素及び化合物、薬物、ワクチン、免疫学的薬剤など、並びに／又はこれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、治療薬は例えば化学療法薬といった、がんの処置に有用な薬剤であり得る。化学療法薬の非限定的な例としては、ダウモマイシン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ベラパミル、シトシンアラビノシド、アミノプテリン、デメコルシン、タモキシフェン、アクチノマイシンＤ、アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア及びトリアゼンを含むがこれらに限定されない）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標））、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレン－メラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、及びテモゾロミド；代謝拮抗薬（葉酸拮抗薬、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、及びアデノシンデアミナーゼ阻害薬）：メトトレキサート、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、フルダラビンリン酸エステル、ペントスタチン（Ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎｅ）、及びゲムシタビン、天然産物及びそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、酵素、リンホカイン及びエピポドフィロトキシン）：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、Ａｒａ－Ｃ、パクリタキセル（パクリタキセルはタキソール（登録商標）として市販されている）、ドセタキセル、ミスラマイシン、デオキシコ－ホルマイシン、マイトマイシン－Ｃ、Ｌ－アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ－ａ）、エトポシド、及びテニポシドが挙げられるがこれらに限定されず、他の抗増殖性細胞傷害性薬剤は、ナベルベン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ－１１、アナストロゾール、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イホスアミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、及びドロロキサフィンである。追加の抗増殖性細胞傷害性薬剤としては、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、イダトレキサート（ｉｄａｔｒｅｘａｔｅ）、トリメトレキサート、ダカルバジン、Ｌ－アスパラギナーゼ、カンプトテシン、トポテカン、ビカルタミド、フルタミド、リュープロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン、インターロイキン、構造色性細胞傷害性薬剤（ＥＧＦＲ阻害薬、Ｈｅｒ－２阻害薬、ＣＤＫ阻害薬、及びトラスツズマブを含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の粒子及び／又は組成物の投与と併用して投与されてもよい治療薬は、エピルビシン（ＥＰＩ）、ドキソルビシン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、タキソール、ドセタキセル、ゲムシタビン、５－フルオロウラシル、マイトマイシン、シタラビン、シトキサン、及びこれらのいずれかの組合せからなる群から選択される化学療法薬である。
【0076】
本発明の追加の態様は、ＮＫ細胞を活性化させ、がん細胞に細胞傷害性を誘発させ、治療薬をがん細胞に送達し、及び／又はがんを処置する際の、本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）及び／又は組成物の使用を含む。本明細書では、本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）及び／又は組成物を含む、使用のための薬物の調製を更に提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書では、本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）及び／又は組成物、並びに取扱説明書を含むキットを更に提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書では、本発明の粒子（例えば、ナノ粒子）及び／又は組成物、並びに取扱説明書を含むキットを更に提供する。
【0077】
（使用のための医薬組成物及び方法）
いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、及び／又はアジュバントのうち１つ以上と共に、本発明の粒子を含む組成物もまた提供する。こうした組成物は、有効量の粒子を含有し得る。したがって、医薬組成物又は薬物の調製においては、本明細書にて提供されるような粒子の使用もまた含まれる。こうした組成物は、本明細書に記載される様々な疾患及び障害の処置で使用され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、及び／又はアジュバントのうち１つ以上と共に、本発明の粒子を含む組成物もまた提供する。こうした組成物は、有効量の粒子を含有し得る。したがって、医薬組成物又は薬物の調製においては、本明細書にて提供されるような粒子の使用もまた含まれる。こうした組成物は、本明細書に記載される様々な疾患及び障害の処置で使用され得る。
【0078】
医薬製剤にとって許容される製剤成分は、使用される投与量及び濃度では移植患者にとって非毒性である。本明細書で提供される粒子に加えて、本明細書による組成物は、例えばｐＨ、容積オスモル濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度又は放出速度、組成物の吸着又は浸透を修飾し、維持し、又はこれらを保存するための成分を含有し得る。医薬組成物を処方するための好適な物質としては、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジン）；抗菌剤；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、酢酸塩、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸塩、又は他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトール又はグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン）；フィラー；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；着色料、香料及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトール又はソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤又は湿潤剤（例えば、プルロニック（登録商標）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；安定性増強剤（例えば、スクロース又はソルビトール）；浸透圧増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達担体；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0079】
医薬組成物中の主要な溶媒又は担体は、実際には水性又は非水性のいずれかであってもよい。こうした組成物にとって好適な溶媒又は担体としては、非経口投与のための組成物において一般的な他の物質と共に補充され得る、注射用水（例えば、滅菌水）、生理食塩水、又は人工脳脊髄液が挙げられる。中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンと混合される生理食塩水は、更に例示的な溶媒である。
【0080】
本発明の粒子を含む組成物は、所望の純度を有する選択された組成物と、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態である最適な製剤とを混合することにより、貯蔵のために調製され得る。更には、粒子はスクロースなどの適切な賦形剤を使用し、凍結乾燥物として処方されてもよい。
【0081】
製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。緩衝剤は有利には、生理学的ｐＨ又はわずかにそれよりも低く、通常約４．０～約８．５、又は代替的には約５．０～約８．０のｐＨ範囲内であるｐＨに組成物を維持するために使用される。医薬組成物は、ｐＨが約６．５～８．５のトリス緩衝剤、又はｐＨが約４．０～５．５の酢酸塩緩衝剤を含むことができるが、これはソルビトール又はその好適な代替物を更に含んでもよい。
【0082】
医薬組成物は、錠剤の製造に好適である非毒性賦形剤との混合物中に、有効量の本発明の粒子を含んでもよい。滅菌水又は別の適切な溶媒に錠剤を溶解させることによって、溶液は単位用量形態に調製され得る。好適な賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウムといった不活性物質；又はデンプン、ゼラチン、若しくはアカシアといった結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルクなどの潤滑剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【0083】
追加の医薬組成物は、持続送達製剤又は制御送達製剤の形態である。例えばリポソーム担体、生体分解性マイクロ粒子又は多孔質ビーズ、及びデポ注射などの様々な他の持続送達手段又は制御送達手段を処方するための手段が可能である。徐放性製剤としては、例えばフィルム、又はマイクロカプセル、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸、Ｌ－グルタミン酸のコポリマー及びγエチル－Ｌ－グルタマート、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリラート）、エチレン酢酸ビニル、又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸といった成形物品の形態である半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。徐放性組成物はまたリポソームを含み得るが、これは当該技術分野で公知であるいくつかの方法のうちいずれかにより調製され得る。
【0084】
インビボ投与のために使用される医薬組成物は、通常は無菌状態である。滅菌は、無菌ろ過膜を通したろ過により達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、滅菌は凍結乾燥及び再構成の前、又は凍結乾燥及び再構成後のいずれかで行われ得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態又は溶液で保存され得る。ある特定の実施形態では、非経口組成物は、例えば静注液バッグ、若しくは皮下注射針で突き刺し可能であるストッパーを有するバイアルといった滅菌アクセスポートを有する容器、又は注射にすぐに使用できる滅菌プレフィルドシリンジの中に入れられる。
【0085】
組成物は、公知技術に従い、任意選択的にはマイクロ針、マイクロプロジェクタイル法、パッチ、電極、接着剤、バッキング、及び／又はパッケージングを含むものによる経皮送達用に処方され得る、又はジェット送達用の製剤であり得る。例えば、米国特許第８，０４３，２５０号、同８，０４１，４２１号、同８，０３６，７３８号、同８，０２５，８９８号、同８，０１７，１４６号を参照されたい。
【0086】
いったん本発明の医薬組成物を処方すると、これは溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、又は脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存され得る。こうした製剤は、すぐに使用できる形態、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存され得る。
【0087】
医薬組成物を処方するために使用される成分は、好ましくは高純度であり、かつ有害である可能性が高い汚染物質を実質的に含まないもの（例えば、少なくとも米国食品（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｏｄ、ＮＦ）グレード、少なくとも、一般的な分析グレード、及び少なくとも、より典型的な医薬品グレード）である。更には、インビボ使用を意図した組成物は、通常無菌である。所与の化合物を使用前に合成しなくてはならないという点から、得られる生成物は、合成プロセス又は精製プロセス中に存在し得る、任意の有害である可能性が高い毒性薬剤（特にいずれかのエンドトキシン）を典型的には実質的に含まない。非経口投与（ｐａｒｅｎｔａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）用組成物はまた、無菌であり、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で作製される。
【0088】
本発明は、マルチドーズ投与単位又はシングルドーズ投与単位を製造するためのキットを提供する。例えば、本発明によるキットはそれぞれ、乾燥させた組成物を有する第１の容器と、水性希釈剤を有する第２の容器との両方を含有してもよい。例えばこれらの容器は、シングルチャンバプレフィルドシリンジ及びマルチチャンバプレフィルドシリンジを含む（例えば、液体シリンジ、溶解シリンジ、又は針なしシリンジ）。
【0089】
本発明の医薬組成物は非経口で送達され得る。これは典型的には、注射によって送達され得る。注射は、眼内注射、腹腔内注射、門脈内注射、筋肉内注射、静脈内注射、くも膜下腔内注射、脳内（実質内）注射、脳室内注射、硝子体内注射、動脈内注射、病巣内注射、病変周囲注射又は皮下注射であり得る。点眼薬は、眼内投与に使用され得る。いくつかの例では、注射は、処置が標的にする特定の１本以上の骨の近傍に局在し得る。非経口投与のため、キメラタンパク質は、薬学的に許容される溶媒中にキメラタンパク質を含む、非経口的に許容されるパイロジェンフリー水溶液で投与され得る。非経口注射に特に好適な溶媒は、適切に保存され、無菌の等張溶液として中にキメラタンパク質を処方した滅菌蒸留水である。
【0090】
本発明の粒子を含む医薬組成物は、ボーラス注射によって、及び／又は点滴により連続的に、埋め込み型デバイス、徐放システム若しくは持続放出を達成するための他の手段によって投与され得る。医薬組成物はまた、膜、スポンジ、又は所望の分子をその上に吸収又は封入した別の適切な物質を埋め込むことによって、局所的に投与され得る。埋め込み型デバイスを使用する場合、該デバイスは任意の好適な組織又は器官へと埋め込まれてもよく、所望の分子は、拡散、時間設定型放出ボーラス（ｔｉｍｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅ ｂｏｌｕｓ）、又は連続放出を介して送達されてもよい。合剤は、例えば注射可能なマイクロスフェア、生体分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸；ポリグリコール酸；又は共重合（乳酸／グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ビーズ又はリポソームであり、デポ注射を介して送達され得、生成物の制御放出又は徐放を提供することができる）といった薬剤と共に処方されてもよい。ヒアルロン酸を含む製剤は、循環における持続時間を促進させる効果を有する。
【0091】
本発明の粒子を含む主題の組成物は、吸入のために処方されてもよい。これらの実施形態では、粒子は吸入用の乾燥粉末として処方され得る。又は粒子吸入溶液はまた、吸入投与などのエアロゾル送達用の噴霧剤と共に処方され得る。
【0092】
本発明のある特定の医薬組成物は、消化管を通し、経口などで送達され得る。この様式で投与される本発明の粒子は、錠剤及びカプセルなどの固形剤形の配合に習慣的に使用されるこれらの担体を用いて、又はこれらの担体を用いないで処方されてもよい。カプセルは、バイオアベイラビリティが最大化され、事前の全身分解（ｐｒｅ－ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化される、消化管に存在する時点で製剤の活性部分を放出するように設計され得る。追加の薬物は、粒子の吸収を促進させるために含まれ得る。経口投与のため、消化酵素に耐性を与えるために修飾アミノ酸が使用されてもよい。希釈剤、香料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤もまた使用されてもよい。
【0093】
粒子を含む主題の組成物はまた、エクスビボで使用されてもよい。こうした例では、対象から取り除かれた細胞、組織又は器官は、粒子と共に曝露又は培養される。次いで、培養された細胞は対象若しくは異なる対象へと戻して埋め込まれてもよい、又は他の目的に使用されてもよい。
【0094】
いくつかの実施形態では、免疫応答の確率を下げるため、本発明の粒子は封入され、周囲組織による浸潤を避けてもよい。封入物質は典型的には、粒子の放出が可能であるが、患者の免疫系による、又は周囲組織由来の他の有害因子による細胞破壊を防止する、生体適合性の半透過性ポリマー封入物又は膜である。
【0095】
提供される医薬組成物は、予防処置及び／又は治療処置のために投与され得る。一般には、本発明の粒子の毒性及び治療有効性は、細胞培養液及び／又は実験動物における標準的な薬学的手順に従って決定され得る。これには例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）を決定することが挙げられる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。高い治療指数を呈示する組成物が好ましい。
【0096】
細胞培養液及び／又は動物研究から得られたデータは、処置のため、対象への投与量の範囲を明確に表す際に使用され得る。活性成分の投与量は典型的には、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあり、これはほぼ又は全く毒性がない。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じ、上記範囲内で変動し得る。
【0097】
本発明の粒子を含む、治療的に又は予防的に使用される医薬組成物の有効量は、例えば治療状況及び治療目的に応じて変動する。当業者は、ある一定の実施形態による、処置のための適切な投与量レベルはしたがって、送達されている組成物、粒子が使用される対象の適応症、投与経路、及びサイズ（体重、体表面及び器官のサイズ）並びに／又は対象の条件（年齢及び健康状態）に一部応じて変化することを理解するであろう。臨床医は、最適な治療効果を得るため、力価により投与量を測定し、かつ投与経路を変更してもよい。本発明の粒子を投与するための通常の投与量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～２，０００ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、いくつかの実施形態では、粒子は１～３週間ごとに静脈内へと投与され得る。
【0098】
投与頻度は、製剤中の粒子の薬物動態パラメータに応じて変動する。例えば、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで組成物を投与する。したがって組成物は、単回用量として若しくは（同様の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）２回以上の経時的な用量として、又は埋め込み型デバイス若しくはカテーテルを介した連続点滴として、投与されてもよい。処置は経時的に連続していてもよく、断続的であってもよい。適切な投与量の更なる改良は、当業者によって日常的に行われており、これは彼らにより日常的に実施されている作業の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量反応データの使用により確認されてもよい。
【0099】
いくつかの実施形態では、粒子は１種以上の他の治療薬及び／又は異なる治療と組み合わせて投与され得る。治療薬の例としては、抗感染症薬（例えば、防腐剤、抗生物質、及び／若しくは抗真菌薬）、抗炎症薬、並びに／又は免疫調節薬が挙げられるがこれらに限定されない。治療薬は粒子と同時に投与され得る、かつ／又は異なる時点で投与され得る。治療薬の投与経路は、粒子の投与経路と同じであり得、又は異なり得る。
【0100】
本発明の障害を処置するため、本発明の粒子を含む組成物は、障害の重症度を反映させた少なくとも１つの指標において、持続して改善をもたらすのに十分な量で及び時間にわたり、その必要がある対象に投与され得る。例えば、粒子は約１日ごと、約２日ごと、約３日ごと、約４日ごと、約５日ごと、約６日ごと、約７日ごと、約８日ごと、約９日ごと、若しくは約１０日以上ごと、及び／又は約１週間ごと、約２週間ごと、約３週間ごと、約４週間ごと、約５週間ごと、約６週間ごと、約７週間ごと、約８週間ごと、約９週間ごと、若しくは約１０週間以上ごとに投与され得る。他の実施形態では、粒子は１週間及び／又は１ヶ月及び／又は１年につき約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、又は約１０回以上であり得る。いくつかの実施形態では、対少なくとも１～７日間、又はいくつかの例では１～６週間あけて少なくとも２回、対象に改善が見られた場合、改善は「持続している」と見なされる。適切な時間間隔は、どんな疾患病状が処置されているかに応じてある程度変動する。改善が持続しているかどうかを決定するための適切な時間間隔の決定は、当業者の範囲内である。
【0101】
本明細書に記載の本発明の粒子を含むキット及び／又は医薬組成物もまた、本明細書にて提供される。いくつかのキットは、容器（例えば、バイアル又はアンプル）内に粒子及び／又は組成物を含む。また、上で開示された様々な方法での粒子及び／又は組成物の取扱説明書を含んでもよい。粒子及び／又は組成物は、例えば溶液の一部として、又は固体（例えば、凍結乾燥粉末）としての形態を含む、様々な形態であり得る。説明書は、適切な液体中でいかに粒子を調製（例えば、溶解若しくは再懸濁）するか、並びに／又は本明細書に記載の疾患及び障害の処置のためにいかに粒子を投与するかの説明を含み得る。
【0102】
キットはまた、例えば緩衝剤、塩、金属錯イオン及び医薬組成物に関するセクションにおいて上に記載された他の薬剤といった様々な他の成分を含んでもよい。これらの成分は、キメラタンパク質と共に含まれてもよく、又は別個の容器に入っていてもよい。キットはまた、キメラタンパク質と共に投与するための他の治療薬を含んでもよい。こうした薬剤の例としては、上記障害又は病状を処置するための薬剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【0103】
以下の実施例は、本明細書で提供される粒子及び組成物のある特定の態様を単に説明するために提供される。したがってこれらは、特許請求される発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【0104】
以下の実施例は、実例となる実施形態を提供する。以下の実施例のある特定の態様は、実施形態の実践において良好に機能することを目的として、本発明の発明者らにより見出され、企図された技術及び手順といった点において開示される。本開示及び当業者の一般レベルの観点から、当業者は以下の実施例が例示のみを意図しており、多数の変更、修正及び変化は、特許請求される主題の範囲から逸脱しない限り使用され得ることを理解するであろう。
【0105】
実施例１：ＮＫ細胞介在免疫療法のためのトリ官能化ナノエンゲージャ
この研究は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現腫瘍を標的とすることができ、ＮＫ細胞介在免疫療法を可能とするナノエンゲージャを開発した。ナノエンゲージャは化学療法薬を腫瘍に送達可能であり、更には治療効果を増強可能である。ナノエンゲージャプラットフォームは、生体適合性ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）ＰＥＧ－ＰＬＧＡナノ粒子（ＮＰ）に基づく。セツキシマブ（抗ヒトＥＧＦＲ抗体、α－ＥＧＦＲ）、及び２種類のＮＫ活性化剤：抗ＣＤ１６（α－ＣＤ１６）及び抗４－１ＢＢ（α－４－１ＢＢ）抗体を用いてＮＰを官能化する。化学療法薬であるエピルビシン（ＥＰＩ）もまた、ＮＰ内部に封入され得る。これらの三価ナノエンゲージャを、ＥＧＦＲが過剰発現した腫瘍における制御放出ＥＰＩに適合させるために作製するだけではなく、全身投与後に循環ＮＫ細胞を動員し、これを活性化させるようにも設計した（図１Ａ）。
この研究は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）発現腫瘍を標的とすることができ、ＮＫ細胞介在免疫療法を可能とするナノエンゲージャを開発した。ナノエンゲージャは化学療法薬を腫瘍に送達可能であり、更には治療効果を増強可能である。ナノエンゲージャプラットフォームは、生体適合性ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）ＰＥＧ－ＰＬＧＡナノ粒子（ＮＰ）に基づく。セツキシマブ（抗ヒトＥＧＦＲ抗体、α－ＥＧＦＲ）、及び２種類のＮＫ活性化剤：抗ＣＤ１６（α－ＣＤ１６）及び抗４－１ＢＢ（α－４－１ＢＢ）抗体を用いてＮＰを官能化する。化学療法薬であるエピルビシン（ＥＰＩ）もまた、ＮＰ内部に封入され得る。これらの三価ナノエンゲージャを、ＥＧＦＲが過剰発現した腫瘍における制御放出ＥＰＩに適合させるために作製するだけではなく、全身投与後に循環ＮＫ細胞を動員し、これを活性化させるようにも設計した（図１Ａ）。
【0106】
多価非標的化及びＥＧＦＲ標的化α－ＣＤ１６及びα－４－１ＢＢ官能化された薬物非含有及びＥＰＩ封入ＰＥＧ－ＰＬＧＡ ＮＰ（ＥＰＩ ＮＰ）を、ＮＫ細胞介在化学免疫療法のための多価ＥＧＦＲ標的ナノエンゲージャの設計：２段階の製造方法（図１Ｂ、図１Ｃ、図２及び図３；表１）により操作した。コアをアジド官能化した薬物非含有ＮＰ及びコアをアジド官能化したＥＰＩ封入ＮＰを、ナノ沈殿法（Ａｕ ｅｔ ａｌ．２０１９ ＡＣＳ Ｃｅｎｔ．Ｓｃｉ．５（１）：１２２－１４４）により最初に調製した。次に、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）官能化したα－ＣＤ１６、α－４－１ＢＢ、及びα－ＥＧＦＲを、銅非含有アジド－シクロオクチン環化付加（Ａｕ ｅｔ ａｌ．２０１８ ＡＣＳ Ｎａｎｏ １２（２）：１５４４－１５６３）により、アジド官能化したＮＰに定量的にコンジュゲートさせた。二価ＮＰ及び三価ＮＰの製造のため、α－ＣＤ１６：α－４－１ＢＢのモル比１：１及びα－ＣＤ１６：α－４－１ＢＢ：α－ＥＧＦＲのモル比１：１：１を使用した。約２．７ｗｔ／ｗｔ％のＥＰＩで、ＥＰＩ ＮＰを封入した（図１Ｄ）。封入ＥＰＩは、生理学的条件でｐＨ依存性制御放出を起こし、最初の２４時間でそのおよそ半分を、弱酸性（ｐＨ６．０）の細胞外腫瘍微小環境及び初期エンドソーム条件で放出した（図１Ｄ及び図４Ａ～図４Ｂ）。蛍光活性化細胞セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）結合アッセイにより、α－ＣＤ１６及びα－４－１ＢＢ官能化ＮＰがＡ４８８標識マウスＣＤ１６及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ標識マウス４－１ＢＢにそれぞれ選択的に結合したことを確認した。更なるインビトロ結合アッセイ及び共焦点レーザ顕微鏡法（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＣＬＳＭ）研究により、４つの異なるＦＩＴＣ標識した多価α－ＣＤ１６ＮＰ及び／又はα－４－１ＢＢ ＮＰ全てがＮＫ細胞に選択的に結合したことを確認した（図５Ａ～図５Ｂ）。異なるα－ＥＧＦＲ官能化したＮＰの、ＥＧＦＲが過剰発現したＨＴ２９（大腸腺がん）細胞、ＭＢ４６８（トリプルネガティブ乳がん）細胞、及びＡ４３１（扁平上皮腫）細胞に対する結合親和性を、インビトロ結合アッセイ（図５Ｃ）及びＣＬＳＭにより検証した。コントロールＥＧＦＲ非発現Ｒａｊｉ細胞では、非特異的結合は観察されなかった（図５Ｄ）。インビトロＣＬＳＭ研究により、３つのＥＧＦＲが過剰発現したがん細胞全てが、ＥＧＦＲ標的化ＮＰと短時間インキュベーションした後に封入ＥＰＩを取り込んだことを確認した。標的化ＥＰＩ封入ＮＰは、ＨＴ２９細胞、ＭＢ４６８細胞、及びＡ４３１細胞に対して直接的な抗がん活性を示し、５０％阻害濃度（ｈａｌｆ－ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＩＣ５０）は４～６μＭであった（図５Ｅ）。一方同じ濃度の非標的化ＥＰＩ ＮＰ又はＮＰアンカー抗体はわずかに毒性を示した。γ－Ｈ２ＡＸアッセイ（図５Ｆ）により、細胞由来ＤＮＡへのＥＰＩのインターカレーションの結果としての、がん細胞におけるＤＮＡ二本鎖切断の形成を確認した。
【0107】
α－ＣＤ１６及びα－４－１ＢＢ官能化したナノ粒子は、インビトロでＮＫ細胞を効果的に活性化可能である：この研究の１つの目的は、α－ＣＤ１６及びα－４－１ＢＢのＮＰ製剤は、遊離α－ＣＤ１６及びα－４－１ＢＢ抗体よりもＮＫ活性化について効果的であることを示すことであった。ＮＫ細胞上のＣＤ１６及び４－１ＢＢ刺激分子の有効な空間時間的活性化は、ＮＫ細胞介在特異的溶解を増大させ得ることを実証するため、ルシフェラーゼ標識Ｂ１６Ｆ１０（Ｂ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ）標的細胞の存在下でＮＫ細胞細胞傷害性アッセイを実施した。ＮＫ細胞単独では、ＮＫ細胞ががん細胞を認識／がん細胞に結合せず、活性化しなかったため、１：１のエフェクター細胞／標的細胞（Ｅ／Ｔ）比率（図６Ａ～図６Ｂ）でＢ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ細胞に対する直接的細胞傷害性は限定されている（約１０％）ことを示した。がん細胞の認識又は結合を可能とするため、腫瘍細胞に所与の５Ｇｙの放射線照射（ＩＲ）を行い、Ｂ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ細胞の表面上にＮＫ細胞活性化リガンド（例えば、ＣＤ１１２、ＵＬＢＰ－１）を上方制御させた。こうした免疫刺激時には、ＮＫ細胞はＢ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ細胞に対して中程度の細胞傷害性を示した（図６Ａ）。遊離α－ＣＤ１６又はα－４－１ＢＢでＮＫ細胞を前処理することで、細胞傷害性はそれぞれ４４．４±２．６％及び３８．０±３．７％に有意に増加した（図６Ａ及び図６Ｃ）。α－ＣＤ１６ ＮＰ及びα－４－１－ＢＢ ＮＰで前処理したＮＫ細胞は、遊離抗体で前処理したＮＫ細胞よりも有意に高い毒性を示した（それぞれ、５２．７±１．９％及び５７．９±３．５％）。こうした細胞傷害性の増加は、ＮＰによるＣＤ１６及び４－１ＢＢの共刺激分子の協同的結合及びより効果的なライゲーション（「クラスター形成」）の増加により説明され得る。最も重要なのは、両方のＮＫ活性化剤（α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ）を含むＮＰの前処理により、ＮＫ細胞の細胞傷害性は７７．１±２．１％に更に増加した。これは、遊離α－ＣＤ１６＋遊離α－４－１ＢＢを用いた前処理（処理に対してｐ＝０．００１９）及びα－ＣＤ１６ ＮＰ＋α－４－１ＢＢ ＮＰを用いた前処理（ｐ＝０．０２０７）よりも有意に高い。細胞傷害性の増加は、両方の遊離アゴニスト抗体を組み合わせることでは達成し得ない、二重抗体で官能化されたＮＰにおける両方の刺激分子の同時活性化及びクラスター形成効果により説明され得る。α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ前処理されたＮＫ細胞と免疫刺激したＢ１６Ｆ１０細胞との会合を、位相感応型光学顕微鏡法により直接確認した（図６Ｄ）。
【0108】
次に、ＥＧＦＲ標的化トリ官能化ナノエンゲージャが、ホタルルシフェラーゼ発現ＨＴ２９細胞（ＨＴ２９－Ｌｕｃ２）に対するＮＫ細胞細胞傷害性をどのように改善するかを調査した。Ｂ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ細胞と同様に、ＮＫ細胞単独では、ＨＴ２９－Ｌｕｃ２細胞に対して非常に低い細胞傷害性を示した（図６Ｆ、上部パネル）。同様に、遊離α－ＥＧＦＲ又はα－ＥＧＦＲ ＮＰの存在下で、遊離α－ＣＤ１６及び遊離α－４－１ＢＢ又はα－ＣＤ１６ ＮＰ及びα－４－１ＢＢ ＮＰで前処理したＨＴ２９－Ｌｕｃ２細胞は、標的リガンドがＮＫ活性化剤と会合しなかったため、ＮＫ細胞細胞傷害性に有意に影響することはなかった。一方、薬物非含有及びＥＰＩ封入トリ官能化ナノエンゲージャ（α－ＥＧＦＲ ＮＰ／α－ＣＤ１６ ＮＰ／α－４－１ＢＢ ＮＰ）の両方は、ＮＫ細胞細胞傷害性を有意に増加させた（図６Ｅ及び図６Ｆ、下部パネル）。治療有効性におけるこうした増加は、α－ＥＧＦＲの標的化効果及びＮＫ活性化剤へのその結合に起因する。この研究では、ＥＰＩはＮＫ細胞細胞傷害性を有意に増加させなかった（図６Ｅ）。更なるインビトロ毒性研究により、治療用量以下の薬物非含有又はＥＰＩ封入三価ナノエンゲージャは、ＨＴ２９細胞、ＭＢ４６９細胞及びＡ４３１細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を有意に増強させ得ることを確認した（図６Ｇ及び図６Ｈ）。遊離α－ＥＧＦＲ、α－ＣＤ１６及びα－４－１ＢＢ抗体を組み合わせることでは、ＮＫ細胞細胞傷害性の増強を達成することはできなかった。位相感応型光学顕微鏡研究により、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰで前処理したがん細胞へのＮＫ細胞の会合を確認したが、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ及びα－ＥＧＦＲ ＮＰで前処理したがん細胞においては有意なＮＫ細胞の会合は確認されなかった。したがって、コンジュゲートα－ＥＧＦＲは、ＮＫ細胞を動員及び活性化させるためには三価ＮＰにとって不可欠である。
【0109】
ＣＤ１６及び４－１ＢＢ刺激分子の空間時間的な同時活性化は、ＮＫ細胞を効果的に活性化させ、インビボでがんを根絶可能であるが、生物学的ターゲッティングを必要とする。４匹のがんのマウスモデルを使用し、インビトロ観察を検証した。α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰのインビボ有効性を試験するため、Ｂ１６Ｆ１０同一遺伝子マウスメラノーマモデルを利用した。免疫能力のあるＣ５７ＢＬ／６マウスは、摂取５日後、８日後、１０日後、１２日後、１５日後及び１８日後に、α－ＣＤ２０、α－ＮＫ１．１、α－ＣＤ４及びα－ＣＤ８（３００μｇ／注射）をｉ．ｐ．注射することにより、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫細胞を除去した状態である。マウスＩｇＧ ２ａ（３００μｇ／注射）をアイソタイプコントロールとして投与した。α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（各抗体１００μｇを含有する）を、摂取６日後、７日後、及び８日後にｉ．ｖ．投与した。１００μｇのα－ＣＤ１６及び／又は１００μｇのα－４－１ＢＢ（遊離又はＮＰコンジュゲート）を含有した免疫療法薬を、摂取６日後、７日後、及び８日後に尾静脈に静脈内投与した。免疫刺激群におけるマウスの異種移植腫瘍は、免疫療法薬の投与４時間前に５Ｇｙの放射線の単回照射に供され、がん細胞中のＮＫ細胞活性化リガンドを上方制御した。α－ＣＤ１６／α－４－ＢＢ ＮＰは中程度の抗がん活性（平均腫瘍体積≒摂取１９日後では未処置群よりも４０％小さい；未処置群に対してｐ＝０．０４７９）及び生存期間のわずかな延長（絶対増殖遅延（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｄｅｌａｙ、ＡＧＤ））＝＋３日間；未処置群に対してはｐ＝０．０１５６；図７Ａ、図８Ａ及び図８Ｂ）。更には、遊離抗体、抗体で官能化されたＮＰ、又はそれらの１：１の組合せでの処置は、有意な抗がん活性を示さなかった（図７Ｂ及び図８Ｂ）。こうした有効性の欠如は、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の認識／この細胞への結合の欠如と一致する。α－ＣＤ１６／α－４－ＢＢ ＮＰの効果は、動物の系全体を通したＮＫ細胞の非特異的活性化により促進される可能性が高い。ただし、こうした系の活性化は、毒性といった観点から望ましくない。
【0110】
腫瘍細胞のＮＫ認識／標的化を可能とするため、腫瘍に５Ｇｙ放射線照射した。放射線照射に続き、マウスをα－ＣＤ１６／α－４－ＢＢ ＮＰで処置し、α－ＣＤ１６、α－４－ＢＢ、α－ＣＤ１６ ＮＰ、α－４－ＢＢ ＮＰ、若しくはそれらの１：１の組合せでコントロールを処置した。放射線療法のみを受けたマウスと比較した場合、約６０％の腫瘍増殖の低減を伴う、α－ＣＤ１６／α－４－ＢＢ ＮＰによるロバストな処置応答（摂取１９日後）を観察した（図７Ｂ及び図８Ｂ～図８Ｃ）。α－ＣＤ１６ ＮＰとα－４－１ＢＢ ＮＰとの組合せもまた腫瘍増殖を抑制したが、抑制はα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰよりも有意ではなかった。他の処置は、コントロールと比較した場合に腫瘍増殖を有意に遅延させなかった。これらの発見は、効果的なＮＫ活性化及び腫瘍の標的化／結合の両方は、ＮＫ細胞介在がん処置において全てが不可欠の機構であることを示唆している。
【0111】
ＣＤ１６及び４－１ＢＢは、同一遺伝子モデルにおいても適応免疫系を活性化させることが可能であるため、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて免疫細胞除去実験を実施し、処置効果がＮＫ細胞活性化に起因すると検証した。ＣＤ２０＋Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の除去は、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰの抗がん有効性に有意に影響しなかった（アイソタイプコントロール群に対し、それぞれ、ｐ＝０．４４４８、０．５５９０及び０．４８５９；図７Ｃ及び図８Ｄ）。一方で、α－ＮＫ１．１によるＮＫ細胞の除去により、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰの抗がん有効性は有意に低減した（アイソタイプコントロール群に対してｐ＜０．０００１）。Ｔ細胞欠損胸腺欠損ヌード（Ｎｕ）マウスのＢ１６Ｆ１０異種移植腫瘍モデルでもこれらの治療薬もまた試験した。これらのマウスは適応免疫系を欠損しており、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ（放射線療法により標的化される）は効果的な処置であった（図８Ｅ）。これらのＮＰの作用機序は自然免疫系によるものであることが更に確認された。
【0112】
ＥＧＦＲ標的化トリ官能化ナノエンゲージャは、インビボにおけるＥＧＦＲが過剰発現したがん増殖を効果的に抑制する：全身性疾患を標的化するために放射線療法を利用することができない場合、この研究は標的リガンドにより腫瘍細胞を標的化することができるナノエンゲージャを操作することを目的としていた。原理証明を実証するため、ＥＧＦＲターゲッティングを選択した。ＥＧＦＲ標的化三価ナノエンゲージャにより、更なる外部免疫刺激なしに効果的なＮＫ細胞介在免疫療法及び化学免疫療法が可能となることを実証するため、包括的なインビボ抗がん有効性研究をＥＧＦＲが過剰発現したＡ４３１腫瘍モデルで実施した（図９Ａ）。この研究は、ＥＧＦＲターゲッティングのみでは効果的な処置を与えないことを示し、α－ＥＧＦＲ処置はコントロールと比較した場合、最小限の効果を示した（未処置群に対してｐ＝０．６１２７、図９Ｂ及び図１０Ａ）。遊離α－ＥＧＦＲ及びα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ又はα－ＥＧＦＲ ＮＰ及びα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰによる処置は、腫瘍増殖において中程度の遅延をもたらした（未処置群に対し、それぞれｐ＝０．００４６及びｐ＝０．００６１）。α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰによる処置は、未処置群と比較すると、初期処置の平均２４日間で腫瘍増殖遅延を伴う最もロバストな処置応答、及び平均１８日間の生存期間の延長を有した（ｐ＝０．００１８）。このデータは、ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャが、外部刺激の必要なしにＥＧＦＲが過剰発現した腫瘍細胞を攻撃するようにＮＫ細胞を効果的に誘導可能であることを確認した。
【0113】
ＮＰもまた化学療法薬を送達可能であり、化学免疫療法が可能となるため、化学療法ペイロードを有するＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャの使用を試験した。ＥＰＩをモデル薬物として使用した。遊離ＥＰＩ、α－ＥＧＦＲ ＥＰＩ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰ、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ及び遊離ＥＰＩ、並びにα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ及びα－ＥＧＦＲ ＥＰＩ ＮＰの抗がん活性を比較した。遊離ＥＰＩ及びα－ＥＧＦＲ ＥＰＩ ＮＰを用いた処置は、腫瘍増殖速度をわずかに低下させた（未処置群に対してそれぞれｐ＝０．００１７及びｐ＝０．００６１、図９Ｂ及び図１０Ａ）。α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ及び遊離ＥＰＩを別々に投与した化学免疫療法は、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ／α－ＥＧＦＲ ＮＰ単独と比較した場合、有効性を有意に改善させることはなかった（ｐ＝０．８５３１；図９Ｂ及び１０Ｂ）。ただし、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰによるＥＧＦＲ標的化化学免疫療法は、約４０日間にわたり腫瘍増殖を効果的に抑制し、生存期間を有意に延長させた（α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ及び遊離ＥＰＩによる未処置群及び処置に対して、それぞれｐ＝０．００１７及びｐ＝０．０３６２）。研究のエンドポイント（摂取７５日後）にて、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰで処置したマウスの半数は生存していたが、他の処置群のマウスはいずれも長期の生存を達成しなかった。この結果は、効果的な標的化化学免疫療法は、化学療法薬及びアゴニスト抗体が同時にがんに到達する場合にのみ達成され得ることを強調している。
【0114】
これらの発見を確認するため、ＭＢ４６８腫瘍モデルにおいてインビボ有効性研究を行い、薬物非含有ナノエンゲージャ及びＥＰＩ封入ナノエンゲージャの両方の抗がん効果を検証した（図９Ａ）。Ａ４３１腫瘍モデルで観察された抗がん活性と同様に、薬物非含有α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰでの処置は腫瘍増殖を有意に遅らせ（未処置群に対してｐ＝０．０００２）、かつ６０％の腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）をもたらした（図９Ｃ及び図１０Ｃ）。α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰによる化学免疫療法は、ＭＢ４６８腫瘍に対してロバストな抗がん活性を示し、研究のエンドポイント（ＴＧＩ＝８４％）にて処置されたマウスの８３％が病勢の安定を有した（すなわち、腫瘍体積において２５％未満の増加）。一方、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ＋遊離ＥＰＩ、又はα－ＥＧＦＲ ＥＰＩ ＮＰ＋α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰによる処置は、腫瘍増殖速度を遅らせたのみであり、６４％及び４９％のＴＧＩをそれぞれもたらした（α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰによる処置に対してｐ＜０．０００１；図９Ｃ及び図１０Ｄ）。これは、化学療法薬をＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャ中へと封入することで、標的化同時化学免疫療法の有効性を増強させることを示している。
【0115】
ＮＫ細胞に基づく処置における腫瘍ターゲッティングの重要性を更に検証するため、ＥＧＦＲ発現ＨＴ２９細胞及びＥＧＦＲ陰性Ｒａｊｉ腫瘍を有する二重異種移植腫瘍モデルを使用してナノエンゲージャを試験した（図９Ｄ）。多剤耐性タンパク質１受容体の過剰発現を前提として、ＥＧＦＲ陰性Ｒａｊｉ腫瘍モデルはＮＫ細胞介在溶解に対し感受性であり、小分子アントラサイクリン処置に対して非感受性であるため、これを陰性コントロールとして選択した。Ａ４３１腫瘍モデル及びＭＢ４６８腫瘍モデルと同様に、遊離α－ＣＤ１６及びα－４－１ＢＢ、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ、並びにα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ＋遊離α－ＥＧＦＲでの処置は、ＮＫ細胞が腫瘍を認識しなかったため、ＨＴ２９腫瘍の増殖を抑制せず（未処置群に対してｐ＝０．１１７１）、かつＲａｊｉ腫瘍の増殖を抑制しなかった（未処置群に対してｐ＝０．１１７１；図９Ｄ及び図１０Ｅ）。一方、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰによるＥＧＦＲ標的化免疫療法は、ＨＴ２９腫瘍増殖を有意に遅延させ、研究のエンドポイントにおいて６６％のＴＧＩをもたらした（未処置群に対してｐ＝０．００８１；図９Ｄ及び図１０Ｆ）。ただし、この処置はＲａｊｉ腫瘍増殖に有意には影響しなかった（未処置群に対してｐ＝０．２８０５；図９Ｄ及び図１０Ｅ）。この研究からのデータは、生物学的ターゲッティングがＮＫ介在免疫療法にとって重要であり、ＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャがＥＧＦＲ発現腫瘍に非常に有効であり、かつこれに特異的であることをはっきりと確証している。Ａ４３１腫瘍モデル及びＭＢ４６８腫瘍モデルで観察された抗がん活性と同様に、遊離ＥＰＩ＋α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰによる同時処置は、ＨＴ２９腫瘍の処置効果を更に改善させなかった（α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰによる処置に対してｐ＝０．２０１４；図９Ｄ及び図１０Ｅ）。反対に、α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰによる処置はＨＴ２９腫瘍増殖を完全に抑制し、８４％の平均ＴＧＩをもたらした（未処置群に対するｐ＝０．０１１３、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ／α－ＥＧＦＲ ＮＰ＋遊離ＥＰＩによる処置に対するｐ＝０．０２７６）。ＨＴ２９腫瘍に対し改善された抗がん活性は、ＥＧＦＲが過剰発現した腫瘍に対するＥＰＩの標的化送達により説明され得る。この標的化処置は、Ｒａｊｉ腫瘍増殖に影響しなかった（未処置群に対してｐ＝０．０５０３）。ＨＴ２９はＡ４３１及びＭＢ４６８より低いＥＧＦＲ抗原発現を有するが、全処置群においてＥＧＦＲ陰性Ｒａｊｉ腫瘍で観察された有効性の欠如は、観察された抗腫瘍活性が自然免疫系の全身活性化ではなく、標的化がん細胞とＮＫ細胞との特異的な会合に関係することを確認した。
【0116】
ＮＫ細胞介在化学免疫療法に関するＥＧＦＲ標的化トリ官能化ナノエンゲージャへの機構的洞察：トリ官能化ナノエンゲージャの機能の機構へと洞察を加えるため、Ａ４３１腫瘍モデルを使用し、相関研究を行った。エクスビボ近赤外蛍光イメージング法による体内分布研究は、α－ＥＧＦＲと同時投与された場合、腫瘍がわずかな量（０．２％ＩＤ／ｇ未満）のＣｙ５標識α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰを取り込んだことを示した（図１０Ｆ及び図１１Ａ）。一方、投与された約５．７±１．３％ＩＤ／ｇのＣｙ５標識α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰは腫瘍内に蓄積した。これはＣｙ５標識α－ＥＧＦＲ ＮＰ＋Ｃｙ５－標識α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰの量よりも約３倍（ｐ＝０．０２５１）高かった。ＥＧＦＲ標的化三価ＮＰの腫瘍取込みの増加は、循環ＮＫ細胞と腫瘍細胞との会合を促進させ、腫瘍浸潤ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の数を約１７倍に増加させた（図１１Ｂ）。ただし、病理組織学的研究で示されるように、有意なＤＮＡ損傷は観察されなかった（図１１Ｃ）。ＮＰ同時固定されたα－ＣＤ１６及びα－４－１ＢＢもまたＮＫ細胞を効果的に活性化させるため、血清サイトカインレベル（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－γ）は三価ナノエンゲージャによる処置後に有意に増加した（図１１Ｄ）。特に、これらの増強はＥＧＦＲ標的化ナノエンゲージャにより処置されたマウスでのみ観察することが可能であるが、α－ＥＧＦＲ ＮＰとα－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰとの組合せではこれは観察されなかった（図１１Ａ）。これは、α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰによるＮＫ細胞活性化はＮＫ細胞による腫瘍細胞認識を促進させず、それゆえに無効な免疫活性化をもたらしたことが理由である。化学免疫療法群で同様の体内分布傾向を観察した（図１１Ａ及び図１１Ｅ）。α－ＥＧＦＲで官能化された全てのＥＰＩ封入ＮＰは、遊離ＥＰＩ（≒３％ＩＤ／ｇ）と比較すると、有意に高いＥＰＩ取込み（８．５～１０％ＩＤ／ｇ）を有する。ＥＰＩ取込みの増加は、病理組織学的研究で観察されるように、より高いγ－Ｈ２ＡＸ発現（ＤＮＡ損傷によりもたらされる）と一致している（図１１Ｃ）。α－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＥＰＩ ＮＰの投与もα－ＥＧＦＲ／α－ＣＤ１６／α－４－１ＢＢ ＮＰ＋遊離ＥＰＩの投与のどちらも血清サイトカインレベルには影響しなかった。これは同時ＥＰＩ処置がＮＫ細胞抗腫瘍活性に影響しなかったことを示唆している（図１１Ｄ）。この包括的な機構的研究は、テーラーメイドＥＰＩ封入ナノエンゲージャが細胞傷害性化学療法薬をがん細胞に効果的に送達可能であり、ＮＫ細胞が腫瘍細胞を攻撃するのを促進させることを確認した。
【0117】
この研究は、化学療法薬を同時標的化送達し、かつがんを根絶するために宿主の自然免疫系を活性化させるための、翻訳可能なマルチモーダルがん処置プラットフォームを提供する。これは、本発明のＥＧＦＲ標的化三価ナノエンゲージャが、腫瘍細胞に治療用量の細胞傷害性化学療法薬を同時送達しながらも、腫瘍細胞を攻撃するためにＮＫ細胞を動員かつ活性化可能であることを実証した。包括的インビトロ研究及びインビボ研究は、この合成致死性が従来的な化学免疫療法戦略では達成不可能であることを実証した。このデータは、ロバストなＮＫ活性化及び生物学的ターゲッティングの両方がＮＫ細胞介在がん処置では重要であり、ＮＰに基づく処置はこの用途に唯一適していることを実証した。生物学的ターゲッティングの必要性はまた、本アプローチでは全身的／非特異的毒性が低いことを示唆している。ナノエンゲージャの単純なモジュール設計により、化学療法薬の容易な交換が可能となり、異なるタイプのがんを処置するための部分を標的とし、様々なタイプの免疫細胞に会合する。ナノエンゲージャプラットフォームの開発は、現在利用可能な併用免疫療法戦略を改善させることができる。
【0118】
前述の内容は本発明の実例となるものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は以下の特許請求の範囲により定義され、特許請求の範囲と同等物はその中に含まれる。
【0119】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E-1】
【図8E-2】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A-1】
【図10A-2】
【図10B】
【図10C-1】
【図10C-2】
【図10D】
【図10E-1】
【図10E-2】
【図10F】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【国際調査報告】