特表2023-508646小胞体内のグルタチオン測定用リアルタイム蛍光イメージングセンサおよびこれを用いる方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-03
(54)【発明の名称】小胞体内のグルタチオン測定用リアルタイム蛍光イメージングセンサおよびこれを用いる方法
(51)【国際特許分類】
C07D 491/16 20060101AFI20230224BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230224BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230224BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20230224BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20230224BHJP
C12Q 1/26 20060101ALI20230224BHJP
【ＦＩ】
C07D491/16 CSP
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N21/64 F
C12Q1/06
C12Q1/26
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022534427
(86)(22)【出願日】2020-12-22
(85)【翻訳文提出日】2022-06-06
(86)【国際出願番号】 KR2020018859
(87)【国際公開番号】W WO2021137500
(87)【国際公開日】2021-07-08
(31)【優先権主張番号】10-2019-0178260
(32)【優先日】2019-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522225583
【氏名又は名称】セル２イン，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カン、フン ソ
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヒェ ミ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン、グァン モ
(72)【発明者】
【氏名】キム、イェジ
(72)【発明者】
【氏名】シン、チ ウン
(72)【発明者】
【氏名】カン、ヒェ ウォン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヨン ファン
(72)【発明者】
【氏名】チェ、キ ハン
(72)【発明者】
【氏名】ミン、ス－ヒョン
【テーマコード（参考）】
2G043
2G045
4B063
4C050
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043BA16
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4C050EE01
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4C050HH04
(57)【要約】
本発明は、小胞体（ＥＲ）内のグルタチオン測定用リアルタイム蛍光イメージングセンサおよびその製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、小胞体（ＥＲ）内のグルタチオン測定用測定用新規化合物、新規化合物の製造方法、前記新規化合物を含む小胞体（ＥＲ）内のグルタチオン測定用リアルタイムイメージングセンサ、その製造方法および前記イメージングセンサを用いた小胞体（ＥＲ）内のグルタチオンの測定方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式Ｉで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：【化1】
前記化学式Ｉにおいて、Ｒ１は、１つ以上のＮを含む３－７員環であるヘテロシクロアルキルであり、前記ヘテロシクロアルキルは、Ｒ２置換基が結合しており；前記Ｒ２は、アミド基である。
【請求項2】
前記Ｒ２は、－（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ）－Ｒ３であり；前記Ｒ３は、－（ＣＨ２）ｍ－Ｒ４、－（ＣＨ２）ｍ－Ｒ５、－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｐ－（ＣＨ２）ｑ－Ｒ４、または－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｐ－（ＣＨ２）ｑ－Ｒ５であり；
ここで、前記ｍは、１－６の整数であり、前記ｎ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１－４の整数であり；
前記Ｒ４は、下記化学式ＩＩで表される置換基であり；
前記Ｒ５は、下記化学式ＩＩＩで表される置換基である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【化2】
【化3】
【請求項3】
前記化学式Ｉで表される化合物は、下記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表されるものである、請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【請求項4】
前記化学式Ｉで表される化合物は、フリー（ｆｒｅｅ）状態で５５０～６８０ｎｍで最大放出波長を示し、チオールと結合した状態で４３０～５５０ｎｍで最大放出波長を示すものである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項5】
前記放出波長の蛍光強度は、４３０ｎｍ～６８０ｎｍの範囲で増減するものである、請求項４に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）における抗酸化能測定用組成物。
【請求項7】
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定である、請求項６に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項8】
前記チオールレベルの測定は、生細胞の細胞小器官におけるチオールレベルの測定である、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項9】
前記細胞小器官は、小胞体（ＥＲ）である、請求項８に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項10】
前記小胞体（ＥＲ）における抗酸化能の測定は、化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つの化合物を用いるものである、請求項９に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項11】
前記チオールレベルの測定にあたり、チオールが増加するにつれ、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度が減少し、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度は増加するものである、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項12】
前記チオールレベルの測定は、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）実施するものである、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項13】
前記比率は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）である、請求項１２に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項14】
前記関係は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の数学的比率関係であり、前記数学的比率関係は、小胞体（ＥＲ）におけるチオールの量に応じて比率計量的（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）かつ可逆的に増減して、細胞内小器官におけるチオールの量をリアルタイムに示すものである、請求項１３に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項15】
前記チオールレベルの測定は、小胞体（ＥＲ）内のチオールの定性または定量的検出である、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項16】
前記チオールレベルの測定は、リアルタイム定量的測定である、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項17】
前記チオールレベルの測定は、細胞の酸化的ストレスまたは酸化度を示すものである、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項18】
前記チオールレベルの測定は、細胞の老化度を示すものである、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項19】
前記チオールは、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）、ホモシステイン（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｈｃｙ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｃｙｓ）またはタンパク質のシステイン残基にあるチオールである、請求項７に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項20】
以下のステップを含む生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法：（ａ）請求項６に記載の組成物および候補物質を同時にまたは順序に関係なく順次に生細胞に投与するステップと、
（ｂ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て標準データと比較するステップと、
（ｃ）前記試験物質をチオール増加剤または抑制剤として決定するステップと、
（ｄ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度の、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率が減少する場合、チオール抑制剤として決定し、蛍光強度の比率が増加する場合、チオール増加剤として決定するステップ。
【請求項21】
前記（ｄ）ステップは、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）が減少する場合、チオール抑制剤として決定し、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）が増加する場合、チオール増加剤として決定するものである、請求項２０に記載の生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項22】
前記蛍光比率の測定は、小胞体（ＥＲ）に対して測定するものである、請求項２０に記載の生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項23】
請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物またはその塩を含む酸化ストレス誘発疾患診断キット。
【請求項24】
以下のステップを含む生細胞における抗酸化能の測定方法：（ａ）生細胞における４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）をリアルタイムに測定するステップと、
（ｂ）請求項６に記載の組成物を生細胞に投与するステップと、
（ｃ）酸化剤をステップ（ｂ）の細胞に投与するステップと、
（ｄ）前記蛍光強度の比率値の変化を観察するステップ。
【請求項25】
前記（ａ）ステップは、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）をリアルタイムに測定するものである、請求項２４に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
【請求項26】
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記蛍光強度の比率値が前記酸化剤を投与しない生細胞の蛍光強度の比率値または前記酸化剤を投与する前の蛍光強度の比率値に回復する時間を測定するステップを追加的に含み、前記時間が短いほど、抗酸化能が高いと判断するものである、請求項２４に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
【請求項27】
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記酸化剤を投与しない生細胞の蛍光強度の比率値と前記酸化剤を投与した生細胞の蛍光強度の比率値との差の酸化剤投与時点から、前記酸化剤を投与する前の蛍光強度の比率値に回復する時点までの積分値を測定するステップを追加的に含み、前記積分値が小さいほど、抗酸化能が高いと判断するものである、請求項２４に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
【請求項28】
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記酸化剤を投与した生細胞の蛍光強度の比率値が減少し始める前記酸化剤の最小濃度を滴定するステップを追加的に含み、前記最小濃度が高いほど、抗酸化能が高いと判断するものである、請求項２４に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
【請求項29】
前記測定方法は、生細胞内の小器官である小胞体（ＥＲ）に対して測定するものである、請求項２４に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、小胞体（ＥＲ）内のグルタチオン測定用リアルタイム蛍光イメージングセンサおよびこれを用いる方法に関する。より詳しくは、本発明は、小胞体（ＥＲ）内のグルタチオン測定用新規化合物および前記新規化合物を用いた小胞体（ＥＲ）内のグルタチオンの測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
人体は抗酸化系の作用により活性酸素種を適切に除去して恒常性を維持するが、ＲＯＳの生成と抗酸化系の作用との間のバランスが崩れると、酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）が増加し、これは、老化をはじめとして退行性関節炎、白内障、アルツハイマーなどの老化関連の退行性疾患、各種癌、線維化疾患をはじめとして、最近は、糖尿病、肥満、心血管疾患などの代謝性症侯群の発病に重要な共通の原因因子として注目されている。前記ＲＯＳは、不安定で反応性が高く、生体分子を酸化させて生化学的、生理的損傷を誘発させ、これは老化の主要機序の一つである。したがって、人体の酸化度のみならず、抗酸化度や抗酸化能力は生体年齢の計測における主たるバイオマーカーになり得る。
【0003】
一方、中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、骨髄、臍帯血、胎盤（または胎盤組織細胞）、脂肪（または脂肪組織細胞）などの多様な成体細胞に由来する多分化性の性質を有する幹細胞である。例えば、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）に由来する中間葉幹細胞は、脂肪組織、骨／軟骨組織、筋肉組織に分化できる多分化性によって細胞治療剤としての開発のために多様な研究が進められている。
【0004】
しかし、細胞治療剤の主要成分である幹細胞は、分離後、培養過程で多分化能、組織再生能を失い老化しやすく、治療的有効量に相当する大量の細胞を得るために複数の継代を経る間、このような危険性はさらに大きくなる。また、組織から得られる幹細胞は非常に少ない量であり、これを用いる時には大量の細胞が必要なため、幹細胞の数を増殖させる培養が行われる。最近は、幹細胞の品質に関連して幹細胞の抗酸化活性を測定し、これによって品質を管理する方法として、細胞内抗酸化活性を測定する方法が開示されている。
【0005】
しかし、幹細胞の抗酸化活性の測定により高い活性を備えた高品質の幹細胞の選別方法に関する研究は不十分であるのが現状である。したがって、希少価値が高い細胞治療剤資源である幹細胞の使用効率性を高めるために、高活性の幹細胞の選別に必要な抗酸化能測定用組成物の開発が必要なのが現状である。
【0006】
また、前記のように幹細胞を含む細胞の抗酸化能の測定にあたり、生体試料からチオールを含有する物質の検出および識別は非常に重要である。これにより、細胞を破砕せずに生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）におけるチオールを効果的に検出する蛍光方法が開発されているが、小胞体内の多様なソースのチオール測定による抗酸化能測定物質が必要なのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、本発明による新規なＥＲ－ＦＴ（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）を用いて小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ；ＥＲ）内のチオールの量に応じて蛍光強度が連続的かつ比率計量的であり、可逆的に増減することを究明し、生きている細胞内小胞体（ＥＲ）におけるチオールの量をリアルタイムに定量または定性的に検出するのに著しい敏感性を有するバイオセンサとして有用に利用できることを確認することにより、本発明を完成した。
【0008】
したがって、本発明の目的は、化学式ＩＶ～ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴ（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）を提供することである。
【0009】
本発明の他の目的は、ＥＲ－ＦＴ（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）を含む小胞体（ＥＲ）のチオール検出用組成物を提供することである。
【0010】
本発明のさらに他の目的は、ＥＲ－ＦＴを用いた生細胞内の小胞体（ＥＲ）のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法を提供することである。
【0011】
本発明の目的および利点は下記の発明の詳細な説明および特許請求の範囲によってより明確になる。
【0012】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は以上に言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【0013】
以下、本願に記載された多様な具体例が図面を参照して記載される。下記の説明において、本発明の完全な理解のために、多様な特異的詳細事項、例えば、特異的形態、組成物および工程などが記載されている。しかし、特定の具体例はこれらの特異的詳細事項の１つ以上なしに、または他の公知の方法および形態とともに実行できる。他の例において、公知の工程および製造技術は本発明を不必要にあいまいにさせないために、特定の詳細事項として記載されない。「一つの具体例」または「具体例」に対する本明細書全体にわたる参照は具体例と結びついて記載された特別な特徴、形態、組成または特性が本発明の一つ以上の具体例に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる多様な位置で表現された「一つの具体例において」または「具体例」の状況は、必ずしも本発明の同一の具体例を示さない。追加的に、特別な特徴、形態、組成または特性は、１つ以上の具体例において、いかなる好適な方法で組み合わされてもよい。
【0014】
本明細書内に特別な定義がなければ、本明細書に使われたすべての科学的および技術的な用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【0015】
本明細書において、用語「比率計量的（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）」は、算出量が投入量（ｉｎｐｕｔ）に直接的に比例することを意味する。具体的には、本発明の一実施形態において、「比率計量的」は、本発明の組成物がチオールの投入量に応じて直接的に比例して蛍光強度が増加または減少することを意味する。
【0016】
本明細書において、用語「検出」は、試料中にて化学種や生物学的物質の存在の有無やその量を測定することを意味する。
【0017】
本明細書において、用語「可逆的（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）」は、化学反応で反応物と生成物との混合物が平衡状態の混合物を生成することが可能な状態を意味する。より具体的には、本明細書において、化学式Ｉで表される化合物とチオールとの反応が平衡状態をなして、チオールの量に応じて正反応または逆反応して可逆的に反応が進行できることを意味する。
【0018】
本明細書において、用語「チオール（ｔｈｉｏｌ）」は、炭素と結合したスルフヒドリル基を含む有機化合物を意味し、スルフヒドリル基またはチオール基は混用されて使用される。
【0019】
本発明において、用語、「細胞」は、生物体を構成する構造的または機能的単位を意味するものであって、本発明の目的上、細胞の老化が進行する細胞を制限なく含むことができる。
【0020】
本明細書において、用語、「細胞の老化」は、細胞の形質および機能退化を意味し、それに続く細胞死または増殖停止が起こるまでの一連の過程を含む。前記形質および機能退化は不可逆的なものであってもよい。また、細胞の老化はこれに限定しないが、標準細胞または標準個体に比べて細胞の増殖能の減少、多分化能および組織再生能の喪失、リポフスチン（ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ）蓄積、β－ガラクトシダーゼの活性増加、ミトコンドリアの活性酸素増加、またはこれらの組み合わせを含むか、それを引き起こす過程を示すことができる。細胞または個体の老化は自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）の活性減少またはミトコンドリア膜電位の減少を含むか、これらを引き起こす過程をさらに含むことができる。若い（ｙｏｕｎｇ）細胞または個体は、標準細胞または個体に比べて細胞の増殖能の増加、リポフスチンの蓄積減少、β－ガラクトシダーゼの活性減少、またはこれらの組み合わせを含むことを示すことができる。例えば、老化細胞は、継代数２の分裂時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）に比べて、分裂時間が２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、９倍以上、１０倍以上、５０倍以上、または１００倍以上増加した場合、その細胞は老化細胞といえる。
【0021】
本発明において、前記細胞老化は、増殖性ストレスおよび／またはＤＮＡ損傷を誘発する内因性および外因性刺激の適用により試験管内および生体内ともにおいて細胞を能動的に分裂させる場合、早期に誘導される。このような刺激には、発癌遺伝子の異常発現および／または活性化、イオン化放射線露出による直接的なＤＮＡ損傷、活性酸素、化学療法薬物および細胞の継代培養による継代数の増加が含まれる。結果的に、細胞老化は、細胞のストレス反応、癌発生および治療結果および幹細胞の治療結果に積極的な影響を及ぼすことができる。
【0022】
本明細書において、用語「細胞の老化度」は、細胞の老化の程度を定量的または定性的に測定したことを意味することができる。
【0023】
本明細書において、用語「抗酸化能」とは、抗酸化剤が酸化を防止する能力で、脂肪を酸素のある密閉容器に入れて酸素消費率を測定することで簡単に測定することができる。しかし、有機体の生化学において抗酸化剤の抗酸化能の測定が重要になっている。
【0024】
本明細書において、前記「抗酸化剤」とは、抗酸化物質または酸化防止剤などと呼ばれ、酸化を防止する物質をあまねく示す言葉である。ここで、抗酸化は、酸化の抑制を意味する。細胞の老化過程とそれに対する予防を説明する時、主に登場する概念で、細胞の老化は、つまり細胞の酸化を意味する。呼吸して体に入ってきた酸素は体に良い作用をするが、この過程で活性酸素が作られる。過度の活性酸素が酸素を不安定な状態に露出させることを引き起こすが、これは動物の体に悪い影響を及ぼす。したがって、活性酸素を適切に維持することが、細胞の酸化、細胞の老化を防ぐものであってもよいが、これに限定されない。
【0025】
本発明の前記抗酸化剤としては、カロテノイド類（ベータカロチン、リコピン、ルテイン）、フラボノイド類（アントシアニン、カテキン、レスベラトロール、プロアントシアニジン）、イソフラボン類（ゲニステイン、ダイゼイン）、ビタミン類、ミネラル、グルタチオン、コエンザイムＱ－１０、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）、スーパーオキシドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、グルタチオン－依存性ペロキシダーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）およびペルオキシレドキシン（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ）などのような細胞の外部および内部の物質であってもよいが、これに限定されない。
【0026】
本明細書において、用語「酸化的ストレス」とは、生体（または細胞）内で発生する酸化物質とこれに対応する抗酸化剤との間のバランスが崩れて酸化比率（活性酸素の比率）が増加するにつれ、生体（または細胞）内の抗酸化力が低下しながら発生するストレスを意味し、用語「酸化的損傷」乃至「酸化度」は、このような酸化的ストレスによって誘発される生体または細胞内の各種損傷（遺伝子損傷、細胞の代謝異常など）を総称するために使用されるものであってもよいが、これに限定されない。
【0027】
本明細書において、特別な言及がない限り、酸化的損傷物質（または酸化的損傷誘発物質）と酸化的ストレス物質（または酸化的ストレス誘発物質）は、同等の意味で使われる。
【0028】
本発明は、酸化的ストレスを測定して酸化的ストレスを誘発する被検出物質または酸化的損傷物質の存在の有無、およびその濃度を測定することができる。
【0029】
本発明の一実施例によれば、本発明は、下記化学式Ｉで表される化合物またはその塩を含む小胞体（ＥＲ）におけるチオール検出用組成物を提供する：
【化1】
【0030】
前記化学式Ｉにおいて、Ｒ１は、１つ以上のＮを含む３－７員環であるヘテロシクロアルキルであり、前記ヘテロシクロアルキルは、Ｒ２置換基が結合しており；前記Ｒ２は、アミド基であり；前記Ｒ２は、－（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ）－Ｒ３であり；前記Ｒ３は、－（ＣＨ２）ｍ－Ｒ４、－（ＣＨ２）ｍ－Ｒ５、－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｐ－（ＣＨ２）ｑ－Ｒ４、または－（ＣＨ２）ｎ－（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｐ－（ＣＨ２）ｑ－Ｒ５であってもよい。ここで、前記ｍは、１－６の整数であり、前記ｎ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１－４の整数であり；前記Ｒ４は、下記化学式ＩＩで表される置換基であり；前記Ｒ５は、下記化学式ＩＩＩで表される置換基である：
【化2】
【化3】
【0031】
本発明者らは、細胞内小胞体（ＥＲ）におけるチオールの量をリアルタイムに定量または定性的に検出するのに著しい敏感性を有するバイオセンサを開発するために、鋭意研究努力した。その結果、前記化学式Ｉで表される本発明のＥＲ－ＦＴ（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）が細胞内小胞体（ＥＲ）におけるチオールの量に応じて蛍光強度が連続的かつ比率計量的であり、可逆的に増減するということを究明し、細胞内小胞体（ＥＲ）におけるチオールの量をリアルタイムに定量または定性的に検出するのに著しい敏感性を有するバイオセンサとして有用に利用できるということを立証した。
【0032】
本発明において、前記放出波長の蛍光強度は、４３０ｎｍ～６８０ｎｍの範囲で増減できる。
【0033】
本明細書において、用語「Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ（ＥＲ－ＦｒｅｓＨ、ＥＲ－ＦＴ）」は、シアノアクリルアミド求電子体（ｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ）を有するクマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）誘導体であって化学式Ｉで表される化合物を意味し、本発明における小胞体（ＥＲ）内のチオール検出用蛍光物質として使用される。
【0034】
本発明の一実施形態において、本発明の小胞体（ＥＲ）は、生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）内に含まれたものである。本発明の組成物は、小胞体（ＥＲ）内のチオールレベルを測定するにあたり、細胞から分離された小胞体（ＥＲ）に限らず、細胞内に含まれた状態の小胞体（ＥＲ）内のチオールレベルを測定できる特徴がある。特に、生きている細胞内小胞体（ＥＲ）におけるチオールレベルを特異的に検出することができる。
【0035】
本発明の一実施形態において、本発明のＲ１は、１または２個のＮを含む６員環ヘテロシクロアルキルであり、前記ヘテロシクロアルキルは、Ｒ２置換基が結合しており、前記Ｒ２は、置換もしくは非置換のアミド基である。本発明において、「６員環ヘテロシクロアルキル」に含まれた用語「６員環」は、ビサイクリック化合物（ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）またはスピロ化合物（Ｓｐｉｒｏ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）のように複数の環が接合された環化合物形態ではない、モノサイクリック化合物としての１つの６員環形態を意味し、「ヘテロシクロアルキル」は、非－芳香族性環状アルキルであって、環内に含まれた炭素原子の少なくとも１つがヘテロ原子、例えば、窒素、酸素または硫黄によって置換されているものを意味する。本実施形態において、Ｒ１は、６員環ヘテロシクロアルキルであって、１個または２個の窒素を環内に含まれたヘテロ原子として含む。
【0036】
本発明において、前記化学式Ｉで表される化合物は、下記化学式ＩＶ～ＶＩＩで表される化合物のいずれか１つ以上である：
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【0037】
本発明の前記化学式Ｉで表される化合物、好ましくは、前記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表される化合物は、生細胞内の小胞体（ＥＲ）におけるチオールの量が増加するにつれ、ＥＲ－ＦＴに結合するチオールの量が増加できる。
【0038】
本発明において、前記化学式Ｉで表される化合物、好ましくは、前記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表される化合物は、フリー（ｆｒｅｅ）状態で５５０～６８０ｎｍで最大放出波長を示し、チオールと結合した状態で４３０～５５０ｎｍで最大放出波長を示すものである、化学式Ｉで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩であってもよい。
【0039】
本発明において、前記化学式Ｉで表される化合物、好ましくは、前記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表される化合物は、フリー状態で５５０～６５０、５５０～６２０、５５０～６００、５７０～５９０または５８０ｎｍで最大放出波長を示す。
【0040】
本発明において、前記化学式Ｉで表される化合物、好ましくは、前記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表される化合物は、チオールと結合した状態で４５０～５５０、４７０～５５０、４７０～５３０、４９０～５３０、５００～５２０または５１０ｎｍで最大放出波長を示す。
【0041】
本発明において、前記放出波長の蛍光強度は、４３０ｎｍ～６８０ｎｍの範囲で増減するものである、化学式Ｉで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩であってもよい。
【0042】
本発明の前記化学式Ｉで表される化合物、好ましくは、前記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表される化合物は、薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）における抗酸化能測定用組成物であってもよい。
【0043】
本発明において、前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定であってもよく、前記チオールレベルの測定は、生細胞の細胞小器官におけるチオールレベルの測定であってもよいし、前記細胞小器官は、小胞体（ＥＲ）であってもよい。
【0044】
本発明において、前記チオールレベルの測定は、チオールが増加するにつれ、フリー状態の化合物が示す５５０～６８０ｎｍの蛍光強度は減少し、チオールが結合している化合物が示す４３０～５５０ｎｍの蛍光強度は増加するものであってもよい。
【0045】
本発明において、蛍光強度は、比率計量的であり、可逆的に増減できる。
【0046】
本発明において、前記チオールレベルの測定は、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）実施するものであり、前記比率は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）であってもよい。
【0047】
本発明において、前記関係は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の数学的比率関係であり、前記数学的比率関係は、小胞体（ＥＲ）におけるチオールの量に応じて比率計量的（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）かつ可逆的に増減して、細胞内小器官におけるチオールの量をリアルタイムに示すものであってもよい。
【0048】
本発明において、前記チオールレベルの測定は、小胞体（ＥＲ）内のチオールの定性または定量的検出であってもよく、前記チオールレベルの測定は、リアルタイム定量的測定であってもよい。
【0049】
本発明において、前記チオールレベルの測定は、細胞の酸化的ストレスまたは酸化度を示すものであってもよく、前記チオールレベルの測定は、細胞の老化度を示すものであってもよい。
【0050】
本発明において、前記チオールは、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）、ホモシステイン（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｈｃｙ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｃｙｓ）またはタンパク質のシステイン残基にあるチオールであってもよい。
【0051】
本発明による化合物を含む組成物を用いて、幹細胞を含むすべての細胞の細胞内小器官である小胞体（ＥＲ）の抗酸化能を測定して、抗酸化能に関連する細胞の活性を正確に測定することができ、高活性の細胞分類が可能である。本発明の組成物を用いた細胞の活性の測定は、抗酸化能の測定を含むが、これに限定されるものではない。
【0052】
本発明において、前記化学式Ｉで表される化合物、好ましくは、前記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表される化合物は；そのラセミ体、光学異性体、部分立体異性体、光学異性体の混合物、または部分立体異性体の混合物；その薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む細胞内小器官の抗酸化能測定用組成物を提供することができる。
【0053】
本発明の他の実施形態によれば、（ａ）前記化学式Ｉで表される化合物、好ましくは、 前記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表される化合物を有効成分として含む組成物および候補物質を同時にまたは順序に関係なく順次に生細胞に投与するステップと、（ｂ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て標準データと比較するステップと、（ｃ）前記試験物質をチオール増加剤または抑制剤として決定するステップと、（ｄ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度の、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度に対するの比率が減少する場合、チオール抑制剤として決定し、蛍光強度の比率が増加する場合、チオール増加剤として決定するステップとを含む生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法であってもよい。
【0054】
本発明において、前記（ｄ）ステップは、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）が減少する場合、チオール抑制剤として決定し、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）が増加する場合、チオール増加剤として決定するものであってもよい。
【0055】
本発明において、前記蛍光比率の測定は、小胞体（ＥＲ）に対して測定するものであってもよい。
【0056】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明の組成物を含む酸化ストレス誘発疾患診断キットを提供する。本明細書の用語「酸化ストレス誘発疾患」は、酸化ストレスによって発生する疾患を意味し、「活性酸素種（ＲＯＳ）関連疾患」と同じ意味で使われる。
【0057】
本発明において、前記酸化ストレス誘発疾患は、老化、退行性関節炎、白内障、アルツハイマー病、癌、線維化疾患、糖尿病、肥満、虚血、虚血性再灌流損傷、炎症、全身性紅斑狼瘡、心筋梗塞、血栓性脳卒中、出血性脳卒中、出血、脊髄外傷、ダウン症候群、クローン病、リウマチ関節炎、ぶどう膜炎、肺気腫、胃潰瘍、酸素中毒、腫瘍または放射線症であってもよいが、これに限定されるものではい。
【0058】
本発明において、「キット」は、チオールに特異的に結合する本発明の検出可能な化合物を標識として標識してチオールの発現レベルを評価できるツールをいう。検出可能な物質を基質との反応によって直接的に標識するだけでなく、直接的に標識された他の試薬との反応性による発色する標識体が接合された間接的標識も含む。前記標識体と発色反応する発色基質溶液、洗浄液およびその他の溶液などを含むことができ、使用される試薬成分を含んで作製される。本発明のキットは、当業界にて公知のものであれば、これに限定されない。
【0059】
本発明の前記キットは、分析方法に適した１種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置をさらに含むことができ、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）および色素（ｄｙｅ）などの標識体が使用できるが、これに限定されるものではい。
【0060】
本発明のさらに他の実施形態によれば、（ａ）生細胞における４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）をリアルタイムに測定するステップと、（ｂ）請求項６に記載の組成物を生細胞に投与するステップと、（ｃ）酸化剤をステップ（ｂ）の細胞に投与するステップと、（ｄ）前記蛍光強度の比率値の変化を観察するステップとを含む生細胞における抗酸化能の測定方法であってもよい。
【0061】
本発明において、前記（ａ）ステップは、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）をリアルタイムに測定するものであってもよい。
【0062】
本発明において、前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記蛍光強度の比率値が前記酸化剤を投与しない生細胞の蛍光強度の比率値または前記酸化剤を投与する前の蛍光強度の比率値に回復する時間を測定するステップを追加的に含み、前記時間が短いほど、抗酸化能が高いと判断するものであってもよい。
【0063】
本発明において、前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記酸化剤を投与しない生細胞の蛍光強度の比率値と前記酸化剤を投与した生細胞の蛍光強度の比率値との差の酸化剤投与時点から、前記酸化剤を投与する前の蛍光強度の比率値に回復する時点までの積分値を測定するステップを追加的に含み、前記積分値が小さいほど、抗酸化能が高いと判断するものであってもよい。
【0064】
本発明において、前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記酸化剤を投与した生細胞の蛍光強度の比率値が減少し始める前記酸化剤の最小濃度を滴定するステップを追加的に含み、前記最小濃度が高いほど、抗酸化能が高いと判断するものであってもよい。
【0065】
本発明において、前記測定方法は、生細胞内の小器官である小胞体（ＥＲ）に対して測定するものであってもよい。
【発明の効果】
【0066】
本発明による化合物を含む組成物を用いて生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）、特に幹細胞内小器官である小胞体（ＥＲ）の抗酸化能を測定することができ、小胞体（ＥＲ）の抗酸化能の測定結果によって高活性の幹細胞を選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【0067】
【図1】化学式ＩＶで表されるＥＲ－ＦＴの構造を示す図である。
【図2】化学式Ｖで表されるＥＲ－ＦＴの構造を示す図である。
【図3】化学式ＶＩで表されるＥＲ－ＦＴの構造を示す図である。
【図4】化学式ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴの構造を示す図である。
【図5】化学式ＩＶ～ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴがＵＣ－ＭＳＣの細胞の小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【図6】化学式ＩＶ～ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴのＩＣ５０を示した毒性実験の結果である。
【図7】化学式ＩＶ～ＶＩで表されるＥＲ－ＦＴのＵＣ－ＭＳＣの保持時間に対して、５１０ｎｍ波長、５８０ｎｍ波長の強度、５１０ｎｍ、５８０ｎｍ波長の強度および両波長の強度比で測定した実験の結果である。
【図8】化学式ＩＶ～ＶおよびＶＩで表されるＥＲ－ＦＴのＵＣ－ＭＳＣの保持時間に対して、５１０ｎｍ波長、５８０ｎｍ波長の強度、５１０ｎｍ、５８０ｎｍ波長の強度および両波長の強度比で測定した実験の結果である。
【図9】化学式ＩＶで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、Ｄｉａｍｉｄｅを追加してＵＣ－ＭＳＣの細胞で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【図10】化学式ＩＶで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、ＤｉａｍｉｄｅおよびＤＴＴを追加してＵＣ－ＭＳＣの細胞で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【図11】化学式Ｖで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、Ｄｉａｍｉｄｅを追加してＵＣ－ＭＳＣの細胞の小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【図12】化学式Ｖで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、ＤｉａｍｉｄｅおよびＤＴＴを追加してＵＣ－ＭＳＣの細胞の小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【図13】化学式ＶＩで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、Ｄｉａｍｉｄｅを追加してＵＣ－ＭＳＣの小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【図14】化学式ＶＩで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、ＤｉａｍｉｄｅおよびＤＴＴを追加してＵＣ－ＭＳＣの小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【図15】化学式ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、Ｄｉａｍｉｄｅを追加してＵＣ－ＭＳＣの小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【図16】化学式ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、ＤｉａｍｉｄｅおよびＤＴＴを追加してＵＣ－ＭＳＣの小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【発明を実施するための形態】
【0068】
本発明の目的は、化学式ＩＶ～ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴ（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）を提供することである。
【実施例】
【0069】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0070】
［製造例］小胞体（ＥＲ）の抗酸化能測定用化合物の合成
小胞体（ＥＲ）である小胞体（ＥＲ）の抗酸化能の測定に使用する化合物（ＥＲ－ＦＴ）の製造方法は下記の通りである。
小胞体（ＥＲ）である小胞体（ＥＲ）の抗酸化能の測定に使用する化合物（ＥＲ－ＦＴ）の製造方法は下記の通りである。
【0071】
【化8】
【0072】
【化9】
【0073】
１－（ｃａｒｂｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（０．３０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）とＮ－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（０．１９ｍＬ、１．０当量）、１－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ（ＨＯＢｔ；０．２３ｇ、１．５当量）、１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）－ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣＩ；０．２９ｇ、１．５当量）をＮ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ）５ｍＬに溶かした溶液を、常温で１５時間撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃで希釈した後、ＮａＨＣＯ３水溶液とＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物１を得る（０．４５ｇ、９８％）。
【0074】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.31-7.37 (m, 5H), 6.63 (br, 1H), 5.12-5.14 (m, 3H), 4.18-4.21 (m, 2H), 3.32-3.35 (m, 2H), 3.25-3.28 (m, 2H), 2.80～2.85 (m, 2H), 2.22-2.27 (m, 1H), 1.80～1.84 (m, 2H), 1.60～1.67 (m, 2H), 1.42 (s, 9H).
【0075】
【化10】
【0076】
化合物１（０．４５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ１０ｍＬに溶かした溶液にｐａｌｌａｄｉｕｍ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ（Ｐｄ－Ｃ；１０ｗｔ％、４５ｍｇ）を添加し、Ｈ２気体（１ａｔｍ）下、１５時間撹拌する。混合物をｃｅｌｉｔｅ層を通過させて得た濾過液を減圧蒸留して溶媒を除去する。真空乾燥して得た固体の一部（０．１５ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）とｃｙａｎｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（４８ｍｇ、１．０当量）、ＨＯＢｔ（０．１１ｇ、１．３当量）、ＥＤＣＩ（０．１４ｇ、１．３当量）、Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ；０．１５ｍＬ、１．５当量）をＤＭＦ５ｍＬに溶かした溶液を、常温で１４時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物２を得る（０．１７ｇ、９０％）。
【0077】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 6.62 (br, 1H), 4.96 (br, 1H), 4.46-4.49 (m, 1H), 3.74-3.77 (m, 1H), 3.51 (s, 2H), 3.34-3.37 (m, 2H), 3.28-3.31 (m, 2H), 3.18-3.24 (m, 1H), 2.80～2.85 (m, 1H), 2.34-2.40 (m, 1H), 1.90～1.98 (m, 2H), 1.63-1.80 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).
【0078】
【化11】
【0079】
１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（０．１２ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）と化合物２（０．１７ｇ、１．１当量）、ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（４４μＬ、１．０当量）を２－ｐｒｏｐａｎｏｌ３ｍＬに溶かした溶液を、６０℃で１６時間加熱した後、常温に冷却する。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物３を得る（０．２５ｇ、９６％）。
【0080】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = ((E)-配座異性体) 8.63 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.55 (br, 1H), 4.97 (br, 1H), 4.29 (br, 2H), 3.28-3.38 (m, 8H), 3.06 (br, 2H), 2.86 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.36-2.42 (m, 1H), 1.94-2.00 (m, 6H), 1.71-1.80 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).
【0081】
ＥＲ－ＦｒｅｓＨ Ａ
化合物３（０．２５ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ；２ｍＬ）／ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）混合溶液に溶かした後、常温で２時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去した後、残りの化合物とｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴｓＣｌ；３２ｍｇ、１．０当量）、ＤＩＥＡ（５８μＬ、２．０当量）をＤＭＦ２ｍＬに溶かした溶液を、常温で４時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、ＥＲ－ＦＲｅＳＨ Ａを得る（２３ｍｇ、２２％）。
化合物３（０．２５ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ；２ｍＬ）／ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）混合溶液に溶かした後、常温で２時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去した後、残りの化合物とｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴｓＣｌ；３２ｍｇ、１．０当量）、ＤＩＥＡ（５８μＬ、２．０当量）をＤＭＦ２ｍＬに溶かした溶液を、常温で４時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、ＥＲ－ＦＲｅＳＨ Ａを得る（２３ｍｇ、２２％）。
【0082】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = ((E)-配座異性体) 8.63 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.00 (s, 1H), 6.52 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 5.66 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 4.26 (br, 2H), 3.32-3.38 (m, 6H), 3.02-3.08 (m, 4H), 2.85 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.36-2.42 (m, 1H), 1.86-1.99 (m, 6H), 1.68-1.77 (m, 2H).
【0083】
【化12】
【0084】
【0085】
１－（ｃａｒｂｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（０．２４ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）とＮ－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－４，７，１０乃至ｔｒｉｏｘａ－１，１３－ｔｒｉｄｅｃａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（０．２８ｇ、１．０当量）、ＨＯＢｔ（０．１８ｇ、１．３当量）、ＥＤＣＩ（０．２２ｇ、１．３当量）をＤＭＦ１０ｍＬに溶かした溶液を、常温で１８時間撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃで希釈した後、ＮａＨＣＯ３水溶液とＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物４を得る（０．４９ｇ、９９％）。
【0086】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.31-7.36 (m, 5H), 6.37 (br, 1H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br, 1H), 4.17-4.23 (m, 2H), 3.57-3.64 (m, 10H), 3.52 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.35-3.39 (m, 2H), 3.19-3.23 (m, 2H), 2.81-2.86 (m, 2H), 2.20～2.26 (m, 1H), 1.73-1.83 (m, 6H), 1.61-1.68 (m, 2H), 1.43 (s, 9H).
【0087】
【化13】
【0088】
化合物４（０．４９ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ５ｍＬに溶かした溶液に、Ｐｄ－Ｃ（１０ｗｔ％、４９ｍｇ）を添加し、Ｈ２気体（１ａｔｍ）下、１４時間撹拌する。混合物をｃｅｌｉｔｅ層を通過させて得た濾過液を減圧蒸留して溶媒を除去する。真空乾燥して得た固体とｃｙａｎｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（７４ｍｇ、１．０当量）、ＨＯＢｔ（０．１７ｇ、１．３当量）、ＥＤＣＩ（０．２２ｇ、１．３当量）、ＤＩＥＡ（０．２３ｍＬ、１．５当量）をＤＭＦ５ｍＬに溶かした溶液を、常温で１２時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物５を得る（０．３４ｇ、７９％）。
【0089】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 6.53 (br, 1H), 4.95 (br, 1H), 4.43-4.47 (m, 1H), 3.75-3.79 (m, 1H), 3.57-3.66 (m, 10H), 3.53 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.52 (s, 2H), 3.36-3.39 (m, 2H), 3.18-3.23 (m, 3H), 2.81-2.87 (m, 1H), 2.33-2.39 (m, 1H), 1.87-1.94 (m, 2H), 1.73-1.82 (m, 5H), 1.64-1.72 (m, 1H), 1.44 (s, 9H).
【0090】
【化14】
【0091】
化合物５（０．１３ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（２ｍＬ）／ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）混合溶液に溶かした後、常温で３時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去した後、残りの化合物とＤＩＥＡ（０．１２ｍＬ、２．６当量）をＣＨ２Ｃｌ２ ３ｍＬに溶かした溶液を０℃に冷却する。ｐ－ＴｓＣｌ（６３ｍｇ、１．３当量）を添加した後、温度を常温に上げながら４時間撹拌する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物６を得る（６８ｍｇ、４７％）。
【0092】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.77 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.62 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.85 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.42-4.46 (m, 1H), 3.67-3.73 (m, 5H), 3.62-3.64 (m, 2H), 3.58 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.50～3.55 (m, 6H), 3.33-3.37 (m, 2H), 3.14-3.20 (m, 1H), 3.04-3.08 (m, 2H), 2.74-2.80 (m, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.35-2.41 (m, 1H), 1.82-1.91 (m, 2H), 1.58-1.80 (m, 6H).
【0093】
ＥＲ－ＦｒｅｓＨ Ｂ
１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（３０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）と化合物６（６８ｍｇ、１．１当量）、ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（１１μＬ、１．０当量）を２－ｐｒｏｐａｎｏｌ １ｍＬに溶かした溶液を、常温で１５時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、ＥＲ－ＦＴ Ｂを得る（７７ｍｇ、８６％）。
１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（３０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）と化合物６（６８ｍｇ、１．１当量）、ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（１１μＬ、１．０当量）を２－ｐｒｏｐａｎｏｌ １ｍＬに溶かした溶液を、常温で１５時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去し、残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、ＥＲ－ＦＴ Ｂを得る（７７ｍｇ、８６％）。
【0094】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = ((E)-配座異性体) 8.63 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.99 (s, 1H), 6.53 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 5.74 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.25 (br, 2H), 3.67-3.69 (m, 4H), 3.62-3.64 (m, 2H), 3.53-3.60 (m, 4H), 3.50～3.52 (m, 2H), 3.32-3.39 (m, 6H), 3.04-3.08 (m, 2H), 3.02 (br, 2H), 2.87 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.42 (s, 3H), 2.34-2.41 (m, 1H), 1.95-2.00 (m, 4H), 1.89-1.92 (m, 2H), 1.66-1.81 (m, 6H).
【0095】
【化15】
【0096】
【化16】
【0097】
１－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（０．３０ｇ、１．３ｍｍｏｌ）とＮ－ｃａｒｂｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ－ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（０．３１ｇ、１．０当量）、ＨＯＢｔ（０．２７ｇ、１．３当量）、ＥＤＣＩ（０．３３ｇ、１．３当量）、ＤＩＥＡ（０．３４ｍＬ、１．５当量）をＤＭＦ１０ｍＬに溶かした溶液を、常温で１８時間撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃで希釈した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物７を得る（０．５３ｇ、１００％）。
【0098】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.31-7.38 (m, 5H), 6.24 (br, 1H), 5.22 (br, 1H), 5.10 (s, 2H), 4.08-4.14 (m, 2H), 3.33-3.39 (m, 4H), 2.68-2.73 (m, 2H), 2.14-2.20 (m, 1H), 1.73-1.76 (m, 2H), 1.52-1.60 (m, 2H), 1.46 (s, 9H).
【0099】
【化17】
【0100】
化合物７（０．５３ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ１０ｍＬに溶かした溶液に、Ｐｄ－Ｃ（１０ ｗｔ％、５３ｍｇ）を添加し、Ｈ２気体（１ａｔｍ）下、２時間撹拌する。混合物をｃｅｌｉｔｅ層を通過させて得た濾過液を減圧蒸留して溶媒を除去する。真空乾燥して得た真空乾燥して得た固体の一部（０．１０ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（０．１３ｍＬ、２．０当量）をＣＨ２Ｃｌ２ ３ｍＬに溶かした溶液に、ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（５２μＬ、１．０当量）を添加した後、２時間撹拌する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、ＮａＨＣＯ３水溶液とＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物８を得る（０．１２ｇ、７３％）。
【0101】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.33 (br, 1H), 6.28 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.10～4.15 (m, 2H), 3.58-3.61 (m, 2H), 3.49-3.53 (m, 2H), 2.70～2.75 (m, 2H), 2.25 (tt, J = 11.6 Hz, J = 3.7 Hz, 1H), 1.77-1.80 (m, 2H), 1.52-1.61 (m, 2H), 1.45 (s, 9H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.8 (2F), -150.6 (1F), -159.9 (2F).
【0102】
【化18】
【0103】
化合物８（０．１２ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）をＨＣｌ溶液（４Ｍ、ｄｉｏｘａｎｅ）２ｍＬに溶かした後、常温で２時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去した後、残りの化合物とｃｙａｎｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（２４ｍｇ、１．０当量）、ＨＯＢｔ（５６ｍｇ、１．３当量）、ＥＤＣＩ（７０ｍｇ、１．３当量）、ＤＩＥＡ（７３μＬ、１．５当量）をＤＭＦ２ｍＬに溶かした溶液を、常温で１７時間撹拌する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物９を得る（４４ｍｇ、３７％）。
【0104】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = 8.94 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.91 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.24-4.28 (m, 1H), 3.97-4.09 (m, 2H), 3.63-3.67 (m, 1H), 3.30～3.34 (m, 2H), 3.18-3.21 (m, 2H), 3.00～3.05 (m, 1H), 2.64-2.69 (m, 1H), 2.31-2.38 (m, 1H), 1.68-1.72 (m, 2H), 1.51-1.59 (m, 1H), 1.34-1.43 (m, 1H). 19F NMR (470 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) = -141.9 (2F), -153.0 (1F), -161.4 (2F).
【0105】
ＥＲ－ＦｒｅｓＨ Ｃ
化合物９（４４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）と１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］－ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（３０ｍｇ、１．１当量）をＤＭＦ１ｍＬに溶かした溶液に、ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ（ＴＭＳＣｌ；３９μＬ、３．０当量）を添加した後、１３０℃で５時間撹拌する。常温に冷却した混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、ＥＲ－ＦＴ Ｃを得る（３３ｍｇ、４８％）。
化合物９（４４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）と１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］－ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（３０ｍｇ、１．１当量）をＤＭＦ１ｍＬに溶かした溶液に、ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ（ＴＭＳＣｌ；３９μＬ、３．０当量）を添加した後、１３０℃で５時間撹拌する。常温に冷却した混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、ＥＲ－ＦＴ Ｃを得る（３３ｍｇ、４８％）。
【0106】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = ((E)-配座異性体) 8.61 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.48 (br, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.62 (br, 1H), 4.29 (br, 2H), 3.97-4.09 (m, 2H), 3.57-3.61 (m, 2H), 3.48-3.52 (m, 2H), 3.33-3.39 (m, 4H), 3.03 (br, 2H), 2.73-2.86 (m, 4H), 2.40～2.47 (m, 1H), 1.89-2.04 (m, 6H), 1.72-1.80 (m, 2H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.7 (2F), -150.8 (1F), -159.9 (2F).
【0107】
【化19】
【0108】
【化20】
【0109】
Ｎ－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－４，７，１０乃至ｔｒｉｏｘａ－１，１３－ｔｒｉｄｅｃａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（０．１０ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、２．０当量）をＣＨ２Ｃｌ２ ３ｍＬに溶かした溶液に、ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（４４μＬ、１．０当量）を添加した後、２時間撹拌する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、ＮａＨＣＯ３水溶液とＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物１０を得る（０．１５ｇ、９４％）。
【0110】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.18 (br, 1H), 4.88 (br, 1H), 3.65 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.58-3.61 (m, 6H), 3.46-3.52 (m, 6H), 3.17-3.21 (m, 2H), 1.88-1.92 (m, 2H), 1.70～1.75 (m, 2H), 1.41 (s, 9H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.7 (2F), -151.8 (1F), -160.6 (2F).
【0111】
【化21】
【0112】
化合物１０（０．１５ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）をＨＣｌ溶液（４Ｍ、ｄｉｏｘａｎｅ）２ｍＬに溶かした後、常温で２時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去した後、残りの化合物と１－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（６９ｍｇ、１．０当量）、ＨＯＢｔ（５９ｍｇ、１．３当量）、ＥＤＣＩ（７３ｍｇ、１．３当量）、ＤＩＥＡ（７６μＬ、１．５当量）をＤＭＦ３ｍＬに溶かした溶液を、常温で１６時間撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃで希釈した後、ＮａＨＣＯ３水溶液とＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物１１を得る（０．１７ｇ、９３％）。
【0113】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.31 (br, 1H), 6.24 (br, 1H), 4.07-4.12 (m, 2H), 3.53-3.63 (m, 12H), 3.49-3.52 (m, 2H), 3.33-3.37 (m, 2H), 2.70～2.75 (m, 2H), 2.18 (tt, J = 11.6 Hz, J = 3.6 Hz, 1H), 1.88-1.92 (m, 2H), 1.73-1.81 (m, 4H), 1.52-1.60(m, 2H), 1.43 (s, 9H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.7 (2F), -151.8 (1F), -160.6 (2F).
【0114】
【化22】
【0115】
化合物１１（０．１７ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）をＨＣｌ溶液（４Ｍ、ｄｉｏｘａｎｅ）２ｍＬに溶かした後、常温で１時間撹拌する。減圧蒸留して溶媒を除去した後、残りの化合物とｃｙａｎｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（２３ｍｇ、１．０当量）、ＨＯＢｔ（５４ｍｇ、１．３当量）、ＥＤＣＩ（６７ｍｇ、１．３当量）、ＤＩＥＡ（７０μＬ、１．５当量）をＤＭＦ２ｍＬに溶かした溶液を、常温で１８時間撹拌する。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、ＮａＨＣＯ３水溶液とＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、化合物１２を得る（０．１１ｇ、６９％）。
【0116】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 7.16 (br, 1H), 6.39 (br, 1H), 4.41-4.46 (m, 1H), 3.73-3.77 (m, 1H), 3.53-3.63 (m, 12H), 3.50～3.52 (m, 4H), 3.33-3.37 (m, 2H), 3.17-3.23 (m, 1H), 2.81-2.86 (m, 1H), 2.35 (tt, J = 10.8 Hz, J = 4.0 Hz, 1H), 1.87-1.96 (m, 4H), 1.71-1.78 (m, 3H), 1.60～1.68 (m, 1H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.7 (2F), -151.6 (1F), -160.5 (2F).
【0117】
ＥＲ－ＦｒｅｓＨ Ｄ
化合物１２（５７ｍｇ、９６μｍｏｌ）と１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］－ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（２８ｍｇ、１．１当量）をＤＭＦ１ｍＬに溶かした溶液に、ＴＭＳＣｌ（１６μＬ、１．３当量）を添加した後、１３０℃で１４時間撹拌する。常温に冷却した混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、ＥＲ－ＦＴ Ｄを得る（３１ｍｇ、３８％）。
化合物１２（５７ｍｇ、９６μｍｏｌ）と１０－ｏｘｏ－２，３，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ，４Ｈ，１０Ｈ－１１－ｏｘａ－３ａ－ａｚａｂｅｎｚｏ［ｄｅ］－ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ－９－ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ（２８ｍｇ、１．１当量）をＤＭＦ１ｍＬに溶かした溶液に、ＴＭＳＣｌ（１６μＬ、１．３当量）を添加した後、１３０℃で１４時間撹拌する。常温に冷却した混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４を添加して乾燥した後、これを濾過して得た溶液を減圧蒸留して溶媒を除去する。残りの混合物をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィーで精製して、ＥＲ－ＦＴ Ｄを得る（３１ｍｇ、３８％）。
【0118】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) = ((E)-配座異性体) 8.61 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.35 (br, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.44 (br, 1H), 4.26 (br, 2H), 3.51-3.63 (m, 14H), 3.33-3.39 (m, 6H), 3.07 (br, 2H), 2.82-2.87 (m, 2H), 2.73-2.78 (m, 2H), 2.31-2.40 (m, 1H), 1.87-2.04 (m, 8H), 1.68-1.79 (m, 4H). 19F NMR (470 MHz, CDCl3): δ (ppm) = -140.6 (2F), -151.8 (1F), -160.5 (2F).
【0119】
前記製造例において、Ｒ３によるＥＲ－ＦｒｅｓＨ Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄの区分は、下記表１の通りである。
【表1】
【0120】
［実験例］実験方法
１．ＥＲ－ＦＴ（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）派生化合物（以下、化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つ）のチオール化合物とのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応
図５は、化学式ＩＶ～ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴがＵＣ－ＭＳＣの小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
１．ＥＲ－ＦＴ（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＳＨ ｇｒｏｕｐ－Ｔｒａｃｅｒ）派生化合物（以下、化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つ）のチオール化合物とのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応
図５は、化学式ＩＶ～ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴがＵＣ－ＭＳＣの小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【0121】
（１）共焦点ディッシュ（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｄｉｓｈ）に臍帯中間葉幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）の細胞およびＨｅｌｌａ細胞シーディング（ＵＣ－ＭＳＣ：５×１０４、ＨｅＬａ ｃｅｌｌ：２×１０５）後、２４時間培養する。（２）１０～２０μＭの濃度のＥＲ－ＦＴ（化学式ＩＶ～ＶＩＩ）を各細胞培地ごとに２ｍｌずつ用意する。（３）ディッシュにＥＲ－ＦＴ投与して染色後、３７℃で３０分間インキュベータで培養する。（４）１ｍＭ ＥＲ ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄを２μｌずつ入れてよく混合した後、３０分培養する。（５）培地サクション後、ＨＢＳＳ２ｍｌを添加する。
【0122】
共焦点顕微鏡により細胞を撮影し、その結果は図５の通りである。
【0123】
２．細胞毒性試験
図６は、化学式ＩＶ～ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴのＩＣ５０を示す毒性実験の結果である。
図６は、化学式ＩＶ～ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴのＩＣ５０を示す毒性実験の結果である。
【0124】
（１）ＵＣ－ＭＳＣの細胞（４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに２４時間培養した。（２）５、１０、２０、４０μＭの濃度のＥＲ－ＦＴ派生化合物（化学式ＩＶ～ＶＩＩ）２ｍｌを用意して処理した後、３７℃、２４時間培養した。（３）１０Ｘ ＥＺ－ｃｙｔｏｘ各ｗｅｌｌあたり１０μｌずつ添加して、３時間培養した。（４）プレートリーダを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（基準波長６００～６５０ｎｍ）。
【0125】
【0126】
３．ＥＲ－ＦＴ派生化合物別の細胞内保持時間の測定
図７は、化学式ＩＶ～ＶＩで表されるＥＲ－ＦＴのＵＣ－ＭＳＣの保持時間に対して、５１０ｎｍ波長の強度、５８０ｎｍ波長の強度、５１０ｎｍ、５８０ｎｍ波長の強度および両波長の強度比で測定した実験の結果である。
図７は、化学式ＩＶ～ＶＩで表されるＥＲ－ＦＴのＵＣ－ＭＳＣの保持時間に対して、５１０ｎｍ波長の強度、５８０ｎｍ波長の強度、５１０ｎｍ、５８０ｎｍ波長の強度および両波長の強度比で測定した実験の結果である。
【0127】
図８は、化学式ＩＶ、ＶＩおよびＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴのＵＣ－ＭＳＣの細胞保持時間に対して、５１０ｎｍ波長の強度、５８０ｎｍ波長の強度、５１０ｎｍ、５８０ｎｍ波長の強度および両波長の強度比で測定した実験の結果である。
【0128】
（１）９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＵＣ－ＭＳＣ４，０００個／ｗｅｌｌシーディング後、２４時間培養する。（２）１０、１５、２０μＭの濃度のＥＲ－ＦＴ（化学式ＩＶ～ＶＩ）を含む細胞培地を用意する。（３）培地サクション後、ＥＲ－ＦＴ染色を実施し、３７℃で１時間インキュベータで培養する。（４）培地サクション後、ｗｅｌｌあたりＨＢＳＳを１００μｌずつ添加する。
【0129】
オペレッタイメージング（Ｏｐｅｒｅｔｔａ ｉｍａｇｉｎｇ）の結果、図７および図８のように、ＵＣ－ＭＳＣで化学式ＩＶ、Ｖが一定の蛍光強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す。化学式ＶＩ、ＶＩＩの場合には初期蛍光強度が高いが、初期の２０分間蛍光強度が次第に減少して他のＥＲ－ＦＴに類似する強度を示した。
【0130】
【0131】
４．ＥＲ－ＦＴ派生化合物別の反応性の測定
図９は、化学式ＩＶで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、Ｄｉａｍｉｄｅを追加してＵＣ－ＭＳＣの細胞で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
図９は、化学式ＩＶで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、Ｄｉａｍｉｄｅを追加してＵＣ－ＭＳＣの細胞で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【0132】
図１０は、化学式ＩＶで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、ＤｉａｍｉｄｅおよびＤＴＴを追加してＵＣ－ＭＳＣの細胞で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【0133】
図１１は、化学式Ｖで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、Ｄｉａｍｉｄｅを追加してＵＣ－ＭＳＣの細胞の小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【0134】
図１２は、化学式Ｖで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、ＤｉａｍｉｄｅおよびＤＴＴを追加してＵＣ－ＭＳＣの細胞の小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【0135】
図１３は、化学式ＶＩで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、Ｄｉａｍｉｄｅを追加してＵＣ－ＭＳＣの小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【0136】
図１４は、化学式ＶＩで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、ＤｉａｍｉｄｅおよびＤＴＴを追加してＵＣ－ＭＳＣの小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【0137】
図１５は、化学式ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、Ｄｉａｍｉｄｅを追加してＵＣ－ＭＳＣの小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【0138】
図１６は、化学式ＶＩＩで表されるＥＲ－ＦＴ処理後、ＤｉａｍｉｄｅおよびＤＴＴを追加してＵＣ－ＭＳＣの小胞体で観察されたものを共焦点顕微鏡で撮影した図である。
【0139】
（１）共焦点ディッシュ（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｄｉｓｈ）に細胞（ＵＣ－ＭＳＣ：５×１０４）をシーディングした後、２４時間培養する。（２）１０～２０μＭの濃度のＥＲ－ＦＴ（化学式ＩＶ～ＶＩ）を含む各細胞培地を２ｍｌずつ用意する。（３）ディッシュで培地サクション後、ＥＲ－ＦＴ染色を実施し、３７℃のインキュベータで３０分間培養する。（４）１ｍＭ ＥＲ ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ２μｌずつ入れてよく混合した後、３０分間培養する。（５）培地サクション後、ＨＢＳＳ２ｍｌを添加する。（６）ＥＲターゲッティング実験後、細胞に１００ｍＭ Ｄｉａｍｉｄｅ１０μｌをレーザの当たる部分にピペットで入れる。（７）共焦点イメージングにより細胞の変化を観察する。（８）前記のような方法で１Ｍ ＤＴＴ２０ｕｌを入れる。（９）共焦点イメージングにより細胞の変化を観察する。
【0140】
図９～図１６のように、４種類のＥＲ－ＦＴ（化学式ＩＶ～ＶＩＩとも、Ｄｉａｍｉｄｅを処理すれば、５１０ｎｍの蛍光強度が減少し、５８０ｎｍの蛍光強度が増加し、ＤＴＴを処理すれば、５１０ｎｍの蛍光強度が増加し、５８０ｎｍの蛍光強度が減少する。
【0141】
本発明による化合物または組成物を用いて、生きている細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）内の小器官である小胞体（ＥＲ）およびゴルジ体の抗酸化能を測定することができる。これを幹細胞に適用して、幹細胞における抗酸化能の測定結果に応じて高活性の幹細胞を選別して細胞治療剤の効率性を増大させることができる。
【0142】
本明細書で引用したすべての参照文献、記事、公報および特許および特許出願がそのまま本明細書に参照として組み込まれている。したがって、下記の特許請求の範囲の真義および範疇は上記の好ましい実施形態の説明によって制限されてはならない。
【産業上の利用可能性】
【0143】
本発明は、小胞体（ＥＲ）内のグルタチオン測定用リアルタイム蛍光イメージングセンサおよびこれを用いる方法に関する。より詳しくは、本発明は、小胞体（ＥＲ）内のグルタチオン測定用新規化合物および前記新規化合物を用いた小胞体（ＥＲ）内のグルタチオンの測定方法に関する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【手続補正書】
【提出日】2023-02-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式Ｉで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：【化1】
前記化学式Ｉにおいて、Ｒ１は、１つ以上のＮを含む３－７員環であるヘテロシクロアルキルであり、
前記化学式Ｉで表される化合物は、下記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表されるものである。
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【請求項2】
前記化学式Ｉで表される化合物は、フリー（ｆｒｅｅ）状態で５５０～６８０ｎｍで最大放出波長を示し、チオールと結合した状態で４３０～５５０ｎｍで最大放出波長を示すものである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項3】
前記放出波長の蛍光強度は、４３０ｎｍ～６８０ｎｍの範囲で増減するものである、請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）における抗酸化能測定用組成物。
【請求項5】
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定であり、前記チオールレベルの測定にあたり、チオールが増加するにつれ、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度が減少し、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度は増加するものである、請求項４に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項6】
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定であり、前記チオールレベルの測定は、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）実施するものである、請求項４に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項7】
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定であり、前記チオールレベルの測定は、小胞体（ＥＲ）内のチオールの定性または定量的検出である、請求項４に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項8】
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定であり、前記チオールレベルの測定は、リアルタイム定量的測定である、請求項４に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項9】
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定であり、前記チオールレベルの測定は、細胞の酸化的ストレスまたは酸化度を示すものである、請求項４に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項10】
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定であり、前記チオールレベルの測定は、細胞の老化度を示すものである、請求項４に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項11】
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定であり、前記チオールは、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）、ホモシステイン（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｈｃｙ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｃｙｓ）またはタンパク質のシステイン残基にあるチオールである、請求項４に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
【請求項12】
以下のステップを含む生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法：（ａ）請求項４に記載の組成物および候補物質を同時にまたは順序に関係なく順次に生細胞に投与するステップと、
（ｂ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て標準データと比較するステップと、
（ｃ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度の、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率が減少する候補物質を、チオール抑制剤として決定し、蛍光強度の比率が増加する候補物質を、チオール増加剤として決定するステップ。
【請求項13】
請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物またはその塩を含む酸化ストレス誘発疾患診断キット。
【請求項14】
以下のステップを含む生細胞における抗酸化能の測定方法：（ａ）生細胞における４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）をリアルタイムに測定するステップと、
（ｂ）請求項４に記載の組成物を生細胞に投与するステップと、
（ｃ）酸化剤をステップ（ｂ）の細胞に投与するステップと、
（ｄ）前記蛍光強度の比率値の変化を観察するステップ。
【請求項15】
前記測定方法は、生細胞内の小器官である小胞体（ＥＲ）に対して測定するものである、請求項１４に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0143】
本発明は、小胞体（ＥＲ）内のグルタチオン測定用リアルタイム蛍光イメージングセンサおよびこれを用いる方法に関する。より詳しくは、本発明は、小胞体（ＥＲ）内のグルタチオン測定用新規化合物および前記新規化合物を用いた小胞体（ＥＲ）内のグルタチオンの測定方法に関する。
本発明の態様は以下を含む。
＜１＞
下記化学式Ｉで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
前記化学式Ｉにおいて、Ｒ １ は、１つ以上のＮを含む３－７員環であるヘテロシクロアルキルであり、前記ヘテロシクロアルキルは、Ｒ ２ 置換基が結合しており；前記Ｒ ２ は、アミド基である。
＜２＞
前記Ｒ ２ は、－（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ）－Ｒ ３ であり；
前記Ｒ ３ は、－（ＣＨ ２ ） ｍ －Ｒ ４ 、－（ＣＨ ２ ） ｍ －Ｒ ５ 、－（ＣＨ ２ ） ｎ －（ＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ） ｐ －（ＣＨ ２ ） ｑ －Ｒ ４ 、または－（ＣＨ ２ ） ｎ －（ＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ） ｐ －（ＣＨ ２ ） ｑ －Ｒ ５ であり；
ここで、前記ｍは、１－６の整数であり、前記ｎ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１－４の整数であり；
前記Ｒ ４ は、下記化学式ＩＩで表される置換基であり；
前記Ｒ ５ は、下記化学式ＩＩＩで表される置換基である、＜１＞に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
＜３＞
前記化学式Ｉで表される化合物は、下記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表されるものである、＜２＞に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
＜４＞
前記化学式Ｉで表される化合物は、フリー（ｆｒｅｅ）状態で５５０～６８０ｎｍで最大放出波長を示し、チオールと結合した状態で４３０～５５０ｎｍで最大放出波長を示すものである、＜１＞に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
＜５＞
前記放出波長の蛍光強度は、４３０ｎｍ～６８０ｎｍの範囲で増減するものである、＜４＞に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
＜６＞
＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）における抗酸化能測定用組成物。
＜７＞
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定である、＜６＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜８＞
前記チオールレベルの測定は、生細胞の細胞小器官におけるチオールレベルの測定である、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜９＞
前記細胞小器官は、小胞体（ＥＲ）である、＜８＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１０＞
前記小胞体（ＥＲ）における抗酸化能の測定は、化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つの化合物を用いるものである、＜９＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１１＞
前記チオールレベルの測定にあたり、チオールが増加するにつれ、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度が減少し、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度は増加するものである、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１２＞
前記チオールレベルの測定は、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）実施するものである、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１３＞
前記比率は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）である、＜１２＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１４＞
前記関係は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の数学的比率関係であり、前記数学的比率関係は、小胞体（ＥＲ）におけるチオールの量に応じて比率計量的（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）かつ可逆的に増減して、細胞内小器官におけるチオールの量をリアルタイムに示すものである、＜１３＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１５＞
前記チオールレベルの測定は、小胞体（ＥＲ）内のチオールの定性または定量的検出である、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１６＞
前記チオールレベルの測定は、リアルタイム定量的測定である、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１７＞
前記チオールレベルの測定は、細胞の酸化的ストレスまたは酸化度を示すものである、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１８＞
前記チオールレベルの測定は、細胞の老化度を示すものである、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１９＞
前記チオールは、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）、ホモシステイン（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｈｃｙ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｃｙｓ）またはタンパク質のシステイン残基にあるチオールである、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜２０＞
以下のステップを含む生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法：
（ａ）＜６＞に記載の組成物および候補物質を同時にまたは順序に関係なく順次に生細胞に投与するステップと、
（ｂ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て標準データと比較するステップと、
（ｃ）前記試験物質をチオール増加剤または抑制剤として決定するステップと、
（ｄ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度の、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率が減少する場合、チオール抑制剤として決定し、蛍光強度の比率が増加する場合、チオール増加剤として決定するステップ。
＜２１＞
前記（ｄ）ステップは、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）が減少する場合、チオール抑制剤として決定し、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）が増加する場合、チオール増加剤として決定するものである、＜２０＞に記載の生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法。
＜２２＞
前記蛍光比率の測定は、小胞体（ＥＲ）に対して測定するものである、＜２０＞に記載の生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法。
＜２３＞
＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の化合物またはその塩を含む酸化ストレス誘発疾患診断キット。
＜２４＞
以下のステップを含む生細胞における抗酸化能の測定方法：
（ａ）生細胞における４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）をリアルタイムに測定するステップと、
（ｂ）＜６＞に記載の組成物を生細胞に投与するステップと、
（ｃ）酸化剤をステップ（ｂ）の細胞に投与するステップと、
（ｄ）前記蛍光強度の比率値の変化を観察するステップ。
＜２５＞
前記（ａ）ステップは、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）をリアルタイムに測定するものである、＜２４＞に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
＜２６＞
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記蛍光強度の比率値が前記酸化剤を投与しない生細胞の蛍光強度の比率値または前記酸化剤を投与する前の蛍光強度の比率値に回復する時間を測定するステップを追加的に含み、前記時間が短いほど、抗酸化能が高いと判断するものである、＜２４＞に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
＜２７＞
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記酸化剤を投与しない生細胞の蛍光強度の比率値と前記酸化剤を投与した生細胞の蛍光強度の比率値との差の酸化剤投与時点から、前記酸化剤を投与する前の蛍光強度の比率値に回復する時点までの積分値を測定するステップを追加的に含み、前記積分値が小さいほど、抗酸化能が高いと判断するものである、＜２４＞に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
＜２８＞
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記酸化剤を投与した生細胞の蛍光強度の比率値が減少し始める前記酸化剤の最小濃度を滴定するステップを追加的に含み、前記最小濃度が高いほど、抗酸化能が高いと判断するものである、＜２４＞に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
＜２９＞
前記測定方法は、生細胞内の小器官である小胞体（ＥＲ）に対して測定するものである、＜２４＞に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
本発明の態様は以下を含む。
＜１＞
下記化学式Ｉで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
前記化学式Ｉにおいて、Ｒ １ は、１つ以上のＮを含む３－７員環であるヘテロシクロアルキルであり、前記ヘテロシクロアルキルは、Ｒ ２ 置換基が結合しており；前記Ｒ ２ は、アミド基である。
＜２＞
前記Ｒ ２ は、－（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ）－Ｒ ３ であり；
前記Ｒ ３ は、－（ＣＨ ２ ） ｍ －Ｒ ４ 、－（ＣＨ ２ ） ｍ －Ｒ ５ 、－（ＣＨ ２ ） ｎ －（ＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ） ｐ －（ＣＨ ２ ） ｑ －Ｒ ４ 、または－（ＣＨ ２ ） ｎ －（ＣＨ ２ ＯＣＨ ２ ） ｐ －（ＣＨ ２ ） ｑ －Ｒ ５ であり；
ここで、前記ｍは、１－６の整数であり、前記ｎ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１－４の整数であり；
前記Ｒ ４ は、下記化学式ＩＩで表される置換基であり；
前記Ｒ ５ は、下記化学式ＩＩＩで表される置換基である、＜１＞に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
＜３＞
前記化学式Ｉで表される化合物は、下記化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つで表されるものである、＜２＞に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
＜４＞
前記化学式Ｉで表される化合物は、フリー（ｆｒｅｅ）状態で５５０～６８０ｎｍで最大放出波長を示し、チオールと結合した状態で４３０～５５０ｎｍで最大放出波長を示すものである、＜１＞に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
＜５＞
前記放出波長の蛍光強度は、４３０ｎｍ～６８０ｎｍの範囲で増減するものである、＜４＞に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
＜６＞
＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む生細胞（ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ）における抗酸化能測定用組成物。
＜７＞
前記抗酸化能の測定は、生細胞におけるチオールレベルの測定である、＜６＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜８＞
前記チオールレベルの測定は、生細胞の細胞小器官におけるチオールレベルの測定である、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜９＞
前記細胞小器官は、小胞体（ＥＲ）である、＜８＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１０＞
前記小胞体（ＥＲ）における抗酸化能の測定は、化学式ＩＶ～ＶＩＩのいずれか１つの化合物を用いるものである、＜９＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１１＞
前記チオールレベルの測定にあたり、チオールが増加するにつれ、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度が減少し、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度は増加するものである、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１２＞
前記チオールレベルの測定は、４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）実施するものである、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１３＞
前記比率は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）である、＜１２＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１４＞
前記関係は、前記４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の数学的比率関係であり、前記数学的比率関係は、小胞体（ＥＲ）におけるチオールの量に応じて比率計量的（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）かつ可逆的に増減して、細胞内小器官におけるチオールの量をリアルタイムに示すものである、＜１３＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１５＞
前記チオールレベルの測定は、小胞体（ＥＲ）内のチオールの定性または定量的検出である、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１６＞
前記チオールレベルの測定は、リアルタイム定量的測定である、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１７＞
前記チオールレベルの測定は、細胞の酸化的ストレスまたは酸化度を示すものである、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１８＞
前記チオールレベルの測定は、細胞の老化度を示すものである、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜１９＞
前記チオールは、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、ＧＳＨ）、ホモシステイン（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｈｃｙ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｃｙｓ）またはタンパク質のシステイン残基にあるチオールである、＜７＞に記載の生細胞における抗酸化能測定用組成物。
＜２０＞
以下のステップを含む生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法：
（ａ）＜６＞に記載の組成物および候補物質を同時にまたは順序に関係なく順次に生細胞に投与するステップと、
（ｂ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）を得て標準データと比較するステップと、
（ｃ）前記試験物質をチオール増加剤または抑制剤として決定するステップと、
（ｄ）４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度の、５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率が減少する場合、チオール抑制剤として決定し、蛍光強度の比率が増加する場合、チオール増加剤として決定するステップ。
＜２１＞
前記（ｄ）ステップは、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）が減少する場合、チオール抑制剤として決定し、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）が増加する場合、チオール増加剤として決定するものである、＜２０＞に記載の生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法。
＜２２＞
前記蛍光比率の測定は、小胞体（ＥＲ）に対して測定するものである、＜２０＞に記載の生細胞内のチオール増加剤または抑制剤のスクリーニング方法。
＜２３＞
＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の化合物またはその塩を含む酸化ストレス誘発疾患診断キット。
＜２４＞
以下のステップを含む生細胞における抗酸化能の測定方法：
（ａ）生細胞における４３０～５５０ｎｍでの蛍光強度および５５０～６８０ｎｍでの蛍光強度の比率（ｒａｔｉｏ）をリアルタイムに測定するステップと、
（ｂ）＜６＞に記載の組成物を生細胞に投与するステップと、
（ｃ）酸化剤をステップ（ｂ）の細胞に投与するステップと、
（ｄ）前記蛍光強度の比率値の変化を観察するステップ。
＜２５＞
前記（ａ）ステップは、５１０ｎｍでの蛍光強度の、５８０ｎｍでの蛍光強度に対する比率（５１０／５８０ｒａｔｉｏ）をリアルタイムに測定するものである、＜２４＞に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
＜２６＞
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記蛍光強度の比率値が前記酸化剤を投与しない生細胞の蛍光強度の比率値または前記酸化剤を投与する前の蛍光強度の比率値に回復する時間を測定するステップを追加的に含み、前記時間が短いほど、抗酸化能が高いと判断するものである、＜２４＞に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
＜２７＞
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記酸化剤を投与しない生細胞の蛍光強度の比率値と前記酸化剤を投与した生細胞の蛍光強度の比率値との差の酸化剤投与時点から、前記酸化剤を投与する前の蛍光強度の比率値に回復する時点までの積分値を測定するステップを追加的に含み、前記積分値が小さいほど、抗酸化能が高いと判断するものである、＜２４＞に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
＜２８＞
前記抗酸化能の測定方法は、前記ステップ（ｄ）の後、前記酸化剤を投与した生細胞の蛍光強度の比率値が減少し始める前記酸化剤の最小濃度を滴定するステップを追加的に含み、前記最小濃度が高いほど、抗酸化能が高いと判断するものである、＜２４＞に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
＜２９＞
前記測定方法は、生細胞内の小器官である小胞体（ＥＲ）に対して測定するものである、＜２４＞に記載の生細胞における抗酸化能の測定方法。
【国際調査報告】