特表 2023-508674 ＣＤ１６３抗体または結合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-03

(54)【発明の名称】ＣＤ１６３抗体または結合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230224BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230224BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230224BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230224BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230224BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230224BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230224BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230224BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230224BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230224BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230224BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P31/14

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2022539134

(86)(22)【出願日】2020-12-24

(85)【翻訳文提出日】2022-07-29

(86)【国際出願番号】 GB2020053370

(87)【国際公開番号】W WO2021130502

(87)【国際公開日】2021-07-01

(31)【優先権主張番号】1919294.7

(32)【優先日】2019-12-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】508056235

【氏名又は名称】エコ アニマルヘルス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】オーウェン チャールズ

(72)【発明者】

【氏名】ベンチャオウイ ハフィド アブデラーリ

(72)【発明者】

【氏名】テイト バーカード クリスティーン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064BJ12

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA08

4B064CA09

4B064CA10

4B064CA11

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA86X

4B065AA87X

4B065AA87Y

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA43

4C085AA14

4C085CC23

4C085GG01

4C085GG08

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA05

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ブタにおけるブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス感染の治療または予防に使用するための、ブタＣＤ１６３に結合するモノクローナル抗体を提供する。好ましい抗体は、ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、アミノ酸配列ＸＹＡＤまたはＸＹＡＥまたはＸＹＡＮを含み、式中、Ｘが任意のアミノ酸であり得る、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２を含む。核酸分子、発現ベクターおよび組成物も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ブタにおけるＰＲＲＳウイルス感染の治療または予防に使用するための、ブタＣＤ１６３に結合するモノクローナル抗体。

【請求項2】

前記抗体が、ブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメインに結合する能力を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。

【請求項3】

前記抗体が、１型および／または２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害する能力を有する、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。

【請求項4】

ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、アミノ酸配列ＸＹＡＤまたはＸＹＡＥまたはＸＹＡＮを含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２を含み、式中、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくはＹ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｆ、もしくはＲ、より好ましくはＹ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、もしくはＲ、またはＹ、ＰもしくはＬ、最も好ましくはＹであり得る、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体。

【請求項5】

ブタＣＤ１６３（配列番号１１６）のアミノ酸Ｌ５２６およびＬ５２７を含むか、またはそれらに対応するブタＣＤ１６３の前記ＳＲＣＲ５ドメイン内のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体、または請求項４に記載の抗体。

【請求項6】

前記抗原結合ドメインが、配列番号１１６のアミノ酸Ｌ５２６、Ｌ５２７およびＳ５０７、もしくはＬ５２６、Ｌ５２７およびＥ５０９、もしくはＬ５２６、Ｌ５２７、Ｓ５０７およびＥ５０９を含むか、またはそれらに対応するブタＣＤ１６３の前記ＳＲＣＲ５ドメイン内のエピトープに結合する、請求項５に記載の抗体。

【請求項7】

ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号２）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＧＩＡＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＧＥＧＡＩＲＷＴＴＬＤＡＹＤＹ（配列番号４）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体、または請求項４～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号２）またはそれに実質的に相同な配列のＶＨ ＣＤＲ１であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸変化を含む配列である、ＶＨ ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）Ｘ₁ Ｉ Ｘ₃ Ｗ Ｓ Ｇ Ｒ Ａ Ｐ Ｙ Ａ Ｄ Ｓ Ｖ Ｋ Ｇ（配列番号７３）のＶＨ ＣＤＲ２であって、式中、Ｘ₁またはＸ₃が、任意のアミノ酸であり得、好ましくはＸ₁が、ＧもしくはＡであり、かつ／またはＸ₃が、ＡもしくはＳである、ＶＨ ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）Ｇ Ｅ Ｇ Ａ Ｉ Ｘ₆ Ｗ Ｔ Ｔ Ｘ₁₀ Ｘ₁₁ Ａ Ｙ Ｘ₁₄ Ｙ（配列番号７５）のＶＨ ＣＤＲ３であって、式中、Ｘ₆、Ｘ₁₀ Ｘ₁₁およびＸ₁₄が、任意のアミノ酸であり得、好ましくはＸ₆が、ＲもしくはＫもしくはＬであり、Ｘ₁₀が、ＬもしくはＰであり、Ｘ₁₁が、ＤもしくはＧであり、かつ／またはＸ₁₄が、ＤもしくはＮである、ＶＨ ＣＤＲ３と、を含む、請求項７に記載の抗体。

【請求項9】

前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＡＩＳＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＧＥＧＡＩＫＷＴＴＬＤＡＹＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項７または８に記載の抗体。

【請求項10】

前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＧＩＡＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＧＥＧＡＩＲＷＴＴＬＤＡＹＤＹ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項７または請求項８に記載の抗体。

【請求項11】

前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＧＩＡＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＧＥＧＡＩＬＷＴＴＰＧＡＹＮＹ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項７または８に記載の抗体。

【請求項12】

ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＴＹＳＭＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＡＨＲＷＳＧＳＡＹＹＡＥＨＡＤＳＶＥＧ（配列番号２７）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＧＶＧＳＡＡＱＹＲＹ（配列番号２８）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体、または請求項４～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項13】

前記重鎖可変領域が、
（ｉ）Ｘ₁ Ｘ₂ Ｓ Ｍ Ｇ（配列番号７７）のＶＨ ＣＤＲ１であって、式中、Ｘ₁またはＸ₂が、任意のアミノ酸であり得、好ましくはＸ₁が、ＴもしくはＰであり、かつ／またはＸ₂が、ＹもしくはＧである、ＶＨ ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）Ａ Ｈ Ｒ Ｗ Ｓ Ｇ Ｓ Ａ Ｙ Ｙ Ａ Ｘ₁₂ Ｘ₁₃ Ａ Ｄ Ｓ Ｖ Ｅ Ｇ（配列番号７９）のＶＨ ＣＤＲ２であって、式中、Ｘ₁₂またはＸ₁₃が、任意のアミノ酸であり得、好ましくはＸ₁₂が、ＥもしくはＤであり、かつ／またはＸ₁₃が、ＨもしくはＹである、ＶＨ ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）Ｇ Ｖ Ｇ Ｓ Ｘ₅ Ａ Ｑ Ｙ Ｘ₉ Ｙ（配列番号８１）のＶＨ ＣＤＲ３であって、式中、Ｘ₅およびＸ₉が、任意のアミノ酸であり得、好ましくはＸ₅が、ＡもしくはＥであり、かつ／またはＸ₉が、ＲもしくはＴである、ＶＨ ＣＤＲ３と、を含む、請求項１２に記載の抗体。

【請求項14】

前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＴＹＳＭＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＡＨＲＷＳＧＳＡＹＹＡＥＨＡＤＳＶＥＧ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＧＶＧＳＡＡＱＹＲＹ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項１２または１３に記載の抗体。

【請求項15】

前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＰＧＳＭＧ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＡＨＲＷＳＧＳＡＹＹＡＤＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＧＶＧＳＡＡＱＹＴＹ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項１２または１３に記載の抗体。

【請求項16】

前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＴＹＳＭＧ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＡＨＲＷＳＧＳＡＹＹＡＥＨＡＤＳＶＥＧ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＧＶＧＳＥＡＱＹＲＹ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項１２または１３に記載の抗体。

【請求項17】

ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＳＹＳＭＧ（配列番号５０）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＡＩＴＷＮＧＹＩＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５１）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＴＴＦＳＴＴＳＰＩＳＲＴＹＮＹ（配列番号５２）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体、または請求項４～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項18】

ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＴＹＡＭＧ（配列番号５８）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＩＩＳＦＧＧＴＦＹＡＤＳＶＫＧのアミノ酸配列（配列番号５９）、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＧＲＴＬＳＫＲＡＤＳＹＡＳ（配列番号６０）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体、または請求項４～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項19】

ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＭＹＡＭＳ（配列番号６６）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＡＩＮＴＳＧＲＹＳＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６７）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＴＤＫＧＮＷＡＬＡＭＳＹＤＹ（配列番号６８）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体、または請求項４～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項20】

前記抗体が、２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に阻害することができる、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体、または請求項４～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項21】

前記抗体が、２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に阻害することができ、ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＶＹＧＴＧのアミノ酸配列（配列番号８４）、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＧＩＳＧＴＴＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧのアミノ酸配列（配列番号８５）、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＧＧＲＶＹＩＴＴＳＳＷＡＹ（配列番号８６）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項２０に記載の抗体。

【請求項22】

前記抗体が、２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に阻害することができ、ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＲＹＡＭＧ（配列番号９２）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＡＩＡＷＳＴＧＳＴＹＹＡＮＳＶＫＧ（配列番号９３）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＥＴＲＹＣＳＧＦＧＣＬＤＰＲＴＹＧＳ（配列番号９４）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項２０に記載の抗体。

【請求項23】

前記抗体が、２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に阻害することができ、ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＴＤＴＭＡのアミノ酸配列（配列番号１００）、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＧＩＧＲＳＧＧＳＩＹＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号１０１）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＲＱＲＩＧＬＶＶＧＡＬＧＹＤＹ（配列番号１０２）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較し１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項２０に記載の抗体。

【請求項24】

前記抗体が、２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に阻害することができ、ブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、
（ｉ）ＤＹＴＩＧのアミノ酸配列（配列番号１０８）、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１と、
（ｉｉ）ＣＩＮＳＩＴＳＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０９）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２と、
（ｉｉｉ）ＤＳＧＬＦＳＧＳＳＣＬＫＹＲＡＭＲＦＧＳ（配列番号１１０）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前記実質的に相同な配列が、所与のＣＤＲ配列と比較して１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３と、を含む、請求項２０に記載の抗体。

【請求項25】

前記抗体が、単一ドメイン抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体、または請求項４～２４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項26】

前記抗体が、１型および２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害することができ、好ましくは前記抗体が、宿主細胞を感染させる２型ＰＲＲＳＶの能力を少なくとも５０％阻害することができ、かつ／または宿主細胞を感染させる１型ＰＲＲＳＶの能力を少なくとも５０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％阻害することができる、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体、または請求項４～１９もしくは２５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項27】

前記抗体が、２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に阻害することができ、好ましくは前記抗体が、宿主細胞を感染させる２型ＰＲＲＳＶの能力を少なくとも４０％阻害することができ、より好ましくは、前記抗体が、宿主細胞を感染させる１型ＰＲＲＳＶの能力を著しく阻害しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に好適な抗体、または請求項４～６もしくは２０～２５のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項28】

請求項７～２４のいずれか一項に記載の抗体と同じブタＣＤ１６３のエピトープに結合する抗体。

【請求項29】

請求項７～２４のいずれか一項に記載の２つ以上の抗体の組み合わせ、または請求項７～１９のいずれか一項に記載の抗体と請求項２１～２４のいずれか一項に記載の抗体との組み合わせ。

【請求項30】

請求項４～２８のいずれか一項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸分子、あるいは
そのような核酸分子を含む１つ以上の発現ベクター、あるいは前記発現ベクターもしくは核酸分子を含むか、または請求項４～２８のいずれか一項に記載の抗体を発現する１つ以上の宿主細胞。

【請求項31】

請求項４～２８のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、前記方法が、（ｉ）請求項３０で定義された、前記発現ベクターのうちの１つ以上または前記核酸配列のうちの１つ以上を含む宿主細胞を、コードされた前記抗体の発現に好適な条件下で培養する工程と、任意選択で、（ｉｉ）前記宿主細胞または増殖培地／上清から発現した前記抗体を単離または取得する工程とを含む、方法。

【請求項32】

請求項４～２８のいずれか一項に記載の抗体、または請求項２９に記載の抗体の組み合わせ、または請求項３０に記載の１つ以上の核酸分子もしくは発現ベクターを含む組成物、好ましくは医薬的に許容される組成物。

【請求項33】

治療に使用するための、好ましくはブタにおけるＰＲＲＳウイルス感染の治療または予防に使用するための、請求項４～２８のいずれか一項に記載の抗体、または請求項２９に記載の抗体の組み合わせ、または請求項３０に記載の１つ以上の核酸分子もしくは発現ベクター。

【請求項34】

ブタにおけるＰＲＲＳウイルス感染の治療または予防に使用するための薬物もしくは組成物の製造における、請求項４～２８のいずれか一項に記載の抗体、または請求項２９に記載の抗体の組み合わせ、または請求項３０に記載の１つ以上の核酸分子もしくは発現ベクターの使用。

【請求項35】

ブタにおけるＰＲＲＳウイルス感染の治療または予防の方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項４～２８のいずれか一項に記載の抗体、または請求項２９に記載の抗体の組み合わせ、または請求項３０に記載の１つ以上の核酸分子もしくは発現ベクターを投与する工程を含む、方法。

【請求項36】

１型および／または２型ＰＲＲＳＶ感染の治療または予防における、請求項３３に記載の使用のための分子、請求項３４に記載の使用、または請求項３５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、概して、ＣＤ１６３（分化抗原群１６３）に結合する結合タンパク質、具体的には抗体、特にブタのＣＤ１６３に結合する結合タンパク質および抗体の分野に関する。このような抗ＣＤ１６３結合タンパク質および抗体は、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス感染症などの感染症の治療または予防などにおいて、治療および保護に使用され、例えば、発生率および重症度を軽減する。結合タンパク質および抗体ベースの組成物、方法およびキットも提供される。

【0002】

ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は、世界で最も壊滅的なウイルス性ブタ疾患の１つであり、養豚業界に多大な経済的損失をもたらす。原因物質は、ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）であり、ニドウイルス目内のアルテリウイルス科に分類されるエンベロープＲＮＡウイルスである。ＰＲＲＳＶは、宿主と細胞の向性が制限されており、重要な標的細胞としてブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）がある。臨床症状は多様であるが、若齢ブタおよび幼い子ブタにおける呼吸困難と呼吸器疾患、後期流産と未経産ブタおよび母ブタの死産、妊娠初期の胎児の再吸収、仕上げブタの低成長などがある。妊娠の減少または喪失、幼い子ブタの死亡、およびすべてのＰＲＲＳＶ感染ブタの成長率の低下により、米国単独で豚肉生産者にとって年間６億５，０００万ドルを超える損失と推定される。

【0003】

現在知られているすべてのＰＲＲＳＶ分離株は、１型（ＰＲＲＳＶ－１）または２型（ＰＲＲＳＶ－２）の２つの遺伝子型（または種）のうちの１つに分類され、これらの両型は、長期感染および同様の臨床症状を引き起こすが、ヌクレオチドレベルではわずかに約６０％の同一性を有する。遺伝子型１はヨーロッパに由来し、ヨーロッパのＰＲＲＳＶ分離株または系統株に見られる傾向があるが、遺伝子型２は北米に由来し、アジアまたはアメリカの分離株または系統株に見られる傾向がある（Ｓｔｏｉａｎ ａｎｄ Ｒｏｗｌａｎｄ，２０１９，Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．，６，９によるレビューを参照）。各遺伝子型には大きな多様性があり、２００６年以降、特に中国およびベトナムで出現した新しい高病原性株を含む、多数の株が特定されている。同様の高病原性株は、マレーシア半島からロシア南部に広がる他の箇所でも出現しており、これらはブタ個体数に対する脅威を増大させている（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７（９）：１７８２）。中国だけでも、２００６年および２００７年にＰＲＲＳウイルス感染のために、毎年２，０００万頭を超えるブタが殺処分された（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １６（２）：３６５）。最近では、ヨーロッパで大発生を引き起こしている毒性株の症例報告は、ＰＲＲＳウイルスの出現の増加を脅威として示している（Ｓｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ（２）：２８）。

【0004】

スカベンジャー受容体ＣＤ１６３は、ＰＲＲＳＶ感染の重要な侵入メディエーターであり、したがってＰＲＲＳＶ感染において重要な役割を有する。ＣＤ１６３は、１３０ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質であり、シグナルペプチドとそれに続く９つのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインを有し、各々は長さが約１００アミノ酸で、３５アミノ酸のプロリン－セリン－スレオニン（ＰＳＴ）－リッチ領域がＳＲＣＲドメイン６（ＳＲＣＲ６）とＳＲＣＲ７を分離している。第２のＰＳＴリッチ領域は、ＳＲＣＲ９を膜貫通ドメインと、機能的な内部移行モチーフを含む短い細胞質側末端とに接続する。ＣＤ１６３の表面発現は、単球－マクロファージ系の細胞に限定されている。ＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメインは、ＰＲＲＳＶによるブタ肺胞マクロファージの感染が発生するために重要な役割を果たすことが確認されている（Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｈ，３１０１－３１０５）。

【0005】

ＰＲＲＳＶ感染の正確なメカニズムは、不明である。しかしながら、このメカニズムの一部として、ＰＲＲＳＶは細胞のエンドソーム区画に侵入すると考えられており、ＣＤ１６３とＰＲＲＳＶのＧＰ２－ＧＰ３－ＧＰ４ヘテロ三量体との相互作用により、ウイルスの脱コートおよびウイルスゲノムの細胞質への放出が仲介される。

【0006】

ＰＲＲＳＶの１つの提案された治療選択肢には、ＰＲＲＳＶ感染に耐性のあるブタを作り、次にこれらのブタを繁殖させて遺伝子組換えを広めるためのある種の遺伝子ノックアウトまたはＣＤ１６３の遺伝子編集が含まれる（Ｂｕｒｋａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７，ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ １３（２）：ｅ１００６２０６）。これは非常に効果的に機能することが示されているが、この治療は、ブタの個体数のかなりの割合を治療することができるという点から、複雑で時間がかかる。さらに、かつ重要なことに、多くの市場では、動物の遺伝子組換えを伴う技術、例えばそのような動物から生産された動物製品の望ましさに関しては、かなりの抵抗がある。

【0007】

ＰＲＲＳの経済的影響を制限するために使用される最も一般的な医学的介入は、ワクチン接種である。ワクチンは、疾患が蔓延しているすべての地域で日常的に使用されている。死滅ウイルスワクチン（ビリン）または（ほとんどの場合）改変生ワクチン（ＭＬＶ）のいずれかの、２つのタイプのワクチンが日常的に使用されている。しかしながら、現在のワクチンは部分的にしか効果がなく、バイオセキュリティと畜産の同時決定が緊密に連携している疾患管理への統合的アプローチ内で展開されるならば最も価値がある。ワクチン有効性の欠如の背後にある理由は複雑であるが、ウイルスの生物学（肺胞マクロファージの向性と高い変異性）と相まってＰＲＲＳＶ集団の高い遺伝的多様性は、ワクチン株と循環株が免疫原性の点でしっかりと一致している場合に最良の結果が見られるようなものである（Ｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１６３５によるレビュー）。さらに、生ワクチン株は、野外株と再結合して、病原性であり得る新しい野外株を産生することができる。

【0008】

現在、ＰＲＲＳＶ感染症に対する抗ウイルス治療の選択肢はない。

【0009】

したがって、かなりの数の動物の感染を治療または予防するために容易に使用することができる、ＰＲＲＳＶ感染（または他のＣＤ１６３媒介感染）のための代替の、好ましくは改善された治療および予防の選択肢への明確な必要性が存在する。

【0010】

本発明は、ＰＲＲＳＶ感染を低減または予防するように作用することができる、ブタＣＤ１６３に向けられた結合タンパク質および抗体の形態で、そのような代替の治療的または予防的選択肢の１つを提供する。

【0011】

驚くべきことに、例えば、ブタＣＤ１６３上の複数の異なるエピトープを標的とするポリクローナル抗体調製物とは対照的に、ブタＣＤ１６３上の同じエピトープを標的とする単一タイプの抗体（モノクローナル抗体）は、ＰＲＲＳＶ感染を大幅に低減または予防するのに効果的であることが示されている。さらに、これらの抗ＣＤ１６３抗体のサブセットは、１型および／または２型ＰＲＲＳＶによる感染の異なる阻害を示すことが確認されている。

【0012】

したがって、本発明者らは、ＣＤ１６３、特にブタＣＤ１６３に結合し、その活性または機能を阻害することができる抗ＣＤ１６３抗体を提供してきた。そのような抗体（または、例えば、本明細書に記載のＣＤ１６３抗原結合ドメインを含む他の結合タンパク質）は、例えば、ウイルスタンパク質などの他のタンパク質と相互作用するＣＤ１６３の能力を阻害し、それにより、ブタ肺胞マクロファージなどの細胞の感染を阻害することができる。そのような抗体（または、例えば、本明細書に記載のＣＤ１６３抗原結合ドメインを含む他の結合タンパク質）は、ブタの感染症、特にＰＲＲＳＶ感染症を治療または予防するために便利にかつ有利に使用することができる。

【0013】

一実施形態において、本発明は、ブタにおける例えばＰＲＲＳウイルス感染またはＣＤ１６３媒介感染などの感染の治療または予防に使用するために、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する結合タンパク質、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体を提供する。したがって、特に、本発明は、ブタにおけるＰＲＲＳウイルス感染の治療または予防に使用するためにブタＣＤ１６３に結合するモノクローナル抗体を提供する。しかしながら、本発明の抗体は、ＣＤ１６３が役割を果たすことが示されているブタの任意の病状の治療または予防に使用することができ、その場合、このタンパク質の結合および阻害は、有用な治療ツールとなり得る。

【0014】

本明細書の他の箇所で考察されるように、本発明の好ましい抗体（または結合タンパク質）および本明細書に記載の治療方法での使用に好適な抗体は、ＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメインに結合する能力を有し、例えば、ＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメインにエピトープを有する。さらに、好ましい抗体（または結合タンパク質）は、１型および／または２型ＰＲＲＳＶ感染、より好ましくは１型および２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害する能力を有する。さらに、いくつかの好ましい抗体は、２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害する能力を有し、好ましくは、２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に阻害する能力を有する。

【0015】

１型および／または２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害する能力
ファミリー４０
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号２）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＧＩＡＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＥＧＡＩＲＷＴＴＬＤＡＹＤＹ（配列番号４）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0016】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号１０）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＩＳＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧのアミノ酸配列（配列番号１１）、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＥＧＡＩＫＷＴＴＬＤＡＹＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0017】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号１８）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＧＩＡＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１９）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＥＧＡＩＬＷＴＴＰＧＡＹＮＹ（配列番号２０）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0018】

好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＧＩＡＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＥＧＡＩＲＷＴＴＬＤＡＹＤＹ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0019】

好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＩＳＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＥＧＡＩＫＷＴＴＬＤＡＹＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0020】

好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＲＹＶＭＧ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＧＩＡＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＥＧＡＩＬＷＴＴＰＧＡＹＮＹ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0021】

本発明のさらなる実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、Ｘ₁ Ｉ Ｘ₃ Ｗ Ｓ Ｇ Ｒ Ａ Ｐ Ｙ Ａ Ｄ Ｓ Ｖ Ｋ Ｇ（配列番号７３）のアミノ酸配列を有するか、またはそれを含む。これらの実施形態において、Ｘ₁またはＸ₃は、任意のアミノ酸であり得る。好ましくは、これらのＸ残基のうちの１つ以上、最も好ましくは、すべてが、以下の基から選択される：Ｘ₁は、ＧまたはＡであり、Ｘ₃は、ＡまたはＳである。したがって、好ましいＶＨ ＣＤＲ２は、Ｇ／ＡＩＡ／ＳＷＳＧＲＡＰＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７４）のアミノ酸配列を有するかまたは含む。例えば、この実施形態の好ましいＶＨ ＣＤＲ２配列は、配列番号３、１１または１９を有するか、またはそれらを含む。

【0022】

本発明のさらなる実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、Ｇ Ｅ Ｇ Ａ Ｉ Ｘ₆ Ｗ Ｔ Ｔ Ｘ₁₀ Ｘ₁₁ Ａ Ｙ Ｘ₁₄ Ｙ のアミノ酸配列（配列番号７５）を有するか、またはそれを含む。これらの実施形態において、Ｘ₆、Ｘ₁₀ Ｘ₁₁およびＸ₁₄は、任意のアミノ酸であり得る。好ましくは、これらのＸ残基のうちの１つ以上、最も好ましくはすべてが、以下の基から選択される：Ｘ₆は、ＲまたはＫまたはＬであり、Ｘ₁₀は、ＬまたはＰであり、Ｘ₁₁は、ＤまたはＧであり、Ｘ₁₄は、ＤまたはＮである。したがって、好ましいＶＨ ＣＤＲ３は、Ｇ Ｅ Ｇ Ａ Ｉ Ｒ／Ｋ／Ｌ Ｗ Ｔ Ｔ Ｌ／Ｐ Ｄ／Ｇ Ａ Ｙ Ｄ／Ｎ Ｙのアミノ酸配列（配列番号７６）を有するかまたは含む。例えば、この実施形態の好ましいＶＨ ＣＤＲ３配列は、配列番号４、１２、または２０を有するか、またはそれらを含む。

【0023】

さらなる実施形態において、本発明は、以下を含む抗体（または結合タンパク質）を提供する：
配列番号２のＶＨ ＣＤＲ１またはそれに実質的に相同な配列を含むＶＨ領域であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つ（好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列である、配列番号２のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号７３のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号７５のＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１は、好ましくは、配列番号２である。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、好ましくは、配列番号３、１１または１９である。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、好ましくは、配列番号４、１２または２０である。

【0024】

一実施形態において、本発明は、以下を含む抗体（または結合タンパク質）を提供する：
配列番号２のＶＨ ＣＤＲ１またはそれに実質的に相同な配列を含むＶＨ領域であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つ（好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列である、配列番号２のＶＨＣＤＲ１，配列番号７４のＣＤＲ２、および配列番号７６のＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１は、好ましくは、配列番号２である。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、好ましくは、配列番号３、１１または１９である。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、好ましくは、配列番号４、１２または２０である。

【0025】

本発明のさらなる実施形態において、抗体（または結合タンパク質）は、以下を含む：
配列番号２のＶＨ ＣＤＲ１または所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つ（好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列と、配列番号７３のＶＨ ＣＤＲ２またはそれに実質的に相同な配列と、配列番号７５のＶＨ ＣＤＲ３、またはそれに実質的に相同な配列と、を含むＶＨ領域。そのような実施形態において、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つ、好ましくは１つ、２つまたは３つ、好ましくは１つまたは２つ（より好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列である。

【0026】

本発明のさらなる実施形態において、抗体（または結合タンパク質）は、以下を含む：
配列番号２のＶＨ ＣＤＲ１または所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つ（好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列と、配列番号７４のＶＨ ＣＤＲ２またはそれに実質的に相同な配列と、配列番号７６のＶＨ ＣＤＲ３またはそれに実質的に相同な配列と、を含むＶＨ領域。そのような実施形態において、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つ、好ましくは１つ、２つまたは３つ、好ましくは１つまたは２つ（より好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列である。

【0027】

ファミリー７０
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＴＹＳＭＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＨＲＷＳＧＳＡＹＹＡＥＨＡＤＳＶＥＧ（配列番号２７）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＶＧＳＡＡＱＹＲＹ（配列番号２８）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0028】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＰＧＳＭＧ（配列番号３４）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＨＲＷＳＧＳＡＹＹＡＤＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号３５）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＶＧＳＡＡＱＹＴＹ（配列番号３６）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0029】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＴＹＳＭＧ（配列番号４２）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＨＲＷＳＧＳＡＹＹＡＥＨＡＤＳＶＥＧ（配列番号４３）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＶＧＳＥＡＱＹＲＹ（配列番号４４）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0030】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＴＹＳＭＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＨＲＷＳＧＳＡＹＹＡＥＨＡＤＳＶＥＧ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＶＧＳＡＡＱＹＲＹ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0031】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＰＧＳＭＧ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＨＲＷＳＧＳＡＹＹＡＤＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＶＧＳＡＡＱＹＴＹ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0032】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＴＹＳＭＧ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＨＲＷＳＧＳＡＹＹＡＥＨＡＤＳＶＥＧ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＶＧＳＥＡＱＹＲＹ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0033】

本発明のさらなる実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１は、Ｘ₁ Ｘ₂ Ｓ Ｍ Ｇ（配列番号７７）のアミノ酸配列を有するか、またはそれを含む。これらの実施形態において、Ｘ₁またはＸ₂は、任意のアミノ酸であり得る。好ましくは、これらのＸ残基のうちの１つ以上、最も好ましくはすべてが、以下の基から選択される：Ｘ₁は、ＴまたはＰであり、Ｘ₂は、ＹまたはＧである。したがって、好ましいＶＨ ＣＤＲ１は、Ｔ／Ｐ Ｙ／Ｇ Ｓ Ｍ Ｇ（配列番号７８）のアミノ酸配列を有するかまたは含む。例えば、この実施形態の好ましいＶＨ ＣＤＲ１配列は、配列番号２６、３４または４２を有するか、またはそれらを含む。

【0034】

本発明のさらなる実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、Ａ Ｈ Ｒ Ｗ Ｓ Ｇ Ｓ Ａ Ｙ Ｙ Ａ Ｘ₁₂ Ｘ₁₃ Ａ Ｄ Ｓ Ｖ Ｅ Ｇ（配列番号７９）のアミノ酸配列を有するか、またはそれを含む。これらの実施形態において、Ｘ₁₂またはＸ₁₃は、任意のアミノ酸であり得る。好ましくは、これらのＸ残基のうちの１つ以上、最も好ましくは、すべてが、以下の基から選択される：Ｘ₁₂は、ＥまたはＤであり、Ｘ₁₃は、ＨまたはＹである。したがって、好ましいＶＨ ＣＤＲ２は、Ａ Ｈ Ｒ Ｗ Ｓ Ｇ Ｓ Ａ Ｙ Ｙ Ａ Ｅ／Ｄ Ｈ／Ｙ Ａ Ｄ Ｓ Ｖ Ｅ Ｇ（配列番号８０）のアミノ酸配列を有するかまたは含む。例えば、この実施形態の好ましいＶＨ ＣＤＲ２配列は、配列番号２７、３５、または４３を有するか、またはそれらを含む。

【0035】

本発明のさらなる実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、Ｇ Ｖ Ｇ Ｓ Ｘ₅ Ａ Ｑ Ｙ Ｘ₉ Ｙ（配列番号８１）のアミノ酸配列を有するか、またはそれを含む。これらの実施形態において、Ｘ₅およびＸ₉は、任意のアミノ酸であり得る。好ましくは、これらのＸ残基のうちの１つ以上、最も好ましくはすべてが、以下の基から選択される：Ｘ₅は、ＡまたはＥであり、Ｘ₉は、ＲまたはＴである。したがって、好ましいＶＨ ＣＤＲ３は、Ｇ Ｖ Ｇ Ｓ Ａ／Ｅ Ａ Ｑ Ｙ Ｒ／Ｔ Ｙ（配列番号８２）のアミノ酸配列を有するかまたは含む。例えば、この実施形態の好ましいＶＨ ＣＤＲ３配列は、配列番号２８、３６または４４を有するか、またはそれらを含む。

【0036】

一実施形態において、本発明は、以下を含む抗体（または結合タンパク質）を提供する：
配列番号７７のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号７９のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号８１のＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１は、好ましくは、配列番号２６、３４または４２である。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、好ましくは、配列番号２７、３５または４３である。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、好ましくは、配列番号２８、３６または４４である。

【0037】

一実施形態において、本発明は、以下を含む抗体（または結合タンパク質）を提供する：
配列番号７８のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号８０のＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号８２のＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ領域。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１は、好ましくは、配列番号２６、３４または４２である。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２は、好ましくは、配列番号２７、３５または４３である。いくつかのそのような実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３は、好ましくは、配列番号２８、３６または４４である。

【0038】

本発明の他の実施形態において、抗体（または結合タンパク質）は、以下を含む：
配列番号７７のＶＨ ＣＤＲ１または所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つ（好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列と、配列番号７９のＶＨ ＣＤＲ２またはそれに実質的に相同な配列と、配列番号８１のＶＨ ＣＤＲ３またはそれに実質的に相同な配列と、を含むＶＨ領域。そのような実施形態において、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つ、好ましくは１つ、２つまたは３つ、好ましくは１つまたは２つ（より好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列である。

【0039】

本発明の他の実施形態において、抗体（または結合タンパク質）は、以下を含む：
配列番号７８のＶＨ ＣＤＲ１または所与のＣＤＲ配列と比較して１つまたは２つ（好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列と、配列番号８０のＶＨ ＣＤＲ２またはそれに実質的に相同な配列と、配列番号８２のＶＨ ＣＤＲ３またはそれに実質的に相同な配列と、を含むＶＨ領域。そのような実施形態において、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つ、好ましくは１つ、２つまたは３つ、好ましくは１つまたは２つ（より好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列である。

【0040】

ＣＤＲ配列のうちの１つ以上が、Ｘ_X残基（または本明細書で定義された別のタイプの代替残基）を含む本発明の実施形態において、次に、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つ、好ましくは１つ、２つまたは３つ（より好ましくは１つもしくは２つ、または１つ）のアミノ酸変化またはアミノ酸置換を含む、それに実質的に相同である配列を有するＣＤＲもまた、本発明により包含される。いくつかのそのような実施形態において、アミノ酸残基における前述の変化または置換は、Ｘ_X残基のうちの１つ以上を含み得るか、またはＸ_X残基以外の残基にあり得る。他のそのような実施形態において、前述の変化は、Ｘ_X残基と非Ｘ_X残基との混合物にある。

【0041】

クローン１５０（＃１５）
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＳＹＳＭＧ（配列番号５０）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＩＴＷＮＧＹＩＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５１）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＴＴＦＳＴＴＳＰＩＳＲＴＹＮＹ（配列番号５２）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0042】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＳＹＳＭＧ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＩＴＷＮＧＹＩＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＴＴＦＳＴＴＳＰＩＳＲＴＹＮＹ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0043】

クローン７０（＃２３）
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＴＹＡＭＧ（配列番号５８）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＩＩＳＦＧＧＴＦＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２および
（ｉｉｉ）ＧＲＴＬＳＫＲＡＤＳＹＡＳ（配列番号６０）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0044】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＴＹＡＭＧ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＩＩＳＦＧＧＴＦＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＲＴＬＳＫＲＡＤＳＹＡＳ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0045】

クローン１４４（＃１）
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＭＹＡＭＳ（配列番号６６）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＩＮＴＳＧＲＹＳＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６７）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２および
（ｉｉｉ）ＴＤＫＧＮＷＡＬＡＭＳＹＤＹ（配列番号６８）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0046】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＭＹＡＭＳ（配列番号６６）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＩＮＴＳＧＲＹＳＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６７）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＴＤＫＧＮＷＡＬＡＭＳＹＤＹ（配列番号６８）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0047】

上記のセクションに記載したすべての抗体（または結合タンパク質）は、１型および２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害する能力を有し、したがって１型および／または２型ＰＲＲＳＶ感染の治療または予防に使用することができる。

【0048】

２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害する能力
上記のように、本発明の他の抗ＣＤ１６３抗体および結合タンパク質は、２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害する能力を有し、好ましくは、２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に（または２型のみを、もしくは優先的に）阻害し、例えば、２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害するが、１型ＰＲＲＳＶ感染を阻害しない（または大幅に阻害しない）。したがって、本発明のさらなる実施形態は、２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に阻害することができる抗体（または結合タンパク質）を提供する。そのような「２型」抗体または結合タンパク質の例を以下に記載する。他の好ましい実施形態において、２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害することができるこれらの「２型」抗体および結合タンパク質は、上記の抗体との組み合わせで使用することができ、それにより１型および／または２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害することができ、好ましくは１型、または１型および２型のＰＲＲＳＶ感染を阻害することができる。

【0049】

クローン５７（＃１１）
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＶＹＧＴＧ（配列番号８４）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＧＩＳＧＴＴＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８５）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＧＲＶＹＩＴＴＳＳＷＡＹ（配列番号８６）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0050】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＶＹＧＴＧ（配列番号８４）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＧＩＳＧＴＴＧＳＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８５）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＧＧＲＶＹＩＴＴＳＳＷＡＹ（配列番号８６）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0051】

クローン４１（＃１２）
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＲＹＡＭＧ（配列番号９２）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＩＡＷＳＴＧＳＴＹＹＡＮＳＶＫＧ（配列番号９３）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＥＴＲＹＣＳＧＦＧＣＬＤＰＲＴＹＧＳ（配列番号９４）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0052】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＲＹＡＭＧ（配列番号９２）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＡＩＡＷＳＴＧＳＴＹＹＡＮＳＶＫＧ（配列番号９３）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＥＴＲＹＣＳＧＦＧＣＬＤＰＲＴＹＧＳ（配列番号９４）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0053】

クローン１７１（＃１４）
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＴＤＴＭＡのアミノ酸配列（配列番号１００）、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＧＩＧＲＳＧＧＳＩＹＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号１０１）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＲＱＲＩＧＬＶＶＧＡＬＧＹＤＹ（配列番号１０２）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0054】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＴＤＴＭＡ（配列番号１００）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＧＩＧＲＳＧＧＳＩＹＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号１０１）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＲＱＲＩＧＬＶＶＧＡＬＧＹＤＹ（配列番号１０２）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0055】

クローン２９（＃１７）
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＤＹＴＩＧ（配列番号１０８）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは２つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＣＩＮＳＩＴＳＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０９）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＤＳＧＬＦＳＧＳＳＣＬＫＹＲＡＭＲＦＧＳ（配列番号１１０）のアミノ酸配列、またはそれに実質的に相同な配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３であって、前述の実質的に相同な配列は、所与のＣＤＲ配列と比較して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を含む配列である、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0056】

さらなる実施形態において、本発明は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗原結合ドメインを含む結合タンパク質、例えば抗体を提供し、前述の抗原結合ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、以下を含む：
（ｉ）ＤＹＴＩＧ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＣＩＮＳＩＴＳＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）ＤＳＧＬＦＳＧＳＳＣＬＫＹＲＡＭＲＦＧＳ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ３。

【0057】

他の実施形態
本発明の特定の好ましい実施形態は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７もしくは６５のアミノ酸配列、またはそれらに実質的に相同な配列を有するＶＨドメインを含むＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗体（または結合タンパク質）を提供する。いくつかの実施形態において、そのような抗体（または結合タンパク質）はまた、最大３つの軽鎖ＣＤＲ、好ましくは３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む。

【0058】

好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７もしくは６５のアミノ酸配列、またはそれらに少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の同一性）を有する配列を有するＶＨドメインを含むＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗体（または結合タンパク質）を提供する。いくつかの実施形態において、そのような抗体（または結合タンパク質）はまた、最大３つの軽鎖ＣＤＲ、好ましくは３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む。

【0059】

好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７もしくは６５のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含むＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗体（または結合タンパク質）を提供する。いくつかの実施形態において、そのような抗体（または結合タンパク質）はまた、最大３つの軽鎖ＣＤＲ、好ましくは３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む。

【0060】

本発明の特定の好ましい実施形態は、配列番号８３、９１、９９もしくは１０７のアミノ酸配列、またはそれらと実質的に相同である配列を有するＶＨドメインを含むＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗体（または結合タンパク質）を提供する。いくつかの実施形態において、そのような抗体（または結合タンパク質）はまた、最大３つの軽鎖ＣＤＲ、好ましくは３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む。

【0061】

好ましい実施形態において、本発明は、配列番号８３、９１、９９もしくは１０７のアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の同一性）を有する配列を有するＶＨドメインを含むＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗体（または結合タンパク質）を提供する。いくつかの実施形態において、そのような抗体（または結合タンパク質）はまた、最大３つの軽鎖ＣＤＲ、好ましくは３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む。

【0062】

好ましい実施形態において、本発明は、配列番号８３、９１、９９もしくは１０７のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含むＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する抗体（または結合タンパク質）を提供する。いくつかの実施形態において、そのような抗体（または結合タンパク質）はまた、最大３つの軽鎖ＣＤＲ、好ましくは３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む。

【0063】

他の好ましい実施形態は、免疫グロブリン（Ｉｇ）形態、例えばＩｇＧ形態、または本明細書で定義された様々な抗体（または結合タンパク質）の免疫グロブリン定常領域、例えばＩｇＧ定常領域の全部または一部を含む形態、例えば全長ＩｇまたはＩｇＧ形態である。もちろん、完全ＩｇＧ抗体は、典型的には、２つの実質的に同一の重鎖および２つの実質的に同一の軽鎖を含むことが理解される。免疫グロブリン定常領域の一部を含む好ましい形態は、Ｆｃ領域またはドメインを含む形態、例えば、Ｆｃ融合物である。そのようなＦｃ領域またはドメインは、当技術分野で知られており、一般に、抗体重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、これらは会合してホモ二量体を形成する。これらの領域は、任意の適切な供給源もしくは種、例えば、免疫化によって抗体を産生するために使用される宿主種とは異なる供給源もしくは種、または抗体が由来する箇所とは異なるが、好ましくはブタＦｃ領域またはドメインに対応するか、または由来する供給源または種に由来し得る。このようなＦｃ領域はホモ二量体である（またはホモ二量体を形成する）ため、２つのポリペプチド鎖を二量体化するために便利に使用することができる。したがって、本発明の１つ以上の単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）をＦｃ領域の各鎖に連結または融合することにより、Ｆｃ領域の２つの鎖が二量体化する場合、それらを使用して、単一の構築物または分子において本発明の単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）の複数のコピーを提供することができる。本発明の複数の単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）が、Ｆｃ領域の各鎖に順番に連結または融合される場合、これらの抗体は、同じ抗体（例えば、同じＶＨＨの２つ以上のコピーが各鎖上に提供され得る）または異なる抗体であり得る。したがって、例えば、Ｆｃ融合物を使用して、本発明の同一の単一ドメイン抗体の複数のコピー、または本発明の異なる単一ドメイン抗体の複数のコピーを含む構築物を提供することができる。そのような構築物は、一般に、本発明の同じ抗体の複数のコピー（例えば、単一の単一ドメイン抗体もしくはＶＨＨ抗体の複数のコピー、または複数の異なる単一ドメイン抗体もしくはＶＨＨ抗体の複数のコピー）を含むので、そのような構築物は、例えば、アビディティ効果によるＣＤ１６３の結合の改善を示すことができる。

【0064】

結合タンパク質、例えば、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨまたはＩに記載の４９（＃１８）、４７（＃１９）、４８（＃２０）、７６（＃２）、７７（＃１６）、７８（＃８）、１５０（＃１５）、７０（＃２３）または１４４（＃１）抗体配列に基づく抗体が好ましい。本発明は、ＶＨＨ抗体（単一ドメイン抗体）であるモノクローナル抗体によって例示され、その配列を本明細書の表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩに示す。これらのＶＨＨ抗体の各々のＶＨ ＣＤＲドメインおよびＶＨドメインを本明細書の表Ａ～Ｉに示す。ＶＨ ＣＤＲドメイン、またはＶＨドメインのこれらのセット、またはそのようなドメインを含むＩｇＧ配列（またはそれに実質的に相同な配列）を含む抗体（または結合タンパク質）は、本発明の好ましい実施形態である。

【0065】

さらに、結合タンパク質、例えば、表１、２、３または４に記載の５７（＃１１）、４１（＃１２）、１７１（＃１４）、２９（＃１７）抗体配列に基づく抗体が好ましい。本発明は、ＶＨＨ抗体（単一ドメイン抗体）であるモノクローナル抗体によって例示され、その配列を本明細書の表１、２、３および４に示す。これらのＶＨＨ抗体の各々のＶＨ ＣＤＲドメインおよびＶＨドメインを本明細書の表１、２、３および４に示す。これらのセットのＶＨ ＣＤＲドメイン、またはＶＨドメイン、またはそのようなドメイン（またはそれに実質的に相同な配列）を含むＩｇＧ配列を含む抗体（または結合タンパク質）は、本発明の好ましい実施形態である。

【0066】

実質的に相同な配列の特定の例は、開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％または６５％の同一性を有する配列である。特定の実施形態において、本発明の抗体（または結合タンパク質）は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７または６５のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％もしくは７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％もしくは９５％、最も好ましくは少なくとも約９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。

【0067】

実質的に相同な配列の他の特定の例は、開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも６０％または６５％の同一性を有する配列である。特定の実施形態において、本発明の抗体（または結合タンパク質）は、配列番号８３、９１、９９または１０７のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％もしくは７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％もしくは９５％、最も好ましくは少なくとも約９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列領域を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。

【0068】

実質的に相同な配列の他の好ましい例は、開示されたアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む配列である。

【0069】

実質的に相同な配列の他の好ましい例は、開示されたＣＤＲ領域のうちの１つ以上またはＦＲ領域のうちの１つ以上において１つ、２つ、３つもしくは４つ、好ましくは１つ、２つもしくは３つ、好ましくは１つもしくは２つ（より好ましくは１つ）のアミノ酸変化を含む配列である。そのような変化は、保存アミノ酸置換もしくは非保存アミノ酸置換、またはそれらの混合物であり得る。

【0070】

そのような実施形態において、好ましい変化は、保存的アミノ酸置換である。

【0071】

すべての実施形態において、実質的に相同な配列を含む結合タンパク質、例えば抗体は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する能力を保持する。好ましくは、実質的に相同な配列を含む結合タンパク質、例えば抗体は、４９（＃１８）、４７（＃１９）、４８（＃２０）、７６（＃２）、７７（＃１６）、７８（＃８）、１５０（＃１５）、７０（＃２３）または１４４（＃１）抗体に関して本明細書に記載の他の特性のうちの１つ以上（好ましくはすべて）を保持する。

【0072】

すべての実施形態において、実質的に相同な配列を含む結合タンパク質、例えば抗体は、ＣＤ１６３、例えばブタＣＤ１６３に結合する能力を保持する。好ましくは、実質的に相同な配列を含む結合タンパク質、例えば抗体は、５７（＃１１）、４１（＃１２）、１７１（＃１４）または２９（＃１７）抗体に関して本明細書に記載の他の特性のうちの１つ以上（好ましくはすべて）を保持する。

【0073】

本発明による実質的に相同なアミノ酸配列のさらなる例は、本明細書の他の箇所に記載されている。

【0074】

本発明の抗体（または結合タンパク質）のＣＤＲは、好ましくは、天然に存在する抗体かつ／または有効な改変抗体に見られるものなどの適切なフレームワーク領域によって分離される。したがって、本発明のＶ_H（例えば、ＶＨＨ）、Ｖ_Lおよび個々のＣＤＲ配列は、好ましくは、抗原（本明細書ではＣＤ１６３）結合を可能にするために適切なフレームワークまたは足場内に提供されるかまたは組み込まれる。そのようなフレームワーク配列または領域は、適切な足場を形成するために必要に応じて、天然に存在するフレームワーク領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３かつ／またはＦＲ４に対応し得るか、または例えば様々な天然に存在するフレームワーク領域を比較することによって識別されるコンセンサスフレームワーク領域に対応し得る。代替的に、非抗体足場またはフレームワーク、例えば、Ｔ細胞受容体フレームワークを使用することができる。

【0075】

フレームワーク領域に使用できる適切な配列は、当技術分野でよく知られており、記述されており、これらのいずれかを使用することができる。フレームワーク領域の好ましい配列は、本発明のＶＨＨ抗体を構成するフレームワーク領域のうちの１つ以上、好ましくは、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩに開示された４９（＃１８）、４７（＃１９）、４８（＃２０）、７６（＃２）、７７（＃１６）、７８（＃８）、１５０（＃１５）、７０（＃２３）、もしくは１４４（＃１）ＶＨＨ抗体のフレームワーク領域、またはそれらに実質的に相同なフレームワーク領域、特に抗原特異性の維持を可能にするフレームワーク領域、例えば、抗体の実質的に同じかもしくは同じ３Ｄ構造をもたらすフレームワーク領域のうちの１つ以上である。

【0076】

フレームワーク領域、特に本発明の「２型」抗体のための他の好ましい配列は、本発明のＶＨＨ抗体を構成するフレームワーク領域のうちの１つ以上、好ましくは表１、２、３、および４に開示された５７（＃１１）、４１（＃１２）、１７１（＃１４）、もしくは２９（＃１７）ＶＨＨ抗体のフレームワーク領域、またはそれらと実質的に相同なフレームワーク領域、特に抗原特異性の維持を可能にするフレ－ムワーク領域、例えば、抗体の実質的に同じかもしくは同じ３Ｄ構造をもたらすフレームワーク領域のうちの１つ以上である。

【0077】

特定の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号５、６、７および８）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0078】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号１３、１４、１５および１６）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0079】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号２１、２２、２３および２４）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0080】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号２９、３０、３１および３２）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0081】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号３７、３８、３９および４０）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0082】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号４５、４６、４７および４８）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0083】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号５３、５４、５５および５６）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0084】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号６１、６２、６３および６４）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0085】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号６９、７０、７１および７２）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0086】

特定の好ましい実施形態において、特に本発明の「２型」抗体について、可変重鎖（配列番号８７、８８、８９および９０）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらと実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0087】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号９５、９６、９７および９８）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0088】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号１０３、１０４、１０５および１０６）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0089】

他の好ましい実施形態において、必要に応じて、可変重鎖（配列番号１１１、１１２、１１３および１１４）フレームワーク領域（ＦＲ）の４つすべて、またはそれらに実質的に相同なＦＲ領域が、本発明の抗体に見られる。

【0090】

上記のように、本発明は、ＣＤ１６３に結合する（または特異的に認識するか、もしくは特異的に結合する）結合タンパク質、例えば抗体を提供する。ＣＤ１６３は、Ｍ１３０、ＭＭ１３０、ＳＣＡＲ１、マクロファージ関連抗原、ヘモグロブリンスカベンジャー受容体、またはスカベンジャー受容体システインリッチ１型タンパク質Ｍ１３０としても知られている。本発明の好ましい結合タンパク質は、抗体、特にＶＨＨ抗体である。しかしながら、抗体、例えばＶＨＨ抗体に関連する本明細書に記載の実施形態は、必要な変更を加えて、他のタイプの結合タンパク質に等しく適用されるか、またはその逆である。

【0091】

好ましい結合タンパク質は、ブタのＣＤ１６３に結合する（例えば、特異的に結合する）ことができる任意の単一のポリペプチド鎖である。本発明で使用することができる適切なタイプの結合タンパク質は、当技術分野で知られている。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の抗体のＣＤＲ領域（および任意選択でＦＲ領域）を適切な足場またはフレームワーク、例えば免疫グロブリン足場上に移植することができるように、一般にＣＤＲ領域（および任意選択でＦＲ領域または免疫グロブリンベースの足場）を含む免疫グロブリンベースのポリペプチドが使用される。

【0092】

しかしながら、他の実施形態において、それ自体が特定の標的抗原（ＣＤ１６３またはブタＣＤ１６３）に特異的に結合する能力について選択することができる、非免疫グロブリンベースの一本鎖結合タンパク質／足場タンパク質を使用することができる。このような分子は、抗体ミミック（または抗体ミメティック）とも称される。適切な非免疫グロブリンベースの一本鎖結合タンパク質の例は、当技術分野で知られており、かつ記載されており、例えば、アドネクチン（例えば、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡから入手可能な化合物）；アフィマー（例えば、Ａｖａｃｔａから入手可能）；アンキリン反復タンパク質またはＤＡＲＰｉｎ（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能）；リポカリン、例えばアンチカリン（例えば、Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）；ヒトＡ－ドメイン（例えば、アビマー）；ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ（ブドウ球菌）タンパク質Ａ（例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）；チオレドキシン；およびガンマ－Ｂ－クリスタリンまたはユビイシンベースの分子、例えば、アフィリン（例えば、Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ，Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）などの、例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの第１０モジュールに基づくフィブロネクチン（またはフィブロネクチンベースの分子）を含む。そのような分子はまた、標的抗原結合を媒介する適切なＣＤＲを移植することができる足場として使用することができる。例えば、本発明の抗体のＣＤＲ領域（および任意選択でＦＲ領域）は、適切な非免疫グロブリン足場上に移植することができる。

【0093】

本発明の他の実施形態において、アプタマーなどの核酸ベースの分子は、そのような分子が、それ自体で特定の標的抗原（ＣＤ１６３またはブタＣＤ１６３）に特異的に結合する能力のために選択され得るという条件で使用され得る。したがって、結合タンパク質が本明細書で言及される場合、これらの実施形態は、核酸ベースの分子などの他のタイプの結合実体または部分に拡張することができる。

【0094】

本発明の好ましい非抗体結合タンパク質（または結合部分）は、本発明の抗ＣＤ１６３抗体と同じエピトープに結合する能力を有し、そのような結合タンパク質（または結合部分）は、例えば、参照抗体として本発明の抗体を使用して、例えば、本明細書の他の箇所に記載のような競合アッセイによって選択することができる。

【0095】

ＣＤ１６３は、１３０ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質であり、シグナルペプチドとそれに続く９つのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインを有し、各々の長さは約１００個のアミノ酸で、３５個のアミノ酸のプロリン－セリン－スレオニン（ＰＳＴ）－リッチ領域がＳＲＣＲドメイン６（ＳＲＣＲ６）とＳＲＣＲ７を分離している。第２のＰＳＴリッチ領域は、ＳＲＣＲ９を膜貫通ドメインと、機能的な内部移行モチーフを含む短い細胞質側末端とに接続する。ＣＤ１６３の表面発現は、単球－マクロファージ系の細胞に限定されている。

【0096】

本発明に特に関連するのは、ＣＤ１６３がブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）の表面に発現し、ウイルス性病原体、特にＰＲＲＳＶを含む様々な病原体がブタでの疾患を引き起こす能力において重要な役割を果たすと考えられている。

【0097】

したがって、本発明の結合タンパク質または抗体は、ＣＤ１６３に結合するか、またはＣＤ１６３に結合することができる。本発明によれば、ＣＤ１６３は、任意の種、例えば、ブタ（ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ））、ヒト、ウシ（ウシ（ｂｏｖｉｎｅ））、イヌ（イヌ（ｃａｎｉｎｅ））、ネコ（ネコ（ｆｅｌｉｎｅ））、ヒツジ（ヒツジ（ｏｖｉｎｅ））、ウマ（ウマ（ｅｑｕｉｎｅ））、マウスおよびサルなどの任意の哺乳動物種に由来し得る。好ましい実施形態において、ＣＤ１６３は、ブタＣＤ１６３であり、抗体は、ブタＣＤ１６３に結合するか、またはブタＣＤ１６３に結合することができる（または特異的に認識されるか、または特異的に結合することができる）。

【0098】

特定の実施形態において、抗体は、他の種のＣＤ１６３と交差反応すること（または結合することも）ができる。したがって、いくつかの実施形態において、抗体は、１つ以上の他の種、例えば、ＣＤ１６３の１つ以上の他の種、例えば、上記のような１つ以上の他の哺乳動物種とともに、ブタＣＤ１６３に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、ブタＣＤ１６３およびヒトＣＤ１６３にも結合することができる。言い換えれば、抗体はブタＣＤ１６３およびヒトＣＤ１６３の両方と交差反応することができる。他の実施形態において、抗体は、ブタＣＤ１６３に結合することができるが、ヒトＣＤ１６３に結合しない（または、ヒトＣＤ１６３に大幅に結合しないか、または交差反応しない）。

【0099】

本発明の結合タンパク質および抗体は、任意の適切な形態のＣＤ１６３、特にＳＲＣＲ５ドメインを含むＣＤ１６３の形態に結合することができる。したがって、そのような形態は、全長ＣＤ１６３、またはＣＤ１６３の非全長形態、例えば、ＣＤ１６３の切断型、もしくは例えばＳＲＣＲドメインのサブセットを含むが一般にＳＲＣＲ５ドメインを含むＣＤ１６３の他の変異形態を含み得る。本発明の結合タンパク質および抗体が結合することができるＣＤ１６３の好ましい便利な形態には、組換えＣＤ１６３、例えば組換えブタＣＤ１６３、または細胞表面に発現された場合のＣＤ１６３（細胞表面発現ＣＤ１６３）が含まれる。したがって、そのような細胞表面形態は、多くの場合、ＣＤ１６３の天然または天然の形態、例えば、ＣＤ１６３を自然に発現または過剰発現する細胞に見られる形態を表す。

【0100】

ＣＤ１６３を自然に発現する適切な細胞型は、当業者に周知であり、単球およびマクロファージが含まれる。好ましい細胞型は、ＰＡＭである。代替的に、ＣＤ１６３は、例えば、ＣＤ１６３を通常は発現しない細胞型において組換え手段によって（または他の工学的手段によって）発現または過剰発現され得る、言い換えれば、ＣＤ１６３の組換え形態を発現する細胞が使用され得る。

【0101】

結合タンパク質および抗体の結合能力を評価するために本明細書で使用され得るＣＤ１６３の例示的な形態、例えば、組換えＣＤ１６３は、全長ＣＤ１６３、またはＣＤ１６３－ＳＲＣＲ１～９、ＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７もしくはＣＤ１６３－ＳＲＣＲ５－６などの異なるＣＤ１６３ ＳＲＣＲドメインのサブセットを含む構築物である。ＳＲＣＲ５ドメインのすべてまたは一部（好ましくはすべて）が存在する条件で、ＣＤ１６３ ＳＲＣＲドメインと、異なるＣＤ１６３ ＳＲＣＲドメインのサブセットを含む断片との他の組み合わせを同様に使用することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＳＲＣＲ５ドメインの欠失またはドメイン内の欠失、またはドメイン内の変異を含むＣＤ１６３分子に結合しない（または大幅に結合しない）。ブタの形態は、本発明の抗体を評価するために好ましく使用されるが、他の種、例えば他の哺乳動物種からの同等の形態もまた、例えば交差反応性を評価するために使用され得る。

【0102】

様々な種のＣＤ１６３の配列は、当技術分野で周知であり、かつ記載されており、例えば、様々な配列データベース、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔから取得することができる。参照しやすいように、ブタのＣＤ１６３のＵｎｉｐｒｏｔ番号は、Ｑ２ＶＬ９０であり、ヒトのＣＤ１６３のＵｎｉｐｒｏｔ番号は、Ｑ８６ＶＢ７である。

【0103】

したがって、本発明の好ましい結合タンパク質または抗体は、ＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメインまたはＳＲＣＲ５ドメイン内のエピトープ、好ましくはブタＳＲＣＲ５ドメインに結合する能力を有する。

【0104】

ブタＳＲＣＲ５ドメインの配列を以下に示す。これは、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ２ＶＬ９０の残基４７７～５７７に対応している：ＰＲＬＶＧＧＤＩＰＣＳＧＲＶＥＶＱＨＧＤＴＷＧＴＶＣＤＳＤＦＳＬＥＡＡＳＶＬＣＲＥＬＱＣＧＴＶＶＳＬＬＧＧＡＨＦＧＥＧＳＧＱＩＷＡＥＥＦＱＣＥＧＨＥＳＨＬＳＬＣＰＶＡＰＲＰＤＧＴＣＳＨＳＲＤＶＧＶＶＣＳ（配列番号１１５）。

【0105】

ブタＣＤ１６３の配列を以下に示す。これは、ＵｎｉｐｒｏｔＱ２ＶＬ９０の全配列に対応している。
ＭＤＫＬＲＭＶＬＨＥＮＳＧＳＡＤＦＲＲＣＳＡＨＬＳＳＦＴＦＡＶＶＡＶＬＳＡＣＬＶＴＳＳＬＧＧＫＤＫＥＬＲＬＴＧＧＥＮＫＣＳＧＲＶＥＶＫＶＱＥＥＷＧＴＶＣＮＮＧＷＤＭＤＶＶＳＶＶＣＲＱＬＧＣＰＴＡＩＫＡＴＧＷＡＮＦＳＡＧＳＧＲＩＷＭＤＨＶＳＣＲＧＮＥＳＡＬＷＤＣＫＨＤＧＷＧＫＨＮＣＴＨＱＱＤＡＧＶＴＣＳＤＧＳＤＬＥＭＧＬＶＮＧＧＮＲＣＬＧＲＩＥＶＫＦＱＧＲＷＧＴＶＣＤＤＮＦＮＩＮＨＡＳＶＶＣＫＱＬＥＣＧＳＡＶＳＦＳＧＳＡＮＦＧＥＧＳＧＰＩＷＦＤＤＬＶＣＮＧＮＥＳＡＬＷＮＣＫＨＥＧＷＧＫＨＮＣＤＨＡＥＤＡＧＶＩＣＬＮＧＡＤＬＫＬＲＶＶＤＧＶＴＥＣＳＧＲＬＥＶＫＦＱＧＥＷＧＴＩＣＤＤＧＷＤＳＤＤＡＡＶＡＣＫＱＬＧＣＰＴＡＶＴＡＩＧＲＶＮＡＳＥＧＴＧＨＩＷＬＤＳＶＳＣＨＧＨＥＳＡＬＷＱＣＲＨＨＥＷＧＫＨＹＣＮＨＤＥＤＡＧＶＴＣＳＤＧＳＤＬＥＬＲＬＫＧＧＧＳＨＣＡＧＴＶＥＶＥＩＱＫＬＶＧＫＶＣＤＲＳＷＧＬＫＥＡＤＶＶＣＲＱＬＧＣＧＳＡＬＫＴＳＹＱＶＹＳＫＴＫＡＴＮＴＷＬＦＶＳＳＣＮＧＮＥＴＳＬＷＤＣＫＮＷＱＷＧＧＬＳＣＤＨＹＤＥＡＫＩＴＣＳＡＨＲＫＰＲＬＶＧＧＤＩＰＣＳＧＲＶＥＶＱＨＧＤＴＷＧＴＶＣＤＳＤＦＳＬＥＡＡＳＶＬＣＲＥＬＱＣＧＴＶＶＳＬＬＧＧＡＨＦＧＥＧＳＧＱＩＷＡＥＥＦＱＣＥＧＨＥＳＨＬＳＬＣＰＶＡＰＲＰＤＧＴＣＳＨＳＲＤＶＧＶＶＣＳＲＹＴＱＩＲＬＶＮＧＫＴＰＣＥＧＲＶＥＬＮＩＬＧＳＷＧＳＬＣＮＳＨＷＤＭＥＤＡＨＶＬＣＱＱＬＫＣＧＶＡＬＳＩＰＧＧＡＰＦＧＫＧＳＥＱＶＷＲＨＭＦＨＣＴＧＴＥＫＨＭＧＤＣＳＶＴＡＬＧＡＳＬＣＳＳＧＱＶＡＳＶＩＣＳＧＮＱＳＱＴＬＳＰＣＮＳＳＳＳＤＰＳＳＳＩＩＳＥＥＮＧＶＡＣＩＧＳＧＱＬＲＬＶＤＧＧＧＲＣＡＧＲＶＥＶＹＨＥＧＳＷＧＴＩＣＤＤＳＷＤＬＮＤＡＨＶＶＣＫＱＬＳＣＧＷＡＩＮＡＴＧＳＡＨＦＧＥＧＴＧＰＩＷＬＤＥＩＮＣＮＧＫＥＳＨＩＷＱＣＨＳＨＧＷＧＲＨＮＣＲＨＫＥＤＡＧＶＩＣＳＥＦＭＳＬＲＬＩＳＥＮＳＲＥＴＣＡＧＲＬＥＶＦＹＮＧＡＷＧＳＶＧＲＮＳＭＳＰＡＴＶＧＶＶＣＲＱＬＧＣＡＤＲＧＤＩＳＰＡＳＳＤＫＴＶＳＲＨＭＷＶＤＮＶＱＣＰＫＧＰＤＴＬＷＱＣＰＳＳＰＷＫＫＲＬＡＳＰＳＥＥＴＷＩＴＣＡＮＫＩＲＬＱＥＧＮＴＮＣＳＧＲＶＥＩＷＹＧＧＳＷＧＴＶＣＤＤＳＷＤＬＥＤＡＱＶＶＣＲＱＬＧＣＧＳＡＬＥＡＧＫＥＡＡＦＧＱＧＴＧＰＩＷＬＮＥＶＫＣＫＧＮＥＴＳＬＷＤＣＰＡＲＳＷＧＨＳＤＣＧＨＫＥＤＡＡＶＴＣＳＥＩＡＫＳＲＥＳＬＨＡＴＧＲＳＳＦＶＡＬＡＩＦＧＶＩＬＬＡＣＬＩＡＦＬＩＷＴＱＫＲＲＱＲＱＲＬＳＶＦＳＧＧＥＮＳＶＨＱＩＱＹＲＥＭＮＳＣＬＫＡＤＥＴＤＭＬＮＰＳＧＤＨＳＥＶＱ（配列番号１１６）。

【0106】

適切な形態のＣＤ１６３への結合（または結合する能力）を評価する方法は、当業者に周知であり、任意の適切な方法を使用することができる。

【0107】

結合を評価するための便利で適切な方法には、上記のような固定化形態のＣＤ１６３などの固定化抗原への抗体の結合を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイなどのインビトロ結合アッセイが含まれる。当業者は、ＥＬＩＳＡアッセイに精通しており、そのようなアッセイにおいて結合タンパク質または抗体がＣＤ１６３に結合する能力を評価するための好適な条件を容易に確立することができるであろう。特に好ましいＥＬＩＳＡアッセイは、実施例のセクションに記載されている。代替的に、または追加的に、細胞表面で発現されるＣＤ１６３への抗体の結合は、例えば、ＰＡＭまたはＣＤ１６３の組換え形態を発現する細胞、例えば、本明細書の他の箇所で記載の形態を使用するフローサイトメトリーアッセイ（例えば、ＦＡＣＳ分析）を含む任意の適切な手段によって評価することができる。特に好ましいフローサイトメトリーアッセイは、実施例のセクションに記載されている。抗体が細胞表面のＣＤ１６３に結合する能力を試験するための別の方法は、免疫組織化学である。

【0108】

特定の実施形態において、本発明の結合タンパク質または抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅアッセイ）において（決定されたように）ＣＤ１６３（例えば、ブタＣＤ１６３またはヒトＣＤ１６３）に結合する。好適なＳＰＲアッセイは、当技術分野で知られている。特定の好ましいＳＰＲアッセイにおいて、適切な形態のＣＤ１６３が、例えばアミンカップリング（例えば、２０００反応単位（ＲＵ）ＣＤ１６３が固定化されている）を介して、固体支持体（例えば、センサーチップ）上で捕捉（または固定化）され、次に、試験される結合タンパク質または抗体の様々な濃度（例えば希釈系列、例えば２倍または３倍希釈系列）が注入される。注入に好ましい濃度および流量は、例のセクションに記載されている。

【0109】

このようなＳＰＲアッセイ法は、抗体－抗原相互作用の結合速度を測定するため、例えば、結合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、親和性（ＫＤ）を決定するためにも、便利に使用することができる。特定の実施形態において、測定は、２５℃で、ｐＨ７．４の好適な緩衝液、例えば、ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって販売される、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０００５％界面活性剤Ｐ２０）などの標準的なＨＥＰＥＳ－ＥＤＴＡ緩衝液中で行われる。速度パラメータは、例えば、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、１：１の相互作用を想定したセンソグラム実験データをフィッティングすることによって、任意の好適なモデルまたはソフトウェアによって決定または計算され得る。特に好ましいＳＰＲアッセイは、本明細書の実施例のセクションに記載されている。

【0110】

したがって、特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質または抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅアッセイ）において（評価された場合、決定されるように）、ＣＤ１６３（例えば、ブタまたはヒトＣＤ１６３、好ましくはブタＣＤ１６３）に結合する。

【0111】

特定の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＶＨＨフォーマットである場合、ＣＤ１６３（例えば、ブタＣＤ１６３）に対して高い結合親和性を有し、例えば、５０ｎＭ以下（より良い）の範囲のＫ_D（平衡解離定数）を有する。

【0112】

したがって、好ましくは、本発明の抗体は、ＶＨＨフォーマットの場合、１００ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４５ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３５ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満、より好ましくは１０．０、９．５、９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５または１．０ｎＭ未満のＫ_Dに対応する、ＣＤ１６３（例えば、ブタＣＤ１６３）に対する結合親和性を有する。特定の例示的な結合親和性は、実施例に開示されている。そのような結合親和性を評価するために使用され得るＣＤ１６３の例示的な形態は、ＳＲＣＲ４－７を含む組換えブタＣＤ１６３またはＳＲＣＲ１－９を含む組換えブタＣＤ１６３である。適切な例示的な形態は、実施例のセクションに記載されており、例えば、構築物ｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７ｈｕＦｃまたはｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ１－９ｈｕＦｃである。したがって、上記の結合親和性は、本発明の抗体がこれらの構築物を使用してアッセイされるとき、またはアッセイされる場合、例えば、ＳＰＲアッセイにおいて観察され得る。

【0113】

上記のように、本発明のいくつかの実施形態において、抗体は、ブタＣＤ１６３に結合することができるが、ヒトＣＤ１６３に結合しない（または大幅に結合しない）。別の見方をすれば、それらはヒトＣＤ１６３とは対照的にブタＣＤ１６３に優先的に結合する。

【0114】

本発明の結合タンパク質または抗体の好ましい使用は、ＣＤ１６３を伴う病原体感染、中でも注目すべきはＰＲＲＳＶ感染の治療または予防においてであり、典型的には、本発明の結合タンパク質または抗体は、病原体（例えば、ＰＲＲＳＶ）感染を阻害する（または遮断もしくは低減する）、例えば、病原体、例えばＰＲＲＳＶが感染を引き起こす（例えば、適切な宿主細胞を感染させる）能力を阻害する（または遮断もしくは低減する）。好ましくは、阻害または減少は、測定可能な阻害または減少であり、より好ましくは、有意な阻害または減少、例えば、≦０．０５または＜０．０５の確率値を伴うような統計的に有意な阻害または減少である。特定の実施形態において、本発明の結合タンパク質または抗体は、宿主細胞を感染させる病原体、例えば、ＰＲＲＳＶの能力を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％阻害する（または遮断もしくは低減する）ことができる。典型的には、そのような％阻害（および本明細書に記載の他のパーセンテージ阻害レベル）は、適切な対照アッセイまたは対照レベルと比較して（または比べて）、例えば、結合タンパク質または抗体の不在下（抗ＣＤ１６３抗体）での対照アッセイまたは対照レベルである（抗ＣＤ１６３抗体）（例えば、陰性対照もしくはバックグラウンドレベルもしくはアッセイ）。したがって、０％の阻害（対照）レベル（または逆に１００％もしくは最大の感染レベル）は、典型的には、結合タンパク質または抗体（抗ＣＤ１６３抗体）の不在下のレベルである。

【0115】

感染を阻害するそのような能力は、任意の適切なアッセイで決定または試験することができ、その例は、当業者によって容易に導き出されるであろう。適切なアッセイは、例えば、インビトロまたはエクスビボアッセイであり得、例えば、本明細書の他の箇所で考察される、ＰＡＭなどのＣＤ１６３発現宿主細胞または組換えＣＤ１６３発現宿主細胞の使用を含む。このような細胞は、細胞の感染を引き起こすレベルでＰＲＲＳＶまたは他の適切な病原体と接触させることができる。適切なアッセイは、典型的には、血清、例えばブタ血清またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で行うことができる。使用する血清の適切なパーセンテージは、当業者によって容易に決定され、例えば、１０％ＦＢＳおよび８０％ブタ血清のレベルが、実施例のセクションに記載されたアッセイで使用された。次に、そのような感染を阻害または低減する本発明の結合タンパク質または抗体の能力を、例えば、対照アッセイによって設定された１００％感染レベルと比較して（または比べて）容易に分析することができる。適切で例示的な感染アッセイは、実施例のセクションに記載されている。

【0116】

感染を阻害または低減するために、任意の適切な濃度の結合タンパク質または抗体を使用することができる。本発明の例示的な抗体は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００または４００μｇ／ｍｌの濃度、例えば、２００、３００または４００μｇ／ｍｌまでの濃度、例えば５０もしくは１００および２００、３００もしくは４００μｇ／ｍｌの間の濃度で使用される場合、抗体、特にＶＨＨで、阻害、例えば本明細書に概説されている阻害レベルを引き起こす能力を有する。抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）の組み合わせが使用される場合、いくつかの実施形態におけるこれらのレベルは、存在する抗体（例えば、ＶＨＨ）の総量、すなわち存在する抗体の個々の濃度の合計を指すことができる。

【0117】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質または抗体は、感染を引き起こす（例えば、ＣＤ１６３発現宿主細胞を感染させる）ＰＲＲＳＶ１型またはＰＲＲＳＶ２型の能力を阻害する（または遮断もしくは低減する）ことができる。いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質または抗体は、感染を引き起こす（例えば、ＣＤ１６３発現宿主細胞を感染させる）１型ＰＲＲＳＶおよび２型ＰＲＲＳＶの両方の能力を阻害する（または遮断もしくは低減する）ことができる。本発明の結合タンパク質または抗体は、ＰＲＲＳＶ（または他の病原性実体）それ自体とは対照的に、宿主細胞ＣＤ１６３を標的とすることに留意されたい。これは、感染または病変形成のためにＣＤ１６３上の同じ結合領域を使用する任意のウイルス、例えばＰＲＲＳＶによる感染を阻害できるという重要な利点を提供する。このように、本発明の抗体などは、細胞を感染させるためにＣＤ１６３を使用することを条件として、高病原性株または分離株を含むＰＲＲＳＶの多くの株または分離株を遮断する手段を提供することができる。ＣＤ１６３の利用は、複数のＰＲＲＳＶ株による感染によく見られると考えられている。したがって、本発明の抗体は、幅広い有用性を有する。これは、例えば、菌株特異的であり得るＰＲＲＳＶの既知のアプローチのいくつか、例えばワクチン接種とは対照的であり、それらの有効性（またはそれらが本当に有効であるかどうか）は、菌株に応じて変化し得る。したがって、本発明の抗体は、そのような従来の方法に勝る重要な利点および柔軟性を提供する。

【0118】

本発明の好ましい抗体は、１型ＰＲＲＳＶ感染をほぼ完全に阻害する能力を有し、例えば、少なくとも９０％の阻害を観察することができる。代替的に、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、または８０％の阻害を観察することができる。いくつかの実施形態において、１型ＰＲＲＳＶ感染の少なくとも８０％の阻害、より好ましくは少なくとも８５％、９０％または９５％の阻害を示す能力を有する抗体が好ましい。

【0119】

本発明の好ましい抗体は、少なくとも５０％、少なくとも５５％もしくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％の阻害により、２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害する能力を有する。

【0120】

本発明のいくつかの好ましい抗体は、例えば、上記および本明細書の他の箇所で記載したレベルで、１型および２型ＰＲＲＳＶ感染の両方を阻害する能力を有する。このような抗体は、本明細書では「二重」抗体と称されることもある。したがって、例示的な抗体は、１型ＰＲＲＳＶの少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の阻害と組み合わせて、２型ＰＲＲＳＶの少なくとも５０％の阻害が可能であり得る。代替の例示的な抗体は、１型ＰＲＲＳＶの少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の阻害と組み合わせて、２型ＰＲＲＳＶの少なくとも５５％または６０％の阻害が可能であり得る。代替の例示的な抗体は、１型ＰＲＲＳＶの少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の阻害と組み合わせて、２型ＰＲＲＳＶの少なくとも６５％、７０％または７５％の阻害が可能であり得る。いくつかの実施形態において、本発明の好ましい抗体は、１型ＰＲＲＳＶの少なくとも９０％または９５％の阻害と組み合わせて、２型ＰＲＲＳＶの少なくとも６５％、７０％または７５％の阻害が可能であり得る。

【0121】

ＶＨＨ抗体の形態の例示的な「二重」抗体は、それぞれ、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩに示されるように、４９（＃１８）、４７（＃１９）、４８（＃２０）、７６（＃２）、７７（＃１６）、７８（＃８）、１５０（＃１５）、７０（＃２３）、および１４４（＃１）である。

【0122】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質または抗体は、宿主細胞に感染するＰＲＲＳＶ ２型の能力を阻害する（または遮断もしくは低減する）ことができる。いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質または抗体は、感染を引き起こすＰＲＲＳＶ２型の能力を特異的に阻害する（または遮断もしくは低減する）能力（例えば、ＣＤ１６３発現宿主細胞を感染させるか、または２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に阻害する）を有する。そのような結合タンパク質または抗体は、ＰＲＲＳＶ１型感染とは対照的に、ＰＲＲＳＶ２型感染を優先的に阻害または低減する。したがって、例示的な抗体は、２型ＰＲＲＳＶ感染を少なくとも４０％、４５％、または５０％阻害することができ得る（例えば、宿主細胞を感染させる２型ＰＲＲＳＶの能力を少なくとも４０％、４５％、または５０％阻害する）。

【0123】

他の実施形態において、そのような結合タンパク質または抗体は、１型ＰＲＲＳＶ感染を阻害または低減しない（例えば、大幅に阻害または低減しない）（例えば、宿主細胞を感染させる１型ＰＲＲＳＶの能力を阻害または低減しない、または大幅に阻害または低減しない）。純粋に例として、１型ＰＲＲＳＶ感染を大幅に阻害または低減しないそのような抗体は、そのような感染を１０％未満、または５％未満、または２％未満、好ましくはまったく（０％）低減し得ない。このような抗体は、本明細書では「２型特異的」または「２型のみ」の抗体と称されることがある。ＶＨＨ抗体の形態の例示的なそのような抗体は、それぞれ、表１、２、３および４に示されるように、５７（＃１１）、４１（＃１２）、１７１（＃１４）、および２９（＃１７）である。

【0124】

１型および２型ＰＲＲＳＶの阻害の比較は、適切なアッセイを使用して簡単に行うことができる。例えば、同じ濃度の試験抗体または結合タンパク質を使用して、アッセイ条件を同じに保ち、１つのアッセイは、１型ＰＲＲＳＶを使用して、別のアッセイは、２型ＰＲＲＳＶを使用して行う。そのような阻害を評価するための適切な対照もまた、本明細書の他の箇所に記載されている。

【0125】

特定の実施形態において、本発明の抗体は、３５０μｇ／ｍｌ以下、３００μｇ／ｍｌ以下、２８０μｇ／ｍｌ以下、２６０μｇ／ｍｌ以下、２４０μｇ／ｍｌ以下、２２０μｇ／ｍｌ以下、２００μｇ／ｍｌ以下、１９０μｇ／ｍｌ以下、１８０μｇ／ｍｌ以下、１７０μｇ／ｍｌ以下、１６０μｇ／ｍｌ以下、１５０μｇ／ｍｌ以下、１４０μｇ／ｍｌ以下、１３０μｇ／ｍｌ以下、１２０μｇ／ｍｌ以下、１１０μｇ／ｍｌ以下、１００μｇ／ｍｌ以下、９０μｇ／ｍｌ以下、または８０μｇ／ｍｌ以下のＩＣ₅₀（例えば、宿主細胞のＰＲＲＳＶ１感染の阻害のため、例えば、ＰＡＭ）を有する。いくつかの実施形態において、ＩＣ₅₀は、８０～３５０、３００、２５０もしくは２００μｇ／ｍｌ、または８０～１６０μｇ／ｍｌ、または８０～１２０μｇ／ｍｌ、または１００～２００μｇ／ｍｌ、または１００～１６０μｇ／ｍｌ、または１００～１２０μｇ／ｍｌである。特定の例示的なＩＣ₅₀値も実施例に示す。

【0126】

特定の実施形態において、本発明の抗体は、３００μｇ／ｍｌ以下、２８０μｇ／ｍｌ以下、２６０μｇ／ｍｌ以下、２４０μｇ／ｍｌ以下、２２０μｇ／ｍｌ以下、２１０μｇ／ｍｌ以下、２００μｇ／ｍｌ以下、１８０μｇ／ｍｌ以下、１７０μｇ／ｍｌ以下、１６０μｇ／ｍｌ以下、１５０μｇ／ｍｌ以下、１４０μｇ／ｍｌ以下、１３０μｇ／ｍｌ以下、１２０μｇ／ｍｌ以下、１１０μｇ／ｍｌ以下または１００μｇ／ｍｌ以下のＩＣ₅₀（例えば、宿主細胞のＰＲＲＳＶ２感染の阻害のため、例えば、ＰＡＭ）を有する。いくつかの実施形態において、ＩＣ₅₀は、１００もしくは１５０もしくは２００～３００μｇ／ｍｌ、または２００～２６０μｇ／ｍｌ、または２００～２２０μｇ／ｍｌ、または２２０～３００μｇ／ｍｌ、または２２０～２６０μｇ／ｍｌ、または２２０～２４０μｇ／ｍｌである。特定の例示的なＩＣ₅₀値も実施例に示す。

【0127】

上記の好ましいＩＣ₅₀値は、好ましくは、適切なウイルス感染性アッセイ、例えば上記または実施例のセクションで決定されるものである。

【0128】

本明細書に記載の二重抗体は、２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害する良好な能力を示すが、２型ＰＲＲＳＶ感染の阻害は、１型ＰＲＲＳＶ感染の阻害について観察されるレベルほど完全ではないか、またはそれほど高いレベルに達しないことが一般に観察される。理論に縛られることを望まないが、２型感染に関与するＣＤ１６３上に複数のエピトープが存在する可能性がある。したがって、本発明の好ましい実施形態において、例えば本明細書に記載の二重抗体および２型特異抗体は、組み合わせて使用することができる。このような組み合わせは、２型ＰＲＲＳＶ感染症の治療または予防が必要または望まれる場合に特に有用であり得る。

【0129】

本発明の代替の実施形態において、本発明の結合タンパク質または抗体を使用して、ＰＲＲＳＶ感染のリスクを低減するか、または予防することができる。

【0130】

好ましくは、上記の能力および特性は、適切な対照レベルと比較した場合、測定可能または有意なレベルで、より好ましくは統計的に有意なレベルで観察される。適切な有意水準については、本書の他の箇所で考察される。より好ましくは、上記の能力および特性のうちの１つ以上は、従来技術の抗体について観察された能力と比較した場合、測定できるほど優れている、またはより好ましくは大幅に優れている（好ましくは統計的に大幅に優れている）レベルで観察される。

【0131】

本明細書で言及する任意の統計分析において、好ましくは、関連する対照もしくは他の比較エンティティもしくは測定値に対する統計的に有意差は、≦０．１または＜０．１、好ましくは≦０．０５または＜０．０５の確率値を有する。統計的有意性を決定する適切な方法は、当技術分野で周知であり、記述されており、これらのいずれかを使用することができる。

【0132】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質または抗体は、本明細書に記載の機能特性、特に好ましい機能特性のうちの１つ以上、好ましくは２つ以上、または３つ以上、最も好ましくはすべてを有する。

【0133】

出願書類全体で使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という用語は、上限がその後具体的に述べられている場合を除いて、参照される「少なくとも１つ」、「少なくとも第１の」、「１つ以上」、または「複数」の成分または工程を意味するという意味で使用される。したがって、本明細書で使用される場合、「抗体」とは、「少なくとも一次抗体」を意味する。

【0134】

さらに、「含む」、「含む」、「有する」または「有する」という用語、または他の同等の用語が本明細書で使用される場合、いくつかのより具体的な実施形態において、例えば、本明細書におけるＣＤＲまたはＦＲ配列の定義において、これらの用語には、「からなる」または「本質的にからなる」という用語、または他の同等の用語が含まれる。

【0135】

本明細書で定義された本発明の結合タンパク質または抗体もしくはその部分もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれに実質的に相同な核酸分子は、本発明のさらに別の態様を形成する。

【0136】

好ましい核酸分子は、本発明のＶＨＨ抗体またはＶＨ領域もしくはドメインをコードするもの（例えば、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７または６５をコードするもの）である。他の好ましい核酸分子は、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨまたはＩのいずれか１つで定義された３つのＣＤＲ配列のセットをコードするものである。好ましいそのような核酸分子はまた、適切なフレームワーク領域、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４領域、好ましくは、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨまたはＩのいずれか１つで定義されたＦＲ配列のセットをコードする。

【0137】

他の実施形態において、好ましい核酸分子は、本発明のＶＨＨ抗体またはＶＨ領域もしくはドメインをコードするもの（例えば、配列番号８３、９１、９９または１０７をコードするもの）である。他の好ましい核酸分子は、表１、２、３または４のいずれか１つで定義された３つのＣＤＲ配列のセットをコードするものである。好ましいそのような核酸分子はまた、適切なフレームワーク領域、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４領域、好ましくは、表１、２、３または４のいずれか１つで定義されたＦＲ配列のセット（例えば、本発明の２型特異抗体）をコードする。

【0138】

アミノ酸または核酸配列に関連して本明細書で使用される場合、「実質的に相同」という用語は、開示されたアミノ酸または核酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％または７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。したがって、本発明の実質的に相同な配列は、本発明の配列への単一もしくは複数の塩基またはアミノ酸の変化（付加、置換、挿入または欠失）を含む。アミノ酸レベルでは、好ましい実質的に相同な配列は、本発明の配列を構成するフレームワーク領域のうちの１つ以上および／またはＣＤＲのうちの１つ以上において、最大５つ、例えば、わずかに１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ、好ましくは１つ、２つ、３つまたは４つ、好ましくは１つ、２つまたは３つ、より好ましくは１つまたは２つのアミノ酸変化を含む。前述の変化は、保存的または非保存的アミノ酸にあり得る。好ましくは、前述の変化は、置換、好ましくは保存的アミノ酸置換である。

【0139】

特定の実施形態において、所与の開始配列が比較的短い（例えば、長さが５アミノ酸）場合、配列において任意選択で行われ得るアミノ酸置換の数と比較して、それに実質的に相同な配列においてより少ないアミノ酸置換が存在し得る。より長い開始配列と実質的に相同である。例えば、特定の実施形態において、本発明による開始ＶＨ ＣＤＲ１配列に実質的に相同な配列は、例えば、いくつかの実施形態において、長さが５アミノ酸残基であり得る開始ＶＨ ＣＤＲ１配列は、開始配列と比較して、好ましくは１つまたは２つ（より好ましくは１つ）のアミノ酸変化を有する。したがって、いくつかの実施形態において、実質的に相同な配列（例えば、実質的に相同なＣＤＲ配列）におけるアミノ酸変化の数は、所与の開始ＣＤＲ配列の長さに合わせて調整することができる。例えば、ＣＤＲにおいて特定の％配列同一性、例えば、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を達成するために、所与の開始ＣＤＲ配列の長さに応じて、異なる数のアミノ酸変化が存在し得る。

【0140】

アラニンスキャニング変異誘発および／または抗原－抗体複合体の結晶構造の分析などの当技術分野の日常的な方法を使用して、ＣＤＲのどのアミノ酸残基が抗原結合に寄与しないか、または大幅に寄与しないかを決定することができ、したがって、実質的に相同な配列に関与する本発明の実施形態における変化または置換の良好な候補である。

【0141】

新しい抗体を形成するための親抗体のアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸の付加、削除、置換、または挿入が同定されると、前述の親抗体は、本明細書の他の箇所で定義された本発明の抗体の１つであり、得られた新しい抗体を試験して、本発明に従ってＣＤ１６３に結合する抗体を同定することは、当技術分野で日常的である技術を使用して行われ得る。このような方法を使用して、複数の新しい抗体を形成することができ、ＣＤ１６３に結合するそれらの能力についてすべてを試験することができる。好ましくは、１つ以上のアミノ酸の前述の付加、欠失、置換または挿入は、ＣＤＲドメインのうちの１つ以上で起こる。

【0142】

例えば、前述の操作は、適切な結合タンパク質およびそのドメインをコードする核酸分子が、結果として生じる発現タンパク質のアミノ酸配列が次に適切な方法で修飾されるように修飾される、核酸レベルでの遺伝子工学によって便利に実行され得る。ＣＤ１６３に結合する修飾抗体のうちの１つ以上の能力を試験することは、当技術分野で周知であり、記載されている任意の適切な方法によって行われ得る。好適な方法は、本明細書の他の箇所および実施例のセクションにも記載されている。

【0143】

これらの方法によって産生され、取得され、または取得可能な新しい抗体は、本発明のさらなる態様を形成する。

【0144】

「実質的に相同である」という用語はまた、実質的に同じ方法で本発明のタンパク質または核酸分子と実質的に同じ機能を実行する本発明のアミノ酸およびヌクレオチド配列の変更または化学的同等物を含む。例えば、任意の実質的に相同な抗体は、上記のようにＣＤ１６３に結合する能力を保持しなければならない。好ましくは、任意の実質的に相同な抗体は、出発抗体の機能的能力のうちの１つ以上（またはすべて）を保持しなければならない。

【0145】

好ましくは、任意の実質的に相同な抗体は、問題の開始抗体によって認識されるＣＤ１６３の同じエピトープ、例えば、本明細書に記載の本発明の抗体のうちの１つ以上のＣＤＲドメインまたは本発明のＶＨ（ＶＨＨ）ドメインによって認識される同じエピトープに特異的に結合する、例えば、本発明の様々な抗体のうちの１つ以上（例えば、それぞれ、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｇ、およびＩに示されるＶＨＨ抗体４９（＃１８）、４７（＃１９）、４８（＃２０）、７６（＃２）、７７（＃１６）、７８（＃８）、１５０（＃１５）、７０（＃２３）、または１４４（＃１）のうちの１つ以上）と同じエピトープに結合する能力を保持しなければならない。したがって、好ましくは、任意の実質的に相同な抗体は、好適なアッセイにおいて、ＣＤ１６３への結合のために、本発明の様々な抗体（例えば、それぞれ、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｇ、およびＩに示されるＶＨＨ抗体４９（＃１８）、４７（＃１９）、４８（＃２０）、７６（＃２）、７７（＃１６）、７８（＃８）、１５０（＃１５）、７０（＃２３）、または１４４（＃１））のうちの１つ以上と競合する能力を保持しなければならない。

【0146】

他の実施形態において、任意の実質的に相同な抗体は、問題の開始抗体によって認識されるＣＤ１６３の同じエピトープ、例えば、本明細書に記載の本発明の１つ以上の抗体のＣＤＲドメインまたは本発明のＶＨ（ＶＨＨ）ドメインによって認識される同じエピトープに特異的に結合する、例えば、本発明の様々な２型抗体のうちの１つ以上（例えば、それぞれ、表１、２、３、および４に示されるＶＨＨ抗体５７（＃１１）、４１（＃１２）、１７１（＃１４）、または２９（＃１７）のうちの１つ以上）と同じエピトープに結合する能力を保持しなければならない。したがって、好ましくは、任意の実質的に相同な抗体は、ＣＤ１６３への結合のために、本発明の様々な２型抗体（例えば、それぞれ、表１、２、３および４に示されるＶＨＨ抗体５７（＃１１）、４１（＃１２）、１７１（＃１４）、または２９（＃１７）、例えば、本発明の２型特異抗体）のうちの１つ以上と競合する能力を保持しなければならない。

【0147】

同じエピトープ／抗原への結合は、当技術分野で周知であり、記載されている方法によって、例えば、結合アッセイ、例えば、競合アッセイを使用するか、または抗原－抗体複合体の結晶構造の分析によって、容易に試験することができる。他の機能特性の保持もまた、当技術分野で周知であり、記載されている方法、または本明細書に記載の方法によって容易に試験することができる。

【0148】

したがって、当業者は、結合アッセイ、例えば、本明細書の他の箇所に記載の競合アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイなどの結合アッセイを使用して、任意の抗体、例えば「実質的に相同な」抗体が同じ結合特異性を有するかどうか、例えば、本発明の抗体および抗体断片と同じエピトープに結合するか、または同じもしくは同等の親和性を有するかどうかを試験することができることを理解するであろう。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイはまた、抗体、例えば「実質的に相同な」抗体がＣＤ１６３に結合することができるかどうかを確立するために容易に使用することができる。当業者は、他の好適な方法および変形を認識するであろう。

【0149】

以下に概説するように、競合結合アッセイを使用して、抗体、例えば「実質的に相同な」抗体が、本明細書の様々な配列表に示すように本発明の抗体のうちの１つ以上によって認識されるＣＤ１６３の実質的に同じエピトープに特異的に結合する能力を保持するかどうか、または本明細書の様々な配列表に示すように本発明の様々な抗体のうちの１つ以上と競合する能力を有するかどうかを試験することができる。以下に説明する方法は、好適な競合アッセイの一例にすぎない。当業者は、他の好適な方法および変形を認識するであろう。

【0150】

例示的な競合アッセイは、様々な濃度の試験抗体（例えば、実質的に相同な抗体）の存在下でのＣＤ１６３への本発明の抗体の様々な有効濃度の結合を評価することを含む。次に、試験抗体によって誘導される結合の阻害の量を評価することができる。濃度の増加で本発明の抗体との競合の増加を示す試験抗体（すなわち、試験抗体の濃度の増加は、ＣＤ１６３に結合する本発明の抗体の量の対応する減少をもたらす）は、実質的に同じエピトープへの結合の証拠である。好ましくは、試験抗体は、ＣＤ１６３に結合する本発明の抗体の量を大幅に低減する。好ましくは、試験抗体は、ＣＤ１６３に結合する本発明の抗体の量を少なくとも約９５％低減する。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイは、そのような競合アッセイにおいて結合の阻害を評価するために使用され得るが、他の好適な技術も、当業者に周知であろう。

【0151】

本発明の抗体（例えば、それぞれ、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩに示されるように、ＶＨＨ抗体４９（＃１８）、４７（＃１９）、４８（＃２０）、７６（＃２）、７７（＃１６）、７８（＃８）、１５０（＃１５）、７０（＃２３）、または１４４（＃１））によって認識される、ＣＤ１６３の実質的に同じ（または同じ）エピトープもしくはＣＤ１６３の重複するエピトープに特異的に結合する能力を有し、または本発明の様々な抗体（例えば、それぞれ、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩに示されるように、ＶＨＨ抗体４９（＃１８）、４７（＃１９）、４８（＃２０）、７６（＃２）、７７（＃１６）、７８（＃８）、１５０（＃１５）、７０（＃２３）、または１４４（＃１））のうちの１つ以上と競合する能力を有するそのような抗体（モノクローナル抗体）は、本発明のさらなる実施形態である。

【0152】

別の実施形態において、本発明の抗体（例えば、それぞれ、表１、２、３および４に示されるように、ＶＨＨ抗体５７（＃１１）、４１（＃１２）、１７１（＃１４）、または２９（＃１７））によって認識される、ＣＤ１６３の実質的に同じ（または同じ）エピトープまたはＣＤ１６３の重複するエピトープに特異的に結合する能力を有し、あるいは本発明の様々な抗体（例えば、それぞれ、表１、２、３および４に示されるように、ＶＨＨ抗体５７（＃１１）、４１（＃１２）、１７１（＃１４）、または２９（＃１７）、例えば、本発明の２型特異抗体）のうちの１つ以上と競合する能力を有するそのような抗体（モノクローナル抗体）は、本発明のさらなる実施形態である。いくつかの実施形態において、好ましいそのような抗体は、表３に概説されている配列番号９９（または前述の配列に関連する３つのＣＤＲ配列）を含むＶＨＨ抗体１７１（＃１４）である。

【0153】

本明細書で使用される場合、「競合抗体」という用語は、「参照抗体」とほぼ実質的にもしくは本質的に同じ、または同じエピトープにも結合する抗体を指す。「競合する抗体」には、重複するエピトープ特異性を有する抗体が含まれる。したがって、競合する抗体は、ＣＤ１６３への結合について参照抗体と効果的に競合することができる。好ましくは、競合する抗体は、参照抗体と同じエピトープに結合することができる。代替的に、競合する抗体は、好ましくは、参照抗体と同じエピトープ特異性を有する。

【0154】

本明細書で使用される場合、「参照抗体」とは、本発明に従ってＣＤ１６３に結合することができる抗体であり、好ましくは本明細書で定義されたＶＨドメインを有し、より好ましくはＶＨドメインを有するか、または表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、またはＩに概説されている配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、または６５（または前述の配列の関連する３つのＣＤＲ配列）を含むＶＨＨ抗体である。

【0155】

本明細書で使用される場合、他の「参照抗体」とは、本発明に従ってＣＤ１６３に結合することができる抗体であり、好ましくは本明細書で定義されたＶＨドメインを有し、より好ましくはＶＨドメインを有するか、または表１、２、３または４（例えば、本発明の２型特異抗体）に概説されている配列番号８３、９１、９９または１０７（または前述の配列の関連する３つのＣＤＲ配列）を含むＶＨＨ抗体である。いくつかの実施形態において、好ましい参照抗体は、表３に概説されている配列番号９９（または前述の配列の関連する３つのＣＤＲ配列）を含むＶＨＨ抗体である。

【0156】

１つ以上の競合する抗体または同じエピトープに結合する抗体の同定は、現在、簡単な技術的問題であり、本明細書の配列表に概説されているような参照抗体が提供されている。競合する抗体または同じエピトープに結合する抗体の同定は、参照抗体と比較して決定するこことができるので、一方または両方の抗体が結合するエピトープを実際に決定することは、競合する抗体または同じエピトープに結合する抗体を同定するために、いかなる方式であっても必要とされないことが理解されよう。しかしながら、必要に応じて、標準的な手法を使用してエピトープマッピングを行うことができる。

【0157】

配列番号１１５に記載のブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメインと、ＶＨＨ抗体１７１（＃１４）、すなわち表３に示した、アミノ酸配列（配列番号１７’または９９）を有するＶＨＨ ０１４（２Ｄ０１）との間の抗原－抗体複合体の結晶構造の分析を、この抗体が結合するＣＤ１６３内の領域（エピトープ）を決定するために行われている（図６を参照）。抗原結合に寄与するブタＣＤ１６３上の残基は、ブタＣＤ１６３のＳ５０７、Ｅ５０９、Ｌ５２６、およびＬ５２７として同定されている（配列番号１１６に記載のＵｎｉｐｒｏｔ Ｑ２ＶＬ９０配列を参照）。結晶構造は、Ｓ５０７およびＥ５０９がＶＨＨ ０１４（２Ｄ０１）のＬ１０４と相互作用し、Ｌ５２６がＶＨＨ ０１４（２Ｄ０１）のＹ５９と相互作用し、Ｌ５２７がＶＨＨ ０１４（２Ｄ０１）のＤ６２と相互作用することを示している。

【0158】

ＣＤ１６３のエピトープ
したがって、さらなる態様は、ブタＣＤ１６３に結合または特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗体（または結合タンパク質）を提供し、前述の抗体（抗原結合ドメイン）は、配列番号１１６のアミノ酸Ｓ５０７、Ｅ５０９、Ｌ５２６およびＬ５２７、または代替ＣＤ１６３配列、例えば別の種からのＣＤ１６３配列中の対応する残基を含む（またはそれによって定義された）ブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメイン中のエピトープに結合する。

【0159】

代替的に、さらなる態様は、ブタＣＤ１６３に結合または特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗体（または結合タンパク質）を提供し、前述の抗体（抗原結合ドメイン）は、配列番号１１５のアミノ酸Ｓ３２、Ｅ３４、Ｌ５１およびＬ５２、または代替ＣＤ１６３配列、例えば別の種からのＣＤ１６３配列中の対応する残基を含む（またはそれによって定義された）ブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメイン中のエピトープに結合する。関連する残基は、以下の配列番号１１５に下線で示される。
［配列表１］

【0160】

特に、ＶＨＨのＣＤＲ２とブタＣＤ１６３の残基Ｌ５２６およびＬ５２７（配列番号１１６）との間の相互作用は、抗原－抗体（抗原結合ドメイン）相互作用にとって重要であるように見える。したがって、本発明のさらなる態様は、ブタＣＤ１６３に結合または特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗体（または結合タンパク質）を提供し、前述の抗体（抗原結合ドメイン）は、配列番号１１６のアミノ酸Ｌ５２６およびＬ５２７、または代替ＣＤ１６３配列、例えば別の種からのＣＤ１６３配列中の対応する残基を含む（それによって定義された）ブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメイン中のエピトープに結合する。

【0161】

他の実施形態において、本発明は、ブタＣＤ１６３に結合または特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗体（または結合タンパク質）を提供し、前述の抗体（抗原結合ドメイン）は、配列番号１１６のアミノ酸Ｌ５２６、Ｌ５２７およびＳ５０７、もしくはＬ５２６、Ｌ５２７およびＥ５０９、またはアミノ酸Ｌ５２６、Ｌ５２７、Ｓ５０７およびＥ５０９、または代替ＣＤ１６３配列、例えば別の種からのＣＤ１６３配列中の対応する残基を含む（またはそれによって定義された）ブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメイン中のエピトープに結合する。

【0162】

他の実施形態において、前述の抗体（または結合タンパク質）は、配列番号１１６の残基Ｓ５０７、Ｅ５０９、Ｌ５２６およびＬ５２７のうちの１つ、２つ、３つ、もしくはすべて、または代替ＣＤ１６３配列、例えば別の種からのＣＤ１６３配列中の対応する残基を含む（またはそれによって定義された）ブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメイン中のエピトープに結合する。言い換えれば、本発明の抗体（または結合タンパク質）によって結合されるＣＤ１６３上のエピトープの少なくとも１つのアミノ酸は、配列番号１１６のＳ５０７、Ｅ５０９、Ｌ５２６もしくはＬ５２７、または代替のＣＤ１６３配列、例えば別の種からのＣＤ１６３配列中の対応する残基を含む。このような抗体は、重複するエピトープに結合する抗体の例とみなすことができる。

【0163】

代替的に、前述の抗体（または結合タンパク質）は、配列番号１１５の残基Ｓ３２、Ｅ３４、Ｌ５１およびＬ５２のうちの１つ、２つ、３つ、もしくはすべて、または代替ＣＤ１６３配列、例えば別の種からのＣＤ１６３配列中の対応する残基を含む（またはそれによって定義された）ブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメイン中のエピトープに結合する。言い換えれば、本発明の抗体（または結合タンパク質）によって結合されるＣＤ１６３上のエピトープの少なくとも１つのアミノ酸は、配列番号１１５のＳ３２、Ｅ３４、Ｌ５１もしくはＬ５２、または代替のＣＤ１６３配列、例えば別の種のＣＤ１６３配列中の対応する残基を含む。このような抗体は、重複するエピトープに結合する抗体の例とみなすことができる。

【0164】

本発明者らの知る限り、ブタＣＤ１６３、特にブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメイン中のエピトープに結合または特異的に結合することができ、２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害または低減することができるモノクローナル抗体は、２型ＰＲＲＳＶ感染のみを阻害または低減する形態、または前述の抗体が１型および２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害または低減することができる形態のいずれかで当技術分野で記載されていない。

【0165】

したがって、本明細書に記載の個々のモノクローナル抗体は、異常であり、かつ有利である。さらに、上記のように、本発明者らは、２型ＰＲＲＳＶ感染に重要であり、したがってＰＲＲＳＶ感染を低減または阻害するために一般に抗体および結合タンパク質の標的であるブタＣＤ１６３上のエピトープを同定したと信じている。さらに、エピトープの一部として本明細書で同定されたブタＣＤ１６３上の残基は、ＰＲＲＳＶ感染にとって潜在的に重要であると以前に同定されたものとは異なるＣＤ１６３の領域に位置することに留意されたい。例えば、以前のレポート、例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１７（Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，９１（３）：ｅ０１８９７－１６）は、ＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメインの残基Ｒ５６１が１型ＰＲＲＳＶ感染に重要であると特定した。この残基は、ＣＤ１６３の残基Ｐｈｅ５４４とＡｒｇ５７０の間に位置するブタＣＤ１６３のループ５－６に見られる。他の報告では、ＣＤ１６３の残基Ｓ４８７とＧ４９９の間に位置するＣＤ１６３のリガンド結合ポケット（ＬＢＰ）も、ＰＲＲＳＶ感染の重要な領域であり得ると推測されている。現在の試験でエピトープの一部であると同定された４つの残基は、いずれもこれらの領域に存在しない。

【0166】

したがって、本発明は、ＰＲＲＳＶ感染、特に２型ＰＲＲＳＶ感染に重要であるブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５領域の異なる部分における新規エピトープを同定したと考えられ、このエピトープに結合する抗体（または結合タンパク質）または重複するエピトープが特に好ましい。上記のように、表３に示した抗体１７１（＃１４）は、このエピトープに結合することが示されている。競合結合試験を使用した最初の実験では、少なくとも抗体５７（＃１１）、７０（＃２３）、１４４（＃１）、および１５０（＃１５）が同じまたは重複するエピトープに結合し得ることを示している。

【0167】

抗体上のパラトープ
ＣＤ１６３の２つのＬ残基、Ｌ５２６およびＬ５２７は、ＶＨＨ抗体１７１（＃１４）のＣＤＲ２、すなわちＶＨＨ ０１４（２Ｄ０１）に見られるＹＹＡＤモチーフのＹ５９およびＤ６２と相互作用することが示されている。このＶＨＨ抗体は、２型ＰＲＲＳＶ感染の阻害効果を有するか、または感染を低減することが示されている。配列ＹＹＡＤまたは配列ＹＹＡＤに非常に類似した配列が、本明細書に記載のすべてのＶＨＨ抗体のＣＤＲ２の同等または対応する領域に見られることに留意されたい。本明細書に記載のすべてのＶＨＨ抗体は、２型ＰＲＲＳＶ感染に対する阻害効果を有するか、または感染を低減することが示されている。したがって、このＶＨ ＣＤＲ２領域は、２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害または低減する能力を有する抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）の重要な特徴のようである。

【0168】

したがって、本発明の好ましい抗体（または結合タンパク質）は、ＣＤＲ２、特に、アミノ酸配列ＹＡＤもしくはＹＡＥ、好ましくはＸＹＡＤもしくＸＹＡＥを含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸、好ましくはＹ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｆ、またはＲ、より好ましくはＹ、Ｆ、Ｌ、ＮもしくはＲ、またはＹ、ＰもしくはＬ、最も好ましくはＹであり得る。他の実施形態において、配列は、ＹＡＤまたはＹＡＥの代替として、ＹＡＮまたはＸＹＡＮを含み得る。

【0169】

実施形態において、Ｘ残基は、ＶＨＨ抗体１７１（＃１４）、すなわち、表３に示すＶＨＨ ０１４（２Ｄ０１）の配列番号１７’または９９の５９位、または代替抗体（またはＶＨＨ）のＶＨ ＣＤＲ２中の対応する位置に位置する。代替的に、Ｘ残基は、ＶＨＨ抗体１７１（＃１４）、すなわち、表３に示すＶＨＨ ０１４（２Ｄ０１）の配列番号１９’または１０１（ＣＤＲ２）の１０位、または代替抗体（またはＶＨＨ）のＶＨ ＣＤＲ２中の対応する位置に位置し、これは、例えば、本明細書に記載の他のＶＨＨ抗体のＣＤＲ２領域の８位または９位にあり得る。ＸＹＡＤもしくはＸＹＡＥもしくはＸＹＡＮモチーフにおける他の残基の位置は、これらの位置を参照してそれに応じて決定することができる。

【0170】

ＣＤ１６３の２つの残基Ｓ５０７およびＥ５０９は、ＶＨＨ抗体１７１（＃１４）のＣＤＲ３、すなわち、ＶＨＨ ０１４（２Ｄ０１）のＬ１０４と相互作用することが示されている。このＶＨＨ抗体は、２型ＰＲＲＳＶ感染の阻害効果を有するか、または感染を低減することが示されている。したがって、このＶＨ ＣＤＲ３残基（または他の抗体、例えばＶＨＨ抗体中の対応する残基）は、２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害または低減する能力を有する抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）における重要な残基であり得る。

【0171】

したがって、いくつかの実施形態において、本発明の抗体（または結合タンパク質）は、ＣＤＲ３、特に、ＶＨＨ抗体１７１（＃１４）、すなわち、表３に示すＶＨＨ ０１４（２Ｄ０１）の配列番号１７’もしくは９９の１０４位、または代替抗体（またはＶＨＨ）のＶＨ ＣＤＲ３における対応する位置にアミノ酸残基Ｌを含む、ＶＨ ＣＤＲ３を含む。代替的に、Ｌ残基は、ＶＨＨ抗体１７１（＃１４）、すなわち、表３に示すＶＨＨ ０１４（２Ｄ０１）の配列番号２０’もしくは１０２の６位、または代替抗体（またはＶＨＨ）のＶＨ ＣＤＲ３における対応する位置に位置する。

【0172】

いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３における上記のＬ残基は、ＣＤＲ２における上記のＹＡＤもしくはＹＡＥもしくはＹＡＮ配列、好ましくはＸＹＡＤもしくはＸＹＡＥもしくはＸＹＡＮに加えて存在し、式中、Ｘは任意のアミノ酸、好ましくはＹ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｆ、もしくはＲ、より好ましくはＹ、Ｆ、Ｌ、ＮもしくはＲ、またはＹ、ＰもしくはＬ、最も好ましくはＹであり得る。

【0173】

実質的に相同な配列が提供される本発明の実施形態において、いくつかの実施形態において、上記で定義された残基ＹＡＤ、ＹＡＥもしくはＹＡＮ、またはＸＹＡＤ、ＸＹＡＥもしくはＸＹＡＮが維持されているか、または存在し、変形はこれらの残基の外側で起こる。

【0174】

本発明のタンパク質の実質的に相同な配列には、保存的アミノ酸置換、または例えば、抗体のＶＨ、ＶＬもしくはＣＤＲドメインに影響を及ぼさない変化、例えば、タグ配列、毒素または他の成分が添加され、抗原の結合に寄与しない抗体、またはあるタイプまたはフォーマットの結合タンパク質、抗体分子もしくは断片を別のタイプまたはフォーマットの結合タンパク質、抗体分子または断片に変換するための変化（例えば、ＶＨＨからＦａｂもしくはｓｃＦｖもしくは全抗体またはその逆への変換）に寄与しない逆）、または抗体分子の特定のクラスまたはサブクラスの抗体分子への変換（例えば、抗体分子のＩｇＧまたはそのサブクラス、例えば、ＩｇＧ₂への変換）が含まれるが、これらに限定されない。

【0175】

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。他の例では、アミノ酸残基のファミリーは、疎水性側基または親水性側基に基づいてグループ化することができる。

【0176】

相同性は、任意の便利な方法で評価することができる。しかしながら、配列間の相同性の程度を決定するために、配列のマルチプルアラインメントを行うコンピュータプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｇｉｂｓｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：４６７３－４６８０，１９９４）が有用である。必要に応じて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムをＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５－１０９１９，１９９２）およびギャップオープニングペナルティ１０およびギャップエクステンションペナルティ０．１と一緒に使用することができ、その結果、２つの配列間で最高次の一致が得られ、一方の配列の全長の少なくとも５０％がアラインメントに関与する。配列を整列させるために使用することができる他の方法は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１）によって改訂されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０）のアライメント方法があり、その結果、２つの配列間で最高次の一致が得られ、２つの配列間で同一のアミノ酸の数が決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージを計算する他の方法は、一般に技術的に認識されており、例えば、ＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｔｏｎによって記載された方法（Ｃａｒｉｌｌｏ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３，１９８８Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｊｅｃｔｓが挙げられる。

【0177】

一般的に、そのような計算にはコンピュータプログラムが用いられる。配列対を比較し、整列させるプログラム、例えばＡＬＩＧＮ（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７，１９８８）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８，１９８８、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：６３－９８，１９９０）およびｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２，１９９７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｈａｅｂｅｒｌｉ，Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３８７，１９８４）もこの目的に有用である。さらに、欧州バイオインフォマティクス研究所のＤａｌｉサーバーは、タンパク質配列の構造ベースのアラインメントを提供する（Ｈｏｌｍ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０：４７８－４８０，１９９５、Ｈｏｌｍ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３３：１２３－３８，１９９３、Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２６：３１６－９，１９９８）。

【0178】

参照点を提供することにより、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性、配列同一性などを有する本発明による配列は、デフォルトのパラメータ（例えば、インターネット上のＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバー、ＩＧＨ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅで入手可能）とともにＡＬＩＧＮプログラムを使用して決定することができる。

【0179】

本明細書で使用される場合、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む、抗原結合ドメインを含む任意の免疫学的結合剤を広く指す。しかしながら、モノクローナル抗体が好ましい。言い換えれば、いくつかの実施形態において、本発明の抗体はポリクローナル抗体ではない。重鎖の定常ドメインのタイプに応じて、全抗体が５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの１つに割り当てられる。本発明の抗体はこれらのクラスのいずれかにあり得る。これらのいくつかは、さらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのサブクラスまたはアイソタイプに分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成はよく知られている。

【0180】

一般に、抗原結合領域ではなく全抗体が本発明で使用される場合、それらが生理学的状況において最も一般的な抗体であり、それらが実験室で最も容易に作製されるため、ＩｇＧが好ましい。

【0181】

哺乳動物の抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列と可変ドメインのフレームワーク領域内のいくつかのアミノ酸に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）の２つの明確に異なるタイプの１つに割り当てられる。

【0182】

本明細書で使用される場合、「重鎖相補性決定領域」（「重鎖ＣＤＲ」）という用語は、抗体分子の重鎖可変領域（Ｖ_Hドメイン）内またはＶＨＨ抗体分子内の超可変性の領域を指す。重鎖可変領域には、アミノ末端からカルボキシ末端まで、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲがある。重鎖可変領域は、４つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）も有する。これらのフレームワーク領域は、ＣＤＲを分離する。

【0183】

本明細書で使用される場合、「重鎖可変領域」（Ｖ_Hドメイン）という用語は、抗体分子の重鎖の可変領域を指す。

【0184】

本明細書で使用される場合、「軽鎖相補性決定領域」（「軽鎖ＣＤＲ」）という用語は、抗体分子の軽鎖可変領域（Ｖ_Lドメイン）内の超可変性の領域を指す。軽鎖可変領域には、アミノ末端からカルボキシ末端まで軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲがある。軽鎖可変領域には、４つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）もある。これらのフレームワーク領域は、ＣＤＲを分離する。

【0185】

本明細書で使用される場合、「軽鎖可変領域」（Ｖ_Lドメイン）という用語は、抗体分子の軽鎖の可変領域を指す。

【0186】

当業者によって理解されるように、「抗体」という用語に包含される免疫学的結合試薬は、全抗体、二量体、三量体および多量体抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組換え抗体および改変抗体、およびそれらの断片を含む、すべての抗体およびその抗原結合断片を含むか、またはそれらに及ぶ。

【0187】

したがって、「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、この用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆｄ、線状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ、トリボディ（それぞれ、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ融合体、二重特異性または三重特異性）；ｓｃ－ダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ－ＣＬ融合体）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞を引き付けるｓｃＦｖ－ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ－Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性フォーマット）；ＳＩＰ（低分子免疫タンパク質、一種のミニボディ）；ＳＭＩＰ（「小型モジュラー免疫医薬品」ｓｃＦｖ－Ｆｃ二量体；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「二重親和性リターゲティング」）；１つ以上のＣＤＲなどを含む小型抗体ミメティックなどの抗原結合ドメインを含む抗体断片を含む。

【0188】

様々な抗体ベースの構築物および断片を調製および使用するための技術は、当技術分野で周知である。

【0189】

抗体は、従来の技術を使用して断片化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂断片は、抗体をペプシンで処理することによって産生され得る。得られたＦ（ａｂ’）₂断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ’断片を産生することができる。パパイン消化は、Ｆａｂ断片の形成につながり得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片およびその他の断片も、組換え技術によって合成することができ、または化学的に合成することができる。抗体断片を産生するための技術は、当技術分野で周知であり、かつ記載されている。

【0190】

本発明のすべての実施形態において、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ抗体、ｓｄＡｂ、ＤＡＢ、ｄＡｂ、ナノボディ、ラクダ科動物の抗体、ｖＮＡＲ（サメ）抗体、ＶＨ抗体またはＶＬ抗体とも称される）、特にＶＨＨ抗体、ナノボディ、ラクダ抗体、およびｖＮＡＲ（サメ）抗体が好ましい。そのような抗体は、抗原に結合することができる単一の単量体可変抗体ドメイン、通常はＶＨドメインを含む（ただし、抗原に結合する能力を有する単一のＶＬドメインが記載されており、使用することができる）。したがって、いくつかのそのような好ましい実施形態において、本発明の抗体（または抗原結合ドメイン）は、１つ（または単一の）重鎖可変領域（ＶＨまたはＶＨＨ）を含むが、いくつかの実施形態において、配列が同じかまたは異なるいくつかのこれらの個々の重鎖可変領域は、同じ構築物または分子に一緒に存在することができる。

【0191】

そのような抗体は、当技術分野で周知であり、記載されている標準的な技術を使用して取得または調製することができる。例えば、そのような抗体は、適切な動物、例えばラマなどのラクダ科動物、またはサメを所望の抗原で免疫し、次に産生された抗体のＶＨドメインを適切な発現ベクターにクローニングし、バインダーのために選択することによって得ることができる。ＶＨドメインのライブラリー（例えば、ヒトＶＨドメインのファージディスプレイライブラリー）も利用可能であり、または生成し、次いでスクリーニングすることができる。

【0192】

それらの比較的小さいサイズのために、単一ドメイン抗体は、比較的短い半減期、例えば、比較的短い血漿半減期を有し得る。したがって、そのような抗体は、それらの半減期を延ばすか、または延長するために時には改変される。これを行うための技術は、当技術分野で周知であり、かつ記載されており、これらのいずれかを使用することができる。例としては、アルブミン（またはそれ自体が長い（もしくはより長い）半減期を有する別のタンパク質もしくはエンティティ）に抗体を結合もしくはコンジュゲートもしくは融合すること、あるいは長い（もしくはより長い）半減期を有するタンパク質もしくはエンティティとそれ自体が相互作用することができる別のタンパク質もしくはエンティティに抗体を結合もしくはコンジュゲートもしくは融合すること、あるいはＰＥＧ（または他のポリマー）に抗体を結合もしくはコンジュゲートもしくは融合すること、あるいはＦｃＲｎに結合するある抗体、または他のタンパク質もしくはエンティティに抗体を結合もしくはコンジュゲートもしくは融合することが挙げられる。

【0193】

特定の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域のすべてまたは一部分を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ２重鎖定常領域、またはその一部分である。さらに、抗体または抗体断片は、カッパ軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域のすべてもしくは一部分、またはその一部分を含むことができる。このような定常領域のすべてもしくは一部は、自然に産生されることもあれば、または全体的もしくは部分的に合成されることもある。そのような定常領域の適切な配列は、当技術分野で周知であり、かつ記述されている。重鎖および軽鎖からの定常領域の完全な補体が本発明の抗体に含まれる場合、そのような抗体は、典型的には、本明細書において「全長」抗体または「全」抗体と称される。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ₂抗体が好ましい。

【0194】

他の実施形態において、定常領域、例えば、重鎖または軽鎖定常領域が存在しないことが好ましく、例えば、可変ドメインまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、存在する抗体の単独の部分である。

【0195】

抗体または抗体断片は、自然に産生することができ、または全体的もしくは部分的に合成的に産生することができる。

【0196】

多くの抗体または抗体断片は、３つのＣＤＲドメインを含む抗体軽鎖可変領域（Ｖ_L）および３つのＣＤＲドメインを含む抗体重鎖可変領域（Ｖ_H）を含む。前述のＶＬおよびＶＨは、一般に、抗原結合部位を形成する。

【0197】

しかしながら、抗体の軽鎖可変ドメインからの３つのＣＤＲおよび重鎖可変ドメインからの３つのＣＤＲの存在が、抗原結合に必ずしも必要ではないことは、当技術分野で十分に記述されている。したがって、上記の古典的な抗体断片よりも小さい構築物が有効であることが知られている。

【0198】

例えば、ラクダ科動物の抗体は、広範な抗原結合レパートリーを有するが、軽鎖がない。また、ＶＨドメインのみまたはＶＬドメインのみを含む単一ドメイン抗体を用いた結果は、これらのドメインが許容できる程度に高い親和性で抗原に結合することができ、サイズが小さく、産生が容易であるなどの他の利点があることを示している。したがって、３つのＣＤＲは、抗原に効果的に結合することができ、そのような単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ抗体、ｓｄＡｂ、ＤＡＢ、ｄＡｂ、ナノボディ、ラクダ科動物の抗体、ｖＮＡＲ（サメ）抗体、ＶＨ抗体またはＶＬ抗体、特にＶＨＨ抗体、ナノボディ、ラクダ科動物抗体、およびｖＮＡＲ（サメ）抗体）が本明細書に例示されており、このタイプの抗体が好ましい（例えば、ＶＨＨ抗体）。

【0199】

本発明の抗体、結合タンパク質および核酸分子は、それらが、ヒトもしくは動物の体内（例えば、ラクダ科動物）またはヒトもしくは動物の体（例えばラクダ科動物）に由来する組織サンプル内にインサイツで存在し得る任意のそのような成分から区別される限り、一般に「単離された」または「精製された」分子である。しかしながら、これらの配列は、ヒトまたは動物の体（例えばラクダ科動物）に見られる配列に対応するか、または実質的に相同であり得る。したがって、核酸分子または配列およびタンパク質またはポリペプチド、例えば抗体に関して本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」という用語は、それらの自然環境から単離された、精製された、または実質的に免れた場合、例えば、ヒトまたは動物の体から単離された、もしくは精製された場合（実際にそれらが自然に発生する場合）、そのような分子を指し、あるいは、技術的プロセスによって産生された場合、すなわち、組換えおよび合成によって産生された分子を含む、そのような分子を指す。

【0200】

本発明の抗体などは、自然界に存在せず、その点で、自然界に生じる分子に対応しないという点で、人工の構築物であることに留意されたい。例えば、好ましい抗体は、操作または組換えにより産生され得る単一ドメイン抗体であり、そのような抗体を自然に産生する種、例えばラクダ科動物においてさえ、そのような種は、実験的にそうするように、例えば、免疫化によって誘導されない限り、ＣＤ１６３、特にブタＣＤ１６３に対する抗体を産生しない。換言すれば、本発明の抗体などは、非天然である。

【0201】

本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、生物学的関連性の断片、例えば、抗原結合に寄与する断片、例えば、抗原結合部位の一部を形成し、かつ／またはＣＤ１６３抗体の機能特性に寄与する断片を指す。特定の好ましい断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Hドメインまたは３つのＶＨ ＣＤＲ）を含むか、またはそれからなる。

【0202】

当業者は、重鎖および軽鎖ＣＤＲ、重鎖および軽鎖可変領域、抗体および抗体断片などの本発明のタンパク質およびポリペプチドが、当技術分野で周知であり、かつ記載されているいくつかの方式のいずれかで調製され得るが、最も好ましくは、組換え法を使用して調製されることを理解するであろう。

【0203】

本発明の抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸断片は、必要に応じて、例えば、クローニングまたは合成による任意の適切な方法によって得られるかまたは産生され得る。

【0204】

本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸断片が得られると、これらの断片は、例えば、可変領域断片を適切な定常領域ドメインを有する完全長抗体分子に、または本明細書の他の箇所で考察される抗体断片の特定のフォーマット、例えば、ＶＨＨ、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片などの単一ドメイン抗体に変換するために標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され得る。典型的には、またはこのさらなる操作手順の一部として、本発明の抗体分子をコードする核酸断片は、本発明の抗体の産生を容易にするために、または例えばファージディスプレイベクターに組み込むことによって、例えば、選択もしくはスクリーニングを容易にするために、１つ以上の適切な発現ベクターに一般に組み込まれる。

【0205】

可能な発現ベクターには、ベクターが使用される宿主細胞と適合する限り、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターは、「宿主細胞の形質転換に好適である」、これは、発現ベクターが、本発明の核酸分子と、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され、核酸分子に作用可能に連結されている調節配列と、を含むことを意味する。作用可能に連結されることは、核酸が、核酸の発現を可能にする方法で調節配列に連結されることを意味することを意図している。

【0206】

したがって、本発明は、発現ベクター、例えば、本発明の核酸分子またはその断片を含有または含む組換え発現ベクター、ならびに、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列を企図する。

【0207】

発現ベクターを宿主細胞に導入して、形質転換された宿主細胞を産生することができる。「形質転換した」、「トランスフェクトした」、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、当技術分野で知られている多くの可能な技術の１つによる細胞への核酸（例えばベクター）の導入を包含することを意図している。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトするための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ，１９８９）および他の実験テキストに見られる。

【0208】

好適な宿主細胞には、多種多様な真核生物宿主細胞および原核細胞が含まれる。例えば、本発明のタンパク質は、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現され得る。さらに、本発明のタンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．などの原核細胞で発現され得る。

【0209】

本発明のタンパク質はまた、固相合成などのタンパク質の化学において周知の技術を使用する化学合成によって調製され得る。

【0210】

さらに別の態様は、本発明の核酸断片もしくはセグメントもしくは分子のうちの１つ以上を含む発現構築物もしくは発現ベクターもしくは発現系（例えば、ウイルスもしくは細菌もしくは他の発現構築物、ベクターまたは系）を提供する。好ましくは、発現構築物もしくはベクターもしくは系は、組換えである。好ましくは、前述の構築物またはベクターまたは系は、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列をさらに含む。好ましい構築物などは、宿主標的種内で、例えばブタ内での本発明の抗体（または結合タンパク質）の長期または持続的発現を可能にするものである。そのような発現は、治療的または生物学的効果が観察されるために十分なレベルおよび長さの発現が達成されるという条件で、例えば、エピソーム組込みにより、一過性であり得、または例えば、ゲノム組込みを介してより永続的であり得る。

【0211】

さらに別の態様は、本発明の１つ以上の発現構築物または発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物もしくは細菌もしくは酵母の宿主細胞）またはウイルスを提供する。本発明の核酸分子のうちの１つ以上を含む宿主細胞またはウイルスも提供される。本発明の抗体（または結合タンパク質）を発現する宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞もしくは細菌宿主細胞、または酵母宿主細胞）またはウイルスは、さらに別の態様を形成する。

【0212】

そのような発現構築物もしくはベクターもしくは系、または宿主細胞もしくはウイルス、または本発明の抗体（または結合タンパク質）をコードする他の核酸産物もしくは断片を、治療薬として対象に投与し、本発明の抗体（または結合タンパク質）の産生を対象内のインサイツで可能にし、それによりそれらの治療効果を発揮することができる。

【0213】

本発明のさらに別の態様は、本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、本発明の抗体を産生（または製造）する方法を提供する。好ましい方法は、（ｉ）コードされた抗体またはタンパク質の発現に好適な条件下で、本発明の組換え発現ベクターのうちの１つ以上または核酸配列のうちの１つ以上を含む宿主細胞を培養する工程、任意選択で（ｉｉ）宿主細胞または増殖培地／上清から抗体またはタンパク質を単離または取得する工程を含む。そのような産生（または製造）の方法はまた、抗体またはタンパク質生成物の精製工程および／または抗体または生成物を、医薬的に許容される担体または賦形剤などの少なくとも１つの追加の成分を含む組成物に調製する工程を含み得る。

【0214】

実施形態において、本発明の抗体またはタンパク質が複数のポリペプチド鎖（例えば、Ｆａｂ断片または全抗体などの特定の断片）から構成される場合、すべてのポリペプチドは、好ましくは、同じまたは異なる発現ベクターのいずれかからの宿主細胞において発現され、そのため本発明の完全なタンパク質、例えば抗体タンパク質が宿主細胞内で集合し、そこから単離または精製され得る。

【0215】

別の態様では、本発明は、ＣＤ１６３を含む組成物を本発明の抗体と接触させることを含む、ＣＤ１６３を結合する方法を提供する。

【0216】

さらに別の態様では、本発明は、ＣＤ１６３／抗体複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、ＣＤ１６３を含むと疑われる組成物を本発明の抗体と接触させ、そのように形成された複合体を検出することを含む、ＣＤ１６３を検出する方法を提供する。

【0217】

本発明の少なくとも一次抗体（または結合タンパク質）を含む組成物は、本発明のさらなる態様を構成する。好適な希釈剤、担体または賦形剤と混合した本発明の１つ以上の抗体を含む製剤（組成物）は、本発明の好ましい実施形態を構成する。そのような製剤は、医薬用途、例えば、獣医学的用途のためであり得、したがって、本発明の組成物は、好ましくは、非ヒト動物、例えば哺乳動物、好ましくはブタへの投与のために医薬的に許容されるか、または許容される。好適な希釈剤、賦形剤および担体は、当業者に知られている。

【0218】

本発明による組成物は、例えば、経口、経鼻、非経口、静脈内、局所または直腸投与に好適な形態で提示することができる。

【0219】

本明細書で定義された活性化合物（例えば、本発明の抗体）は、錠剤、被覆錠剤、点鼻薬、液剤、乳剤、リポソーム剤、散剤、カプセル剤または徐放性形態などの従来の薬理学的投与形態で提示され得る。これらの形態の調製には、従来の医薬賦形剤ならびに通常の産生方法を用いることができる。

【0220】

注射液は、例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸塩などの保存剤、またはＥＤＴＡなどの安定剤の添加によるなどの従来の様式で産生することができる。次に、液剤を注射バイアルまたはアンプルに充填することができる。

【0221】

好適な投与量単位は、当業者によって決定することができる。

【0222】

医薬組成物は、同時投与レジメンまたは併用レジメンと関連して、さらなる有効成分（例えば、本明細書の他の箇所に記載される）をさらに含み得る。

【0223】

本発明のさらなる態様は、治療で使用するために、特に、ＣＤ１６３と関連する任意の疾患もしくは状態の治療または予防で使用するために、またはＣＤ１６３が役割、例えば、原因となる役割（例えば、全体的または部分的に原因となる役割）、または本質的な役割を有する場合に、本明細書で定義された抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）を提供する。例えば、本発明の抗ＣＤ１６３抗体は、ウイルスまたは他の病原体によって引き起こされる任意の感染症の治療または予防に使用することができ、前述の感染症は、ＣＤ１６３と関連するか、またはＣＤ１６３が、役割、例えば、原因となる役割（例えば、全体的または部分的に原因となる役割）、または本質的な役割を有する。別の言い方をすれば、本発明によれば、抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）は、ＣＤ１６３、特にＰＡＭまたは他のＣＤ１６３陽性細胞上または細胞内で発現されるＣＤ１６３の機能を標的とし、阻害または低減し得る。したがって、本明細書で定義された抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）は、ＣＤ１６３の阻害またはＣＤ１６３機能の遮断もしくは低減が有用である、任意の疾患または状態の治療または予防に使用することができる。

【0224】

好ましい実施形態は、ブタの感染症、好ましくはブタのウイルス感染症の治療または予防に使用するための本発明の抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）を提供する。特に好ましいのは、ＰＲＲＳＶ感染の治療または予防である。ブタが治療される実施形態において、本発明の抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）は、典型的には、抗ブタＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）である。

【0225】

ＣＤ１６３は、すべてのＰＲＲＳウイルスの受容体である可能性が高いと思われる。しかしながら、本書の他の箇所に記載されているように、ＰＲＲＳＶには、１型および２型のウイルスの２つの血清型がある。１型ウイルスおよび２型ウイルスは、いくつかのレベルで表現型上では類似しているが、ウイルスの遺伝子型には違いがある。本発明の抗体（または結合タンパク質）を使用して、１型および／または２型ＰＲＲＳウイルス、例えば１型および２型ＰＲＲＳウイルスを治療または予防することができる。他の実施形態において、本発明は、２型ＰＲＲＳＶ感染を阻害する能力、好ましくは２型ＰＲＲＳＶ感染を特異的に阻害する能力を有し、したがって２型ＰＲＲＳウイルスを治療または予防するために使用することができる抗体（または結合タンパク質）を提供する。

【0226】

本発明の治療方法および使用における結合タンパク質または抗体の投与は、治療を必要とする対象（動物、または哺乳動物、例えばブタ）に対して、医薬的、治療的、または生理学的有効量で行われる。したがって、前述の方法および使用は、治療を必要とする対象を特定する追加の工程を含み得る。

【0227】

本発明による疾患もしくは状態の治療（例えば、既存の疾患の治療）には、前述の疾患もしくは状態の治癒、または疾患の低減もしくは緩和（例えば、疾患の重症度の低下）または疾患の症状が含まれる。

【0228】

本発明の治療方法および使用は、疾患の予防ならびに疾患の積極的治療（例えば、既存疾患の治療）に好適である。したがって、予防的およびメタ感染防御的（疾患の発生に直面した治療、例えば、密接に接触している、かつ／および重大なリスクがある動物への感染性疾患の拡大を防ぐことを目的とし、感染症の診断後の対象群の治療、かつ／または群の一部での臨床的疾患の治療）治療も本発明により包含される。本発明の方法および使用におけるこの理由のために、治療はまた、発症予防、メタ防御もしくは適切な場合予防を含む。

【0229】

そのような予防的（または保護的）な側面は、健康もしくは正常な、またはリスクにある対象に対して便利に行うことができ、完全な予防および重要な予防の両方を含み得る。同様に、重要な予防には、治療を行わない場合に予想される重症度または症状と比較して、疾患の重症度または疾患の症状が低減する（例えば、測定可能にまたは大幅に低減する）シナリオが含まれる。

【0230】

例えばＰＲＲＳ感染の臨床症状には、妊娠中の母ブタまたは未経産ブタにおける胎児の再吸収、死産および後期流産、すべてのブタ、特に、若齢ブタおよび幼い子ブタにおける、呼吸器疾患および症候群、例えば呼吸困難が含まれる。他の症状には、食欲不振（成長率の低下につながることが多い）、発熱、倦怠感、呼吸困難、生殖障害、下痢（特に幼い子ブタ）、中枢神経系（ＣＮＳ）の兆候が含まれる。ＰＲＲＳＶ感染症の対象は、髄膜炎、グラッサー病、滲出性皮膚炎、ヒゼンダニ症、細菌性気管支肺炎などの風土病にもかかりやすいと報告されている（Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ，Ｅｌｅｖｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｊ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ Ｌｏｃｋｅ Ａ．Ｋａｒｒｉｋｅｒ Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ｒａｍｉｒｅｚ Ｋｅｎｔ Ｊ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｗ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｊｉａｎｑｉａｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｆｉｒｓｔ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ：２９Ｍａｒｃｈ２０１９）、このような病気は通常、抗生物質などの抗菌薬を使用して管理される。結果として、本発明は、農場での抗菌製品の使用を減らす役割を有する。

【0231】

したがって、本発明の抗体は、臨床的疾患または症状、例えば、ＰＲＲＳＶ感染または上記に概説されるような下流の固有疾患と関連する臨床的疾患または症状を治療または予防するために、またはウイルス、例えばＰＲＲＳＶ、循環（例えば、循環ウイルス粒子）または感染（例えば、第１の感染）または新しい感染（例えば、第２のまたは後続の感染）、例えば、ＰＲＲＳＶ感染（例えば、第１のＰＲＲＳＶ感染）または新しいＰＲＲＳＶ感染（例えば、第２のまたは後続のＰＲＲＳＶ感染）を防ぐために使用され得る。

【0232】

したがって、本発明による治療の好ましい対象には、すべてのタイプのブタ（時にはブタ（ｓｗｉｎｅ）とも称される）、例えば、本明細書で定義された病原体、特にＰＲＲＳＶに感染しやすい、または感染を受けやすいという条件で、すべての年齢および種のブタを含む、任意のブタ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、またはブタ種が含まれる。 子ブタ、特に幼い子ブタまたは感染した母ブタからの出生子ブタ（その８０％までが死亡する）は、保育ブタ（例えば、１２週齢までの離乳後のブタ）、および成長期または肥育期のブタ（例えば、屠殺年齢までのブタ）、特に成長期ブタと同様に、特に好ましい対象である。離乳前の子ブタ、生後４週間までの子ブタ（特に、感染した母ブタの乳腺分泌物を介して感染が伝染する可能性のある感染した母ブタの子ブタ）も、母ブタおよび妊娠母ブタと同様に、治療の対象として好ましい。

【0233】

いくつかの実施形態において、例えば、予防が関係する場合、対象は、問題の疾患または状態によって影響を受けているリスクがある、例えば、上記のような病原体またはウイルス（例えば、ＰＲＲＳＶ）に感染して疾患を発症しているリスクがある対象である。そのような対象は、健康な対象、もしくは疾患の症状を示さない対象、もしくは任意の他の適切な「リスクがある」対象であり得る。別の実施形態において、対象は、上記のような問題の疾患もしくは状態を有する、または有する（または発症している）と疑われる、または潜在的に有する（または発症している）対象である。

【0234】

代替的に、本発明は、ＣＤ１６３と関連する疾患もしくは状態、またはＣＤ１６３が役割、例えば、原因となる役割（例えば、全体的または部分的に原因となる役割）または本質的な役割を有する場合に、治療または予防する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、本明細書で定義された本発明の治療有効量の抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）を投与することを含む。適切な疾患または状態は、本明細書の他の箇所に記載されている。

【0235】

ブタにおける感染症の治療または予防、好ましくはブタにおけるウイルス感染の治療または予防が好ましい。特に好ましいのは、ＰＲＲＳＶ感染の治療または予防、例えば１型および／または２型ＰＲＲＳウイルス感染、例えば１型および２型ＰＲＲＳウイルス感染を治療または予防すること、または２型ＰＲＲＳウイルス感染を治療または予防する（例えば、具体的に治療または予防する）ことである。

【0236】

したがって、さらにさらなる態様は、ブタにおけるＰＲＲＳＶ感染の治療または予防の方法、例えば、ブタにおける１型および／または２型ＰＲＲＳウイルス感染の治療または予防を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、ブタＣＤ１６３に結合する治療有効量のモノクローナル抗体を投与することを含む。そのような方法で使用するための適切なＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）が本明細書に記載されている。

【0237】

本明細書に記載の本発明の治療的使用の実施形態は、必要な変更を加えて、本発明のこの態様に適用される。

【0238】

治療有効量は、臨床評価に基づいて決定され、容易に監視することができる。

【0239】

さらに、代替的に、本発明は、治療に使用するための薬物の製造において本明細書で定義された、本発明の抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）、例えば本発明のモノクローナル抗体の使用を提供する。好ましい治療用途は、特に、ＣＤ１６３と関連する任意の疾患もしくは状態の治療または予防における使用、またはＣＤ１６３が役割、例えば、原因となる役割（例えば、全体的または部分的に原因となる役割）または本質的な役割を有する場合に使用するために、本明細書の他の箇所に記載される。例えば、本発明の抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）は、ウイルスまたは他の病原体によって引き起こされる任意の感染症の治療または予防に使用することができ、前述の感染症は、ＣＤ１６３と関連するか、またはＣＤ１６３が役割、例えば、原因となる役割（例えば、全体的または部分的に原因となる役割）、または本質的な役割を有する。別の言い方をすれば、本発明によれば、抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）は、ＣＤ１６３、特にＰＡＭまたは他のＣＤ１６３陽性細胞上または細胞内で発現されるＣＤ１６３の機能を標的とし、阻害または低減し得る。したがって、本明細書で定義された抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）は、ＣＤ１６３の阻害またはＣＤ１６３機能の遮断もしくは低減が有用である任意の疾患または状態の治療または予防に使用することができる。

【0240】

好ましい実施形態は、ブタの感染症、好ましくはブタのウイルス感染症の治療または予防に使用するための薬物の製造における本発明の抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）の使用を提供する。特に好ましいのは、ＰＲＲＳＶ感染の治療または予防、例えば１型および／または２型ＰＲＲＳウイルス感染、例えば１型および２型ＰＲＲＳウイルス感染を治療または予防すること、または２型ＰＲＲＳウイルス感染を治療または予防する（例えば、具体的に治療または予防する）ことである。

【0241】

したがって、さらにさらなる態様は、ＰＲＲＳウイルス感染、好ましくはブタにおける１型および／または２型ＰＲＲＳウイルス感染の治療または予防に使用するための薬物の製造において、ブタＣＤ１６３に結合するモノクローナル抗体の使用を提供する。そのような使用のための適切なＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）が本明細書に記載されている。

【0242】

本明細書に記載の本発明の治療的使用の実施形態は、必要な変更を加えて、本発明のこの態様に適用される。

【0243】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、組み合わせて使用することができる。

【0244】

それぞれ、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩに示されるように、ＶＨＨ抗体４９（＃１８）、４７（＃１９）、４８（＃２０）、７６（＃２）、７７（＃１６）、７８（＃８）、１５０（＃１５）、７０（＃２３）および１４４（＃１）の任意の組み合わせを使用することができる。したがって、これらのうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つすべてを組み合わせて、好ましくは２つまたは３つ、より好ましくは２つを使用することができる。

【0245】

好ましい組み合わせは以下を含む：
７０（＃２３）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１４４（＃１）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１５０（＃１５）ならびに、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）、例えば、１５０（＃１５）および４７（＃１９）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７６（＃２）および、７０（＃２３）もしくは１４４（＃１）もしくは１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７７（＃１６）および、７０（＃２３）もしくは１４４（＃１）もしくは１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４９（＃１８）および、７０（＃２３）もしくは１４４（＃１）もしくは１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４７（＃１９）および、７０（＃２３）もしくは１４４（＃１）もしくは１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４８（＃２０）および、７０（＃２３）もしくは１４４（＃１）もしくは１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、または
７８（＃８）および、７０（＃２３）もしくは１４４（＃１）もしくは１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ。

【0246】

好ましい組み合わせは以下を含む：
７６（＃２）および１５０（＃１５）、
７６（＃２）および７７（＃１６）、
７６（＃２）および４８（＃２０）、
１５０（＃１５）および７７（＃１６）、
１５０（＃１５）および４８（＃２０）、
７７（＃１６）および４８（＃２０）、または
１５０（＃１５）および７７（＃１６）および４８（＃２０）。

【0247】

それぞれ、表１、２、３および４に示されるように、ＶＨＨ抗体５７（＃１１）、４１（＃１２）、１７１（＃１４）、および２９（＃１７）の任意の組み合わせを、本発明で使用することができる。したがって、これらのうちの２つ、３つ、または４つすべてを組み合わせて、好ましくは２つまたは３つ、より好ましくは２つを使用することができる。

【0248】

好ましい組み合わせは以下を含む：
５７（＃１１）ならびに、４１（＃１２）または２９（＃１７）、例えば５７（＃１１）および２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１７１（＃１４）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４１（＃１２）および、５７（＃１１）または１７１（＃１４）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、または
２９（＃１７）および、５７（＃１１）または１７１（＃１４）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ。

【0249】

他の組み合わせには以下が挙げられる：
それぞれ、表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩに示されるように、ＶＨＨ抗体４９（＃１８）、４７（＃１９）、４８（＃２０）、７６（＃２）、７７（＃１６）、７８（＃８）、１５０（＃１５）、７０（＃２３）、または１４４（＃１）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つと、それぞれ、表１、２、３、および４に示されるように、ＶＨＨ抗体５７（＃１１）、４１（＃１２）、１７１（＃１４）、または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つとの任意の組み合わせ。

【0250】

好ましい組み合わせは以下を含む：
１５０（＃１５）および２９（＃１７）、
４７（＃１９）および２９（＃１７）、または
１４４（＃１）および２９（＃１７）。

【0251】

他の好ましい組み合わせは以下を含む：
５７（＃１１）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
５７（＃１１）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１７１（＃１４）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１７１（＃１４）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７０（＃２３）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７０（＃２３）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１４４（＃１）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１４４（＃１）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１５０（＃１５）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、または
１５０（＃１５）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ。

【0252】

代替の好ましい組み合わせは、以下を含む：
４１（＃１２）および、５７（＃１１）、１７１（＃１４）、７０（＃２３）、１４４（＃１）、または１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４１（＃１２）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
２９（＃１７）および、５７（＃１１）、１７１（＃１４）、７０（＃２３）、１４４（＃１）、または１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、または
２９（＃１７）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ。

【0253】

代替の好ましい組み合わせは、以下を含む：
７６（＃２）および、５７（＃１１）、１７１（＃１４）、７０（＃２３）、１４４（＃１）、または１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７６（＃２）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７７（＃１６）および、５７（＃１１）、１７１（＃１４）、７０（＃２３）、１４４（＃１）、または１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７７（＃１６）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４９（＃１８）および、５７（＃１１）、１７１（＃１４）、７０（＃２３）、１４４（＃１）、または１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４９（＃１８）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４７（＃１９）および、５７（＃１１）、１７１（＃１４）、７０（＃２３）、１４４（＃１）、または１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４７（＃１９）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４８（＃２０）および、５７（＃１１）、１７１（＃１４）、７０（＃２３）、１４４（＃１）、または１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４８（＃２０）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７８（＃８）および、５７（＃１１）、１７１（＃１４）、７０（＃２３）、１４４（＃１）、または１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、または
７８（＃８）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ。

【0254】

好ましい組み合わせは以下を含む：
５７（＃１１）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１７１（＃１４）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７０（＃２３）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１４４（＃１）および１つ以上、好ましくは４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
１５０（＃１５）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４１（＃１２）および、７０（＃２３）、１４４（＃１）、または１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４１（＃１２）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
２９（＃１７）および、７０（＃２３）、１４４（＃１）または１５０（＃１５）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
２９（＃１７）および、７６（＃２）、７８（＃８）、７７（＃１６）、４９（＃１８）、４７（＃１９）、または４８（＃２０）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７６（＃２）および、５７（＃１１）または１７１（＃１４）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７６（＃２）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７７（＃１６）および、５７（＃１１）または１７１（＃１４）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７７（＃１６）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ。
４９（＃１８）および、５７（＃１１）または１７１（＃１４）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４９（＃１８）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４７（＃１９）および、５７（＃１１）または１７１（＃１４）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４７（＃１９）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４８（＃２０）および、５７（＃１１）または１７１（＃１４）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
４８（＃２０）および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、
７８（＃８）、および、５７（＃１１）または１７１（＃１４）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ、または
７８（＃８）、および、４１（＃１２）または２９（＃１７）のうちの１つ以上、好ましくはそのうちの１つ。

【0255】

上記のすべての組み合わせにおいて、必要に応じて、表Ａ～Ｉおよび１～４に示される３つのＣＤＲを有する抗体を使用することもできる。

【0256】

好ましい組み合わせは、単独の活性剤（単剤療法）、もしくは単独の抗体、もしくは単独の抗ＣＤ１６３剤として投与された本発明の抗体（例えば、ＶＨＨ）のいずれかと比較して、治療効果の改善または増加、好ましくは大幅な改善または増加をもたらす組み合わせである。他の好ましい組み合わせは、組み合わせの個々の抗ＣＤ１６３抗体が、ＣＤ１６３分子上の異なるエピトープに結合する組み合わせである。

【0257】

本発明の２つ以上の抗体（または結合タンパク質）を使用するそのような併用治療では、第２の（またはその後の）抗ＣＤ１６３抗体は、本発明の第１の抗ＣＤ１６３抗体と実質的に同時に、単一の医薬組成物から、または密接に一緒に（同時にまたは同様の時間に）投与された２つの医薬組成物からなど、対象に投与され得る。代替的に、本発明の第２の（またはその後の）抗ＣＤ１６３抗体は、本発明の第１の抗ＣＤ１６３抗体の投与前または投与に続いて、対象に投与され得る。本明細書で使用される場合、「前または続いて」とは、「交互」を意味し、したがって、第１の抗ＣＤ１６３抗体成分の投与とは異なる時間に第２の抗体が対象に投与される。一般に、２つ（またはそれ超）の成分は、個々の成分がそれぞれの治療効果を発揮することを可能にするために、時間の間隔を効果的にあけて、または一緒に投与されてもよく、すなわち、それらの成分は「生物学的に有効な時間間隔」で「生物学的に有効な量」で投与され、かつ同じ治療レジメンの一部として投与される。

【0258】

本発明の抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）の組み合わせは、適切な場合、同じ分子または構築物の一部として都合よく投与することができ、例えば、人工リンカーを用いて、例えば、コンジュゲートまたは連結することができる。この投与様式は、ＶＨＨ抗体（または単一のポリペプチド鎖から構成される他のタイプの抗体分子）に特に適切であり得、その個々の抗体は、適切なペプチド（または他の）リンカー、例えば非天然ペプチド、または本発明のＶＨＨ抗体かまたは他のＶＨＨもしくは他の抗体との組み合わせのいずれかの複数のＶＨＨ（または他の）抗体を含む単一のポリペプチド鎖における人工リンカーによって便利に結合されている。そのような実施形態において、薬剤は、一般に、適切な技術、例えばスペーシングを使用して一緒に連結され、その結果、各成分は、それらのそれぞれの効果、例えば、ＣＤ１６３への結合を発揮することができる。例えば、本発明の抗ＣＤ１６３抗体がＣＤ１６３上の異なるエピトープに結合する実施形態において、そのような抗体の組み合わせが好ましく、構築物は、個々の抗体がＣＤ１６３、例えばそのＣＤ１６３エピトープに結合することができるように適切に設計される。

【0259】

したがって、いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）は、治療レジメン（単剤療法）における単独の活性剤として使用され得るか、または本発明の複数の抗ＣＤ１６３抗体が、例えば上記の組み合わせで使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）（または適切な組み合わせ）は、治療レジメンにおける単独の活性抗ＣＤ１６３剤または単独の活性抗ＣＤ１６３抗体として使用され得るか、またはそれらは、治療レジメンにおける単独の有効な抗ＰＲＲＳＶ剤であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、追加の抗ＣＤ１６３剤または抗ＰＲＲＳＶ剤を使用することができる。

【0260】

したがって、本発明の抗ＣＤ１６３結合タンパク質または抗体（または適切な組み合わせ）は、１つ以上のさらなる（追加のＣＤ１６３標的または非ＣＤ１６３標的）活性剤と、例えば、少なくとも第２の治療薬または生物学的薬剤と組み合わせることができ、第１は、本発明の抗ＣＤ１６３結合タンパク質または抗体（またはそのような結合タンパク質または抗体の組み合わせ）である。

【0261】

本発明の抗ＣＤ１６３抗体（または結合タンパク質）（または適切な組み合わせ）は、例えば、本明細書の他の箇所に記載された問題の疾患を治療するのに有用な他の任意の治療薬、例えばＰＲＲＳＶと組み合わせることができる。

【0262】

そのような併用治療の場合、一般的に言えば、第２の（本発明の非抗ＣＤ１６３抗体）薬剤は、本発明の抗ＣＤ１６３抗体（またはそのような抗体の組み合わせ）と実質的に同時に、例えば、単一の医薬組成物から、または密接に一緒に（同時にまたは同様の時間に）投与される２つの医薬組成物から、対象に投与されてもよい。代替的に、第２の（本発明の非抗ＣＤ１６３抗体）薬剤は、本発明の成分の抗ＣＤ１６３抗体の投与前または投与に続いて、対象に投与され得る。本明細書で使用される場合、「前または続いて」とは、「交互」を意味し、したがって、抗ＣＤ１６３抗体成分の投与とは異なる時間に第２（本発明の非抗ＣＤ１６３抗体）薬剤が対象に投与される。一般に、２つ（またはそれ超）の成分は、２つの成分がそれぞれの治療効果を発揮することを可能にするために、時間の間隔を効果的にあけて、または一緒に投与されてもよく、すなわち、それらの成分は「生物学的に有効な時間間隔」で「生物学的に有効な量」で投与され、かつ同じ治療レジメンの一部として投与される。

【0263】

本発明はさらに、本発明の抗体もしくは組成物のうちの１つ以上、または本発明の抗体をコードする核酸分子のうちの１つ以上、または本発明の核酸配列を含む１つ以上の組換え発現ベクター、または本発明の組換え発現ベクターもしくは核酸配列を含む１つ以上の宿主細胞もしくはウイルスを含むキットを含む。好ましくは、前述のキットは、本明細書に記載の方法および使用、例えば、本明細書に記載の治療方法で使用するためのものである。好ましくは、前述のキットは、キット構成要素の使用のための説明書を含む。好ましくは、前述のキットは、本明細書の他の箇所に記載された疾患または状態を治療するためのものであり、任意選択で、そのような疾患または状態を治療するためのキット構成要素の使用に関する説明書を含む。本発明の結合タンパク質による同等の実施形態も提供される。

【0264】

本明細書で定義された本発明の抗体（または結合タンパク質）はまた、インビトロまたはインビボでの適用およびアッセイのための分子ツールとして使用され得る。抗体（および一部の結合タンパク質）は、抗原結合部位を有するため、これらは、特異的結合対のメンバーとして機能することができ、これらの分子は特定の結合対メンバーが必要な任意のアッセイで使用され得る。

【0265】

したがって、本発明のさらに別の態様は、本明細書で定義された本発明の抗体（または結合タンパク質）および、例えばインビトロまたはインビボアッセイにおける分子ツールとしてのそのような抗体（または結合タンパク質）の使用を含む試薬を提供する。

【0266】

本明細書に開示したアミノ酸配列およびそれらの配列識別子（配列番号）の表
本明細書では、この技術分野の慣例に従って、すべてのアミノ酸配列をＮ末端からＣ末端に向かって記述する。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【表14】

【0267】

次に、以下の図面を参照して、本発明を以下の非限定的な実施例においてさらに説明する。

【図面の簡単な説明】

【0268】

【図1】高ブタ血清の存在下でのＰＲＲＳ１型ウイルスＢＯＲ５７の遮断 パネルＡ～Ｉのデータは、８０％ブタ血清の存在下でブタ肺胞マクロファージ細胞とともに１７時間インキュベートした場合に、１型ＢＯＲ５７ ＰＲＲＳウイルスによる増殖ウイルス感染を阻害する候補ＶＨＨ抗体の能力を示している。候補ＶＨＨ抗体は、５０～４００μｇ／ｍＬの用量反応範囲で評価した。データは、平均値＋／－ＳＥＭ（ｎ＞３）として示した偽対照と比較して、被験物質の不在下での感染に関連して提示する。

【0269】

【図2】１０％ＦＢＳ含有培地中のＰＲＲＳ２型ウイルスＭＮ１８４の遮断 データは、１０％ＦＢＳの存在下でブタ肺胞マクロファージ細胞とともに１７時間インキュベートした場合に、２型ＭＮ１８４ ＰＲＲＳウイルスによる増殖ウイルス感染を阻害する候補ＶＨＨ抗体の能力を示している。候補抗体は、５０～３００μｇ／ｍＬの用量反応範囲で評価した。データは、平均値＋／－ＳＥＭ（ｎ＞３）として示した偽対照と比較して、被験物質の不在下での感染に関連して提示する。

【0270】

【図3】ＰＲＲＳウイルス２型特異的ＶＨＨ阻害抗体による１型ウイルス感染の遮断 データは、８０％ブタ血清の存在下でブタ肺胞マクロファージ細胞とともに１７時間インキュベートした場合に、１型ＢＯＲ５７ ＰＲＲＳウイルスによる増殖ウイルス感染を阻害する候補ＶＨＨ抗体の能力を示している。候補抗体は、１～１００μｇ／ｍＬの用量反応範囲で評価した。データは、平均値＋／－ＳＥＭ（ｎ＞３）として示した偽対照と比較して、被験物質の不在下での感染に関連して提示する。

【0271】

【図4】ＶＨＨ１５、ＶＨＨ１６、およびＶＨＨ２０を含むＶＨＨ組み合わせを使用するＰＲＲＳ１型ウイルスＢＯＲ５７の遮断 データは、個々のＶＨＨを組み合わせて使用して、ＰＲＲＳ１型ウイルスによる感染を阻止し得ることを示している。ＶＨＨ１５とＶＨＨ１６、ＶＨＨ１５とＶＨＨ２０、ならびにＶＨＨ１６とＶＨＨ２０の組み合わせは、増殖ウイルス感染の効果的な遮断を示した。ＶＨＨ対の各ＶＨＨの１００μｇ／ｍＬの単一濃度を試験した。さらに、ＶＨＨ１５＋ＶＨＨ１６＋ＶＨＨ２０の三重組み合わせを評価した。各ＶＨＨは、５０μｇ／ｍＬの濃度で存在した。データは、ＰＲＲＳウイルスによる感染を阻止するために使用されるＶＨＨの組み合わせの可能性を示している。データを偽対照と比較して、被験物質の不在下での感染に関連して示す。

【0272】

【図5】ＶＨＨ０２、ＶＨＨ１５、ＶＨＨ１６、およびＶＨＨ２０を含むＶＨＨの組み合わせを使用するＰＲＲＳ１型ウイルスＢＯＲ５７の遮断 データは、個々のＶＨＨを組み合わせて使用して、ＰＲＲＳ１型ウイルスによる感染を阻止し得ることを示している。ＶＨＨ０２とＶＨＨ１５、ＶＨＨ０２とＶＨＨ１６、ならびにＶＨＨ０２とＶＨＨ２０の組み合わせは、ＶＨＨ対の各々３μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で増殖ウイルス感染の効果的な遮断を示した。データは、ＰＲＲＳウイルスによる感染を阻止するために使用されるＶＨＨの組み合わせの可能性を示している。データを偽対照と比較して、被験物質の不在下での感染に関連して示す。

【0273】

【図6】ＶＨＨ１４（０２Ｄ０１）とブタＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５ドメインとの相互作用のＸ線結晶構造 左側のパネルは、ＶＨＨ１４：ＳＲＣＲ５複合体の精密な構造を表している。左側にはＣＤ１６３：ＳＲＣＲ５ドメインがあり、Ｎ末端に向かって逆平行に湾曲した２枚の短いβシートが隣接する１枚の長いβシートと、それに続く１枚のαヘリックスとからなる。右側は、ＶＨＨ１４（０２Ｄ０１）のコア構造であり、７枚の逆平行βシートと３枚の短いαヘリックスがコアの周りに配置されている。各タンパク質について、Ｃ末端およびＮ末端の両方を示す。

【0274】

右側のパネルは、１シグマレベルで輪郭を描いた電子密度（２ｍ｜Ｆｏ｜－Ｄ｜Ｆｃ｜）の例である。タンパク質鎖および個々のアミノ酸は、線で描かれる。データは、ＶＨＨ１４のＣＤＲ２ドメイン内のチロシン（Ｙ５９）およびアスパラギン酸（Ｄ６２）残基と、ブタＳＲＣＲ５ドメイン内のロイシン残基の対（Ｌｅｕ５２６、Ｌｅｕ５２７）の間の明確な相互作用を示している。ＶＨＨ１４（ＣＤＲ３）のロイシン１０４と、ＳＲＣＲ５セリン５０７（Ｓ５０７）内アミノ酸の対と、グルタミン酸５０９（Ｅ５０９）の間の追加の相互作用も見られる。結晶構造を、２．０～２．３Ａに精密化した。この図のＬｅｕ（Ｌ）５２は、配列番号１１６に示す全長ＣＤ１６３分子のＬｅｕ（Ｌ）５２７に対応する。この図のＬｅｕ（Ｌ）５１は、配列番号１１６に示す全長ＣＤ１６３分子のＬｅｕ（Ｌ）５２６に対応する。この図のＳｅｒ（Ｓ）３２は、配列番号１１６に示す全長ＣＤ１６３分子のＳｅｒ（Ｓ）５０７に対応する。この図のＧｌｕ（Ｅ）３４は、配列番号１１６に示す全長ＣＤ１６３分子のＧｌｕ（Ｅ）５０９に対応する。ＶＨＨ０２Ｄ０１のＡｓｐ（Ｄ）６２、Ｔｙｒ（Ｙ）５９およびＬｅｕ（Ｌ）１０４は、配列番号１７’または９９に示す（表３）。

【実施例】

【0275】

実施例１：免疫化、ライブラリー生成、スクリーニングおよびクローン選択
材料および方法
免疫化
単一ドメイン抗体は、組換えタンパク質で免疫されたラマから得た。ラマに、不完全フロイントアジュバント（ｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ１－９－ｈｕＦｃおよびｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７－ｈｕＦｃ）で調製されたブタＣＤ１６３Ｆｃ融合抗原調製物を注射した。動物を、１週間間隔で６回の皮下注射（１００μｇ／用量での２回の注射、続いて５０μｇ／用量での４回の注射）で免疫した。最後の追加免疫から１週間後、血清を収集して、ＥＬＩＳＡによってｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ１－９－ｈｕＦｃおよびｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７－ｈｕＦｃに対する抗体価を明らかにした。

【0276】

このＥＬＩＳＡでは、９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ；Ｎｕｎｃ）を組換えタンパク質でコーティングした。希釈血清サンプルをブロックして添加した後、マウス抗ラクダ科動物ＩｇＧ２／３（ＥＭＤ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＭＡＣ１３１）、続いて抗マウス免疫グロブリンペルオキシダーゼコンジュゲート（ＪＩＲ、カタログ番号７１５－０３５－１５０）を使用して抗ｐＣＤ１６３抗体の存在を実証した。

【0277】

ライブラリー構築
３頭の免疫されたラマ（各４００ｍｌ）のＰＢＭＣからＲＮＡを抽出した。ランダムプライマーを使用するｃＤＮＡ合成には４０μｇのＲＮＡを使用した。このｃＤＮＡを、リーダー配列およびヒンジＣＨ１領域でアニーリングする非タグ付きプライマーを使用した一次ＰＣＲ増幅において使用し、続いてｐＤＣＬ１ファージミドベクターにＶＨＨ遺伝子をクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する二次ＰＣＲ増幅において使用した。ライブラリーをＴＧ１Ｅ．ｃｏｌｉ細胞にエレクトロポレーションし、免疫ライブラリーの細胞グリセロールストックを－８０℃で保存した（ＦＬ１１５８およびＦＬ１１５９）。

【0278】

選択
ラマＶＨＨライブラリープールからのファージ産生を、ｐＣＤ１６３組換えタンパク質またはブタ肺胞マクロファージ（ｐＰＡＭ）を使用して連続した２ラウンドのファージディスプレイ選択で使用した。組換えタンパク質の選択ラウンドは、１０μｇ／ｍｌのｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ１－９－ｈｕＦｃまたはｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７－ｈｕＦｃ ｐＨ７．４（ＰＢＳ緩衝液）を使用して行い、非特異的ファージを洗浄し、続いてトリプシンによる特異的ファージ溶出（全溶出）を行った。ｐＰＡＭの選択ラウンドは、ｐＨ７．４の５Ｅ１０６細胞（ＰＢＳ緩衝液）を使用して行い、非特異的ファージを洗浄し、続いてトリプシンによる特異的ファージ溶出（全溶出）を行った。溶出したファージの段階希釈を行い、指数関数的に増殖するＴＧ１を感染させるために使用した。感染したＴＧ１をＬＢＣａｒｂ１００Ｇｌｕ２％プレートにプレーティングし、バックグラウンドで濃縮値を計算した（選択用の抗原なし）。

【0279】

ＥＬＩＳＡスクリーニング
選択条件出力の第２ラウンドからの個々のクローンを９６ウェルのＭａｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅに選び、ペリプラズム抽出物（ＰＥ）として、ｐＨ７．０でｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７－ｈｕＦｃまたはｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ５－６－ｈｕＦｃタンパク質に結合することを結合ＥＬＩＳＡによって試験した。ＰＥ結合ＥＬＩＳＡの場合、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）高タンパク質結合容量９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌのｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７－ｈｕＦｃタンパク質を使用して４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、２５０μｌ／ウェルの４％Ｍａｒｖｅｌ／ＣＰＡまたは４％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳで、室温で１時間ブロックした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、ウェル当たり２０μｌのＰＥ＋１％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中８０μｌとともに室温で１時間振とうしながらインキュベートした。プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１００μｌの抗ｃ－Ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号１１６６７２０３００１）、続いて１％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の二次抗体ＤＡＭ－ＨＲＰ（ＪＩＲ；カタログ番号７１５－０３５－１５０）とともに室温で１時間振とうしながらインキュベートした。プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ０．０５％（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、基質溶液（ＴＭＢ溶液）をプレートに添加した。Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、プレートをプレートリーダーで、４５０ｎｍで読み取った。

【0280】

細胞のスクリーニング（ＦＡＣＳ）：
選択したクローンからのペリプラズム抽出物（ＰＥ）を、可溶性ＶＨＨに存在するｃ－ｍｙｃタグに特異的な抗ｃ－ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号１１６６７２０３００１）とともに、室温（ＲＴ）で３０分間撹拌しながらインキュベートした。混合物（ＰＥ＋抗ｃ－ｍｙｃ抗体）をｐＰＡＭまたはｐＰＡＭΔ５ドメイン（ＳＲＣＲドメイン５が欠失した細胞）に加え、４℃で６０分間、穏やかに振とうしながらインキュベートした。

【0281】

細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、５０μｌ／ウェルの二次抗体ＧＡＭ－ＡＰＣとともに４℃で３０分間、振とうしながらインキュベートし、光から保護した。

【0282】

細胞を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、７５μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、ＲＬ－１チャネル（ＡＰＣチャネル）のＦＡＣＳマシン（Ａｔｔｕｎｅ（商標）ＮｘＴ）で測定し、サンプルごとに計１００００細胞を取得した。

【0283】

配列決定
ポジティブバインダーを配列決定のために送った。クローンは、異なるＨＣＤＲ３配列に従ってファミリーによって分類した。

【0284】

結果および考察：

【表15】

【表16】

【0285】

組換えＣＤ１６３でラマを免疫した後、２ラウンドのファージパニングによってファージクローンを選択した。ファージ候補は、対照ヒトＩｇＧと比較して、ＥＬＩＳＡによる組換えＣＤ１６３発現構築物（ｐＣＤ１６３ＳＲＣＲ１－９－ＦｃまたはｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７－Ｆｃ）を結合することによって確認した。表５に示すように、選択的結合を、ブタＣＤ１６３へのいくつかの候補によって実証した。

【0286】

クローンをさらに、ドナー動物の気管支肺胞洗浄から回収された細胞から調製された、単離された初代ブタ肺胞マクロファージ上の天然膜結合ＣＤ１６３に結合する能力についてさらに選択した（Ｂｕｒｋａｒｄ Ｃ．，ｅｔ ａｌ ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ２０１７）。候補ファージは、ＣＤ１６３受容体がエンドサイトーシスメカニズムによって内在化される可能性が高いとき、室温と同様に、４℃の両方で天然膜結合ＣＤ１６３に結合することを実証した。

【0287】

ＣＤ１６３遺伝子においてこのドメインが欠失したブタから単離されたブタ肺胞マクロファージに結合することができない候補を選択することにより、ＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメインへの選択的結合についてもすべての候補を評価した（Ｂｕｒｋａｒｄ Ｃ．，ｅｔ ａｌ ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ２０１７）。選択されたすべての候補は、これらの動物から単離されたＰＡＭに結合することができなかったため、ブタＣＤ１６３のＳＲＣＲ５ドメインへの優先結合を示している。

【0288】

したがって、組換えＣＤ１６３タンパク質構築物によるラマの免疫により、初代ブタ肺胞マクロファージで発現されるＣＤ１６３に結合することができ、これらの細胞のＰＲＲＳウイルス感染に必須であることが知られているＳＲＣＲ５ドメインを特異的に標的とするファージ抗体候補の良好な単離がもたらされた。

【0289】

参照文献：
Ｂｕｒｋａｒｄ Ｃ，Ｌｉｌｌｉｃｏ ＳＧ，Ｒｅｉｄ Ｅ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｂ，Ｍｉｌｅｈａｍ ＡＪ，Ａｉｔ－Ａｌｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ＰＲＲＳＶ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐｉｇｓ：Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｅｄ ｐｉｇｓ ｌａｃｋｉｎｇ ＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５ ｄｏｍａｉｎ ａｒｅ ｆｕｌｌｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｂｏｔｈ ＰＲＲＳＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｗｈｉｌｅ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ １３（２）：ｅ１００６２０６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００６２０６

【0290】

実施例２：ブタＣＤ１６３に対する抗ＣＤ１６３ ＶＨＨ抗体の親和性決定
材料および方法：
同定されたＶＨＨ抗体候補のそれぞれによるブタＣＤ１６３への結合の親和性を表面プラズモン共鳴によって決定した。

【0291】

ＶＨＨ候補抗体の発現および精製
ＦＬＡＧおよびＨｉｓタグ付きＶＨＨ可変ドメインにコードする合成遺伝子を購入し、製造元の指示に従って再構成した。各ＤＮＡ構築物を制限酵素消化し、インサートをゲル精製し、各可変ドメインインサートを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１とライゲーションさせた。ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞に、４０μｇの全ＤＮＡプラスミド構築物を使用して２３のリードパネル配列をトランスフェクトした。総量２５ｍＬの細胞を８日間のタンパク質産生に使用した（３２℃、５％ＣＯ２）。産生されたＶＨＨ抗体は、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ２５ＦＰＬＣシステム上でＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ５ｍＬ ＩＭＡＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－５２４８－０２）を使用して、清澄化した上清から捕捉した。溶出した抗体のピーク画分を１×ＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換し、３ｋＤａ ＭＣＯスピン濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＵＦＣ９００３２４）を使用して濃縮した。精製したタンパク質は、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによって正しい鎖の存在について分析した。

【0292】

親和性の決定
選択した精製クローンのｐＣＤ１６３への親和性を評価するために、ｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ１－９－ｈｕＦｃまたはｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７－ｈｕＦｃタンパク質をＣＭ５センサーシップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でアミンカップリングによってコーティングした。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ｐＨ７．４で選択した単一ドメイン抗体の結合速度を決定した。約２０００ＲＵのｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ１－９－ｈｕＦｃまたはｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７－ｈｕＦｃ、酢酸緩衝液ｐＨ５．０もしくはｐＨ５．５中の２０もしくは３０μｇ／ｍｌのタンパク質を、標準的なアミンカップリング手順を使用してＣＭ５チップに固定化した。固定化のＱＣは、３０．０μｇ／ｍｌの濃度で市販の抗体抗ｈｕＦｃ（ＪＩＲ、カタログ番号１０９－００５－０９８）を使用して行った。

【0293】

１×ＨＢＳ－ＥＰ ｐＨ７．４を結合速度測定中にランニング緩衝液として利用した。精製したＶＨＨは、３倍希釈（３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３ｎＭ、１１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭ）で１２０秒間、３０μｌ／分の流速で注入した。ＲＵレベルは、サンプル間で１０μｌの１０ｍＭ ＮａＯＨ／１Ｍ ＮａＣｌおよび１０μｌの１０ｍＭグリシンｐＨ１．５での再生後、ベースレベルに復元させた。物質移動を伴うフィッティング１：１結合を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアの同時フィッティング選択肢を使用して設定されたサンプル曲線に適用し、結合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、親和性（ＫＤ）を含む抗体－抗原相互作用の速度定数を計算した。残留物を目視検査し、カイ２の値を考慮した後、曲線をフィッティングから削除した。同時フィッティングでは、最低４つの曲線を考慮した。

【0294】

【表17】

【0295】

上記のように、ファージ候補をＶＨＨとして発現させて、精製した。全長または切断型ＣＤ１６３のいずれかに結合するＶＨＨの各々の特性評価は、上記のように表面プラズモン共鳴によって行った。結合速度および解離速度の両方を各抗体について決定し、親和性決定を計算した。表７に見られるように、抗体候補のＫＤ値は１～７５ｎＭの範囲であった。全長または切断型ｐＣＤ１６３－ＳＲＣＲ４－７構築物のいずれかに対する相対的な親和性は、ほぼ同様であった。

【0296】

実施例３：候補ＣＤ１６３特異的候補抗体による初代ブタ肺胞マクロファージ細胞のブタ呼吸器生殖器（ＰＲＲＳ）ウイルス感染の阻害
材料および方法
ＰＲＲＳウイルス感染プロトコル
試薬
ＶＨＨ候補抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度で等分した
対照抗体：
一次抗体：抗ＰＲＲＳ １ＡＣ７、Ｉｎｇｅｎａｓａ
二次抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ３２７２３
培地：
完全ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳまたは８０％（高）ブタ血清、ウルトラグルタミン、ペニシリン／ストレップトマイシン）
ＰＡＭ単離：ブタ肺胞マクロファージ単離は、Ｂｕｒｋａｒｄ ｅｔ ａｌ ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ２０１７に記載のように行った。
ウイルス単離株：
１型ウイルス：ＢＯＲ５７単離株（Ｒｏｓｌｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ）
２型ウイルス：ＭＮ１８４米国株（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ ２００６）
感染プロトコル
１日目－細胞播種
ブタ肺胞マクロファージ細胞を、４８ウェルプレートの完全ＲＰＭＩにプレート当たり２，０００万個で播種し、ＣＯ₂インキュベーター内に一晩放置した。
２日目－ＶＨＨ処置および感染チャレンジ
１． 前処置（感染の３０分前）
ａ．細胞から培地を吸引する
ｂ．非処置の非感染対照および非処置の感染対照に１００μＬの培地を加える
ｃ．１００μＬの培地中２０μＬのＰＢＳを偽処置した感染対照に加える
ｄ．処置サンプルおよび感染サンプルに１００μＬの培地中適切な量のＶＨＨストックを加える
ｅ．プレートをＣＯ₂インキュベーターに３０分間戻す
２． ウイルスストックを解凍し、使用前に１５秒間超音波処理する
３． 感染チャレンジ（２時間）
ａ．細胞から培地を取り除き、ＶＨＨ含有培地を終夜インキュベーション工程用に保持する
ｂ．非処置の非感染対照に１００μＬの培地を加える
ｃ．非処置の感染対照に１００μＬの培地中１０μＬのウイルスを加える
ｄ．偽処置した感染対照の１００μＬ培地に１０μＬウイルスと２０μＬＰＢＳを加える
ｅ．処置サンプルおよび感染サンプルに、１００μＬの培地中の適切な量のＶＨＨストックおよび１０μＬのウイルスを加える。
ｆ．プレートを静かに撹拌し、ＣＯ₂インキュベーターに戻す
ｇ．プレートを１５分ごとに２時間穏やかに撹拌する
４． 終夜インキュベーション（１５時間）
ａ．細胞から培地を吸引する
ｂ．非処置の非感染対照および非処置の感染対照に１００μＬの培地を加える
ｃ．１００μＬの培地中２０μＬのＰＢＳを偽処置した感染対照に加える
ｄ．前処置工程から保持しておいたＶＨＨ含有培地を適切なサンプルに加える
ｅ．プレートをＣＯ₂インキュベーターに１５時間戻す
３日目－ウェル内固定および染色プロトコル
５． 細胞から培地を吸引する
６． 細胞を４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ＋＋（カルシウムおよびマグネシウムを含む）溶液で、室温で３０分間固定する
７． ＰＢＳ＋＋で１回洗浄する
８． Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（ＰＢＳ＋＋中１％）を用いて室温で５分間透過処理する
９． ＰＢＳ＋＋またはブロッキング溶液（ＰＢＳ＋＋／５％ＦＢＳ）で１回洗浄する
１０． ブロッキング溶液（ＰＢＳ＋＋／５％ＦＢＳ）を用いて室温で２０分間ブロックする
１１． 非染色対照および二次抗体のみの対照を除くすべてのウェルに、一次抗体抗－ＰＲＲＳ１ＡＣ７を１：５０００で加える
１２． 室温で１時間インキュベートする
１３． ＰＢＳ＋＋で３回洗浄する
１４． 非染色対照を除くすべてのウェルに、二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８を１：５０００で加える
１５． 室温で４５分間インキュベートする
１６． ＰＢＳ＋＋で３回洗浄する
１７． ３００μＬのＰＢＳ＋＋を加える
１８． 広口径ｐ２００ピペットチップを使用して細胞をこすり取り、次に通常のｐ２００チップでウェルの端の周りをこすり取り、次にｐ１０００を使用してウェルの表面を３回洗浄し、細胞を収集してＦＡＣチューブに移す。
１９． Ｆｏｒｔｅｓｓａ×２０で測定を行った（電圧：ＦＳＣ＝４１８、ＳＳＣ＝３０８＆５３０－３０＝３８６）

【0297】

結果および考察：
ＰＲＲＳウイルスファミリーメンバーによるＰＡＭ宿主細胞の感染を阻止する個々のＶＨＨの能力を以下に説明する。上記のアッセイを使用して、１７時間の感染サイクルに続いてＦＡＣＳによって測定された、ウイルスを増殖させる能力によって定量化されたウイルス感染の程度を測定した。提示されたデータを図１および図２に示し、ならびに以下の表８に要約する。

【0298】

【表18】

【0299】

データは、ＶＨＨがＰＲＲＳ１型（図１も参照）および２型（図２も参照）の両アイソタイプによるブタ肺胞マクロファージ細胞の増殖感染を阻害することができることを明確に示している。感染アッセイにおいて活性を示すＶＨＨは、１型および２型の両ウイルス感染に対して有効であったもの（ＶＨＨの００１、００２、００８、０１５、０１６、０１８、０１９、０２０、および０２３）および、１型ＰＲＲＳウイルス感染に対しては阻害活性を示さなかったが、２型ＰＲＲＳウイルス感染に対して選択的阻害活性を示した（ＶＨＨ０１１、０１２、０１４、０１７）ものに分けることができる。データは、ＶＨＨがＰＲＲＳ１型および２型の両方のアイソタイプによるブタ肺胞マクロファージ細胞の増殖感染を阻害することができることを明確に示している。

【0300】

一部のＶＨＨは、最大３００μｇ／ｍＬの濃度範囲で２型ウイルス感染（ＶＨＨの０１１、０１２、０１４、０１７）でのみ阻害活性を示した（図２）。これらの候補ＶＨＨは、ＰＲＲＳ２型ウイルスに特異性を示し、１型ウイルス感染アッセイにおいて１００μｇ／ｍＬまでの同様の用量反応濃度範囲にわたり阻害活性を示さなかった（図３）。

【0301】

参照文献：
Ｂｕｒｋａｒｄ Ｃ．，ｅｔ ａｌ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ＰＲＲＳＶ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐｉｇｓ：Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｅｄ ｐｉｇｓ ｌａｃｋｉｎｇ ＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５ ｄｏｍａｉｎ ａｒｅ ｆｕｌｌｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｂｏｔｈ ＰＲＲＳＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｗｈｉｌｅ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，１３（２）２０１７：ｅ１００６２０６
Ｈａｎ Ｊ．，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｓ．Ｆａａｂｅｒｇ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＦＬＰ １８４ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２２（２００６），ｐｐ．１７５．

【0302】

実施例４：候補ＣＤ１６３特異的候補抗体の組み合わせによる初代ブタ肺胞マクロファージ細胞のブタ呼吸器生殖器（ＰＲＲＳ）ウイルス感染の阻害
材料および方法
ＰＲＲＳウイルス感染プロトコル
試薬
ＶＨＨ候補抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度で等分した
対照抗体：
一次抗体：抗ＰＲＲＳ １ＡＣ７、Ｉｎｇｅｎａｓａ
二次抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ３２７２３
培地：
完全ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳまたは８０％高ブタ血清、ウルトラグルタミン、ペニシリン／ストレップトマイシン）
ＰＡＭ単離：ブタ肺胞マクロファージ単離は、Ｂｕｒｋａｒｄ ｅｔ ａｌ ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ２０１７に記載のように行った。
ウイルス単離株：
１型ウイルス：ＢＯＲ５７単離株（Ｒｏｓｌｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ）
２型ウイルス：ＭＮ１８４米国株（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ ２００６）
感染プロトコル
１日目－細胞を播種
ブタ肺胞マクロファージ細胞を、４８ウェルプレートの完全ＲＰＭＩにプレート当たり２，０００万個で播種し、ＣＯ₂インキュベーター内に一晩放置した。
２日目－ＶＨＨ治療および感染チャレンジ
１．前処置（感染の３０分前）
ａ．細胞から培地を吸引する
ｂ．非処置の非感染および非処置の感染対照に１００μＬの培地を加える
ｃ．１００μＬの培地に２０μＬのＰＢＳを加えて、偽処置した感染対照に加える
ｄ．処置サンプルおよび感染サンプルに１００μＬの培地中適切な量のＶＨＨストックを加える
ｅ．プレートをＣＯ₂インキュベーターに３０分間戻す
２．ウイルスストックを解凍し、使用前に１５秒間超音波処理する
３．感染チャレンジ（２時間）
ａ．細胞から培地を取り除き、ＶＨＨ含有培地を終夜インキュベーション工程用に保持する
ｂ．非処置の非感染対照に１００μＬの培地を加える
ｃ．非処置の感染対照に１００μＬの培地に１０μＬのウイルスを加える
ｄ．偽処置した感染対照において１００μＬ培地中１０μＬウイルスおよび２０μＬＰＢＳを加える
ｅ．処置サンプルおよび感染サンプルに、適切な量の個々のＶＨＨストック溶液（またはＶＨＨの組み合わせ）および１００μＬの培地中１０μＬのウイルスを加える
ｆ．プレートを静かに撹拌し、ＣＯ₂インキュベーターに戻す
ｇ．プレートを１５分ごとに２時間穏やかに撹拌する
４．終夜インキュベーション（１５時間）
ａ．細胞から培地を吸引する
ｂ．非処置の非感染対照および非処置の感染対照に１００μＬの培地を加える
ｃ．偽処置した感染対照に１００μＬの培地中２０μＬのＰＢＳを加える
ｄ．前処置工程から保持しておいたＶＨＨ含有培地を適切なサンプルに加える
ｅ．プレートをＣＯ₂インキュベーターに１５時間戻す
３日目－ウェル内固定および染色プロトコル
５．細胞から培地を吸引する
６．細胞を４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ＋＋（カルシウムおよびマグネシウムを含む）溶液中で、室温で３０分間固定する
７．ＰＢＳ＋＋で１回洗浄する
８．Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（ＰＢＳ＋＋中１％）を用いて室温で５分間透過処理する
９．ＰＢＳ＋＋またはブロッキング溶液（ＰＢＳ＋＋／５％ＦＢＳ）で１回洗浄する
１０．ブロッキング溶液（ＰＢＳ＋＋／５％ＦＢＳ）を用いて室温で２０分間ブロックする
１１．非染色対照および二次抗体のみの対照を除くすべてのウェルに、一次抗体抗－ＰＲＲＳ１ＡＣ７を１：５０００で加える
１２．室温で１時間インキュベートする
１３．ＰＢＳ＋＋で３回洗浄する
１４．非染色対照を除くすべてのウェルに、二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８を１：５０００で加える
１５．室温で４５分間インキュベートする
１６．ＰＢＳ＋＋で３回洗浄する
１７．３００μＬのＰＢＳ＋＋を加える
１８．広口径ｐ２００ピペットチップを使用して細胞をこすり取り、次に通常のｐ２００チップでウェルの端の周りをこすり取り、次にｐ１０００を使用してウェルの表面を３回洗浄し、細胞を収集してＦＡＣチューブに移す。
１９．Ｆｏｒｔｅｓｓａ×２０で測定を行った（電圧：ＦＳＣ＝４１８、ＳＳＣ＝３０８＆Ｂ５３０－３０＝３８６）

【0303】

結果および考察：
ＰＲＲＳウイルスファミリーメンバーによるＰＡＭ宿主細胞の感染を阻止する個々のＶＨＨの能力を以下に説明する。上記のアッセイを使用して、１７時間の感染サイクルに続いてＦＡＣＳによって測定された、ウイルスを増殖させる能力によって定量化されたウイルス感染の程度を測定した。提示されたデータを図４および図５に示す。

【0304】

ＶＨＨ１５、１６、および２０の組み合わせを、１０％ＦＢＳ含有培地の存在下でＢＯＲ５７ ＰＲＲＳ１型ウイルスを使用する感染アッセイで使用した。ＶＨＨ１５とＶＨＨ１６、ＶＨＨ１５とＶＨＨ２０、ＶＨＨ１６とＶＨＨ２０の各々１００μｇの特定の組み合わせ、およびＶＨＨ１５＋ＶＨＨ１６＋ＶＨＨ２０の各々５０μｇの三重組み合わせは、ＰＲＲＳ１型ウイルスの感染の可能性を非常に低いレベルの感染力に低減させる可能性を示した（図４を参照）。

【0305】

ＶＨＨの様々なペアワイズの組み合わせの可能性を、１０％ＦＢＳを含有する培地の存在下でＢＯＲ５７ ＰＲＲＳ１型ウイルスを使用して感染アッセイで調べた。ＶＨＨ０２（０１Ｂ０４）をＶＨＨ１５（０２Ｇ０１）、ＶＨＨ１６（０２Ｈ１１）、およびＶＨＨ２０（０３Ｈ１１）のパートナーとして使用して、感染をブロックする可能性を評価した。各パートナーＶＨＨの濃度を上げて組み合わせを試験した。データは、ＶＨＨの組み合わせを使用してＰＲＲＳ１型ウイルス感染をブロックし得ることを示している（図５を参照）。

【0306】

データは、ＶＨＨの組み合わせにより、ＰＲＲＳ１型アイソタイプによるブタ肺胞マクロファージ細胞の増殖感染の阻害が、個々のＶＨＨ候補よりも潜在的に大幅に増強されることができることを示している。データは、個々のＶＨＨを組み合わせて、ＰＲＲＳウイルスファミリーメンバーによる感染遮断の可能性を増強することが可能であり得ることを示唆している。

【0307】

参照文献：
Ｂｕｒｋａｒｄ Ｃ．，ｅｔ ａｌ，前掲；Ｈａｎ Ｊ．，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｓ．Ｆａａｂｅｒｇ，前掲。

【0308】

実施例５：ブタＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５に結合する抗ＣＤ１６３ ＶＨＨ抗体の決定
材料および方法：
ＶＨＨ抗体候補２Ｄ０１（ＶＨＨ１４）に結合するブタＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５ドメインのＸ線結晶構造を決定した。

【0309】

ＶＨＨ１４抗体の発現および精製
ＦＬＡＧおよびＨｉｓタグ付きＶＨＨ可変ドメインにコードする合成遺伝子を購入し、製造元の指示に従って再構成した。各ＤＮＡ構築物を制限酵素消化し、インサートをゲル精製し、各可変ドメインインサートを哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１とライゲーションさせた。ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞に、４０μｇの全ＤＮＡプラスミド構築物を使用して２３のリードパネル配列をトランスフェクトした。総量２５ｍＬの細胞を８日間のタンパク質産生に使用した（３２℃、５％ＣＯ２）。産生されたＶＨＨ抗体を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ２５ＦＰＬＣシステムでＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ５ｍＬ ＩＭＡＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－５２４８－０２）を使用して、清澄化した上清から捕捉した。溶出した抗体のピーク画分を１×ＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換し、３ｋＤａ ＭＣＯスピン濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＵＦＣ９００３２４）を使用して濃縮した。精製したタンパク質は、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによって正しい鎖の存在について分析した。

【0310】

ブタＳＲＣＲ５の発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂａｃに形質転換して、組換えＢａｃｍｉｄを産生する前に、＾ｘＨＩＳタグが付いたブタＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５領域をコードする合成遺伝子をｐＴＸＢａｃ１（独自のベクター）にサブクローニングした。組換えＢａｃｍｉｄを使用して、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞を形質転換し、Ｐ１ウイルスクローンを生成した。Ｐ１クローンからの細胞および培地サンプルを定期的にチェックして、タンパク質の発現を調べ、高発現クローンを特定した。高発現クローンは、Ｓｆ細胞をＰ１ウイルスストックに感染させることによって増幅させて、Ｐ２ウイルスストックを生成し、その後、感染多重度（ＭＯＩ）約１で７２時間にわたってＳｆ１細胞内で組換えＳＲＣＲ５タンパク質を発現させるために使用した。

【0311】

産生スケールアップは、Ｓｆ細胞の１０Ｌの培養で行った。上記のように最適な発現条件を使用した。培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．５で平衡化した後、標準プロトコルによってＩＭＡＣ上でＨＩＳタグを使用して精製した。サンプルをＰＢＳ ｐＨ７．５および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４緩衝液で洗浄した。タンパク質を製造元の指示に従ってイミダゾールで溶出した。コバルト樹脂でさらに精製する前に、溶出したサンプルをＰＢＳ ｐＨ７．５と緩衝液交換した。イミダゾールシフトを使用して（上記のように）洗浄した後、サンプルを溶出した。得られた溶出サンプルを２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌに緩衝液交換した。

【0312】

【表19】

【0313】

結晶化およびＸ線構造決定試験
ＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５：ＶＨＨ１４複合体は、ＰＢＳ ｐＨ７．４緩衝液で１１．８４ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。板状結晶は、０．２ＭのＮａＣｌ、０．１Ｍのリン酸／クエン酸ｐＨ４．５、２０％ｗ／ｖのＰＥＧ８０００で成長させた。０．１４ＭのＮａＣｌ、０．０７Ｍのリン酸／クエン酸緩衝液ｐＨ４．５、１３．９％のＰＥＧ８０００および４６％のエチレングリコールを含む凍結溶液を添加した後、個々の結晶を液体窒素で急速凍結させた。

【0314】

データは、スウェーデンのＭＡＸ ＩＶのＢｉｏＭＡＸビームライン（ｌ＝０．９７６２５Å）で、１００Ｋで収集した。ビームラインには、Ｅｉｇｅｒ１６Ｍハイブリッドピクセル検出器が装備されていた。

【0315】

構造は、Ｐｈａｓｅｒソフトウェアおよび２つの相同タンパク質（ＰＤＢコード：５ＤＡ４および５ＪＦＢ）を使用して決定し、それぞれ２．４Åおよび２．０Åと決定した。ＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５ドメインの１０３のアミノ酸（表９の太字）および太字でマークした残基４以降のＶＨＨ０１４（０２Ｄ０１）の１２２のアミノ酸をモデル化することができた（表９）。

【0316】

結果および考察：
ＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５：ＶＨＨ０１４複合体の構造から、図６に示すように、単一の単量体ＶＨＨ０１４抗体（右側）と相互作用する単一の単量体ＳＲＣＲ５ドメイン（左側）が明らかになる。電子密度マップから、ＶＨＨ０１４の残基とＣＤ１６３：ＳＲＣＲ５ドメイン内の同定したアミノ酸との間の特異的相互作用が明らかになる。特に、ブタＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５ドメイン内のロイシン５２６およびロイシン５２７は、同定したすべてのＶＨＨ候補間で共有されるモチーフであるＶＨＨ１４のＣＤＲ２内のＸＹＡＤ／Ｅ／Ｎモチーフによると、特定の保存残基と相互作用を形成するにみえる。ＶＨＨ１４（０２Ｄ０１）は、ＰＲＲＳ１型ウイルスによる感染を阻害しないが、ＰＲＲＳ２型ファミリーウイルスによる感染を低減することができるため、興味深いものである。ブタＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５で同定されたジロイシンモチーフは、ＰＲＲＳ２型ウイルスとＳＲＣＲ５との相互作用、およびブタ肺胞マクロファージの増殖感染に重要な特徴を表し得る。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】