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特表2023-508689ＰＨＦ２０を阻害する製剤を含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-03
(54)【発明の名称】ＰＨＦ２０を阻害する製剤を含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20230224BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20230224BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230224BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230224BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230224BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230224BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20230224BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230224BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20230224BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230224BHJP
A23L 33/13 20160101ALI20230224BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230224BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61P21/04 ZNA
A61P21/00
A61P43/00 105
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61K31/713
A61K31/711
A61K31/7105
A61K38/02
A61K31/7088
A23L33/13
C12N15/11 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022539268
(86)(22)【出願日】2021-04-01
(85)【翻訳文提出日】2022-06-23
(86)【国際出願番号】 KR2021004056
(87)【国際公開番号】W WO2021251602
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】10-2020-0070987
(32)【優先日】2020-06-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
２．ＴＷＥＥＮ
３．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522252626
【氏名又は名称】ミトス セラピューティクス インコーポレーティッド
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】特許業務法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】パーク、ジョンソン
(72)【発明者】
【氏名】パーク、ジス
(72)【発明者】
【氏名】イ、ヒョンジ
【テーマコード（参考）】
4B018
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B018MD44
4B018ME14
4C084AA13
4C084AA17
4C084BA03
4C084MA02
4C084MA43
4C084MA52
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZB211
4C084ZB212
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C085GG08
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA52
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA94
4C086ZB21
(57)【要約】
本発明は、筋肉分化メカニズムにおけるＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）の機能に関するものであって、より具体的にはＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤の用途に関する。本発明によるＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて筋分化を促進させるところ、筋肉減少による疾患の予防、改善または治療分野において多様に活用されることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項2】
前記筋肉減少による疾患は、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、緊張減退症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉の退化、筋強直性ジストロフィー （ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、 筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）および悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項3】
前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、ＰＨＦ２０遺伝子に相補的に結合するｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択された１種以上である、請求項１に記載の筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項4】
前記ｓｈＲＮＡは、配列番号１の塩基配列で表されるものである、請求項３に記載の筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項5】
前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、ＹＹ１（Ｙｉｎ Ｙａｎｇ １）プロモーター活性阻害剤である、請求項１に記載の筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項6】
前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、ＭｙｏＤ（ＭｙｏＤｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）の発現を増加させ、筋分化を促進させるものである、請求項１に記載の筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項7】
前記ＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤は、ＰＨＦ２０タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチドおよび抗体からなる群から選択される１種以上である、請求項１に記載の筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項8】
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤；またはＹＹ１プロモーター活性阻害剤；を含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項9】
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉増強用または筋肉量減少阻害用健康機能食品組成物。
【請求項10】
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉増強用または筋肉量減少阻害用飼料添加剤組成物。
【請求項11】
ＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を、これを必要とする個体に処理する段階；を含む、筋肉減少による疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、筋分化のメカニズムにおけるＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）の機能に関するものであって、より詳細にはＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤の用途に関する。
【背景技術】
【0002】
骨格筋の質量は、体重の４０～５０％であり、身体において質量が最も大きな組織である。骨格筋の発達は、ＭｙｏＤｅｎｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ、筋芽細胞の増殖、および末端分化を含むメカニズムが要求される。筋形成（ＭｙｏＤｅｎｅｓｉｓ）の過程は、シグナルカ伝達スケードのターミナルエフェクターの役割を果たし、適切な発達段階－特異的転写物により制御される。分化段階は、ＭｙｏＤ（ＭｙｏＤｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）ファミリー、ＭＥＦ２（ｍｙｏｃｙｔｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆａｃｔｏｒ-２）ファミリー、および他の転写因子を含む筋肉－特異的転写因子の複雑なネットワークによって制御される。
筋肉の減少により引き起こされるサルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）は、主に加齢による筋肉の減少により発病する。現在、韓国のみならず全世界的に 高齢化が重要な問題として台頭しているため、サルコペニアに対する社会的関心がますます大きくなっている。これを反映するかのように、米国では２０１６年１０月に、世界保健機関（ＷＨＯ）の国際疾病分類で高齢者のサルコペニアにコード（Ｍ６２．８４）を付与した。しかし、今まで承認された治療剤は皆無であり、開発中の薬物も他の疾患に比べて極めて少ない。特に、ミオスタチン－アクチビン－フォリスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ-ａｃｔｉｖｉｎ-ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）システムおよびアンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を標的とするほとんどの薬剤は、治療効果が大きくないか、または致命的な副作用が存在するなどの限界があるところ、サルコペニアの治療薬剤に対する研究が必要であるのが実情である。
筋肉の減少により引き起こされるサルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）は、主に加齢による筋肉の減少により発病する。現在、韓国のみならず全世界的に 高齢化が重要な問題として台頭しているため、サルコペニアに対する社会的関心がますます大きくなっている。これを反映するかのように、米国では２０１６年１０月に、世界保健機関（ＷＨＯ）の国際疾病分類で高齢者のサルコペニアにコード（Ｍ６２．８４）を付与した。しかし、今まで承認された治療剤は皆無であり、開発中の薬物も他の疾患に比べて極めて少ない。特に、ミオスタチン－アクチビン－フォリスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ-ａｃｔｉｖｉｎ-ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）システムおよびアンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を標的とするほとんどの薬剤は、治療効果が大きくないか、または致命的な副作用が存在するなどの限界があるところ、サルコペニアの治療薬剤に対する研究が必要であるのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
そこで、本発明者等は、筋分化においてＰＨＦ２０のメカニズムを明らかにすることによって本発明を完成した。
本発明の目的は、ＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の他の目的は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤；またはＹＹ１プロモーター活性阻害剤；を含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明のまた他の目的は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉強化用又は筋肉量減少阻害用組成物を提供する。
本発明の他の目的は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を、これを必要とする個体に処理する段階；を含む、筋肉減少による疾患の治療方法を提供する。
本発明の目的は、ＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の他の目的は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤；またはＹＹ１プロモーター活性阻害剤；を含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明のまた他の目的は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉強化用又は筋肉量減少阻害用組成物を提供する。
本発明の他の目的は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を、これを必要とする個体に処理する段階；を含む、筋肉減少による疾患の治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0004】
前記目的を達成するために、本発明は、ＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤；またはＹＹ１プロモーター活性阻害剤；を含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉増強用または筋肉量減少阻害用健康機能食品組成物を提供する。
また、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉増強用または筋肉量減少阻害用飼料添加剤組成物を提供する。
また、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を、これを必要とする個体に処理する段階；を含む、筋肉減少による疾患の治療方法を提供する。
また、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤；またはＹＹ１プロモーター活性阻害剤；を含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉増強用または筋肉量減少阻害用健康機能食品組成物を提供する。
また、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉増強用または筋肉量減少阻害用飼料添加剤組成物を提供する。
また、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を、これを必要とする個体に処理する段階；を含む、筋肉減少による疾患の治療方法を提供する。
【発明の効果】
【0005】
本発明によるＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで筋分化を促進させるところ、筋肉の減少による疾患の予防、改善または治療分野において多様に活用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】ｑＲＴ－ＰＣＲによりＣ２Ｃ１２細胞の筋分化中におけるＰＨＦ２０の発現を確認した結果を示す図である（Ｐｒｅ、プレマイオサイト（ｐｒｅｍｙｏｃｙｔｅ）；Ｄ１～Ｄ５、分化された日数による細胞）。
【図2】ウエスタンブロッティングによりＣ２Ｃ１２細胞の筋分化中におけるＰＨＦ２０およびＭｙｏＤの発現を確認した結果を示す図である。
【図3】ｑＲＴ－ＰＣＲによりＣ２Ｃ１２細胞の筋分化中におけるＹＹ１の発現を確認した結果を示す図である。
【図4】ウエスタンブロッティングによりＣ２Ｃ１２細胞の筋分化中におけるＹＹ１およびＭｙｏＤの発現を確認した結果を示す図である。
【図5】ＰＨＦ２０の発現がＣ２Ｃ１２細胞の分化に及ぼす影響を確認した結果を示す図である（－Ｄｏｘｙ、ドキシサイクリン未処理細胞；＋Ｄｏｘｙ、ドキシサイクリン処理細胞）。より詳しくは、図５Ａは、Ｃ２Ｃ１２細胞において、ドキシサイクリン処理の有無によるＰＨＦ２０、ＹＹ１およびＭｙｏＤのタンパク質発現を解析した結果である。また、図５Ｂは、Ｃ２Ｃ１２細胞において、ドキシサイクリン処理の有無によるＰＨＦ２０、ＹＹ１およびＭｙｏＤのｍＲＮＡ発現を解析した結果である。
【図6】免疫組織化学染色解析を通じてＰＨＦ２０の発現が筋管形成に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
【図7】ウエスタンブロッティングによりＰＨＦ２０の発現抑制がＹＹ１およびＭｙｏＤの発現に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。より詳しくは、図７Ａは、分化前のＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）の結果であり、図７Ｂは、１日分化された筋線維の結果である。
【図8A】ウエスタンブロッティングによりドキシサイクリンの処理濃度によるＰＨＦ２０の発現を確認した結果（上部パネル）およびルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにいより、前記ＰＨＦ２０の発現によるＹＹ１プロモーターの活性を確認した結果（下部パネル）を示す図である。図８Ｂは、ウエスタンブロッティングにより、ｓｈＲＮＡのトランスフェクトによるＰＨＦ２０の発現を確認した結果（上部パネル）およびルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにより、前記ＰＨＦ２０の発現によるＹＹ１プロモーターの活性を確認した結果（下部パネル）を示す図である。
【図9】図９Ａは、ドキシサイクリン未処理のＣ２Ｃ１２細胞における分化期間によるＹＹ１プロモーターの活性（上部パネル）およびＰＨＦ２、ＹＹ１およびＭｙｏＤの発現（下部パネル）を確認した結果を示す図である。図９Ｂは、ドキシサイクリン処理したＣ２Ｃ１２細胞における分化期間によるＹＹ１プロモーターの活性（上部パネル）およびＰＨＦ２、ＹＹ１およびＭｙｏＤの発現（下部パネル）を確認した結果を示す図である。
【図10】クロマチン免疫沈降アッセイによりＰＨＦ２０がＹＹ１プロモーターを調節する方式を確認した結果を示す図である。
【図11】ウエスタンブロッティングによりＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）および３日間分化させた細胞において、ＹＹ１の発現がＭｙｏＤの発現に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
【図12】免疫組織化学染色解析により１日分化されたＣ２Ｃ１２細胞において、ＹＹ１の発現が筋管形成に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
【図13】ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスにおいて、ＰＨＦ２０、ＹＹ１およびＭＨＣの発現をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す図である（ＷＴ、対照群；ＰＨＦ２０-ＴＧ、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウス）。
【図15】組織学的解析によりＰＨＦ２０トランスジェニックマウスの腓腹筋組織を観察した結果を示す図である。より詳しくは、図１５Ａは、前記腓腹筋組織の横断面を観察したものであり、図１５Ｂは、縦断面を観察した結果である。
【図16】組織学的解析によりトランスジェニックマウスの腓腹筋組織の横断面を観察した結果を示す図である。
【図17】免疫組織化学染色解析によりＰＨＦ２０トランスジェニックマウスの腓腹筋組織を観察した結果を示す図である。より詳しくは、図１７Ａは、前記腓腹筋組織の縦断面を観察したものであり、図１７Ｂは、横断面を観察した結果である。
【図18】ＰＨＦ２０の発現が筋肉分化に及ぼすメカニズムを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0007】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の態様によれば、本発明は、ＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を、これを必要とする個体に処理する段階；を含む、筋肉減少による疾患の治療方法を提供する。
本発明の態様によれば、本発明は、ＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を、これを必要とする個体に処理する段階；を含む、筋肉減少による疾患の治療方法を提供する。
【0008】
本発明において、ＰＨＦ２０（ｐｌａｎｔ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０，ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）は、ヒストンＨ４をアセチル化したリジンアセチルトランスフェラーゼ複合体（ｌｙｓｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）のマルチドメインタンパク質およびサブユニットである。ＰＨＦ２０は、転写因子であって、神経膠腫患者から初めて確認された。ＰＨＦ２０ノックアウトマウスは、出生後まもなく死亡し、骨格系および造血系内において様々な表現型がみられる。しかし、ＰＨＦ２０ノックアウトマウスから、これら表現型の詳細なメカニズムは報告されなかった。
本発明の実施形態において、前記ＰＦＨ２０は筋分化において、図１８のようなメカニズムを通じて筋分化に影響を及ぼすことが確認された。より詳しくは、ＰＨＦ２０の発現阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＹＹ１プロモーターに結合されたＰＨＦ２０を分離させ、ＭｙｏＤの発現を増加させ、前記ＭｙｏＤ（ＭｙｏＤｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）の発現の増加は、筋分化を促進する。
本発明の具体例において、前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、ＹＹ１プロモータ活性阻害剤であることが好ましい。
本発明の実施形態において、前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、ＭｙｏＤの発現を増加させ、筋分化を促進させるものであってもよい。
本発明において、ＹＹ１（Ｙｉｎ Ｙａｎｇ １）は、４個のＣ－末端ジンクフィンガードメインを介してＤＮＡに結合する転写抑制タンパク質を意味する。骨格筋において、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）阻害薬のラパマイシン治療は、ミトコンドリア転写調節因子（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の遺伝子発現を増加させ、ミトコンドリア遺伝子発現および酸素消費を低減させる。ｍＴＯＲリン酸化およびその下流の標的であるＹＹ１およびＰＧＣ-１α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ １-ａｌｐｈａ）Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞において、ＦＧＦ２１（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２１）の処理によって増加される。筋芽細胞において、ＦＧＦ２１によるｍＴＯＲ-ＹＹ１-ＰＧＣ１α経路の活性化は、細胞内ＡＴＰ合成、酸素消費率、クエン酸合成酵素（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性、解糖、ミトコンドリアＤＮＡコピー数および主要エネルギー発現の有意な増加によって現れるエネルギー恒常性を調節する。
本発明の実施形態において、前記筋肉減少による疾患は、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、緊張減退症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉の退化、筋強直性ジストロフィー （ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、 筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）および悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明の実施形態において、前記ＰＦＨ２０は筋分化において、図１８のようなメカニズムを通じて筋分化に影響を及ぼすことが確認された。より詳しくは、ＰＨＦ２０の発現阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＹＹ１プロモーターに結合されたＰＨＦ２０を分離させ、ＭｙｏＤの発現を増加させ、前記ＭｙｏＤ（ＭｙｏＤｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）の発現の増加は、筋分化を促進する。
本発明の具体例において、前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、ＹＹ１プロモータ活性阻害剤であることが好ましい。
本発明の実施形態において、前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、ＭｙｏＤの発現を増加させ、筋分化を促進させるものであってもよい。
本発明において、ＹＹ１（Ｙｉｎ Ｙａｎｇ １）は、４個のＣ－末端ジンクフィンガードメインを介してＤＮＡに結合する転写抑制タンパク質を意味する。骨格筋において、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）阻害薬のラパマイシン治療は、ミトコンドリア転写調節因子（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の遺伝子発現を増加させ、ミトコンドリア遺伝子発現および酸素消費を低減させる。ｍＴＯＲリン酸化およびその下流の標的であるＹＹ１およびＰＧＣ-１α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ １-ａｌｐｈａ）Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞において、ＦＧＦ２１（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２１）の処理によって増加される。筋芽細胞において、ＦＧＦ２１によるｍＴＯＲ-ＹＹ１-ＰＧＣ１α経路の活性化は、細胞内ＡＴＰ合成、酸素消費率、クエン酸合成酵素（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性、解糖、ミトコンドリアＤＮＡコピー数および主要エネルギー発現の有意な増加によって現れるエネルギー恒常性を調節する。
本発明の実施形態において、前記筋肉減少による疾患は、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、緊張減退症（ａｔｏｎｙ）、筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋ジストロフィー（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉の退化、筋強直性ジストロフィー （ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、 筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）および悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）からなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【0009】
本発明において、「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与により、筋肉減少による疾患の発症を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味する。また、本発明において、「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与により、筋肉減少による疾患の症状が好転したり有利に変更するすべての行為を意味する。
本発明の具体例において、前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、ＰＨＦ２０遺伝子に相補的に結合するｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択された１種以上であってもよい。
本発明の好ましい具体例において、前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、配列番号１の塩基配列で表されるｓｈＲＮＡであってもよく、配列番号１で表される塩基配列の変異体もまた本発明の範囲内に含まれる。本発明の配列番号１で表されるｓｈＲＮＡの官能性同等物、例えば、配列番号１で表される配列の一部が欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）により改変されたが、これにより配列番号１の塩基配列からなるｓｈＲＮＡと機能的に同一の作用をすることができる変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む概念である。
具体的には、ｓｈＲＮＡは、配列番号１の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する配列を含むことができる。ポリヌクレオチドまたはアミノ酸に対する「配列相同性の％」は、２個の最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認される。
前記ｓｉＲＮＡは、ＰＨＦ２０遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列中から選択される１５～３０マー（ｍｅｒ）のセンス配列および該センス配列に相補的に結合するアンチセンス配列からなり、このとき、前記センス配列は、特にこれに制限されるものではない。
本発明の実施形態において、前記ＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤は、ＰＨＦ２０タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、および抗体からなる群より選択された１種以上であってもよい。
前記化合物は、ＰＨＦ２０タンパク質に特異的に結合し、その活性を阻害することができる任意の化合物を全て含む。
前記抗体は、ＰＨＦ２０タンパク質に特異的かつ直接的に結合し、ＰＨＦ２０タンパク質の活性を効果的に抑制することができる。前記ＰＨＦ２０タンパク質に特異的に結合する抗体としては、ポリクローナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体またはモノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体を用いることが好ましく、前記抗体は、当業者に知られている公知の方法で作製することができ、市販の抗体を購入して用いることもできる。
本発明の具体例において、前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、ＰＨＦ２０遺伝子に相補的に結合するｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択された１種以上であってもよい。
本発明の好ましい具体例において、前記ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤は、配列番号１の塩基配列で表されるｓｈＲＮＡであってもよく、配列番号１で表される塩基配列の変異体もまた本発明の範囲内に含まれる。本発明の配列番号１で表されるｓｈＲＮＡの官能性同等物、例えば、配列番号１で表される配列の一部が欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）により改変されたが、これにより配列番号１の塩基配列からなるｓｈＲＮＡと機能的に同一の作用をすることができる変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む概念である。
具体的には、ｓｈＲＮＡは、配列番号１の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する配列を含むことができる。ポリヌクレオチドまたはアミノ酸に対する「配列相同性の％」は、２個の最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認される。
前記ｓｉＲＮＡは、ＰＨＦ２０遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列中から選択される１５～３０マー（ｍｅｒ）のセンス配列および該センス配列に相補的に結合するアンチセンス配列からなり、このとき、前記センス配列は、特にこれに制限されるものではない。
本発明の実施形態において、前記ＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤は、ＰＨＦ２０タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、および抗体からなる群より選択された１種以上であってもよい。
前記化合物は、ＰＨＦ２０タンパク質に特異的に結合し、その活性を阻害することができる任意の化合物を全て含む。
前記抗体は、ＰＨＦ２０タンパク質に特異的かつ直接的に結合し、ＰＨＦ２０タンパク質の活性を効果的に抑制することができる。前記ＰＨＦ２０タンパク質に特異的に結合する抗体としては、ポリクローナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体またはモノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体を用いることが好ましく、前記抗体は、当業者に知られている公知の方法で作製することができ、市販の抗体を購入して用いることもできる。
【0010】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加剤をさらに含むことができ、このとき、薬剤学的に許容される添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸水素カルシウム、乳糖、マンニトール、飴、アラビアゴム、アルファ化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナバワックス、合成珪酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖などを用いることができる。本発明による薬剤学的に許容される添加剤は、前記組成物に対して０．１～９０重量部含まれることが好ましいが、これに限定されるものではない。
また、本発明の薬学的組成物は、実際の臨床投与時に経口または非経口の種々の剤形で投与されることができるが、製剤化する場合には通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製することができ、当該技術分野に知られた適合した製剤を用いることが好ましい。前記組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などがある。
前記経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。また、前記経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが相当するが、よく用いられる単純な希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。
前記非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを用いることができる。座薬の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。前記非経口投与は、皮膚外用または腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射などの注入方式を用いてなることができる。
本発明の薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度によってその範囲が多様であり、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で投与することができる。
本発明の薬学的組成物は、筋肉減少による疾患の予防または治療のために単独で、または手術、放射線治療、ホルモン療法、化学療法および生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用することができる。
また、本発明の薬学的組成物は、実際の臨床投与時に経口または非経口の種々の剤形で投与されることができるが、製剤化する場合には通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製することができ、当該技術分野に知られた適合した製剤を用いることが好ましい。前記組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などがある。
前記経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。また、前記経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが相当するが、よく用いられる単純な希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。
前記非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを用いることができる。座薬の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。前記非経口投与は、皮膚外用または腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射などの注入方式を用いてなることができる。
本発明の薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度によってその範囲が多様であり、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で投与することができる。
本発明の薬学的組成物は、筋肉減少による疾患の予防または治療のために単独で、または手術、放射線治療、ホルモン療法、化学療法および生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用することができる。
【0011】
本発明の他の態様によれば、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤；またはＹＹ１プロモーター活性阻害剤；を含む、筋肉減少による疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の具体例において、前記ＹＹ１プロモーター活性阻害剤は、ｓｉＲＮＡであってもよく、配列番号２の塩基配列で表されることが好ましい。
本発明の具体例において、前記ＹＹ１プロモーター活性阻害剤は、ｓｉＲＮＡであってもよく、配列番号２の塩基配列で表されることが好ましい。
【0012】
本発明のまた他の態様によれば、本発明は、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤を有効成分として含む、筋肉増強用または筋肉量減少阻害用組成物を提供する。
前記組成物は、健康機能食品組成物または飼料添加剤組成物であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明において、飼料添加剤は、栄養的または特定の目的のために飼料に微量添加される物質を意味する。
前記筋肉増強用または筋肉量減少阻害用組成物が健康機能食品組成物である場合、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤をそのまま添加したり、他の食品または食品成分とともに使用することができ、通常の方法により適宜使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適切に決定することができる。一般に、食品または飲料を製造する際に、本発明のＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤は、全組成物に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康および衛生を目的とする、または健康調節を目的とする長期間摂取の場合は、前記範囲以下であってもよく、安全性の面で何ら問題がないので、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。
前記健康機能食品の種類には特別な制限はない。前記健康機能食品としては、キャンデー類、スナック類、ガム類、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などがあり、通常の意味での健康食品を全て含む。
前記筋肉増強または筋肉量減少阻害用組成物が飼料添加剤組成物である場合、本発明の飼料添加剤組成物は、飼料原料に適宜配合して飼料として提供されるが、前記飼料原料として、穀物類、糟糠類、植物油糧、動物性飼料原料、その他の飼料原料、精製品などが用いられるが、これに限定されるものではない。
前記組成物は、健康機能食品組成物または飼料添加剤組成物であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明において、飼料添加剤は、栄養的または特定の目的のために飼料に微量添加される物質を意味する。
前記筋肉増強用または筋肉量減少阻害用組成物が健康機能食品組成物である場合、ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤をそのまま添加したり、他の食品または食品成分とともに使用することができ、通常の方法により適宜使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適切に決定することができる。一般に、食品または飲料を製造する際に、本発明のＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤は、全組成物に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康および衛生を目的とする、または健康調節を目的とする長期間摂取の場合は、前記範囲以下であってもよく、安全性の面で何ら問題がないので、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。
前記健康機能食品の種類には特別な制限はない。前記健康機能食品としては、キャンデー類、スナック類、ガム類、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などがあり、通常の意味での健康食品を全て含む。
前記筋肉増強または筋肉量減少阻害用組成物が飼料添加剤組成物である場合、本発明の飼料添加剤組成物は、飼料原料に適宜配合して飼料として提供されるが、前記飼料原料として、穀物類、糟糠類、植物油糧、動物性飼料原料、その他の飼料原料、精製品などが用いられるが、これに限定されるものではない。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、実施形態を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施形態は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施形態によって限定されるものと解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
実験材料
抗－ＰＨＦ２０抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。抗－β－アクチン抗体は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から得た。抗－ＹＹ１、抗－ＭｙｏＤおよび抗ミオシン重鎖抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。抗－ミオシン（ＭＦ２０）抗体は、アイオワ大学のＤＳＨＢから得た。ＨＲＰが結合した抗－マウス、抗－ウサギ抗体および抗－ヤギＩｇＧ抗体は、Ｋｏｍａ ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から入手した。ｐＹＹ－ルシフェラーゼは、Ｐａｎｏｍｉｃｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）から購入した。Ｔｅｔ-ｏｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）から入手した。
実験材料
抗－ＰＨＦ２０抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。抗－β－アクチン抗体は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から得た。抗－ＹＹ１、抗－ＭｙｏＤおよび抗ミオシン重鎖抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。抗－ミオシン（ＭＦ２０）抗体は、アイオワ大学のＤＳＨＢから得た。ＨＲＰが結合した抗－マウス、抗－ウサギ抗体および抗－ヤギＩｇＧ抗体は、Ｋｏｍａ ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から入手した。ｐＹＹ－ルシフェラーゼは、Ｐａｎｏｍｉｃｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）から購入した。Ｔｅｔ-ｏｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）から入手した。
【0014】
実験例１．細胞培養
１-１．Ｃ２Ｃ１２細胞培養および分化
プレマイオサイト（ｐｒｅｍｙｏｃｙｔｅ）であるＣ２Ｃ１２細胞は、ＤＭＥＭ培地を使用して３７℃および５％ＣＯ２の条件で培養した。前記ＤＭＥＭ（ＷＥＬＧＥＮＥ，Ｇｙｅｏｎｇｓａｎ，Ｋｏｒｅａ）培地は、１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＳＡ）および１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ-Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）を含む。
細胞分化のために、培地を分化培地（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭ）に交換した後、培養し、培地を２日毎に交換した。前記分化培地は、２％ウマ血清（ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ）および１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ-Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）を含む。前記細胞分化は、培地を交換してから２４時間後に始まった。
１-２．Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞
Ｃ２Ｃ１２細胞を用いてＣ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞を調製した。具体的には、Ｃ２Ｃ１２-ＴＥＴ３Ｇ筋芽細胞を調製するために、Ｃ２Ｃ１２細胞にレンチウイルス－ＴＥＴ３Ｇを施し、Ｇ４１８（１．２ｍｇ／ｍｌ）を選択し、Ｃ２Ｃ１２-ＴＥＴ３Ｇ筋芽細胞を得た。前記Ｃ２Ｃ１２-ＴＥＴ３Ｇ細胞をｐＬＶＸ-ＴＲＥ３Ｇ-ＰＨＦ２０で一時的にトランスフェクトした。ピューロマイシン（３μｇ／ｍｌ）を用いて一時的にトランスフェクトした細胞中、Ｔｅｔ－Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞を選択した。選択された細胞（Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞）は、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，Ｄｏｘｙ）が含まれた培地で培養すると、ＰＨＦ２０の発現が誘導される。
後述する実験において、Ｃ２Ｃ１２細胞からＰＨＦ２０の発現を誘導するためにドキシサイクリンを１００ｎｇ／ｍｌの濃度で含む培地で培養した。
１-１．Ｃ２Ｃ１２細胞培養および分化
プレマイオサイト（ｐｒｅｍｙｏｃｙｔｅ）であるＣ２Ｃ１２細胞は、ＤＭＥＭ培地を使用して３７℃および５％ＣＯ２の条件で培養した。前記ＤＭＥＭ（ＷＥＬＧＥＮＥ，Ｇｙｅｏｎｇｓａｎ，Ｋｏｒｅａ）培地は、１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＳＡ）および１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ-Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）を含む。
細胞分化のために、培地を分化培地（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭ）に交換した後、培養し、培地を２日毎に交換した。前記分化培地は、２％ウマ血清（ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ）および１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ-Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）を含む。前記細胞分化は、培地を交換してから２４時間後に始まった。
１-２．Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞
Ｃ２Ｃ１２細胞を用いてＣ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞を調製した。具体的には、Ｃ２Ｃ１２-ＴＥＴ３Ｇ筋芽細胞を調製するために、Ｃ２Ｃ１２細胞にレンチウイルス－ＴＥＴ３Ｇを施し、Ｇ４１８（１．２ｍｇ／ｍｌ）を選択し、Ｃ２Ｃ１２-ＴＥＴ３Ｇ筋芽細胞を得た。前記Ｃ２Ｃ１２-ＴＥＴ３Ｇ細胞をｐＬＶＸ-ＴＲＥ３Ｇ-ＰＨＦ２０で一時的にトランスフェクトした。ピューロマイシン（３μｇ／ｍｌ）を用いて一時的にトランスフェクトした細胞中、Ｔｅｔ－Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞を選択した。選択された細胞（Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞）は、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，Ｄｏｘｙ）が含まれた培地で培養すると、ＰＨＦ２０の発現が誘導される。
後述する実験において、Ｃ２Ｃ１２細胞からＰＨＦ２０の発現を誘導するためにドキシサイクリンを１００ｎｇ／ｍｌの濃度で含む培地で培養した。
【0015】
実験例２．ウェスタンブロッティング
調製された細胞を氷上に置き、前記細胞に溶解緩衝液で処理し、細胞溶解物を製造した。前記溶解緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％ｖ／ｖのＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ-４０、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのフッ化ナトリウム、４０ｍＭのβ-リン酸、０．１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭのベンザミジンおよび２μＭのミクロシスチン－ＬＲを含む。細胞溶解物を１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、タンパク質を得た。該タンパク質を１０．０～７．５％ゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥで展開した。展開されたタンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ-Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。それから、メンブレンを５％のスキムミルクおよび０．２％のＴｗｅｅｎ-２０を含有する１Ｘ ＴＢＳ（ｔｒｉ-ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ；１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を施し、１時間ブロッキングした。その後、１０００倍希釈された各タンパク質に対する１次抗体を処理した後、４℃で一晩培養した。反応後、ＴＢＳでメンブレンを洗浄した。洗浄したメンブレンに２０００倍希釈した２次抗体（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ-ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＩｇＧまたはａｎｔｉ-ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｋｏｍａｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ））を処理した後、培養した。培養後、メンブレンをＴＢＳで洗浄し、メーカーのマニュアルに従ってタンパク質を検出した。
調製された細胞を氷上に置き、前記細胞に溶解緩衝液で処理し、細胞溶解物を製造した。前記溶解緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％ｖ／ｖのＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ-４０、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのフッ化ナトリウム、４０ｍＭのβ-リン酸、０．１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭのベンザミジンおよび２μＭのミクロシスチン－ＬＲを含む。細胞溶解物を１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、タンパク質を得た。該タンパク質を１０．０～７．５％ゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥで展開した。展開されたタンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ-Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。それから、メンブレンを５％のスキムミルクおよび０．２％のＴｗｅｅｎ-２０を含有する１Ｘ ＴＢＳ（ｔｒｉ-ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ；１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、２５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を施し、１時間ブロッキングした。その後、１０００倍希釈された各タンパク質に対する１次抗体を処理した後、４℃で一晩培養した。反応後、ＴＢＳでメンブレンを洗浄した。洗浄したメンブレンに２０００倍希釈した２次抗体（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ-ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＩｇＧまたはａｎｔｉ-ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｋｏｍａｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ））を処理した後、培養した。培養後、メンブレンをＴＢＳで洗浄し、メーカーのマニュアルに従ってタンパク質を検出した。
【0016】
実験例３．リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ-ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑＲＴＰＣＲ）
Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞を６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。ＰＨＦ－２０の発現を誘導するために、前記Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞にドキシサイクリンを処理した。ドキシサイクリンを処理した翌日、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＲＮＡ ｋｉｔ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ’ｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、細胞から全ＲＮＡを抽出した。また、ＳｕＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ（ＧｅＮｅｔ Ｂｉｏ，Ｃｈｅｏｎａｎ，Ｋｏｒｅａ）を用いて、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ増幅は、Ｐｒｉｍｅ Ｑ-Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＧｅＮｅｔ Ｂｉｏ，Ｃｈｅｏｎａｎ，Ｋｏｒｅａ）およびＣＦＸ９６Ｔ Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ-Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った。各ｃＤＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲアッセイは、ＳＹＢＲ緑色染料およびＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ＤＮＡ二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ）の形成を測定した。
本実験にて用いたプライマーを表１に示す。
Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞を６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。ＰＨＦ－２０の発現を誘導するために、前記Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞にドキシサイクリンを処理した。ドキシサイクリンを処理した翌日、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＲＮＡ ｋｉｔ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ’ｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、細胞から全ＲＮＡを抽出した。また、ＳｕＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ（ＧｅＮｅｔ Ｂｉｏ，Ｃｈｅｏｎａｎ，Ｋｏｒｅａ）を用いて、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ増幅は、Ｐｒｉｍｅ Ｑ-Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＧｅＮｅｔ Ｂｉｏ，Ｃｈｅｏｎａｎ，Ｋｏｒｅａ）およびＣＦＸ９６Ｔ Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ-Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った。各ｃＤＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲアッセイは、ＳＹＢＲ緑色染料およびＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ＤＮＡ二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ）の形成を測定した。
本実験にて用いたプライマーを表１に示す。
【表1】
【0017】
実験例４．免疫組織化学染色解析を通じたミオシン重鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＭＨＣ）の検出
Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞を１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で滅菌したカバースリップを含む１２ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２の条件で培養した。ドキシサイクリン未処理群（－Ｄｏｘｙ）は、細胞にドキシサイクリンを処理せずに２４時間培養し、ドキシサイクリン処理群（＋Ｄｏｘｙ）は、培地をドキシサイクリンを含む培地に交換した後、２４時間培養した。培養された各細胞の培地を分化培地に交換した後、１日（Ｄ１）または３日（Ｄ３）間培養して分化させた。それから、細胞を３７℃のＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１５分間培養し、カバースリップに固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。ブロッキングのために、カバースリップに１％のＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を処理した後、室温で１時間振とう培養した。また、ａｎｔｉ-ｍｙｏｓｉｎ（ＭＦ-２０）抗体を１：２００の割合で希釈し、細胞に添加し、４℃で一晩振とう培養した。振とう培養後、カバースリップをＰＢＳで３回洗浄した。ＦＩＴＣ２次抗体（１：１０００）（ｉｎ ５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を添加した後、暗所において室温で６時間振とう培養した。振とう培養後、カバースリップをＰＢＳで３回洗浄した。洗浄したカバースリップの培地をＤＡＰＩ ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を含むマウンティング培地に交換した後、スライドに結合させて蛍光を解析した。
Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞を１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で滅菌したカバースリップを含む１２ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２の条件で培養した。ドキシサイクリン未処理群（－Ｄｏｘｙ）は、細胞にドキシサイクリンを処理せずに２４時間培養し、ドキシサイクリン処理群（＋Ｄｏｘｙ）は、培地をドキシサイクリンを含む培地に交換した後、２４時間培養した。培養された各細胞の培地を分化培地に交換した後、１日（Ｄ１）または３日（Ｄ３）間培養して分化させた。それから、細胞を３７℃のＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１５分間培養し、カバースリップに固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。ブロッキングのために、カバースリップに１％のＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を処理した後、室温で１時間振とう培養した。また、ａｎｔｉ-ｍｙｏｓｉｎ（ＭＦ-２０）抗体を１：２００の割合で希釈し、細胞に添加し、４℃で一晩振とう培養した。振とう培養後、カバースリップをＰＢＳで３回洗浄した。ＦＩＴＣ２次抗体（１：１０００）（ｉｎ ５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を添加した後、暗所において室温で６時間振とう培養した。振とう培養後、カバースリップをＰＢＳで３回洗浄した。洗浄したカバースリップの培地をＤＡＰＩ ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を含むマウンティング培地に交換した後、スライドに結合させて蛍光を解析した。
【0018】
実験例５．ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞を３ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で６ウェルプレートに播種した。播種された細胞にＹＹ１-ルシフェラーゼを含むプラスミド１μｇを、メーカーのマニュアルに従ってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、２４時間後、実験のために使用した。
トランスフェクトされた細胞にレポーター溶解緩衝液を施し、細胞を溶解させた。前記レポーター溶解緩衝液は、２５ｍＭのリン酸トリス、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのｔｒａｎｓ－１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールおよび１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ ｘ-１００を含む。ルシフェラーゼの活性は、細胞溶解物２０μｇにｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して培養し、１０秒間の発光をルミノメーター（Ｄｕｏ Ｌｕｍａｔ ＬＢ ９５０７）を用いて測定した。
Ｃ２Ｃ１２／Ｔｅｔ-Ｏｎ誘導性ＰＨＦ２０細胞を３ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で６ウェルプレートに播種した。播種された細胞にＹＹ１-ルシフェラーゼを含むプラスミド１μｇを、メーカーのマニュアルに従ってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、２４時間後、実験のために使用した。
トランスフェクトされた細胞にレポーター溶解緩衝液を施し、細胞を溶解させた。前記レポーター溶解緩衝液は、２５ｍＭのリン酸トリス、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのｔｒａｎｓ－１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールおよび１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ ｘ-１００を含む。ルシフェラーゼの活性は、細胞溶解物２０μｇにｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して培養し、１０秒間の発光をルミノメーター（Ｄｕｏ Ｌｕｍａｔ ＬＢ ９５０７）を用いて測定した。
【0019】
実験例６．クロマチン免疫沈降（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ-ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣｈｉＰ）アッセイ
クロマチン免疫沈降アッセイは、メーカーのマニュアル（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）に従って行った。具体的には、Ｃ２Ｃ１２細胞を３日間分化させ、ホルムアルデヒドを７．５分間処理した。その後、プロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、氷上に移した。氷上の細胞にＳＤＳ－溶解緩衝液を処理した後、１０分間培養し、溶解物を得た。前記溶解緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび２μｇ／ｍｌのぺプスタチンを含む。前記得られた溶解物は、１次抗体または対照群ＩｇＧを処理した後、４℃で一晩培養した。その後、培養物にプロテインＡビーズ（５００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび２００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む）３０μｌを共に４℃で３時間培養した。培養後、ＤＮＡ試料は、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて定量した。ｑＲＴ－ＰＣＲの結果は、入力された値の百分率で表示する。本実験にて使用したプロモーター特異的プライマーであるｍｏｕｓｅ ＹＹ１（-２００／-５５）の配列は、以下の通りである。
-ｍｏｕｓｅ ＹＹ１（-２００／-５５）：５’ -ＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴ-３’（順方向、配列番号１２）、５’ -ＣＧＴＣＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧＴＡＧＡ-３’（逆方向、配列番号１３）
クロマチン免疫沈降アッセイは、メーカーのマニュアル（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）に従って行った。具体的には、Ｃ２Ｃ１２細胞を３日間分化させ、ホルムアルデヒドを７．５分間処理した。その後、プロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、氷上に移した。氷上の細胞にＳＤＳ－溶解緩衝液を処理した後、１０分間培養し、溶解物を得た。前記溶解緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび２μｇ／ｍｌのぺプスタチンを含む。前記得られた溶解物は、１次抗体または対照群ＩｇＧを処理した後、４℃で一晩培養した。その後、培養物にプロテインＡビーズ（５００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび２００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む）３０μｌを共に４℃で３時間培養した。培養後、ＤＮＡ試料は、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて定量した。ｑＲＴ－ＰＣＲの結果は、入力された値の百分率で表示する。本実験にて使用したプロモーター特異的プライマーであるｍｏｕｓｅ ＹＹ１（-２００／-５５）の配列は、以下の通りである。
-ｍｏｕｓｅ ＹＹ１（-２００／-５５）：５’ -ＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴ-３’（順方向、配列番号１２）、５’ -ＣＧＴＣＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧＴＡＧＡ-３’（逆方向、配列番号１３）
【0020】
実験例７．ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスの作製
ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスを作製するために、ｐｃＤＮＡ３ベクターのＣＭＶプロモータの下流に、ヒトＰＨＦ２０をコードするｃＤＮＡをサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）し、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを前記ベクターでトランスフェクトした。対照群は、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いており、ＷＴで表わした。マウスＰＨＦ２０－ＴＧおよびＷＴは、１２ｈ／１２ｈ長日周期、湿度５０～６０％、および周辺温度２２℃の環境で飼育した。また、全ての動物実験は機関におけるガイドラインに従って動物施設にて行われた。実験プロトコルは、忠南大学（ＣＮＵ-００８９０）の検討委員会から承認を得た。
ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスを作製するために、ｐｃＤＮＡ３ベクターのＣＭＶプロモータの下流に、ヒトＰＨＦ２０をコードするｃＤＮＡをサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）し、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを前記ベクターでトランスフェクトした。対照群は、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いており、ＷＴで表わした。マウスＰＨＦ２０－ＴＧおよびＷＴは、１２ｈ／１２ｈ長日周期、湿度５０～６０％、および周辺温度２２℃の環境で飼育した。また、全ての動物実験は機関におけるガイドラインに従って動物施設にて行われた。実験プロトコルは、忠南大学（ＣＮＵ-００８９０）の検討委員会から承認を得た。
【0021】
実験例８．組織学的解析および免疫組織化学染色解析
マウスから採取した筋肉は、１０％のホルマリンで処理した上、４℃で一晩培養して固定した。固定された筋肉試料は、パラフィンブロックに包埋した。パラフィンブロックを切り取り、５μｍ厚の切片を用意した。隣接部位の薄片をさらに用意し、順にスライドを作製した。
一般的な形態学的解析を行うために、作製したスライドをヘマトキシリンおよびエオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎおよびｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）で染色した。
また、免疫組織化学解析を行うために、スライド上の切片をキシレンで脱パラフィン化させ、エタノールを用いて再水和させた。次いで、スライドをペルオキシダーゼ反応停止液（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に浸して１０分間反応させた。反応後、スライドをＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄し、ブロッキングのためにスライドに試薬Ａを２滴加えた後、３０分間培養した。培養後、スライドをＰＢＳで２回洗浄した。洗浄したスライドに１次抗体（ａｎｔｉ-ＭＨＣ）を処理した後、４℃で一晩培養した。培養されたスライドをＰＢＳで洗浄した後、ビオチン化された（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）２次抗体試薬Ｂを処理し、室温で１時間培養した。培養されたスライドをＰＢＳで洗浄した後、酵素が結合された試薬Ｃをスライドに滴下し、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＢ発色体；および試薬、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３の混合物；をスライドに滴下させ、蛍光顕微鏡でシグナルを観察した。そして、蒸留水で反応を止めてから蛍光顕微鏡でスライドの写真を撮った。
マウスから採取した筋肉は、１０％のホルマリンで処理した上、４℃で一晩培養して固定した。固定された筋肉試料は、パラフィンブロックに包埋した。パラフィンブロックを切り取り、５μｍ厚の切片を用意した。隣接部位の薄片をさらに用意し、順にスライドを作製した。
一般的な形態学的解析を行うために、作製したスライドをヘマトキシリンおよびエオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎおよびｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）で染色した。
また、免疫組織化学解析を行うために、スライド上の切片をキシレンで脱パラフィン化させ、エタノールを用いて再水和させた。次いで、スライドをペルオキシダーゼ反応停止液（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に浸して１０分間反応させた。反応後、スライドをＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄し、ブロッキングのためにスライドに試薬Ａを２滴加えた後、３０分間培養した。培養後、スライドをＰＢＳで２回洗浄した。洗浄したスライドに１次抗体（ａｎｔｉ-ＭＨＣ）を処理した後、４℃で一晩培養した。培養されたスライドをＰＢＳで洗浄した後、ビオチン化された（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）２次抗体試薬Ｂを処理し、室温で１時間培養した。培養されたスライドをＰＢＳで洗浄した後、酵素が結合された試薬Ｃをスライドに滴下し、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＢ発色体；および試薬、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３の混合物；をスライドに滴下させ、蛍光顕微鏡でシグナルを観察した。そして、蒸留水で反応を止めてから蛍光顕微鏡でスライドの写真を撮った。
【0022】
実験例９．統計解析
データは平均±Ｓ．Ｅ．で表した。少なくとも３回の実験におけるグループ間の差は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ-ｔｅｓｔを用いて解析し、Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であるとみなした。また、結果の定量解析にはＩｍａｇｅ Ｊソフトウェア（バージョン１．４７）を使用した。
データは平均±Ｓ．Ｅ．で表した。少なくとも３回の実験におけるグループ間の差は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ-ｔｅｓｔを用いて解析し、Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であるとみなした。また、結果の定量解析にはＩｍａｇｅ Ｊソフトウェア（バージョン１．４７）を使用した。
【0023】
実施形態１．筋分化中におけるＹＹ１およびＰＨＦ２０の発現の解析
筋分化におけるＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）の変化を評価するために、筋分化におけるＹＹ１（Ｙｉｎ Ｙａｎｇ １）およびＰＨＦ２０ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現をｑＲＴ－ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングにより解析した。
１-１．ＰＨＦ２０
Ｃ２Ｃ１２細胞を播種してから２４時間後、２％ウマ血清を含有する分化培地（ＤＭ）に交換し、筋分化を誘導した。細胞のＰＨＦ２０ ｍＲＮＡ発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲを通じて筋分化期間中、毎日測定した。また、前記筋分化期間中、ＰＨＦ２０およびＭｙｏＤのタンパク質発現は、ウエスタンブロッティングにより毎日確認した。ＰＨＦ２０ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を解析した結果は、それぞれ図１および２に示す。
図１および２に示すように、筋分化が進むほどＰＨＦ２０は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が減少することが確認された。その反面、ＭｙｏＤは、筋分化が進むほどタンパク質の発現が増加することが確認された。上記の結果は、Ｃ２Ｃ１２細胞において転写因子のＰＨＦ２０が筋分化に関与しうることを示唆する。
１-２．ＹＹ１
ＹＹ１は、先行研究を通じてＰＨＦ２０が過剰発現される細胞において、発現が増加されることが確認されている。そこで、ＹＹ１のｍＲＮＡおよびタンパク質発現を、前記実施形態１－１と同様の方法で解析した。ＹＹ１のｍＲＮＡおよびタンパク質発現を解析した結果は、それぞれ図３および４に示す。
図３および４に示すように、ＹＹ１は、筋分化が進むほどｍＲＮＡの発現が減少することが確認された。また、筋分化が進むほどＭｙｏＤのタンパク質発現は、増加したが、ＹＹ１のタンパク質発現は、減少したことが確認された。
筋分化におけるＰＨＦ２０（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）の変化を評価するために、筋分化におけるＹＹ１（Ｙｉｎ Ｙａｎｇ １）およびＰＨＦ２０ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現をｑＲＴ－ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングにより解析した。
１-１．ＰＨＦ２０
Ｃ２Ｃ１２細胞を播種してから２４時間後、２％ウマ血清を含有する分化培地（ＤＭ）に交換し、筋分化を誘導した。細胞のＰＨＦ２０ ｍＲＮＡ発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲを通じて筋分化期間中、毎日測定した。また、前記筋分化期間中、ＰＨＦ２０およびＭｙｏＤのタンパク質発現は、ウエスタンブロッティングにより毎日確認した。ＰＨＦ２０ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を解析した結果は、それぞれ図１および２に示す。
図１および２に示すように、筋分化が進むほどＰＨＦ２０は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が減少することが確認された。その反面、ＭｙｏＤは、筋分化が進むほどタンパク質の発現が増加することが確認された。上記の結果は、Ｃ２Ｃ１２細胞において転写因子のＰＨＦ２０が筋分化に関与しうることを示唆する。
１-２．ＹＹ１
ＹＹ１は、先行研究を通じてＰＨＦ２０が過剰発現される細胞において、発現が増加されることが確認されている。そこで、ＹＹ１のｍＲＮＡおよびタンパク質発現を、前記実施形態１－１と同様の方法で解析した。ＹＹ１のｍＲＮＡおよびタンパク質発現を解析した結果は、それぞれ図３および４に示す。
図３および４に示すように、ＹＹ１は、筋分化が進むほどｍＲＮＡの発現が減少することが確認された。また、筋分化が進むほどＭｙｏＤのタンパク質発現は、増加したが、ＹＹ１のタンパク質発現は、減少したことが確認された。
【0024】
実施形態２．ＰＨＦ２０の発現がＣ２Ｃ１２細胞の分化に及ぼす影響の調査
ＰＨＦ－２０の発現が筋分化に及ぼす影響を追加で評価した。
２-１．ＰＨＦ２０の発現がＭｙｏＤタンパク質発現に及ぼす影響
Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を準備した後、ドキシサイクリン未処理群（－Ｄｏｘｙ）および処置群（＋Ｄｏｘｙ）に分けた。それから、ドキシサイクリン未処理群（－Ｄｏｘｙ）は、調製された細胞にドキシサイクリンを処理せずに２４時間培養し、ドキシサイクリン処理群（＋Ｄｏｘｙ）は、ドキシサイクリンを含む培地に交換した後、調製された細胞を２４時間培養した。ドキシサイクリンが未処理または処理されたＣ２Ｃ１２細胞を実験に使用し、Ｐｒｅとして表した。
分化した筋線維（Ｄ１、Ｄ３およびＤ５）を作製するために、前記ドキシサイクリンが未処理または処理されたＣ２Ｃ１２細胞の培地を分化培地と交換した後、培養した。培養された細胞は、分化日数毎にＤ１、Ｄ３およびＤ５としてそれぞれ表した。
調製された細胞に溶解緩衝液を処理し、各細胞溶解物を製造し、ＰＨＦ２０、ＹＹ１、およびＭｙｏＤタンパク質発現をウエスタンブロッティングにより解析した。ＰＨＦ２０、ＹＹ１、およびＭｙｏＤのタンパク質発現を解析した結果は、図５Ａに示した。
図５Ａに示すように、対照群であるドキシサイクリン未処理群（左パネル）は、筋分化中におけるＰＨＦ２０およびＹＹ１のタンパク質発現が減少し、ＭｙｏＤの発現が増加する傾向を示す。その反面、ドキシサイクリン処理群（右パネル）は、ＰＨＦ２０の発現が誘導されたものであって、ＭｙｏＤの発現が対照群に比べて低いことが確認された。
２-２．ＰＨＦ２０の発現がＭｙｏＤ ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響
前記実施形態２－１のドキシサイクリン処理（＋Ｄｏｘｙ）または未処理（－Ｄｏｘｙ）されたＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）および分化した筋線維（Ｄ５）の全ＲＮＡを抽出した後、ｑＲＴ－ＰＣＲを介してＰＨＦ２０、ＹＹ１、およびＭｙｏＤのｍＲＮＡ発現を解析した。前記ｍＲＮＡ発現を解析した結果は、図５Ｂに示した。
図５Ｂに示すように、筋分化中におけるＰＨＦ２０、ＹＹ１、およびＭｙｏＤの発現は、タンパク質発現のような傾向性、すなわち、ＰＨＦ２０の発現が誘導された細胞は、ＭｙｏＤの発現が減少したことが確認された。
２-３．ＰＨＦ２０の発現が筋管形成に及ぼす影響
ＰＨＦ２０が筋管（ｍｙｏｔｕｂｅ）形成に及ぼす影響を確認するために、免疫組織化学染色解析によりミオシン重鎖の発現を調べた。具体的には、ドキシサイクリン処理（＋Ｄｏｘｙ）または未処理（－Ｄｏｘｙ）されたＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）および分化した筋線維（Ｄ１およびＤ３）を調製した。調製した細胞を用いて、抗－ＭＦ抗体（緑色）を用いた免疫組織化学染色解析を行った。ミオシン重鎖は、抗－ＭＦ抗体で染色され緑色で表され、細胞核は４’，６-ジアミジノ-２-フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色され、青色で表される。免疫組織化学染色解析の結果は、図６に示した。
図６に示すように、ドキシサイクリンによってＰＨＦ２０の発現が誘導された細胞（＋Ｄｏｘｙ、Ｄ１およびＤ３）は、筋分化中に筋管形成が抑制されたことが確認された。その反面、対照群であるドキシサイクリン未処理群（-Ｄｏｘｙ、Ｄ１およびＤ３）においては、Ｃ２Ｃ１２細胞が筋管に分化されたことが確認された。
２-４．ＰＨＦ２０の発現抑制がＭｙｏＤの発現に及ぼす影響
ＰＨＦ２０の発現抑制がＭｙｏＤの発現に及ぼす影響を確認した。これのために、Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）および分化した筋線維（Ｄ１）を調製した。調製した細胞に、配列番号１の塩基配列で表されるＰＨＦ２０配列に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＰＨＦ２０）を発現するレンチウイルスをトランスフェクトさせた。対照群は、配列番号３の塩基配列で表されるスクランブル配列に対するｓｈＲＮＡを使用した。トランスフェクトされた細胞は２４時間培養した。培養後、細胞を溶解させ、細胞溶解物を用いてウエスタンブロッティングを行った。分化前のＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）の結果を図７Ａに示し、分化した筋線維（Ｄ１）の結果は図７Ｂに示した。
図７に示すように、分化前のＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）において、ｓｈＲＮＡによるＰＨＦ２０の発現の抑制は、ＹＹ１の発現抑制を誘導し、ＭｙｏＤの発現増加を引き起こした。前記のような現象は、分化１日目である筋線維（Ｄ１）においてより際立つことが確認された。
ＰＨＦ－２０の発現が筋分化に及ぼす影響を追加で評価した。
２-１．ＰＨＦ２０の発現がＭｙｏＤタンパク質発現に及ぼす影響
Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を準備した後、ドキシサイクリン未処理群（－Ｄｏｘｙ）および処置群（＋Ｄｏｘｙ）に分けた。それから、ドキシサイクリン未処理群（－Ｄｏｘｙ）は、調製された細胞にドキシサイクリンを処理せずに２４時間培養し、ドキシサイクリン処理群（＋Ｄｏｘｙ）は、ドキシサイクリンを含む培地に交換した後、調製された細胞を２４時間培養した。ドキシサイクリンが未処理または処理されたＣ２Ｃ１２細胞を実験に使用し、Ｐｒｅとして表した。
分化した筋線維（Ｄ１、Ｄ３およびＤ５）を作製するために、前記ドキシサイクリンが未処理または処理されたＣ２Ｃ１２細胞の培地を分化培地と交換した後、培養した。培養された細胞は、分化日数毎にＤ１、Ｄ３およびＤ５としてそれぞれ表した。
調製された細胞に溶解緩衝液を処理し、各細胞溶解物を製造し、ＰＨＦ２０、ＹＹ１、およびＭｙｏＤタンパク質発現をウエスタンブロッティングにより解析した。ＰＨＦ２０、ＹＹ１、およびＭｙｏＤのタンパク質発現を解析した結果は、図５Ａに示した。
図５Ａに示すように、対照群であるドキシサイクリン未処理群（左パネル）は、筋分化中におけるＰＨＦ２０およびＹＹ１のタンパク質発現が減少し、ＭｙｏＤの発現が増加する傾向を示す。その反面、ドキシサイクリン処理群（右パネル）は、ＰＨＦ２０の発現が誘導されたものであって、ＭｙｏＤの発現が対照群に比べて低いことが確認された。
２-２．ＰＨＦ２０の発現がＭｙｏＤ ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響
前記実施形態２－１のドキシサイクリン処理（＋Ｄｏｘｙ）または未処理（－Ｄｏｘｙ）されたＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）および分化した筋線維（Ｄ５）の全ＲＮＡを抽出した後、ｑＲＴ－ＰＣＲを介してＰＨＦ２０、ＹＹ１、およびＭｙｏＤのｍＲＮＡ発現を解析した。前記ｍＲＮＡ発現を解析した結果は、図５Ｂに示した。
図５Ｂに示すように、筋分化中におけるＰＨＦ２０、ＹＹ１、およびＭｙｏＤの発現は、タンパク質発現のような傾向性、すなわち、ＰＨＦ２０の発現が誘導された細胞は、ＭｙｏＤの発現が減少したことが確認された。
２-３．ＰＨＦ２０の発現が筋管形成に及ぼす影響
ＰＨＦ２０が筋管（ｍｙｏｔｕｂｅ）形成に及ぼす影響を確認するために、免疫組織化学染色解析によりミオシン重鎖の発現を調べた。具体的には、ドキシサイクリン処理（＋Ｄｏｘｙ）または未処理（－Ｄｏｘｙ）されたＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）および分化した筋線維（Ｄ１およびＤ３）を調製した。調製した細胞を用いて、抗－ＭＦ抗体（緑色）を用いた免疫組織化学染色解析を行った。ミオシン重鎖は、抗－ＭＦ抗体で染色され緑色で表され、細胞核は４’，６-ジアミジノ-２-フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色され、青色で表される。免疫組織化学染色解析の結果は、図６に示した。
図６に示すように、ドキシサイクリンによってＰＨＦ２０の発現が誘導された細胞（＋Ｄｏｘｙ、Ｄ１およびＤ３）は、筋分化中に筋管形成が抑制されたことが確認された。その反面、対照群であるドキシサイクリン未処理群（-Ｄｏｘｙ、Ｄ１およびＤ３）においては、Ｃ２Ｃ１２細胞が筋管に分化されたことが確認された。
２-４．ＰＨＦ２０の発現抑制がＭｙｏＤの発現に及ぼす影響
ＰＨＦ２０の発現抑制がＭｙｏＤの発現に及ぼす影響を確認した。これのために、Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）および分化した筋線維（Ｄ１）を調製した。調製した細胞に、配列番号１の塩基配列で表されるＰＨＦ２０配列に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＰＨＦ２０）を発現するレンチウイルスをトランスフェクトさせた。対照群は、配列番号３の塩基配列で表されるスクランブル配列に対するｓｈＲＮＡを使用した。トランスフェクトされた細胞は２４時間培養した。培養後、細胞を溶解させ、細胞溶解物を用いてウエスタンブロッティングを行った。分化前のＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）の結果を図７Ａに示し、分化した筋線維（Ｄ１）の結果は図７Ｂに示した。
図７に示すように、分化前のＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）において、ｓｈＲＮＡによるＰＨＦ２０の発現の抑制は、ＹＹ１の発現抑制を誘導し、ＭｙｏＤの発現増加を引き起こした。前記のような現象は、分化１日目である筋線維（Ｄ１）においてより際立つことが確認された。
【0025】
実施形態３．ＰＨＦ－２０の発現がＹＹ１プロモーターの発現に及ぼす影響
前記実施形態１および２を通じて筋分化中におけるＰＨＦ２０の発現増加は、ＹＹ１の発現を増加させ、ＭｙｏＤの発現を減少させることが確認された。そこで、さらにＰＨＦ２０の発現が筋分化に及ぼす影響をＹＹ１プロモーター解析を通じて評価した。
３－１．ドキシサイクリン処理濃度によるＰＨＦ２０およびＹＹ１プロモーターの発現の調査
ドキシサイクリンの処理濃度によるＰＨＦ２０およびＹＹ１プロモーターの発現を調べた。Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）にＹＹ１－ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞にドキシサイクリンを濃度別（０，５０，１００および５００ｎｇ／ｍｌ）に処理した後、２４時間培養した。培養後、Ｃ２Ｃ１２細胞を、ウエスタンブロッティングおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを行った。前記ウェスタンブロッティングは、ＰＨＦ２０の発現を確認するためのものであり、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイは、ＹＹ１プロモーターの活性を確認するためのものである。ウェスタンブロッティングの結果およびルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果は、図８Ａに示した。
図８Ａに示すように、ドキシサイクリンは、ＰＨＦ２０の発現を誘導するが、前記ＰＨＦ２０の発現は、ドキシサイクリンの濃度に依存的であることが確認された。また、ＹＹ１プロモーターの活性は、ＰＨＦ２０の発現量に依存することが確認された。
３-２．ｓｈＲＮＡのトランスフェクトによるＰＨＦ２０およびＹＹ１プロモーターの発現の調査
ｓｈＲＮＡのトランスフェクトによるＰＨＦ２０およびＹＹ１プロモーターの発現を調べた。具体的に、Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を調製し、調製された細胞にスクランブル配列（ｓｈＲＮＡ）またはＰＨＦ２０配列（ｓｈＰＨＦ２０）に対するｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスをトランスフェクトさせた。トランスフェクトされた細胞を２４時間培養した後、ＹＹ１－ルシフェラーゼ遺伝子を追加でトランスフェクトさせた。それから、細胞を溶解させ、細胞溶解物を用いてウエスタンブロッティングおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子解析を実施し、その結果は図８Ｂに示した。
図８Ｂに示すとおり、ｓｈＲＮＡによるＰＨＦ２０の発現の減少は、ＹＹ１プロモーターの活性を抑制することが確認された。このことはＰＨＦ２０がプレマイオサイトにおけるＹＹ１の発現を、転写レベルで陽性的に調節することを意味する。
３－３．筋分化期間によるＰＨＦ２０およびＹＹ１プロモーターの発現の調査
筋分化期間によるＰＨＦ２０の発現抑制がＹＹ１プロモーターの発現に及ぼす影響を解析した。これのためのＹＹ１プロモーター解析は、プレマイオサイトであるＣ２Ｃ１２細胞を用いて行った。具体的に、ドキシサイクリン処理していないＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を分化培地で培養して分化させ、各分化時点（Ｄ１およびＤ３）においてＹＹ１－ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトさせた。ウエスタンブロッティングによりトランスフェクトされた細胞のＰＨＦ２、ＹＹ１およびＭｙｏＤの発現を解析した。また、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを通じてＹＹ１プロモーターの活性を確認した。ドキシサイクリン処理したＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を使用して前記と同様の方法で実験した。前記ドキシサイクリン処理していないＣ２Ｃ１２細胞を用いた実験の結果は、図９Ａに示しており、ドキシサイクリン処理したＣ２Ｃ１２細胞を用いた実験の結果は、図９Ｂに示した。
図９Ａに示すように、Ｃ２Ｃ１２細胞の筋分化が進むほどＹＹ１プロモーター活性が減少するにつれてＰＨＦ２０およびＹＹ１の発現は減少し、ＭｙｏＤの発現は増加した。
図９Ｂに示すように、ドキシサイクリンによって誘導されたＰＨＦ２０の発現は、筋分化中におけるＹＹ１プロモーター活性を誘導し、これによってＭｙｏＤの発現は減少したことが確認された。
上記の結果は、ＰＨＦ２０の発現量がＹＹ１およびＹＹ１プロモーターによる筋分化の調節において重要であることを意味する。
３-４．ＰＨＦ２０によるＹＹ１プロモーター調節手法の確認
クロマチン免疫沈降（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ-ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣｈｉＰ）解析によりＰＨＦ２０がＹＹ１プロモーターをどのような手法で調節するかを確認した。前記クロマチン免疫沈降アッセイは、Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）および分化した筋線維（Ｄ１およびＤ３）を利用し、プライマーｍｏｕｓｅ ＹＹ１（-２００／-５５）を使用した。対照群としてはＩｇＧを使用した。クロマチン免疫沈降アッセイの結果は、図１０に示した。
図１０に示すように、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＰＨＦ２０は、筋分化中、ＹＹ１プロモーター（-２００／-５５）に結合することが減少した。上記の結果は、ＰＨＦ２０が筋分化を制御するための転写因子であって、ＹＹ１プロモーターに直接結合することを示唆する。
前記実施形態１および２を通じて筋分化中におけるＰＨＦ２０の発現増加は、ＹＹ１の発現を増加させ、ＭｙｏＤの発現を減少させることが確認された。そこで、さらにＰＨＦ２０の発現が筋分化に及ぼす影響をＹＹ１プロモーター解析を通じて評価した。
３－１．ドキシサイクリン処理濃度によるＰＨＦ２０およびＹＹ１プロモーターの発現の調査
ドキシサイクリンの処理濃度によるＰＨＦ２０およびＹＹ１プロモーターの発現を調べた。Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）にＹＹ１－ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞にドキシサイクリンを濃度別（０，５０，１００および５００ｎｇ／ｍｌ）に処理した後、２４時間培養した。培養後、Ｃ２Ｃ１２細胞を、ウエスタンブロッティングおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを行った。前記ウェスタンブロッティングは、ＰＨＦ２０の発現を確認するためのものであり、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイは、ＹＹ１プロモーターの活性を確認するためのものである。ウェスタンブロッティングの結果およびルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果は、図８Ａに示した。
図８Ａに示すように、ドキシサイクリンは、ＰＨＦ２０の発現を誘導するが、前記ＰＨＦ２０の発現は、ドキシサイクリンの濃度に依存的であることが確認された。また、ＹＹ１プロモーターの活性は、ＰＨＦ２０の発現量に依存することが確認された。
３-２．ｓｈＲＮＡのトランスフェクトによるＰＨＦ２０およびＹＹ１プロモーターの発現の調査
ｓｈＲＮＡのトランスフェクトによるＰＨＦ２０およびＹＹ１プロモーターの発現を調べた。具体的に、Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を調製し、調製された細胞にスクランブル配列（ｓｈＲＮＡ）またはＰＨＦ２０配列（ｓｈＰＨＦ２０）に対するｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスをトランスフェクトさせた。トランスフェクトされた細胞を２４時間培養した後、ＹＹ１－ルシフェラーゼ遺伝子を追加でトランスフェクトさせた。それから、細胞を溶解させ、細胞溶解物を用いてウエスタンブロッティングおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子解析を実施し、その結果は図８Ｂに示した。
図８Ｂに示すとおり、ｓｈＲＮＡによるＰＨＦ２０の発現の減少は、ＹＹ１プロモーターの活性を抑制することが確認された。このことはＰＨＦ２０がプレマイオサイトにおけるＹＹ１の発現を、転写レベルで陽性的に調節することを意味する。
３－３．筋分化期間によるＰＨＦ２０およびＹＹ１プロモーターの発現の調査
筋分化期間によるＰＨＦ２０の発現抑制がＹＹ１プロモーターの発現に及ぼす影響を解析した。これのためのＹＹ１プロモーター解析は、プレマイオサイトであるＣ２Ｃ１２細胞を用いて行った。具体的に、ドキシサイクリン処理していないＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を分化培地で培養して分化させ、各分化時点（Ｄ１およびＤ３）においてＹＹ１－ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトさせた。ウエスタンブロッティングによりトランスフェクトされた細胞のＰＨＦ２、ＹＹ１およびＭｙｏＤの発現を解析した。また、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを通じてＹＹ１プロモーターの活性を確認した。ドキシサイクリン処理したＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を使用して前記と同様の方法で実験した。前記ドキシサイクリン処理していないＣ２Ｃ１２細胞を用いた実験の結果は、図９Ａに示しており、ドキシサイクリン処理したＣ２Ｃ１２細胞を用いた実験の結果は、図９Ｂに示した。
図９Ａに示すように、Ｃ２Ｃ１２細胞の筋分化が進むほどＹＹ１プロモーター活性が減少するにつれてＰＨＦ２０およびＹＹ１の発現は減少し、ＭｙｏＤの発現は増加した。
図９Ｂに示すように、ドキシサイクリンによって誘導されたＰＨＦ２０の発現は、筋分化中におけるＹＹ１プロモーター活性を誘導し、これによってＭｙｏＤの発現は減少したことが確認された。
上記の結果は、ＰＨＦ２０の発現量がＹＹ１およびＹＹ１プロモーターによる筋分化の調節において重要であることを意味する。
３-４．ＰＨＦ２０によるＹＹ１プロモーター調節手法の確認
クロマチン免疫沈降（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ-ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣｈｉＰ）解析によりＰＨＦ２０がＹＹ１プロモーターをどのような手法で調節するかを確認した。前記クロマチン免疫沈降アッセイは、Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）および分化した筋線維（Ｄ１およびＤ３）を利用し、プライマーｍｏｕｓｅ ＹＹ１（-２００／-５５）を使用した。対照群としてはＩｇＧを使用した。クロマチン免疫沈降アッセイの結果は、図１０に示した。
図１０に示すように、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＰＨＦ２０は、筋分化中、ＹＹ１プロモーター（-２００／-５５）に結合することが減少した。上記の結果は、ＰＨＦ２０が筋分化を制御するための転写因子であって、ＹＹ１プロモーターに直接結合することを示唆する。
【0026】
実施形態４．ＹＹ１の発現がＭｙｏＤの発現に及ぼす影響
前記実施形態３を通じてＰＨＦ２０がＹＹ１を直接調節することを確認した。そこで、本実施形態において、ＹＹ１プロモーターの発現が下流遺伝子であるＭｙｏＤに及ぼす影響を調べた。
４．ウエスタンブロッティング
ＹＹ１プロモーターの発現が下流遺伝子であるＭｙｏＤに及ぼす影響を調べるために、ドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）処理（＋Ｄｏｘｙ）または未処理（－Ｄｏｘｙ）されたＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を調製した。前記Ｃ２Ｃ１２細胞を、分化培地で培養して筋肉に分化させた。分化３日目（Ｄ３）にｓｉＲＮＡまたはｓｉＹＹ１（配列番号２）をトランスフェクトさせた後、２４時間培養した。培養後、細胞溶解物を調製し、ウエスタンブロッティングによりＰＨＦ２０、ＹＹ１およびＭｙｏＤの発現を解析した。対照群はドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）処理（＋Ｄｏｘｙ）または未処理（－Ｄｏｘｙ）されたＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を用いた。ウエスタンブロッティングの結果は、図１１に示した。
図１１に示すように、ＰＨＦ２０の過剰発現は、Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）においてＭｙｏＤの発現の低下を誘導し、分化３日目（Ｄ３）には筋分化のみならず、プレマイオサイトにおいてＹＹ１の発現を誘導した（各条件における最初の２個のレーン）。また、ｓｈＲＮＡによるＹＹ１の発現抑制は、ＭｙｏＤの発現を増加させた（各条件における最後の２個のレーン）。
４－２．免疫組織化学染色解析
ＹＹ１が筋管（ｍｙｏｔｕｂｅ）形成に及ぼす影響を確認するために、免疫組織化学染色解析によりミオシン重鎖の発現を調べた。具体的には、ドキシサイクリン処理（＋Ｄｏｘｙ）または未処理（－Ｄｏｘｙ）分化した筋線維（Ｄ１）を調製した。調製した細胞にｓｉＲＮＡまたはｓｉＹＹ１をトランスフェクトさせた後、２４時間培養した。培養された細胞を用いて、抗―ミオシン（ＭＦ２０）抗体を用いた免疫組織化学染色解析を行った。ミオシン重鎖は、抗－ミオシン（ＭＦ２０）抗体で染色されて緑色で表され、細胞核は４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色され、青色で表される。免疫組織化学染色解析の結果は、図１２に示した。
図１２に示すように、ｓｈＲＮＡによるＹＹ１の発現の減少は、筋管形成を促進することを確認した（＋ｓｉＹＹ１、-Ｄｏｘｙ）。その反面、ドキシサイクリンによってＰＨＦ２０の発現が誘導される場合、筋管形成が抑制されることを確認した（-ｓｉＹＹ１、＋Ｄｏｘｙ）。特に、ＰＨＦ２０の過剰発現にもかかわらず、ＹＹ１の発現が抑制される際、分化が回復したことを確認した（＋ｓｉＹＹ１、＋Ｄｏｘｙ）。上記の結果は、ＰＨＦ２０がＹＹ１を通じてＭｙｏＤのような分化制御因子を調節することを意味する。
前記実施形態３を通じてＰＨＦ２０がＹＹ１を直接調節することを確認した。そこで、本実施形態において、ＹＹ１プロモーターの発現が下流遺伝子であるＭｙｏＤに及ぼす影響を調べた。
４．ウエスタンブロッティング
ＹＹ１プロモーターの発現が下流遺伝子であるＭｙｏＤに及ぼす影響を調べるために、ドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）処理（＋Ｄｏｘｙ）または未処理（－Ｄｏｘｙ）されたＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を調製した。前記Ｃ２Ｃ１２細胞を、分化培地で培養して筋肉に分化させた。分化３日目（Ｄ３）にｓｉＲＮＡまたはｓｉＹＹ１（配列番号２）をトランスフェクトさせた後、２４時間培養した。培養後、細胞溶解物を調製し、ウエスタンブロッティングによりＰＨＦ２０、ＹＹ１およびＭｙｏＤの発現を解析した。対照群はドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）処理（＋Ｄｏｘｙ）または未処理（－Ｄｏｘｙ）されたＣ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）を用いた。ウエスタンブロッティングの結果は、図１１に示した。
図１１に示すように、ＰＨＦ２０の過剰発現は、Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｐｒｅ）においてＭｙｏＤの発現の低下を誘導し、分化３日目（Ｄ３）には筋分化のみならず、プレマイオサイトにおいてＹＹ１の発現を誘導した（各条件における最初の２個のレーン）。また、ｓｈＲＮＡによるＹＹ１の発現抑制は、ＭｙｏＤの発現を増加させた（各条件における最後の２個のレーン）。
４－２．免疫組織化学染色解析
ＹＹ１が筋管（ｍｙｏｔｕｂｅ）形成に及ぼす影響を確認するために、免疫組織化学染色解析によりミオシン重鎖の発現を調べた。具体的には、ドキシサイクリン処理（＋Ｄｏｘｙ）または未処理（－Ｄｏｘｙ）分化した筋線維（Ｄ１）を調製した。調製した細胞にｓｉＲＮＡまたはｓｉＹＹ１をトランスフェクトさせた後、２４時間培養した。培養された細胞を用いて、抗―ミオシン（ＭＦ２０）抗体を用いた免疫組織化学染色解析を行った。ミオシン重鎖は、抗－ミオシン（ＭＦ２０）抗体で染色されて緑色で表され、細胞核は４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色され、青色で表される。免疫組織化学染色解析の結果は、図１２に示した。
図１２に示すように、ｓｈＲＮＡによるＹＹ１の発現の減少は、筋管形成を促進することを確認した（＋ｓｉＹＹ１、-Ｄｏｘｙ）。その反面、ドキシサイクリンによってＰＨＦ２０の発現が誘導される場合、筋管形成が抑制されることを確認した（-ｓｉＹＹ１、＋Ｄｏｘｙ）。特に、ＰＨＦ２０の過剰発現にもかかわらず、ＹＹ１の発現が抑制される際、分化が回復したことを確認した（＋ｓｉＹＹ１、＋Ｄｏｘｙ）。上記の結果は、ＰＨＦ２０がＹＹ１を通じてＭｙｏＤのような分化制御因子を調節することを意味する。
【0027】
実施形態５．ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスにおけるＰＨＦ２０の発現が筋分化に及ぼす影響の調査
５-１．ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスにおけるＰＨＦ２０、ＹＹ１およびＭＨＣの発現の解析および表現型の確認
ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスから骨格筋組織を分離した。分離された筋組織を溶解し、細胞溶解物を調製した。前記細胞溶解物を調製し、ウエスタンブロッティングによりＰＨＦ２０、ＹＹ１およびミオシン重鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＭＨＣ）発現を解析した。前記ミオシン重鎖は、筋分化マーカーであって、分化が進むにつれて発現が増加する。対照群は、５ヶ月齢の雄のＷＴマウスを使用した。ウエスタンブロッティングの結果は、図１３に示した。
図１３に示すように、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、ＰＨＦ２０およびＹＹ１の発現が対照群（ＷＴ）に比べて有意に増加した。しかし、前記ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、筋分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭＨＣ）の発現が対照群に比べて減少したことを確認した。
ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスを、次の実験のために犠牲にする前に体重を測定した。その後、ＰＨＦトランスジェニックマウスを解剖した後、大腿および筋肉を観察した。ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスの体重測定の結果は、図１４Ａに示し、大腿筋を観察した結果は図１４Ｂに示した。
図１４Ａに示すように、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群（ＷＴ）に比べて体重が有意に増加したことが確認できた。
図１４Ｂに示すように、解剖されたＰＨＦ２０トランスジェニックマウスの筋肉は、筋肉の色が対象群（ＷＴ）に比べて薄いことが確認されたが、これは、対照群よりも筋肉は少なく、脂肪蓄積量が多いことを意味する。
前記の結果からＰＨＦ２０のトランスジェニックマウスは、脂肪蓄積による体重が増加したことが分かる。
５－２．組織学的解析および免疫組織化学染色解析
ＰＨＦ２０トランスジェニックマウス（ＰＨＦ２０-ＴＧ）および対照群（ＷＴ）の腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ）組織を横方向（Ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）又は縦方向（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）にスライスしてスライドを作製した。
前記作製された横方向または縦方向スライドの組織をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。腓腹筋組織の横断面を観察した結果は、図１５Ａに示し、縦断面を観察した結果は図１５Ｂに示した。
図１５Ａに示すように、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群よりも筋線維が少ないことを確認した。また、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群よりも筋繊維が丸く、筋線維間に複数の空隙（白色）があることを確認した。
図１５Ｂに示すように、筋肉の縦断面を観察したところ、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群に比べて筋線維が完全に圧縮されていないことが確認されており、このことは筋肉の完全性が低いことを意味する。
また、前記ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された横断面スライドをさらに観察し、その結果は図１６に示した。
図１６に示すように、対照群（ＷＴ）は、筋肉間に脂肪組織がほとんどないのに対し、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、筋肉間において脂肪組織が観察された。
免疫組織化学解析により作製された横方向または縦方向スライドの腓腹筋組織を観察した。腓腹筋組織の縦断面を観察した結果は図１７Ａに示し、横断面を観察した結果は図１７Ｂに示した。
図１７Ａに示すように、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群（ＷＴ）に比べて筋線維が少なく、長さが短いことを確認した。また、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、ＭＨＣの発現が対照群（ＷＴ）に比べて減少したことを確認した。
図１７Ｂに示すように、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群（ＷＴ）に比べて筋線維間に空隙が発見されており、このことは筋線維の圧縮程度が低いことを意味する。
前記の結果から、ＰＨＦ２０が生体内で筋肉発達に否定的な影響を及ぼすことが確認された。
総体として、前記の実験結果を通じてＰＨＦ２０の発現は、図１８のようなメカニズムを介して筋分化に影響を及ぼすことが確認できた。より詳細には、ＰＨＦ２０遺伝子ノックアウト、すなわちＰＨＦ２０の発現阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてＹＹ１プロモーターに結合されたＰＨＦ２０を分離させ、ＭｙｏＤの発現を増加させ、前記ＭｙｏＤの発現増加は、筋分化が促進されることを確認した。これはＰＨＦ２０阻害剤が筋肉減少による疾患の予防又は治療の分野において多様に活用されることができる。
以下、製剤例を挙げて本発明をより詳しく説明する。製剤例は単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲が実施形態によって限定されるものと解釈されるものではない。
５-１．ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスにおけるＰＨＦ２０、ＹＹ１およびＭＨＣの発現の解析および表現型の確認
ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスから骨格筋組織を分離した。分離された筋組織を溶解し、細胞溶解物を調製した。前記細胞溶解物を調製し、ウエスタンブロッティングによりＰＨＦ２０、ＹＹ１およびミオシン重鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＭＨＣ）発現を解析した。前記ミオシン重鎖は、筋分化マーカーであって、分化が進むにつれて発現が増加する。対照群は、５ヶ月齢の雄のＷＴマウスを使用した。ウエスタンブロッティングの結果は、図１３に示した。
図１３に示すように、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、ＰＨＦ２０およびＹＹ１の発現が対照群（ＷＴ）に比べて有意に増加した。しかし、前記ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、筋分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭＨＣ）の発現が対照群に比べて減少したことを確認した。
ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスを、次の実験のために犠牲にする前に体重を測定した。その後、ＰＨＦトランスジェニックマウスを解剖した後、大腿および筋肉を観察した。ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスの体重測定の結果は、図１４Ａに示し、大腿筋を観察した結果は図１４Ｂに示した。
図１４Ａに示すように、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群（ＷＴ）に比べて体重が有意に増加したことが確認できた。
図１４Ｂに示すように、解剖されたＰＨＦ２０トランスジェニックマウスの筋肉は、筋肉の色が対象群（ＷＴ）に比べて薄いことが確認されたが、これは、対照群よりも筋肉は少なく、脂肪蓄積量が多いことを意味する。
前記の結果からＰＨＦ２０のトランスジェニックマウスは、脂肪蓄積による体重が増加したことが分かる。
５－２．組織学的解析および免疫組織化学染色解析
ＰＨＦ２０トランスジェニックマウス（ＰＨＦ２０-ＴＧ）および対照群（ＷＴ）の腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ）組織を横方向（Ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）又は縦方向（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）にスライスしてスライドを作製した。
前記作製された横方向または縦方向スライドの組織をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。腓腹筋組織の横断面を観察した結果は、図１５Ａに示し、縦断面を観察した結果は図１５Ｂに示した。
図１５Ａに示すように、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群よりも筋線維が少ないことを確認した。また、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群よりも筋繊維が丸く、筋線維間に複数の空隙（白色）があることを確認した。
図１５Ｂに示すように、筋肉の縦断面を観察したところ、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群に比べて筋線維が完全に圧縮されていないことが確認されており、このことは筋肉の完全性が低いことを意味する。
また、前記ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された横断面スライドをさらに観察し、その結果は図１６に示した。
図１６に示すように、対照群（ＷＴ）は、筋肉間に脂肪組織がほとんどないのに対し、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、筋肉間において脂肪組織が観察された。
免疫組織化学解析により作製された横方向または縦方向スライドの腓腹筋組織を観察した。腓腹筋組織の縦断面を観察した結果は図１７Ａに示し、横断面を観察した結果は図１７Ｂに示した。
図１７Ａに示すように、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群（ＷＴ）に比べて筋線維が少なく、長さが短いことを確認した。また、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、ＭＨＣの発現が対照群（ＷＴ）に比べて減少したことを確認した。
図１７Ｂに示すように、ＰＨＦ２０トランスジェニックマウスは、対照群（ＷＴ）に比べて筋線維間に空隙が発見されており、このことは筋線維の圧縮程度が低いことを意味する。
前記の結果から、ＰＨＦ２０が生体内で筋肉発達に否定的な影響を及ぼすことが確認された。
総体として、前記の実験結果を通じてＰＨＦ２０の発現は、図１８のようなメカニズムを介して筋分化に影響を及ぼすことが確認できた。より詳細には、ＰＨＦ２０遺伝子ノックアウト、すなわちＰＨＦ２０の発現阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてＹＹ１プロモーターに結合されたＰＨＦ２０を分離させ、ＭｙｏＤの発現を増加させ、前記ＭｙｏＤの発現増加は、筋分化が促進されることを確認した。これはＰＨＦ２０阻害剤が筋肉減少による疾患の予防又は治療の分野において多様に活用されることができる。
以下、製剤例を挙げて本発明をより詳しく説明する。製剤例は単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲が実施形態によって限定されるものと解釈されるものではない。
【0028】
製剤例１．薬学的組成物の製造
１．散剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤２０μｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
前記の成分を混合し、気密布に充填して散剤を製造する。
１－２．錠剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤２０μｇ
トウモロコシデンプン １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法により打錠して錠剤を調製する。
１－３．カプセル剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤２０μｇ
結晶性セルロース ３ｍｇ
ラクトース １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法により前記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。
１－４．注射剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤１０μｇ
マンニトール １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水 ２９７４ｍｇ
リン酸二ナトリウム二水和物 ２６ｍｇ
通常の注射剤製造方法に従って１アンプル当たり（２ｍｌ）前記成分の含有量で調製する。
１－５．液剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤１０μｇ
異性化糖 １０ｇ
マンニトール ５ｇ
精製水 適量
通常の液剤の製造方法に従って精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、前記の成分を混合した上、精製水を加えて全体を精製水を加え、全体１００ｍＬに調節した後、茶色瓶に充填して滅菌させて液剤を調製する。
１．散剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤２０μｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
前記の成分を混合し、気密布に充填して散剤を製造する。
１－２．錠剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤２０μｇ
トウモロコシデンプン １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法により打錠して錠剤を調製する。
１－３．カプセル剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤２０μｇ
結晶性セルロース ３ｍｇ
ラクトース １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法により前記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。
１－４．注射剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤１０μｇ
マンニトール １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水 ２９７４ｍｇ
リン酸二ナトリウム二水和物 ２６ｍｇ
通常の注射剤製造方法に従って１アンプル当たり（２ｍｌ）前記成分の含有量で調製する。
１－５．液剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤１０μｇ
異性化糖 １０ｇ
マンニトール ５ｇ
精製水 適量
通常の液剤の製造方法に従って精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、前記の成分を混合した上、精製水を加えて全体を精製水を加え、全体１００ｍＬに調節した後、茶色瓶に充填して滅菌させて液剤を調製する。
【0029】
製剤例２ 食品製剤の製造
２－１．健康食品の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤１０μｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０ｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２ｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０ｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０ｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
無機質混合物 適量
硫酸第１鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
第１リン酸カリウム １５ｍｇ
第２リン酸カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
前記のビタミンおよびミネラル混合物の組成比は、比較的健康食品に適した成分を好ましい実施形態で混合組成したが、その配合比を任意に変形実施してもよく、通常の健康食品製造方法に従って前記の成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法に従って健康食品組成物の製造に使用することができる。
２－２．健康飲料の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤１０μｇ
ビタミンＣ １５ｇ
ビタミンＥ（粉末）１００ｇ
乳酸鉄 １９．７５ｇ
酸化亜鉛 ３．５ｇ
ニコチン酸アミド ３．５ｇ
ビタミンＡ ０．２ｇ
ビタミンＢ１ ０．２５ｇ
ビタミンＢ２ ０．３ｇ
水 適量
通常の健康飲料の製造方法に従って前記の成分を混合した上、約１時間の間８５℃で攪拌加熱した後、得られた溶液を濾過して滅菌した２Ｌの容器に取得し、密封滅菌して冷蔵保管した後、本発明の健康飲料組成物の製造に使用する。
前記組成比は、比較的嗜好飲料に相応しい成分を好ましい実施形態で混合組成したが、需要階層や、需要国、使用用途など地域的、民族的嗜好度によってその配合比を任意に変形実施してもよい。
２－１．健康食品の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤１０μｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０ｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２ｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０ｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０ｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
無機質混合物 適量
硫酸第１鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
第１リン酸カリウム １５ｍｇ
第２リン酸カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
前記のビタミンおよびミネラル混合物の組成比は、比較的健康食品に適した成分を好ましい実施形態で混合組成したが、その配合比を任意に変形実施してもよく、通常の健康食品製造方法に従って前記の成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法に従って健康食品組成物の製造に使用することができる。
２－２．健康飲料の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤１０μｇ
ビタミンＣ １５ｇ
ビタミンＥ（粉末）１００ｇ
乳酸鉄 １９．７５ｇ
酸化亜鉛 ３．５ｇ
ニコチン酸アミド ３．５ｇ
ビタミンＡ ０．２ｇ
ビタミンＢ１ ０．２５ｇ
ビタミンＢ２ ０．３ｇ
水 適量
通常の健康飲料の製造方法に従って前記の成分を混合した上、約１時間の間８５℃で攪拌加熱した後、得られた溶液を濾過して滅菌した２Ｌの容器に取得し、密封滅菌して冷蔵保管した後、本発明の健康飲料組成物の製造に使用する。
前記組成比は、比較的嗜好飲料に相応しい成分を好ましい実施形態で混合組成したが、需要階層や、需要国、使用用途など地域的、民族的嗜好度によってその配合比を任意に変形実施してもよい。
【0030】
製剤例３．飼料添加剤の製造
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤２．０％
グルコース ２．０％
ペプトン １．０％
酵母抽出物 １．０％
第二リン酸 ０．２％
硫酸マグネシウム ０．０５％
システイン ０．０５％
精製水 １００％ まで
賦形剤 脱脂糠適量
以上、本発明内容の特定部分を詳細に説明したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施形態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではないことは自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるものといえる。
ＰＨＦ２０遺伝子発現阻害剤またはＰＨＦ２０タンパク質活性阻害剤２．０％
グルコース ２．０％
ペプトン １．０％
酵母抽出物 １．０％
第二リン酸 ０．２％
硫酸マグネシウム ０．０５％
システイン ０．０５％
精製水 １００％ まで
賦形剤 脱脂糠適量
以上、本発明内容の特定部分を詳細に説明したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施形態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではないことは自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるものといえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】