2023-508845 ＳＡＧＥ１関連症状の処置及び診断のための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-06

(54)【発明の名称】ＳＡＧＥ１関連症状の処置及び診断のための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6886 20180101AFI20230227BHJP

   C12Q 1/6827 20180101ALI20230227BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20230227BHJP

   C12Q 1/6874 20180101ALI20230227BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230227BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230227BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230227BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230227BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230227BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20230227BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230227BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230227BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20230227BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230227BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230227BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230227BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20230227BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20230227BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230227BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230227BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230227BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230227BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20230227BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20230227BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230227BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230227BHJP

   G16B 30/00 20190101ALI20230227BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6886 Z ZNA

C12Q1/6827 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6874 Z

C12N5/10

C12N15/113 Z

C12N15/11 Z

C12N15/62 Z

C07K19/00

C07K16/30

A61P43/00 111

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K38/17

A61P35/00

A61K48/00

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K47/64

A61K47/55

A61K35/17 Z

A61K35/12

A61K31/7088

A61K31/7105

A61K38/19

G01N33/68

G01N33/50 P

G01N33/53 D

G01N33/53 M

G16B30/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022534358

(86)(22)【出願日】2020-12-14

(85)【翻訳文提出日】2022-08-08

(86)【国際出願番号】 CN2020136081

(87)【国際公開番号】W WO2021115478

(87)【国際公開日】2021-06-17

(31)【優先権主張番号】201911282566.7

(32)【優先日】2019-12-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201911282567.1

(32)【優先日】2019-12-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201911282487.6

(32)【優先日】2019-12-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514082712

【氏名又は名称】上海交通大学医学院付属第九人民医院

(71)【出願人】

【識別番号】522200317

【氏名又は名称】上海交通大学医学院

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＪＩＡＯＴＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＳＣＨＯＯＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ２８０， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｓｏｕｔｈ Ｒｏａｄ， Ｈｕａｎｇｐｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００２５，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001999

【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】レイ ミン

(72)【発明者】

【氏名】ドン ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン イェンジェ

(72)【発明者】

【氏名】ソン ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ジェン チャオ

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB03

2G045CB07

2G045CB08

2G045CB11

2G045DA13

2G045DA14

2G045DA36

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS28

4B063QS36

4B063QX01

4B065AA90X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA46

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA23

4C084BA44

4C084CA18

4C084DA01

4C084DC50

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC411

4C084ZC412

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4C085GG08

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA05

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC41

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA12

4C087MA02

4C087NA05

4C087ZB26

4C087ZC41

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＳＡＧＥ１陽性疾患の診断判定方法及びキットと、ＳＡＧＥ１陽性疾患の処置のための組成物及び方法とを示す。本開示は、さらに、ＳＡＧＥ１複合体と、ＳＡＧＥ１複合体の阻害及びＳＡＧＥ１陽性疾患の処置のための方法及び組成物とを示す。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験者のＳＡＧＥ１陽性疾患を診断する方法であって、
前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、
前記生体サンプルにおいて前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患であると診断する
方法。

【請求項2】

前記生体サンプルは、正常な場合、検出可能なＳＡＧＥ１発現がないタイプのサンプルである
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記被験者はＴＰ５３が欠損（例えば、変異）していると判断されている
請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＳＡＧＥ１陽性疾患は、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍である
請求項１に記載の方法。

【請求項5】

被験者の腫瘍の悪性度又は悪性になる可能性を判定する方法であって、
前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、
前記生体サンプルにおいて前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記腫瘍は、悪性である、又は悪性になる可能性があると判定する
方法。

【請求項6】

前記生体サンプルは、正常な場合、検出可能なＳＡＧＥ１発現がないタイプのサンプルである
請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記悪性度は、以下の特徴、すなわち、
ａ）１以上の幹細胞マーカが発現する、
ｂ）転移可能である、
ｃ）細胞の無制御増殖が可能である、
ｄ）疾病が進行する可能性が高い、
ｅ）抗癌治療に耐性が生じる可能性が高い、
ｆ）抗癌治療の処置後に再発する可能性が高い、及び
ｇ）１以上の癌関連ドライバー変異が生じている、又は生じる可能性が高い、
のうちの１以上の特徴を有する
請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

前記被験者には悪性の臨床症状が現れていない
請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患である可能性を断定する方法であって、
前記被験者の第１生体サンプルにおいてＴＰ５３の欠損を検出するステップを含み、
ＴＰ５３の欠損が検出された場合、前記被験者はＳＡＧＥ１陽性疾患である可能性が高いと断定する
方法。

【請求項10】

ＴＰ５３の変異が検出された場合、ＳＡＧＥ１発現の検査をするように前記被験者に推薦するステップをさらに含む
請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記第１生体サンプル又は前記被験者の第２生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップをさらに含む
請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

前記生体サンプルにおいてＳＡＧＥ１発現が検出されなかった場合、時間を置いて前記被験者のＳＡＧＥ１発現をモニタリングするステップをさらに含む
請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第１又は第２生体サンプルは、正常な場合、検出可能なＳＡＧＥ１発現がないタイプのサンプルである
請求項１１又は１２に記載の方法。

【請求項14】

前記第１生体サンプル又は前記第２生体サンプルにおいてＳＡＧＥ１発現を検出した場合、有効量のＳＡＧＥ１阻害薬を前記被験者に投与するステップをさらに含む
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

ＳＡＧＥ１阻害薬に対する腫瘍サンプルの感受性を判断する方法であって、
前記腫瘍サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、
前記腫瘍サンプルにおいて前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記腫瘍サンプルはＳＡＧＥ１阻害薬に感受性があると判断する
方法。

【請求項16】

ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高い腫瘍がある被験者を特定する方法であって、
前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、
前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記被験者は前記ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高いと特定する方法。

【請求項17】

前記被験者はＴＰ５３が変異していると判断されている
請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高いと特定された前記被験者にＳＡＧＥ１阻害薬を提供又は投与するステップをさらに含む
請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項19】

被験者におけるＳＡＧＥ１陽性疾患の進行をモニタリングする方法であって、
前記被験者の第１生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出するステップ（ａ）と、
前記被験者の第２生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出するステップ（ｂ）とを含み、
前記第２生体サンプルは前記第１サンプルから時間を置いて取得されたものであり、
前記ＳＡＧＥ１発現のレベルが前記第１生体サンプルよりも前記第２生体サンプルの方が高い場合、前記腫瘍は進行していると判断する
方法。

【請求項20】

ＳＡＧＥ１陽性疾患がある被験者の治療期間中のＳＡＧＥ１阻害薬による処置に対する応答性をモニタリングする方法であって、
前記治療期間の後、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出
し、処置後のＳＡＧＥ１発現レベルを取得するステップ（ａ）と、
前記治療期間以前に前記被験者から得た生体サンプルにおいて検出されたＳＡＧＥ１発現の基準レベルと前記処置後のＳＡＧＥ１発現レベルを比較するステップ（ｂ）とを含み、
前記処置後のＳＡＧＥ１発現レベルが前記基準レベルより低い場合、前記被験者は前記処置に応答性があると特定する
方法。

【請求項21】

前記ＳＡＧＥ１発現は、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、又はタンパク質レベルで検出される
請求項１～８及び１１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記ＳＡＧＥ１発現は、
（ｇ）ＳＡＧＥ１タンパク質の存在又はレベル、
（ｈ）ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの存在又はレベル、
（ｉ）ＳＡＧＥ１複合体の存在又はレベル、
（ｊ）ＳＡＧＥ１遺伝子の脱メチル化のレベル、
（ｋ）ＳＡＧＥ１遺伝子のヒストンのアセチル化の存在又はレベル、
（ｌ）ＳＡＧＥ１遺伝子に対する転写因子の結合の存在又はレベル、
（ｍ）これらの組み合わせ、
のいずれかによって示される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＳＡＧＥ１と、ＩＮＴＳ３、ＩＮＩＰ、ＮＡＢＰ１／２、ＣＲＥＢＢＰ、ＴＬＥ１、ＴＬＥ２、ＴＬＥ３、ＴＬＥ４、ＴＬＥ５、ＧＧＡ３、ＣＮＯＴ１、ＴＡＸ１ＢＰ１、ＳＥＣ１６Ａ、ＣＹＬＤ、及びＰＡＸＢＰ１から選択される少なくとも１種の成分とを含む
請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３とを含む
請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記メチル化は、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写開始部位の上流３ｋｂ以内及び下流３ｋｂ以内の領域（例えば、前記ＳＡＧＥ１遺伝子のＣｐＧ含有部分）で検出される
請求項２２に記載の方法。

【請求項26】

前記ヒストンのアセチル化は、前記ＳＡＧＥ１遺伝子のエンハンサ領域、プロモータ領域、又は発現領域の付近で検出される
請求項２２に記載の方法。

【請求項27】

前記検出は、免疫学的検査、増幅検査、ハイブリダイゼーションアッセイ、又はシーケンシングアッセイを含む
請求項２１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記生体サンプルを細胞、組織、体液、及びこれらの組み合わせから選択する
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記体液を血液、血清、血漿、腹水、嚢胞液、胸水、腹膜液、脳脊髄液、涙液、尿、唾液、痰、乳頭液、リンパ液、気道・腸管・尿生殖路の体液、母乳、臓器系の体液、腹膜液、組織移植片の培養で得られる馴化培地、又はこれらの組み合わせから選択する
請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記腫瘍を固形腫瘍又は血液系腫瘍から選択する
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

副腎癌、リンパ上皮性腫瘍、腺様細胞癌、リンパ腫、聴神経腫、急性リンパ性白血病、肢端黒子型黒色腫、急性骨髄性白血病、先端汗腺腫、慢性リンパ性白血病、急性好酸球性白血病、肝臓癌、急性赤血球白血病、小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、非小細胞肺癌、急性巨核芽球性白血病、ＭＡＬＴリンパ腫、急性単球性白血病、悪性線維性組織球腫、急性前骨髄球性白血病、悪性末梢神経鞘腫、マントル細胞リンパ腫、腺癌、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、海馬の悪性腫瘍、腺様嚢胞癌、腺腫様、腺様歯原性腫瘍、肥満細胞白血病、腺扁平上皮癌、縦隔胚細胞腫瘍、脂肪組織腫瘍、乳房髄様癌、副腎皮質癌、甲状腺髄様癌、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、髄芽腫、浸潤性ＮＫ細胞白血病、黒色腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、髄膜腫、肺横紋筋肉腫、メルケル細胞癌、肺胞軟部肉腫、中皮腫、エナメル上皮腫、転移性尿路上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、ミュラー管混合腫瘍、甲状腺未分化癌、粘液性腫瘍、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、血管筋脂肪腫、筋肉組織腫瘍、血管肉腫、菌状息肉腫、星細胞腫、粘液性脂肪肉腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、粘液腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、粘液肉腫、Ｂ細胞リンパ性白血病、上咽頭癌、Ｂ細胞リンパ腫、神経鞘腫、基底細胞癌、神経芽細胞腫、胆道癌、神経線維腫症、膀胱癌、神経腫、芽細胞腫、結節性黒色腫、骨癌、眼癌、ブレンナー腫瘍、乏突起膠細胞、褐色腫瘍、乏突起膠腫、バーキットリンパ腫、好酸球性乳癌、脳腫瘍、視神経腫瘍、口腔上皮内腫瘍、骨肉腫、癌肉腫、卵巣癌、骨軟部腫瘍、肺溝腫瘍、甲状腺乳頭癌、骨髄腫、傍神経節腫、軟骨腫、松果体芽細胞腫、脊索腫、松果体細胞腫、絨毛癌、下垂体腫瘍、脈絡叢乳頭腫、下垂体腺腫、腎明細胞肉腫、下垂体腫瘍、頭蓋咽頭腫、形質細胞腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、多胎芽腫、子宮頸癌、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、大腸癌、中枢神経系原発性リンパ腫、デゴス病、原発性滲出性リンパ腫、増殖性小円形細胞腫、原発性腹膜前癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、神経上皮性腫瘍の胚芽異形成症、膵臓癌、未分化細胞腫瘍、咽頭癌、胚性癌、腹膜偽粘液腫、内分泌腺腫瘍、腎細胞癌、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫、内胚葉洞腫瘍、腎髄質癌、網膜芽細胞腫、食道癌、横紋筋肉腫、エンダデルフォス、横紋筋肉腫、筋腫、リヒター形質転換、線維肉腫、直腸癌、濾胞性リンパ腫、肉腫、濾胞性甲状腺癌、神経鞘腫、神経節細胞腫、セミノーマ、消化管癌、セルトリ細胞腫、胚細胞腫、性索－性腺間質腫瘍、妊娠絨毛癌、印環細胞腫、巨細胞線維芽細胞腫、皮膚癌、骨巨細胞腫、小円形青色細胞腫瘍、神経膠腫、小細胞癌、多形性膠芽腫、軟部肉腫、神経膠腫、ソマトスタチン腫瘍、脳神経膠腫、煤イボ、膵臓の高グルカゴン腫、脊髄腫瘍、性腺芽腫、脾臓辺縁リンパ腫、顆粒膜細胞腫、扁平上皮癌、エストロゲン腫瘍、滑膜肉腫、胆嚢癌、セザリー病、胃癌、小腸癌、ヘアリー細胞白血病、扁平上皮癌、血管芽細胞腫、胃癌、頭頸部癌、Ｔ細胞リンパ腫、血管上皮腫、精巣癌、血液悪性腫瘍、肉腫、肝芽腫、甲状腺癌、肝脾臓Ｔ細胞リンパ腫、移行上皮細胞癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、非ホジキンリンパ腫、尿路癌、浸潤性小葉癌、泌尿生殖器癌、腸癌、尿路上皮癌、腎臓癌、ブドウ膜黒色腫、喉頭癌、子宮癌、悪性そばかす様喀痰、疣贅癌、致死性正中線肉芽腫、視経路神経膠腫、白血病、外陰癌、精巣間質腫瘍、膣癌、脂肪肉腫、ワルデンストームマクログロブリン血症、肺癌、腺リンパ腫リンパ管腫、腎芽腫、リンパ肉腫、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、又は急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）から前記腫瘍を選択する
請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

先行請求項のいずれか１項に記載の方法で使用されるキットであって、ＳＡＧＥ１発現を検出する１種以上の試薬を含むキット。

【請求項33】

ＳＡＧＥ１発現を検出する１種以上の前記試薬は、
（ｎ）ＳＡＧＥ１タンパク質の存在又はレベルを検出するための試薬
（ｏ）ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの存在又はレベルを検出するための試薬
（ｐ）ＳＡＧＥ１複合体の存在又はレベルを検出するための試薬
（ｑ）ＳＡＧＥ１遺伝子のメチル化レベルを検出するための試薬
（ｒ）ＳＡＧＥ１遺伝子のヒストンのアセチル化の存在又はレベルを検出するための試薬
（ｓ）ＳＡＧＥ１遺伝子に対する転写因子の結合の存在又はレベルを検出するための試薬
（ｔ）これらの組み合わせ
から選択される
請求項３２に記載のキット。

【請求項34】

ＳＡＧＥ１特異オリゴヌクレオチドプライマ、ＳＡＧＥ１特異オリゴヌクレオチドプローブ、抗ＳＡＧＥ１抗体、及び抗ＳＡＧＥ１複合体抗体から選択される少なくとも１種の試薬を含む
請求項３２に記載のキット。

【請求項35】

前記ＳＡＧＥ１特異オリゴヌクレオチドプライマ又はプローブは、SEQ ID NO: 2の８個以上の連続ヌクレオチド又はSEQ ID NO: 1の８個以上の連続ヌクレオチドを含む又はこれと特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む
請求項３４に記載のキット。

【請求項36】

ＳＡＧＥ１複合体のレベル又は活性を低下させる
ＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項37】

ポリペプチド、化合物、その抗体もしくは抗原結合フラグメント、又は核酸分子（例えば、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド）を含む
請求項３６に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項38】

前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＩＮＴＳ３、ＩＮＩＰ、ＮＡＢＰ１／２、ＣＲＥＢＢＰ、ＴＬＥ１、ＴＬＥ２、ＴＬＥ３、ＴＬＥ４、ＴＬＥ５、ＧＧＡ３、ＣＮＯＴ１、ＴＡＸ１ＢＰ１、ＳＥＣ１６Ａ、ＣＹＬＤ、及びＰＡＸＢＰ１からなる群から選択される少なくとも１種の成分と複合したＳＡＧＥ１を含む
請求項３６又は３７に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項39】

前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＩＮＴＳ３と複合したＳＡＧＥ１を含む
請求項３８に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項40】

前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１がＩＮＴＳ３に結合するのを阻害する
請求項３９に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項41】

前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＩＮＴＳ３に結合する、又は当該ＩＮＴＳ３がＳＡＧＥ１のＦ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｍ８３２、Ｖ８７６、Ｒ８７２、Ｋ８２８、Ｒ８３６及びＱ８４０からなる群から選択された１以上の残基（残基のナンバリングはＳＡ
ＧＥ１のSEQ ID NO: 3に準ずる）に結合しないようにする
請求項４０に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項42】

前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、当該抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）ＳＡＧＥ１に特異的に結合する、（ｂ）ＳＡＧＥ１と複合する成分（例えば、ＩＮＴＳ３）に特異的に結合する、又は（ｃ）前記ＳＡＧＥ１複合体に特異的に結合するが、ＳＡＧＥ１にもＳＡＧＥ１と複合する成分にも結合しない
請求項４０に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項43】

前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＩＮＴＳ３のＳＡＧＥ１結合フラグメント、その変異体もしくは誘導体、又はその融合ポリペプチドを含む
請求項４０に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項44】

前記ＩＮＴＳ３のＳＡＧＥ１結合フラグメントは、ＳＡＧＥ１に結合可能なSEQ ID NO:
9のアミノ酸配列、その変異体もしくはフラグメント、又はその融合ポリペプチドを含む
請求項４３に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項45】

前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１のＩＮＴＳ３結合フラグメント、その変異体もしくは誘導体、又はその融合ポリペプチドを含む
請求項４０に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項46】

前記ＳＡＧＥ１のＩＮＴＳ３結合フラグメントは、ＩＮＴＳ３に結合可能なSEQ ID NO:
8のアミノ酸配列、その変異体もしくはフラグメント、又はその融合ポリペプチドを含む
請求項４５に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項47】

前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＩＮＴＳ３に結合可能なＩＮＴＳ６もしくはＩＮＴＳ６ＬのＩＮＴＳ３結合フラグメント、その変異体もしくは誘導体、又はその融合ポリペプチドを含む
請求項４０に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項48】

前記ＩＮＴＳ６もしくはＩＮＴＳ６ＬのＩＮＴＳ３結合フラグメントは、ＩＮＴＳ３に結合可能なSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 104、又はSEQ ID NO: 105のアミノ酸配列、その変異体もしくはフラグメント、又はその融合ポリペプチドを含む
請求項４７に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬。

【請求項49】

ユビキチン経路タンパク質に結合可能な第１部分と、ＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体に結合可能な第２部分とを含む
ＳＡＧＥ１阻害薬。

【請求項50】

前記第１部分及び前記第２部分は、リンカーを介して結合している
請求項４９に記載のＳＡＧＥ１阻害薬。

【請求項51】

抗原結合ドメインと、膜貫通型ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
前記抗原結合ドメインは、ＳＡＧＥ１のエピトープ又はＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープに特異的に結合する
ＣＡＲ。

【請求項52】

共刺激ドメインをさらに含む
請求項５１に記載のＣＡＲ。

【請求項53】

請求項５１又は５２に記載の前記ＣＡＲを発現させるように遺伝子操作された細胞。

【請求項54】

前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、ＴＣＲ発現細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＮＫ細胞を含む
請求項５３に記載の細胞。

【請求項55】

ＳＡＧＥ１のエピトープ又はＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープに暴露されるエクスビボ活性化抗原提示細胞であって、場合によって樹状細胞を含むエクスビボ活性化抗原提示細胞。

【請求項56】

請求項３６～４８のいずれか１項に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬と、
請求項４９又は５９に記載のＳＡＧＥ１阻害薬、又は請求項５３、５４、又は５５に記載の細胞と、
薬学的に許容されるキャリアとを含む
医薬組成物。

【請求項57】

ＳＡＧＥ１阻害薬と、
薬学的に許容されるキャリアとを含む
医薬組成物。

【請求項58】

前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１のレベル又は活性を低下させることができる
請求項５７に記載の医薬組成物。

【請求項59】

前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ転写を阻害し、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡレベルを低下させ、ＳＡＧＥ１タンパク質レベルを低下させ、又はＳＡＧＥ１を介する生物学的機能を少なくとも１つ阻害する
請求項５８に記載の医薬組成物。

【請求項60】

前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、化合物、又はその抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む
請求項５８又は５９に記載の医薬組成物。

【請求項61】

前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１タンパク質に特異的に結合し、ポリペプチド、化合物、オリゴヌクレオチド、又はその抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む
請求項５７～６０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項62】

前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１核酸（例えば、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡもしくはＳＡＧＥ１遺伝子）を標的とするオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドもしくは前記ポリヌクレオチドを含む核酸ベクターを含む
請求項５７～６０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項63】

前記オリゴヌクレオチドは、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列、又はＳＡＧＥ１遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含む
請求項６２に記載の医薬組成物。

【請求項64】

ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの前記一部は、SEQ ID NO: 2のヌクレオチド266-366、866-1116、1316-1616、1916-2266、2466-2666、及び2782-2946間の配列内の１０個以上の連続ヌクレ
オチドを含む
請求項６３に記載の医薬組成物。

【請求項65】

前記オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NOs: 82-95及び106-147から選択される配列を含む
請求項６３に記載の医薬組成物。

【請求項66】

前記オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NOs: 70/71、72/73、74/75、76/77、78/79、又は 80/81から選択されるセンス／アンチセンス配列のペアを含む
請求項６３に記載の医薬組成物。

【請求項67】

前記オリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はガイドＲＮＡである
請求項６２に記載の医薬組成物。

【請求項68】

ＳＡＧＥ１陽性疾患について予防又は処置を必要とする被験者に対して当該疾患の予防又は処置を行う方法であって、
ａ）ＳＡＧＥ１阻害薬、
ｂ）請求項５７～６７のいずれか１項に記載の医薬組成物、
ｃ）請求項３６～４８のいずれか１項に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬、
ｄ）請求項３９又は５０に記載のＳＡＧＥ１阻害薬、
ｄ）請求項５３、５４、又は５５に記載の細胞、又は
ｅ）これらの組み合わせ
の有効量を前記被験者に投与するステップを含む方法。

【請求項69】

前記ＳＡＧＥ１陽性疾患は、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍である
請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

ＴＰ５３が変異した被験者の腫瘍の悪性度の進行を予防し、抑制し、又は遅らせる方法であって、
ａ）ＳＡＧＥ１阻害薬、
ｂ）請求項５７～６７のいずれか１項に記載の医薬組成物、
ｃ）請求項３６～４８のいずれか１項に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬、
ｄ）請求項４９又は５０に記載のＳＡＧＥ１阻害薬、
ｄ）請求項５３、５４、又は５５に記載の細胞、又は
ｅ）これらの組み合わせ
の有効量を前記被験者に投与するステップを含む方法。

【請求項71】

前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１のレベル又は活性を低下させることができる
請求項６８～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ転写を阻害し、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡレベルを低下させ、ＳＡＧＥ１タンパク質レベルを低下させ、又はＳＡＧＥ１を介する生物学的機能を少なくとも１つ阻害する
請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、化合物、又はその抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む
請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡもしくはＳＡＧＥ１遺伝子を標的とする
オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドもしくは前記ポリヌクレオチドを含む核酸ベクターを含む
請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記オリゴヌクレオチドは、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列、又はＳＡＧＥ１遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含む
請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１タンパク質に特異的に結合し、ポリペプチド、化合物、オリゴヌクレオチド、又はその抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む
請求項７３に記載の方法。

【請求項77】

第２治療薬を投与するステップをさらに含む
請求項６８～７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

前記第２治療薬は、化学療法剤、抗癌剤、放射線治療、免疫療法剤、抗血管形成剤、標的治療薬、細胞療法薬、遺伝子療法薬、ホルモン療法薬、又はサイトカインを含む
請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

ＳＡＧＥ１阻害薬である薬剤をスクリーニングする方法であって、
（１）ＳＡＧＥ１タンパク質又はその機能的等価物を検査薬に接触させ、前記検査薬と前記ＳＡＧＥ１又はその機能的等価物との結合を検出するステップ、又は
（２）検査薬をＳＡＧＥ１複合体の成分のＳＡＧＥ１結合フラグメントに接触させ、前記検査薬と前記ＳＡＧＥ１結合フラグメントとの結合を検出するステップ、又は
（３）検査薬をＳＡＧＥ１及びＳＡＧＥ１複合体の成分のＳＡＧＥ１結合フラグメントに接触させ、当該ＳＡＧＥ１と当該ＳＡＧＥ１結合フラグメントとの結合を阻害もしくは抑制する当該検査薬の能力又はＳＡＧＥ１複合体の形成を抑制する当該検査薬の能力を検出するステップのいずれかを含む方法。

【請求項80】

ＳＡＧＥ１阻害薬である薬剤をスクリーニングする方法であって、
ＳＡＧＥ１発現細胞又はその機能的等価物を検査薬に接触させるステップと、
ＳＡＧＥ１又はその機能的等価物の量又は活性を低下させる前記検査薬の能力を判定するステップとを含む方法。

【請求項81】

前記細胞は、腫瘍細胞である
請求項８１に記載の方法。

【請求項82】

ＳＡＧＥ１をコードする第1遺伝子と、
レポーターをコードする第２遺伝子とを含む組み換え細胞であって、
前記レポーターは、ＳＡＧＥ１の発現又はＳＡＧＥ１を介する活性に応じて、検出可能なシグナルを生成するように構成されている
組み換え細胞。

【請求項83】

ＳＡＧＥ１複合体の結合界面のＸ線結晶構造座標セットであって、
前記結合界面は、Ｆ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｍ８３２、Ｖ８７６、Ｒ８７２、Ｋ８２８、Ｒ８３６、及びＱ８４０からなる群から選択されるＳＡＧＥ１の１以上のアミノ酸残基、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含み、
前記残基のナンバリングはSEQ ID NO: 3に準ずる
Ｘ線結晶構造座標セット。

【請求項84】

タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）のコード７Ｃ５Ｕに規定されている
請求項８３に記載のＸ線結晶構造座標。

【請求項85】

ＩＮＴＳ３の結合界面のＸ線結晶構造座標セットであって、
前記結合界面は、Ｔ８０４、Ｓ８４１、Ｓ８７４、Ｓ７６９、Ｎ９３３、Ｒ８４９、Ｑ７７３、Ｃ７７７、Ｍ７８１、Ａ８１６、Ｎ８１８、Ｅ８３８、Ｅ８５０、Ｆ８７１、Ｒ８４８、Ｆ８０５、Ｌ８４５、Ｌ８１５、Ｌ８４４、Ｙ８０８、Ｃ８４２、Ｑ８４６、Ｑ８７０、Ｒ８７７、Ｈ８７８、Ｋ８８２、Ｅ７３２、Ｖ７６６、Ｑ７７１、Ｄ７６８、Ａ７６５、Ｑ７３１、Ｅ８３５、Ｅ８０３、Ｃ８０９、及びＬ７７２からなる群から選択されるＩＮＴＳ３の１以上のアミノ酸残基、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含み、
前記残基のナンバリングはSEQ ID NO: 5に準ずる
Ｘ線結晶構造座標セット。

【請求項86】

タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）のコード７Ｃ５Ｕに規定されている
請求項８５に記載のＸ線結晶構造座標。

【請求項87】

ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との結合界面のＸ線結晶構造座標セットであって、
前記ＳＡＧＥ１の結合界面は、ＳＡＧＥ１のＦ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｍ８３２、Ｖ８７６、Ｒ８７２、Ｋ８２８、Ｒ８３６、及びＱ８４０からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基（当該残基のナンバリングはSEQ ID NO: 3に準ずる）、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含み、前記ＩＮＴＳ３の結合界面は、ＩＮＴＳ３のＴ８０４、Ｓ８４１、Ｓ８７４、Ｓ７６９、Ｎ９３３、Ｒ８４９、Ｑ７７３、Ｃ７７７、Ｍ７８１、Ａ８１６、Ｎ８１８、Ｅ８３８、Ｅ８５０、Ｆ８７１、Ｒ８４８、Ｆ８０５、Ｌ８４５、Ｌ８１５、Ｌ８４４、Ｙ８０８、Ｃ８４２、Ｑ８４６、Ｑ８７０、Ｒ８７７、Ｈ８７８、Ｋ８８２、Ｅ７３２、Ｖ７６６、Ｑ７７１、Ｄ７６８、Ａ７６５、Ｑ７３１、Ｅ８３５、Ｅ８０３、Ｃ８０９、及びＬ７７２からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基（当該残基のナンバリングはSEQ ID NO: 5に準ずる）、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含む
Ｘ線結晶構造座標セット。

【請求項88】

タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）のコード７Ｃ５Ｕに規定されている
請求項８５に記載のＸ線結晶構造座標。

【請求項89】

請求項８３～８８に記載のＸ線結晶構造座標セットを記憶している機械可読データ記憶媒体。

【請求項90】

潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬である薬剤を同定する方法であって、
ａ）請求項８３～８８に記載のＸ線結晶構造座標セットに基づく結合界面の３次元構造の表示物をコンピュータ上で生成するステップと、
ｂ）前記薬剤の表示物をコンピュータ上で生成するステップと、
ｃ）前記薬剤が前記結合界面の１以上の残基と相互作用するよう、前記ステップｂ）における前記薬剤の表示物を前記ステップａ）における前記結合界面の３次元構造のコンピュータ表示物にフィットさせるステップと、
ｄ）前記薬剤と前記結合界面の１以上の残基との前記ステップｃ）における相互作用を評価するステップとを含み、
前記相互作用により、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体に対して競合する場合もある、前記薬剤とＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３とを含む低エネルギーで安定的な複合体が生じると、前記薬剤を潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬と同定する
方法。

【請求項91】

潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬を同定するバーチャルスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項８３～８８に記載のＸ線結晶構造座標に基づく結合界面の３次元構造の表示物をコンピュータ上で生成するステップと、
（ｂ）コンピュータ上で、薬剤の表示物を生成する、又はライブラリの薬剤の表示物にアクセスするステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）における前記薬剤の表示物を前記ステップ（ａ）における前記結合界面の３次元構造のコンピュータ表示物にフィットさせ、前記結合界面の１以上の残基と相互作用する前記薬剤の構成を提供するステップと、
（ｄ）前記薬剤と前記結合界面の１以上の残基との前記ステップ（ｃ）における相互作用を評価するステップとを含み、
前記相互作用により、ＳＡＧＥ１複合体に対して競合する場合もある、前記薬剤とＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３とを含む低エネルギーで安定的な複合体が生じると、前記薬剤を潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬と同定する
バーチャルスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、概して、ＳＡＧＥ１をバイオマーカとする疾病診断判定方法と、ＳＡＧＥ１を標的とする疾病処置のための組成物及び方法とに関する。

【背景技術】

【0002】

癌精巣抗原（ＣＴＡ（Cancer-testis antigen））は、タンパク質の混成群であり、そのファミリは７０を超え、メンバは１４０を超える（Fratta E.ら、Mol Oncol (2011) 5:
164）。様々な腫瘍においてＣＴＡの発現が報告されているが、正常組織におけるＣＴＡの発現は、主に精巣に限定されている。ＣＴＡは、腫瘍と免疫特権を持つ精巣とに限定的に発現するため、近年、癌免疫療法及びワクチン開発における抗原として研究されてきた。しかしながら、腫瘍細胞の増殖に関わるＣＦＡの機能は、まだほとんど解明されていない。

【0003】

肉腫抗原１（Sarcoma antigen 1（ＳＡＧＥ１））は、ＣＴＡファミリに属する。ＳＡＧＥ１が腫瘍特異性抗原として発見されてから２０年近く経つが、腫瘍の増殖及び進行の促進においてなんらかの役割を果たしているのか、どのようにその役割を果たしているのか、未だによく分かっていない。有効な腫瘍診断及び治療法を開発する必要性は継続してあるので、腫瘍細胞の増殖におけるＳＡＧＥ１の役割を解明し、腫瘍の新しい診断マーカ及び治療標的として機能するかについて、その可能性を探ることが望まれる。

【発明の概要】

【0004】

一態様において、本開示の方法は、被験者のＳＡＧＥ１陽性疾患を診断する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップと、前記生体サンプルにおいて検出される前記ＳＡＧＥ１発現の有無又はレベルに基づいて、前記被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患であるか否かを評価するステップとを含む。

【0005】

一態様において、本開示の方法は、被験者のＳＡＧＥ１陽性疾患を診断する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、前記生体サンプルにおいて前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患であると診断する。

【0006】

実施の形態によっては、前記生体サンプルは、正常な場合、検出可能なＳＡＧＥ１発現がないタイプのサンプルである。

【0007】

実施の形態によっては、前記被験者はＴＰ５３が欠損（例えば、変異）していると判断されている。

【0008】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１陽性疾患は、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍である。

【0009】

別の態様において、本開示の方法は、被験者の腫瘍の悪性度又は悪性になる可能性を判定する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、前記生体サンプルにおいて前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記腫瘍は、悪性である、又は悪性になる可能性があると判定する。

【0010】

別の態様において、本開示の方法は、被験者の腫瘍の悪性度又は悪性になる可能性を判定する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップと、前記生体サンプルにおいて検出される前記ＳＡＧＥ１発現の有無又はレベルに基
づいて、前記被験者に悪性又は悪性になる可能性がある腫瘍があるか否かを評価するステップとを含む。

【0011】

実施の形態によっては、前記生体サンプルは、正常な場合、検出可能なＳＡＧＥ１発現がないタイプのサンプルである。

【0012】

実施の形態によっては、前記悪性度は、以下の特徴、すなわち、
（ａ）１以上の幹細胞マーカが発現する、
（ｂ）転移可能である、
（ｃ）細胞の無制御増殖が可能である、
（ｄ）疾病が進行する可能性が高い、
（ｅ）抗癌治療に耐性が生じる可能性が高い、
（ｆ）抗癌治療の処置後に再発する可能性が高い、
（ｇ）１以上の癌関連ドライバー変異が生じている、又は生じる可能性が高い、のうちの１以上の特徴を有する。

【0013】

実施の形態によっては、前記被験者には悪性の臨床症状が現れていない。

【0014】

別の態様において、本開示の方法は、被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患である可能性を断定（predicate）する方法であって、前記被験者の第１生体サンプルにおいてＴＰ５３の欠損を検出するステップを含み、ＴＰ５３の欠損が検出された場合、前記被験者はＳＡＧＥ１陽性疾患である可能性が高いと断定する。

【0015】

別の態様において、本開示の方法は、被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患である可能性を断定（predicate）する方法であって、前記被験者の第１生体サンプルにおいてＴＰ５３の欠損を検出するステップと、前記第１生体サンプルにおいて検出される前記ＴＰ５３の欠損の有無に基づいて、前記被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患である可能性があるか否かを評価するステップとを含む。

【0016】

実施の形態によっては、前記方法は、ＴＰ５３の欠損（例えば、変異）が検出された場合、ＳＡＧＥ１発現の検査をするように前記被験者に推めるステップをさらに含む。

【0017】

実施の形態によっては、前記方法は、前記第１生体サンプル又は前記被験者の第２生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップをさらに含む。

【0018】

実施の形態によっては、前記生体サンプルにおいてＳＡＧＥ１発現が検出されなかった場合、前記方法は、時間を置いて前記被験者のＳＡＧＥ１発現をモニタリングするステップをさらに含む。

【0019】

実施の形態によっては、前記第１又は第２生体サンプルは、正常な場合、検出可能なＳＡＧＥ１発現がないタイプのサンプルである。

【0020】

実施の形態によっては、前記方法は、前記第１生体サンプル又は追加の前記第２生体サンプルにおいてＳＡＧＥ１発現を検出した場合、有効量のＳＡＧＥ１阻害薬を前記被験者に投与するステップをさらに含む。

【0021】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬に対する腫瘍サンプルの感受性を判断する方法であって、前記腫瘍サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、前記腫瘍サンプルにおいて前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記腫瘍サンプルはＳＡＧＥ１阻害薬に感受性があると判断する。

【0022】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬に対する腫瘍サンプルの感受性を判断する方法であって、前記腫瘍サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップと、前記腫瘍サンプルにおいて検出される前記ＳＡＧＥ１発現の有無又はレベルに基づいて、前記腫瘍サンプルが前記ＳＡＧＥ１阻害薬に感受性があるか否かを評価するステップとを含む。

【0023】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高い腫瘍がある被験者を特定する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記被験者は前記ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高いと特定する。

【0024】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高い腫瘍がある被験者を特定する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップと、前記生体サンプルにおいて検出される前記ＳＡＧＥ１発現の有無又はレベルに基づいて、前記被験者がＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高いか否かを評価するステップとを含む。

【0025】

実施の形態によっては、前記被験者はＴＰ５３が変異していると判断されている。

【0026】

実施の形態によっては、前記方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高いと特定された前記被験者にＳＡＧＥ１阻害薬を提供又は投与するステップをさらに含む。

【0027】

別の態様において、本開示の方法は、被験者におけるＳＡＧＥ１陽性疾患の進行をモニタリングする方法であって、前記被験者の第１生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出するステップ（ａ）と、前記被験者の第２生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出するステップ（ｂ）とを含み、前記第２生体サンプルは前記第１サンプルから時間を置いて取得されたものであり、前記ＳＡＧＥ１発現のレベルが前記第１生体サンプルよりも前記第２生体サンプルの方が高い場合、前記腫瘍は進行していると判断する。

【0028】

別の態様において、本開示の方法は、被験者におけるＳＡＧＥ１陽性疾患の進行をモニタリングする方法であって、前記被験者の第１生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出するステップ（ａ）と、前記被験者の第２生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出するステップ（ｂ）と、前記ステップ（ａ）及び前記ステップ（ｂ）のそれぞれにおいて検出された前記ＳＡＧＥ１発現のレベルに基づいて、前記被験者において前記ＳＡＧＥ１陽性疾患が進行しているか否かを評価するステップ（ｃ）とを含み、前記第２生体サンプルは前記第１サンプルから時間を置いて取得されたものである。

【0029】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１陽性疾患がある被験者の治療期間中のＳＡＧＥ１阻害薬による処置に対する応答性をモニタリングする方法であって、前記治療期間の後、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出し、処置後のＳＡＧＥ１発現レベルを取得するステップ（ａ）と、前記治療期間以前に前記被験者から得た生体サンプルにおいて検出されたＳＡＧＥ１発現の基準レベルと前記処置後のＳＡＧＥ１発現レベルを比較するステップ（ｂ）とを含み、前記処置後のＳＡＧＥ１発現レベルが前記基準レベルより低い場合、前記被験者は前記処置に応答性があると特定する。

【0030】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１陽性疾患がある被験者の治療期間中のＳＡＧＥ１阻害薬による処置に対する応答性をモニタリングする方法であって、前記治療
期間の後、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出し、処置後のＳＡＧＥ１発現レベルを取得するステップ（ａ）と、前記治療期間以前に前記被験者から得た生体サンプルにおいて検出されたＳＡＧＥ１発現の基準レベルと前記処置後のＳＡＧＥ１発現レベルを比較するステップ（ｂ）と、前記ステップ（ａ）及び前記ステップ（ｂ）のそれぞれにおいて検出された前記ＳＡＧＥ１発現のレベルに基づいて、前記ＳＡＧＥ１阻害薬による前記処置に対する応答性があるか否かを評価するステップ（ｃ）とを含む。

【0031】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１発現は、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、又はタンパク質レベルで検出される。

【0032】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１発現は、
（ａ）ＳＡＧＥ１タンパク質の存在又はレベル、
（ｂ）ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの存在又はレベル、
（ｃ）ＳＡＧＥ１複合体の存在又はレベル、
（ｄ）ＳＡＧＥ１遺伝子の脱メチル化のレベル、
（ｅ）ＳＡＧＥ１遺伝子のヒストンのアセチル化の存在又はレベル、
（ｆ）ＳＡＧＥ１遺伝子に対する転写因子の結合の存在又はレベル、
これらの組み合わせ、のいずれかによって示される。

【0033】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＳＡＧＥ１と、ＩＮＴＳ３、ＩＮＩＰ、ＮＡＢＰ１／２、ＣＲＥＢＢＰ、ＴＬＥ１、ＴＬＥ２、ＴＬＥ３、ＴＬＥ４、ＴＬＥ５、ＧＧＡ３、ＣＮＯＴ１、ＴＡＸ１ＢＰ１、ＳＥＣ１６Ａ、ＣＹＬＤ、及びＰＡＸＢＰ１から選択される少なくとも１種の成分とを含む。

【0034】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３とを含む。

【0035】

実施の形態によっては、前記メチル化は、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写開始部位の上流３ｋｂ以内及び下流３ｋｂ以内の領域（例えば、前記ＳＡＧＥ１遺伝子のＣｐＧ含有部分）で検出される。

【0036】

実施の形態によっては、前記ヒストンのアセチル化は、前記ＳＡＧＥ１遺伝子のエンハンサ領域、プロモータ領域、又は発現領域の付近で検出される。

【0037】

実施の形態によっては、前記検出は、免疫学的検査、増幅検査、ハイブリダイゼーションアッセイ、又はシーケンシングアッセイを含む。

【0038】

実施の形態によっては、前記生体サンプルを細胞、組織、体液、及びこれらの組み合わせから選択する。

【0039】

実施の形態によっては、前記体液を血液、血清、血漿、腹水、嚢胞液、胸水、腹膜液、脳脊髄液、涙液、尿、唾液、痰、乳頭液、リンパ液、気道・腸管・尿生殖路の体液、母乳、臓器系の体液、腹膜液、組織移植片の培養で得られる馴化培地、又はこれらの組み合わせから選択する。

【0040】

実施の形態によっては、前記腫瘍を固形腫瘍又は血液系腫瘍から選択する。

【0041】

実施の形態によっては、前記腫瘍は、副腎癌、リンパ上皮性腫瘍、腺様細胞癌、リンパ腫、聴神経腫、急性リンパ性白血病、肢端黒子型黒色腫、急性骨髄性白血病、先端汗腺腫、慢性リンパ性白血病、急性好酸球性白血病、肝臓癌、急性赤血球白血病、小細胞肺癌、
急性リンパ性白血病、非小細胞肺癌、急性巨核芽球性白血病、ＭＡＬＴリンパ腫、急性単球性白血病、悪性線維性組織球腫、急性前骨髄球性白血病、悪性末梢神経鞘腫、マントル細胞リンパ腫、腺癌、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、海馬の悪性腫瘍、腺様嚢胞癌、腺腫様、腺様歯原性腫瘍、肥満細胞白血病、腺扁平上皮癌、縦隔胚細胞腫瘍、脂肪組織腫瘍、乳房髄様癌、副腎皮質癌、甲状腺髄様癌、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、髄芽腫、浸潤性ＮＫ細胞白血病、黒色腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、髄膜腫、肺横紋筋肉腫、メルケル細胞癌、肺胞軟部肉腫、中皮腫、エナメル上皮腫、転移性尿路上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、ミュラー管混合腫瘍、甲状腺未分化癌、粘液性腫瘍、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、血管筋脂肪腫、筋肉組織腫瘍、血管肉腫、菌状息肉腫、星細胞腫、粘液性脂肪肉腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、粘液腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、粘液肉腫、Ｂ細胞リンパ性白血病、上咽頭癌、Ｂ細胞リンパ腫、神経鞘腫、基底細胞癌、神経芽細胞腫、胆道癌、神経線維腫症、膀胱癌、神経腫、芽細胞腫、結節性黒色腫、骨癌、眼癌、ブレンナー腫瘍、乏突起膠細胞、褐色腫瘍、乏突起膠腫、バーキットリンパ腫、好酸球性乳癌、脳腫瘍、視神経腫瘍、口腔上皮内腫瘍、骨肉腫、癌肉腫、卵巣癌、骨軟部腫瘍、肺溝腫瘍、甲状腺乳頭癌、骨髄腫、傍神経節腫、軟骨腫、松果体芽細胞腫、脊索腫、松果体細胞腫、絨毛癌、下垂体腫瘍、脈絡叢乳頭腫、下垂体腺腫、腎明細胞肉腫、下垂体腫瘍、頭蓋咽頭腫、形質細胞腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、多胎芽腫、子宮頸癌、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、大腸癌、中枢神経系原発性リンパ腫、デゴス病、原発性滲出性リンパ腫、増殖性小円形細胞腫、原発性腹膜前癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、神経上皮性腫瘍の胚芽異形成症、膵臓癌、未分化細胞腫瘍、咽頭癌、胚性癌、腹膜偽粘液腫、内分泌腺腫瘍、腎細胞癌、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫、内胚葉洞腫瘍、腎髄質癌、網膜芽細胞腫、食道癌、横紋筋肉腫、エンダデルフォス、横紋筋肉腫、筋腫、リヒター形質転換、線維肉腫、直腸癌、濾胞性リンパ腫、肉腫、濾胞性甲状腺癌、神経鞘腫、神経節細胞腫、セミノーマ、消化管癌、セルトリ細胞腫、胚細胞腫、性索－性腺間質腫瘍、妊娠絨毛癌、印環細胞腫、巨細胞線維芽細胞腫、皮膚癌、骨巨細胞腫、小円形青色細胞腫瘍、神経膠腫、小細胞癌、多形性膠芽腫、軟部肉腫、神経膠腫、ソマトスタチン腫瘍、脳神経膠腫、煤イボ、膵臓の高グルカゴン腫、脊髄腫瘍、性腺芽腫、脾臓辺縁リンパ腫、顆粒膜細胞腫、扁平上皮癌、エストロゲン腫瘍、滑膜肉腫、胆嚢癌、セザリー病、胃癌、小腸癌、ヘアリー細胞白血病、扁平上皮癌、血管芽細胞腫、胃癌、頭頸部癌、Ｔ細胞リンパ腫、血管上皮腫、精巣癌、血液悪性腫瘍、肉腫、肝芽腫、甲状腺癌、肝脾臓Ｔ細胞リンパ腫、移行上皮細胞癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、非ホジキンリンパ腫、尿路癌、浸潤性小葉癌、泌尿生殖器癌、腸癌、尿路上皮癌、腎臓癌、ブドウ膜黒色腫、喉頭癌、子宮癌、悪性そばかす様喀痰、疣贅癌、致死性正中線肉芽腫、視経路神経膠腫、白血病、外陰癌、精巣間質腫瘍、膣癌、脂肪肉腫、ワルデンストームマクログロブリン血症、肺癌、腺リンパ腫リンパ管腫、腎芽腫、リンパ肉腫、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）から選択される。

【0042】

別の態様において、本開示のキットは、本明細書に記載の前記方法のいずれかで使用されるものであって、ＳＡＧＥ１発現を検出する１種以上の試薬を含む。

【0043】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１発現を検出する１種以上の前記試薬は、
（ａ）ＳＡＧＥ１タンパク質の存在又はレベルを検出するための試薬、
（ｂ）ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの存在又はレベルを検出するための試薬、
（ｃ）ＳＡＧＥ１複合体の存在又はレベルを検出するための試薬、
（ｄ）ＳＡＧＥ１遺伝子のメチル化レベルを検出するための試薬、
（ｅ）ＳＡＧＥ１遺伝子のヒストンのアセチル化の存在又はレベルを検出するための試薬、
（ｆ）ＳＡＧＥ１遺伝子に対する転写因子の結合の存在又はレベルを検出するための試薬、
これらの組み合わせ、から選択される。

【0044】

実施の形態によっては、少なくとも１種の試薬がＳＡＧＥ１特異オリゴヌクレオチドプライマ、ＳＡＧＥ１特異オリゴヌクレオチドプローブ、抗ＳＡＧＥ１抗体、及び抗ＳＡＧＥ１複合体抗体から選択される。

【0045】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１特異オリゴヌクレオチドプライマ又はプローブは、SEQ ID NO: 2の８個以上の連続ヌクレオチド又はSEQ ID NO: 1の８個以上の連続ヌクレオチドを含む又はこれと特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む。

【0046】

別の態様において、本開示のＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１複合体のレベル又は活性を低下させる。

【0047】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ポリペプチド、化合物、その抗体もしくは抗原結合フラグメント、又は核酸分子（例えば、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド）を含む。

【0048】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＩＮＴＳ３、ＩＮＩＰ、ＮＡＢＰ１／２、ＣＲＥＢＢＰ、ＴＬＥ１、ＴＬＥ２、ＴＬＥ３、ＴＬＥ４、ＴＬＥ５、ＧＧＡ３、ＣＮＯＴ１、ＴＡＸ１ＢＰ１、ＳＥＣ１６Ａ、ＣＹＬＤ、及びＰＡＸＢＰ１からなる群から選択される少なくとも１種の成分と複合したＳＡＧＥ１を含む。

【0049】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＩＮＴＳ３と複合したＳＡＧＥ１を含む。

【0050】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１がＩＮＴＳ３に結合するのを阻害する。

【0051】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＩＮＴＳ３に結合する、又は当該ＩＮＴＳ３がＳＡＧＥ１のＦ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｍ８３２、Ｖ８７６、Ｒ８７２、Ｋ８２８、Ｒ８３６及びＱ８４０からなる群から選択された１以上の残基（残基のナンバリングはＳＡＧＥ１のSEQ ID NO: 3に準ずる）に結合しないようにする。

【0052】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、当該抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）ＳＡＧＥ１に特異的に結合する、（ｂ）ＳＡＧＥ１と複合する成分（例えば、ＩＮＴＳ３）に特異的に結合する、又は（ｃ）前記ＳＡＧＥ１複合体に特異的に結合するが、ＳＡＧＥ１にもＳＡＧＥ１と複合する成分にも結合しない。

【0053】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＩＮＴＳ３のＳＡＧＥ１結合フラグメント、その変異体もしくは誘導体、又はその融合ポリペプチドを含む。

【0054】

実施の形態によっては、前記ＩＮＴＳ３のＳＡＧＥ１結合フラグメントは、ＳＡＧＥ１
に結合可能なSEQ ID NO: 9のアミノ酸配列、その変異体もしくはフラグメント、又はその融合ポリペプチドを含む。

【0055】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１のＩＮＴＳ３結合フラグメント、その変異体もしくは誘導体、又はその融合ポリペプチドを含む。

【0056】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１のＩＮＴＳ３結合フラグメントは、ＩＮＴＳ３に結合可能なSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列、その変異体もしくはフラグメント、又はその融合ポリペプチドを含む。

【0057】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＩＮＴＳ３に結合可能なＩＮＴＳ６もしくはＩＮＴＳ６ＬのＩＮＴＳ３結合フラグメント、その変異体もしくは誘導体、又はその融合ポリペプチドを含む。

【0058】

実施の形態によっては、前記ＩＮＴＳ６もしくはＩＮＴＳ６ＬのＩＮＳＴ３結合フラグメントは、ＩＮＴＳ３に結合可能なSEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 104、又はSEQ ID NO: 105のアミノ酸配列、その変異体もしくはフラグメント、又はその融合ポリペプチドを含む。

【0059】

別の態様において、本開示のＳＡＧＥ１阻害薬は、ユビキチン経路タンパク質に結合可能な第１部分と、ＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体に結合可能な第２部分とを含む。

【0060】

実施の形態によっては、前記第１部分及び前記第２部分は、リンカーを介して結合している。

【0061】

別の態様において、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合ドメインと、膜貫通型ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記抗原結合ドメインは、ＳＡＧＥ１のエピトープ又はＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープに特異的に結合する。

【0062】

実施の形態によっては、前記ＣＡＲは、共刺激ドメインをさらに含む。

【0063】

別の態様において、本開示の細胞は、本明細書に記載の前記ＣＡＲを発現させるように遺伝子操作されている。

【0064】

実施の形態によっては、前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、ＴＣＲ発現細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＮＫ細胞を含む。

【0065】

別の態様において、本開示のエクスビボ活性化抗原提示細胞は、ＳＡＧＥ１のエピトープ又はＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープに暴露されるものであって、当該抗原提示細胞は、場合によって樹状細胞を含む。

【0066】

別の態様において、本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬と、本明細書に記載の前記ＳＡＧＥ１阻害薬、又は本明細書に記載の細胞と、薬学的に許容されるキャリアとを含む。

【0067】

別の態様において、本開示の医薬組成物は、ＳＡＧＥ１阻害薬と、薬学的に許容されるキャリアとを含む。

【0068】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１のレベル又は活性を低下させることができる。

【0069】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ転写を阻害し、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡレベルを低下させ、ＳＡＧＥ１タンパク質レベルを低下させ、又はＳＡＧＥ１を介する生物学的機能を少なくとも１つ阻害する。

【0070】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、化合物、又はその抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む。

【0071】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１タンパク質に特異的に結合し、ポリペプチド、化合物、オリゴヌクレオチド、又はその抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む。

【0072】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１核酸（例えば、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡもしくはＳＡＧＥ１遺伝子）を標的とするオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドもしくは前記ポリヌクレオチドを含む核酸ベクターを含む。

【0073】

実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドは、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列、又はＳＡＧＥ１遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含む。

【0074】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの前記一部は、SEQ ID NO: 2のヌクレオチド266-366、866-1116、1316-1616、1916-2266、2466-2666、及び2782-2946間の配列内の１０個以上の連続ヌクレオチドを含む。

【0075】

実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NOs: 82-95及び106-147から選択される配列を含む。

【0076】

実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NOs: 70/71、72/73、74/75、76/77、78/79、又は 80/81から選択されるセンス／アンチセンス配列のペアを含む。

【0077】

実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はガイドＲＮＡである。

【0078】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１陽性疾患について予防又は処置を必要とする被験者に対して当該疾患の予防又は処置を行う方法であって、
（ａ）本明細書に記載の前記ＳＡＧＥ１阻害薬、
（ｂ）本明細書に記載の前記医薬組成物、
（ｃ）本明細書に記載の前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬、
（ｅ）本明細書に記載の前記細胞、又は
（ｆ）これらの組み合わせ
の有効量を前記被験者に投与するステップを含む。

【0079】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１陽性疾患は、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍である。

【0080】

別の態様において、本開示の方法は、ＴＰ５３が変異した被験者の腫瘍の悪性度の進行を予防し、抑制し、又は遅らせる方法であって、
（ａ）本明細書に記載の前記ＳＡＧＥ１阻害薬、
（ｂ）本明細書に記載の前記医薬組成物、
（ｃ）本明細書に記載の前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬、
（ｅ）本明細書に記載の前記細胞、又は
（ｆ）これらの組み合わせ
の有効量を前記被験者に投与するステップを含む。

【0081】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１のレベル又は活性を低下させることができる。

【0082】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ転写を阻害し、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡレベルを低下させ、ＳＡＧＥ１タンパク質レベルを低下させ、又はＳＡＧＥ１を介する生物学的機能を少なくとも１つ阻害する。

【0083】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、化合物、又はその抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む。

【0084】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡもしくはＳＡＧＥ１遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドもしくは前記ポリヌクレオチドを含む核酸ベクターを含む。

【0085】

実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドは、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列、又はＳＡＧＥ１遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含む。

【0086】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１タンパク質に特異的に結合し、ポリペプチド、化合物、オリゴヌクレオチド、又はその抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む。

【0087】

実施の形態によっては、前記方法は、第２治療薬を投与するステップをさらに含む。

【0088】

実施の形態によっては、前記第２治療薬は、化学療法剤、抗癌剤、放射線治療、免疫療法剤、抗血管形成剤、標的治療薬、細胞療法薬、遺伝子療法薬、ホルモン療法薬、又はサイトカインを含む。

【0089】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬である薬剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＳＡＧＥ１タンパク質又はその機能的等価物を検査薬に接触させ、前記検査薬と前記ＳＡＧＥ１又はその機能的等価物との結合を検出するステップ、又は
（ｂ）検査薬をＳＡＧＥ１複合体の成分のＳＡＧＥ１結合フラグメントに接触させ、前記検査薬と前記ＳＡＧＥ１結合フラグメントとの結合を検出するステップ、又は
（ｃ）検査薬をＳＡＧＥ１及びＳＡＧＥ１複合体の成分のＳＡＧＥ１結合フラグメントに接触させ、当該ＳＡＧＥ１と当該ＳＡＧＥ１結合フラグメントとの結合を阻害もしくは抑制する当該検査薬の能力又はＳＡＧＥ１複合体の形成を抑制する当該検査薬の能力を検出するステップのいずれかを含む。

【0090】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬である薬剤をスクリーニングする方法であって、ＳＡＧＥ１発現細胞又はその機能的等価物を検査薬に接触させるステップと、ＳＡＧＥ１又はその機能的等価物の量又は活性を低下させる前記検査薬の能力を判定するステップとを含む。

【0091】

実施の形態によっては、前記細胞は、腫瘍細胞である。

【0092】

別の態様において、本開示の組み換え細胞は、ＳＡＧＥ１をコードする第1遺伝子と、レポーターをコードする第２遺伝子とを含み、前記レポーターは、ＳＡＧＥ１の発現又はＳＡＧＥ１を介する活性に応じて、検出可能なシグナルを生成するように構成されている。

【0093】

別の態様において、本開示はＳＡＧＥ１複合体の結合界面のＸ線結晶構造座標セットを示し、前記結合界面は、Ｆ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｍ８３２、Ｖ８７６、Ｒ８７２、Ｋ８２８、Ｒ８３６、及びＱ８４０からなる群から選択されるＳＡＧＥ１の１以上のアミノ酸残基、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含み、前記残基のナンバリングはSEQ ID NO: 3に準ずる。

【0094】

実施の形態によっては、前記Ｘ線結晶構造座標は、タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）のコード７Ｃ５Ｕに規定されている。

【0095】

別の態様において、本開示はＩＮＴＳ３の結合界面のＸ線結晶構造座標セットを示し、前記結合界面は、Ｔ８０４、Ｓ８４１、Ｓ８７４、Ｓ７６９、Ｎ９３３、Ｒ８４９、Ｑ７７３、Ｃ７７７、Ｍ７８１、Ａ８１６、Ｎ８１８、Ｅ８３８、Ｅ８５０、Ｆ８７１、Ｒ８４８、Ｆ８０５、Ｌ８４５、Ｌ８１５、Ｌ８４４、Ｙ８０８、Ｃ８４２、Ｑ８４６、Ｑ８７０、Ｒ８７７、Ｈ８７８、Ｋ８８２、Ｅ７３２、Ｖ７６６、Ｑ７７１、Ｄ７６８、Ａ７６５、Ｑ７３１、Ｅ８３５、Ｅ８０３、Ｃ８０９、及びＬ７７２からなる群から選択されるＩＮＴＳ３の１以上のアミノ酸残基、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含み、前記残基のナンバリングはSEQ ID NO: 5に準ずる。

【0096】

実施の形態によっては、前記Ｘ線結晶構造座標は、タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）のコード７Ｃ５Ｕに規定されている。

【0097】

別の態様において、本開示はＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との結合界面のＸ線結晶構造座標セットを示し、前記ＳＡＧＥ１の結合界面は、ＳＡＧＥ１のＦ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｍ８３２、Ｖ８７６、Ｒ８７２、Ｋ８２８、Ｒ８３６、及びＱ８４０からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基（当該残基のナンバリングはSEQ ID NO: 3に準ずる）、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含み、前記ＩＮＴＳ３の結合界面は、ＩＮＴＳ３のＴ８０４、Ｓ８４１、Ｓ８７４、Ｓ７６９、Ｎ９３３、Ｒ８４９、Ｑ７７３、Ｃ７７７、Ｍ７８１、Ａ８１６、Ｎ８１８、Ｅ８３８、Ｅ８５０、Ｆ８７１、Ｒ８４８、Ｆ８０５、Ｌ８４５、Ｌ８１５、Ｌ８４４、Ｙ８０８、Ｃ８４２、Ｑ８４６、Ｑ８７０、Ｒ８７７、Ｈ８７８、Ｋ８８２、Ｅ７３２、Ｖ７６６、Ｑ７７１、Ｄ７６８、Ａ７６５、Ｑ７３１、Ｅ８３５、Ｅ８０３、Ｃ８０９、及びＬ７７２からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基（当該残基のナンバリングはSEQ ID NO: 5に準ずる）、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含む。

【0098】

実施の形態によっては、前記Ｘ線結晶構造座標は、タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）のコード７Ｃ５Ｕに規定されている。

【0099】

別の態様において、本開示の機械可読データ記憶媒体は、本明細書に記載の前記Ｘ線結晶構造座標セットを記憶している。

【0100】

別の態様において、本開示の方法は、潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬である薬剤を同定する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の前記Ｘ線結晶構造座標セットに基づく結合界面の３次元構造の表示物をコンピュータ上で生成するステップと、
（ｂ）前記薬剤の表示物をコンピュータ上で生成するステップと、
（ｃ）前記薬剤が前記結合界面の１以上の残基と相互作用するよう、前記ステップ（ｂ）における前記薬剤の表示物を前記ステップ（ａ）における前記結合界面の３次元構造のコンピュータ表示物にフィットさせるステップと、
（ｄ）前記薬剤と前記結合界面の１以上の残基との前記ステップ（ｃ）における相互作用を評価するステップとを含み、
前記相互作用により、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体に対して競合する場合もある、前記薬剤とＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３とを含む低エネルギーで安定的な複合体が生じると、前記薬剤を潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬と同定する。

【0101】

別の態様において、本開示のバーチャルスクリーニング方法は、潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬を同定する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の前記Ｘ線結晶構造座標に基づく結合界面の３次元構造の表示物をコンピュータ上で生成するステップと、
（ｂ）コンピュータ上で、薬剤の表示物を生成する、又はライブラリの薬剤の表示物にアクセスするステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）における前記薬剤の表示物を前記ステップ（ａ）における前記結合界面の３次元構造のコンピュータ表示物にフィットさせ、前記結合界面の１以上の残基と相互作用する前記薬剤の構成を提供するステップと、
（ｄ）前記薬剤と前記結合界面の１以上の残基との前記ステップ（ｃ）における相互作用を評価するステップとを含み、
前記相互作用により、ＳＡＧＥ１複合体に対して競合する場合もある、前記薬剤とＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３とを含む低エネルギーで安定的な複合体が生じると、前記薬剤を潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬と同定する。

【0102】

本開示全体を通して、ここで使用される冠詞「a」、「an」、及び「the」は、その冠詞を付した目的語が１又は複数（すなわち、少なくとも１つ）あることを示している。例えば、「a polypeptide」は、１つ又は複数のポリペプチドを意味する。

【0103】

本出願において一連の数値が記載される場合はいずれも、それらの数値のいずれかがある数値範囲の上限又は下限となり得ると理解される。さらに、本発明は、このような数値範囲、すなわち、上限値及び下限値の組み合わせを有する範囲の全体を包含すると理解され、この上限及び下限のそれぞれの数値は、本明細書に記載の数値であり得る。本明細書に提示される範囲は、その範囲内のすべての値を含むと理解される。例えば、１～１０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の値すべてと、必要に応じて小数値とが含まれると理解される。同様に、「少なくとも／以上」で定められる範囲は、その数字とそれより大きい値とを含むと理解される。

【0104】

本明細書で使用する「約(about)」は、平均値の３つの標準偏差内、又は特定の技術分野における標準的な許容範囲内に収まると理解される。ある実施の形態では、約の変動量は0.5以内と理解される。

【0105】

本明細書において、冠詞「a」及び「an」は、その冠詞を付した目的語が１又は複数（すなわち、少なくとも１つ）あることを示している。例えば、「an element」は、１つ又は複数の元素を意味する。

【0106】

本明細書において、用語「含む（including）」は、「含むが、これに限定されない」という意味で、この文言と同義に用いられている。同様に、「等の」は、「等であって、これに限定されない」という意味で、この文言と同義に用いられている。

【0107】

本明細書において、用語「又は」は、文脈上明らかに別段の指定がなされていない限り、「及び／又は」という意味で包括的に用いられ、この文言と同義である。

【0108】

「含む／備える（comprising）」といった用語は、別段の記載がない限り、非限定的（open-ended）な用語（すなわち、「含むが、これに限定されない」）と解釈される。

【0109】

添付の図面は、本明細書に組み込まれ、その一部を形成するものである。この図面は、この明細書の説明部分と共に、さらに本開示内容の原理を説明し、かつ当業者が本開示内容を作製し、利用できるようにするものである。

【図面の簡単な説明】

【0110】

【図1A】図１Ａは、ＧＴＥｘのＲＮＡ－Ｓｅｑデータセットを使用した場合の正常組織におけるＳＡＧＥ１の発現を示す。

【図1B】図１Ｂは、ＴＣＧＡの多種多様な癌タイプの発現を示す。

【図1C】図１Ｃは、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ発現レベルで階層化されたＴＣＧＡの患者の全生存期間（ＯＳ）及び無憎悪生存期間（ＰＦＩ）を示す。

【図2A】図２Ａは、ＳＡＧＥ１がヒト精巣及び数種の腫瘍組織に発現することを示すＩＨＣ染色を示す。

【図2B】図２Ｂは、各腫瘍組織におけるＳＡＧＥ１発現レベルのリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を示す。

【図2C】図２Ｃは、各癌細胞株及びＳＡＧＥ１陰性非癌細胞株におけるＳＡＧＥ１発現レベルのウェスタンブロット分析を示す。

【図2D】図２Ｄは、６０個の大腸癌組織及び対応する前癌部のＳＡＧＥ１発現レベルのリアルタイムｑＰＣＲ分析を示す。

【図2E】図２Ｅは、ＴＣＧＡの癌の種類ごとのＳＡＧＥ１発現レベルのパターンを示す。

【図3A】図３Ａは、ＳＡＧＥ１が減少すると、ＲＴＣＡアッセイにおいてＨｕＴｕ８０細胞、Ａ３７５細胞、ＫＹＳＥ３０細胞、Ａ５４９細胞、及びＰＬＣＰＲＦ５細胞の成長が抑制されることを示す。

【図3B】図３Ｂは、ＳＡＧＥ１が減少すると、軟寒天上のＨｕＴｕ８０細胞、Ａ３７５細胞、ＫＹＳＥ３０細胞、Ａ５４９細胞、及びＰＬＣＰＲＦ５細胞の足場非依存性成長が抑制されることを示す。

【図3C】図３Ｃは、ＨｕＴｕ８０細胞においてＳＡＧＥ１が減少すると、ヌードマウスにおいて異種移植片の成長が妨げられることを示す。

【図3D】、

【図3E】図３Ｄ及び図３Ｅは、ｓｈＳＡＧＥ１治療によって、ブドウ膜黒色腫細胞株ＭＵＭ２Ｂ由来の直交異方性モデルの輝度シグナルが減少し（図３Ｄ）及び生存期間が延びた（図３Ｅ）ことを示す。

【図3F】図３Ｆは、定量ＰＣＲで異なるｓｉＲＮＡを用いた場合のＫＹＳＥ３０におけるＳＡＧＥ１ＫＤの能力を示す。

【図4A】、

【図4B】、

【図4C】図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃは、ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ－Ｐ）におけるＳＡＧＥ１のノックダウンを示す。代表画像は、ＨＣＣ－ＰＤＸ腫瘍として、ｓｈＳＡＧＥ１アデノウイルスで処置を施したもの（ｎ＝９）又は施していないもの（ｎ＝９）（図４Ａ）を示し、腫瘍の体積（図４Ｂ）及び重量（図４Ｃ）の統計分析を示す（ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定でＰ＜０．０１）。

【図4D】、

【図4E】、

【図4F】図４Ｄ、図４Ｅ、及び図４Ｆは、ヒト大腸癌（ＣＲＣ－Ｐ）におけるＳＡＧＥ１のノックダウンを示す。代表画像は、ＣＲＣ－ＰＤＸ腫瘍として、ｓｈＳＡＧＥ１アデノウイルスで処置を施したもの（ｎ＝６）又は施していないもの（ｎ＝９）（図４Ｄ）を示し、腫瘍の体積（図４Ｅ）及び重量（図４Ｆ）の統計分析を示す（ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定でＰ＜０．０１）。

【図4G】、

【図4H】、

【図4I】図４Ｇ、図４Ｈ、及び図４Ｉは、ヒト肺腺癌（ＬＵＡＤ－Ｐ）におけるＳＡＧＥ１のノックダウンを示す。代表画像は、ＬＵＡＤ－ＰＤＸ腫瘍として、ｓｈＳＡＧＥ１アデノウイルスで処置を施したもの（ｎ＝６）又は施していないもの（ｎ＝９）（図４Ｇ）を示し、腫瘍の体積（図４Ｈ）及び重量（図４Ｉ）の統計分析を示す（ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定でＰ＜０．０１）。

【図4J】、

【図4K】、

【図4L】図４Ｊ、図４Ｋ、及び図４Ｌは、ヒト肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ－Ｐ）におけるＳＡＧＥ１のノックダウンを示す。代表画像は、ＬＵＳＣ－ＰＤＸ腫瘍として、ｓｈＳＡＧＥ１アデノウイルスで処置を施したもの（ｎ＝７）又は施していないもの（ｎ＝９）を示し、腫瘍の体積（図４Ｊ）（ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定でＰ＜０．０１）及び重量（図４Ｋ）の統計分析を示す。異種移植腫瘍組織のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色ならびに周囲の非上皮細胞から癌細胞を同定するマーカである汎サイトケラチンのＩＨＣ染色を示す（図４Ｌ）。

【図4M】、

【図4N】、

【図4O】図４Ｍ、図４Ｎ、及び図４Ｏは、ＳＡＧＥ１陰性ＨＣＣにｓｈＳＡＧＥ１アデノウイルスを導入しても腫瘍の成長を抑制しないことを示す。代表画像は、ＰＤＸ腫瘍として、ｓｈＳＡＧＥ１アデノウイルスで処置を施したもの又は施していないものを示し、群ごとにｎ＝７とした腫瘍の重量（図４Ｍ）及び体積（図４Ｎ）の統計分析を示す（ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定でＰ＜０．０１）。病理組織代表画像は、対照群及びｓｈＳＡＧＥ処置群の両群におけるヌードマウスの心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び肺を示す（Ｈ＆Ｅ染色、尺度は２００μｍ）（図４Ｏ）。

【図5A】、

【図5B】、

【図5C】図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、転移の実験モデルにおいて腫瘍の転移を抑制したｓｈＳＡＧＥ処置を示す。尾静脈にＨＣＣ－Ｐ、ＬＵＡＤ－Ｐ、ＬＵＳＣ－ＰのＰＤＸ由来の細胞を注射した。７～１０日後、尾静脈注射によってマウス１匹あたり４×１０^１１個のゲノムコピーでＡＡＶ制御又はＡＡＶ－ＳＡＧＥ１の処置をレシピエントに施した。７０～９０日後、転移性腫瘍の存在について、ＰＥＴ－ＣＴでこれらの動物の評価を行った。マウスの健康状態が悪化した場合、予定を早めて分析を行った（図５Ａ）。 図５Ｂは、体積×ＳＵＶ－ｂｗ平均値による全身腫瘍組織量の計算及びＴ検定による全身腫瘍組織量分析を示す。また、ＨＣＣ－Ｐマウスの生存時間を計算し、カプラン・マイヤー法で分析した。 図５Ｃは、マウスを安楽死させ、その臓器を解剖した後、ヘマトキシリン・エオジン及びＭＨＣ－Ｉで染色することで行った転移性腫瘍の存在についての評価を示す。

【図6A】図６Ａは、ＨｕＴｕ８０細胞において免疫沈降したＳＡＧＥ１相互作用タンパク質に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び銀染色による分析を示す。

【図6B】図６Ｂは、４種の癌細胞株の免疫沈降したＳＡＧＥ１複合体組成物のＭＳ分析を示す。

【図6C】、

【図6D】図６Ｃ及び図６Ｄは、ＳＡＧＥ１のＩＮＴＳ３との相互作用（図６Ｃ）及びＴＬＥ３及びＣＢＰとの相互作用（図６Ｄ）のＣｏ－ＩＰ分析を示す。

【図6E】図６Ｅは、ＳＡＧＥ１、ＩＮＴＳ３、及びＩＮＴＳ６のドメイン構成を示す。

【図6F】図６Ｆは、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ及びＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤの構造ベースのシーケンスアラインメントを示す。

【図6G】図６Ｇは、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤとＩＮＴＳ３_ＣＴＤとの相互作用のＩＴＣ測定値を示す。挿入図はＩＴＣ滴定データである。

【図6H】図６Ｈは、精製ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ－ＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤ複合体とＧＳＴタグ付きＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤとの混合物のＧＳＴプルダウン分析を示す。

【図6I】図６Ｉは、２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ－１、２９３Ｔ－２、２９３Ｔ－３）又はＳＡＧＥ１過剰発現２９３Ｔ細胞（２９３ＯＥ ＳＡＧＥ－１、２９３ＯＥ ＳＡＧＥ－２、２９３ＯＥ ＳＡＧＥ－３）の抗ＩＮＴＳ３抗体を使用した免疫沈降複合体の定量ＭＳ分析を示す。

【図7A】、

【図7B】図７Ａ及び図７Ｂは、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体の二面図のリボンダイアグラム（図７Ａ）及びＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ複合体結晶構造の二面図のリボンダイアグラム（図７Ｂ）を示す。

【図7C】図７Ｃは、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤとＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体との相互作用の詳細を示す。

【図7D】図７Ｄは、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤのＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ結合ポケットの表面静電ポテンシャルを示す。

【図7E】図７Ｅは、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤの結合によってＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体におけるＰｈｅ８０５及びＴｙｒ８０７の側鎖が対称から非対称へ変化をすることを示す。

【図7F】図７Ｆは、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤにＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤの構造モデルを重ねると、Ｐｈｅ８３８ＳＡＧＥ１とＰｒｏ８２３ＩＮＴＳ６との違いが分かりやすくなることを示す。

【図7G】図７Ｇは、ＷＴ ＳＡＧＥ１、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ、及びＳＡＧＥ１ｍｕｔとＩＮＴＳ３との相互作用のＣｏ－ＩＰ分析を示す。

【図7H】図７Ｈは、ＷＴ又は変異ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤとＩＮＴＳ３_ＣＴＤとの相互作用のＩＴＣ測定値の比較を示す。

【図7I】、

【図7J】、

【図7K】、

【図7L】図７Ｉ、図７Ｊ、図７Ｋ、及び図７Ｌは、ＳＡＧＥ１ｍｕｔではなくＷＴ ＳＡＧＥ１の再発現によって、ＳＡＧＥ１－ＫＤ Ｃａｃｏ２の細胞の成長（図７Ｉ）、ＳＡＧＥ１－ＫＯ ＨｕＴｕ ８０の細胞増殖（図７Ｊ）、軟寒天上のＳＡＧＥ１－ＫＯ ＨｕＴｕ ８０細胞の足場非依存性成長（図７Ｋ）が復活し、異種移植分析における腫瘍の大きさ及び重量の急激な上昇につながる（図７Ｌ）ことを示す。

【図8A】、

【図8B】図８Ａ及び図８Ｂは、Superdex 200のカラム上のＩＮＴＳ３_ＣＴＤ（図８Ａ）及びＩＮＴＳ３_ＣＴＤ－ＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤ（図８Ｂ）複合体のサイズ排除クロマトグラフィーの断面を示し、精製複合体のピークのフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分解し、クマシーブリリアントブルーで染色したことを示す。

【図8C】図８Ｃは、結晶学的対称性に関連する２つのＩＮＴＳ３_ＣＴＤ分子が広範な相互作用を仲介することを示す結晶格子分析を示す。

【図8D】図８Ｄは、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体の界面の詳細を示す。相互作用に重要な残基の側鎖をスティックモデルで示す。

【図8E】、

【図8F】図８Ｅ及び図８Ｆは、ａｐｏＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体（図８Ｅ）及びＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ複合体構造（図８Ｆ）におけるＰｈｅ８０５^{ＩＮＴＳ３}及びＴｙｒ８０８^{ＩＮＴＳ３}の電子密度マップの立体視を示す。

【図8G】図８Ｇは、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ界面のクローズアップを示す。ＳＡＧＥ１ｍｕｔにおいてアラニンに置換された６つの重要な相互作用残基をスティックモデルでハイライトしている。

【図9A】図９Ａは、ＨｕＴｕ８０細胞におけるＳＡＧＥ１の減少が、ウェスタンブロットアッセイにおいて、細胞シグナル伝達経路のパネル、転写因子、及び膜タンパク質に影響することを示す。

【図9B】図９Ｂは、ＨｕＴｕ８０細胞及びＫＹＳＥ３０細胞においてＳＡＧＥ１が減少すると、フローサイトメトリーアッセイにおいて、Ｇ０／Ｇ１ブロックになることを示す。

【図9C】図９Ｃは、ＳＡＧＥ１－ＫＤ ＨＣＣ－Ｐ細胞においてほとんどの細胞周期遺伝子の発現が減少したことを示すＭＳ分析を示す。これらの結果から、ＳＡＧＥ１が初代肝臓癌細胞における細胞周期制御にも不可欠であることが分かった。

【図9D】図９Ｄは、ＨＣＣ１５細胞においてＳＡＧＥ１が減少すると、フローサイトメトリーアッセイにおいて、Ｇ０／Ｇ１ブロックになることを示す。ＨＣＣ１５細胞においてＳＡＧＥ１が減少すると、ＩＦ染色でのｋｉ６７発現がなくなり、Ｇ０期で停止する。

【図9E】図９Ｅは、ＨＣＣ１５初代癌細胞におけるＳＡＧＥ１の減少が、ウェスタンブロットアッセイにおいて、細胞シグナル伝達経路のパネル、転写因子、及び膜タンパク質に影響することを示す。

【図10A】図１０Ａは、原発性腫瘍に広がるＳＡＧＥ１発現の分布を示し、点線は、高ＳＡＧＥ１患者（ＳＡＧＥ１発現が上位６％のＴＣＧＡ患者）と低ＳＡＧＥ１患者（その他９４％のＴＣＧＡ患者）との閾値を示している。

【図10B】図１０Ｂは、高ＳＡＧＥ１患者（ＳＡＧＥ１発現が上位６％のＴＣＧＡ患者）と低ＳＡＧＥ１患者（その他９４％のＴＣＧＡ患者）との間のゲノム変化のエンリッチメントを示す。Fisherの正確確率検定でオッズ比を推定し、ＦＤＲ法を適用してｐ値を調整した。高ＳＡＧＥ１患者の場合、ＴＰ５３の体細胞変異及びタンパク質のみをコードする変異が残った(Frame_Shift_Del、Frame_Shift_Ins、In_Frame_Del、In_Frame_Ins, Missense_Mutation、Nonsense_Mutation、Nonstop_Mutation、Splice_Site、及びd Translation_Start_Site)。

【図11A】図１１Ａは、Ｘｑ２６．３、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３（Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 13）に位置する、遺伝子ＩＤ:55511のＳＡＧＥ１肉腫抗原１［ホモ・サピエンス（ヒト）］を示し、ヒト遺伝子の特定位置は、ChrX: 135,893,700..135,913,062である。

【図11B】図１１Ｂは、ＳＡＧＥ１の転写開始部位がChrX: 135893700（すなわち第１エクソンの５’端）付近に位置する（白矢印）ことを示すＣＡＧＥ（cap analysis of gene expression）分析を示す。ＣｈＩＰ分析によって、明らかなＨ３Ｋ２７Ａｃ及びＨ３Ｋ４Ｍｅ３修飾シグナル（灰色矢印）及び多数の転写因子結合シグナル（黒矢印）が部位付近にあったことが分かった。

【図11C】図１１Ｃは、ＳＡＧＥ１の転写開始部位の２ｋｂ（―１ｋｂ～１ｋｂ）以内においてＤＮＡメチル化修飾に明らかな違いがある（chrX: 135, 892, 700-135, 894, 700）（紫矢印）ことを示す全ゲノムＤＮＡメチル化配列（全ゲノム重亜硫酸塩配列決定ＷＧＢＳ（Whole Genome Bisulfite Sequencing））分析を示し、高ＳＡＧＥ１発現の細胞は、この部位でのＤＮＡメチル化レベルが低く、低ＳＡＧＥ１発現の細胞又はＳＡＧＥ１発現がない細胞は、この部位でのＤＮＡメチル化レベルが高い。これにより、ＤＮＡ脱メチル化がＳＡＧＥ１発現の制御に関わっていることが分かる。

【図12】図１２は、結晶データコレクション及びリファインメント統計を示す。

【図13A】図１３Ａは、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体間の相互作用に関わる残基を示す。

【図13B】図１３Ｂは、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ－ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ間の相互作用に関わる残基を示す。

【図14A】、

【図14B】、

【図14C】、

【図14D】図１４Ａ～図１４Ｄは、ＩＰ－ＭＳ分析によって同定されたＨｕＴｕ８０細胞（図１４Ａ）、Ｋ５６２細胞（図１４Ｂ）、Ｕ２ＯＳ細胞（図１４Ｃ）、及びＫＹＳＥ３０細胞（図１４Ｄ）における信頼性の高いＳＡＧＥ１の相互作用分子のスペクトル数を示す。

【図15】図１５は、汎癌ＳＡＧＥ１発現の有病率（ＩＨＣ染色で推定）を示す。

【図16】図１６は、ヒトＳＡＧＥ１ｓｈＲＮＡによるＳＡＧＥ１発現の抑制を示す。

【図17-1】、

【図17-2】、

【図17-3】、

【図17-4】、

【図17-5】、

【図17-6】、

【図17-7】、

【図17-8】、

【図17-9】、

【図17-10】、

【図17-11】、

【図17-12】、

【図17-13】、

【図17-14】、

【図17-15】、

【図17-16】、

【図17-17】、

【図17-18】、

【図17-19】、

【図17-20】、

【図17-21】図１７－１～図１７－２１は、本開示に記載の配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0111】

本開示をさらに詳しく説明する前に、本開示はここに記載する特定の実施の形態に限定されることなく、変更も当然のこととして可能であると理解される。また、本開示の範囲は添付の請求項でのみ限定されるものであるから、本明細書で使用する用語は、特定の実施の形態を説明するためのものにすぎず、限定的する意図はない。

【0112】

別段の定義付けがない限り、本明細書で使用するいずれの科学技術用語も本開示が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同様の意味をもつ。本明細書に記載の方法及び材料と類似又は同等のものを本開示の実施又は検査に使用することもできるが、ここでは好ましい方法及び材料について説明する。

【0113】

本明細書で引用するすべての文献及び特許は、参照することで本明細書に組み込まれるが、これは個々の文献又は特許を参照によって組み込むと具体的かつ個別的に明記しているのと同じであり、参照によって本明細書に組み込むことで、引用した文献に関連する方法及び／又は材料を開示し、説明している。あらゆる文献の引用は、出願日以前に公開されているものに関するが、このことをもって本開示が先願として当該文献に先行する権利がないと認めたものではない。また、提供した文献の日付について、実際の文献の日付は個別に確認が必要な場合があり、実際と異なる場合もある。

【0114】

本開示を読むにあたり当業者には明らかであるが、本明細書において説明して図示した個別の実施の形態はそれぞれ、その構成要素及び特徴を本開示の範囲又は趣旨から逸脱し
ない範囲内において別の複数の実施の形態のいずれの特徴とも容易に分離したり、組み合わせたりすることができる。記載した方法はいずれも記載順又は論理上可能な別の順序で実施することができる。

【0115】

本明細書で使用する用語「抗体」は、特定の抗原と結合する免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、１価抗体、２価抗体、多価抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体を含む。正常な自然抗体は、２本の重鎖（Ｈ）及び２本の軽鎖（Ｌ）を含む。哺乳類の重鎖は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューに分類され、それぞれ可変領域（ＶＨ）と第１、第２、第３、場合によっては第４の定常領域（それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３，ＣＨ４）とからなり、哺乳類の軽鎖は、ラムダ又はカッパに分類され、それぞれ可変領域（ＶＬ）と定常領域とからなる。抗体は、「Ｙ」字型をしており、このＹの幹部分がジスルフィド結合で結合した２本の重鎖の第２及び第３定常領域からなる。このＹの腕部分のそれぞれは、１本の軽鎖の可変領域及び定常領域に結合した１本の重鎖の可変領域と第１定常領域とを含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。両鎖の可変領域は一般に、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と呼ばれる３つ超可変ループを含む（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲｓとＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲｓ）。この３つのＣＤＲｓは、ＣＤＲｓよりも一定で超可変ループを支える足場となるフレームワーク領域（ＦＲｓ）として知られる側方に延びた部分（ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、及びＬＦＲ４を含む軽鎖ＦＲｓとＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、及びＨＦＲ４を含む重鎖ＦＲｓ）の間に介在する。重鎖及び軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、様々なエフェクタ機能を果たす。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて分類される。抗体の５つの主な分類クラス、すなわちアイソタイプは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューの重鎖の存在で特徴づけられるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭである。この主な抗体クラスのうちのいくつかは、ＩｇＧ１（gamma1重鎖）、ＩｇＧ２（gamma2重鎖）、ＩｇＧ３（gamma3重鎖）、ＩｇＧ４（gamma4重鎖）、ＩｇＡ１（alpha1重鎖）、又はＩｇＡ２（alpha2重鎖）といったサブクラスに分けられる。

【0116】

本明細書で使用する用語「バイオマーカ」又は「マーカ」は、なんらかの生物学上の状態又は症状の測定可能な指標となる生体分子を指す。本明細書で示すバイオマーカの例としては、遺伝子（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）又はその遺伝子から転写されたｍＲＮＡ等の遺伝子産物、その遺伝子でコードされたタンパク質、及びタンパク質複合体がある。実施の形態によっては、バイオマーカは、腫瘍、特に悪性腫瘍と関連する腫瘍マーカである。腫瘍マーカは、生化学的又は免疫化学的な定量測定が可能で、臨床腫瘍学における診断、予後、又は治療アッセイの情報を提供する。腫瘍マーカは、臨床及び画像の検査よりも何カ月も早く腫瘍を診断できることが多いため、腫瘍患者のスクリーニングに有用である。また、腫瘍マーカは、予後、腫瘍再発のモニタリング及び発見、ならびに治療の有効性の判断に使用できる。

【0117】

タンパク質又はポリペプチドに関して本明細書で使用する用語「複合体」は、関連する２以上のポリペプチド鎖のグループを指す。ポリペプチド鎖が違うと、機能が違う場合もある。典型的には、タンパク質複合体におけるポリペプチド鎖は、非共有相互作用で結合している。タンパク質複合体が違うと、経時安定性が違う場合もある。

【0118】

用語「相補的」又は「相補性」は、従来のワトソン・クリック型又は他の新しい型によって核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性とは、別の核酸配列と水素結合を形成できる核酸分子における残基の割合を示す（例えば、１０個のうちの５個、６個、７個、８個、９個、１０個は、５０％相補的、６０％相補的、７０％相補的、８０％相補的、９０％相補的、１００％相補的である）。パーセント相補性は、基本的な局所配列検索ツール（ＢＬＡＳＴプログラム）（Altschul (1990) J. Mol. Biol
. 215, 403-410; Zhang and Madden (1997) Genome Res. 7, 649-656）を使用して定期的に測定できる。

【0119】

ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関する用語「誘導体」は、化学的に修飾されたポリペプチド又はポリヌクレオチドを指し、１以上の特定の数の置換基がポリペプチドの１以上の特定のアミノ酸残基又はポリヌクレオチドの１以上の特定のヌクレオチドに共有結合している（異種ポリペプチド、脂肪酸、ならびに化合物による結合又はグリコシル化、アセチル化、リン酸化反応による）。化合物に関する用語「誘導体」は、１つの原子を別の原子又は原子団と置き換えることで親化合物から合成された化合物を指す。

【0120】

用語「診断」は、本明細書に記載の方法を使用して被験者の発症（例えば、ＳＡＧＥ１陽性疾患）の有無を判断することを指す。また、この用語には被験者の疾患レベルを評価する方法の使用も含まれる。

【0121】

用語「検出」は、従来の手段で実施可能な定量的又は半定量的な判断、検査、又は測定の行為を指す。この用語は、例えば血液サンプル又はその他組織サンプル等の生体サンプルが物理試験を経てある状態から別の状態に形質転換する等の物質の変化を想定している。「ＳＡＧＥ１発現を検出する」という文等は、あるサンプルがＳＡＧＥ１発現の有無又はＳＡＧＥ１発現レベルを確認するために（直接又は間接的に）検査され得ることを意味するために用いられる。ＳＡＧＥ１発現の有無及びレベルは診断又は治療の判断指針となり得るものと理解される。

【0122】

バイオマーカ（例えばＳＡＧＥ１）に関する用語「高い」は、生体サンプルにおいて検出されるバイオマーカのレベルがそのバイオマーカの対応する基準レベルよりも高いことを指す。同様に、本明細書で使用する用語「低い」は、生体サンプルにおいて検出されるバイオマーカのレベルがそのバイオマーカの対応する基準レベルよりも低いことを指す。実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１発現のレベルはそれぞれ、そのレベルが基準レベルに対して１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１００％、又は２倍、３倍、４倍、５倍、もしくはそれ以上高く又は低くあれば、基準レベルよりも「高い」又は「低い」とみなすことができる。

【0123】

用語「有効量」又は「治療効果のある量」は、薬理活性剤を必要とする個人に対し、所望の生理学的効果を得るために十分な当該薬剤の量を意味する。有効量は、治療対象の個人の健康状態及び体調、治療対象の個人の分類群、配合処方、個人の病状の診断、及びその他関連する要因によって個人ごとに異なる。

【0124】

本明細書で使用する用語「フラグメント」は、長さに関わらず、基準となるポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部の配列を指す。フラグメントにも基準となるポリペプチドの少なくとも部分的な生物活性はみられる。

【0125】

本明細書で使用する用語「阻害薬」は、標的分子（例えば、ＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体）の効果を阻害する（例えば、拮抗する、抑制する、低下させる、ブロックする、逆転させる、変更する）薬剤を指す。阻害効果は、例えば、標的分子の量を減らしたり、分子の活性を抑制することで発揮される。このような阻害薬は、拮抗作用を示すものであれば、いかなる化合物、タンパク質、もしくは核酸又はその誘導体を含んでいてもよい。

【0126】

本明細書で使用する用語「単離した」は、元の自然環境で存在しなくなった分子又はその複合体を指す。

【0127】

用語「パーセント（％）配列同一性」は、同一のアミノ酸（又は核酸）の個数が最大に
なるように配列をアラインし、必要に応じてギャップを挿入した場合の、基準配列におけるアミノ酸（又は核酸）残基と同一の候補配列におけるアミノ酸（又は核酸）残基の割合と定義される。言い換えれば、アミノ酸配列（又は核酸配列）のパーセント（％）配列同一性は、比較対象の基準配列に対して同一のアミノ酸残基（又は塩基）の個数を候補配列か基準配列か、いずれか短い方のアミノ残基（又は塩基）の総数で割ることで計算できる。アミノ酸残基の同類置換は同一の残基とは考えない。パーセントアミノ酸（又は核酸）配列同一性を判断するためのアラインメントは、例えば、BLASTN、 BLASTp (U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI)のウェブサイトで公開されている。また、Altschul S.F.ら、J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Stephen F.ら、Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))、European Bioinformatics Instituteのウェブサイトで公開されているClustalW2も参照されたい。さらに、Higgins D.G.ら、Methods in Enzymology, 266: 383-402 (1996); Larkin M.A.ら、Bioinformatics (Oxford, England), 23 (21): 2947-8 (2007)も参照されたい。)、及びALIGN or Megalign (DNASTAR)ソフトウェア等の一般に公開されているツールを使って行うことができる。当業者は、このツールが提供する初期パラメータを使用してもよいし、適切なアルゴリズムを選択する等して、このパラメータをアラインメント用に適宜カスタマイズしてもよい。

【0128】

本明細書で使用する用語「インテグレータ複合体サブユニット３」すなわち「ＩＮＴＳ３」は、ＩＮＴＳ３遺伝子ならびにＩＮＴＳ３遺伝子のｍＲＮＡ及びＩＮＴＳ３遺伝子でコードされたタンパク質等のＩＮＴＳ３遺伝子産物を指す。これらのフラグメント、変異体、および誘導体も含まれるものとする。ヒトＩＮＴＳ３遺伝子でコードされたタンパク質は、Uniprotアクセッション番号がQ68E01-1である推定１０４３アミノ酸タンパク質である（第１メチオニンを取り除いたＩＮＴＳ３タンパク質の配列であって、SEQ ID NO: 5として本明細書に組み込まれる）。

【0129】

本明細書で使用する用語「インテグレータ複合体サブユニット６」すなわち「ＩＮＴＳ６」は、ＩＮＴＳ６遺伝子ならびにＩＮＴＳ６遺伝子のｍＲＮＡ及びＩＮＴＳ６遺伝子でコードされたタンパク質等のＩＮＴＳ６遺伝子産物を指す。これらのフラグメント、変異体、および誘導体も含まれるものとする。ヒトＩＮＴＳ６遺伝子でコードされたタンパク質は、Uniprotアクセッション番号がQ9UL03-1である推定８８７アミノ酸タンパク質である（この配列はSEQ ID NO: 6として本明細書に組み込まれる）。

【0130】

本明細書で使用する用語「インテグレータ複合体サブユニット６－ｌｉｋｅ」すなわち「ＩＮＴＳ６Ｌ」は、ＩＮＴＳ６Ｌ遺伝子ならびにＩＮＴＳ６Ｌ遺伝子のｍＲＮＡ及びＩＮＴＳ６Ｌ遺伝子でコードされたタンパク質等のＩＮＴＳ６Ｌ遺伝子産物を指す。これらのフラグメント、変異体、および誘導体も含まれるものとする。ヒトＩＮＴＳ６Ｌ遺伝子でコードされたタンパク質は、Uniprotアクセッション番号がQ5JSJ4-1である推定８６１アミノ酸タンパク質である（この配列はSEQ ID NO: 7として本明細書に組み込まれる）。

【0131】

本明細書で使用する用語「キット」は、本開示の範囲に含まれるＳＡＧＥ１の発現を具体的に検出又は調節する少なくとも１種の試薬を含む製品（例えば、パッケージ又は容器）を指す。このキットは、本明細書に記載の方法を実行するユニットとして宣伝、流通、又は販売され得る。

【0132】

バイオマーカに関する用語「レベル」は、サンプルに存在する注目バイオマーカの分量を指す。この分量は、絶対量、すなわちサンプルにおけるバイオマーカの総量で表現されてもよいし、相対量、すなわちサンプルにおけるバイオマーカの濃度又は割合で表現されてもよい。バイオマーカのレベルは、ＤＮＡレベルで測定でき（例えば、ＤＮＡメチル化又はヒストンのアセチル化等のエピジェネティックな修飾の分量で表される）、ＲＮＡレベルでも測定でき（例えば、ｍＲＮＡ量）、タンパク質レベルでも測定できる（例えば、
タンパク質又はタンパク質複合体の分量）。

【0133】

用語「可能性」及び「可能性が高い」は、その出来事が起こる可能性の度合いを測ったものである。可能性は、通常の判断能力を備えた人が常識、訓練、又は経験を通して辿り着く場合、推測よりも見込みは高いが、確実性が低いことを指す。実施の形態によっては、用語「可能性」及び「可能性が高い」は、パーセンテージで例えば５０％以上、６０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上の見込みのことである。

【0134】

ＳＡＧＥ１遺伝子のヒストンのアセチル化に関する用語「付近」は、アセチル化の位置がＳＡＧＥ１遺伝子の特定の領域又は部位の近く（例えば、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、４００ｂｐ、６００ｂｐ、８００ｂｐ、又は１ｋｂ上流又は下流の範囲内）であることを指す。

【0135】

癌治療（例えば、ＳＡＧＥ１阻害薬による処置）の文脈で使用される「治療効果を得られる」又は「応答性がある」の用語は、その治療に効果的又は好適な応答があることを指し、好ましくない応答、すなわち有害事象ではないということである。患者において、効果的応答は、数多くの臨床的指標で現れるが、検出可能な腫瘍が無くなったり（完全寛解）、腫瘍の大きさ及び／又は腫瘍細胞の数が減少したり（部分寛解）、腫瘍の成長が止まったり（症状の安定）、抗腫瘍免疫応答が強くなったり、腫瘍の退行又は拒絶につながることもあり、腫瘍に関連する１以上の症状がある程度和らいだり、処置後の生存期間が延びたり、及び／又は処置後のある時点における死亡率が低下したりする。

【0136】

用語「ＴＰ５３」及び「ｐ５３」は、本明細書では同義に用いられ、腫瘍タンパク質ｐ５３を指し、ｐ５３タンパク質及びｐ５３コード用のＤＮＡ（例えば、コード遺伝子配列）又はＲＮＡを指すこともあり、イソ型及び変異体もすべて含まれる。このｐ５３の別名として、例えば、抗原ＮＹ－ＣＯ－１３、リンタンパク質ｐ５３、腫瘍サプレッサーｐ５３、及び細胞性腫瘍抗原ｐ５３がある。ヒトｐ５３の典型的な配列は、UniProtKBデータベースのアクセッション番号P04637(P53-HUMAN)で入手できる。

【0137】

用語「予後」は、病気の起こり得る経過及び結果の予測又は当該病気から快復する可能性を含む。腫瘍に関して使用される場合、予後とは、例えば、治療効果の有無の傾向、臨床亜種の発症、再発、転移、完全又は部分寛解である。予後が良いとは、腫瘍の処置で期待される又は見込まれる結果が良いことであり、予後が悪いとは、腫瘍の処置で期待される又は見込まれる結果があまり良くないことである。

【0138】

用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」は、同義に用いられ、共有結合したヌクレオチドの鎖を指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであってもよく、それぞれが独立して修飾されていても未修飾であってもよい。

【0139】

用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同義に用いられ、ペプチド結合で共有結合したアミノ酸残基の鎖を指す。タンパク質又はポリペプチドは、アミノ酸以外の部分を含んでもよく（例えば、糖タンパク質であってもよく）、及び／又は、加工されていても修飾されていてもよい。さらに、タンパク質は、例えば、ジスルフィド結合で結合したり、別の手段で関連付けられた１本以上のポリペプチド鎖を含むことがあるとういうことは、当業者であれば理解できると思われる。

【0140】

用語「被験者」は、ヒト又はヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、犬、猫、牛、豚、羊、馬、又は霊長目）を指す。多くの実施の形態では、被験者はヒトである。被験者は、医療提供者による病気の診断又は処置を受ける患者であり得る。用語「被験
者」は、本明細書では「個人」又は「患者」と同義に用いられる。被験者は、ある病気又は疾患に悩まされていたり、かかりやすかったりするが、その病気又は疾患の症状が現れる場合もあれば、現れない場合もある。

【0141】

本明細書で使用する用語「サンプル」又は「生体サンプル」は、被験者から得られた生体サンプルであって、本発明の方法で評価される１以上の注目バイオマーカを含むものを指す。サンプルは、細胞又は細胞から分泌された産物を含み、単離した細胞、組織サンプル、又は体液サンプルがあるが、これらに限定されない。実施の形態よっては、サンプルは、腫瘍細胞又は腫瘍細胞から分泌された産物を含む。実施の形態よっては、サンプルは、腫瘍細胞サンプルである。

【0142】

本明細書で使用する「肉腫抗原１」すなわち「ＳＡＧＥ１」は、ＳＡＧＥ１遺伝子ならびにＳＡＧＥ１のｍＲＮＡ及びＳＡＧＥ１遺伝子でコードされたタンパク質等のＳＡＧＥ１遺伝子産物を指す。これらのフラグメント、変異体、および誘導体も含まれるものとする。ヒトＳＡＧＥ１遺伝子は、Ｘ染色体に位置する（Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 13によれば、X: 135, 893, 700-135, 913, 026, Xq26.3）。また、ＮＣＢＩデータベースにおける遺伝子ＩＤは55511である（この配列はSEQ ID NO: 1として本明細書に組み込まれる）。ヒトＳＡＧＥ１転写産物変異体１は、ＳＡＧＥ１の正準ｍＲＮＡ配列であり、このＮＣＢＩアクセッション番号は、NM_001381902.1 (GI: 1833303494)である（この配列はSEQ ID NO: 2として本明細書に組み込まれる）。ＳＡＧＥ１転写産物変異体１は、少なくとも２種類のＳＡＧＥ１タンパク質をコードする。正準ＳＡＧＥ１タンパク質は、Uniprotアクセッション番号がQ9NXZ1-1である推定９０４アミノ酸タンパク質である（この配列はSEQ ID NO: 3として本明細書に組み込まれる）。別段の記載がない限り、ＳＡＧＥ１タンパク質に関する位置情報は、この配列から決定する。ＳＡＧＥ１タンパク質のイソ型は、ＮＣＢＩアクセッション番号がAAI44261.1である推定５２８アミノ酸タンパク質であり（この配列はSEQ ID NO: 4として本明細書に組み込まれる）、これも本開示の範囲内に含まれる。

【0143】

用語「構造座標」は、結晶状態のタンパク質又はタンパク質複合体の原子（散乱中心）によるＸ線単色ビームの回折で得られたパターンに関する数学的方程式から導いた直交座標を指す。この回折データを用いて結晶の繰り返し単位の電子密度マップを計算する。次に、この電子密度マップを用いて分子又は分子複合体の個々の原子の位置を確定する。

【0144】

用語「腫瘍」又は「癌」は、同義に用いられ、異常な細胞の成長を伴う病気を指し、人体の組織、内臓、又は細胞に影響するあらゆるステージ及びあらゆる型を含む。この用語は、既知のあらゆる癌及び腫瘍性疾患を含み、悪性腫瘍、陽性腫瘍、軟部組織腫瘍、固形腫瘍、又は血液系腫瘍を問わず、ステージも悪性度も問わず、転移前の腫瘍及び転移後の腫瘍も含む。一般に、腫瘍は、それが位置する組織もしくは内臓又はその発生源である組織もしくは内臓ならびに癌組織及び癌細胞の形態学によって分類される。実施の形態によっては、腫瘍の種類として、副腎癌、リンパ上皮性腫瘍、腺様細胞癌、リンパ腫、聴神経腫、急性リンパ性白血病、肢端黒子型黒色腫、急性骨髄性白血病、先端汗腺腫、慢性リンパ性白血病、急性好酸球性白血病、肝臓癌、急性赤血球白血病、小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、非小細胞肺癌、急性巨核芽球性白血病、ＭＡＬＴリンパ腫、急性単球性白血病、悪性線維性組織球腫、急性前骨髄球性白血病、悪性末梢神経鞘腫、マントル細胞リンパ腫、腺癌、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、海馬の悪性腫瘍、腺様嚢胞癌、腺腫様、腺様歯原性腫瘍、肥満細胞白血病、腺扁平上皮癌、縦隔胚細胞腫瘍、脂肪組織腫瘍、乳房髄様癌、副腎皮質癌、甲状腺髄様癌、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、髄芽腫、浸潤性ＮＫ細胞白血病、黒色腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、髄膜腫、肺横紋筋肉腫、メルケル細胞癌、肺胞軟部肉腫、中皮腫、エナメル上皮腫、転移性尿路上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、ミュラー管混合腫瘍、甲状腺未分化癌、粘液性腫瘍、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、血
管筋脂肪腫、筋肉組織腫瘍、血管肉腫、菌状息肉腫、星細胞腫、粘液性脂肪肉腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、粘液腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、粘液肉腫、Ｂ細胞リンパ性白血病、上咽頭癌、Ｂ細胞リンパ腫、神経鞘腫、基底細胞癌、神経芽細胞腫、胆道癌、神経線維腫症、膀胱癌、神経腫、芽細胞腫、結節性黒色腫、骨癌、眼癌、ブレンナー腫瘍、乏突起膠細胞、褐色腫瘍、乏突起膠腫、バーキットリンパ腫、好酸球性乳癌、脳腫瘍、視神経腫瘍、口腔上皮内腫瘍、骨肉腫、癌肉腫、卵巣癌、骨軟部腫瘍、肺溝腫瘍、甲状腺乳頭癌、骨髄腫、傍神経節腫、軟骨腫、松果体芽細胞腫、脊索腫、松果体細胞腫、絨毛癌、下垂体腫瘍、脈絡叢乳頭腫、下垂体腺腫、腎明細胞肉腫、下垂体腫瘍、頭蓋咽頭腫、形質細胞腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、多胎芽腫、子宮頸癌、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、大腸癌、中枢神経系原発性リンパ腫、デゴス病、原発性滲出性リンパ腫、増殖性小円形細胞腫、原発性腹膜前癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、神経上皮性腫瘍の胚芽異形成症、膵臓癌、未分化細胞腫瘍、咽頭癌、胚性癌、腹膜偽粘液腫、内分泌腺腫瘍、腎細胞癌、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫、内胚葉洞腫瘍、腎髄質癌、網膜芽細胞腫、食道癌、横紋筋肉腫、エンダデルフォス、横紋筋肉腫、筋腫、リヒター形質転換、線維肉腫、直腸癌、濾胞性リンパ腫、肉腫、濾胞性甲状腺癌、神経鞘腫、神経節細胞腫、セミノーマ、消化管癌、セルトリ細胞腫、胚細胞腫、性索－性腺間質腫瘍、妊娠絨毛癌、印環細胞腫、巨細胞線維芽細胞腫、皮膚癌、骨巨細胞腫、小円形青色細胞腫瘍、神経膠腫、小細胞癌、多形性膠芽腫、軟部肉腫、神経膠腫、ソマトスタチン腫瘍、脳神経膠腫、煤イボ、膵臓の高グルカゴン腫、脊髄腫瘍、性腺芽腫、脾臓辺縁リンパ腫、顆粒膜細胞腫、扁平上皮癌、エストロゲン腫瘍、滑膜肉腫、胆嚢癌、セザリー病、胃癌、小腸癌、ヘアリー細胞白血病、扁平上皮癌、血管芽細胞腫、胃癌、頭頸部癌、Ｔ細胞リンパ腫、血管上皮腫、精巣癌、血液悪性腫瘍、肉腫、肝芽腫、甲状腺癌、肝脾臓Ｔ細胞リンパ腫、移行上皮細胞癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、非ホジキンリンパ腫、尿路癌、浸潤性小葉癌、泌尿生殖器癌、腸癌、尿路上皮癌、腎臓癌、ブドウ膜黒色腫、喉頭癌、子宮癌、悪性そばかす様喀痰、疣贅癌、致死性正中線肉芽腫、視経路神経膠腫、白血病、外陰癌、精巣間質腫瘍、膣癌、脂肪肉腫、ワルデンストームマクログロブリン血症、肺癌、腺リンパ腫リンパ管腫、腎芽腫、リンパ肉腫等があるが、これらに限定されない。実施の形態によっては、腫瘍は、大腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎臓癌、白血病、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）から選択される。

【0145】

本明細書で使用する用語「処置／治療」又は「処置を施す／治療する」は、疾患を予防したり、緩和したり、疾患の発症を遅らせたり、減速させたり、疾患に関連する症状の進行を予防したり、遅らせたり、疾患に関連する症状を抑えたり、止めたり、疾患の完全寛解又は部分寛解を実現したり、疾患を完治させたり、又はこれらの組み合わせを実現することを指す。腫瘍に関して、「処置を施す／治療する」又は「処置／治療」は、腫瘍性又は悪性の細胞の発生、増殖、進行、転移、癌症状、又はこれらの組み合わせを予防したり、抑制したり、遅らせたり、減速させることを指す場合がある。処置／治療は、必ずしも疾病、疾患、又はその疾病もしくは疾患の症状について、完治又は完全なアブレーションを意味するものではないと理解される。

【0146】

用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドの導入、複製、又は発現のために、ポリペプチドが動作可能に挿入される媒体を指す。ベクターには、様々な調節要素が含まれることが
あり、それらは複製元、プロモータ、転写開始配列、エンハンサ、選択可能なマーカ遺伝子、レポーター遺伝子等であるが、これらに限定されない。また、ベクターには、宿主細胞に入るときの手助けをする物質が含まれており、それらはウイルス粒子、リポソーム、イオン化合物、又は両親媒性化合物等であるが、これらに限定されない。

【0147】

なお、本開示において、「含む／備える（comprises, comprised, comprising, contains, containing）」等の用語は、米国特許法に基づく意味をもち、これらは包括的、すなわち非限定的（open-ended）であって、記載されていない追加の要素又は方法ステップを排除しない。また、「基本的に～からなる（consisting essentially of, consists essentially of）」等の用語は、米国特許法に基づく意味をもち、これらは請求項に係る発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない追加の材料又はステップを含むことを許容する。用語「からなる（consists of, consisting of）」は、米国特許法に基づく意味をもつ。すなわち、これらの用語は限定的(close-ended)である。

【0148】

ＩＩ．新規な診断用バイオマーカ及び治療対象としてのＳＡＧＥ１
肉腫抗原１（ＳＡＧＥ１）は、癌精巣抗原（ＣＴＡ）の規模の大きい混成群に属する。ＳＡＧＥ１は、腫瘍特異性抗原として同定されてから２０年近く経つが、腫瘍の増殖及び進行におけるその役割については未だにあまり解明されていない。

【0149】

本開示では、数多くの研究を通し、ＳＡＧＥ１が腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、皮膚癌、頭頸部癌、白血病等、様々な腫瘍組織及び細胞で発現すること、精巣組織以外の正常な細胞ではＳＡＧＥ１は検出されないことが分かった。

【0150】

本開示は、ＳＡＧＥ１が発癌に関わる転写を促進し、多くの癌増殖経路を上方制御するということを思いがけず発見した。このように増殖能が高まることは、異常な増殖、新生物及び腫瘍の進行、ＳＡＧＥ１発現をＳＡＧＥ１陽性疾病の診断及び予後に有益なバイオマーカとすること、ＳＡＧＥ１陽性疾病の進行をモニタリングすること、治療効果の予測及び治療計画の選択に大きな影響を及ぼす場合がある。

【0151】

本開示は、さらに、ＳＡＧＥ１が腫瘍に依らない（tumor-agnostic）治療標的であることを初めて確認した。様々な腫瘍の患者腫瘍移植（ＰＤＸ）モデルにおいてＳＡＧＥ１を下方制御することで腫瘍の成長が効果的に抑制され、病理学的完全寛解にまで至ることもある。本開示では、原発組織又はゲノム景観多様性に関わらず、癌遺伝子中毒につながることもあるＳＡＧＥ１の発現は、新しい診断物をＳＡＧＥ１陽性疾患（例えば、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍）と判断し、ＳＡＧＥ１レベル又は活性を抑制することは、ＳＡＧＥ１陽性疾患に効果的な治療アプローチとなり得ることが分かった。

【0152】

本明細書で使用する用語「ＳＡＧＥ１陽性」は、細胞又は組織においてＳＡＧＥ１が発現することを意味する。用語「ＳＡＧＥ１陽性疾患」は、正常時はＳＡＧＥ１が発現しないＳＡＧＥ１陽性細胞又はＳＡＧＥ１陽性組織があることを特徴とする症状を意味する。ＳＡＧＥ１陽性疾患は、正常な発現パターンから逸れたＳＡＧＥ１の異常又は不所望な発現を特徴とする。ＳＡＧＥ１は、正常な組織では発現しないが、精原細胞、場合によって胎盤及び脳は除く。

【0153】

ある実施の形態では、ＳＡＧＥ１陽性疾患は、精原幹細胞（ＳＳＣ又はＳＰＧ）でないＳＡＧＥ１陽性細胞があることを特徴とする。ある実施の形態では、ＳＡＧＥ１陽性疾患は、卵管、唾液腺、脂肪組織、副腎、血液、膀胱、血管、胸部、子宮頚部、結腸、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、神経、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、甲状腺、子宮又は膣にみられる細胞であるＳＡＧＥ１陽性細胞があることを特徴とする。

【0154】

ある実施の形態では、ＳＡＧＥ１陽性疾患は、ＳＡＧＥ１陽性異常細胞があることを特徴とする。本明細書で使用する用語「異常細胞」は、生物学上、生理学上、又は病理学上の１以上の側面において、対応する正常細胞と異なる細胞を意味する。異常細胞は、例えば、特に細胞の成長、遺伝子の変異、特定の生物学的経路の異常活性化、特定の遺伝子の異常発現、異常な移動能、又は異常な分化能等が対応する正常細胞と異なり得る。

【0155】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１陽性疾患は、腫瘍（すなわち、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍）を含む。

【0156】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１陽性疾患は、固形腫瘍又は血液系腫瘍から選択される。

【0157】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１陽性疾患は、副腎癌、リンパ上皮性腫瘍、腺様細胞癌、リンパ腫、聴神経腫、急性リンパ性白血病、肢端黒子型黒色腫、急性骨髄性白血病、先端汗腺腫、慢性リンパ性白血病、急性好酸球性白血病、肝臓癌、急性赤血球白血病、小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、非小細胞肺癌、急性巨核芽球性白血病、ＭＡＬＴリンパ腫、急性単球性白血病、悪性線維性組織球腫、急性前骨髄球性白血病、悪性末梢神経鞘腫、マントル細胞リンパ腫、腺癌、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、海馬の悪性腫瘍、腺様嚢胞癌、腺腫様、腺様歯原性腫瘍、肥満細胞白血病、腺扁平上皮癌、縦隔胚細胞腫瘍、脂肪組織腫瘍、乳房髄様癌、副腎皮質癌、甲状腺髄様癌、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、髄芽腫、浸潤性ＮＫ細胞白血病、黒色腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、髄膜腫、肺横紋筋肉腫、メルケル細胞癌、肺胞軟部肉腫、中皮腫、エナメル上皮腫、転移性尿路上皮癌、未分化大細胞リンパ腫、ミュラー管混合腫瘍、甲状腺未分化癌、粘液性腫瘍、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、血管筋脂肪腫、筋肉組織腫瘍、血管肉腫、菌状息肉腫、星細胞腫、粘液性脂肪肉腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、粘液腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、粘液肉腫、Ｂ細胞リンパ性白血病、上咽頭癌、Ｂ細胞リンパ腫、神経鞘腫、基底細胞癌、神経芽細胞腫、胆道癌、神経線維腫症、膀胱癌、神経腫、芽細胞腫、結節性黒色腫、骨癌、眼癌、ブレンナー腫瘍、乏突起膠細胞、褐色腫瘍、乏突起膠腫、バーキットリンパ腫、好酸球性乳癌、脳腫瘍、視神経腫瘍、口腔上皮内腫瘍、骨肉腫、癌肉腫、卵巣癌、骨軟部腫瘍、肺溝腫瘍、甲状腺乳頭癌、骨髄腫、傍神経節腫、軟骨腫、松果体芽細胞腫、脊索腫、松果体細胞腫、絨毛癌、下垂体腫瘍、脈絡叢乳頭腫、下垂体腺腫、腎明細胞肉腫、下垂体腫瘍、頭蓋咽頭腫、形質細胞腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、多胎芽腫、子宮頸癌、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、大腸癌、中枢神経系原発性リンパ腫、デゴス病、原発性滲出性リンパ腫、増殖性小円形細胞腫、原発性腹膜前癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、神経上皮性腫瘍の胚芽異形成症、膵臓癌、未分化細胞腫瘍、咽頭癌、胚性癌、腹膜偽粘液腫、内分泌腺腫瘍、腎細胞癌、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫、内胚葉洞腫瘍、腎髄質癌、網膜芽細胞腫、食道癌、横紋筋肉腫、エンダデルフォス、横紋筋肉腫、筋腫、リヒター形質転換、線維肉腫、直腸癌、濾胞性リンパ腫、肉腫、濾胞性甲状腺癌、神経鞘腫、神経節細胞腫、セミノーマ、消化管癌、セルトリ細胞腫、胚細胞腫、性索－性腺間質腫瘍、妊娠絨毛癌、印環細胞腫、巨細胞線維芽細胞腫、皮膚癌、骨巨細胞腫、小円形青色細胞腫瘍、神経膠腫、小細胞癌、多形性膠芽腫、軟部肉腫、神経膠腫、ソマトスタチン腫瘍、脳神経膠腫、煤イボ、膵臓の高グルカゴン腫、脊髄腫瘍、性腺芽腫、脾臓辺縁リンパ腫、顆粒膜細胞腫、扁平上皮癌、エストロゲン腫瘍、滑膜肉腫、胆嚢癌、セザリー病、胃癌、小腸癌、ヘアリー細胞白血病、扁平上皮癌、血管芽細胞腫、胃癌、頭頸部癌、Ｔ細胞リンパ腫、血管上皮腫、精巣癌、血液悪性腫瘍、肉腫、肝芽腫、甲状腺癌、肝脾臓Ｔ細胞リンパ腫、移行上皮細胞癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、非ホジキンリンパ腫、尿路癌、浸潤性小葉癌、泌尿生殖器癌、腸癌、尿路上皮癌、腎臓癌、ブドウ膜黒色腫、喉頭癌、子宮癌、悪性そばかす様喀痰、疣贅癌、致死性正中線肉芽腫、視経路神経膠腫、白血病、外陰癌、精巣間質腫瘍、膣癌、脂肪肉腫、ワルデンストームマクログロブリン血症、肺癌、腺リンパ腫リンパ管腫、腎芽腫、リンパ肉腫、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵
巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、又は急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）から選択される。

【0158】

ＩＩＩ．疾病の診断、予後、及びモニタリングを目的としたＳＡＧＥ１発現の検出
ｉ．ＳＡＧＥ１陽性疾患の診断
一態様において、本開示の方法は、被験者のＳＡＧＥ１陽性疾患を診断する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップと、前記生体サンプルにおいて検出される前記ＳＡＧＥ１発現の有無又はレベルに基づいて、前記被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患であるか否かを評価するステップとを含む。

【0159】

一態様において、本開示の方法は、被験者のＳＡＧＥ１陽性疾患を診断する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、前記生体サンプルにおいて前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患であると診断する。

【0160】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１陽性疾患は、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍である。実施の形態によっては、前記被験者はｐ５３が欠損（例えば、変異）していると判断されている。本実施の形態の詳細は以下のセクションで説明する。

【0161】

実施の形態によっては、前記方法は、ＳＡＧＥ１陽性疾患であると診断された被験者にＳＡＧＥ１阻害薬を推奨、処方、又は投与するステップをさらに含む。

【0162】

ｉｉ．悪性度の判定
別の態様において、本開示の方法は、被験者の腫瘍の悪性度又は悪性になる可能性を判定する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップと、前記生体サンプルにおいて検出される前記ＳＡＧＥ１発現の有無又はレベルに基づいて、前記被験者に悪性又は悪性になる可能性がある腫瘍があるか否かを評価するステップとを含む。

【0163】

一態様において、本開示の方法は、被験者の腫瘍の悪性度又は悪性になる可能性を判定する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、前記生体サンプルにおいて前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記腫瘍は、悪性である、又は悪性になる可能性があると判定する。

【0164】

用語「悪性度」は、良性の反対であり、近辺の細胞に（局所的に）侵入して破壊し、さらには人体の他の部位にまで広がる（転移する）能力がある悪性腫瘍の存在を指す。悪性細胞は、高速で無制御成長する傾向があり、通常、その遺伝子構造が変化することでは死滅しない。悪性細胞には、新しい腫瘍を生むことで再発及び転移を引き起こすと考えられる幹細胞様表現型（「幹細胞性(stemness)」）を示すものもある。したがって、悪性腫瘍は、治療効果がない場合もあり、検出可能な痕跡を治療で除去又は破壊した後に復活する場合もある。用語「悪性になる可能性」は、疾病が進行して悪性になる可能性を意味する。被験者には悪性の兆候がまだ現れていないこともあるが、今後、悪性になったり、疾病が進行して悪性になれば、悪性になる可能性がある場合もある。

【0165】

実施の形態によっては、前記悪性度は、以下の特徴、すなわち、（ａ）１以上の幹細胞マーカが発現する、（ｂ）転移可能である、（ｃ）細胞の無制御増殖が可能である、（ｄ）疾病が進行する可能性が高い、（ｅ）抗癌治療に耐性が生じる可能性が高い、（ｆ）抗癌治療の処置後に再発する可能性が高い、（ｇ）１以上の癌関連ドライバー変異が生じている、又は生じる可能性が高い、のうちの１以上の特徴を有する。腫瘍が進行すると、患者の生存期間が短くなったり、転移が増えたり、細胞の増殖が増えたり、全身腫瘍組織量が増えたりする。実施の形態によっては、前記被験者には悪性の臨床症状（例えば、上記の特徴）が現れていない。

【0166】

本明細書で使用する用語「癌関連ドライバー変異」は、選択的成長アドバンテージをもつことによって癌の発症を促す変異を指す。癌関連ドライバー変異は、例えば、特にコピー数変化、コード領域又は非コード領域における変異、マイクロＲＮＡの調節異常、エピジェネティックな変化、及びクロマチン修飾因子における変異等によって、遺伝子の機能に影響を与え得る。癌関連ドライバー変異は、腫瘍患者の腫瘍サプレッサーｐ５３、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子、ＫＭＴ２Ｄ遺伝子、ＳＭＡＲＣＡ４遺伝子、ＮＦＥ２Ｌ２遺伝子、ＦＡＴ１遺伝子、ＳＰＴＡ１遺伝子、ＡＲＩＤ１Ａ遺伝子（例えば、図１０を参照）、ＭＹＣ腫瘍遺伝子、ＢＲＡＦ腫瘍遺伝子において、よく観察されている（例えば、Pon, Julia
R and Marra, Marco A, Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2015.10: 25-50を参照）。

【0167】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１陽性腫瘍は、悪性である可能性が高い、又は悪性になる可能性がある。

【0168】

実施の形態によっては、前記方法は、悪性である、又は悪性になる可能性があると判定された腫瘍をもつ前記被験者に対し、悪性度に適合した治療法の選択肢を提供するステップをさらに含む。

【0169】

実施の形態によっては、前記被験者はｐ５３が変異していると判断されている。この実施の形態の詳細は以下のセクションで説明する。

【0170】

実施の形態によっては、前記方法は、前記生体サンプルにおいて前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記被験者にＳＡＧＥ１阻害薬を推奨、処方、又は投与するステップをさらに含む。

【0171】

ｉｉｉ．ＴＰ５３欠損（又は変異）
別の態様において、本開示の方法は、被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患である可能性を断定（predicate）する方法であって、前記被験者の第１生体サンプルにおいてＴＰ５３の欠損を検出するステップと、前記第１生体サンプルにおいて検出される前記ＴＰ５３の欠損の有無に基づいて、前記被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患である可能性があるか否かを評価するステップとを含む。

【0172】

別の態様において、本開示の方法は、被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患である可能性を断定（predicate）する方法であって、前記被験者の第１生体サンプルにおいてＴＰ５３の欠損を検出するステップを含み、ＴＰ５３の欠損が検出された場合、前記被験者はＳＡＧＥ１陽性疾患である可能性が高いと断定される。

【0173】

本明細書で使用する用語「欠損」又は「欠損している」は、活性又はレベルが不十分であることを指し、例えば、正常な活性又は正常なレベルよりも低いこと、活性又はレベルそのものが無かったり、ゼロであることが含まれる。例えば、ＴＰ５３の活性又はレベルに欠損があると、ＴＰ５３の機能が働かなかったり、正常な機能に及ばず、生体サンプル
におけるＴＰ５３の発現レベルがゼロになったり、低下したりする。

【0174】

ＴＰ５３が無くなることは、様々な癌でよく起こる遺伝子異常である。ある実施の形態において、ＴＰ５３の活性又はレベルに欠損があることは、ＴＰ５３に不活性化変異があることで示すことができる。ＴＰ５３に関して本明細書で使用する用語「不活性化変異」は、ＴＰ５３の遺伝子又は遺伝子産物の機能又は活性の少なくとも部分的な（又は完全な）損失になる変異、又は非機能的な遺伝子又は遺伝子産物になる変異を指す。例えば、影響を受けたＴＰ５３の遺伝子又は遺伝子産物の活性は、野生型カウンターパートよりも著しく低く、全く無くなっていることもある。ある実施の形態において、ＴＰ５３における不活性化変異は、転座、欠失、挿入、置換、又はこれらの組み合わせであって、ＴＰ５３の生物活性を低下させる。

【0175】

本明細書で使用する用語「ＴＰ５３」は、ｍＲＮＡ、タンパク質、さらにはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を含む別の型も包含するものとする。したがって、ＴＰ５３のレベル及び／又は活性及び／又は変異状態は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、タンパク質、又はＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）で測定できる。

【0176】

ＤＮＡ又はＲＮＡレベルにおけるＴＰ５３の変異状態又は発現レベルは、この技術分野で公知の方法であれば測定可能であり、この方法としては、例えば、増幅検査、ハイブリダイゼーションアッセイ、又はシーケンシングアッセイがあるが、これらに限定されない。タンパク質レベルにおけるＴＰ５３の変異状態又は発現レベルは、この技術分野で公知の方法であれば測定可能であり、この方法としては、例えば、免疫学的検査があるが、これに限定されない。

【0177】

実施の形態によっては、前記方法は、ＴＰ５３の欠損が検出された場合、例えば、ＴＰ５３の不活性化変異が検出された場合、ＳＡＧＥ１発現の検査をするように前記被験者に推めるステップをさらに含む。

【0178】

実施の形態によっては、前記方法は、前記第１生体サンプル又は前記被験者の第２生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップをさらに含む。ＳＡＧＥ１発現は、第１生体サンプル、すなわち、ＴＰ５３が検出されるサンプルと同じものにおいて検出でき、それに代えて第１生体サンプルと組織型が同じ又は異なる被験者の第２生体サンプルにおいても検出できる。ＳＡＧＥ１発現を検出するための生体サンプルは、正常時は検出可能なＳＡＧＥ１発現がない型のサンプルである。

【0179】

実施の形態によっては、前記生体サンプルにおいてＳＡＧＥ１発現が検出されなかった場合、前記方法は、時間を置いて、例えば、１カ月後、２カ月後、３カ月後などに、前記被験者のＳＡＧＥ１発現をモニタリングするステップをさらに含む。

【0180】

ｉｖ．ＳＡＧＥ１阻害薬に対する感受性の判断
別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬に対する腫瘍サンプルの感受性を判断する方法であって、前記腫瘍サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップと、前記腫瘍サンプルにおいて検出される前記ＳＡＧＥ１発現の有無又はレベルに基づいて、前記腫瘍サンプルが前記ＳＡＧＥ１阻害薬に感受性があるか否かを評価するステップとを含む。

【0181】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬に対する腫瘍サンプルの感受性を判断する方法であって、サンプル腫瘍細胞におけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、検出した前記ＳＡＧＥ１発現によって、前記腫瘍細胞がＳＡＧＥ１阻害薬に感受性があることが示される。

【0182】

腫瘍細胞に関する用語「感受性」は、腫瘍細胞が腫瘍処置（例えば、ＳＡＧＥ１阻害薬による処置）に応答する能力を指す。腫瘍細胞の感受性は、例えば腫瘍細胞の増殖の抑制又は腫瘍細胞の死滅の観点から測定できる。

【0183】

実施の形態によっては、前記腫瘍サンプルは、被験者から得る。実施の形態によっては、前記方法は、前記腫瘍サンプルがＳＡＧＥ１阻害薬に感受性があると判断された場合、前記被験者にＳＡＧＥ１阻害薬による処置を勧めるステップをさらに含む。実施の形態によっては、前記方法は、前記腫瘍サンプルを得た前記被験者であって、ＳＡＧＥ１阻害薬に感受性があると判断された前記被験者にＳＡＧＥ１阻害薬を提供又は投与するステップをさらに含む。

【0184】

ｖ．ＳＡＧＥ１阻害薬に応答性がある被験者の特定
別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高い腫瘍がある被験者を特定する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップと、前記生体サンプルにおいて検出される前記ＳＡＧＥ１発現の有無又はレベルに基づいて、前記被験者がＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高いか否かを評価するステップとを含む。

【0185】

別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高い腫瘍がある被験者を特定する方法であって、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップを含み、前記ＳＡＧＥ１発現が検出された場合、前記被験者は前記ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高いと特定する。

【0186】

実施の形態によっては、前記被験者はＴＰ５３が変異していると判断されている。

【0187】

実施の形態によっては、前記方法は、ＳＡＧＥ１阻害薬の治療効果を得られる可能性が高いと特定された前記被験者にＳＡＧＥ１阻害薬を推奨、処方、又は投与するステップをさらに含む。

【0188】

実施の形態によっては、前記方法は、前記生体サンプル又は前記被験者の別の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現を検出するステップをさらに含む。

【0189】

実施の形態によっては、前記生体サンプルにおいてＳＡＧＥ１発現が検出されなかった場合、前記方法は、時間を置いて、前記被験者のＳＡＧＥ１発現をモニタリングするステップをさらに含む。

【0190】

ｖｉ．ＳＡＧＥ１陽性疾患の進行のモニタリング
別の態様において、本開示の方法は、被験者におけるＳＡＧＥ１陽性疾患の進行をモニタリングする方法であって、前記被験者の第１生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出するステップ（ａ）と、前記被験者の第２生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出するステップ（ｂ）と、前記ステップ（ａ）及び前記ステップ（ｂ）のそれぞれにおいて検出された前記ＳＡＧＥ１発現のレベルに基づいて、前記被験者において前記ＳＡＧＥ１陽性疾患が進行しているか否かを評価するステップ（ｃ）とを含み、前記第２生体サンプルは前記第１サンプルから時間を置いて取得されたものである。

【0191】

別の態様において、本開示の方法は、被験者における腫瘍の進行をモニタリングする方法であって、前記被験者の第１生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出するステップ（ａ）と、前記被験者の第２生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出するステップ（ｂ）とを含み、前記第２生体サンプルは前記第１サンプルから時間を置
いて取得されたものである。実施の形態によっては、前記方法は、前記第２生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを前記第１生体サンプルにおける前記レベルと比較して腫瘍の進行を判断するステップ（ｃ）をさらに含む。実施の形態によっては、前記第２生体サンプルにおける前記ＳＡＧＥ１発現のレベルが前記第１生体サンプルよりも前記第２生体サンプルの方が高い場合、前記腫瘍は進行していると判断される。

【0192】

実施の形態によっては、前記第２生体サンプルにおける前記ＳＡＧＥ１発現のレベルが前記第１生体サンプルよりも前記第２生体サンプルの方が低い場合、前記腫瘍は退縮していると判断される。実施の形態によっては、前記第1、第２生体サンプル間の経過期間に腫瘍の治療が行われる、又は行われない。実施の形態によっては、前記方法は、前記腫瘍が進行していると判断された場合、前記被験者にＳＡＧＥ１阻害薬を推奨、処方、又は投与するステップをさらに含む。

【0193】

ｖｉｉ．ＳＡＧＥ１阻害薬に対する被験者の応答性のモニタリング
別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１陽性疾患がある被験者の治療期間中のＳＡＧＥ１阻害薬による処置に対する応答性をモニタリングする方法であって、前記治療期間の後、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出し、処置後のＳＡＧＥ１発現レベルを取得するステップ（ａ）と、前記治療期間以前に前記被験者から得た生体サンプルにおいて検出されたＳＡＧＥ１発現の基準レベルと前記処置後のＳＡＧＥ１発現レベルを比較するステップ（ｂ）と、前記ステップ（ａ）及び前記ステップ（ｂ）のそれぞれにおいて検出された前記ＳＡＧＥ１発現のレベルに基づいて、前記ＳＡＧＥ１阻害薬による前記処置に対する応答性があるか否かを評価するステップ（ｃ）とを含む。

【0194】

別の態様において、本開示の方法は、腫瘍がある被験者のＳＡＧＥ１阻害薬による処置に対する応答性をモニタリングする方法であって、前記治療期間の後、前記被験者の生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現のレベルを検出し、処置後のＳＡＧＥ１発現レベルを取得するステップ（ａ）と、前記治療期間以前に前記被験者から得た生体サンプルにおいて検出されたＳＡＧＥ１発現の基準レベルと前記処置後のＳＡＧＥ１発現レベルを比較するステップ（ｂ）とを含む。

【0195】

実施の形態によっては、前記処置後のレベルが前記基準レベルより低い場合、前記被験者は前記処置に応答性があると判断される。

【0196】

実施の形態によっては、前記処置後のレベルが前記基準レベルより高い場合、前記被験者は前記処置に応答性がないと判断される。

【0197】

ｖｉｉｉ．ＳＡＧＥ１発現の検出
本明細書で説明するいずれの方法及び実施の形態も、この技術分野で公知の方法のうち、適切な方法によってＳＡＧＥ１発現を検出できる。実施の形態によっては、本明細書に記載の前記方法には、前記生体サンプルにおけるＳＡＧＥ１発現の存在又はレベルを検出できる薬剤に前記生体サンプルを接触させることが含まれる。

【0198】

ＳＡＧＥ１発現は、ＳＡＧＥ１発現の有無に基づいて検出でき、ＳＡＧＥ１発現があるということがＳＡＧＥ１陽性を意味する。

【0199】

あるいは、ＳＡＧＥ１発現は、ＳＡＧＥ１発現のレベルに基づいて検出でき、検出したレベルが基準レベルより高いということがＳＡＧＥ１陽性を意味する。基準レベルは、１以上の基準サンプル（例えば、健康な被験者、健康な組織、又は腫瘍患者の前癌組織から得たサンプル）から得られる。ＳＡＧＥ１発現の検出は、基準サンプル及び注目生体サン
プルの取得と並行して行える。基準レベルは、１以上の基準サンプルに基づくデータ群、標準、又はレベルを含むデータベースから取得することも可能である。実施の形態によっては、当該データ群、標準、又はレベルは、正規化されている。ＳＡＧＥ１は、ほとんどの健康な細胞又は組織には通常みられないものであるため、基準レベルは、ＳＡＧＥ１発現がないことを示すレベル（又はノイズレベル）も包含するものと理解される。

【0200】

本明細書に記載のＳＡＧＥ１は、ｍＲＮＡ、タンパク質（及びその複合体）、さらにはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を含む別の型も包含するものとする。したがって、ＳＡＧＥ１発現は、ＤＮＡ転写レベル、ＲＮＡレベル、又はタンパク質レベルで検出できる。

【0201】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１発現は、（ａ）ＳＡＧＥ１タンパク質の存在又はレベル、（ｂ）ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの存在又はレベル、（ｃ）ＳＡＧＥ１複合体の存在又はレベル、（ｄ）ＳＡＧＥ１遺伝子のメチル化レベル、（ｅ）ＳＡＧＥ１遺伝子のヒストンのアセチル化の存在又はレベル、（ｆ）ＳＡＧＥ１遺伝子に対する転写因子の結合の存在又はレベル、又は（ｇ）これらの組み合わせによって示される。

【0202】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１発現は、（ａ）ＳＡＧＥ１遺伝子の転写の存在又は基準レベルよりも高いレベル、（ｂ）ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの存在又は基準レベルよりも高いレベル、（ｃ）ＳＡＧＥ１タンパク質の存在又は基準レベルよりも高いレベル、（ｄ）ＳＡＧＥ１複合体の存在又は基準レベルよりも高いレベル、又は（ｅ）これらの組み合わせによって示される。

【0203】

ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの存在又はレベルは、この技術分野で公知の核酸検査のうち、適切な検査、例えば核酸増幅検査、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、核酸シーケンシングアッセイ、その他、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）フラグメント分析及びキャピラリー電気泳動法等の方法等によって検出できる。核酸増幅検査、ハイブリダイゼーションアッセイ、及びシーケンシングアッセイは、以下のセクションで説明する。ＲＮＡ分子の存在及びレベルを増幅検査又はシーケンシングアッセイで検出するために、分析前にＲＮＡをｃDNAに逆転写しておく必要がある場合がある。

【0204】

ＳＡＧＥ１タンパク質の存在又はレベルは、この技術分野で周知のポリペプチドの検出又は定量に適したアッセイで検出できる。これには、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（hyeprdiffusion）クロマトグラフィー、質量分析、又は様々な免疫学的検査等の生化学的分析方法が含まれる。当業者であれば、ＳＡＧＥ１タンパク質の発現の存在又はレベルを判定する際に使用する公知のタンパク質検出方法を容易に応用できる。

【0205】

ＳＡＧＥ１の存在又はレベルは、ＳＡＧＥ１複合体の存在又はレベルで示すこともできる。本明細書において、「ＳＡＧＥ１複合体」、「ＳＡＧＥ１含有複合体」、及び「ＳＡＧＥ１を含む複合体」は、同義に用いられており、ＳＡＧＥ１タンパク質又はそのフラグメントに加えて１以上のタンパク質又はポリペプチドを含むタンパク質複合体を指す。本開示は、ＳＡＧＥ１が他のタンパク質又はポリペプチドと複合体を形成でき、この複合体を介して生物学的機能を発揮するということを思いがけず発見した。例えば、ＳＡＧＥ１は、ＩＮＴＳ３と相互作用し、インテグレータのＩＮＴＳ６を置換する。インテグレータは、ほとんどのＲＮＡＰＩＩ依存性遺伝子の制御、例えば、非コード小核ＲＮＡの３’末端処理、エンハンサＲＮＡの合成、転写の一時停止―放出（transcription pause-release）及びプロセッシビティ（processivity）、ならびにインテグレータ標的遺伝子及びエンハンサの未成熟転写終結等に重要な役割をもつ１４種以上のサブユニット（ＩＮＴＳ１～ＩＮＴＳ１４）からなる大きなタンパク質複合体である。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＳＡＧＥ１及びＩＮＴＳ３を含む。実施の形態によっては、前記Ｓ
ＡＧＥ１複合体は、ＳＡＧＥ１―ＩＮＴＳ３複合体を含む。ＳＡＧＥ１―ＩＮＴＳ３複合体は、インテグレータによって結び付けられた遺伝子のプロモータ近位領域に結合することができ、その後、こうした遺伝子の転写を活性化する。本開示は、細胞増殖及び癌表現型に不可欠な経路においてエンリッチされる遺伝子の発現がＳＡＧＥ１の発現によって明らかに刺激されていることを発見した。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＩＮＩＰ、ＮＡＢＰ１／２、ＣＲＥＢＢＰ、ＴＬＥ１、ＴＬＥ２、ＴＬＥ３、ＴＬＥ４、ＴＬＥ５、ＧＧＡ３、ＣＮＯＴ１、ＴＡＸ１ＢＰ１、ＳＥＣ１６Ａ、ＣＹＬＤ、及びＰＡＸＢＰ１から選択される１以上の分子をさらに含む。

【0206】

ＳＡＧＥ１複合体の存在又はレベルは、タンパク質間相互作用を測定する方法のうち、適切な方法によって検出できる。ある実施の形態では、タンパク質間相互作用解析法は、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）社開発の酵素結合免疫吸着測定法（ＭＳＤ－ＥＬＩＳＡ）、標準的な複合体用のＥＬＳＩＡ、近接ライゲーション法（ＰＬＡ）、免疫共沈降法、又は免疫ブロット法等の免疫学的検査又は近接解析に基づく。ＳＡＧＥ１複合体を検出する免疫学的検査は、通常、複合体の成分又は複合体特有のエピトープに特異的に結合する抗体を用いて、複合体の存在又はレベルを検出又は計測する。タンパク質間相互作用は一過性のものであり、サンプル調製中に解離する場合があるが、科学的又は物理的な架橋によってタンパク質複合体の相互作用の成分の安定化又は恒久的な接合が可能である。タンパク質複合体の成分が共有結合で架橋されると、相互作用する元の複合体を維持しながら他のステップ（例えば、細胞溶解、親和性精製、電気泳動法、又は質量分析）を利用してタンパク質間相互作用を分析できる。

【0207】

ＳＡＧＥ１遺伝子の転写は、ＳＡＧＥ１遺伝子のＤＮＡメチル化又はＤＮＡ脱メチル化を測定することで判定できる。ＤＮＡメチル化は、ＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡ分子の１個のシトシン塩基または複数の塩基）にメチル基を付加する（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の働きによる）生物学的プロセスである。哺乳類では、転写開始部位付近であることが多いシトシン－リン酸－グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドの５’末端位置（すなわち、「ＣｐＧ部位」）においてＤＮＡメチル化がみられ、遺伝子のエピジェネティックな不活性化につながり得る。逆に、ＤＮＡ脱メチル化プロセスでは、メチル化されたＤＮＡ分子からメチル基を取り除く（例えば、メチルシトシン塩基をシトシンに変える）ことができ、遺伝子のエピジェネティックな活性化につながり得る。実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１遺伝子のＤＮＡメチル化のレベルが基準レベルよりも低い（又は、ＤＮＡ脱メチル化のレベルが基準レベルよりも高い）ことによって、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写があること又はそのレベルが基準レベルよりも高いことが示される。

【0208】

ヒトＳＡＧＥ１遺伝子は、Ｘ染色体に位置し（Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 13によれば、ChrX: 135, 893, 700-135, 913, 026, Xq26.3）、ＮＣＢＩデータベースにおける遺伝子ＩＤは55511である（この配列はSEQ ID NO: 1として本明細書に組み込まれる）。ＳＡＧＥ１遺伝子のＤＮＡメチル化は、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡに転写される発現領域（ChrX: 135, 893, 716-135, 913, 062）又は発現領域から５’端上流の非発現領域（例えば、ChrX: 135, 890, 700-135, 893, 715）で生じ得る。発現領域には、ＣｐＧ（ChrX: 135, 893, 450-135, 893, 686）でエンリッチされたＤＮＡの伸長部分が含まれ、これがＣｐＧ含有領域として設計される。実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１遺伝子のＣｐＧ含有領域でＳＡＧＥ１遺伝子のＤＮＡメチル化が検出される。ＳＡＧＥ１遺伝子の遺伝子発現のCap Analysis of Gene Expression（ＣＡＧＥ）法によると、転写開始部位は、ChrX: 135893700付近に位置しており、さらに全ゲノム重亜硫酸塩配列決定（ＷＧＢＳ）によると、ＳＡＧＥ１発現のレベルが様々である細胞株全体において、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写開始部位の１ｋｂ上流又は下流の領域内にはＤＮＡメチル化差がある（www. encodeproject.org のＷＧＢＳデータK562: ENCSR765JPC, ENCSR481JIW (A549), ENCSR550RTN (HeLa-S3)に基づく）。実施の形態によっては、前記ＤＮＡメチル化
は、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写開始部位の上流１ｋｂ以内及び下流１ｋｂ以内の領域（例えば、ChrX: 135, 892, 700-135, 894, 700に広がる領域）で検出される。実施の形態によっては、前記ＤＮＡ脱メチル化は、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写開始部位の上流３ｋｂ以内及び下流３ｋｂ以内の領域（例えば、ChrX: 135, 890, 700-135, 896, 700に広がる領域）で検出される。

【0209】

ＤＮＡメチル化は、この技術分野における方法のうち、適切な方法によって検出できる。実施の形態によっては、生体サンプルに含まれるＤＮＡにおいて非メチル化シトシンとメチル化シトシンとを区別することができる試薬で前記生体サンプルに処置を施す。このような試薬は、例えば、重亜硫酸塩及びメチル化感受性制限酵素を含む。重亜硫酸塩は、メチル化シトシンはそのままで、非メチル化シトシンを選択的に修飾でき、これをウラシルに変換できる。この変換の後、以下に示す核酸増幅検査、シーケンシングアッセイ、又はハイブリダイゼーションアッセイによって、特定の遺伝子座又は遺伝子におけるＤＮＡメチル化を検出及び計測できる。実施の形態によっては、前記生体サンプルに含まれるＤＮＡは、前記ＤＮＡメチル化の検出前に増幅される。

【0210】

ＳＡＧＥ１遺伝子の転写の存在又はレベルも、ＳＡＧＥ１遺伝子のヒストンのアセチル化の存在又はレベルを測定することによって判定できる。ヒストンのアセチル化は、ヒストンタンパク質のＮ末端にアセチル基が付加される（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼの働きによる）生物学的プロセスである。ヒストンのアセチル化によって、凝縮クロマチンがより高い遺伝子転写レベルに関連した、より緩い構造となるように変化する。哺乳類では、一般に、ヒストンＨ３タンパク質の９～１２番目のリジン残基又はヒストンＨ４タンパク質の１６番目のリジン残基においてヒストンのアセチル化がみられる（H3K9ac, H3K27ac, H4K16ac）。実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１遺伝子のヒストンのアセチル化のレベルが基準レベルよりも高いことによって、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写があること又はそのレベルが基準レベルよりも高いことが示される。実施の形態によっては、ヒストンのアセチル化は、ＳＡＧＥ１遺伝子の非発現領域又は発現領域で検出される。実施の形態によっては、ヒストンのアセチル化は、ＳＡＧＥ１遺伝子のエンハンサ又はプロモータ領域の付近で検出される。実施の形態によっては、前記ヒストンのアセチル化又はＳＡＧＥ１遺伝子との転写因子の結合は、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写開始部位の上流１ｋｂ以内及び下流１ｋｂ以内の領域（chrX: 135, 892, 700-135, 894, 700）で検出される。実施の形態によっては、前記ヒストンのアセチル化又はＳＡＧＥ１遺伝子との転写因子の結合は、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写開始部位の上流３ｋｂ以内及び下流３ｋｂ以内の領域（chrX: 135, 890, 700-135, 896, 700）で検出される。

【0211】

ＳＡＧＥ１遺伝子の転写の存在又はレベルは、ＳＡＧＥ１遺伝子のプロモータ領域又はエンハンサ領域等、ＳＡＧＥ１遺伝子との転写因子の結合を測定することでも判定できる。実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１遺伝子との転写因子の結合は、ChrX: 135, 892, 756-135, 894, 140に広がる領域において検出される。ＳＡＧＥ１遺伝の転写は、Ｍｙｃ及びＣＴＣＦといった転写因子によって制御される。実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１遺伝子との転写因子の結合があること又はそのレベルが基準レベルよりも高いことによって、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写があること又はそのレベルが基準レベルよりも高いことが示される。

【0212】

ヒストンのアセチル化及びＳＡＧＥ１遺伝子との転写因子の結合は、共にクロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）によって分析できる。ＣｈＩＰでは、単一の遺伝子座又は複数の遺伝子座における特定のタンパク質―ＤＮＡ相互作用を検出し、相対的に定量化できる。ＣｈＩＰでは、ＤＮＡ配列にタンパク質を化学的又は物理的に架橋し、その後、ＤＮＡ配列を切断して断片化し、注目タンパク質に特異的な抗体によって架橋複合体の免疫沈降を行い、架橋の反転によって関連ＤＮＡフラグメントを放出し、得られたＤＮＡフラグメント
を核酸増幅検査（例えば、エンドポイント又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応）、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ChIP-chip）、又はシーケンシングアッセイ（ChIP-seq）で分析する。核酸増幅検査、ハイブリダイゼーションアッセイ、及びシーケンシングアッセイについては上述した。ヒストンのアセチル化の検出には、抗Ｈ３Ｋ９ａｃ抗体、抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ抗体、抗Ｈ４Ｋ１６ａｃ抗体等のアセチル化ヒストンに特異的な抗体が有用であり、ＳＡＧＥ１遺伝子との転写因子の結合の検出には、有用な抗体として抗Ｍｙｃ抗体等がある。複数の腫瘍細胞株をChIP-seq分析すると、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写開始部位付近の領域がエンリッチされてＨ３Ｋ２７ａｃ修飾が生じ、転写因子アレイが結合することが分かった。

【0213】

ＳＡＧＥ１発現の検出に利用できる方法は、適切なものであればよく、例えば、免疫学的検査、増幅検査、ハイブリダイゼーションアッセイ、又はシーケンシングアッセイ等がある。

【0214】

増幅検査

【0215】

核酸増幅検査では、標的核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）をコピーすることによって、増幅核酸配列のコピー数を増やす。増幅は指数関数的増幅又は線形増幅である。核酸増幅方法の例として、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」、米国特許第４６８３１９５号及び第４６８３２０２号、ＰＣＲプロトコルA Guide To Methods And Applications (Innisら編、1990)を参照）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ等の定量ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（Abravaya, K.ら、Nucleic Acids Research, 23: 675-682, (1995)を参照）、分枝ＤＮＡシグナル増幅（Urdea, M. S.ら、AIDS, 7 (suppl 2) : S11-S14, (1993)を参照）、増幅可能なＲＮＡレポーター、Ｑベータ複製（Lizardiら、Biotechnology (1988) 6: 1197を参照）、転写ベースの増幅（Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 1173-1177を参照）、ブーメランＤＮＡ増幅、鎖置換活性、サイクリングプローブ技術、自家持続配列複製（Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 1874-1878）、ローリングサークル複製（米国特許第５８５４０３３号）、核酸配列ベースの等温増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）を用いた増幅があるが、これらに限定されない。

【0216】

核酸のレベルは、リアルタイム増幅または定量的増幅としても知られる増幅検査中に定量化できる。定量的増幅の方法は、例えば、Gibsonら、Genome Research (1996) 6: 995-1001; DeGravesら、Biotechniques (2003) 34 (1) : 106-10, 112-5; Deiman Bら、Mol Biotechnol. (2002) 20 (2) : 163-79に開示されている。定量化は、通常、増幅（例えば、ＰＣＲ）反応のサイクルで鋳型のコピーを示す検出可能なシグナルをモニタリングすることを基礎とする。検出可能なシグナルは、増幅中に使用される挿入剤又は標識プライマ又は標識プローブによって生成され得る。検出されたバイオマーカのレベルは、この技術分野で公知の方法によって定量化できる。品質管理の手段として、内部コントロールバイオマーカのレベルを計測してもよい。当業者であれば、内部コントロールバイオマーカがサンプルに本来存在し得るものであり、そのレベルを用いてＳＡＧＥ１の測定レベルを正規化すれば、サンプルの絶対量の違いを相殺できるということは分かると思われる。これに代えて、増幅検査の後に核酸のレベルを定量化することもできる。

【0217】

ハイブリダイゼーションアッセイ

【0218】

核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、プローブを用いて標的核酸をハイブリダイズすることで標的核酸を検出可能にする。ある実施の形態では、ハイブリダイゼーションアッセイ用のプローブは、検出可能に標識化されている。ある実施の形態では、ハイブリダ
イゼーションアッセイ用の核酸ベースのプローブは、標識化されていない。このような標識化されていないプローブは、マイクロアレイ等の固体支持体に固定化でき、検出可能に標識化されている標的核酸分子にハイブリダイズできる。

【0219】

ある実施の形態では、ハイブリダイゼーションアッセイは、核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を単離させ、核酸を分離（例えば、ゲル電気泳動によって分離）した後、分離した核酸を適切な薄膜フィルタ（例えば、ニトロセルロースフィルタ）に移すことで実行でき、そこでプローブが標的核酸にハイブリダイズして検出を可能にする。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrookら編、2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapter 7を参照されたい。プローブと標的核酸のハイブリダイゼーションは、この技術分野で公知の方法によって検出又は測定できる。例えば、ハイブリダイズされたフィルタを写真用フィルムに露光することでハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィによる検出が行える。ハイブリダイズされたフィルタを露光した写真用フィルムに対し、デンシトメトリーのスキャンを行うと、標的核酸レベルが正確に測定される。コンピュータ撮像システムを用いてバイオマーカのレベルを定量化することもできる。

【0220】

シーケンシングアッセイ

【0221】

シーケンシングアッセイ（例えば、次世代シーケンシング法又は第３世代シーケンシング法）は、標的ＤＮＡ分子の存在及びレベルの検出に有用であり、標的ＤＮＡのシーケンシングし、シーケンシングされた標的ＤＮＡ分子を数える。これらのシーケンシング法は、合成によるシーケンシング（sequencing-by-synthesis）、ライゲーションによるシーケンシング（sequencing-by-ligation）、ウルトラディープシーケンシング（ultra-deep
sequencing）、又は単一分子シーケンシング（single molecule sequencing）等の原理に基づく。例えば、合成によるシーケンシングは、ポリメラーゼ増幅において、標識化されたヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を取り込んで標的核酸の相補鎖を合成する。標識化されたヌクレオチドが取り込まれた直後またはその時点で、標識化のシグナルを測定し、ヌクレオチドの同定を記録する。取り込まれたヌクレオチドの検出可能な標識は、取り込みステップ、検出ステップ、及び同定ステップが繰り返される前に取り除かれる。合成によるシーケンシングは、フォールドバックＰＣＲおよびアンカー型プライマを用いて固体表面（又はマイクロアレイ又はチップ）上で行う場合がある。標的ＤＮＡフラグメントは、アンカー型プライマにハイブリダイズすることによって固体表面に付着でき、ブリッジが増幅される。シーケンシング法の例として、シーケンシング法（sequencing）、パイロシーケンシング法（pyrosequencing）、ＳｏＬｉＤ法（supported oligonucleotide ligation and detection）、イオントレント技術（Ion torrent technology）、ＳＭＲＴ（single-molecular real time）シーケンシング法、Helicosシーケンシング法（Helicos
sequencing）、ナノポアシーケンシング法（Nanopore sequencing）等があるが、これらに限定されない。

【0222】

免疫学的検査

【0223】

免疫学的検査は、通常、注目タンパク質に特異的に結合する抗体を用いる。このような抗体は、この技術分野で公知の方法によって取得でき（例えば、Huseら、Science (1989)
246: 1275-1281; Wardら、Nature (1989) 341: 544-546を参照されたい）、商用の供給源からも取得できる。免疫学的検査の例として、ウェスタンブロッティング（Western blotting）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定（RIA）、免疫沈降、サンドイッチ法、競合アッセイ、免疫蛍光染色イメージング、免疫組織化学、及び蛍光活性化セルソーティング（FACS）があるが、これらに限定されない。免疫学的方法及び免疫学的検査法の検討については、Basic and Clinical Immunology（S
tites&Terr編、7th ed. 1991）を参照されたい。また、免疫学的検査は、Enzyme Immunoassay（Maggio編、1980）及びHarlow &Lane, supraで検討されているいくつか構成のうちのいずれでも実施することができる。一般的な免疫学的検査の検討については、Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37（Asai編、1993）及びBasic and Clinical Immunology（Stites&Terr編、7th ed. 1991）を参照されたい。

【0224】

本明細書に記載のＳＡＧＥ１発現検出用アッセイ及び方法は、いずれも自動及び半自動システム又は医療現場の分析システムにおいて使用するために応用又は最適化することができる。ＳＡＧＥ１発現のレベルを判定する際、本明細書に記載のアッセイで検出されたＳＡＧＥ１発現のレベルをこの技術分野で公知の方法のうち、適切な方法によって正規化できる。例えば、複数の内部マーカの平均レベルもしくは合計レベル又は内部マーカであり得る内部コントロールにレベルを正規化できる。

【0225】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１は、本明細書に記載の方法で検出される単一のバイオマーカである。実施の形態によっては、本明細書に記載の方法によるＳＡＧＥ１発現の検出は、被験者から得た生体サンプルを提供するステップを含む。

【0226】

ｉｘ．ＳＡＧＥ１発現に基づく評価
ＳＡＧＥ１は、胚発生時にヒト全能性幹細胞など幹細胞性が高い細胞において発現しているのが確認されるものの、ほとんどの正常な組織では発現していない。一方、様々な異常組織でＳＡＧＥ１の発現が確認されることから、ＳＡＧＥ１は、ＳＡＧＥ１陽性疾患を診断するバイオマーカとして使用できると言える。

【0227】

これまで効果的な早期検出ができなかった腫瘍を診断する方法、腫瘍の悪性度、進行、転移、再発、予後、及び腫瘍処置の効果を評価する方法、及び標的治療を選択する方法をＳＡＧＥ１発現の検出に基づいて実現する。ＳＡＧＥ１は、従来のバイオマーカと比べ、特異度が高く、正常な組織と腫瘍とを区別する際の正確性がほぼ１００％である。

【0228】

実施の形態によっては、正常時にはＳＡＧＥ１を発現しない生体サンプルにおいてＳＡＧＥ１が発現することは、その生体サンプルの提供元である被験者がＳＡＧＥ１陽性疾患であることを示す。これに対し、ＳＡＧＥ１が発現しないことは、このようなＳＡＧＥ１陽性疾患ではないことを示している。

【0229】

同様に、腫瘍生体サンプルにＳＡＧＥ１が発現することは、その腫瘍が悪性である可能性が高いこと、もしくは悪性になる可能性があること、その腫瘍がＳＡＧＥ１阻害薬による処置に感受性があること、又は被験者がＳＡＧＥ１阻害薬に応答性がある可能性が高いことを示す。

【0230】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１発現のレベルについて、判定が可能で、閾値レベルと比較できる。この閾値レベルは、ＳＡＧＥ１を発現することが分かっている陽性の基準サンプル及びＳＡＧＥ１を発現しないことが分かっている陰性の基準サンプルに基づいて判定でき、陽性の基準サンプルを陰性の基準サンプルと区別できるレベルであればよい。

【0231】

実施の形態によっては、被験者におけるＳＡＧＥ１発現のレベルの変化は、ＳＡＧＥ１陽性疾患の進行又はＳＡＧＥ１阻害薬に対する被験者の応答性を示し得る。例えば、ＳＡＧＥ１発現のレベルが上昇したことは、ＳＡＧＥ１陽性疾患が進行したこと、又はＳＡＧＥ１阻害薬を投与された被験者が処置に応答しなくなる可能性が高いこと、もしくは処置に対する耐性を獲得したことを示す。

【0232】

ｘ．生体サンプル
適切なものであればどの生体サンプルでもＳＡＧＥ１発現の検出に使用できる。実施の形態によっては、前記生体サンプルは、特にＳＡＧＥ１陽性細胞、ＳＡＧＥ１発現産物、又はＳＡＧＥ１遺伝子もしくはそのフラグメントが含まれると疑われるものである。

【0233】

実施の形態によっては、前記生体サンプル、特にＳＡＧＥ１発現産物又はＳＡＧＥ１遺伝子もしくはそのフラグメントが含まれると疑われる異常細胞を含むものである。実施の形態によっては、前記生体サンプルは、正常な場合、検出可能なＳＡＧＥ１発現がないタイプのサンプルである。ある実施の形態では、生体サンプルは、精原幹細胞（ＳＳＣ）を含まない。ある実施の形態では、生体サンプルは、卵管、唾液腺、脂肪組織、副腎、血液、膀胱、血管、胸部、子宮頚部、結腸、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、神経、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、甲状腺、子宮又は膣から得たものである。

【0234】

実施の形態によっては、前記生体サンプルは、細胞、組織、体液、及びこれらの組み合わせから選択される。被験者から生体サンプルを得るには当業者が知る適切な方法を用いる。一般に、サンプルのタイプ（すなわち、細胞、組織、又は体液）は、腫瘍細胞の成長に関する評価対象の臓器もしくは組織の入手しやすさ及び構造又は評価対象の癌の種別に基づいて選択される。生体サンプルとしては、腫瘍細胞又は腫瘍細胞含有物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ，タンパク質、細胞内小器官）をもつ可能性がある被験者の体液又は細胞であればよい。実施の形態によっては、前記生体サンプルは、組織切片、バイオプシー、パラフィン包埋組織、体液、外科的切除によるサンプル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0235】

体液は、細胞内液、細胞外液、又はこの２つの組み合わせであり得る。実施の形態によっては、前記体液は、血液、血清、血漿、腹水、嚢胞液、胸水、腹膜液、脳脊髄液、涙液、尿、唾液、痰、乳頭液、リンパ液、気道・腸管・尿生殖路の体液、母乳、臓器系の体液、腹膜液、組織移植片の培養で得られる馴化培地、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0236】

生体サンプルは、取得後そのままの状態、冷凍状態、固定状態、又は保存状態で使用できる。生体サンプルを調製する方法は、使用した検出技術に適した方法であればよい。例えば、体液サンプルから腫瘍細胞（循環腫瘍細胞等）を単離又は抽出して調製を行う。別の例としては、パラフィンに組織サンプルを固定化して調製を行う。固定化された組織は、その後、切開され、標的（例えば、ＳＡＧＥ１タンパク質又はＳＡＧＥ１複合体）との結合を検出するための抗体に接触させる。ある実施の形態では、生体サンプルを加工し、ＳＡＧＥ１発現の検出用にタンパク質、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ又はセルフリーＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、又は細胞内小器官を単離する。

【0237】

ｘｉ．ＳＡＧＥ１発現の検出用キット
別の態様において、本開示のキットは、本明細書に記載の前記方法のいずれかで使用されるものであって、ＳＡＧＥ１発現を検出する１種以上の試薬を含む。

【0238】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１発現を検出する１種以上の前記試薬は、ＳＡＧＥ１タンパク質の存在又はレベルを検出するための試薬、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの存在又はレベルを検出するための試薬、ＳＡＧＥ１複合体の存在又はレベルを検出するための試薬、ＳＡＧＥ１遺伝子のメチル化レベルを検出するための試薬、ＳＡＧＥ１遺伝子のヒストンのアセチル化の存在又はレベルを検出するための試薬、ＳＡＧＥ１遺伝子に対する転写因子の結合の存在又はレベルを検出するための試薬、及びこれらの組み合わせから選択される。

【0239】

ある実施の形態では、キットは、プライマ、プローブ、及び／又は抗体等の１以上の薬
剤を含む。薬剤は、ＳＡＧＥ１ゲノムＤＮＡ、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ、ＳＡＧＥ１タンパク質、ＳＡＧＥ１複合体、メチル化もしくは非メチル化シトシン、又はその変換後のヌクレオチドの検出に特異的なもの、あるいはアセチル化ヒストンの検出又はＳＡＧＥ１ゲノムＤＮＡに結合する転写因子の検出に特異的なものであり得る。

【0240】

実施の形態によっては、前記キットは、ＳＡＧＥ１特異オリゴヌクレオチドプライマ、ＳＡＧＥ１特異オリゴヌクレオチドプローブ、抗ＳＡＧＥ１抗体、及び抗ＳＡＧＥ１複合体抗体から選択された少なくとも１種の試薬を含む。

【0241】

核酸に関して本明細書で使用する用語「プライマ」及び「プローブ」は、標的ポリヌクレオチド配列のシーケンス内のプライマの少なくとも一部と配列相補性があることにより、標的ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマを伸長させることで新しいポリヌクレオチド鎖を生成する核酸増幅検査及びシーケンシングアッセイにおいて、プライマは有用である。プローブは、標的核酸にハイブリダイズすることによってサンプル内の標的核酸を同定する際に有用である。プライマ及びプローブは、当業者であれば技術常識でもって容易に設計できるので、本明細書に記載の標的ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に特異的にアニールできる。プライマ又はプローブの長さは、少なくとも８ヌクレオチドで、典型的には８～７０ヌクレオチドであり、通常は１８～２６ヌクレオチドである。プライマは、標的配列に正しくハイブリダイズするために、標的ポリヌクレオチド配列のハイブリダイズ部分に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列相補性を有する。

【0242】

ある実施の形態では、本明細書に記載のプライマ又はプローブは、ＳＡＧＥ１ゲノムＤＮＡ（SEQ ID NO: 1）又はｍＲＮＡ（SEQ ID NO: 2）の一部（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続ヌクレオチド）にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列を含む。ある実施の形態では、本明細書に記載のプライマ又はプローブは、ＳＡＧＥ１ゲノムＤＮＡ（SEQ ID NO: 1）又はｍＲＮＡ（SEQ ID NO: 2）の一部（例えば、６６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続ヌクレオチド）に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相補性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【0243】

ある実施の形態では、本明細書に記載の抗体は、SEQ ID NO: 3の配列を有するＳＡＧＥ１タンパク質内のエピトープに特異的に結合できる抗原結合領域を含む。

【0244】

本明細書に記載のプライマ、プローブ、及び／又は抗体は、検出可能に標識化されていてもよいし、されていなくてもよい。本明細書で使用する用語「検出可能な標識」は、検出を可能にする分子又は部分を指す。試薬に関する用語「検出可能に標識化される」は、その試薬が検出可能な標識を含む、又は検出可能な標識によって結合可能であることを指す。ある実施の形態では、本明細書に記載のプライマ、プローブ、及び抗体は、検出可能に標識化されたリガンドに特異的に結合できる。プライマ、プローブ、及び抗体の標識化に適した検出可能な標識は、例えば、発色団、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光部分、粒子（可視粒子又は蛍光粒子）、核酸、リガンド、又は酵素等の触媒である。検出可能な標識はそれ自体が検出可能なシグナルを生成する必要はなく、ある実施の形態では、検出可能なパートナー又は１以上の追加化合物と反応し、検出可能なシグナルを生成できればよいと理解される。別の例として、酵素は、検出可能なシグナルの生成につながる発色基質、蛍光発生基質、又は発光基質に対するその触媒作用により、検出可能な標識として有用である。

【0245】

ある実施の形態では、このキットは、本明細書に記載の方法を実施するために他の薬剤
をさらに含む場合がある。このような用途の場合、このキットは、適切なバッファ、核酸を単離させる試薬、核酸を増幅させる試薬（例えば、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス）、核酸を配列する試薬、核酸を定量化する試薬（例えば、挿入剤、検出プローブ）、タンパク質を単離させる試薬、及びタンパク質を検出する試薬（例えば、二次抗体）のうちの一部又は全部を含んでよい。

【0246】

実施の形態によっては、前記キットは、メチル化を検出する薬剤を含んでよい。このような用途の場合、このキットは、ＤＮＡ処置用にＤＮＡ内の非メチル化及びメチル化ＣｐＧ部位を区別できる変換試薬を含む。実施の形態によっては、前記試薬は、重亜硫酸塩試薬である。重亜硫酸塩試薬は、例えば、重亜硫酸アンモニウム、重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸カリウム、重亜硫酸カルシウム、重亜硫酸マグネシウム、重亜硫酸アルミニウム、亜硫酸水素塩、及びこれらの組み合わせからなる群から選択できる。あるいは、亜硫酸塩試薬は、MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit、EpiMarkTM Bisulfite Conversion Kit、EpiJETTM Bisulfite Conversion Kit、EZ DNA Methylation-GoldTM Kit等の市販のものである。実施の形態によっては、前記試薬は、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）である。実施の形態によっては、前記ＭＳＲＥは、HpaII、SalI、ScrFI、BbeI、NotI、SmaI、XmaI、MboI、BstBI、ClaI、MluI、NaeI、NarI、PvuI、SacII、HhaI及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0247】

本明細書に記載の方法のいずれかで有用である試薬は、キャリア又は仕切られた容器に含められる。キャリアは、例えば、袋状、箱状、管状、ラック状などの容器又支持体であり、仕切られている場合もある。

【0248】

ある実施の形態では、前記キットは、標準的なネガティブコントロール及び／又は標準的なポジティブコントロールをさらに含む。

【0249】

また、このキットは、本明細書に記載の方法の実施に関する指示（すなわち、プロトコル）を含む教材を含む場合がある。この教材は、通常、書面又は印刷物であるが、これに限定されない。

【0250】

別の態様において、本開示は、腫瘍を診断するためのキットの作製時におけるＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための物質の使用について示す。このキットは、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントの発現レベルを検出することで腫瘍を診断したり、ＳＡＧＥ１標的治療が被験者に適しているか否かを判断することができる。発明者は、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントの発現が被験者に腫瘍があるか否かと密接に関連していることと、ＳＡＧＥ１の発現が陽性又は発現のレベルが高い腫瘍患者にはＳＡＧＥ１標的治療がより適していることとを発見した。本開示では、ＳＡＧＥ１を阻害することで腫瘍細胞の増殖、移動、及び足場非依存性成長を大幅に抑えられる一方、妨げられていたＳＡＧＥ１の発現が復活すると、腫瘍細胞のクローン原生が復活できることを実証する。

【0251】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１は前記キットにおける単一のバイオマーカである。このキットは、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための物質以外に他のバイオマーカを検出する物質を含まない。

【0252】

ＩＶ．疾病治療のためのＳＡＧＥ１及びＳＡＧＥ１複合体の標的化
別の態様において、本開示は、ＳＡＧＥ１阻害薬、及びＳＡＧＥ１陽性疾患の処置におけるその利用である。

【0253】

本開示では、驚いたことに、ＳＡＧＥ１の発現及び／又は機能を阻害することでＳＡＧ
Ｅ１を発現する様々な腫瘍細胞の増幅、移動、足場非依存性成長等を大幅に抑えられる一方、ＳＡＧＥ１の発現が復活すると、細胞の腫瘍形成能が復活できることが分かり、腫瘍の処置としてＳＡＧＥ１阻害薬が使用できることを実証する。また、ＳＡＧＥ１は、様々な腫瘍組織で特異的に発現するが、精巣以外の正常な組織ではそのようなことはにない。ＳＡＧＥ１タンパク質は、通常、核に位置するが、このタンパク質のペプチド断片は、腫瘍の治療において標的の認識及び免疫活性化に利用可能な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって腫瘍細胞の表面に提示される。したがって、ＳＡＧＥ１標的治療は、特異性が高く、ＳＡＧＥ１発現がある正常な組織には影響しない。

【0254】

本明細書で使用する用語「ＳＡＧＥ１阻害薬」は、ＳＡＧＥ１のレベル又はＳＡＧＥ１を介する生物活性を抑制する薬剤である。例えば、ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１の発現及び／又は活性を部分的に阻害する、すなわち、抑制する、あるいはＳＡＧＥ１の発現及び／又は活性を完全に阻害する、すなわち、完全に排除することができ、これにはＳＡＧＥ１がＩＮＴＳ３に結合してＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体を形成する能力が含まれる。ＳＡＧＥ１のレベルを抑えることは、ＳＡＧＥ１遺伝子の転写を阻害し、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡのレベルを低下させる、又はＳＡＧＥ１タンパク質のレベルを低下させることで実現できる。ＳＡＧＥ１の生物活性を阻害することは、ＳＡＧＥ１が結合パートナーのうちの１以上と結合しないように、又はこれを活性化しないようにすることで実現できる。

【0255】

ＳＡＧＥ１阻害薬の種別は、阻害薬の適切な種別であればよい。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、核酸分子（例えば、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド）、ポリペプチド、化合物（例えば、化学化合物）、又はその抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、キメラ受容体でもＴ細胞受容体でもない。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１エピトープ又はＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープに結合するキメラ受容体でもＴ細胞受容体でもない。

【0256】

ｉ．核酸
実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、核酸分子を含む。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡもしくはＳＡＧＥ１遺伝子等のＳＡＧＥ１核酸を標的とするオリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドもしくは前記ポリヌクレオチドを含む核酸ベクターを含む。

【0257】

ＳＡＧＥ１核酸を標的とするオリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドの両方を含み得る。例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、及びその他オリゴマー化合物又はオリゴヌクレオチド類似体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0258】

オリゴヌクレオチドは、ＳＡＧＥ１核酸の適切な部分を標的とする。本明細書で使用する用語「部分」は、オリゴヌクレオチド又は核酸の所定数の連続ヌクレオチドを指す。当業者であれば、例えば、不所望なオフターゲット結合を抑制できるだけの特異的な配列となるよう、及び／又は、ＳＡＧＥ１核酸の二次又は三次構造にも関わらず、オリゴヌクレオチドに十分届くよう、ＳＡＧＥ１の適切な標的部分を決定できる。このために様々なツールがある。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、ＳＡＧＥ１核酸の配列をゲノム全体で他の配列と比較し、選択された標的核酸以外の配列に非特異的にハイブリダイズする可能性がある標的部分を選択しないようにすることができる（すなわち、非標的配列又はオフターゲット配列）。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１核酸の標的部分は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、もしくはそれ以上のヌクレオチドの長さがあるか、又はこれらのうち２つの長さで決まる範囲内の長さがある。

【0259】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１核酸は、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡである。ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの標的部分は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、イントロン、エクソンーイントロン連結、コード領域、翻訳開始領域、又は翻訳終了領域等のＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの構造上規定された領域に位置する場合がある。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの標的部分は、SEQ ID NO: 2のヌクレオチド266-366、866-1116、1316-1616、1916-2266、2466-2666、2782-2946間の配列内の６個以上の連続ヌクレオチド（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド）を含む。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの標的部分は、SEQ ID NO: 2のヌクレオチド282-310、333-351、 1076-1094、880-898、1933-1951、2148-2166、1471-1489、2493-2511、1331-1349、2215-2233、1559-1579、2799-2819間の配列からなる群から選択することができる。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの標的部分は、SEQ ID NOs: 11-67からなる群から選択された配列を含む。

【0260】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１核酸は、ＳＡＧＥ１ゲノムＤＮＡである。ＳＡＧＥ１ゲノムＤＮＡにおける標的部分は、ＳＡＧＥ１ゲノムＤＮＡの非コード領域又はコード領域に位置する場合がある。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１核酸は、ＳＡＧＥ１ゲノムの標的部分は、SEQ ID NOs: 68及び69から選択される配列を含む。

【0261】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）における標的部分と相補的な配列を含み、その発現又は機能を阻害する。オリゴヌクレオチドの配列とＳＡＧＥ１核酸の標的部分とは、１００％の相補性を必要としない場合がある。ある実施の形態では、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１核酸の標的部分に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の相補性を有する配列を含む。相補性のレベルは、オリゴヌクレオチドとＳＡＧＥ１標的核酸とのハイブリダイゼーションによって所望の効果が得られれば十分であると考えられる。所望の効果とは、標的核酸のｍＲＮＡレベルの低下、標的核酸にコードされたタンパク質のレベルの低下、又は標的核酸に関連する表現型の変化があるが、これらに限定されない。

【0262】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１核酸を標的とするオリゴヌクレオチドは、少なくとも８～８０、１０～８０、１２～５０、１５～３０、１８～２４、１９～２２、もしくは２０ヌクレオチド又は塩基対の長さがある。実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９又は８０ヌクレオチド又は塩基対の長さがあるか、又はこれらのうち２つの長さで決まる範囲内の長さがある。

【0263】

実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドを化学的に修飾できる。この修飾には、ヌクレオシド間結合、ヌクレオチドの糖成分、又はヌクレオチドの核酸塩基に対する置換又は変更も含まれる。修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、高められた細胞取り込み、
核酸標的に対する高められた親和性、ヌクレアーゼが存在する状態における高められた安定性、又は高められた阻害活性等の望ましい性質をもつことができる。化学的に修飾されたヌクレオチドを使用することで、その標的核酸に対する短縮又は欠失オリゴヌクレオチドの結合親和性を高めることもできる。

【0264】

ＲＮＡ及びＤＮＡの自然に生じるヌクレオシド間結合は、３’～５’端のホスホジエステル結合である。修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を保持するヌクレオシド間結合とリン原子を持たないヌクレオシド間結合とが含まれる。ヌクレオシド間結合を含む代表的なリンは、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、メチルホスホン酸、ホスホロアミド酸、及びホスホロチオエートがあるが、これらに限定されない。ヌクレオシド間結合を含む代表的なリン以外のものは、アミド骨格、モルホリノ骨格、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格があるが、これらに限定されない。リンを含む結合及びリンを含まない結合は、周知の方法で作製される。ある実施の形態では、ＳＡＧＥ１核酸を標的とするオリゴヌクレオチドは、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。

【0265】

本開示のオリゴヌクレオチドは、糖が修飾された１以上のヌクレオシドを含み得る。ある実施の形態では、ヌクレオシドは、化学的に修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学的に修飾されたリボフラノース環の例として、置換基（２’、３’、及び５’端の置換基を含む）を追加したもの、非ジェミナル環を架橋することによって二環式核酸の形成したもの、リボシル環酸素原子をＳ、Ｎ（Ｒ）、又はＣ（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ、Ｒ１、及びＲ２はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１－Ｃ２アルキル、又は保護基である）と置き換えたもの、及びこの組み合わせがあるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシルの代わりにシクロブチル等の糖類似体を有してもよい。

【0266】

核酸塩基（又は塩基）修飾又は置換は、自然に生じた核酸塩基と構造上、区別はできるが、機能上は取り替え可能である。本明細書で使用する「自然／天然」の核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が含まれる。天然核酸塩基も修飾核酸塩基も両方とも水素結合に加わることができる。このような核酸塩基修飾によって、アンチセンス化合物にはヌクレアーゼの安定性、結合親和性、その他生物学上有益な性質が与えられる場合がある。修飾核酸塩基には、例えば、イノシン、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン（例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ））、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、ゲントビオシルＨＭＣ、等の合成核酸塩基及び天然核酸塩基が含まれ、合成核酸塩基、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニン、又はその他ヘテロ置換型アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、２，６－ジアミノプリン、５－リボシルウラシル（Carlile (2014)
Nature 5 15 (7525): 143-6）が含まれる。

【0267】

１つのオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が一様に修飾される必要はなく、実際、前述の修飾の１以上は、単一のオリゴヌクレオチド、さらにはオリゴヌクレオチド内部の単一のヌクレオシドに組み込まれる場合がある。実施の形態によっては、核酸塩基も骨格も両方修飾されてよい。実施の形態によっては、糖もヌクレオシド間結合も両方修飾されてよい。実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドは、それぞれが少なくとも１ヌクレオチドからなる化学的に異なる２以上の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、１以上の有益な性質（例えば、高められたヌクレアーゼ耐性、高められた細胞取り込み、標的に対する高められた結合親和性等）をもたらす修飾ヌクレオチドの１以上の領域と、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断可能な酵素に対する基質となる領域と含む。このようなキメラオリゴヌク
レオチドは、この技術分野ではハイブリッド（hybrids）又はギャップマー（gapmers）とも呼ばれている。

【0268】

オリゴヌクレオチドは、得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを高める１以上の部分又は共役系に共有結合していてもよい。典型的な共役基は、コレステロール部分及び脂質部分を含む。その他の共役基は、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料等である。

【0269】

オリゴヌクレオチドも修飾可能で、これにより、一般にオリゴヌクレオチドの片方又は両方の末端に付加される１以上の安定化基を有し、例えばヌクレアーゼの安定性等、性質を向上させられる。これらの末端修飾は、エキソヌクレアーゼ分解からオリゴヌクレオチドを保護し、細胞内の輸送及び／又は局在化に役立つ。安定化基にはキャップ構造が含まれる。このキャップは、５’末端（５キャップ）、３’末端（３’キャップ）、又はこの両方の末端に存在できる。

【0270】

ｉｉ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、オリゴヌクレオチドである。実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的に結合し、転写、翻訳、又はスプライシングのレベルで発現を止めることで、当該標的の発現をブロックするように設計されている。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、厳格な条件のもとＳＡＧＥ１核酸にハイブリダイズするように設計されたアンチセンス核酸配列である。本明細書で使用する「厳格な条件」とは、配列がその標的配列にハイブリダイズするが、相補的でない他の配列にはハイブリダイズしないという条件を指す。厳格な条件は、配列によるものであり、各状況によって異なる。例えば、フラグメントが長いと、短いフラグメントよりも特異的ハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーション温度を高くする必要がある場合がある。ハイブリダイゼーションの厳格さには他の要因も影響するので、何か１つのパラメータの絶対尺度よりも相補鎖の長さ及び塩基組成、有機溶剤の存在、塩基のミスマッチの程度、パラメータの組み合わせを含めることが重要である。一般的に厳格な条件は、所定のイオン強度及びｐＨにおいて特異的配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。このように、著しいオフターゲット効果が生じないよう、すなわち、直接結合しないよう、発現レベルに直接強く作用しないよう、対象となる標的以外に転写しないように努めつつ、標的に十分相補的なオリゴヌクレオチド、すなわち、所望の効果が得られるように十分にハイブリダイズし、十分な特異性があるオリゴヌクレオチドが選ばれる。

【0271】

アンチセンスオリゴヌクレオチドの最適な長さは様々（例えば、１２～１８個のヌクレオチドの長さ）であるが、その標的配列はトランスクリプトームにおいてユニークである（Seth (2009) J Med Chem 52: 10-13）。実施の形態によっては、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドには、本明細書に記載の１以上の修飾が含まれる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、修飾糖は、二環性の糖又は２’－Ｏ－目時氏エチルであり、修飾核酸塩基は、５－メチルシトシンである。別の例として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、結合デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、結合ヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、結合ヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントとを含むギャップマーであり、ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間で直接隣接するように位置づけられ、各ウィングセグメントのヌクレオシドは修飾糖を含む。

【0272】

ｉｉｉ．干渉オリゴヌクレオチド
実施の形態によっては、オリゴヌクレオチドは、二本鎖干渉オリゴヌクレオチドであり、低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）又は短ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）が含まれるが、これに限定されない。二本鎖干渉オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制又は分解が可能である。

【0273】

干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、２つの別々のオリゴヌクレオチドをまとめて作られることが可能であり、その場合、１本の鎖がセンス鎖でもう１本の鎖がアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖及びセンス鎖は自己相補的で二重鎖又は二本鎖構造を形成する。アンチセンス鎖は、標的核酸分子の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列の少なくとも一部に対応するヌクレオチド配列を含む。実施の形態によっては、前記二重鎖構造は、約１５～約３０個、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の塩基対である。実施の形態によっては、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖に３’オーバーハング（例えば、ｄＴｄＴ等のダブレット）を有する。実施の形態によっては、前記ｓｉＲＮＡは、SEQ ID NOs: 70/71、72/73、74/75、76/77、78/79、80/81からなる群から選択される３’ｄＴｄＴオーバーハングを備えた、又は備えていないセンスＲＮＡ鎖／アンチセンスＲＮＡ鎖のペアを含む。

【0274】

あるいは、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、単一のオリゴヌクレオチドであることが可能であり、その場合、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域は核酸ベース又は非核酸ベースのリンカーによって結合する。実施の形態によっては、前記干渉ＲＮＡは、センス領域、アンチセンス領域、及びループ領域を有するｓｈＲＮＡである。ループ領域は、一般に、約２ヌクレオチド～約１０ヌクレオチドの長さである。実施の形態によっては、前記ループ領域は、約６ヌクレオチド～約９ヌクレオチドの長さである。実施の形態によっては、前記センス領域及び前記アンチセンス領域は、約１５ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド）の長さである。転写後プロセスの後、ｓｈＲＮＡは、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）酵素による切断事象により、ｓｉＲＮＡに変換される。

【0275】

ｓｉＲＮＡがガイドする標的ＲＮＡ切断反応は、配列特異性が高い。一般に、標的核酸の一部と同一のヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡが阻害するには好ましい。しかしながら、本発明を実施するにあたり、ｓｉＲＮＡと標的遺伝子との配列同一性が１００％である必要はない。したがって、本発明は、遺伝子の変異、鎖の多型性、又は進化的分岐によって予想される配列の多様性を許容できるという効果を有する。例えば、標的配列と比較して、挿入、欠失、及び単一点突然変異があるｓｉＲＮＡ配列でも阻害効果があることが分かっている。

【0276】

実施の形態によっては、本開示において有用なｓｈＲＮＡは、SEQ ID NOs: 82-95及び106-145からなる群から選択された配列を含む。

【0277】

実施の形態によっては、前記二本鎖干渉オリゴヌクレオチドには、本明細書に記載の１以上の修飾が含まれる。実施の形態によっては、前記二本鎖干渉オリゴヌクレオチドとしては、ＲＮＡのみを含む分子に限定されず、化学的に修飾されたヌクレオチドも包含される。例えば、両鎖全体がリボヌクレオチドからなるか、一本の鎖全体がリボヌクレオチドからなり、一本の鎖全体がデオキシリボヌクレオチドからなるか、片方又は両方の鎖がリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含む。

【0278】

ｉｖ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集システムは、典型的には、非特異ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓ９））及びガイドＲＮＡを含むものであって、多種多様な有機体及び細胞タイプにおいて効率的なゲノム編集を可能にする（Doudna & Charpentier, Science 346, 1258096 (2014)）。このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集システムを使用して、ＳＡＧＥ１の出現を阻害することもできる。実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドは、ガイドＲＮＡである。用語「ｓｇＲＮＡ」及び「ガイドＲＮＡ」は、本明細書において同義に用いており、Ｃａｓ９結合に必要な「足場（scaffold)」配列と、標的ゲノムＤＮＡの少なくとも一部と相補的な、ユーザ規定のヌクレオチド「スペーサ（spacer）」又は「ターゲッティング（targeting）」又は「ガイド（guide）」配列とを含む短いＲＮＡを指す。本明細書における用語「ガイド配列」にも対応するＤＮＡ又はＲＮＡガイド配列をコードするＤＮＡが含まれる。Ｃａｓ９による標的部位の認識は、ガイドＲＮＡのガイド配列及び隣接する短いＰＡＭの認識の両方によってプログラムされている。ガイドＲＮＡは、この技術分野において周知の標準的なツールを使って設計できる。

【0279】

Ｃａｓ９のゲノム標的は、ガイドＲＮＡに存在するガイド配列を変更することで変更できる。ガイドＲＮＡ配列のガイド配列は、遺伝子座の内部にあっても外部にあってもよい。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、かつ標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するよう、標的ポリヌクレオチド配列と十分に相補的なポリヌクレオチド配列であればよい。実施の形態によっては、ガイド配列とこれに対応する標的配列との相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９７．５％、９９％、又はそれ以上である。実施の形態によっては、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド又はそれ以上の長さである。実施の形態によっては、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド又はそれ以下の長さである。

【0280】

実施の形態によっては、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減させるように選択される。二次構造は、ポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムのうち適切なもので決定されるとよい。プログラムによっては、ギブスの自由エネルギーの算出に基づくものもある。このような一アルゴリズムの例として、ｍＦｏＩｄがあり、これはZuker及びStieglerによって説明されている（Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148）。別のフォールディングアルゴリズムとしては、ウィーン大学の理論化学学会（Institute for Theoretical Chemistry at the University of Vienna）がセントロイド構造予測アルゴリズムを用いて開発したオンラインウェブサーバＲＮＡｆｏｉｄがある（例えば、A.R. Gruberら、2008, Cell 106 (1) : 23-24及びPA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27 (12): 1151-62を参照されたい）。

【0281】

実施の形態によっては、前記ガイド配列は、SEQ ID NO: 68及び69からなる群から選択された配列を含むＳＡＧＥ１ゲノムの一部と相補的である。実施の形態によっては、前記ガイドＲＮＡは、SEQ ID NOs: 146及び147からなる群から選択された配列を含む。

【0282】

ｖ．ＳＡＧＥ１複合体阻害薬
実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１複合体阻害薬を含む。

【0283】

本明細書で使用する用語「ＳＡＧＥ１複合体阻害薬」は、ＳＡＧＥ１複合体のレベル又は活性を低下させることができる。例えば、ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１複合体の形成を阻害したり、ＳＡＧＥ１複合体を不活性化したり、ＳＡＧＥ１複合体の生物活性を低下させたりする。ＳＡＧＥ１複合体（例えば、ＳＡＧＥ１―ＩＮＴＳ３複合体）の
生物活性には、ＤＮＡ（例えば、典型的にインテグレータによって結び付けられた遺伝子のプロモータ近位領域）へのＳＡＧＥ１複合体の結合及び遺伝子の転写の制御が含まれるが、これに限定されない。

【0284】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１複合体の形成を阻害する。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１複合体を不活性化する。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１複合体の生物活性を低下させる。

【0285】

本開示では、様々なＳＡＧＥ１複合体を用意した。ＳＡＧＥ１と他の結合パートナーとのタンパク質間相互作用は、例えば、免疫沈降法（例えば、Hamilton B. J.ら、Biochem.
Biophys. Res. Commun. 1999, 261: 646-51を参照されたい）を用いて特定し、検査できる。ＳＡＧＥ１は、抗ＳＡＧＥ１抗体を用いてＳＡＧＥ１発現細胞株から免疫沈降させることができる。あるいは、ＳＡＧＥ１とＨｉｓタグとの融合を発現するように操作された細胞株にＨｉｓタグ抗体を用いることができる。免疫沈降複合体は、ウェスタンブロッティング（Western blotting）、タンパク質の３５Ｓ－メチオニンの標識化、タンパク質のマイクロシーケンシング、銀染色、及び２次元ゲル電気泳動等の処置によって、タンパク質会合に関して検査され得る。

【0286】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＩＮＴＳ３、ＩＮＩＰ（UniProt Accession: Q9NRY2）、ＮＡＢＰ１／２（UniProt Accession: Q96AH0、Q9BQ15）、ＣＲＥＢＢＰ（UniProt Accession: Q92793）、ＴＬＥ１（UniProt Accession: Q04724）、ＴＬＥ２（UniProt Accession: Q04725）、ＴＬＥ３（UniProt Accession: Q04726）、ＴＬＥ４（UniProt Accession: Q04727）、ＴＬＥ５（UniProt Accession: Q08117）、ＧＧＡ３（UniProt Accession: Q9NZ52）、ＣＮＯＴ１（UniProt Accession: A5YKK6）、ＴＡＸ１ＢＰ１（UniProt Accession: Q86VP1）、ＳＥＣ１６Ａ（UniProt Accession: O15027）、ＣＹＬＤ（UniProt Accession: Q9NQC7）、及びＰＡＸＢＰ１（UniProt Accession: Q9Y5B6）からなる群から選択される少なくとも１種の成分と複合したＳＡＧＥ１を含む。この少なくとも１種の成分とＳＡＧＥ１とが形成する複合体を阻害する阻害薬であれば、本明細書で検討している阻害薬であるものとする。

【0287】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体は、ＩＮＴＳ３と複合したＳＡＧＥ１を含む。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との相互作用を阻害することでＳＡＧＥ１複合体のレベルを低下させる。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１がＩＮＴＳ３に結合するのを阻害する。

【0288】

本開示では、驚いたことに、腫瘍細胞のＳＡＧＥ１複合体を阻害することで腫瘍の成長を抑制でき、腫瘍細胞の増殖は、外因性野生型ＳＡＧＥ１の発現によって復活することがあるが、残基がＩＮＴＳ３との相互作用に関与していると推定的される変異ＳＡＧＥ１の発現では復活しないことが分かった。また、本開示では、ＳＡＧＥ１発現の抑制に応じた遺伝子の差次的発現は、ＩＮＴＳ３の抑制と一致することも分かった。これらの研究結果から、ＳＡＧＥ１は機能するためにＩＮＴＳ３と複合体を形成できることが分かり、ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との相互作用を妨げたり、ＳＡＧＥ１陽性細胞のＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の量が減少させたりすることがＳＡＧＥ１陽性細胞の処置には有用となり得ることが実証された。

【0289】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１と複合する前記成分（例えば、ＩＮＴＳ３）とＳＡＧＥ１との相互作用を妨げる。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との相互作用を妨げる。この妨
害は、ＩＮＴＳ３との相互作用に関わっているＳＡＧＥ１タンパク質のアミノ酸残基をブロックすることによって行われてもよい。本明細書で使用するＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体とは、概して、タンパク質間相互作用によってＳＡＧＥ１（又はそのフラグメント）とＩＮＴＳ３（又はそのフラグメント）との間で形成される複合体を指す。ＩＮＴＳ３は、典型的には量体を形成するものでよく、形成された量体がさらにＳＡＧＥ１とＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体を形成する場合もある。ＳＡＧＥ１のＣ末端フラグメント（SEQ ID
NO: 3の残基８１８－９０４）及びＩＮＴＳ３のＣ末端フラグメント（SEQ ID NO: 5の残基５７２－９７８）を含む複合体の結晶構造によると、ＩＮＴＳ３との結合界面におけるＳＡＧＥ１のアミノ酸残基には、Ｆ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｍ８３２、Ｖ８７６、Ｒ８７２、Ｋ８２８、Ｒ８３６、及びＱ８４０（SEQ ID NO: 3に従ってナンバリングされた残基）からなる群から選択される少なくとも１以上の残基が含まれ得る。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＩＮＴＳ３に結合する、あるいはＩＮＴＳ３がＳＡＧＥ１のＦ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｍ８３２、Ｖ８７６、Ｒ８７２、Ｋ８２８、Ｒ８３６、及びＱ８４０から選択される少なくとも１以上の残基に結合しないようにする。例えば、ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１の結合界面にある残基の少なくとも１以上と結合しようとＩＮＴＳ３と競い合ったり、ＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３の配座をアロステリックに変更することでＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との結合を弱めたり、解消するような形でＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３と結合する。

【0290】

ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、適切なタイプの阻害薬であればよく、例えば、核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド）、ポリペプチド、化合物（例えば、化学化合物）、又はその抗体もしくは抗原結合フラグメントである。

【0291】

ａ）化合物
実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１複合体（例えば、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体）の形成を阻害できる化合物を含む。化合物は、この技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ（combinatorial library）法における多数のアプローチのうちのいずれかを用いて得ることができ、例えば、空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリ、デコンボリューションを必要とするシンセティックライブラリ法、「ＯＢＯＣ（one-bead one-compound）」ライブラリ法、及び親和性クロマトグラフィセレクションを用いたシンセティックライブラリ法等のアプローチがある（Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145）。

【0292】

本開示の目的に適合する化合物は、ＳＡＧＥ１のアクティブ結合部位又はアロステリック結合部位に結合できるものである。アクティブ結合部位は、その形状及び帯電電位によってＳＡＧＥ１複合体の別の成分（例えばＩＮＴＳ３）と様々な共有結合力及び／又は非共有結合力を介して好適に相互作用するＳＡＧＥ１の領域を指す。アロステリック結合部位は、モジュレータによって、ＳＡＧＥ１の配座を変更してＳＡＧＥ１の活性に作用する、アクティブ結合部位以外のＳＡＧＥ１の領域を指す。実施の形態によっては、化合物は、ＳＡＧＥ１のアクティブ結合部位に結合しようとＩＮＴＳ３と競い合う。例えば、化合物は、ＳＡＧＥ１に結合したＩＮＴＳ３タンパク質又はそのフラグメントの位置を変更でき、ＳＡＧＥ１複合体を分解し、その活性の阻害する。実施の形態によっては、前記化合物は、ＳＡＧＥ１のアロステリック結合部位に結合し、ＩＮＴＳ３と競い合わない。

【0293】

化合物は、本明細書に開示した細胞ベース又は非細胞ベースのアッセイでスクリーニングすることができる。本明細書に開示した方法によって化合物をバーチャルスクリーニングすることもできる。実施の形態によっては、リード化合物は最初に同定され、ＳＡＧＥ１に結合するために必要なリード化合物のファルマコフォアを次に決定する。その後、リード化合物と同じファルマコフォアでありながらもより優れた薬理学的特性を示す一連の候補化合物を生成し、設計し、選択するため、コンピュータモデリングを行ってもよい。
化合物のスクリーニングはプール単位（例えば、検査サンプルごとに複数の化合物）で行うことも、個別の化合物単位で行うこともできる。

【0294】

ｂ）抗ＳＡＧＥ１抗体
実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、抗体又はそのフラグメントを含む。

【0295】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、抗体又はそのフラグメントを含み、当該抗体又フラグメントは、（ａ）ＳＡＧＥ１に特異的に結合する、（ｂ）ＳＡＧＥ１と複合する成分（例えば、ＩＮＴＳ３）に特異的に結合する、又は（ｃ）前記ＳＡＧＥ１複合体に特異的に結合するが、ＳＡＧＥ１にもＳＡＧＥ１と複合する成分にも結合しない。

【0296】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、抗体又はそのフラグメントを含み、当該抗体又フラグメントは、ＩＮＴＳ３と相互作用する場合があるＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１のフラグメントに特異的に結合でき、これによってＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３と相互作用をブロックする。

【0297】

ＳＡＧＥ１タンパク質又はＩＮＴＳ３と相互作用するＳＡＧＥ１のフラグメント（例えば、SEQ ID NO: 3の残基８１８－９０４）は、免疫原として使用でき、この技術分野で周知の方法に従って、多クローン性及びの単クローン性の抗体を調製する標準的な技術を用いて当該免疫原に結合する抗体を生成する。抗原ペプチドは、典型的には、少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対する抗体が各全長分子と特異的免疫複合体を形成するよう、各全長分子に存在するエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む。ある実施の形態では、このような抗原ペプチドは、マウス又はヒト等の１種（species）の任意のポリペプチド分子に特異的であり得る。

【0298】

さらに、ヒトの部分及びヒト以外の部分の両方を含み、標準的なＤＮＡ組み換え技術で作製可能なキメラ化モノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体等の組み換えポリペプチド抗体が本発明の範囲内に含まれる。ＳＡＧＥ１タンパク質又はそのフラグメントに対して作製された完全ヒト抗体も本発明の範囲内に含まれる。完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の定常領域が導入されたマウスを用いて作製でき、標的抗体は、抗体産生リンパ球をマウスから分離してハイブリドーマにすることにより、量産可能である。また、ヒト抗体遺伝子を取り込み、ファージのコートタンパク質と融合した形でヒト抗体をその表面に示すファージを使ったファージディスプレイ（phage display）法によっても作製できる。

【0299】

実施の形態によっては、本開示の抗体又は抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、組み換え抗体、標識抗体、２価抗体、抗イディオタイプ抗体、二量体・多量体抗体、又は修飾抗体（例えば、グリコシル化抗体）である。実施の形態によっては、本開示の抗体又は抗原結合フラグメントは、ダイアボディ（diabody）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（２価ダイアボディ）、二重特異性ｓｃＦｖ二量体、多特異性抗体、重鎖抗体、、ラクダ化シングルドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、又は２価ドメイン抗体である。

【0300】

ｃ）阻害ポリペプチド
実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ポリペプチドを含む。本開示において有用なポリペプチドには、ＳＡＧＥ１と複合する成分（例えば、ＩＮＴＳ３）に結合できるＳＡＧＥ１のフラグメント、変異体、もしくは誘導体であるポリペプチド、又はＳＡＧＥ１に結合できる、ＳＡＧＥ１と複合する当該成分（例えば、ＩＮＴＳ３）のフラグメント、変異体、もしくは誘導体であるポリペプチドが含まれるが、完成した複合体は、遺伝子転写制御においてＳＡＧＥ１複合体（例えば、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体）の活性を欠く。

【0301】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＩＮＴＳ３のＳＡＧＥ１結合フラグメント又はその変異体もしくは誘導体を含む。ＩＮＴＳ３のポリペプチドフラグメントは、ＳＡＧＥ１に結合し、ＩＮＴＳ３へのＳＡＧＥ１の結合に干渉する。用語「変異体」は、天然に生じるポリペプチドと比べ、１個以上のアミノ酸残基が変更又は修飾されているポリペプチドを指す。変異ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＩＮＴＳ３又はＩＮＴＳ３のフラグメントのアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は１００％一致してよい。ＩＮＴＳ３の典型的なアミノ酸配列はSEQ ID NO:5に示されている。実施の形態によっては、前記ＩＮＴＳ３のポリペプチドフラグメントは、ＩＮＴＳ３のＣ末端フラグメントを含む。ＩＮＴＳ３のＣ末端フラグメントは、Ｃ末端から数えて最後の少なくとも５００、４００、３００、２５０、２００、もしくは１５０個の残基、又はＣ末端から５００～１００、４００～１００、３００～１００、２００～１００、５００～５０、４００～５０、３００～５０、又は２００～５０個の残基を含んでよい。実施の形態によっては、前記ＩＮＴＳ３のＣ末端ＳＡＧＥ１結合フラグメントは、ＳＡＧＥ１に結合可能なSEQ ID NO:9のアミノ酸配列（すなわち、SEQ ID NO:5の残基５７２～９７８）又はその変異体もしくはフラグメントを含む。

【0302】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１のＩＮＴＳ３結合フラグメント又はその変異体もしくは誘導体を含む。ＳＡＧＥ１のポリペプチドフラグメントは、ＩＮＴＳ３に結合し、ＩＮＴＳ３へのＳＡＧＥ１の結合に干渉する。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１のＩＮＴＳ３結合フラグメントは、ＳＡＧＥ１のＣ末端フラグメントを含む。ＳＡＧＥ１のＣ末端フラグメントは、Ｃ末端から数えて最後の１００、９０、８０、７０、６０、又は５０個の残基を含んでよい。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１のＣ末端フラグメントは、SEQ ID NO: 3の残基８１８～９０４を含む。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体阻害薬は、ＳＡＧＥ１に結合可能なSEQ ID NO: 8の配列（すなわち、SEQ ID NO:3の残基８１８～９０４）を有するポリペプチド又はその変異体もしくはフラグメントを含む。

【0303】

本開示において有用なポリペプチドは、ＩＮＴＳ６もしくはＩＮＴＳ６ＬのＩＮＴＳ３結合フラグメント又はその変異体もしくは誘導体も含む。このＩＮＴＳ６もしくはＩＮＴＳ６ＬのＩＮＴＳ３結合フラグメントは、ＳＡＧＥ１と競い合ってＩＮＴＳ３と結合することができ、これによってＩＮＴＳ３へのＳＡＧＥ１の結合をブロックする。実施の形態によっては、前記ＩＮＴＳ６もしくはＩＮＴＳ６ＬのＳＡＧＥ１結合フラグメントは、ＩＮＴＳ３に結合可能なSEQ ID NO: 10（例えば、ＩＮＴＳ６のSEQ ID NO:6の残基８０３～８８７）、SEQ ID NO:104（例えば、ＩＮＴＳ６のSEQ ID NO:6の残基７８６～８８７）、又はSEQ ID NO:105（例えば、ＩＮＴＳ６ＬのSEQ ID NO:7の残基７５９～８６１）のアミノ酸配列又はその変異体（例えば、少なくとも５０％の配列同一性を有する）もしくはフラグメントを含む。

【0304】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との相互作用を妨げる又は競合的に阻害することができる前記ポリペプチドフラグメントは、前記フラグメントとは異種の第２ポリペプチドに融合され、融合ポリペプチドを形成する。第２ポリペプチド、例えば、免疫グロブリンの定常領域又はヒト血清アルブミン結合部分は、第１ポリペプチドの溶解度
、親和性、安定性、又は価数を変更したり、融合ポリペプチドの発現、分泌、又は精製を容易にしたりする。

【0305】

ｖｉ．タンパク質分解誘導キメラ分子（Ｐｒｏｔａｃ）
本開示は、さらに、ユビキチン経路タンパク質に結合可能な第１部分と、ＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体に結合可能な第２部分とを含む二官能性分子を含むＳＡＧＥ１阻害薬（及びＳＡＧＥ１複合体阻害薬）も検討している。二官能性分子は、ＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体をユビキチン経路付近に置くことでＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体を分解させることができる。

【0306】

実施の形態によっては、前記二官能性分子は、ユビキチン経路でＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体の分解を促進するタンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）を含む。ＰＲＯＴＡＣは、２６Ｓプロテアソームが後で分解する注目タンパク質のユビキチン化に用いられるＥ３ユビキチンリガーゼの活性をハイジャックすることで注目タンパク質の分解を誘導する（詳細は、例えば、Wang Y, Acta Pharmaceutica Sinica B 2020;10 (2):207-238で確認できる）。

【0307】

ユビキチン経路タンパク質結合部分には、Ｅ３リガーゼと結合する任意の分子が含まれていてよい。ＰＲＯＴＡＣ等の二官能性分子の成長に適するＥ３リガーゼの例として、フォン・ヒッペル－リンドウ（ＶＨＬ）、セレブロン、ＭＤＭ２（Ｍｏｕｓｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ ２）、ｂｅｔａ－ＴｒＣＰ１、アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）Ｅ３リガーゼ、ＴＲＩＭ２１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１９４７４（ＲＯ５２＿ＨＵＭＡＮ））、後期促進複合体（ＡＰＣ）、ＵＢＲ５（ＥＤＤ１）、ＳＯＣＳ／ＢＣ－ｂｏｘ／ｅｌｏＢＣ／ＣＵＬ５／ＲＩＮＧ、ＬＮＸｐ８０、ＣＢＸ４、ＣＢＬＬ１、ＨＡＣＥ１、ＨＥＣＴＤ１、ＨＥＣＴＤ２、ＨＥＣＴＤ３、ＨＥＣＷ１、ＨＥＣＷ２、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＵＷＥ１、ＩＴＣＨ、ＮＥＤＤ４、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＰＰＩＬ２、ＰＲＰＦ１９、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ２、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳ４、ＲＡＮＢＰ２、ＲＮＦ４、ＲＢＸ１、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＴＵＢ１、ＴＯＰＯＲＳ、ＴＲＩＰ１２、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ５、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、Ｐａｒｋｉｎ、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＭＦＲ／ｇｐ７８、ＡＲＡ５４、ｂｅｔａ－ＴｒＣＰ１／ＢＴＲＣ、ＢＲＣＡ１、ＣＢＬ、ＣＨＩＰ／ＳＴＵＢ１、Ｅ６、Ｅ６ＡＰ／ＵＢＥ３Ａ、Ｆ－ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ
１５／ＦＢＸＯ１５、ＦＢＸＷ７／Ｃｄｃ４、ＧＲＡＩＬ／ＲＮＦ１２８、ＨＯＩＰ／ＲＮＦ３１、ｃＩＡＰ－１／ＨＩＡＰ－２、ｃＩＡＰ－２／ＨＩＡＰ－１、ｃＩＡＰ（ｐａｎ）、ＩＴＣＨ／ＡＩＰ４、ＫＡＰ１、ＭＡＲＣＨ８、Ｍｉｎｄ Ｂｏｍｂ １／ＭＩＢ１、Ｍｉｎｄ Ｂｏｍｂ ２／ＭＩＢ２、ＭｕＲＦ１／ＴＲＩＭ６３、ＮＤＦＩＰ１、ＮＥＤＤ４、ＮｌｅＬ、Ｐａｒｋｉｎ、ＲＮＦ２、ＲＮＦ４、ＲＮＦ８、ＲＮＦ１６８、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ１、Ｓｋｐ２、ＳＭＵＲＦ２、ＴＲＡＦ－１、ＴＲＡＦ－２、ＴＲＡＦ－３、ＴＲＡＦ－４、ＴＲＡＦ－５、ＴＲＡＦ－６、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ３２、ＵＢＲ５、及びＺＮＲＦ３があるが、これに限定されない。

【0308】

例として、ＶＨＬは、革新的な治療可能性を有するＥ３リガーゼの１つである。ＶＨＬは、エロンギン（elongin）Ｂ及びＣ、Ｃｕｌ２、ならびにＲｂｘ１からなるＥ３リガーゼ複合体ＶＣＢの基質認識サブユニットである。

【0309】

別の例として、セレブロンは、ヒトにおいてＣＲＢＮ遺伝子がコードするタンパク質である。セレブロンは、損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）、カリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、及びカリン１（ＲＯＣ１）の調節因子とＥ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成する。この複合体は、多数の他のタンパク質をユビキチン化する。

【0310】

化合物の２つの部分は、直接又は化学リンカーを介してつながることができる。リンカーは、切断可能なリンカーでも切断不可能なリンカーでもよい。リンカーはある程度の柔軟性があるものが好ましいため、様々な長さのＰＥＧ及び（不）飽和アルカン鎖がよく用いられる。実施の形態によっては、前記リンカーは、例えば、アミド、エステル、チオエステル、ケト、カルバメート（ウレタン）、炭素、又はエステル基を介して前記２つの部分に独立して共有結合しており、ユビキチンリガーゼのユビキチン経路タンパク質結合部分と、分解されるＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体におけるＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体結合部分とを最も強く結合するため、各基は前記２つの部分のどこに挿入されてもよい。

【0311】

ある実施の形態では、本明細書に記載の化合物は、複数のユビキチン経路タンパク質結合部分、複数のＳＡＧＥ１もしくはＳＡＧＥ１複合体結合部分、複数のリンカー、又はこれらの組み合わせを含む。

【0312】

二官能性分子は、この技術分野で公知の方法で設計かつ作製され、詳細は、例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ２０１７２０１４４９Ａ１、米国特許出願ＵＳ１０，５８４，１０１、ＵＳ１０，０７１，１６４、米国特許出願ＵＳ２０１８０１４７２０２、Ishida T, Ciulli A. E3 Ligase Ligands for PROTACs、How They Were Found and How to Discover New
Ones、SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. November 2020. doi: 10.1177/2472555220965528, Wang, Y.ら、Degradation of proteins by PROTACs and
other strategies, Acta Pharmaceutica Sinica B, Volume 10, Issue 2, 2020, Pages 207-238で確認でき、これらは全体として本明細書に組み込まれる。

【0313】

Ｖ．医薬組成物及び組み合わせ
別の態様において、本開示の医薬組成物は、本明細書に記載のＳＡＧＥ１阻害薬を含む。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１複合体阻害薬である。用語「医薬組成物」は、被験者への投与に適合する型の本開示のＳＡＧＥ１阻害薬を含む製剤を指す。この組成物は、腫瘍の処置及び／又はＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３の発現レベルの調節に使用できる。

【0314】

実施の形態によっては、前記医薬組成物は、薬学上許容される賦形剤をさらに含む。用語「薬学上許容される賦形剤」は、全般的に安全で、毒性がなく、生物学上もその他の点でも被験者に対して望ましい医薬組成物を調製する際に有用な賦形剤を意味する。実施の形態によっては、薬学上許容される前記賦形剤は、薬学上許容されるキャリア及び／又は薬学上許容される希釈剤を含む。適切な賦形剤には、例えば、酸化防止剤、フィラー、バインダー、崩壊剤、バッファ、防腐剤、潤滑剤、香料、増粘剤、着色料、乳化剤、安定剤等が含まれてよい。

【0315】

医薬組成物は、通常、予定の投与経路に適合するように構成される。使用する特定の賦形剤は、本開示の化合物が適用される手段及び目的によって変わる。溶剤は、一般に、ヒトを含む哺乳類に投与しても安全であると当業者が認識する溶剤に基づいて選択される。一般に、安全な溶剤とは、水等の毒性のない水性溶剤及び毒性のないその他水溶性又は水混和性溶剤である。適切な水性溶剤には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００）等及びこれらの混合物が含まれる。

【0316】

実施の形態によっては、適切な賦形剤には、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他有機酸等のバッファ、アルコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノールアルコール、ブチルアルコール、ベンジルアルコール、メ
チルパラベンもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール等）、低分子量（残基が１０個未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン等のアミノ酸、単糖、二糖、その他グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、ならびに／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン界面活性剤が含まれ得る。

【0317】

実施の形態によっては、適切な賦形剤には、１以上の安定剤、界面活性剤、湿潤剤、潤滑剤、乳化剤、懸濁剤、保存料、酸化防止剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色料、甘味料、香料、香味料、及びその他の公知の添加物が含まれていてよく、これによって薬（すなわち、本開示の化合物又はその医薬組成物）の提供形態が洗練されたり、医薬製品（すなわち、薬剤）の製造が助けられる。原薬は、例えば、液滴形成法又は界面重合によって調製したマイクロカプセルに封入してもよく、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルションにおけるヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入してもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。リポソームは、ヒトを含む哺乳類への薬（本明細書に開示する化合物と場合によっては化学療法剤等）の送達に有用な様々な種類の脂質、リン脂質、及び／又は、界面活性剤からなる小胞である。リポソームの成分は、生体膜の脂質組成と同様、二重層に並べられることが多い。

【0318】

本明細書に記載する医薬組成物は、ヒトに限定されないが、ヒトを含む被験者に投与される組成物が取り得る形態であればよく、予定の投与経路に適合するように構成される。投与経路の例としては、非経口（皮下、静脈注射、筋肉、及び腹腔）、経口、直腸、皮膚、経皮、胸腔、肺内、及び鼻腔（呼吸器官）の経路がある。医薬組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ピル、カプセル、錠剤、徐放性製剤、又は粉末剤であり得る。

【0319】

本明細書に記載の医薬組成物については様々な経路が考えられるので、予定の投与経路次第で本明細書に記載の医薬組成物をまとめて供給してもよいし、投与量単位で供給してもよい。例えば、経口投与、口腔投与、及び舌下投与では、粉末剤、懸濁液、顆粒、錠剤、ピル、カプセル、ジェルキャップ、及びカプレットが固形での投薬形態として可能であり、乳濁液、シロップ、エリキシル剤、懸濁液、及び溶液が液体での投薬形態として可能である。注射による投与では、乳濁液及び懸濁液が液体での投薬形態として可能であり、適切な溶液と再構成させられる粉末が固形での投薬形態として可能である。吸入投与では、溶液、スプレー、乾燥粉末、及びエアロゾルが投薬形態として可能である。局所（口腔及び舌下等）投与又は経皮投与では、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、溶液、及びパッチが投薬形態として可能である。膣内投与では、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、スプレーが投薬形態として可能である。適切な医薬組成物を製剤する方法は、この技術分野で公知のものであり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005を参照されたい。

【0320】

実施の形態では、医薬組成物を注射可能な組成物に製剤する。注射可能な医薬組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、又は溶液、懸濁液、もしくは乳濁液の生成に適した固形等、従来の任意の形態に調製してよい。注射用の調合液には、そのまま注射できる減菌溶液及び／又は非発熱性溶液、皮下錠剤を含む凍結乾燥粉末等の溶剤と混ぜて使う滅菌乾
燥済みの可溶性製品、そのまま注射できる減菌懸濁液、賦形剤と混ぜて使う不溶性の滅菌乾燥製品、ならびに滅菌及び／又は非発熱性乳濁液が含まれる場合がある。溶液は水溶液でも非水溶液でもよい。

【0321】

ある実施の形態では、投与量単位の非経口製剤をアンプル、バイアル、又は針付き注射器にパッケージングする。この技術分野で知られていて実際に行われているように、非経口投与されるすべての調剤は滅菌され、発熱性はないものする。ある実施の形態では、本明細書に開示したポリペプチド複合体を適切な溶剤に溶かすことで、滅菌された凍結乾燥粉末を調製する。凍結乾燥粉末を注射用の水で戻すと非経口投与用の製剤なる。ある実施の形態では、戻すために、滅菌及び／又は非発熱性の水、又はその他適切な液体のキャリアを凍結乾燥粉末に加える。正確な分量は、選択された治療によって異なり、経験的に決定できる。

【0322】

実施の形態によっては、本開示の医薬組成物は、短時間作用型、速放性、長時間作用型、及び徐放性のものとして製剤できる。したがって、本開示の医薬組成物は、制御放出性又は持続放出性のものに製剤されてもよい。実施の形態によっては、核酸であるＳＡＧＥ１阻害薬又は核酸を含むＳＡＧＥ１阻害薬を含む前記医薬組成物は、核酸剤の投与に適した任意の方法で投与できる。これらの方法には、例えば、遺伝子銃、バイオ注射器、及び皮膚パッチが含まれる。

【0323】

医薬組成物は、投与の指示書とともに容器、パック、又はディスペンサに含ませることができる。

【0324】

ある実施の形態では、本明細書に記載のＳＡＧＥ１阻害薬は、腫瘍処置に使用される他の任意の治療薬と組み合わせて投与してよい。本明細書で使用する用語「組み合わせて投与する」には、同じ医薬組成物の一部として同時に投与すること、別々の組成物として同時に投与すること、又は別々の組成物として異なるタイミングで投与することが含まれる。医薬組成物が別の薬剤の前後に投与される場合、その組成物と別の薬剤とが別の経路で投与されたとしても、本明細書で言うところの当該薬剤と「組み合わせて」投与されることになる。本明細書に記載のＳＡＧＥ１阻害薬とその他の治療薬とは、同時期に被験者に効力を及ぼす場合に時間が合っていてもずれていても投与が可能である。可能であれば、本明細書に記載のＳＡＧＥ１阻害薬と組み合わせて投与される別の治療薬は、その治療薬の製品情報に記載されたスケジュール、Physicians' Desk Reference (Physicians' Desk
Reference, 70th Ed (2016))、又はこの技術分野で公知のプロトコルに従って投与する。

【0325】

ＶＩ．細胞治療
ｉ．操作免疫細胞
本開示では、キメラ受容体を発現するように操作された免疫細胞も検討しており、これらをＳＡＧＥ１陽性腫瘍に向かわせる。腫瘍細胞に対する特異性は、ＳＡＧＥ１のエピトープ又はＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープに対する結合特異性をもたらす受容体の抗体結合ドメインに基づく。

【0326】

本明細書で使用する「ＭＨＣ」は、細胞表面にみられ、細胞内から免疫細胞（Ｔ細胞等）にタンパク質のフラグメントを提示する主要組織適合遺伝子複合体分子を指す。実施の形態によっては、前記ＭＨＣ分子は、サイトゾルタンパク質に由来するペプチドを提示するＭＨＣクラスＩタンパク質である。実施の形態によっては、前記ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、又はＨＬＡ－Ｇである。実施の形態によっては、前記ＨＬＡ－Ａは、ＨＬＡ－Ａ０２である。

【0327】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１のエピトープは、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドである。実施の形態によっては、前記エピトープは、アミノ酸が約８個～約１２個（約８、９、１０、１１、又は１２個等）の長さである。ＳＡＧＥ１の適切なＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドは、例えば、当業者には公知のコンピュータ予想モデルを使用し、特定のＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１）結合モチーフならびにプロテアソーム及び免疫プロテアソームの切断部位の存在に基づいて決定できる。

【0328】

実施の形態によっては、前記抗体結合ドメインは、Ｆｖ状抗原結合モジュールである。実施の形態によっては、前記抗体結合ドメインは、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含むＦｂ状抗原結合モジュールである。

【0329】

実施の形態によっては、前記操作受容体は、抗原結合ドメインと、膜貫通型ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記抗原結合ドメインは、ＳＡＧＥ１のエピトープ又はＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープに特異的に結合する。

【0330】

ＣＡＲの膜貫通型ドメインは、天然のものでも、合成されたものでもよい。天然の場合、ドメインは、任意の膜結合型タンパク質又は膜貫通型タンパク質に由来するものでよい。本発明における特定の使用のための膜貫通型領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３ｓ、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、又はＣＤ１５４のα鎖、β鎖、δ鎖、γ鎖、又はζ鎖に由来するものでよい（すなわち、少なくともこれらの膜貫通型領域を含んでよい）。実施の形態によっては、前記膜貫通型ドメインは合成でよく、その場合、ロイシン及びバリン等の疎水性残基を主に含んでよい。実施の形態によっては、合成の膜貫通型ドメインの各端には、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンの三重項が見られる場合がある。実施の形態によっては、例えば、アミノ酸が約２個～約１０個（約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個等）の長さである短いペプチドリンカーがＣＡＲの膜貫通型ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを形成してもよい。実施の形態によっては、前記リンカーは、グリシン―セリン二重項である。

【0331】

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが置かれた免疫細胞の正常なエフェクタ機能の少なくとも１つの活性に関与する。例えば、Ｔ細胞のエフェクタ機能は、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であってよい。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクタ機能シグナルを伝達して細胞に特殊化した機能を行わせるタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの全体又は切断後の部分から得られる細胞内シグナル伝達配列を含むことができる。細胞内シグナル伝達ドメインの例には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列と、抗原受容体連結後にシグナル伝達を開始させるために協働するコレセプターの細胞質配列と、これらの配列の任意の誘導体又は変異体と、同じ機能を有する任意の合成配列とが含まれる。本開示における特定の使用のための細胞内シグナル伝達配列の例には、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、及びＴＣＲゼータに由来するものが含まれる。

【0332】

実施の形態によっては、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはさらに共刺激ドメインを含む。Ｔ細胞の完全活性化には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して生成したシグナルと二次又は共刺激シグナルとが必要であることが知られている。本開示に有用な共刺激ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインから得ることができる。共刺激分子の例には、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド等が含まれる。

【0333】

実施の形態によっては、前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列と、ＣＤ２８及び／又は４－ＩＢＢ細胞内シグナル伝達配列とを含む。

【0334】

実施の形態によっては、前記操作受容体は、抗原結合ドメインと、ＴＣＲ膜貫通型ドメインを含むＴ細胞受容体モジュール（ＴＣＲＭ）とを含む操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記抗原結合ドメインは、ＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープに特異的に結合する。

【0335】

実施の形態によっては、前記操作ＴＣＲは、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体である。第１及び第２ポリペプチド鎖は、共有結合（例えば、ペプチド又はその他の化学結合）又は非共有結合（例えば、ジスルフィド結合）等によって結合し得る。

【0336】

実施の形態によっては、前記ＴＣＲＭは、少なくとも１つのＴＣＲ関連シグナル伝達モジュールをリクルートできる。実施の形態によっては、前記ＴＣＲ関連シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３δε、ＣＤ３γε及びζζからなる群から選択される。

【0337】

実施の形態によっては、前記ＴＣＲＭは、ＴＣＲ（αβＴＣＲ又はγδＴＣＲ等）の膜貫通型モジュールを含む。実施の形態によっては、ＴＣＲＭは、ＴＣＲの結合ペプチド又はそのフラグメントの一方又は両方をさらに含む。実施の形態によっては、前記操作ＴＣＲは、少なくとも１つの細胞内ドメインをさらに含む。例えば、操作ＴＣＲの少なくとも１つの細胞内ドメインのうち１以上は、ＴＣＲの細胞内ドメイン又はＴ細胞共刺激シグナル伝達配列からの配列を含む。共刺激シグナル伝達配列は、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド等が含まれる共刺激分子の細胞内ドメインの一部であり得る。実施の形態によっては、前記操作ＴＣＲは、前記抗原結合ドメインと前記ＴＣＲＭとの間に１以上のペプチドリンカーをさらに含むことで、細胞外ドメインの長さを最適化する。

【0338】

ＣＡＲ又は操作ＴＣＲをコードする核酸及び当該核酸が挿入されるベクターが本開示で検討されている。ベクターには、受容体の発現が細胞表面を標的とするようにシグナルペプチドをコードする配列が含まれていてよい。

【0339】

本開示はＣＡＲ又は操作ＴＣＲを発現するように遺伝子操作された細胞も示す。このような細胞は、ＣＡＲ又は操作ＴＣＲを細胞にコードする核酸を含むベクターを導入することによって生成可能である。実施の形態によっては、前記細胞は、樹状細胞、Ｔ細胞、又はナチュラルキラーを含む。

【0340】

ｉｉ．操作抗原提示細胞
別の態様において、本開示のエクスビボ活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＳＡＧＥ１陽性疾患に対する免疫反応（例えば、抗原特異性Ｔ細胞応答）を高めるためにＳＡＧＥ１又はそのフラグメントが取り込まれている。

【0341】

ＡＰＣは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質と複合した抗原をその表面に提示する細胞である。ＡＰＣの例には、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、Ｂ細胞、及び一定の活性化上皮細胞が含まれる。実施の形態によっては、ＡＰＣは樹状細胞である。ＳＡＧＥ１を取り込んだＡＰＣは、患者の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）にＭＨＣ－Ｉ及び／又はＭＨＣ－ＩＩ分子が複合したＳＡＧＥ１特異的ペプチドを提示することで、強い
腫瘍特異的免疫反応を生じさせる。

【0342】

一般に、エクスビボ活性化ＡＰＣの調製では、患者からＡＰＣ細胞（例えば、ＤＣ）を単離する。単離された細胞は、エクスビボで活性化されて成熟し、患者に戻す前に注目抗原を提示する。特定の腫瘍抗原（例えば、ＳＡＧＥ１）及び腫瘍溶解物等をＡＰＣの活性化に使用できる。特定の腫瘍抗原（例えば、ＳＡＧＥ１のエピトープ又はＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープ）をコードする発現ベクター（例えば、ウイルスベクター又はｍＲＮＡ）、全腫瘍細胞ｍＲＮＡ、腫瘍由来のエキソソーム（ＴＤＥ）、又はＳＡＧＥ１のエピトープもしくはＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープを発現するように修飾された細胞（例えば、線維芽細胞）等を用いて、エレクトロポレーション、トランスフェクション、又は形質導入を行うことによってもＡＰＣを活性化できる。

【0343】

被験者（例えば、癌患者）への投与に適したＡＰＣは、そのような細胞が見つかった任意の組織から単離して得ることができるが、培養して提供することもできる。ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）は、例として、哺乳類の骨髄又はＰＭＢＣ、哺乳類の脾臓、又は哺乳類の皮膚で見つけられる。例えば、骨髄は、哺乳類から採取し、ＤＣの成長を促す培地で培養できる。この培地には、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４及び／又はその他サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α）、成長因子、並びにサプリメントを含ませることができる。ＤＣは、これが存在するあらゆる細胞内で数が少ないので、ＤＣの単離及び濃縮が必要となる。単離したＤＣを濃縮した集合体を得るため、反復的な密度勾配分離、蛍光活性化細胞選別法、陽性選別、陰性選別、又はこの組み合わせを伴う多くの作業が定期的に行われる。

【0344】

適切なサイトカインを含んだ培地における適切な培養時間（例えば、ＤＣを増殖及び分化させて成熟させるもので、４日、６日、８日、１０日、１２日、又は１４日等）を経て、標準的な技術を使い、ＤＣのクラスタがＳＡＧＥ１の１以上のエピトープがある中で培養されるか、ＳＡＧＥ１の１以上のエピトープをコードする発現ベクターを用いてトランスフェクト／形質導入されて、癌ワクチン用に採取できる。実施の形態によっては、ＡＰＣは、ＳＡＧＥ１のエピトープ又はＳＡＧＥ１のＭＨＣ関連エピトープを発現する細胞と融合させることもできる。実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１のエピトープは、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープ又はＭＨＣクラスＩＩ拘束性エピトープである。

【0345】

別の態様において、本開示のワクチン組成物は、本明細書に記載のエクスビボ活性化ＡＰＣを含む。別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１陽性疾患の予防又は治療を行う方法であって、本明細書に記載の活性化ＡＰＣを有効量投与するステップを含む。

【0346】

ＡＰＣベースのワクチンは、注射、点滴、接種、直接的な手術による投与、又はこれらの組み合わせを含む任意の適切な投与経路で被験者に投与できる。他の実施形態では、ワクチンを静脈内投与する。

【0347】

ＶＩＩ．ＳＡＧＥ１陽性疾患の処置方法
別の態様において、本開示の方法は、ＳＡＧＥ１陽性疾患の処置を必要とする被験者に対して当該疾患の処置を施す方法であって、有効量の（ａ）ＳＡＧＥ１阻害薬、（ｂ）本明細書に記載の医薬組成物、（ｃ）本明細書に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬、（ｄ）本明細書に記載の細胞、及び（ｅ）これらの組み合わせを被験者に投与するステップを含む。ある実施の形態では、投与前の被験者の生体サンプルからＳＡＧＥ１発現を検出する。ＳＡＧＥ１発現の検出には、本明細書に開示したいずれの方法も使うことができる。

【0348】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１陽性疾患は、腫瘍である。本明細書に開示したいずれの腫瘍もその腫瘍がＳＡＧＥ１陽性である限り、本明細書に記載の方法を使用して処置を施されてよい。実施の形態によっては、前記処置は、前記腫瘍の発症、進行、転移
、又は再発を予防し、遅らせ、又は抑制する。

【0349】

別の態様において、本開示の方法は、ＴＰ５３が変異した被験者の腫瘍の悪性度の進行を予防し、抑制し、又は遅らせる方法であって、有効量の（ａ）ＳＡＧＥ１阻害薬、（ｂ）本明細書に記載の医薬組成物、（ｃ）本明細書に記載のＳＡＧＥ１複合体阻害薬、（ｄ）本明細書に記載の細胞、及び（ｅ）これらの組み合わせを被験者に投与するステップを含む。ある実施の形態では、投与前の被験者の生体サンプルからＳＡＧＥ１発現を検出する。本明細書に記載のＳＡＧＥ１阻害薬、ＳＡＧＥ１複合体阻害薬、及び細胞のいずれも使用できる。

【0350】

ある実施の形態では、有効量は、治療効果のある量である。ある実施の形態では、治療効果のある量は、病気の症状の予防、緩和、もしくは改善又は治療中の被験者の生存期間の延長に十分な量である。治療効果のある量の判定は、当業者の能力範囲内で十分行える。治療効果のある量は、被験者に対する特定の処置によって異なり、被験者の体重、サイズ、及び健康、疾患の性質及び程度、投与率、投与のために選択された治療法又はその組み合わせ、ならびに処方医師の指示等の公知の様々な要因に左右される。所定の状況に治療効果のある量は、臨床医の技能及び判断の範囲内の日々の実験によって判定することができる。例えば、初回の投与量を以降の投与量より多くしてもよい。別の例として、処置期間中、被験者の応答次第で投与量を変更してよい。

【0351】

ある実施の形態では、有効量は、予防効果のある量である。予防効果のある量は、疾患（例えば、ＳＡＧＥ１陽性疾患）の予防又は当該症患（例えば、ＳＡＧＥ１陽性疾患）に関連する症状の緩和等、被験者に所望の予防効果が得られる量とすることができる。症状が緩和されたか否かは、内科医又はその他医療関係者がその症状の重症度又は進行状態の検査に用いる任意の臨床測定によって検査でき、入院の必要性について改善が見られる場合もある。

【0352】

オリゴヌクレオチド又は核酸を細胞に導入する方法には、物理的方法、生物学的方法、及び化学的方法がある。ポリヌクレオチドを細胞に導入する物理的方法には、トランスフェクション、形質転換、形質導入、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーション等がある。

【0353】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、及びビーズ等のコロイド分散系ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソーム等の脂質ベース系が含まれる。体外（in vitro）及び体内（in vivo）で運搬媒体として使用される典型的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

【0354】

注目ポリヌクレオチドを細胞に導入する生物学的方法には、核酸ベクターの使用が含まれる。本明細書に開示のオリゴヌクレオチドは、ベクターに挿入でき、ベクター内の転写単位から発現できる。実施の形態によっては、前記オリゴヌクレオチドは、核酸ベクターに含まれる、又はコードされる。当業者には明らかであるが、本発明の核酸を細胞に移入させるのに適したベクターは各種ある。核酸を運搬する適切なベクターを選択し、選択した発現ベクターを細胞に挿入するために状況を最適化することは、過度に実験する必要もなく、当業者の技術範囲内のことである。

【0355】

ウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類、例えば、ヒトの細胞に挿入するために最も広く用いられている方法である。使用するウイルスベクターは複製に適したもので、場合によっては真核細胞における組み込みに適したものである。典型的なベクターは、転写ターミ
ネータ及び翻訳ターミネータと、開始配列と、所望の核酸配列の発現の制御に有用なプロモータと、少なくとも１つの有機体において機能する複製の起点と、１以上の選択可能なマーカ（4th Edition, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2012）とを含む。ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスを含むウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス等から得られる。

【0356】

ある実施の形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１以上の要素を発現させる１以上のベクターを宿主細胞に導入することで、ＣＲＩＳＰＲシステムの当該要素の発現によって１以上の標的部位にＣＲＩＳＰＲ複合体が形成される。例えば、ＣＡＳ酵素及びガイド配列は、単一のベクターの同一又は別々の調節要素に操作可能に結合する、又はそれぞれが別々のベクターの別々の調節要素に結合する。

【0357】

プラスミド等の非ウイルスベクターを用いて核酸又はポリヌクレオチドを細胞に導入することもできる。ある実施の形態では、ｓｈＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトする。

【0358】

ＶＩＩＩ．ＳＡＧＥ１阻害薬のスクリーニング方法
別の態様において、本開示は、ＳＡＧＥ１阻害薬である薬剤（例えば、ＳＡＧＥ１のレベル又はＳＡＧＥ１を介する生物活性を抑制する薬剤）を同定又はスクリーニングする方法を示す。薬剤は、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、化合物、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、又はこれらのうちのいずれかの誘導体である。

【0359】

実施の形態によっては、前記方法は、ＳＡＧＥ１タンパク質又はその機能的等価物をスクリーニング対象の薬剤に接触させ、前記ＳＡＧＥ１又はその機能的等価物と前記薬剤との結合を検出するステップを含む。結合の存在は、その薬剤がＳＡＧＥ１阻害薬であり得ることを示している。本明細書で使用する「機能的等価物」とは、化学構造が違っても少なくとも部分的には天然のポリペプチドの生物学的機能を保持する天然のポリペプチド（例えば、ＳＡＧＥ１）のフラグメント、変異体、誘導体、又は融合ポリペプチドを指す。実施の形態によっては、機能的等価物は、天然のポリペプチドの少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の生物活性を保持する。ＳＡＧＥ１の生物学的機能には、増殖促進遺伝子の転写を上方制御する等して腫瘍形成を促進すること、及びＩＮＴＳ３と結合することが含まれるが、これに限定されない。

【0360】

実施の形態によっては、前記方法は、検査薬をＳＡＧＥ１複合体の成分のＳＡＧＥ１結合フラグメントに接触させ、前記ＳＡＧＥ１結合フラグメントと前記検査薬との結合を検出するステップを含む。結合の存在は、その薬剤がＳＡＧＥ１複合体阻害薬であり得ることを示している。

【0361】

実施の形態によっては、前記方法は、検査薬をＳＡＧＥ１及びＳＡＧＥ１複合体の成分のＳＡＧＥ１結合フラグメントに接触させ、当該ＳＡＧＥ１と当該ＳＡＧＥ１結合フラグメントとの結合を阻害もしくは抑制する当該検査薬の能力を検出するステップを含む。これに代えて、前記方法は、ＳＡＧＥ１複合体の形成を抑制する当該検査薬の能力を検出するステップを含んでもよい。検査薬がＳＡＧＥ１複合体の成分のＳＡＧＥ１結合フラグメントへのＳＡＧＥ１の結合を阻害もしくは抑制すれば、又はＳＡＧＥ１複合体の形成を抑制すれば、この検査薬は、ＳＡＧＥ１複合体阻害薬であり得る。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体の成分は、ＩＮＴＳ３、ＩＮＩＰ、ＮＡＢＰ１／２、ＣＲＥＢＢＰ、ＴＬＥ１、ＴＬＥ２、ＴＬＥ３、ＴＬＥ４、ＴＬＥ５、ＧＧＡ３、ＣＮＯＴ１、ＴＡＸ１ＢＰ１、ＳＥＣ１６Ａ、ＣＹＬＤ、及びＰＡＸＢＰ１からなる群から選択される１以上
の成分を含む。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１複合体の成分は、ＩＮＴＳ３を含む。実施の形態によっては、前記ＩＮＴＳ３のＳＡＧＥ１結合フラグメントは、ＳＡＧＥ１結合可能なSEQ ID NO: 9のアミノ酸配列、その変異体もしくはフラグメント、又はこれらのいずれかの融合タンパク質を含む。

【0362】

実施の形態によっては、前記方法は、薬剤の存在下でＳＡＧＥ１をＩＮＴＳ３に接触させ、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の形成を検出するステップを含み、当該薬剤がＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の形成を阻害した場合、当該薬剤をＳＡＧＥ１阻害薬と同定する。実施の形態によっては、セルフリースクリーニングアッセイは、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体を薬剤に接触させ、当該複合体の量を検出するステップを含み、当該薬剤が当該複合体の量を減少させた場合、当該薬剤をＳＡＧＥ１阻害薬と同定する。

【0363】

薬剤とＳＡＧＥ１又はその機能的等価物との結合は、様々な方法で判断できる。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又は質量分析を用いて結合の存在及び／又は量を分析できる。別の例として、ＳＡＧＥ１及びＳＡＧＥ１複合体の成分のＳＡＧＥ１結合フラグメント（例えば、ＩＮＴＳ３）を放射性同位元素標識又は酵素標識と連結させることで、そのつながりにおける標識化分子を検出してＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１結合フラグメントへの薬剤の結合を判断できる。この結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）等の方法で、いずれの成分も標識化することなくリアルタイムでも判断できる。実施の形態によっては、結合分子又は結合済みの分子の分離／検出を容易にするとともにアッセイの自動化に対応できるよう、ＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体の成分（例えば、ＩＮＴＳ３）のＳＡＧＥ１結合フラグメントのいずれかを固定するとよい。例えば、ＳＡＧＥ１及び／又はＳＡＧＥ１複合体の成分（例えば、ＩＮＴＳ３）のＳＡＧＥ１結合フラグメントは、マトリックスに結合できるような別のドメインを含む融合タンパク質（例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼベースの融合タンパク質）の形態で提供できる。

【0364】

例えば、ペプチドライブラリをスクリーニングすることで、ＳＡＧＥ１、その機能的等価物、もしくはＩＮＴＳ３のＳＡＧＥ１結合フラグメントと相互作用又は結合する分子又はＩＮＴＳ３等の結合先へのＳＡＧＥ１の結合をブロックする分子を同定できる。有用なペプチドライブラリには、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現でき、その後、ＳＡＧＥ１又はその機能的等価物に対してスクリーニングされ得る無作為のアミノ酸集合又は制御されたアミノ酸集合をコードするものが含まれる。典型的なペプチドライブラリには、ＨＳＰ９０又はフィブロネクチン（Anders Olson C.ら、Protein Sci., 2007; 16: 476, Wahlberg E.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) ; 100: 3185)に基づくものが含まれる。ＳＡＧＥ１タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために用いることができるスクリーニング方法は、例えば、米国特許第５７２３２８６号及び第５７３３７３１号に開示されている。

【0365】

実施の形態によっては、前記方法は、ＳＡＧＥ１又はその機能的等価物を発現させる細胞をスクリーニング対象の薬剤に接触させるステップと、ＳＡＧＥ１又はその機能的等価物の量又は活性を低下させる当該薬剤の能力を判定するステップとを含む。実施の形態によっては、前記細胞は、腫瘍細胞である。

【0366】

例えば、ＳＡＧＥ１機能に干渉する小分子が同定でき、これにはＲＮＡＰＩＩ依存性転写制御を仲介するＳＡＧＥ１の能力、癌遺伝子の転写を活性化させるＳＡＧＥ１の能力、又は腫瘍形成につがなる転写制御ミスに対して干渉する分子が含まれる。ＳＡＧＥ１機能を制御するリガンドが同定でき、これはＳＡＧＥ１複合体に結合するその能力又はＳＡＧＥ１複合体の機能に干渉するその能力に基づく。

【0367】

ＳＡＧＥ１の活性は、例えば、ＳＡＧＥ１複合体が制御する遺伝子の発現を検出するこ
とによって判定できる。例えば、ＳＡＧＥ１複合体が標的とする応答性のある制御要素に動作可能に結合するレポーター遺伝子の導入を検出することでＳＡＧＥ１の活性が示され得る。

【0368】

実施の形態によっては、前記方法は、前記ＳＡＧＥ１複合体（例えば、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体）を薬剤に接触させ、ＳＡＧＥ１複合体の制御下におけるレポーター遺伝子の活性化を検出するステップを含み、当該薬剤がレポーター遺伝子の活性化を抑制又は防止した場合、当該薬剤をＳＡＧＥ１阻害薬と同定する。

【0369】

実施の形態によっては、本開示の組み換え細胞は、ＳＡＧＥ１をコードする第1遺伝子と、レポーターをコードする第２遺伝子とを含み、当該レポーターは、ＳＡＧＥ１の発現又はＳＡＧＥ１を介する活性に応じて、検出可能なシグナルを生成するように構成されている。

【0370】

典型的な方法は、例えば、１９９９年７月２７日登録の米国特許第５９２８８６８号で検討されており、少なくとも１つのリガンドが小分子であるハイブリッドリガンドを形成する方法を含む。これを説明する実施の形態では、ＳＡＧＥ１とＤＮＡ結合タンパク質との融合タンパク質を発現するように操作された細胞を用いて、ハイブリッドリガンド／小分子の融合タンパク質及びｃＤＮＡライブラリ転写活性化タンパク質を共発現させる。この細胞は、さらにレポーター遺伝子を含み、その発現は第１及び第２融合タンパク質付近に調節され、ハイブリッドリガンドが両方のハイブリッドタンパク質の標的部位に結合する場合にのみ生じる事象である。レポーター遺伝子を発現させるこれらの細胞を選択し、不明の小分子又は不明のリガンドを同定する。この方法によって、ＳＡＧＥ１を活性化する又は阻害するモジュレータを同定する手段が提供される。

【0371】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１阻害薬である薬剤のスクリーニングアッセイは、細胞ベースのアッセイであり、ＳＡＧＥ１発現細胞を発現させる細胞を検査薬に接触させ、ＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体の量又は活性を低下させる検査薬の能力を判定するステップを含む。実施の形態によっては、前記細胞は、腫瘍細胞である。腫瘍細胞は、動物モデル又は腫瘍患者から得られる。実施の形態によっては、前記接触ステップは、インビボ（in vivo）、エクスビボ（ex vivo）、又はインビトロ（in vitro）で行われる。

【0372】

ＳＡＧＥ１の量は、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ又はそのタンパク質もしくはフラグメントの発現のレベルで示され得る。細胞におけるＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ又はそのタンパク質もしくはフラグメントの発現レベルは、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ又はそのタンパク質を検出する本明細書に記載の方法で判定できる。薬剤がないときよりもあるときの方がＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの量が減少する（統計的に大幅に少ない）場合、その薬剤をＳＡＧＥ１阻害薬と同定する。

【0373】

ＳＡＧＥ１の活性は、上述のように判定できるＳＡＧＥ１複合体の量又は活性で示すことができる。ＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体の活性は、さらに、コントロールと比較した腫瘍細胞の生存性又は増殖性の低下等、ＳＡＧＥ１が制御する細胞応答によって示すこともできる。コントロールとしては、薬剤に接触させられなかった腫瘍細胞又は抗癌剤に接触させられた腫瘍細胞があり得る。例えば、細胞の増殖又は侵入は、本明細書に記載した細胞の個数、細胞の動き、マトリゲルアッセイ、増殖及び／又は侵入関連遺伝子発現の誘導等をモニタリングすることで判定できる。さらに、ＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１複合体のインビボ活性は、固形腫瘍であれば、例えば、ＰＥＴスキャンで撮像することで、腫瘍の縮小によって示すことができる。

【0374】

本開示は、さらに、上述のスクリーニングアッセイで同定される薬剤に関する。したが
って、本明細書に記載するとおりに同定された薬剤を適切な動物モデルにさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載するとおりに同定された薬剤は、動物モデルに使用することで、その薬剤による処置の有効性、毒性、又は副作用を判定できる。あるいは、本明細書に記載するとおりに同定された薬剤は、動物モデルに使用することで、その薬剤の作用のメカニズムを判定できる。さらに、本発明は、上述のスクリーニングアッセイで同定される薬剤の本明細書に記載の処置のための使用に関する。

【0375】

ＩＸ．ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体阻害薬の構造ベースの発見
別の態様において、本開示の単離ＳＡＧＥ１－ＩＮＳＴ３複合体は、ＳＡＧＥ１又はそのフラグメント及びＩＮＳＴ３又はそのフラグメントを含む。実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１のフラグメントは、ＩＮＴＳ３に結合できる。実施の形態によっては、ＩＮＴＳ３のフラグメントは、ＳＡＧＥ１に結合できる。

【0376】

実施の形態によっては、前記ＩＮＴＳ３のフラグメントは、ＩＮＴＳ３のＣ末端フラグメント、例えば、Ｃ末端から５００、４００、３００、２５０、２００、もしくは１５０個の残基、又はＣ末端から５００～１００、４００～１００、３００～１００、２００～１００、５００～５０、４００～５０、３００～５０、又は２００～５０個の残基を含む。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１のフラグメントは、ＳＡＧＥ１のＣ末端フラグメント、例えば、Ｃ末端から数えて最後の１００、９０、８０、７０、６０、又は５０個の残基を含む。実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１は、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列又はこれと少なくとも７０％一致する配列を有する。実施の形態によっては、ＩＮＴＳ３は、SEQ ID NO: 5のアミノ酸配列又はこれと少なくとも７０％一致する配列を有する。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は、SEQ ID NO: 5の残基５７２～９７８を含むＩＮＴＳ３のＣ末端フラグメントと、SEQ ID NO: 3の残基８１８～９０４を含むＳＡＧＥ１のＣ末端フラグメントとを含む。

【0377】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は結晶化している。結晶化ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は、ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との界面でつながる特定のアミノ酸及びその原子の原子モデリング情報を得るための手段を提供する場合がある。

【0378】

実施の形態によっては、本開示の前記結晶化ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は、Ｘ線を回折し、５Å、４Å、３Å、２Å、又は１．５Åよりも高い解像度を得ることができ、かつ分子の３次元構造の判定に有用である。

【0379】

ｉ．Ｘ線結晶構造座標
別の態様において、本開示は、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体のＸ線結晶構造座標セットを示す。このＸ線結晶構造座標セットは、タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）にコード７Ｃ５Ｕで預けられたもの（Deposition ID D_1300015303）（Bernstein, F. C, T. F. Koetzleら(1977) J MoI Biol 112 (3):535-42）であり、これは、SEQ ID NO: 3の残基８１８～９０４のアミノ酸配列を含むＳＡＧＥ１ポリペプチドと、SEQ ID NO: 5の残基５７２～９７８のアミノ酸配列を有するＩＮＴＳ３ポリペプチドとを含むＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体のＸ線結晶構造座標を示している。実施の形態によっては、本明細書に記載の結晶は、おおよその寸法が２６０．１１２±０．１Å、ｂ＝４６．２４０±０．１Å、ｃ＝１０３．１０１±０．１Å、α＝９０±０．１°、β＝１１３．２８０±０．１°、γ＝９０±０．１°で、対称であり、空間群がＣ２である。

【0380】

ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体、特にＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との界面の３次元構造によって、ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との相互作用に干渉する、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体阻害薬を含むＳＡＧＥ１阻害薬の設計と同定が可能になる。例えば、３次元構造の知識があれば、分子設計、好ましくはＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３に結合できる医薬品の設計が
可能になり、これにより、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体に妨害を加え、この複合体が細胞増殖及び癌表現型に関わる遺伝子の発現を上方制御する等の生物学的機能を発揮できないようにできる。界面について言及する際、界面の一部（例えば、保管されている座標ファイル（ＰＤＢコード：７Ｃ５Ｕ）のＳＡＧＥ１部分の構造座標の全部もしくは一部、保管されている座標ファイル（ＰＤＢコード：７Ｃ５Ｕ）のＩＮＴＳ３部分の構造座標の全部もしくは一部、又は保管されている座標ファイル（ＰＤＢコード：７Ｃ５Ｕ）のＳＡＧＥ１部分及びＩＮＴＳ３部分の両方）を指す場合がある。この構造座標は２０２０年５月２０日にＲＣＳＢのＰＤＢにアクセッション番号７Ｃ５Ｕで預けられている。保管情報は本明細書に開示した発明の公開後に公開される。

【0381】

実施の形態によっては、本開示はＳＡＧＥ１複合体のＸ線結晶構造座標セットを示し、結合界面は、Ｆ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｍ８３２、Ｖ８７６、Ｒ８７２、Ｋ８２８、Ｒ８３６、及びＱ８４０（ナンバリングはSEQ ID NO: 3に準ずる）からなる群から選択されるＳＡＧＥ１の１以上のアミノ酸残基、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含む。

【0382】

実施の形態によっては、本開示はＩＮＴＳ３の結合界面（例えば、ＳＡＧＥ１結合界面）のＸ線結晶構造座標セットを示し、前記結合界面は、Ｔ８０４、Ｓ８４１、Ｓ８７４、Ｓ７６９、Ｎ９３３、Ｒ８４９、Ｑ７７３、Ｃ７７７、Ｍ７８１、Ａ８１６、Ｎ８１８、Ｅ８３８、Ｅ８５０、Ｆ８７１、Ｒ８４８、Ｆ８０５、Ｌ８４５、Ｌ８１５、Ｌ８４４、Ｙ８０８、Ｃ８４２、Ｑ８４６、Ｑ８７０、Ｒ８７７、Ｈ８７８、Ｋ８８２、Ｅ７３２、Ｖ７６６、Ｑ７７１、Ｄ７６８、Ａ７６５、Ｑ７３１、Ｅ８３５、Ｅ８０３、Ｃ８０９、及びＬ７７２（ナンバリングはSEQ ID NO: 5に準ずる）からなる群から選択されるＩＮＴＳ３の１以上のアミノ酸残基、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含む。

【0383】

実施の形態によっては、本開示はＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３と結合界面のＸ線結晶構造座標セットを示し、前記ＳＡＧＥ１の結合界面は、ＳＡＧＥ１のＦ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｍ８３２、Ｖ８７６、Ｒ８７２、Ｋ８２８、Ｒ８３６、及びＱ８４０からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基（当該残基のナンバリングはSEQ ID NO: 3に準ずる）、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含み、前記ＩＮＴＳ３の結合界面は、ＩＮＴＳ３のＴ８０４、Ｓ８４１、Ｓ８７４、Ｓ７６９、Ｎ９３３、Ｒ８４９、Ｑ７７３、Ｃ７７７、Ｍ７８１、Ａ８１６、Ｎ８１８、Ｅ８３８、Ｅ８５０、Ｆ８７１、Ｒ８４８、Ｆ８０５、Ｌ８４５、Ｌ８１５、Ｌ８４４、Ｙ８０８、Ｃ８４２、Ｑ８４６、Ｑ８７０、Ｒ８７７、Ｈ８７８、Ｋ８８２、Ｅ７３２、Ｖ７６６、Ｑ７７１、Ｄ７６８、Ａ７６５、Ｑ７３１、Ｅ８３５、Ｅ８０３、Ｃ８０９、及びＬ７７２からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基（当該残基のナンバリングはSEQ ID NO: 5に準ずる）、又はそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の等価残基を含む。

【0384】

当業者であれば理解できることであるが、タンパク質複合体又はそのタンパク質の構造座標セットは３次元の形状を規定する相対的な点集合である。したがって、完全に異なる座標セットで類似又は同一の形状を規定することも可能であり、これは本発明の範囲に含まれる。また、個々の座標における僅かなばらつきは、全体の形状にはほとんど影響がない。結合界面でいえば、界面でつながる原子又は残基がこうしたばらつきによって大幅に変わるとは考えられない。

【0385】

なお、アミノ酸の変異、追加、置換、及び／もしくは欠失又は結晶を構成する構成要素のいずれかにおけるその他の変更により結晶構造が変化することで構造座標にばらつきが生じる場合もある。このようなばらつきは、保存主鎖原子から約２Å以下の平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）等、元の座標と比較して誤差の許容基準範囲内であるならば、得られる３次
元形状は同じとみなされる。実施の形態によっては、前記平均二乗偏差は、約１．５Å、１．０Å、又は０．５Å以下である。本明細書で使用する用語「平均二乗偏差」は、平均値からの偏差の２乗の算術平均の平方根を指す。原子オブジェクトの観点から、これらの数字はオングストロームで示される。

【0386】

ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の構造座標を数学的に操作することで上述の変化を生じさせてもよい。例えば、元の構造座標の結晶学的置換（crystallographic permutation）、元の構造座標の分割（fractionalization）、元の構造座標セットに対する整数加算又は減算（integer additions or subtraction）、元の構造座標の反転（inversion）、又はこれらの組み合わせによって、保管されている座標ファイル（ＰＤＢコード：７Ｃ５Ｕ）に示される構造座標を操作できる。例えば、本開示のＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は、保管されている座標ファイル（ＰＤＢコード：７Ｃ５Ｕ）に示されるアミノ酸残基±２Å以下（より好ましくは１．５Å以下、さらに好ましくは１Å以下、最も好ましくは０．５Å以下）の当該アミノ酸の保存主鎖原子からの平均二乗偏差を特徴とする結合界面を含むことが好ましい。

【0387】

したがって、本開示は、結合界面を構成するアミノ酸の主鎖原子からの平均二乗偏差が約２Å以下、約１．５Å以下、約１Å以下、又は約０．５Å以下の範囲内にある本明細書に記載のＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の結合界面（例えば、保管されている座標ファイル（ＰＤＢコード：７Ｃ５Ｕ））を含むＸ線結晶構造座標をさらに示す。

【0388】

ｉｉ．コンピュータ可読記憶媒体
本明細書に記載のＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体から生成した構造座標を使用するためには、関連座標を３次元形状又はグラフィック描写として表示したり、関連座標を変換して３次元形状又はグラフィック描写にする必要があったり、そうでない場合はこれらを操作する必要がある場合がある。一般に、構造座標のこのような３次元表示は、合理的薬物設計、分子置換法、ホモロジーモデリング、及び変異分析において使用される。これは、通常、構造座標セットから分子又はその一部の３次元のグラフィック描写を生成できる様々な市販のソフトウェアプログラムを使用することで行われる。この科学技術分野には既存のソフトウェアプログラムが多く、これらは参照によって全体が本明細書に組み込まれる。例えば、ＧＲＩＤ（Oxford University, Oxford, UK）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Scripps
Research Institute, La Jolla, Calif.)、Ｆｌｏ９９（Thistlesoft, Morris Township, NJ.）等を参照されたい。

【0389】

したがって、別の態様において、本開示のコンピュータ可読記憶媒体には、保管されている座標ファイル（ＰＤＢコード：７Ｃ５Ｕ）に示されるもの等、本開示に係る結晶構造座標が記憶されている。

【0390】

このようなプログラムの記憶、転送、及び使用に関し、結合界面を含むＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の３次元表示を生成するコンピュータ等の機械も考えられる。この機械は、本開示に係る結晶構造座標が記憶されている機械可読データ記憶媒体を含む。コンピュータ可読記憶媒体は、当業者に周知であり、例えば、ハードディスク、ＣＤ－ＲＯＭ，フロッピーディスク、ＤＶＤ、ＵＳＢメモリ等、及びその他磁気媒体、光磁気媒体、光媒体、フロプティカル媒体、その他コンピュータで使用できる媒体が含まれる。前記機械は、さらに、機械可読データを処理するための指令を記憶するための作業用メモリと、当該作業用メモリ及び機械可読データ記憶媒体に連結される、機械可読データを所望の３次元表示に加工するための中央処理装置（ＣＰＵ）とを含む。また、本発明の前記機械は、さらに、ユーザが３次元表示を視認できるようにＣＰＵに接続されたディスプレイを含む。したがって、前記データを使用するための指令がプログラミングされた機械、例えば、上述したタイプの１以上のプログラムを搭載したコンピュータで使用すると、本明細書に記載
された機械は、本明細書に記載のＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の３次元表示を行うことができる。

【0391】

ｉｉｉ．潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬の同定及びスクリーニング方法
別の態様において、本開示の方法は、潜在ＳＡＧＥ１複合体阻害薬である薬剤を同定する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の前記Ｘ線結晶構造座標セットに基づく結合界面の３次元構造の表示物をコンピュータ上で生成するステップと、
（ｂ）前記薬剤の表示物をコンピュータ上で生成するステップと、
（ｃ）前記薬剤が前記結合界面の１以上の残基と相互作用するよう、前記ステップ（ｂ）における前記薬剤の表示物を前記ステップ（ａ）における前記結合界面の３次元構造のコンピュータ表示物にフィットさせるステップと、
（ｄ）前記薬剤と前記結合界面の１以上の残基との前記ステップ（ｃ）における相互作用を評価するステップとを含み、
前記相互作用により、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体に対して競合する場合もある、前記薬剤とＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３とを含む低エネルギーで安定的な複合体が生じると、前記薬剤を潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬と同定する。

【0392】

別の態様において、本開示のバーチャルスクリーニング方法は、潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬を同定する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の前記Ｘ線結晶構造座標に基づく結合界面の３次元構造の表示物をコンピュータ上で生成するステップと、
（ｂ）コンピュータ上で薬剤の表示物を生成する、又はライブラリの薬剤の表示物にアクセスするステップと、
（ｃ）前記薬剤が前記結合界面の１以上の残基と相互作用するよう、前記ステップ（ｂ）における前記薬剤の表示物を前記ステップ（ａ）における前記結合界面の３次元構造のコンピュータ表示物にフィットさせるステップと、
（ｄ）前記薬剤と前記結合界面の１以上の残基との前記ステップ（ｃ）における相互作用を評価するステップとを含み、
前記相互作用により、ＳＡＧＥ１複合体に対して競合する場合もある、前記薬剤とＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３とを含む低エネルギーで安定的な複合体が生じると、前記薬剤を潜在的ＳＡＧＥ１複合体阻害薬と同定する。

【0393】

コンピュータ上の結合界面の表示物はグラフィック表示、すなわち３次元空間にアミノ酸残基の座標を描いたものであり得る。ステップ（a）における結合界面の３次元グラフィック表示及び／又はステップ（ｂ）の薬剤の３次元グラフィック表示を生成するソフトウェアは、公知で市販のものである。例として、Quanta、WebLite Viewer、Schrodinger Suite、AUTODDOCK、及びDOCK等がある。

【0394】

上記ステップ（ｃ）におけるフィッティング（すなわちドッキング）は、ステップ（ｂ）における薬剤の表示物とステップ（ａ）における結合界面の３次元構造の表示物との相補性を検査するプロセスである。フィッティングは、この技術分野で公知の方法で行うことができ、例えば、超精密グライドドッキング（Glide XP）等、結合界面と薬剤との「フィット」を評価する様々な計算手法を用いることができる。

【0395】

薬剤と本開示のＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の結合界面の１以上の残基との相互作用は、コンピュータ評価で検査して最適化してよい。例えば、形状、大きさ、及び静電相補性で評価されてもよく、これらは目視で定性的に判断されたり、ＬＵＤＩ、ＰＬＰ、ＰＭＦ、ＳＣＯＲＥ、ＧＯＬＤ、ＦｌｅｘＸ、Ｅｍｏｄｅｌスコア、及びＧｌｉｄｅ ＸＰスコア等のスコアリング機能を使用して定量的に判断される。これらの定性的及び定量的評
価の方法は、個別に使用してもよいし、コンセンサススコアリング形式等で組み合わせて使用してもよい。

【0396】

あるいは、薬剤と結合界面の１以上の残基との相互作用は、薬剤とＳＡＧＥ１分子又はＩＮＴＳ３分子単体との結合又はつながりによって形成される複合体の相互作用エネルギーに基づいて評価できる。本明細書で使用する用語「低エネルギーで安定している複合体」とは、薬剤とＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３との間の疎水性エンクロージャ、水素結合相互作用、内部エネルギー（ファン・デル・ワールスの相互作用等）を含む相互作用のエネルギーがコンピュータプログラムで設定され得る所定の閾値未満の複合体を指す。相互作用のエネルギーは、例えば、Ｇｌｉｄｅプログラムの超精密グライドドッキング（Glide XP）等、この技術分野で公知のソフトウェアを使用して判定できる。

【0397】

所定の閾値とのエネルギーの比較は、手動で行ってもコンピュータベースで行ってもよい。コンピュータベースの比較では、コンピュータプログラムによってデータベースに保存された所定の閾値と相互作用のエネルギーの値を比較してよく、このコンピュータプログラムは、さらに、比較結果を評価し、自動で所望の査定を適切な出力形式で提供してもよい。当業者であれば、この比較に基づいて、潜在ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体阻害薬を容易に同定できる。実施の形態によっては、前記所定の閾値は、グライドＸＰスコアであり、これは疎水性エンクロージャ、水素結合相互作用、内部エネルギー（ファン・デル・ワールスの相互作用等）、静電相互作用、２つのＸＰペナルティ（すなわち、脱溶媒和ペナルティ及びリガンド－歪ペナルティ）によって決まる。実施の形態によっては、前記所定の閾値は、－１２の基準グライドＸＰスコアに対し、グライドＸＰスコアが－１０である。

【0398】

上述のとおり同定された潜在ＳＡＧＥ１複合体阻害薬の効果は、さらに、コンピュータで評価されても、実験によって評価されてもよい（例えば、競合結合実験又はＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の生物活性に対する薬剤の効果の測定等）。

【0399】

実施の形態によっては、潜在ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体阻害薬を同定又はスクリーニングする方法は、ステップ（ｄ）で得られた結果に基づいて薬剤を修飾するステップ（ｅ）をさらに含む。修飾は、ＳＡＧＥ１又はＩＮＴＳ３との親和性である薬剤の結合特性及び選択性の向上又は変更のために、薬剤を対して行うことができる。一般に、最初の修飾は控えめである。すなわち、置き換える基は、大きさ、形状、疎水性、及び電荷が元の基とほぼ同じである。このように修飾された薬剤は、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の結合界面の１以上の残基との相互作用について、詳述した方法と同じコンピュータによる方法で分析できる。実施の形態によっては、前記方法は、潜在ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体阻害薬を同定又はスクリーニングする方法において、ステップ（ｂ）～（ｅ）を繰り返すステップをさらに含む。

【0400】

米国特許第５８３４２２８号及び第７９３０１０９号ならびにＰＣＴ出願国際公開ＷＯ９９／０９１４８には様々な分子分析技術及び合理的薬物設計技術がさらに開示されており、これらの内容は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0401】

実施の形態によっては、前記薬剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、化合物、抗体もしくはその抗原結合フラグメント又はこれらのうちのいずれかの誘導体である。

【0402】

Ｘ．優先出願で開示した実施の形態の組み込み
ｉ．腫瘍用バイオマーカとしてのＳＡＧＥ１の使用
別の態様において、本開示は、腫瘍の処置の治療効果の評価及び／又は腫瘍の予後の判断のためのキットの製造時におけるＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出す
るための物質の使用について示す。

【0403】

実施の形態によっては、前記物質は、細胞、組織、又は体液におけるＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するためのものであり、当該体液は、好ましくは、細胞内液、細胞外液、間質液、血漿、リンパ液、及びその組み合わせからなる群から選択され、且つ／又は

【0404】

前記物質は、ＳＡＧＥ１遺伝子のタンパク質発現レベル又はＳＡＧＥ１遺伝子の分子発現レベルを検出するためのものであり、且つ／又は

【0405】

ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための前記物質は、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための特異性プローブを含み、且つ／又は

【0406】

ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための前記物質は、ＳＡＧＥ１遺伝子を特異的に増幅させるためのプライマを含む。

【0407】

実施の形態によっては、前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、好ましくは、腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎臓癌、白血病、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）から選択される。

【0408】

実施の形態によっては、腫瘍の処置の治療効果の評価及び／又は腫瘍の予後の判断のための前記キットは、サンプル中のＳＡＧＥ１遺伝子の発現レベルに基づく。

【0409】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１遺伝子は、前記キットにおける単一のバイオマーカである。

【0410】

別の態様において、本開示は、腫瘍を診断するためのキットの製造時におけるＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための物質の使用について示す。

【0411】

実施の形態によっては、前記物質は、細胞、組織、又は体液におけるＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するためのものであり、当該体液は、好ましくは、細胞内液、細胞外液、間質液、血漿、リンパ液、及びその組み合わせからなる群から選択され、且つ／又は

【0412】

前記物質は、ＳＡＧＥ１遺伝子のタンパク質発現レベル又はＳＡＧＥ１遺伝子の分子発現レベルを検出するためのものであり、且つ／又は

【0413】

ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための前記物質は、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための特異性プローブを含み、且つ／又は

【0414】

ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための前記物質は、ＳＡＧＥ１遺伝子を特異的に増幅させるためのプライマを含む。

【0415】

実施の形態によっては、前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、好ましくは、腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎臓癌、白血病、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）から選択される。

【0416】

実施の形態によっては、腫瘍の診断又はＳＡＧＥ１の標的治療に対する前記被験者の適合性の有無は、サンプル中のＳＡＧＥ１遺伝子の発現レベルに基づく。

【0417】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１遺伝子は、前記キットにおける単一のバイオマーカである。

【0418】

主に精巣及び胚の組織の細胞で発現する癌精巣抗原、腫瘍関連抗原は、他の正常な組織では発現しないか、発現レベルが低い。しかしながら、この抗原は、悪性腫瘍細胞の組織タイプごとに異なる割合で発現レベルが高く、腫瘍の早期検出及び免疫療法の観点からは潜在的抗原標的である。腫瘍形成におけるその役割は最近の研究で分かってきているが、成長期間、幹細胞の分化期間、及び発癌期間において重要な細胞過程の調節を担っている可能性がある。ただし、これらの再活性化精巣タンパク質が発癌作用を助ける働きをするのか否か、いかにして働くのかはまだほとんど説明されていない。本開示は、多くの研究を重ねる中で、ＳＡＧＥ１すなわちＸ染色体（X:135895410-135913726, Xq26.3）に位置するＣＴ－Ｘ癌精巣抗原が腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、皮膚癌、頭頸部癌、白血病等、様々な腫瘍組織及び細胞で発現すること、またＳＡＧＥ１の発現が精巣組織以外の他の正常な細胞では検出されないことを思いがけず発見した。よって、被験者に腫瘍が形成されやすいか否かを分析したり、被験者に腫瘍があるか否かを診断したり、腫瘍処置の治療効果を分析したり、且つ／又は腫瘍の予後の判定したりするためにＳＡＧＥ１（例えば、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその発現産物）を用いることが考えられる。

【0419】

別の態様において、本開示は、腫瘍処置の治療効果を評価し、且つ／又は腫瘍の予後を判定するためのキットの作製時におけるＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための物質の使用について示す。このキットは、全般的に、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための物質によって、サンプル中のＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントの発現量を検出できるので、当該サンプル中のＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントの発現量を用いて腫瘍の悪性度を評価し、腫瘍処置の治療効果を評価し、且つ／又は腫瘍の予後を判定できる。本開示は、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントの発現が患者の腫瘍の悪性度、処置を受けた患者の当該処置の治療効果、及び／又は腫瘍の予後と密接に関連していることを発見した。

【0420】

特に、固形腫瘍又は血液系腫瘍の場合、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍は、一般に高めの悪性度を示し、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍がある患者は、腫瘍処置を施された後の応答性が一般に比較的低く、比較的予後が悪く、比較的短期間で新しい腫瘍が成長してしまう。例えば、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍がある患者は、全生存期間及び／又は無憎悪生存期間が比較的短い。別の例として、陽性のＳＡＧＥ１発現はリンパ節転移と関連があり、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍がある患者は、よりリンパ節転移が生じやすかったり、新たな腫瘍が成長しやすい。ＳＡＧＥ１
発現とは、ＳＡＧＥ１ｍRNAの発現レベル又はＳＡＧＥ１タンパク質の発現レベルのことでもあり得る。陽性のＳＡＧＥ１発現（又はＳＡＧＥ１陽性）とは、概して、ＳＡＧＥ１発現が存在すること、又は基準に対してＳＡＧＥ１発現のレベルが高いことを指す。ある実施の形態では、陽性のＳＡＧＥ１発現は、腫瘍組織におけるＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの検出可能な発現によって示される。ある実施の形態では、陽性のＳＡＧＥ１発現は、腫瘍組織におけるＳＡＧＥ１タンパク質の検出可能な発現によって示される。ある実施の形態では、陽性のＳＡＧＥ１発現は、サンプルにおいて、周囲の健康な組織と比較して高いＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの発現が検出されることで示される。ある実施の形態では、陽性のＳＡＧＥ１発現は、サンプルにおいて、周囲の健康な組織と比較して高いＳＡＧＥ１タンパク質の発現が検出されることで示される。

【0421】

固形腫瘍又は血液系腫瘍がある患者の場合、通常、ＳＡＧＥ１陽性レベルが高いほど腫瘍の悪性度が高く、腫瘍処置を施された後の応答性が一般に比較的低く、比較的予後が悪く、比較的短期間で新しい腫瘍が成長してしまう。例えば、ＳＡＧＥ１発現のレベルが高いほど、患者の全生存期間及び／又は無憎悪生存期間が短くなる。別の例では、高いＳＡＧＥ１発現のレベルはリンパ節転移と関連があり、ＳＡＧＥ１発現のレベルが高いほど、患者は、よりリンパ節転移が生じやすかったり、新たな腫瘍が成長しやすい。

【0422】

腫瘍処置の治療効果又は腫瘍の予後は、腫瘍患者の全生存期間及び／又は無憎悪生存期間を評価することで評価できる。全生存期間（ＯＳ）とは、通常、ある時点（例えば、腫瘍が診断されたとき又は外科手術で腫瘍が切除されたとき等）からその患者がなんらかの原因で死亡するまでの時間を指す。無憎悪生存期間（ＰＦＳ）とは、概して、ある時点（例えば、腫瘍が診断されたとき、外科手術で腫瘍が切除されたとき等）から別の時点、腫瘍の局所的又は部分的な退縮が検出されたり、遠隔転移が検出された時点又はその患者の死亡までの時間を指す。

【0423】

別の態様において、本開示は、腫瘍を診断するためのキットの作製時におけるＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための物質の使用について示す。このキットは、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントの発現レベルを検出することで腫瘍を診断したり、ＳＡＧＥ１標的治療が被験者に適しているか否かを判断することができる。本開示では、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントの発現が被験者に腫瘍があるか否かと密接に関係していることと、ＳＡＧＥ１発現が陽性又はＳＡＧＥ１発現のレベルが高い腫瘍患者にはＳＡＧＥ１標的治療がより適していることとが分かった。

【0424】

具体的には、固形腫瘍及び／又は血液系腫瘍がある患者の場合、腫瘍組織においてＳＡＧＥ１遺伝子が特異的に陽性に発現する。したがって、ＳＡＧＥ１遺伝子の発現量で患者に腫瘍があるか否かを判定できる。例えば、ＳＡＧＥ１発現が陽性の患者は、通常、腫瘍がある可能性が高い。あるいは、ＳＡＧＥ１遺伝子の発現量を用いて、ＳＡＧＥ１の標的治療が被験者に適しているか否かを判断できる。本開示は、ＳＡＧＥ１を阻害することで腫瘍細胞の増殖、移動、及び足場非依存性成長を大幅に抑えられる一方、妨げられていたＳＡＧＥ１の発現が復活すると、腫瘍細胞のクローン原生が復活できることを実証しており、これは、ＳＡＧＥ１発現が陽性、且つ／又はＳＡＧＥ１発現のレベルが高い患者は一般にＳＡＧＥ１の標的治療に適していることを示している。

【0425】

本開示において、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための物質は当業者に周知であり、この物質を調製する方法もまた当業者に周知である。具体的には、この物質は、概してＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントの発現を検出し、詳細にはＳＡＧＥ１遺伝子のタンパク質発現レベル又ＳＡＧＥ１遺伝子の分子（例えば、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ）発現レベルを検出してよい。例えば、この物質は、標的分子（例えば、ＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ、ＳＡＧＥ１タンパク質等）に特異的に結合できる物質であってよく、
この物質の結合が検出される。ある実施の形態では、この物質は、ＳＡＧＥ１遺伝子に特異的に結合できるプローブとすることができ、別の実施の形態では、この物質は、ＳＡＧＥ１タンパク質を特異的に標的とできる抗体とすることができる。別の例として、この物質は、ＳＡＧＥ１遺伝子を特異的に増幅できる物質であってよく、この特異的な増幅から得られる遺伝子フラグメントを検出することによってＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントの発現が検出できる。ある実施の形態では、この物質は、ＳＡＧＥ１遺伝子を特異的に増幅できるプライマ及び／又は増幅によって得られる産物の検出に適した標識（例えば、染料）等であってよい。

【0426】

本開示において、キットを使用する方法は、一般に、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための物質によって異なる。このキットは、概して、患者の細胞、組織、及び体液に対して行われる検出に使用できる。具体的には、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための物質を用いて、被験者の細胞、組織、及び体液におけるＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出できる。この体液は、例えば、細胞内液（核を含む）及び細胞外液等から選択される流動体又はこれらの組み合わせである。この細胞外液は、具体的には、例えば、間質液、血漿、及びリンパ液等から選択される流動体又はこれらの組み合わせである。ある実施の形態では、キットの検出対象のサンプルは、細胞、血液サンプル（例えば、血漿サンプル及び／又は全血サンプル等）、及び組織（例えば、腫瘍組織又は前癌組織等）又は病理切片から選択される。

【0427】

実施の形態によっては、前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、例えば、腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎臓癌、白血病、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、及び急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）等から選択される。

【0428】

ＳＡＧＥ１遺伝子は、キットにおける単一のバイオマーカであってよい。すなわち、キットは、ＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントを検出するための物質に加えて他のバイオマーカを検出するための物質を含むことはしない。ＳＡＧＥ１遺伝子をキットにおける単一のバイオマーカとして用いることで、腫瘍処置の治療効果の評価、及び／又は腫瘍の予後の判定、又は腫瘍を診断を行うことができる。

【0429】

本開示のＳＡＧＥ１遺伝子又はその活性フラグメントは、腫瘍の悪性度、転移、再発、予後の評価、及び標的治療の選択のためのバイオマーカとして機能する。ＳＡＧＥ１は、従来のバイオマーカと比べて特異性が高く（ＳＡＧＥ１は腫瘍組織で発現するが正常な組織では発現しない）、腫瘍を正常な組織と見分ける正確性は１００％に近い上、腫瘍処置の治療標的としても機能でき、腫瘍が映らない撮像にも使える。また、ＳＡＧＥ１の発現プロフィールによって、腫瘍処置の治療効果を評価するための基礎、再発及び転移をモニタリングするための基礎、及び腫瘍の悪性レベルを判定するための基礎が提供され得る。

【0430】

ｉｉ．薬又はキットの調製時におけるＳＡＧＥ１阻害薬の使用
別の実施の形態では、本開示は、１）腫瘍の処置のため、及び／又は２）ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現レベルを調節するための薬又はキットの製造時におけるＳＡＧＥ１阻害薬の使用を示す。

【0431】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬がＳＡＧＥ１の発現及び／又は機能を阻害する。

【0432】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、単一の活性成分である。

【0433】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、核酸分子、タンパク質分子、又は化合物から選択される。

【0434】

実施の形態によっては、核酸分子は、ＳＡＧＥ１用の干渉ＲＮＡ、ＳＡＧＥ１用のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＳＡＧＥ１発現をノックアウト又はノックダウンさせるための薬剤からなる群から選択され、且つ／又は、タンパク質分子は、抗ＳＡＧＥ１抗体、好ましくは、モノクローナル抗体である。

【0435】

実施の形態によっては、前記核酸分子は、SEQ ID Nos. 59-67のいずれかに示される配列を含む標的配列を標的とし、前記核酸分子のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID Nos. 87-95及び96-99のいずれかに示される配列を含む。

【0436】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＩＮＴＳ３に結合しようとＳＡＧＥ１と競い合い、好ましくは、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＩＮＴＳ６、ＩＮＴＳ６Ｌ、又はその組み合わせである。

【0437】

実施の形態によっては、前記腫瘍は、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍である。

【0438】

実施の形態によっては、前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、好ましくは、腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎臓癌、白血病、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）から選択される。

【0439】

別の態様において、本開示の組成物は、本明細書に開示したＳＡＧＥ１阻害薬を含み、当該組成物は、

【0440】

腫瘍に処置を施し、且つ／又は

【0441】

ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現レベルを調節する。

【0442】

癌／精巣の遺伝子（癌精巣抗原すなわちＣＴＡ）のファミリは、通常、成獣の精巣でのみ発現し、その他の正常な組織においては発現が少ない又は発現がないが、ほとんどの種類の悪性腫瘍及び血液系腫瘍でも発現する。これらのＣＴＡは、癌の主要なバイオマーカと考えられており、癌免疫療法の優れた抗原標的でもある。ＮＹ－ＥＳＯ－１等、いくつかの癌精巣抗原は、第３相臨床試験に入った癌ワクチンのために開発された。腫瘍形成におけるその役割は最近の研究で分かってきているが、成長期間、幹細胞の分化期間、及び発癌期間において重要な細胞過程の調節を担っている可能性がある。多数の癌精巣抗原が
癌幹細胞（ＣＳＣ）又は癌開始細胞（ＣＩＣ）で選択的に発現することは実証されているが、再活性化精巣タンパク質が発癌作用を助ける働きをするのか否か、いかにして働くのかはまだほとんど説明されていない。本開示は、多くの研究を重ねる中で、Ｘ染色体（X:135895410-135913726, Xq26.3）に位置するＣＴ－Ｘ癌精巣抗原が正常な精巣組織外の様々な種類のヒト腫瘍で腫瘍特異性抗原として異常に活性化されることを思いがけず発見した。ＳＡＧＥ１は、ＩＮＴＳ３と機能複合体を形成することができ、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は、様々な腫瘍細胞及び腫瘍組織に特異的にみられる。本開示は、さらに、ＳＡＧＥ１遺伝子／タンパク質又はＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体遺伝子／タンパク質を特異的に標的とすることで、ＳＡＧＥ１陽性癌細胞の増殖及び足場非依存性成長ならびにインビボ異種移植片の成長が大幅に抑えられることを実証しており、これによって、腫瘍の処置に効果的な新たな標的を提供している。

【0443】

一態様において、本発明は、腫瘍の処置用の薬剤又はキット製造時におけるＳＡＧＥ１阻害薬の使用を示す。様々な種類の腫瘍でＳＡＧＥ１が陽性に発現するだけでなく、ＳＡＧＥ１発現が陽性の患者は予後が比較的悪くなることが分かった。ＳＡＧＥ１は、腫瘍組織で特異的に陽性に発現する一方、健康な組織（例えば、前癌組織）では発現しない。本開示は、ＳＡＧＥ１を阻害することで腫瘍細胞の増殖、移動、及び足場非依存性成長を大幅に抑えられる一方、妨げられていたＳＡＧＥ１の発現が復活すると、腫瘍細胞のクローン原生が復活できることが分かり、ＳＡＧＥ１阻害薬が腫瘍の処置に使用できることを実証している。

【0444】

本明細書で使用する用語「処置」とは、所望の薬効及び／又は生理学的効果をもたらすことができる予防的、治癒的、又は緩和的な処置を指す。そのような効果は、好ましくは、疾病の１以上の症状を医学的に抑制すること、又は疾病を完全に排除すること、又は疾病の発生を阻止する、もしくは遅らせること、及び／又は疾病の進行もしくは悪化の危険性を低下させることを指す。

【0445】

別の実施の形態では、本開示は、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現レベルの調節に利用される薬剤又はキットの製造時におけるＳＡＧＥ１阻害薬の使用を示す。本開示は、腫瘍特異性抗原であるＳＡＧＥ１が異常活性の後にＩＮＴＳ３と複合体を形成できることを発見した。ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は、様々な腫瘍細胞及び腫瘍組織に特異的にみられる。ＳＡＧＥ１が阻害される場合、野生型ＳＡＧＥ１の発現で腫瘍細胞増殖が促進されることがあるが、ＩＮＴＳ３と相互作用する主要な残基（Ｆ８３８Ａ、Ｆ８７３Ａ、Ｋ８７４Ａ、Ｒ８７２Ａ、Ｍ８３２Ａ、Ｑ８４０Ａ）に点変異がある変異ＳＡＧＥ１の発現では、こういったことはない。この発見によれば、ＳＡＧＥ１が機能するにはＩＮＴＳ３と複合体を形成する必要があり、ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との相互作用を妨げることでＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の量を減らせば腫瘍細胞の成長が抑えられる。

【0446】

ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体とは、概して、タンパク質間相互作用で形成されるＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との複合体を指す。通常、ＩＮＴＳ３が二量体を（例えば、溶液内で）形成でき、これがさらに水素結合及び塩橋等の相互作用でＳＡＧＥ１と複合体を形成することができる。ＳＡＧＥ１－ＩＮＳＴ３複合体の結晶構造が取り得る単位格子のパラメータは２６０．１１２±０．１Å、ｂ＝４６．２４０±０．１Å、ｃ＝１０３．１０１±０．１Å、α＝９０±０．１°Å、β＝１１３．２８０±０．１°Å、γ＝９０±０．１°Åである。ＳＡＧＥ１－ＩＮＳＴ３複合体において、ＳＡＧＥ１－ＩＮＳＴ３複合体の形成に関わる主要なアミノ酸残基には、典型的には、Ｆ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｒ８７２、Ｍ８３２、及びＱ８４０等が含まれる。

【0447】

本明細書に開示したＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１の発現及び／又は機能を阻害できる。例えば、ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１の発現及び／又は機能を部分的に阻害でき
る、すなわち抑制できるか、ＳＡＧＥ１の発現及び／又は機能を完全に阻害できる、すなわち排除できるが、この機能には、ＩＮＴＳ３に結合してＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体を形成するＳＡＧＥ１の能力が含まれる。ＳＡＧＥ１阻害薬として機能できる薬剤の種類は、当業者に公知のものである。例えば、阻害薬は拮抗薬及び遮断薬等である。別の例として、阻害薬は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）レベル又はタンパク質レベルでＳＡＧＥ１発現を阻害できる。さらに別の例として、阻害薬は、ＩＮＴＳ３に結合しようとＳＡＧＥ１と競い合う薬剤であり得る。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、核酸分子、タンパク質分子、又は化合物等である。核酸分子は、ＳＡＧＥ１に対する干渉ＲＮＡ、ＳＡＧＥ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＡＧＥの発現をノックアウト又はノックダウンするための薬剤から選択されてよい。具体的には、ＳＡＧＥ１阻害薬は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、遺伝子ノックアウトベクター、又はｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくは干渉ＲＮＡ等を発現できる遺伝子発現ベクターであり得る。タンパク質分子は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい抗ＳＡＧＥ１抗体から選択されてよい。一例として、ＩＮＴＳ３と結合しようとＳＡＧＥ１と競い合える薬剤は、ＩＮＴＳ６（DDX26, Accession: NP_036273.1）又はＩＮＴＳ６Ｌ（DDX26b, Accession: Q8BND4.1）又はその組み合わせであり得る。実施の形態によっては、前記核酸分子は、SEQ ID Nos. 59-67のいずれかに示される配列を含む標的配列を標的とする。ある実施の形態では、前記核酸分子のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID Nos. 87-95のいずれかに示される配列を含む。ある実施の形態では、前記核酸分子のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID Nos. 96-99のいずれかに示される配列を含む。

【0448】

本明細書に開示した薬又はキットでは、ＳＡＧＥ１阻害薬を単一の活性成分として、又はその他の活性成分と組み合わせて、腫瘍の処置に用いることができる。

【0449】

本明細書に開示した薬又はキットで処置を施される腫瘍は、ほとんどの場合、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍である。ＳＡＧＥ１陽性又は陽性のＳＡＧＥ１発現とは、概して、ＳＡＧＥ１発現が存在すること、又は基準に対してＳＡＧＥ１発現のレベルが高いことを指す。ある実施の形態では、陽性のＳＡＧＥ１発現は、腫瘍組織におけるＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの検出可能な発現によって示される。ある実施の形態では、陽性のＳＡＧＥ１発現は、腫瘍組織におけるＳＡＧＥ１タンパク質の検出可能な発現によって示される。ある実施の形態では、陽性のＳＡＧＥ１発現は、腫瘍組織において、周囲の健康な組織と比較して高いＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの発現が検出されることで示される。ある実施の形態では、陽性のＳＡＧＥ１発現は、腫瘍組織において、周囲の健康な組織と比較して高いＳＡＧＥ１タンパク質の発現が検出されることで示される。実施の形態によっては、前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、例えば、腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎臓癌、白血病、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、及び急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）等から選択される。

【0450】

別の態様において、本開示の組成物は、本明細書に開示したＳＡＧＥ１阻害薬を含み、当該組成物は、腫瘍の処置、及び／又は、ＳＡＧＥ１複合体の発現レベルの調節に使用される。

【0451】

別の態様において、本開示は、例えば、個体及び細胞等におけるＳＡＧＥ１―ＩＮＴＳ
３複合体の発現レベルを調節するために用いられる調節方法を示す。例えば、この方法は、本明細書に開示した被験者に有効量のＳＡＧＥ１阻害薬又は組成物を投与するステップを含む。

【0452】

別の態様において、本開示は、被験者に本明細書に開示したＳＡＧＥ１阻害薬又は組成物の有効量を投与するステップを含む処置方法を示す。腫瘍に限定されないが、腫瘍を含む疾病の処置にこの方法が使用できる。実施の形態によっては、前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、例えば、腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎臓癌、白血病、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、及び急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）等から選択される。

【0453】

本明細書で使用する用語「被験者」とは、概して、本明細書に記載の薬剤、キット、又は化合物による処置で恩恵を受けることになると思われるヒト、ヒト以外の哺乳類、犬、猫、馬、羊、豚、牛などの霊長類を指す。

【0454】

本明細書で使用する用語「治療効果のある量」とは、概して、本明細書に記載の疾病の処置について適切な投与期間を経れば効果が出る量を指す。

【0455】

本明細書に記載のＳＡＧＥ１遺伝子は、抗腫瘍薬剤の標的として用いられる。本開示は、ＳＡＧＥ１遺伝子が発現しないようにすることで、陽性のＳＡＧＥ１発現を示す様々な腫瘍細胞（例えば、黒色腫細胞Ａ３７５、十二指腸腺癌細胞ＨＵＴＯ８０、結腸直腸腺癌細胞Ｃａｃｏ－２、食道癌細胞ＴＥ１）の増殖、移動等が大幅に阻害できることを発見し、これは、ＳＡＧＥ１が様々な種類の腫瘍の腫瘍促進因子として機能することを意味する。また、ＳＡＧＥ１遺伝子が発現しないようにすることで、ヒト由来の固形腫瘍の成長を大幅に阻害でき、固形腫瘍における腫瘍細胞の死滅が促進されるため、この標的が重要な生理学的機能を有していることが分かる。さらに、ＳＡＧＥ１は様々な腫瘍細胞において特異的に発現するが、精巣以外の正常な組織ではそのようなことはない。ＳＡＧＥ１タンパク質は、通常、核酸にあるが、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってタンパク質のペプチドフラグメントが腫瘍細胞の表面に提示されるので、このことが標的治療における標的の認識及び／又は癌免疫療法における免疫活性化に利用できる。したがって、ＳＡＧＥ１を標的とした遺伝子干渉療法は、特異性が高く、ＳＡＧＥ１発現のない正常な組織に影響を与えることがないので、正常な生理学的機能又は健康を害さない。ＳＡＧＥ１の発現及び／又は機能を阻害するＳＡＧＥ１阻害薬は、臨床腫瘍処置に大きな可能性がある。

【0456】

ｉｉｉ．ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を調節する物質の使用
別の態様において、本開示は、腫瘍の処置用の薬剤又はキットの製造時におけるＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を調節するための物質の使用を示す。

【0457】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を調節するための前記物質は、単一の活性成分である。

【0458】

実施の形態によっては、前記物質は、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能の調節時に使用するためのものである。

【0459】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を調節するための前記物質は、核酸分子、タンパク質分子、及び化合物から選択される。

【0460】

実施の形態によっては、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を調節するための前記物質は、ＳＡＧＥ１阻害薬である。

【0461】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１用の干渉ＲＮＡ、ＳＡＧＥ１用のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＳＡＧＥ１発現をノックアウト又はノックダウンするための薬剤からなる群から選択される。

【0462】

実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＩＮＴＳ３に結合しようとＳＡＧＥ１と競い合う物質であり、且つ／又は前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＩＮＴＳ６及びＩＮＴＳ６Ｌから選択される。

【0463】

実施の形態によっては、前記腫瘍は、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍である。

【0464】

実施の形態によっては、前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、好ましくは、腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎臓癌、白血病、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）から選択される。

【0465】

別の態様において、本開示は、腫瘍の処置時に使用するための組成物を示し、前記組成物は、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能の調節時に使用するための物質を含む。

【0466】

本開示は、多くの研究を重ねる中で、ＳＡＧＥ１すなわちＸ染色体（X:135895410-135913726, Xq26.3）に位置するＣＴ－Ｘ癌精巣抗原が腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、皮膚癌、頭頸部癌、白血病等、様々な腫瘍組織及び細胞で腫瘍特異性抗原として発現し、異常活性の後に様々な種類のヒト腫瘍においてＩＮＴＳ３と新たな機能複合体を形成することを思いがけず発見した。本開示は、ＳＡＧＥ１遺伝子／タンパク質又はＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体遺伝子／タンパク質を特異的に標的とすることで、ＳＡＧＥ１陽性癌細胞の増殖及び足場非依存性成長ならびにインビボ異種移植片の成長が大幅に抑えられることが分かり、これによって、腫瘍の処置に効果的な新たな標的を提供している。

【0467】

別の態様において、本開示は、腫瘍の処置用の薬剤又はキットの製造時におけるＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を調節するための物質の使用を示す。本開示は、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は、ＳＡＧＥ１が発現してＩＮＴＳ３に結合する細胞にのみ存在する一方、ＳＡＧＥ１発現が陰性の細胞には存在しないことを発見した。ＳＡＧＥ１発現の減少による主な差次的遺伝子発現は、ＩＮＴＳ３発現の減少によるそれと一致する。すなわち、ＳＡＧＥ１発現の減少に応じて上昇制御される遺伝子は、ＩＮＴＳ
３発現の減少にも応じて上昇制御され、その逆も然りで、これは、ＳＡＧＥ１がＩＮＴＳ３と複合体を形成することで腫瘍関連遺伝子の発現の制御と変更を行っていることを示唆している。ＩＮＴＳ３とＳＡＧＥ１とは、共働するものであり（synergistic）、１つの複合体ユニットとして機能する。また、ＩＮＴＳ３－ＳＡＧＥ１間の相互作用を乱すことによって、腫瘍細胞の成長を促進するＳＡＧＥ１の能力を完全に消失させ、異種移植片の成長を大幅に阻害することができる。本開示は、腫瘍の成長を阻害するための標的としてＳＡＧＥ１―ＩＮＴＳ３複合体が機能できることを実証する。

【0468】

ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体とは、概して、タンパク質間相互作用で形成されるＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との複合体を指す。通常、ＩＮＴＳ３が二量体を（例えば、溶液内で）形成でき、これがさらに水素結合及び塩橋等の相互作用でＳＡＧＥ１と複合体を形成することができる。ＳＡＧＥ１－ＩＮＳＴ３複合体の結晶構造が取り得る単位格子のパラメータは２６０．１１２±０．１Å、ｂ＝４６．２４０±０．１Å、ｃ＝１０３．１０１±０．１Å、α＝９０±０．１°Å、β＝１１３．２８０±０．１°Å、γ＝９０±０．１°Åである。ＳＡＧＥ１－ＩＮＳＴ３複合体において、ＳＡＧＥ１－ＩＮＳＴ３複合体の形成に関わる主要なアミノ酸残基には、典型的には、Ｆ８３８、Ｆ８７３、Ｋ８７４、Ｒ８７２、Ｍ８３２、及びＱ８４０等が含まれる。

【0469】

本明細書で使用する用語「処置」とは、所望の薬効及び／又は生理学的効果をもたらすことができる予防的、治癒的、又は緩和的な処置を指す。そのような効果は、好ましくは、疾病の１以上の症状を医学的に抑制すること、又は疾病を完全に排除すること、又は疾病の発生を阻止する、もしくは遅らせること、及び／又は疾病の進行もしくは悪化の危険性を低下させることを指す。

【0470】

ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を調節するための物質は、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を阻害する物質であり得る。例えば、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を阻害するための物質は、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を部分的に阻害、すなわち抑制してもよく、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を完全に阻害、すなわち完全に排除してもよい。ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を阻害するための物質は、上記の機能を果たすことができる物質（例えば、核酸分子、タンパク質分子、又は化合物等）であれば、いかなる物質でもよい。

【0471】

ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能を調節するための物質は、ＳＡＧＥ１阻害薬であり得る。ＳＡＧＥ１阻害薬は、ＳＡＧＥ１の発現及び／又は機能を部分的に阻害できる、すなわち抑制できるか、ＳＡＧＥ１の発現及び／又は機能を完全に阻害できる、すなわち排除できるが、この機能には、ＩＮＴＳ３に結合してＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体を形成するＳＡＧＥ１の能力が含まれる。ＳＡＧＥ１阻害薬として機能できる薬剤の種類は、当業者に公知のものである。例えば、阻害薬は拮抗薬及び遮断薬等である。別の例として、阻害薬は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）レベル又はタンパク質レベルでＳＡＧＥ１発現を阻害できる。さらに別の例として、阻害薬は、ＩＮＴＳ３に結合しようとＳＡＧＥ１と競い合う薬剤であり得る。実施の形態によっては、前記ＳＡＧＥ１阻害薬は、核酸分子、タンパク質分子、又は化合物等である。核酸分子は、ＳＡＧＥ１に対する干渉ＲＮＡ、ＳＡＧＥ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＡＧＥの発現をノックアウト又はノックダウンするための薬剤から選択されてよい。具体的には、ＳＡＧＥ１阻害薬は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、遺伝子ノックアウトベクター、又はｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくは干渉ＲＮＡ等を発現できる遺伝子発現ベクターであり得る。タンパク質分子は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい抗ＳＡＧＥ１抗体から選択されてよい。一例として、ＩＮＴＳ３と結合しようとＳＡＧＥ１と競い合える薬剤は、ＩＮＴＳ６（DDX26, Accession: NP_036273.1）又はＩＮＴＳ６Ｌ（DDX26b,
Accession: Q8BND4.1）又はその組み合わせであり得る。実施の形態によっては、前記核酸分子は、SEQ ID Nos. 59-67のいずれかに示される配列を含む標的配列を標的とする。ある実施の形態では、前記核酸分子のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID Nos. 87-95のいずれかに示される配列を含む。ある実施の形態では、前記核酸分子のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID Nos. 96-99のいずれかに示される配列を含む。

【0472】

本明細書に開示した薬又はキットでは、ＳＡＧＥ１阻害薬を単一の活性成分として、又はその他の活性成分と組み合わせて、腫瘍の処置に用いることができる。

【0473】

本明細書に開示した薬又はキットで処置を施される腫瘍は、ほとんどの場合、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍である。ＳＡＧＥ１陽性又は陽性のＳＡＧＥ１発現とは、概して、ＳＡＧＥ１発現が存在すること、又は基準に対してＳＡＧＥ１発現のレベルが高いことを指す。ある実施の形態では、陽性ＳＡＧＥ１発現は、腫瘍組織におけるＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの検出可能な発現によって示される。ある実施の形態では、陽性ＳＡＧＥ１発現は、腫瘍組織におけるＳＡＧＥ１の検出可能な発現によって示される。ある実施の形態では、陽性のＳＡＧＥ１発現は、腫瘍組織において、周囲の健康な組織と比較して高いＳＡＧＥ１ｍＲＮＡの発現が検出されることで示される。ある実施の形態では、陽性のＳＡＧＥ１発現は、腫瘍組織において、周囲の健康な組織と比較して高いＳＡＧＥ１タンパク質の発現が検出されることで示される。実施の形態によっては、前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、例えば、腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎臓癌、白血病、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、及び急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）等から選択される。

【0474】

別の態様において、本開示は、腫瘍の処置時に使用するための組成物を示し、前記組成物は、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体の発現及び／又は機能の調節時に使用するための、本明細書に開示した物質を含む。

【0475】

別の態様において、本開示の処置方法は、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体もしくは本明細書に開示した複合体の発現及び／又は機能を調節できる物質の有効量を被験者に投与するステップを含む。腫瘍に限定されないが、腫瘍を含む疾病の処置にこの方法が使用できる。実施の形態によっては、前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、例えば、腸癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌、腎臓癌、白血病、結腸腺癌（ｃｏａｄ）、肝臓肝細胞癌（ｌｉｈｃ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ｏｖ）、子宮体部内膜癌（ｕｃｅｃ）、甲状腺癌（ｔｈｃａ）、皮膚皮膚黒色腫（ｓｋｃｍ）、肺腺癌（ｌｕａｄ）、頭頸部扁平上皮癌（ｈｎｓｃ）、多形性膠芽腫（ｇｂｍ）、前立腺腺癌（ｐｒａｄ）、胸腺腫（ｔｈｙｍ）、脳低悪性度神経膠腫（ｌｇｇ）、直腸腺癌（ｒｅａｄ）、褐色細胞腫および傍神経節腫（ｐｃｐｇ）、食道癌（ｅｓｃａ），腎臓腎明細胞癌（ｋｉｒｃ）、子宮頸部扁平上皮癌および内頸部腺癌（ｃｅｓｃ）、膀胱尿路上皮癌（ｂｌｃａ）、腎臓乳頭状腎細胞癌（ｋｉｒｐ）、膵臓腺癌（ｐａｄ）、胃腺癌（ｓｔａｄ）、腎臓嫌色素性腺腫（ｋｉｃｈ）、乳房浸潤癌（ｂｒｃａ）、肺扁平上皮癌（ｌｕｓｃ）、肉腫（ｓａｒｃ）、及び急性骨髄性白血病（ｌａｍｌ）等から選択される。

【0476】

本発明において、「被験者」には、概して、製剤、キット、又は複合製剤による処置で
恩恵を受けることになると思われるヒト、ヒト以外の哺乳類、犬、猫、馬、羊、豚、牛などの霊長類が含まれる。

【0477】

本発明において、「治療効果のある量」とは、概して、適切な投与期間を経れば上記疾病の処置の効果が得られる量を指す。

【0478】

本明細書に記載のＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は、抗腫瘍薬剤の標的として用いられる。ＳＡＧＥ１は、黒色腫、膀胱癌、肝臓癌、類表皮癌、非小細胞肺癌、及び扁平上皮癌等の様々な腫瘍の細胞表面で発現するが、精巣以外の正常な組織では通常は発現しない。ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は、ＳＡＧＥ１発現が陽性のいかなる種類の腫瘍の治療標的としても効果的に機能でき、ＳＡＧＥ１発現が陽性の腫瘍の割合が比較的高い。ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体は、標的治療に用いられてきた他の標的とは異なる。遺伝子の変異ではなく、新たな複合体でＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３とが相互に作用することで、標的治療における作用機序の基礎ができる。これは、生理学的条件下において、ＳＡＧＥ１発現が通常、精巣等の生殖器系でしか見られず、脳では低いレベルでみられるものの、他の組織ではみられない一方、ＳＡＧＥ１は様々な腫瘍組織ごとに異なる頻度で特異的に発現するという事実に基づくものでもある。精巣及び脳の内部のバリアによって、ＳＡＧＥ１／ＳＡＧＥ１－ＩＮＳＴ３遺伝子／タンパク質を特異的に標的としても正常な組織には影響しない。

【実施例】

【0479】

特定の実施の形態（そのうちのいくつかは好適な実施の形態である）を参照し、本開示を具体的に示して説明してきたが、本明細書に開示した開示内容の趣旨を逸脱しない限り、形態及び詳細について様々な変更が加えられてよいことは当業者には理解されることである。

【0480】

実施例で用いる材料及び方法は、このセクションの最後に記載する。

【0481】

実施例１：正常な組織及び癌組織におけるＳＡＧＥ１発現の分布

【0482】

ＳＡＧＥ１発現は精巣に限定され、体細胞組織の大部分でほとんど又は全く発現しない（図１Ａ及び図１Ｂ）。ＧＴＥｘウェブサイト（https: //gtexportal. org/home/gene/）で可視化のために使用した各遺伝子のＴＰＭ値をＧＴＥｘウェブサイト（https: //gtexportal. org/home/datasets）からダウンロードした。

【0483】

癌組織の場合、ほぼ全ての悪性腫瘍で異常に発現した（図１Ｂ）。ＴＣＧＡプロジェクトにおける各遺伝子のＦＰＫＭ値は、ＧＤＣウェブサイト（https: //portal. gdc. cancer. gov）から取得しており、exp(log(FPKM) -log(sum(FPKM)) + log(10⁶))の式を使って、ＴＰＭに変換している。

【0484】

実施例２：ＴＣＧＡにおける癌の種類ごとの全生存期間分析及びＳＡＧＥ１発現レベルのパターン

【0485】

ＳＡＧＥ１は、その発現が癌細胞の増殖を促進し、癌患者の予後の悪さと関連する癌増殖遺伝子として同定される（図１Ｃ）。癌におけるＳＡＧＥ１発現の生物学的意義を理解するために、ＴＣＧＡデータセットを用いて生存曲線の分析を行った。汎癌におけるＳＡＧＥ１の存在が予後の悪さに関連していた。また、汎癌におけるＳＡＧＥ１発現のレベルが高いほど全生存期間が短くなることが分かり、このことは、ＳＡＧＥ１の発現が疾病のステージの進行及び予後の悪さと関連する傾向があることを示唆している。

【0486】

ＴＣＧＡにおける癌の種類ごとにＳＡＧＥ１発現レベルを分析し、正規化した個数に応じて、陰性（0RESM）、低発現（0.1857-11.2969RESM）、及び高発現（>11.30RESM）の３つのグループに分類した。

【0487】

実施例３：多様な腫瘍組織ごとのＳＡＧＥ１発現レベル及びＩＨＣ染色によるＰＤＸマウス処置効果実験

【0488】

正常な組織では発現が限定的であることに関し、健康な組織又は前癌部と比較して、精巣癌以外の多くの癌タイプ及び癌細胞株でＳＡＧＥ１が高発現であることが分かった。

【0489】

組織学的に、ＳＡＧＥ１ノックダウン腫瘍では、ＩＨＣ染色で示すとおり、ＳＡＧＥ１発現及び細胞増殖レベルの両方が実質的に抑制された（図４Ｌ）。顕著なことに、ｓｈＳＡＧＥ１処置後のＬＵＳ－Ｐにおける７つの腫瘍のうち、４つはエンドポイントで検出不能となっており、残りの３つの残渣塊は線維性炎症となっていたものの病理学検査及びＩＨＣ検査で確認できる癌の遺残はみられなかった。

【0490】

実施例４：ＳＡＧＥ１陽性癌細胞はＳＡＧＥ１に依存する

【0491】

癌におけるＳＡＧＥ１の機能を調査するため、まず、腫瘍組織のウェスタンブロッティング（Western blotting）及びｑＰＣＲ分析（図２Ｂ）によってＳＡＧＥ１陽性癌細胞株（図２Ｃ）を同定した。５つの癌細胞株（図３Ａ）におけるＳＡＧＥ１（ＳＡＧＥ１－ＫＤ）に対し、短ヘアピンＲＮＡ（SEQ ID NO: 33 GCTGCAGTCACTCACAACAに示される配列を標的とするｓｈＲＮＡ Ｙ１２６８２（SEQ ID NO: 128））を運ぶレンチウイルスによってＳＡＧＥ１をノックダウンすると、リアルタイム細胞解析（ＲＴＣＡ）及び足場非依存性成長アッセイの両方で細胞の成長が鈍くなった（図３Ｂ）。さらにＳＡＧＥ１のインビボ機能を調査するため、ＨｕＴｕ８０親細胞及びＳＡＧＥ１－ＫＯ細胞を並行して皮下注射することでヌードマウスにおける異種移植片の成長を調べた。親の異種移植片に比べ、ＳＡＧＥ１－ＫＯ ＨｕＴｕ８０異種移植片には著しい成長抑制がみられた（図３Ｃ）。また、ＳＡＧＥ１陽性のブドウ膜黒色腫細胞株（ＭＵＭ２Ｂ）由来の直交異方性モデルにおいて、ＳＡＧＥ１がノックダウンされると、コントロールグループに比べて輝度シグナルが大幅に低下するが（Ｐ＜０．００１、図３Ｄ）、眼内播種の５日後にベースラインを撮像すると、同じ輝度を示す（図３Ｄ）。さらに、ＳＡＧＥ１－ＫＤグループの生存期間の方がかなり優れていることが観察された（図３Ｅ）。まとめると、これらの結果によって、ＳＡＧＥ１がＳＡＧＥ１陽性癌細胞の腫瘍形成上の成長にとって重要であることが実証された。定量ＰＣＲで異なるｓｉＲＮＡ（SEQ ID NOs: 70-81）を用いてＫＹＳＥ３０におけるＳＡＧＥ１ＫＤの能力をテストした（図３Ｆ）。

【0492】

実施例５：ＳＡＧＥ１が癌細胞の増殖及び細胞周期に関わる複数の経路を制御する

【0493】

癌細胞におけるＳＡＧＥ１の機能をタンパク質レベルでさらに調査するため、これらの成長因子によって活性化される受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のタンパク質の産物について、ＳＡＧＥ１欠失癌細胞では、リン酸化レベルが低くなるであろうとモニタリングした。ＳＡＧＥ１－ＫＤ Ｈｕｔｕ８０細胞においては確かに、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、Ｍｅｔ、Ｋｉｔ、ＦＬＴ３、及びＰＤＧＦαのリン酸化が明らかに抑制されており、ＳＡＧＥ１がＲＴＫ介在経路の制御において重要な役割を担っていることが強く示唆された。また、Ｗｎｔ、ＴＧＦ－－β、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、及びＮｏｔｃｈ経路における主要なシグナル分子のリン酸化が著しく抑制されていることを観察し、これらの経路もまたＳＡＧＥ１によって制御されていることを確認した。ウェスタンブロッティング（Western blotting）による分析によれば、ＳＡＧＥ１－ＫＤ細胞においてＳＡＧＥ１制御転写因子のタンパク質が明らかに減少していることも分かった（図９Ａ）。

【0494】

これらのＳＡＧＥ１制御経路すべての主な下流効果は、細胞増殖である。癌細胞の増殖に関するＳＡＧＥ１の効果を直接的に評価するため、ＷＴ及びＳＡＧＥ１－ＫＤの両方の状態における複数のＳＡＧＥ１陽性癌細胞株の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析を行った。定量的測定によって、ＳＡＧＥ１をノックダウンすると細胞周期のＧｏ／Ｇ１期で静止し、Ｇ２／Ｍ期に入らないようにブロックされることが分かり（図９Ｂ）、ＳＡＧＥ１がＳＡＧＥ１陽性癌細胞における細胞増殖の重要な役割を担っていることが示唆された。

【0495】

患者由来の初代腫瘍細胞におけるＳＡＧＥ１の機能をさらに調査するため、初代ＨＣＣ－Ｐ細胞におけるＨＣＣ－Ｐコントロール及びＳＡＧＥ１－ＫＤに対してＷＢ及びＴＭＴ標識化ＭＳ－ｂａｃを行った（図９Ｃ及び図９Ｅ）。その結果、ＲＴＫ、細胞周期に関連するタンパク質、及び転写因子の発現がＳＡＧＥ１に依存していることが分かり、ＨＣＣ－Ｐ細胞における遺伝子発現プログラムは、ＨｕＴｕ８０細胞の場合と同様に、ＳＡＧＥ１によって制御されていることが示された。これと同じく、ＦＡＣＳ及びＫｉ６７染色データからもＧｏ／Ｇ１期で明らかに静止することが見てとれ（図９Ｄ）、ＭＳ分析によって、ＳＡＧＥ１－ＫＤ ＨＣＣ－Ｐ細胞においてほとんどの細胞周期遺伝子の発現が減少したことが明らかになった。これらの結果から、ＳＡＧＥ１が初代肝臓癌細胞における細胞周期制御にも不可欠であることが分かった。まとめると、ＳＡＧＥ１が複数の癌経路を活性化させることで腫瘍細胞を増殖させる汎癌マスター調節因子であることが我々の分析で実証された。

【0496】

実施例６

【0497】

患者由来の組織及び初代腫瘍細胞におけるＳＡＧＥ１の機能をさらに調査するため、ＳＡＧＥ１についてｑＰＣＲ及びウェスタンブロッティングによる分析を行った（図２Ｂ及び図２Ｃ）。正常な組織では発現が限定的であることに関し、健康な組織又は前癌部と比較して、多数の癌細胞株及び腫瘍組織でＳＡＧＥ１が高発現であることが分かった。さらに、６０個の大腸癌（ＣＲＣ）組織及び対応する前癌部のｑＰＣＲ分析によって、このＳＡＧＥ１の癌特異性発現プロファイルを確認した（図２Ｄ）。

【0498】

実施例７．ＳＡＧＥ１を標的とすると癌の進行を妨げる新たなアプローチの効果を高める

【0499】

次に、ＳＡＧＥ１陽性癌細胞の増殖にはＳＡＧＥ１が必要であることから、ＳＡＧＥ１を標的とすることが有効な抗癌治療ストラテジーになるか否かを直接評価した。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって初期継代の患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）の大型パネルをスクリーニングし、ＳＡＧＥ１陽性腫瘍を探した（図１５）。異なる癌タイプに由来する７つのＳＡＧＥ１陽性ＰＤＸ、すなわち、肝細胞癌（ＨＣＣ－Ｐ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳ－Ｐ）、肺腺癌（ＬＵＡ－Ｐ）、結腸癌（ＣＲＣ－Ｐ）、口腔咽頭扁平上皮癌（ＯＳＣ－Ｐ）、胆嚢癌（ＧＢＣ－Ｐ）、及び食道扁平上皮癌（ＥＳＣ－Ｐ）をインビボＳＡＧＥ１－ＫＤ治療のために用意した。２つのＳＡＧＥ１陰性ＰＤＸ、すなわちＨＣＣ－Ｎ及びＬＵＳ－Ｎをコントロールとして用いた。

【0500】

ｓｈＲＮＡ８２（SEQ ID NO: 80）をアデノウイルスに組み込み、ＰＤＸマウスに投与した。この処置によって腫瘍の体積及び重量が８５％以上の平均成長抑制率（Ｐ＜０．００１）で著しく減少し、ＳＡＧＥ１が腫瘍の成長において重要な役割を担っていることを示した（図４Ａ～図４Ｌ）。顕著なことに、ｓｈＳＡＧＥ１処置後のＬＵＳ－Ｐにおける７つの腫瘍のうち、４つはエンドポイントで検出不能となっており、残りの３つの残渣塊は線維性炎症となっていたものの病理学検査及びＩＨＣ検査で確認できる癌の遺残はみら
れなかった（図４Ｊ～図４Ｌ）。全く対照的に、２つのＳＡＧＥ１陰性腫瘍、すなわちＨＣＣ－Ｎ及びＬＵＳ－Ｎにおいて、同じアデノウイルス処置を施したが、投与期間中に腫瘍の成長について目立った効果はなく、平均成長抑制率は３．０８％であり、ＳＡＧＥ１陽性ＰＤＸにみられた腫瘍の抑制がＳＡＧＥ１に特異的であったことが強く示唆された（図４Ｍ～図４Ｏ）。特筆すべきは、ｓｈＳＡＧＥ１で処置を施した動物について、体重、外見、及び行動パターンに大きな変化はなく、臓器損傷の兆候もなかった（図４Ｏ）ことであり、ｓｈＳＡＧＥ１の投与について、臓器レベルでも生体内レベルでもオフターゲット効果は検出されなかったことになる。まとめると、我々の前臨床データによれば、ＳＡＧＥ１は複数の癌タイプの腫瘍形成上の成長にとって重要である。ＳＡＧＥ１のノックダウンが腫瘍の成長を鈍化させるということは、このような腫瘍がＳＡＧＥ１に依存してきているということ、また、ＳＡＧＥ１を標的とすることがＳＡＧＥ１陽性腫瘍に対する新たな治療ストラテジーになり得るということを示唆している。

【0501】

実施例８．癌細胞におけるＩＮＴＳ３との結合のためにＳＡＧＥ１がＩＮＴＳ６と競い合う

【0502】

腫瘍形成におけるＳＡＧＥ１の機能を力学的に洞察するため、抗ＳＡＧＥ１抗体によってＨｕＴｕ８０細胞に引きこまれた内因性ＳＡＧＥ１複合体のプロテオーム解析を行った。この複合体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分解され、銀染色によって可視化させて、ＭＳ分析が行われた（図６Ａ及び図１４Ａ～図１４Ｄ）。ＣＢＰ（ＣＲＢＰ結合タンパク質）、ＴＬＥ（Groucho/Transducin-Like Enhancer of Split）タンパク質、ＩＮＴＳ３（インテグレータ複合体の成分）、及びＩＮＴＳ３結合パートナーであるＮＡＢＰ（核酸結合タンパク質）及びＩＮＩＰ（ＩＮＴＳ３とＮＡＢＰとの相互作用タンパク質）（図６Ｂ）等、転写制御に関連付けられていた多数のタンパク質を信頼性の高いＳＡＧＥ１の相互作用分子として再現性のある方法で同定した。特に、他のＳＡＧＥ１発現癌細胞株におけるＳＡＧＥ１複合体のプロテオーム解析でも同じグループのタンパク質を同定したので、これらのタンパク質が、癌細胞において、ＳＡＧＥ１と相互作用する真の因子であることが強く示唆された（図６Ｂ）。ＳＡＧＥ１とこれらのタンパク質との相互作用は、さらに、免疫共沈降（ｃｏ－ＩＰ）分析によって確認された（図６Ｃ及び図６Ｄ）。

【0503】

ＩＮＴＳ３（ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ、残基５７２～９７８、SEQ ID NO: 9）のＣ末端ドメインがＩＮＴＳ６（残基８０３～８８７、SEQ ID NO: 10）のＣ末端における小さなドメインとの直接的な相互作用を仲介することは、過去の研究で示唆されていた。このデータと一致するが、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ及びＩＮＴＳ６_{８０３－８８７}を同時に精製し、これらがサイズ排除クロマトグラフィー分析が可能な、安定した二元複合体を形成したことが分かった（図８Ａ及び図８Ｂ）。興味深いことに、ＳＡＧＥ１の小さなＣ末端領域（残基８１８～９０４、SEQ ID NO: 8）は、ＩＮＴＳ６_{８０３－８８７}と配列がよく似ているので（４３％の同一性及び８２％の類似性）（図６Ｅ及び図６Ｆ）、ＳＡＧＥ１_{８１８－９０４}がＩＮＴＳ６_{８０３－８８７}に似た３次元構造を有する可能性が高く、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤとの相互作用も仲介し得ることが分かる。確かに、ＳＡＧＥ１_{８１８－９０４}は平衡解離定数が～３９ｎＭでＩＮＴＳ３_ＣＴＤに結合できることは等温熱量（ＩＴＣ）測定によって分かっている（図６Ｇ）。したがって、以降はＳＡＧＥ１_{８１８－９０４}及びＩＮＴＳ６_{８０３－８８７}をそれぞれＳＡＧＥ_Ｉ３ＢＤ及びＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤ（ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ６とのＩＮＴＳ３結合ドメイン）と呼ぶ（図６Ｅ）。

【0504】

ＳＡＧＥ_Ｉ３ＢＤがＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤとよく似ているため、これらはＩＮＴＳ３_ＣＴＤと互いに排他的な方法で相互作用する可能性が高い。この発想をテストするため、精製したＩＮＴＳ３_ＣＴＤ－ＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤ複合体をＧＳＴタグＳＡＧＥ_Ｉ３ＢＤと混ぜ合わせ、ＧＳＴプルダウン解析を行った。このインビトロ競合アッセイによって、ＳＡＧＥ_Ｉ３ＢＤが確かにＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤと競い合い、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤとより高い親和性
で結合するということがはっきりと分かった（図６Ｈ）。このインビボ競合をさらにテストするため、ＳＡＧＥ１陰性２９３Ｔ細胞におけるＩＮＴＳ３相互作用タンパク質をＩＰ－ＭＳ分析で調べた。抗ＩＮＴＳ３抗体は、ＩＮＴＳ６とインテグレータのその他の成分すべてとをプルダウンできたことから、ＩＮＴＳ３は２９３Ｔ細胞においてインテグレータのサブユニットとして存在していると思われる（図６Ｉ）。これに対し、同じアプローチではＳＡＧＥ１過剰発現２９３Ｔ細胞におけるＩＮＴＳ６をプルダウンすることはできなかった（図６Ｉ）。その代わり、ＳＡＧＥ１はプルダウンアッセイで確実に検出できることから（図６Ｉ）、２９３Ｔ細胞において異所的に発現したＳＡＧＥ１がＩＮＴＳ３－ＩＮＴＳ６間の相互作用を妨げ、インテグレータからＩＮＴＳ３を取ることで新たにＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体を形成できるということが分かった。

【0505】

実施例９．ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ－ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ複合体の結晶構造

【0506】

ＳＡＧＥ１がＩＮＴＳ３と相互作用するためにＩＮＴＳ６とどのように競い合うかを理解するため、まず、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤの結晶構造を単波長異常分散（ＳＡＤ）法によって２．３Åの解像度で決定した（図７Ａ、ＰＤＢにおいてコード７Ｃ５Ｔで保管されている座標）。ＩＮＴＳ３_ＣＴＤは、密集した２３個のヘリックスからなり、立体配座は細長い棒状になっている（図７Ａ）。特に、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤは、結晶に二量体の立体配座が採用され、その二量体界面には、疎水性相互作用と静電相互作用の両方がみられ、全体で１６２０Åの溶媒露出表面積を持つ（図８Ｃ、図８Ｄ、及び図８Ｅ）。較正サイズ排除クロマトグラフィーを用いた実験によって、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤの溶出ピークが～９５ｋＤａの分子量に相当することが分かり（図８Ａ）、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤも溶液中で二量体として存在することが確認された。また、ＩＮＴＳ３－ＩＮＴＳ６タンパク質複合体も精製した（図８Ｂ）。

【0507】

次に、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ複合体を結晶化し、その構造を２．９Åの解像度で分子置換によって決定した（図７Ｂ～図７Ｄ及び図１２、ＰＤＢにコード７Ｃ５Ｕで保管されている座標）。ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ複合体の構造において、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ分子は、１対２の化学量論組成比でＩＮＴＳ３_ＣＴＤの二量体に結合する（図７Ｂ）。なお、ＩＴＣ測定値からもＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ間の相互作用における化学量論組成比が１対２であることが分かった（図７Ｈ）。ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤは、４本のヘリックス束であり、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体のジョイント部分に位置する（図７Ｂ～図７Ｄ）。ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤにおいてヘリックスをつなげる２本の内部ループが疎水性相互作用と静電相互作用の両方によってＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体との接触を仲介する（図７Ｅ及び図８Ｆ）。ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体における接触面は、酸性度が高く、電荷相補性および形状相補性の両方によって、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤの塩基性残基のパネル（Ｌｙｓ８３３、Ａｒｇ８３６、Ａｒｇ８７２、及びＬｙｓ８７４）と相互作用する（図８Ｆ及び図８Ｇ）。この酸性のＩＮＴＳ３_ＣＴＤ表面の中心付近には疎水性ポケットが２つ隣接してある。Ｐｈｅ８３８^{ＳＡＧＥ１}の側鎖がキャビティが深い方のポケットに入り込み、もう１つのフェニルアラニンＰｈｅ８７３^{ＳＡＧＥ１}が浅い方に置かれる。なお、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤはＩＮＴＳ３_ＣＴＤの二量体状態には干渉しないが、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体に結合することで、Ｐｈｅ８０５^{ＩＮＴＳ３}及びＴｙｒ８０８^{ＩＮＴＳ３}の芳香族側鎖の構造が対称から非対称へ遷移し、これによって、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤと効率的に結合するための２つの疎水性ポケットが形作られる（図７Ｅ、図８Ｃ、図８Ｅ、及び図８Ｆ）。ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ二量体及びＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３^ＣＴＤ複合体の相互作用に関わった残基は同定される（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。

【0508】

ＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤとＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤとは配列の一致度が高いことから、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ複合体構造に基づいてＩＮＴＳ３_ＣＴＤ－ＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤ界面をモデリングした。予想通り、プロリン置換（Ｐｈｅ８３８^{ＳＡＧＥ１}からＰｒ
ｏ８２３^{ＩＮＴＳ６}）以外、ＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３_ＣＴＤ界面は、ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤとＩＮＴＳ３_ＣＴＤとの界面とほぼ同じである（図７Ｆ）。なお、このプロリン置換は、エネルギー的に好ましくないキャビティを生むことが予想されるもので、ＩＮＴＳ６_Ｉ３ＢＤとＩＮＴＳ３_ＣＴＤとの相互作用の弱さの理由である（図７Ｆ）。このように、これらの構造データは、癌細胞におけるＳＡＧＥ１発現によってＩＮＴＳ３とＩＮＴＳ６との相互作用が妨げられ、新たにＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３複合体が形成され得ることの確かな根拠となる。

【0509】

実施例１０：ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３間の相互作用が癌細胞の増殖に不可欠である

【0510】

ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３間の相互作用のインビボ機能を研究するため、まず、ＩＮＴＳ３とＳＡＧＥ１の欠失変異体（ＳＡＧＥ１_{ΔＩ３ＢＤ}）との相互作用を調べた。Ｃｏ－ＩＰ実験によって、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３間の相互作用にはＳＡＧＥ１のＩ３ＢＤドメインが必要であることが分かった（図７Ｇ）。次に、Ｐｈｅ８３８等の界面にある６つの重要な残基がアラニンに置換された変異ＳＡＧＥ１（ＳＡＧＥ１ｍｕｔ）を生成し、これらの変異によってＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３間の相互作用が完全に無くなったことを確認した（図７Ｇ及び図７Ｈ）。Ｃｏ－ＩＰデータによれば、ＩＴＣ分析では、ＩＮＴＳ３_ＣＴＤと変異ＳＡＧＥ１_Ｉ３ＢＤとの検出可能な相互作用は認められず（図７Ｈ）、結晶構造におけるＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との観察界面がＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３間の相互作用に不可欠であることが裏付けられた。

【0511】

ＳＡＧＥ１とＩＮＴＳ３との相互作用が癌細胞の増殖に重要であるか否かを調べるために、野生型（ＷＴ）ＳＡＧＥ１及び変異ＳＡＧＥ１をそれぞれＳＡＧＥ１－ＫＯ ＨｕＴｕ８０細胞及びＳＡＧＥ１－ＫＤ Ｃａｃｏ２細胞に導入した。ＷＴ ＳＡＧＥ１の発現によって両方の細胞株で細胞の成長が復活し、ＳＡＧＥ１－ＫＯ ＨｕＴｕ８０細胞及びＳＡＧＥ１－ＫＤ Ｃａｃｏ２細胞で観察された抑制がＳＡＧＥ１に特異的であったことが裏付けられた（図７Ｉ及び図７Ｊ）。全く対照的に、ＳＡＧＥ１ｍｕｔでは、ＷＴ ＳＡＧＥ１よりもさらに高いレベルで発現したものの、細胞増殖能は回復しなかった。次に、軟寒天及び異種移植片によるアッセイにおいて、ＷＴ又は変異ＳＡＧＥ１で復活したＳＡＧＥ１－ＫＯ ＨｕＴｕ８０細胞を用いて、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３間の相互作用の影響をさらに調査した。細胞成長データと一致するが、変異ＳＡＧＥ１ではなく、ＷＴの異所性発現によって、ＳＡＧＥ１－ＫＯ ＨｕＴｕ８０細胞の足場非依存性成長が助けられることで腫瘍の体積及び重量が増加する（図７Ｋ及び図７Ｌ）。まとめると、これらの変異解析によって、ＳＡＧＥ１－ＩＮＴＳ３間の相互作用が癌細胞の増殖に不可欠であること、また、この相互作用を妨げることでＳＡＧＥ１の腫瘍形成機能を弱めることができることが分かった。

【0512】

実施例１１：尾静脈注射アッセイによるインビボ転移分析

【0513】

この実験では、インビボ腫瘍形成転移にとってＳＡＧＥ１が重要であることが示される。ＳＡＧＥ１のノックダウンが腫瘍の転移を鈍化させるということは、このような腫瘍がＳＡＧＥ１に依存してきているということ、また、ＳＡＧＥ１を標的とすることがインビボＳＡＧＥ１陽性腫瘍に対する新たな治療ストラテジーになり得るということを示唆している。

【0514】

転移の実験モデルでは、ｓｈＳＡＧＥ１処置によって腫瘍の転移が抑制された。尾静脈にＨＣＣ－Ｐ、ＬＵＡＤ－Ｐ、ＬＵＳＣ－ＰのＰＤＸ由来の細胞を注射した。７～１０日後、尾静脈注射によってマウス１匹あたり４×１０^１１個のゲノムコピーでＡＡＶ制御又はＡＡＶ－ＳＡＧＥ１（SEQ ID NO: 33 GCTGCAGTCACTCACAACAに示される配列を標的としたｓｈＲＮＡ Ｙ１２６８２（SEQ ID NO: 128）を運ぶもの）の処置をレシピエントに施
した。７０～９０日後、転移性腫瘍の存在について、ＰＥＴ－ＣＴでこれらの動物の評価を行った。マウスの健康状態が悪化した場合、予定を早めて分析を行った。全身腫瘍組織量を体積×ＳＵＶ－ｂｗ平均値で計算し、Ｔ検定で分析した。ＨＣＣ－Ｐマウスの生存時間を計算し、カプラン・マイヤー法で分析した。マウスを安楽死させ、臓器を解剖し、ヘマトキシリン・エオジン及びＭＨＣ－Ｉで染色することで転移性腫瘍の存在について評価を行った（図５Ａ～図５Ｃ）。

【0515】

実施例１２

【0516】

ＳＡＧＥ１が高発現であることが腫瘍のドライバー変異と関連しているのか否かをさらに研究するため、ＴＣＧＡデータでさらなる分析を行った（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。このＳＡＧＥ１高発現患者の場合、ＳＡＧＥ１の高発現（ＳＡＧＥ１の発現レベルの上位６％）と相関性が高いＴＰ５３の体細胞変異及びタンパク質のみをコードするＴＰ５３の変異が残った（Frame_Shift_Del、Frame_Shift_Ins、In_Frame_Del、In_Frame_Ins、Missense_Mutation、Nonsense_Mutation、Nonstop_Mutation、Splice_Site、及びTranslation_Start_Site）。

【0517】

実施例１３：ＳＡＧＥ１遺伝子の局在性、制御、メチル化に関する分析

【0518】

肉腫抗原１（ＳＡＧＥ１）は、Ｘ染色体に位置するＣＴＡ遺伝子であって、推定９０４アミノ酸タンパク質をコードし、Ｘｑ２６．３、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３（Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 13）に位置する、遺伝子ＩＤ:55511のＳＡＧＥ１肉腫抗原１［ホモ・サピエンス（ヒト）］であって、ヒト遺伝子の特定位置は、ChrX: 135,893,700..135,913,062である（図１１Ａ）。

【0519】

さらにＣＡＧＥ（cap analysis of gene expression）分析によって、Ｋ５６２において、ＳＡＧＥ１の転写開始部位はChrX: 135893700（すなわち第１エクソンの５’端）付近に位置することが分かった（白矢印）。ＣｈＩＰ分析では、ＳＡＧＥ１が活性化された場合、明らかなＨ３Ｋ２７Ａｃ及びＨ３Ｋ４Ｍｅ３修飾シグナル（灰色矢印）及び多数の転写因子結合シグナル（黒矢印）が部位付近にあったことが分かった（図１１Ｂ）。

【0520】

全ゲノムＤＮＡメチル化配列（全ゲノム重亜硫酸塩配列決定ＷＧＢＳ（Whole Genome Bisulfite Sequencing））分析によって、ＳＡＧＥ１の転写開始部位の２ｋｂ（－１ｋｂ～１ｋｂ）以内においてＤＮＡメチル化修飾に明らかな違いがある（chrX: 135, 892, 700-135, 894, 700）（紫矢印）ことが分かり、高ＳＡＧＥ１発現の細胞は、この部位でのＤＮＡメチル化レベルが低く、低ＳＡＧＥ１発現の細胞又はＳＡＧＥ１発現がない細胞は、この部位でのＤＮＡメチル化レベルが高い。これにより、ＤＮＡ脱メチル化がＳＡＧＥ１発現の制御に関わっていることが分かる（図１０Ｃ）。
方法：

【0521】

１．全生存期間

【0522】

カプラン・マイヤー法でログランク検定を用いて生存期間の分析を行った。全生存期間とは、最初の外科的切除から死亡時又は最後の経過観察時（打ち切り）までの期間とした。陰性（0RESM）、低発現（0.1857-11.2969RESM）、高発現（>11.30RESM）に準じて、ＴＣＧＡデータベースを陰性グループ、低レベルＳＡＧＥ１発現グループ、及び高レベルＳＡＧＥ１発現グループに分類した。

【0523】

Ｒソフトウェア、バージョン４．０．２を用いて全ての分析を行った。両側ｐ値＜０．０５は、統計的には大きいと考えられる。

【0524】

２．足場非依存性成長アッセイ

【0525】

軟寒天コロニー形成試験では、０．３５％のFisher低融点寒天を含む成長培地に２×１０３個の細胞を加え、６ウェルプレートにおける０．７％Sigma寒天ベッド上に重ねた。続いて、培養皿を冷蔵庫（４℃）に移して１５分置き、室温で１０分置いた後、細胞培養インキュベータ（３７℃）に移した。細胞培地は３日ごとに補充した。２～３週間後、培地をオーバーナイトでpiodonitroneotetrazolium violet（Sigma-Aldrich、#146-68-9）染色し、MiniCount Colony Counter（Imaging Products International、#013100708）を用いて撮像した。コロニーを数え、３つの個別実験から平均値±ＳＤとしてデータ化した。

【0526】

３．ＷＢ

【0527】

次に挙げる抗体、すなわち、ウサギ抗ＳＡＧＥ１ポリクローナル抗体（Novus Biologicals、#NBP1-84355）、ウサギ抗ＩＮＴＳ３ポリクローナル抗体（Novus Biologicals、#NBP1-19091）、マウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Proteintech、#66005-1-Ig）、ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（Proteintech、#20543-1-AP）、マウス抗ＳＴＲＥＰＩＩモノクローナル抗体（Abcam、#ab184224）、ウサギ抗ＴＬＥ３ポリクローナル抗体（Proteintech、#11372-1-AP）、マウス抗ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体（Proteintech、#60004-1-Ig）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰ複合体（Proteintech、#SA00001-2）、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰ複合体（Proteintech、#SA00001-1）を用いてウェスタンブロットを行った。

【0528】

タンパク質を４～２０％の濃度勾配のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Genescript、#M42012C）で分解し、ＰＶＤＦ膜に移した。その後、希釈した１×ＴＢＳＴバッファ（Sangon、#tbst-C520009）の５％の脱脂乳でこれらの膜をブロックし、４℃で一次抗体を用いてオーバーナイトでプローブし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－共役ロバ抗マウス、抗ウサギ、又は抗ヤギ抗体を室温で１時間培養した。膜洗浄を３回行った後、Western Lightning ECL Pro（PerkinElmer、#NEL122001EA）又はECL Prime Western Blotting検出試薬（Amersham、#RPN2232）で免疫複合体を検出した。

【0529】

４．細胞周期及びＫｉ６７テスト

【0530】

インビボＳＡＧＥ１ノックダウン実験のため、免疫組織化学でストレプトアビジン－ビオチン複合体（ＳＡＢＣ）法を用いてＳＡＧＥ１及びＫｉ６７を検出した。ＬＵＳＣ－Ｐについては、腫瘍残基の組織学的変化を示すため、ヘマトキシリン及びエオシンによる染色を行った。汎サイトケラチン染色によって、ＳＡＧＥ１ｓｈＲＮＡ処置後の組織において腫瘍性成分に代わる線維性炎症の変化がみられた。ＳＡＧＥ１、Ｋｉ６７、及び汎サイトケラチンに対する一次抗体は、それぞれ、１：３００、１：１００、１：２００の濃度で使用した。この研究で使用した全ての抗体は、製造元が標的としたものにのみ反応することが確認されている。

【0531】

５．ＩＨＣ

【0532】

非特定化ヒト正常組織及び癌組織を上海芯超生物科技有限公司（Shanghai OUTDO Biotech Co. Ltd）（中国、上海）から取得した。ＳＡＧＥ１を検出するため、免疫組織化学でストレプトアビジン－ビオチン複合体法を使用した。免疫蛍光染色のため、ＨｕＴｕ８０由来の異種移植組織及びＨＣＣ－ＰＤＸ組織の切片を新しいキシレン中でそれぞれ１５分間２回脱ロウし、１００％、９５％、７５％、５０％のエタノール及びＰＢＳでそれぞれ
１０分間再水和した。切片をTUF TARGET UNMASKING FLUID（Invitrogen、Z00R.0000）に入れて２０分間沸騰させることで、エピトープ賦活化を行った。その後、スライドをＰＢＳＴ（０．５％のトリトンＸ－１００を補充したＰＢＳバッファ）で洗浄し、５％のＢＳＡを用いてＲＴで３時間ブロックした後、４℃でウサギ抗ＳＡＧＥ１ポリクローナル抗体（Novus NBP1-84355）又はウサギ抗ＩＮＴＳ３ポリクローナル抗体（Novus NBP1-19091）を用いてオーバーナイトで培養してから洗浄し、Alexa Fluor 555又は488共役二次抗体（Proteintech）を用いて培養した。核はＤＡＰＩ（Sigma）で対比染色した。スライドをＰＢＳＴでよく洗浄してマウントし、レーザ走査型共焦点顕微鏡を用いて可視化した。

【0533】

６．ＬＣ ＭＳ／ＭＳベースのプロテオミクス及びデータ処理

【0534】

ソニケーションによって細胞を溶解バッファ（８Ｍの尿素、１％のＳＤＳ、１００ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．５、１ｍＭのＰＭＳＦ、１：１００（vol/vol）のプロテアーゼ阻害薬カクテル（スイス、ロシュ）を含む）で溶解した。溶解物を氷上で３０分培養した後、１６０００ｇを３０分間、４℃で遠心分離することで、溶けないデブリを除去した。上清のタンパク質濃度をPierce^TM BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific）によって測定した。ジスルフィド架橋を１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）－ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて室温で１０分間還元した後、１５ｍＭのヨードアセトアミドを用いて室温で暗所において３０分間アルキル化を行った。ＳＤＳを除去するため、アセトン沈殿を行った。タンパク質サンプルをｐＨ８．０の４Ｍの尿素及び４０ｍＭのトリス塩酸に再懸濁させた。まず１：１００でＬｙｓ－Ｃ（Wako）を３時間かけて加え、１：５０でトリプシン（Promega）をオーバーナイトで加えることで、２段階の消化を３７℃で行った。Ｃ１８ＲＰ固相抽出カートリッジ（Waters）を用いて消化物を脱塩し、真空分離（Labconco）で溶出物を乾燥させた。製造元の指示に従ってＴＭＴ標識化を行った。簡潔に述べると、１００ｍｇのペプチドを５０ｍＭのＴＥＡＢバッファ（ｐｈは８．５）１００ｍＬに浸してもどした。TMT 6-plex剤（ThermoFisher）を０．８ｍｇずつアセトニトリル４１ｍＬに浸してもどしてから、ペプチドの対応するアリコートに加えた。標識化反応は、室温で１時間培養した後、５％のヒドロキシルアミンを８ｍｌ加えてクエンチした。標識ペプチドを組み合わせ、Ｃ１８カラムカートリッジ（Waters）を用いて脱塩した。ＴＭＴ標識ペプチドをAgilent 1200 HPLCを用いてAcquity BEH300 C18 Column（３００Å、１．７μｍ、１ｍｍ×１５０ｍｍ、Waters）の高ｐＨ逆相クロマトグラフィーで断片化した。ペプチドは３２個の断片に分離され、これを１５個の断片にまとめた。セルフパック式のStageTipを用いて各断片を脱塩し、真空遠心分離で乾燥させ、ＬＣ ＭＳ／ＭＳ分析用に０．１％のギ酸に浸してもどした。各断片は、社内のパックドキャピラリーカラム（20 cm x 75 μm i.d., ReproSil-Pur C18、粒子径１．９μｍ、細孔サイズ１２０Å、Dr. Maisch)を用いてEASY-nLC 1200 UHPLC（ThermoScientific）で１５０分以上のＬＣグラジエントで２５０ｎＬ／ｍｉｎの流速（４～８％バッファＢで８分間、８～２５％バッファＢで１０５分間、２５～４０％バッファＢで３０分間、４０～８０％バッファＢで７分間、バッファＡは水に０．１％のギ酸、バッファＢはアセトニトリルに０．１％のギ酸及び２０％の水）で分離した。マスデータは、ＳＰＳ－ＭＳ３法を用いてOrbitrap Fusion Lumos質量分析計（ThermoScientific）で取得した。スキャン範囲を３７５～１５００ｍ／ｚとし、ＡＧＣ標的を４×１０５とし、最大イオン注入時間（ＭＩＴ）を２０ｍｓとし、ダイナミックエクスクルージョンを６０ｓとして、６０Ｋの解像度でＭＳ１スキャンを集めた。ＭＳ２分析のため、単離ウィンドウを０．７ｍ／ｚとし、ＡＧＣ標的を１×１０４とし、ＭＩＴを５０ｍｓとして、ＭＳ１プリカーサーイオンを四重極で単離し、３５％の正規化衝突エネルギーの衝突誘起解離で断片化した。ＭＳ２断片イオンを「高速」スキャンのイオントラップで検出した。各ＭＳ２スペクトルを取得した後、ＭＳ２スペクトルにおける強度が上位１０個のイオンにＳＰＳ（synchronous precursor selection）のＭＳ３スキャンを行った。単離ウィンドウを０．７ｍ／ｚとし、ＡＧＣ標的を５×１０４とし、ＭＩＴを１００ｍｓとしてＳＰＳ―ＭＳ３プリカーサーを単離した後、ＨＣＤを用いて活
性エネルギーを６５％として断片化を行い、Orbitrapを用いて１５ｋの解像度で検出を行った。

【0535】

同定、定量化、及び差次的発現の分析は、Proteome Discover 2.2（ThermoScientific）を用いて行った。簡潔に述べると、ＴＭＴ定量化の原データをProteome Discover 2.2（ThermoFisher）を用いて加工した。Sequest HT検索エンジンによってヒト参照プロテオーム（UP000005640）に対してＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。ＭＳ１の許容範囲は１０ｐｐｍに設定し、ＭＳ２の許容範囲は０．６に設定した。タンパク質分解酵素としてトリプシンを特定したので、２箇所以下の切断ミスは許容される。システイン残基のカルバミドメチル化（+57.0214 Da）ならびにペプチドＮ末端及びリシン残基のＴＭＴタグ（+229.1629 Da）を静的修飾として設定した。メチオニンの酸化及びタンパク質Ｎ末端のアセチル化を可変修飾として設定した。並行してデコイ（decoy）データベース検索も行い、ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）及びタンパク質の両方について偽発見率（ＦＤＲ）を１％に設定した。ＴＭＴレポーターイオンの信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）の値をＭＳ３スキャンから取得し、ＭＳ２のペプチドの同定とペアリングした。Ｓ／Ｎの平均値が１０未満又は共単離干渉イオンが２５％より多いＰＳＭは排除した。異なるＴＭＴ試薬の同位体不純物に応じてＳ／Ｎ測定値を調整した。タンパク質ごとにその量を当該タンパク質にマッチする全てのＰＳＭのＳ／Ｎ値を合計して算出した。各経路の全てのタンパク質の信号の合計が同じになるようにタンパク質量を正規化した。各タンパク質測定値に両側ｔ検定を適用した後、ベンジャミーニ・ホッホベルク（Benjamini-Hochberg）法を用いて複数の検定上の補正を行った。倍率変化（fold change）＞１．５でベンジャミーニ・ホッホベルク調整ｐ値＜０．０５のタンパク質は、差次的に発現するタンパク質であると考えられる。

【0536】

７．実験動物

【0537】

ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの飼育及びあらゆる処置は、動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって認められ、１９８６年（英国）（２０１３年改正）の動物（科学的処置）法に準じたものとした。本願の全セクションが動物を使用した研究の報告のためのＡＲＲＩＶＥガイドラインに従っている。全てのマウスは特定病原体のない（ＳＰＦ）状態において個別換気されたケージで飼育されていた（１ケージにつき５匹）。飼育室は温度管理され、１２時間ずつの明暗サイクルが保たれていた。動物の体重は１日置きに測定した。

【0538】

８．細胞株由来の皮下異種移植片

【0539】

雄のＢＡＬＢ／ｃ胸腺欠損ヌードマウス（生後４～６週）をＳＩＢＳの実験動物センターから得た。上述のとおり、ＨｕＴｕ８０親細胞及びＳＡＧＥ１－ＫＯ細胞（１００μＬに３×１０６細胞）をマウスの脇腹に皮下注射した。最終的には腫瘍組織をこのマウスから切除し、重さを測った。腫瘍重量のデータは平均値±ＳＤ（ｎ＝６）で示される。動物実験は、上海第９人民医院（shanghai ninth people’s hospital）、上海交通大学医学院（Jiaotong University School of Medicine）の動物愛護協会（SH9H-2019-A727-1）に認められているもので、中華人民共和国国家衛生与計画生育委員会（National Health and Family Planning Commission of China）が制定したガイドラインに準ずる上海交通大学（Shanghai JiaoTong University）の動物に関する指針に従って実行した。

【0540】

９．細胞株由来の眼内ブドウ膜黒色腫異種移植片

【0541】

ブドウ膜黒色腫細胞株ＭＵＭ２Ｂをplvx-luciferase-mCherry-Blasticidinベクターがコードしたレンチウイルスでプレトランスフェクトした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ト
リプシン処理で採取した。まず、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雄、生後６週間）に表面麻酔剤ベノキシール（Benoxil）で麻酔をかけた。眼の乾燥を防ぐためにメトセル（Methocel）点眼薬を使用した。外科用顕微鏡を用いて注射を行った。ハミルトンシリンジを用いて３×１０４個のブドウ膜黒色腫細胞を含む２ｕｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水を右眼の脈絡膜上腔に強膜を通して注射した。注射後、これらの眼に抗生点眼薬で処置を施した。アデノウイルスの投与（５日目）の前及びアデノウイルスの投与（１２日目）の後に生物発光イメージングアッセイ（bio-luminance imaging assay）を行った。アデノウイルスのＳＡＧＥ１抑制ベクター又は空ベクターを硝子体に注入した（７、９、１１日目の各投与において、３．２＊１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、１．５ｕｌ）。生存期間はマウスごとに算出している。

【0542】

１０．患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍及びインビボＳＡＧＥ１ノックダウン実験

【0543】

ＰＤＸ腫瘍は、上海尚泰生物技術有限公司（Shanghai Sunstem Biotechnology Co., Ltd.）及び無錫薬明康徳新薬開発股フン有限公司（WuXi Apptec Co., Ltd.）又は我々の部門（SH9H-2019-T279-2）から提供されたものである。異種移植片を５０～１００ｍｍ３の大きさになるまで成長させた後、上述のとおり、インビボＲＮＡｉ実験用にマウスを無作為に２つのグループに分けた（１グループにつき７～９匹）。３日置きに腫瘍内に多点注射を行うことでｓｈＳＡＧＥ１アデノウイルスを入れた。腫瘍体積＝（長さ×幅２）／２の式を用いて、一定間隔ごとに腫瘍サイズをデジタルキャリパーで測定した。最後の投薬から１日経った後、動物を犠牲死させて腫瘍の重さを測り、ホルマリンで固定した。ＩＨＣを行ってＳＡＧＥ１及びＫｉ６７を調べた。腫瘍体積及び腫瘍重量のデータは平均値±ＳＤ又は平均値±ＳＥ（ｎ＝７～９）で示される。全ての動物実験は、上海交通大学医学院（Jiaotong University School of Medicine）の動物愛護協会（SH9H-2019-A727-1）に認められているもので、中華人民共和国国家衛生与計画生育委員会（National Health and Family Planning Commission of China）が制定したガイドラインに準ずる上海交通大学（Shanghai JiaoTong University）の動物に関する指針に従って実行した。

【0544】

１１．ＰＤＸ由来の細胞（ＰＤＣ）の単離及び単細胞ＲＮＡシーケンシング用のサンプル調製

【0545】

新しいＰＤＸ組織を１×ＰＢＳで２回洗浄し、コラゲナーゼタイプＩＶ（Sigma Aldrichカタログ番号C5138-500MG）で２０～３０分間３７℃で軽く攪拌（２５０ｒｐｍ）しながら消化させた。消化は１０％のＦＢＳ（Gibcoカタログ番号0082147）を加えることで停止させた。メッシュサイズが４０μｍのストレーナー（Fisher Scientificカタログ番号08-771-1）で漉して単細胞を得た。この細胞を６００×ｇで１５分間、遠心分離にかけてペレット化し、１×ＰＢＳで２回洗浄した。その後、細胞を培養し、ｓｈＲＮＡウイルスに感染させた。最終的には細胞をトリプシン処理し、単細胞ＲＮＡシーケンシング用に１×ＰＢＳ＋１０％のＦＢＳに再懸濁させた。

【0546】

１２．組織の染色

【0547】

非特定化ヒト正常組織及び癌組織を上海芯超生物科技有限公司（Shanghai OUTDO Biotech Co. Ltd）（中国、上海）から取得した。ＳＡＧＥ１を検出するため、免疫組織化学でストレプトアビジン－ビオチン複合体法を使用した。免疫蛍光染色のため、ＨｕＴｕ８０由来の異種移植組織及びＨＣＣ－ＰＤＸ組織の切片を新しいキシレン中でそれぞれ１５分間２回脱ロウし、１００％、９５％、７５％、５０％のエタノール及びＰＢＳでそれぞれ１０分間再水和した。切片をTUF TARGET UNMASKING FLUID（Invitrogen、Z00R.0000）に入れて２０分間沸騰させることで、エピトープ賦活化を行った。その後、スライドをＰＢＳＴ（０．５％のトリトンＸ－１００を補充したＰＢＳバッファ）で洗浄し、５％のＢＳ
Ａを用いてＲＴで３時間ブロックした後、４℃でウサギ抗ＳＡＧＥ１ポリクローナル抗体（Novus NBP1-84355）又はウサギ抗ＩＮＴＳ３ポリクローナル抗体（Novus NBP1-19091）を用いてオーバーナイトで培養してから洗浄し、Alexa Fluor 555又は488共役二次抗体（Proteintech）を用いて培養した。核はＤＡＰＩ（Sigma）で対比染色した。スライドをＰＢＳＴでよく洗浄してマウントし、レーザ走査型共焦点顕微鏡を用いて可視化した。

【0548】

１３．インビボＳＡＧＥ１ノックダウン実験ＩＨＣ

【0549】

ＳＡＧＥ１及びＫｉ６７を検出するため、免疫組織化学でストレプトアビジン－ビオチン複合体（ＳＡＢＣ）法を使用した。ＬＵＳＣ－Ｐについては、腫瘍残基の組織学的変化を示すため、ヘマトキシリン及びエオシンによる染色を行った。汎サイトケラチン染色によって、ＳＡＧＥ１ｓｈＲＮＡ処置後の組織において腫瘍性成分に代わる線維性炎症の変化がみられた。ＳＡＧＥ１、Ｋｉ６７、及び汎サイトケラチンに対する一次抗体は、それぞれ、１：３００、１：１００、１：２００の濃度で使用した。この研究で使用した全ての抗体は、製造元が標的としたものにのみ反応することが確認されている。

【0550】

１４．タンパク質発現及び精製

【0551】

ＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤ（残基８１８～９０４）及びＩＮＴＳ３ＣＴＤ（残基５７２～９７８）を６×Ｈｉｓタグ（１）の後のＮ末端で融合したＳＵＭＯタンパク質を有する修飾ｐＥＴ２８ベクターにクローニングした。ＩＮＴＳ６Ｉ３ＢＤ（残基５７２～９７８）及びＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤ（残基８１８～９０４）をＧＳＴタグを有するｐＧＥＸ―６Ｐ－１ベクターにクローニングした。Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＩＮＴＳ３ＣＴＤ及びＧＳＴ－ＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ細胞（Stratagene）で共発現させた。０．１ｍMのＩＰＴＧによって２０℃で２０時間誘導した後、遠心分離で細胞を採取し、ペレットを溶解バッファ（５０ｍMのトリス塩酸、ｐＨ８．０、４００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のグリセロール、１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのベンズアミジン、１ｍｇ ｍＬ－１のロイペプチン、及び１ｍｇ ｍＬ－１のぺプスタチン）に再懸濁させた。その後、ソニケーションによって細胞を溶解し、細胞デブリを超遠心分離で除去した。上清をＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（QIAGEN）と混ぜ合わせ、４℃で２時間揺り動かした後、２５０ｍMのイミダゾールで溶出を行った。ＵＬＰ１及び３ＣPreScissionプロテアーゼを添加してＨｉｓ－ＳＵＭＯ及びＧＳＴタグを取り除いた。そして、２５ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び２ｍＭのジチオスレイトールで平衡化したサイズ排除クロマトグラフィーでＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３ＣＴＤ複合体を精製した。精製したＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３ＣＴＤ複合体を１５ｍｇ ｍＬ－１まで濃縮し、－８０℃で保存した。その他のタンパク質及びタンパク質複合体（ＩＮＴＳ３ＣＴＤ、ＷＴ及び変異ＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤ、及びＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３ＣＴＤ複合体）を同様に精製し、１０～２０ｍｇ ｍＬ－１まで濃縮し、－８０℃で保存した

【0552】

１５．結晶化、データ収集、及び構造決定

【0553】

４℃でシッティングドロップ蒸気拡散することでＩＮＴＳ３ＣＴＤ二量体及びＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３ＣＴＤ複合体の結晶を成長させた。ＩＮＴＳ３ＣＴＤの沈殿ウェル溶液は、２５％のエチレングリコール３３５０と、０．０１ｍＭのＥＤＴＡと、１５０ｍＭの塩化ナトリウムとからなっていた。ＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３ＣＴＤ複合体の沈殿ウェル溶液は、０．２Ｍの硫酸アンモニウムと、２５％のエチレングリコール３３５０とからなっていた。結晶を採取溶液（ＩＮＴＳ３ＣＴＤの結晶用には、２５％のエチレングリコール、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２５％のグリセロール、及びＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３ＣＴＤ複合体の結晶用には、０．２Ｍの
硫酸アンモニウム、２５％のエチレングリコール３３５０、２５％のグリセロール）に徐々に移した後、保存のために液体窒素で瞬間冷凍した。上海光源ＳＳＲＦ（Shanghai Synchrotron Radiation Facility）ビームラインＢＬ１８Ｕ１及びＢＬ１９Ｕ１において極低温環境（１００K）でデータセットを収集した。ＩＮＴＳ３ＣＴＤの３．０－ＡのＳｅＭｅ－ＳＡＤデータセットをＳｅピーク波長（０．９７８５３Ａ）で収集し、ＨＫＬ３０００（２）で加工した。７個のセレン原子を見つけて精製し、ＨＫＬ３０００．（３）を用いて元のＳＡＤ電子密度マップを算出した。溶媒平滑化（solvent flattening）で最初のＳＡＤマップの実質的な改良を行った。そして、フェニックス（４）を用いて２．５－Ａの解像度のネイティブデータセットに対し、モデルを精緻化した。ＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤＩＮＴＳ３ＣＴＤ複合体の結晶は、２．９０Ａの解像度に回折し、分子置換法で構造を決定した。

【0554】

１６．ＧＳＴプルダウンアッセイ

【0555】

精製ＧＳＴ－ＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤをＩＮＴＳ３ＣＴＤ－ＩＮＴＳ６Ｉ３ＢＤ複合体に同じモル比で加え、混合物を１００μＬのバッファ（２５ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び２ｍＭの塩化マグネシウム）中で２時間、４℃でグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（GE Healthcare）と培養した。同一のバッファでよく洗浄した後、結合したタンパク質を溶出バッファ（２５ｍＭのトリス塩酸、、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭの塩化マグネシウム、及び１５ｍＭの還元グルタチオン）に溶出させた。インプット及び溶出サンプルのタンパク質を１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥでCoomassieブルー染色によって可視化した。

【0556】

１７．等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）

【0557】

ＳＡＧＥ１Ｉ３ＢＤ－ＩＮＴＳ３ＣＴＤ相互作用の平衡解離定数をMicroCal iTC200熱量計（Malvern）を用いて決定した。２５ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び５ｍＭの塩化マグネシウム中で結合エンタルピーを１６℃で測定した。実験は２つ別個に行った。続いて、Origin 7ソフトウェア（OriginLab）を用いてＩＴＣデータを分析し、適合させた。

【0558】

１８．細胞培養、トランスフェクション、及びレンチウイルス形質導入

【0559】

この研究で使用した細胞株は、上海盖寧生物科技有限公司（Shanghai Gaining Biological Technology Ltd.）（中国、上海）から購入したもので、ＤＮＡ指紋法を用いて検証した。１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Gibco、#10091-148）を補充した最小必須培地（Gibco、#42360032）でヒト十二指腸腺癌ＨｕＴｕ８０細胞を培養した。ＨＥＫ－２９３Ｔ、ヒト悪性黒色腫Ａ３７５、及びヒト結腸直腸腺癌Ｃａｃｏ２細胞を１０％のＦＢＳを含むダルベッコの（Dulbecco’s）修飾イーグル培地（HyClone、#SH30022.01）でそれぞれ培養した。

【0560】

１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Gibco、#22400089）でヒト不死化初代肝細胞ＬＯ２、慢性骨髄性白血病Ｋ－５６２、及び骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞を維持した。１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Gibco、#11330032）でヒト食道扁平上皮癌ＫＹＳＥ－３０細胞を培養した。

【0561】

ヒトＨｉｓ－ＳＡＧＥ１－Ｆｌａｇ、Ｈｉｓ－ＩＮＴＳ３－ＳｔｒｅｐをレンチウイルスｐＣＤＨ－ＣＭＶベクター（Addgene、プラスミド#72265）にそれぞれサブクローニングした。所望の変異を含むプライマを有するQuikChange II site指向の突然変異生成キット（Agilent、#200523）を用いて、ＷＴ ＳＡＧＥ１プラスミドから変異ＳＡＧＥ１（Ｓ
ＡＧＥ１ｍｕｔ：Ｒ８７２Ａ、Ｆ８７３Ａ、Ｋ８７４Ａ、Ｍ８３２Ａ、Ｆ８３８Ａ、及びＱ８４０Ａ）を得た。外因性ＳＡＧＥ１発現細胞を蛍光標識するために、レンチウイルス骨格が宿主細胞ゲノムに組み込まれた場合に蛍光ｃｏｐＧＦＰが同じ細胞で発現できるようにする修飾レンチウイルスｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰベクターにおけるＢａｍＨＩ－ＸｂａＩ部位にＷＴＳＡＧＥ１、ＳＡＧＥ１ｍｕｔを挿入した。全てのプラスミドは、配列解析によって検証した。

【0562】

１９．ＳＡＧＥ１ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ

【0563】

ヒトＳＡＧＥ１ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを試験し、それらのうちの多くが内因性ＳＡＧＥ１発現を十分に抑制できた（図１６）。ネガティブコントロールとして、ｐＬＫ０．１スクランブルｓｈＲＮＡベクターを使用した。指示されたｐＬＫ０．１－ＳＡＧＥ１ｓｈＲＮＡ構造をｐＣＭＶ－ｄＲ８．２ ｄｖｐｒ（Addgene、プラスミドAddgene）及びｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ（Addgene、プラスミド#8454）の２つのパッケージングベクターと共に一過性でトランスフェクトすることによって、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞にレンチウイルスを生成した。トランスフェクションから４８時間後に上清を採取し、０．４５μｍ滅菌フィルタ（Millipore、#SLHU033RB）で濾過した。得られたレンチウイルスの備蓄を使ってＨｕＴｕ８０、Ｃａｃｏ２、Ａ３７５、及びＬＯ２細胞それぞれの形質導入を行った。２４時間後、３～５日間の３μｇ ｍＬ－１のピューロマイシン（Gibco、#A11138-03）による細胞選択を行った。

【0564】

図１７－１～図１７－２１は、本開示で使用したＳＡＧＥ１ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと、本開示で使用したＳＡＧＥ１ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡによるＳＡＧＥ１ｍＲＮＡ転写産物の標的配列とを示す。

【0565】

２０．フローサイトメトリー及びセルソーティング

【0566】

外因性ＳＡＧＥ１又はＳＡＧＥ１ｍｕｔ発現細胞を単離するために、ｃｏｐＧＦＰ発現が同じ細胞で生じることを利用し、これによって、これらのＳＡＧＥ１発現細胞集団の精製のために蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用できた。簡潔に述べると、ＳＡＧＥ１－ＫＤ及びＫＯ又はコントロール細胞をＷＴ ＳＡＧＥ１、ＳＡＧＥ１ｍｕｔ、又は空のベクターに２４時間感染させた後、２４時間培養した。そして、これらの細胞をトリプシン処理し、１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Gibco、#15140122）を含む滅菌ＦＣＡＳバッファに再懸濁させ、BD Influxでセルソーティングした。選別した生ｃｏｐＧＦＰ＋細胞をさらなる研究のために採取した。

【0567】

２１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法によるＳＡＧＥ１のノックアウト

【0568】

内因性ＳＡＧＥ１をノックアウトするため、２ペアのＤＮＡオリゴ（Hum SAGE1 sg1-Up: ACCGaaggaagagtatgtcctcg（SEQ ID NO: 96）、Hum SAGE1 sg1-D: AAACCGAGGACATACTCTTCCTT（SEQ ID NO: 98）、Hum SAGE1 sg2-Up: ACCGaagtaaatctggttgcaac（SEQ ID NO: 97）、Hum SAGE1 sg2-D: AAACGTTGCAACCAGATTTACTT（SEQ ID NO: 99）（小文字はＳＡＧＥ１ゲノムにおける標的配列を示す））の両方をｓｇＲＮＡの生成に使用し、このｓｇＲＮＡがpX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9ベクター（Addgene、プラスミド#42230）のAgeI-EcoRI部位にアニールしてクローニングした。製造元の指示に従い、lipofectamine 2000試薬（Invitrogen、#11668019）を用いて、これらのＳＡＧＥ１標的構造をＨｕＴｕ８０細胞にトランスフェクトした。４８時間後、細胞を分離し、再懸濁させ、希釈物が１ウェルごとに１細胞入る９６ウェルプレートに再播種した。数日培養した後、個々のコロニーを分け、各コロニーの全ての細胞の半分をゲノムＤＮＡ抽出及びＴ７エンドヌクレアーゼＩ切断アッセイ（New England Biolabs、#M0302S）を行ったが、これは前述の（５）のと
おりである。簡単に述べると、１００μＬの溶解バッファ（１０μＭのトリス塩酸、０．４Ｍの塩化ナトリウム、２μＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ，及び１００μｇ ｍＬ―１のプロテイナーゼＫ）で細胞を溶解した。ゲノムＤＮＡをフェノール－クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、溶出バッファ（１ｍＭのトリス塩酸、、ｐＨ８．３）で溶解した。標的部位を内部にもつＤＮＡフラグメントをＱ５ホットスタート高正確性ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs、#M0493）によって増幅し、ＰＣＲ及びＤＮＡクリーンアップキット（New England Biolabs、#T1030）で精製した。精製ＰＣＲ産物を変性し、ＮＥＢバッファ２でアニールした。得られたハイブリッドＰＣＲ産物をＴ７エンドヌクレアーゼＩで３０分間消化し、２．５％のアガロースゲルで分離した。ＳＡＧＥ１がないコロニーもＳＡＧＥ１遺伝子座シーケンシング及びウェスタンブロットによって検証した。

【0569】

２２．細胞成長分析

【0570】

リアルタイム細胞アナライザーＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ（ACEA Biosciences）を使用して、製造元の指示に従い、細胞の成長をモニタリングした。簡潔に述べると、１ウェルあたり３－６×１０３の密度の細胞をＥプレート９６に播種し、リアルタイム電機抵抗値を１２０時間測定した。各ウェルにおける電機インピーダンスの上昇は、細胞数の増加と正の関連があり、細胞インデックス＝（Ｒｔｎ－Ｒｔ０）／１５Ω（Ｒｔｎは、時点Ｔｎにおいて測定した抵抗であり、Ｒｔ０は、時点Ｔ０において測定したバックグラウンド抵抗である）の式によって、単位のない細胞インデックスのリアルタイム測定値として細胞成長曲線を示した。

【0571】

２３．組織の染色

【0572】

非特定化ヒト正常組織及び癌組織を上海芯超生物科技有限公司（Shanghai OUTDO Biotech Co. Ltd）（中国、上海）から取得した。ＳＡＧＥ１を検出するため、免疫組織化学でストレプトアビジン－ビオチン複合体法を使用した。免疫蛍光染色のため、ＨｕＴｕ８０由来の異種移植組織及びＨＣＣ－ＰＤＸ組織の切片を新しいキシレン中でそれぞれ１５分間２回脱ロウし、１００％、９５％、７５％、５０％のエタノール及びＰＢＳでそれぞれ１０分間再水和した。切片をTUF TARGET UNMASKING FLUID（Invitrogen、Z00R.0000）に入れて２０分間沸騰させることで、エピトープ賦活化を行った。その後、スライドをＰＢＳＴ（０．５％のトリトンＸ－１００を補充したＰＢＳバッファ）で洗浄し、５％のＢＳＡを用いてＲＴで３時間ブロックした後、４℃でウサギ抗ＳＡＧＥ１ポリクローナル抗体（Novus NBP1-84355）又はウサギ抗ＩＮＴＳ３ポリクローナル抗体（Novus NBP1-19091）を用いてオーバーナイトで培養してから洗浄し、Alexa Fluor 555又は488共役二次抗体（Proteintech）を用いて培養した。核はＤＡＰＩ（Sigma）で対比染色した。スライドをＰＢＳＴでよく洗浄してマウントし、レーザ走査型共焦点顕微鏡を用いて可視化した。

【0573】

インビボＳＡＧＥ１ノックダウン実験のため、免疫組織化学でストレプトアビジン－ビオチン複合体（ＳＡＢＣ）法を用いてＳＡＧＥ１及びＫｉ６７を検出した。ＬＵＳＣ－Ｐについては、腫瘍残基の組織学的変化を示すため、ヘマトキシリン及びエオシンによる染色を行った。汎サイトケラチン染色によって、ＳＡＧＥ１ｓｈＲＮＡ処置後の組織において腫瘍性成分に代わる線維性炎症の変化がみられた。ＳＡＧＥ１、Ｋｉ６７、及び汎サイトケラチンに対する一次抗体は、それぞれ、１：３００、１：１００、１：２００の濃度で使用した。この研究で使用した全ての抗体は、製造元が標的としたものにのみ反応することが確認されている。

【0574】

２４．ｑＰＣＲ及びＷＢ

【0575】

患者由来の初代腫瘍細胞におけるＳＡＧＥ１の機能をさらに調査するため、以下のプライマを有するサンプルについてｑＰＣＲ及びウェスタンブロッティングによる分析を行った。

【0576】

定量ＰＣＲプライマＳａｇｅ－Ｆ：ＡＣＴＴＣＡＡＡＣＧＡＧＴＣＡＡＣＣＡＡＣＴ（SEQ ID NO: 100）、

【0577】

Ｓａｇｅ－Ｒ：ＴＣＴＡＡＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＣＴＴ（SEQ ID NO: 101）、

【0578】

ＧＡＰＤＨ－Ｆ：ＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＴＡＣＴＧＧ（SEQ ID NO: 102）、

【0579】

ＧＡＰＤＨ－Ｒ：ＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＣ（SEQ ID NO: 103）。

【0580】

次に挙げる抗体、すなわち、ウサギ抗ＳＡＧＥ１ポリクローナル抗体（Novus Biologicals、#NBP1-84355）、ウサギ抗ＩＮＴＳ３ポリクローナル抗体（Novus Biologicals、#NBP1-19091）、マウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Proteintech、#66005-1-Ig）、ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（Proteintech、#20543-1-AP）、マウス抗ＳＴＲＥＰＩＩモノクローナル抗体（Abcam、#ab184224）、ウサギ抗ＴＬＥ３ポリクローナル抗体（Proteintech、#11372-1-AP）、マウス抗ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体（Proteintech、#60004-1-Ig）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰ複合体（Proteintech、#SA00001-2）、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰ複合体（Proteintech、#SA00001-1）を用いてウェスタンブロットを行った。

【0581】

タンパク質を４～２０％の濃度勾配のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Genescript、#M42012C）で分解し、ＰＶＤＦ膜に移した。その後、希釈した１×ＴＢＳＴバッファ（Sangon、#tbst-C520009）の５％の脱脂乳でこれらの膜をブロックし、４℃で一次抗体を用いてオーバーナイトでプローブし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－共役ロバ抗マウス、抗ウサギ、又は抗ヤギ抗体を室温で１時間培養した。膜洗浄を３回行った後、Western Lightning ECL Pro（PerkinElmer、#NEL122001EA）又はECL Prime Western Blotting検出試薬（Amersham、#RPN2232）で免疫複合体を検出した。

【0582】

２５．チラミドシグナル増幅に基づく多重免疫組織化学的蛍光分析

【0583】

ＴＳＡ５色キット（Yuanxibio、#D110051-50T）と合わせ、一次抗体を用いて４μｍ厚の脱パラフィン組織切片を連続的に染色することで多重免疫蛍光（ｍＩＦ）分析を行った。簡潔に述べると、抗原回復及び内因性ペルオキシダーゼ活性の失活の後、ＴＢＳＴバッファ内で５％のＢＳＡを用いてスライドを１時間ブロックし、抗ＩＮＴＳ３抗体（Proteintech、#16620-1-AP）を用いて３０分間培養し、その後、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ共役（ＨＲＰ）二次抗体（Yuanxibio、#A10011-60）を用いて１０分間プローブした。ＴＳＡ５７０を用いた蛍光標識化を製造元の指示に従って１０分間行った。そして、ＴＢＳＴバッファでスライドを洗浄し、１ｍＭのクエン酸塩溶液に移し、１５分間サブボイリングした。スライドを冷まし、洗浄し、ブロックして、抗ヒストンＨ３Ｋ９ｍｅ３（Acam、#ab8898）／ＴＳＡ６２０及び抗ＳＡＧＥ１（Acam、# ab233388）／ＴＳＡ５２０に対する次の３回の染色に使用した。最後に、スライドをＤＡＰＩ（ThermoFisher、#D1306）２滴で処置を施し、蒸留水で洗浄し、Prolong Goldマウンティング培地でマウントした。Zeiss LSM 880レーザ走査型共焦点顕微鏡で観察して撮影し、Indica Haloソフトウェアを用いて分析した。

【0584】

２６．免疫沈降（ＩＰ）及び免疫共沈降（ｃｏ－ＩＰ）

【0585】

ＩＰのために、１×１０７細胞をプロテアーゼ阻害薬カクテル（Sigma-Aldrich、#B14001）を補充した溶解バッファ（２０ｍＭのトリス塩酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のグリセロール、０．５％のトリトンＸ－１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．４）で溶解し、１０分間４℃で培養し、Bioruptor Plus（Diagenode）（５～１０％のamplitude/powerで５秒ＯＮ－５秒ＯＦＦ）によって１分間ソニケーションした。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）後、１ｍｇの上清を５μｇのウサギ抗ＳＡＧＥ１ポリクローナル抗体（Novus Biologicals、#NBP1-84355、又はAbcam、#ab233388）及びウサギ抗ＩＮＴＳ３ポリクローナル抗体（Novus Biologicals、#NBP1-19091）でそれぞれ１６時間培養した。

【0586】

翌日、２０μLのタンパク質Ｇビーズ（Millipore、#LSKMAGG02）を各チューブに添加し、もう３時間培養した。そして、ビーズを採取し、溶解バッファで３回洗浄し、０．２Ｍのグリシン（ｐＨ２．２）によって溶出した。

【0587】

ｃｏ－ＩＰのために、X-tremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬（Sigma-Aldrich、#6366546001）を用いて、指示されたプラスミドでＨＥＫ－２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。４８時間後、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のトリトンＸ－１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１×Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害薬を含むＩＰバッファで細胞を溶解した。マウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Proteintech #66005-1-Ig）又はウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（(Proteintech #20543-1-AP）を用いてオーバーナイトで上清を培養した。そして、タンパク質Ａ／Ｇアガロースビーズ（Millipore、#LSKMAGAG02）を添加し、さらに２時間回転させた。免疫沈降複合体に対し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ウェスタンブロット及び／又はＭＳ分析を行った。

【0588】

２７．質量分析（ＭＳ）によるタンパク質の同定

【0589】

免疫沈降の溶出液を５ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で還元し、２５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。冷アセトンによるタンパク質の沈降後、タンパク質を２５ｍＭの重炭酸アンモニウムバッファに浸してもどし、オーバーナイトで３７℃において酵素／基質の割合を１：５０としてsequencing-gradeトリプシン（Promega）によって消化させた。

【0590】

液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）のため、EASY-nLC 1000 UHPLC（Thermo Scientific）を用いて、オンライン脱塩用のトラップカラム（内径（ｉ．ｄ．）２ｃｍ×１００μｍ、C18、粒径３μｍ、細孔径１００Ａ）に消化ペプチド混合物を入れた。そして、キャピラリーカラム（内径１５ｃｍ×７５μｍ、ReproSil-Pur C18、粒径１．９μｍ、細孔径１２０Ａ）において、３００ｎＬ ｍｉｎ－１の流量で、ペプチドを分離した。溶出液をOrbitrap Fusion質量分析計又はQ Exactive HF質量分析計（Thermo Scientific）に直接導入した。質量スペクトルは、データ依存モードで取得し、各フルスキャンＭＳ（ｍ／ｚ３５０～１５００、解像度６０Ｋ）の後、最も強いプリカーサーイオンに対して高衝突誘起解離ＭＳ／ＭＳスキャンを数度行った。生データを抽出し、ヒトUniProtデータベース（UP000005640）に対してSEQUEST検索エンジンを有するProteome Discoverer 2.2（Thermo Scientific）によって検索を行った。酵素特異性をトリプシンに設定したので、２箇所以下の切断ミスは許容した。質量の許容範囲は、プリカーサーについては１０ｐｐｍ、フラグメントイオンについては０．０２Ｄａに設定した。システインのカルバミドメチル化（+57.022 Da）を静的修飾として設定し、メチオニン残基（+15.995 Da）の酸化を可変修飾として設定した。並行してデコイ（decoy）データベース検索も行い、偽発見率（ＦＤＲ）１％未満のペプチドは許容した。

【0591】

２８．細胞株由来の異種移植片

【0592】

雄のＢＡＬＢ／ｃ胸腺欠損ヌードマウス（生後４～６週）を上海生命科学研究院（中国、上海）の実験動物センターから得た。１－３×１０６個のＨｕＴｕ８０親細胞、ＫＯ／ＳＡＧＥ１細胞、及びＳＡＧＥ１ｍｕｔ細胞をマウスの脇腹に皮下注射した。エンドポイントにおいて、腫瘍組織を犠牲死させた動物から切除し、重量及び体積を算出した。腫瘍重量のデータは平均値±ＳＤで示した。

【0593】

２９．ＴＣＧＡデータセット

【0594】

コホートは、ヒトの大人の癌のほとんどの主要クラスを示す３２ＴＣＧＡプロジェクトの１０２０７個のサンプルからなった。レベル３ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、次に挙げるＴＣＧＡデータセット、すなわち、ＡＣＣ（ｎ＝７９）、ＢＬＣＡ（ｎ＝４１４）、ＢＲＣＡ（ｎ＝１，１０９）、ＣＥＳＣ（ｎ＝３０６）、ＣＨＯＬ（ｎ＝３６）、ＣＯＡＤ（ｎ＝４８０）、ＤＬＢＣ（ｎ＝４８）、ＥＳＣＡ（ｎ＝１６２）、ＧＢＭ（ｎ＝１６９）、ＨＮＳＣ（ｎ＝５０２）、ＫＩＣＨ（ｎ＝６５）、ＫＩＲＣ（ｎ＝５３９）、ＫＩＲＰ（ｎ＝２８９）、ＬＡＭＬ（ｎ＝１５１）、ＬＧＧ（ｎ＝５２９）、ＬＩＨＣ（ｎ＝３７４）、ＬＵＡＤ（ｎ＝５３５）、ＬＵＳＣ（ｎ＝５０２）、ＭＥＳＯ（ｎ＝８６）、ＯＶ（ｎ＝３７９）、ＰＡＡＤ（ｎ＝１７８）、ＰＣＰＧ（ｎ＝１８３）、ＰＲＡＤ（ｎ＝４９９）、ＲＥＡＤ（ｎ＝１６７）、ＳＡＲＣ（ｎ＝２６３）、ＳＫＣＭ（ｎ＝４７１）、ＳＴＡＤ（ｎ＝３７５）、ＴＨＣＡ（ｎ＝５１０）、ＴＨＹＭ（ｎ＝１１９）、ＵＣＥＣ（ｎ＝５５２）、ＵＣＳ（ｎ＝５６）、及びＵＶＭ（ｎ＝８０）のそれぞれからダウンロードした。関連する臨床的アノテーションもダウンロードし、参照用Ｒオブジェクトとして保存した。これらのｍＲＮＡシーケンシングＦＰＫＭデータセットは、「ＴＣＧＡｂｉｏｌｉｎｋｓ」パッケージ（ｖ２．１５．３）（２６）でＲを介して全て自由にアクセスできる。

【0595】

３０．ＧＴＥｘデータセット

【0596】

Genotype-Tissue Expression（ＧＴＥｘ）プロジェクト（２７）は、組織特異的遺伝子の発現及び制御を研究するため、包括的な公的リソースを構築するための継続的な努力である。２９ＧＴＥｘ健常組織のＲＮＡ―ｓｅｑデータの遺伝子リードカウント及びGENCODE 26転写モデルに基づく遺伝子レベルのモデルは、GTEx_Analysis_2017-06-05_v8_RNASeQCv1.1.9_gene_reads. gct及びgencode. v26. GRCh38. genes. gtf.を含むＧＴＥｘウェブサイト（https: //www. gtexportal. org）からダウンロードした。

【0597】

２９個の組織の１６０４７個のサンプルのＲＮＡ発現値をfragments per kilobase of transcript per million mapped reads（ＦＰＫＭ）に正規化した。サンプルは、脂肪（ｎ＝１２０４）、副腎（ｎ＝２５８）、膀胱（ｎ＝２１）、血液（ｎ＝９２９）、脳（ｎ＝２６４２）、胸（ｎ＝４５９）、子宮頸（ｎ＝１９）、腸（ｎ＝７７９）、食道（ｎ＝１４４５）、卵管（ｎ＝９）、心臓（ｎ＝８６１）、腎臓（ｎ＝８９）、肝臓（ｎ＝２２６）、肺（ｎ＝５７８）、筋肉（ｎ＝８０３）、神経（ｎ＝６１９）、卵巣（ｎ＝１８０）、膵臓（ｎ＝３２８）、下垂体（ｎ＝２８３）、前立腺（ｎ＝２４５）、唾液腺（ｎ＝１６２）、皮膚（ｎ＝１８０９）、小腸（ｎ＝１８７）、脾臓（ｎ＝２４１）、胃（ｎ＝３５９）、精巣（ｎ＝３６１）、甲状腺（ｎ＝６５３）、子宮（ｎ＝１４２）、及び膣（ｎ＝１５６）を含む。

【0598】

３１．定量化及び統計分析

【0599】

実験結果の統計的検定はすべて、特段の記載がない限り、GraphPad Prism 7を用いて行った。統計的有意性は、独立２群のスチューデントのt検定によって算出した。ＩＴＣ実験における解離定数（Ｋｄ）は、単一部位に特異的な結合モデルを使った別々の２つの実験から、Origin 7ソフトウェアを用いて、平均値±標準誤差として算出した。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を用いて、インビボ実験のデータの統計分析を行った。結果は、特段の記載がない限り、平均値±標準偏差として示し、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図4L】

【図4M】

【図4N】

【図4O】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図6I】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図7H】

【図7I】

【図7J】

【図7K】

【図7L】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図17-4】

【図17-5】

【図17-6】

【図17-7】

【図17-8】

【図17-9】

【図17-10】

【図17-11】

【図17-12】

【図17-13】

【図17-14】

【図17-15】

【図17-16】

【図17-17】

【図17-18】

【図17-19】

【図17-20】

【図17-21】

【配列表】

2023508845000001.app

【国際調査報告】