(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-06
(54)【発明の名称】液体試料の分析のための方法及び装置
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20230227BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20230227BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20230227BHJP
G01N 33/72 20060101ALI20230227BHJP
G01N 33/82 20060101ALI20230227BHJP
G01N 33/92 20060101ALI20230227BHJP
G01N 21/27 20060101ALI20230227BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 Z
G01N33/483 C
G01N33/68
G01N33/72 A
G01N33/82
G01N33/92
G01N21/27 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022537790
(86)(22)【出願日】2020-12-21
(85)【翻訳文提出日】2022-06-29
(86)【国際出願番号】 EP2020087510
(87)【国際公開番号】W WO2021136715
(87)【国際公開日】2021-07-08
(31)【優先権主張番号】PA201901565
(32)【優先日】2019-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】522241871
【氏名又は名称】クライフ エーピーエス
【氏名又は名称原語表記】ＱＬＩＦＥ ＡＰＳ
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ワーソー，ピーター
(72)【発明者】
【氏名】ファインディング，エッベ
(72)【発明者】
【氏名】エルキャア，ロバート
【テーマコード（参考）】
2G043
2G045
2G059
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043BA17
2G043CA04
2G043DA02
2G043DA08
2G043EA01
2G043EA13
2G043FA03
2G043KA02
2G043NA01
2G043NA11
2G045AA25
2G045CA25
2G045DA35
2G045DA36
2G045DA48
2G045DA57
2G059AA01
2G059BB13
2G059CC16
2G059DD13
2G059EE01
2G059EE07
2G059EE12
2G059GG02
2G059HH02
2G059HH03
2G059KK02
2G059MM01
(57)【要約】
本発明は、液体試料中の分析物の存在又は非存在を定量的に検出するための方法及び装置に関する。本発明は分析物検出アセンブリを備え、当該分析物検出アセンブリは、電磁放射線源と、電磁放射線を検出するための手段と、検出液を収容する容器であって、電磁放射線が検出液を通って線源から検出手段に放射されるように線源と検出手段との間に配置される容器とを具備する。検出液の内容物の混合が、検出アセンブリ（の全体）を円運動又は楕円運動で振り動かすことにより（そのような振動に適合した手段を使用して）行われ、それによって、前記線源及び手段に対する容器の位置決め（位置取り）が、液体試料中の分析物の量の測定の間中、一定である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の分析物の量を測定する方法であって、当該方法は、以下のステップを含む、即ち、ａ．検出アセンブリを準備するステップであり、当該検出アセンブリが、
(i) 電磁放射線源と、
(ii) 電磁放射線を検出する手段と、
(iii) 試料非含有液体を収容する容器であって、前記線源から印加された電磁放射線が前記容器を通って前記線源から前記検出手段に放射され得るように、又は代替的に、前記線源から印加された電磁放射線の結果として前記容器内の前記液体から前記検出手段に電磁放射線が放射され得るように、前記電磁放射線源と前記電磁放射線を検出する手段との間に配置される、容器と、
を備える、ステップと、
ｂ．前記容器内の試料非含有液体に試料を添加するステップと、
ｃ．オプションとして、１種以上の試薬を添加するステップと、
ｄ．時点Ｔ０での電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｅ．オプションとして、１種以上の試薬を添加するステップと、
ｆ．時点Ｔ１での電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｇ．オプションとして、電磁放射線の１回以上の更なる試料測定を実施するステップと、
を含んでおり、
ステップｂ～ｄは任意の順序で実施することができる、方法において、
当該方法は、前記容器内の試料及び液体が、前記検出アセンブリを振り動かすことにより実行される少なくとも１回の混合ステップ（ｍ）に供されて、従って、前記線源及び前記手段に対する前記容器の位置取りが、前記混合ステップの間、一定であることを特徴とする、方法。
【請求項2】
混合ステップ（ｍ）は、ステップｂの後に続いて、且つステップｄの前に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
混合ステップ（ｍ）は、ステップｄの後に続いて、且つステップｆの前に実施される、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
混合ステップ（ｍ）は、ステップｆの後に続いて実施される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記試料は５０μｌ未満からなる液体試料である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記混合ステップ（ｍ）における混合は、前記検出アセンブリを、少なくとも１０００ｒｐｍの速度の円運動又は楕円運動で振り動かすことにより行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記試料は血液試料である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記分析物は、フェニルアラニン、ｈｓ－ＣＲＰ、ＨｂＡ１ｃ、ビタミンＤ、ｄ－ダイマー又は血中脂質を含む群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法を実施するための装置であって、当該装置は、
ａ．検出アセンブリであって、
(i) 電磁放射線源と、
(ii) 電磁放射線を検出するための手段と、
(iii) 試料非含有液体を収容する容器、又は、試料非含有液体を収容する容器を受け入れるための手段と、
を具備してなる、検出アセンブリと、
ｂ．前記検出アセンブリの円運動又は楕円運動での振れ動きをもたらすための手段と、
を備えてなる、装置。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法を実施するためのパーツキットであって、Ａ）試料非含有液体を収容する容器と、
Ｂ）装置と、
を備えており、
前記装置（Ｂ）は、
ａ．検出アセンブリであって、
ｉ．電磁放射線源と、
ｉｉ．電磁放射線を検出するための手段と、
ｉｉｉ．試料非含有液体を収容する容器を受け入れるための手段と、
を含む、検出アセンブリと、
ｂ．前記検出アセンブリの円運動又は楕円運動での振れ動きをもたらすための手段と、
を含んでなる、
ことを特徴とする、パーツキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、改善された感度、精度及び総アッセイ時間で液体試料中の分析物（analyte,分析対象物）の存在又は非存在を定量的に検出するための方法及び装置に関する。特に、本発明は、血液試料中のバイオマーカーの存在又は非存在を定量的に検出する方法及び装置に関する。更に、本発明は、改善された感度、精度及び総アッセイ時間で液体試料中のウイルス検体、特にｃｏｖｉｄ－１９の存在又は非存在を検出するための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【0002】
体液試料中のマーカー又はバイオマーカーなどの特定の分析物の存在又は非存在を監視すること、特に血液試料中の特定の分析物の存在又は非存在を監視することによって、多くの疾患を監視することができる。
【0003】
そのような疾患マーカーを監視する場合、分析に使用される装置及び方法の感度、精度及び総アッセイ時間（ｔｏｔａｌ ａｓｓａｙ ｔｉｍｅ：ＴＡＴ）は常に重要な課題である。
【0004】
血液などの液体を分析するためのポイントオブケア装置及び方法では、５０μｌを超える試料サイズを使用することは実際には許容されない。多くの場合、試料サイズは、１～２滴の血液中に存在する液体の量、すなわち約４０μｌ又は２０μｌ以下に限定される。そのような少量の試料で作業する場合、装置及び分析に使用される方法の感度、精度及びＴＡＴは非常に重要な課題となり、装置及び方法の感度、精度及び／又はＴＡＴを改善するための方策は常に困難を伴う。
【0005】
従来、例えば１滴の血液の分析など、少量の液体試料を分析する場合、様々な方法で感度、精度及びＴＡＴの改善が達成されてきた。
【0006】
いくつかの方法及び装置は、少量の試料を正確に計量することに関して改善を提供することに重点を置いており、それによって精度を高めることができる。近年では、新しいアプローチである体積吸収マイクロサンプリングにより、一定体積の全血を採取することが可能である。この技術は、少量の血液を高正確度かつ高精度に採取することを可能にする多孔質親水性の先端部を有するサンプラーの使用を含む。採取プロセスは通常、ヘマトクリット値にかかわらず約２～４秒かかる。乾燥後、試料を保存、輸送又は直接分析することができる。この技術は、その単純さ及び費用効果のために注目度が高まりつつある。この技術の目的は、一定体積の血液試料を提供することによって検査の信頼性を改善し、最小限の指示で自己サンプリングを容易にすることである。
【0007】
他の方法は、特定の試料の成分と検出手段（フルオロフォア（蛍光プローブ）、透過率、吸光度など）とを正確に組み合わせることで感度及び精度を高めることができる改善された方法及び装置を提供することに重点を置いている。
【0008】
他の方法は、分析に使用される試料材料（試料物質）の品質を（例えば、試料の望ましくない成分を除去することによって）改善することに重点を置いている。しかしながら、液体試料中に存在する特定の分析物の正確な分析には、特に家庭におけるポイントオブケア用途のための方法及び装置に関して、当技術分野において遍在的な問題（よくある課題）が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】（国際調査報告を参照）
【発明の概要】
【0010】
従って、本発明の１つの目的は、５０μＬ未満を含む液体試料などの液体試料中の１つ以上の分析物の存在又は非存在を定量的に検出することの可能な光学測定に基づく既存の装置及び方法の感度、精度及びＴＡＴを改善することである。
【0011】
光学ベースの方法は、電磁放射線源が容器（例えば、キュベット(cuvette)）内に存在する液体試料を照射し、その後、容器（例えばキュベット）内の試料による電磁放射線の吸収及び／又は放射が監視される光学測定システムに依存する方法として理解されるべきである。
【0012】
更に、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの出現以来、試験室外の非専門家が実施することができる迅速な核酸ベースの検査の必要性が生じている。そのような検査は、パンデミックＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの封じ込めを助け、都市や国家の更なるロックダウンを防ぐことができる。
【0013】
従って、本発明の別の目的は、試料中のＣＯＶＩＤ－１９感染因子の存在又は非存在の高感度、高精度かつ迅速な核酸ベースの検査を提供することである。
【0014】
一般に、検出装置内の容器（例えばキュベット）内に存在する試料による照射の透過量及び／又は吸収量を光学測定システムが監視する方法は、当技術分野で周知である。従来、その間に特定の試薬が試料試薬混合物に導入される一連の測定（ブランク測定を含む）が行われている。試料及び／又は試薬の各導入後、物質は、様々な技術によって、多くの場合には、物質を入れた容器の振動（oscillation,振り動かすこと）、つまりボルテックスすること(vortexing)によって完全に混合される。
【0015】
［発明の概略説明］
本発明は、５０μＬ未満を含む液体試料などの液体試料中の１つ以上の分析物の存在又は非存在を光学測定に基づいて定量的に検出することの可能な改善された方法及び装置に関する。
本発明は、５０μＬ未満を含む液体試料などの液体試料中の１つ以上の分析物の存在又は非存在を光学測定に基づいて定量的に検出することの可能な改善された方法及び装置に関する。
【0016】
本発明による一般的なアッセイ手順の重要な改良は、試料及びアッセイ試薬を容器（検出装置の「検出アセンブリ」の一部）に受け入れた後、液体を受け入れるための手段（容器）のみの従来の振動とは対照的に、光学測定システム全体、すなわち光学測定システムと試料を入れた容器とを含む検出アセンブリが、振動運動(oscillating motions)に供される（つまり「ボルテックスされる(vortexed)」）ことである。換言すれば、アッセイカプセル／キュベット並びに放射線源及び検出器を含む光学システム全体が、検出液の成分を混合するための振動運動を行っている。これにより、アッセイの精度及び正確度が有意に改善されることが分かった。この改良は、以下の実施例で使用されるＥｇｏｏ装置光学ユニットで具現化される。本発明の技術的利点は、以下の実施例から明らかになる。
【0017】
従って、１つの非常に好ましい態様において、本発明は、試料中の分析物の量を測定する方法であって、当該方法は（以下のステップを含む）、
ａ．検出アセンブリを提供するステップであって、検出アセンブリは、
ｉ．電磁放射線源と、
ｉｉ．電磁放射線を検出するための手段と、
ｉｉｉ．試料非含有液体を収容する容器であって、線源から印加された電磁放射線が容器を通って線源から検出手段に放射され得るように、又は代替的に、線源から印加された電磁放射線の結果として容器内の液体から検出手段に電磁放射線が放射され得るように、電磁放射線源と電磁放射線を検出するための手段との間に位置決めされている、容器と、
を含む、ステップと、
ｂ．容器内の試料非含有液体に試料を添加するステップと、
ｃ．任意に１つ以上の試薬を添加するステップと、
ｄ．時点Ｔ０で電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｅ．任意に１つ以上の試薬を添加するステップと、
ｆ．時点Ｔ１で電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｇ．任意に、電磁放射線の１つ以上の更なる試料測定を実施するステップと、
を含み、
ステップｂ～ｄは任意の順序で実施することができる、
という方法において、
当該方法は、容器内の試料及び液体が、検出アセンブリを振動させる（振り動かす）ことによって実行される少なくとも１つの混合ステップ（ｍ）に供されることにより、前記線源及び前記手段に対する容器の位置決め（位置取り）が混合ステップの間、一定であることを特徴とする、方法に関する。
ａ．検出アセンブリを提供するステップであって、検出アセンブリは、
ｉ．電磁放射線源と、
ｉｉ．電磁放射線を検出するための手段と、
ｉｉｉ．試料非含有液体を収容する容器であって、線源から印加された電磁放射線が容器を通って線源から検出手段に放射され得るように、又は代替的に、線源から印加された電磁放射線の結果として容器内の液体から検出手段に電磁放射線が放射され得るように、電磁放射線源と電磁放射線を検出するための手段との間に位置決めされている、容器と、
を含む、ステップと、
ｂ．容器内の試料非含有液体に試料を添加するステップと、
ｃ．任意に１つ以上の試薬を添加するステップと、
ｄ．時点Ｔ０で電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｅ．任意に１つ以上の試薬を添加するステップと、
ｆ．時点Ｔ１で電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｇ．任意に、電磁放射線の１つ以上の更なる試料測定を実施するステップと、
を含み、
ステップｂ～ｄは任意の順序で実施することができる、
という方法において、
当該方法は、容器内の試料及び液体が、検出アセンブリを振動させる（振り動かす）ことによって実行される少なくとも１つの混合ステップ（ｍ）に供されることにより、前記線源及び前記手段に対する容器の位置決め（位置取り）が混合ステップの間、一定であることを特徴とする、方法に関する。
【0018】
［定義］
【0019】
「精度(Precision)」
分析手順の精度は、所定の条件下での均質試料の多重サンプリングから得られた一連の測定値間の一致の近さ（散乱の程度）を表す。精度は、１）併行精度、２）室内再現精度、及び３）室間再現精度の３つのレベルで考慮することができる。併行精度は、短い時間間隔にわたる同じ動作条件下での精度を表す。併行精度はアッセイ内精度とも呼ばれる。室内再現精度は、異なる日、異なる分析者、異なる機器などの試験室内の変動を表す。室間再現精度は、試験室間（通常は方法の標準化を目的として行われる共同試験）の精度を表す。精度は、均質で信頼できる（フルスケールの）試料を使用して調査されるべきである。しかし、フルスケールの試料を得ることができない場合、パイロットスケール又はベンチトップスケールの試料又は試料溶液を使用して調査することができる。分析手順の精度は、通常、一連の測定の分散、標準偏差又は変動係数として表される。
分析手順の精度は、所定の条件下での均質試料の多重サンプリングから得られた一連の測定値間の一致の近さ（散乱の程度）を表す。精度は、１）併行精度、２）室内再現精度、及び３）室間再現精度の３つのレベルで考慮することができる。併行精度は、短い時間間隔にわたる同じ動作条件下での精度を表す。併行精度はアッセイ内精度とも呼ばれる。室内再現精度は、異なる日、異なる分析者、異なる機器などの試験室内の変動を表す。室間再現精度は、試験室間（通常は方法の標準化を目的として行われる共同試験）の精度を表す。精度は、均質で信頼できる（フルスケールの）試料を使用して調査されるべきである。しかし、フルスケールの試料を得ることができない場合、パイロットスケール又はベンチトップスケールの試料又は試料溶液を使用して調査することができる。分析手順の精度は、通常、一連の測定の分散、標準偏差又は変動係数として表される。
【0020】
「正確度(Accuracy)」
正確度は、統計的かたよりの尺度である系統的誤差を説明するものであり、これらの誤差は結果と「真の」値との間の差を引き起こす。最も簡単に言えば、同じ量の反復測定からのデータ点のセットを考えると、値が互いに近い場合、セットは高精度であると言うことができ、その平均が測定されている量の真の値に近い場合、セットは高正確度であると言うことができる。正確度の概念と精度の概念とは互いに独立しているため、特定のデータセットは、高正確度又は高精度のいずれか一方であるか、高正確度かつ高精度の両方であるか、あるいは高正確度でも高精度でもないと言うことができる。
正確度は、統計的かたよりの尺度である系統的誤差を説明するものであり、これらの誤差は結果と「真の」値との間の差を引き起こす。最も簡単に言えば、同じ量の反復測定からのデータ点のセットを考えると、値が互いに近い場合、セットは高精度であると言うことができ、その平均が測定されている量の真の値に近い場合、セットは高正確度であると言うことができる。正確度の概念と精度の概念とは互いに独立しているため、特定のデータセットは、高正確度又は高精度のいずれか一方であるか、高正確度かつ高精度の両方であるか、あるいは高正確度でも高精度でもないと言うことができる。
【0021】
「光学的検出方法」
本明細書に記載の発明による試料中の分析物の存在を検出するために、任意の光学的検出方法を最終的に使用することができる。これらには、分光分析法及び分光光度分析法が含まれる。分光光度計の使用は、物理学、材料科学、化学、生化学、及び分子生物学などの様々な科学分野に及ぶ。
本明細書に記載の発明による試料中の分析物の存在を検出するために、任意の光学的検出方法を最終的に使用することができる。これらには、分光分析法及び分光光度分析法が含まれる。分光光度計の使用は、物理学、材料科学、化学、生化学、及び分子生物学などの様々な科学分野に及ぶ。
【0022】
分光法及び分光光度法は、従来、試料によって吸収／放射される光の波長の関数としての材料（分析物）の吸収、反射及び／又は透過特性の定量的測定に使用されている。これらの技術の使用は当技術分野で周知である。
【0023】
吸収分光法は、試料との相互作用に起因する、周波数又は波長の関数としての放射線の吸収を測定する分光技術を指す。試料は、放射場からエネルギー、すなわち光子を吸収する。吸収の強度は周波数の関数として変化し、この変化は吸収スペクトルである。吸収分光法は、電磁スペクトルにわたって実施される。
【0024】
一般に分光光度法と呼ばれる吸収分光法は、所与の波長で試料によって吸収された光の量を測定することに基づく分析技術である。特に電磁スペクトルの可視部分及びＵＶ部分における分光光度法は、化学及び生命科学において最も多目的かつ広範に使用されている技術の１つである。吸収分光法は、試料中の特定の物質の存在を判定し、多くの場合、存在する物質の量を定量するための分析化学ツールとして使用される。赤外可視分光法及び紫外可視分光法は、分析用途において特に一般的である。吸収分光法は、分子物理学及び原子物理学、天体分光学及びリモートセンシングの研究でも使用されている。
【0025】
吸収スペクトルを測定するための広範な実験アプローチがある。最も一般的な構成は、生成された放射線ビームを試料に向け、試料を通過する放射線の強度を検出することである。透過エネルギーを使用して吸収を計算することができる。線源、試料配置及び検出技術は、周波数範囲及び実験の目的に応じて大きく異なる。
【0026】
蛍光分光法は、蛍光特性に基づいて溶液中の分析物の濃度を測定するための迅速、単純かつ安価な方法である。蛍光分光法は、分析される化合物（分析物）の種類が既知である比較的単純な分析に使用することができ、例えば、定量分析を実行して試料中の分析物の濃度を測定するために使用することができる。蛍光は、主に溶液中の化合物を測定するために使用される。
【0027】
蛍光分光法では、電磁ビームがキュベット内の溶液を通過し、試料中の分析物がビームからエネルギーを吸収する。このエネルギーは、異なる波長の電磁ビーム（光）として放射される。試料によって吸収及び放射される光の量は、試料中の分析物の存在に比例する。蛍光分光法では、励起スペクトル（分析物が吸収する光）及び／又は発光スペクトル（励起された分析物によって放射される光）の両方を測定することができる。分析物の濃度は、発光の強度に正比例する。
【0028】
濁度測定は、その中に懸濁された粒子の散乱効果による透過光の強度の損失を測定するプロセスである。光は、既知の波長の光を作り出すフィルタを通過し、次いで、アッセイ溶液を収容しているキュベットを通過する。光電検出器が、キュベットを通過した光を集光する。次いで、吸収された光の量の測定が行われる。
【0029】
免疫比濁法は、臨床化学の広範な診断分野における重要なツールである。これは、古典的な臨床化学法では検出できないタンパク質を測定するために使用される。免疫比濁法は、古典的な抗原抗体反応を使用する。抗原抗体複合体は、光度計によって光学的に検出され得る粒子である。より詳細には、液体試料を緩衝液に添加し、ラテックスに結合した分析物に対するモノクローナル抗体の懸濁液と混合する。分析物はラテックス結合抗体に結合し、凝集する。粒径の増加によって引き起こされる光散乱は、分析物濃度の尺度として使用される。光散乱の量は、試料中の分析物の濃度に比例する。
【0030】
「光学的検出方法を実施する際の一般的な手順」
従来、光学的検出方法は、液体試料を容器（例えば、「キュベット」）に直接導入すること及び、試料の存在によって生成される光学信号の変化を測定することに依存している。通常、容器には、試料の導入前に試料非含有液体を入れる。反応液は、試料中の分析物と相互作用して分析物の存在下で信号を生成することのできる特定の試薬を含有してもよい。あるいは、そのような試薬は、試料の導入後に添加される。容器は、例えば、特定の方法では、容器内に液体が到達すると可溶化され得るフルオロフォア（蛍光プローブ）を含んでもよい。
従来、光学的検出方法は、液体試料を容器（例えば、「キュベット」）に直接導入すること及び、試料の存在によって生成される光学信号の変化を測定することに依存している。通常、容器には、試料の導入前に試料非含有液体を入れる。反応液は、試料中の分析物と相互作用して分析物の存在下で信号を生成することのできる特定の試薬を含有してもよい。あるいは、そのような試薬は、試料の導入後に添加される。容器は、例えば、特定の方法では、容器内に液体が到達すると可溶化され得るフルオロフォア（蛍光プローブ）を含んでもよい。
【0031】
バックグラウンド基準を提供するためにサンプルブランク測定を実行することができる。バックグラウンド測定は、検出液中の分析物以外の成分によって生成された信号である非特異的信号（「ノイズ」）、並びに信号に対するシステム（例えば、容器）の影響について試料測定値を補正するために行われる。非特異的信号は、例えば、濾過された血漿／血清の質に影響を及ぼす血液の溶血によって生成される可能性がある。従って、一般化された方法は、時点Ｔ０において第１の液体を通る１つ以上の波長の電磁放射線の透過及び／又は放射を測定することによってサンプルブランク測定を実施するステップを含む。
【0032】
この点において、Ｔ０測定は、試料の導入前に実施されるか、又は代替的に、試料からの放射線の透過／放射の定量的変化をもたらす試薬の導入前（又は直後）に実施され、試料中のバックグラウンドによって生成された信号を提供する。ブランク測定の精度を高めるために、繰り返し測定を行ってもよい。
【0033】
導入された試料／試薬は、検出液を通る１つ以上の波長の電磁放射線の透過又は放射を変化させ、変化の程度は、導入された試料中の分析物の存在の程度を反映する。換言すれば、試料／試薬の導入は、検出可能な放射線ベースの信号の変化をもたらし、変化は、（例えば、既知の濃度の試料に内部標準を使用することで測定される）試料の存在量に定量的に比例する。
【0034】
試料を試薬に導入した後、高正確度かつ高精度の試料測定値を生成するために、生成された検出液の成分を完全に混合しなければならない。
【0035】
従来の試験室構成では、本方法を実行する人は、分析前に試料成分を検出液中に正確に注入すると同時に検出液の成分を適切に混合するために、キュベット内の検出液を繰り返し空にして再充填する計量装置（例えばピペット）を使用することが多い。
【0036】
自動化されたシステムにおいて、計量装置から検出液に液体を繰り返し吸引し放射することによって計量装置を繰り返し空にして再装填することには問題があることが判明している。ポイントオブケア装置及び方法では、そのような装置及び方法は、一般に、外部環境への曝露を最小限に抑えるために自動化された閉鎖区画で動作するため、試料を第１の検出液に導入する手段において検出液を繰り返し導入及び再充填することは、不可能ではないにしても困難であることが多い。
【0037】
代わりに、従来の自動化されたシステムでは、計量装置が試料を検出液中に注入し、検出液は次いで、実際の試料測定の実行前に、容器（キュベット）を円運動で急速振動させる、すなわち、検出液を収容しているキュベットをボルテックスすることによって混合される。
【0038】
混合後、試料分析物測定が、従来の方法で、時点Ｔ１において検出液を通る１つ以上の波長の電磁放射線の透過及び／又は放射を測定することによって行われる。測定の精度を高めるために、繰り返し測定を行ってもよい。従って、時点Ｔ１は、試料を導入して検出液を混合した後に行われる１つ以上の測定を反映する。
【0039】
［発明の詳細な開示］
本発明に至る実験の間に、上述の一般的なアプローチは、所望されるよりも感度、正確度及び精度が低いことが判明した。
本発明に至る実験の間に、上述の一般的なアプローチは、所望されるよりも感度、正確度及び精度が低いことが判明した。
【0040】
驚くべきことに、本発明の発明者らは、検出液を収容している容器を振動させるだけでなく、電磁放射線源、電磁放射線を検出するための手段、及び検出液を収容している容器を含む検出アセンブリ全体を振動させる（振り動かす）ことにより検出液の内容物を混合することで、従来の手法を感度及び精度に関して大幅に改善できることを見出した。
【0041】
感度及び精度が向上する理由は明らかではない。しかしながら、従来の自動分析では、試料成分は、分析前に、アセンブリ装置内又はアセンブリ装置外で、検出液を収容しているキュベットをボルテックスすることによって混合される。この手順の結果として、キュベットは、ブランク測定においても試料測定においても、線源及び検出手段に対して正確に同じ位置に位置決め（位置取り）されない。
【0042】
驚くべきことに、いずれの測定においても、キュベットの位置決めを正確に同じ位置に固定することにより、測定の感度及び精度が著しく改善された。
【0043】
容器材料のわずかな差及び不純物が、従来の測定の感度及び精度を損なうこれらの相違を生じさせる可能性があると推測される。
【0044】
驚くべきことに、本発明によれば、検出アセンブリ全体をボルテックスすることによって、電磁放射線源及び電磁放射線を検出するための手段を容器及び試料と同じ動きに供することによって、サンプルブランク測定及び試料測定の両方において容器（キュベット）を正確に同じ位置に位置決め（位置取り）することができた。
【0045】
これにより、電磁放射線源及び電磁放射線を検出するための手段に対する容器の位置決めは、時点Ｔ０でのブランク測定から時点Ｔ１での試料測定までの方法ステップの間中、一定である。
【0046】
更に、容器の取り扱いが少ないため、液体試料を収容している容器の外面の潜在的な汚染が最小限に抑えられる。従って、本発明の方法は、家庭におけるポイントオブケア (point-of-care)の用途に非常に適している。
【0047】
従って、好適な一態様において、本発明は、液体試料中の分析物の量を測定する方法であって、当該方法は（以下のステップを含む）、
ａ．検出アセンブリを提供するステップであって、検出アセンブリは、
ｉ．電磁放射線源と、
ｉｉ．電磁放射線を検出するための手段と、
ｉｉｉ．試料非含有液体を収容する容器であって、線源から印加された電磁放射線が容器を通って線源から検出手段に放射され得るように、又は代替的に、線源から印加された電磁放射線の結果として容器内の液体から検出手段に電磁放射線が放射され得るように、電磁放射線源と電磁放射線を検出するための手段との間に位置決めされている、容器と、
を含む、ステップと、
ｂ．容器内の試料非含有液体に試料を添加するステップと、
ｃ．任意に１つ以上の試薬を添加するステップと、
ｄ．時点Ｔ０で電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｅ．任意に１つ以上の試薬を添加するステップと、
ｆ．時点Ｔ１で電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｇ．任意に、電磁放射線の１つ以上の更なる試料測定を実施するステップと、
を含み、
ステップｂ～ｄは任意の順序で実施することができる、
方法において、
当該方法は、容器内の試料及び液体が、検出アセンブリを振動させる（振り動かす）ことによって実行される少なくとも１つの混合ステップ（ｍ）に供されることにより、電磁放射線源及び電磁放射線を検出するための手段に対する容器の位置決めが混合ステップの間、一定であることを特徴とする、方法に関する。
ａ．検出アセンブリを提供するステップであって、検出アセンブリは、
ｉ．電磁放射線源と、
ｉｉ．電磁放射線を検出するための手段と、
ｉｉｉ．試料非含有液体を収容する容器であって、線源から印加された電磁放射線が容器を通って線源から検出手段に放射され得るように、又は代替的に、線源から印加された電磁放射線の結果として容器内の液体から検出手段に電磁放射線が放射され得るように、電磁放射線源と電磁放射線を検出するための手段との間に位置決めされている、容器と、
を含む、ステップと、
ｂ．容器内の試料非含有液体に試料を添加するステップと、
ｃ．任意に１つ以上の試薬を添加するステップと、
ｄ．時点Ｔ０で電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｅ．任意に１つ以上の試薬を添加するステップと、
ｆ．時点Ｔ１で電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｇ．任意に、電磁放射線の１つ以上の更なる試料測定を実施するステップと、
を含み、
ステップｂ～ｄは任意の順序で実施することができる、
方法において、
当該方法は、容器内の試料及び液体が、検出アセンブリを振動させる（振り動かす）ことによって実行される少なくとも１つの混合ステップ（ｍ）に供されることにより、電磁放射線源及び電磁放射線を検出するための手段に対する容器の位置決めが混合ステップの間、一定であることを特徴とする、方法に関する。
【0048】
分析物検出アセンブリは、容器を受け入れるための手段を備える（これらの手段及び容器は、電磁放射線が線源から容器及び液体を通って検出手段に放射されるように、線源と検出手段との間に位置決めされている）。
【0049】
一実施形態では、ステップｂの後、かつステップｄの前に混合ステップ（ｍ）が実施される。
【0050】
一実施形態では、ステップｄの後、かつステップｆの前に混合ステップ（ｍ）が実施される。
【0051】
好適な一実施形態では、ステップｆに続いて混合ステップ（ｍ）が実施される。
【0052】
本発明はまた、上述の方法を実行するための装置を備え、当該装置は、
ａ．検出アセンブリであって、
ｉ．電磁放射線源と、
ｉｉ．電磁放射線を検出するための手段と、
ｉｉｉ．試料非含有液体を収容する容器、又は試料非含有液体を収容する容器を受け入れるための手段と、
を含む、検出アセンブリと、
ｂ．検出アセンブリの円運動又は楕円運動での振動（振り動き）を提供するための手段と、
を備える。
ａ．検出アセンブリであって、
ｉ．電磁放射線源と、
ｉｉ．電磁放射線を検出するための手段と、
ｉｉｉ．試料非含有液体を収容する容器、又は試料非含有液体を収容する容器を受け入れるための手段と、
を含む、検出アセンブリと、
ｂ．検出アセンブリの円運動又は楕円運動での振動（振り動き）を提供するための手段と、
を備える。
【0053】
当業者は、検出アセンブリの円運動又は楕円運動での振動（振り動き）を提供するための手段を提供する方法を知っていることに留意されたい。そのような手段は、基本的に、検出アセンブリの全ての部分が提供された運動に供されるように、検出アセンブリの部分を互いに締結することと組み合わせた特定の物質の振動運動を提供するための従来の手段である。
【0054】
本発明はまた、上述の方法を実施するためのパーツキットを更に備え、このパーツキットは、
Ａ）試料非含有液体を収容する容器と、
Ｂ）装置であって、
ａ．検出アセンブリであって、
ｉ．電磁放射線源と、
ｉｉ．電磁放射線を検出するための手段と、
ｉｉｉ．試料非含有液体を含む容器を受け入れるための手段と、
を含む、検出アセンブリと、
ｂ．検出アセンブリの円運動又は楕円運動での振動を提供するための手段と、
を含む、装置と、
を備える。
Ａ）試料非含有液体を収容する容器と、
Ｂ）装置であって、
ａ．検出アセンブリであって、
ｉ．電磁放射線源と、
ｉｉ．電磁放射線を検出するための手段と、
ｉｉｉ．試料非含有液体を含む容器を受け入れるための手段と、
を含む、検出アセンブリと、
ｂ．検出アセンブリの円運動又は楕円運動での振動を提供するための手段と、
を含む、装置と、
を備える。
【0055】
好ましくは、容器Ａ）はまた、計量された量の試料を収集するためのフィルタ材料を備えた区画（コンパートメント）をも含む。
【0056】
好ましくは、容器Ａ）はまた、特定の分析物との特定の反応を実行するための１つ以上の試薬を含む区画（コンパートメント）をも含む。
【0057】
一態様では、本発明は、本発明による方法を実行することの可能な装置に関する。一実施形態では、本発明は、以下でより詳細に説明するＥｇｏｏ装置に関する。
【0058】
「Ｅｇｏｏ装置」：
Ｅｇｏｏ装置は、本発明を実施することの可能なマイクロオプト電気機械装置である。Ｅｇｏｏ装置全体は、ヒト血液又は別の適切な検出液中のバイオマーカーを測定するための光学ユニットとＥｇｏｏカプセルとからなる。使い捨てアッセイカプセルが、アッセイを実施するための全てのアッセイ試薬を含む。アッセイカプセルがＥｇｏｏ装置に挿入された後に、アッセイが自動的に実行される。
Ｅｇｏｏ装置は、本発明を実施することの可能なマイクロオプト電気機械装置である。Ｅｇｏｏ装置全体は、ヒト血液又は別の適切な検出液中のバイオマーカーを測定するための光学ユニットとＥｇｏｏカプセルとからなる。使い捨てアッセイカプセルが、アッセイを実施するための全てのアッセイ試薬を含む。アッセイカプセルがＥｇｏｏ装置に挿入された後に、アッセイが自動的に実行される。
【0059】
本質的に、Ｅｇｏｏ装置は、アッセイキュベットが光源と検出器との間に配置され得るように配置された光源と検出器とからなる検出アセンブリからなる。Ｅｇｏｏ装置は、Ｅｇｏｏカプセルがアセンブリに追加されると検出アセンブリ全体をボルテックスするための手段を更に備える。Ｅｇｏｏ装置には、アッセイキュベットを含むカプセルと、液体試料をその上に添加することができるフィルタ材料を含む別個のチャンバとが付属している。
【0060】
従って、Ｅｇｏｏ装置は、経験の浅いユーザによるポイントオブケア使用のために設計されたパーツキットである。
【0061】
パーツキットは、測定装置と、試料材料を受け入れるためのカプセルとを備える。
【0062】
「Ｅｇｏｏ光学ユニット」：
Ｅｇｏｏ光学ユニットは、電磁放射線源と、電磁放射線を検出するための手段と、液体を収容する容器（「キュベット」）を受け入れるための手段とを含む検出アセンブリを含む従来の光学測定システムを備え、これらの手段及び容器は、電磁放射線が線源から液体を通って検出手段に放射されるように、線源と検出手段との間に位置決めされている。試料液体を含む容器を受け取った後、装置は、液体を含む容器のみの振動が行われる従来の装置及び方法とは対照的に、光学測定システム（検出アセンブリ）全体を振動運動（「ボルテックスすること」）に供することが可能である。
Ｅｇｏｏ光学ユニットは、電磁放射線源と、電磁放射線を検出するための手段と、液体を収容する容器（「キュベット」）を受け入れるための手段とを含む検出アセンブリを含む従来の光学測定システムを備え、これらの手段及び容器は、電磁放射線が線源から液体を通って検出手段に放射されるように、線源と検出手段との間に位置決めされている。試料液体を含む容器を受け取った後、装置は、液体を含む容器のみの振動が行われる従来の装置及び方法とは対照的に、光学測定システム（検出アセンブリ）全体を振動運動（「ボルテックスすること」）に供することが可能である。
【0063】
検出アセンブリの内側に配置された光学システムは、一般に２つの光路からなる。以下の実施例１～３では、光源としてＬＥＤ５７０ｎｍ、吸光度信号をする測定検出器としてフォトダイオード１を使用し、光路１の透過率を５７０ｎｍで測定した。以下の実施例１～３では、光路２において、光源はＬＥＤ３９０であり、フォトダイオード１は蛍光信号を測定するための検出器である。ＰＫＵ測定は光路２を使用して行われ、ヘモグロビンは、光路１を使用して測定された。
【0064】
実施例４では、光源としてＬＥＤ４６０ｎｍを使用し、検出器としてフォトダイオード１を使用して、光路１の透過率を４６０ｎｍ／５３０ｎｍで測定し、蛍光信号を５３０ｎｍで測定した（Ｃｙｂｒ－ｇｒｅｅｎ）。
【0065】
「Ｅｇｏｏカプセル」
Ｅｇｏｏカプセルは、主キュベット（反応チャンバと呼ばれることもある）及び別個の区画（コンパートメント）を含む。より正確には、Ｅｇｏｏカプセルは、試料注入区画Ｒ１、流体チャンバＲ２、Ｒ３及び主キュベットＲ４からなる。Ｅｇｏｏ装置は、関連するアッセイに応じて、Ｒ１、Ｒ２及び／又はＲ３の構成成分を主キュベット（Ｒ４）に添加することができる。
Ｅｇｏｏカプセルは、主キュベット（反応チャンバと呼ばれることもある）及び別個の区画（コンパートメント）を含む。より正確には、Ｅｇｏｏカプセルは、試料注入区画Ｒ１、流体チャンバＲ２、Ｒ３及び主キュベットＲ４からなる。Ｅｇｏｏ装置は、関連するアッセイに応じて、Ｒ１、Ｒ２及び／又はＲ３の構成成分を主キュベット（Ｒ４）に添加することができる。
【0066】
更に、カプセルはプランジャ／シールブレーカを含み、プランジャ／シールブレーカは、各区画からの試薬又は物質が、液体不透過性シールの破壊後に主キュベット内の液体と流体連通することができ、及び／又はシールを通じてキュベット内に注入されることによって主キュベットに入ることができるように作動させることができる。
【0067】
「試料中のＣＯＶＩＤ－１９の測定」
ポイントオブケアＣＯＶＩＤ－１９検査に対する需要の急速な増加に応えて、本発明者らはまた、驚くべきことに、周知のＳＩＢＡ増幅技術（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１４ Ｎｏｖ ２４；９（１１）：ｅ１１２６５６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１２６５６．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１４）を使用して、試料からの事前の核酸抽出を実行する必要なく、Ｅｇｏｏ装置で患者からのスワップ（ｓｗａｐ）試料からＣＯＶＩＤ－１９を直接迅速に検出できることを見出した。
ポイントオブケアＣＯＶＩＤ－１９検査に対する需要の急速な増加に応えて、本発明者らはまた、驚くべきことに、周知のＳＩＢＡ増幅技術（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１４ Ｎｏｖ ２４；９（１１）：ｅ１１２６５６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１２６５６．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１４）を使用して、試料からの事前の核酸抽出を実行する必要なく、Ｅｇｏｏ装置で患者からのスワップ（ｓｗａｐ）試料からＣＯＶＩＤ－１９を直接迅速に検出できることを見出した。
【0068】
周知の「鎖侵入ベースの増幅」（Ｓｔｒａｎｄ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＩＢＡ）などの等温核酸増幅技術は、熱サイクル又は精巧な試験室用機器を必要としないという点で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を超える大きな利点を提供する。
【0069】
ＳＩＢＡ技術は、二本鎖標的核酸への侵入オリゴヌクレオチド（ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＩＯ）のリコンビナーゼ依存的挿入に依存する。ＩＯ挿入部位の周辺の二重鎖領域は解離し、それによって標的特異的プライマーが結合することを可能にする。次いで、ポリメラーゼがプライマーを標的核酸上に伸長させ、標的の指数関数的増幅をもたらす。プライマーはリコンビナーゼの基質ではないため、ＩＯの非存在下では標的鋳型を伸長させることができない。ＩＯに２９－Ｏ－メチルＲＮＡを含めることにより、ＩＯが伸長可能でなく、標的鋳型の伸長に関与しないことが保証される。プライマーダイマー又はミスプライミングは指数関数的に増幅することができないので、これらの特徴は、本技術を非特異的増幅に対して耐性とすることができる。その結果、ＳＩＢＡは非常に特異的であり、複雑なプローブ又は精巧な試験室用機器を使用せずに単一分子感度で密接に関連した種を区別することができる。
【0070】
本発明に至る調査の間に、驚くべきことに、ＳＩＢＡ増幅技術を使用してコロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）感染について検査した患者からのスワップ試料の適用は、試料からの核酸の抽出を必要としないことが見出された。従って、従来のスワップ試料（約１ｍｌの緩衝液に溶解した患者からのスワップを含有する試料）を効率的に検査することができ、ＳＩＢＡ増幅技術はＣＯＶＩＤ－１９感染症を有する患者を積極的に判定するのに有効であった。しかし、プロトコルは有意な数の偽陽性検査結果を与えることが分かった。驚くべきことに、この問題は、（様々な）緩衝液でスワップ試料を希釈することで、真の陽性試料を特定する際の有効性に悪影響を及ぼすことなく解決された。従って、驚くべきことに、試料を適切な緩衝液で希釈することによって、偽陽性検査結果を最小限とするか又は回避することが可能であることが見出された。具体的には、スワップ試料を総最終体積が２ｍｌとなるように希釈すると、偽陽性が最小限に抑えられることが分かった。試料を緩衝液／スワップの最終体積が５ｍｌとなるように希釈することによって、より良好な結果が得られた。しかしながら、非特異的反応（偽陽性）を完全に回避するためには、試料を最終体積が１０ｍｌ／スワップなど、５ｍｌ／スワップ超となるように希釈することが必要であった。従って、１０倍体積の緩衝液（体積／体積）で希釈したスワップ試料（１～２ｍｌの緩衝液で希釈したスワップヘッドからなる標準スワップ試料）は、偽陰性試料の増加を引き起こすことなく、偽陽性結果を回避することが分かった。従って、実際には、スワップ試料（約１ｍｌの試料材料）は、偽陽性をほぼ完全に回避するためには、Ｅｇｏｏ装置内の反応混合物に添加される前に１０ｍｌの緩衝液で希釈されるべきである。しかしながら、偽陽性の数を最小限に抑えるためには、希釈度をより低くすれば十分であり得る。
【0071】
従って、別の一態様では、本発明は、試料中のＣＯＶＩＤ－１９の存在を検出する方法であって、当該方法は（以下のステップを含む）、
ａ．患者からスワップ試料を提供するステップと、
ｂ．少なくとも２ｍｌ、好ましくは少なくとも３ｍｌ、より好ましくは少なくとも４ｍｌ、更により好ましくは少なくとも５ｍｌ、更により好ましくは少なくとも６ｍｌ、更により好ましくは少なくとも７ｍｌ、更により好ましくは少なくとも８ｍｌ、更により好ましくは少なくとも９ｍｌ、更により好ましくは少なくとも１０ｍｌの体積の希釈緩衝液にスワップ試料を希釈するステップと、
ｃ．希釈された試料のサブサンプルを、ＳＩＢＡ増幅を行うのに適した反応混合物に曝露するステップと、
ｄ．試料及び反応混合物を、適用されるＳＩＢＡ増幅に適した反応温度に曝露するステップと、
ｅ．反応生成物の存在又は非存在を検出するステップであって、反応生成物の存在は試料中のＣＯＶＩＤ－１９の存在の検出として解釈され、非存在はＣＯＶＩＤ－１９の非存在の検出として解釈される、ステップと、
ｆ．任意的に、試料中のＣＯＶＩＤ－１９の存在が検出された試料を、陽性検出を検証するための融解曲線分析に供するステップと、
を含む、方法に関する。
ａ．患者からスワップ試料を提供するステップと、
ｂ．少なくとも２ｍｌ、好ましくは少なくとも３ｍｌ、より好ましくは少なくとも４ｍｌ、更により好ましくは少なくとも５ｍｌ、更により好ましくは少なくとも６ｍｌ、更により好ましくは少なくとも７ｍｌ、更により好ましくは少なくとも８ｍｌ、更により好ましくは少なくとも９ｍｌ、更により好ましくは少なくとも１０ｍｌの体積の希釈緩衝液にスワップ試料を希釈するステップと、
ｃ．希釈された試料のサブサンプルを、ＳＩＢＡ増幅を行うのに適した反応混合物に曝露するステップと、
ｄ．試料及び反応混合物を、適用されるＳＩＢＡ増幅に適した反応温度に曝露するステップと、
ｅ．反応生成物の存在又は非存在を検出するステップであって、反応生成物の存在は試料中のＣＯＶＩＤ－１９の存在の検出として解釈され、非存在はＣＯＶＩＤ－１９の非存在の検出として解釈される、ステップと、
ｆ．任意的に、試料中のＣＯＶＩＤ－１９の存在が検出された試料を、陽性検出を検証するための融解曲線分析に供するステップと、
を含む、方法に関する。
【0072】
好ましくは、希釈緩衝液は、以下に列挙される界面活性剤などのマイルドな界面活性剤を含有する緩衝液である。好ましくは、希釈緩衝液は、以下の実施例に記載されるＳＩＢＡ緩衝液などのＳＩＢＡ増幅に適した緩衝液である。
【0073】
実施例で使用したＳＩＢＡ緩衝液は、以下の試薬からなる：３３．１７ｍｌのヌクレアーゼ非含有水、３．２ｍｌの１Ｍ 酢酸マグネシウム、０．８ｍｌの酢酸トリス、ｐＨ８、２．６７ｍｌの３０％ Ｂｒｉｊ－５８、０．１２ｍｌの１０％ ＡＳＢ－１４、及び０．０４ｍｌの１００％ Ｐｒｏｃｌｉｎ３００（合計４０ｍｌ）を含み、
緩衝液中の最終濃度は、８０ｍＭ 酢酸マグネシウム、２０ｍＭ 酢酸トリス、ｐＨ８、２％ Ｂｒｉｊ－１４、０．０３％ ＡＳＢ－１４、及び０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎとなる。
緩衝液中の最終濃度は、８０ｍＭ 酢酸マグネシウム、２０ｍＭ 酢酸トリス、ｐＨ８、２％ Ｂｒｉｊ－１４、０．０３％ ＡＳＢ－１４、及び０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎとなる。
【0074】
アッセイで検出されたＣＯＶＩＤ－１９アンプリコンは以下の配列を有していた：
ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＧＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧ
ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＧＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧ
【0075】
鎖侵入プローブは以下の配列を有していた：
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴ．
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴ．
【0076】
２つのプライマー標的は以下の配列を有していた：
ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＧＴＣＡＧＴＴＣＴＴ （プライマー１）
ＴＧＴＴＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧ （プライマー２）
ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＧＴＣＡＧＴＴＣＴＴ （プライマー１）
ＴＧＴＴＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧ （プライマー２）
【0077】
本発明の他の好ましい実施形態は、後述の実施例４から明らかである。
【0078】
［本発明の好ましい実施形態］
【0079】
「試料材料（試料物質）」
好ましくは、液体試料は、４０μｌ未満の液体からなる試料である。そのような試料サイズは、自動化された方法及び装置に関連する。より好ましくは、液体試料は、２０μｌ未満の液体からなる試料である。そのような試料サイズは、ポイントオブケア装置及び方法に関連する。
好ましくは、液体試料は、４０μｌ未満の液体からなる試料である。そのような試料サイズは、自動化された方法及び装置に関連する。より好ましくは、液体試料は、２０μｌ未満の液体からなる試料である。そのような試料サイズは、ポイントオブケア装置及び方法に関連する。
【0080】
非常に好ましい一実施形態では、分析される試料は血液試料である。好ましい一実施形態では、血液試料は全血である。別の好ましい一実施形態では、血液試料は血漿試料である。
【0081】
「混合」
上記の方法において、検出液の内容物の混合は、検出液イオンを少なくとも１０００ｒｐｍの速度で円運動又は楕円運動で急速に振動させる（振り動かす）ことによって行われることが非常に好ましい。好ましくは、混合は、円運動又は楕円運動で検出液を急速に（１０００ｒｐｍ～４０００ｒｐｍ）振動させる（振り動かす）こと（即ち、ボルテックスすること）によって行われる。
上記の方法において、検出液の内容物の混合は、検出液イオンを少なくとも１０００ｒｐｍの速度で円運動又は楕円運動で急速に振動させる（振り動かす）ことによって行われることが非常に好ましい。好ましくは、混合は、円運動又は楕円運動で検出液を急速に（１０００ｒｐｍ～４０００ｒｐｍ）振動させる（振り動かす）こと（即ち、ボルテックスすること）によって行われる。
【0082】
「電磁放射線源」
検出アセンブリは、電磁放射線源を備え、電磁放射線源は、電磁放射線を放射する手段として定義される。関連する電磁放射線は、原則として、いかなる適切な波長のものであってもよい。しかしながら、３００ｎｍ～９００ｎｍの波長の電磁放射線が好ましい。
検出アセンブリは、電磁放射線源を備え、電磁放射線源は、電磁放射線を放射する手段として定義される。関連する電磁放射線は、原則として、いかなる適切な波長のものであってもよい。しかしながら、３００ｎｍ～９００ｎｍの波長の電磁放射線が好ましい。
【0083】
「電磁放射線検出手段」
分析物検出アセンブリは、電磁放射線検出手段を備え、電磁放射線検出手段は、電磁放射線を検出する（すなわち、吸収し、電気エネルギーに変換する）手段として定義される。検出対象の関連する電磁放射線は、原則として、いかなる適切な波長のものであってもよい。しかしながら、検出対象の電磁放射線は、線源及び／又は試料によって放射される電磁放射線として適切でなければならない。
分析物検出アセンブリは、電磁放射線検出手段を備え、電磁放射線検出手段は、電磁放射線を検出する（すなわち、吸収し、電気エネルギーに変換する）手段として定義される。検出対象の関連する電磁放射線は、原則として、いかなる適切な波長のものであってもよい。しかしながら、検出対象の電磁放射線は、線源及び／又は試料によって放射される電磁放射線として適切でなければならない。
【0084】
「分析物（Analyte, 分析対象物）」
一般に、本発明の方法及び装置は、臨床化学、癌診断及び全ての他の関連する診断分野内の全ての血液バイオマーカーを測定するために使用することができる。
一般に、本発明の方法及び装置は、臨床化学、癌診断及び全ての他の関連する診断分野内の全ての血液バイオマーカーを測定するために使用することができる。
【0085】
しかしながら、本発明の方法及び装置は、好ましくは、以下の血液マーカー（分析物）、すなわち、フェニルアラニン（フェニルケトン尿症患者）、ＣＲＰ、ｈｓ－ＣＲＰ、脂質パネル（炎症及び心血管系血管疾患バイオマーカー）、脂質プロファイル（総コレステロール、ＨＤＬ及びトリグリセリド）、ＨｂＡ１ｃ（糖尿病バイオマーカー）、ＡＬＡＴ（肝臓バイオマーカー）、ビタミンＤ及びＤ－ダイマーのうちのの１つ以上の検出に使用される。
【0086】
本発明の好ましい一実施形態では、反応液は、ＨｂＡ１検出のためのフルオロフォア・エオシン－ホウ酸などの、試料中に存在する分析物に結合する物質を含む。
【実施例】
【0087】
以下の実施例の目的は、記載された発明（本願に開示の発明）を使用してアッセイ精度、％ＣＶ（標準偏差／平均×１００）を記述し比較することである。
【0088】
［実施例１．ＰＫＵ測定］
フェニルケトン尿症（ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ：ＰＫＵ）は、肝フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ：ＰＡＨ）活性の欠損によって引き起こされる常染色体劣性遺伝性障害である。コーカサス人集団では、５０人に約１人がキャリアであり、１０，０００人に１人がＰＫＵに罹患している。ＰＡＨ欠損のため、フェニルアラニンはアミノ酸チロシンに変換されない。これにより、脳を含む身体の全ての部分、血液及び尿中に過剰量のＰＨＥ及び毒性代謝産物が蓄積する。これらの過剰は、様々な程度の精神遅滞をもたらす化学的不均衡を引き起こす。過去１０年間に、いくつかの販売業者は、家庭でのＰＨＥレベルを測定するための最良の方法、すなわち糖尿病患者の家庭での血糖測定に匹敵しなければならない方法を特定するための様々なアッセイ方法を試験した。残念なことに、フェニルアラニン分子は、グルコース（ｍＭ）と比較して５００～１０００倍低い濃度（μＭ）で血液中に存在する。これまでのところ、家庭ベースの方法を見出すためのあらゆる試みは、アッセイの感度、アッセイの精度、アッセイの安定性、アッセイの比較及びアッセイの複雑さなどのアッセイ関連パラメータに苦慮している。本発明は、上記のアッセイ関連の課題を克服することに成功した。
フェニルケトン尿症（ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ：ＰＫＵ）は、肝フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ：ＰＡＨ）活性の欠損によって引き起こされる常染色体劣性遺伝性障害である。コーカサス人集団では、５０人に約１人がキャリアであり、１０，０００人に１人がＰＫＵに罹患している。ＰＡＨ欠損のため、フェニルアラニンはアミノ酸チロシンに変換されない。これにより、脳を含む身体の全ての部分、血液及び尿中に過剰量のＰＨＥ及び毒性代謝産物が蓄積する。これらの過剰は、様々な程度の精神遅滞をもたらす化学的不均衡を引き起こす。過去１０年間に、いくつかの販売業者は、家庭でのＰＨＥレベルを測定するための最良の方法、すなわち糖尿病患者の家庭での血糖測定に匹敵しなければならない方法を特定するための様々なアッセイ方法を試験した。残念なことに、フェニルアラニン分子は、グルコース（ｍＭ）と比較して５００～１０００倍低い濃度（μＭ）で血液中に存在する。これまでのところ、家庭ベースの方法を見出すためのあらゆる試みは、アッセイの感度、アッセイの精度、アッセイの安定性、アッセイの比較及びアッセイの複雑さなどのアッセイ関連パラメータに苦慮している。本発明は、上記のアッセイ関連の課題を克服することに成功した。
【0089】
記載された発明を使用して、そのようなＰＨＥアッセイを、最先端の試験室ベースの機器と比較して同一の又は更に良好な分析性能を有する小型のＥｇｏｏ ＰＯＣ装置によって、ユーザの家庭内で行うことが可能である。
【0090】
「ＰＨＥアッセイの原理」
フェニルアラニンアッセイは、蛍光ニンヒドリンアッセイ法を利用する。アッセイ手順は、ＭｃＣａｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎ，Ｌａｂ Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ ５９，ｐａｇｅ ８８５－８９０ ｉｎ １９６２によって最初に公開された蛍光測定アッセイ手順の改良である。アッセイは、血液中のＰＨＥの定量的測定を意図した化学的方法に基づく。
フェニルアラニンアッセイは、蛍光ニンヒドリンアッセイ法を利用する。アッセイ手順は、ＭｃＣａｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎ，Ｌａｂ Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ ５９，ｐａｇｅ ８８５－８９０ ｉｎ １９６２によって最初に公開された蛍光測定アッセイ手順の改良である。アッセイは、血液中のＰＨＥの定量的測定を意図した化学的方法に基づく。
【0091】
「本発明によるＰＨＥアッセイ手順の概要」
正確な体積の毛細管血液（１５μｌ）を、指から、１５ｍｌの試料を収容することの可能な毛細管チャネルを含む血液計量移送ピペットに移送した。血液計量移送ピペットを、Ｅｇｏｏカプセルのカプセル入口に挿入し、そこで膜材料（Ｗｈａｔｍａｎ－９０３）と接触させた。計量移送ピペットが膜材料と物理的に接触すると、血液はピペット内の毛細管チャネルから膜材料内に受動的に流れた。乾燥期間の後、試料を含む膜を主キュベットに注入し、そこで抽出溶液（Ｒ１）の使用及びＥｇｏｏ装置内部のキュベットを含む検出アセンブリの振動（ボルテックス）運動によって、アミノ酸フェニルアラニン（及び他の全てのアミノ酸）を膜から抽出した。次に、Ｒ２試薬を主キュベットに注入し、本発明に従って混合した。４８°Ｃ（４５～８０°Ｃ）でインキュベートした後、ＰＨＥはニンヒドリンと蛍光化合物を形成した。蛍光測定応答及び特異性は、ジペプチドＬ－ロイシル－Ｌ－アラニンの存在によって大幅に増強された。反応中のｐＨは、特異性を最大にするために５．８＋／－０．１のコハク酸緩衝液によって厳密に制御された。ニンヒドリン反応後、Ｒ３溶液を主キュベットに注入することにより、最適な蛍光検出のためにｐＨを、
＞８．０（８．０超え）に調整した。蛍光分子を４５０ｎｍで測定し、励起波長は３９０ｎｍであった。
正確な体積の毛細管血液（１５μｌ）を、指から、１５ｍｌの試料を収容することの可能な毛細管チャネルを含む血液計量移送ピペットに移送した。血液計量移送ピペットを、Ｅｇｏｏカプセルのカプセル入口に挿入し、そこで膜材料（Ｗｈａｔｍａｎ－９０３）と接触させた。計量移送ピペットが膜材料と物理的に接触すると、血液はピペット内の毛細管チャネルから膜材料内に受動的に流れた。乾燥期間の後、試料を含む膜を主キュベットに注入し、そこで抽出溶液（Ｒ１）の使用及びＥｇｏｏ装置内部のキュベットを含む検出アセンブリの振動（ボルテックス）運動によって、アミノ酸フェニルアラニン（及び他の全てのアミノ酸）を膜から抽出した。次に、Ｒ２試薬を主キュベットに注入し、本発明に従って混合した。４８°Ｃ（４５～８０°Ｃ）でインキュベートした後、ＰＨＥはニンヒドリンと蛍光化合物を形成した。蛍光測定応答及び特異性は、ジペプチドＬ－ロイシル－Ｌ－アラニンの存在によって大幅に増強された。反応中のｐＨは、特異性を最大にするために５．８＋／－０．１のコハク酸緩衝液によって厳密に制御された。ニンヒドリン反応後、Ｒ３溶液を主キュベットに注入することにより、最適な蛍光検出のためにｐＨを、
＞８．０（８．０超え）に調整した。蛍光分子を４５０ｎｍで測定し、励起波長は３９０ｎｍであった。
【0092】
ＰＨＥアッセイ試薬：
Ｒ１：膜を含む試料注入器
Ｒ２：水中７０ｍＭ ニンヒドリン
Ｒ３：０．３Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０５Ｍ ＮａＯＨ、ｐＨ＝１１．５．
Ｒ４：７０％ エタノール、０．２Ｍ コハク酸緩衝液 ｐＨ ４．９、０．４％ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｌ－ロイシル－Ｌ－アラニン。
Ｒ１：膜を含む試料注入器
Ｒ２：水中７０ｍＭ ニンヒドリン
Ｒ３：０．３Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０５Ｍ ＮａＯＨ、ｐＨ＝１１．５．
Ｒ４：７０％ エタノール、０．２Ｍ コハク酸緩衝液 ｐＨ ４．９、０．４％ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｌ－ロイシル－Ｌ－アラニン。
【0093】
ＰＫＵ手順：
１．１５μｌの全血を血液計量移送ピペットに加えた。
２．計量移送ピペットを、Ｅｇｏｏ ＰＨＥカプセルの入口に挿入した。
３．計量移送ピペットがＲ１内のＷｈａｔｍａｎ９０３膜材料と物理的に接触すると、血液は膜材料内に受動的に流れた。血液移送の後、計量移送ピペットを廃棄した。
４．Ｗｈａｔｍａｎ－９０３膜に血液を移した後、フィルタを３時間乾燥させた。
５．乾燥後、Ｒ１からの血液膜を主キュベットに注入し、ここで、振動（ボルテックス）運動と組み合わされた抽出溶液Ｒ４は、抽出溶液Ｒ４中にＰＨＥ分子（及び他のアミノ酸）を抽出（放出）させた。
６．Ｒ２試薬を主キュベットに注入し、蛍光アッセイを開始した。
７．時点Ｔ０までの蛍光を測定することによるサンプルブランク測定を行った。
８．アッセイ混合物を４８°Ｃで３０～９０分間インキュベートした。
９．Ｒ３試薬を主キュベットに注入し、蛍光増強のためにＰＨを＞８．０に調整した。
１０．次に、Ｔ１で蛍光測定を行い、結果をＴ１／Ｔ０で算出した。
１１．最後に、検量線を使用してＰＨＥ濃度を計算し、生の蛍光データを最終ＰＨＥ濃度に変換した。
１．１５μｌの全血を血液計量移送ピペットに加えた。
２．計量移送ピペットを、Ｅｇｏｏ ＰＨＥカプセルの入口に挿入した。
３．計量移送ピペットがＲ１内のＷｈａｔｍａｎ９０３膜材料と物理的に接触すると、血液は膜材料内に受動的に流れた。血液移送の後、計量移送ピペットを廃棄した。
４．Ｗｈａｔｍａｎ－９０３膜に血液を移した後、フィルタを３時間乾燥させた。
５．乾燥後、Ｒ１からの血液膜を主キュベットに注入し、ここで、振動（ボルテックス）運動と組み合わされた抽出溶液Ｒ４は、抽出溶液Ｒ４中にＰＨＥ分子（及び他のアミノ酸）を抽出（放出）させた。
６．Ｒ２試薬を主キュベットに注入し、蛍光アッセイを開始した。
７．時点Ｔ０までの蛍光を測定することによるサンプルブランク測定を行った。
８．アッセイ混合物を４８°Ｃで３０～９０分間インキュベートした。
９．Ｒ３試薬を主キュベットに注入し、蛍光増強のためにＰＨを＞８．０に調整した。
１０．次に、Ｔ１で蛍光測定を行い、結果をＴ１／Ｔ０で算出した。
１１．最後に、検量線を使用してＰＨＥ濃度を計算し、生の蛍光データを最終ＰＨＥ濃度に変換した。
【0094】
結果
以下の分析性能特性試験を行った：
精度
－ 室内精度試験（室内変動性）
－ 室間精度試験（室間変動性）
以下の分析性能特性試験を行った：
精度
－ 室内精度試験（室内変動性）
－ 室間精度試験（室間変動性）
【0095】
約５０μＭ及び５００μＭのフェニルアラニンを含有する血液試料（血液試料１及び血液試料２）をアッセイした。
【0096】
室内精度。 １回の一連のＰＨＥ測定において、１人の操作者が１つの装置で経験する変動。
【0097】
【表1】
【0098】
室間精度試験。 室間精度は、試験室間、試験日間、異なる装置間、及び異なる操作者間の変動である。結果を以下の表２に示す。
【0099】
【表2】
【0100】
考察
この実施例の目的は、周知の蛍光ベースのＰＨＥアッセイを本発明と融合させる可能性を探求することである。結果は、本発明による方法が優れた性能を発揮することを示した。
この実施例の目的は、周知の蛍光ベースのＰＨＥアッセイを本発明と融合させる可能性を探求することである。結果は、本発明による方法が優れた性能を発揮することを示した。
【0101】
［実施例２．ヘモグロビンアッセイ］
「ヘモグロビンアッセイの原理」
ヘモグロビンは、日常的な診断パラメータである。
「ヘモグロビンアッセイの原理」
ヘモグロビンは、日常的な診断パラメータである。
【0102】
本発明のこの実施形態では、シアン化物非含有ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ：ＳＬＳ）を使用する周知のＳＬＳヘモグロビン検出方法を使用する。試薬は、試料中の赤血球及び白血球を溶解する。化学反応は、グロビンを変化させ、次いでヘム基を酸化することによって始まる。その後、ＳＬＳの親水性基はヘム基に結合し、安定な着色錯体（ＳＬＳ－ＨＧＢ）を形成することができ、これを、測光法を使用して分析する。
【0103】
Ｅｇｏｏ装置では、ＬＥＤ（５７０ｎｍ）は、混合物を通過する時にＳＬＳ－ＨＧＢ錯体によって吸収される単色光を送出する。吸光度は、フォトセンサによって測定され、試料のヘモグロビン濃度に比例する。
【0104】
「Ｈｂアッセイ手順の概要」
正確な体積の毛細管血液（１５μｌ）を指先から血液計量移送ピペットに移送した。血液計量移送ピペットをカプセル入口に挿入し、試料を受動移送によってフィルタ材料に移送した。フィルタ材料を含む試料を主キュベットに注入／挿入し、検出アセンブリのボルテックス運動を使用して血液を膜から即座に抽出した。ＨｂはここでＳＬＳ－ＨＧＢ複合体を形成し、Ｒ１試薬との２分間のインキュベーション後に５７０ｎｍで測定することができた。
正確な体積の毛細管血液（１５μｌ）を指先から血液計量移送ピペットに移送した。血液計量移送ピペットをカプセル入口に挿入し、試料を受動移送によってフィルタ材料に移送した。フィルタ材料を含む試料を主キュベットに注入／挿入し、検出アセンブリのボルテックス運動を使用して血液を膜から即座に抽出した。ＨｂはここでＳＬＳ－ＨＧＢ複合体を形成し、Ｒ１試薬との２分間のインキュベーション後に５７０ｎｍで測定することができた。
【0105】
ヘモグロビンアッセイ試薬
Ｒ４：市販のＳＬＳヘモグロビン検出試薬（Ｓｙｓｍｅｘ）。
Ｒ４：市販のＳＬＳヘモグロビン検出試薬（Ｓｙｓｍｅｘ）。
【0106】
血液を計量し、アッセイカプセルに添加した後、全てのアッセイステップをＥｇｏｏ装置によって行った：
１．指穿刺からの１５μｌの全血を血液計量移送ピペットに加えた。
２．計量移送ピペットをＥｇｏｏ Ｈｂカプセルの入口に挿入し、そこで計量移送ピペットを膜材料と物理的に接触させた。血液移送の後、計量移送ピペットを廃棄した。
３．時点Ｔ０までの吸光度を測定することによるサンプルブランク測定を行った。
４．Ｒ１上の膜に血液を移した後、血液を主キュベットに注入し、検出アセンブリの振動（ボルテックス）運動を使用して血液をＲ４試薬と混合した。
５．２分後のＴ１で吸光度測定を行い、結果をＴ１／Ｔ０で算出した。
６．最後に、較正曲線を使用してＨｂ濃度を計算し、生の吸光度データを最終Ｈｂ濃度に変換した。
１．指穿刺からの１５μｌの全血を血液計量移送ピペットに加えた。
２．計量移送ピペットをＥｇｏｏ Ｈｂカプセルの入口に挿入し、そこで計量移送ピペットを膜材料と物理的に接触させた。血液移送の後、計量移送ピペットを廃棄した。
３．時点Ｔ０までの吸光度を測定することによるサンプルブランク測定を行った。
４．Ｒ１上の膜に血液を移した後、血液を主キュベットに注入し、検出アセンブリの振動（ボルテックス）運動を使用して血液をＲ４試薬と混合した。
５．２分後のＴ１で吸光度測定を行い、結果をＴ１／Ｔ０で算出した。
６．最後に、較正曲線を使用してＨｂ濃度を計算し、生の吸光度データを最終Ｈｂ濃度に変換した。
【0107】
分析性能特性
室内精度。室内精度は、単一の一連のヘモグロビン測定において単一の装置で単一の操作者が経験する変動性である。
室内精度。室内精度は、単一の一連のヘモグロビン測定において単一の装置で単一の操作者が経験する変動性である。
【0108】
結果
結果を以下の表３に示す。ヘモグロビンアッセイのための室内精度試験。
１０回のＨｂアッセイを２つのＨｂ濃度で行った。
Ｅｇｏｏで合計２×１０＝８０回のＨｂアッセイを実行した。
結果を以下の表３に示す。ヘモグロビンアッセイのための室内精度試験。
１０回のＨｂアッセイを２つのＨｂ濃度で行った。
Ｅｇｏｏで合計２×１０＝８０回のＨｂアッセイを実行した。
【0109】
【表3】
【0110】
考察：
実施例２の目的は、周知の吸光度ベースのＨｂアッセイを本発明と融合させる可能性を探求することである。
実施例２の目的は、周知の吸光度ベースのＨｂアッセイを本発明と融合させる可能性を探求することである。
【0111】
［実施例３］
この実施例の目的は、アッセイキュベット、光源及び検出器を含む検出アセンブリをボルテックスすることによって試薬／試料混合が行われる本発明を使用した精度（％ＣＶ）を、検出アセンブリの外部でアッセイキュベットをボルテックスすることによって試薬／試料混合が行われる同様の方法と比較することである。
この実施例の目的は、アッセイキュベット、光源及び検出器を含む検出アセンブリをボルテックスすることによって試薬／試料混合が行われる本発明を使用した精度（％ＣＶ）を、検出アセンブリの外部でアッセイキュベットをボルテックスすることによって試薬／試料混合が行われる同様の方法と比較することである。
【0112】
蛍光色素エオシンＹ（励起３７０ｎｍ及び発光５５０ｎｍ）を含む液体５０μｌを流体チャンバＲ２に添加した。色素ブロモフェノールブルー（最大吸光度５７０ｎｍ）を含む液体５０μｌを流体チャンバＲ３に添加した。３００μｌのリン酸塩溶液からなる液体を主キュベットＲ４に添加した。カプセルをＥｇｏｏ装置に挿入した。Ｅｇｏｏ測定手順を以下に説明する。
【0113】
Ｅｇｏｏ測定手順１（本発明による手順）：
１．カプセルをＥｇｏｏ装置に挿入した。
２．主キュベット（リン酸緩衝液）からのブランク信号を測定した。
３．Ｒ２溶液を主キュベットに注入し、本発明によるボルテックス運動（５秒、１５００ｒｐｍ）によって混合し、続いて蛍光信号及び吸光度信号（信号１及び信号２）を測定した。
４．Ｒ３溶液を主キュベットに注入し、本発明によるボルテックス運動（５秒、１５００ｒｐｍ）によって混合し、続いて蛍光信号及び吸光度信号（信号３及び信号４）を測定した。
５．カプセルをＥｇｏｏ装置から取り出して廃棄した。
６．この手順を２０個のカプセルを用いて２０回繰り返した（ｎ＝２０）。
１．カプセルをＥｇｏｏ装置に挿入した。
２．主キュベット（リン酸緩衝液）からのブランク信号を測定した。
３．Ｒ２溶液を主キュベットに注入し、本発明によるボルテックス運動（５秒、１５００ｒｐｍ）によって混合し、続いて蛍光信号及び吸光度信号（信号１及び信号２）を測定した。
４．Ｒ３溶液を主キュベットに注入し、本発明によるボルテックス運動（５秒、１５００ｒｐｍ）によって混合し、続いて蛍光信号及び吸光度信号（信号３及び信号４）を測定した。
５．カプセルをＥｇｏｏ装置から取り出して廃棄した。
６．この手順を２０個のカプセルを用いて２０回繰り返した（ｎ＝２０）。
【0114】
手順２（試薬の全ての混合ステップがＥｇｏｏ装置の外部で行われ、全ての測定ステップがＥｇｏｏ装置の内部で行われる参照手順）
【0115】
蛍光色素エオシンＹ（励起３７０ｎｍ及び発光５５０ｎｍ）からなる液体５０μｌを流体チャンバＲ２に添加した。色素ブロモフェノールブルー（最大吸光度５７０ｎｍ）からなる液体５０μｌを流体チャンバＲ３に添加した。３００μｌのリン酸塩溶液からなる液体を主キュベットＲ４に添加した。カプセルを、後述する手順に従って、Ｅｇｏｏ測定器に挿入した。
【0116】
Ｅｇｏｏ手順２：
１．カプセルをＥｇｏｏ装置に挿入した。
２．主キュベット（リン酸緩衝液）からのブランク信号を測定した。
３．Ｒ２溶液を主キュベットに注入した。
４．カプセルをＥｇｏｏ装置から取り出し、手動混合ステップを、ボルテックス混合（５秒、１５００ｒｐｍ）を用いて行った。
５．カプセルを再びＥｇｏｏ装置に挿入し、続いて蛍光信号及び吸光度信号を測定した。
６．Ｒ３溶液を主キュベットに注入した。
７．カプセルをＥｇｏｏ装置から取り出し、手動混合ステップを、ボルテックス混合（５秒、１５００ｒｐｍ）を用いて行った。
８．カプセルを再びＥｇｏｏ装置に挿入し、続いて蛍光信号及び吸光度信号を測定した。
９．カプセルをＥｇｏｏ装置から取り出して廃棄した。
１０．この手順を２０個のカプセルを用いて２０回繰り返した（ｎ＝２０）。
１．カプセルをＥｇｏｏ装置に挿入した。
２．主キュベット（リン酸緩衝液）からのブランク信号を測定した。
３．Ｒ２溶液を主キュベットに注入した。
４．カプセルをＥｇｏｏ装置から取り出し、手動混合ステップを、ボルテックス混合（５秒、１５００ｒｐｍ）を用いて行った。
５．カプセルを再びＥｇｏｏ装置に挿入し、続いて蛍光信号及び吸光度信号を測定した。
６．Ｒ３溶液を主キュベットに注入した。
７．カプセルをＥｇｏｏ装置から取り出し、手動混合ステップを、ボルテックス混合（５秒、１５００ｒｐｍ）を用いて行った。
８．カプセルを再びＥｇｏｏ装置に挿入し、続いて蛍光信号及び吸光度信号を測定した。
９．カプセルをＥｇｏｏ装置から取り出して廃棄した。
１０．この手順を２０個のカプセルを用いて２０回繰り返した（ｎ＝２０）。
【0117】
アッセイ試薬：
Ｒ２：エオシンＹ ０．５ｗ／ｖ溶液、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ試薬２８５３、
ロット ０１８３８
Ｒ３：ブロモフェノールブルー溶液、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ試薬３１３７４４、
ロット ＭＫＣＤ９６６２
Ｒ４：標準的なリン酸緩衝液、Ｐｈ７．４
Ｒ２：エオシンＹ ０．５ｗ／ｖ溶液、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ試薬２８５３、
ロット ０１８３８
Ｒ３：ブロモフェノールブルー溶液、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ試薬３１３７４４、
ロット ＭＫＣＤ９６６２
Ｒ４：標準的なリン酸緩衝液、Ｐｈ７．４
【0118】
【表4】
【0119】
考察：
この実施例の目的は、本発明を使用した精度（％ＣＶ）を、本発明を使用していない同様の方法と比較することである。
この実施例の目的は、本発明を使用した精度（％ＣＶ）を、本発明を使用していない同様の方法と比較することである。
【0120】
上記の表４から分かるように、本発明を使用した蛍光信号及び吸光度信号の精度は有意に改善される。この精度改善の主な理由は、おそらく、本発明に記載されるように混合及び測定ステップが実施される時の主キュベット（分析ユニット）と光学システムとの間のより良好な位置合わせに関係している。
【0121】
［実施例４．Ｅｇｏｏ装置における逆転写鎖侵入ベースの増幅を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出］
【0122】
本実施例では、等温逆転写鎖侵入ベースの増幅（ＲＴ－ＳＩＢＡ）を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の無抽出検出にＥｇｏｏモニタリングシステムを使用した。
【0123】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイを、核酸抽出なしで粗中咽頭スワブ（swab）及び鼻咽頭スワブ（swab）で直接実施し、３０分以内に検出可能な反応がもたらされた。
【0124】
試料を適用した後、ＥｇｏｏカプセルシステムがＥｇｏｏ装置内で自動的に密封され、分子等温増幅に最適な閉鎖系が得られるため、Ｅｇｏｏ装置及びカプセルはこのタイプの分析に理想的である。以下から分かるように、Ｅｇｏｏ装置は、分析感度がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイについて反応当たり２５ウイルスＲＮＡコピーであり、また臨床的感度及び特異性がそれぞれ９３％及び１００％であり、ＰＣＲ装置に匹敵する感度及び特異性を示した。
【0125】
「試料調製」
口腔咽頭又は鼻咽頭スワブ（swab）をフロックスワブ（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈａｎｈｅｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｐａｎ）で採取し、１ｍｌのＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液、１ｍｌのＰＢＳ、１～４ｍｌの生理食塩水、１ｍｌのＵＴＭ（Ｃｏｐａｎ）、１ｍｌのＶＴＭ（ＮＥＳＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又は１ｍｌのＶＴＭ（Ｍｏｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に直接溶解した。ＰＢＳ、生理食塩水、ＵＴＭ又はＶＴＭに溶解した試料を、ＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液（８０ｍＭ 酢酸マグネシウム、２０ｍＭ 酢酸トリス（ｐＨ ８）、２％ Ｂｒｉｊ－５８、０．０３％ ＡＳＢ－１４、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ３００）で１０倍希釈してから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡマスターミックス（Ｑｌｉｆｅ）に適用した。鼻咽頭スワブからのウイルスＲＮＡも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＰＣＲアッセイで分析する前に、ＱｉａＡｍｐウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して精製した。
口腔咽頭又は鼻咽頭スワブ（swab）をフロックスワブ（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈａｎｈｅｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｐａｎ）で採取し、１ｍｌのＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液、１ｍｌのＰＢＳ、１～４ｍｌの生理食塩水、１ｍｌのＵＴＭ（Ｃｏｐａｎ）、１ｍｌのＶＴＭ（ＮＥＳＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又は１ｍｌのＶＴＭ（Ｍｏｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に直接溶解した。ＰＢＳ、生理食塩水、ＵＴＭ又はＶＴＭに溶解した試料を、ＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液（８０ｍＭ 酢酸マグネシウム、２０ｍＭ 酢酸トリス（ｐＨ ８）、２％ Ｂｒｉｊ－５８、０．０３％ ＡＳＢ－１４、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ３００）で１０倍希釈してから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡマスターミックス（Ｑｌｉｆｅ）に適用した。鼻咽頭スワブからのウイルスＲＮＡも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＰＣＲアッセイで分析する前に、ＱｉａＡｍｐウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して精製した。
【0126】
「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡ」
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡマスターミックス（Ｑｌｉｆｅ）は、製造業者（Ａｉｄｉａｎ）の指示に従って混合される３つの試薬を混合することからなる。ＲＴ－ＳＩＢＡ Ｍｉｘ Ａ（組換え及び増幅のための酵素を含有する反応混合物）、Ｍｉｘ Ｂ（補助因子を含有する反応混合物）及びオリゴミックス（プライマー及び侵入プローブを含有する反応混合物）を氷上で解凍し、ボルテックスによって混合する。マスターミックス試薬の詳細は、製造業者（Ａｉｄｉａｎ）に連絡することによって、又は例えば、「Ｈｏｓｅｒ ＭＪ，Ｍａｎｓｕｋｏｓｋｉ ＨＫ，Ｍｏｒｒｉｃａｌ ＳＷ，Ｅｂｏｉｇｂｏｄｉｎ ＫＥ．Ｓｔｒａｎｄ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＩＢＡＨ）：Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｔｅ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ｜ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１２６５６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２４，２０１４」又は「Ｅｂｏｉｇｂｏｄｉｎ Ｋ，Ｆｉｌｅｎ Ｓ，Ｏｊａｌｅｈｔｏ Ｔ，Ｂｒｕｍｍｅｒ Ｍ，Ｅｌｆ Ｓ，Ｐｏｕｓｉ Ｋ，Ｈｏｓｅｒ Ｍ．Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔｒａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ－ＳＩＢＡ）：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ａｎｄ Ｂ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１６）１００：５５５９－５５６７ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２５３－０１６－７４９１－ｙ」を参照することで確認できる。オリゴミックス中のプライマー及び侵入プローブは、本明細書に記載の通りであった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡマスターミックス（Ｑｌｉｆｅ）は、製造業者（Ａｉｄｉａｎ）の指示に従って混合される３つの試薬を混合することからなる。ＲＴ－ＳＩＢＡ Ｍｉｘ Ａ（組換え及び増幅のための酵素を含有する反応混合物）、Ｍｉｘ Ｂ（補助因子を含有する反応混合物）及びオリゴミックス（プライマー及び侵入プローブを含有する反応混合物）を氷上で解凍し、ボルテックスによって混合する。マスターミックス試薬の詳細は、製造業者（Ａｉｄｉａｎ）に連絡することによって、又は例えば、「Ｈｏｓｅｒ ＭＪ，Ｍａｎｓｕｋｏｓｋｉ ＨＫ，Ｍｏｒｒｉｃａｌ ＳＷ，Ｅｂｏｉｇｂｏｄｉｎ ＫＥ．Ｓｔｒａｎｄ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＩＢＡＨ）：Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ａｎａｌｙｔｅ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ｜ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１２６５６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２４，２０１４」又は「Ｅｂｏｉｇｂｏｄｉｎ Ｋ，Ｆｉｌｅｎ Ｓ，Ｏｊａｌｅｈｔｏ Ｔ，Ｂｒｕｍｍｅｒ Ｍ，Ｅｌｆ Ｓ，Ｐｏｕｓｉ Ｋ，Ｈｏｓｅｒ Ｍ．Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔｒａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ－ＳＩＢＡ）：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ａｎｄ Ｂ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１６）１００：５５５９－５５６７ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２５３－０１６－７４９１－ｙ」を参照することで確認できる。オリゴミックス中のプライマー及び侵入プローブは、本明細書に記載の通りであった。
【0127】
場合によっては、Ｍｉｘ Ａは沈殿物を形成することができ、これを３７～４１°Ｃに加熱し、続いてボルテックスすることによって除去することができる。ＰＣＲ装置で行われる参照反応のために、マスターミックスを、反応あたり７μｌのＭｉｘ Ａ、７μｌのＭｉｘ Ｂ及び３．５μｌのオリゴミックスを混合することによって調製した。マスターミックス（１７．５μｌ）をＰＣＲチューブに添加し、２、５μｌの試料（ＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液で１０倍希釈）をマスターミックスに添加した。ＲＴ－ＳＩＢＡ反応を、ＭＸ３００５Ｐ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）又はＣＦＸ９６（ＢｉｏＲＡＤ）のいずれかを使用し、ＰＣＲ装置を４４°Ｃに設定して実施し、３０分間毎分蛍光測定値を記録し、続いて融解曲線分析：４４°Ｃ～９５°Ｃを行った。Ｅｇｏｏ装置で行われる反応では、１４０μｌの既製のマスターミックスを入れたＥｇｏｏカプセル（Ｑｌｉｆｅ）を、２０μｌの試料（ＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液で１０倍希釈）を適用した後にＥｇｏｏ装置に装填した。反応が始まる前に、ピストン機構がカプセルをプランジャで密封すると、ＥｇｏｏカプセルがＥｇｏｏ装置内で閉じた。プランジャがカプセルを密封すると、Ｅｇｏｏ装置はカプセルを４４°Ｃに３０分間加熱した。反応の間、カプセル内の試薬を５分毎に３秒間振盪（１０００ｒｐｍ）することによって混合した。蛍光測定値を毎分３回記録した。
【0128】
「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＰＣＲ（参考）」
Ｃｈａｒｉｔｅ Ｂｅｒｌｉｎ製のＥ遺伝子アッセイを、Ｌｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）と共に使用した。簡単に説明すると、１２．５μｌのＬｕｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、１．２５μｌのＬｕｎａ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、０．５μｌのＥ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｆ１（２０μＭ）、０．５μｌのＥ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｒ２（２０μＭ）、０．２５μｌのＥ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｐ１（２０μＭ）、７．５μｌのヌクレアーゼ非含有水及び２．５μｌの試料（精製ＲＮＡ又はＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液で１０倍希釈された試料）を混合し、以下のプログラムで実行した。
５５°Ｃで１０分間、９５°Ｃで３分間、９５°Ｃで１５秒間と５８°Ｃで３０秒間とを４５サイクル。
ＲＴ－ＰＣＲ反応は、ＭＸ ３００５ Ｐ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、ＣＦＸ ９６（ＢｉｏＲＡＤ）又はＡｒｉａＭｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ）のいずれかを用いて行った。
Ｃｈａｒｉｔｅ Ｂｅｒｌｉｎ製のＥ遺伝子アッセイを、Ｌｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）と共に使用した。簡単に説明すると、１２．５μｌのＬｕｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、１．２５μｌのＬｕｎａ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、０．５μｌのＥ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｆ１（２０μＭ）、０．５μｌのＥ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｒ２（２０μＭ）、０．２５μｌのＥ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｐ１（２０μＭ）、７．５μｌのヌクレアーゼ非含有水及び２．５μｌの試料（精製ＲＮＡ又はＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液で１０倍希釈された試料）を混合し、以下のプログラムで実行した。
５５°Ｃで１０分間、９５°Ｃで３分間、９５°Ｃで１５秒間と５８°Ｃで３０秒間とを４５サイクル。
ＲＴ－ＰＣＲ反応は、ＭＸ ３００５ Ｐ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、ＣＦＸ ９６（ＢｉｏＲＡＤ）又はＡｒｉａＭｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ）のいずれかを用いて行った。
【0129】
「ウイルス培養」
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）（Ｂ９５－８）、パラインフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ－１）、アデノウイルス５型（Ａｄｖ５）、呼吸器合胞体ウイルスＡ型（ＲＳＶ－Ａ）（２００６）、インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ（ＩＮＦＬ Ａ）（ＮＹ／０２／０７）、インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ（ＩＮＦＬ Ｂ）（Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８）、ライノウイルスＡ１６、エンテロウイルス６８型（ＥＶ－６８）（２００７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）（Ｐｅｒｕ２－２００２）、コロナウイルスＯＣ４３、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルス２２９Ｅ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（Ｉｔａｌｙ－ＩＮＭＩ１）（１．０２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅから購入したＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）（３．０９×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／ＶＭ２０００ｉ０６ｉ／２０２０）（１．１５×１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を、中咽頭スワブバックグラウンドにスパイクして直接使用し、ウイルスを１０倍希釈した。ＭＥＲＳ（２０１９）、ＲＳＶ（２０１９）、ｈＭＰＶ（２０１９）及びコロナウイルス（２０１９）のＱＣＭＤパネルを、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）並びにＤＮＡ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ ＮＡ Ｓｍａｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製する。ヒト２０１９－ｎＣｏＶ分離株（０２６Ｖ－０３８８３）（ＥＶＡｇ）をＶｅｒｏ Ｅ６細胞中で培養し、上清のウイルス力価を１．６×１０５ ＴＣＩＤ５０／ｍｌと決定した。更に、採取した上清を、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ精製ＲＮＡ及び中咽頭スワブからＲＮＡにスパイクした合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ対照（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に基づく標準曲線を用いて１．２×１０７ ＲＮＡコピー／ｍｌに定量した。定量はＲＴ－ＰＣＲ Ｅ遺伝子アッセイを用いて行った。
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）（Ｂ９５－８）、パラインフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ－１）、アデノウイルス５型（Ａｄｖ５）、呼吸器合胞体ウイルスＡ型（ＲＳＶ－Ａ）（２００６）、インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ（ＩＮＦＬ Ａ）（ＮＹ／０２／０７）、インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ（ＩＮＦＬ Ｂ）（Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８）、ライノウイルスＡ１６、エンテロウイルス６８型（ＥＶ－６８）（２００７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）（Ｐｅｒｕ２－２００２）、コロナウイルスＯＣ４３、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルス２２９Ｅ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（Ｉｔａｌｙ－ＩＮＭＩ１）（１．０２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅから購入したＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）（３．０９×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／ＶＭ２０００ｉ０６ｉ／２０２０）（１．１５×１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を、中咽頭スワブバックグラウンドにスパイクして直接使用し、ウイルスを１０倍希釈した。ＭＥＲＳ（２０１９）、ＲＳＶ（２０１９）、ｈＭＰＶ（２０１９）及びコロナウイルス（２０１９）のＱＣＭＤパネルを、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）並びにＤＮＡ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ ＮＡ Ｓｍａｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製する。ヒト２０１９－ｎＣｏＶ分離株（０２６Ｖ－０３８８３）（ＥＶＡｇ）をＶｅｒｏ Ｅ６細胞中で培養し、上清のウイルス力価を１．６×１０５ ＴＣＩＤ５０／ｍｌと決定した。更に、採取した上清を、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ精製ＲＮＡ及び中咽頭スワブからＲＮＡにスパイクした合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ対照（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に基づく標準曲線を用いて１．２×１０７ ＲＮＡコピー／ｍｌに定量した。定量はＲＴ－ＰＣＲ Ｅ遺伝子アッセイを用いて行った。
【0130】
「臨床試料」
ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイ及びＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用して、２５人の陽性鼻咽頭スワブ（Ｃｅｎｔｒａｌ ＢｉｏＨｙｂ（登録商標））、２５人の陰性鼻咽頭スワブ（Ｃｅｎｔｒａｌ ＢｉｏＨｙｂ（登録商標））、３０人の陽性中咽頭スワブ（Ｑｌｉｆｅ ＣＯＶＩＤ－１９サービスセンター）、及び３０人の陰性中咽頭スワブ（Ｑｌｉｆｅ ＣＯＶＩＤ－１９サービスセンター）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について検査した。検査した各試料について患者インフォームドコンセントを得た。
ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイ及びＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用して、２５人の陽性鼻咽頭スワブ（Ｃｅｎｔｒａｌ ＢｉｏＨｙｂ（登録商標））、２５人の陰性鼻咽頭スワブ（Ｃｅｎｔｒａｌ ＢｉｏＨｙｂ（登録商標））、３０人の陽性中咽頭スワブ（Ｑｌｉｆｅ ＣＯＶＩＤ－１９サービスセンター）、及び３０人の陰性中咽頭スワブ（Ｑｌｉｆｅ ＣＯＶＩＤ－１９サービスセンター）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について検査した。検査した各試料について患者インフォームドコンセントを得た。
【0131】
開発された等温ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲｄＲｐ遺伝子を標的とする。
【0132】
ＲＴ－ＳＩＢＡアンプリコン：
ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＧＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴ
ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＧＴＣＡＧＴＴＣＴＴ
ＴＧＴＴＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧ
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ＴＧＴＴＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧ
【0133】
結果
ＧＩＳＡＩＤに提出された１１９，２１５個のウイルス配列からの全長配列のＳｉｌｉｃｏ分析は、世界中の全分離株の９９．６２％が上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイプライマー及びプローブによって検出されることを示した（世界中の４５２個の配列が一意でないランダムＳＮＰを含有していた）。
ＧＩＳＡＩＤに提出された１１９，２１５個のウイルス配列からの全長配列のＳｉｌｉｃｏ分析は、世界中の全分離株の９９．６２％が上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイプライマー及びプローブによって検出されることを示した（世界中の４５２個の配列が一意でないランダムＳＮＰを含有していた）。
【0134】
方法を単純化するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイは、マイルドな界面活性剤及びマグネシウムを含有するＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液を使用して、ＮＡ抽出なしで粗試料に直接使用されるように設計された。
【0135】
最初に、他のヒトコロナウイルス（ｈＣｏＶ－ＮＬ６３、ｈＣｏＶ－２２９Ｅ及びｈＣｏＶ－ＯＣ４３）及び最も一般的なヒト呼吸器ウイルス、例えばインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１、インフルエンザＢ及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイの分析特異性を確認した。異なるウイルスからの精製ウイルスＮＡ又は不活化ウイルス培養物をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性中咽頭バックグラウンドにスパイクした。
【0136】
試料をＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液で１０倍希釈した後、２つの異なるＰＣＲ装置（ＭＸ３００５Ｐ又はＣＦＸ９６）及び小型Ｅｇｏｏ装置を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイで分析した。精製ＮＡ又は全溶解ウイルス培養物（非精製ＲＮＡ）のいずれについても、他の呼吸器ウイルスに対する交差反応性は検出されず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に１００％特異的であった。
【0137】
その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイの分析感度を調べた。合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ及び不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス培養物を異なる濃度で陰性中咽頭スワブにスパイクし、ＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液で１０倍希釈した。ＰＣＲ装置（Ｍｘ３００５Ｐ）と５つの異なるＥｇｏｏ装置との両方を使用して、異なる希釈液を試験した。
【0138】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイの分析感度
【0139】
【表5】
【0140】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイの検出限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＬＯＤ）は、合成ＲＮＡと全ウイルス培養物との両方を使用した場合、２０～２５ＲＮＡコピー／反応であることが分かる。ＰＣＲ装置と試験した５つのＥｇｏｏ装置との間でＬＯＤの差は観察されない。しかし、ＰＣＲ装置の場合、ＰＣＲチューブに装填されるのはわずか２．５μｌの試料であり、一方、Ｅｇｏｏカプセルには２０μｌの試料が装填される。これは、ＰＣＲ装置と比較して、Ｅｇｏｏ装置の試料投入濃度が低いことに対応している。Ｅｇｏｏ装置は、１．２５ウイルスＲＮＡコピー／μｌという低濃度であっても検出することができた。
【0141】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイは、ＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液を使用して、ＮＡ抽出なしで粗試料に直接使用されるように設計されている。溶解を試料採取チューブで直接実施できるかどうかを試験するために、異なる濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス培養物を陰性中咽頭スワブバックグラウンドにスパイクし、続いてサンプリングスワブ（ｎ＝１６）に添加した。スパイクされたスワブを含むチューブにＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液（５００μｌ）を直接添加し、チューブを振盪しながら室温で１０分間インキュベートしてスワブからウイルスＲＮＡを放出させた後、ＰＣＲ装置を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイで分析した。陰性対照として、ＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液に直接溶解された陰性中咽頭スワブ（ｎ＝１８）も分析した。４２００ウイルスｃｐをスパイクし、７９ウイルスｃｐ／μｌの濃度までＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液に溶解させたスワブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡ反応で容易に検出することができた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性中咽頭スワブの分析は試料の３９％（７／１８）で陽性検出を示し、融解曲線の分析は５６°Ｃ付近に第２の融解ピークを示したが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性試料の正しい融解ピークは６８°Ｃにあるべきである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ検出に基づいており、従って、試料中のゲノムバックグラウンドのために非標的増幅が起こり得る。融解曲線分析を行うことにより、ＰＣＲ装置において非標的増幅を容易に検出することができる。しかしながら、Ｅｇｏｏ装置では、融解曲線分析を実行することができない。従って、試料を２倍、５倍、１０倍、２０倍希釈すると非標的増幅が減少するかどうかを調べた。試料の希釈は、試料の１０倍及び２０倍の希釈が非標的融解ピークの形成を排除することを明確に示した。これを更に試験するために、１２８人の陰性中咽頭患者スワブ（１ｍｌのＰＢＳに溶解）をＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液で１０倍希釈し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイで分析した。１０倍希釈した陰性中咽頭スワブの１／１２８（０．７％）のみが非標的増幅を示し、増幅曲線は非常に小さかった。これらの結果は、Ｅｇｏｏ装置で分析する前に、試料をＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液で１０倍希釈することが好ましいことを示している。非専門家向けの希釈手順の方法を単純化するために、試料をＥｇｏｏ装置のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイで直接使用する場合、１０ｍｌのＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液を試料採取チューブに添加しなければならない。
【0142】
中咽頭スワブにおける非標的増幅を減少させるためには、試料は好ましくは１０倍希釈されるべきであるので、本発明者らは、ＵＴＭやＶＴＭなどの別のサンプリング媒体をＥｇｏｏ監視システムと共に使用できるかどうかを調べたいと考えた。本発明者らは、ＰＢＳ又は生理食塩水に溶解したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性中咽頭患者試料しか入手できなかったので、ＵＴＭ（Ｃｏｐａｎ）、ＶＴＭ（ＮＥＳＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びＶＴＭ（Ｍｏｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（１：１０）中のウイルス培養（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／ＶＭ２０００ｉ０６ｉ／２０２０）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性中咽頭患者試料（元々は１ｍｌのＰＢＳに溶解）をスパイクすることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性ＵＴＭ及びＶＴＭ試料をシミュレートした。試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイで分析する前に、シミュレート対象のＵＴＭ及びＶＴＭ試料をＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液で更に１０倍希釈した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイは、ＵＴＭ（Ｃｏｐａｎ）、ＶＴＭ（ＮＥＳＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又はＶＴＭ（Ｍｏｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在によって影響されず、陰性のままであったＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性スワブを除いて、ウイルス培養物の全ての希釈物及び全ての患者試料が検出された。異なる培地間の有意差は観察されなかった。これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイが試料採取方法に依存せず、異なるＶＴＭ及びＵＴＭ培地で既に採取された試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイで使用できることを示している。
【0143】
試料の直接溶解及び１０倍希釈は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイの臨床的感度を低下させる可能性がある。これを試験するために、Ｅ遺伝子を標的としたＲＴ－ＰＣＲで以前に診断された、１ｍｌのＰＢＳに溶解した３０人のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性中咽頭患者スワブ及び３０人のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性中咽頭患者スワブ（Ｑｌｉｆｅ ＣＯＶＩＤ－１９サービスセンター）で臨床的感度を試験した。１～４ｍｌの生理食塩水に溶解し、Ｃｅｎｔｒａｌ ＢｉｏＨｕｂから購入した、Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｐａｎｔｈｅｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｐａｎｅｌ ２及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で以前に診断された追加の２５人のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性鼻咽頭患者スワブ及び２５人の陰性鼻咽頭患者スワブも分析した。採取した試料をＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液で１０倍希釈し、Ｅｇｏｏ装置で試験した。これらの結果は、ＰＢＳ中の中咽頭スワブについて９３％及び１００％の臨床的感度及び特異性を示した。
【0144】
中咽頭患者試料及び鼻咽頭患者試料の臨床的感度及び特異性
【0145】
【表6】
【0146】
驚くべきことに、生理食塩水中の鼻咽頭スワブでは１０／２５（４０％）しか検出されなかった（上記の表６）。鼻咽頭スワブは、Ｃｅｎｔｒａｌ ＢｉｏＨｕｂから購入され、Ｃｅｎｔｒａｌ ＢｉｏＨｕｂでは、試料は、外国から出荷される前に未知の日数の間－８０度で保存されていた。従って、本発明者らは、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を確認することにした。鼻咽頭スワブからのＲＮＡを、ＱｉａＡｍｐウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、次いで、Ｅ遺伝子アッセイ（１４）を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを分析した。ＲＴ－ＰＣＲで陽性と確認できた試料は１１／２５（４４％）のみであり（表６）、これらの試料の１／１１のみがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイで検出されなかった（表６）。これらの劣化した試料を計算から除外すると、鼻咽頭スワブ及び中咽頭スワブにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイの総合的な感度及び特異度（特異性）は、それぞれ９３％及び１００％であった（表６）。
【0147】
考察
試験室外の非専門家によって行われる迅速な核酸ベースの検査は、ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックの封じ込めに役立ち得る。これまでのところ、非専門的使用のために開発され商業化されているのは、感度の低い抗原検査及び１つの核酸ベースの検査のみである（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｕｃｉｒａｈｅａｌｔｈ．ｃｏｍ／）。ここで、本発明者らは、生化学的マーカーの家庭用モニタリングのために開発された、Ｅｇｏｏモニタリングシステムと呼ばれる新しい非常に小型の装置を初めて提示する。Ｅｇｏｏモニタリングシステムは、使用が簡単であり、個人宅、プライマリケア診療所、介護施設、大量輸送ハブ（空港又は駅）及び職場で専門の試験室スタッフを必要とせずに、使用することができる。
試験室外の非専門家によって行われる迅速な核酸ベースの検査は、ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックの封じ込めに役立ち得る。これまでのところ、非専門的使用のために開発され商業化されているのは、感度の低い抗原検査及び１つの核酸ベースの検査のみである（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｕｃｉｒａｈｅａｌｔｈ．ｃｏｍ／）。ここで、本発明者らは、生化学的マーカーの家庭用モニタリングのために開発された、Ｅｇｏｏモニタリングシステムと呼ばれる新しい非常に小型の装置を初めて提示する。Ｅｇｏｏモニタリングシステムは、使用が簡単であり、個人宅、プライマリケア診療所、介護施設、大量輸送ハブ（空港又は駅）及び職場で専門の試験室スタッフを必要とせずに、使用することができる。
【0148】
方法を単純化するために、本発明者らは、マイルドな界面活性剤を含有する専用のＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液を使用する無抽出ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイを開発した。ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックの間に、ＮＡ抽出は時間がかかるだけでなく、消耗品の不足に起因するボトルネックも引き起こすことが証明されている。従って、多くの試験室は、ウイルスの不活化及び溶解のために熱又は界面活性剤のいずれかを使用して粗試料を直接使用するなど、ＮＡ抽出の代替方法を探すことを強いられている。これは、ゴールドスタンダード精製方法とほぼ同等の感度及び特異性であることが証明されており、最適化後、本発明者らは、Ｅｇｏｏ装置を使用して非専門家が使用することができるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡアッセイのための単純化されたサンプリングワークフローを完成させた。
【0149】
単純化されたワークフローの１つの欠点は、試料をＥｇｏｏ装置専用の緩衝液（ＳＩＢＡ溶解／反応緩衝液など）で希釈しなければならないことである。ＰＣＲ装置でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイを行う場合、アッセイの特異性を試験するために融解曲線分析を行うことができる。しかしながら、これはＥｇｏｏ装置では不可能であり、従って、例えばより大きなサンプリング体積を採取チューブに添加することによって試料希釈を行わなければならない。大きなサンプリング体積は、アッセイの感度に影響を及ぼす可能性が非常に高く、またウイルス含有量が極めて少ない試料は、Ｅｇｏｏ装置に適していない可能性がある。他の研究では、ＮＡ抽出なしでＰＢＳ、生理食塩水及びＵＴＭに溶解させた鼻咽頭試料を直接使用すると、直接ＲＴ－ＰＣＲが阻害され、試料の希釈（又はＲＴ－ＰＣＲ反応への試料投入量の減少）は阻害効果を減少させることが示されている。従って、Ｅｇｏｏ装置における分析前の試料の１０倍希釈は、非標的増幅を排除するだけでなく、そうでなければＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＳＩＢＡ反応に影響を及ぼし得る阻害剤も排除し得る。
【0150】
Ｅｇｏｏ装置は、試料を適用した後にＥｇｏｏ装置内のプランジャで密封される特殊なカプセルを使用し、従ってアンプリコン汚染のリスクを排除する。核酸ベースの検査における増幅工程は極端であり、数十億コピーの目的の標的をもたらす。この増幅工程は、アンプリコン汚染及び偽陽性の検出を回避するための閉鎖系を必要とする。増幅後にチューブを開いてラテラルフロースティック上で使用することは、専門の試験室では可能であるが、周囲全体を汚染することなく現在の形態で試験室外で行うことは不可能である。ラテラルフロースティックの代替として、最近ＦＤＡ認可を受けたＬｕｃｉｒａ（商標）ＣＯＶＩＤ－１９ Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ使い捨て試験キット（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｕｃｉｒａｈｅａｌｔｈ．ｃｏｍ／）がある。このオールインワン使い捨ては、増幅後にチューブを開く必要がない。Ｌｕｒｉｃａ使い捨て検査キットとは対照的に、Ｅｇｏｏ装置は何回でも使用することができ、使用後にアッセイカプセルを交換するだけでよい。従って、Ｅｇｏｏ装置は、他の呼吸器ウイルスの検査を含む多くのその後のアッセイに使用することができる。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-10-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の分析物の量を測定する方法であって、当該方法は、以下のステップを含む、即ち、ａ．検出アセンブリを準備するステップであり、当該検出アセンブリが、
(i) 電磁放射線源と、
(ii) 電磁放射線を検出する手段と、
(iii) 試料非含有液体を収容する容器であって、前記線源から印加された電磁放射線が前記容器を通って前記線源から前記検出手段に放射され得るように、又は代替的に、前記線源から印加された電磁放射線の結果として前記容器内の前記液体から前記検出手段に電磁放射線が放射され得るように、前記電磁放射線源と前記電磁放射線を検出する手段との間に配置される、容器と、
を備える、ステップと、
ｂ．前記容器内の試料非含有液体に試料を添加するステップと、
ｃ．オプションとして、１種以上の試薬を添加するステップと、
ｄ．時点Ｔ０での電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｅ．オプションとして、１種以上の試薬を添加するステップと、
ｆ．時点Ｔ１での電磁放射線の測定を実施するステップと、
ｇ．オプションとして、電磁放射線の１回以上の更なる試料測定を実施するステップと、
を含んでおり、
ステップｂ～ｄは任意の順序で実施することができる、方法において、
当該方法は、前記容器内の試料及び液体が、前記検出アセンブリをボルテックスすることにより実行される少なくとも１回の混合ステップ（ｍ）に供されて、従って、前記線源及び前記手段に対する前記容器の位置取りが、前記混合ステップの間、一定であることを特徴とする、方法。
【請求項2】
混合ステップ（ｍ）は、ステップｂの後に続いて、且つステップｄの前に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
混合ステップ（ｍ）は、ステップｄの後に続いて、且つステップｆの前に実施される、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
混合ステップ（ｍ）は、ステップｆの後に続いて実施される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記試料は５０μｌ未満からなる液体試料である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記混合ステップ（ｍ）における混合は、前記検出アセンブリを、少なくとも１０００ｒｐｍの速度の円運動又は楕円運動でボルテックスすることにより行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記試料は血液試料である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記分析物は、フェニルアラニン、ｈｓ－ＣＲＰ、ＨｂＡ１ｃ、ビタミンＤ、ｄ－ダイマー又は血中脂質を含む群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法を実施するための装置であって、当該装置は、
ａ．検出アセンブリであって、
(i) 電磁放射線源と、
(ii) 電磁放射線を検出するための手段と、
(iii) 試料非含有液体を収容する容器、又は、試料非含有液体を収容する容器を受け入れるための手段と、
を具備してなる、検出アセンブリと、
ｂ．前記検出アセンブリをボルテックスするべく構成された手段と、
を備えてなる、装置。
【国際調査報告】