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特表2023-508968認知症および年齢依存性の認知機能低下を治療するための腸内微生物叢に関連する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-06
(54)【発明の名称】認知症および年齢依存性の認知機能低下を治療するための腸内微生物叢に関連する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20230227BHJP
C12Q 1/00 20060101ALI20230227BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20230227BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20230227BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230227BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230227BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
C12Q1/00
G01N33/569 F
G01N33/48 M
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022539021
(86)(22)【出願日】2020-12-22
(85)【翻訳文提出日】2022-07-29
(86)【国際出願番号】 EP2020087698
(87)【国際公開番号】W WO2021130267
(87)【国際公開日】2021-07-01
(31)【優先権主張番号】19219331.6
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20161869.1
(32)【優先日】2020-03-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522250910
【氏名又は名称】アルベルト・ルートヴィヒ大学フライブルク
(74)【代理人】
【識別番号】100080182
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 三彦
(74)【代理人】
【識別番号】100142572
【弁理士】
【氏名又は名称】水内 龍介
(72)【発明者】
【氏名】ブランク トーマス
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045AA40
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB03
2G045CB04
2G045CB07
2G045CB21
2G045CB26
2G045CB30
2G045DA35
2G045FA34
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ80
4B063QR49
4B063QR72
(57)【要約】
本発明は、認知症疾患の診断および治療の新たな手法に関する。具体的には、本発明は、認知症疾患を診断する新たなマーカー、および認知症疾患治療の新たな標的に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記濃度に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
を含む方法。
【請求項2】
前記試料が、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料のうちの１つから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０５０μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前記前駆体が、５－アミノ吉草酸またはＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）のうちの１つから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
前記濃度が、内部標準物質との比較、または代謝物標準物質との外部比較によって決定される、請求項１～４のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ｃ）のステップが、前記ｂ）のステップの前記濃度を、対照データ、具体的には、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人の健常者の対照データの濃度と比較することを含む、請求項１～５のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記認知症が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、請求項１～６のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、ａ）第１の時点で被験者から第１の試料を入手すること；
ｂ）前記第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｃ）第２の時点で前記被験者から第２の試料を入手すること；
ｄ）前記第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｅ）前記ｂ）とｄ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
を含む方法。
【請求項9】
前記第１の時点と第２の時点が約３～６カ月間隔てられている、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、ファーミキューテス、およびバクテロイデスのいずれかの存在量を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記存在量に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することであって、特に、前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することが、ファーミキューテスとバクテロイデスの比率を比較することを含むこと
を含む方法。
【請求項11】
前記試料が、微生物試料、腸内細菌叢試料、腸試料、糞便試料、および／または便試料のうち１つまたは複数から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、ａ）ヒトから脳試料を入手すること；
ｂ）前記脳試料中のパルブアルブミン陽性介在ニューロンを同定すること；
ｃ）前記脳試料における自発性ＩＰＳＣの頻度を測定すること；
ｄ）前記ｃ）のステップで測定した前記頻度に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
を含む方法。
【請求項13】
薬剤候補をスクリーニングする方法であって、ａ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のうち１つまたは複数を含む試料を用意すること；
ｂ）前記試料を前記試験薬に曝露すること；
ｃ）前記試料に対する前記試験薬の効果を測定すること；
ｄ）前記試料に対する前記試験薬の効果に基づいて、前記試験薬の薬剤候補としての適格性を決定すること
を含む方法。
【請求項14】
認知症の治療に適している患者群を同定する方法であって、ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記濃度に基づいて前記被験者が治療に応答する確率を決定すること
を含む方法。
【請求項15】
認知症の治療に適している患者群を同定する方法であって、ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、ファーミキューテス、およびバクテロイデスのいずれかの存在量を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記存在量に基づいて前記被験者が治療に応答する確率を決定することであって、特に、前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することが、ファーミキューテスとバクテロイデスの比率を比較することを含むこと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、認知症疾患の診断および治療の新たな手法に関する。具体的には、本発明は、認知症疾患を診断する新たなマーカー、および認知症疾患治療の新たな標的に関する。
【背景技術】
【0002】
認知症とは、日常生活や活動が妨げられるほどに人の認知機能（判断、記憶、推論）や行動能力が低下することである。これらの機能には、記憶、言語技能、視覚認知、問題解決、自己管理のほか、注意力や集中力などがある。認知症を有する人の中には感情を抑制できない人もおり、性格が変わってしまうこともある。認知症の重症度は、人間の機能に影響が出始めたばかりのごく軽度のものから、生活の基本的な活動を完全に他者に頼らざるを得ない極めて重度のものまである。
【0003】
認知症の徴候や症状は、かつて健康であった脳のニューロン（神経細胞）が機能しなくなり、他の脳細胞との結合が失われ、死滅することで生じ得る。加齢に伴って誰もが多少のニューロンを失うが、認知症を有する人では、通常はるかに多くのニューロンが失われている。認知症は高齢になるほどよく見られるが（８５歳以上の人の半数近くが何らかの認知症を患っている可能性がある）、加齢に伴う正常な現象ではない。９０歳を超えても認知症の徴候もなく生活している人も多い。認知症の１つである前頭側頭型認知症は、高齢者よりも中高年で多く見られる。認知症の原因は、起こっているとみられる脳の変化の種類によって異なる可能性がある。高齢者の認知症で最も一般的な原因疾患はアルツハイマー病である。その他の認知症には、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、血管性認知症などがある。２種類以上の認知症が合併した混合型認知症もよく見られ、例えばアルツハイマー型認知症と血管性認知症を併発する人もいる。
【0004】
一般に、人口動態の変化により、社会における認知症の重要性が飛躍的に高まっている。現在、治療の選択肢は限られている。近年、認知症の原因や病態生理に関する知識が膨大に増えているが、それにもかかわらず、認知症をいかに診断し、治療するかが大きな課題となっている。「腸－脳」軸が非常に重要であることを示す調査研究が増えており、さまざまな神経疾患のトリガーが消化管に見いだされ得ることが示唆されている。また、微生物が宿主の行動や認知機能に与える影響もますます重要視されている。無菌動物モデルを用いた実験では、行動障害や認知機能低下の出現が認められている。その他のいくつかの動物モデルやヒト患者の研究で、不安様行動、うつ病、注意欠陥障害、認知障害で見られるようなさまざまな病的行動が、腸内代謝物によって調節されることが確認されている（非特許文献１～３）。腸内毒素症が認知機能に与える影響が十分に研究されている疾患の一例が肝性脳症（認知症に至ることがある）であり、抗生物質の経口投与療法に多少の効果がある（非特許文献４）。従来のリスク因子を調節した多変量解析から、バクテロイデスの保有率が低く、その他の細菌の保有率が高いことが、独立的に認知症と強く関連することが明らかになった（非特許文献５）。２０１５年の症例報告に、グレード２の門脈大循環性脳症による、アルコールとＣ型肝炎（ＨＣＶ）ウイルスの両方に続発する非代償性肝硬変を有する５７歳男性について記載されたものがある。この患者は、一般的な便ドナーから糞便微生物移植（ＦＭＴ）を受け、血清アンモニア値の低下に加え、認知の改善も認められた（非特許文献６）。アルツハイマー病におけるＦＭＴの有効性は、２種類のアルツハイマー病マウスモデルで示されており、健康な若齢ドナーからの糞便移植後に空間記憶と認識記憶の改善が認められた（非特許文献７、８）。若齢の野生型のマイクロバイオームを（ＦＭＴによって）老齢の野生型マウスに移植すると、炎症老化、および加齢に伴う認知機能低下にも有益な影響があった（非特許文献９）。しかしながら、いずれの場合も、基礎となる機序についての記載やそれ以上の取り組みはなかった。
【0005】
認知症の診断において、既存の選択肢は限られている。認知症には特有の種類や原因が数多くあり、それぞれ症状は似ているがわずかに異なる。症状のみから認知症を診断することは難しく、こうした症状が進行してから、すなわち疾患のかなり後期になってからでないと可能でない。診断には脳機能イメージング技術が用いられることが多いが、現在の技術では、疾患の早期診断は不可能である。脳生検で診断できる認知症もあるものの、これはめったに推奨されない。現在、認知症の基準診断法は認知テストである。例えばミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）は、認知症の診断用として最も研究が進んだ最も一般的に使用されている認知テストである。とはいえ、認知テストも症状が進行してからでないと診断できない。
【0006】
認知症の薬物療法において、既存の介入の可能性は限られている。ドイツ神経学会のガイドライン（非特許文献１０）によると、２つの物質の使用が推奨されている。１つがアセチルコリンエステラーゼ阻害剤であり、軽度から中等度のアルツハイマー型認知症において、日常活動の遂行能力、認知機能の改善、全体的な医学的所見という点で有効であり、治療が推奨される。常に変更や修正が加えられているが、新たなアセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、従来の化合物よりも高い効果を示すことはほとんどない（非特許文献１１）。もう１つがメマンチンで、中等度から重度のアルツハイマー型認知症患者において、認知機能、日常生活機能、および全体的な臨床所見に有効である。軽度のアルツハイマー型認知症では、メマンチンの有効性は証明されていない。メマンチンは、軽度のアルツハイマー型認知症患者の治療には使用すべきではない。
【0007】
本発明の目的は、認知症疾患の診断および治療の新たな手法を提供することである。具体的には、本発明は、認知症疾患を診断する新たなマーカー、認知症疾患治療の新たな標的、および認知症の治療に適した新たな治療薬を提供することを目的とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｂｅｒｃｉｋ，Ｐ．，Ｄｅｎｏｕ，Ｅ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｗ．，Ｌｕ，Ｊ．，Ｊｕｒｙ，Ｊ．，Ｄｅｎｇ，Ｙ．，Ｂｌｅｎｎｅｒｈａｓｓｅｔｔ，Ｐ．，Ｍａｃｒｉ，Ｊ．，ＭｃＣｏｙ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｆｆｅｃｔ ｃｅｎｔｒａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４１，５９９－６０９，６０９ ｅ５９１－５９３
【非特許文献2】Ｃａｓｐａｎｉ，Ｇ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｓ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｗａｎｎ，Ｊ．（２０１９）．Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ ６，４５４－４８１
【非特許文献3】Ｄａｍ，Ｓ．Ａ．，Ｍｏｓｔｅｒｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｚｏｐｉｎｓｋａ－Ｔｏｋｏｖ，Ｊ．Ｗ．，Ｂｌｏｅｍｅｎｄａａｌ，Ｍ．，Ａｍａｔｏ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｒｉａｓ－Ｖａｓｑｕｅｚ，Ａ．（２０１９）．Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｕｔ－Ｂｒａｉｎ Ａｘｉｓ ｉｎ Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ－Ｄｅｆｉｃｉｔ／Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４８，４０７－４３１
【非特許文献4】Ａｈｌｕｗａｌｉａ，Ｖ．，Ｂｅｔｒａｐａｌｌｙ，Ｎ．Ｓ．，Ｈｙｌｅｍｏｎ，Ｐ．Ｂ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ｂ．，Ｇｉｌｌｅｖｅｔ，Ｐ．Ｍ．，Ｕｎｓｅｒ，Ａ．Ｂ．，Ｆａｇａｎ，Ａ．，Ｄａｉｔａ，Ｋ．，Ｈｅｕｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｇｕｔ－Ｌｉｖｅｒ－Ｂｒａｉｎ Ａｘｉｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６，２６８００
【非特許文献5】Ｓａｊｉ，Ｎ．，Ｎｉｉｄａ，Ｓ．，Ｍｕｒｏｔａｎｉ，Ｋ．，Ｈｉｓａｄａ，Ｔ．，Ｔｓｕｄｕｋｉ，Ｔ．，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．，Ｔｏｂａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｓａｋｕｒａｉ，Ｔ．（２０１９）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ａｎｄ ｄｅｍｅｎｔｉａ：ａ ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｉｎ Ｊａｐａｎ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９，１００８
【非特許文献6】Ｓｈｅｎ，Ｔ．Ｃ．，Ａｌｂｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｂｉｔｔｉｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｃｈｅｈｏｕｄ，Ｃ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｙ．，Ｊｕｄｇｅ，Ｃ．Ａ．，Ｃｈａｕ，Ｌ．，Ｎｉ，Ｊ．，Ｓｈｅｎｇ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２５，２８４１－２８５０
【非特許文献7】Ｓｕｎ，Ｊ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｌｉｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｇｏｎｇ，Ｔ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．，Ｙｅ，Ｓ．，Ｙｅ，Ｋ．，Ｗｅｉ，Ｄ．，Ｓｏｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｌｌｅｖｉａｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ－ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ＡＰＰ／ＰＳ１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｔｒａｎｓｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ９，１８９
【非特許文献8】Ｅｌａｎｇｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９（予稿）
【非特許文献9】Ｍ．ＢＯＥＨＭＥ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍ Ｎｏ．６７６．０１．２０１９ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｌａｎｎｅｒ．Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ：Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９年オンライン
【非特許文献10】ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｇｎ．ｏｒｇ／ｌｅｉｔｌｉｎｉｅｎ
【非特許文献11】Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法、認知症の治療薬候補をスクリーニングする方法、認知症を発症するまたは有する被験者を治療する方法、認知症の治療に適している患者群を同定する方法、および認知症の治療の進捗を監視し、任意で認知症の予後を推測する方法を目的とする。本発明は、認知症の治療薬も目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
一態様では、本発明は、以下を含む、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法を目的とする：被験者から試料を入手すること；試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；測定した濃度に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること。試料は、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料のうちの１つから選択できる。被験者はヒトであり得る。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０１０μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、被験者が認知症を発症するまたは有することが示され得る。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体は、５－アミノ吉草酸またはＮε－トリメチルリシンのうちの１つから選択できる。５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０１０μＭ／ｇ尿中クレアチニン、またはＮε－トリメチルリシンの濃度が４～８μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、被験者が認知症を発症するまたは有することが示され得る。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物は、グルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンのうちの１つから選択できる。グルタル酸の濃度が６～２４μＭ／ｇ尿中クレアチニン、血清中濃度が１０～２０μＭ、脳脊髄液濃度が１０～４０ｍＭ、または５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンの濃度が１．４～２μＭ／ｇ尿中クレアチニンおよび血清中濃度が０．１～０．３μＭである場合、被験者が認知症を発症するまたは有することが示され得る。濃度は、内部標準物質との比較、または代謝物標準物質との外部比較によって決定できる。濃度は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはイムノアッセイのいずれかの方法を用いて決定できる。被験者が認知症を発症するまたは有する確率を測定することは、対照データ、具体的には、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人の健常者の対照データと濃度を比較することを含み得る。認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択され得る。濃度は、センサーまたは画像関連手法を用いて生体内で測定できる。
【0011】
さらなる態様では、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法は、第１の時点で被験者から第１の試料を入手すること；第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；第２の時点で被験者から第２の試料を入手すること；第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；試料で測定した濃度の比較に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することを含む。１つまたは複数の試料は、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、唾液試料、尿試料、または便試料のうちの１つから選択できる。被験者はヒトであり得る。第１の時点と第２の時点は約３～６カ月間隔てることができる。第２の時点は第１の時点の１２～２４週間後であり得る。第２の時点は第１の時点の３～６カ月後であり得る。方法は、さらに、第３の時点で被験者から第３の試料を入手すること；第３の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；試料で測定した濃度の比較に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することを含み得る。第２の時点と第３の時点は約６～１２カ月間隔てることができる。方法は、さらなる試料をさらなる時点で入手することを含み、被験者が認知症を発症するまたは有する確率は、試料で測定した濃度の比較に基づく。認知症は、加齢に伴う認知症または加齢に伴わない認知症であり得る。認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択され得る。濃度は、センサーまたは画像関連手法を用いて生体内で測定できる。
【0012】
さらなる態様では、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法は、被験者から試料を入手すること；試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ（Ｃｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｖｒｙｅｎｓｉ）、およびファーミキューテスのいずれかの存在量を決定すること；測定した存在量に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することを含む。試料は、微生物試料、腸内細菌叢試料、腸試料、糞便試料、および／または便試料のうち１つまたは複数から選択できる。被験者はヒトであり得る。コリネバクテリウムは、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ジェイケイウム、コリネバクテリウム・ウレアリティクム、およびコリネバクテリウム・エフィシエンスのうち１つまたは複数から選択できる。オシリバクターは、オシリバクター・バレリシゲネス（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ ｖａｌｅｒｉｃｉｇｅｎｅｓ）およびオシリバクター属ＫＬＥ１７４５株から選択できる。試料中の微生物叢の構成を決定し得る。腸メタゲノムを決定し得る。方法は、被験者の試料の細菌の存在量または微生物叢の構成または腸メタゲノムを対照と比較することを含み得る。対照は、１人または複数人の健常者のデータに基づき得る。対照は、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人の健常者から決定し得る。方法は、試料中のファーミキューテスとバクテロイデスの比率を決定すること、およびこの比率と対照中のファーミキューテスとバクテロイデスの比率とを比較することを含み得る。ファーミキューテス／バクテロイデス（Ｆ／Ｂ）の比率が１より高い場合、被験者が認知症を発症するまたは有する確率が高いことが示される可能性がある。特に、Ｆ／Ｂの比率が１．１、１．２、１．３、１．４、または１．５より高い場合、被験者が認知症を発症するまたは有する確率が高いことが示される可能性がある。比率の向上が経時的に検出される場合があり、これは被験者が認知症を発症するまたは有することを示す可能性がある。試料は、配列に基づく技術、ジェノタイピングアッセイ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長のクローンライブラリー、ＤＧＧＥ、Ｔ－ＲＦＬＰ、ＡＲＩＳＡ、マイクロアレイ、ＤＮＡハイブリダイゼーション法のいずれかの方法を用いて解析できる。細菌の存在量は、懸濁液培養またはプレート培養、染色法、顕微鏡観察法、ＦＡＣＳなどのフローサイトメトリー法、光学密度測定法のうち少なくとも１つを含む細胞培養アッセイを用いて測定できる。認知症は、加齢に伴う認知症または加齢に伴わない認知症であり得る。認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択され得る。
【0013】
さらなる態様では、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法は、試料中のパルブアルブミン（ＰＶ）陽性介在ニューロンを同定すること；試料中の自発性抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）の頻度を測定すること；測定した頻度に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することを含む。試料は、脳、急性脳スライス、培養脳組織、ニューロンの培養物、またはＰＶ陽性介在ニューロンの培養物から選択できる。被験者はヒトであり得る。自発性ＩＰＳＣは、電気生理学的方法および／またはカルシウムイメージングを用いて測定できる。方法は、例えば脳波記録（ＥＥＧ）および脳磁図（ＭＥＧ）によって、ＰＶ陽性ＧＡＢＡニューロンの振動を検出することも含み得る。
【0014】
別の態様では、本発明は、薬剤候補をスクリーニングする方法を目的とし、方法は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のうち１つまたは複数を含む試料を提供すること；試料を試験薬に曝露すること；試料に対する試験薬の効果を測定すること；試料に対する試験薬の効果に基づいて、試験薬の薬剤候補としての適格性を決定することを含む。
【0015】
別の態様では、本発明は、認知症を発症するまたは有する被験者を治療する方法を目的とし、方法は、被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を低下させる薬剤または薬剤の組み合わせを被験者に投与することを含む。１つまたは複数の薬剤は、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を低下させることができる。１つまたは複数の薬剤は、個別に、または組み合わせで投与できる、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｓｎ２＋、Ｚｎ２＋などの酵素５－アミノペンタンアミダーゼの阻害剤であり得る。加えて、または別法として、１つまたは複数の薬剤は、個別に、または組み合わせで投与される、１，５－ペンタンジアミン、リン酸２－エチルヘキシルジフェニル、６－アミノヘキサン酸、アクリジンオレンジ、ＤＬ－α－ジフルオロメチルオルニチン、ヒドロキシルアミン、ヨードアセトアミド、セミカルバジド、リン酸トリス（２－クロロ－１－（クロロメチル）エチル）、リン酸トリス（２－クロロエチル）、リン酸トリ－ｍ－クレジル、リン酸トリフェニル、リン酸トリス（２－クロロイソプロピル）、および尿素などのＬ－リシンカルボキシリアーゼの阻害剤であり得る。加えて、または別法として、１つまたは複数の薬剤は、個別に、または組み合わせで投与される、２，２’－ジピリジル、２－オキソグルタル酸、クエン酸塩、グルタル酸塩、オキサロ酢酸塩、およびコハク酸塩などのリシン２－モノオキシゲナーゼの阻害剤であり得る。
【0016】
別の態様では、本発明は、認知症を発症するまたは有する被験者を治療する方法を目的とし、方法は、腸内細菌叢中のコリネバクテリウム門、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの細菌を減少させる、または根絶する薬剤を被験者に投与することを含む。薬剤は、上述の細菌の存在量に直接的または間接的に影響を与える抗菌剤、ワクチン、もしくは局所プロバイオティック介入、または別の細菌を含み得る。薬剤は、特に、腸内細菌叢中のファーミキューテス／バクテロイデスの比率を低下させるよう構成されていてよい。
【0017】
別の態様では、本発明は、認知症の治療に適している患者群を同定する方法を目的とし、方法は、被験者から試料を入手すること；試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；測定した濃度に基づいて被験者が治療に応答する確率を決定することを含む。治療は、被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を低下させる薬剤を被験者に投与することを含み得る。
【0018】
別の態様では、本発明は、認知症の治療に適している患者群を同定する方法を目的とし、方法は、被験者から試料を入手すること；試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの存在量を決定すること；測定した存在量に基づいて被験者が治療に応答する確率を決定することを含む。方法は、試料中のファーミキューテスとバクテロイデスの比率を決定すること、およびこの比率と対照中のファーミキューテスとバクテロイデスの比率とを比較することを含み得る。方法は、試料中のファーミキューテスとバクテロイデスの比率を決定すること、およびこの比率と対照中のファーミキューテスとバクテロイデスの比率とを比較することを含み得る。ファーミキューテス／バクテロイデスの比率が１より高い場合、被験者が認知症を発症するまたは有する確率が高いことが示される可能性がある。特に、Ｆ／Ｂの比率が１．１、１．２、１．３、１．４、または１．５より高い場合、被験者が認知症を発症するまたは有する確率が高いことが示される可能性がある。比率の向上が経時的に検出される場合があり、これは被験者が認知症を発症するまたは有することを示す可能性がある。治療は、腸内細菌叢中のコリネバクテリウム門、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの細菌を減少させる、または根絶する薬剤を被験者に投与することを含み得る。薬剤は、特に、腸内細菌叢中のファーミキューテス／バクテロイデスの比率を低下させるよう構成されていてよい。
【0019】
別の態様では、本発明は、被験者から試料を入手すること、試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定すること、ならびに測定した濃度に基づいて治療の進捗を決定することを含む、認知症の治療の進捗を監視し、任意で予後を推測する方法を目的とする。
【0020】
別の態様では、本発明は、第１の時点で被験者から第１の試料を入手すること、第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること、第２の時点で被験者から第２の試料を入手すること、第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること、前に測定した濃度の比較に基づいて治療の進捗を決定することを含む、認知症の治療の進捗を監視する方法を目的とする。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】若齢マウス（２カ月齢）と比較した、老齢マウス（２０～２４カ月齢）の空間作業記憶（Ｔ迷路試験）の低下を示すグラフである。点は個々のマウスの数を表す。データは平均±ＳＥＭとして表される；＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定。
【図2】若齢マウス（２カ月齢）と比較した、老齢マウス（２０～２４カ月齢）の認識記憶（新奇物体認識（ＮＯＲ）試験）の低下を示すグラフである。点は個々のマウスの数を表す。データは平均±ＳＥＭとして表される；＊＊Ｐ＜０．０１、ｔ検定。
【図3】若齢マウス（２カ月齢）から老齢マウス（２０～２４カ月齢）への糞便微生物移植（ＦＭＴ）後に、老齢マウスの低下した空間作業記憶（Ｔ迷路試験）が若齢マウスの水準に向上したことを示すグラフである。若齢マウスの空間作業記憶は老齢マウスからのＦＭＴ後に低下している。データは平均±ＳＥＭとして表される；＊Ｐ＜０．０５（各群のｎ＝５匹）、ｔ検定。
【図4】若齢マウス（２カ月齢）から老齢マウス（２０～２４カ月齢）への糞便微生物移植（ＦＭＴ）後に、老齢マウスの低下した認識記憶（ＮＯＲ試験）が若齢マウスの水準に向上したことを示すグラフである。若齢マウスの認識記憶は老齢マウスからのＦＭＴ後に低下している。データは平均±ＳＥＭとして表される；＊Ｐ＜０．０５（各群のｎ＝７匹）、ｔ検定、ｎｓ＝有意差なし。
【図5】ノンターゲットメタボロミクスの結果を示す。（ａ）若齢マウス（２カ月齢）と老齢（２０～２４カ月齢）マウスの血清および海馬組織のノンターゲットメタボロミクスの結果を示す表である。数字は倍数変化を示す。グレーのスケールは統計的有意性を表す。（ｂ）ノンターゲットメタボロミクスの結果を示し、血清および脳組織中の年齢によって調節される代謝物のレベルを示す図である。交差代謝物のＺスコア（ｎ＝４）。若齢ドナー（５，５）、老齢ドナー（６，５）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（６，５）、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ（６，５）、ｎは血清および脳それぞれについて。対応のあるウェルチの２標本ｔ検定を用いた統計解析（代謝物はａｂｓＦＣ＞１で別個に調節されたと見なされた、ｐ＜０．１）。データは独立した３つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。一元配置分散分析による統計解析。（ｃ）ノンターゲットメタボロミクスの結果を示し、血清および脳組織中の年齢によって調節される代謝物のレベルを示す図である。交差代謝物のＺスコア（ｎ＝４）。若齢ドナー（５，５）、老齢ドナー（６，５）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（６，５）、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ（６，５）、ｎは血清および脳それぞれについて。対応のあるウェルチの２標本ｔ検定を用いた統計解析（代謝物はａｂｓＦＣ＞１で別個に調節されたと見なされた、ｐ＜０．１）。データは独立した３つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。一元配置分散分析による統計解析。
【図6】（ａ）質量分析法で解析した、若齢マウスと比較して、老齢マウスの血清および海馬脳組織で上昇しているＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸（慣用名）の構造を示す図である。ＩＵＰＡＣ名：５－（トリメチルアンモニオ）－ペンタノアート；またはδ－バレロベタイン。分子式はＣ８Ｈ１７ＮＯ２、平均質量は１５９．２２６Ｄａである。（ｂ）ＬＣ－ＭＳによる、老齢（９６～１０４週齢）ＳＰＦおよびＧＦマウス（ｎ＝５）の糞便ペレットにおけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の定量化のグラフである。エラーバーはＳＥＭを表す（９５％信頼区間）。マン・ホイットニーのＵ検定による統計解析。（ｃ）ＬＣ－ＭＳによる、若齢（８週齢）および老齢（９６～１０４週齢）ＳＰＦおよびＧＦマウス（若齢ｎ＝５、老齢ｎ＝８）の前頭皮質におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の定量化のグラフである。エラーバーはＳＥＭを表す（９５％信頼区間）。二元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析。（ｄ）ＴｗｉｎｓＵＫデータバンクの加齢コホート（検出可能な場合）の血清／血漿についてノンターゲットメタボロミクスによって定量化したＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のドットプロット、Ｓｈｉｎら（ｎ＝３６４８）のデータを描写。ピアソンの積率相関係数による統計解析。（ｅ）ＴｗｉｎｓＵＫデータバンクの加齢コホート（検出可能な場合）の血清／血漿についてノンターゲットメタボロミクスによって定量化したＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のドットプロット、Ｌｏｎｇら（ｎ＝６１９４）のデータを描写。ピアソンの積率相関係数による統計解析。
【図7】（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ電気生理学的記録を用いた、シナプス伝達に対するＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の影響を示す図。急性マウス海馬スライスのパルブアルブミン陽性介在ニューロンに対するＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の影響を示す（最初の一連の記録のデータを描写、マウス３匹からの３つの切片で記録し、バーとバーの間の線は個々のマウスのデータを表す；実験は独立して２回実行し、マウス５匹からの計８つの切片で記録し、両方の実験で同様の結果が示された；データは平均±ＳＥＭとして表される）。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のバス投与により、パルブアルブミン陽性介在ニューロンにおける自発性ＩＰＳＣ（ｓｐＩＰＳＣ）の発現頻度の増加が誘発される。これは、介在ニューロンシナプスにおけるＧＡＢＡの放出確率が高いことを示唆している。（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ電気生理学的記録を用いた、シナプス伝達に対するＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の影響を示す図。制御条件下（黒）およびＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸１０μＭを用いたプレインキュベーション後（グレー）の前頭前野錐体細胞の自発性興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ、左）および自発性抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ、右）の例。データは急性脳スライスのパッチクランプ記録から得たものである。（ｃ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ電気生理学的記録を用いた、シナプス伝達に対するＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の影響を示す図。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸によって自発性ＩＰＳＣの頻度は増加したが（ｐ＝０．００６、対応のないｔ検定）、振幅は増加しなかった（ｐ＝０．１７４、対応のないｔ検定）一方で、ＥＰＳＣ特性は不変であった（頻度ではｐ＝０．０８９、振幅ではｐ＝０．６４１）。ｎは対照が１０、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸処理ニューロンが９。
【図8】ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の全身投与（腹腔内）後に、ｍＰＦＣの前辺縁皮質または下辺縁皮質からのｉｎ ｖｉｖｏ記録でスパイク－スパイクの同期が促進されたことを示すグラフである（ｎ＝９匹）。データは平均±ＳＥＭとして表される；＊＊Ｐ＜０．０１、ｔ検定。
【図9】（ａ）δ－バレロベタインがｉｎ ｖｉｖｏで集団活動に及ぼす影響を評価するために、自然睡眠中の内側前頭前野から行った単一ユニット記録（ｎ＝４匹）を示す図である。ベースラインデータを得た後、マウスにＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸（５ｍｇ／ｋｇ体重、ｎ＝４匹、ｎ＝５６ユニット）またはＰＢＳのみ（ｎ＝４匹、７９ユニット）を投与した。投与後４５分間記録を続けた。トレースの例は、１回の記録セッションにおける全ユニットの合計集団発火率の短いセグメント（黒、ビン幅１００ミリ秒、方法参照）、およびδ－バレロベタイン投与前（左）と投与後（右）の１つのニューロンのビニングしたスパイク率（下）を示している。ユニットから、δ－バレロベタイン投与により集団活動への結合が増加し、前頭前野ネットワークにおける同期が促進されたことがわかることに留意されたい。（ｂ）全ニューロンのスパイク率と集団結合を定量化した図である。平均スパイク頻度に対するＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の影響は認められないが、記録された細胞の集団結合の有意な増加（対照：４匹のマウスでｎ＝７９ユニット、δ－バレロベタイン：４匹でｎ＝５６ユニット、ｐ＝０．００１７、ウェルチの検定）が見られた。データはベースライン値に対して正規化されており、黒線は分布の平均値を示す。
【図10】（ａ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の急性投与が、加齢に伴う記憶障害を再現し、若齢マウスの微生物移植による救援を減弱させることを示す、実験設定の概略図である。ＳＰＦ条件下で飼育した８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスに、行動パラダイムを開始する１時間前にＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。（ｂ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の急性投与が、加齢に伴う記憶障害を再現し、若齢マウスの微生物移植による救援を減弱させることを示す、Ｔ迷路の結果を示すグラフである（ビークル、δ－バレロベタインでｎ＝１０）。データは独立した２つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。マン・ホイットニーのＵ検定による統計解析（＊＊ｐ＜０．０１）。（ｃ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の急性投与が、加齢に伴う記憶障害を再現し、若齢マウスの微生物移植による救援を減弱させることを示す、新奇物体認識試験（ＮＯＲ）の習熟の結果を示すグラフである（ビークル、δ－バレロベタインでｎ＝１０）。データは独立した２つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。マン・ホイットニーのＵ検定による統計解析（ｎｓ＝有意差なし）。（ｄ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の急性投与が、加齢に伴う記憶障害を再現し、若齢マウスの微生物移植による救援を減弱させることを示す、新奇物体認識試験（ＮＯＲ）の習熟から６時間後の試験セッションの結果を示すグラフである（ビークル、δ－バレロベタインでｎ＝１０）。データは独立した２つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。マン・ホイットニーのＵ検定による統計解析（＊＊ｐ＜０．０１）。（ｅ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の急性投与が、加齢に伴う記憶障害を再現し、若齢マウスの微生物移植による救援を減弱させることを示す、実験設定の概略図である。ＳＰＦ条件下で飼育した１５～１６カ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスに、抗生物質を４日間強制経口投与して腸内微生物叢を枯渇させた。次いで、７２時間の間隔を空けてマウスに２回の糞便微生物移植を行い、４０日目に行動試験を実施した。行動パラダイムを開始する１時間前にＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸（５ｍｇ／ｋｇ）を各群に腹腔内投与した。（ｆ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の急性投与が、加齢に伴う記憶障害を再現し、若齢マウスの微生物移植による救援を減弱させることを示す、Ｔ迷路の結果を示すグラフである（若齢ドナー（ビークル）、老齢ドナー（ビークル）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ビークル）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸）、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ（ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸）；ｎ＝６）。データは独立した２つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。一元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし）。（ｇ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の急性投与が、加齢に伴う記憶障害を再現し、若齢マウスの微生物移植による救援を減弱させることを示す、新奇物体認識試験（ＮＯＲ）の習熟の結果を示すグラフである（若齢ドナー（ビークル）、老齢ドナー（ビークル）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ビークル）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸）、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ（ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸）；ｎ＝６）。データは独立した２つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。一元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析（ｎｓ＝有意差なし）。（ｈ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の急性投与が、加齢に伴う記憶障害を再現し、若齢マウスの微生物移植による救援を減弱させることを示す、新奇物体認識試験（ＮＯＲ）の習熟から６時間後の試験セッションの結果を示すグラフである（若齢ドナー（ビークル）、老齢ドナー（ビークル）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ビークル）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸）、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ（ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸）；ｎ＝６）。データは独立した２つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。一元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし）。
【図11】マウスへのＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の全身投与（腹腔内）が学習と記憶に及ぼす影響を示す図である。左図は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が、若齢マウス（２カ月齢）と老齢マウス（２０～２４カ月齢）の空間作業記憶（Ｔ迷路試験）に及ぼす影響を示す。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸をマウスに全身投与すると、若齢マウス（２カ月齢）の空間作業記憶（Ｔ迷路試験）が老齢マウス（２０～２４カ月齢）のレベルに低下した。若齢のマウスと比較して学習と記憶が低下していた老齢マウスでは、同じ処理でさらなる低下は認められなかった。点は個々のマウスの数を表す。データは平均±ＳＥＭとして表される；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；ｔ検定、ｎｓ＝有意差なし。右図は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が、若齢マウス（２カ月齢）と老齢マウス（２０～２４カ月齢）の認識記憶（新奇物体認識試験）に及ぼす影響を示す。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸をマウスに全身投与すると、若齢マウス（２カ月齢）の認識記憶（新奇物体認識試験）が老齢マウス（２０～２４カ月齢）のレベルに低下した。若齢のマウスと比較して学習と記憶が低下していた老齢マウスでは、同じ処理でさらなる低下は認められなかった。点は個々のマウスの数を表す。データは平均±ＳＥＭとして表される；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；ｔ検定、ｎｓ＝有意差なし。
【図12】Ｌ－リシンの分解に関与する酵素を示す図である。
【図13】Ｌ－リシンの分解を示す図である。
【図14】（ａ）若齢マウスから老齢マウスへの腸移植が記憶機能に与える影響を示す、実験設定の概略図である。ＳＰＦ条件下で飼育した１５～１６カ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスに、抗生物質を４日間強制経口投与して腸内微生物叢を枯渇させた。次いで、７２時間の間隔を空けてマウスに２回の糞便微生物移植を行い、４０日目に行動試験を実施した。（ｂ）若齢マウスから老齢マウスへの腸移植が記憶機能に与える影響を示す、Ｔ迷路の結果を示すグラフである（若齢ドナー、老齢ドナー、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ；それぞれｎ＝１３、１５、１６、１４）。データは独立した２つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。一元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし）。（ｃ）若齢マウスから老齢マウスへの腸移植が記憶機能に与える影響を示す、新奇物体認識試験（ＮＯＲ）の習熟の結果を示すグラフである（若齢ドナー、老齢ドナー、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ；それぞれｎ＝１３、１５、１６、１４）。データは独立した２つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。一元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析（ｎｓ＝有意差なし）。（ｄ）若齢マウスから老齢マウスへの腸移植が記憶機能に与える影響を示す、新奇物体認識試験（ＮＯＲ）の習熟から６時間後の試験セッションの結果を示すグラフである（若齢ドナー、老齢ドナー、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ；それぞれｎ＝１３、１５、１６、１４）。データは独立した２つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。一元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし）。（ｅ）若齢マウスから老齢マウスへの腸移植が記憶機能に与える影響を示す、抗生物質およびＰＬＸ５６２２処理の影響を示す図である。ＳＰＦおよびＡＢＸ処理マウスの糞便試料のＤＡＰＩ－ Ｓｙｔｏ９＋生細菌に関するゲーティング。フローサイトメトリーゲーティングの代表的なプロット。（ｆ）若齢マウスから老齢マウスへの腸移植が記憶機能に与える影響を示す、抗生物質およびＰＬＸ５６２２処理の影響を示すグラフである。グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の割合。エラーバーはＳＥＭを表す。マン・ホイットニーのＵ検定による統計解析（＊＊ｐ＜０．０１）。（ｇ）若齢マウスから老齢マウスへの腸移植が記憶機能に与える影響を示す、抗生物質およびＰＬＸ５６２２処理の影響を示すグラフである。糞便試料１ｍｇ当たりの生細菌の定量化。エラーバーはＳＥＭを表す。マン・ホイットニーのＵ検定による統計解析（＊＊ｐ＜０．０１）。
【図15】（ａ）ミクログリアがＦＭＴによる認知操作に影響を与えないことを示す、実験設定の概略図である。図１４の設定に加え、対照のＡＩＮ－７６Ａ標準飼料、またはミクログリアを含むｃｓｆ１依存性細胞を枯渇させるＰＬＸ５６２２（１２００ｍｇ／ｋｇ）を追加した飼料のいずれかをマウスに与えた。（ｂ）ミクログリアがＦＭＴによる認知操作に影響を与えないことを示す、Ｔ迷路の結果を示すグラフである（若齢ドナー（ＮＣ）、老齢ドナー（ＮＣ）、老齢ドナー（ＰＬＸ）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ＮＣ）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ＰＬＸ）、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ；それぞれｎ＝４、７、８、７、８、７）。データは独立した３つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。二元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析（＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし）。（ｃ）ミクログリアがＦＭＴによる認知操作に影響を与えないことを示す、新奇物体認識試験（ＮＯＲ）の習熟の結果を示すグラフである（若齢ドナー（ＮＣ）、老齢ドナー（ＮＣ）、老齢ドナー（ＰＬＸ）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ＮＣ）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ＰＬＸ）、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ；それぞれｎ＝４、７、８、７、８、７）。データは独立した３つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。二元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析（ｎｓ＝有意差なし）。（ｄ）ミクログリアがＦＭＴによる認知操作に影響を与えないことを示す、新奇物体認識試験（ＮＯＲ）の習熟から６時間後の試験セッションの結果を示すグラフである（若齢ドナー（ＮＣ）、老齢ドナー（ＮＣ）、老齢ドナー（ＰＬＸ）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ＮＣ）、老齢＋ＡＢＸ＋ｙＦＭＴ（ＰＬＸ）、老齢＋ＡＢＸ＋ｏＦＭＴ；それぞれｎ＝４、７、８、７、８、７）。データは独立した３つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを表す。二元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし）。（ｅ）ミクログリアがＦＭＴによる認知操作に影響を与えないことを示す、抗生物質およびＰＬＸ５６２２処理の影響を示す図である。行動試験後に屠殺したＰＬＸ５６２２処理マウスの皮質および海馬におけるＤＡＰＩ、Ｉｂａ－１＋（明るいドット）の代表的な免疫蛍光画像。スケールバー、１５０μｍ。上段：標準飼料、下段：ＰＬＸ５６２２。左カラム：皮質、右カラム：海馬。（ｆ）ミクログリアがＦＭＴによる認知操作に影響を与えないことを示す、抗生物質およびＰＬＸ５６２２処理の影響を示すグラフである。ＰＬＸ５６２２処理後の１つのＲＯＩとしての皮質および海馬におけるＩｂａ－１細胞密度の定量化。二元配置分散分析後にボンフェローニの事後検定による統計解析（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ｎｓ＝有意差なし）。
【発明を実施するための形態】
【0022】
以下に、本発明の方法および構成を説明するが、当然ながら、こうしたものは変化する可能性があるため、本発明は、説明する特定の方法または構成に限定されないものと理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の実施形態によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を説明することを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0023】
値の範囲を提示する場合、文脈が明らかに他に指示しない限り、その範囲の上限と下限の間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されると理解される。記載された範囲内の任意の記載値または介在値と、記載された範囲内の任意の他の記載値または介在値との間のより小さな範囲はそれぞれ本発明に包含される。記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して、その範囲に含まれることも除外されることもあり、より小さな範囲に、いずれかの限界もしくは両方の限界が含まれる場合、または両方の限界が含まれない場合、各範囲も本発明内に包含される。記載された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【0024】
別段に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用できるが、以下に、可能性のある好ましい方法および材料をいくつか記載する。本明細書で言及したすべての出版物は、その出版物の引用に関連する方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に援用される。本開示は、矛盾がある範囲において、援用された出版物のいかなる開示にも優先することが理解される。
【0025】
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書で説明し、図示する個々の実施形態はそれぞれ、本発明の範囲または精神から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離する、またはこれらと組み合わせることができる個別の構成要素および特徴を有する。列挙した方法はいずれも、列挙した事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施できる。
【0026】
本明細書および添付の実施形態で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他を指示しない限り、複数の指示物を含むことに留意する必要がある。したがって、例えば「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は、複数のそのような細胞を含む。
【0027】
本明細書で検討する出版物は、本願の出願日前のこれらの開示についてのみ提供される。本明細書のいかなる内容も、本発明が、先行発明に基づきかかる出版物に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるものではない。さらに、提示した出版物の日付は実際の出版物の日付と異なる場合があり、別途確認が必要となる可能性がある。
【0028】
認知症は、認知機能や行動能力の低下を伴い、多くの場合、年齢依存的である。認知症を研究するために、マウスモデルなどいくつかの動物モデルが確立されている。動物はヒトとは異なるものの、動物モデル、特にげっ歯類モデルから得られたデータはヒトに転用できるということが、この分野で広く合意されている。
【0029】
記憶を研究するために、さまざまな認知試験や行動試験が開発されている。例えば、Ｔ迷路試験は動物、特にげっ歯類の探索行動を測定するための行動試験である。Ｔ迷路試験は、動物が新しい環境を探索しようとすること、すなわち、迷路の見慣れたアームよりも新しいアームを好んで訪れることに基づいている。この課題には、海馬を含む脳の多くの部位が関与している。もう１つの典型的な試験は、認知、特に認識記憶を評価するために用いられる新奇物体認識（ＮＯＲ）課題である。この試験は、見慣れた物体よりも新しい物体を探索することに多くの時間を費やすという動物の自発的な傾向に基づいている。新しい物体を探索するという選択は、学習記憶や認識記憶の利用を反映している。
【0030】
図１および２は、それぞれＴ迷路試験と新奇物体認識試験における若齢マウス（２カ月齢）と老齢マウス（例えば２０～２４カ月齢）の能力の比較を示す。見てわかり得るように、加齢に伴って、マウスの記憶が有意に低下している。ヒトにおいても、多くの場合、記憶機能は年齢と相関する（Ｎｙｂｅｒｇら，２０１２）。
【0031】
近年、胃腸管と中枢神経系の間で生化学シグナリングが行われていることが示されている。最近のアルツハイマーマウスモデル研究では、若齢マウスから老齢マウスへの糞便微生物移植法（ＦＭＴ）によって、加齢に伴う認知機能低下に有益な効果が得られたことが示された（Ｍ．ＢＯＥＨＭＥら，Ｐｒｏｇｒａｍ Ｎｏ．６７６．０１．２０１９ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｌａｎｎｅｒ．イリノイ州シカゴ：Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９年オンライン）。ヒトにおいても、糞便微生物移植法（ＦＭＴ）が認知を改善し得ることが示されている（Ｓｈｅｎら，２０１５）。ＦＭＴとは、腸内微生物叢を調節するために、腸内毒素症が疑われる患者に健常者の糞便を移植することである。ＦＭＴ後の脳機能への影響を媒介する基本構造は、脳腸軸（ＧＢＡ）、すなわち内分泌、免疫、および神経メディエーターで構成された、腸と脳の間の非常に複雑な双方向ネットワークである（Ｒｈｅｅら，２００９）。ＧＢＡは、主に中枢神経系（ＣＮＳ）、腸管神経系（ＥＮＳ）、および腸内微生物叢によって媒介されている（Ｇｒｅｎｈａｍら，２０１１）。胃腸（ＧＩ）管の外来性神経は、迷走神経と脊髄の求心性線維を介して腸と脳を結び、脳は遠心性交感神経線維と副交感神経線維をＧＩ管に送っている（Ｇｒｅｎｈａｍら，２０１１）。
【0032】
図３および４は、若齢マウス（２カ月齢）から老齢マウス（例えば２０～２４カ月齢）への、およびその逆の腸移植が記憶機能に与える影響を、それぞれＴ迷路試験と新奇物体認識試験を用いて示す。若齢マウス（２カ月齢）から老齢マウス（２０～２４カ月齢）への腸内微生物叢の移植によって、Ｔ迷路試験と新奇物体認識試験における老齢マウス（２０～２４カ月齢）の記憶が改善した。反対に、老齢マウスから若齢マウスへの腸移植によって記憶機能は低下した。
【0033】
図１４も、若齢マウスから老齢マウスへの腸移植が記憶機能に与える影響を示している。学習と記憶への影響を調べるために、糞便微生物移植（ＦＭＴ）によって若齢マウス（８週齢）から老齢マウス（１５～１６カ月齢）に腸内微生物叢を移植した（図１４ａ）。ビークルを投与した老齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、若齢ドナーマウスと比較して、Ｔ迷路で空間作業記憶障害を（図１４ｂ）、新奇物体認識（ＮＯＲ）試験で認識記憶の低下を示した（図１４ｃ、ｄ）。特に、若齢マウスからのＦＭＴによって微生物移植を受けた老齢マウスでは認知障害が後退した。老齢ドナー（１５～１６カ月齢）から老齢レシピエントへの糞便移植では、行動変化は認められなかった（図１４ａ～ｄ）。ＦＭＴ用のマウスの腸は、抗生物質カクテル（ＡＢＸ）を投与して準備した。これにより、生細胞の割合は対照の７５％からＡＢＸ処理マウスの２％に効率的に低下した（図１４ｅ、ｆ）。同じ処理によって、フローサイトメトリーによる解析で、糞便細菌の数が１０３分の１に低下した（図１４ｇ）。
【0034】
図１５は、ミクログリアがＦＭＴによる認知操作に影響を与えないことを示している。以前の試験で我々は、ミクログリアは、その成熟と生理機能に影響を与える腸内微生物叢によって生成された代謝物に対する感受性が特に高いことを示した（Ｅｒｎｙ，Ｄ．ら）。同時にミクログリアは、シナプス結合性とシナプス可塑性を形成する学習によるシナプスのリモデリングによって、認知処理中に重要な役割を果たす（Ｂｌａｎｋ，Ｔ．ら；Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ，Ｃ．ら；Ｗｕ，Ｙ．ら）。この疑問に取り組むために、１日目からマウスを高効率の脳透過性ＣＳＦ１Ｒ阻害剤（ＰＬＸ５６２２）で処理し、大幅なミクログリア除去を行う以外は以前と同じ処置計画を実施した（Ｄａｇｈｅｒ，Ｎ．ら）（図１５ａ）。我々は、免疫組織化学的検査によってミクログリアの枯渇を検証し、ＰＬＸ５６２２で処理したマウスの脳組織にミクログリアがほぼ完全に存在しないことを確認した（図１５ｅ、ｆ）。ミクログリアが枯渇したマウス、老齢マウス、および若齢の微生物叢ドナーからＦＭＴを受けた老齢マウスの能力をそれぞれの対照マウスと比較すると、意外なことに、両方の行動パラダイムに変化がなかった（図１５ｂ～ｄ）。これらのデータは、ミクログリアがＦＭＴによる認知操作に関与していないことを示唆している。
【0035】
本発明の目的は、この作用の原因となる物質を同定すること、ならびに被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法、認知症の治療薬候補をスクリーニングする方法、認知症を発症するまたは有する被験者を治療する方法、および認知症の治療に適している患者群を同定する方法を提供することである。本明細書で説明するすべての方法は、治療の種類にかかわらず、認知症の治療の進捗を監視し、任意で認知症の予後を推測することも目的とする。
【0036】
上述の作用の原因である可能性のある物質を同定するために、集中的なメタボロミクス解析を実施した。ＦＭＴ後の行動変化を促す代謝物を同定するために、若齢マウス、老齢マウス、および若齢または老齢のドナーマウスからＦＭＴを受けた老齢マウスから採取した血清および脳組織試料でノンターゲットメタボロミクスを実施した。そのために、ノンターゲット質量分析法を用いて、若齢マウス（２カ月齢）と老齢マウス（例えば２４カ月齢）の血清と脳組織を解析した（図５ａ参照）。血清で６３５の代謝物が、脳で４６９の代謝物が検出され、そのうち、それぞれ１０６と１６７の代謝物が、年齢で特異的に調節されていた。年齢によって調節される全代謝物のうち、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベルが、特にＦＭＴドナーの年齢の影響を受けやすかった。トリメチルアミン－Ｎ－オキシド、ステアロイルカルニチン（Ｃ１８）、スタキドリン、およびＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が年齢依存性調節を示した。若齢ドナーマウスからのＦＭＴを受けた老齢マウスにおけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベルのみ、若齢マウスと同程度であることがわかった（図５ｂ～ｃ）。数多くの物質の中で、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が、若齢マウスと比較して老齢マウスの血清と脳で有意に上昇することが確認された。血清と脳組織で同様に上昇しているのは、末梢のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が脳に到達し、血液脳関門を通過できることを示している（図５参照）。
【0037】
以下に、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の作用をより詳細に説明する。しかしながら、これは限定を意図するものではない。同じく年齢依存性調節を示したトリメチルアミン－Ｎ－オキシド、ステアロイルカルニチン（Ｃ１８）、およびスタキドリンでも同じ作用が観察される可能性がある（図５参照）。
【0038】
図６ａは、質量分析法で解析した、若齢マウスと比較して、老齢マウスの血清および脳組織で上昇しているＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸（慣用名）の化学構造を示す。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のＩＵＰＡＣ名は、５－（トリメチルアンモニオ）ペンタノアートまたはδ－バレロベタインである。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の分子式はＣ８Ｈ１７ＮＯ２であり、平均質量は１５９．２２６Ｄａである。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のＣｈｅｍＳｐｉｄｅｒ ＩＤはＩＤ３４２３６８７８である。
【0039】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の化学構造（図６ａ）は、腸内細菌叢によって産生される、食物由来のＬ－カルニチンの代謝物であるγ－ブチロベタイン（γ－ＢＢ）と同様である（Ｋｏｅｔｈ，Ｒ．ら）。以前の研究では、腸内細菌叢が、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸を含むトリメチル化アミノ酸の産生に寄与することが示唆されている（Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ，Ｖら）。この発見を検証するために、特定の病原体を保有していない（ＳＰＦ）老齢マウス（主要な病原種が存在しない複雑な常在細菌叢を保有している）および無菌（ＧＦ）マウスの糞便を用いてターゲットメタボロミクスを実施した。我々のデータでは、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が、ＳＰＦマウスとは対照的にＧＦマウスで検出されなかったことから、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の主たる発生源が腸内微生物叢であることも示された（図６ｂ）。ＳＰＦマウスとＧＦマウスの脳組織の画像は似ており、老齢ＳＰＦマウスでは、若齢ＳＰＦマウスと比較してＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベルが高いことが示された（図６ｃ）。若齢および老齢ＧＦマウスの脳組織におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベルは有意に低下しており、検出限界に近かった（図６ｃ）。
【0040】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベルの上昇は、一般に、老齢ＳＰＦマウスの血液だけでなく、ＴｗｉｎｓＵＫコホートから得られるヒトの血液試料でも検出された。（図６ｄ、図６ｅ）。試験のうちの１つでは、ハイスループット代謝プロファイリングを用いたゲノムワイド関連スキャンを使用し、１４５の代謝遺伝子座、およびそれらと４００以上の代謝物との接続性において有意な関連が認められた（Ｓｈｉｎ，Ｓ．ら）。これらのヒト血液試料の代謝物を含むデータセットを、代謝物濃度と年齢の間の線形回帰分析で解析したところ、３６４８の試料で、２０～８０歳の間で年齢依存的に増加してＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が検出された（ｒ＝０．１４６４、Ｒ２＝０．０２１４２、Ｐ値＜０．００１）（図６ｄ）。第２の独立した解析では、３２～８７歳のヒトの血液メタボロームの経時的変化を調べたＬｏｎｇらの研究データを利用した。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は６１９４の試料で検出できた。データを線形回帰分析にかけたところ、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度と年齢の間に有意な相関関係が認められた（ｒ＝０．１４４２、Ｒ２＝０．０２０８０、Ｐ値＜０．００１）（図６ｅ）。マウスおよびヒトにおける年齢とＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸濃度との強い相関関係とあわせて、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベルと行動遂行能力における平行変化から、我々はＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が、加齢に伴う認知機能低下の重要な要因であると考えるに至った。
【0041】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が記憶障害において中心的な役割を果たしていることを実証するために、いくつかの実験を行った。実験について詳述する前に、海馬、ならびにシナプス伝達とスパイク－スパイク同期についてのみ簡単に説明する。
【0042】
海馬は、短期記憶から長期記憶への情報の固定や、ナビゲーションを可能にする空間記憶において重要な役割を担う脳領域である。海馬は、他の多くの脳領域と同様に、さまざまな種類のニューロンから構成されている。以下に、錐体細胞と興奮性シナプス伝達、ならびに介在ニューロンと抑制性シナプス伝達について簡単に説明する。
【0043】
錐体細胞は、海馬だけでなく、例えば大脳皮質や扁桃体にも見られ得る興奮性細胞である。錐体細胞の軸索は長く、広範囲に枝分かれしていることが多いため、長距離にわたって投射できる。錐体細胞の樹状突起は、細胞体の先端（尖端樹状突起）だけでなく、底部（基底樹状突起）からも伸びている。樹状突起上にある、樹状突起スパインと呼ばれる小さな突起は、ニューロンの興奮性入力の位置を表している。スパインは樹状突起の遠位領域に広範に存在し、近位領域や錐体細胞の細胞体には存在しない。錐体細胞の細胞体および軸索起始部は、シナプス後スパインを形成しないＧＡＢＡ性シナプスのみを受け取る。
【0044】
興奮性シナプス後受容体の活性化は、正に帯電したイオンがシナプス後細胞内に流入することで起こり、シナプス後膜を脱分極させる。シナプス後細胞は、興奮の時間的加重と空間的加重が活動電位の閾値に達すると発火し始める。したがって、興奮性シナプス伝達はシナプス後細胞が活動電位を発火させる確率を高める。グルタミン酸は中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であり、特定の代謝型およびイオンチャネル型グルタミン酸受容体を介して作用する。
【0045】
介在ニューロンは、わずかな例外を除き、錐体細胞の活動を調節する局所投射型の抑制性ニューロンである。一様な錐体細胞とは異なり、介在ニューロンは、神経支配や発火パターン、および分子発現プロファイルが大きく異なる種類の多様なニューロンを形成している。海馬では、介在ニューロンが放出する主な抑制性神経伝達物質はＧＡＢＡである。介在ニューロンの種類によって発火特性が異なり、異なるタイミングで錐体細胞の異なる細胞内ドメインにＧＡＢＡを放出すると推定されている（ＫｌａｕｓｂｅｒｇｅｒおよびＳｏｍｏｇｙｉ，２００８）。多くの場合、介在ニューロンは、カルシウム結合タンパク質（パルブアルブミン、カルレチニン、およびカルビンジン）、神経ペプチドＹ、一酸化窒素合成酵素、および血管作動性腸ペプチドなどの特異な神経化学物質の存在に基づいて分類される。介在ニューロンは、統合失調症、双極性障害、てんかん、自閉スペクトラム症、ハンチントン病などのいくつかの神経疾患や、記憶喪失とも関連している。
【0046】
成体の海馬における抑制性シナプス伝達は、主にγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を介し、リガンド依存性イオンチャネル型ＧＡＢＡＡ受容体およびＧタンパク質共役型ＧＡＢＡＢ受容体に作用する。抑制性シナプス伝達は、さまざまな機序、例えば膜電位の位相性と持続性の調節、およびに短絡抑制によって、興奮性の正味の流れを時空間的に制御している。シナプスでの抑制を位相性抑制と呼び、シナプス領域外での抑制を持続性抑制と呼ぶ。活動電位によるＧＡＢＡ放出は主にシナプスのＧＡＢＡ受容体に作用し、ニューロンの過剰興奮を防ぐ。ＧＡＢＡＡ受容体は、大部分のイオンチャネル型抑制性受容体と同様に、１つの天然イオン、つまり塩化物のみに対して透過性がある。塩化物イオンチャネルが開口すると、塩化物が膜を通過し、静止膜電位が塩化物の平衡電位（ＥＣｌ）（成熟ニューロンでは約－６５ｍＶ）まで達することが可能となる。抑制は膜電位にもＥＣｌにも大きく依存する。ＥＣｌが静止膜電位よりも負である場合、ＧＡＢＡＡ受容体が活性化すると、過分極性抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）が生じる。成熟ニューロンでは、ＥＣｌはほぼ静止膜電位に近い。この場合、抑制性シナプスの活性化は電気的短絡として機能し、正電荷がさらに流れるのを阻止する。このような抑制を短絡抑制と呼ぶ。
【0047】
成体哺乳類の神経系では、シナプス伝達は大部分が化学的で一方向性である。化学シナプスでは、到達した電気信号が化学信号に変換され、続いてこれがシナプス後ニューロンで電気信号を再び発生させることができる。電気信号は、シナプス前終末またはシナプスボタンという特殊なシナプス前構造に到達し、神経伝達物質を含むシナプス小胞を放出させる引き金となる。神経伝達物質はシナプス間隙に放出され、隣接するシナプス後膜に拡散する。シナプス後膜の受容体は、同種の神経伝達物質と結合することによって活性化され、イオンが膜を透過できるようになる。これによりシナプス後電気信号が生成される。
【0048】
シナプス前終末に存在するシナプス小胞は、電気信号が到達することによって、協調的に融合する。しかしながら、シナプス小胞は電気的活動と関わりなく確率的に融合することもある。ランダムに発生する融合イベント（すなわち、活動に依存しないイベント）によって生成されるシナプス後信号は、微小興奮性または抑制性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣまたはｍＩＰＳＣ）と呼ばれる。活動が存在する場合のシナプス後信号（すなわち、活動電位によるイベントを含む）は、自発性興奮性または抑制性シナプス後電流（ｓｐＥＰＳＣまたはｓｐＩＰＣＳ）と呼ばれる。微小および自発性ＥＰＳＣとＩＰＳＣは振幅に変動があり、これについてはさまざまな機序が提示されている。例えば、振幅の変動はシナプス小胞内の伝達物質量またはシナプス後受容体の数の変動を示している可能性がある。周波数の変化は、放出確率の変化、または放出部位の数の変化のいずれかを反映している。
【0049】
シナプス伝達のほかに、脳領域の活動を読み取るものにスパイク－スパイク同期がある。スパイク列の同期性の尺度（または逆にスパイク列の距離）は、２つの、または場合によってはそれ以上のスパイク列間の（非）類似性の推定量である。本明細書では、スパイク列はニューロン活動電位のシーケンスを指す。活動電位の形状も背景の活動も関連情報を伝えないと仮定すると、ニューロン反応はスパイク列に還元され、個々のスパイクのタイミングのみが情報として保持される。相補的な種類のアプローチには、ニューロン信号の同期性の尺度が含まれる。スパイク列間の同期性の程度を推定する尺度は、多くの用途で重要なツールとなる。特に、刺激を反復提示したときのニューロン反応の信頼性を定量化するために（ＭａｉｎｅｎおよびＳｅｊｎｏｗｓｋｉ，１９９５）、またはニューロンモデルの性能を試験するために使用できる（Ｊｏｌｉｖｅｔら，２００８）。同期スパイクは受信ニューロンのスパイク放出を引き起こすのに有効であり、同時記録に関する多くの研究において、行動と関連して発生することが示されている（Ｖａａｄｉａら，１９９５；Ｒｉｅｈｌｅら，１９９７；Ｈａｔｓｏｐｏｕｌｏｓら，１９９８；Ｊａｃｋｓｏｎら，２００３）。
【0050】
神経ネットワークにおけるスパイク活動は、情報伝達とそれに続く記憶を可能にする重要な過程である。ニューロンのスパイク発火の同期性は、もともと新皮質機能の基本的な特性として提示され、大脳皮質の多くの領域においてさまざまな条件下で観察されてきた（Ｖａａｄｉａ，Ｅ．ら；Ｃｏｕｒｔｉｎ，Ｊ．ら；Ｐｒｅｚｉｏｓｏ，Ｍ．ら；Ｄｅｊｅａｎ，Ｃ．ら）。我々は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸がニューロン発火挙動を妨げるか、またそれによって認知能力が低下するかという疑問を持った。この疑問に取り組むために、内側前頭前野（ｍＰＦＣ）のニューロンから電気生理学的記録を行った。この脳領域は、ニューロンによる位置と選択結果に関する情報のコード化に必要であり、これらはいずれもＴ迷路によって評価できる（Ｙａｎｇ，Ｙ．ら）。ＮＯＲ試験では、以前に遭遇した刺激に対する認識記憶のトレースを形成する必要があるが、これもｍＰＦＣの完全性に依存すると考えられている（Ｍｏｒｉｃｉ，Ｊ．Ｆ．ら）。
【0051】
図７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ電気生理学的記録を用いた、シナプス伝達に対するＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の影響を示す。
【0052】
図７ａは、急性マウス海馬スライスのパルブアルブミン陽性介在ニューロンに対するＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の影響を示す（最初の一連の記録のデータを描写、マウス３匹からの３つの切片で記録し、バーとバーの間の線は個々のマウスのデータを表す；実験は独立して２回実行し、マウス５匹から合計８つの切片で記録し、両方の実験で同様の結果が示された；データは平均±ＳＥＭとして表される）。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のいずれの投与でも、パルブアルブミン陽性介在ニューロンにおける自発性ＩＰＳＣ（ｓｐＩＰＳＣ）の発現頻度の増加が誘発される。ｓｐＩＰＳＣ頻度の増加は、学習および記憶にとって破壊的であり得る（ＢｕｚｓａｋｉおよびＤｒａｇｕｈｎ，２００４；Ｆｒｉｅｓ，２０１５）。
【0053】
図７ｂおよび図７ｃは、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）と抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）に与える影響を示す。下辺縁または前辺縁ｍＰＦＣに限局する２／３層の錐体細胞でホールセルパッチクランプ記録を実施した。最初のステップとして、２／３層の錐体細胞に作用する自発性抑制性シナプス後電流（自発性ＩＰＳＣ）と自発性興奮性シナプス後電流（自発性ＥＰＳＣ）の基本的な特性の評価を試みた。これらの実験の結果から、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は基本的な自発性ＥＰＳＣとＩＰＳＣの振幅に有意な影響を及ぼさなかったが、自発性イベントのＩＰＳＣ頻度を増加させたことが示された（図７ｃ）。自発性ＩＰＳＣの頻度の増加は、ＧＡＢＡ放出確率の上昇、放出部位の数の増加、またはシナプス前介在ニューロン活動の増大を示している可能性がある。
【0054】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸がシナプス伝達に影響を及ぼすという事実は、ｉｎ ｖｉｖｏ実験によってさらに証明される。図８は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の全身投与（腹腔内）後にスパイク－スパイク同期が促進されることを示している。これは内側前頭前野の前辺縁皮質または下辺縁皮質からのｉｎ ｖｉｖｏ記録によって観察された（ｎ＝マウス９匹、データは平均±ＳＥＭとして表される；＊＊Ｐ＜０．０１；ｔ検定）。スパイク同期は、スパイクの準同時出現の相対数から同期の程度を定量化する。スパイク列が一致を含まない場合にのみ０となり、すべてのスパイク列の各スパイクに、他のすべてのスパイク列に一致するスパイクが１つある場合にのみ１となる。スパイク－スパイク同期が促進されると、細かく調整された興奮と抑制のバランスが変化し、認知機能が低下する。認知には、脳全体にわたって脳の各領域間で効率的なニューロンの協調が必要というのが、この仮説の根拠である。このような協調の機序として、振動同期が提示されている。つまり、ニューロンの集団は、その振動活動を、特定の周波数で受容体集団の振動と協調させることによって情報を伝達する。さらに、周波数ごとに、より一般的には、振動パターンごとにそれぞれ異なる機能を担っている。同時に、特定の周波数帯におけるニューロン集団間の位相結合が、認知的内容の統合と流れを調節する機序として提示されている（ＢｕｚｓａｋｉおよびＤｒａｇｕｈｎ，２００４；Ｆｒｉｅｓ，２０１５）。
【0055】
シナプス伝達におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の中心的な役割は、内側前頭前野からのｉｎ ｖｉｖｏ単一ユニット記録によってさらに証明される。前頭前野（ＰＦＣ）は、前頭葉の前部を覆う大脳皮質である。この脳領域は、複雑な認知行動の計画、個性表現、意思決定、および社会的行動の調整に関与している。ＰＦＣが、前頭葉型認知症だけでなくアルツハイマー病、軽度の認知障害、および正常な老化にも関与しているという証拠が増えている。ＰＦＣの部位ごとにそれぞれ異なる種類の記憶や記憶機能障害に関連していると考えられよう（Ｍａｃｌｉｎら，２０１９；Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉら，２００９）。
【0056】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸がｍＰＦＣ機能に及ぼす影響をさらに調べるために、細胞（細胞外単一ユニット記録）と集団活動（局所フィールド電位）のｉｎ ｖｉｖｏ測定を用いた。集団結合は、個々のニューロンの活動が集団の残りの部分とどれだけ同期しているかを示す尺度で、学習や記憶に重要な影響を与えることが示されている（Ｏｋｕｎ，Ｍ．ら；Ｓｗｅｅｎｙ，Ｙ＆Ｃｌｏｐａｔｈ，Ｃ．）。
【0057】
図９は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸を全身投与すると集団結合が促進されることを示している。マウスにＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸を腹腔内投与すると、錐体ニューロンのスパイク発火率には変化がなかったが、集団結合には有意な増加が認められた。自然睡眠（ｎ＝４匹）中に内側前頭前野から単一ユニット記録を行った。ベースラインデータを得た後、マウスにＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸（５ｍｇ／ｋｇ体重、ｎ＝４匹、ｎ＝５６ユニット）または対照としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｎ＝４匹、ｎ＝７９ユニット）を投与した。投与後４５分間記録を続けた。図９ａの上部は、１回の記録セッションにおける全ユニットの集団発火率の短いセグメントの例（ビン幅１００ミリ秒）、下部は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の投与前（左側）と投与後（右側）の１つのニューロンのビニングしたスパイク率（下）を示す。前頭前野ネットワークで同期の促進が確認できる。図９ｂは全ニューロンのスパイク率と集団結合の定量化を示しており、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は平均スパイク発火率には影響を及ぼさないが、記録された細胞の集団結合を有意に増加させることがわかった（ｐ＝０．００１７、ウェルチのｔ検定、データはベースライン値に対して正規化されており、黒線は分布の平均値を示す）。集団結合が増加すると、ニューロンネットワークの正常な機能が阻害され、認知機能が損なわれる。したがってＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は、記憶障害に関与し、認知症の原因となり得る。
【0058】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が記憶機能に与える影響を、行動試験でさらに証明する。
【0059】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が認知能力を低下させるという我々の仮説を試験するために、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸を合成して若齢成体マウス（８週齢）に腹腔内投与し、１時間後に、以前に採用した行動パラダイムを実行させた（図１０ａ）。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸存在下のマウスは、ビークルを投与した対照と比較して、Ｔ迷路およびＮＯＲ試験において遂行能力が有意に低下した（図１０ｂ～ｄ）。若齢マウスからのＦＭＴ後に両方の行動パラダイムで遂行能力が向上した老齢マウスでも同様であった（図１０ｅ）。この場合、試験実施の１時間前にＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸を投与することによって、学習と記憶の向上が無効となった（図１０ｆ～ｈ）。老齢マウスの腸内微生物叢を移植された若齢マウスにこの化合物を投与した場合、さらなる低下は生じなかった（図１０ｆ～ｈ）。全体として、我々はＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が空間作業記憶と空間長期記憶に悪影響を及ぼすと結論付けた。
【0060】
図１１も、マウスへのＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の全身（腹腔内）投与が学習と記憶に及ぼす影響を示す。図１１の左側は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸をマウスに全身（腹腔内）投与すると、若齢マウス（２カ月齢）の空間作業記憶（Ｔ迷路試験）が老齢マウス（２０～２４カ月齢）のレベルに低下したことを示している。老齢マウスは、若齢のマウスと比較して学習および記憶の低下を示したが、同じ処理でさらなる低下は認められなかった（点は個々のマウスの数を表し、データは平均±ＳＥＭとして表される；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；ｔ検定、ｎｓ＝有意差なし）。対照としてＰＢＳを投与し、循環中に存在するマイナス因子の希釈が、認知機能の向上をもたらしている可能性を評価した。同様に、図１１の右側は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸をマウスに全身（腹腔内）投与すると、同じく若齢マウス（２カ月齢）の認識記憶（新奇物体認識試験）が老齢マウス（２０～２４カ月齢）のレベルに低下したことを示している。老齢マウスは、若齢のマウスと比較して学習および記憶の低下を示したが、同じ処理でさらなる低下は認められなかった（点は個々のマウスの数を表し、データは平均±ＳＥＭとして表される；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；ｔ検定、ｎｓ＝有意差なし）。対照としてＰＢＳを再び投与し、循環中に存在するマイナス因子の希釈が、認知機能の向上をもたらしている可能性を評価した。
【0061】
このように、行動試験も、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が若齢マウスの正常な脳機能を老齢マウスのレベルに混乱させる可能性があることを示している。
【0062】
このように、若齢マウスと比較すると、老齢マウスの血清および脳でＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸レベルの増加が認められる。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は抑制性シナプス伝達やネットワーク活動を調節するため、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸を健康な若齢動物に投与すると、認知障害を引き起こす。したがって、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は正常な脳機能と相関関係があり、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベル上昇は、記憶障害および／または認知症の存在もしくは発症を示している。
【0063】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、その前駆体および代謝物は、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断するマーカーとなる。
【0064】
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法は、被験者から試料を入手することを含み得、被験者はヒトであり得る。試料を入手することは、ヒトまたは動物の体で実施される任意のステップを含まない。むしろ、入手するとは、被験者から試料が提供されることを意味する。試料は、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、もしくは便試料、または他の任意の適切な試料のうち１つまたは複数であり得る。
【0065】
方法は、試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸および／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体および／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の絶対濃度を測定することを含み得る。絶対濃度を決定する標準的な方法に、内部標準との比較（液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）は、１３Ｃまたは１５Ｎで標識した標準と標識していない代謝物の強度差を測定することによって実施し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）では単一参照代謝物が使用されることが多い）、または濃度の領域で調製した代謝物標準との外部比較によるものの２つがある。マトリクス効果を考慮し、外部較正曲線は、好ましくは標準を試料に添加して作成する。標準と内在性の検体とで、抽出および取り扱い時の損失を等しくするために、標準は最終試料ではなく元の抽出溶媒に添加する必要がある。
【0066】
ＬＣ－ＭＳでは、各クロマトグラフィーの実行に要する時間が重要な制約となる。したがって、試料のスループットを向上させるダイレクトＭＳに大きな関心が集まっている。クロマトグラフィーを使用しない市販のシステムの一例に、ＡｇｉｌｅｎｔのＲａｐｉｄＦｉｒｅ装置がある。一般的なメタボロミクスＬＣ－ＭＳ法では分析時間が１試料当たり約３０分であるのに対し、１試料当たり１分未満という利点がある。抗体を用いた定量・定性分析法であるイムノアッセイ（例えば酵素免疫測定法／酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））も濃度を測定する選択肢のひとつである。
【0067】
方法は、測定した濃度に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することをさらに含み得る。このため、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸および／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体および／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度は、例えばターゲットメタボロミクス手法またはＥＬＩＳＡによって決定し得る。濃度は内部標準または代謝物標準と比較し得る。代謝物標準は、対照データセットの解析によって確立できる。したがって、濃度は健康な対照または認知症を有する対照と比較し得る。対照は、１人または複数人のデータに基づき得る。対照は、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人から決定し得る。認知症患者の対照データと濃度を比較することは、認知症の予後に有益である可能性がある。各患者の予測モデルは、主要なパラメータ（患者の年齢、性別、民族、および地理的位置、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸およびＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体（例えば５－アミノ吉草酸）濃度）を含む決定木に基づいて作成できる。多変量受信機動作特性（ＲＯＣ）解析を用いて、健康で認知的に正常な高齢者、認知障害（ＭＣＩ）を有する高齢者、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する高齢者を区別する診断力を判定するための決定木を作成することができる。
【0068】
一般的に、本明細書における任意の物質の濃度は、対照値と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、１００％、２００％、３００％、または１０００％（１０～１０００％の間のすべての割合を含む）増加した場合、増加したとみなされる。濃度増加によって、認知症を発症するまたは有する被験者を予測できる。濃度が高いほど、予測の信頼性が高い。
【0069】
尿試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度はクレアチニンレベルで正規化できる。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０１０μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、被験者が認知症を発症するまたは有することが示され得る。クレアチニンレベルは、性別および被験者固有のパラメータに応じて調整することもできる（例えばクレアチニンレベルの上昇または低下を考慮して）。
【0070】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体または代謝物の濃度も、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を示し得る。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体は、５－アミノ吉草酸またはＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）のうち１つまたは複数から選択できる。
【0071】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は、５－アミノ吉草酸のメチル化によってｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成できる。
５－アミノ吉草酸 ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸
Ｃ５Ｈ１０ＮＯ２＋３ＣＨ３ Ｃ８Ｈ１７ＮＯ２＋Ｈ２
【化1】
Ｃ５Ｈ１０ＮＯ２＋３ＣＨ３ Ｃ８Ｈ１７ＮＯ２＋Ｈ２
【0072】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸も、グリシンとＮε－トリメチルリシンとの反応によってｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成できる。
Ｎε－トリメチルリシン＋グリシン＋２Ｈ２Ｏ＋３ＡＤＰ＋３Ｐｉ
→ ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸＋酢酸＋ＣＯ２＋３ＮＨ３＋３ＡＴＰ
【化2】
→ ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸＋酢酸＋ＣＯ２＋３ＮＨ３＋３ＡＴＰ
【0073】
Ｎε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）は、Ｌ－リシンの分解とＬ－カルニチンの最終的な合成の間に産生される代謝物である。図１２からわかり得るように、生合成経路全体で、少なくとも５つの酵素、すなわち６－Ｎ－トリメチルリシンジオキシゲナーゼ（ＴＭＬＤ）、４－トリメチルアンモニオブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＴＭＡＢＡＤＨ）、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ１および２（ＳＨＭＴ１および２）、ならびにγ－ブチロベタインヒドロキシラーゼ（ＢＢＨ）が関与している。
【0074】
図１３からわかるように、５－アミノ吉草酸（または５－アミノペンタン酸）はリシン分解生成物である。これは細菌によるリシンの異化によって生成され得る。微生物におけるリシン異化は、モノオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、またはトランスアミナーゼのいずれかの活性によって開始され得る。ｌ－リシンの利用は、中間体としてカダベリンと５－アミノ吉草酸を用いるリジン脱カルボキシル経路によって仲介される可能性がある。別法として、ｌ－リシンの５－アミノ吉草酸への変換は、ＡｒｕＨおよびＡｒｕＩによって触媒される共役反応によって成されることもある。ＡｒｕＨおよびＡｒｕＩ酵素はアルギニンとして、すなわちそれぞれピルビン酸トランスアミナーゼおよび２－ケトアルギニンデカルボキシラーゼとして報告されている（ＹａｎｇおよびＬｕ，２００７）。
【0075】
５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンは５－ヒドロキシリシンの配糖体である。５－ヒドロキシリシンは分子式がＣ６Ｈ１４Ｎ２Ｏ３のアミノ酸である。これはリシンのヒドロキシ誘導体である。
【化3】
【0076】
認知症の症状を呈していない健常者における５－アミノ吉草酸の濃度は、２６２＋／－２５４ｎｍｏｌ／ｇ湿った糞便および０．１～２μｍｏｌ／ｍｍｏｌ尿中クレアチニンの範囲であり得る。健康な対照と比べて５－アミノ吉草酸の濃度が有意に高い、または低い場合、被験者が認知症を発症するまたは有することが示され得る。
【0077】
認知症の症状を呈していない健常者におけるＮε－トリメチルリシンの濃度は、脳脊髄液中で１．５＋／－２．０μＭおよび５．３（３．８～１０．４）μｍｏｌ／ｍｍｏｌ尿中クレアチニンの範囲であり得る。健康な対照と比べてＮε－トリメチルリシンの濃度が有意に高い、または低い場合、被験者が認知症を発症するまたは有することが示され得る。
【0078】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度も、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を示し得る。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物は、グルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンのうちの１つから選択できる。
【0079】
認知症の徴候を示していない健常者におけるグルタル酸の濃度は、血中で０．８（０．０～１．８）μＭ、脳脊髄液中で０～１μＭ、１８９＋／－１２５ｎｍｏｌ／ｇ湿った糞便、唾液中で０．５＋／－１．４μＭの範囲であり得る。認知症の徴候を示していない健常者における５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンの濃度は、２．５（１－５）ｕｍｏｌ／ｍｍｏｌ尿中クレアチニンの範囲であり得る。グルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンの濃度が有意に高い、または低い場合、被験者が認知症を発症するまたは有することが示され得る。
【0080】
認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、レビー小体型認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択され得る。
【0081】
濃度は、センサーまたは画像関連の方法を用いてｉｎ ｖｉｖｏでも測定できる。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸および／または前駆体および／または代謝物の継続的なモニタリングによって、認知障害管理が大幅に改善する可能性がある。最小限の侵襲で、血液中または脳脊髄液中または任意の他の適切な試料中の代謝物を検知する装置は、電気化学的な超小型検出プローブを、例えば単中空マイクロニードルの管腔に組み込んだものをベースとし、別途、例えば標準的なシリコン微細加工技術を用いて実現し得る。血管内腔または髄液につながる開口部に向けて管腔内に検出電極を設置することで、短距離の分子拡散を利用した純粋なリアルタイム計測が可能となる。さらにこの装置は、複雑な流体抽出機構を必要とせず、毛細血管内腔の受動的充満のみに依存する。センサー技術とマイクロニードルを組み合わせ、挿入および注入の信頼性を高めることで、経時的に、正確かつ動的にＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、その前駆体、またはその代謝物を動的に追跡する可能性が得られる。
【0082】
加えて、または別法として、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法は、第１の時点で被験者から第１の試料を入手すること；第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸および／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体および／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；第２の時点で被験者から第２の試料を入手すること；第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸および／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体および／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；試料で測定した濃度の比較に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することを含み得る。上述のとおり、１つまたは複数の試料は、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、唾液試料、尿試料、便試料、または他の任意の適切な試料のうちの１つから選択できる。被験者はヒトであり得る。
【0083】
さまざまな時点の濃度を比較すると、対照として健常者の参照データが不要になるという利点がある。基本的に、第１の時点がベースラインまたは対照値となり、被験者に特有のものであってよい。しかしながら、第１の試料および第２の試料（およびそれ以降の試料）の濃度は、さらに健常者の対照値と比較してよく、これにより予測の精度が向上する可能性がある。
【0084】
第１の時点と第２の時点は約３～６カ月間隔てることができる。第２の時点は第１の時点の１２～２４週間後であり得る。第２の時点は第１の時点の３～６カ月後であり得る。指定した時点に従うことで、一般的な傾向が見つかり、個人差を排除できる。オレイルエタノールアミド、メラトニン、およびドーパミンなど一部の生化学物質は概日リズムの影響を受けるため、試料を採取する時間帯が重要となる。試料を長期間保存し、短期間保存した試料と同時に分析する縦断的な研究では、アッセイ間の変動を最小にするために、凍結温度で試料が安定している期間を知ることが重要である。
【0085】
方法は、さらに、第３の時点で被験者から第３の試料を入手すること；第３の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸および／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体および／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；試料で測定した濃度の比較に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することをさらに含み得る。第２の時点と第３の時点は約６～１２カ月間隔てることができる。方法は、さらなる試料をさらなる時点で入手することを含み、被験者が認知症を発症するまたは有する確率は、試料で測定した濃度の比較に基づく。
【0086】
同じ状況（例えば食事状況が同じ、採取時点が同じなど）で採取した試料を評価すると、予測の精度にとって有益である可能性がある。これにより、自然に生じる各濃度の変動も低減される可能性がある。
【0087】
上述のとおり、認知症は、加齢に伴う認知症または加齢に伴わない認知症であり得る。認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、レビー小体型認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択され得る。上述のとおり、濃度は、センサーまたは画像関連の方法を用いてｉｎ ｖｉｖｏでも測定できる。
【0088】
加えて、または別法として、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法は、被験者の腸内細菌叢の解析を含み得る。
【0089】
腸内微生物叢には１０００種を超える細菌種が含まれ、これらは主に、ファーミキューテス、バクテロイデス、アクチノバクテリア、およびプロテオバクテリアの４つの門に分類される（Ｌｅｃｌｅｒｙ，Ｓ．ら．；Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｋ．Ａ．ら）。ヒトおよびマウスでは年齢とともに腸内微生物叢が変化することが多くの研究で示されており（Ｌａｎｇｉｌｌｅ Ｍ．Ｇ．ら、Ｂｉａｇｉ，Ｅ．ら）、これは、加齢に伴ってδＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度が上昇する理由の１つである可能性がある。特定の細菌分類または特定の細菌種の相対存在量（正または負の相関を意味する）は、老化過程における記憶障害および／または認知症の予後因子および／または徴候である可能性がある。
【0090】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸自体の濃度を決定する代わりに、その合成に関与している特定の腸内細菌の存在および／または存在量を決定することも可能である。例えばＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体である５－アミノ吉草酸は、コリネバクテリウムで見られ得る。さらに、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の生成につながるリシン分解は、ヒトの腸内細菌叢に常在する細菌であるコリネバクテリウム内で生じる。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸はリシンの分解中に生成される。ヒトの腸内で細菌を発酵させるその他のリシンは、大腸菌、肺炎桿菌、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジオイデス・ディフィシル、およびクロストリジウム・パーフリンジェンスである（Ｄａｉら，２０１１）。
【0091】
フェカリス菌および緑膿菌はトリメチルリシンをＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－５－アミノ吉草酸に代謝する（Ｚｈａｏ，Ｍ．ら）。Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－５－アミノ吉草酸とビフィドバクテリウムの間で強い正の相関が見られ、またＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－５－アミノ吉草酸と、クロストリジウム、デスルフォビブリオ、ムシスピリルム（Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、オドリバクター、およびリケネラのうちの未分類の属であるアリスティペスとの間に強い負の相関が認められた（Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ，Ｖ．Ｍ．ら）。
【0092】
ファーミキューテスの増加によって、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、その共代謝物トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－ｄｅｌ Ｃａｍｐ，Ａ．ら）、およびそれによりその前駆体ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸（Ｓｅｒｖｉｌｌｏ，Ｌ．ら）が増加する可能性がある。加齢に伴うファーミキューテス／バクテロイデス（Ｆ／Ｂ）比の増加は、代謝物の血液脳関門通過を促進させる上皮タイトジャンクションの低下とさらに関連している（Ｂｒａｎｉｓｔｅ，Ｖ．ら）。幼児期から高齢までの間にファーミキューテス門の相対存在量が増加したのに対し、バクテロイデスの相対存在量は減少した。男女ともに、Ｆ／Ｂ＞１となるオッズは年齢とともに増加する傾向にあり、高齢の年齢集団で最大値に達している［オッズ比（ＯＲ）；同性の参照年齢（０～９歳）集団と比較して、６０～６９歳の年齢集団で女性のＯＲ＝２．７（９５％ＣＩ、１．２～６．０）、男性のＯＲ＝３．７（９５％ＣＩ、１．４～９．６）］。最高齢集団（６０～６９歳）では、幼児・小児集団（０～９歳）よりも４０％高かった。バクテロイデス存在量では逆の傾向が示され、幼児・小児と比較して高齢集団で約８０％低い。その結果、Ｆ／Ｂ比は年齢とともに増加する傾向にあり、６０～６９歳の年齢集団で最高値（１．４２）に達する。これは、老化した脳でＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベルが上昇する別の機序を示している。
【0093】
したがって、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法は、被験者から試料を入手すること；試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ（Ｃｌｏａｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｖｒｙｅｎｓｉ）、およびファーミキューテスのいずれかの存在量を決定すること；測定した存在量に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することを含み得る。方法は、試料中のファーミキューテスとバクテロイデスの比率を決定すること、およびこの比率と対照中のファーミキューテスとバクテロイデスの比率とを比較することを含み得る。ファーミキューテス／バクテロイデスの比率が１より高い場合、被験者が認知症を発症するまたは有する確率が高いことが示される可能性がある。特に、Ｆ／Ｂの比率が１．１、１．２、１．３、１．４、または１．５より高い場合、被験者が認知症を発症するまたは有する確率が高いことが示される可能性がある。比率の向上が経時的に検出される場合があり、これは被験者が認知症を発症するまたは有することを示す可能性がある。
【0094】
存在量の決定とは、細菌の存在の有無を検出することと理解され、必ずしも定量的な量を検出する必要はない。しかしながら、細菌の量は、被験者が認知症を発症するまたは有する確率の予測を向上させる要因となる可能性がある。
【0095】
試料は、微生物試料、腸内細菌叢試料、腸試料、糞便試料、および／または便試料のうち１つまたは複数から選択できる。被験者はヒトであり得る。
【0096】
コリネバクテリウムは、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ジェイケイウム、コリネバクテリウム・ウレアリティクム、およびコリネバクテリウム・エフィシエンスのうち１つまたは複数から選択できる。
【0097】
オシリバクターは、オシリバクター・バレリシゲネス（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ ｖａｌｅｒｉｃｉｇｅｎｅｓ）およびオシリバクター属ＫＬＥ１７４５株から選択できる。
【0098】
試料中の微生物叢の構成を決定し得る。腸メタゲノムを決定し得る。方法は、被験者の試料の細菌の存在量または微生物叢の構成または腸メタゲノムを対照と比較することを含み得る。対照は、１人または複数人の健常者のデータに基づき得る。対照は、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人の健常者から決定し得る。
【0099】
腸メタゲノム、腸メタゲノムの微生物叢、または微生物叢の組成変化は、疾患またはリスク被験者（患者）と対照被験者との間で識別することができ、好ましくは、これは、存在する細菌群もしくは細菌種の種類または数の変化、例えば、種または他の分類学的な存在量の変化を識別することによって行われる。好ましい方法は、特定の細菌群または細菌種の存在について前記被験者の腸内細菌叢の試料を分析すること、例えば、対照レベルと比較して、特定の細菌群または細菌種、特に認知症または認知症関連疾患を有する被験者の腸内メタゲノムにおいて増大または増加することが確認されている種の増大または増加について前記試料を分析することを含む。別法として、対照被験者（健康な被験者）の腸内メタゲノムにおいて増大または増加することが確認されている細菌群または細菌種については、対照レベルと比較して、特定の細菌群または細菌種で減少または枯渇について被験者の試料、例えば腸内細菌叢試料を分析することができよう。本明細書に記載する細菌または遺伝子のレベルの「増加」または「増加した」レベルまたは「増大」等は、当該マーカーを対照レベルと比較する場合の、当該マーカーの任意の測定可能な増加または上昇または増大を含む。好ましくは、レベルの増加は有意となり、より好ましくは臨床的または統計的に有意となり（好ましくは確率値＜０．０５）、最も好ましくは臨床的および統計的に有意となる（好ましくは確率値＜０．０１）。
【0100】
試料は、配列に基づく技術、ジェノタイピングアッセイ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長のクローンライブラリー、ＤＧＧＥ、Ｔ－ＲＦＬＰ、ＡＲＩＳＡ、マイクロアレイ、ＤＮＡハイブリダイゼーション法のいずれかの方法を用いて解析できる。細菌の存在量は、懸濁液培養またはプレート培養、染色法、顕微鏡観察法、ＦＡＣＳなどのフローサイトメトリー法、光学密度測定法のうち少なくとも１つを含む細胞培養アッセイを用いて測定できる。
【0101】
例えば、糞便試料または腸試料などの腸内細菌叢試料は、配列に基づく技術によって核酸レベルで分析できよう。本発明は、例えばバーコードマルチプレックス４５４シーケンシングを用いて実施し、腸内微生物叢の細菌構成を単独で、または他の解析と組み合わせて分析することができる。本発明は、当技術分野で既知の特定の細菌種または細菌群を定量化する他の方法を用いて実施することもできる。
【0102】
上述のとおり、認知症は加齢に伴う認知症であり得、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、レビー小体型認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択され得る。
【0103】
加えて、または別法として、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法は、試料中のパルブアルブミン陽性介在ニューロンを同定すること；試料中の自発性ＩＰＳＣの頻度を測定すること；測定した頻度に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することを含む。
【0104】
上記に詳述したとおり、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は、パルブアルブミン陽性介在ニューロンにおける自発性ＩＰＳＣの頻度に影響を及ぼす。したがって、異常なｓｐＩＰＳＣ頻度は、被験者が認知症を発症するまたは有することも示し得る。
【0105】
同様に、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法は、試料中のパルブアルブミン陽性介在ニューロンを同定すること；パルブアルブミン陽性介在ニューロンの振動を測定すること；測定した振動に基づいて被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することを含み得る。
【0106】
上に示すように、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は、ガンマ振動の生成において主要な役割を果たすＰＶ陽性ＧＡＢＡニューロンに影響を及ぼす（ＢｕｚｓａｋｉおよびＷａｎｇ，２０１２）。したがって、振動を決定および／または定量化することによって、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を予測してよい。振動は脳波記録（ＥＥＧ）および脳磁図（ＭＥＧ）によって検出してよい。
【0107】
試料は、脳、急性脳スライス、培養脳組織、ニューロンの培養物、またはパルブアルブミン陽性介在ニューロンの培養物から選択できる。被験者はヒトであり得る。自発性ＩＰＳＣは、電気生理学的方法および／またはカルシウムイメージングを用いて測定できる。方法は、例えば脳波記録（ＥＥＧ）および脳磁図（ＭＥＧ）によって、ＰＶ陽性ＧＡＢＡニューロンの振動を検出することも含み得る。
【0108】
加えて、または別法として、本発明は、薬剤候補をスクリーニングする方法を目的とし、方法は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のうち１つまたは複数を含む試料を提供すること；試料を試験薬に曝露すること；試料に対する試験薬の効果を測定すること；試料に対する試験薬の効果に基づいて、試験薬の薬剤候補としての適格性を決定することを含む。試料は、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料のうちの１つから選択できる。試験薬は、酵素分解、キレート化、結合、吸収など、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかとの特定の生化学的相互作用に関与する作用機序を有し得る。試験薬の効果は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度の低下であってよい。試験薬の薬剤候補としての適切性は、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のうちいずれかの濃度の低下に対して試験薬が及ぼす効果に基づいて決定してよい。加えて、または別法として、試験薬は、試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの細菌を減少させる、または根絶することもできる。試験薬は、上述の細菌の存在量に直接的または間接的に影響を与える抗菌剤、ワクチン、もしくは局所プロバイオティック介入、または別の細菌を含み得る。例えば、大腸菌などその他の細菌が増加し、それにより上述の細菌が減少する可能性がある。試験薬の薬剤候補としての適格性は、上述の細菌のいずれかの存在量に対して試験薬が及ぼす効果に基づいて決定してよい。
【0109】
上述のように、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は、シナプス伝達、特に抑制性伝達に影響を与える。自発性ＩＰＳＣの頻度の変化は、放出確率の変化、または放出部位の数の変化のいずれかを示す。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は、ＧＡＢＡ受容体作動薬として機能する可能性もある。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸がシナプス伝達に及ぼす影響を低減する薬剤はいずれも、認知症の症状を軽減する、または認知症の発症を遅延させる可能性がある。潜在的な機序の１つが、スパイク－スパイク頻度の同期の正常化である。これにより、この場合のＰＦＣのように、特定の脳領域内の情報処理が向上する。同時に、他の脳領域（例えば海馬）との同期も向上する。その結果、認知処理が促進されることになる。
【0110】
本発明は、認知症を発症するまたは有する被験者を治療するさまざまな方法も目的とする。「治療」、「治療すること」などは、一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患またはその症状を完全もしくは部分的に妨げるという点で予防的であってよい、ならびに／または、疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用を部分的もしくは完全に治癒するという点で治療的であってよい。本明細書で使用する「治療」は、ヒトにおける疾患のあらゆる治療を対象とし、以下を含む：（ａ）疾患にかかりやすい素因を持っているが、罹患しているという診断をまだ受けていない被験者で疾患が発生するのを防ぐこと；（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、発病を阻止または遅らせること；または（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすこと。治療は、例えば遺伝子発現の調節、組織または器官の若返りなど、さまざまな物理的発現をもたらす可能性がある。治療薬は、疾患または損傷の発生前、発生中、または発生後に投与してよい。継続している疾患で、治療により患者の望ましくない臨床症状が安定化または軽減されるような場合は、特に関心が高い。このような治療は、罹患した組織の機能が完全に失われる前に行われることがある。治療薬は、疾患の症状を呈する段階で投与する場合や、場合によっては疾患症状の後に投与する場合がある。治療の進展は、被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定することによって、監視または評価または決定してよい。診断との関連で上記または下記に説明する方法は、治療の進展を監視または評価または決定する方法にも同様に適用され、任意で予後を推測する。治療は、被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかに作用する治療であってよいが、その他の治療でもあり得る。認知症の治療は、これらの物質のいずれかの濃度に変化をもたらすことができ、そのため、これらの濃度は治療の進展を監視または評価または決定することに使用してよい。
【0111】
例えば、本発明は、認知症を発症するまたは有する被験者を治療する方法を目的とし、方法は、被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を低下させる薬剤または薬剤の組み合わせを被験者に投与することを含む。１つまたは複数の薬剤は、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を低下させることができる。以下の酵素反応に示すように、１つまたは複数の薬剤は、５－アミノペンタンアミドから５－アミノ吉草酸を生成させる酵素である５－アミノペンタンアミダーゼの阻害剤であり得る。この酵素は以下の化合物によって阻害され得、これらは個別に、または組み合わせで投与される可能性がある：Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｓｎ２＋、Ｚｎ２＋。もう１つの標的はＬ－リシンカルボキシリアーゼとなり、これはカダベリンＬ－リシンからカダベリンを産生する。この酵素は、個別に、または組み合わせで投与される、１，５－ペンタンジアミン、リン酸２－エチルヘキシルジフェニル、６－アミノヘキサン酸、アクリジンオレンジ、ＤＬ－α－ジフルオロメチルオルニチン、ヒドロキシルアミン、ヨードアセトアミド、セミカルバジド、リン酸トリス（２－クロロ－１－（クロロメチル）エチル）、リン酸トリス（２－クロロエチル）、リン酸トリ－ｍ－クレジル、リン酸トリフェニル、リン酸トリス（２－クロロイソプロピル）、および尿素によって阻害され得る。Ｌ－リシンからの５－アミノペンタンアミドの生成は、酵素リシン２－モノオキシゲナーゼを阻害することによって標的とし得る。この酵素反応の好適な阻害剤は、個別に、または組み合わせて適用される２，２’－ジピリジル、２－オキソグルタル酸、クエン酸塩、グルタル酸塩、オキサロ酢酸塩、およびコハク酸塩である。
【0112】
酵素反応：
反応：５－アミノペンタンアミド＋Ｈ2Ｏ＝５－アミノ吉草酸＋ＮＨ3
酵素：５－アミノペンタンアミダーゼ
阻害剤：Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｓｎ２＋、Ｚｎ２＋
反応：カダベリンＬ－リシン＜＝＞カダベリン＋ＣＯ２
酵素：Ｌ－リシンカルボキシリアーゼ
阻害剤：１，５－ペンタンジアミン、リン酸２－エチルヘキシルジフェニル、６－アミノヘキサン酸、アクリジンオレンジ、ＤＬ－α－ジフルオロメチルオルニチン、ヒドロキシルアミン、ヨードアセトアミド、セミカルバジド、リン酸トリス（２－クロロ－１－（クロロメチル）エチル）、リン酸トリス（２－クロロエチル）、リン酸トリ－ｍ－クレジル、リン酸トリフェニル、リン酸トリス（２－クロロイソプロピル）、尿素
反応：Ｌ－リシン＋Ｏ２＝５－５－アミノペンタンアミド＋ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ
酵素：リシン２－モノオキシゲナーゼ
阻害剤：２，２’－ジピリジル、２－オキソグルタル酸、クエン酸塩、グルタル酸塩、オキサロ酢酸塩、コハク酸塩
反応：５－アミノペンタンアミド＋Ｈ2Ｏ＝５－アミノ吉草酸＋ＮＨ3
酵素：５－アミノペンタンアミダーゼ
阻害剤：Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｓｎ２＋、Ｚｎ２＋
反応：カダベリンＬ－リシン＜＝＞カダベリン＋ＣＯ２
酵素：Ｌ－リシンカルボキシリアーゼ
阻害剤：１，５－ペンタンジアミン、リン酸２－エチルヘキシルジフェニル、６－アミノヘキサン酸、アクリジンオレンジ、ＤＬ－α－ジフルオロメチルオルニチン、ヒドロキシルアミン、ヨードアセトアミド、セミカルバジド、リン酸トリス（２－クロロ－１－（クロロメチル）エチル）、リン酸トリス（２－クロロエチル）、リン酸トリ－ｍ－クレジル、リン酸トリフェニル、リン酸トリス（２－クロロイソプロピル）、尿素
反応：Ｌ－リシン＋Ｏ２＝５－５－アミノペンタンアミド＋ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ
酵素：リシン２－モノオキシゲナーゼ
阻害剤：２，２’－ジピリジル、２－オキソグルタル酸、クエン酸塩、グルタル酸塩、オキサロ酢酸塩、コハク酸塩
【0113】
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は、リシンのコハク酸塩への異化の一部として生成される。リシンは、無差別酵素ＧａｂＴおよびＧａｂＤによって５－アミノ吉草酸を介した経路に入る。ＧａｂＴは、コハク酸セミアルデヒドを産生するＧＡＢＡトランスアミナーゼと称される。ＧａｂＤは、コハク酸セミアルデヒドをコハク酸塩に変換する脱水素酵素である（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，２００２）。この経路は、ＣｓｉＤオペロンを抑制するリガンド依存性転写因子をコードするＣｓｉＲを、例えばウイルス構築体によって腸内微生物叢に導入することによって抑制することが可能である（Ｋｎｏｒｒら，２０１８）。
【0114】
本発明は、認知症を発症するまたは有する被験者を治療する方法も目的とし、方法は、腸内細菌叢中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの細菌を減少させる、または根絶する薬剤を被験者に投与することを含む。薬剤は、上述の細菌の存在量に直接的または間接的に影響を与える抗菌剤、ワクチン、もしくは局所プロバイオティック介入、または別の細菌を含み得る。例えば、大腸菌などその他の細菌が増加し、それにより上述の細菌が減少する可能性がある。
【0115】
薬剤は、製剤、調合薬、もしくは医薬品、または栄養補助食品として送達される可能性があり、これは、遅延放出性もしくは徐放性の腸溶性組成物もしくは製剤、または即放性製剤として製剤化してよい。任意で製剤は、回腸末端でｐＨ７で溶解するように設計された胃耐性コーティングを含み、例えば活性成分は、ｐＨ７以上で溶解するアクリル系樹脂または等価物、例えばポリ（メタ）アクリレート、例えばメタクリル酸コポリマーＢ、ＮＦでコーティングされ、例えば、マルチマトリクス（ＭＭＸ）製剤を含む。
【0116】
本製剤、調合薬、または医薬品は、追加的な抗菌剤または抗生物質をさらに含み、任意で、追加的な抗菌剤または抗生物質は以下を含む：アンピシリン、スルバクタム、テトラサイクリン、セファロスポリン、カルバペネム、イミペネム、メロペネム、モノバクタム、リンコサミド、クリンダマイシン、キノロン、フルオロキノロン、スルホンアミド、フラジシン、ニトロイミダゾール、メトロニダゾール、チニダゾール、抗クロストリジウム剤、またはラモプラナン、アミノグリコシド系抗生物質、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、パロモマイシン、ベルダマイシン、ムタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、レチミシン、カナマイシン、アンフェニコール、アンサマイシン、β－ラクタム系抗生物質、カルバペネム、セファロスポリン、セファマイシン、モノバクタム、オキサセフェム、リンコサミド系抗生物質、クリンダマイシン。
【0117】
加えて、または別法として、本発明は、認知症の治療に適している患者群を同定する方法を目的とし、方法は、被験者から試料を入手すること；試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定すること；測定した濃度に基づいて被験者が治療に応答する確率を決定することを含む。治療は、被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を低下させる薬剤を被験者に投与することを含み得る。
【0118】
加えて、または別法として、本発明は、認知症の治療に適している患者群を同定する方法を目的とし、方法は、被験者から試料を入手すること；試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの存在量を決定すること；測定した存在量に基づいて被験者が治療に応答する確率を決定することを含み、特に、被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することは、ファーミキューテスとバクテロイデスの比率を比較することを含む。治療は、腸内細菌叢中のコリネバクテリウム門、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの細菌を減少させる、または根絶する薬剤を被験者に投与することを含み得る。薬剤は、上述の細菌の存在量に直接的または間接的に影響を与える抗菌剤、ワクチン、もしくは局所プロバイオティック介入、または別の細菌を含み得る。例えば、大腸菌などその他の細菌が増加し、それにより上述の細菌が減少する可能性がある。
【0119】
加えて、または別法として、本発明は、被験者から試料を入手すること、試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定すること、ならびに測定した濃度に基づいて治療の進捗を決定することを含む、認知症の治療の進捗を監視し、任意で予後を推測する方法も目的とする。治療は、被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかに作用する治療であってよいが、その他の治療でもあり得る。認知症の治療は、これらの物質のいずれかの濃度に変化をもたらすことができ、そのため、これらの濃度は治療の進展を監視または評価または決定することに使用してよい。認知症を診断する方法に関する本開示は、同様に、認知症の治療の進捗を監視する方法に適用される。
【0120】
加えて、または別法として、本発明は、第１の時点で被験者から第１の試料を入手すること、第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること、第２の時点で被験者から第２の試料を入手すること、第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること、前に測定した濃度の比較に基づいて治療の進捗を決定することを含む、認知症の治療の進捗を監視し、任意で予後を推測する方法を目的とする。認知症を診断する方法に関する本開示は、同様に、認知症の治療の進捗を監視する方法に適用される。
【0121】
以前の研究では、認知的フレイルが、健康な老化における幸福にとって最も深刻な脅威の１つであることが確認されており、認知の衰えと神経機構の分解が関連付けられている（Ｌａｗｔｏｎ，Ｍ．ら）。脳機能の指標としてのみならず、加齢に伴う記憶障害の直接の原因として代謝物に注目した研究はごくわずかであった。本研究において、我々は、若齢マウス、ならびに若齢および老齢ドナーマウスの糞便を用いたＦＭＴ後の老齢マウスから得た血液および脳組織試料を用いてノンターゲットメタボロミクスを実施した。我々は、血液中および脳組織中の代謝物ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベルが年齢とともに増加したこと、ならびにδＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸が、ｍＰＦＣニューロン活動のレベルで行動的に評価されるように、加齢に伴う認知障害の原因となっている成分の１つであることの証拠を提示する。
【0122】
我々の行動データから、若齢マウスにＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸を腹腔内投与した後、作業記憶と認識記憶が低下したことが示された。老齢のマウスとヒトの脳では、ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベルが上昇していることから、明らかにこの代謝物は血液脳関門を通過し、加齢に伴う作業記憶と認識記憶の低下を引き起こしている可能性がある。老齢マウスと同様に老齢のヒトも、記憶内容を絶えず更新する必要がある作業記憶課題に影響を受けている（Ｇａｚｚａｌｅｙ，Ａ．，ら）。さらに高齢者は、刺激を適切にコード化できないため、加齢に伴う認識記憶の低下も生じている（Ｇｒａｄｙ，Ｃ．ら）。老化過程では、髄鞘と髄節間の変化に起因によって軸索に沿った伝導速度が低下することで、反応時間が長くなり、認知能力（注意と記憶を含む）や感覚機能および運動機能に関わるニューロンの同期性が妨げられる（Ｊｅｒｍａｋｏｗｉｃｚ，ＷＪら）。ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸は、スパイクの同期性が高いことを示すｍＰＦＣにおける集団結合を促進し、まさにこのようにして認知能力を阻害しているようである。興奮と抑制のバランスの観察される変化は、全体的な集団活動と、それにより集団結合を変化させる可能性がある。学習と記憶の過程では、集団結合の程度が異なることが機能的に重要であることを示唆する理論的な議論がいくつかある。強い集団結合は、関連する信号とは無関係な揺らぎ、すなわちノイズ相関として現れ、信号対雑音比を悪化させ、情報処理を阻害することがある（Ｃｏｈｅｎ Ｍ．Ｒ．ら；Ａｖｅｒｂｅｃｋ Ｂ．Ｂ．，ら）。さらに、相関が強いと集団符号化の情報量が低下し得るため、集団結合が強いと、正常な認知機能にとって有害となる可能性がある（Ｒｏｌｌｓ Ｅ．Ｔ．，ら；Ｓｈｅｗ，Ｗ．Ｌ．ら）。神経の同期の逸脱は、老齢マウスだけでなく高齢者の中枢聴覚系でも認められ、これは音声知覚問題に起因している（Ｇｏｏｓｓｅｎｓ，Ｔ．ら）。
【0123】
腸内微生物叢には１０００種を超える細菌種が含まれ、これらは主に、ファーミキューテス、バクテロイデス、アクチノバクテリア、およびプロテオバクテリアの４つの門に分類される（Ｌｅｃｌｅｒｙ，Ｓ．ら．；Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｋ．Ａ．ら）。ヒトおよびマウスでは年齢とともに腸内微生物叢が変化することが多くの研究で示されており（Ｌａｎｇｉｌｌｅ Ｍ．Ｇ．ら、Ｂｉａｇｉ，Ｅ．ら）、これは、加齢に伴ってδＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度が上昇する理由の１つである可能性がある。例えば、ファーミキューテスの増加によって、トリメチルアミン（ＴＭＡ）、その共代謝物トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－ｄｅｌ Ｃａｍｐ，Ａ．ら）、およびそれによりその前駆体ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸（Ｓｅｒｖｉｌｌｏ，Ｌ．ら）が増加する可能性がある。加齢に伴うファーミキューテス／バクテロイデス（Ｆ／Ｂ）比の増加は、代謝物の血液脳関門通過を促進させる上皮タイトジャンクションの低下とさらに関連している（Ｂｒａｎｉｓｔｅ，Ｖ．ら）。これは、老化した脳でＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸のレベルが上昇する別の機序を示している。
【0124】
つまり我々は、代謝物ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の加齢に伴う増加は腸内微生物叢に依存しており、認知能力に悪影響を及ぼすｍＰＦＣニューロン活動パターンの脳同期性を変化させる可能性があるという証拠を示す。
【0125】
実験手順：
上記に開示した実験を、以下に示す材料と方法を用いて実施した。本開示は、これらの材料および方法に限定されるものではなく、異なる材料および異なる方法を用いても、検討したものと同じ結果が得られ得ることを理解されたい。
上記に開示した実験を、以下に示す材料と方法を用いて実施した。本開示は、これらの材料および方法に限定されるものではなく、異なる材料および異なる方法を用いても、検討したものと同じ結果が得られ得ることを理解されたい。
【0126】
マウス
特定の病原体を保有していない（ＳＰＦ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＴａｃｏｎｉｃ ＦａｒｍｓまたはＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（フランス）から購入した。若齢マウス（２カ月齢）と老齢マウス（１５～１６カ月齢または２０～２４カ月齢）の２つの年齢集団の雌雄マウスを実験に用いた。マウスは１ケージ当たり最大５匹とし、午前６時に点灯する１２時間の明暗サイクルで飼育した。餌と水は自由摂食とした。マウスは、実験開始前にＳＰＦ飼育室の個別換気ケージ（ＩＶＣ）で少なくとも１週間休ませた。マウスは、ＣＥＭＴ（ドイツ、フライブルク）の特定の病原体を排除した（ＳＰＦ）条件下で、餌と水は自由摂食として１２時間ごとの明暗サイクルで飼育した。ケージの影響を避けるために、実験ごとに少なくとも３つの異なるケージから集めたマウス群を解析した。無菌（ＧＦ）マウスは、ベルン大学病院胃腸科Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ研究室（スイス）から得た。
特定の病原体を保有していない（ＳＰＦ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＴａｃｏｎｉｃ ＦａｒｍｓまたはＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（フランス）から購入した。若齢マウス（２カ月齢）と老齢マウス（１５～１６カ月齢または２０～２４カ月齢）の２つの年齢集団の雌雄マウスを実験に用いた。マウスは１ケージ当たり最大５匹とし、午前６時に点灯する１２時間の明暗サイクルで飼育した。餌と水は自由摂食とした。マウスは、実験開始前にＳＰＦ飼育室の個別換気ケージ（ＩＶＣ）で少なくとも１週間休ませた。マウスは、ＣＥＭＴ（ドイツ、フライブルク）の特定の病原体を排除した（ＳＰＦ）条件下で、餌と水は自由摂食として１２時間ごとの明暗サイクルで飼育した。ケージの影響を避けるために、実験ごとに少なくとも３つの異なるケージから集めたマウス群を解析した。無菌（ＧＦ）マウスは、ベルン大学病院胃腸科Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ研究室（スイス）から得た。
【0127】
処置
腸内微生物叢を急激に枯渇させるために、１５～１６カ月齢のＳＰＦ雄マウスに、セフォキシチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、メトロニダゾール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびバンコマイシン（Ｈｉｋｍａ－ｐｈａｒｍａ）を含む抗生物質（ＡＢＸ）の混合物を、滅菌１ｘＰＢＳ中、各１０ｍｇ／ｋｇで、３日間連続で強制経口投与した。４日目に、マウスにクリンダマイシン塩酸塩を１回投与した（３３．３ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。２４時間後に糞便微生物移植（ＦＭＴ）を開始した。ミクログリアなどのｃｓｆ１依存性細胞をｉｎ ｖｉｖｏで枯渇させるために、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤ＰＬＸ５６２２（Ｐｌｅｘｘｉｃｏｎ Ｉｎｃ．）を混ぜ入れたＡＩＮ－７６Ａ標準飼料を、１２００ｍｇ／ｋｇ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ．）でマウスに自由摂食させた。各対照にはＡＩＮ－７６Ａ標準飼料を与えた。行動試験の１時間前に、５ｍｇ／ｋｇのδ－バレロベタイン（ＭＣＡＴ、ドイツ）をマウスに投与した。
腸内微生物叢を急激に枯渇させるために、１５～１６カ月齢のＳＰＦ雄マウスに、セフォキシチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、メトロニダゾール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびバンコマイシン（Ｈｉｋｍａ－ｐｈａｒｍａ）を含む抗生物質（ＡＢＸ）の混合物を、滅菌１ｘＰＢＳ中、各１０ｍｇ／ｋｇで、３日間連続で強制経口投与した。４日目に、マウスにクリンダマイシン塩酸塩を１回投与した（３３．３ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。２４時間後に糞便微生物移植（ＦＭＴ）を開始した。ミクログリアなどのｃｓｆ１依存性細胞をｉｎ ｖｉｖｏで枯渇させるために、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤ＰＬＸ５６２２（Ｐｌｅｘｘｉｃｏｎ Ｉｎｃ．）を混ぜ入れたＡＩＮ－７６Ａ標準飼料を、１２００ｍｇ／ｋｇ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ．）でマウスに自由摂食させた。各対照にはＡＩＮ－７６Ａ標準飼料を与えた。行動試験の１時間前に、５ｍｇ／ｋｇのδ－バレロベタイン（ＭＣＡＴ、ドイツ）をマウスに投与した。
【0128】
メタボロミクス解析
若齢および老齢マウスから血清と海馬脳組織を採取し、重量を測定した後に液体窒素を用いて瞬間凍結した。試料解析は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．独自の一連の有機および水抽出を用いて行い、タンパク質成分を除去しながら低分子を最大限に回収した。抽出液は、ＬＣによる分析用とＧＣによる分析用の２つに分けた。ＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ）を用いて有機溶剤成分を除去した。次いで、各試料を凍結し、真空下で乾燥させた。方法の詳細は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．が、ノンターゲット質量分析法メタボロミクスの標準プロトコルとして提供され得る。
若齢および老齢マウスから血清と海馬脳組織を採取し、重量を測定した後に液体窒素を用いて瞬間凍結した。試料解析は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．独自の一連の有機および水抽出を用いて行い、タンパク質成分を除去しながら低分子を最大限に回収した。抽出液は、ＬＣによる分析用とＧＣによる分析用の２つに分けた。ＴｕｒｂｏＶａｐ（登録商標）（Ｚｙｍａｒｋ）を用いて有機溶剤成分を除去した。次いで、各試料を凍結し、真空下で乾燥させた。方法の詳細は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．が、ノンターゲット質量分析法メタボロミクスの標準プロトコルとして提供され得る。
【0129】
ノンターゲットメタボロミクス
試料は採取時に瞬間凍結し、次の処理までＭｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．５２で、－８０℃で保存した。簡潔に説明すると、品質管理のために、抽出工程の第１のステップの前に回収標準を加えた。タンパク質を除去し、タンパク質に結合した低分子または沈殿したタンパク質マトリクスに捕捉された低分子を解離させ、化学的に多様な代謝物を回収するために、メタノールを用いて２分間激しく振とうし（Ｇｌｅｎ Ｍｉｌｌｓ Ｇｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ ２０００）、その後遠心分離を行ってタンパク質を沈殿させた。得られた抽出物を５つに分け、超高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ；正イオン化）による解析用に２つ（すなわち、早期および後期溶出化合物）、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（負イオン化）による解析用に１つ、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ極プラットフォーム（ｐｏｌａｒ ｐｌａｔｆｏｒｍ）（負イオン化）用に１つ、さらにバックアップ用に１つの試料を確保した。実験試料と合わせて、以下の３種類の対照を解析した：Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．によって幅広く特性付けされたスパイクイン対照のプールから作成した試料、またはデータセット全体で技術的複製として用いた、関心のある各実験試料のごく一部から作成した試料；プロセスブランクとして用いた抽出水試料；ならびに装置性能の監視を可能にした各解析試料にスパイクされた標準物質のカクテル。装置の変動性は、質量分析計に注入する前に各試料に添加された標準物質の相対標準偏差（ＲＳＤ）の中央値を計算することによって決定した（ＲＳＤ中央値＝通常４～６％；ｎ≧３０標準物質）。全体的なプロセスの変動は、対照プールまたはクライアントマトリクス試料の１００％に存在するすべての内因性代謝物（すなわち非標準器（ｎｏｎ－ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓｔａｎｄａｒｄ））のＲＳＤ中央値を計算することによって決定した（ＲＳＤ中央値＝１０～１４％；ｎ＝代謝物数百）。実験試料と対照は、プラットフォームの実行全体にランダムに配置した。
試料は採取時に瞬間凍結し、次の処理までＭｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．５２で、－８０℃で保存した。簡潔に説明すると、品質管理のために、抽出工程の第１のステップの前に回収標準を加えた。タンパク質を除去し、タンパク質に結合した低分子または沈殿したタンパク質マトリクスに捕捉された低分子を解離させ、化学的に多様な代謝物を回収するために、メタノールを用いて２分間激しく振とうし（Ｇｌｅｎ Ｍｉｌｌｓ Ｇｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ ２０００）、その後遠心分離を行ってタンパク質を沈殿させた。得られた抽出物を５つに分け、超高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ；正イオン化）による解析用に２つ（すなわち、早期および後期溶出化合物）、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（負イオン化）による解析用に１つ、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ極プラットフォーム（ｐｏｌａｒ ｐｌａｔｆｏｒｍ）（負イオン化）用に１つ、さらにバックアップ用に１つの試料を確保した。実験試料と合わせて、以下の３種類の対照を解析した：Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．によって幅広く特性付けされたスパイクイン対照のプールから作成した試料、またはデータセット全体で技術的複製として用いた、関心のある各実験試料のごく一部から作成した試料；プロセスブランクとして用いた抽出水試料；ならびに装置性能の監視を可能にした各解析試料にスパイクされた標準物質のカクテル。装置の変動性は、質量分析計に注入する前に各試料に添加された標準物質の相対標準偏差（ＲＳＤ）の中央値を計算することによって決定した（ＲＳＤ中央値＝通常４～６％；ｎ≧３０標準物質）。全体的なプロセスの変動は、対照プールまたはクライアントマトリクス試料の１００％に存在するすべての内因性代謝物（すなわち非標準器（ｎｏｎ－ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓｔａｎｄａｒｄ））のＲＳＤ中央値を計算することによって決定した（ＲＳＤ中央値＝１０～１４％；ｎ＝代謝物数百）。実験試料と対照は、プラットフォームの実行全体にランダムに配置した。
【0130】
ノンターゲット質量分析法（ＭＳ）解析はＭｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．（米国）で実施した。試料を超高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析計（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）５２に導入した。クロマトグラフィーは標準化し、方法の妥当性を確認した後、それ以上の変更は行わなかった。Ｍｅｔａｂｏｌｏｎでの一般的な実施手順として、カラムはすべて、実験開始時に単一の製造業者のロットから購入した。すべての溶媒も同様に、関連するすべての実験を完了するのに十分な量を単一の製造業者のロットから一括購入した。各試料について、真空乾燥した試料を、プラットフォームに応じて一定濃度の８種以上の注入標準を含む注入溶媒に溶解させた。注入とクロマトグラフィーの一貫性を保証するために、いずれも内部標準を使用した。装置は、質量分解能と質量精度について、毎日調整と校正を行った。
【0131】
ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳプラットフォームは、ＷａｔｅｒｓのＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣとＷａｔｅｒｓのＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８－２．１ｘ１００ｍｍ、１．７μｍカラム、さらに加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ－ＩＩ）源と適合したＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ高解像度／精密質量分析計を利用し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計は３５，０００の質量分解能で作動させた。試料抽出物は乾燥させた後に、酸性または塩基性ＬＣ適合溶媒で再構成した。注入とクロマトグラフィーの一貫性を確保するために、溶媒はいずれも一定濃度の８種以上の注入標準を含有していた。１つのアリコートは酸性陽イオン最適化条件で、もう１つは塩基性陰イオン最適化条件で、別々の専用カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８－２．１ｘ１００ｍｍ、１．７μｍ）を用いて、独立した注入を２回行って分析した。酸性条件下で再構成した抽出物は、０．１％ギ酸を含む水およびメタノールでグラジエント溶出し、塩基性抽出物は６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムを含む水およびメタノールを用いた。３つ目のアリコートは、１０ｍＭギ酸アンモニウムを含む水およびアセトニトリルからなるグラジエントを用いたＨＩＬＩＣカラム（ＷａｔｅｒｓのＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ ２．１ｘ１５０ｍｍ、１．７μｍ）から溶出した後に、負イオン化により分析した。ＭＳ分析は、動的排除を用いてＭＳスキャンとデータ依存性ＭＳ２スキャンを交互に行い、スキャン範囲は８０～１０００ｍ／ｚとした。
【0132】
代謝物は、実験試料のイオン特徴を、保持時間、分子量（ｍ／ｚ）、好ましい付加物、およびインソースフラグメント、ならびに関連するＭＳスペクトルを含む化学標準物質の参照ライブラリーの項目と自動比較することによって同定し、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ５３が開発したソフトウェアを使用して、品質管理のために目視検査でキュレーションした。既知の化学物質の同定は、精製された標準物質のメタボロミクスライブラリーの項目との比較に基づいている。市販の精製標準化合物を入手し、検出可能な特徴を決定するためにＬＩＭＳに登録した。クロマトグラフィーと質量スペクトルの両方が繰り返し現れるという性質から同定された、構造的に特定されていない生化学物質の質量スペクトルの項目を追加で作成した。これらの化合物は、適合する精製標準物質を将来的に入手することによって、または従来の構造解析によって同定できる可能性がある。ピークは曲線下面積を用いて定量化した。各試料中の各代謝物の生の領域数を正規化し、各実施日の中央値によって装置の日間調整差による変動を補正し、そのために各実施の中央値を１．０に設定した。これにより、試料間の差を保持しながら、生のピーク面積が大きく異なる代謝物を同様のグラフ尺度で比較することが可能となった。欠落値は、正規化後に観察された最小値に帰属させた。
【0133】
ターゲットメタボロミクス
予冷した（－８０℃）抽出溶液（８０：２０メタノールＬＣ－ＭＳグレード：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏ）を用いて試料を抽出した。ＬＣ－ＭＳによる標的代謝物の定量化は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６４９５ＱＱＱ－ＭＳと合わせてＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣを使用し、ＭＲＭモードで行った。ＭＲＭ設定は、すべての化合物について純粋な標準物質を用いて個別に最適化した。ＬＣ分離はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘのＬｕｎａプロピルアミンカラム（５０ｘ２ｍｍ、３μｍ粒子）で１００％緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル中５ｍＭ炭酸アンモニウム）からの９０％緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４）への溶媒グラジエントを用いて行った。流量は１０００～７５０μＬ／分からとした。オートサンプラーの温度は５℃、注入量は２μＬであった。ピーク面積は、各代謝物の標準物質に基づいて特定し、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて計算した。
予冷した（－８０℃）抽出溶液（８０：２０メタノールＬＣ－ＭＳグレード：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏ）を用いて試料を抽出した。ＬＣ－ＭＳによる標的代謝物の定量化は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６４９５ＱＱＱ－ＭＳと合わせてＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣを使用し、ＭＲＭモードで行った。ＭＲＭ設定は、すべての化合物について純粋な標準物質を用いて個別に最適化した。ＬＣ分離はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘのＬｕｎａプロピルアミンカラム（５０ｘ２ｍｍ、３μｍ粒子）で１００％緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル中５ｍＭ炭酸アンモニウム）からの９０％緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４）への溶媒グラジエントを用いて行った。流量は１０００～７５０μＬ／分からとした。オートサンプラーの温度は５℃、注入量は２μＬであった。ピーク面積は、各代謝物の標準物質に基づいて特定し、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて計算した。
【0134】
ヒトのメタボロミクスデータ
ＴｗｉｎｓＵＫのＡｄｕｌｔ Ｔｗｉｎ Ｒｅｇｉｓｔｒｙには、疾患およびライフスタイル特性が一般的な英国人と似通った、主に女性からなる約１４，０００人の被験者が登録されている。セント・トーマス病院の研究倫理委員会が試験を承認し、すべての双子が書面によるインフォームド・コンセントを提出した。我々は、加齢コホートを含み、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ Ｉｎｃ．のプラットフォームで実施された血液メタボローム試験２試験５４、５５のδ－バレロベタインについてデータをマイニングした。簡潔に説明すると、代謝物の比率は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．（米国ノースカロライナ州モリスビル）がノンターゲットＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳプラットフォームを用いて血液試料で測定した。代謝物は、実施日の中央値でスケーリングし、対数変換を行った。データは、平均値０、標準偏差１になるようにさらに分位正規化した。δ－バレロベタインが検出レベル（ゼロ）未満であった被験者は、利用不可（ＮＡ）とみなされた。
ＴｗｉｎｓＵＫのＡｄｕｌｔ Ｔｗｉｎ Ｒｅｇｉｓｔｒｙには、疾患およびライフスタイル特性が一般的な英国人と似通った、主に女性からなる約１４，０００人の被験者が登録されている。セント・トーマス病院の研究倫理委員会が試験を承認し、すべての双子が書面によるインフォームド・コンセントを提出した。我々は、加齢コホートを含み、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ Ｉｎｃ．のプラットフォームで実施された血液メタボローム試験２試験５４、５５のδ－バレロベタインについてデータをマイニングした。簡潔に説明すると、代謝物の比率は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．（米国ノースカロライナ州モリスビル）がノンターゲットＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳプラットフォームを用いて血液試料で測定した。代謝物は、実施日の中央値でスケーリングし、対数変換を行った。データは、平均値０、標準偏差１になるようにさらに分位正規化した。δ－バレロベタインが検出レベル（ゼロ）未満であった被験者は、利用不可（ＮＡ）とみなされた。
【0135】
糞便微生物移植（ＦＭＴ）
微生物枯渇試験のために、１ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｕｒｏｍｅｄｉｃｓ）、ネオマイシン硫酸塩（Ｆｉｓｈｅｒ）、ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、および０．５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシン（Ｓａｇｅｎｔ）を含む飲料水を、ＳＰＦマウスに４～５週間摂取させた（Ｋｈｏｓｒａｖｉら，２０１４）。これらのマウスは、糞便スラリーの強制経口投与によって実施したＦＭＴにより再コロニー化した。レシピエントマウスは、ＦＭＴの２時間前にケージから餌を取り除いた。糞便スラリーは、８～１４匹のドナーマウスの糞便ペレットをプールして得た。ペレットは計量し、糞便３００ｍｇにつき１ｍＬのＰＢＳで１分間ボルテックスして再懸濁させた。５００×ｇで５分間遠心分離して大きな粒子をペレットにした後、ＦＭＴ用に上澄みを回収した。各レシピエントマウスに１５０μＬの糞便スラリーを強制経口投与した。残ったスラリーは、１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシング用に－８０℃で保管した。ＦＭＴ後、レシピエントマウスのケージには、ドナーマウスの汚れた床敷および新鮮な糞便ペレットをそれぞれ週に１回および２回補充した。１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシング用の糞便ペレットはＦＭＴの前日かつ実験の最後に回収し、ＤＮＡ抽出のために－８０℃で保管した。ＡＢＸ処理マウスの再コロニー化のために、８週齢または１５～１６カ月齢の雄マウスからのＦＭＴを実施した。新鮮な糞便ペレットは滅菌フード下で回収し、嫌気性細菌を保持するために、１ｘＰＢＳ中０．１％Ｌ－システイン塩酸塩一水和物中で直接完全にホモジナイズする。ホモジネートは１分間、２００ｇ、４℃でスピンダウンし、濁った上澄みを使用してレシピエントマウスに強制経口投与および経直腸投与した。ＦＭＴは７２時間の間隔を空けて２回実施した。
微生物枯渇試験のために、１ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｕｒｏｍｅｄｉｃｓ）、ネオマイシン硫酸塩（Ｆｉｓｈｅｒ）、ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、および０．５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシン（Ｓａｇｅｎｔ）を含む飲料水を、ＳＰＦマウスに４～５週間摂取させた（Ｋｈｏｓｒａｖｉら，２０１４）。これらのマウスは、糞便スラリーの強制経口投与によって実施したＦＭＴにより再コロニー化した。レシピエントマウスは、ＦＭＴの２時間前にケージから餌を取り除いた。糞便スラリーは、８～１４匹のドナーマウスの糞便ペレットをプールして得た。ペレットは計量し、糞便３００ｍｇにつき１ｍＬのＰＢＳで１分間ボルテックスして再懸濁させた。５００×ｇで５分間遠心分離して大きな粒子をペレットにした後、ＦＭＴ用に上澄みを回収した。各レシピエントマウスに１５０μＬの糞便スラリーを強制経口投与した。残ったスラリーは、１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシング用に－８０℃で保管した。ＦＭＴ後、レシピエントマウスのケージには、ドナーマウスの汚れた床敷および新鮮な糞便ペレットをそれぞれ週に１回および２回補充した。１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシング用の糞便ペレットはＦＭＴの前日かつ実験の最後に回収し、ＤＮＡ抽出のために－８０℃で保管した。ＡＢＸ処理マウスの再コロニー化のために、８週齢または１５～１６カ月齢の雄マウスからのＦＭＴを実施した。新鮮な糞便ペレットは滅菌フード下で回収し、嫌気性細菌を保持するために、１ｘＰＢＳ中０．１％Ｌ－システイン塩酸塩一水和物中で直接完全にホモジナイズする。ホモジネートは１分間、２００ｇ、４℃でスピンダウンし、濁った上澄みを使用してレシピエントマウスに強制経口投与および経直腸投与した。ＦＭＴは７２時間の間隔を空けて２回実施した。
【0136】
マウスへの投与
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸を０．９％ＮａＣｌに溶解し、１０ｍＬ／ｋｇの容量で、２００ｍｇ／ｋｇの用量を腹腔内投与した。対照としてビークルＮａＣｌを投与した。
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸を０．９％ＮａＣｌに溶解し、１０ｍＬ／ｋｇの容量で、２００ｍｇ／ｋｇの用量を腹腔内投与した。対照としてビークルＮａＣｌを投与した。
【0137】
行動試験
薬剤もしくはビークル投与の４０分後、またはＦＭＴの４週間後にマウスを試験した。まずマウスに新奇物体認識試験の訓練試行を行ってからＴ迷路試験を実施し、次いで訓練セッションマウスの６時間後に新奇物体認識試験を実施した。空間作業記憶は、前述のとおり、Ｔ迷路で継続的な自発的交替課題を用いて試験した（Ｓｐｏｗａｒｔ－Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｌ．ら）。簡潔に説明すると、Ｔ迷路の基部にマウスを置き、基部のアームに戻るまで、ランダムに割り当てたＴ迷路のアームを探索させた。続いて、ブロックしていたアームを開き、マウスに迷路全体を探索させた。Ｔ迷路の片方のアームに入ったら、もう一方のアームはマウスが基部のアームに戻るまでブロックした。その後、基部のアームの出口を５秒間ブロックし、マウスに再び迷路を探索させた。実験は１４回自由にアームに進入させた後に終了した。アームへの進入は、直前に訪れたアームと反対側のアームをマウスが選択した場合に交替として得点した。認識記憶の評価には、以前に公表されている（Ａｎｔｕｎｅｓ，Ｍ．およびＢｉａｌａ，Ｇ．ら）新奇物体認識（ＮＯＲ）課題を適用した。馴化期では、各マウスに、２０秒間の総探索時間内に２つの類似物体を探索させた。試験セッションは馴化セッションの６時間後に開始した。試験セッションでは、各マウスに、見慣れた物体と、形状や質感の異なる新奇物体とを探索させた。新奇物体と見慣れた物体の位置はマウスごとに無作為に設定した。各マウスが新奇物体と見慣れた物体を探索するのに費やした時間を記録した。実験は、探索時間の合計が２０秒に達した時点で終了した。
薬剤もしくはビークル投与の４０分後、またはＦＭＴの４週間後にマウスを試験した。まずマウスに新奇物体認識試験の訓練試行を行ってからＴ迷路試験を実施し、次いで訓練セッションマウスの６時間後に新奇物体認識試験を実施した。空間作業記憶は、前述のとおり、Ｔ迷路で継続的な自発的交替課題を用いて試験した（Ｓｐｏｗａｒｔ－Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｌ．ら）。簡潔に説明すると、Ｔ迷路の基部にマウスを置き、基部のアームに戻るまで、ランダムに割り当てたＴ迷路のアームを探索させた。続いて、ブロックしていたアームを開き、マウスに迷路全体を探索させた。Ｔ迷路の片方のアームに入ったら、もう一方のアームはマウスが基部のアームに戻るまでブロックした。その後、基部のアームの出口を５秒間ブロックし、マウスに再び迷路を探索させた。実験は１４回自由にアームに進入させた後に終了した。アームへの進入は、直前に訪れたアームと反対側のアームをマウスが選択した場合に交替として得点した。認識記憶の評価には、以前に公表されている（Ａｎｔｕｎｅｓ，Ｍ．およびＢｉａｌａ，Ｇ．ら）新奇物体認識（ＮＯＲ）課題を適用した。馴化期では、各マウスに、２０秒間の総探索時間内に２つの類似物体を探索させた。試験セッションは馴化セッションの６時間後に開始した。試験セッションでは、各マウスに、見慣れた物体と、形状や質感の異なる新奇物体とを探索させた。新奇物体と見慣れた物体の位置はマウスごとに無作為に設定した。各マウスが新奇物体と見慣れた物体を探索するのに費やした時間を記録した。実験は、探索時間の合計が２０秒に達した時点で終了した。
【0138】
Ｔ迷路：Ｔ迷路の自発性交替は、中枢神経系障害について、動物、特にげっ歯類モデルの探索行動を測定する行動試験である。この試験は、げっ歯類が新しい環境を探索しようとすること、すなわち、迷路の見慣れたアームよりも新しいアームを好んで訪れることに基づいている。この課題には、海馬を含む脳の多くの部位が関与している。最初にマウスをＴ迷路のスタートアームに置く。スタートアームで放すと、マウスは左または右いずれかのゴールアームへの進入を選択する。試行を繰り返すと（計１５回）、前回訪れたアームに進入する傾向が低いことがわかる。交替の割合（各ゴールアームでの転換数）と総試行時間を記録する。この試験は、マウスの形質転換系における認知障害を定量化し、新規の化学物質が認知に及ぼす影響を評価するのに用いる。
【0139】
新奇物体認識：新奇物体認識（ＮＯＲ）課題は、中枢神経系障害のげっ歯類モデルにおける認知、特に認識記憶を評価するために用いられる。この試験は、見慣れた物体よりも新しい物体を探索することに多くの時間を費やすというげっ歯類の自発的な傾向に基づいている。新しい物体を探索するという選択は、学習記憶と認識記憶の利用を反映している。新奇物体認識課題は、２種類の物体を置いたオープンフィールドアリーナで実施する。２つの物体は高さと体積は概ね同じであるが、形状と外観が異なる。マウスは、２つの同一物体が等距離の位置に置かれた見慣れたアリーナに入れられる。マウスは物体を計２０秒探索した後に元のケージに戻される。訓練試行の６時間後に試験の第２段階を実施する。長期認識記憶を試験するために、見慣れた物体と新奇物体が置かれたオープンフィールドでマウスを探索させる。１０分の間に各物体を探索するのに費やした時間と、識別指数の割合を記録する。この試験は、マウスの形質転換系における認知能力の低下を判定し、新規の化学物質が認知に及ぼす影響を評価するのに有益である。
【0140】
ｉｎ ｖｉｖｏ電気生理学的手法のための手術
１０～１１週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにイソフルラン（導入濃度：３％、維持濃度：１．５％）で麻酔をかけた。鎮痛のためにブプレノルフィン（０．０５～０．１ｍｇ／ｋｇ体重）とカプロフェン（４～５ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した。移植中は加熱パッドを用いて体温を維持した。小脳から鼻まで皮膚を切開し、骨を３％Ｈ２Ｏ２で洗浄した。ラムダ縫合の前方に基礎スクリューと参照スクリュー（直径１ｍｍ）を埋入した。３本目の安定スクリューは左頭頂骨に埋入した。タングステン線で作製された四極真空管（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｆｉｎｅ Ｗｉｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）８個が装着されたマイクロドライブを、（脳表面から）右前頭前野の座標ＡＰ＋１．９、ＭＬ０．４、ＤＶ－１．２に挿入した。開頭部はワセリンで保護し、マイクロドライブは歯科用セメントで頭蓋骨に固定した。手術後、マウスにブプレノルフィンとカプロフェン４８時間かけて皮下投与し、個別に収容した。
１０～１１週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにイソフルラン（導入濃度：３％、維持濃度：１．５％）で麻酔をかけた。鎮痛のためにブプレノルフィン（０．０５～０．１ｍｇ／ｋｇ体重）とカプロフェン（４～５ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した。移植中は加熱パッドを用いて体温を維持した。小脳から鼻まで皮膚を切開し、骨を３％Ｈ２Ｏ２で洗浄した。ラムダ縫合の前方に基礎スクリューと参照スクリュー（直径１ｍｍ）を埋入した。３本目の安定スクリューは左頭頂骨に埋入した。タングステン線で作製された四極真空管（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｆｉｎｅ Ｗｉｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）８個が装着されたマイクロドライブを、（脳表面から）右前頭前野の座標ＡＰ＋１．９、ＭＬ０．４、ＤＶ－１．２に挿入した。開頭部はワセリンで保護し、マイクロドライブは歯科用セメントで頭蓋骨に固定した。手術後、マウスにブプレノルフィンとカプロフェン４８時間かけて皮下投与し、個別に収容した。
【0141】
電気生理学的手法
海馬スライスの作製
マウスに麻酔をかけて断頭した後、直ちに脳を取り出し、スクロース１５０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２５ｍＭ、ブドウ糖１０ｍＭ、ＫＣｌ ２．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ １ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ７ｍＭを含む、酸素化した氷冷高スクロースの人工脳脊髄液（ｈｓＡＣＳＦ）に浸漬させた。ｈｓＡＣＳＦ中に２分間保持した後、脳のブロックを作製し、ビブラトーム（ＶＴＳ１０００；Ｌｅｉｃａ、イリノイ州バンノックバーン）のステージに接着して、海馬を含む３００μｍ厚の水平な脳スライスを作製した。続いて、スライスをＡＣＳＦ（ＮａＣｌ １２４ｍＭ、ＫＣｌ ３ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ １．２５ｍＭ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２６ｍＭ、ブドウ糖１０ｍＭ、およびＣａＣｌ２ ２ｍＭを含有）を含むチャンバーに入れた。スライスは３５℃で４０分間インキュベートした後、室温で保持した（６～８時間）。
海馬スライスの作製
マウスに麻酔をかけて断頭した後、直ちに脳を取り出し、スクロース１５０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２５ｍＭ、ブドウ糖１０ｍＭ、ＫＣｌ ２．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ １ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ７ｍＭを含む、酸素化した氷冷高スクロースの人工脳脊髄液（ｈｓＡＣＳＦ）に浸漬させた。ｈｓＡＣＳＦ中に２分間保持した後、脳のブロックを作製し、ビブラトーム（ＶＴＳ１０００；Ｌｅｉｃａ、イリノイ州バンノックバーン）のステージに接着して、海馬を含む３００μｍ厚の水平な脳スライスを作製した。続いて、スライスをＡＣＳＦ（ＮａＣｌ １２４ｍＭ、ＫＣｌ ３ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ １．２５ｍＭ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２６ｍＭ、ブドウ糖１０ｍＭ、およびＣａＣｌ２ ２ｍＭを含有）を含むチャンバーに入れた。スライスは３５℃で４０分間インキュベートした後、室温で保持した（６～８時間）。
【0142】
記録
記録のために、スライスは３２℃で温めた酸素化ＡＣＳＦを２～４ｍＬ／分で灌流させた水浸式の記録チャンバー（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、コネチカット州ハムデン）に入れた。赤外線微分干渉（ＩＲ－ＤＩＣ）顕微鏡下でＣＡ１領域に介在ニューロンを同定した。マイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、カリフォルニア州ノバート）を用いて、外径１．５ｍｍのホウケイ酸ガラス（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フロリダ州サラソータ）から３～７ＭΩでパッチピペットを引いた。データはＡｘｏｐａｔｃｈ１Ｄ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて取得し、１０ｋＨｚでデジタル化して、Ｄｉｇｉｄａｔａ１３２０ＡとｐＣｌａｍｐ８．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて記録した。すべての実験で、内部記録液（グルコンサンＫ ４０ｍＭ、ＫＣｌ １００ｍＭ、ＮａＣｌ ２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ、ＥＧＴＡ ４ｍＭ、ＭｇＡＴＰ ４ｍＭ、Ｎａ２ＧＴＰ ０．３ｍＭ、およびＱＸ－３１４ １．２５ｍＭを含有）（ｐＨ７．２０～７．２５；２８５～２９５ｍＯｓｍ）を使用した。すべての実験で、マウスはＰ５０からＰ６０の間であった。ＣＡ１介在ニューロンから安定した電圧クランプ記録を取得した後、記録を電流クランプモードに切り替え、過分極および脱分極電流の注入ステップを用いて、公表された発火パターンおよび活動電位（ＡＰ）特性（Ｂｕｔｔら，２００５；ＦｌａｍｅｓおよびＭａｒｉｎ，２００５）を利用して記録されている細胞のクラスを決定した。続いて、記録を電圧クランプモード（保持電位、－６０ｍＶ）に切り替えてｓＩＰＳＣを記録した。自発性ＩＰＳＣは、２０μＭの６，７－ジニトロキノキサリン－２，３－ジオン（ＤＮＱＸ、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソキサゾールプロピオン酸［ＡＭＰＡ］受容体ブロッカー）および５０μＭのｄ－２－アミノ－５－ホスホノ吉草酸（ｄ－ＡＰＶ、ＮＭＤＡ受容体ブロッカー；Ｓｉｇｍａ）を含むＡＣＳＦでスライスを灌流することによって薬理学的に単離した。記録はすべて３２℃で取得した。電圧クランプ記録は１ｋＨｚでローパスフィルターを、６０Ｈｚでバンドパスフィルターをかけた（Ｈｕｍ Ｂｕｇ；ＡｕｔｏＭａｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州バークレー）。ホールセルのアクセス抵抗と保持電流を継続的にモニタリングし、記録が安定していることを確認した。すべての記録は、まず対照条件下で行い、次いで浴液中で１０μＭのＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の存在下で行った。
記録のために、スライスは３２℃で温めた酸素化ＡＣＳＦを２～４ｍＬ／分で灌流させた水浸式の記録チャンバー（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、コネチカット州ハムデン）に入れた。赤外線微分干渉（ＩＲ－ＤＩＣ）顕微鏡下でＣＡ１領域に介在ニューロンを同定した。マイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、カリフォルニア州ノバート）を用いて、外径１．５ｍｍのホウケイ酸ガラス（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フロリダ州サラソータ）から３～７ＭΩでパッチピペットを引いた。データはＡｘｏｐａｔｃｈ１Ｄ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて取得し、１０ｋＨｚでデジタル化して、Ｄｉｇｉｄａｔａ１３２０ＡとｐＣｌａｍｐ８．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて記録した。すべての実験で、内部記録液（グルコンサンＫ ４０ｍＭ、ＫＣｌ １００ｍＭ、ＮａＣｌ ２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ、ＥＧＴＡ ４ｍＭ、ＭｇＡＴＰ ４ｍＭ、Ｎａ２ＧＴＰ ０．３ｍＭ、およびＱＸ－３１４ １．２５ｍＭを含有）（ｐＨ７．２０～７．２５；２８５～２９５ｍＯｓｍ）を使用した。すべての実験で、マウスはＰ５０からＰ６０の間であった。ＣＡ１介在ニューロンから安定した電圧クランプ記録を取得した後、記録を電流クランプモードに切り替え、過分極および脱分極電流の注入ステップを用いて、公表された発火パターンおよび活動電位（ＡＰ）特性（Ｂｕｔｔら，２００５；ＦｌａｍｅｓおよびＭａｒｉｎ，２００５）を利用して記録されている細胞のクラスを決定した。続いて、記録を電圧クランプモード（保持電位、－６０ｍＶ）に切り替えてｓＩＰＳＣを記録した。自発性ＩＰＳＣは、２０μＭの６，７－ジニトロキノキサリン－２，３－ジオン（ＤＮＱＸ、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソキサゾールプロピオン酸［ＡＭＰＡ］受容体ブロッカー）および５０μＭのｄ－２－アミノ－５－ホスホノ吉草酸（ｄ－ＡＰＶ、ＮＭＤＡ受容体ブロッカー；Ｓｉｇｍａ）を含むＡＣＳＦでスライスを灌流することによって薬理学的に単離した。記録はすべて３２℃で取得した。電圧クランプ記録は１ｋＨｚでローパスフィルターを、６０Ｈｚでバンドパスフィルターをかけた（Ｈｕｍ Ｂｕｇ；ＡｕｔｏＭａｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州バークレー）。ホールセルのアクセス抵抗と保持電流を継続的にモニタリングし、記録が安定していることを確認した。すべての記録は、まず対照条件下で行い、次いで浴液中で１０μＭのＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の存在下で行った。
【0143】
ｉｎ ｖｉｔｒｏパッチクランプ記録
マウスにケタミン／キシラジン（１００／１３ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与し、氷冷液（ＮａＣｌ ８７ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２５ｍＭ、ＫＣｌ ２．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４ １．２５ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、スクロース７５ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．５ｍＭ、およびＭｇＣｌ２ ７ｍＭ（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で通気）を含有）を心内灌流した。ＰＦＣの３００μｍ厚の前頭切片をビブラトームで作製し、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）（ＮａＣｌ １２５ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２５ｍＭ、ＫＣｌ ２．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４ １．２５ｍＭ、グルコース２５ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２ｍＭ、およびＭｇＣｌ２ １ｍＭ（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で通気）を含有）中に、最初に３４℃で３０分間、次いで室温で保管した。パッチクランプ記録では、ホウケイ酸ガラス管から引いて、セシウム系のピペット溶液（ＣｓＣｌ ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ、Ｎａ２ＡＴＰ ２ｍＭ、ＱＸ－３１４ １ｍＭ、ヘペス１０ｍＭ、ＴＥＡＣｌ ８ｍＭ、グルコン酸セシウム（Ｃｓ－Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）１１０ｍＭを含有）を満たしたピペットを使用し、特徴的な細胞体の形状から識別される錐体ニューロンを対象とした。記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ増幅器を電圧クランプモードで使用し、３０～３４℃で行った。自発性興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）を分離するために、静止膜電位を－７０ｍＶに保持した（抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）の逆転電位）。自発性ＩＰＳＣを記録するために、細胞は０ｍＶに保持した（ＥＰＳＣの逆転電位）。ＩＰＳＣとＥＰＳＣはともに、１０μＭのδ－バレロベタインでプレインキュベーションしたスライス、またはＡＣＳＦで保存した対照スライスで、同じニューロンから記録された。自発性イベントは、ローパスフィルターをかけたデータ（＜１ｋＨｚ）から視覚的に同定した。振幅は平均的なイベントから測定した。
マウスにケタミン／キシラジン（１００／１３ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与し、氷冷液（ＮａＣｌ ８７ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２５ｍＭ、ＫＣｌ ２．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４ １．２５ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、スクロース７５ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．５ｍＭ、およびＭｇＣｌ２ ７ｍＭ（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で通気）を含有）を心内灌流した。ＰＦＣの３００μｍ厚の前頭切片をビブラトームで作製し、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）（ＮａＣｌ １２５ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２５ｍＭ、ＫＣｌ ２．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４ １．２５ｍＭ、グルコース２５ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２ｍＭ、およびＭｇＣｌ２ １ｍＭ（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で通気）を含有）中に、最初に３４℃で３０分間、次いで室温で保管した。パッチクランプ記録では、ホウケイ酸ガラス管から引いて、セシウム系のピペット溶液（ＣｓＣｌ ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ、Ｎａ２ＡＴＰ ２ｍＭ、ＱＸ－３１４ １ｍＭ、ヘペス１０ｍＭ、ＴＥＡＣｌ ８ｍＭ、グルコン酸セシウム（Ｃｓ－Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）１１０ｍＭを含有）を満たしたピペットを使用し、特徴的な細胞体の形状から識別される錐体ニューロンを対象とした。記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ増幅器を電圧クランプモードで使用し、３０～３４℃で行った。自発性興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）を分離するために、静止膜電位を－７０ｍＶに保持した（抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）の逆転電位）。自発性ＩＰＳＣを記録するために、細胞は０ｍＶに保持した（ＥＰＳＣの逆転電位）。ＩＰＳＣとＥＰＳＣはともに、１０μＭのδ－バレロベタインでプレインキュベーションしたスライス、またはＡＣＳＦで保存した対照スライスで、同じニューロンから記録された。自発性イベントは、ローパスフィルターをかけたデータ（＜１ｋＨｚ）から視覚的に同定した。振幅は平均的なイベントから測定した。
【0144】
ｉｎ ｖｉｖｏ電気生理学的手法
局所フィールド電位は、自由行動マウスで、術後２～２１日目に無線増幅器システム（Ｗ４、Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてサンプリングレート２ｋＨｚで、または有線記録システム（ＲＨＤ２０００、Ｉｎｔａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンプリングレート１０ｋＨｚ）で記録した。単一ユニット活動は３２チャンネル増幅器システム（ＲＨＤ２０００、Ｉｎｔａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２０～３０ｋＨｚで記録した。最後の記録セッションの後、マウスにウレタン（２ｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して深い麻酔をかけた。記録位置を特定するため、各電極に短時間（約１秒）１０～２０Ｖを印加して電解病変を作製した。マウスはリン酸緩衝生理食塩水（約１分）に続いて４％パラホルムアルデヒド（約１０分）で心内灌流した。脳を切片化し（スライス厚１００～２００μｍ）、光学顕微鏡で検査した。脳の一部をクレシルバイオレットまたは４’，６’－ジアミジノ－２－フェニルインドールで染色した。ｍＰＦＣの前辺縁または下辺縁皮質に位置する記録領域のみが解析対象とした。
局所フィールド電位は、自由行動マウスで、術後２～２１日目に無線増幅器システム（Ｗ４、Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてサンプリングレート２ｋＨｚで、または有線記録システム（ＲＨＤ２０００、Ｉｎｔａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンプリングレート１０ｋＨｚ）で記録した。単一ユニット活動は３２チャンネル増幅器システム（ＲＨＤ２０００、Ｉｎｔａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２０～３０ｋＨｚで記録した。最後の記録セッションの後、マウスにウレタン（２ｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して深い麻酔をかけた。記録位置を特定するため、各電極に短時間（約１秒）１０～２０Ｖを印加して電解病変を作製した。マウスはリン酸緩衝生理食塩水（約１分）に続いて４％パラホルムアルデヒド（約１０分）で心内灌流した。脳を切片化し（スライス厚１００～２００μｍ）、光学顕微鏡で検査した。脳の一部をクレシルバイオレットまたは４’，６’－ジアミジノ－２－フェニルインドールで染色した。ｍＰＦＣの前辺縁または下辺縁皮質に位置する記録領域のみが解析対象とした。
【0145】
数日間記録室に馴化させた後、３２チャンネル増幅器（Ｉｎｔａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３０ｋＨｚのサンプリング周波数で単一ユニット記録を実施した。馴化期間中、電極は１日に１００μｍずつＰＦＣ（ＤＶ－２／－２．１）に下降させた。最初に、マウスがホームケージ内で完全に不動で、ＰＦＣの局所フィールド電位に徐波活動が見られるエポックとして、睡眠中のベースラインを記録した。このとき、マウスのホームケージのビデオ記録と、増幅器に取り付けた３軸加速度計を用いて、不動時間を抽出した。３０分後、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した５ｍｇ／ｋｇのδ－バレロベタイン、または滅菌ＰＢＳ（対照）をマウスに腹腔内投与し、ホームケージに戻した。投与後５０分から９０分の間に記録を継続し、δ－バレロベタインがｍＰＦＣの集団活動に及ぼす影響を評価した。記録後、マイクロドライブを進め、次の記録日に独立したユニット群から記録した。記録２日目には、δ－バレロベタインとＰＢＳの投与をマウス間で入れ替えて実験を繰り返した。最後の記録セッションの後、マウスはＰＢＳに続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、４％）で心内灌流した。４％ＰＦＡで一晩後固定した後、１００μｍの前頭切片をビブラトームで切り出し、ＤＡＰＩで染色してＰＦＣの記録部位を同定した。
【0146】
スパイクソーティングと単一ユニットデータ解析
アーチファクトを含む記録部分は手作業で識別して除去した。無作為に選択した８～１０チャンネルの平均値として計算した共通の平均値を、すべてのチャンネルから差し引いた。ＭｏｕｎｔａｉｎＳｏｒｔを用いて、０．３～６ｋＨｚのバンドパスフィルターをかけたデータから単一ユニットをクラスタリングした。得られたクラスターは、きれいなスパイク形状と明確な不応期を持つ自己相関図に基づいて手動でキュレーションした。さらに、発火率が０．５Ｈｚ超のユニットのみを、さらなる解析のために保持した。発火率は、解析した行動エピソード中のスパイクの総数を持続時間で割った値から推定した。集団の同期性を定量化するために、各時点における任意のユニットのレート変化と正規化した集団発火率とを比較する測定基準を利用した。まず、各記録セッションについて、同時に記録されたユニットの平均正規化発火率を１００ミリ秒ビンで合計することにより、集団活動ベクトルを作成した。次に、発火率と集団の比率の積の和を各ビンの発火率の和で割ることにより、各ユニットの集団結合を定量化した。最後に、各ユニットについて、δ－バレロベタインまたはＰＢＳの投与前後の集団結合の測定値をそれぞれ引くことにより、集団結合の変化を定量化した。
アーチファクトを含む記録部分は手作業で識別して除去した。無作為に選択した８～１０チャンネルの平均値として計算した共通の平均値を、すべてのチャンネルから差し引いた。ＭｏｕｎｔａｉｎＳｏｒｔを用いて、０．３～６ｋＨｚのバンドパスフィルターをかけたデータから単一ユニットをクラスタリングした。得られたクラスターは、きれいなスパイク形状と明確な不応期を持つ自己相関図に基づいて手動でキュレーションした。さらに、発火率が０．５Ｈｚ超のユニットのみを、さらなる解析のために保持した。発火率は、解析した行動エピソード中のスパイクの総数を持続時間で割った値から推定した。集団の同期性を定量化するために、各時点における任意のユニットのレート変化と正規化した集団発火率とを比較する測定基準を利用した。まず、各記録セッションについて、同時に記録されたユニットの平均正規化発火率を１００ミリ秒ビンで合計することにより、集団活動ベクトルを作成した。次に、発火率と集団の比率の積の和を各ビンの発火率の和で割ることにより、各ユニットの集団結合を定量化した。最後に、各ユニットについて、δ－バレロベタインまたはＰＢＳの投与前後の集団結合の測定値をそれぞれ引くことにより、集団結合の変化を定量化した。
【0147】
データ解析
ＬＦＰデータは、Ｐｙｔｈｏｎ２．７ Ｓｐｙｄｅｒ ＩＤＥで動作するビルトインおよびカスタムメイドのルーチンで解析した。各マウスのＬＦＰ生データは、ＬＦＰの平均値を引き、信号の標準偏差で割ることによってＺスコアに変換した。
ＬＦＰデータは、Ｐｙｔｈｏｎ２．７ Ｓｐｙｄｅｒ ＩＤＥで動作するビルトインおよびカスタムメイドのルーチンで解析した。各マウスのＬＦＰ生データは、ＬＦＰの平均値を引き、信号の標準偏差で割ることによってＺスコアに変換した。
【0148】
データおよび統計解析
データは平均値±ＳＥＭとして表される。統計解析はＰｒｉｓｍ７．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。２群間の平均は、対応のないスチューデントの両側ｔ検定で比較した。複数群の平均値の相互比較、または１つの対照群に対する比較は、一元配置分散分析およびボンフェローニの事後検定で分析した。実施したすべての電気生理学的手法および行動実験は、無作為化かつ盲検化された方法で行った。
データは平均値±ＳＥＭとして表される。統計解析はＰｒｉｓｍ７．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。２群間の平均は、対応のないスチューデントの両側ｔ検定で比較した。複数群の平均値の相互比較、または１つの対照群に対する比較は、一元配置分散分析およびボンフェローニの事後検定で分析した。実施したすべての電気生理学的手法および行動実験は、無作為化かつ盲検化された方法で行った。
【0149】
組織学的検査と免疫蛍光法
マウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で致死的に麻酔した後、１ｘＰＢＳで左心腔内を灌流した。組織学的検査のために、脳を４％ＰＦＡ中で一晩保持した。次いで、脳を３０％スクロース中で脱水し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．ＴＭ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨ）に埋め込んだ。脳組織から１４μｍ厚の凍結切片を滑走式ミクロトーム（ＳＭ２０００Ｒ，Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で切り出し、抗Ｉｂａ－１（１：５００，Ｗａｋｏ）を用いて４℃で２４時間、続いて１：５００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８共役二次抗体を用いて室温で２時間免疫標識した。核はＤＡＰＩで対比染色した。老齢マウスの組織の自家蛍光を除去するために、スライドをＴｒｕｅＢｌａｃｋリポフスチン自家蛍光クエンチャーで処理した。カバースリップはＰｒｏＬｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてマウントした。蛍光イメージングはＢＺ－９０００ Ｂｉｏｒｅｖｏ顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて行った。Ｉｂａ－１＋ ＤＡＰＩ＋細胞はＩｍａｇｅＪ（ｖ．１．５３ｃ）を用いて定量した。
マウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で致死的に麻酔した後、１ｘＰＢＳで左心腔内を灌流した。組織学的検査のために、脳を４％ＰＦＡ中で一晩保持した。次いで、脳を３０％スクロース中で脱水し、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．ＴＭ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨ）に埋め込んだ。脳組織から１４μｍ厚の凍結切片を滑走式ミクロトーム（ＳＭ２０００Ｒ，Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で切り出し、抗Ｉｂａ－１（１：５００，Ｗａｋｏ）を用いて４℃で２４時間、続いて１：５００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８共役二次抗体を用いて室温で２時間免疫標識した。核はＤＡＰＩで対比染色した。老齢マウスの組織の自家蛍光を除去するために、スライドをＴｒｕｅＢｌａｃｋリポフスチン自家蛍光クエンチャーで処理した。カバースリップはＰｒｏＬｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてマウントした。蛍光イメージングはＢＺ－９０００ Ｂｉｏｒｅｖｏ顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて行った。Ｉｂａ－１＋ ＤＡＰＩ＋細胞はＩｍａｇｅＪ（ｖ．１．５３ｃ）を用いて定量した。
【0150】
フローサイトメトリー（微生物負荷）
糞便試料をＳＰＦおよびＡＢＸ処理マウスから採取し、重量を測定した後、直ちに氷冷１ｘＰＢＳ中でホモジナイズし、５０μｍのＣｅｌｌＴｒｉｃｓフィルター（Ｓｙｓｍｅｘ）でろ過した。ろ液の画分を１ｘＰＢＳで１：２０に希釈し、５分間、３０００ｇ、４℃で遠心分離を行った。続いて、上澄みを吸引し、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌を識別する色素Ｓｙｔｏ９（ＰＢＳ中１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にペレットを再懸濁し、４℃で１０分間インキュベートした。ＤＡＰＩ（１：１０００）を用いて死細胞を排除し、生細菌の割合を記録した。フローサイトメトリー細胞計数ビーズ（１：２０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を添加し、糞便試料１ｍｇ当たりの生菌の絶対量を定量した。
糞便試料をＳＰＦおよびＡＢＸ処理マウスから採取し、重量を測定した後、直ちに氷冷１ｘＰＢＳ中でホモジナイズし、５０μｍのＣｅｌｌＴｒｉｃｓフィルター（Ｓｙｓｍｅｘ）でろ過した。ろ液の画分を１ｘＰＢＳで１：２０に希釈し、５分間、３０００ｇ、４℃で遠心分離を行った。続いて、上澄みを吸引し、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌を識別する色素Ｓｙｔｏ９（ＰＢＳ中１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にペレットを再懸濁し、４℃で１０分間インキュベートした。ＤＡＰＩ（１：１０００）を用いて死細胞を排除し、生細菌の割合を記録した。フローサイトメトリー細胞計数ビーズ（１：２０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を添加し、糞便試料１ｍｇ当たりの生菌の絶対量を定量した。
【0151】
科学文献
Ａｈｌｕｗａｌｉａ，Ｖ．，Ｂｅｔｒａｐａｌｌｙ，Ｎ．Ｓ．，Ｈｙｌｅｍｏｎ，Ｐ．Ｂ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ｂ．，Ｇｉｌｌｅｖｅｔ，Ｐ．Ｍ．，Ｕｎｓｅｒ，Ａ．Ｂ．，Ｆａｇａｎ，Ａ．，Ｄａｉｔａ，Ｋ．，Ｈｅｕｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｇｕｔ－Ｌｉｖｅｒ－Ｂｒａｉｎ Ａｘｉｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ６，２６８００．
Ａｎｔｕｎｅｓ，Ｍ．＆Ｂｉａｌａ，Ｇ．Ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｏｂｊｅｃｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｅｍｏｒｙ：ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｔｅｓｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｏｇｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ１３，９３－１１０，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０３３９－０１１－０４３０－ｚ（２０１２）．
Ａｖｅｒｂｅｃｋ，Ｂ．Ｂ．，Ｌａｔｈａｍ，Ｐ．Ｅ．＆Ｐｏｕｇｅｔ，Ａ．Ｎｅｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ，ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ７，３５８－３６６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎ１８８８（２００６）．
Ｂｅｒｃｉｋ，Ｐ．，Ｄｅｎｏｕ，Ｅ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｗ．，Ｌｕ，Ｊ．，Ｊｕｒｙ，Ｊ．，Ｄｅｎｇ，Ｙ．，Ｂｌｅｎｎｅｒｈａｓｓｅｔｔ，Ｐ．，Ｍａｃｒｉ，Ｊ．，ＭｃＣｏｙ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｆｆｅｃｔ ｃｅｎｔｒａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１４１，５９９－６０９，６０９ｅ５９１－５９３． Ｂｉａｇｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ａｇｅｉｎｇ，ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ：ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｓｅｎｉｏｒｓ ａｎｄ ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ５，ｅ１０６６７，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１０６６７（２０１０）．
Ｂｌａｎｋ，Ｔ．，Ｇｏｌｄｍａｎｎ，Ｔ．＆Ｐｒｉｎｚ，Ｍ．Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｆｕｅｌ ｔｈｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｂｒａｉｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ３５，１３９－１４０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｔ．２０１４．０２．００５（２０１４）．
Ｂｒａｎｉｓｔｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ６，２６３ｒａ１５８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００９７５９（２０１４）
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Ｄａｍ，Ｓ．Ａ．，Ｍｏｓｔｅｒｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｚｏｐｉｎｓｋａ－Ｔｏｋｏｖ，Ｊ．Ｗ．，Ｂｌｏｅｍｅｎｄａａｌ，Ｍ．，Ａｍａｔｏ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｒｉａｓ－Ｖａｓｑｕｅｚ，Ａ．（２０１９）．Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｕｔ－Ｂｒａｉｎ Ａｘｉｓ ｉｎ Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ－Ｄｅｆｉｃｉｔ／Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ４８，４０７－４３１．
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Ｇａｚｚａｌｅｙ，Ａ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｉｓｓｍａｎ，Ｊ．＆Ｄ’Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｍ．Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｅｍｏｒｙ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｇｉｎｇ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ８，１２９８－１３００，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ１５４３（２００５）．
Ｇｏｏｓｓｅｎｓ，Ｔ．，Ｖｅｒｃａｍｍｅｎ，Ｃ．，Ｗｏｕｔｅｒｓ，Ｊ．＆ｖａｎ Ｗｉｅｒｉｎｇｅｎ，Ａ．Ａｇｉｎｇ Ａｆｆｅｃｔｓ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｐｅｅｃｈ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ８，１３３，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎａｇｉ．２０１６．００１３３（２０１６）．
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Ｊｅｒｍａｋｏｗｉｃｚ，Ｗ．Ｊ．＆Ｃａｓａｇｒａｎｄｅ，Ｖ．Ａ．Ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ａ ｃｅｎｔｕｒｙ ａｆｔｅｒ Ｃａｊａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ５５，２６４－２８４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｒａｉｎｒｅｓｒｅｖ．２００７．０６．００３（２００７）．
Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｙｏｏ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄＫｉｍ，Ｗ．Ｕ．（２０１６）．Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ３９，１５６５－１５７６．
Ｌｅｃｌｅｒｃｑ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ， ｇｕｔ－ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ，ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１１，Ｅ４４８５－４４９３，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４１５１７４１１１（２０１４）．
Ｋｈｏｓｒａｖｉ，Ａ．，Ｙａｎｅｚ，Ａ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｈｏｗ， Ａ．， Ｍｅｒａｄ，Ｍ．，Ｇｏｏｄｒｉｄｇｅ，Ｈ．Ｓ．，ａｎｄ Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｋ．（２０１４）．Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｐｒｏｍｏｔｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ１５，３７４－３８１．
Ｋｌａｕｓｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｏｍｏｇｙｉ，Ｐ．（２００８）．Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ：ｔｈｅ ｕｎｉｔｙ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｃｉｒｃｕｉｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２１，５３－５７．
Ｋｎｏｒｒ，Ｓ．，Ｓｉｎｎ，Ｍ．，Ｇａｌｅｔｓｋｉｙ，Ｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｎ．，Ｍａｙａｎｓ，Ｏ．，Ｓｃｈｌｅｈｅｃｋ，Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｒｔｉｇ，Ｊ．Ｓ．（２０１８）．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｖｉａ ｇｌｕｔａｒａｔｅ ａｎｄ Ｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ９，５０７１．
Ｋｏｅｔｈ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ｇａｍｍａ－Ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ ｉｓ ａ ｐｒｏａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｔｏ ＴＭＡＯ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ２０，７９９－８１２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｍｅｔ．２０１４．１０．００６（２０１４）．
Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｏ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｇｌｙｃｉｎｅ ｂｅｔａｉｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｌｏｎｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ７，１０３，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ４０１６８－０１９－０７１８－２（２０１９）．
Ｌａｎｇｉｌｌｅ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｈｉｆｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｇｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｇｕｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ２，５０，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ４０１６８－０１４－００５０－９（２０１４）．
Ｌａｗｔｏｎ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｌｔｈ，ｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｆｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｗｉｓｈ ｔｏ ｌｉｖｅ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ３９，４０６－４１６，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｇｅｒｏｎｔ／３９．４．４０６（１９９９）．
Ｌｏｎｇ，Ｔ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｍ．，Ｙｕ，Ｈ．Ｃ．，Ｂｉｇｇｓ，Ｗ．Ｈ．，Ｋｉｒｋｎｅｓｓ，Ｅ．Ｆ．，Ｍｅｎｎｉ，Ｃ．，Ｚｉｅｒｅｒ，Ｊ．，Ｓｍａｌｌ，Ｋ．Ｓ．，Ｍａｎｇｉｎｏ，Ｍ．，Ｍｅｓｓｉｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｃｏｍｍｏｎ－ｔｏ－ｒａｒｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４９，５６８－５７８．
Ｍａｃｌｉｎ，Ｊ．Ｍ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．，ａｎｄ Ｘｉａｏ，Ｓ．（２０１９）．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ，ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ．Ｇｅｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ３２，ｅ１０００５４．
Ｍａｒｔｉｎｅｚ－ｄｅｌ Ｃａｍｐｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｔｈａｔ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｈｏｌｉｎｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｂａｃｔｅｒｉａ．ｍＢｉｏ６，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．０００４２－１５（２０１５）．
Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｓｈｏｊｉ，Ｈ．，Ｔａｎａｋａ，Ｙ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｗ．，ａｎｄ Ｔａｂｉｒａ，Ｔ．（２００９）．Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐａｔｉａｌ ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｅｍｏｒｙ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１６２，１１９２－１２０１．
Ｍｏｒｉｃｉ，Ｊ．Ｆ．，Ｂｅｋｉｎｓｃｈｔｅｉｎ，Ｐ．＆Ｗｅｉｓｓｔａｕｂ，Ｎ．Ｖ．Ｍｅｄｉａｌ ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ２９２，２４１－２５１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒ．２０１５．０６．０３０（２０１５）．
Ｎｙｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｌｏｖｄｅｎ，Ｍ．，Ｒｉｋｌｕｎｄ，Ｋ．，Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ Ｂａｃｋｍａｎ，Ｌ．（２０１２）．Ｍｅｍｏｒｙ ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｏｇｎ Ｓｃｉ１６，２９２－３０５．
Ｏｋｕｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｖｅｒｓｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｔｏ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｎｓｏｒｙ ｃｏｒｔｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ５２１，５１１－５１５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２７３（２０１５）．
Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｐｒｏｍｏｔｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｙｎａｐｓｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ１５５，１５９６－１６０９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．１１．０３０（２０１３）．
Ｐｒｅｚｉｏｓｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｐｉｋｅ－ｔｉｍｉｎｇ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐａｓｓｉｖｅｌｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｅｍｒｉｓｔｉｖｅ ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ９，５３１１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０７７５７－ｙ（２０１８）．
Ｒｈｅｅ，Ｓ．Ｈ．，Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ，Ｃ．，ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．（２００９）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ－ｇｕｔ－ｅｎｔｅｒｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｘｉｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ６，３０６－３１４．
Ｒｏｌｌｓ，Ｅ．Ｔ．，Ｔｒｅｖｅｓ，Ａ．＆Ｔｏｖｅｅ，Ｍ．Ｊ．Ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｏｆ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｖｉｓｕａｌ ｃｏｒｔｅｘ．Ｅｘｐ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ１１４，１４９－１６２，ｄｏｉ：１０．１００７／ｐｌ００００５６１５（１９９７）．
Ｓａｊｉ，Ｎ．，Ｎｉｉｄａ，Ｓ．，Ｍｕｒｏｔａｎｉ，Ｋ．，Ｈｉｓａｄａ，Ｔ．，Ｔｓｕｄｕｋｉ，Ｔ．，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．，Ｔｏｂａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｓａｋｕｒａｉ，Ｔ．（２０１９）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ａｎｄ ｄｅｍｅｎｔｉａ：ａ ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｉｎ Ｊａｐａｎ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ９，１００８．
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｒｕｂａｃｋ，Ｓ．，Ｋｉｕｐａｋｉｓ，Ａ．Ｋ．，Ｋａｓｂａｒｉａｎ，Ｈ．，Ｐｙｂｕｓ，Ｃ．，ａｎｄ Ｒｅｉｔｚｅｒ，Ｌ．（２００２）．Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇａｂＤＴＰＣ ｏｐｅｒｏｎ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｍｍａ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１８４，６９７６－６９８６．
Ｓｅｒｖｉｌｌｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｒｕｍｉｎａｎｔ ｍｅａｔ ａｎｄ ｍｉｌｋ ｃｏｎｔａｉｎ ｄｅｌｔａ－ｖａｌｅｒｏｂｅｔａｉｎｅ，ａｎｏｔｈｅｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ Ｎ－ｏｘｉｄｅ（ＴＭＡＯ）ｌｉｋｅ ｇａｍｍａ－ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ２６０，１９３－１９９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｏｏｄｃｈｅｍ．２０１８．０３．１１４（２０１８）．
Ｓｈｅｎ，Ｔ．Ｃ．，Ａｌｂｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｂｉｔｔｉｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｃｈｅｈｏｕｄ，Ｃ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｙ．，Ｊｕｄｇｅ，Ｃ．Ａ．，Ｃｈａｕ，Ｌ．，Ｎｉ，Ｊ．，Ｓｈｅｎｇ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１２５，２８４１－２８５０．
Ｓｈｅｗ，Ｗ．Ｌ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｙｕ，Ｓ．，Ｒｏｙ，Ｒ．＆Ｐｌｅｎｚ，Ｄ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｒｅ ｍａｘｉｍｉｚｅｄ ｉｎ ｂａｌａｎｃｅｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｖａｌａｎｃｈｅｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ３１，５５－６３，ｄｏｉ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．４６３７－１０．２０１１（２０１１）．
Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｙ．，Ｆａｕｍａｎ，Ｅ．Ｂ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ａ．Ｋ．，Ｋｒｕｍｓｉｅｋ，Ｊ．，Ｓａｎｔｏｓ，Ｒ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．，Ａｒｎｏｌｄ，Ｍ．，Ｅｒｔｅ，Ｉ．，Ｆｏｒｇｅｔｔａ，Ｖ．，Ｙａｎｇ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ａｎ ａｔｌａｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４６，５４３－５５０．
Ｓｐｏｗａｒｔ－Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｌ．＆ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔａａｙ，Ｆ．Ｊ．Ｔｈｅ Ｔ－ｍａｚｅ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｔａｓｋ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５１，３７－４６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒ．２００３．０８．００４（２００４）．
Ｓｕｎ，Ｊ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｌｉｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｇｏｎｇ，Ｔ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．，Ｙｅ，Ｓ．，Ｙｅ，Ｋ．，Ｗｅｉ，Ｄ．，Ｓｏｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｌｌｅｖｉａｔｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ－ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ＡＰＰ／ＰＳ１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｔｒａｎｓｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ９，１８９．
Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｙ．＆Ｃｌｏｐａｔｈ，Ｃ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｔｈｅ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｔｉｍｕｌｕｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｅｌｉｆｅ９，ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．５６０５３（２０２０）．
Ｖａａｄｉａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｏｎｋｅｙ ｃｏｒｔｅｘ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｅｖｅｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ３７３，５１５－５１８，ｄｏｉ：１０．１０３８／３７３５１５ａ０（１９９５）．
Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｂｏｅｓｍａｎｓ，Ｌ．＆Ｂｏｅｔｓ，Ｅ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ，ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｏｒ ｆａｅｃａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ？Ｐｒｏｃ Ｎｕｔｒ Ｓｏｃ７３，４９０－４９７，ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ００２９６６５１１４０００６３９（２０１４）．
Ｗｕ，Ｙ．，Ｄｉｓｓｉｎｇ－Ｏｌｅｓｅｎ，Ｌ．，ＭａｃＶｉｃａｒ，Ｂ．Ａ．＆Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｂ．Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ：Ｄｙｎａｍｉｃ Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ３６，６０５－６１３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｔ．２０１５．０８．００８ （２０１５）．
Ｙａｎｇ，Ｙ．＆Ｍａｉｌｍａｎ，Ｒ．Ｂ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｉｎ ｍｅｄｉａｌ ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔ－ｍａｚｅ．Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ３４３，５０－６０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒ．２０１８．０１．０２０（２０１８）.
Ｚｈａｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＴＭＡＶＡ，ａ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，Ｉｓ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ Ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ，Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｇａｍｍａ－Ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ａｎｄ Ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ ｉｎ Ｍｉｃｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１５８，２２６６－２２８１ ｅ２２２７，ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０２０．０２．０３３（２０２０）．
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Ｂｅｒｃｉｋ，Ｐ．，Ｄｅｎｏｕ，Ｅ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｗ．，Ｌｕ，Ｊ．，Ｊｕｒｙ，Ｊ．，Ｄｅｎｇ，Ｙ．，Ｂｌｅｎｎｅｒｈａｓｓｅｔｔ，Ｐ．，Ｍａｃｒｉ，Ｊ．，ＭｃＣｏｙ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｆｆｅｃｔ ｃｅｎｔｒａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１４１，５９９－６０９，６０９ｅ５９１－５９３． Ｂｉａｇｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ａｇｅｉｎｇ，ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ：ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔａｔｕｓ ｉｎ ｓｅｎｉｏｒｓ ａｎｄ ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ５，ｅ１０６６７，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１０６６７（２０１０）．
Ｂｌａｎｋ，Ｔ．，Ｇｏｌｄｍａｎｎ，Ｔ．＆Ｐｒｉｎｚ，Ｍ．Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｆｕｅｌ ｔｈｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｂｒａｉｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ３５，１３９－１４０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｔ．２０１４．０２．００５（２０１４）．
Ｂｒａｎｉｓｔｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ６，２６３ｒａ１５８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００９７５９（２０１４）
Ｂｕｔｔ，Ｓ．Ｊ．，Ｆｕｃｃｉｌｌｏ，Ｍ．，Ｎｅｒｙ，Ｓ．，Ｎｏｃｔｏｒ，Ｓ．，Ｋｒｉｅｇｓｔｅｉｎ，Ａ．，Ｃｏｒｂｉｎ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄ Ｆｉｓｈｅｌｌ，Ｇ．（２００５）．Ｔｈｅ ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｎｄ ｓｐａｔｉａｌ ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｈｅｉｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｔｙｐｅ．Ｎｅｕｒｏｎ４８，５９１－６０４．
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Ｃａｓｐａｎｉ，Ｇ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｓ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｗａｎｎ，Ｊ．（２０１９）．Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ６，４５４－４８１．
Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．Ｒ．＆Ｋｏｈｎ，Ａ．Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１４，８１１－８１９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．２８４２（２０１１）．
Ｃｏｕｒｔｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ ｓｈａｐｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｄｒｉｖｅ ｆｅａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ５０５，９２－９６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２７５５（２０１４）．
Ｄａｇｈｅｒ，Ｎ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｐｌａｑｕｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ３ｘＴｇ－ＡＤ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ１２，１３９，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９７４－０１５－０３６６－９（２０１５）
Ｄａｉ，Ｚ．Ｌ．，Ｗｕ，Ｇ．，ａｎｄ Ｚｈｕ，Ｗ．Ｙ．（２０１１）．Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｌｉｎｋｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｕｔ ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｈｅａｌｔｈ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ（Ｌａｎｄｍａｒｋ Ｅｄ）１６，１７６８－１７８６．
Ｄａｍ，Ｓ．Ａ．，Ｍｏｓｔｅｒｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｚｏｐｉｎｓｋａ－Ｔｏｋｏｖ，Ｊ．Ｗ．，Ｂｌｏｅｍｅｎｄａａｌ，Ｍ．，Ａｍａｔｏ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｒｉａｓ－Ｖａｓｑｕｅｚ，Ａ．（２０１９）．Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｕｔ－Ｂｒａｉｎ Ａｘｉｓ ｉｎ Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ－Ｄｅｆｉｃｉｔ／Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ４８，４０７－４３１．
Ｄｅｊｅａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｅａｒ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ．Ｎａｔｕｒｅ５３５，４２０－４２４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１８６３０（２０１６）．
Ｅｒｎｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｈｏｓｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｃｏｎｓｔａｎｔｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｉｎ ｔｈｅ ＣＮＳ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１８，９６５－９７７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．４０３０（２０１５）
Ｆｌａｍｅｓ，Ｎ．， ａｎｄ Ｍａｒｉｎ，Ｏ．（２００５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｎｅｕｒｏｎ４６，３７７－３８１．
Ｆｒｉｅｓ，Ｐ．（２０１５）．Ｒｈｙｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ．Ｎｅｕｒｏｎ８８，２２０－２３５．
Ｇａｚｚａｌｅｙ，Ａ．，Ｃｏｏｎｅｙ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｉｓｓｍａｎ，Ｊ．＆Ｄ’Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｍ．Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｔ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｅｍｏｒｙ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｇｉｎｇ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ８，１２９８－１３００，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ１５４３（２００５）．
Ｇｏｏｓｓｅｎｓ，Ｔ．，Ｖｅｒｃａｍｍｅｎ，Ｃ．，Ｗｏｕｔｅｒｓ，Ｊ．＆ｖａｎ Ｗｉｅｒｉｎｇｅｎ，Ａ．Ａｇｉｎｇ Ａｆｆｅｃｔｓ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｐｅｅｃｈ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ８，１３３，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎａｇｉ．２０１６．００１３３（２０１６）．
Ｇｒａｄｙ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｅｍｏｒｙ ｄｕｅ ｔｏ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９，２１８－２２１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．７６１８０８２（１９９５）．
Ｇｒｅｎｈａｍ，Ｓ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｇ．，Ｃｒｙａｎ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ Ｄｉｎａｎ，Ｔ．Ｇ．（２０１１）．Ｂｒａｉｎ－ｇｕｔ－ｍｉｃｒｏｂｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ２，９４．
Ｊｅｒｍａｋｏｗｉｃｚ，Ｗ．Ｊ．＆Ｃａｓａｇｒａｎｄｅ，Ｖ．Ａ．Ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ａ ｃｅｎｔｕｒｙ ａｆｔｅｒ Ｃａｊａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ５５，２６４－２８４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｒａｉｎｒｅｓｒｅｖ．２００７．０６．００３（２００７）．
Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｙｏｏ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄＫｉｍ，Ｗ．Ｕ．（２０１６）．Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ３９，１５６５－１５７６．
Ｌｅｃｌｅｒｃｑ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ， ｇｕｔ－ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ，ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１１，Ｅ４４８５－４４９３，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１４１５１７４１１１（２０１４）．
Ｋｈｏｓｒａｖｉ，Ａ．，Ｙａｎｅｚ，Ａ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｈｏｗ， Ａ．， Ｍｅｒａｄ，Ｍ．，Ｇｏｏｄｒｉｄｇｅ，Ｈ．Ｓ．，ａｎｄ Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｋ．（２０１４）．Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｐｒｏｍｏｔｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ１５，３７４－３８１．
Ｋｌａｕｓｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｏｍｏｇｙｉ，Ｐ．（２００８）．Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ：ｔｈｅ ｕｎｉｔｙ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｃｉｒｃｕｉｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２１，５３－５７．
Ｋｎｏｒｒ，Ｓ．，Ｓｉｎｎ，Ｍ．，Ｇａｌｅｔｓｋｉｙ，Ｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｎ．，Ｍａｙａｎｓ，Ｏ．，Ｓｃｈｌｅｈｅｃｋ，Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｒｔｉｇ，Ｊ．Ｓ．（２０１８）．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｖｉａ ｇｌｕｔａｒａｔｅ ａｎｄ Ｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ９，５０７１．
Ｋｏｅｔｈ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ｇａｍｍａ－Ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ ｉｓ ａ ｐｒｏａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ Ｌ－ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｔｏ ＴＭＡＯ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ２０，７９９－８１２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｍｅｔ．２０１４．１０．００６（２０１４）．
Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ，Ｖ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｏ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｇｌｙｃｉｎｅ ｂｅｔａｉｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｌｏｎｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ７，１０３，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ４０１６８－０１９－０７１８－２（２０１９）．
Ｌａｎｇｉｌｌｅ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｈｉｆｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｇｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｇｕｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ２，５０，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ４０１６８－０１４－００５０－９（２０１４）．
Ｌａｗｔｏｎ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅａｌｔｈ，ｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｆｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｗｉｓｈ ｔｏ ｌｉｖｅ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ３９，４０６－４１６，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｇｅｒｏｎｔ／３９．４．４０６（１９９９）．
Ｌｏｎｇ，Ｔ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｍ．，Ｙｕ，Ｈ．Ｃ．，Ｂｉｇｇｓ，Ｗ．Ｈ．，Ｋｉｒｋｎｅｓｓ，Ｅ．Ｆ．，Ｍｅｎｎｉ，Ｃ．，Ｚｉｅｒｅｒ，Ｊ．，Ｓｍａｌｌ，Ｋ．Ｓ．，Ｍａｎｇｉｎｏ，Ｍ．，Ｍｅｓｓｉｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｃｏｍｍｏｎ－ｔｏ－ｒａｒｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４９，５６８－５７８．
Ｍａｃｌｉｎ，Ｊ．Ｍ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．，ａｎｄ Ｘｉａｏ，Ｓ．（２０１９）．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ，ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ．Ｇｅｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ３２，ｅ１０００５４．
Ｍａｒｔｉｎｅｚ－ｄｅｌ Ｃａｍｐｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｔｈａｔ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｈｏｌｉｎｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｂａｃｔｅｒｉａ．ｍＢｉｏ６，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．０００４２－１５（２０１５）．
Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｓｈｏｊｉ，Ｈ．，Ｔａｎａｋａ，Ｙ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｗ．，ａｎｄ Ｔａｂｉｒａ，Ｔ．（２００９）．Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐａｔｉａｌ ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｅｍｏｒｙ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１６２，１１９２－１２０１．
Ｍｏｒｉｃｉ，Ｊ．Ｆ．，Ｂｅｋｉｎｓｃｈｔｅｉｎ，Ｐ．＆Ｗｅｉｓｓｔａｕｂ，Ｎ．Ｖ．Ｍｅｄｉａｌ ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｂｅｈａｖ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ２９２，２４１－２５１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒ．２０１５．０６．０３０（２０１５）．
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【0152】
また、上述した発明は、以下の実施形態で説明されてもよい。
【0153】
実施形態１
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、
ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記濃度に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
を含む方法。
実施形態２
前記試料が、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料のうちの１つから選択される、実施形態１に記載の方法。
実施形態３
前記被験者は、ヒトである、実施形態１および２のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態４
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０５０μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態１～３のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態５
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前記前駆体が、５－アミノ吉草酸またはＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）のうちの１つから選択される、実施形態１～３のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６
５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０５０μＭ／ｇ尿中クレアチニン、またはＮε－トリメチルリシンの濃度が４～８μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態５に記載の方法。
実施形態７
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前記代謝物は、グルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンのうちの１つから選択される、実施形態１～３のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態８
グルタル酸の濃度が６～２４μＭ／ｇ尿中クレアチニン、血清中濃度が１０～２０μＭ、脳脊髄液濃度が１０～４０ｍＭ、または５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンの濃度が１．４～２μＭ／ｇ尿中クレアチニンおよび血清中濃度が０．１～０．３μＭである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態７に記載の方法。
実施形態９
前記濃度が、内部標準物質との比較、または代謝物標準物質との外部比較によって決定される、実施形態１～８のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１０
前記濃度は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはイムノアッセイのいずれかの方法を用いて決定される、実施形態１～９のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１１
前記ｃ）のステップが、前記ｂ）のステップの前記濃度を、対照データ、具体的には、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人の健常者の対照データの濃度と比較することを含む、実施形態１～１０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２
前記認知症が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、実施形態１～１１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、
ａ）第１の時点で被験者から第１の試料を入手すること；
ｂ）前記第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｃ）第２の時点で前記被験者から第２の試料を入手すること；
ｄ）前記第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｅ）前記ｂ）とｄ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
を含む方法。
実施形態１４
前記試料のうちの１つまたは複数は、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、唾液試料、尿試料、または便試料から選択される、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５
前記被験者は、ヒトである、実施形態１３および１４のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６
前記第１の時点と第２の時点が、約３～６カ月間隔てられている、実施形態１３～１５のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１７
前記第２の時点は、前記第１の時点の１２～２４週間後である、実施形態１３～１６のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１８
前記第２の時点は、前記第１の時点の３～６カ月後である、実施形態１３～１７のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１９
前記方法は、
ｆ）第３の時点で被験者から第３の試料を入手すること；
ｇ）前記第３の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｈ）前記ｂ）、ｄ）とｇ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
をさらに含む、実施形態１３～１８のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２０
前記第２の時点と第３の時点は、約６～１２カ月間隔てられている、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１
さらなる試料をさらなる時点で入手し、かつ前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率は、前記試料で測定した前記濃度の比較に基づく、実施形態１３～２０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２２
前記認知症は、加齢に伴う認知症または加齢に伴わない認知症である、実施形態１３～２１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２３
前記認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、実施形態１３～２２のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２４
前記濃度は、センサーまたは画像関連手法を用いて生体内で測定される、実施形態１３～２３のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２５
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、
ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、ファーミキューテス、およびバクテロイデスのいずれかの存在量を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記存在量に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することであって、特に、前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することが、ファーミキューテスとバクテロイデスの比率を比較することを含むこと
を含む方法。
実施形態２６
前記試料が、微生物試料、腸内細菌叢試料、腸試料、糞便試料、および／または便試料のうち１つまたは複数から選択される、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７
前記被験者は、ヒトである、実施形態２５および２６のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２８
前記コリネバクテリウムは、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ジェイケイウム、コリネバクテリウム・ウレアリティクム、およびコリネバクテリウム・エフィシエンスのうち１つまたは複数から選択される、実施形態２５～２７のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２９
前記オシリバクターは、オシリバクター・バレリシゲネスおよびオシリバクター属ＫＬＥ１７４５株から選択される、実施形態２５～２８のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３０
前記試料中の前記微生物叢の構成を決定する、実施形態２５～２９のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３１
腸メタゲノムを決定する、実施形態２５～３０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３２
前記方法は、前記被験者の前記試料の前記細菌の前記存在量または前記微生物叢の前記構成または前記腸メタゲノムを対照と比較することを含む、実施形態２５～３１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３３
前記対照は、１人または複数人の健常者のデータに基づく、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４
前記対照は、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人の健常者から決定される、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５
前記試料は、配列に基づく技術、ジェノタイピングアッセイ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長のクローンライブラリー、ＤＧＧＥ、Ｔ－ＲＦＬＰ、ＡＲＩＳＡ、マイクロアレイ、ＤＮＡハイブリダイゼーション法のいずれかの方法を用いて解析される、実施形態２５～３４のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３６
細菌の前記存在量は、懸濁液培養またはプレート培養、染色法、顕微鏡観察法、ＦＡＣＳなどのフローサイトメトリー法、光学密度測定法のうち少なくとも１つを含む細胞培養アッセイを用いて測定される、実施形態２５～３５のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３７
前記認知症は、加齢に伴う認知症または加齢に伴わない認知症である、実施形態２５～３６のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３８
前記認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、実施形態２５～３７のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３９
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、
ａ）試料中のパルブアルブミン陽性介在ニューロンを同定すること；
ｂ）前記試料中の自発性ＩＰＳＣの頻度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記頻度に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
を含む方法。
実施形態４０
前記試料は、脳、急性脳スライス、培養脳組織、ニューロンの培養物、またはパルブアルブミン陽性介在ニューロンの培養物から選択される、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１
前記被験者は、ヒトである、実施形態３９および４０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態４２
前記自発性ＩＰＳＣは、電気生理学的方法および／またはカルシウムイメージングを用いて測定される、実施形態３９～４１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態４３
脳波記録（ＥＥＧ）および脳磁図（ＭＥＧ）によって、ＰＶ陽性ＧＡＢＡニューロンの振動を検出する、実施形態３９～４２のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態４４
薬剤候補をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のうち１つまたは複数を含む試料を用意すること；
ｂ）前記試料を前記試験薬に曝露すること；
ｃ）前記試料に対する前記試験薬の効果を測定すること；
ｄ）前記試料に対する前記試験薬の効果に基づいて、前記試験薬の薬剤候補としての適格性を決定すること
を含む方法。
実施形態４５
認知症を発症するまたは有する被験者を治療する方法であって、
前記被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を低下させる薬剤を前記被験者に投与すること
を含む方法。
実施形態４６
前記薬剤または薬剤の前記組み合わせは、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を低下させる、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４７
前記方法は、
ａ）前記被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記濃度に基づいて治療の進捗および／または予後を決定すること
をさらに含み、
前記方法は、前記ｃ）のステップで決定された前記進捗に基づいて治療を任意に調整することを含む、実施形態４５または４６に記載の方法。
実施形態４８
前記方法は、
ａ）第１の時点で前記被験者から第１の試料を入手すること；
ｂ）前記第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｃ）第２の時点で前記被験者から第２の試料を入手すること；
ｄ）前記第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｅ）前記ｄ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて治療の進捗および／または予後を決定すること
をさらに含み、
前記方法は、前記ｅ）のステップで決定された前記進捗に基づいて治療を任意に調整することを含む、実施形態４５または４６に記載の方法。
実施形態４９
前記第１の時点と第２の時点が、約３～６カ月間隔てられている、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０
前記試料のうちの１つまたは複数は、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、唾液試料、尿試料、または便試料から選択される、実施形態４７～４９のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態５１
認知症を発症するまたは有する被験者を治療する方法であって、
腸内細菌叢中のコリネバクテリウム門、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの細菌を減少させる、または根絶する薬剤を前記被験者に投与すること
を含む方法。
実施形態５２
前記薬剤は、実施形態５１の前記細菌の存在量に直接的または間接的に影響を与える抗菌剤、ワクチン、もしくは局所プロバイオティック介入、または別の細菌を含む、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３
認知症の治療に適している患者群を同定する方法であって、
ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記濃度に基づいて前記被験者が治療に応答する確率を決定すること
を含む方法。
実施形態５４
前記治療は、前記被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を低下させる薬剤を前記被験者に投与することを含む、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５
認知症の治療に適している患者群を同定する方法であって、
ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、ファーミキューテス、およびバクテロイデスのいずれかの存在量を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記存在量に基づいて前記被験者が治療に応答する確率を決定することであって、特に、前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することが、ファーミキューテスとバクテロイデスの比率を比較することを含むこと
を含む方法。
実施形態５６
前記治療は、腸内細菌叢中のコリネバクテリウム門、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの細菌を減少させる、または根絶する薬剤を前記被験者に投与することを含む、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７
前記薬剤は、実施形態５６の前記細菌の存在量に直接的または間接的に影響を与える抗菌剤、ワクチン、もしくは局所プロバイオティック介入、または別の細菌を含む、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８
認知症の治療の進捗を監視する方法であって、
ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記濃度に基づいて治療の進捗および／または予後を決定すること
を含む方法。
実施形態５９
前記治療は、前記被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度に影響を与える治療である、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０
前記試料は、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料のうちの１つから選択される、実施形態５８または５９に記載の方法。
実施形態６１
前記被験者は、ヒトである、実施形態５８～６０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６２
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０５０μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態５８～６１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６３
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前記前駆体は、５－アミノ吉草酸またはＮε－トリメチルリシンのうちの１つから選択される、実施形態５８～６２のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６４
５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０５０μＭ／ｇ尿中クレアチニン、またはＮε－トリメチルリシンの濃度が４～８μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前記代謝物は、グルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンのうちの１つから選択される、実施形態５８～６１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６６
グルタル酸の濃度が６～２４μＭ／ｇ尿中クレアチニン、血清中濃度が１０～２０μＭ、脳脊髄液濃度が１０～４０ｍＭ、または５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンの濃度が１．４～２μＭ／ｇ尿中クレアチニンおよび血清中濃度が０．１～０．３μＭである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６７
前記濃度が、内部標準物質との比較、または代謝物標準物質との外部比較によって決定される、実施形態５８～６６のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６８
前記濃度は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはイムノアッセイのいずれかの方法を用いて決定される、実施形態５８～６７のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６９
前記ｃ）のステップが、前記ｂ）のステップの前記濃度を、対照データ、具体的には、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人の健常者の対照データの濃度と比較することを含む、実施形態５８～６８のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７０
前記認知症が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、実施形態５８～６９のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７１
認知症の治療の進捗および／または予後を監視する方法であって、
ａ）第１の時点で被験者から第１の試料を入手すること；
ｂ）前記第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｃ）第２の時点で前記被験者から第２の試料を入手すること；
ｄ）前記第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｅ）前記ｂ）とｄ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて治療の進捗を決定すること
を含む方法。
実施形態７２
前記試料のうちの１つまたは複数は、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、唾液試料、尿試料、または便試料から選択される、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３
前記被験者は、ヒトである、実施形態７１および７２のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７４
前記第１の時点と第２の時点が、約３～６カ月間隔てられている、実施形態７１～７３のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７５
前記第２の時点は、前記第１の時点の１２～２４週間後である、実施形態７１～７４のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７６
前記第２の時点は、前記第１の時点の３～６カ月後である、実施形態７１～７５のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７７
前記方法は、
ｆ）第３の時点で被験者から第３の試料を入手すること；
ｇ）前記第３の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｈ）前記ｂ）、ｄ）とｇ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて治療の進捗を決定すること
をさらに含む、実施形態７１～７６のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７８
前記第２の時点と第３の時点は、約６～１２カ月間隔てられている、実施形態７７に記載の方法。
実施形態７９
さらなる試料をさらなる時点で入手し、かつ前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率は、前記試料で測定した前記濃度の比較に基づく、実施形態７１～７８のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態８０
前記認知症は、加齢に伴う認知症または加齢に伴わない認知症である、実施形態７１～７９のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態８１
前記認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、実施形態７１～８０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態８２
前記濃度は、センサーまたは画像関連手法を用いて生体内で測定される、実施形態７１～８１のうちいずれか一項に記載の方法。
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、
ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記濃度に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
を含む方法。
実施形態２
前記試料が、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料のうちの１つから選択される、実施形態１に記載の方法。
実施形態３
前記被験者は、ヒトである、実施形態１および２のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態４
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０５０μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態１～３のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態５
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前記前駆体が、５－アミノ吉草酸またはＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）のうちの１つから選択される、実施形態１～３のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６
５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０５０μＭ／ｇ尿中クレアチニン、またはＮε－トリメチルリシンの濃度が４～８μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態５に記載の方法。
実施形態７
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前記代謝物は、グルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンのうちの１つから選択される、実施形態１～３のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態８
グルタル酸の濃度が６～２４μＭ／ｇ尿中クレアチニン、血清中濃度が１０～２０μＭ、脳脊髄液濃度が１０～４０ｍＭ、または５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンの濃度が１．４～２μＭ／ｇ尿中クレアチニンおよび血清中濃度が０．１～０．３μＭである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態７に記載の方法。
実施形態９
前記濃度が、内部標準物質との比較、または代謝物標準物質との外部比較によって決定される、実施形態１～８のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１０
前記濃度は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはイムノアッセイのいずれかの方法を用いて決定される、実施形態１～９のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１１
前記ｃ）のステップが、前記ｂ）のステップの前記濃度を、対照データ、具体的には、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人の健常者の対照データの濃度と比較することを含む、実施形態１～１０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２
前記認知症が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、実施形態１～１１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、
ａ）第１の時点で被験者から第１の試料を入手すること；
ｂ）前記第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｃ）第２の時点で前記被験者から第２の試料を入手すること；
ｄ）前記第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｅ）前記ｂ）とｄ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
を含む方法。
実施形態１４
前記試料のうちの１つまたは複数は、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、唾液試料、尿試料、または便試料から選択される、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５
前記被験者は、ヒトである、実施形態１３および１４のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６
前記第１の時点と第２の時点が、約３～６カ月間隔てられている、実施形態１３～１５のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１７
前記第２の時点は、前記第１の時点の１２～２４週間後である、実施形態１３～１６のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１８
前記第２の時点は、前記第１の時点の３～６カ月後である、実施形態１３～１７のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態１９
前記方法は、
ｆ）第３の時点で被験者から第３の試料を入手すること；
ｇ）前記第３の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｈ）前記ｂ）、ｄ）とｇ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
をさらに含む、実施形態１３～１８のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２０
前記第２の時点と第３の時点は、約６～１２カ月間隔てられている、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１
さらなる試料をさらなる時点で入手し、かつ前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率は、前記試料で測定した前記濃度の比較に基づく、実施形態１３～２０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２２
前記認知症は、加齢に伴う認知症または加齢に伴わない認知症である、実施形態１３～２１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２３
前記認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、実施形態１３～２２のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２４
前記濃度は、センサーまたは画像関連手法を用いて生体内で測定される、実施形態１３～２３のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２５
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、
ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、ファーミキューテス、およびバクテロイデスのいずれかの存在量を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記存在量に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することであって、特に、前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することが、ファーミキューテスとバクテロイデスの比率を比較することを含むこと
を含む方法。
実施形態２６
前記試料が、微生物試料、腸内細菌叢試料、腸試料、糞便試料、および／または便試料のうち１つまたは複数から選択される、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７
前記被験者は、ヒトである、実施形態２５および２６のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２８
前記コリネバクテリウムは、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ジェイケイウム、コリネバクテリウム・ウレアリティクム、およびコリネバクテリウム・エフィシエンスのうち１つまたは複数から選択される、実施形態２５～２７のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態２９
前記オシリバクターは、オシリバクター・バレリシゲネスおよびオシリバクター属ＫＬＥ１７４５株から選択される、実施形態２５～２８のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３０
前記試料中の前記微生物叢の構成を決定する、実施形態２５～２９のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３１
腸メタゲノムを決定する、実施形態２５～３０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３２
前記方法は、前記被験者の前記試料の前記細菌の前記存在量または前記微生物叢の前記構成または前記腸メタゲノムを対照と比較することを含む、実施形態２５～３１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３３
前記対照は、１人または複数人の健常者のデータに基づく、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４
前記対照は、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人の健常者から決定される、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５
前記試料は、配列に基づく技術、ジェノタイピングアッセイ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長のクローンライブラリー、ＤＧＧＥ、Ｔ－ＲＦＬＰ、ＡＲＩＳＡ、マイクロアレイ、ＤＮＡハイブリダイゼーション法のいずれかの方法を用いて解析される、実施形態２５～３４のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３６
細菌の前記存在量は、懸濁液培養またはプレート培養、染色法、顕微鏡観察法、ＦＡＣＳなどのフローサイトメトリー法、光学密度測定法のうち少なくとも１つを含む細胞培養アッセイを用いて測定される、実施形態２５～３５のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３７
前記認知症は、加齢に伴う認知症または加齢に伴わない認知症である、実施形態２５～３６のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３８
前記認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、実施形態２５～３７のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態３９
被験者が認知症を発症するまたは有する確率を診断する方法であって、
ａ）試料中のパルブアルブミン陽性介在ニューロンを同定すること；
ｂ）前記試料中の自発性ＩＰＳＣの頻度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記頻度に基づいて前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定すること
を含む方法。
実施形態４０
前記試料は、脳、急性脳スライス、培養脳組織、ニューロンの培養物、またはパルブアルブミン陽性介在ニューロンの培養物から選択される、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１
前記被験者は、ヒトである、実施形態３９および４０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態４２
前記自発性ＩＰＳＣは、電気生理学的方法および／またはカルシウムイメージングを用いて測定される、実施形態３９～４１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態４３
脳波記録（ＥＥＧ）および脳磁図（ＭＥＧ）によって、ＰＶ陽性ＧＡＢＡニューロンの振動を検出する、実施形態３９～４２のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態４４
薬剤候補をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のうち１つまたは複数を含む試料を用意すること；
ｂ）前記試料を前記試験薬に曝露すること；
ｃ）前記試料に対する前記試験薬の効果を測定すること；
ｄ）前記試料に対する前記試験薬の効果に基づいて、前記試験薬の薬剤候補としての適格性を決定すること
を含む方法。
実施形態４５
認知症を発症するまたは有する被験者を治療する方法であって、
前記被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を低下させる薬剤を前記被験者に投与すること
を含む方法。
実施形態４６
前記薬剤または薬剤の前記組み合わせは、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を低下させる、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４７
前記方法は、
ａ）前記被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記濃度に基づいて治療の進捗および／または予後を決定すること
をさらに含み、
前記方法は、前記ｃ）のステップで決定された前記進捗に基づいて治療を任意に調整することを含む、実施形態４５または４６に記載の方法。
実施形態４８
前記方法は、
ａ）第１の時点で前記被験者から第１の試料を入手すること；
ｂ）前記第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｃ）第２の時点で前記被験者から第２の試料を入手すること；
ｄ）前記第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｅ）前記ｄ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて治療の進捗および／または予後を決定すること
をさらに含み、
前記方法は、前記ｅ）のステップで決定された前記進捗に基づいて治療を任意に調整することを含む、実施形態４５または４６に記載の方法。
実施形態４９
前記第１の時点と第２の時点が、約３～６カ月間隔てられている、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０
前記試料のうちの１つまたは複数は、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、唾液試料、尿試料、または便試料から選択される、実施形態４７～４９のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態５１
認知症を発症するまたは有する被験者を治療する方法であって、
腸内細菌叢中のコリネバクテリウム門、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの細菌を減少させる、または根絶する薬剤を前記被験者に投与すること
を含む方法。
実施形態５２
前記薬剤は、実施形態５１の前記細菌の存在量に直接的または間接的に影響を与える抗菌剤、ワクチン、もしくは局所プロバイオティック介入、または別の細菌を含む、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３
認知症の治療に適している患者群を同定する方法であって、
ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記濃度に基づいて前記被験者が治療に応答する確率を決定すること
を含む方法。
実施形態５４
前記治療は、前記被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を低下させる薬剤を前記被験者に投与することを含む、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５
認知症の治療に適している患者群を同定する方法であって、
ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のコリネバクテリウム、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、ファーミキューテス、およびバクテロイデスのいずれかの存在量を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記存在量に基づいて前記被験者が治療に応答する確率を決定することであって、特に、前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率を決定することが、ファーミキューテスとバクテロイデスの比率を比較することを含むこと
を含む方法。
実施形態５６
前記治療は、腸内細菌叢中のコリネバクテリウム門、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スティックランディイ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・グルタミクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジオイデス・ディフィシル、オシリバクター、クロアシバシルス・エブリエンシ、およびファーミキューテスのいずれかの細菌を減少させる、または根絶する薬剤を前記被験者に投与することを含む、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７
前記薬剤は、実施形態５６の前記細菌の存在量に直接的または間接的に影響を与える抗菌剤、ワクチン、もしくは局所プロバイオティック介入、または別の細菌を含む、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８
認知症の治療の進捗を監視する方法であって、
ａ）被験者から試料を入手すること；
ｂ）前記試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度を測定すること；
ｃ）前記ｂ）のステップで測定した前記濃度に基づいて治療の進捗および／または予後を決定すること
を含む方法。
実施形態５９
前記治療は、前記被験者におけるＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物のいずれかの濃度に影響を与える治療である、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０
前記試料は、唾液試料、尿試料、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、または便試料のうちの１つから選択される、実施形態５８または５９に記載の方法。
実施形態６１
前記被験者は、ヒトである、実施形態５８～６０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６２
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０５０μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態５８～６１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６３
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前記前駆体は、５－アミノ吉草酸またはＮε－トリメチルリシンのうちの１つから選択される、実施形態５８～６２のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６４
５－アミノ吉草酸の濃度が０．００５～０．０５０μＭ／ｇ尿中クレアチニン、またはＮε－トリメチルリシンの濃度が４～８μＭ／ｇ尿中クレアチニンである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５
ＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前記代謝物は、グルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンのうちの１つから選択される、実施形態５８～６１のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６６
グルタル酸の濃度が６～２４μＭ／ｇ尿中クレアチニン、血清中濃度が１０～２０μＭ、脳脊髄液濃度が１０～４０ｍＭ、または５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンの濃度が１．４～２μＭ／ｇ尿中クレアチニンおよび血清中濃度が０．１～０．３μＭである場合、前記被験者が認知症を発症するまたは有することを示す、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６７
前記濃度が、内部標準物質との比較、または代謝物標準物質との外部比較によって決定される、実施形態５８～６６のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６８
前記濃度は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはイムノアッセイのいずれかの方法を用いて決定される、実施形態５８～６７のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態６９
前記ｃ）のステップが、前記ｂ）のステップの前記濃度を、対照データ、具体的には、年齢が同じ、性別が同じ、民族が同じ、および／または地理的位置が同じである１人または複数人の健常者の対照データの濃度と比較することを含む、実施形態５８～６８のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７０
前記認知症が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、実施形態５８～６９のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７１
認知症の治療の進捗および／または予後を監視する方法であって、
ａ）第１の時点で被験者から第１の試料を入手すること；
ｂ）前記第１の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｃ）第２の時点で前記被験者から第２の試料を入手すること；
ｄ）前記第２の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｅ）前記ｂ）とｄ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて治療の進捗を決定すること
を含む方法。
実施形態７２
前記試料のうちの１つまたは複数は、血液試料、血清試料、脳液試料、脳室液試料、髄液試料、脳組織試料、微生物試料、糞便試料、唾液試料、尿試料、または便試料から選択される、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３
前記被験者は、ヒトである、実施形態７１および７２のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７４
前記第１の時点と第２の時点が、約３～６カ月間隔てられている、実施形態７１～７３のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７５
前記第２の時点は、前記第１の時点の１２～２４週間後である、実施形態７１～７４のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７６
前記第２の時点は、前記第１の時点の３～６カ月後である、実施形態７１～７５のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７７
前記方法は、
ｆ）第３の時点で被験者から第３の試料を入手すること；
ｇ）前記第３の試料中のＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸、ならびに／または５－アミノ吉草酸およびＮε－トリメチルリシン（Ｎ（６），Ｎ（６），Ｎ（６）－トリメチル－Ｌ－リシン）を含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の前駆体、ならびに／またはグルタル酸および５－（ガラクトシルヒドロキシ）－Ｌ－リシンを含むがこれらに限定されないＮＮＮ－トリメチル－５－アミノ吉草酸の代謝物の濃度を測定すること；
ｈ）前記ｂ）、ｄ）とｇ）のステップで測定した前記濃度の比較に基づいて治療の進捗を決定すること
をさらに含む、実施形態７１～７６のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態７８
前記第２の時点と第３の時点は、約６～１２カ月間隔てられている、実施形態７７に記載の方法。
実施形態７９
さらなる試料をさらなる時点で入手し、かつ前記被験者が認知症を発症するまたは有する確率は、前記試料で測定した前記濃度の比較に基づく、実施形態７１～７８のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態８０
前記認知症は、加齢に伴う認知症または加齢に伴わない認知症である、実施形態７１～７９のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態８１
前記認知症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症のうちの１つから選択される、実施形態７１～８０のうちいずれか一項に記載の方法。
実施形態８２
前記濃度は、センサーまたは画像関連手法を用いて生体内で測定される、実施形態７１～８１のうちいずれか一項に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】