特表2023-509058Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔならびにその調製方法及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-06
(54)【発明の名称】Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔならびにその調製方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230227BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20230227BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230227BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230227BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20230227BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230227BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230227BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230227BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230227BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230227BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N1/00 B
C12N15/12
C12N15/09 100
C12N15/09 110
C12N15/85 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
A61K47/68
A61K39/395 T
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022540775
(86)(22)【出願日】2020-12-28
(85)【翻訳文提出日】2022-08-26
(86)【国際出願番号】 CN2020140176
(87)【国際公開番号】W WO2021136176
(87)【国際公開日】2021-07-08
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/129956
(32)【優先日】2019-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520047082
【氏名又は名称】博雅▲緝▼因（北京）生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＥＤＩＧＥＮＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ，Ｆｌｏｏｒ ２，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ２，２２ ＫｅＸｕｅＹｕａｎ Ｒｏａｄ，Ｃｈａｎｇｐｉｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２２０６，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002000
【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲飛▼
(72)【発明者】
【氏名】袁 ▲鵬▼▲飛▼
(72)【発明者】
【氏名】牛 立超
(72)【発明者】
【氏名】付 建▲強▼
(72)【発明者】
【氏名】▲呉▼ ▲蘭▼▲蘭▼
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076EE59
4C085AA14
4C085BB01
(57)【要約】
Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する新規な調製方法、この方法によって調製されたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞、及び該ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を含む生物学的製品が提供される。Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法は、健康なリンパ系を持つヒトドナーからＴ細胞を取得し、遺伝子編集技術によって前記Ｔ細胞のＴＲＡＣゲノム領域とＢ２Ｍゲノム領域を破壊することによって、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を前記Ｔ細胞中で安定して発現させることを含む。この調製方法によって調製されたＴ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞の天然ＴＣＲ発現を排除し、移植片対宿主反応を大幅に低減するとともに、それ自体の免疫原性も大幅に低下させ、Ｔ細胞リンパ腫細胞を持続的かつ効率的に殺すことができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１）健康なリンパ系を持つヒトドナーからＴ細胞を取得することと、２）前記Ｔ細胞中の
（ｉ）ＴＲＡＣゲノム領域、及び
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノム領域
を遺伝子編集技術によって破壊することと、
３）Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を前記Ｔ細胞中で安定して発現させることと
を含む、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法。
【請求項2】
天然ＴＣＲを依然として発現しているＴ細胞を除去するように、ステップ３）から得られた細胞を適切な時間培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＴＲＡＣゲノム領域が、ヒト１４番目染色体の第２３０１６４４８位から第２３０１６４９０位のゲノム領域を含み、前記Ｂ２Ｍゲノム領域が、ヒト１５番目染色体の第４５００３７４５位から第４５００３７８８位のゲノム領域を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とする前記ＣＡＲ分子の細胞外領域が、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βの細胞外領域に結合するｓｃＦｖ分子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＣＡＲ分子が、リンカーによって連結された前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域 配列番号１９
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ；
前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域 配列番号２０
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記リンカーが（Ｇ）ｎ（Ｓ）ｍを含むアミノ酸配列であり、ｎが１～２０の正の整数であり、ｍが１～１０の正の整数である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記リンカー配列が、配列番号２１に示される配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＴＲＡＣゲノム領域及び前記Ｂ２Ｍゲノム領域が、相同組換え、ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術によって破壊される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記遺伝子編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
（ｉ）ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号２～５から選択されるいずれか１つの配列を有する；及び／または（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号６～１３から選択されるいずれか１つの配列を有する、
請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を一緒にまたは別々に前記Ｔ細胞に導入する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ｓｇＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の３つの塩基及び３’末端の３つの塩基の２’－Ｏ－メチル修飾及びヌクレオチド間３’チオ修飾である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列をエレクトロポレーションによって一緒に前記Ｔ細胞に導入する、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記エレクトロポレーション条件は、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；及び２５０Ｖ、０．５ｍｓから選択されるいずれかである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍのそれぞれのノックアウト効率が９０％以上であり、同時ノックアウト効率が７５％以上である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とする前記ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を、ウイルストランスフェクションによって前記Ｔ細胞に導入する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ＣＡＲ分子を発現するヌクレオチド配列を相同組換えによって前記Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子座に導入して、前記ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列がＴＣＲ遺伝子プロモーターの制御下で前記ＴＲＡＣ遺伝子座で発現される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ステップ３）から得られた細胞を３～２１日間培養して、依然として天然ＴＣＲを発現しているＴ細胞を除去する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を発現する、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項23】
前記ＣＡＲ分子が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項24】
ＴＣＲα／β、クラス１ ＨＬＡタンパク質、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３から選択される１つまたは複数のタンパク質を低いレベルで発現するか、または発現しない、請求項２２または２３に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項25】
請求項２２～２４のいずれか一項に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を含む生物学的製品。
【請求項26】
前記ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の９８％または９９％以上がＴＣＲ陰性である、請求項２５に記載の生物学的製品。
【請求項27】
Ｔ細胞リンパ腫の治療のための薬剤の調製における、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞または請求項２５もしくは２６に記載の生物学的製品の使用。
【請求項28】
Ｔ細胞リンパ腫に罹患している被験者に、治療有効量の請求項２２～２４のいずれか一項に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞または請求項２５もしくは２６に記載の生物学的製品を投与することを含む、Ｔ細胞リンパ腫を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｔ細胞リンパ腫を治療するためのユニバーサルＣＡＲ－Ｔの調製技術、ならびに該調製技術によって調製されたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
悪性腫瘍は、体の健康と命の安全を深刻に脅かす疾患となっており、腫瘍の治癒はずっと人類の夢であった。近年来、腫瘍免疫療法は広範に注目されており、特にＣＡＲ－Ｔ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ）技術の現れにより、腫瘍制御において画期的な発展が遂げられた。１９８９年にＣＡＲ－Ｔ技術が初めて適用され、２０１２年にペンシルベニア大学のＣａｒｌ Ｊｕｎｅ教授が率いるチームによりＥｍｉｌｙ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄが治癒され、そして、２０１７年にＦＤＡ腫瘍薬物専門家諮問委員会（ＯＤＡＣ）が１０：０の圧倒的な投票結果で、若年性進行Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（ｒ／ｒＡｌｌ）の治療におけるノバルティスＣＡＲ－Ｔ薬ＣＴＬ０１９の使用を推奨・承認した。
【0003】
一般的には、従来のＣＡＲ－Ｔ技術のＴ細胞は主に患者自身に由来し、ＧＭＰ環境下でインビトロでＴ細胞の分離、活性化、ＣＡＲ導入、培養増幅を経て、最後に品質管理して患者の体内に再注入する。しかし、Ｔリンパ細胞白血病患者のＴ細胞は癌性であるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療には使用できない。同時に、患者が重症の場合、他の細胞の調製のための十分な待ち時間がない。これらの問題は、ＣＡＲ－Ｔ技術の広範な応用を制限してしまう。そのため、現在、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の一つの重要な研究の方向は、如何に健康な献血者のＴ細胞を使用して大量のＣＡＲ－Ｔ細胞を調製して患者の臨床使用を満足することである。この技術の確立は、Ｔ細胞リンパ腫患者に治療方法を提供し、ＣＡＲ－Ｔ療法のコストを大幅に削減し、均一に調製された細胞の品質をより確実に保証し、患者が必要な時にすぐにＣＡＲ－Ｔ細胞を取得して治療することができる。
【0004】
本明細書全文でいくつかの文献が引用されている。ここで、各文書（いずれのジャーナル記事または要約、公開済みまたは未公開の特許出願、登録された特許、メーカーの仕様書、プロトコルなどを含む）は言及により本文に取り込まれる。しかしながら、ここに引用された文書が実際に本発明の既存技術であると認めるわけではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する新規な調製方法、この方法によって調製されたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞、及び該ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を含む生物学的製品に関する。本願の調製方法によって調製されたＴ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、天然ＴＣＲの発現を有さず、移植片対宿主反応を大幅に低減できる。同時に、前記Ｔ細胞中のＢ２Ｍ遺伝子のノックアウトにより、クラスＩ ＨＬＡタンパク質の発現も大幅に低減及び排除され、Ｔ細胞の自己免疫原性が低下する。本願の方法によって調製されたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞リンパ腫細胞を持続的かつ効率的に殺すことができるとともに、移植片対宿主反応が大幅に低減され、使用の安全性が高まる。
【0006】
したがって、一態様では、本発明は、ＴＣＲα／βを標的として、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を初めて開示する。具体的には、本願は以下の項目を提供する。
１、１）健康なリンパ系を持つヒトドナーからＴ細胞を取得すること、
２）前記Ｔ細胞中の
（ｉ）ＴＲＡＣゲノム領域、及び
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノム領域
を遺伝子編集技術によって破壊すること、
３）Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を前記Ｔ細胞中で安定して発現させること
を含む、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法。
一部の実施形態において、本願のＴ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法は、
４）天然ＴＣＲを依然として発現しているＴ細胞を除去するように、ステップ３）から得られた細胞を適切な時間培養することをさらに含む。前記適切な時間は例えば、３～２１、４～１８、５～１６、６～１４、７～１２、８～１０日であり、これによって、前記ＣＡＲを発現する細胞が、天然ＴＣＲを依然として発現しているＴ細胞を除去する。
１、１）健康なリンパ系を持つヒトドナーからＴ細胞を取得すること、
２）前記Ｔ細胞中の
（ｉ）ＴＲＡＣゲノム領域、及び
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノム領域
を遺伝子編集技術によって破壊すること、
３）Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を前記Ｔ細胞中で安定して発現させること
を含む、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法。
一部の実施形態において、本願のＴ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法は、
４）天然ＴＣＲを依然として発現しているＴ細胞を除去するように、ステップ３）から得られた細胞を適切な時間培養することをさらに含む。前記適切な時間は例えば、３～２１、４～１８、５～１６、６～１４、７～１２、８～１０日であり、これによって、前記ＣＡＲを発現する細胞が、天然ＴＣＲを依然として発現しているＴ細胞を除去する。
【0007】
２、天然ＴＣＲを依然として発現しているＴ細胞を除去するように、ステップ３）から得られた細胞を適切な時間培養することをさらに含む、項１に記載の方法。
３、前記ＴＲＡＣゲノム領域が、ヒト１４番目染色体の第２３０１６４４８位から第２３０１６４９０位のゲノム領域を含み、前記Ｂ２Ｍゲノム領域が、ヒト１５番目染色体の第４５００３７４５位から第４５００３７８８位のゲノム領域を含む、項１または２に記載の方法。
４、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とする前記ＣＡＲ分子の細胞外領域が、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βの細胞外領域に結合するｓｃＦｖ分子である、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
５、前記ＣＡＲ分子が、リンカーによって連結された以下の配列を含む、項４に記載の方法。
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域 配列番号１９
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ；
前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域 配列番号２０
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ。
３、前記ＴＲＡＣゲノム領域が、ヒト１４番目染色体の第２３０１６４４８位から第２３０１６４９０位のゲノム領域を含み、前記Ｂ２Ｍゲノム領域が、ヒト１５番目染色体の第４５００３７４５位から第４５００３７８８位のゲノム領域を含む、項１または２に記載の方法。
４、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とする前記ＣＡＲ分子の細胞外領域が、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βの細胞外領域に結合するｓｃＦｖ分子である、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
５、前記ＣＡＲ分子が、リンカーによって連結された以下の配列を含む、項４に記載の方法。
前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域 配列番号１９
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ；
前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域 配列番号２０
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ。
【0008】
６、前記リンカーが（Ｇ）ｎ（Ｓ）ｍを含むアミノ酸配列であり、ｎが１～２０の正の整数であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０であり、ｍが１～１０の正の整数であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である、項５に記載の方法。
７、前記リンカー配列が、配列番号２１に示される配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである、項６に記載の方法。
８、前記ＴＲＡＣゲノム領域及び前記Ｂ２Ｍゲノム領域が、相同組換え、ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術によって破壊される、項１～７のいずれか一項に記載の方法。
９、前記遺伝子編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である、項８に記載の方法。
１０、（ｉ）ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号２～５から選択されるいずれか１つの配列を有する；及び／または
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号６～１３から選択されるいずれか１つの配列を有する、
項９に記載の方法。
７、前記リンカー配列が、配列番号２１に示される配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである、項６に記載の方法。
８、前記ＴＲＡＣゲノム領域及び前記Ｂ２Ｍゲノム領域が、相同組換え、ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術によって破壊される、項１～７のいずれか一項に記載の方法。
９、前記遺伝子編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である、項８に記載の方法。
１０、（ｉ）ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号２～５から選択されるいずれか１つの配列を有する；及び／または
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号６～１３から選択されるいずれか１つの配列を有する、
項９に記載の方法。
【0009】
１１、前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を一緒にまたは別々に前記Ｔ細胞に導入する、項１０に記載の方法。
１２、前記ｓｇＲＮＡが化学的に修飾されている、項１０または１１に記載の方法。
１３、前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む、項１２に記載の方法。
１４、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の３つの塩基及び３’末端の３つの塩基の２’－Ｏ－メチル修飾及びヌクレオチド間３’チオ修飾である、項１３に記載の方法。
１５、前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列をエレクトロポレーションによって一緒に前記Ｔ細胞に導入する、項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
１２、前記ｓｇＲＮＡが化学的に修飾されている、項１０または１１に記載の方法。
１３、前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む、項１２に記載の方法。
１４、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の３つの塩基及び３’末端の３つの塩基の２’－Ｏ－メチル修飾及びヌクレオチド間３’チオ修飾である、項１３に記載の方法。
１５、前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列をエレクトロポレーションによって一緒に前記Ｔ細胞に導入する、項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【0010】
１６、前記エレクトロポレーション条件は、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；及び２５０Ｖ、０．５ｍｓから選択されるいずれかである、項１５に記載の方法。
１７、前記ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍのそれぞれのノックアウト効率が９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であり、同時ノックアウト効率が７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％以上である、項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とする前記ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を、ウイルストランスフェクションによって前記Ｔ細胞に導入する、項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９、前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスである、項１８に記載の方法。
２０、前記ＣＡＲ分子を発現するヌクレオチド配列を相同組換えによって前記Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子座に導入して、前記ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列がＴＣＲ遺伝子プロモーターの制御下で前記ＴＲＡＣ遺伝子座で発現される、項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
２１、ステップ３）から得られた細胞を３～２１日間培養して、依然として天然ＴＣＲを発現しているＴ細胞を除去する、項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
１７、前記ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍのそれぞれのノックアウト効率が９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であり、同時ノックアウト効率が７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％以上である、項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とする前記ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を、ウイルストランスフェクションによって前記Ｔ細胞に導入する、項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９、前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスである、項１８に記載の方法。
２０、前記ＣＡＲ分子を発現するヌクレオチド配列を相同組換えによって前記Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子座に導入して、前記ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列がＴＣＲ遺伝子プロモーターの制御下で前記ＴＲＡＣ遺伝子座で発現される、項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
２１、ステップ３）から得られた細胞を３～２１日間培養して、依然として天然ＴＣＲを発現しているＴ細胞を除去する、項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【0011】
２２、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を発現する、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞。
２３、前記ＣＡＲ分子が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、項２２に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞。
２４、クラス１ ＨＬＡタンパク質、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３から選択される１つまたは複数のタンパク質を低いレベルで発現するか、または発現しない、項２２または２３に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞。
２５、項２２～２４のいずれか一項に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を含む生物学的製品。
２６、前記ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の９８％、９９％以上がＴＣＲ陰性である、項２５に記載の生物学的製品。一部の実施形態では、ＴＣＲ９８％、９９％以上の前記ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞がＴＣＲ及びＢ２Ｍ陰性である。
２７、Ｔ細胞リンパ腫の治療のための薬剤の調製における、項２２～２４のいずれか一項に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞または項２５もしくは２６に記載の生物学的製品の使用。
２８、Ｔ細胞リンパ腫に罹患している被験者に、治療有効量の項２２～２４のいずれか一項に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞または項２５もしくは２６に記載の生物学的製品を投与することを含む、Ｔ細胞リンパ腫を治療する方法。
２３、前記ＣＡＲ分子が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、項２２に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞。
２４、クラス１ ＨＬＡタンパク質、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３から選択される１つまたは複数のタンパク質を低いレベルで発現するか、または発現しない、項２２または２３に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞。
２５、項２２～２４のいずれか一項に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を含む生物学的製品。
２６、前記ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の９８％、９９％以上がＴＣＲ陰性である、項２５に記載の生物学的製品。一部の実施形態では、ＴＣＲ９８％、９９％以上の前記ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞がＴＣＲ及びＢ２Ｍ陰性である。
２７、Ｔ細胞リンパ腫の治療のための薬剤の調製における、項２２～２４のいずれか一項に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞または項２５もしくは２６に記載の生物学的製品の使用。
２８、Ｔ細胞リンパ腫に罹患している被験者に、治療有効量の項２２～２４のいずれか一項に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞または項２５もしくは２６に記載の生物学的製品を投与することを含む、Ｔ細胞リンパ腫を治療する方法。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１は、エレクトロポレーション後の細胞の生存率を示す図である。Ｔ細胞及びＵＣＡＲ－Ｔ細胞の生存率はよく、培養時間の増加につれて細胞の生存率は９０％以上に達したが、Ｕ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存率は５日目に最初の生存率よりも低かった。ＣＡＲはＴＣＲを標的とすることができるため、Ｕ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は初期段階で「自殺」現象を起こし、生存率は低かったが、時間の経過とともに徐々に生存率が上昇し、９日間の培養後、生存率は９０％以上に達した。
【図2】図２は、エレクトロポレーション後の細胞の増殖を示す図である。Ｔ細胞の増殖速度は最も速く、Ｕ－Ｔ細胞及びＵ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は遅く、１２日間培養した後、Ｕ－Ｔ細胞に対してＴＣＲα／βの精製を行い、その精製回収率は約４０％であった。したがって、Ｕ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の最終的な数はＵ－Ｔ細胞の数よりも多かった。
【図3】図３は、ＴＣＲα／β－ＣＡＲが添加されたＤＫＯ－Ｔ細胞の培養後のＣＡＲ発現型分析を示す図である。その結果から、ＴＣＲα／β－ＣＡＲが添加されたＤＫＯ－Ｔ細胞を培養した後のＣＡＲの発現率は１０％以上であることが分かった。
【図4】図４は、最適化されたｓｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用した、Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ（ダブルノックアウト、Ｄｏｕｂｌｅ Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ，ＤＫＯ）ノックアウト分析の結果を示す図である。ｓｇＲＮＡを化学的に修飾し、次に化学的に修飾されたｓｇＲＮＡとＣａｓ９を、さらに最適化されたエレクトロポレーション条件を介して初代Ｔ細胞に送達して関連する遺伝子ノックアウトをした。結果として図に示すように、ＴＲＡＣとＢ２Ｍの二重遺伝子のノックアウト効率は８４％に増加した。
【図5】図５は、ＴＣＲα／β－ＣＡＲが添加されたＤＫＯ－Ｔ細胞の培養後の発現型分析を示す図である。その結果から、ＴＣＲα／β－ＣＡＲが添加されたＤＫＯ－Ｔ細胞を培養した後、そのＴＣＲα／β陰性細胞の割合は９８％以上であることが分かった。
【発明を実施するための形態】
【0013】
なお、明細書及び特許請求の範囲では、特定の構成要素を指すために特定の用語が使用されていることに注意されたい。同じ構成要素が異なる名詞で呼ばれ得ることは、当業者によって理解されるべきである。本明細書及び特許請求の範囲は、構成要素を区別する方法として名詞の違いを使用せず、区別するための基準として構成要素の機能の違いを使用する。例えば、明細書及び特許請求の範囲全体で言及されるように、「包含する」または「含む」は、開放的な用語であるため、「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである。本明細書における後続の説明は、本発明を実施するための好ましい実施形態であるが、前記説明は、本明細書の一般原則を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の保護の範囲は、添付の特許請求の範囲によって決定されるべきである。
【0014】
本願は、第１の態様において、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供する。
【0015】
一つの具体的な実施形態において、
１）健康なリンパ系を持つヒトドナーからＴ細胞を取得すること、
２）前記Ｔ細胞中の
（ｉ）ＴＲＡＣゲノム領域、及び
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノム領域
を遺伝子編集技術によって破壊すること、
３）Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を前記Ｔ細胞中で安定して発現させること、及び
４）ステップ３）から得られた細胞を培養すること
を含む、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法が提供される。
１）健康なリンパ系を持つヒトドナーからＴ細胞を取得すること、
２）前記Ｔ細胞中の
（ｉ）ＴＲＡＣゲノム領域、及び
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノム領域
を遺伝子編集技術によって破壊すること、
３）Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を前記Ｔ細胞中で安定して発現させること、及び
４）ステップ３）から得られた細胞を培養すること
を含む、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法が提供される。
【0016】
本明細書の文脈では、Ｔ細胞は健康なヒトに由来する。Ｔ細胞は、臍帯血、骨髄、または末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）などに由来する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は幹細胞に由来し、例えば、各分化段階の造血幹細胞に由来する。本出願に記載の調製方法は、例えば、ＰＢＭＣまたは幹細胞にＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍをノックアウトし、さらに培養・分化し、及び／または対応する遺伝子改変されたＴ細胞を精製することに使用されることができる。
【0017】
本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞で発現されるＣＡＲは、順に連結されるシグナルペプチド、細胞外結合領域、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナル領域を含む。本文で使用される用語の「シグナルペプチド」とは、新しく合成したタンパク質の分泌経路への移動をガイドする短い（例えば、５～３０のアミノ酸長の）ペプチド鎖をいう。本発明では、人体内の様々なタンパク質のシグナルペプチド、例えば、体内で分泌されるサイトカインタンパク質や白血球分化抗原（ＣＤ分子）のシグナルペプチドを使用することができる。一部の実施形態では、前記シグナルペプチドはＣＤ８シグナルペプチドであり、例えば、そのアミノ酸配列は、発明特許出願ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１に示されている通りである。一部の実施形態では、前記ヒンジ領域は、異なる抗体または抗原受容体のヒンジ領域、特にＣＤ分子のヒンジ領域を使用することができる。一つの具体的な実施形態では、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８またはＣＤ２８などのタンパク質のヒンジ領域から選択することができる。前記ＣＤ８またはＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面の天然マーカーである。
【0018】
本発明では、人体におけるタンパク質の様々な膜貫通領域、特に異なる抗原受容体の膜貫通領域を使用することができる。好ましく使用される膜貫通領域は、ＣＤ分子の膜貫通領域である。一実施形態では、前記膜貫通領域は、ＣＤ８タンパク質の膜貫通領域から選択される。
【0019】
本発明では、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域（ＣＤ８－ｈｉｎｇｅ）であり、そのアミノ酸配列は、発明特許出願ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１に示されている通りである。
【0020】
「細胞外結合領域」とは、標的抗原を特異的に認識する領域をいう。一部の実施形態では、当該細胞外結合領域は、標的腫瘍細胞表面抗原を特異的に認識する領域を含む。例えば、この領域は、ｓｃＦｖまたはその他の抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。本文で使用される用語の「ｓｃＦｖ」とは、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって連結される重鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ，ＶＨ）と軽鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，ＶＬ）の組換えタンパク質をいい、リンカーによってこの２つのドメインが関連し、最終的に抗原結合部位を形成する。ｓｃＦｖは通常、ひとつのヌクレオチド鎖によってコードされるアミノ酸配列である。上記ｓｃＦｖはさらにその誘導体を含むことができる。
【0021】
本発明で使用されるＣＡＲ及びその様々なドメインは、アミノ酸の欠失、挿入、置換、追加、及び／または組換え、及び／またはその他の修飾方法など、本分野で既知の通常技術を単独または組み合わせて使用することによりさらに修飾することができる。ある抗体のアミノ酸配列に基づいてそのＤＮＡ配列にその修飾を導入する方法は、当業者にとって公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．参照）。この修飾は好ましくは核酸レベルで行われる。
【0022】
本文で使用される用語の「特異的認識」とは、本発明の抗原認識領域が、目標抗原以外のいかなるポリペプチドと交差反応しない、または基本的に交差反応しないことを意味する。その特異性の程度は、イムノブロッティング、イムノアフィニティークロマトグラフィー、フローサイトメトリーなどを含むが、これらに限られていない免疫学的技術によって判断することができる。
【0023】
前記細胞外結合領域は、ＴＣＲα／βを特異的に認識する抗原結合領域である。
【0024】
本発明において、前記細胞内シグナル領域は、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）タンパク質の細胞内シグナル領域である。ＣＤ３分子は５つのサブユニットからなり、その中で、ＣＤ３ζサブユニット（ＣＤ３ｚｅｔａとも呼ばれ、ζと略称する）は３つのＩＴＡＭモチーフを含み、このモチーフは、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体における重要なシグナル変換領域である。ＦｃεＲＩγは主にマスト細胞と好塩基球の表面に分布しており、構造、分布及び機能ではＣＤ３ζと類似しているＩＴＡＭモチーフを含む。また、前述のように、ＣＤ１３７は、共刺激シグナル分子であり、それぞれのリガンドに結合した後、その細胞内シグナルセグメントの共刺激効果により、Ｔ細胞の継続的な増殖を引き起こし、Ｔ細胞がＩＬ－２とＩＦＮ－γなどのサイトカインを分泌するレベルを上昇させることができるとともに、ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボでの生存サイクルと抗腫瘍効果を改善することができる。特定の実施形態では、ＴＣＲ単独で生成したシグナルは、天然Ｔ細胞を完全に活性化するのに十分ではなく、ＴＣＲによる抗原依存の初期活性化の配列（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）、及び抗原非依存的な方法で作用して共刺激シグナルを提供する配列（共刺激ドメイン）も必要である。一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の初期活性化を刺激的または抑制的に調節する。刺激的に作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達モチーフを含んでもよく、これは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）と呼ばれる。本発明のＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列はＣＤ３ζである。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、修飾されたＩＴＡＭドメインを含み、例えば、天然ＩＴＡＭドメインと比較して活性が変更（例えば、増加または低下）した突然変異ＩＴＡＭドメイン、またはトランケートされたＩＴＡＭの一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
【0025】
共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲの中の、共刺激分子細胞内ドメインを含む部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。本願の共刺激分子領域は、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。
【0026】
「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」は、ＣＤ３と結合してＴＣＲ－ＣＤ３複合体を形成する、すべてのＴ細胞の表面上の特徴的なマーカーである。ＴＣＲはαとβとの２つのペプチド鎖からなり、各ペプチド鎖はさらに、可変領域（Ｖ領域）、定常領域（Ｃ領域）、膜貫通領域、及び細胞質領域に分けられる。ＴＣＲ分子は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、その抗原特異性はＶ領域に存在する。Ｖ領域（Ｖα、Ｖβ）にはそれぞれ３つの超可変領域、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３があり、その中で、ＣＤＲ３の変異が最も大きくて、ＴＣＲの抗原結合特異性を直接に決定する。ＴＣＲがＭＨＣ－抗原ペプチド複合体を認識する時、ＣＤＲ１とＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子抗原結合溝の側壁を認識して結合し、ＣＤＲ３は抗原ペプチドに直接に結合する。ＴＣＲは、ＴＣＲ１とＴＣＲ２との２類に分けられ、ＴＣＲ１は、γとδとの２つの鎖で構成され、ＴＣＲ２は、αとβとの２つの鎖で構成される。末梢血では、Ｔ細胞の９０％～９５％はＴＣＲ２を発現し、いずれのＴ細胞は、ＴＣＲ２とＴＣＲ１のいずれか１つのみを発現する。
【0027】
「β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）」は、細胞表面のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のβ鎖（軽鎖）部分であり、分子量が１１８００である、９９個のアミノ酸からなる単鎖ポリペプチドである。
【0028】
本出願で使用されるように、「Ｉｎｄｅｌ」は、挿入／欠失、すなわち、挿入変異・欠失変異のことを指す。
【0029】
「移植片対宿主反応（ＧＶＨＤ）」とは、ドナーと受容体の間に免疫遺伝学的差異が存在するため、例えば、一方で、免疫活性を有するドナーのＴリンパ球のようなドナー細胞が受容体である患者の体内に入ってある程度までに増殖した後、受容体である患者の正常な細胞または組織を標的と誤認して攻撃して起こった反応を指す。もう一方では、異系細胞について、受容体体内の正常な免疫系は、それらをクリアして「宿主対移植片反応（（ＨＶＧＲ）」を起こすこともある。
【0030】
ＨＶＧＲとＧＶＨＲの関連遺伝子は、ＴＣＲ、ＨＬＡ分子の関連遺伝子を含み、これらの遺伝子が同時にノックアウトされたＴリンパ球を同種異系患者に再注入する時、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こさないため、「ユニバーサルＴ細胞」と呼ばれることができる。例えば、単一のＴＲＡＣ遺伝子は、ＴＣＲα鎖をコードする遺伝子と、ＴＣＲβをコードする２つのＴＲＢＣ遺伝子とから形成した完全且つ機能的なＴＣＲ複合体であり、ＴＲＡＣをノックアウトするとＴＣＲの不活性化を引き起こす可能性があり、Ｂ２ＭはＭＨＣＩ関連遺伝子である。これら２つの遺伝子が同時にノックアウトされたＴリンパ球は、同種異系患者に再注入する時に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こすことはない。
【0031】
「ＣＡＲ－Ｔ」は「キラメ抗原受容体Ｔ細胞」の略称であり、キラメ抗原受容体（ＣＡＲ）はＣＡＲ－Ｔのコアコンポーネントであり、ＨＬＡに依存しない方法で標的細胞（例えば、腫瘍）の抗原を認識する能力をＴ細胞に付与し、これによって、ＣＡＲにより改変されたＴ細胞は、天然Ｔ細胞の表面上の受容体ＴＣＲよりも広い範囲の目標を認識することができる。一部の実施形態では、腫瘍を標的とするＣＡＲの設計には、１つの腫瘍関連抗原（ｔｕｍоｒ－ａｓｓоｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ、ＴＡＡ）結合領域（例えば、通常はモノクローナル抗体の抗原結合領域に由来するｓｃＦＶセグメント）、１つの細胞外ヒンジ領域、１つの膜貫通領域、及び１つの細胞内シグナル領域を含む。目標抗原の選択は、ＣＡＲの特異性と有効性、及び遺伝子改変されたＴ細胞自体の安全性にとって肝心な決定要素である。
【0032】
「ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞」とは、特異的な標的細胞（例えば、腫瘍）に関連するマーカーを標的とし、細胞表面のＴＣＲとＭＨＣの機能が不活性化になり、同種異系細胞治療によって引き起こされる免疫拒絶反応を低めることができるＣＡＲ－Ｔ細胞をいう。
【0033】
自己細胞のＣＡＲ－Ｔ治療では、採血して患者自身のＴリンパ球を分離する必要があり、一方、患者のＴ細胞が癌性であるため、ＣＡＲ－Ｔの調製には患者自身のＴ細胞を使用できなくなったり、ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製プロセスでは突然の状況が発生して、準備された細胞をタイムリーに患者に再注入することができなくなったりする場合、治療効果に影響を与えてしまう。同種異系治療に使用可能なユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、上記状況において大きな優勢を持っている。
【0034】
養子細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ，ＡＣＴ）、腫瘍養子免疫療法（Ｔｕｍｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）のような養子免疫療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）とは、免疫細胞をインビトロで処理し、例えば、特異的な抗原を加えて免疫細胞により発現される分子を改変し、またはサイトカインを利用してそれを刺激するなどの方法を利用して、特異性の高い標的細胞（例えば、腫瘍）殺傷性免疫エフェクター細胞をスクリーニングして大量に増幅し、そして患者に注入して標的細胞（例えば、腫瘍）を殺す治療方法であり、受動免疫療法である。
【0035】
「安定した発現」とは、連続的な発現を意味する。宿主細胞における導入遺伝子の安定した発現は、安定したトランスフェクションにより、標的遺伝子を細胞の染色体ＤＮＡに組み込み、適切な量の標的タンパク質の合成をガイドすることによって達成することができる。安定したトランスフェクション（例えばウイルストランスフェクションによる）の場合、外因性遺伝子は細胞のゲノムに組み込まれ、外因性遺伝子は細胞のゲノムの一部になり、複製され、安定にトランスフェクトされた細胞の子孫細胞も外因性遺伝子を発現し、それによって安定した発現を達成できる。
【0036】
別の具体的な実施形態において、前記ＴＲＡＣゲノム領域が、ヒト１４番目染色体の第２３０１６４４８位から第２３０１６４９０位のゲノム領域を含み、前記Ｂ２Ｍゲノム領域が、ヒト１５番目染色体の第４５００３７４５位から第４５００３７８８位のゲノム領域を含む。
【0037】
本明細書の文脈では、「ゲノム」は、分子生物学の分野における一般的な定義に準拠しており、すなわち、生体のすべての遺伝物質の合計を指す。これらの遺伝物質には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれ得る。
【0038】
さらに別の実施形態において、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とする前記ＣＡＲ分子の細胞外領域が、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βの細胞外領域に結合するｓｃＦｖ分子である。
【0039】
本明細書の文脈において、「ｓｃＦｖ」とは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が１５～２０のアミノ酸の短ペプチド（ｌｉｎｋｅｒ、リンカー）を介して結合した抗体である単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）を指す。ｓｃＦｖ分子は、軽鎖可変領域、リンカー、及び重鎖可変領域で構成されるＣＡＲ分子の細胞外部分として理解できる。
【0040】
一つの具体的な実施形態において、前記ＣＡＲ分子が、リンカーによって連結された以下の配列：
ｓｃＦｖの軽鎖可変領域 配列番号１９
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ；
ｓｃＦｖの重鎖可変領域 配列番号２０
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
を含む。
ｓｃＦｖの軽鎖可変領域 配列番号１９
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ；
ｓｃＦｖの重鎖可変領域 配列番号２０
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
を含む。
【0041】
別の具体的な実施形態において、前記リンカーが（Ｇ）ｎ（Ｓ）ｍを含むアミノ酸配列であり、ｎが１～２０の正の整数であり、ｍが１～１０の正の整数である。具体的には、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０であり得、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であり得る。ここで、Ｇはグリシンの略号であり、Ｇｌｙと省略することもあり、Ｓはセリンの略号であり、Ｓｅｒと省略することもある。
【0042】
一つの具体的な実施形態において、前記リンカー配列が、配列番号２１に示される配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。
【0043】
別の具体的な実施形態において、前記ＣＡＲ分子のアミノ酸配列は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる。
【0044】
一つの具体的な実施形態において、前記ＴＲＡＣゲノム領域及び前記Ｂ２Ｍゲノム領域が、相同組換え、ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術によって破壊される。
【0045】
別の具体的な実施形態において、前記遺伝子編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術である。
【0046】
本出願で使用されたように、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」は遺伝子編集技術であり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのような、自然に存在するまたは人工的に設計された様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むが、これらに限られていない。自然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ）は、細菌と古細菌が長期的な進化中に形成した適応性免疫防御であり、侵入するウイルス及び外因性ＤＮＡと対抗することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の作動原理は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＮＡ）が塩基対を通してｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ）と結合してｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体を形成し、この複合体は、ヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質をガイドしてｃｒＲＮＡとペアになっている配列標的部位で二本鎖ＤＮＡを切断する。ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを人工的に設計することにより、ガイド作用を有するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を改変形成することができ、Ｃａｓ９がＤＮＡを固定点で切断することをガイドするには十分である。ＲＮＡ指向のｄｓＤＮＡ結合タンパク質として、Ｃａｓ９エフェクターヌクレアーゼは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質を共局在化することができるため、巨大な改変可能性を有する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、クラス１、クラス２、またはクラス３のＣａｓタンパク質が使用可能である。本発明の一部の実施形態では、前記方法にはＣａｓ９が使用される。その他の適用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＷＯ２０１３１７６７７２、ＷＯ２０１４０６５５９６、ＷＯ２０１４０１８４２３、ＵＳ８，６９７，３５９に記載されているシステムと方法を含むが、これらに限られていない。
【0047】
別の具体的な実施形態において、本願のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９方法では、
（ｉ）ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、配列番号２～５から選択されるいずれか１つの配列を有する；及び／または
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、配列番号６～１３から選択されるいずれか１つの配列を有する。
（ｉ）ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、配列番号２～５から選択されるいずれか１つの配列を有する；及び／または
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、配列番号６～１３から選択されるいずれか１つの配列を有する。
【0048】
本発明において、「ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ」と「ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」、または、「シングルガイドＲＮＡ」、「合成されたガイドＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」は、置き換えて使用できる。本発明のｓｇＲＮＡは、目的配列を標的とするガイド配列（ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。
【0049】
一般に、ｓｇＲＮＡの中のガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有し、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合をガイドする任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを行う場合、ガイド配列及びそれに対応する標的配列間の相補程度は約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７．５％以上、９９％以上またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定でき、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づいたアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｉ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＳＯＡＰ（ｓоａｐ．ｇｅｎоｍｉｃｓ．оｒｇ．ｃｎで入手可能）及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が含まれる。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約７５未満、７０未満、６５未満、６０未満、５５未満、５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１２未満、またはそれより少ないヌクレオチドであってもよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列の配列特異的結合をガイドするガイド配列の能力は、任意の適切な測定方法により評価することができる。例えば、対応する標的配列を有する宿主細胞に、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するには十分なＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネント（テストされるガイド配列を含む）を提供してもよく、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列コンポーネントをコードするベクターを使用してトランスフェクションし、そして標的配列内の優先的な切断を評価することで行うことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験管内で、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体（テストされるガイド配列と、ガイド配列と異なる対照ガイド配列とを含む）のコンポーネントを提供し、標的配列におけるテストと対照ガイド配列の結合または切断率を比較して評価することができる。また、当業者に既知の他の測定方法を使用して上記測定と評価を行うことができる。
【0050】
さらに別の具体的な実施形態において、前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を一緒にまたは別々に前記Ｔ細胞に導入する。
【0051】
一つの具体的な実施形態において、前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列をエレクトロポレーションによって一緒に前記Ｔ細胞に導入する。
【0052】
具体的には、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ及び／またはＣａｓ９をコードするヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、エレクトロポレーションによってＴ細胞に導入する。いくつかの実施形態において、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドは、エレクトロポレーションによってＴ細胞に一緒に導入される。
【0053】
具体的には、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドはｍＲＮＡであり、例えば、ＡＲＣＡキャップを含むｍＲＮＡである。一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターにある。一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドは、例えば、配列番号１の配列を含む。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドは同一のベクターにある。
【0054】
具体的には、前記エレクトロポレーション条件は、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；及び２５０Ｖ、０．５ｍｓの条件から選択されるいずれかである。
【0055】
本願では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡを同時にＴ細胞に導入する。具体的には、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡを同時にＴ細胞に導入する場合、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡのそれぞれの量は、互いに近いか、同等であってもよい。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡは任意の適切な順序で一つずつＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドを同時にＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡより、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドを先にＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドまたはＣａｓ９タンパク質を含む。
【0056】
本願では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子がノックアウトされる。例えば、いくつかの特定の実施形態において、本発明のＴＣＲ α鎖定常コード領域遺伝子は、前記細胞のＴＲＡＣ－ｓｇ２、３、４、６分子の１つに導入される（詳細については表１を参照）。
【0057】
【表1】
【0058】
一つの具体的な実施形態において、前記ｓｇＲＮＡが化学的に修飾されている。
【0059】
もう一つの具体的な実施形態において、前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む。
【0060】
別の具体的な実施形態において、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の３つの塩基及び３’末端の３つの塩基の２’－Ｏ－メチル修飾及びヌクレオチド間３’チオ修飾である。
【0061】
実施例に使用されている具体的な化学修飾の他に、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ＧＦ１，Ｄ案はＭＪ． Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ａｕｇ ２４；１９（８）：９３７－５４、及びＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｅｎｈａｎｃｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５ Ｓｅｐ；３３（９）：９８５－９８９の文献に報告された化学修飾方法など、その他の修飾方法を含む。
【0062】
本発明において、化学修飾されたｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９コード遺伝子を共にエレクトロポレーションによってＴ細胞に導入し、効率的な遺伝子編集効率（例えば、ＴＣＲα／β－Ｂ２Ｍ－％で表される）を生成し、ｓｇＲＮＡの化学修飾は本発明の肝心な要素の一つである。実施例のデータによって、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと一緒にエレクトロポレーションしたのは、化学修飾されていないｓｇＲＮＡである場合、そのＩｎｄｅｌｓ効率は、化学修飾されたｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションした時に得られた遺伝子編集効率よりはるかに低いことは示されている。一つの具体的な実施形態において、前記ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍのそれぞれのノックアウト効率が９０％、９２％、９４％、９６％、９８％以上であり、同時ノックアウト効率が７５％、８０％、８５％以上である。
【0063】
「ノックアウト効率」は、遺伝子レベルで遺伝子ノックアウトが発生したＩＮＤＥＬの効率を用いて表すことができる。また、細胞レベルで、その遺伝子ノックアウトによって遺伝子によって発現されたタンパク質が消失する、または有意に減少する細胞の百分比を用いて表すこともできる。本発明において、「ノックアウト効率」とは、後者に基づいて算出したノックアウト効率をいう。高いノックアウト効率が目標細胞の収量を増加させ、生産コスト及び治療コストを削減できることは、当業者が理解することができる。
【0064】
具体的には、遺伝子編集されたＴ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）をさらにスクリーニングしてより高純度の二重遺伝子（ＴＲＡＣとＢ２Ｍ）ノックアウトＴ細胞を取得する。例えば、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍの発現量の低い遺伝子編集されたＴ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）をＦＡＣＳでスクリーニングすることができる。
【0065】
具体的には、本発明のユニバーサルＴ細胞のＴＣＲ及び／またはＨＬＡ遺伝子がノックアウトされる。一部の具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）の遺伝子がノックアウトされる。Ｂ２Ｍのコード領域がノックアウトされる。
【0066】
一つの具体的な実施形態において、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とする前記ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を、ウイルストランスフェクションによって前記Ｔ細胞に導入して安定的に発現させる。具体的には、前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスである。
【0067】
いくつかの具体的な実施形態では、ステップ４）の培養プロセスとともに、天然ＴＣＲを発現するＴ細胞が除去される。本願では、この除去プロセスは「精製」とも呼ばれ、磁気ビーズを使用してＵ（ユニバーサル）ＣＡＲ－Ｔ細胞を精製する従来の方法の代替手段である。この方法による精製は、追加の精製ステップが必要とせず、細胞の損失がなく、それと共に、時間及びコストも削減できる。
【0068】
第２の態様では、本願は、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞に関する。
【0069】
一つの具体的な実施形態において、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が提供され、該細胞は、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を発現し、天然ＴＣＲ分子がない。別の具体的な実施形態において、前記ＣＡＲ分子が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。
【0070】
さらに別の具体的な実施形態において、クラス１ ＨＬＡタンパク質、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３から選択される１つまたは複数のタンパク質を低いレベルで発現するか、または発現しない、上記のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が提供される。
【0071】
本明細書の文脈では、ＣＤ２７９（分化のクラスター２７９）とも呼ばれるＰＤ－１（プログラム細胞死受容体１）は重要な免疫抑制分子である。ヒト細胞に対する免疫系の応答をダウンレギュレートし、Ｔ細胞の炎症活性を抑制することにより、免疫系を調節して自己耐性を促進する。ＰＤ－１、ＴＩＭ３、及び／またはＬＡＧ３遺伝子をノックダウンすることにより、Ｔ細胞はこれらのタンパク質を低いレベルで発現するか、またはまったく発現しないため、注入された外来Ｔ細胞に対する被験者の耐性が弱まり、除去が減少し、ＣＡＲ－Ｔ細胞が被験者体内において生存及び機能する時間を延長する。
【0072】
一つの具体的な実施形態において、上記のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を含む生物学的製品が提供される。
【0073】
第３の態様では、本願はユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の使用を提供する。
【0074】
一つの具体的な実施形態において、Ｔ細胞リンパ腫の治療のための薬剤の調製における、上記のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞または生物学的製品の使用が提供される。
【0075】
本明細書の文脈では、「Ｔ細胞リンパ腫（Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，ＴＣＬ）」は、異常なＴ細胞増殖によって現れる悪性腫瘍であり、非ホジキンリンパ腫の特殊なタイプに属し、発生率は低いが悪性度は高く、患者の１年生存率は低い。この疾患の臨床症状は、リンパ節腫脹、低抵抗、高カルシウム血症、骨侵食などである。Ｔ細胞リンパ腫は大よそ２つのカテゴリー、すなわち、Ｔ細胞前腫瘍と胸腺後Ｔ細胞リンパ腫に分けられ、リンパ節、リンパ節外組織、または皮膚に発生し得る。具体的な例としては、未分化大細胞リンパ腫（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ，ＡＬＣＬ）及び末梢Ｔ細胞リンパ腫（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，ＰＴＣＬ）が挙げられる。成熟または末梢Ｔ細胞リンパ腫は、進行性のＢ細胞リンパ腫と比較して予後が不良である。自然免疫系に由来する末梢Ｔ細胞リンパ腫は、主に結節外病変を伴う青年期に発生する傾向があり、好発部位は皮膚と粘膜であり、他の免疫系に由来する末梢Ｔ細胞リンパ腫は成人に発生する傾向があり、主にリンパ節転移を伴い、ＰＴＣＬの２／３以上を占める。
【0076】
もう一つの具体的な実施形態において、上記使用は、Ｔ細胞リンパ腫に罹患している被験者に、治療有効量の上記のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞または生物学的製品を投与することを含む。
【0077】
本発明に係るＣＡＲ－Ｔ細胞は、静脈注入経路など、細胞成分を含む医薬品を投与するために従来使用されている経路を通じて、それを必要とする被験者に投与することができる。投与量は、被験者の病状及び一般的な健康状況に基づいて具体的に決定することができる。
【0078】
増幅と遺伝子修飾をする前に、被験者からＴ細胞源が得られる。用語の「被験者」は、免疫応答を誘発することができる生物（例えば、哺乳動物）を含もうとする。被験者の例には、ヒトが含まれている。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍（Ｔ細胞リンパ腫は除外される）など、さまざまなソースから取得可能である。本発明のＴ細胞はまた、各分化段階にある造血幹細胞に由来することができる。方向性分化培養条件下で、造血幹細胞はＴ細胞に分化する。本発明のある局面では、本分野で利用可能な複数のＴ細胞株を使用することができる。
【0079】
本発明のある局面では、Ｔ細胞は、熟練技術者に既知の様々な技術、例えば、ＦｉｃｏｌｌＴＭを利用して被験者から収集された血液から単離して得てもよいし、アフェレーシス（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって個体の循環血液から細胞を得てもよい。アフェレーシスの産物は通常、Ｔ細胞、単核細胞、顆粒球、Ｂ細胞を含むリンパ球、その他の有核白血球、赤血球、血小板を含む。一局面では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿部分を除去し、後続の加工ステップのために細胞を適切な緩衝液または媒質に入れてもよい。
【0080】
赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配遠心分離または向流遠心分離によって単核細胞をパニングして枯渇させ、末梢血リンパ球からＴ細胞を分離することができる。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの特定のＴ細胞サブセットは、陽性または陰性選択技術によってさらに分離することができる。例えば、一態様では、Ｔ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ－４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）結合ビーズと一緒に、所望のＴ細胞に対して陽性選択するのに十分な時間でインキュベーションすることで分離する。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を腫瘍組織から分離することができる。
【0081】
次は具体的な実施例を通して本発明の内容を説明する。以下の具体的な実施例は、例示のみを目的としており、本発明の内容が具体的な実施例に限定されることを意味するものではないことを理解されたい。本明細書全文でいくつかの文献が引用されている。ここで、各文書（いずれのジャーナル記事または要約、公開済みまたは未公開の特許出願、登録された特許、メーカーの仕様書、プロトコルなどを含む）は言及により本文に取り込まれる。しかしながら、ここに引用された文書が実際に本発明の既存技術であると認めるわけではない。
【実施例1】
【0082】
実施例１：ユニバーサルＴ細胞の調製
ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製と増幅
ヒト末梢血から選別してＴ細胞を取得し、選別されたＴ細胞をサイトカインによって活性化させ、Ｔ細胞培養培地を利用して細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。７２時間後、細胞の状態を観察し、細胞懸濁液を収集し、３００ｇで７分間遠心分離し、上澄みを捨て、ＤＰＢＳ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１９２４２９４）で２回洗浄し、そしてエレクトロポレーション試薬培地で細胞密度を２．５×１０７細胞／ｍＬに調整した。合成したＣａｓ９ ｍＲＮＡ及び合成されたｓｇＲＮＡをＴ細胞とＲＮＡと均一に混合し、最終濃度が１００μＬ当たり２．５×１０６細胞と２μｇのＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡをそれぞれ２μｇ含む）を含むようにした。そして、エレクトロポレーターＢＴＸ Ａｇｉｌｅ ｐｕｌｓｅ ＭＡＸを使用してＲＮＡをＴ細胞に導入して培養した。細胞の成長状態を毎日観察し、１日おきに細胞を数えて液を補充し、４日目にＭＯＩ＝２－１０の比率で、ＣＡＲ（具体的な配列については以下を参照）（抗ＴＣＲα／βｓｃＦｖ、リンカー領域（Ｌｉｎｋｅｒ）、ＣＤ８ ａｌｐｈａヒンジ領域（ＣＤ８ ａｌｐｈａ ｈｉｎｇｅ）、ＣＤ８膜貫通領域（ＣＤ８ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄоｍａｉｎ）、４－１１ＢＢシグナル領域（４－１１ＢＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及びＣＤ３ ｚｅｔａ、具体的な構造についてＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１を参照）が包装されたレンチウイルスを加えた。
ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製と増幅
ヒト末梢血から選別してＴ細胞を取得し、選別されたＴ細胞をサイトカインによって活性化させ、Ｔ細胞培養培地を利用して細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。７２時間後、細胞の状態を観察し、細胞懸濁液を収集し、３００ｇで７分間遠心分離し、上澄みを捨て、ＤＰＢＳ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１９２４２９４）で２回洗浄し、そしてエレクトロポレーション試薬培地で細胞密度を２．５×１０７細胞／ｍＬに調整した。合成したＣａｓ９ ｍＲＮＡ及び合成されたｓｇＲＮＡをＴ細胞とＲＮＡと均一に混合し、最終濃度が１００μＬ当たり２．５×１０６細胞と２μｇのＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡをそれぞれ２μｇ含む）を含むようにした。そして、エレクトロポレーターＢＴＸ Ａｇｉｌｅ ｐｕｌｓｅ ＭＡＸを使用してＲＮＡをＴ細胞に導入して培養した。細胞の成長状態を毎日観察し、１日おきに細胞を数えて液を補充し、４日目にＭＯＩ＝２－１０の比率で、ＣＡＲ（具体的な配列については以下を参照）（抗ＴＣＲα／βｓｃＦｖ、リンカー領域（Ｌｉｎｋｅｒ）、ＣＤ８ ａｌｐｈａヒンジ領域（ＣＤ８ ａｌｐｈａ ｈｉｎｇｅ）、ＣＤ８膜貫通領域（ＣＤ８ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄоｍａｉｎ）、４－１１ＢＢシグナル領域（４－１１ＢＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及びＣＤ３ ｚｅｔａ、具体的な構造についてＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１を参照）が包装されたレンチウイルスを加えた。
【0083】
増殖培養プロセス中の細胞生存率の検出の結果を図１に示す。細胞培養の初期段階である４～８日目頃、Ｕ－ＣＡＲ－Ｔ（ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲを導入したユニバーサルＴ細胞）の添加で生存率は良くなかった。これは、細胞が自殺しても天然ＴＣＲα／βのＴ細胞を発現できるからであるが、後期細胞の生存率は他の２つの群とは有意な差がなかった。図２は、１３日間の培養後の細胞の増殖倍率を示している。ＣＡＲを添加した細胞の自殺により、増殖倍率は他の対照群ほど良くなかった。ただし、Ｕ－Ｔはさらに精製する必要があるため、精製を必要としないユニバーサルＣＡＲ－Ｔよりも最終的に得られた細胞の数が少なかった。
【0084】
細胞増殖と培養の過程で、フローサイトメトリーを使用してＣＡＲの発現率をモニタリングした。結果をそれぞれ図３に示す。ＣＡＲの陽性率は約１２．７６％であった。化学修飾されたＲＮＡは遺伝子ノックアウトに使用され、その編集効率は安定して効率的であり、図４に示すように、ＴＣＲ及びＢ２ＭがノックアウトされたＴ細胞はフローサイトメトリーによって検出され、二重遺伝子ノックアウト効率は８４．９５％であった。図５に示すように、ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲが添加された二重遺伝子ノックアウトＴ細胞は、そのＴＣＲとＢ２Ｍの陰性率は９８％を超え、ＴＣＲとＢ２Ｍを発現する細胞がさらに除去され、さらなる精製効果が収められ、プロセスが簡素化され、時間とコストが節約されるとともに、より多くの細胞が得られた。
【0085】
ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞のスクリーニング
ＴＣＲ及びＢ２Ｍ陰性、ＣＤ４及びＣＤ８陽性なＴ細胞を下記の方法でスクリーニングした。
ＴＣＲ及びＢ２Ｍ陰性、ＣＤ４及びＣＤ８陽性なＴ細胞を下記の方法でスクリーニングした。
【0086】
免疫磁気ビーズを利用してＴＣＲ及びＢ２Ｍ陰性、ＣＤ４及びＣＤ８陽性なＴ細胞をスクリーニングし、編集されたＴ細胞の状態をＴ細胞生存率によってモニタリングした。具体的なステップは下記通りである：
第１ステップでは、１２～１４日目に、エレクトロポレーションされたＴ細胞を収集し、４００Ｇで５分間遠心分離し、上澄みを捨て、Ｅａｓｙ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を１×１０８／ｍｌに溶解してから、細胞を５ｍｌフローサイトメトリーチューブに移した。スクリーニングビーズを利用して、Ｔ細胞中の、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍを依然として発現している細胞を除去し、スクリーニングして最終的な製品、すなわちユニバーサルＴ細胞を得た。
第２ステップでは、少量のＴ細胞を取ってフローサイトメトリー検出をすると共に、ＴＣＲ及びＢ２Ｍ細胞表面のバイオマーカーを染色した。ＴＣＲ及び／またはＢ２Ｍの陽性率は１％未満である場合、次のステップに進むことができる。本実施例では、ＴＣＲ陽性率は１％であり、ＴＣＲとＢ２Ｍ ＤＫＯのＴ細胞陽性率は０．７９％未満である。
第１ステップでは、１２～１４日目に、エレクトロポレーションされたＴ細胞を収集し、４００Ｇで５分間遠心分離し、上澄みを捨て、Ｅａｓｙ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を１×１０８／ｍｌに溶解してから、細胞を５ｍｌフローサイトメトリーチューブに移した。スクリーニングビーズを利用して、Ｔ細胞中の、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍを依然として発現している細胞を除去し、スクリーニングして最終的な製品、すなわちユニバーサルＴ細胞を得た。
第２ステップでは、少量のＴ細胞を取ってフローサイトメトリー検出をすると共に、ＴＣＲ及びＢ２Ｍ細胞表面のバイオマーカーを染色した。ＴＣＲ及び／またはＢ２Ｍの陽性率は１％未満である場合、次のステップに進むことができる。本実施例では、ＴＣＲ陽性率は１％であり、ＴＣＲとＢ２Ｍ ＤＫＯのＴ細胞陽性率は０．７９％未満である。
【0087】
実施例２：実施例１で得られたユニバーサルＣＡＲ－Ｔの機能検証
実施例１で得られたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞（すなわち、エフェクター細胞）の、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病細胞に対する殺傷効果が観察された。
実施例１で得られたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞（すなわち、エフェクター細胞）の、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病細胞に対する殺傷効果が観察された。
【0088】
一、特異的腫瘍細胞に対するインビトロ殺傷効果
本発明の実験ステップは下記通りである：
ステップ１：標的細胞の標識
ＣＥＬＬ ＴＲＡＣＥ（商標） Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１８８８５６９）を用いて標的細胞（ヒトリンパ腫細胞Ｊｕｒｋａｔ、すべての細胞はＡＴＣＣに由来）を標識した。
１． ＣＥＬＬ ＴＲＡＣＥ（商標） Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎを再蒸留水で１ｍｍоｌの溶液に希釈した；
２． １×１０６個の標的細胞を取り、４００ｇで５分間遠心分離して上澄みを除去した；
３． １μｌのＣＥＬＬ ＴＲＡＣＥ（商標） Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ溶液を加え、３７℃の暗所で２０分間インキュベーションした；
４． 細胞をＴ細胞培養培地に加え、３７℃で５分間インキュベーションした；
５． ４００ｇで５分間遠心分離した後、上澄みを除去し、標識を完了した。
ステップ２：標的細胞に対するエフェクター細胞の殺傷検出
標識された標的細胞を２×１０５個の細胞／ｍＬの密度でＲ１６４０＋１０％ＦＢＳ培養液で再懸濁し、５００μＬを取って４８ウェルプレートに加えた。適切なエフェクター細胞と標的細胞との比率（２．５：１、１．２５：１、０．６：１）で、各ウェルに５００μｌのエフェクター細胞を加えると共に、Ｔ細胞と健康なヒト臍帯血ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｔ細胞培養の２日目に、ＣＡＲ（具体的な構造について、ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１を参照）が包装されているレンチウイルスをＭＯＩ＝２～１０の比率で加えて得られたＣＡＲ－Ｔ）を対照細胞として、各群に３つが平行し、個別の標的細胞群を設計し、その死亡率を検出した。３７℃、５％ＣＯ２で１２～１６時間培養し、４００ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを取り、１５０μｌのＤＰＢＳ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１９２４２９４）で再懸濁した。ＰＩ（メーカー：Ｓｉｇｍａ；カタログ番号：Ｐ４１７０）で染色した後、フローサイトメトリーで標的細胞の死亡率を検出した。その結果を図６に示すように、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、高効率の特異的殺傷効果を示している。また、非特異的な標的細胞に対して殺傷効果はほとんどない。
ステップ３：ＥＬＩＳＡによるサイトカイン放出の検出
標識された標的細胞を２×１０５個の細胞／ｍＬの密度でＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳで再懸濁し、５００μＬを取って４８ウェルプレートに加えた。適切なエフェクター細胞と標的細胞との比率（１０：１）で、各ウェルに５００μｌのエフェクター細胞を加えると共に、Ｔ細胞と健康なヒト臍帯血ＣＡＲ－Ｔ細胞を対照細胞として、各群に３つが平行し、個別の標的細胞群を設計した。３７℃、５％ＣＯ２で１２～１６時間培養し、各ウェルから１００μｌの培養上澄みを取り、４００ｇで５分間遠心分離して細胞ペレットを除去し、上澄みを取ってからＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸ（商標） Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２／ＩＦＮ－ｇａｍａ（メーカー：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号：４３１８０７、４３０１０８）キットを用いて、プロトコルに従ってサイトカイン放出を検出した。その結果を図７に示す。
本発明の実験ステップは下記通りである：
ステップ１：標的細胞の標識
ＣＥＬＬ ＴＲＡＣＥ（商標） Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１８８８５６９）を用いて標的細胞（ヒトリンパ腫細胞Ｊｕｒｋａｔ、すべての細胞はＡＴＣＣに由来）を標識した。
１． ＣＥＬＬ ＴＲＡＣＥ（商標） Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎを再蒸留水で１ｍｍоｌの溶液に希釈した；
２． １×１０６個の標的細胞を取り、４００ｇで５分間遠心分離して上澄みを除去した；
３． １μｌのＣＥＬＬ ＴＲＡＣＥ（商標） Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ溶液を加え、３７℃の暗所で２０分間インキュベーションした；
４． 細胞をＴ細胞培養培地に加え、３７℃で５分間インキュベーションした；
５． ４００ｇで５分間遠心分離した後、上澄みを除去し、標識を完了した。
ステップ２：標的細胞に対するエフェクター細胞の殺傷検出
標識された標的細胞を２×１０５個の細胞／ｍＬの密度でＲ１６４０＋１０％ＦＢＳ培養液で再懸濁し、５００μＬを取って４８ウェルプレートに加えた。適切なエフェクター細胞と標的細胞との比率（２．５：１、１．２５：１、０．６：１）で、各ウェルに５００μｌのエフェクター細胞を加えると共に、Ｔ細胞と健康なヒト臍帯血ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｔ細胞培養の２日目に、ＣＡＲ（具体的な構造について、ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１を参照）が包装されているレンチウイルスをＭＯＩ＝２～１０の比率で加えて得られたＣＡＲ－Ｔ）を対照細胞として、各群に３つが平行し、個別の標的細胞群を設計し、その死亡率を検出した。３７℃、５％ＣＯ２で１２～１６時間培養し、４００ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを取り、１５０μｌのＤＰＢＳ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１９２４２９４）で再懸濁した。ＰＩ（メーカー：Ｓｉｇｍａ；カタログ番号：Ｐ４１７０）で染色した後、フローサイトメトリーで標的細胞の死亡率を検出した。その結果を図６に示すように、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、高効率の特異的殺傷効果を示している。また、非特異的な標的細胞に対して殺傷効果はほとんどない。
ステップ３：ＥＬＩＳＡによるサイトカイン放出の検出
標識された標的細胞を２×１０５個の細胞／ｍＬの密度でＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳで再懸濁し、５００μＬを取って４８ウェルプレートに加えた。適切なエフェクター細胞と標的細胞との比率（１０：１）で、各ウェルに５００μｌのエフェクター細胞を加えると共に、Ｔ細胞と健康なヒト臍帯血ＣＡＲ－Ｔ細胞を対照細胞として、各群に３つが平行し、個別の標的細胞群を設計した。３７℃、５％ＣＯ２で１２～１６時間培養し、各ウェルから１００μｌの培養上澄みを取り、４００ｇで５分間遠心分離して細胞ペレットを除去し、上澄みを取ってからＬＥＧＥＮＤ ＭＡＸ（商標） Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２／ＩＦＮ－ｇａｍａ（メーカー：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号：４３１８０７、４３０１０８）キットを用いて、プロトコルに従ってサイトカイン放出を検出した。その結果を図７に示す。
【0089】
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して上で説明したが、本発明は、上記の特定の実施形態及び応用分野に限定されず、上記の具体的な実施形態は、単に例示的であり、ガイドに過ぎず、限定的ではない。本明細書の教示の下で、本発明の特許請求の範囲によって保護される範囲から逸脱することなく、当業者はまた多くの形態を作ることができ、これらはすべて本発明の保護範囲に属する。
【0090】
配列表
配列番号１：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ配列
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配列番号１：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ配列
ｇａｃａａｇａａｇｕａｃａｇｃａｕｃｇｇｃｃｕｇｇａｃａｕｃｇｇｃａｃｃａａｃｕｃｕｇｕｇｇｇｃｕｇｇｇｃｃｇｕｇａｕｃａｃｃｇａｃｇａｇｕａｃａａｇｇｕｇｃｃｃａｇｃａａｇａａａｕｕｃａａｇｇｕｇｃｕｇｇｇｃａａｃａｃｃｇａｃｃｇｇｃａｃａｇｃａｕｃａａｇａａｇａａｃｃｕｇａｕｃｇｇａｇｃｃｃｕｇｃｕｇｕｕｃｇａｃａｇｃｇｇｃｇａａａｃａｇｃｃｇａｇｇｃｃａｃｃｃｇｇｃｕｇａａｇａｇａａｃｃｇｃｃａｇａａｇａａｇａｕａｃａｃｃａｇａｃｇｇａａｇａａｃｃｇｇａｕｃｕｇｃｕａｕｃｕｇｃａａｇａｇａｕｃｕｕｃａｇｃａａｃｇａｇａｕｇｇｃｃａａｇｇｕｇｇａｃｇａｃａｇｃｕｕｃｕｕｃｃａｃａｇａｃｕｇｇａａｇａｇｕｃｃｕｕｃｃｕｇｇｕｇｇａａｇａｇｇａｕａａｇａａｇｃａｃｇａｇｃｇｇｃａｃｃｃｃａｕｃｕｕｃｇｇｃａａｃａｕｃｇｕｇｇａｃｇａｇｇｕｇｇｃｃｕａｃｃａｃｇａｇａａｇｕａｃｃｃｃａｃｃａｕｃｕａｃｃａｃｃｕｇａｇａａａｇａａａｃｕｇｇｕｇｇａｃａｇｃａｃｃｇａｃａａｇｇｃｃｇａｃｃｕｇｃｇｇｃｕｇａｕｃｕａｕｃｕｇｇｃｃｃｕｇｇｃｃｃａｃａｕｇａｕｃａａｇｕｕｃｃｇｇｇｇｃｃａｃｕｕｃｃｕｇａｕｃｇａｇｇｇｃｇａｃｃｕｇａａｃｃｃｃｇａｃａａｃａｇｃｇａｃｇｕｇｇａｃａａｇｃｕｇｕｕｃａｕｃｃａｇｃｕｇｇｕｇｃａｇａｃｃｕａｃａａｃｃａｇｃｕｇｕｕｃｇａｇｇａａａａｃｃｃｃａｕｃａａｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｕｇｇａｃｇｃｃａａｇｇｃｃａｕｃｃｕｇｕｃｕｇｃｃａｇａｃｕｇａｇｃａａｇａｇｃａｇａｃｇｇｃｕｇｇａａａａｕｃｕｇａｕｃｇｃｃｃａｇｃｕｇｃｃｃｇｇｃｇａｇａａｇａａｇａａｕｇｇｃｃｕｇｕｕｃｇｇｃａａｃｃｕｇａｕｕｇｃｃｃｕｇａｇｃｃｕｇｇｇｃｃｕｇａｃｃｃｃｃａａｃｕｕｃａａｇａｇｃａａｃｕｕｃｇａｃｃｕｇｇｃｃｇａｇｇａｕｇｃｃａａａｃｕｇｃａｇｃｕｇａｇｃａａｇｇａｃａｃｃｕａｃｇａｃｇａｃｇａｃｃｕｇｇａｃａａｃｃｕｇｃｕｇｇｃｃｃａｇａｕｃｇｇｃｇａｃｃａｇｕａｃｇｃｃｇａｃｃｕｇｕｕｕｃｕｇｇｃｃｇｃｃａａｇａａｃｃｕｇｕｃｃｇａｃｇｃｃａｕｃｃｕｇｃｕｇａｇｃｇａｃａｕｃｃｕｇａｇａｇｕｇａａｃａｃｃｇａｇａｕｃａｃｃａａｇｇｃｃｃｃｃｃｕｇａｇｃｇｃｃｕｃｕａｕｇａｕｃａａｇａｇａｕａｃｇａｃｇａｇｃａｃｃａｃｃａｇｇａｃｃｕｇａｃｃｃｕｇｃｕｇａａａｇｃｕｃｕｃｇｕｇｃｇｇｃａｇｃａｇｃｕｇｃｃｕｇａｇａａｇｕａｃａａａｇａｇａｕｕｕｕｃｕｕｃｇａｃｃａｇａｇｃａａｇａａｃｇｇｃｕａｃｇｃｃｇｇｃｕａｃａｕｕｇａｃｇｇｃｇｇａｇｃｃａｇｃｃａｇｇａａｇａｇｕｕｃｕａｃａａｇｕｕｃａｕｃａａｇｃｃｃａｕｃｃｕｇｇａａａａｇａｕｇｇａｃｇｇｃａｃｃｇａｇｇａａｃｕｇｃｕｃｇｕｇａａｇｃｕｇａａｃａｇａｇａｇｇａｃｃｕｇｃｕｇｃｇｇａａｇｃａｇｃｇｇａｃｃｕｕｃｇａｃａａｃｇｇｃａｇｃａｕｃｃｃｃｃａｃｃａｇａｕｃｃａｃｃｕｇｇｇａｇａｇｃｕｇｃａｃｇｃｃａｕｕｃｕｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｇａａｇａｕｕｕｕｕａｃｃｃａｕｕｃｃｕｇａａｇｇａｃａａｃｃｇｇｇａａａａｇａｕｃｇａｇａａｇａｕｃｃｕｇａｃｃｕｕｃｃｇｃａｕｃｃｃｃｕａｃｕａｃｇｕｇｇｇｃｃｃｕｃｕｇｇｃｃａｇｇｇｇａａａｃａｇｃａｇａｕｕｃｇｃｃｕｇｇａｕｇａｃｃａｇａａａｇａｇｃｇａｇｇａａａｃｃａｕｃａｃｃｃｃｃｕｇｇａａｃｕｕｃｇａｇｇａａｇｕｇｇｕｇｇａｃａａｇｇｇｃｇｃｕｕｃｃｇｃｃｃａｇａｇｃｕｕｃａｕｃｇａｇｃｇｇａｕｇａｃｃａａｃｕｕｃｇａｕａａｇａａｃｃｕｇｃｃｃａａｃｇａｇａａｇｇｕｇｃｕｇｃｃｃａａｇｃａｃａｇｃｃｕｇｃｕｇｕａｃｇａｇｕａｃｕｕｃａｃｃｇｕｇｕａｕａａｃｇａｇｃｕｇａｃｃａａａｇｕｇａａａｕａｃｇｕｇａｃｃｇａｇｇｇａａｕｇａｇａａａｇｃｃｃｇｃｃｕｕｃｃｕｇａｇｃｇｇｃｇａｇｃａｇａａａａａｇｇｃｃａｕｃｇｕｇｇａｃｃｕｇｃｕｇｕｕｃａａｇａｃｃａａｃｃｇｇａａａｇｕｇａｃｃｇｕｇａａｇｃａｇｃｕｇａａａｇａｇｇａｃｕａｃｕｕｃａａｇａａａａｕｃｇａｇｕｇｃｕｕｃｇａｃｕｃｃｇｕｇｇａａａｕｃｕｃｃｇｇｃｇｕｇｇａａｇａｕｃｇｇｕｕｃａａｃｇｃｃｕｃｃｃｕｇｇｇｃａｃａｕａｃｃａｃｇａｕｃｕｇｃｕｇａａａａｕｕａｕｃａａｇｇａｃａａｇｇａｃｕｕｃｃｕｇｇａｃａａｕｇａｇｇａａａａｃｇａｇｇａｃａｕｕｃｕｇｇａａｇａｕａｕｃｇｕｇｃｕｇａｃｃｃｕｇａｃａｃｕｇｕｕｕｇａｇｇａｃａｇａｇａｇａｕｇａｕｃｇａｇｇａａｃｇｇｃｕｇａａａａｃｃｕａｕｇｃｃｃａｃｃｕｇｕｕｃｇａｃｇａｃａａａｇｕｇａｕｇａａｇｃａｇｃｕｇａａｇｃｇｇｃｇｇａｇａｕａｃａｃｃｇｇｃｕｇｇｇｇｃａｇｇｃｕｇａｇｃｃｇｇａａｇｃｕｇａｕｃａａｃｇｇｃａｕｃｃｇｇｇａｃａａｇｃａｇｕｃｃｇｇｃａａｇａｃａａｕｃｃｕｇｇａｕｕｕｃｃｕｇａａｇｕｃｃｇａｃｇｇｃｕｕｃｇｃｃａａｃａｇａａａｃｕｕｃａｕｇｃａｇｃｕｇａｕｃｃａｃｇａｃｇａｃａｇｃｃｕｇａｃｃｕｕｕａａａｇａｇｇａｃａｕｃｃａｇａａａｇｃｃｃａｇｇｕｇｕｃｃｇｇｃｃａｇｇｇｃｇａｕａｇｃｃｕｇｃａｃｇａｇｃａｃａｕｕｇｃｃａａｕｃｕｇｇｃｃｇｇｃａｇｃｃｃｃｇｃｃａｕｕａａｇａａｇｇｇｃａｕｃｃｕｇｃａｇａｃａｇｕｇａａｇｇｕｇｇｕｇｇａｃｇａｇｃｕｃｇｕｇａａａｇｕｇａｕｇｇｇｃｃｇｇｃａｃａａｇｃｃｃｇａｇａａｃａｕｃｇｕｇａｕｃｇａａａｕｇｇｃｃａｇａｇａｇａａｃｃａｇａｃｃａｃｃｃａｇａａｇｇｇａｃａｇａａｇａａｃａｇｃｃｇｃｇａｇａｇａａｕｇａａｇｃｇｇａｕｃｇａａｇａｇｇｇｃａｕｃａａａｇａｇｃｕｇｇｇｃａｇｃｃａｇａｕｃｃｕｇａａａｇａａｃａｃｃｃｃｇｕｇｇａａａａｃａｃｃｃａｇｃｕｇｃａｇａａｃｇａｇａａｇｃｕｇｕａｃｃｕｇｕａｃｕａｃｃｕｇｃａｇａａｕｇｇｇｃｇｇｇａｕａｕｇｕａｃｇｕｇｇａｃｃａｇｇａａｃｕｇｇａｃａｕｃａａｃｃｇｇｃｕｇｕｃｃｇａｃｕａｃｇａｕｇｕｇｇａｃｃａｕａｕｃｇｕｇｃｃｕｃａｇａｇｃｕｕｕｃｕｇａａｇｇａｃｇａｃｕｃｃａｕｃｇａｃａａｃａａｇｇｕｇｃｕｇａｃｃａｇａａｇｃｇａｃａａｇａａｃｃｇｇｇｇｃａａｇａｇｃｇａｃａａｃｇｕｇｃｃｃｕｃｃｇａａｇａｇｇｕｃｇｕｇａａｇａａｇａｕｇａａｇａａｃｕａｃｕｇｇｃｇｇｃａｇｃｕｇｃｕｇａａｃｇｃｃａａｇｃｕｇａｕｕａｃｃｃａｇａｇａａａｇｕｕｃｇａｃａａｕｃｕｇａｃｃａａｇｇｃｃｇａｇａｇａｇｇｃｇｇｃｃｕｇａｇｃｇａａｃｕｇｇａｕａａｇｇｃｃｇｇｃｕｕｃａｕｃａａｇａｇａｃａｇｃｕｇｇｕｇｇａａａｃｃｃｇｇｃａｇａｕｃａｃａａａｇｃａｃｇｕｇｇｃａｃａｇａｕｃｃｕｇｇａｃｕｃｃｃｇｇａｕｇａａｃａｃｕａａｇｕａｃｇａｃｇａｇａａｕｇａｃａａｇｃｕｇａｕｃｃｇｇｇａａｇｕｇａａａｇｕｇａｕｃａｃｃｃｕｇａａｇｕｃｃａａｇｃｕｇｇｕｇｕｃｃｇａｕｕｕｃｃｇｇａａｇｇａｕｕｕｃｃａｇｕｕｕｕａｃａａａｇｕｇｃｇｃｇａｇａｕｃａａｃａａｃｕａｃｃａｃｃａｃｇｃｃｃａｃｇａｃｇｃｃｕａｃｃｕｇａａｃｇｃｃｇｕｃｇｕｇｇｇａａｃｃｇｃｃｃｕｇａｕｃａａａａａｇｕａｃｃｃｕａａｇｃｕｇｇａａａｇｃｇａｇｕｕｃｇｕｇｕａｃｇｇｃｇａｃｕａｃａａｇｇｕｇｕａｃｇａｃｇｕｇｃｇｇａａｇａｕｇａｕｃｇｃｃａａｇａｇｃｇａｇｃａｇｇａａａｕｃｇｇｃａａｇｇｃｕａｃｃｇｃｃａａｇｕａｃｕｕｃｕｕｃｕａｃａｇｃａａｃａｕｃａｕｇａａｃｕｕｕｕｕｃａａｇａｃｃｇａｇａｕｕａｃｃｃｕｇｇｃｃａａｃｇｇｃｇａｇａｕｃｃｇｇａａｇｃｇｇｃｃｕｃｕｇａｕｃｇａｇａｃａａａｃｇｇｃｇａａａｃｃｇｇｇｇａｇａｕｃｇｕｇｕｇｇｇａｕａａｇｇｇｃｃｇｇｇａｕｕｕｕｇｃｃａｃｃｇｕｇｃｇｇａａａｇｕｇｃｕｇａｇｃａｕｇｃｃｃｃａａｇｕｇａａｕａｕｃｇｕｇａａａａａｇａｃｃｇａｇｇｕｇｃａｇａｃａｇｇｃｇｇｃｕｕｃａｇｃａａａｇａｇｕｃｕａｕｃｃｕｇｃｃｃａａｇａｇｇａａｃａｇｃｇａｕａａｇｃｕｇａｕｃｇｃｃａｇａａａｇａａｇｇａｃｕｇｇｇａｃｃｃｕａａｇａａｇｕａｃｇｇｃｇｇｃｕｕｃｇａｃａｇｃｃｃｃａｃｃｇｕｇｇｃｃｕａｕｕｃｕｇｕｇｃｕｇｇｕｇｇｕｇｇｃｃａａａｇｕｇｇａａａａｇｇｇｃａａｇｕｃｃａａｇａａａｃｕｇａａｇａｇｕｇｕｇａａａｇａｇｃｕｇｃｕｇｇｇｇａｕｃａｃｃａｕｃａｕｇｇａａａｇａａｇｃａｇｃｕｕｃｇａｇａａｇａａｕｃｃｃａｕｃｇａｃｕｕｕｃｕｇｇａａｇｃｃａａｇｇｇｃｕａｃａａａｇａａｇｕｇａａａａａｇｇａｃｃｕｇａｕｃａｕｃａａｇｃｕｇｃｃｕａａｇｕａｃｕｃｃｃｕｇｕｕｃｇａｇｃｕｇｇａａａａｃｇｇｃｃｇｇａａｇａｇａａｕｇｃｕｇｇｃｃｕｃｕｇｃｃｇｇｃｇａａｃｕｇｃａｇａａｇｇｇａａａｃｇａａｃｕｇｇｃｃｃｕｇｃｃｃｕｃｃａａａｕａｕｇｕｇａａｃｕｕｃｃｕｇｕａｃｃｕｇｇｃｃａｇｃｃａｃｕａｕｇａｇａａｇｃｕｇａａｇｇｇｃｕｃｃｃｃｃｇａｇｇａｕａａｕｇａｇｃａｇａａａｃａｇｃｕｇｕｕｕｇｕｇｇａａｃａｇｃａｃａａｇｃａｃｕａｃｃｕｇｇａｃｇａｇａｕｃａｕｃｇａｇｃａｇａｕｃａｇｃｇａｇｕｕｃｕｃｃａａｇａｇａｇｕｇａｕｃｃｕｇｇｃｃｇａｃｇｃｕａａｕｃｕｇｇａｃａａａｇｕｇｃｕｇｕｃｃｇｃｃｕａｃａａｃａａｇｃａｃｃｇｇｇａｕａａｇｃｃｃａｕｃａｇａｇａｇｃａｇｇｃｃｇａｇａａｕａｕｃａｕｃｃａｃｃｕｇｕｕｕａｃｃｃｕｇａｃｃａａｕｃｕｇｇｇａｇｃｃｃｃｕｇｃｃｇｃｃｕｕｃａａｇｕａｃｕｕｕｇａｃａｃｃａｃｃａｕｃｇａｃｃｇｇａａｇａｇｇｕａｃａｃｃａｇｃａｃｃａａａｇａｇｇｕｇｃｕｇｇａｃｇｃｃａｃｃｃｕｇａｕｃｃａｃｃａｇａｇｃａｕｃａｃｃｇｇｃｃｕｇｕａｃｇａｇａｃａｃｇｇａｕｃｇａｃｃｕｇｕｃｕｃａｇｃｕｇｇｇａｇｇｃｇａｃ
【0091】
ＴＲＡＣ－ｓｇ２（Ｔ２）配列：配列番号２
ｇｃｕｇｇｕａｃａｃｇｇｃａｇｇｇｕｃａ
ｇｃｕｇｇｕａｃａｃｇｇｃａｇｇｇｕｃａ
【0092】
ＴＲＡＣ－ｓｇ３（Ｔ３）配列：配列番号３
ｃｕｃｕｃａｇｃｕｇｇｕａｃａｃｇｇｃａ
ｃｕｃｕｃａｇｃｕｇｇｕａｃａｃｇｇｃａ
【0093】
ＴＲＡＣ－ｓｇ４（Ｔ４）配列：配列番号４
ａｕｕｕｇｕｕｕｇａｇａａｕｃａａａａｕ
ａｕｕｕｇｕｕｕｇａｇａａｕｃａａａａｕ
【0094】
ＴＲＡＣ－ｓｇ６（Ｔ６）配列：配列番号５
ｕｃｕｃｕｃａｇｃｕｇｇｕａｃａｃｇｇｃ
ｕｃｕｃｕｃａｇｃｕｇｇｕａｃａｃｇｇｃ
【0095】
Ｂ２Ｍ－ｓｇ１（Ｂ１）配列：配列番号６
ａｃｕｃｕｃｕｃｕｕｕｃｕｇｇｃｃｕｇｇ
ａｃｕｃｕｃｕｃｕｕｕｃｕｇｇｃｃｕｇｇ
【0096】
Ｂ２Ｍ－ｓｇ２（Ｂ２）配列：配列番号７
ｇａｇｕａｇｃｇｃｇａｇｃａｃａｇｃｕａ
ｇａｇｕａｇｃｇｃｇａｇｃａｃａｇｃｕａ
【0097】
Ｂ２Ｍ－ｓｇ３（Ｂ３）配列：配列番号８
ｃｇｃｇａｇｃａｃａｇｃｕａａｇｇｃｃａ
ｃｇｃｇａｇｃａｃａｇｃｕａａｇｇｃｃａ
【0098】
Ｂ２Ｍ－ｓｇ４（Ｂ４）配列：配列番号９
ｕｃａｃｇｕｃａｕｃｃａｇｃａｇａｇａａ
ｕｃａｃｇｕｃａｕｃｃａｇｃａｇａｇａａ
【0099】
Ｂ２Ｍ－ｓｇ５（Ｂ５）配列：配列番号１０
ｇｃｕａｃｕｃｕｃｕｃｕｕｕｃｕｇｇｃｃ
ｇｃｕａｃｕｃｕｃｕｃｕｕｕｃｕｇｇｃｃ
【0100】
Ｂ２Ｍ－ｓｇ６（Ｂ６）配列：配列番号１１
ｕｕｕｇａｃｕｕｕｃｃａｕｕｃｕｃｕｇｃ
ｕｕｕｇａｃｕｕｕｃｃａｕｕｃｕｃｕｇｃ
【0101】
Ｂ２Ｍ－ｓｇ７（Ｂ７）配列：配列番号１２
ｃｇｕｇａｇｕａａａｃｃｕｇａａｕｃｕｕ
ｃｇｕｇａｇｕａａａｃｃｕｇａａｕｃｕｕ
【0102】
Ｂ２Ｍ－ｓｇ８（Ｂ８）配列：配列番号１３
ｃｕｃｇｃｇｃｕａｃｕｃｕｃｕｃｕｕｕｃ
ｃｕｃｇｃｇｃｕａｃｕｃｕｃｕｃｕｕｕｃ
【0103】
抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖのアミノ酸配列：配列番号１４
【0104】
【化1】
【0105】
ここで、下線の付いた部分はリンカー（すなわちＬｉｎｋｅｒ）配列である。
【0106】
ＣＤ８ ａｌｐｈａヒンジ領域のヌクレオチド配列：配列番号１５
ａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇｃｃｇｃｇａｃｃａｃｃａａｃａｃｃｇｇｃｇｃｃｃａｃｃａｔｃｇｃｇｔｃｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃｃａｇａｇｇｃｇｔｇｃｃｇｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｇｇｇｇｇｃｇｃａｇｔｇｃａｃａｃｇａｇｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｔｇａｔ
ａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇｃｃｇｃｇａｃｃａｃｃａａｃａｃｃｇｇｃｇｃｃｃａｃｃａｔｃｇｃｇｔｃｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃｃａｇａｇｇｃｇｔｇｃｃｇｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｇｇｇｇｇｃｇｃａｇｔｇｃａｃａｃｇａｇｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｔｇａｔ
【0107】
ＣＤ８膜貫通領域のヌクレオチド配列：配列番号１６
ａｔｃｔａｃａｔｃｔｇｇｇｃｇｃｃｃｔｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｃｔｇｇｔｔａｔｃａｃｃｃｔｔｔａｃｔｇｃ
ａｔｃｔａｃａｔｃｔｇｇｇｃｇｃｃｃｔｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｃｔｇｇｔｔａｔｃａｃｃｃｔｔｔａｃｔｇｃ
【0108】
４－１１ＢＢシグナル領域のヌクレオチド配列：配列番号１７
ａａａｃｇｇｇｇｃａｇａａａｇａａａｃｔｃｃｔｇｔａｔａｔａｔｔｃａａａｃａａｃｃａｔｔｔａｔｇａｇａｃｃａｇｔａｃａａａｃｔａｃｔｃａａｇａｇｇａａｇａｔｇｇｃｔｇｔａｇｃｔｇｃｃｇａｔｔｔｃｃａｇａａｇａａｇａａｇａａｇｇａｇｇａｔｇｔｇａａｃｔｇ
ａａａｃｇｇｇｇｃａｇａａａｇａａａｃｔｃｃｔｇｔａｔａｔａｔｔｃａａａｃａａｃｃａｔｔｔａｔｇａｇａｃｃａｇｔａｃａａａｃｔａｃｔｃａａｇａｇｇａａｇａｔｇｇｃｔｇｔａｇｃｔｇｃｃｇａｔｔｔｃｃａｇａａｇａａｇａａｇａａｇｇａｇｇａｔｇｔｇａａｃｔｇ
【0109】
ＣＤ３ ｚｅｔａのヌクレオチド配列：配列番号１８
ａｇａｇｔｇａａｇｔｔｃａｇｃａｇｇａｇｃｇｃａｇａｃｇｃｃｃｃｃｇｃｇｔａｃａａｇｃａｇｇｇｃｃａｇａａｃｃａｇｃｔｃｔａｔａａｃｇａｇｃｔｃａａｔｃｔａｇｇａｃｇａａｇａｇａｇｇａｇｔａｃｇａｔｇｔｔｔｔｇｇａｃａａｇａｇａｃｇｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａｔｇｇｇｇｇｇａａａｇｃｃｇａｇａａｇｇａａｇａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｃａａｔｇａａｃｔｇｃａｇａａａｇａｔａａｇａｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔａｃａｇｔｇａｇａｔｔｇｇｇａｔｇａａａｇｇｃｇａｇｃｇｃｃｇｇａｇｇｇｇｃａａｇｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｃｃｔｔｔａｃｃａｇｇｇｔｃｔｃａｇｔａｃａｇｃｃａｃｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｃｇａｃｇｃｃｃｔｔｃａｃａｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｔｃｇｃ
ａｇａｇｔｇａａｇｔｔｃａｇｃａｇｇａｇｃｇｃａｇａｃｇｃｃｃｃｃｇｃｇｔａｃａａｇｃａｇｇｇｃｃａｇａａｃｃａｇｃｔｃｔａｔａａｃｇａｇｃｔｃａａｔｃｔａｇｇａｃｇａａｇａｇａｇｇａｇｔａｃｇａｔｇｔｔｔｔｇｇａｃａａｇａｇａｃｇｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａｔｇｇｇｇｇｇａａａｇｃｃｇａｇａａｇｇａａｇａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｃａａｔｇａａｃｔｇｃａｇａａａｇａｔａａｇａｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔａｃａｇｔｇａｇａｔｔｇｇｇａｔｇａａａｇｇｃｇａｇｃｇｃｃｇｇａｇｇｇｇｃａａｇｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｃｃｔｔｔａｃｃａｇｇｇｔｃｔｃａｇｔａｃａｇｃｃａｃｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｃｇａｃｇｃｃｃｔｔｃａｃａｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｔｃｇｃ
【0110】
抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖの軽鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号１９
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
【0111】
抗ＴＣＲα／βのｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号２０
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
【0112】
ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域を連結するリンカーのアミノ酸配列：配列番号２１
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-09-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１）健康なリンパ系を持つヒトドナーからＴ細胞を取得することと、２）前記Ｔ細胞中の
（ｉ）ＴＲＡＣゲノム領域、及び
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノム領域
を遺伝子編集技術によって破壊することと、
３）Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を前記Ｔ細胞中で安定して発現させることと
を含み、
任意的に、天然ＴＣＲを依然として発現しているＴ細胞を除去するように、ステップ３）から得られた細胞を適切な時間培養することをさらに含む、
Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法。
【請求項2】
前記ＴＲＡＣゲノム領域が、ヒト１４番目染色体の第２３０１６４４８位から第２３０１６４９０位のゲノム領域を含み、前記Ｂ２Ｍゲノム領域が、ヒト１５番目染色体の第４５００３７４５位から第４５００３７８８位のゲノム領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とする前記ＣＡＲ分子の細胞外領域が、Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βの細胞外領域に結合するｓｃＦｖ分子であり、好ましくは、前記ＣＡＲ分子が、リンカーによって連結された
前記ｓｃＦｖ分子の軽鎖可変領域 配列番号１９
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ；
前記ｓｃＦｖ分子の重鎖可変領域 配列番号２０
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＫＦＴＳＹＶＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＶＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＳＹＹＤＹＤＧＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記リンカーが（Ｇ）ｎ（Ｓ）ｍを含むアミノ酸配列であり、ｎが１～２０の正の整数であり、ｍが１～１０の正の整数であり、好ましくは、前記リンカーの配列が、配列番号２１に示される配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである、
請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ＴＲＡＣゲノム領域及び前記Ｂ２Ｍゲノム領域が、相同組換え、ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術によって破壊され、
好ましくは、前記遺伝子編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術であり、
更に好ましくは、（ｉ）ＴＲＡＣゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号２～５から選択されるいずれか１つの配列を有する；及び／または
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノムを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号６～１３から選択されるいずれか１つの配列を有し、
更に好ましくは、前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を一緒にまたは別々に前記Ｔ細胞に導入する、
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ｓｇＲＮＡが化学修飾されており、好ましくは、前記化学修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含み、
更に好ましくは、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の３つの塩基及び３’末端の３つの塩基の２’－Ｏ－メチル修飾及びヌクレオチド間３’チオ修飾である、
請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列をエレクトロポレーションによって一緒に前記Ｔ細胞に導入し、好ましくは、前記エレクトロポレーションの条件は、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；及び２５０Ｖ、０．５ｍｓから選択されるいずれかである、
請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍのそれぞれのノックアウト効率が９０％以上であり、同時ノックアウト効率が７５％以上である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とする前記ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を、ウイルスによるトランスフェクションによって前記Ｔ細胞に導入し、好ましくは、前記ウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＣＡＲ分子を発現するヌクレオチド配列を相同組換えによって前記Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子座に導入して、前記ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列がＴＣＲ遺伝子プロモーターの制御下で前記ＴＲＡＣ遺伝子座で発現される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ステップ３）から得られた細胞を３～２１日間培養して、依然として天然ＴＣＲを発現しているＴ細胞を除去する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
Ｔ細胞リンパ腫細胞ＴＣＲα／βを標的とするＣＡＲ分子を発現し、前記ＣＡＲ分子が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞リンパ腫細胞を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項13】
ＴＣＲα／β、クラス１ ＨＬＡタンパク質、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３から選択される１つまたは複数のタンパク質を低いレベルで発現するか、または発現しない、請求項１２に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項14】
請求項１３に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を含み、好ましくは、前記ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の９８％または９９％以上がＴＣＲ陰性である、生物学的製品。
【請求項15】
Ｔ細胞リンパ腫の治療のための薬剤の調製における、請求項１２又は１３に記載のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞または請求項１４に記載の生物学的製品の使用。
【国際調査報告】