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特表2023-509072異種膵島細胞の産生のための方法及び組成物並びにそれを用いたインスリン抵抗性又は欠乏状態の処置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-06
(54)【発明の名称】異種膵島細胞の産生のための方法及び組成物並びにそれを用いたインスリン抵抗性又は欠乏状態の処置
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230227BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230227BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20230227BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230227BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230227BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230227BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230227BHJP
A61K 31/436 20060101ALI20230227BHJP
A61K 31/522 20060101ALI20230227BHJP
A61K 38/28 20060101ALI20230227BHJP
A61K 35/39 20150101ALI20230227BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N15/12
C12N15/54
A61P3/10
A61P43/00 121
A61K39/395 G
A61K39/395 U
A61K45/00
A61K31/436
A61K31/522
A61K38/28
A61K35/39
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022540966
(86)(22)【出願日】2021-01-07
(85)【翻訳文提出日】2022-08-30
(86)【国際出願番号】 CN2021070659
(87)【国際公開番号】W WO2021139722
(87)【国際公開日】2021-07-15
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/070698
(32)【優先日】2020-01-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519375457
【氏名又は名称】イージェネシス，インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】521500155
【氏名又は名称】ハンチョウ キハン バイオテクノロジー カンパニー，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ガオ，ヤンビン
(72)【発明者】
【氏名】ユエ，ヤナン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ルハン
(72)【発明者】
【氏名】グエル，マーク
(72)【発明者】
【氏名】カン，イーナン
(72)【発明者】
【氏名】チン，ウェニング
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA44
4C084DB34
4C084MA02
4C084NA05
4C084ZC202
4C084ZC351
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE03
4C086AA01
4C086CB07
4C086CB22
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZC35
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB51
4C087CA04
4C087MA02
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZC35
4C087ZC75
(57)【要約】
異種移植に適したトランスジェニック膵島細胞を生成するための方法、組成物及びシステムが本明細書に記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞であって、（ａ）少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有さず、ここで、前記グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２又はＣＭＡＨであり、
（ｂ）非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列を発現し、ここで、前記少なくとも２つのポリペプチド配列が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１の少なくとも２つを含み、及び
（ｃ）前記非ブタ哺乳動物種由来の補体による毒性の低減、前記非ブタ哺乳動物種由来の活性化プロテインＣ凝固の誘導の低減、前記非ブタ哺乳動物種由来のトロンビン－アンチトロンビン複合体の誘導の低減又は前記非ブタ種由来のＮＫ細胞による毒性の低減の１つ以上を示す、単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項2】
前記細胞が、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨから選択される少なくとも２つ又は３つ全てのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有しない、請求項１に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項3】
前記細胞が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個又は全てを発現する、請求項１又は２に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項4】
単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞であって、（ａ）少なくとも２つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有さず、ここで、前記グリコシルトランスフェラーゼ酵素が、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２又はＣＭＡＨの少なくとも２つを含み、
（ｂ）非ブタ哺乳動物種由来のポリペプチド配列を発現し、ここで、前記ポリペプチド配列は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１であり、及び
（ｃ）前記非ブタ哺乳動物種由来の補体による毒性の低減、前記非ブタ種由来の活性化プロテインＣ凝固の誘導の低減、前記非ブタ種由来のトロンビン－アンチトロンビン複合体の誘導の低減又は前記非ブタ種由来のＮＫ Ｔ細胞による毒性の低減を示す、単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項5】
前記細胞が、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨの酵素活性を実質的に有しない、請求項４に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項6】
前記細胞が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個又は全てを発現する、請求項４又は５に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項7】
ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ及びＣＤ４７を発現する、請求項１～６のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項8】
前記細胞が、前記１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現を実質的に有しない、請求項１～６のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項9】
前記細胞が、前記１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼ酵素におけるフレームシフト突然変異を含み、翻訳の早期終了を生じさせ、それにより前記グリコシルトランスフェラーゼ酵素の活性が消失する、請求項８に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項10】
非ブタ哺乳動物種由来の前記１つ又は複数のポリペプチド配列をコードする１つ又は複数の核酸配列が、ブタオルソログの非オルソロガス遺伝子座内に挿入される、請求項１～９のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項11】
非ブタ哺乳動物種由来の前記１つ又は複数のポリペプチド配列をコードする１つ又は複数の核酸配列が、ブタオルソログの非オルソロガスプロモーターに作動可能に連結される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項12】
前記非オルソロガスプロモーターが、非ブタプロモーターである、請求項１１に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項13】
前記膵島細胞が、ブタ膵臓の脱凝集によって得られる、請求項１～１２のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項14】
前記膵島細胞が、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、イプシロン細胞、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）細胞又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項15】
前記非ブタ哺乳動物種が、霊長類種である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項16】
前記細胞が、前記非ブタ哺乳動物種に移植された場合、８日間を超える生存を示す、請求項１～１５のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ膵島細胞。
【請求項17】
前記細胞が、前記非ブタ哺乳動物種から単離されたＰＢＭＣに対して減少したＩＢＭＩＲを示す、請求項１～１６のいずれか一項に記載のトランスジェニックブタ細胞。
【請求項18】
治療有効量の、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたブタ膵島細胞を含む組成物。
【請求項19】
前記等張緩衝液が、ヘパリン又はＴＮＦ－アルファ阻害剤をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
少なくとも約１２％～約２５％のベータ細胞又は少なくとも約１５％～約３０％のアルファ細胞を含む、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記組成物が、請求項３５～４２のいずれか一項に従って調製される、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
インスリン抵抗性又は欠乏状態の処置を、それを必要とする非ブタ哺乳動物において行う方法であって、治療有効用量の、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞又は請求項１８～２１のいずれか一項に記載の組成物を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項23】
前記哺乳動物の内頸静脈又は肝門脈を介して前記細胞を中枢に投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記インスリン抵抗性状態が、１型糖尿病を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項25】
前記インスリン抵抗性状態が、２型糖尿病を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項26】
前記非ブタ哺乳動物が、前記トランスジェニックブタ膵島細胞又は前記組成物を投与する前に、治療有効用量の抗胸腺細胞グロブリン、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ２０抗体、ラパログ、カルシニューリン阻害剤、ガンシクロビル又はそのプロドラッグ、抗ヒスタミン剤及びコルチコステロイドを含む導入レジメンを受けている、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記トランスジェニックブタ膵島細胞又は前記組成物の投与後、治療有効用量の抗ＣＤ４０抗体、ラパログ、カルシニューリン阻害剤及びガンシクロビル又はそのプロドラッグを投与することを含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記トランスジェニックブタ膵島細胞又は前記組成物の投与後、治療有効用量の中間作用型又は長時間作用型インスリン類似体、インスリングラルギン、インスリンデテミル又はＮＰＨインスリンを投与することを含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記治療有効用量が、非ブタ哺乳動物の体重１ｋｇあたり少なくとも５，０００ＩＥＱである、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたブタ膵島細胞を含む、単離されたブタ膵島。
【請求項31】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたブタ膵島細胞を含む、単離されたブタ膵臓オルガノイド。
【請求項32】
前記膵島又はオルガノイドが、膵臓外分泌細胞を実質的に含まない、請求項３０又は３１に記載の単離されたブタ膵島又は単離されたブタ膵臓オルガノイド。
【請求項33】
前記膵臓オルガノイドが、以下：（ａ）新生仔７日目以前に新生仔ブタ動物から膵臓を単離すること、及び
（ｂ）前記膵臓を機械的又は酵素的消化に供して、オルガノイド断片を生成すること、並びに任意選択により、
（ｃ）ステップ（ｂ）のオルガノイド断片をフィコール勾配沈降によって精製すること
によって調製される、請求項３１又は３２に記載の単離されたブタ膵臓オルガノイド。
【請求項34】
請求項１～１７のいずれか一項に記載のブタ膵島細胞を含む、単離されたブタ膵臓。
【請求項35】
非ブタ哺乳動物レシピエントへの移植前にブタドナーからの膵島の収率を改善する方法であって、以下：（ａ）精製手順を受けた新生仔ブタ動物からの膵臓オルガノイドを提供すること、
（ｂ）有効濃度のカスパーゼ阻害剤の存在下において、前記精製後少なくとも９０分間にわたって前記オルガノイドを培養すること、及び
（ｃ）有効濃度のコルチコステロイドの存在下で少なくとも７日間にわたって培養を継続すること
を含む方法。
【請求項36】
前記精製手順が、（ａ）新生仔７日目以前にトランスジェニック新生仔ブタ動物から膵臓を単離すること、及び
（ｂ）前記膵臓を機械的又は酵素的消化に供して、オルガノイド断片を生成すること、並びに任意選択により、
（ｃ）フィコール勾配沈降により、前記消化された膵臓からオルガノイド断片を精製すること
を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記新生仔ブタ動物が、請求項１～１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのブタ細胞を含むトランスジェニックブタである、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項38】
前記カスパーゼ阻害剤が、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫである、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記コルチコステロイドが、メチルプレドニゾロンである、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記膵臓オルガノイドが、ＩＢＭＸ、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はアデノシン受容体アンタゴニストの存在下で培養される、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記膵臓オルガノイドが、ニコチンアミド又はその代謝的に許容される類似体の存在下で培養される、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
インスリン抵抗性又は欠乏状態の処置を、それを必要とする非ブタ哺乳動物において行う方法であって、請求項３５～４１のいずれか一項に記載のオルガノイドを、前記オルガノイドが以下の基準（ａ）約５ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシン、
（ｂ）陰性グラム染色、
（ｃ）約７０％を超える生存率、又は
（ｄ）総沈降量の約２０，０００ＩＥＱ／ｍＬ以上の膵島濃度
のいずれかを満たす場合に前記非ブタ哺乳動物に移植することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、２０２０年１月７日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０２０／０７０６９８号に対する優先権を主張するものであり、これは、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[0001] 本出願は、２０２０年１月７日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０２０／０７０６９８号に対する優先権を主張するものであり、これは、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
[0002] 現在の推定では、２０３０年までに世界的に全ての年齢群で１／２型糖尿病の有病率が４．４％に達することが示されている。現在利用されている薬理学的処置は、１型糖尿病についてインスリン補充（replacement）を含み、２型糖尿病について、単独で又はメトホルミン、スルホニル尿素、グリニド、ＤＰＰ－４阻害剤、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、ＳＧＬＴ－２阻害剤若しくはピオグリタゾンとの組み合わせでインスリン補充（supplementation）を含む。これらの戦略は、全て詳細な患者管理及び服薬コンプライアンスを要する。さらに、多くの患者は、これらの介入にもかかわらず、血糖コントロールを達成することができない。
[0002] 現在の推定では、２０３０年までに世界的に全ての年齢群で１／２型糖尿病の有病率が４．４％に達することが示されている。現在利用されている薬理学的処置は、１型糖尿病についてインスリン補充（replacement）を含み、２型糖尿病について、単独で又はメトホルミン、スルホニル尿素、グリニド、ＤＰＰ－４阻害剤、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、ＳＧＬＴ－２阻害剤若しくはピオグリタゾンとの組み合わせでインスリン補充（supplementation）を含む。これらの戦略は、全て詳細な患者管理及び服薬コンプライアンスを要する。さらに、多くの患者は、これらの介入にもかかわらず、血糖コントロールを達成することができない。
【0003】
[0003] 抗糖尿病薬若しくはインスリンの複雑な投与の不在下で糖尿病患者のグルコース制御を改善するか、又は抗糖尿病薬若しくはインスリンの投与にもかかわらず、グルコース制御が不十分な糖尿病患者のグルコース制御を改善する治療戦略が必要である。同種膵島細胞移植（例えば、門脈内膵島細胞移植）は、重度のリスク要因（例えば、不安定型Ｔ１ＤＭ、無自覚性低血糖、重度の低血糖エピソード、血糖不安定性）を伴う１型糖尿病患者の場合に使用の増加が見られるが、厳密な免疫抑制の必要性、移植片生存の課題及びドナー細胞の入手可能性は、改善されたグルコース制御が長期的な合併症のリスクを最も最小化する場合、１型糖尿病患者、２型糖尿病患者及び疾患の初期の１型又は２型糖尿病患者におけるこの技術の幅広い使用を妨げる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
発明の概要
[0004] 一態様において、本開示は、単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞を提供し、ここで、この細胞は、（ａ）ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２又はＣＭＡＨである少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有さず、（ｂ）非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列であって、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－２の少なくとも２つを含む、少なくとも２つのポリペプチド配列を発現し、及び（ｃ）非ブタ哺乳動物種由来の補体による毒性の低減、非ブタ哺乳動物種由来の活性化プロテインＣ凝固の誘導の低減、非ブタ哺乳動物種由来のトロンビン－アンチトロンビン複合体の誘導の低減又は非ブタ種由来のＮＫ細胞による毒性の低減の１つ以上を示す。
[0004] 一態様において、本開示は、単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞を提供し、ここで、この細胞は、（ａ）ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２又はＣＭＡＨである少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有さず、（ｂ）非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列であって、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－２の少なくとも２つを含む、少なくとも２つのポリペプチド配列を発現し、及び（ｃ）非ブタ哺乳動物種由来の補体による毒性の低減、非ブタ哺乳動物種由来の活性化プロテインＣ凝固の誘導の低減、非ブタ哺乳動物種由来のトロンビン－アンチトロンビン複合体の誘導の低減又は非ブタ種由来のＮＫ細胞による毒性の低減の１つ以上を示す。
【0005】
[0005] いくつかの実施形態において、この細胞は、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨから選択される少なくとも２つ又は３つ全てのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有しない。
【0006】
[0006] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、この細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個又は全てを発現する。
【0007】
[0007] 別の態様において、本開示は、単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞を提供し、ここで、この膵島細胞は、（ａ）ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２又はＣＭＡＨの少なくとも２つを含む、少なくとも２つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有さず、（ｂ）非ブタ哺乳動物種由来のポリペプチド配列であって、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１であるポリペプチド配列を発現し、及び（ｃ）非ブタ哺乳動物種由来の補体による毒性の低減、非ブタ種由来の活性化プロテインＣ凝固の誘導の低減、非ブタ種由来のトロンビン－アンチトロンビン複合体の誘導の低減又は非ブタ種由来のＮＫ Ｔ細胞による毒性の低減を示す。
【0008】
[0008] いくつかの実施形態において、この細胞は、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨの酵素活性を実質的に有しない。
【0009】
[0009] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、この細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個又は全てを発現する。
【0010】
[0010] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、この細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ及びＣＤ４７を発現する。
【0011】
[0011] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、この細胞は、１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現を実質的に有しない。いくつかの実施形態において、この細胞は、１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼ酵素におけるフレームシフト突然変異を含み、翻訳の早期終了を生じさせ、それによりグリコシルトランスフェラーゼ酵素の活性を除去する。
【0012】
[0012] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、非ブタ哺乳動物種由来の１つ又は複数のポリペプチド配列をコードする１つ又は複数の核酸配列は、ブタオルソログの非オルソロガス遺伝子座内に挿入される。
【0013】
[0013] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、非ブタ哺乳動物種由来の１つ又は複数のポリペプチド配列をコードする１つ又は複数の核酸配列は、ブタオルソログの非オルソロガスプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、非オルソロガスプロモーターは、非ブタプロモーターである。
【0014】
[0014] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、この膵島細胞は、ブタ膵臓の脱凝集によって得られる。
【0015】
[0015] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、この膵島細胞は、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、イプシロン細胞、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）細胞又はそれらの任意の組み合わせである。
【0016】
[0016] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、非ブタ哺乳動物種は、霊長類種である。
【0017】
[0017] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、この細胞は、非ブタ哺乳動物種に移植された場合、８日間を超える生存を示す。
【0018】
[0018] 本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかのいくつかの実施形態において、この細胞は、非ブタ哺乳動物種から単離されたＰＢＭＣに対して減少したＩＢＭＩＲを示す。
【0019】
[0019] 別の態様において、本開示は、治療有効量の、本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、等張緩衝液は、ヘパリン又はＴＮＦ－アルファ阻害剤をさらに含む。
【0020】
[0020] 本明細書に開示される組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、この組成物は、少なくとも約１２％～約２５％のベータ細胞又は少なくとも約１５％～約３０％のアルファ細胞を含む。
【0021】
[0021] 本明細書に開示される組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、この組成物は、本明細書に開示される方法のいずれか１つに従って調製される。
【0022】
[0022] 別の態様において、本開示は、インスリン抵抗性又は欠乏状態の処置を、それを必要とする非ブタ哺乳動物において行う方法であって、治療有効用量の、本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれか又は本明細書に開示される組成物のいずれかを哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【0023】
[0023] いくつかの実施形態において、この方法は、哺乳動物の内頸静脈又は肝門脈を介して細胞を中枢に投与することを含む。
【0024】
[0024] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、インスリン抵抗性状態は、１型糖尿病を含む。
【0025】
[0025] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、インスリン抵抗性状態は、２型糖尿病を含む。
【0026】
[0026] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、非ブタ哺乳動物は、トランスジェニックブタ膵島細胞又は組成物を投与する前に、治療有効用量の抗胸腺細胞グロブリン、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ２０抗体、ラパログ、カルシニューリン阻害剤、ガンシクロビル又はそのプロドラッグ、抗ヒスタミン剤及びコルチコステロイドを含む導入レジメンを受けている。
【0027】
[0027] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、この方法は、トランスジェニックブタ膵島細胞又は組成物の投与後、治療有効用量の抗ＣＤ４０抗体、ラパログ、カルシニューリン阻害剤及びガンシクロビル又はそのプロドラッグを投与することをさらに含む。
【0028】
[0028] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、この方法は、トランスジェニックブタ膵島細胞又は組成物の投与後、治療有効用量の中間作用型又は長時間作用型インスリン類似体、インスリングラルギン、インスリンデテミル又はＮＰＨインスリンを投与することをさらに含む。
【0029】
[0029] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、本明細書に開示される治療有効用量のいずれかは、非ブタ哺乳動物の体重１ｋｇあたり少なくとも５，０００ＩＥＱである。
【0030】
[0030] 別の態様において、本開示は、本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかを含む、単離されたブタ膵島を提供する。いくつかの実施形態において、膵島は、膵臓外分泌細胞を実質的に含まない。
【0031】
[0031] 別の態様において、本開示は、本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかを含む、単離されたブタ膵臓オルガノイドを提供する。いくつかの実施形態において、オルガノイドは、膵臓外分泌細胞を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、膵臓オルガノイドは、（ａ）新生仔７日目以前に新生仔ブタ動物から膵臓を単離すること、及び（ｂ）膵臓を機械的又は酵素的消化に供して、オルガノイド断片を生成すること、並びに任意選択により、（ｃ）ステップ（ｂ）のオルガノイド断片をフィコール勾配沈降によって精製することによって調製される。
【0032】
[0032] 別の態様において、本開示は、本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかを含む、単離されたブタ膵臓を提供する。
【0033】
[0033] 別の態様において、本開示は、非ブタ哺乳動物レシピエントへの移植前にブタドナーからの膵島の収率を改善する方法であって、（ａ）新生仔ブタ由来の精製手順に供した膵臓オルガノイドを提供すること、（ｂ）有効濃度のカスパーゼ阻害剤の存在下において、精製後少なくとも９０分間にわたってオルガノイドを培養すること、及び（ｃ）有効濃度のコルチコステロイドの存在下で少なくとも７日間にわたって培養を継続することを含む方法を提供する。
【0034】
[0034] いくつかの実施形態において、精製手順は、（ａ）新生仔７日目以前にトランスジェニック新生仔ブタ動物から膵臓を単離すること、及び（ｂ）膵臓を機械的又は酵素的消化に供して、オルガノイド断片を生成すること、並びに任意選択により、（ｃ）フィコール勾配沈降により、消化された膵臓からオルガノイド断片を精製することを含む。
【0035】
[0035] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、新生児ブタ動物は、本明細書に開示される単離されたトランスジェニックブタ膵島細胞のいずれかによる少なくとも１つのブタ細胞を含むトランスジェニックブタである。
【0036】
[0036] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、カスパーゼ阻害剤は、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫである。
【0037】
[0037] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、コルチコステロイドは、メチルプレドニゾロンである。
【0038】
[0038] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、膵臓オルガノイドは、ＩＢＭＸ、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はアデノシン受容体アンタゴニストの存在下で培養される。
【0039】
[0039] 本明細書に開示される方法のいずれか１つのいくつかの実施形態において、膵臓オルガノイドは、ニコチンアミド又はその代謝的に許容される類似体の存在下で培養される。
【0040】
[0040] 別の態様において、本開示は、インスリン抵抗性又は欠乏状態の処置を、その処置を必要とする非ブタ哺乳動物において行う方法であって、本明細書に開示されるオルガノイドのいずれか１つによるオルガノイドを、オルガノイドが以下の基準：（ａ）約５ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシン、（ｂ）陰性グラム染色、（ｃ）約７０％を超える生存率、又は（ｄ）総沈降量の約２０，０００ＩＥＱ／ｍＬ以上の膵島濃度のいずれかを満たす場合に非ブタ哺乳動物に移植することを含む方法を提供する。
【0041】
参照による組み込み
[0041] 本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的及び個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
[0041] 本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的及び個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0042】
図面の簡単な説明
[0042] 本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載される。本発明の特徴及び利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明及びその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
[0042] 本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載される。本発明の特徴及び利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明及びその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【図1】[0043]ヒト血清中でインキュベートした４－７トランスジェニック内皮臍帯静脈ブタ細胞（ＰＵＶＥＣ）のＦＡＣＳ免疫染色結果を示す。上パネルは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（「ＨＵＶＥＣ」）、トランスジェニック４－７ブタ臍帯静脈内皮細胞（「４－７ＰＵＶＥＣ」）又は正常ブタ臍帯静脈内皮細胞（「ＷＴ ＰＵＶＥＣ」）のＩｇＧ又はＩｇＭによる染色を示すＦＡＣＳプロットである。トランスジェニック４－７ＰＵＶＥＣは、ＨＵＶＥＣ細胞と同様に、正常なブタ対応物と比較して、ヒト血清からのＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の結合が減少していることを示す。データは、平均±標準偏差として示される。エラーバーは、標準偏差を示し、Ｐ値は、独立両側スチューデントｔ検定から導出される。＊は、Ｐ＜０．０５であることを示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１であることを示す。
【図2】[0044]４－７トランスジェニック内皮臍帯静脈ブタ細胞（ＰＵＶＥＣ）で実施されたヒト補体毒性アッセイの結果を示す。左パネルは、アッセイワークフローを示す図であり、右パネルは、様々な濃度のヒト補体（「ＨＣ」）とのインキュベーション後の、ヒト臍帯静脈内皮細胞（「ＨＵＶＥＣ」）、トランスジェニック４－７ブタ臍帯静脈内皮細胞（「４－７ＰＵＶＥＣ」）又は正常ブタ内皮細胞（「ＷＴ ＰＵＶＥＣ」）のいずれかの死滅を示すチャートである。４－７細胞は、ヒトＨＵＶＥＣ細胞と同様に、正常なブタ対応物に対して、ヒト補体に応答して著しく死滅したものが減少したことを示す。
【図3】[0045]４－７トランスジェニックブタ臍帯静脈内皮ブタ細胞（ＰＵＶＥＣ）におけるＣＤ３９の発現／機能性を検証するために実施された分析の結果を示す。トランスジェニック４－７ブタ臍帯静脈内皮細胞（「４－７ＰＵＶＥＣ」）は、ＨＵＶＥＣ及びＷＴ ＰＵＶＥＣと比較して、ＡＤＰとインキュベートした場合のリン酸産生によって測定されるｈＣＤ３９のＡＤＰａｓｅ生化学活性が有意に高い。データは、平均±標準偏差として示される。エラーバーは、標準偏差を示し、Ｐ値は、独立両側スチューデントｔ検定から導出される。＊＊は、Ｐ＜０．０１であることを示す。
【図4】[0046]ヒトプロテインＣ及びヒトトロンビンを使用した異種細胞での活性化プロテインＣアッセイの概略図を示す。
【図5】[0047]４－７細胞でのトロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ（ＴＡＴ）形成アッセイの結果を示す。左パネルは、ヒト血液を使用してトロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ（ＴＡＴ）複合体形成を測定するためのワークフローを示す図であり、右パネルは、ＨＵＶＥＣ、４－７ＰＵＶＥＣ又はＷＴ ＰＵＶＥＣによる対応するアッセイの結果を示すチャートである。４－７細胞は、ＷＴ ＰＵＶ ＥＣと比較して、ＨＵＶＥＣ細胞と同等のＴＡＴ形成の減少を示す。
【図6】[0048]４－７トランスジェニック細胞で実施された血小板溶解アッセイの結果を示す。ＨＵＶＥＣ、４－７ＰＵＶＥＣ又はＷＴ ＰＵＶＥＣと４５分間又は６０分間インキュベートした後、ヒト血液から残存する血小板（輪郭が描かれたクラスター）の数を定量化するＦＡＣＳトレースが示される。４－７細胞は、ブタＷＴ ＰＵＶＥＣに対する残存血小板の割合の上昇を示し続けており、これは、ＨＵＶＥＣ細胞とインキュベートした場合の残存血小板の割合と同等である。
【図8】[0050]４－７トランスジェニック細胞で実施されたＮＫ細胞毒性アッセイの結果を示す。ＨＵＶＥＣ、４－７ＰＵＶＥＣ又はＷＴ ＰＵＶＥＣにおいて、エフェクター：標的細胞比１０で実施されたＮＫ毒性アッセイの結果を示すチャートが示される。４－７ＰＵＶＥＣＳは、正常なＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣ細胞間の中間の細胞死滅値を示す。
【図9】[0051]移植のためにブタ膵島細胞を処理するための例示的なワークフローを示すチャートである。例示的な実施形態において、新生仔ブタは、膵切除に供され（「調達」）、その後、膵臓は、コラゲナーゼで切り刻まれ、消化される（「膵島単離」）。次に、消化された膵島細胞は、ガス透過性、水不透過性のバッグに移され、培養できるようになるまで２２～２４℃で保持される（「輸送」）。次に、膵島細胞を一定期間にわたって培養し（任意選択によりＥＧＭ２培地及びカスパーゼ阻害剤を伴う、「培養」）、機能的膵島均等物定量（ＩＥＱ）、エンドトキシンアッセイ、グラム染色、生存率アッセイ及び細胞純度アッセイなどの品質管理手順を実行する。
【図11】[0053]図９のように単離された膵島細胞で実施された血小板溶解又はＴＡＴ複合体形成アッセイの結果を示す。左パネルは、４－７膵島が、ヒト全血とインキュベートした場合、ＷＴ膵島及び実験対照（ＮＣ、生理食塩水のみ）と比較して血小板溶解の減少を明らかにすることを示す。右パネルは、４－７膵島が、ヒト全血とインキュベートした場合、ＷＴ膵島及び実験対照（ＮＣ、生理食塩水のみ）と比較してＴＡＴ複合体の形成の減少を明らかにすることを示す。
【図12】[0054]図９のように得られた４－７膵島でヒト血液により実施された即時血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）アッセイの結果を示す。４－７膵島切片をヒト血液とインキュベートした後の抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭ、左パネル）及び補体（Ｃ３ａ及びＣ４ｄ、右パネル）の病巣の染色を示す、２００倍の倍率でのＩＨＣ顕微鏡写真が示される。４－７膵島細胞は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｃ３ａ及びＣ４ｄに関連する染色及び病巣の減少を示し、これは、膵島細胞がＩＢＭＩＲの減少を示すことを示唆している。
【図13】[0055]図１２のようなヒト血液とのインキュベーション後の４－７膵島、ＷＴ膵島及び実験対照（ＮＣ、生理食塩水のみ）への好中球浸潤を示す。４－７膵島は、ＷＴ膵島及び実験対照と比較して残存好中球の数が多いことを示す。
【図14】[0056]２つの異なる培養条件下で経時的に図９のように単離された膵島細胞を示す。ＥＧＭ－２培地又は標準培地（「Ｆ－１０」、HamのＦ－１０を示す）培地のいずれかでの７日間にわたる培養における膵島均等物（ＩＥＱ）を示すグラフが示される。ＥＧＭ－２培地は、膵島の収率の改善と関連していた。
【図16】[0058]コルチコステロイドを含まない培地（左パネル）対コルチコステロイドを含む培地（右パネル）で図９のように単離された膵島の培養物を比較する。コルチコステロイドは、膵島の収率の改善と関連していた。
【図17】[0059]初期（上段、Ｆ－１０培地）又は改良（ＥＧＭ－２培地＋コルチコステロイド、下段）培養条件下で図９のように単離された膵島の細胞画分を比較する。２つの条件間で無傷の膵島細胞（左）、ベータ細胞（中央）又は生ベータ細胞（右）を比較するＦＡＣＳトレースが示される。改善された状態は、無傷の膵島細胞の数の改善及びベータ細胞の数の改善と関連していた。
【図18】[0060]免疫蛍光染色による腎臓凍結切片における４－７導入遺伝子のタンパク質発現検証を示す。スケールバー（白）、７５μｍ。
【図19】[0060]ＳＴＺを受けた後、ＷＴ新生仔ブタ膵島を膵島移植したＮＣＧマウスの６０日間にわたる血糖値を示し、これは、約４０日後に血糖値が正常化することを示す。４－７腎臓凍結切片における３つのノックアウト及び９つの導入遺伝子の免疫蛍光染色検証。抗体スケールバー（白）、７５μｍ。
【図20】[0061]ＳＴＺを受けた後、ＷＴブタ膵島細胞（「ＷＴ Ｔｘ」）、４－７膵島細胞（「４－７Ｔｘ」）又は偽手術（「Ｓｈａｍ Ｔｘ」）による膵島移植を受けたＮＣＧマウスの１２６日間にわたる血糖値を示す。４，０００ＩＥＱ、２，０００ＩＥＱ及び１，０００ＩＥＱを含む異なる膵島線量が「４－７Ｔｘ」及び「ＷＴ Ｔｘ」の両方の実験群に適用された。
【図21】[0062]本明細書に記載の方法に従って膵島を移植されたＮＨＰの典型的な誘導、免疫抑制、移植及び管理プロトコルを示す。
【図22】[0063]本明細書に記載の方法による、糖尿病のＳＴＺ導入前後の血糖、インスリン及びＣ－ペプチドに関するＮＨＰの耐糖能試験の応答例を示し、プロトコルは、動物に糖尿病を誘発することに成功していることを示す。
【図26】[0065]移植後１２時間及び１ヶ月の動物のＭＡ－１及びＭＡ－２について、肝生検のヘマトキシリン／エオシン染色及び抗クロモグラニンＡ染色を示し、これは、肝組織に膵島が存在することを示す。
【図27】[0066]移植後２４時間の動物のＭＢ－１１について、肝生検の免疫蛍光染色分析を示し、これは、肝組織における膵島の存在（インスリン及びグルカゴン染色の陽性シグナルによって明らかにされる）を示す。サルＩｇＧ、ＣＤ４１（血小板のマーカー）、フィブリノゲン（凝固の指標のマーカー）及びＣＤ６８（マクロファージのマーカー）もインスリン陽性のＷＴブタ膵島の周囲で検出され、これは、ＭＢ－１１の移植後２４時間での即時血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の発生を示す。この結果は、遺伝子改変がインビボでのブタ膵島の生存を強化するために重要であることも示す。
【図28】[0067]ＷＴブタ膵島を使用した、移植後の異なる時点でのサルレシピエントのブタｃ－ペプチド、サルｃ－ペプチド、空腹時血糖及び外因性インスリン摂取の血清濃度を示す。ブタ膵島移植後５５日以内に動物の血清からブタｃ－ペプチドを着実に検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【0044】
発明の詳細な説明
概要
[0068] 本開示は、移植のための異種膵島細胞を提供することにより、移植に関連する免疫抑制、移植片の生存及びドナー細胞の入手可能性の課題に対処する。開示される異種細胞（例えば、遺伝子改変された異種細胞）は、免疫原性の低下及び生存の増加を示し、したがって移植レシピエントにおける免疫抑制剤の使用を減らす必要がある膵島細胞移植に適している。そのような細胞を誘導するための方法、組成物及びシステム並びにそのような細胞の使用を含む治療方法が本明細書でさらに説明される。
概要
[0068] 本開示は、移植のための異種膵島細胞を提供することにより、移植に関連する免疫抑制、移植片の生存及びドナー細胞の入手可能性の課題に対処する。開示される異種細胞（例えば、遺伝子改変された異種細胞）は、免疫原性の低下及び生存の増加を示し、したがって移植レシピエントにおける免疫抑制剤の使用を減らす必要がある膵島細胞移植に適している。そのような細胞を誘導するための方法、組成物及びシステム並びにそのような細胞の使用を含む治療方法が本明細書でさらに説明される。
【0045】
定義
[0069] 「ブタ（pig）」、「ブタ（swine）」及び「ブタ（porcine）」という用語は、本明細書において互換的に使用され、家畜ブタ、イノシシ（Sus scrofa）種の様々な品種に関連するものを指す。
[0069] 「ブタ（pig）」、「ブタ（swine）」及び「ブタ（porcine）」という用語は、本明細書において互換的に使用され、家畜ブタ、イノシシ（Sus scrofa）種の様々な品種に関連するものを指す。
【0046】
[0070] 「処置」、「処置すること」、「緩和」などの用語は、疾患、傷害又は障害に関連して使用される場合、一般に所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために本明細書で使用され、また処置中の状態の１つ以上の症状の重症度を改善、緩和及び／又は軽減することを指すために使用される。効果は、疾患、状態又はその症状の発症又は再発を完全に又は部分的に遅らせる点で予防的であり得、及び／又は疾患若しくは状態の部分的若しくは完全な治癒及び／又は疾患若しくは状態に起因する有害作用の点で治療的であり得る。本明細書において使用される「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患又は状態の任意の処置を包含し、（ａ）疾患又は状態の素因があり得るが、それを有すると依然として診断されていない対象において疾患又は状態が発生することを防ぐこと、（ｂ）疾患又は状態を阻害すること（例えば、その発症を阻止すること）、又は（ｃ）疾患又は状態を緩和すること（例えば、疾患又は状態の退行を引き起こし、１つ以上の症状の改善を提供すること）を含む。
【0047】
[0071] タンパク質又はポリペプチドの断片若しくは誘導体を指すために使用される場合の「生物学的に活性な」という用語は、断片又は誘導体が、参照全長タンパク質又はポリペプチドの少なくとも１つの測定可能及び／又は検出可能な生物学的活性を保持することを意味する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質の生物学的に活性な断片又は誘導体は、ｇＲＮＡ（本明細書では単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれる）に結合し、ガイドＲＮＡと複合体を形成したときに標的ＤＮＡ配列に結合し、及び／又は１つ以上のＤＮＡ鎖を切断する能力を有し得る。例えば、細胞受容体の生物学的に活性な断片又は誘導体は、前記受容体を介してシグナル伝達する天然リガンドに結合する能力を有し得るか、又はリガンドに応答して前記受容体によって一般に伝達される細胞内シグナルを伝達する能力を有し得る。
【0048】
[0072] 本明細書で使用される場合、本明細書における「インデル」という用語は、染色体又はエピソームの標的ＤＮＡ配列におけるヌクレオチド塩基の挿入又は欠失を指す。そのような挿入又は欠失は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える塩基であり得る。特定の実施形態におけるインデルは、さらに大きく、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０ｐ、８０、９０又は１００塩基であり得る。インデルが遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に導入された場合、インデルは、フレームシフト変異を作製することにより、ＯＲＦによってコードされるタンパク質の野生型発現を妨害し得る。インデルは、ゲノム配列の二本鎖切断（例えば、部位特異的又はプログラム可能なヌクレアーゼによる）、それに続く非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用した細胞修復の結果であり得る。
【0049】
[0073] 本明細書で使用される場合、「１型糖尿病」（Ｔ１ＤＭ）という用語は、膵臓のベータ細胞の破壊（例えば、自己免疫破壊）のためにインスリンを産生できないことを特徴とする状態を指す。いくつかの実施形態において、１型糖尿病は、１２６ｍｇ／ｄＬ（７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）レベル、２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）中の２時間血漿グルコースレベル、２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の高血糖又は高血糖急性発症の典型的症状を有する患者におけるランダム血漿グルコース又は６．５％以上のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベルの少なくとも１つを含む、特定の臨床基準（「ステージ３ Ｔ１ＤＭ」）によって定義される。いくつかの実施形態において、「１型糖尿病」（Ｔ１ＤＭ）は、ステージ１、ステージ２又はステージ３などのＴ１ＤＭの特定のステージである。ステージ１は、ベータ細胞に対する複数の自己抗体の存在を除いて無症候性である可能性があるが、ステージ２は、血糖異常（ＩＦＧ及び／又はＩＧＴ）、１００～１２５ｍｇ／ｄＬ（５．６～６．９ｍｍｏｌ／Ｌ）などの中間ＦＰＧレベル、１４０～１９９ｍｇ／ｄＬ（７．８～１１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）中の中間２時間血漿グルコースレベル又は５．７～６．４％（３９～４７ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）の中間ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベルを伴う可能性がある。１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）は、小児、若年、青年又は成人で発生し得る。１型糖尿病は、典型的には、多尿症、多飲症、多食症、糖尿病性ケトアシドーシス又は原因不明の体重減少の事象後に診断される。
【0050】
[0074] 本明細書で使用される場合、「２型糖尿病」（Ｔ２ＤＭ）という用語は、インスリン抵抗性の背景で頻繁にβ細胞インスリン分泌の進行性喪失を特徴とする状態を指す。いくつかの実施形態において、１型糖尿病は、１２６ｍｇ／ｄＬ（７．０ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）レベル、２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）中の２時間血漿グルコースレベル、２００ｍｇ／ｄＬ（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上の高血糖又は高血糖急性発症の典型的症状を有する患者におけるランダム血漿グルコース又は６．５％以上のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベルの少なくとも１つを含む、特定の臨床基準によって定義される。
【0051】
[0075] いくつかの実施形態において、本明細書で言及されるタンパク質又は遺伝子は、以下の表による。
【0052】
【表1】
【0053】
【表2】
【0054】
細胞、組織、細胞及び組織の生成方法並びにそれを使用した処置方法
[0076] 本開示は、複数の改変遺伝子を有する細胞、組織及び器官並びにそれらの生成方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞、組織又は器官は、動物から得られる。いくつかの実施形態において、動物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物、例えばウマ、霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ又はネコである。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ブタである。
[0076] 本開示は、複数の改変遺伝子を有する細胞、組織及び器官並びにそれらの生成方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞、組織又は器官は、動物から得られる。いくつかの実施形態において、動物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物、例えばウマ、霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ又はネコである。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ブタである。
【0055】
[0077] いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は、ブタ細胞である。ブタ細胞が生じるか又は由来する品種の非限定的な例には、以下のブタ品種：American Landrace、American Yorkshire、Aksai Black Pied、Angeln saddleback、Appalachian English、Arapawa Island、Auckland Island、Australian Yorkshire、Babi Kampung、Ba Xuyen、Bantu、Basque、Bazna、Beijing Black、Belarus Black Pied、Belgian Landrace、Bengali Brown Shannaj、Bentheim Black Pied、Berkshire、Bisaro、Bangur、Black Slavonian、Black Canarian、Breitovo、British Landrace、British Lop、British Saddleback、Bulgarian White、Cambrough、Cantonese、Celtic、Chato Murciano、Chester White、Chiangmai Blackpig、Choctaw Hog、Creole、Czech Improved White、Danish Landrace、Danish Protest、Dermantsi Pied、Li Yan、Duroc、Dutch Landrace、East Landrace、East Balkan、Essex、Estonian Bacon、Fengjing、Finnish Landrace、Forest Mountain、French Landrace、Gascon、German Landrace、Gloucestershire Old Spots、Gottingen minipig、Grice、Guinea Hog、Hampshire、Hante、Hereford、Hezuo、Hogan Hog、Huntington Black Hog、Iberian、Italian Landrace、Japanese Landrace、Jeju Black、Jinhua、Kakhetian、Kele、Kemerovo、Korean Native、Krskopolje、Kunekune、Lamcombe、Large Black、Large Black-White、Large White、Latvian White、Leicoma、Lithuanian Native、Lithuanian White、Lincolnshire Curly-Coated、Livny、Malhado de Alcobaca、Mangalitsa、Meishan、Middle White、Minzhu、Minokawa Buta、Mong Cai、Mora Romagnola、Moura、Mukota、Mulefoot、Murom、Myrhorod、Nero dei Nebrodi、Neijiang、New Zealand、Ningxiang、North Caucasian、North Siberian、Norwegian Landrace、Norwegian Yorkshire、Ossabaw Island、Oxford Sandy and Black、Pakchong 5、Philippine Native、Pietrain、Poland China、Red Wattle、Saddleback、Semirechensk、Siberian Black Pied、Small Black、Small White、Spots、Surabaya Babi、Swabian-Hall、Swedish Landrace、Swallow Belied Mangalitza、Taihu pig、Tamworth、Thuoc Nhieu、Tibetan、Tokyo-X、Tsivilsk、Turopolje、Ukrainian Spotted Steppe、Ukrainian White Steppe、Urzhum、Vietnamese Potbelly、Welsh、Wessex Saddleback、West French White、Windsnyer、Wuzhishanm、Yanan、Yorkshire及びYorkshire Blue and Whiteのいずれかが含まれる。いくつかの実施形態において、ブタ細胞は、ヨークシャー及びユカタンブタ細胞である。
【0056】
[0078] いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、膵島細胞又はそのサブセットである。膵島細胞は、ベータ細胞、アルファ細胞、デルタ細胞、イプシロン細胞又はＰＰ細胞（別名ガンマ細胞又はＦ細胞）を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、膵島である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、無傷の膵臓に含まれる。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、膵臓断片に含まれる。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、膵臓オルガノイドに含まれる。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、細胞の集合体に含まれる。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、培地（例えば、固体、半固体、ゲル、液体又はそれらの組み合わせ）に分散された細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、細胞クラスターに含まれる。いくつかの実施形態において、本開示の膵島細胞又はオルガノイドは、膵臓外分泌細胞を実質的に含まない。
【0057】
[0079] いくつかの実施形態において、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の遺伝子が、その一部又は配列が変化した遺伝子の一部の付加、欠失、不活性化、破壊、切除によって改変されるように遺伝子改変されている。
【0058】
[0080] いくつかの実施形態において、本開示の細胞、組織又は器官は、１つ以上の遺伝子を不活性化する１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の変異を有する１つ以上の遺伝子の発現の減少又は排除を生じる１つ以上の変異又は後成的変化を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子は、細胞、組織、器官又は動物に存在する核酸を遺伝子改変することによって不活性化される。いくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子の不活性化は、アッセイによって確認される。いくつかの実施形態において、アッセイは、逆転写酵素ＰＣＲアッセイ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、リアルタイムＰＣＲ又はジャンクションＰＣＲマッピングアッセイである。いくつかの実施形態において、アッセイは、遺伝子タンパク質の機能についての酵素的アッセイ又は遺伝子又は遺伝子の断片から転写されたタンパク質についてのイムノアッセイである。
【0059】
[0081] 本開示の細胞、組織又は器官は、任意の適切な方法によって遺伝子改変することができる。本明細書に開示及び記載されるノックアウト（ＫＯ）、ノックイン（ＫＩ）及び／又はゲノム置換戦略に適した方法の非限定的な例には、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ又はその他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター及びヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、発現ベクター、トランスポゾンシステム（例えば、PiggyBacトランスポサーゼ）又はそれらの任意の組み合わせを使用したＣＲＩＳＰＲ媒介性遺伝子改変が含まれる。いくつかの実施形態において。
【0060】
[0082] いくつかの実施形態において、細胞、組織又は器官は、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有さず、前記グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２又はＣＭＡＨである。細胞、組織又は器官は、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨから選択される少なくとも２つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有しない可能性がある。細胞、組織又は器官は、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨから選択される少なくとも３つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有しない可能性がある。いくつかの場合、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨから選択される少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有しない細胞は、検出可能なレベルのグリコシルトランスフェラーゼ酵素タンパク質の全長コピーを実質的に含まない。いくつかの場合、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨから選択される少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有しない細胞は、検出可能なレベルのグリコシルトランスフェラーゼ酵素タンパク質の機能的ポリペプチド断片を実質的に含まない。いくつかの場合、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨから選択される少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有しない細胞は、全長グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするｍＲＮＡの転写物を実質的に含まない。いくつかの場合、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨから選択される少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有しない細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素の機能的断片をコードするｍＲＮＡの転写物を実質的に含まない。いくつかの場合、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨから選択される少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を実質的に有しない細胞は、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素のオープンリーディングフレーム内にインデルを含む。インデルは、部位特異的ヌクレアーゼを使用して生成され得る。インデルは、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（又はゲノム内に複数のコピーを有する遺伝子の場合、全てのＯＲＦ）を破壊し、その結果、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が転写されるとき、全長又は機能的断片のｍＲＮＡ又はタンパク質の産生が妨げられる。
【0061】
[0083] いくつかの実施形態において、細胞、組織又は器官は、非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列（例えば、少なくとも２つの異種ポリペプチド配列）を発現し、前記少なくとも２つのポリペプチド配列は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１の少なくとも２つを含む。細胞、組織又は器官は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個又は全てを発現し得る。いくつかの場合、非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ若しくはＨＯ－１又はそれらの組み合わせの全長配列を含む。いくつかの場合、非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ若しくはＨＯ－１又はそれらの組み合わせの機能的断片を含む。いくつかの場合、非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列を発現する細胞、組織又は器官は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ若しくはＨＯ－１又はそれらの組み合わせの全長配列をコードするｍＲＮＡを発現する。いくつかの場合、非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列を発現する細胞、組織又は器官は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ若しくはＨＯ－１又はそれらの組み合わせの機能的断片をコードするｍＲＮＡを発現する。
【0062】
[0084] いくつかの実施形態において、本明細書に開示される異種ポリペプチド配列のいずれか１つは、目的のヒト遺伝子又はその断片によってコードされるポリペプチド配列と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される異種ポリペプチド配列のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド配列は、目的のヒト遺伝子又はその断片と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である。いくつかの例において、本明細書に開示される目的のヒト遺伝子は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ及びＨＯ－１から選択される１つ以上のメンバー（例えば、２つ以上のメンバー）を含み得る。
【0063】
[0085] いくつかの実施形態において、本明細書に開示される遺伝子改変された細胞、組織又は器官のいずれかは、遺伝子改変された細胞として、異なる種の対象を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の遺伝子改変された細胞、組織又は器官のいずれかを、それを必要とする対象に移植する方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、非ヒト霊長類である。
【0064】
[0086] 非ブタ哺乳動物種は、霊長類種であり得る。いくつかの実施形態において、非ブタ哺乳動物種は、非ヒト霊長類である。
【0065】
[0087] いくつかの実施形態において、非ブタ哺乳動物種は、ヒト（Homo Sapiens）である。
【0066】
[0088] いくつかの場合、非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列を発現する細胞、組織又は器官は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ若しくはＨＯ－１、それらの組み合わせ又はそれらの融合物をコードするゲノム配列を含む。いくつかの場合、ゲノム配列は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ若しくはＨＯ－１、それらの組み合わせ又はそれらの融合物の全長コピーをコードするオープンリーディングフレームを含む。いくつかの場合、ゲノム配列は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ若しくはＨＯ－１、それらの組み合わせ又はそれらの融合物の機能的断片をコードするオープンリーディングフレームを含む。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレームは、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ユビキタスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、非ブタプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ブタプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ユビキタスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、非ブタ哺乳動物種由来の遺伝子の天然ヒトプロモーター又はその機能的断片、例えばＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１の天然プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、非ブタ哺乳動物種由来の遺伝子のブタオルソログのブタプロモーター又はその機能的断片、例えばＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１のプロモーターである。
【0067】
[0089] 少なくとも２つのポリペプチド配列をコードするゲノム配列は、細胞、組織又は器官のゲノム内の任意の適切な位置に位置し得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのポリペプチド配列をコードするゲノム配列は、ＡＡＶＳ１、ＣＥＰ１１２、ＲＯＳＡ２６、Ｐｉｆｓ３０２又はＰｉｆｓ５０１などのブタゲノムの「セーフ・ハーバー」遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのポリペプチド配列をコードするゲノム配列は、部位特異的又はプログラム可能なヌクレアーゼ（例えば、上記したＧＧＴＡ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ）を使用するインデル形成によって「ノックアウト」された別の遺伝子の遺伝子座又はその近位に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのポリペプチド配列をコードするゲノム配列は、非ブタ哺乳動物種由来のポリペプチドの対応するオルソロガスブタ遺伝子座、例えばＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１のオルソログの遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのポリペプチド配列をコードするゲノム配列は、対応するオルソロガスブタポリペプチド、例えばＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１のオルソログの代わりに位置する。
【0068】
[0090] いくつかの実施形態において、非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ又はＨＯ－１のサブセットを含む。サブセットは、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ３９、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡＥ及びＣＤ４７であり得る。サブセットは、炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、免疫調節剤導入遺伝子、凝固応答導入遺伝子、補体応答導入遺伝子及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも２つのタイプの導入遺伝子であり得る。炎症応答導入遺伝子は、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１）、分化クラスター４７（ＣＤ４７）又はそれらの組み合わせを含み得る。免疫応答導入遺伝子は、ヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）又はそれらの組み合わせを含み得る。免疫調節剤導入遺伝子は、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）又はそれらの組み合わせを含み得る。凝固応答導入遺伝子は、分化クラスター３９（ＣＤ３９）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）及びそれらの組み合わせを含み得る。補体応答導入遺伝子は、膜補因子タンパク質（ｈＣＤ４６）、補体崩壊促進因子（ｈＣＤ５５）、ＭＡＣ阻害因子（ｈＣＤ５９）又はそれらの組み合わせを含み得る。
【0069】
[0091] いくつかの実施形態において、非ブタ哺乳動物種由来の少なくとも２つのポリペプチド配列は、タンデム配列として（例えば、例えば相同組換えによって組み込まれた、単一の構築物として）提供され得る。
【0070】
[0092] いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞、組織又は器官は、非ブタ哺乳動物種に移植した場合、約１日超、２日超、３日超、４日超、５日超、６日超、７日超、８日超、９日超、１０日超、１１日超、１２日超、１３日超、１４日超、１５日超、１６日超、２０日超、２４日超、３６日超、４８日超、６０日超、７２日超、８４日超又はそれを超える生存を示し得る。
【0071】
[0093] いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞、組織又は器官は、本明細書に記載の非ブタ哺乳動物種に移植された場合、変化した免疫応答を示し得る。本明細書に記載の細胞、組織又は器官は、非ブタ哺乳動物種から単離されたＰＢＭＣに対して減少したＩＢＭＩＲを示し得る。即時血液媒介性免疫応答（ＩＢＭＩＲ）は、凝固及び補体カスケード、白血球及び血小板集団を含む強力な自然免疫応答であり、ドナー膵島をレシピエントに移植した直後に誘発され、例えば補体活性化をモニターするアッセイを使用して測定することができる（J. D. Lambris et al. (eds.), Immune Responses to Biosurfaces (2015), Advances in Experimental Medicine and Biology,Springer InternationalにおけるKourtzelis et al., Chapter 11“Regulation of Instant Blood Mediated Inflammatory Reaction (IBMIR) in Pancreatic Islet Xeno-Transplantation:Points for Therapeutic Interventions”）。ＩＢＭＩＲは、少なくとも約０．２５倍、約０．５倍、約０．７５倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍若しくは約１０倍又はそれを超えて減少し得る。本明細書に記載の細胞、組織又は器官は、非ブタ種由来の補体による毒性の低減を示し得る。非ブタ種由来の補体からの毒性は、放射性アッセイ（例えば、５１Ｃｒアッセイ）、生細胞染色（例えば、フローサイトメトリーによる）、ＬＤＨ又はＧＡＰＤＨなどの放出された細胞内酵素の活性又は死細胞染色を使用して測定され得る。例示的な方法は、Yamamoto et al. Scientific Reports (10): 9771 (2020)に記載されている。非ブタ種由来の補体に対する毒性は、少なくとも約０．２５倍、約０．５倍、約０．７５倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍若しくは約１０倍又はそれを超えて減少し得る。本明細書に記載の細胞、組織又は器官は、非ブタ哺乳動物種由来の活性化プロテインＣ凝固の誘導の低減を示し得る。非ブタ哺乳動物種由来の活性化プロテインＣ凝固の誘導は、少なくとも約０．２５倍、約０．５倍、約０．７５倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍若しくは約１０倍又はそれを超えて減少し得る。本明細書に記載の細胞、組織又は器官は、非ブタ種由来のトロンビン－アンチトロンビン複合体形成の誘導の低減を示し得る。非ブタ種由来のトロンビン－アンチトロンビン複合体形成の誘導は、少なくとも約０．２５倍、約０．５倍、約０．７５倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍若しくは約１０倍又はそれを超えて減少し得る。本明細書に記載の細胞、組織又は器官は、非ブタ種由来のＮＫ細胞による毒性の低減を示し得る。非ブタ種由来のＮＫ細胞からの毒性は、放射性アッセイ（例えば、５１Ｃｒアッセイ）、生細胞染色（例えば、フローサイトメトリーによる）、ＬＤＨ又はＧＡＰＤＨなどの放出された細胞内酵素の活性、死細胞染色又は細胞毒性を評価するために使用される他の技術を使用して測定され得る。非ブタ種由来のＮＫ細胞による毒性は、少なくとも約０．２５倍、約０．５倍、約０．７５倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍若しくは約１０倍又はそれを超えて減少し得る。
【0072】
[0094] いくつかの場合、本開示は、治療有効用量の、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるブタ膵島細胞を含む組成物を提供する。膵島細胞は、膵臓に見られる天然の割合の膵島細胞を含み得るか、又は膵島細胞のサブセット若しくは膵臓に天然に見られるものと異なる割合の膵島細胞を含み得る。膵島細胞は、ベータ細胞、アルファ細胞、デルタ細胞、イプシロン細胞又はＰＰ細胞（別名ガンマ細胞又はＦ細胞）を含み得る。
【0073】
[0095] いくつかの場合、膵島細胞は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超える量のベータ細胞を含み得る。いくつかの場合、膵島細胞は、最大で約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満の量のベータ細胞を含み得る。いくつかの例において、膵島細胞は、約１０％～約３０％の範囲の量のベータ細胞を含み得る。いくつかの例において、膵島細胞は、約１２％～約２５％の範囲の量のベータ細胞を含み得る。
【0074】
[0096] いくつかの場合、膵島細胞は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超える量のアルファ細胞を含み得る。いくつかの場合、膵島細胞は、最大で約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満の量のアルファ細胞を含み得る。いくつかの例において、膵島細胞は、約１０％～約４０％の範囲の量のアルファ細胞を含み得る。いくつかの例において、膵島細胞は、約１５％～約３０％の範囲の量のベータ細胞を含み得る。
【0075】
[0097] いくつかの場合、膵島細胞は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超える量のデルタ細胞を含み得る。いくつかの場合、膵島細胞は、最大で約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満の量のデルタ細胞を含み得る。いくつかの例において、膵島細胞は、約１０％～約４０％の範囲の量のデルタ細胞を含み得る。いくつかの例において、膵島細胞は、約１５％～約３０％の範囲の量のデルタ細胞を含み得る。
【0076】
[0098] いくつかの場合、膵島細胞は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超える量のイプシロン細胞を含み得る。いくつかの場合、膵島細胞は、最大で約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満の量のイプシロン細胞を含み得る。いくつかの例において、膵島細胞は、約１０％～約４０％の範囲の量のイプシロン細胞を含み得る。いくつかの例において、膵島細胞は、約１５％～約３０％の範囲の量のイプシロン細胞を含み得る。
【0077】
[0099] いくつかの場合、膵島細胞は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、５０％又はそれを超える量の膵臓ポリペプチド（ＰＰ）細胞を含み得る。いくつかの場合、膵島細胞は、最大で約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満の量のＰＰ細胞を含み得る。いくつかの例において、膵島細胞は、約１０％～約４０％の範囲の量のＰＰ細胞を含み得る。いくつかの例において、膵島細胞は、約１５％～約３０％の範囲の量のＰＰ細胞を含み得る。
【0078】
[00100] いくつかの場合、アルファ細胞の数と比較したベータ細胞の数は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％又はそれを超えるものであり得る。いくつかの場合、アルファ細胞の数と比較したベータ細胞の数は、最大で５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満であり得る。いくつかの例において、アルファ細胞の数と比較したベータ細胞の数は、約１０％～約４０％の範囲であり得る。いくつかの例において、アルファ細胞の数と比較したベータ細胞の数は、約１５％～約３０％の範囲であり得る。
【0079】
[00101] 細胞は、最初にその培地又は脱凝集した膵臓から採取し、次に処置有効量での投与に適した培地及び容器系（「薬学的に許容される」担体）で細胞を洗浄し、濃縮することによって製剤化され得る。適切な注入培地は、任意の等張培地であり得、通常の生理食塩水、Normosol R（Abbott）、Plasma-Lyte A（Baxter）、水中５％デキストロース、乳酸リンゲル液、フェノールレッド及びヘパリンを含まないCMRL 1066（例えば、１００Ｕ／ｋｇレシピエント）などを利用できる。注入培地は、ヒト血清アルブミン、ウシ胎児血清又は他のヒト血清成分で補充できる。いくつかの場合、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）は、レシピエント１キログラムあたり少なくとも１単位（Ｕ／ｋｇ）、２Ｕ／ｋｇ、３Ｕ／ｋｇ、４Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ、１０Ｕ／ｋｇ、１５Ｕ／ｋｇ、２０Ｕ／ｋｇ、３０Ｕ／ｋｇ、４０Ｕ／ｋｇ、５０Ｕ／ｋｇ、６０Ｕ／ｋｇ、７０Ｕ／ｋｇ、８０Ｕ／ｋｇ、９０Ｕ／ｋｇ、１００Ｕ／ｋｇ、１５０Ｕ／ｋｇ、２００Ｕ／ｋｇ、２５０Ｕ／ｋｇ、３００Ｕ／ｋｇ、３５０Ｕ／ｋｇ、４００Ｕ／ｋｇ、４５０Ｕ／ｋｇ、５００Ｕ／ｋｇ、６００Ｕ／ｋｇ、７００Ｕ／ｋｇ、８００Ｕ／ｋｇ、９００Ｕ／ｋｇ、１，０００Ｕ／ｋｇ又はそれを超える量で投与され得る。抗凝固剤は、膵島細胞と同じ溶液（例えば、緩衝液）で投与され得る。他の実施形態において、抗凝固剤及び膵島細胞は、別々に投与され得る。いくつかの場合、ＴＮＦ－アルファ阻害剤（例えば、エタネルセプト）は、レシピエント１キログラムあたり少なくとも約０．１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又はそれを超える量で投与され得る。一例において、ＴＮＦ－アルファ阻害剤は、約３ｍｇ／ｋｇの量で投与され得る。ＴＮＦ－アルファ阻害剤は、膵島細胞と同じ溶液（例えば、緩衝液）で投与され得る。他の実施形態において、ＴＮＦ－アルファ阻害剤及び膵島細胞は、別々に投与され得る。
【0080】
[00102] いくつかの場合、本開示は、インスリン抵抗性又は欠乏状態の処置を、それを必要とする非ブタ哺乳動物において行う方法を提供する。インスリン抵抗性又は欠乏状態は、１型又は２型糖尿病、単一遺伝子型糖尿病症候群（新生児糖尿病及び若年発症成人型糖尿病［ＭＯＤＹ］など）、外分泌膵臓の疾患（嚢胞性線維症及び膵炎など）又は薬物若しくは化学物質誘発性糖尿病（グルココルチコイドの使用、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの処置又は臓器移植後など）を含み得る。いくつかの実施形態において、インスリン抵抗性又は欠乏状態が１型又は２型糖尿病を含む場合、哺乳動物は、空腹時血漿グルコースレベル、経口耐糖能試験での成績又はＨｂＡ１Ｃなどの特定の臨床基準を示し得る。いくつかの実施形態において、インスリン抵抗性又は欠乏状態は、不安定形糖尿病、無自覚性低血糖、重度の低血糖エピソード又は血糖不安定性などの哺乳動物に存在する強化された危険因子を含み得る。
【0081】
[00103] 非ブタ哺乳動物種は、霊長類種であり得る。いくつかの実施形態において、非ブタ哺乳動物種は、非ヒト霊長類である。非ヒト霊長類には、マーモセット科（Callitrichidae）（マーモセット及びタマリン）、オマキザル科（Cebidae）（新世界ザル）、オナガザル科（Cercopithecidae）（旧世界ザル）、コビトキツネザル科（Cheirogaleidae）（コビトキツネザル及びネズミキツネザル）、アイアイ科（Daubentoniidae）（アイアイ）、ガラゴ科（Galagonidae）（ブッシュベビー及びガラゴ）、ヒト科（Hominidae）（大型類人猿を含む）、テナガザル科（Hylobatidae）（テナガザル及び小型類人猿）、インドリ科（Indridae）（インドリ、シファカ及び近縁種）、キツネザル科（Lemuridae）（チャイロキツネザル）、ロリス科（Loridae）（ロリス）、メガラダピス科（Megaladapidae）（イタチキツネザル）及びメガネザル科（Tarsiidae）（メガネザル）のファミリーを含むが、これらに限定されない、現存の非ヒト霊長類の様々な分類のいずれか又は全てによる現存の非ヒト霊長類が含まれる。「非ヒト霊長類」という用語は、現存の非ヒト霊長類の様々な分類のいずれか又は全てに従って分類された非ヒト霊長類及びその群を包含する。例えば、Wilson及びReeder（1993）は、キツネザル科（Lemuridae）からメガラダピス科（Megaladapidae）、ロリス科（Loridae）からガラゴ科（Galagonidae）を分け（前者の綴りは、ロリス科（Lorisidae）ではなく、ロリス科（Loridae）である）、ヒト科（Hominidae）に類人猿を含めている。Wilson, D. E.及びD. M. Reeder. 1993. Mammal Species of the World, A Taxonomic and Geographic Reference. 2nd edition. Smithsonian Institution Press, Washington。Anderson及びJones（１９８４年）は、現存の霊長類（Primates）の目を、曲鼻猿亜目（Strepsirhini）と直鼻猿亜目との２つの亜目に分けている。Thorington, R. W., Jr.及びS. Anderson. 1984. Primates. Pp. 187-217 in Anderson, S.and J. K. Jones, Jr. (eds). Orders and Families of Recent Mammals of the World. John Wiley and Sons, N.Y。曲鼻猿亜目（Strepsirhines）は、主に多くの原始的な特徴を有する樹上性の種を含むが、同時に特定の生活様式のためのいくつかの極端な分化を有し、直鼻猿亜目（Haplorhine）は、いわゆる「高等」霊長類であり、さらに２つの主要群、広鼻下目（Platyrrhini）と狭鼻下目（Catarrhini）とに分けられる。広鼻下目（Platyrrhine）は、平らな鼻、外向きの鼻の開口部、上顎及び下顎に３つの小臼歯、３つ又は４つの主要な歯尖を備えた前上臼歯を有し、新世界（オマキザル科（Cebidae）及びマーモセット科（Callitrichidae））でのみ見られる。狭鼻下目は、互いに接近した下向きの鼻の開口部の対を有し、通常、各顎に２つの小臼歯、４つの歯尖を備えた前上臼歯を有し、旧世界（オナガザル科（Cercopithecidae）、テナガザル科（Hylobatidae）、ヒト科（Hominidae））でのみ見られる。大半の霊長類は、熱帯又は亜熱帯に生息しているが、温帯地域にも生息しているものもある。いくつかの陸生種を除いて、霊長類は、樹上性である。一部の種は、葉又は果物を食べ、他の種は食虫性又は肉食性である。Myers, P. 1999.“Primates”(On-line), Animal Diversity Web. Accessed Aug. 26, 2005を参照されたい。
【0082】
[00104] いくつかの実施形態において、非ブタ哺乳動物種は、ヒト（Homo Sapiens）である。
【0083】
[00105] インスリン抵抗性又は欠乏状態の処置を、それを必要とする非ブタ哺乳動物において行う方法は、本明細書に記載の組成物、細胞、器官又は組織のいずれかの投与又は移植を含み得る。いくつかの場合、細胞組成物が投与されるとき、組成物は、中枢に投与され、例えば非ブタ哺乳動物の内頸静脈又は肝門脈を介して投与される。
【0084】
[00106] いくつかの場合、組成物、細胞、器官又は組織による処置前に、非ブタ哺乳動物は、誘導免疫抑制レジメンを受けている。導入レジメンは、前記細胞、組織又は器官を投与する前の、治療有効用量の抗胸腺細胞グロブリン、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ２０抗体、ラパログ、カルシニューリン阻害剤、ガンシクロビル又はそのプロドラッグ、抗ヒスタミン剤又はコルチコステロイドを含み得る。
【0085】
[00107] いくつかの場合、組成物、細胞、器官又は組織による処置後、非ブタ哺乳動物は、維持免疫抑制レジメンを受ける。維持レジメンは、治療有効用量の抗ＣＤ４０抗体、ラパログ、カルシニューリン阻害剤及びガンシクロビル又はガンシクロビルのプロドラッグを含み得る。
【0086】
[00108] いくつかの場合、組成物、細胞、器官又は組織で処置した後、非ブタ哺乳動物は、支持的インスリンレジメンを受ける。支持的インスリンレジメンは、前記細胞、組織、器官又は組成物の投与後の、治療有効用量の中間作用型又は長時間作用型インスリン類似体（例えば、インスリングラルギン、インスリンデテミル又はＮＰＨインスリン）を含み得る。
【0087】
[00109] インスリン抵抗性又は欠乏状態の処置を、それを必要とする非ブタ哺乳動物において行う方法は、特定の膵島等価用量（１ｋｇあたりのＩＥＱ）の投与を含み得る。参考として、膵島等価性（ＩＥＱ）は、直径１５０μｍの単一の球状膵島に等しい１つのＩＥＱとして定義され（Huang et al. Cell Transplant 2018 Jul: 27 (7): 1017-26）、膵島等価用量は、レシピエントの非ブタ哺乳動物体重１ｋｇあたりのＩＥＱである。いくつかの場合、用量は、非ブタ哺乳動物の体重１ｋｇあたり少なくとも約１，０００ＩＥＱ（ＩＥＱ／ｋｇ）、２，０００ＩＥＱ／ｋｇ、３，０００ＩＥＱ／ｋｇ、４，０００ＩＥＱ／ｋｇ、５，０００ＩＥＱ／ｋｇ、６，０００ＩＥＱ／ｋｇ、７，０００ＩＥＱ／ｋｇ、８，０００ＩＥＱ／ｋｇ、９，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１０，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１１，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１２，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１３，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１４，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１５，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１６，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１７，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１８，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１９，０００ＩＥＱ／ｋｇ、２０，０００ＩＥＱ／ｋｇ又はそれを超える量であり得る。いくつかの場合、用量は、最大で約２０，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１９，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１８，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１７，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１６，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１５，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１４，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１３，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１２，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１１，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１０，０００ＩＥＱ／ｋｇ、９，０００ＩＥＱ／ｋｇ、８，０００ＩＥＱ／ｋｇ、７，０００ＩＥＱ／ｋｇ、６，０００ＩＥＱ／ｋｇ、５，０００ＩＥＱ／ｋｇ、４，０００ＩＥＱ／ｋｇ、３，０００ＩＥＱ／ｋｇ、２，０００ＩＥＱ／ｋｇ、１，０００ＩＥＱ／ｋｇ又はそれ未満であり得る。一例において、用量は、非ブタ哺乳動物の体重１ｋｇあたり少なくとも５，０００ＩＥＱであり得る。
【0088】
[00110] いくつかの態様において、本開示は、非ブタ哺乳動物レシピエントへの移植前にブタドナーからの膵島の収率を改善する方法を提供する。方法は、膵臓オルガノイドを提供すること、有効濃度のカスパーゼ阻害剤の存在下で前記オルガノイドを培養すること及び有効濃度のコルチコステロイドの存在下で培養を継続することを含み得る。オルガノイドは、カスパーゼ阻害剤の存在下で少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも９０分間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも９０時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１８０時間、少なくとも３６０時間、少なくとも７２０時間又はそれを超える期間にわたって培養され得る。オルガノイドは、コルチコステロイドの存在下において、カスパーゼ阻害剤による処置後、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３又は少なくとも１４日間にわたって培養され得る。膵臓オルガノイドは、７日目以前にブタ動物から単離され得る。カスパーゼ阻害剤は、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＬＥＨＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫ、Emricasan、Ｚ－ＶＥＩＤＦＭＫ、Ｚ－ＤＥＶＤ－ＣＭＫ、ＭＸ１１２２、Ｍ８６７、ＭＭＰＳＩ、イサチンスルホンアミド、Ｂｏｃ－Ａｓｐ－ＦＭＫ、ＶＸ－１６６、Ｑ－ＶＤ－ＯＰｈ又はＩＤＮ－６５５６であり得る。コルチコステロイドは、メチルプレドニゾロンであり得る。オルガノイドは、ニコチンアミド又はその代謝的に許容される類似体の存在下で培養され得る。
【実施例】
【0089】
実施例
実施例１．トランスジェニックブタ動物及びそれに由来する内皮細胞の構成及び特性評価
[00111] ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を介したＮＨＥＪを使用して、バマ（Bama）ミニブタのブタ初代線維芽細胞で３つの主要な炭水化物産生グリコシルトランスフェラーゼ／グリコシルヒドロラーゼ遺伝子ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ及びＢ４ＧＡＬＮＴ２を機能的にノックアウトした。次に、１２のヒト導入遺伝子（ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ３９、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＨＯ－１）を、PiggyBACトランスポゾンを介したランダム統合を介してブタゲノムの単一のマルチ導入遺伝子カセットに統合して、「４－７」と呼ばれる３ＫＯ／１２ＴＧ細胞（体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を介してブタを生成するために使用された）を生成した。野生型ブタ耳線維芽細胞は、最初に、ａ）ＧＧＴＡ、ＣＭＡＨ及びＢ４ＧＡＬＮＴ２遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９試薬、及びｂ）（ｉ）PiggyBacトランスポザーゼカセット（ｉｉ）１２のヒト導入遺伝子の１つ以上を含むトランスジェニック構築物を保持するペイロードプラスミドの両方でエレクトロポレーションされた。導入遺伝子は、所望のユビキタスプロモーター又は組織特異的プロモーターを有する４つの異なるシストロン中に配置された。各シストロン内の導入遺伝子は、同様のモル比での発現を確実にするため、リボソームスキップ２Ａペプチドにより分離された。さらに、ユビキタスクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）などのシスエレメントの組み合わせを導入して、導入遺伝子のサイレンシングを防ぎ、強力なポリアデニル化部位及びターミネーターを備えたインスレーターを導入して、導入遺伝子間及び導入遺伝子と隣接染色体との間の相互作用を最小限に抑えた。線維芽細胞の単一細胞クローンを生成し、断片分析／全ゲノム配列決定によってスクリーニングして、所望のゲノム改変を有するクローンを同定し、次に所望の改変を有するクローンをドナーとして使用して、ＳＣＮＴにより生きたブタを作製した。
実施例１．トランスジェニックブタ動物及びそれに由来する内皮細胞の構成及び特性評価
[00111] ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を介したＮＨＥＪを使用して、バマ（Bama）ミニブタのブタ初代線維芽細胞で３つの主要な炭水化物産生グリコシルトランスフェラーゼ／グリコシルヒドロラーゼ遺伝子ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ及びＢ４ＧＡＬＮＴ２を機能的にノックアウトした。次に、１２のヒト導入遺伝子（ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ３９、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＨＯ－１）を、PiggyBACトランスポゾンを介したランダム統合を介してブタゲノムの単一のマルチ導入遺伝子カセットに統合して、「４－７」と呼ばれる３ＫＯ／１２ＴＧ細胞（体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を介してブタを生成するために使用された）を生成した。野生型ブタ耳線維芽細胞は、最初に、ａ）ＧＧＴＡ、ＣＭＡＨ及びＢ４ＧＡＬＮＴ２遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９試薬、及びｂ）（ｉ）PiggyBacトランスポザーゼカセット（ｉｉ）１２のヒト導入遺伝子の１つ以上を含むトランスジェニック構築物を保持するペイロードプラスミドの両方でエレクトロポレーションされた。導入遺伝子は、所望のユビキタスプロモーター又は組織特異的プロモーターを有する４つの異なるシストロン中に配置された。各シストロン内の導入遺伝子は、同様のモル比での発現を確実にするため、リボソームスキップ２Ａペプチドにより分離された。さらに、ユビキタスクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）などのシスエレメントの組み合わせを導入して、導入遺伝子のサイレンシングを防ぎ、強力なポリアデニル化部位及びターミネーターを備えたインスレーターを導入して、導入遺伝子間及び導入遺伝子と隣接染色体との間の相互作用を最小限に抑えた。線維芽細胞の単一細胞クローンを生成し、断片分析／全ゲノム配列決定によってスクリーニングして、所望のゲノム改変を有するクローンを同定し、次に所望の改変を有するクローンをドナーとして使用して、ＳＣＮＴにより生きたブタを作製した。
【0090】
[00112] 導入遺伝子の発現レベルは、ｑＰＣＲによって決定され、統合部位は、逆ＰＣＲに基づくジャンクションキャプチャーを使用して決定され、タンパク質レベルは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって決定された。結果は、以下の表１Ｂに要約される。
【0091】
【表3】
【0092】
[00113] 表１Ｂは、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色の結果による、４－７ブタの組織における様々な導入遺伝子の発現を示す。
【0093】
【表4】
【0094】
[00114] 遺伝子ノックアウト／ノックインの結果の機能的特徴
[00115] ＧＧＴＡ／ＣＭＡＨ／Ｂ４Ｇａｌ
[00116] 野生型ブタ組織に結合する予め形成された抗体は、異種移植に対する主要な初期免疫学的障壁と見なされており、これらの３つの遺伝子は、これらの抗体が標的とする異種抗原の産生に大きく関与していることが確認されている（Byrne 2014、Lai 2002、Lutz 2013、Martens 2017、Tseng 2006）。したがって、これらの遺伝子の機能喪失は、ブタ移植片の内皮への予め形成された抗ブタ抗体の結合を大きく排除するであろうと予測された。これは、標的ブタ臍帯静脈内皮細胞（「４－７」と呼ばれ、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２ノックアウトを含む、図１を参照されたい）への宿主抗体の結合の減少を示すフローサイトメトリーの結果によって確認された。抗体結合の低下を実証するために、遺伝子操作されたブタ内皮細胞をプールされたヒト血清とインキュベートし、結合したヒトＩｇＭ及びＩｇＧを結合型二次抗ヒト抗体で検出し、フローサイトメトリーで分析した。野生型ブタ臍帯静脈内皮細胞（ＰＵＶＥＣ）（赤色の等高線図）とは対照的に、３つの遺伝子を排除すると、抗体結合が有意に減少した（青色及び黄色の等高線図を比較、結合が約１log減少）。
[00115] ＧＧＴＡ／ＣＭＡＨ／Ｂ４Ｇａｌ
[00116] 野生型ブタ組織に結合する予め形成された抗体は、異種移植に対する主要な初期免疫学的障壁と見なされており、これらの３つの遺伝子は、これらの抗体が標的とする異種抗原の産生に大きく関与していることが確認されている（Byrne 2014、Lai 2002、Lutz 2013、Martens 2017、Tseng 2006）。したがって、これらの遺伝子の機能喪失は、ブタ移植片の内皮への予め形成された抗ブタ抗体の結合を大きく排除するであろうと予測された。これは、標的ブタ臍帯静脈内皮細胞（「４－７」と呼ばれ、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２ノックアウトを含む、図１を参照されたい）への宿主抗体の結合の減少を示すフローサイトメトリーの結果によって確認された。抗体結合の低下を実証するために、遺伝子操作されたブタ内皮細胞をプールされたヒト血清とインキュベートし、結合したヒトＩｇＭ及びＩｇＧを結合型二次抗ヒト抗体で検出し、フローサイトメトリーで分析した。野生型ブタ臍帯静脈内皮細胞（ＰＵＶＥＣ）（赤色の等高線図）とは対照的に、３つの遺伝子を排除すると、抗体結合が有意に減少した（青色及び黄色の等高線図を比較、結合が約１log減少）。
【0095】
[00117] 補体調節タンパク質（ＣＤ４６、ＣＤ５５及びＣＤ５９）
[00118] ブタ移植片の機能を維持し、補体を介した毒性からドナー器官を保護するために、ヒト補体調節タンパク質を過剰発現させた。簡単に説明すると、遺伝子操作されたブタ線維芽細胞及びブタ脾細胞を２５％ヒト補体と共に１時間インキュベートした。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーで分析して細胞死を定量化した（図２を参照されたい）。図２の左パネルは、アッセイワークフローを示す図であり、右パネルは、様々な濃度のヒト補体（「ＨＣ」）とのインキュベーション後の、ヒト臍帯静脈内皮細胞（「ＨＵＶＥＣ」）、トランスジェニック４－７ブタ臍帯静脈内皮細胞（「４－７ＰＵＶＥＣ」）又は正常ブタ臍帯静脈内皮細胞（「ＷＴ ＰＵＶＥＣ」）のいずれかの死を示すチャートである。３つの導入遺伝子の全てを有する４－７細胞は、ヒトＨＵＶＥＣ細胞と同様に、正常なブタ対応物に対して、ヒト補体に応答して劇的に減少した死を示す。
[00118] ブタ移植片の機能を維持し、補体を介した毒性からドナー器官を保護するために、ヒト補体調節タンパク質を過剰発現させた。簡単に説明すると、遺伝子操作されたブタ線維芽細胞及びブタ脾細胞を２５％ヒト補体と共に１時間インキュベートした。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーで分析して細胞死を定量化した（図２を参照されたい）。図２の左パネルは、アッセイワークフローを示す図であり、右パネルは、様々な濃度のヒト補体（「ＨＣ」）とのインキュベーション後の、ヒト臍帯静脈内皮細胞（「ＨＵＶＥＣ」）、トランスジェニック４－７ブタ臍帯静脈内皮細胞（「４－７ＰＵＶＥＣ」）又は正常ブタ臍帯静脈内皮細胞（「ＷＴ ＰＵＶＥＣ」）のいずれかの死を示すチャートである。３つの導入遺伝子の全てを有する４－７細胞は、ヒトＨＵＶＥＣ細胞と同様に、正常なブタ対応物に対して、ヒト補体に応答して劇的に減少した死を示す。
【0096】
[00119] 凝固応答遺伝子
[00120] 血管形成されたＷＴブタ器官がヒトに移植される場合、予め形成された抗体、補体及び自然免疫細胞が内皮細胞の活性化を誘発し、凝固及び炎症を引き起こす可能性がある。ブタ内皮細胞からの凝固調節因子とヒト血液との間の不和合性は、異常な血小板活性化及びトロンビン形成をもたらし、損傷を悪化させる。さらに、ブタとヒトとの間の凝固調節因子（例えば、組織因子経路阻害剤、ＴＦＰＩ）の分子の不和合性により、外因性凝固調節が無効となる。
[00120] 血管形成されたＷＴブタ器官がヒトに移植される場合、予め形成された抗体、補体及び自然免疫細胞が内皮細胞の活性化を誘発し、凝固及び炎症を引き起こす可能性がある。ブタ内皮細胞からの凝固調節因子とヒト血液との間の不和合性は、異常な血小板活性化及びトロンビン形成をもたらし、損傷を悪化させる。さらに、ブタとヒトとの間の凝固調節因子（例えば、組織因子経路阻害剤、ＴＦＰＩ）の分子の不和合性により、外因性凝固調節が無効となる。
【0097】
[00121] これらの異種凝固の問題に対処するために、ａ）ヒトＣＤ３９（凝固カスケードにおけるＡＤＰの血栓作用を打ち消すＡＤＰヒドロラーゼ）、及びｂ）ヒトＴＦＰＩ（内皮細胞の活性化後に細胞表面に移動する因子）の両方を４－７ＰＵＶＥＣで過剰発現させ、次に様々なインビトロ及びエクスビボアッセイを実施して、これらの導入遺伝子が正しく機能し、血小板及び凝固カスケードを調節する能力を検証した。図３は、４－７トランスジェニック内皮臍帯静脈ブタ細胞（ＰＵＶＥＣ）におけるＣＤ３９の発現／機能性を検証するために実施された分析の結果を示す。チャートは、ＨＵＶＥＣ、４－７ＰＵＶＥＣ又はＷＴ ＰＵＶＥＣで実施された比色ＣＤ３９ ＡＤＰ加水分解ベースの活性アッセイの結果を示す。４－７細胞は、ＣＤ３９の活性が強化されており、これは、導入遺伝子が機能的及び過剰発現していることを示唆している。インビトロＡＤＰａｓｅ生化学アッセイは、ＷＴ ＰＵＶＥＣ又はＨＵＶＥＣに対して４－７ＰＵＶＥＣで有意に高いＣＤ３９活性を示した。同様に、活性化された４－７ＰＵＶＥＣは、ヒトＸａに効果的に結合し中和する能力を示し、これにより凝固を緩和し、トロンビン－アンチトロンビン（ＴＡＴ）複合体の形成を低減することができる（図５）。４－７ＰＵＶＥＣと共培養したヒト全血を用いた図５のエクスビボ凝固アッセイは、最小限のＴＡＴ（トロンビン－アンチトロンビン）が形成され、ＴＡＴ形成のレベルがＨＵＶＥＣのレベルと類似していたことを示し（図５）、これは、４－７ＰＵＶＥＣが人的要因との凝固適合性を高めることを示唆している。
【0098】
[00122] 図６は、血小板活性化に対するこれらの遺伝子改変の影響を評価するために行われたアッセイの結果を示す。図６は、４－７トランスジェニック細胞で実施された血小板溶解アッセイの結果を示す。ＨＵＶＥＣ、４－７ＰＵＶＥＣ又はＷＴ ＰＵＶＥＣと４５分間又は６０分間インキュベートした後、ヒト血液から残存する血小板（輪郭が描かれたクラスター）の数を定量化するＦＡＣＳトレースが示される。４－７細胞は、ブタＷＴ ＥＣに対する残存血小板の数の上昇を示し続けており、これは、ＨＵＶＥＣ細胞とインキュベートした場合の残存血小板の割合と同等である。
【0099】
[00123] ＨＬＡ成分（ＨＬＡ－Ｅ／Ｂ２Ｍ）
[00124] ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のキラー細胞抑制受容体（ＫＩＲ）による標的細胞上のＭＨＣ Ｉの連結は、ＮＫ細胞を介した標的細胞の死滅を阻害する。ブタＭＨＣＩは、ヒトＮＫ ＫＩＲを介してシグナルを伝達することができないため、ブタ細胞は、ＮＫ細胞による標的細胞殺傷の影響を受けやすい。ＮＫを介した細胞死を克服するために、ヒトＮＫ ＫＩＲ受容体を連結するヒトＨＬＡ－Ｅをブタ細胞で過剰発現させた。さらに、ＭＨＣヘテロ二量体化パートナーＢ２Ｍのヒトコピーも過剰発現された。
[00124] ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のキラー細胞抑制受容体（ＫＩＲ）による標的細胞上のＭＨＣ Ｉの連結は、ＮＫ細胞を介した標的細胞の死滅を阻害する。ブタＭＨＣＩは、ヒトＮＫ ＫＩＲを介してシグナルを伝達することができないため、ブタ細胞は、ＮＫ細胞による標的細胞殺傷の影響を受けやすい。ＮＫを介した細胞死を克服するために、ヒトＮＫ ＫＩＲ受容体を連結するヒトＨＬＡ－Ｅをブタ細胞で過剰発現させた。さらに、ＭＨＣヘテロ二量体化パートナーＢ２Ｍのヒトコピーも過剰発現された。
【0100】
[00125] 次に、機能アッセイを実施して、４－７内皮細胞が遺伝子改変によるＮＫを介した細胞死滅に抵抗性であることを検証した。ＷＴ ＰＵＶＥＣ、４－７ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣは、インビトロアッセイでヒトＮＫ細胞による殺傷の標的となった（図７）。図７は、４－７ＰＵＶＥＣが、ＷＴの対応物よりもＮＫを介した細胞毒性が有意に低いことを示す（独立両側スチューデントｔ検定）。
【0101】
実施例２．トランスジェニック動物からの膵島の単離
[00126] トランスジェニック雄バマ（Bama）ミニブタ（実施例１のように産生された）を麻酔し、出生後０～７日で開腹及び瀉血に供した。膵臓を切除し、メスを用いて無菌条件下で小断片に切断した。膵臓断片をコラゲナーゼＶ消化（１ｍｇ／ｍｌ）に供し、ガス透過性培養バッグ（OriGen PermaLife（商標）細胞培養バッグ）に移し、培養施設に輸送するために２２～２４℃で保持した。膵島は、ＥＧＭ－２培地（ＦＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｒ３－ＩＧＦ、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、ヘパリン、Ｄ－グルコース、ニコチンアミド、１０％ブタ血清、５０μＭ ＩＢＭＸ、１２０μＭアミカシン及び６０μＭアンピシリンを含むＥＧＭ－２）、ＥＧＭ－２培地＋コルチコステロイド（ＥＧＭ－２＋１μＭメチルプレドニゾロン）又はHamのＦ－１０培地のいずれかにおいて、７日間にわたりバッグ又はペトリ皿で培養された。膵島均等物（ＩＥＱ）は、培養中の７日間にわたって測定され、グラフ化された（図１４、１５及び１６を参照されたい）。コルチコステロイドを含むＥＧＭ－２培地は、３つの条件の中で膵島の収率の改善と関連していた。
[00126] トランスジェニック雄バマ（Bama）ミニブタ（実施例１のように産生された）を麻酔し、出生後０～７日で開腹及び瀉血に供した。膵臓を切除し、メスを用いて無菌条件下で小断片に切断した。膵臓断片をコラゲナーゼＶ消化（１ｍｇ／ｍｌ）に供し、ガス透過性培養バッグ（OriGen PermaLife（商標）細胞培養バッグ）に移し、培養施設に輸送するために２２～２４℃で保持した。膵島は、ＥＧＭ－２培地（ＦＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｒ３－ＩＧＦ、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ、ヘパリン、Ｄ－グルコース、ニコチンアミド、１０％ブタ血清、５０μＭ ＩＢＭＸ、１２０μＭアミカシン及び６０μＭアンピシリンを含むＥＧＭ－２）、ＥＧＭ－２培地＋コルチコステロイド（ＥＧＭ－２＋１μＭメチルプレドニゾロン）又はHamのＦ－１０培地のいずれかにおいて、７日間にわたりバッグ又はペトリ皿で培養された。膵島均等物（ＩＥＱ）は、培養中の７日間にわたって測定され、グラフ化された（図１４、１５及び１６を参照されたい）。コルチコステロイドを含むＥＧＭ－２培地は、３つの条件の中で膵島の収率の改善と関連していた。
【0102】
[00127] いくつかの場合、機械的又は酵素的消化に続いて、膵臓断片が沈降（例えば、フィコール勾配沈降）によって精製され得る。他の場合、沈降によるそのような精製ステップは、必要でない可能性があるか又は必ずしも必要でない。そのような場合、膵臓断片は、移植前に培養され得（例えば、培養皿で約７日間）、その間に非膵島細胞（例えば、外分泌細胞）が死滅し得る。
【0103】
[00128] 実施例３．トランスジェニック動物からの膵島の分析
[00129] 実施例２のように正常及びトランスジェニックなバマ（Bama）ミニブタから膵島細胞を単離した後、アッセイを実施して、４－７内皮細胞について実施例１で行った実験のスキームと同様に、４－７膵島細胞の異種適合性の側面を評価した。
[00129] 実施例２のように正常及びトランスジェニックなバマ（Bama）ミニブタから膵島細胞を単離した後、アッセイを実施して、４－７内皮細胞について実施例１で行った実験のスキームと同様に、４－７膵島細胞の異種適合性の側面を評価した。
【0104】
[00130] 第一に、血小板及び凝固カスケードを調節するための遺伝子改変の効果を評価するために実験を行った。図１１は、図９／実施例２のように単離された膵島細胞で実施された血小板溶解又はＴＡＴ複合体形成アッセイの結果を示す。陰性対照（ＮＣ）としてのヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ＷＴ又は４－７膵島で実施された図６のような血小板溶解アッセイ（左パネル）及びＨＵＶＥＣ ＮＣ、ＷＴ又は４－７膵島で実施された図５のようなＴＡＴ複合体形成アッセイを示すチャートが示される。４－７膵島は、ヒト血液成分とインキュベートすると、血小板溶解の減少及びＴＡＴ複合体形成の減少を示す。
【0105】
[00131] 第二に、移植されたブタ組織に対するヒト免疫系の短期的なＩＢＭＩＲ応答を調節するための遺伝子改変の効果を評価するために実験を行った。図１２は、図９のように得られた４－７膵島でヒト血液により実施された即時血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）アッセイの結果を示す。簡単に説明すると、ヒト全血を、本明細書に開示されるようにブタ膵島細胞と共にインキュベートし、その後、ヒト全血とブタ膵島細胞との間の接触（又は相互作用）によって少なくとも部分的に引き起こされる凝固又は血餅をチェックした。いくつかの場合、血餅のサイズ及び／又は重量が測定された。４－７膵島切片をヒト血液とインキュベートした後の抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭ、左パネル）及び補体（Ｃ３ａ及びＣ４ｄ、右パネル）の病巣の染色を示す、２００倍の倍率でのＩＨＣ顕微鏡写真が図９に示される。４－７膵島細胞は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｃ３ａ及びＣ４ｄに関連する染色及び病巣の減少を示し、これは、膵島細胞がＩＢＭＩＲの減少を示し、最初の移植時に死に対する抵抗性が強化されていることを示すはずであることを示唆している。
【0106】
[00132] 第三に、ヒト好中球の活性を調節するための遺伝子改変の効果を評価するために実験が行われた。図１３は、４－７膵島で培養されたヒト全血中の好中球の残存数を示す。４－７膵島は、ヒト全血とインキュベートした場合、ＷＴ膵島と比較して好中球の残存数が多いことが明らかになった。
【0107】
実施例４．レシピエントマウスへの膵島の移植
[00133] 異種移植時の４－７ブタトランスジェニック膵島細胞の機能を試験するために、ＳＴＺベースのマウス糖尿病膵島養子移入モデルが確立された。このモデル手順を使用したマウスの例示的な血糖値を図１９に示す。このモデルは、毒素（ストレプトゾトシン、ＳＴＺ）を使用して免疫不全マウスの膵島細胞を殺傷し、血糖値の劇的な上昇を生じる。膵島細胞の移植は、移植後約６０日までに血糖値の正常化をもたらす。
[00133] 異種移植時の４－７ブタトランスジェニック膵島細胞の機能を試験するために、ＳＴＺベースのマウス糖尿病膵島養子移入モデルが確立された。このモデル手順を使用したマウスの例示的な血糖値を図１９に示す。このモデルは、毒素（ストレプトゾトシン、ＳＴＺ）を使用して免疫不全マウスの膵島細胞を殺傷し、血糖値の劇的な上昇を生じる。膵島細胞の移植は、移植後約６０日までに血糖値の正常化をもたらす。
【0108】
[00134] 糖尿病の処置における４－７膵島細胞の有効性を評価するために、糖尿病は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ、１２５ｍｇ／ｋｇ）の単回投与による処置と、それに続く３日間のウォッシュアウト期間により、ｎ＝１２ ＮＣＤ（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｃｄ５２Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６Ｃｄ２２／ＮｊｕＣｒｌ）マウスで最初に誘発され、３匹の未処置同齢マウスを対象として残した。次に、未処置のマウス及びＳＴＺ処置マウスのうちの３匹を偽移植手術に供し、ＳＴＺマウスのうちの３匹に、図９／実施例２のように単離された野生型ブタ膵島（３０００ＩＥＱ）を投与し、ＳＴＺマウスのうちの３匹に、図９／実施例２のように単離された４－７トランスジェニックブタ膵島（３０００ＩＥＱ）を投与した。膵島が移植された場合、それらは、左腎被膜下に移植された。簡単に説明すると、４－７膵島細胞を溶液（例えば、緩衝液）に混合又は分散させ、注射器及びソフトチューブを介して腎臓被膜下に注入（例えば、ゆっくりと注入）した。
【0109】
[00135] 図２０は、本明細書で提供される対象の４－７ブタトランスジェニック膵島細胞を含む膵島様細胞クラスター（ＮＩＣＣ）を投与された（Ｔ１Ｄ齧歯動物モデルとしての）ＮＣＧマウスの血糖値を示す。野生型ブタ膵島細胞を含むＮＩＣＣを対照として使用した。様々な量のＮＩＣＣがＮＣＧマウスに移植された：４０００ＩＥＱ、２０００ＩＥＱ及び１０００ＩＥＱ。データは、ＷＴブタ膵島細胞と比較して、４－７ブタトランスジェニック膵島細胞がマウスの血糖値の上昇を制御するのに同様の有効性を示したことを示す。４－７ブタのトランスジェニック膵島細胞は、移植後約２週間で、インビボで機能するようになった（例えば、血糖値の制御において）。
【0110】
[00136] いくつかの場合、移植されたブタ細胞の異常増殖をより長い時間（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月超又はそれを超える期間）モニターし得る。いくつかの場合、ヒト成人膵島細胞は、例えば、臨床的なヒト成人膵島処置用量で陽性対照として使用され得る。いくつかの場合、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）Ｔ１Ｄマウスモデルが二次的なインビボモデルとして使用され得る。いくつかの場合、その適合性及び安全性を試験するために、ブタトランスジェニック膵島細胞が門脈内静脈注射によって投与され得る。
【0111】
[00137] 実施例５．レシピエントサルへの膵島の移植
[00138] 霊長類への異種移植時の４－７ブタトランスジェニック膵島細胞の機能を試験するために、ＳＴＺベースのＮＨＰ糖尿病膵島養子移入（門脈内膵島細胞移植を使用）モデルが確立された。図９／実施例２のように単離された４－７膵島及びＷＴを、超音波によって誘導される経皮経肝門脈カテーテル法によりカニクイザルに移植した。これらの実験のスキームを図２１に示す。
[00138] 霊長類への異種移植時の４－７ブタトランスジェニック膵島細胞の機能を試験するために、ＳＴＺベースのＮＨＰ糖尿病膵島養子移入（門脈内膵島細胞移植を使用）モデルが確立された。図９／実施例２のように単離された４－７膵島及びＷＴを、超音波によって誘導される経皮経肝門脈カテーテル法によりカニクイザルに移植した。これらの実験のスキームを図２１に示す。
【0112】
[00139] ブタ細胞の移植に使用された免疫抑制プロトコルは、以下の通りであった。
【0113】
[00140] ＡＴＧは、－７日目（±２日）、－６日目（±２日）、－４日目（±２日）に５ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶ投与され、血中のベースラインレベルの５％未満までのリンパ球枯渇が達成された場合、－１日目に追加のＡＴＧが投与された。
【0114】
[00141] 抗ＣＤ４０は、－４日目（±１日）、０日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目に静脈内投与され、その後、毎週、５０ｍｇ／ｋｇ初回用量及びその後３０ｍｇ／ｋｇで投与された。
【0115】
[00142] 抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブを０日目（±２日）に３７５ｍｇ／ｍ２の用量でＩＶ投与し、Ｂ細胞数がベースラインの５％を超えて上昇した場合には最大３ヶ月ごとに反復投与した。
【0116】
[00143] ラパマイシンとタクロリムスは、それぞれ０．３ｍｇ／ｋｇＱＤ及び０．０２ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤの開始用量で経口により－３日目（±１日）に開始され、血漿濃度に応じて調整した。
【0117】
[00144] ガンシクロビルは、５ｍｇ／ｋｇの用量で－７日目（±２日）から開始して筋肉内投与された。
【0118】
[00145] 注入反応を防ぐために、クロルトリメトン０．４ｍｇ／ｋｇ ＩＭ及びメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶの予防的使用がＡＴＧ、抗ＣＤ４０及び抗ＣＤ２０投与前に投与された。
【0119】
[00146] 健康をサポートするためのＳＴＺ導入動物へのインスリンの支持的投与は、以下のように提供された。
【0120】
[00147] グラルギンインスリンは、ＱＤで投与され、最初に２Ｕ ＱＤで投与された。用量は、ＦＢＧが１５０ｍｇ／ｄｌ超である場合には２Ｕ増加し、ＦＢＧが１００ｍｇ／ｄｌ未満である場合には２Ｕ減少した。
【0121】
[00148] 動物の記録された血糖値に応じて、朝及び夕方にインスリンをＢＩＤ投与した。朝の投与では、２００ｍｇ／ｄｌ未満は、インスリンを投与せず、２００～３５０ｍｇ／ｄｌは、４Ｕのインスリンを投与し、３５０～４００ｍｇ／ｄｌは、６Ｕのインスリンを投与し、４００～６００ｍｇ／ｄｌは、８Ｕのインスリンを投与し、６００ｍｇ／ｄｌ超は、１０Ｕのインスリンを投与した。夕方の投与では、３００ｍｇ／ｄｌ未満は、インスリンを投与せず、３００～３５０ｍｇ／ｄｌは、４Ｕのインスリンを投与し、３５０～４００ｍｇ／ｄｌは、６Ｕのインスリンを投与し、４００～６００ｍｇ／ｄｌは、８Ｕのインスリンを投与し、６００ｍｇ／ｄｌ超は、１０Ｕのインスリンを投与した。
【0122】
[00149] サル（ＭＢ－１）でＳＴＺ糖尿病誘発プロトコルを使用したパイロット実験を図２２に示し、動物は、図２１のスキームに従って管理されている。移植された細胞の機能的出力を測定するために、５０％デキストロース１ｍｌ／ｋｇ ｉｖの投与後、動物の血糖、Ｃ－ペプチド及びインスリンを評価した。図２２のデータは、ＳＴＺ処置後の血糖の増加並びにＣ－ペプチド及びインスリンの減少により、糖尿病誘発プロトコルが成功したことを示す。このプロトコルを使用して、さらなる動物ＭＡ－１、ＭＡ－２、ＭＢ－２、ＭＣ－１、ＭＤ－１及びＭＥ－１に糖尿病を誘発し、以下の表２に従って移植片を移植した。移植後の白血球数、リンパ球数、ＣＤ４＋細胞型、ＣＤ８＋細胞型、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びラパマイシンレベルについて動物をモニターした（図２３、２４及び２５）。
【0123】
[00150] 動物ＭＡ－１及びＭＡ－２は、その後、移植された４－７膵島の存在について、移植後１２時間及び１ヶ月の肝生検の免疫組織化学について分析された。肝生検を実施し、ヘマトキシリン／エオシン（ＭＡ－１及びＭＡ－２の場合）及び（ＭＡ２の場合）膵島細胞を染色する神経上皮マーカークロモグラニンＡについて染色し、膵島様構造の存在及び動物肝臓への４－７細胞の生着を示す（図２６を参照されたい）。
【0124】
[00151] 非ヒト霊長類の移植片の機能を長期間にわたって評価するために、免疫組織化学、血糖、Ｃ－ペプチド（サル及びブタの両方）及びインスリンレベルは、表２の全ての動物で引き続き監視される。
【0125】
【表5】
【0126】
[00153] 本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは、当業者に明らかであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、多数の変形形態、変更形態及び置換形態が当業者に想到されるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態は、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物は、それによって包含されることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【国際調査報告】