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特表2023-509151トランスアミナーゼ突然変異体、固定化トランスアミナーゼ及びシタグリプチンの製造における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-07
(54)【発明の名称】トランスアミナーゼ突然変異体、固定化トランスアミナーゼ及びシタグリプチンの製造における使用
(51)【国際特許分類】
C12P 17/16 20060101AFI20230228BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20230228BHJP
C12N 11/08 20200101ALI20230228BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20230228BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20230228BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230228BHJP
【ＦＩ】
C12P17/16
C12N9/10 ZNA
C12N11/08
C12N15/54
C12N15/70 Z
C12N1/21
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022540794
(86)(22)【出願日】2020-12-10
(85)【翻訳文提出日】2022-06-30
(86)【国際出願番号】 CN2020135136
(87)【国際公開番号】W WO2021135886
(87)【国際公開日】2021-07-08
(31)【優先権主張番号】201911423071.1
(32)【優先日】2019-12-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520385157
【氏名又は名称】エーバイオケム バイオテクノロジー カンパニー，リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ティエン、チェンホア
(72)【発明者】
【氏名】チョン、チャンピン
(72)【発明者】
【氏名】ティン、シャオナン
(72)【発明者】
【氏名】チアオ、チー
(72)【発明者】
【氏名】ハオ、チュイシー
(72)【発明者】
【氏名】チー、ヨンリャン
【テーマコード（参考）】
4B033
4B050
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B033NA25
4B033NB34
4B033NC03
4B033ND02
4B033ND08
4B033ND12
4B050CC04
4B064AE54
4B064AE57
4B064CA21
4B064CB30
4B064CC24
4B064CD06
4B064CD12
4B064CD15
4B064CE10
4B064DA01
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA18
4B065CA44
(57)【要約】
シタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンの製造における固定化トランスアミナーゼの使用を提供する。前記固定化トランスアミナーゼは、樹脂及びトランスアミナーゼ突然変異体を含み、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号７に示される。固定化トランスアミナーゼ、トランスアミナーゼ突然変異体およびその製造方法並びに使用をさらに提供する。前記トランスアミナーゼ突然変異体がケトアミド基質を触媒する際に酵素活性が高く、それを固定化トランスアミナーゼに製造した後の酵素活性が依然として高く、それをケトアミド基質を触媒するに用いてシタグリプチン又はその中間体を生産する際に、選別された溶媒反応系と結合し、固定化トランスアミナーゼの転化率が高く且つ立体選択性に優れ、安定性に優れ、繰り返し使用率を向上させ、操作がより簡単で、さらに生産コストを低減させ、産業化生産に有利である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンの製造における固定化トランスアミナーゼの使用であって、ただし、前記固定化トランスアミナーゼは、樹脂及びトランスアミナーゼ突然変異体を含み、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号７に示され、
好ましくは、
前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号４又は配列番号８に示され、及び／又は、前記トランスアミナーゼ突然変異体と前記樹脂は、共有結合により接続され、及び／又は、前記樹脂は、好ましくはエポキシ樹脂であり、より好ましくはＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡ、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＨＦＡ４０３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ１１３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ４０３及び／又はＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＥＰであり、例えばＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡであり、
より好ましくは、前記製造に用いられる反応溶媒は、イソプロパノール水溶液であり、好ましくは前記イソプロパノール水溶液における水の体積含有量が、２％～２０％であり、及び／又は、前記製造の反応系には、さらにトランスアミナーゼの補助因子、例えばリン酸ピリドキサールを含み、その濃度は、好ましくは０．５～５ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする使用。
【請求項2】
樹脂及びトランスアミナーゼ突然変異体を含み、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号７に示され、好ましくは、
前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号４又は配列番号８に示され、及び／又は、前記トランスアミナーゼ突然変異体と前記樹脂は、共有結合により接続され、及び／又は、前記樹脂は、好ましくはエポキシ樹脂であり、より好ましくはＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡ、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＨＦＡ４０３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ１１３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ４０３及び／又はＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＥＰであり、例えばＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡであることを特徴とする固定化トランスアミナーゼ。
【請求項3】
１）トランスアミナーゼ突然変異体の溶液と樹脂とを接触させて固定化トランスアミナーゼを形成させ、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号７に示される、ステップと、２）前記固定化トランスアミナーゼを濾過し洗浄するステップとを、含む固定化トランスアミナーゼの製造方法であって、
好ましくは、
前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号４又は配列番号８に示され、及び／又は、前記トランスアミナーゼ突然変異体と前記樹脂は、共有結合により接続され、及び／又は、前記樹脂は、好ましくはエポキシ樹脂であり、より好ましくはＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡ、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＨＦＡ４０３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ１１３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ４０３及び／又はＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＥＰであり、例えばＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡであることを特徴とする製造方法。
【請求項4】
アミノ基供与体が存在する際、反応溶媒において固定化トランスアミナーゼでケトアミド基質を触媒してシタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンを得るステップを含むシタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンの製造方法であって、ただし、前記固定化トランスアミナーゼは、請求項２に記載のとおりであり、及び／又は、前記反応溶媒は、イソプロパノール水溶液であり、
好ましくは、
前記ケトアミド基質は、４－オキソ－４－［３－（トリフルオロメチル）－５，６－ジヒドロ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジン－７－（８Ｈ）－イル）－１－（２，４，５－トリフルオロフェニル）ブタン－２－オン及び／又は１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１，３－ブタンジオンであり、
及び／又は、前記アミノ基供与体は、イソプロピルアミンであり、
及び／又は、前記アミノ基供与体と基質とのモル比は、１：１～５：１であり、
及び／又は、前記反応溶媒がイソプロパノール水溶液である際に、水の体積含有量は、２％～２０％であり、
及び／又は、前記ケトアミド基質の濃度は、２０ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌであり、
及び／又は、前記固定化トランスアミナーゼと基質との質量比は、１：１～６：１であり、
及び／又は、前記製造の反応系には、さらにトランスアミナーゼの補助因子、例えばリン酸ピリドキサールを含み、その濃度は、好ましくは０．５～５ｍｇ／ｍＬであり、
及び／又は、前記反応の温度は、３０～６０℃であり、好ましくは４５℃であることを特徴とする製造方法。
【請求項5】
固定化トランスアミナーゼであって、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号７に示され、好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号４又は配列番号８に示されることを特徴とする固定化トランスアミナーゼ。
【請求項6】
請求項５に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項7】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターであって、好ましくは、前記組換え発現ベクターの骨格は、プラスミドｐＥＴ２８ａであることを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項8】
形質転換体であって、請求項６に記載のポリヌクレオチド又は請求項７に記載の組換え発現ベクターを宿主に導入し、好ましくは、前記宿主は、大腸菌であり、好ましくは、大腸菌ＢＬ２１であることを特徴とする形質転換体。
【請求項9】
シタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンの製造における請求項５に記載のトランスアミナーゼ突然変異体の使用。
【請求項10】
シタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンの製造における反応溶媒の使用であって、前記反応溶媒は、イソプロパノール水溶液であり、好ましくは、前記使用は、アミノ基供与体が存在する際に、イソプロパノール水溶液においてトランスアミナーゼでケトアミド基質を触媒してシタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンを得るステップを含み、
より好ましくは、前記トランスアミナーゼは、請求項２に記載の固定化トランスアミナーゼ及び／又は請求項５に記載のトランスアミナーゼ突然変異体であり、
及び／又は、前記ケトアミド基質は、４－オキソ－４－［３－（トリフルオロメチル）－５，６－ジヒドロ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジン－７－（８Ｈ）－イル）－１－（２，４，５－トリフルオロフェニル）ブタン－２－オン及び／又は１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１，３－ブタンジオンであり、
及び／又は、前記アミノ基供与体は、イソプロピルアミンであり、
及び／又は、前記アミノ基供与体と基質とのモル比は、１：１～５：１であり、
及び／又は、前記反応溶媒がイソプロパノール水溶液である際に、水の体積含有量は、２％～２０％であり、及び／又は、前記ケトアミド基質の濃度は、２０ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌであり、
及び／又は、前記固定化トランスアミナーゼと基質との質量比は、１：１～６：１であり、
及び／又は、前記製造の反応系には、さらにトランスアミナーゼの補助因子、例えばリン酸ピリドキサールを含み、その濃度は、好ましくは０．５～５ｍｇ／ｍＬであり、
及び／又は、前記反応の温度は、３０～６０℃であり、好ましくは４５℃であることを特徴とする使用。
【請求項11】
シタグリプチンリン酸塩の製造方法であって、請求項４に記載の製造方法により、シタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンを製造するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られたシタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンを反応させ、シタグリプチンリン酸塩を得るステップ（２）と、を含み、
好ましくは、前記シタグリプチンリン酸塩は、シタグリプチンリン酸塩一水和物であることを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、出願日が２０１９年１２月３１日である中国特許出願２０１９１１４２３０７１１の優先権を主張する。本願は、上記中国特許出願の全文を引用する。
【0002】
本発明は、バイオ技術分野に属し、具体的には、トランスアミナーゼ突然変異体、固定化トランスアミナーゼ及びシタグリプチン又はその中間体の製造における当該固定化トランスアミナーゼの使用に関し、本発明は、さらに、シタグリプチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【0003】
糖尿病は、インスリン分泌の変化により、インスリンの欠乏及び作用の低下、又はインスリン活性が低下を引き起こし、又は両者が共に影響を及ぼして高血糖を特徴とする代謝性疾患が出現し、タンパク質、糖及び脂肪の代謝乱れを伴うものである。糖尿病及びその合併症が人類の健康に対する危害程度は、心臓血管疾患、腫瘍後の第３位であり、人類の健康を危害する重要な疾患になった。糖尿病の四種類のタイプにおいて、ＩＩ型糖尿病は、９０％以上を占め、３０歳以上の中高齢者に多く見られ、病因は、主に、体がインスリンに敏感ではないためである。
【0004】
シタグリプチンリン酸塩（Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、２００６年ＦＤＡによって許可されて上市したジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰ－４）阻害剤であり、ＩＩ型糖尿病を治療するために用いられるものである。その単独使用又はジメチルビグアニド、ピオグリタゾンと併用はいずれも顕著な血糖降下作用を有し、且つ服用が安全で、耐性に優れ、有害反応が少なかった。
【0005】
米国特許ＵＳ８２９３５０７には、Ｃｏｄｅｘｉｓ会社がコリネバクテリウム由来のトランスアミナーゼを改造して得られたトランスアミナーゼを用いて４－オキソ－４－［３－（トリフルオロメチル）－５，６－ジヒドロ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジン－７－（８Ｈ）－イル）－１－（２，４，５－トリフルオロフェニル）ブタン－２－オンを触媒してシタグリプチン（（２Ｒ）－４－オキソ－４－［３－（トリフルオロメチル）－５，６－ジヒドロ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジン－７－（８Ｈ）－イル］－１－（２，４，５－トリフルオロフェニル）ブタン－２－アミンを得、シタグリプチンをさらにリン酸化してシタグリプチンリン酸塩を得ることが開示された。改造されたトランスアミナーゼは、ケトアミド基質２ｇ／Ｌ、イソプロピルアミン０．５Ｍ、２２℃、５％ＤＭＳＯ、リン酸ピリドキサール（ＰＬＰ）１００μＭ及びトランスアミナーゼポリペプチド２０ｍｇ／ｍＬの条件で、基質である４－オキソ－４－［３－（トリフルオロメチル）－５，６－ジヒドロ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジン－７－（８Ｈ）－イル）－１－（２，４，５－トリフルオロフェニル）ブタン－２－オン（本発明では、シタグリプチンジオンと略称する）をＨＰＬＣ－ＵＶが２１０ｎｍで検出可能なレベルのシタグリプチンに変換することができる。そのうち効果の最も高い突然変異体（配列番号１１０）の触媒転化率は、９０～９５％に達することができた。
【0006】
【化1】
【0007】
ＵＳ９６１７５７３は、ＵＳ８２９３５０７における配列番号１１０を引き続き改造し、得られた突然変異体は、ケトアミド基質５０ｇ／Ｌ、イソプロピルアミン（ｉｓｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）１．５Ｍ、５５℃、５０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）、リン酸ピリドキサール１ｍＭの条件で、少なくとも１．２倍の配列番号１１０の活性で４－オキソ－４－［３－（トリフルオロメチル）－５，６－ジヒドロ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジン－７－（８Ｈ）－イル）－１－（２，４，５－トリフルオロフェニル）ブタン－２－オンをシタグリプチンに変換することができた。そのうち効果の最も高い突然変異体（配列番号１３０）の触媒転化率は、９０～９５％に達することができた。
【0008】
しかし、これらのトランスアミナーゼ突然変異体は、いずれも１００％有機溶媒中で不安定なものであるため、液体酵素を固定させ、固定化酵素を得て、トランスアミナーゼの有機溶媒における安定性を向上させる。例えば、ＵＳ９５８７２２９には、ＵＳ８２９３５０７における配列番号１１０をＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＥＸＥ１２０樹脂に固定させることが開示され、その結果、配列番号１１０のＳＥＰＡＢＥＡＤ ＳＥＸＥ１２０固定化酵素が水飽和のＩＰＡｃ（酢酸イソプロピル）溶媒において、基質である４－オキソ－４－［３－（トリフルオロメチル）－５，６－ジヒドロ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジン－７－（８Ｈ）－イル）－１－（２，４，５－トリフルオロフェニル）ブタン－２－オン１００ｇ／Ｌをシタグリプチンに触媒することができ、ｅｅ値は９９．９％以上であることを示した。しかし、ＵＳ９５８７２２９では、固定化酵素の繰り返し使用率（使用ロット回数）を研究せず、且つ反応溶媒は水飽和のＩＰＡｃ（酢酸イソプロピル）溶媒であり、当該溶媒を生産に用いる際、事前にＩＰＡｃを水飽和させる必要があり、操作がより煩雑であり、複数ロットの使用反応に用いると、その反応系における含水量も制御しにくく、固定化酵素の水活性度に影響を与え、固定化酵素を失活変性し易くなるようにさせる。
【0009】
ＷＯ２０１９０１１２３６Ａ１には、１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１，３－ブタンジオン（本発明では、モルホリンジオンと略称する）がトランスアミナーゼで触媒して（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンを製造することができ、さらに多段階反応を介してシタグリプチンを製造することが報告されたが、反応において液体酵素を採用し、所定量のＤＭＳＯの水溶媒系を含み、基質濃度が高くなく、液体酵素を再利用できず、生産に使用する時にコストが高く、効率が低かった。
【0010】
【化2】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明が解決しようとする技術的課題は、従来技術におけるトランスアミナーゼの酵素活性が高くなく、それを固定化酵素に製造する時に酵素活性が高くなく、安定性が悪く、さらにケトアミド基質を触媒してシタグリプチン又はその中間体を生産する時に転化率が高いため再利用できない等の欠陥を克服するために、トランスアミナーゼ突然変異体、固定化トランスアミナーゼ及びシタグリプチン又はその中間体の製造における使用を提供することである。本発明のトランスアミナーゼ突然変異体がケトアミド基質を触媒する際に酵素活性が高く、それを固定化トランスアミナーゼに製造した後の酵素活性が依然として高く、それをケトアミド基質の触媒に用いてシタグリプチン又はその中間体を生産する際に選別された溶媒反応系と結合し、固定化トランスアミナーゼの転化率が高く且つ立体選択性に優れ、安定性に優れ、繰り返し使用率を向上させ、操作がより簡単で、さらに生産コストを低減させ、産業化生産に有利である。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者は、従来技術におけるトランスアミナーゼに対して多くの研究を行い、ある具体的な部位の突然変異を行う際に、トランスアミナーゼ突然変異体の酵素活性が大幅に向上することを発見した。且つ継続的にこれらのトランスアミナーゼ突然変異体に対して固定化研究を行った後、選別された特定の樹脂と結合し、且つ特定の溶媒反応系を選別して、得られた固定化酵素をケトアミド基質の触媒に用いる際に安定性がより高く且つ転化率がより高くなり、それをシタグリプチンの生産に用いる時にコストがより低かった。
【0013】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第１態様は、シタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンの製造における固定化トランスアミナーゼの使用を提供し、
【0014】
ただし、前記固定化トランスアミナーゼは、樹脂及びトランスアミナーゼ突然変異体を含み、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号７に示される。
【0015】
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号４又は配列番号８に示される。
【0016】
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体と前記樹脂は、共有結合により接続される。
【0017】
好ましくは、前記樹脂は、好ましくはエポキシ樹脂であり、好ましくはＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡ、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＨＦＡ４０３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ１１３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ４０３及び／又はＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＥＰであり、例えばＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡである。
【0018】
より好ましくは、前記製造に用いられる反応溶媒は、イソプロパノール水溶液であり、好ましくは前記イソプロパノール水溶液における水の体積含有量（溶液全体で占める水の体積比）は、２％～２０％であり、より好ましくは前記製造の反応系には、トランスアミナーゼの補助因子、例えばリン酸ピリドキサールをさらに含み、その濃度は、好ましくは０．５～５ｍｇ／ｍＬである。
【0019】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第２態様は、固定化トランスアミナーゼを提供し、当該固定化トランスアミナーゼは、樹脂及びトランスアミナーゼ突然変異体を含み、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号７に示される。
【0020】
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号４又は配列番号８に示される。
【0021】
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体と前記樹脂は、共有結合により接続される。
【0022】
好ましくは、前記樹脂は、好ましくはエポキシ樹脂であり、好ましくはＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡ、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＨＦＡ４０３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ１１３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ４０３及び／又はＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＥＰであり、例えばＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡである。
【0023】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第３態様は、固定化トランスアミナーゼの製造方法を提供し、
【0024】
１）トランスアミナーゼ突然変異体の溶液と樹脂とを接触させて固定化トランスアミナーゼを形成させ、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号７に示される、ステップと、
【0025】
２）前記固定化トランスアミナーゼを濾過し洗浄するステップとを、含む。
【0026】
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号４又は配列番号８に示される。
【0027】
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体と前記樹脂は、共有結合により接続される。
【0028】
好ましくは、前記樹脂は、好ましくはエポキシ樹脂であり、好ましくはＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡ、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＨＦＡ４０３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ１１３、ＲｅｌｉＺｙｍｅＴＭ ＥＰ４０３及び／又はＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＥＰであり、例えばＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡである。
【0029】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第４態様は、シタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンの製造方法を提供し、当該方法は、アミノ基供与体が存在する際、反応溶媒において固定化トランスアミナーゼでケトアミド基質を触媒してシタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンを得るステップを含み、
【0030】
ただし、前記固定化トランスアミナーゼは、本発明の第２態様に記載のとおりであり、 及び／又は、前記反応溶媒は、イソプロパノール水溶液である。
【0031】
好ましくは、前記ケトアミド基質は、４－オキソ－４－［３－（トリフルオロメチル）－５，６－ジヒドロ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジン－７－（８Ｈ）－イル）－１－（２，４，５－トリフルオロフェニル）ブタン－２－オン及び／又は１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１，３－ブタンジオンである。
【0032】
好ましくは、前記アミノ供与体は、イソプロピルアミンである。
【0033】
好ましくは、前記アミノ供与体と基質とのモル比は、１：１～５：１である。
【0034】
好ましくは、前記反応溶媒がイソプロパノール水溶液である際に、水の体積含有量（溶液全体で占める水の体積比）は、２％～２０％である。
【0035】
好ましくは、前記ケトアミド基質の濃度は、２０ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌである。
【0036】
好ましくは、前記固定化トランスアミナーゼと基質との質量比は、１：１～６：１である。
【0037】
好ましくは、前記製造の反応系には、さらにトランスアミナーゼの補助因子、例えばリン酸ピリドキサールを含み、その濃度は、好ましくは０．５～５ｍｇ／ｍＬである。
【0038】
好ましくは、前記反応の温度は、３０～６０℃であり、好ましくは４５℃である。
【0039】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第５態様は、固定化トランスアミナーゼを提供し、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号７に示される。
【0040】
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号４又は配列番号８に示される。
【0041】
上記課題を解決するために、本発明の第６態様は、本発明の第５態様に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードするポリヌクレオチドをを提供する。
【0042】
上記課題を解決するために、本発明の第７態様は、本発明の第６態様に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターをを提供する。
【0043】
好ましくは、前記組換え発現ベクターの骨格は、プラスミドｐＥＴ２８ａである。
【0044】
上記課題を解決するために、本発明の第８態様は、本発明の第６態様に記載のポリヌクレオチド又は本発明の第７態様に記載の組換え発現ベクターを宿主に導入しする形質転換体を提供する。
【0045】
好ましくは、前記宿主は、大腸菌であり、好ましくは、大腸菌ＢＬ２１である。
【0046】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第９態様は、シタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンの製造における本発明の第５態様に記載のトランスアミナーゼ突然変異体の使用を提供する。
【0047】
上記技術的課題を解決するために、本発明の第１０態様は、シタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンの製造における反応溶媒の使用を提供し、前記反応溶媒は、イソプロパノール水溶液である。
【0048】
好ましくは、前記使用は、アミノ基供与体が存在する際に、イソプロパノール水溶液においてトランスアミナーゼでケトアミド基質を触媒してシタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンを得るステップを含む。
【0049】
より好ましくは、前記トランスアミナーゼは、本発明の第２態様に記載の固定化トランスアミナーゼ及び／又は本発明の第５態様に記載のトランスアミナーゼ突然変異体である。
【0050】
より好ましくは、前記ケトアミド基質は、４－オキソ－４－［３－（トリフルオロメチル）－５，６－ジヒドロ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジン－７－（８Ｈ）－イル）－１－（２，４，５－トリフルオロフェニル）ブタン－２－オン及び／又は１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１，３－ブタンジオンである。
【0051】
より好ましくは、前記アミノ供与体は、イソプロピルアミンである。
【0052】
より好ましくは、前記アミノ供与体と基質とのモル比は、１：１～５：１である。
【0053】
より好ましくは、前記反応溶媒がイソプロパノール水溶液である際に、水の体積含有量（溶液全体で占める水の体積比）は、２％～２０％である。
【0054】
より好ましくは、前記ケトアミド基質の濃度は、２０ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌである。
【0055】
より好ましくは、前記固定化トランスアミナーゼと基質との質量比は、１：１～６：１である。
【0056】
より好ましくは、前記製造の反応系には、さらにトランスアミナーゼの補助因子、例えばリン酸ピリドキサールを含み、その濃度は、好ましくは０．５～５ｍｇ／ｍＬである。
【0057】
より好ましくは、前記反応の温度は、３０～６０℃であり、好ましくは４５℃である。
【0058】
本発明において、前記イソプロパノール水溶液におけるイソプロパノールの量は、基質を全て溶解させることができる量であればよい。イソプロパノール水溶液における水の体積含有量（溶液全体で占める水の体積比）は、２％～２０％であってもよく、水が少なすぎると固定化酵素を失活させ、水が多すぎると基質の溶解が不十分である。
【0059】
本発明のある態様は、さらに、シタグリプチンリン酸塩の製造方法を提供し、
【0060】
本発明の第４態様に記載の製造方法により、シタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンを製造するステップ（１）と、
【0061】
ステップ（１）で得られたシタグリプチン及び／又は（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンを反応させ、シタグリプチンリン酸塩を得るステップ（２）と、を含む。
【0062】
好ましくは、前記シタグリプチンリン酸塩は、シタグリプチンリン酸塩一水和物である。
【0063】
本発明において、前記「ケトアミド基質１（本発明では、シタグリプチンジオンと略称することもある）」の総称は、４－オキソ－４－［３－（トリフルオロメチル）－５，６－ジヒドロ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジン－７－（８Ｈ）－イル）－１－（２，４，５－トリフルオロフェニル）ブタン－２－オンであり、具体的な構造式は下記のとおりである。
【0064】
【化3】
【0065】
本発明において、前記「ケトアミド基質２（本発明では、モルホリンジオンと略称することもある）」の総称は、１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１，３－ブタンジオン、具体的な構造式は下記のとおりである。
【0066】
【化4】
【0067】
当技術分野の常識に適合することに基づいて、上記好ましい条件を任意に組み合わせて、本発明の各好ましい例を得ることができる。
【0068】
本発明で使用される試薬及び原材料はすべて市販されているものである。
【発明の効果】
【0069】
本発明の積極的な進歩的な効果は、下記の通りである。本発明のトランスアミナーゼ突然変異体がケトアミド基質を触媒する際に酵素活性が高く、それを固定化トランスアミナーゼに製造した後に酵素活性が依然として高い。それをケトアミド基質の触媒に用いてシタグリプチン又はその中間体を生産する際に、選別された溶媒反応系と結合し、固定化トランスアミナーゼの転化率が高く且つ立体選択性に優れ、安定性に優れ、繰り返し使用率を向上させ、操作がより簡単で、さらに生産コストを低減させ、産業化生産に有利である。
【発明を実施するための形態】
【0070】
以下では、実施例により本発明をさらに説明したが、それにより本発明を述べた実施例の範囲に限定するものではない。下記の実施例では、具体的な条件を明記しない実験方法は、従来の方法と条件、又は製品明細書に従って実験方法を選択する。
【0071】
本発明における実験方法は、特に説明しない限り、いずれも従来の方法を採用し、遺伝子クローニング作業は、具体的に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらが編著した「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｇｕｉｄｅ」を参照することができる。
【0072】
本発明におけるアミノ酸の略語は、特に説明しない限り、当技術分野の慣用用語であり、具体的な略語に対応するアミノ酸を表１に示す。
【0073】
【表1】
【0074】
前記アミノ酸に対応するコドンも当技術分野の慣用用語であり、具体的なアミノ酸とコドンの対応関係は表２に示される通りである。
【0075】
【表2】
【0076】
Ｐｅｔ２８ａはＮｏｖａｇｅｎ会社から購入されたものであり、ＮｄｅＩ酵素、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ会社から購入されたものであり、ＢＬ２１コンピテントセルはＢｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎｇｇｕｏ Ｃｈａｎｇｓｈｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入されたものである。
【実施例】
【0077】
実施例１ トランスアミナーゼ突然変異体酵素液の製造
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８のヌクレオチド配列に示された遺伝子を合成し得て、遺伝子製造会社は蘇州金唯智生物科学技術有限公司（蘇州工業園区星湖町２１８号生物ナノ科学技術園Ｃ３階）である。上記遺伝子は、それぞれ、配列表における配列番号１（すなわちＵＳ８２９３５０７における配列番号１１０）、配列番号３、配列番号５（すなわちＵＳ９６１７５７３における配列番号１３０）、配列番号７に示されたトランスアミナーゼをコードする。
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８のヌクレオチド配列に示された遺伝子を合成し得て、遺伝子製造会社は蘇州金唯智生物科学技術有限公司（蘇州工業園区星湖町２１８号生物ナノ科学技術園Ｃ３階）である。上記遺伝子は、それぞれ、配列表における配列番号１（すなわちＵＳ８２９３５０７における配列番号１１０）、配列番号３、配列番号５（すなわちＵＳ９６１７５７３における配列番号１３０）、配列番号７に示されたトランスアミナーゼをコードする。
【0078】
【表3】
【0079】
そして、合成した遺伝子酵素をｐＥＴ２８ａに連結し、酵素切断部位をＮｄｅＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩとし、酵素が連結されたベクターを宿主大腸菌ＢＬ２１コンピテントセルに形質転換させた。構築された菌種をＴＢ培地に接種して培養し、３７℃、２００ｒｐｍのシェーカーで、ＩＰＴＧ濃度０．１ｍＭで一晩誘導し、菌を回収して、トランスアミナーゼ遺伝子を含む工程菌を得た。
【0080】
トランスアミナーゼ遺伝子を含む工程菌をプレート上にストリークして活性化させた後、単一のコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地５ｍＬに接種し、３７℃で振とうしながら１２時間培養した。２％（ｖ／ｖ）接種量で５０μｇ／ｍＬの同じくカナマイシンを含む新鮮なＬＢ液体培地１５０ｍＬに移し、３７℃で振とうしてＯＤ６００値が約０．８に達した時にＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭになすまで添加し、１８℃で１６時間誘導して培養した。培養完了後、培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体を収集し、－８０℃の超低温冷蔵庫に保存して、待機させた。
【0081】
培養終了後に収集された菌体２ｇを、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液５０ｍＭで菌体を２回洗浄し、そして菌体をｐＨ７．４のリン酸緩衝液２０ｍＬに懸濁し、超音波破砕し、破砕液を遠心分離して沈殿を除去し、得られた上清液はトランスアミナーゼ突然変異体を含む粗酵素液であった。粗酵素液１０ｍＬをニッケルカラム（Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ）で精製して純粋な酵素液を得、且つタンパク質濃度を約４．５ｍｇ／ｍＬに保持させた。
【0082】
ケトアミド基質２（モルホリンジオン）及びケトアミド基質１（シタグリプチンジオン）を、それぞれ、基質として酵素活性を測定し、測定方法は下記のとおりである：シタグリプチンジオン又はモルホリンジオン０．１ｇを秤量し、無水エタノール２ｍＬ、０．１ｍｏｌ／ＬのｐＨ８．５のトリエチルアミン緩衝液６．４ｍＬ、２ｍｏｌ／ＬのｐＨ８．５のイソプロピルアミン塩酸塩溶液１．６ｍＬ及びリン酸ピリドキサール（ＰＬＰ）粉末０．００３ｇを加え、３７℃のシェーカーで３０分間予熱し、純粋な酵素液０．１ｍＬを加え、温度を３７℃に制御したシェーカーで、３０分間反応し、６Ｎ塩酸０．５ｍＬを迅速に加えて、３０秒間振とうし続けて不活化した。サンプリングしてアセトニトリルで希釈し、ＨＰＬＣで検出し、検量線に基づいて酵素液活力を算出した。異なる突然変異体の酵素活性の検出結果は下記の表４に示される通りである。
【0083】
ＨＰＬＣ方法は、下記の通りである。カラム：Ｃ１８カラム４．６×２５０ｍｍ、５μｍ；検出器：ＵＶ２６８ｎｍ；カラム温度：４０℃；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；サンプル注入量：２０μＬ；移動相Ａ：水：アセトニトリル：ギ酸：アンモニア水＝９５０：５０：０．５：０．５であり、ｐＨは３．６０～３．８０の間にあるべきであり、ｐＨが達成できなければ、１０％のアンモニア水又は１０％のギ酸でｐＨを３．７０に調節した；ギ酸アンモニウムを用いてｐＨを３．７０に調節することもできた；移動相Ｂ：水：アセトニトリル＝２０：８０；グラジエント溶出：１００％Ａ（０．０１ｍｉｎ）、６０％Ａ＋４０％Ｂ（２０ｍｉｎ）、６０％Ａ＋４０％Ｂ（４０ｍｉｎ）、１００％Ａ（５０ｍｉｎ）、１００％Ａ（６０ｍｉｎ）。
維持時間：モルホリンジオン：２７．８２８ｍｉｎ；（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノン：１４．８３５ｍｉｎ；
維持時間：シタグリプチンジオン：３４．８１１ｍｉｎ；シタグリプチン：１７．４８９ｍｉｎ。
モルホリンジオンコントロールの維持時間：２７．８２０ｍｉｎ；
（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンコントロールの維持時間：１４．８５６ｍｉｎ；
シタグリプチンジオンコントロールの維持時間：３４．７１５ｍｉｎ；
シタグリプチンコントロール（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｎｇｘｉａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したものである）の維持時間：１７．７０５ｍｉｎ。
維持時間：モルホリンジオン：２７．８２８ｍｉｎ；（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノン：１４．８３５ｍｉｎ；
維持時間：シタグリプチンジオン：３４．８１１ｍｉｎ；シタグリプチン：１７．４８９ｍｉｎ。
モルホリンジオンコントロールの維持時間：２７．８２０ｍｉｎ；
（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンコントロールの維持時間：１４．８５６ｍｉｎ；
シタグリプチンジオンコントロールの維持時間：３４．７１５ｍｉｎ；
シタグリプチンコントロール（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｎｇｘｉａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したものである）の維持時間：１７．７０５ｍｉｎ。
【0084】
ただし、モルホリンジオン基質原料とコントロールである（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンは、自社で合成したものであり、合成方法はＷＯ２０１９０１１２３６Ａ１を参照した；３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンラセミ体は、実験室で自己合成したものであり、モルホリンジオンでアンモニア化及び触媒し、水素化して製造されたものである。コントロールである（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノン配置の決定は、下記の通りである。（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンはさらに反応させて（３Ｒ）－Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３－アミノ－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－酪酸（ＷＯ２０１９０１１２３６Ａ１を参照する）を得、安徽海康薬業有限責任公司から購入した（３Ｒ）－Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３－アミノ－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－酪酸標準品をコントロールとして、Ｒ配置を確定することができる。
【0085】
配置決定のＨＰＬＣ方法は、下記の通りである。
カラム：Ｄａｉｃｅｌ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ－Ｈ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）；移動相：ｎ－ヘキサン：イソプロパノール＝９０：１０；検出波長：２１０ｎｍ；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；注入体積：１０μＬ；カラム温度：２５℃；維持時間：４０ｍｉｎ。
カラム：Ｄａｉｃｅｌ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ－Ｈ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）；移動相：ｎ－ヘキサン：イソプロパノール＝９０：１０；検出波長：２１０ｎｍ；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；注入体積：１０μＬ；カラム温度：２５℃；維持時間：４０ｍｉｎ。
【0086】
シタグリプチンジオン基質原料は、本実験室で自己合成したものであり、合成方法はＣＮ１００４３０３９７Ｃを参照し、シタグリプチンラセミ体は、本実験室で自己合成したものであり、シタグリプチンジオンでアンモニア化及び触媒水素化を行って製造したものである。
【0087】
【表4】
【0088】
表４から分かるように、Ｅｎｚ．２－Ｍ１２２Ｆ及びＥｎｚ．１－Ｍ１２２Ｑ－Ｐ２２３Ｔの酵素活性は、シタグリプチンジオン又はモルホリンジオンを基質とした時に、いずれも有意に増加した。ただし、Ｅｎｚ．２－Ｍ１２２Ｆの酵素活性はＥｎｚ．２の２倍程度であった；Ｅｎｚ．１－Ｍ１２２Ｑ－Ｐ２２３Ｔはシタグリプチンジオンを触媒する時に、Ｅｎｚ．１の酵素活性より５０％増加し、Ｅｎｚ．１－Ｍ１２２Ｑ－Ｐ２２３Ｔがモルホリンジオンを触媒する時に、その酵素活性はＥｎｚ．１の３倍より多かった。
【0089】
実施例２ 固定化トランスアミナーゼ突然変異体の製造
トランスアミナーゼ突然変異体の菌スラッジ１２ｇを取り、１００ｍＭのリン酸緩衝液１２０ｍＬを加えて均一に混合し、細胞を高圧均質化して破砕し、遠心分離して上清酵素液を収集し、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ２２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２．２ｇとＰＬＰ０．０２４ｇを加え、撹拌して溶解し、樹脂（樹脂型番は具体的に表５に示され、いずれもＳｏｏｃｈｏｗ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したものである）１０ｇを加えて固定し、２５℃、１８０ｒｐｍのシェーカーで２０～２５時間固定し、吸引濾過し、脱イオン洗浄し、吸引濾過して固定化酵素を得た。モルホリンジオン及びシタグリプチンジオンをそれぞれ基質として固定化酵素の酵素活性検出を行い、酵素活性検出方法は下記のとおりである。
トランスアミナーゼ突然変異体の菌スラッジ１２ｇを取り、１００ｍＭのリン酸緩衝液１２０ｍＬを加えて均一に混合し、細胞を高圧均質化して破砕し、遠心分離して上清酵素液を収集し、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ２２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２．２ｇとＰＬＰ０．０２４ｇを加え、撹拌して溶解し、樹脂（樹脂型番は具体的に表５に示され、いずれもＳｏｏｃｈｏｗ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したものである）１０ｇを加えて固定し、２５℃、１８０ｒｐｍのシェーカーで２０～２５時間固定し、吸引濾過し、脱イオン洗浄し、吸引濾過して固定化酵素を得た。モルホリンジオン及びシタグリプチンジオンをそれぞれ基質として固定化酵素の酵素活性検出を行い、酵素活性検出方法は下記のとおりである。
【0090】
モルホリンジオン又はシタグリプチンジオン基質１．２ｇを５０ｍＬの三角フラスコに秤量し、イソプロパノール１９ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ溶液０．６ｍＬ及びイソプロピルアミン０．４ｍＬを加え、４５℃でそれを完全に溶解させるまでシェーカーで振とうし、３７℃まで降温して３０分間維持し、検出しようとする固定化酵素０．５ｇを秤量して予熱された基質に加え、３７℃で、２００ｒｐｍのシェーカーで２０分間反応し、サンプリングしてアセトニトリルで希釈し、ＨＰＬＣ検出し、標準品シタグリプチン（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｎｇｘｉａｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したものである）／標準品シタグリプチン中間体（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノン（自己合成し、合成方法はＷＯ２０１９０１１２３６Ａ１を参照する）濃度検量線に基づいて生成物シタグリプチン（モルホリンジオンを基質とする時に、計算する生成物は、シタグリプチン中間体（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンである）の濃度を算出し、固定化酵素活性を算出し、結果は下記の表５に示される通りである。
【0091】
ＨＰＬＣ検出方法は実施例１におけるＨＰＬＣ方法と同じである。
【0092】
【表5】
【0093】
表５における異なる樹脂の固定化効果に基づき、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ ＨＦＡ型番の樹脂で製造された固定化酵素を選択して触媒反応を行った。
【0094】
実施例３ イソプロパノール系における固定化酵素（樹脂：ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣＨＦＡ）のモルホリンジオンを触媒するための使用
三角フラスコに、イソプロパノール２５ｍＬ、モルホリンジオン２．５ｇ、水２ｍＬ、ＰＬＰ３２ｍｇ、イソプロピルアミン１．１３５ｍＬ、実施例２で得られた固定化酵素１０ｇを加え、４５℃、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させた。２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。反応液を濾過して固定化酵素を得、続いてイソプロパノール２５ｍＬ、モルホリンジオン２．５ｇ、水２ｍＬ、ＰＬＰ３２ｍｇ、イソプロピルアミン１．１３５ｍＬを加え、４５℃で、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。上記方法に従って固定化酵素を繰り返して使用した。結果は表６に示される通りであり、表中に下記のことがを示された。固定化酵素を１０バッチを反応に使用し、Ｅｎｚ．１－Ｍ１２２Ｑ－Ｐ２３３Ｔ及びＥｎｚ．２－Ｍ１２２Ｆの転化率は依然として８５％以上を維持し、且つｅｅ値＞９９．９％であり、固定化酵素は安定した；Ｅｎｚ．１及びＥｎｚ．２（３バッチを使用した後、効果が良くなかった）は転化率が低く、モルホリンジオンの触媒には適さなかった。
ただし、ＨＰＬＣで転化率を検出する方法は実施例１におけるＨＰＬＣ方法と同じである。
維持時間：モルホリンジオン：２７．８３１ｍｉｎ；（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノン：１４．８１１ｍｉｎ。
三角フラスコに、イソプロパノール２５ｍＬ、モルホリンジオン２．５ｇ、水２ｍＬ、ＰＬＰ３２ｍｇ、イソプロピルアミン１．１３５ｍＬ、実施例２で得られた固定化酵素１０ｇを加え、４５℃、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させた。２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。反応液を濾過して固定化酵素を得、続いてイソプロパノール２５ｍＬ、モルホリンジオン２．５ｇ、水２ｍＬ、ＰＬＰ３２ｍｇ、イソプロピルアミン１．１３５ｍＬを加え、４５℃で、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。上記方法に従って固定化酵素を繰り返して使用した。結果は表６に示される通りであり、表中に下記のことがを示された。固定化酵素を１０バッチを反応に使用し、Ｅｎｚ．１－Ｍ１２２Ｑ－Ｐ２３３Ｔ及びＥｎｚ．２－Ｍ１２２Ｆの転化率は依然として８５％以上を維持し、且つｅｅ値＞９９．９％であり、固定化酵素は安定した；Ｅｎｚ．１及びＥｎｚ．２（３バッチを使用した後、効果が良くなかった）は転化率が低く、モルホリンジオンの触媒には適さなかった。
ただし、ＨＰＬＣで転化率を検出する方法は実施例１におけるＨＰＬＣ方法と同じである。
維持時間：モルホリンジオン：２７．８３１ｍｉｎ；（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノン：１４．８１１ｍｉｎ。
【0095】
キラルＨＰＬＣ方法で生成物ｅｅ値を検出する方法は下記のとおりである：
カラム：Ｄａｉｃｅｌ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ－Ｈカラム４．６ｍｍ＊２５０ｍｍ、５μｍ；移動相：ｎ－ヘキサン：イソプロパノール：ジエチルアミン＝４０：６０：０．１；検出器：ＵＶ２６８ｎｍ；カラム温度：２５℃；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；サンプル注入量：１０μＬ。維持時間：（Ｓ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノン：１０．２９５ｍｉｎであり、（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノン：２８．０９１ｍｉｎ。
ラセミ体コントロールの維持時間：１０．２９０ｍｉｎと２８．０８７ｍｉｎ；
（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンコントロールの維持時間：２８．０９３ｍｉｎ。
カラム：Ｄａｉｃｅｌ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ－Ｈカラム４．６ｍｍ＊２５０ｍｍ、５μｍ；移動相：ｎ－ヘキサン：イソプロパノール：ジエチルアミン＝４０：６０：０．１；検出器：ＵＶ２６８ｎｍ；カラム温度：２５℃；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；サンプル注入量：１０μＬ。維持時間：（Ｓ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノン：１０．２９５ｍｉｎであり、（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノン：２８．０９１ｍｉｎ。
ラセミ体コントロールの維持時間：１０．２９０ｍｉｎと２８．０８７ｍｉｎ；
（Ｒ）－３－アミノ－１－モルホリン－４－（２，４，５－トリフルオロフェニル）－１－ブタノンコントロールの維持時間：２８．０９３ｍｉｎ。
【0096】
【表6】
【0097】
以上の結果から、本発明のトランスアミナーゼ変異体は、モルホリンジオンを固定化酵素触媒する実験において、従来技術のＥｎｚ．１及びＥｎｚ．２を固定化酵素触媒に用いた場合よりも優れた変換率の効果を示しており、その差は統計的に有意であった（ｐ値はいずれも０．０５未満であり、ただし、ｐ値の算出にはＴ－Ｔｅｓｔダブルテール実験を用いた）。
【0098】
実施例４ イソプロパノール系における固定化酵素のシタグリプチンジオンを触媒するための使用
三角フラスコに、イソプロパノール２５ｍＬ、シタグリプチンジオン３．７５ｇ、水２ｍＬ、ＰＬＰ３２ｍｇ、イソプロピルアミン１．７ｍＬ、及び実施例２で得られた固定化酵素１０ｇを加え、４５℃、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。反応液を濾過して固定化酵素を得、続いてイソプロパノール２５ｍＬ、シタグリプチンジオン３．７５ｇ、１６ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ水溶液２ｍＬ、イソプロピルアミン１．７ｍＬを加え、４５℃で、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。上記方法に従って固定化酵素を繰り返して使用し、結果は、固定化酵素を１０バッチを反応に使用し、転化率は依然として８５％以上に維持し、且つｅｅ値＞９９．９％であり、固定化酵素が比較的に安定したことを示した。具体的な使用結果を下記の表７に示される通りである。
ただし、ＨＰＬＣで転化率を検出する方法は実施例１におけるＨＰＬＣ方法と同じである。
維持時間：シタグリプチンジオン：３４．８２７ｍｉｎ；シタグリプチン：１７．３９４ｍｉｎ。
三角フラスコに、イソプロパノール２５ｍＬ、シタグリプチンジオン３．７５ｇ、水２ｍＬ、ＰＬＰ３２ｍｇ、イソプロピルアミン１．７ｍＬ、及び実施例２で得られた固定化酵素１０ｇを加え、４５℃、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。反応液を濾過して固定化酵素を得、続いてイソプロパノール２５ｍＬ、シタグリプチンジオン３．７５ｇ、１６ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ水溶液２ｍＬ、イソプロピルアミン１．７ｍＬを加え、４５℃で、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。上記方法に従って固定化酵素を繰り返して使用し、結果は、固定化酵素を１０バッチを反応に使用し、転化率は依然として８５％以上に維持し、且つｅｅ値＞９９．９％であり、固定化酵素が比較的に安定したことを示した。具体的な使用結果を下記の表７に示される通りである。
ただし、ＨＰＬＣで転化率を検出する方法は実施例１におけるＨＰＬＣ方法と同じである。
維持時間：シタグリプチンジオン：３４．８２７ｍｉｎ；シタグリプチン：１７．３９４ｍｉｎ。
【0099】
キラルＨＰＬＣ方法で生成物ｅｅ値を検出する方法は下記のとおりである：
カラム：Ｄａｉｃｅｌ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ－Ｈカラム４．６ｍｍ＊２５０ｍｍ、５μｍ；移動相：Ｎ－ヘプタン：エタノール：ジエチルアミン＝４０：６０：０．１；検出器：ＵＶ２６８ｎｍ；カラム温度：２５℃；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；サンプル注入量：１０μＬ。維持時間：（Ｓ）－鏡像異性体：１４．１８１、シタグリプチン：１７．５８０。
ラセミ体コントロールの維持時間：１４．１７２ｍｉｎ及び１７．７０２ｍｉｎ；
シタグリプチンコントロールの維持時間：１７．６６５ｍｉｎ。
カラム：Ｄａｉｃｅｌ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ－Ｈカラム４．６ｍｍ＊２５０ｍｍ、５μｍ；移動相：Ｎ－ヘプタン：エタノール：ジエチルアミン＝４０：６０：０．１；検出器：ＵＶ２６８ｎｍ；カラム温度：２５℃；流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；サンプル注入量：１０μＬ。維持時間：（Ｓ）－鏡像異性体：１４．１８１、シタグリプチン：１７．５８０。
ラセミ体コントロールの維持時間：１４．１７２ｍｉｎ及び１７．７０２ｍｉｎ；
シタグリプチンコントロールの維持時間：１７．６６５ｍｉｎ。
【0100】
【表7】
【0101】
後述する比較例１と比較して、上記実施例３のモルホリンジオン触媒反応と組み合わせて見ると、本発明の反応溶媒であるイソプロパノールは、ＩＰＡｃよりもシタグリプチンジオン及び／又はモルホリンジオンの触媒に適している（標準偏差が小さく、より安定である）ことが分かった。
【0102】
実施例５ シタグリプチンリン酸塩一水和物の製造
実施例４の反応が終了した後、濾過し、固定化酵素と濾液を得て、濾液を６０℃で濃縮乾固して濃縮物を得た。ジクロロメタン１００ｍＬを加えて溶解し、精製水１００ｍＬを加え、撹拌し、３０％の濃塩酸でｐＨを２～３の間に調節し、静置して分層した。水相にジクロロメタン１００ｍＬを加え、撹拌し、３０％の水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを１１に調節し、静置して分層した。水相に再びジクロロメタン１００ｍＬを加え、撹拌して抽出し、静置して分層した。２回のアルカリ抽出の有機相を合併した。６０℃で濃縮し、濃縮物にイソプロパノール１２０ｍＬを加え、撹拌して溶解させ、８５％のリン酸１０．６ｇを加え、７５℃まで昇温させ、撹拌して全部溶解させ、徐々に降温させてシタグリプチンリン酸塩結晶を析出させ、５℃で２時間保温し、濾過し、ケーキを６０℃でドライ乾燥させて、シタグリプチンリン酸塩一水和物を得た。
実施例４の反応が終了した後、濾過し、固定化酵素と濾液を得て、濾液を６０℃で濃縮乾固して濃縮物を得た。ジクロロメタン１００ｍＬを加えて溶解し、精製水１００ｍＬを加え、撹拌し、３０％の濃塩酸でｐＨを２～３の間に調節し、静置して分層した。水相にジクロロメタン１００ｍＬを加え、撹拌し、３０％の水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを１１に調節し、静置して分層した。水相に再びジクロロメタン１００ｍＬを加え、撹拌して抽出し、静置して分層した。２回のアルカリ抽出の有機相を合併した。６０℃で濃縮し、濃縮物にイソプロパノール１２０ｍＬを加え、撹拌して溶解させ、８５％のリン酸１０．６ｇを加え、７５℃まで昇温させ、撹拌して全部溶解させ、徐々に降温させてシタグリプチンリン酸塩結晶を析出させ、５℃で２時間保温し、濾過し、ケーキを６０℃でドライ乾燥させて、シタグリプチンリン酸塩一水和物を得た。
【0103】
比較例１ ＩＰＡｃ（酢酸イソプロピル）系でシタグリプチンジオンに対する固定化樹脂の触媒
三角フラスコに、酢酸イソプロピル２５ｍＬ、シタグリプチンジオン１．２５ｇ、１６ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ水溶液２ｍＬ、イソプロピルアミン０．９５ｍＬ及び実施例２で得られた固定化酵素３．７５ｇを加え、４５℃、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。反応液を濾過して固定化酵素を得、続いて酢酸イソプロピル２５ｍＬ、シタグリプチンジオン１．２５ｇ、水２ｍＬ、ＰＬＰ３２ｍｇ、イソプロピルアミン０．９５ｍＬを加え、４５℃で、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。上記方法で固定化酵素を繰り返して使用し、結果は表８に示されるとおりであり、表中に、固定化酵素を３バッチを反応に使用し、固定化酵素の安定性が比較的に低く（即ち標準差値が高い）、転化率が比較的に低かったことを示した。
三角フラスコに、酢酸イソプロピル２５ｍＬ、シタグリプチンジオン１．２５ｇ、１６ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ水溶液２ｍＬ、イソプロピルアミン０．９５ｍＬ及び実施例２で得られた固定化酵素３．７５ｇを加え、４５℃、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。反応液を濾過して固定化酵素を得、続いて酢酸イソプロピル２５ｍＬ、シタグリプチンジオン１．２５ｇ、水２ｍＬ、ＰＬＰ３２ｍｇ、イソプロピルアミン０．９５ｍＬを加え、４５℃で、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。上記方法で固定化酵素を繰り返して使用し、結果は表８に示されるとおりであり、表中に、固定化酵素を３バッチを反応に使用し、固定化酵素の安定性が比較的に低く（即ち標準差値が高い）、転化率が比較的に低かったことを示した。
【0104】
【表8】
【0105】
比較例２ ＩＰＡｃ（酢酸イソプロピル）系でモルホリンジオンに対する固定化樹脂の触媒
三角フラスコに、酢酸イソプロピル２５ｍＬ、モルホリンジオン１．２５ｇ、水２ｍＬ、ＰＬＰ水溶液３２ｍｇ、イソプロピルアミン０．９５ｍＬ及び実施例２で得られた固定化酵素５ｇを加え、４５℃、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。反応液を濾過して固定化酵素を得、続いて酢酸イソプロピル２５ｍＬ、モルホリンジオン１．２５ｇ、１６ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ水溶液２ｍＬ、イソプロピルアミン０．９５ｍＬを加え、４５℃で、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。上記方法で固定化酵素を繰り返して使用し、結果は表９に示される通りである。
三角フラスコに、酢酸イソプロピル２５ｍＬ、モルホリンジオン１．２５ｇ、水２ｍＬ、ＰＬＰ水溶液３２ｍｇ、イソプロピルアミン０．９５ｍＬ及び実施例２で得られた固定化酵素５ｇを加え、４５℃、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。反応液を濾過して固定化酵素を得、続いて酢酸イソプロピル２５ｍＬ、モルホリンジオン１．２５ｇ、１６ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ水溶液２ｍＬ、イソプロピルアミン０．９５ｍＬを加え、４５℃で、２００ｒｐｍのシェーカーで反応させ、２４時間反応させてサンプリングして転化率を検出した。上記方法で固定化酵素を繰り返して使用し、結果は表９に示される通りである。
【0106】
【表9】
【0107】
表８及び表９は、水飽和のＩＰＡｃ（酢酸イソプロピル）溶媒系において、異なる固定化酵素は、それぞれシタグリプチンジオンとモルホリンジオンを触媒し、それぞれ３バッチを反応に使用し、固定化酵素の安定性が悪く、転化率が低く、且つその転化率は本発明の固定化酵素の転化率と顕著な差があり、これは酢酸イソプロピル系が該固定化酵素の応用に適さなかったことを示した。
【配列表】
【国際調査報告】