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▶ オハイオ ステート イノベーション ファウンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-07
(54)【発明の名称】細胞膜透過性ペプチドを含むループ状タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230228BHJP
C07K 4/00 20060101ALI20230228BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20230228BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20230228BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20230228BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230228BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230228BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20230228BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20230228BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230228BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230228BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230228BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230228BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230228BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230228BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K4/00 ZNA
C12N9/16 B
C07K16/00
C12N9/10
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/54
C12N15/55
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022540812
(86)(22)【出願日】2020-12-30
(85)【翻訳文提出日】2022-06-30
(86)【国際出願番号】 US2020067427
(87)【国際公開番号】W WO2021138397
(87)【国際公開日】2021-07-08
(31)【優先権主張番号】62/955,009
(32)【優先日】2019-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516046846
【氏名又は名称】オハイオ ステート イノベーション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ペイ デフア
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050DD11
4B050LL01
4B050LL03
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA29
4B065CA31
4B065CA44
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA14
4H045CA42
4H045CA50
4H045DA76
4H045DA89
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、少なくとも１つのループ状領域を含む修飾されたループ状タンパク質を提供し、ここで、少なくとも１つのループ状領域は、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、修飾されたループ状タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びその産生のための方法を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのループ領域を含む、修飾されたループ状タンパク質であって、前記少なくとも１つのループ領域は、前記ループ領域に挿入された細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列を含む、前記修飾されたループ状タンパク質。
【請求項2】
前記ループ状タンパク質がプロテインチロシンホスファターゼである、請求項１に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項3】
前記プロテインチロシンホスファターゼがＰＴＰ１Ｂである、請求項２に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項4】
配列番号１８１～１８５のうちの１つに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項5】
配列番号１８１～１８５から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、請求項１～３のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項6】
前記ループ状タンパク質が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項7】
前記ＣＰＰ配列が、前記抗体の重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインのループ状領域に位置する、請求項４に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項8】
前記ＣＰＰ配列が、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３に位置する、請求項６に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項9】
前記ループ状タンパク質がグリコシルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項10】
前記グリコシルトランスフェラーゼがプリンヌクレオシドホスホリラーゼである、請求項９に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項11】
配列番号１８７に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項12】
配列番号１８７の前記アミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１０に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項13】
前記ループ状タンパク質が蛍光タンパク質である、請求項１に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項14】
前記蛍光タンパク質がＧＦＰである、請求項１３に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項15】
配列番号１７７～１７９のうちの１つに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項16】
配列番号１７７～１７９から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、請求項１４に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項17】
前記ＣＰＰ配列が、少なくとも３つのアルギニン、またはその類似体を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項18】
前記ＣＰＰが、３～６個のアルギニン、またはその類似体を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項19】
前記ＣＰＰが、疎水性側鎖を持つ少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項20】
前記ＣＰＰが、疎水性側鎖を持つ１～６個のアミノ酸を含む、請求項１９に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項21】
疎水性側鎖を持つ前記アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、チロシン、シクロヘキシルアラニン、ピペリジン－２－カルボン酸、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、３－（３－ベンゾチエニル）－アラニン、３－（２－キノリル）－アラニン、Ｏ－ベンジルセリン、３－（４－（ベンジルオキシ）フェニル）－アラニン、Ｓ－（４－メチルベンジル）システイン、Ｎ－（ナフタレン－２－イル）グルタミン、３－（１，１’－ビフェニル－４－イル）－アラニン、ｔｅｒｔ－ロイシン、またはニコチノイルリシンから独立して選択され、そのぞれぞれは、任意選択により、１つ以上の置換基で置換される、請求項２０に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項22】
疎水性側鎖を持つ前記アミノ酸のうちの少なくとも１つが、トリプトファンである、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項23】
疎水性側鎖を持つ前記アミノ酸のそれぞれがトリプトファンである、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項24】
前記ＣＰＰ配列が、少なくとも３つのアルギニン及び少なくとも３つのトリプトファンを含む、請求項１８～２３のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項25】
前記ＣＰＰ配列が、１～６個のＤ－アミノ酸を含む、請求項１８～２４のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項26】
第１のループ状領域及び第２のループ状領域を含み、ここで、第１のＣＰＰ配列が前記第１のループ状領域に挿入され、第２のＣＰＰ配列が前記第２のループ状領域に挿入される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項27】
前記第１のＣＰＰが、少なくとも３つのアルギニンを含み、前記第２のＣＰＰが、疎水性側鎖を持つ少なくとも３つのアミノ酸を含む、請求項２６に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項28】
前記ＣＰＰ配列が、表Ｄから独立して選択される、請求項１～２６のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質。
【請求項29】
請求項１～２８のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質をコードする、組み換え核酸分子。
【請求項30】
プロモーターに作動可能に連結された請求項２９に記載の組み換え核酸分子を含む、発現カセット。
【請求項31】
請求項３０に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項32】
請求項３１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項33】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、マウスＮＳＯ細胞、マウスＳＰ２／０細胞、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞から選択される、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項34】
請求項１～２８のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質を産生する方法であって、請求項３２に記載の宿主細胞を培養することと、発現された前記修飾されたループ状タンパク質を上清から精製することとを含む、前記方法。
【請求項35】
請求項１～２８のいずれか１項に記載の修飾されたループ状タンパク質を投与することを含む、疾患または状態を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／９５５，００９号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／９５５，００９号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によるＧＭ１２２４５９及びＣＡ２３４１２４に基づく助成を受け、政府の支援によりなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によるＧＭ１２２４５９及びＣＡ２３４１２４に基づく助成を受け、政府の支援によりなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0003】
電子提出されたテキストファイルの説明
本出願とともに電子提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される：コンピュータ読み取り可能な形式の配列表のコピー（ファイル名：ＣＹＰＴ＿０２０＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２０年１２月１５日、ファイルサイズ７７．６キロバイト）。
［背景技術］
本出願とともに電子提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される：コンピュータ読み取り可能な形式の配列表のコピー（ファイル名：ＣＹＰＴ＿０２０＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２０年１２月１５日、ファイルサイズ７７．６キロバイト）。
［背景技術］
【0004】
哺乳類細胞のサイトゾル及び核へのタンパク質の効果的な送達は、現在難治性である多くの疾患の治療を含む、幅広い応用への扉を開くことになる。しかしながら、臨床現場での効果的なタンパク質送達は、いまだ達成されておらず、細胞膜透過性の欠如が障害となっている。細胞膜透過性を向上させるために、タンパク質表面工学技術、ナノ粒子担体への組み込み、及び細胞膜透過性ペプチドの付加を含む、多くの試みが行われてきた。しかしながら、これらのアプローチは、概して、サイトゾル送達効率が低く、ほとんどのカーゴがエンドソーム／リソソームコンパートメント内に閉じ込められる。したがって、様々な治療及び研究目的のために、タンパク質の細胞膜透過性を向上させる更なる戦略が必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】ＰＴＰ１Ｂループ挿入変異体の予測されるタンパク質折り畳みを示す。ＣＰＰ配列を、描写された側鎖とともに示し、矢印で示す。構造は、ＰｙＭＯＬによって解析した。
【図2】１０個のＰＴＰ１Ｂ変異体のパイロットスケール（５ｍＬ培養液）での発現を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。Ｓ＝細胞溶解物の可溶性画分；Ｐ＝細胞溶解物の不溶性画分。
【図3】１０個の異なるＰＴＰ１Ｂ変異体を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の粗製溶解物におけるホスファターゼ活性を示す。示されるデータは、３回の独立した実験の平均及びＳＥＭを表し、野生型ＰＴＰ１Ｂを発現する細胞（１００％）に対して正規化されている。
【図4】ＮＩＨ ３Ｔ３細胞におけるグローバルｐＹレベルに対するＷＴ及び変異型ＰＴＰ１Ｂの影響を示す。Ａは、１％血清の存在下で野生型または変異型ＰＴＰ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ１Ｒでは２．１μＭ及び他の全てのタンパク質では３．０μＭ）で２時間処理した後のＮＩＨ ３Ｔ３細胞のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び抗ｐＹウェスタンブロット分析を示す。Ｂは、ＰＴＰ１Ｂ２Ｒの濃度（０．５～５μＭ）に応じたグローバルｐＹレベルの用量依存的な減少を示す。膜は、抗ＧＡＰＤＨ抗体で再ブロットし、サンプルのローディングが確実に均等になるようにした。Ｍ＝分子量マーカー；Ｃ＝ＰＴＰ１Ｂを含まない対照。
【図5】サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＧＦＰ／ＧＢＮ複合体の分析を示す。ＧＦＰ及びＧＢＮを１：３のモル比で混合し、ＰＢＳで予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １６／６０サイズ排除カラムに注入した。タンパク質を含有する画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、クマシーブルーで染色した。ＡはＧＦＰ＋ＧＢＮＷＴ、ＢはＧＦＰ＋ＧＢＮ３Ｗ、ＣはＢＳＡ＋ＧＢＮＷＴ、ＤはＢＳＡ＋ＧＢＮ３Ｗを示す。
【図6】２．５μＭのローダミン標識タンパク質で処理した後のＨｅＬａ細胞の共焦点画像を示す。ＡはＧＢＮＷＴ、ＢはＧＢＮ３Ｗ、ＣはＧＢＮ３Ｒを示す。
【図7】ｐＨ７．４及びｐＨ５．０でフローサイトメトリーによって測定した、ＮＦで標識したＴａｔ、環状ＣＰＰ９、及び３つのＧＦＰナノボディ（ＧＢＮＷＴ、ＧＢＮ３Ｗ、及びＧＢＮ３Ｒ）のサイトゾル侵入効率の比較を示す。値は、処理した細胞の平均蛍光強度を表す。
【図8】ＧＦＰ－Ｍｆｆ（左パネル）を一過性にトランスフェクトし、３μＭのローダミン標識ＧＢＮ３Ｗ（中央パネル）で２時間処理したＨｅＬａ細胞の生細胞共焦点画像を示す。マージした画像を右側に示し、Ｒ値は、共局在化のピアソンの相関係数を表す。
【図9】ＧＦＰ（赤）、ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳ（青）、及びＧＦＰ／ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳ複合体（緑）のサイズ排除カラムからの溶出プロファイルを示す（上部パネル）。ＧＦＰ及びＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳを１：３のモル比で混合し、ＰＢＳで予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １６／６０カラムに注入し、カラムをＰＢＳで溶出した。溶出したタンパク質含有画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を下のパネルに示す。
【図10】ＰＢＳ（図１０Ａ）、１０μＭのＧＢＮＷＴ－ＮＬＳ（図１０Ｂ）、１０μＭのＧＢＮ３Ｗ（図１０Ｃ）、または１０μＭのＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳ（図１０Ｄ）で２時間処理した後のＨｅＬａ細胞における細胞内ＧＦＰ局在を示す生細胞共焦点画像を示す。
【図12】ローダミン標識ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳ及び２つの異なるＧＦＰ融合タンパク質の細胞内分布を示す生細胞共焦点画像を示す。Ａは、ＧＦＰ－フィブリラリンを一過性にトランスフェクトし、次いで、共焦点顕微鏡の前に５μＭのローダミン標識ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳで２時間処理したＨｅＬａ細胞を示す。Ｂは、ＧＦＰ－Ｍｆｆを一過性にトランスフェクトし、次いで、５μＭのローダミン標識ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳで２時間処理したＨｅＬａを示す。枠で囲んだ領域を拡大し、下部に示す。
【図13】ループ９にＣＰＰを挿入したＥＧＦＰの細胞内送達を示す。Ａは、ループ９の位置及び挿入したＣＰＰモチーフを示す、ＷＴ及び変異体ＥＧＦＰの構造を示す。Ｂは、１％ＦＢＳの存在下、ＷＴ及び変異体ＥＧＦＰ（５μＭ）で２時間処理した後のＨｅＬａ細胞の生細胞共焦点画像を示す。
【図14】ＰＮＰ３Ｒの細胞侵入及び生物活性を示す。Ａは、１％ＦＢＳの存在下、５μＭのフルオレセイン標識ＰＮＰＷＴ（上）またはＰＮＰ３Ｒ（下）で５時間処理した後のＨｅＬａ細胞の生細胞共焦点画像を示す。左パネル：ＦＩＴＣ蛍光、右パネル：同じ細胞のＦＩＴＣシグナルとＤＩＣ画像の重ね合わせ。Ｂは、ＰＮＰＷＴまたはＰＮＰ３Ｒ（１μＭ）による処理あり及び処理なしのＳ４９（野生型ＰＮＰ）またはＮＳＵ－１細胞から得られた細胞溶解物におけるＰＮＰ活性を示す。３回の独立した実験からの代表的なデータ（平均±ＳＤ）を示す。Ｃは、ＮＳＵ－１細胞のｄＧ毒性に対する保護を示す。ＮＳＵ－１細胞をＰＢＳ（タンパク質なし）、３μＭのＰＮＰＷＴ、または３μＭのＰＮＰ３Ｒで３７℃で６時間処理し、徹底的に洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡとともに３分間インキュベートした。２５μＭのｄＧを含有するＤＭＥＭ中に細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で播種し、細胞成長（細胞カウント）を７２時間モニタリングした。タンパク質処理もｄＧ処理もない細胞を陽性対照として使用した。
【図16】様々なインキュベーション時間後の残余酵素活性を定量することによってモニタリングした野生型及び変異型ＰＮＰの血清安定性。
【発明を実施するための形態】
【0006】
［発明の概要］
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列を含む、修飾されたタンパク質を提供し、ここで、ＣＰＰは、Ｎ末端及び／もしくはＣ末端に位置するか、またはタンパク質に挿入される。例えば、ＣＰＰは、抗体のＮ末端及び／またはＣ末端に融合され得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列を含む、修飾されたタンパク質を提供し、ここで、ＣＰＰは、Ｎ末端及び／もしくはＣ末端に位置するか、またはタンパク質に挿入される。例えば、ＣＰＰは、抗体のＮ末端及び／またはＣ末端に融合され得る。
【0007】
いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのループ領域を含む、修飾されたループ状タンパク質を提供し、ここで、少なくとも１つのループ領域は、当該ループ領域に挿入された（ＣＰＰ）配列を含む。
【0008】
いくつかの実施形態において、修飾されたループ状タンパク質は、プロテインチロシンホスファターゼである。いくつかの実施形態において、プロテインチロシンホスファターゼは、ＰＴＰ１Ｂである。いくつかの実施形態において、ループ状タンパク質は、グリコシルトランスフェラーゼである。いくつかの実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼである。いくつかの実施形態において、ループ状タンパク質は、蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質は、ＧＦＰである。
【0009】
いくつかの実施形態において、請求項１に記載の修飾されたループ状タンパク質であって、ループ状タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３に位置する。
【0010】
いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、少なくとも３つのアルギニン、またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、３～６個のアルギニン、またはその類似体を含む。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、疎水性側鎖を持つ少なくとも１つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、疎水性側鎖を持つ１～６個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、疎水性側鎖を持つアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、チロシン、シクロヘキシルアラニン、ピペリジン－２－カルボン酸、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、３－（３－ベンゾチエニル）－アラニン、３－（２－キノリル）－アラニン、Ｏ－ベンジルセリン、３－（４－（ベンジルオキシ）フェニル）－アラニン、Ｓ－（４－メチルベンジル）システイン、Ｎ－（ナフタレン－２－イル）グルタミン、３－（１，１’－ビフェニル－４－イル）－アラニン、ｔｅｒｔ－ロイシン、またはニコチノイルリシンから独立して選択され、そのぞれぞれは、任意選択により、１つ以上の置換基で置換される。いくつかの実施形態において、疎水性側鎖を持つアミノ酸のうちの少なくとも１つは、トリプトファンである。いくつかの実施形態において、疎水性側鎖を持つアミノ酸のうちの少なくとも１つのそれぞれは、トリプトファンである。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、少なくとも３つのアルギニン及び少なくとも３つのトリプトファンを含む。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、１～６個のＤ－アミノ酸を含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、ループ状タンパク質は、第１のループ状領域及び第２のループ状領域を含み、ここで、第１のＣＰＰ配列が当該第１のループ状領域に挿入され、第２のＣＰＰ配列が当該第２のループ状領域に挿入される。いくつかの実施形態において、第１のＣＰＰは、少なくとも３つのアルギニンを含み、第２のＣＰＰは、疎水性側鎖を持つ少なくとも３つのアミノ酸を含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、表Ｄから独立して選択される。
【0013】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質をコードする、組み換え核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、プロモーターに作動可能に連結された組み換え核酸分子を含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、発現カセットを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、マウスＮＳＯ細胞、マウスＳＰ２／０細胞、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞から選択される。
【0014】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質を産生する方法を提供し、請求項２４に記載の宿主細胞を培養することと、発現された修飾されたループ状タンパク質を上清から精製することとを含む。
［発明を実施するための形態］
［発明を実施するための形態］
【0015】
いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのループ状領域を含む修飾されたループ状タンパク質を提供し、ここで、少なくとも１つのループ状領域は、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質の産生のための方法を提供する。
【0016】
本明細書に記載されるＣＰＰモチーフをタンパク質の表面ループ中に挿入するための組成物及び方法は、そうでなければ細胞膜不透過性であるタンパク質に、細胞膜透過性を付与する一般的なアプローチを表す。このアプローチは、これまでの方法と比べて、多くの利点を提供し、なかでも、細胞溶解物から組み換えタンパク質を精製し、生物学的プローブ、治療薬、または研究薬として直接使用することができることから、そのシンプルさは特に重要である。更に、タンパク質とＣＰＰ（または他の化学実体）の翻訳後コンジュゲーションは、典型的に、異なる種の混合物をもたらすが、本明細書に記載される方法は、明確に定義された単一種の構造を生成する。他のタンパク質表面リモデリング法、例えば、スーパーチャージング（Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｐｏｔｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５，７４７－７５２；及びＦｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｇｒａｆｔｉｎｇ ｔｏ Ｅｎｄｏｗ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２，１６７－１７０）及びエステル化（Ｍｉｘ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３９，１４３９６－１４３９８）と比較すると、本明細書に記載される方法は、タンパク質構造への変化が比較的軽微であり、より幅広いタンパク質に適用可能であるはずである。得られた変異体タンパク質はまた、元のタンパク質の折り畳み／活性が保持され、免疫原性が低いことが期待される。最後に、タンパク質ループにグラフトされたＣＰＰモチーフは、構造的に制約されており、タンパク質分解に対して比較的安定である。
【0017】
分子及び細胞生化学の一般的な方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）；及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的なテキストに見出すことができ、それらの開示は、参照により本明細書に援用される。
【0018】
定義
別途の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。特定の実施形態の実施または検証には、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、組成物、方法及び材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示の目的のために、次の用語は以下の定義とする。更なる定義については、本開示を通して記載される。
別途の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。特定の実施形態の実施または検証には、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、組成物、方法及び材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示の目的のために、次の用語は以下の定義とする。更なる定義については、本開示を通して記載される。
【0019】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、その冠詞の文法上の対象が１つまたは１つより多いこと（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上であること）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【0020】
選択肢（例えば、「または」）の使用は、その選択肢のいずれか一方、両方またはその任意の組み合わせを意味することを理解されたい。
【0021】
「及び／または」という用語は、選択肢のうちの１つまたは両方のいずれかを意味するものと理解されたい。
【0022】
「アルキル」または「アルキル基」は、１～１５個の炭素原子を有する完全に飽和した直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖で、単結合によって分子の残りの部分に結合しているものを指す。１～１５個の任意数の炭素原子を含むアルキルが含まれる。最大１５個の炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１～Ｃ１５アルキルであり、最大１０個の炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１～Ｃ１０アルキルであり、最大６個の炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、最大５個の炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１～Ｃ５アルキルである。Ｃ１～Ｃ５アルキルは、Ｃ５アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ２アルキル及びＣ１アルキル（すなわち、メチル）を含む。Ｃ１～Ｃ６アルキルは、Ｃ１～Ｃ５アルキルについて上に記載される全ての部分を含み、Ｃ６アルキルも含む。Ｃ１～Ｃ１０アルキルは、Ｃ１～Ｃ５アルキル及びＣ１～Ｃ６アルキルについて上に記載される全ての部分を含み、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０アルキルも含む。同様に、Ｃ１～Ｃ１５アルキルは、前述の全ての部分を含み、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、及びＣ１５アルキルも含む。Ｃ１～Ｃ１５アルキルの非限定的な例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｓｅｃ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｔ－アミル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、及びｎ－ドデシルが挙げられる。本明細書で特に別に明記しない限り、アルキル基は、任意選択により置換され得る。
【0023】
「アルキレン」または「アルキレン鎖」は、完全に飽和した直鎖または分枝鎖の二価炭化水素鎖で、１～１２個の炭素原子を有するものを指す。Ｃ１～Ｃ１２アルキレンの非限定的な例としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ－ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ－ブテニレン、プロピニレン、ｎ－ブチニレンなどが挙げられる。アルキレン鎖は、単結合を介して分子の残りの部分に、単結合を介して基に結合している。アルキレン鎖の分子の残りの部分及び基への結合点は、鎖内の１つの炭素または任意の２つの炭素を介し得る。本明細書で特に別に明記しない限り、アルキレン鎖は、任意選択により置換され得る。
【0024】
「アルケニル」または「アルケニル基」は、２～１５個の炭素原子を有し、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有する、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を指す。各アルケニル基は、単結合によって分子の残りの部分に結合している。２～１５個の任意数の炭素原子を含むアルケニル基が含まれる。最大１５個の炭素原子を含むアルケニル基は、Ｃ２～Ｃ１５アルケニルであり、最大１０個の炭素原子を含むアルケニルは、Ｃ２～Ｃ１０アルケニルであり、最大６個の炭素原子を含むアルケニル基は、Ｃ２～Ｃ６アルケニルであり、最大５個の炭素原子を含むアルケニルは、Ｃ２～Ｃ５アルケニルである。Ｃ２～Ｃ５アルケニルは、Ｃ５アルケニル、Ｃ４アルケニル、Ｃ３アルケニル、及びＣ２アルケニルを含む。Ｃ２～Ｃ６アルケニルは、Ｃ２～Ｃ５アルケニルについて上に記載される全ての部分を含み、Ｃ６アルケニルも含む。Ｃ２～Ｃ１０アルケニルは、Ｃ２～Ｃ５アルケニル及びＣ２～Ｃ６アルケニルについて上に記載される全ての部分を含み、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０アルケニルも含む。同様に、Ｃ２～Ｃ１５アルケニルは、前述の全ての部分を含み、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、及びＣ１５アルケニルも含む。Ｃ２～Ｃ１２アルケニルの非限定的な例としては、エテニル（ビニル）、１－プロペニル、２－プロペニル（アリル）、イソ－プロペニル、２－メチル－１－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、５－ヘキセニル、１－ヘプテニル、２－ヘプテニル、３－ヘプテニル、４－ヘプテニル、５－ヘプテニル、６－ヘプテニル、１－オクテニル、２－オクテニル、３－オクテニル、４－オクテニル、５－オクテニル、６－オクテニル、７－オクテニル、１－ノネニル、２－ノネニル、３－ノネニル、４－ノネニル、５－ノネニル、６－ノネニル、７－ノネニル、８－ノネニル、１－デセニル、２－デセニル、３－デセニル、４－デセニル、５－デセニル、６－デセニル、７－デセニル、８－デセニル、９－デセニル、１－ウンデセニル、２－ウンデセニル、３－ウンデセニル、４－ウンデセニル、５－ウンデセニル、６－ウンデセニル、７－ウンデセニル、８－ウンデセニル、９－ウンデセニル、１０－ウンデセニル、１－ドデセニル、２－ドデセニル、３－ドデセニル、４－ドデセニル、５－ドデセニル、６－ドデセニル、７－ドデセニル、８－ドデセニル、９－ドデセニル、１０－ドデセニル、及び１１－ドデセニルが挙げられる。本明細書で特に別に明記しない限り、アルキル基は、任意選択により置換され得る。
【0025】
「アルキニル」または「アルキニル基」は、２～１２個の炭素原子を有し、１つ以上の炭素－炭素三重結合を有する、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を指す。各アルキニル基は、単結合によって分子の残りの部分に結合している。２～１５個の任意数の炭素原子を含むアルキニル基が含まれる。最大１２個の炭素原子を含むアルキニル基は、Ｃ２～Ｃ１５アルキニルであり、最大１０個の炭素原子を含むアルキニルは、Ｃ２～Ｃ１０アルキニルであり、最大６個の炭素原子を含むアルキニル基は、Ｃ２～Ｃ６アルキニルであり、最大５個の炭素原子を含むアルキニルは、Ｃ２～Ｃ５アルキニルである。Ｃ２～Ｃ５アルキニルは、Ｃ５アルキニル、Ｃ４アルキニル、Ｃ３アルキニル、及びＣ２アルキニルを含む。Ｃ２～Ｃ６アルキニルは、Ｃ２～Ｃ５アルキニルについて上に記載される全ての部分を含み、Ｃ６アルキニルも含む。Ｃ２～Ｃ１０アルキニルは、Ｃ２～Ｃ５アルキニル及びＣ２～Ｃ６アルキニルについて上に記載される全ての部分を含み、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０アルキニルも含む。同様に、Ｃ２～Ｃ１２アルキニルは、前述の全ての部分を含み、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、及びＣ１５アルキニルも含む。Ｃ２～Ｃ１５アルケニルの非限定的な例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルなどが挙げられる。本明細書で特に別に明記しない限り、アルキル基は、任意選択により置換され得る。
【0026】
「アリール」は、水素、６～１８個の炭素原子及び少なくとも１つの芳香環を含む、炭化水素環系を指し、単結合によって分子の残りの部分に結合している。本開示の目的のために、アリールは、縮合または架橋された環系を含み得る、単環式、二環式、三環式または四環式の環系であり得る。アリールとしては、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ－インダセン、ｓ－インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、フェナレン、フェナントレン、プレイアデン、ピレン、及びトリフェニレンから誘導されるアリールが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で特に別に明記しない限り、「アリール」は、任意選択により置換され得る。
【0027】
「ヘテロアリール」は、水素原子、１～１４個の炭素原子、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選択される１～６個のヘテロ原子、ならびに少なくとも１つの芳香環を含む、５～２０員の環系を指し、単結合によって分子の残りの部分に結合している。本開示の目的のために、ヘテロアリールは、縮合または架橋された環系を含み得る、単環式、二環式、三環式または四環式の環系であり得；ヘテロアリール中の窒素、炭素または硫黄原子は、任意選択により酸化され得；窒素原子は、任意選択により四級化され得る。例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズインドリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル、１，４－ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２－ａ］ピリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラノニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、２－オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、１－オキシドピリジニル、１－オキシドピリミジニル、１－オキシドピラジニル、１－オキシドピリダジニル、１－フェニル－１Ｈ－ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、キヌクリジニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、及びチオフェニル（すなわち、チエニル）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で特に別に明記しない限り、ヘテロアリール基は、任意選択により置換され得る。
【0028】
本明細書で使用される「置換された」という用語は、本明細書で言及される任意の基であって、少なくとも１つの水素原子が、限定するものではないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩなどのハロゲン原子；ヒドロキシル基、アルコキシ基、及びエステル基などの基中の酸素原子；チオール基、チオアルキル基、スルホン基、スルホニル基、及びスルホキシド基などの基中の硫黄原子；アミン、アミド、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、Ｎ－オキシド、イミド、及びエナミンなどの基中の窒素原子；トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基、及びトリアリールシリル基などの基中のケイ素原子；ならびに様々な他の基中の他のヘテロ原子などの非水素原子への結合によって置き換えられているものを意味する。「置換された」はまた、本明細書の基のいずれかであって、１つ以上の水素原子が、オキソ、カルボニル、カルボキシル、及びエステル基中の酸素などのヘテロ原子；ならびにイミン、オキシム、ヒドラゾン、及びニトリルなどの基中の窒素への高次結合（例えば、二重または三重結合）によって置き換えられているものを意味する。例えば、「置換された」には、上記の基のいずれかであって、１つ以上の水素原子が、－ＮＲｇＲｈ、－ＮＲｇＣ（＝Ｏ）Ｒｈ、－ＮＲｇＣ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、－ＮＲｇＣ（＝Ｏ）ＯＲｈ、－ＮＲｇＳＯ２Ｒｈ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、－ＯＲｇ、－ＳＲｇ、－ＳＯＲｇ、－ＳＯ２Ｒｇ、－ＯＳＯ２Ｒｇ、－ＳＯ２ＯＲｇ、＝ＮＳＯ２Ｒｇ、及び－ＳＯ２ＮＲｇＲｈで置き換えられているものが含まれる。「置換された」はまた、上記の基のいずれかであって、１つ以上の水素原子が、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｇ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｇ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｇＲｈ、－ＣＨ２ＳＯ２Ｒｇ、－ＣＨ２ＳＯ２ＮＲｇＲｈで置き換えられているものを意味する。前述において、Ｒｇ及びＲｈは、同一であるか、または異なり、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ヘテロシクリル、Ｎ－ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、Ｎ－ヘテロアリール及び／またはヘテロアリールアルキルである。「置換された」は、更に、本明細書の基のいずれかであって、１つ以上の水素原子が、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、イミノ、ニトロ、オキソ、チオキソ、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ヘテロシクリル、Ｎ－ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、Ｎ－ヘテロアリール及び／またはヘテロアリールアルキル基への結合によって置き換えられているものを意味する。加えて、前述の置換基のそれぞれは、任意選択により、上記の置換基のうちの１つ以上によって置換され得る。
【0029】
本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」という用語は、当該技術分野において許容されるレベルで変動する、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。いくつかの実施形態において、変動量は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％程度であり得る。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さについて、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
【0030】
数値範囲、例えば、１～５、約１～５、または約１～約５は、当該範囲に包含される各数値を指す。例えば、非限定的かつ単に例示的な一実施形態において、「１～５」の範囲は、１、２、３、４、５；または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０；または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現と同等である。
【0031】
本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じである効果、例えば、生理学的効果をもたらす、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。
【0032】
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書中で区別なく使用され、任意の長さのアミノ酸の重合形態を指し、これらには、コードアミノ酸及び非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾されたアミノ酸、または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。「修飾された」という用語は、対応する未修飾の物質または化合物と比較して、改変または変更がなされた物質または化合物（例えば、細胞、ポリヌクレオチド配列、及び／またはポリペプチド配列）を指す。
【0033】
本明細書で使用されるとき、「インサート」または「挿入」とは、ＣＰＰ配列のタンパク質配列への付加を意味する。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、タンパク質のアミノ酸を除去または置換することなく、タンパク質のループ状領域中のアミノ酸とアミノ酸の間に挿入され、そのため、得られるタンパク質は、ＣＰＰに加えて、天然型タンパク質のアミノ酸を全て含有する。このような実施形態において、ＣＰＰの挿入は、タンパク質のアミノ酸の総数を増加させる。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、タンパク質のループ領域中に存在する１つ以上のアミノ酸を置き換え、そのため、得られるタンパク質は、ＣＰＰの挿入前に存在していたアミノ酸の全てを含有しない。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列が１つ以上のアミノ酸を置き換える場合、ＣＰＰは、ＣＰＰのアミノ酸の数と同数のアミノ酸を置き換えてもよいし、そうでなくてもよい。例えば、ＣＰＰが６つのアミノ酸を含有する場合、ＣＰＰは、ループ中の６つのアミノ酸を置き換えてもよいし、ループ中の１、２、３、４、または５つのアミノ酸を置き換えてもよい。あるいは、アミノ酸を置き換えるのではなく、ループ中のアミノ酸とアミノ酸の間に挿入されてもよい。
【0034】
細胞膜透過性ペプチド
いくつかの実施形態において、本開示は、タンパク質であって、当該タンパク質に挿入された少なくとも１つの細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列を含むタンパク質を提供する。ＣＰＰの挿入は、タンパク質中の任意の好適な場所、例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはＮ末端とＣ末端との間に行うことができる。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのループ領域を含む、修飾されたループ状タンパク質を提供し、ここで、少なくとも１つのループ領域は、当該ループ領域に挿入された細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列を含む。タンパク質は、任意の数のループ及び任意の好適な数のＣＰＰ配列を含有し得る。当業者であれば、ＣＰＰの挿入に好適なループは、ＣＰＰの挿入によりタンパク質の所望の活性が消失しないループであることを認識するであろう。タンパク質の活性に対するＣＰＰ挿入の影響を決定するための方法は、当該技術分野において知られている（例えば、本明細書に記載される方法を参照されたい）。いくつかの実施形態において、タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のループ、及び当該ループ領域（複数可）に挿入された１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質中のループ領域の約１０％～約１００％に挿入される。
いくつかの実施形態において、本開示は、タンパク質であって、当該タンパク質に挿入された少なくとも１つの細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列を含むタンパク質を提供する。ＣＰＰの挿入は、タンパク質中の任意の好適な場所、例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはＮ末端とＣ末端との間に行うことができる。いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのループ領域を含む、修飾されたループ状タンパク質を提供し、ここで、少なくとも１つのループ領域は、当該ループ領域に挿入された細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列を含む。タンパク質は、任意の数のループ及び任意の好適な数のＣＰＰ配列を含有し得る。当業者であれば、ＣＰＰの挿入に好適なループは、ＣＰＰの挿入によりタンパク質の所望の活性が消失しないループであることを認識するであろう。タンパク質の活性に対するＣＰＰ挿入の影響を決定するための方法は、当該技術分野において知られている（例えば、本明細書に記載される方法を参照されたい）。いくつかの実施形態において、タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のループ、及び当該ループ領域（複数可）に挿入された１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質中のループ領域の約１０％～約１００％に挿入される。
【0035】
ＣＰＰは、本明細書で開示される修飾されたループ状タンパク質の細胞取り込みを促進する任意のアミノ酸配列であってもよいし、それを含んでもよい。本明細書に記載されるタンパク質ループ及び方法における使用に好適なＣＰＰは、ループ状タンパク質の取り込みを促進する、天然に生じる配列、修飾された配列、及び合成配列、ならびに線状または環状配列を含み得る。線状ＣＰＰの非限定的な例としては、ポリアルギニン（例えば、Ｒ９またはＲ１１）、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ配列、ＨＩＶ－ＴＡＴ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ－３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ－ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ－１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ－７、ＨＮ－１、ＢＧＳＣ（ビス－グアニジウム－スペルミジン－コレステロール、及びＢＧＴＣ（Ｂｉｓ－グアニジウム－トレン－コレステロール）が挙げられる。
【0036】
実施形態において、ＣＰＰ中のアミノ酸の総数は、４～約２０アミノ酸の範囲であり得、例えば、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、及び約１９アミノ酸であり、それらの間の全ての範囲及びサブ範囲を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＣＰＰは、約４～約１３個のアミノ酸を含む。特定の実施形態において、本明細書で開示されるＣＰＰは、約６～約１０個のアミノ酸、または約６～約８個のアミノ酸を含む。
【0037】
ＣＰＰの各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸であり得る。「非天然アミノ酸」という用語は、一端にアミン（－ＮＨ２）基及び他端にカルボン酸（－ＣＯＯＨ）基を有するが、側鎖または主鎖が修飾されている、天然アミノ酸の同族種である有機化合物を指す。得られる部分は、天然アミノ酸と類似しているが、同一ではない構造及び反応性を有する。そのような修飾の非限定的な例としては、１つ以上のメチレン基による側鎖の伸長、１つの原子を別の原子に置き換えること、及び芳香環のサイズを大きくすることが挙げられる。非天然アミノ酸は、２０個の一般的な天然に生じるアミノ酸または稀少な天然アミノ酸であるセレノシステインまたはピロリシンの１つではない、修飾アミノ酸、及び／またはアミノ酸類似体であり得る。例えば、アルギニンの類似体は、側鎖上に１多いまたは１少ないメチレン基を有し得る。非天然アミノ酸はまた、天然アミノ酸のＤ－異性体であり得る。好適なアミノ酸の例としては、アラニン、アロソロイシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ナフチルアラニン、フェニルアラニン、プロリン、ピログルタミン酸、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、その誘導体、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらアミノ酸及び他のものを、本明細書で使用されるその略語とともに、表Ａに列挙する。
【0038】
【表1-1】
【0039】
【表1-2】
【0040】
いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、少なくとも３つのアルギニン、またはその類似体を、例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０含む。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、３～６個のアルギニン、またはその類似体を含む。
【0041】
いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、疎水性側鎖を持つ少なくとも１つのアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のそのようなアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、疎水性側鎖を持つ１～６個のアミノ酸を含む。
【0042】
ＣＰＰ配列への組み込みには、より高い疎水性値を有するアミノ酸が選択され得、より低い疎水性値を有するアミノ酸を含むＣＰＰ配列と比べて、修飾されたタンパク質のサイトゾル送達効率を向上することができる。いくつかの実施形態において、各疎水性アミノ酸（本明細書中、疎水性側鎖を有するアミノ酸とも称される）は、独立して、グリシンよりも大きい疎水性値を有する。他の実施形態において、各疎水性アミノ酸は、独立して、アラニンよりも大きい疎水性値を有する。更に他の実施形態において、各疎水性アミノ酸は、独立して、フェニルアラニンよりも大きいまたは等しい疎水性値を有する。疎水性は、当該技術分野において知られている疎水性スケールを使用して測定され得る。以下の表Ｂは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８４；８１（１）：１４０－１４４）、Ｅｎｇｌｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．．１９８６；（１５）：３２１－５３）、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２；１５７（１）：１０５－１３２）、Ｈｏｏｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８１；７８（６）：３８２４－３８２８）、及びＪａｎｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ．１９７９；２７７（５６９６）：４９１－４９２）によって報告された、様々なアミノ酸の疎水性値をリストにしたものであり、そのそれぞれの全体は、その全体が参照により本明細書に援用される。特定の実施形態において、疎水性は、Ｅｎｇｌｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．に報告されている疎水性スケールを使用して測定される。
【0043】
【表2】
【0044】
いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、１～６個のＤ－アミノ酸を含む。アミノ酸のキラリティは、サイトゾル取り込み効率を向上するように選択され得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸の少なくとも２つは、反対のキラリティを有する。いくつかの実施形態において、反対のキラリティを有する少なくとも２つのアミノ酸は、互いに隣接し得る。いくつかの実施形態において、少なくとも３つのアミノ酸は、互い違いの立体化学を有する。いくつかの実施形態において、互い違いにキラリティを有する少なくとも３つのアミノ酸は、互いに隣接し得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸の少なくとも２つは、同じキラリティを有する。いくつかの実施形態において、同じキラリティを有する少なくとも２つのアミノ酸は、互いに隣接し得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのアミノ酸は、同じキラリティを有し、少なくとも２つのアミノ酸は、反対のキラリティを有する。いくつかの実施形態において、反対のキラリティを有する少なくとも２つのアミノ酸は、同じキラリティを有する少なくとも２つのアミノ酸に隣接し得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＣＰＰで隣接するアミノ酸は、次の配列のいずれかを有し得る：Ｄ－Ｌ；Ｌ－Ｄ；Ｄ－Ｌ－Ｌ－Ｄ；Ｌ－Ｄ－Ｄ－Ｌ；Ｌ－Ｄ－Ｌ－Ｌ－Ｄ；Ｄ－Ｌ－Ｄ－Ｄ－Ｌ；Ｄ－Ｌ－Ｌ－Ｄ－Ｌ；またはＬ－Ｄ－Ｄ－Ｌ－Ｄ。タンパク質合成中にＤアミノ酸をＣＰＰ配列に組み込む方法は、当該技術分野において知られており、例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｗａｒｄ Ｄ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｐ ｅｎａｂｌｅｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ Ｄ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．（２０１７）ｂｉｏＲｘｉｖ １２５９３０；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１２５９３０；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．（２０１７）Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４：４６－５４を参照されたい。非天然アミノ酸を含有するタンパク質は、ネイティブケミカルライゲーションを使用して生成され得、例えば、Ｂｏｎｄａｌａｐａｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌｕｍｅ ８，ｐａｇｅｓ ４０７－４１８；Ａｍｙ Ｅ．Ｒａｂｉｄｅａｕ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ Ｌｅｔｈｅｒ Ｐｅｎｔｅｌｕｔｅ＊．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｎａｔｉｖｅ Ｃａｒｇｏ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｈｒａｘ Ｌｅｔｈａｌ Ｔｏｘｉｎ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．（２０１６）Ｂｉｏｌ．，１１（６）１４９０－１５０１；及びＷｅｉｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｐｙｉｎｇ Ｌｉｆｅ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｉｒｒｏｒ－Ｉｍａｇｅ ＤＮＡ－Ｌｉｇａｓｅ Ｍａｄｅ ｏｆ Ｄ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ．Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２０１９ Ｍａｙ １６）２６（５）；６１６－６１９を参照されたい。
【0045】
いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸は、アリール基またはヘテロアリール基を含み、そのそれぞれは、任意選択により、置換される。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸は、アルキル、アルケニル、またはアルキニル側鎖を含み、そのそれぞれは、任意選択により、置換される。
【0046】
いくつかの実施形態において、疎水性側鎖を有する各アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、チロシン、シクロヘキシルアラニン、ピペリジン－２－カルボン酸、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、３－（３－ベンゾチエニル）－アラニン、３－（２－キノリル）－アラニン、Ｏ－ベンジルセリン、３－（４－（ベンジルオキシ）フェニル）－アラニン、Ｓ－（４－メチルベンジル）システイン、Ｎ－（ナフタレン－２－イル）グルタミン、３－（１，１’－ビフェニル－４－イル）－アラニン、ｔｅｒｔ－ロイシン、またはニコチノイルリシンから独立して選択され、そのそれぞれは、任意選択により、１つ以上の置換基で置換される。これらの非天然芳香族疎水性アミノ酸のいくつかの構造（本明細書で開示されるペプチドに組み込まれる前のもの）を以下に示す。特定の実施形態において、各疎水性アミノ酸は、独立して、疎水性芳香族アミノ酸である。いくつかの実施形態において、芳香族疎水性アミノ酸は、ナフチルアラニン、３－（３－ベンゾチエニル）－アラニン、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシンであり、そのそれぞれは、任意選択により、１つ以上の置換基で置換される。いくつかの実施形態において、各疎水性アミノ酸は、トリプトファンである。
【0047】
【化1】
【0048】
任意選択の置換基は、ｃＣＰＰのサイトゾル送達効率を、例えば、置換基を有しないこと以外は同一である配列と比較して、大きく（例えば、５０％超）低下させない任意の原子または基であり得る。いくつかの実施形態において、任意選択の置換基は、疎水性置換基または親水性置換基であり得る。ある特定の実施形態において、任意選択の置換基は、疎水性置換基である。いくつかの実施形態において、置換基は、疎水性アミノ酸の溶媒露出表面積（本明細書に定義される）を増加させる。いくつかの実施形態において、置換基は、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、アルキルカルバモイル、アルキルカルボキサミジル、アルコキシカルボニル、アルキルチオ、またはアリールチオであり得る。いくつかの実施形態において、置換基は、ハロゲンである。
【0049】
疎水性アミノ酸のサイズは、ＣＰＰのサイトゾル送達効率を向上するように選択され得る。例えば、より大きな疎水性アミノ酸は、より小さな疎水性アミノ酸を有すること以外は同一である配列と比較して、サイトゾル送達効率を向上し得る。疎水性アミノ酸のサイズは、疎水性アミノ酸の分子量、疎水性アミノ酸の立体作用、側鎖の溶媒露出表面積（ＳＡＳＡ）、またはそれらの組み合わせの観点から測定することができる。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸のサイズは、疎水性アミノ酸の分子量の観点から測定され、より大きい疎水性アミノ酸は、少なくとも約９０ｇ／ｍｏｌ、または少なくとも約１３０ｇ／ｍｏｌ、または少なくとも約１４１ｇ／ｍｏｌの分子量を持つ側鎖を有する。他の実施形態において、アミノ酸のサイズは、疎水性側鎖のＳＡＳＡの観点から測定され、より大きい疎水性アミノ酸は、アラニンより大きいＳＡＳＡ、またはグリシンより大きいＳＡＳＡを持つ側鎖を有する。他の実施形態において、疎水性アミノ酸（複数可）は、ピペリジン－２－カルボン酸程度以上、トリプトファン程度以上、フェニルアラニン程度以上、またはナフチルアラニン程度以上のＳＡＳＡを持つ疎水性側鎖を有する。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸（複数可）は、少なくとも約２００Å２、少なくとも約２１０Å２、少なくとも約２２０Å２、少なくとも約２４０Å２、少なくとも約２５０Å２、少なくとも約２６０Å２、少なくとも約２７０Å２、少なくとも約２８０Å２、少なくとも約２９０Å２、少なくとも約３００Å２、少なくとも約３１０Å２、少なくとも約３２０Å２、少なくとも約３３０Å２、少なくとも約３５０Å２、少なくとも約３６０Å２、少なくとも約３７０Å２、少なくとも約３８０Å２、少なくとも約３９０Å２、少なくとも約４００Å２、少なくとも約４１０Å２、少なくとも約４２０Å２、少なくとも約４３０Å２、少なくとも約４４０Å２、少なくとも約４５０Å２、少なくとも約４６０Å２、少なくとも約４７０Å２、少なくとも約４８０Å２、少なくとも約４９０Å２、約５００Å２超、少なくとも約５１０Å２、少なくとも約５２０Å２、少なくとも約５３０Å２、少なくとも約５４０Å２、少なくとも約５５０Å２、少なくとも約５６０Å２、少なくとも約５７０Å２、少なくとも約５８０Å２、少なくとも約５９０Å２、少なくとも約６００Å２、少なくとも約６１０Å２、少なくとも約６２０Å２、少なくとも約６３０Å２、少なくとも約６４０Å２、約６５０Å２超、少なくとも約６６０Å２、少なくとも約６７０Å２、少なくとも約６８０Å２、少なくとも約６９０Å２、または少なくとも約７００Å２のＳＡＳＡを持つ側鎖側を有する。
【0050】
本明細書で使用されるとき、「疎水性表面積」または「ＳＡＳＡ」は、溶媒に接触可能なアミノ酸側鎖の表面積を指す（平方オングストローム；Å２として報告される）。特定の実施形態において、ＳＡＳＡは、Ｓｈｒａｋｅ ＆ Ｒｕｐｌｅｙ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．７９（２）：３５１－７１）によって開発された「ローリングボール」アルゴリズムを使用して算出され、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。このアルゴリズムは、特定の半径の溶媒の「球体」を使用して、分子の表面を調べるものである。球体の典型的な値は１．４Åであり、これは水分子の半径に近似している。
【0051】
いくつかの側鎖のＳＡＳＡ値を以下の表Ｃに示す。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるＳＡＳＡ値は、Ｔｉｅｎ，ｅｔ ａｌ．（ＰＬＯＳ ＯＮＥ ８（１１）：ｅ８０６３５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８０６３５によって報告された、以下の表Ｃに列挙される理論値に基づき、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
【0052】
【表3】
【0053】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰは、少なくとも３つのアルギニンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰは、疎水性側鎖を持つ少なくとも１つ、２つ、または３つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも３つのアルギニン及び疎水性側鎖を有する少なくとも３つのアミノ酸が一緒にＣＰＰを構成し、１つのループに挿入され得る。タンパク質が２つ以上のループ状領域を有する場合、ＣＰＰは、２つ以上のループ状領域に挿入されてもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも３つのアルギニンを持つＣＰＰが第１のループに挿入される。そのような実施形態において、少なくとも３つのアルギニンは、ＣＰＰとみなされる。いくつかの実施形態において、疎水性側鎖を持つ少なくとも３つのアミノ酸が第２のループに挿入される。そのような実施形態において、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、ＣＰＰとみなされる。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、少なくとも３つのアルギニンと、本明細書に記載される少なくとも１つ、２つ、または３つの疎水性アミノ酸との任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰは、少なくとも３つのアルギニン及び本明細書に記載される少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰは、少なくとも３つのアルギニン及び本明細書に記載される少なくとも４つの疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰは、少なくとも４つのアルギニン及び本明細書に記載される少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰは、少なくとも４つのアルギニン及び本明細書に記載される少なくとも４つの疎水性アミノ酸を含む。
【0054】
いくつかの実施形態において、アルギニンは、疎水性アミノ酸に隣接している。いくつかの実施形態において、アルギニンは、疎水性アミノ酸と同じキラリティを有する。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのアルギニンは、互いに隣接している。更に他の実施形態において、３つのアルギニンは、互いに隣接している。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの疎水性アミノ酸は、互いに隣接している。他の実施形態において、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、互いに隣接している。他の実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰは、少なくとも２つの連続する疎水性アミノ酸及び少なくとも２つの連続するアルギニンを含む。更なる実施形態において、１つの疎水性アミノ酸は、アルギニンのうちの１つに隣接している。更に他の実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰは、少なくとも３つの連続する疎水性アミノ酸及び３つの連続するアルギニンを含む。更なる実施形態において、１つの疎水性アミノ酸は、アルギニンのうちの１つに隣接している。これらのアミノ酸の様々な組み合わせは、Ｄアミノ酸及びＬアミノ酸の任意の配置を有し得る。いくつかの実施形態において、ＣＰＰは、表Ｄに列挙される配列のいずれであり得るか、またはそのいずれかを含み得る。すなわち、本明細書で開示される修飾されたループタンパク質に使用されるＣＰＰは、表Ｄの配列のうちの１つであり得るか、または表Ｄに列挙される配列のいずれか１つを追加のアミノ酸とともに含み得る。
【0055】
【表4-1】
【0056】
【表4-2】
【0057】
【表4-3】
【0058】
【表4-4】
【0059】
本明細書で使用されるとき、サイトゾル送達効率は、ＣＰＰを含む修飾されたタンパク質が細胞膜を通過してサイトゾルに入る能力を指す。実施形態において、ＣＰＰを含む修飾されたタンパク質のサイトゾル送達効率は、受容体または細胞型に依存しない。サイトゾル送達効率は、絶対サイトゾル送達効率または相対サイトゾル送達効率を指し得る。
【0060】
絶対サイトゾル送達効率は、成長培地における、ＣＰＰを含むタンパク質の濃度に対する、ＣＰＰを含むタンパク質のサイトゾル濃度の比である。相対サイトゾル送達効率は、ＣＰＰを含む対照タンパク質のサイトゾル中の濃度と比較した、ＣＰＰを含むタンパク質のサイトゾル中の濃度を指す。定量は、タンパク質を蛍光標識し（例えば、ＦＩＴＣ色素による）、当該技術分野においてよく知られた技術を使用して蛍光強度を測定することによって、達成することができる。
【0061】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰを含むタンパク質の相対サイトゾル送達効率は、ループ中に融合されたＣＰＰを有しないこと以外は同一であるタンパク質と比較して、約５０％～約１０００％の範囲内、例えば、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、約５００％、約５１０％、約５２０％、約５３０％、約５４０％、約５５０％、約５６０％、約５７０％、約５８０％、または約５９０％、６００％、約６１０％、約６２０％、約６３０％、約６４０％、約６５０％、約６６０％、約６７０％、約６８０％、約６９０％、約７００％、約７１０％、約７２０％、約７３０％、約７４０％、約７５０％、約７６０％、約７７０％、約７８０％、約７９０％、約８００％、約８１０％、約８２０％、約８３０％、約８４０％、約８５０％、約８６０％、約８７０％、約８８０％、約８９０％、約９００％、約９１０％、約９２０％、約９３０％、約９４０％、約９５０％、約９６０％、約９７０％、約９８０％、約９９０％、約１０００％であり、それらの間の全ての値及びサブ範囲を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰを含むタンパク質の相対サイトゾル送達効率は、約１．５倍～約１０００倍の範囲内、例えば、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１００倍であり、それらの間の全ての値及びサブ範囲を含む。他の実施形態において、「ループ中に融合されたＣＰＰを有しないこと以外は同一であるタンパク質」は、Ｎ末端及び／またはＣ末端にＣＰＰを含有しており、例えば、Ｎ末端及び／またはＣ末端に融合された線状ＣＰＰを含有する。
【0062】
他の実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰを含むタンパク質の絶対サイトゾル送達効率は、ループ中に融合されたＣＰＰを有しないこと以外は同一であるタンパク質と比較して、約１０％～約１００％の範囲内、例えば、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３０％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％であり、それらの間の全ての値及びサブ範囲を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＰＰを含むタンパク質の絶対サイトゾル送達効率は、約０．１倍～約１０００倍の範囲内、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１００倍であり、それらの間の全ての値及びサブ範囲を含む。他の実施形態において、「ループ中に融合されたＣＰＰを有しないこと以外は同一であるタンパク質」は、Ｎ末端及び／またはＣ末端にＣＰＰを含有しており、例えば、Ｎ末端及び／またはＣ末端に融合された線状ＣＰＰを含有する。
【0063】
ループ状タンパク質
いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのループ領域を含む、修飾されたループ状タンパク質を提供し、ここで、少なくとも１つのループ領域は、当該ループに挿入された細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列を含む。「ループ状タンパク質」という用語は、１つ以上のループ状領域を含む二次構造を持つタンパク質を指す。ループは、アルファヘリックス及びベータストランド以外のタンパク質の領域を指す。構造上、ループは、一般に、二次構造で方向変化がある領域に位置する。いくつかの実施形態において、方向の変化は、少なくとも１２０度であり得る。いくつかの実施形態において、方向の変化は、２００アミノ酸以下で決定付けられる。内部水素結合に関与するアミノ酸残基が４または５個しかないループは、「ターン」と称される。タンパク質ループは、ベータターン及びオメガループを含む。最も一般的なタイプのループ及びターンは、ポリペプチド鎖の方向を変化させ、鎖を折り返し、よりコンパクトな構造を生み出すことを可能にする。ループの別の例は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）である。例示的なループ状タンパク質は、プロテインチロシンホスファターゼ、抗体、ナノボディなどのその抗原結合断片、及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼである。タンパク質のループ状領域は、当該技術分野において知られている手段、例えば、Ｌｏｏｐｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓデータベースのクエリー（Ｍｉｃｈａｌｅｓｋｙ ａｎｄ Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ，Ｌｏｏｐｓ Ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＬＩＰ）－ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｌｏｏｐ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．（２００３）１６：１２；９７９－９８５参照）、及びオンラインのタンパク質折り畳み認識サーバーＰｈｙｒｅ２（Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｈｙｒｅ２ Ｗｅｂ Ｐｏｒｔａｌ Ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ ２０１５，１０（６），８４５－８５８）によって決定することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１つのループ領域を含む、修飾されたループ状タンパク質を提供し、ここで、少なくとも１つのループ領域は、当該ループに挿入された細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列を含む。「ループ状タンパク質」という用語は、１つ以上のループ状領域を含む二次構造を持つタンパク質を指す。ループは、アルファヘリックス及びベータストランド以外のタンパク質の領域を指す。構造上、ループは、一般に、二次構造で方向変化がある領域に位置する。いくつかの実施形態において、方向の変化は、少なくとも１２０度であり得る。いくつかの実施形態において、方向の変化は、２００アミノ酸以下で決定付けられる。内部水素結合に関与するアミノ酸残基が４または５個しかないループは、「ターン」と称される。タンパク質ループは、ベータターン及びオメガループを含む。最も一般的なタイプのループ及びターンは、ポリペプチド鎖の方向を変化させ、鎖を折り返し、よりコンパクトな構造を生み出すことを可能にする。ループの別の例は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）である。例示的なループ状タンパク質は、プロテインチロシンホスファターゼ、抗体、ナノボディなどのその抗原結合断片、及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼである。タンパク質のループ状領域は、当該技術分野において知られている手段、例えば、Ｌｏｏｐｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓデータベースのクエリー（Ｍｉｃｈａｌｅｓｋｙ ａｎｄ Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ，Ｌｏｏｐｓ Ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＬＩＰ）－ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｌｏｏｐ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．（２００３）１６：１２；９７９－９８５参照）、及びオンラインのタンパク質折り畳み認識サーバーＰｈｙｒｅ２（Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｈｙｒｅ２ Ｗｅｂ Ｐｏｒｔａｌ Ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ ２０１５，１０（６），８４５－８５８）によって決定することができる。
【0064】
ループ状タンパク質の非限定的な例としては、抗体及びその抗原結合断片、例えば、ナノボディ、ならびに細胞内標的に結合するか、または細胞内標的の高親和性結合剤に操作することができる任意のタンパク質が挙げられる。
【0065】
本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質を生成するために、いくつかの理由により、ＣＰＰモチーフをカーゴタンパク質のＮ末端またはＣ末端ではなくループ領域に融合させた。第１に、短いＣＰＰペプチドを表面ループへ挿入すること、または元のループ配列をＣＰＰで置き換えることで、ＣＰＰ配列が「環状」のようなコンフォメーションに拘束されることが予想され、ＣＰＰ配列のタンパク質分解安定性が大きく向上するものと予想される。第２に、ループを埋め込んだＣＰＰの「環状」のようなコンフォメーションは、環状ＣＰＰのコンフォメーションを模倣するものであり得、その細胞侵入効率を高める可能性がある（環状ＣＰＰは、線状ＣＰＰと比較してより大きなサイトゾル取り込み効率を有する）。第３に、これまでの研究により、適切なペプチド配列のタンパク質表面ループへの挿入は、多くの場合、タンパク質構造の軽微な不安定しかもたらさないことが示されている（Ｓｃａｌｌｅｙ－Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，１２，１９７－２０６）。
【0066】
もう１つの重要な考慮事項は、ＣＰＰ配列である。ＣＰＰは、腔内膜に結合して、ＣＰＰに富む脂質ドメインが小さなベシクルとしてエンドソーム膜から出芽することを誘導することによってエンドソームを離脱し、次いで、これが細胞質内でアモルファスの脂質／ＣＰＰ凝集体に分解されると考えられる（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５５，２６０１－２６１２）。両親媒性ＣＰＰは、疎水性基（複数可）が膜に挿入されて正の曲率を生み出し、アルギニン残基がリン脂質の頭部をまとめて負の曲率を誘導することができることから、直交方向に同時に正及び負の膜曲率（または負のガウス曲率）が生じることを特徴とする出芽ネック構造の安定化によって、エンドソーム離脱を促進すると思われる（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１９，１１９，１０２４１－１０２８７）。加えて、最も活性な環状ＣＰＰ（例えば、シクロ（Ｐｈｅ－ｐｈｅ－Ｎａｌ－Ａｒｇ－ａｒｇ－Ａｒｇ－ａｒｇ－Ｇｌｎ）（配列番号１２５）、ここで、ｐｈｅはＤ－フェニルアラニンであり、ＮａｌはＬ－ナフチルアラニン（Ｎａｌ）であり、ａｒｇはＤ－アルギニンである）は、ほぼ交互の位置に、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸を含有する。Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５５，２６０１－２６１２を参照されたい。環状コンフォメーションにおける疎水性正電荷側鎖の特定の空間的な配置が、あらゆる出芽イベントにおいて必須の中間体である出芽ネックにおける負のガウス曲率の形成を促進し得るのではと仮定される。
【0067】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質は、検出可能なタグを更に含む。検出可能なタグの例としては、ＦＬＡＧタグ、ポリ－ヒスチジンタグ（例えば、６ｘＨｉｓ）（配列番号１２６）、ＳＮＡＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ｃＭｙｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ、アビジン、酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質、化学発光タンパク質、生物発光タンパク質、及びリン光性タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質は、青色／ＵＶタンパク質（ＢＦＰ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅなど）；シアン色タンパク質（ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、及びｍＴＦＰ１など）；緑色タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍｅＧＦＰ（Ａ２０８Ｋ変異）、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、及びｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎなど）；黄色タンパク質（ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、及びＴａｇＹＦＰなど）；オレンジ色タンパク質（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、及びｍＯｒａｎｇｅ２など）；赤色タンパク質（ＲＦＰ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、及びｍＲｕｂｙ２など）；遠赤色タンパク質（ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、及びＮｉｒＦＰなど）；近赤外線タンパク質（ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、及びｉＲＦＰなど）；ロングストークスシフトタンパク質（ｍＫｅｉｍａ Ｒｅｄ、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ２、及びｍＢｅＲＦＰなど）；光活性化タンパク質（ＰＡ－ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、及びＰＡＴａｇＲＦＰなど）；光変換性タンパク質（Ｋａｅｄｅ（ｇｒｅｅｎ）、Ｋａｅｄｅ（ｒｅｄ）、ＫｉｋＧＲ１（ｇｒｅｅｎ）、ＫｉｋＧＲ１（ｒｅｄ）、ＰＳ－ＣＦＰ２、ＰＳ－ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ２（ｒｅｄ）、ｍＥｏｓ３．２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ３．２（ｒｅｄ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、及びＰＳｍＯｒａｎｇｅなど）；及び光切替可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａなど）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、検出可能なタグは、ＡｍＣｙａｎ、ＡｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、ＨｃＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ Ｍｏｎｏｍｅｒ、及び／またはＡｃＧＦＰから選択することができ、その全てがＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。
【0068】
プロテインチロシンホスファターゼ
プロテインチロシンホスファターゼは、タンパク質上のリン酸化チロシン残基からリン酸基を除去する酵素の一群である。プロテインチロシン（ｐＴｙｒ）リン酸化は、タンパク相互作用及び細胞局在化のための新しい認識モチーフを作り、タンパク質の安定性に影響を与え、酵素活性を制御することができる、一般的な翻訳後修飾である。そのため、プロテインチロシンリン酸化を適切なレベルに維持することは、多くの細胞機能にとって不可欠である。
プロテインチロシンホスファターゼは、タンパク質上のリン酸化チロシン残基からリン酸基を除去する酵素の一群である。プロテインチロシン（ｐＴｙｒ）リン酸化は、タンパク相互作用及び細胞局在化のための新しい認識モチーフを作り、タンパク質の安定性に影響を与え、酵素活性を制御することができる、一般的な翻訳後修飾である。そのため、プロテインチロシンリン酸化を適切なレベルに維持することは、多くの細胞機能にとって不可欠である。
【0069】
プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）としても知られる非受容体型チロシンプロテインホスファターゼ１は、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーの初期メンバーである酵素である。ヒトでは、ＰＴＰＮ１遺伝子によってコードされている。ＰＴＰ１Ｂは、インスリンシグナル伝達経路の負の調節因子であり、特に２型糖尿病の治療として、有望な潜在的治療標的とみなされている。また、乳癌の発生にも関与しており、乳癌の潜在的治療標的としても探究されている。ＰＴＰ１Ｂの三次構造は、５つのループ領域を含む。
【0070】
いくつかの実施形態において、本開示の修飾されたループ状タンパク質は、５つのループ領域の１つ以上にＣＰＰ配列を含む、修飾されたＰＴＰ１Ｂタンパク質である。いくつかの実施形態において、本開示の修飾されたループ状タンパク質は、ループ１領域にＣＰＰ配列を含む、修飾されたＰＴＰ１Ｂタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾されたＰＴＰ１Ｂタンパク質は、ループ２領域にＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＰＴＰ１Ｂタンパク質は、ループ３領域にＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＰＴＰ１Ｂタンパク質は、ループ４領域にＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＰＴＰ１Ｂタンパク質は、ループ５領域にＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、ループ１領域、ループ２領域、ループ３領域、ループ４領域、ループ５領域、またはそれらの組み合わせ中のＣＰＰ配列。
【0071】
グリコシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ、Ｇｔｆ）は、天然グリコシド結合を確立する酵素（ＥＣ２．４）である。活性化された糖ヌクレオチド（「グリコシルドナー」としても知られる）から求核性のグリコシルアクセプター分子に糖部分を転移することを触媒し、その求核剤は、酸素、炭素、窒素、または硫黄系であり得る。いくつかの実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼである。プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）は、イノシンをヒポキサンチンとリボースリン酸に、グアノシンをグアニンとリボースリン酸に変換することによって、プリン代謝に関与する酵素である（Ｅｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ．２．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，３６，１１７３５－４８）。ＰＮＰ欠損をもたらす変異は、Ｔ細胞（細胞媒介性）免疫に欠陥を引き起こすだけでなく、Ｂ細胞免疫及び抗体反応にも影響することがある（Ｍａｒｋｅｒｔ，Ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃ．Ｒｅｖ．１９９１，３，４５－８１）。この稀な遺伝子疾患の潜在的な治療法は、患者の細胞のサイトゾルに酵素的に活性なＰＮＰを送達することである。
グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ、Ｇｔｆ）は、天然グリコシド結合を確立する酵素（ＥＣ２．４）である。活性化された糖ヌクレオチド（「グリコシルドナー」としても知られる）から求核性のグリコシルアクセプター分子に糖部分を転移することを触媒し、その求核剤は、酸素、炭素、窒素、または硫黄系であり得る。いくつかの実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼである。プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）は、イノシンをヒポキサンチンとリボースリン酸に、グアノシンをグアニンとリボースリン酸に変換することによって、プリン代謝に関与する酵素である（Ｅｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ．２．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，３６，１１７３５－４８）。ＰＮＰ欠損をもたらす変異は、Ｔ細胞（細胞媒介性）免疫に欠陥を引き起こすだけでなく、Ｂ細胞免疫及び抗体反応にも影響することがある（Ｍａｒｋｅｒｔ，Ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃ．Ｒｅｖ．１９９１，３，４５－８１）。この稀な遺伝子疾患の潜在的な治療法は、患者の細胞のサイトゾルに酵素的に活性なＰＮＰを送達することである。
【0072】
いくつかの実施形態において、本開示の修飾されたループ状タンパク質は、１つ以上のＰＮＰループ領域にＣＰＰ配列を含む、修飾されたＰＮＰタンパク質である。いくつかの実施形態において、修飾されたＰＮＰタンパク質は、２つのＰＮＰループ領域にＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＰＮＰタンパク質は、３つのＰＮＰループ領域にＣＰＰ配列を含む。
【0073】
抗体及び抗原結合断片
「抗体」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子であって、Ｉｇ分子の可変領域に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはポリペプチドなどの特定の標的に結合することが可能なＩｇ分子を指す。本明細書で使用されるとき、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体及びその抗原結合断片を包含する。例えば、天然型免疫グロブリン分子は、２つの重鎖ポリペプチド及び２つの軽鎖ポリペプチドから構成される。重鎖ポリペプチドのそれぞれは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの間の鎖内ジスルフィド結合により、軽鎖ポリペプチドと会合して、２つのヘテロ二量体タンパク質またはポリペプチド（すなわち、２つの異種ポリペプチド鎖からなるタンパク質）を形成する。次いで、２つのヘテロ二量体タンパク質は、重鎖ポリペプチド間の追加の鎖内ジスルフィド結合により会合して、免疫グロブリンタンパク質またはポリペプチドを形成する。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子であって、Ｉｇ分子の可変領域に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはポリペプチドなどの特定の標的に結合することが可能なＩｇ分子を指す。本明細書で使用されるとき、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体及びその抗原結合断片を包含する。例えば、天然型免疫グロブリン分子は、２つの重鎖ポリペプチド及び２つの軽鎖ポリペプチドから構成される。重鎖ポリペプチドのそれぞれは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの間の鎖内ジスルフィド結合により、軽鎖ポリペプチドと会合して、２つのヘテロ二量体タンパク質またはポリペプチド（すなわち、２つの異種ポリペプチド鎖からなるタンパク質）を形成する。次いで、２つのヘテロ二量体タンパク質は、重鎖ポリペプチド間の追加の鎖内ジスルフィド結合により会合して、免疫グロブリンタンパク質またはポリペプチドを形成する。
【0074】
本明細書で使用される「抗原結合断片」という用語は、目的の抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有するポリペプチド断片を指す。この点に関して、本明細書に記載される抗体の抗原結合断片は、標的分子に特異的に結合する抗体に由来する可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）配列の１、２、３、４、５、または６つ全てのＣＤＲを含み得る。抗原結合断片には、全長抗体の一部、一般に、その抗原結合領域または可変領域を含むタンパク質、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ断片、ミニボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体断片から構成される多重特異性抗体、及び必要とされる特異性の抗原結合部位または断片を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構造体が含まれる。
【0075】
「Ｆ（ａｂ）」という用語は、パパイン酵素によるＩｇＧ分子のタンパク質分解性切断によって得られるタンパク質断片のうちの２つを指す。各Ｆ（ａｂ）は、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖の共有結合ヘテロ二量体を含み、インタクトな抗原結合部位を含む。各Ｆ（ａｂ）は、一価の抗原結合断片である。「Ｆａｂ’」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２から得られる断片を指し、Ｆｃのごく一部を含有し得る。各Ｆａｂ’断片は、一価の抗原結合断片である。
【0076】
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、ペプシン酵素によるタンパク質分解性切断によって生成されたＩｇＧのタンパク質断片を指す。各Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つのＦ（ａｂ’）断片を含み、したがって、二価の抗原結合断片である。
【0077】
「Ｆｖ断片」は、天然型抗体分子の抗原認識及び結合能力のほとんどを保持しているが、Ｆａｂ内に含有されるＣＨ１及びＣＬドメインを欠く抗原結合部位を含む、非共有結合性のＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を指す。Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９－２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６－２７１０；及びＥｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１－４０９６。
【0078】
ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディもまた本明細書に含まれる（Ｓ．Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３０５５－３０６１，１９９６）。例えば、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９）；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３－４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９－５８８３，１９８８；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４－６４４８，１９９３；Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９－１２４５，１９９６；Ｓ．Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３０５５－３０６１，１９９６を参照されたい。
【0079】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なる固有の抗原（または同じ抗原の異なるエピトープ）に同時に結合することができる抗体である。現在、ＢｓＡｂの主な用途は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びエフェクター細胞によって媒介される他の細胞傷害機序による腫瘍細胞の殺傷を増大させるために、細胞傷害性免疫エフェクター細胞をリダイレクトすることである。
【0080】
組み換え抗体工学技術により、親モノクローナル抗体（ｍａｂ）の可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む組み換え二重特異性抗体断片の作製が可能となる。非限定的な例としては、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）、ＢｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（一本鎖二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ＤＮＬ－（Ｆａｂ）３（ドック・アンド・ロック三価Ｆａｂ）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、及びＢｓｓｄＡｂ（二重特異性単一ドメイン抗体）が挙げられる。
【0081】
Ｆｃ領域を持つＢｓＡｂは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣなどのＦｃ媒介性エフェクター機能を果たすのに有用である。これらは、通常のＩｇＧの半減期を有する。一方、Ｆｃ領域を持たないＢｓＡｂ（二重特異性断片）は、治療活性の発揮には、抗原結合能力にのみ依存している。これらの断片は、サイズが小さいことから、固形腫瘍への透過率に優れている。ＢｓＡｂ断片は、グリコシル化を必要とせず、細菌細胞で産生され得る。その用途に合わせたＢｓＡｂのサイズ、価数、柔軟性及び半減期。
【0082】
二重特異性ＩｇＧ抗体は、組み換えＤＮＡ技術を使用して、同じ細胞株で発現させた２つの異なる重鎖及び軽鎖から組み立てることができる。異なる鎖のランダムな組み立てにより、非機能性分子及び望ましくないＨＣホモ二量体の形成が生じる。この問題に対応するために、第２の結合部分（例えば、単鎖可変断片）をＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端またはＣ末端に融合させ、各抗原に対して２つの結合部位を含有する四価ＢｓＡｂを得ることができる。ＬＣ－ＨＣのミスペアリング及びＨＣホモ二量体化に対処するための更なる方法は、以下の通りである。
【0083】
ノブ・イントゥ・ホールＢｓＡｂ ＩｇＧ。２つのＣＨ３ドメインに異なる変異を導入することによって、Ｈ鎖ヘテロ二量体化を強制的に起こさせ、非対称抗体を得る。具体的には、一方のＨＣに「ノブ」変異を作り、もう一方のＨＣに「ホール」変異を作り、ヘテロ二量体化を促進させる。
【0084】
Ｉｇ－ｓｃＦｖ融合。全長ＩｇＧに新しい抗原結合部分を直接付加することで、四価の融合タンパク質を得る。例としては、ＩｇＧ Ｃ末端のｓｃＦｖ融合及びＩｇＧ Ｎ末端のｓｃＦｖ融合が挙げられる。
【0085】
ダイアボディ－Ｆｃ融合。これは、ＩｇＧのＦａｂ断片を二重特異性ダイアボディ（ｓｃＦｖの誘導体）に置き換えることを伴う。
【0086】
デュアル可変ドメイン－ＩｇＧ（ＤＶＤ－ＩｇＧ）。１つの特異性を持つＩｇＧのＶＬ及びＶＨドメインを、リンカー配列を介して、異なる特異性を持つＩｇＧのＶＬ及びＶＨのＮ末端にそれぞれ融合して、ＤＶＤ－ＩｇＧを形成する。
【0087】
「ダイアボディ」という用語は、ＶＨ及びＶＬドメインが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合が起こらないような短いリンカーを使用して単一ポリペプチド鎖に発現させることにより、これらのドメインを別の鎖の相補ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を形成させた二重特異性抗体を指す（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－４８（１９９３）及びＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－２３（１９９４）参照）。
【0088】
「ナノボディ」または「単一ドメイン抗体」という用語は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗原結合断片を指す。これらには、従来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と比べて、サイズの小ささ（１５ｋＤ）、還元的な細胞内環境での安定性、及び細菌系での産生の容易さを含む、いくつかの利点がある（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５７，２３１４；Ｓｉｏｎｔｏｒｏｕ，（２０１３）Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｎｏｖｅｌ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，８，４２１５－２７）。これらの特徴により、ナノボディは、遺伝子及び化学的な修飾が可能であり（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５７，２３１４）、研究ツール及び治療薬としての応用を容易にしている（Ｂａｎｎａｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８，１６０３）。過去１０年間にわたり、ナノボディは、タンパク質の固定化（Ｒｏｔｈｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｎａｎｏｔｒａｐ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，７，２８２－２８９）、イメージング（Ｔｒａｅｎｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ Ｗｉｔｈ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１４，７０７－７２３）、タンパク質間相互作用の検出（Ｈｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ，４，２６６０；Ｍａｓｓａ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ－Ｔａｇｇｅｄ Ｃａｍｅｌｉｄ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ，２５，９７９－９８８）、及び高分子阻害剤（Ｔｒｕｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）ＨｙｐＥ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ Ｔｏｏｌｓ ｔｏ Ｍｏｄｕｌａｔｅ ＨｙｐＥ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔａｒｇｅｔ ＡＭＰｙｌａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０，９０８７－９１００）に使用されてきた。
【0089】
しかしながら、抗体及びナノボディの細胞内応用は、細胞膜透過性の欠如により阻まれてきた。その細胞膜透過性を向上させるために多くの試みが行われており、それらには、タンパク質表面工学技術（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２５，１１２９－１１３７）、ナノ粒子担体への組み込み（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｈｒｏｍｏｂｏｄｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ，６，２５０１９）、及び環状ＣＰＰの付加（Ｈｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ，９，７６２－７７１）が含まれる。しかしながら、これらのアプローチは、ほとんどのカーゴがエンドソーム／リソソームコンパートメント内に閉じ込められるため、概して、サイトゾル送達効率が低い。したがって、抗体及びナノボディの細胞膜透過性を向上させる更なる戦略が必要とされている。
【0090】
いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、抗体またはその抗原結合断片の１つ以上のループ（例えば、１、２、３、またはそれより多いループ）に挿入される。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、可変アミノ酸配列を持つループ領域（すなわち、ＣＤＲループ）に挿入される。抗体及びその抗原結合断片の高度保存領域または可変領域を決定する方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【0091】
いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、抗体の定常ドメイン内のループ領域に挿入される。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、重鎖のＣＨ１ドメインの１つ以上のループに挿入される。このような実施形態において、ＣＰＰ配列は、アミノ酸位置Ｄ１４８とＴ１５５の間及び／またはＮ２０１とＶ２１１の間に挿入され得る。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、重鎖のＣＨ２ドメインの１つ以上のループに挿入される。このような実施形態において、ＣＰＰ配列は、アミノ酸位置Ｄ２６５とＫ２７４の間及び／またはＫ３２２とＩ３３２の間に挿入され得る。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、重鎖のＣＨ３ドメインの１つ以上のループに挿入される。このような実施形態において、ＣＰＰ配列は、アミノ酸位置のＧ３７１とＡ３７８の間及び／またはＳ４２６とＴ４３７の間に挿入され得る。抗体重鎖のアミノ酸位置への全ての言及は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）にあるようなＥＵインデックスに従い、これは、参照により本明細書に明示的に援用される。「ＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１抗体のナンバリングを指す。
【0092】
いくつかの実施形態において、本開示の修飾されたループ状タンパク質は、抗体または抗原結合断片上のＣＤＲのうちの１つ以上に挿入されたＣＰＰ配列を含む、修飾された抗体である。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域、またはそれらの組み合わせに挿入される。いくつかの実施形態において、修飾された抗体は、ＣＤＲ１に挿入されたＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾された抗体は、ＣＤＲ２に挿入されたＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾された抗体は、ＣＤＲ３に挿入されたＣＰＰ配列を含む。
【0093】
いくつかの実施形態において、本開示の修飾されたループ状タンパク質は、抗体または抗原結合断片上のＣＤＲのうちの１つ以上に挿入されたＣＰＰ配列を含む、修飾されたナノボディである。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域、またはそれらの組み合わせに挿入される。いくつかの実施形態において、修飾されたナノボディは、ＣＤＲ１に挿入されたＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたナノボディは、ＣＤＲ２に挿入されたＣＰＰ配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたナノボディは、ＣＤＲ３に挿入されたＣＰＰ配列を含む。
【0094】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片におけるＣＰＰ挿入の最適部位は、部分的には、「エピトープビニング」を使用することによって、決定される。「エピトープビニング」は、標的タンパク質に対するモノクローナル抗体またはその断片のライブラリーを特性評価及び分類するために使用される競合イムノアッセイを指す。エピトープビニングにより、モノクローナル抗体を、ペアワイズ方式で、抗原に対する結合を互いに遮断する能力に基づいて、エピトープ「ファミリー」または「ビン」に分類することができる。あるモノクローナル抗体の抗原結合が別のモノクローナル抗体の結合を阻害する場合、それらの抗体は、類似または重複するエピトープに結合するとみなされ、同じ「ビン」に分類される。逆に、モノクローナル抗体の抗原への結合が別のモノクローナル抗体の結合と干渉しない場合、それらは、別個の重複しないエピトープに結合するとみなされる。エピトープビニングは、所与の抗体ライブラリーの数百または数千の抗体クローンを特性評価するために使用される。エピトープビニングの標準的な方法は、典型的に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を伴う。ＳＰＲを使用すると、モノクローナル抗体候補は、標的タンパク質への結合について、ペアワイズでスクリーニングされる。他の標準的な方法は、インタンデム、プレミックス、または古典的なサンドイッチアッセイなどのＥＬＩＳＡベースのスクリーニングを伴う。抗体の分類は、米国特許第８，５６８，９９２号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１３１２７６号に更に開示されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0095】
いくつかの実施形態において、エピトープビニングデータは、抗体配列決定データとマージされ、ループ領域へのＣＰＰ配列挿入の最適部位が決定され得る。各「ビン」に属する抗体の配列アライメントにより、同一のアミノ酸配列を持つループ状領域が特定され、これらの保存残基が抗原結合に重要であることが示唆される。各「ビン」に属する抗体の配列アライメントにより、可変アミノ酸配列を持つループ状領域が特定され、ＣＰＰ挿入が抗原結合活性に影響しないことが示唆される。いくつかの実施形態において、ＣＰＰ配列は、可変アミノ酸配列を持つ抗体のループ領域（すなわち、ＣＤＲループ）に挿入される。
【0096】
好適な抗体または本明細書で言及される断片のいずれかの非限定的な例としては、Ｋ－Ｒａｓ、ベータ－カテニン、ｃ－Ｍｙｃ、ＳＴＡＴ３、及び他の発がん性タンパク質が挙げられる。
【0097】
例示的な修飾されたループ状タンパク質
いくつかの実施形態において、本開示は、表Ｅから選択される修飾されたループ状タンパク質を提供する。挿入されたＣＰＰ配列を太字で示す。ＰＴＰ１Ｂ２Ｒ（Ｃ２１５Ｓ）中のＳｅｒ２１５に下線を引く。
いくつかの実施形態において、本開示は、表Ｅから選択される修飾されたループ状タンパク質を提供する。挿入されたＣＰＰ配列を太字で示す。ＰＴＰ１Ｂ２Ｒ（Ｃ２１５Ｓ）中のＳｅｒ２１５に下線を引く。
【0098】
【表5-1】
【0099】
【表5-2】
【0100】
いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１７７～１７９、１８１～１８５、及び１８７から選択される配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、修飾されたループ状タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１７７～１７９、１８１～１８５、及び１８７から選択されるアミノ酸配列を含む、修飾されたループ状タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１７７～１７９、１８１～１８５、及び１８７から選択されるアミノ酸配列からなる、修飾されたループ状タンパク質を提供する。
【0101】
ポリヌクレオチド及び発現ベクター
ポリヌクレオチド
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸分子である。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書中で区別なく使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。したがって、この用語は、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖もしくは多本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基及びピリミジン塩基もしくは他の天然、化学的もしくは生化学的修飾、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含む重合体を含む。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖または二本鎖のＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的上、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られ、遺伝子から単離され得るか、または当該技術分野において知られている方法によって化学的に合成され得る。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載される実施形態に適用されるように、一本鎖及び二本鎖のポリヌクレオチドを含むものと理解されたい。
ポリヌクレオチド
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸分子である。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書中で区別なく使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。したがって、この用語は、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖もしくは多本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基及びピリミジン塩基もしくは他の天然、化学的もしくは生化学的修飾、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含む重合体を含む。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖または二本鎖のＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的上、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られ、遺伝子から単離され得るか、または当該技術分野において知られている方法によって化学的に合成され得る。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載される実施形態に適用されるように、一本鎖及び二本鎖のポリヌクレオチドを含むものと理解されたい。
【0102】
２つ以上のポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の配列関係を記述するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、及び「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含め、長さが少なくとも１２であるが、しばしば１５～１８、多くの場合、少なくとも２５モノマー単位である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、及び（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含み得るので、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウインドウ」にわたって比較して、配列類似性のある局所領域を特定及び比較することによって実施される。「比較ウインドウ」は、少なくとも６、通常は約５０～約１００、より通常は約１００～約１５０の連続する位置の概念上のセグメントを指し、ある配列が、同数の連続する位置の参照配列と、２つの配列の最適なアライメントの後に比較される。比較ウインドウは、２つの配列の最適アライメントを得るために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウのアライメントを行うための配列の最適アライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ実装によって、または調査及び選択された様々な方法のいずれかによって生成されるベストアライメント（すなわち、比較ウインドウにわたって最大の相同性パーセンテージをもたらすもの）によって実施され得る。また、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されているＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを参照してもよい。配列解析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４－１９９８（第１５章単元１９．３）に見出すことができる。
【0103】
「配列同一性」、または例えば「～に対して５０％同一である配列」を含む記述は、本明細書で使用される場合、配列が、比較ウインドウにわたって、ヌクレオチド単位ごとまたはアミノ酸単位ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、最適にアライメントされた２つの配列を比較ウインドウにわたって比較し、両方の配列で同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が存在する位置の数を決定して、一致する位置の数を得、一致する位置の数を比較ウインドウの位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。
【0104】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」などという用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または以下に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して１つ以上のヌクレオチドが付加もしくは欠失されているか、または異なるヌクレオチドと置き換えられている、ポリヌクレオチドを含む。この点に関して、変異、付加、欠失及び置換を含むある特定の変更は、参照ポリヌクレオチドに対して行うことができ、それによって変更されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または生物活性を保持することは当該技術分野においてよく理解されている。
【0105】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【0106】
本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、本明細書に別途開示されるように、または当技術分野において知られているように、コーディング配列自体の長さにかかわらず、他のＤＮＡ配列、例えば、プロモーター及び／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、マルチクローニングサイト、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、ならびに自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグと組み合わせてもよく、そのため、その全体的な長さは大きく変動し得る。したがって、特定の実施形態において、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片を採用することができ、その全長は、好ましくは、目的の組み換えＤＮＡプロトコルにおける調製及び使用が容易であることに限られることが企図される。ポリヌクレオチドは、当該技術分野において知られ、利用可能である、様々な十分に確立された技術のいずれかを使用して、調製、操作及び／または発現させることができる。
【0107】
プロモーター及びシグナル配列
いくつかの実施形態において、ベクターはまた、修飾されたループ状タンパク質をコードするポリヌクレオチドに融合された、シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のため）をコードする配列も含み得る。例えば、ベクターは、修飾されたループ状タンパク質をコードするポリヌクレオチドに融合された、核局在化配列（例えば、ＳＶ４０またはｃＭｙｃ由来）を含み得る。例示的な核局在化配列を以下に示す：
ＳＶ４０：ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２７）
ＮＬＰ：ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号１２８）
ＴＵＳ：ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１２９）
ＥＧＬ－１３：ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１３０）
いくつかの実施形態において、ベクターはまた、修飾されたループ状タンパク質をコードするポリヌクレオチドに融合された、シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のため）をコードする配列も含み得る。例えば、ベクターは、修飾されたループ状タンパク質をコードするポリヌクレオチドに融合された、核局在化配列（例えば、ＳＶ４０またはｃＭｙｃ由来）を含み得る。例示的な核局在化配列を以下に示す：
ＳＶ４０：ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２７）
ＮＬＰ：ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号１２８）
ＴＵＳ：ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１２９）
ＥＧＬ－１３：ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１３０）
【0108】
ベクター
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を輸送または運搬することが可能な核酸分子を指すために本明細書で使用される。輸送された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは、細胞内で自律複製を誘導する配列を含み得るか、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を輸送または運搬することが可能な核酸分子を指すために本明細書で使用される。輸送された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは、細胞内で自律複製を誘導する配列を含み得るか、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。
【0109】
本明細書で使用される「発現カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後タンパク質を発現することができるベクター内の遺伝子配列を指す。核酸カセットは、目的の遺伝子、例えば、修飾されたループ状タンパク質を含有する。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換細胞の活性に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内コンパートメントを標的とすることまたは細胞外コンパートメントへの分泌によって生物活性に適切なコンパートメントへ移動していくことができるように、ベクター内に位置的及び連続的に配向される。好ましくは、カセットは、ベクターへの容易な挿入に適合された３’末端及び５’末端を有し、例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。カセットは、取り出して、プラスミドまたはウイルスベクターに単一のユニットとして挿入されてもよい。いくつかの実施形態において、核酸カセットは、修飾されたループ状タンパク質の配列を含有する。
【0110】
例示的なベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、トランスポゾン、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定するものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの例は、哺乳類細胞における発現には、ｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳類細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子移入及び発現には、ｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。特定の実施形態において、本明細書で開示される修飾されたループ状タンパク質のコーディング配列は、宿主細胞における修飾されたループ状タンパク質の発現のために、そのような発現ベクターにライゲーションされ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で企図される１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に送達するために、非ウイルスベクターが使用される。
【0111】
いくつかの実施形態において、ベクターは、エピソームベクターまたは染色体外に維持されるベクターを含むがこれらに限定されない、非組み込み型ベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込まれることなく、また分裂する宿主細胞から次第に失われることなく、複製することが可能なベクターを指し、当該ベクターは、染色体外またはエピソームで複製することも意味する。ベクターは、リンパ球向性ヘルペスウイルスもしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母に由来するＤＮＡ複製起点または「ｏｒｉ」、具体的には、ＥＢＶのｏｒｉＰに対応するリンパ球向性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルスの複製起点をコードする配列を有するように操作される。具体的な態様において、リンパ球向性ヘルペスウイルスは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、サルヘルペスウイルス（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であり得る。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）は、ガンマヘルペスウイルスの例でもある。典型的に、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製トランス活性化因子タンパク質を含む。
【0112】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、トランスポゾンベクター系を使用して、標的細胞または宿主細胞に導入される。ある特定の実施形態において、トランスポゾンベクター系は、転移要素及び本明細書で企図されるポリヌクレオチドを含むベクター；ならびにトランスポザーゼを含む。一実施形態において、トランスポゾンベクター系は、単一のトランスポザーゼベクター系であり、例えば、ＷＯ２００８／０２７３８４を参照されたい。例示的なトランスポザーゼとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｍｏｓ１、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ－Ｔｏｌ２、Ｔｃ３、ＭｕＡ、ＨｉｍａｒＩ、ＦｒｏｇＰｒｉｎｃｅ、及びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えば、米国特許第６，９６２，８１０号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えば、Ｉｚｓｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：９３－１０２（２０００）に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。メダカのＯｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓから最初に単離され、ｈＡＴファミリーのトランスポゾンに属するＴｏｌ２トランスポゾンは、Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）に記載されている。Ｍｉｎｉ－Ｔｏｌ２は、Ｔｏｌ２のバリアントであり、Ｂａｌｃｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）に記載されている。Ｔｏｌ２及びＭｉｎｉ－Ｔｏｌ２トランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポザーゼと協働する場合に、導入遺伝子の生物のゲノムへの組み込みを促進する。Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅトランスポゾン及びトランスポザーゼは、例えば、Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：６８７３－６８８１（２００３）に記載されている。
【0113】
発現ベクターに存在する「制御要素」または「調節配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実施する、ベクターの非翻訳領域（例えば、複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’非翻訳領域）である。そのような要素は、その強さ及び特異性が異なり得る。利用されるベクター系及び宿主に応じて、ユビキタスプロモーター及び誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写及び翻訳要素が使用され得る。いくつかの実施形態において、目的のポリヌクレオチドは、制御要素または調節配列に作動可能に連結される。「作動可能に連結される」とは、そのように記載される要素が、その意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターは、プロモーターがポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響する場合、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【0114】
いくつかの実施形態において、目的のポリヌクレオチドは、プロモーター配列に作動可能に連結される。本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態において使用するのに好適な例示的なユビキタスプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）プロモーター、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、及びＰ１１プロモーター、伸長因子１－アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、初期成長応答１（ＥＧＲ１）プロモーター、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）プロモーター、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）プロモーター、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）プロモーター、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータメンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）プロモーター、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）プロモーター、β－キネシン（β－ＫＩＮ）プロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７－１４８２（２００７））、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、ならびに骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーの負調節領域欠失ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー－結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８－５５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。
【0115】
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥデキストラン媒介導入、遺伝子銃、及び熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
【0116】
特定の実施形態で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なポリヌクレオチド送達系の例示的な例としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって提供されているものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質及び中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７；及びＢａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照されたい。抗体を標的とした細菌由来の非生物ナノセルベースの送達もまた、特定の実施形態において企図される。
【0117】
タンパク質発現系
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを含むベクターは、コードされた修飾されたループ状タンパク質を発現することが可能な宿主細胞に導入される。例示的な宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、マウスＮＳＯ細胞、またはマウスＳＰ２／０細胞、及びＥ．ｃｏｌｉ細胞が挙げられる。次いで、発現されたタンパク質は、当該技術分野において知られている様々な方法（例えば、プロテインＡカラム、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）のいずれか１つを使用して、培養系から精製される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを含むベクターは、コードされた修飾されたループ状タンパク質を発現することが可能な宿主細胞に導入される。例示的な宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、マウスＮＳＯ細胞、またはマウスＳＰ２／０細胞、及びＥ．ｃｏｌｉ細胞が挙げられる。次いで、発現されたタンパク質は、当該技術分野において知られている様々な方法（例えば、プロテインＡカラム、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）のいずれか１つを使用して、培養系から精製される。
【0118】
本明細書に記載される修飾されたループタンパク質の産生に使用するのに好適な数多くの発現系が存在する。特に、真核生物ベースの系は、核酸配列、またはその同族ポリペプチド、タンパク質及びペプチドを産生するために利用することができる。そのような系は数多く市販され、広く入手可能である。
【0119】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される修飾されたループタンパク質は、標準化されたプロトコルに従って、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して産生される。あるいは、例えば、トランスジェニック動物を利用して本明細書に記載される修飾されたループタンパク質を産生することができ、一般に、十分に確立されたトランスジェニック動物技術を使用して、動物の乳汁に発現させることによってなされる。Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｓｅｐ；２３（９）：１１１７－２５；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４ Ｊａｎ；２６（１）：３９－６０；Ｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ ｂｉｏｐｈａｒｍｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．２００５ Ｊｕｌ；１１１（１）：９３－１００もまた参照されたい。
【0120】
昆虫細胞／バキュロウイルス系は、高レベルの異種核酸セグメントのタンパク質発現をもたらすことができ、例えば、米国特許第５，８７１，９８６号及び同第４，８７９，２３６号（いずれもその全体が参照により本明細書に援用される）に記載され、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからＭＡＸＢＡＣ（登録商標）２．０及びＣｌｏｎｏｔｅｃｈからＢＡＣＰＡＣＫ（商標）バキュロウイルス発現系の名称で購入することができる。
【0121】
発現系の他の例としては、合成エクジソン誘導性受容体を利用する、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。誘導性発現系の別の例は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能であり、全長ＣＭＶプロモーターを使用する誘導性哺乳類発現系であるＴ－ＲＥＸ（商標）（テトラサイクリン制御性発現）Ｓｙｓｔｅｍが提供されている。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎは、メチロトローフ酵母菌Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおける高レベルの組み換えタンパク質産生のために設計された、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍと呼ばれる酵母菌発現系も提供している。当業者であれば、本明細書に記載される修飾されたループ状タンパク質をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトなどのベクターを発現させ、コードされる核酸配列またはその同族ポリペプチド、タンパク質、もしくはペプチドを産生させる方法を知っているであろう。概して、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｂｙ Ｒｏｃｋｙ Ｓ．Ｔｕａｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９７），ＩＳＢＮ０８９６０３３３３３；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｂｙ Ｒｏｓｈｎｉ Ｌ．Ｄｕｔｔｏｎ，Ｊｅｎｏ Ｍ．Ｓｃｈａｒｅｒ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００７），ＩＳＢＮ０８１３ ８０５１７１；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ Ｂｙ Ｏｔｔｏ－Ｗｉｌｈｅｌｍ Ｍｅｒｔｅｎ，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｓｔａｆｆ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００１），ＩＳＢＮ０７９２３７１３７２を参照されたい。
【0122】
別の方法として、本発明のタンパク質は、排他的固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合または古典的な液相合成によって合成することができる。これらの合成法は、当業者によく知られている（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．１９８４）、Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｒａｐｐ，Ｃｈｅｍ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．３：３（１９８６）、Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９）、Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，“Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ２８９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、及びＬｌｏｙｄ－Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）参照）。「ネイティブケミカルライゲーション」及び「発現タンパク質ライゲーション」などの全化学合成戦略の変形形態も標準である（例えば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：７７６（１９９４）、Ｈａｃｋｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：７８４５（１９９７）、Ｄａｗｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８７：３４（１９９７）、Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６７０５（１９９８）、及びＳｅｖｅｒｉｎｏｖ ａｎｄ Ｍｕｉｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６２０５（１９９８）参照）。発現タンパク質ライゲーションの一例において、組み換え発現タンパク質をインテインから切断し、共役チオフェノールを含有する反応溶液中で、酸化されていないスルフヒドリル側鎖を有するＮ末端システインを含有するペプチドとタンパク質を接触させることによって、タンパク質をペプチドにライゲートさせる。これにより、組み換えタンパク質のＣ末端にチオエステルが形成され、これが分子内で自然に転位し、タンパク質とペプチドを連結するアミド結合が形成される。概して、Ｍｕｉｒ，ＴＷ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＰＮＡＳ（１９９８）９５（１２）６７０５－６７１０；米国特許第６，８４９，４２８号；米国特許出願公開第２００２／０１５１００６号；Ｂｏｎｄａｌａｐａｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌｕｍｅ ８，ｐａｇｅｓ ４０７－４１８；Ａｍｙ Ｅ．Ｒａｂｉｄｅａｕ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ Ｌｅｔｈｅｒ Ｐｅｎｔｅｌｕｔｅ＊．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｎａｔｉｖｅ Ｃａｒｇｏ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｈｒａｘ Ｌｅｔｈａｌ Ｔｏｘｉｎ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．（２０１６）Ｂｉｏｌ．，１１（６）１４９０－１５０１；及びＷｅｉｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｐｙｉｎｇ Ｌｉｆｅ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｉｒｒｏｒ－Ｉｍａｇｅ ＤＮＡ－Ｌｉｇａｓｅ Ｍａｄｅ ｏｆ Ｄ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ．Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２０１９ Ｍａｙ １６）２６（５）；６１６－６１９を参照されたい。
【実施例】
【0123】
実施例１：細胞膜透過性ＰＴＰ１Ｂ
本明細書に記載されるタンパク質工学アプローチの一般性を実証するために、プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の触媒ドメイン（アミノ酸１～３２１）を、哺乳類細胞への送達を可能にするように、ＣＰＰを用いて操作した。チロシンリン酸化は、一般に、サイトゾル及び核タンパク質または膜貫通タンパク質のサイトゾルドメインに制限されている。したがって、これらのタンパク質のホスホチロシン（ｐＹ）レベルの変動は、ＰＴＰ１Ｂのサイトゾル空間への機能的送達の決定的な証拠を提供する。更に、ｐＹレベルの任意の変化は、抗ｐＹ抗体を用いた免疫ブロット法によって簡便に検出することができる。
本明細書に記載されるタンパク質工学アプローチの一般性を実証するために、プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の触媒ドメイン（アミノ酸１～３２１）を、哺乳類細胞への送達を可能にするように、ＣＰＰを用いて操作した。チロシンリン酸化は、一般に、サイトゾル及び核タンパク質または膜貫通タンパク質のサイトゾルドメインに制限されている。したがって、これらのタンパク質のホスホチロシン（ｐＹ）レベルの変動は、ＰＴＰ１Ｂのサイトゾル空間への機能的送達の決定的な証拠を提供する。更に、ｐＹレベルの任意の変化は、抗ｐＹ抗体を用いた免疫ブロット法によって簡便に検出することができる。
【0124】
ＰＴＰ１Ｂ（１～３２１）構造の調査により、ＣＰＰのグラフトが可能な部位として、５つの溶媒露出ループ領域が明らかになった。これらのループは、ＰＴＰ１Ｂの触媒部位またはアロステリック部位から遠位である。ＰＴＰファミリーの他のメンバーとの配列アライメントにより、これらのループ領域には高い配列変異があることが示されており（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）．Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＳＨＰ－１．Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３（４３），２８１９９－２８２０７）、これらのループの修飾がＰＴＰ１Ｂのフォールディングまたは触媒機能を阻害する可能性は低いことが示唆される。各ループに対して、ＷＷＷＲＲＲＲ（配列番号１１７）及びＲＲＲＲＷＷＷ（配列番号１１８）の両方の配向でＣＰＰ配列を挿入し、合計で１０個のループ挿入変異体を得た（表１）。グリシン残基は、ループの柔軟性を提供するために導入した。変異体タンパク質は、挿入の部位（すなわち、ループ１～５をそれぞれ「１～５」）及びＣＰＰの配向（ＷＷＷＲＲＲＲ（配列番号１１７）を「Ｗ」及びＲＲＲＲＷＷＷ（配列番号１１８）を「Ｒ」）に基づいて、「１～５Ｗ」及び「１～５Ｒ」と名付けた。修飾されたループの全体的な正電荷を確保するために、元のループ領域の酸性残基のいくつかを除去した。場合によっては、ループの柔軟性を高めるために、グリシン残基をＣＰＰ配列の両側に挿入した。
【0125】
【表6】
【0126】
１０個のＰＴＰ１Ｂ変異体の３Ｄ構造を、オンラインのタンパク質折り畳み認識サーバーＰｈｙｒｅ２を使用して予測した。１０個の変異体は全て、ＣＰＰ配列がタンパク質表面に提示された野生型タンパク質の折り畳みを有することが予測された（図１）。ループ１、３、及び５の挿入変異体について、ＣＰＰモチーフは、溶媒に面した側鎖を持つ「環状のような」トポロジーを取ったが、ループ２及び４の変異体では、ＣＰＰは、制約の低い構造を示した。
【0127】
実施例２：細胞膜透過性ＰＴＰ１Ｂの生成及び特性評価
ＰＴＰ１Ｂ変異体をワンステップＰＣＲ法によって生成した（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４９，８５－９０）。溶解性及び触媒活性を迅速に評価するために、変異体のそれぞれを５ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞培養で発現させた。粗製細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。１０個の挿入変異体は全て、低温で導入すると主に可溶性タンパク質を産生し、これは、ＣＰＰのループへの挿入がＰＴＰ１Ｂの全体的な折り畳みを阻害しないことを示している（図２）。
ＰＴＰ１Ｂ変異体をワンステップＰＣＲ法によって生成した（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４９，８５－９０）。溶解性及び触媒活性を迅速に評価するために、変異体のそれぞれを５ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞培養で発現させた。粗製細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。１０個の挿入変異体は全て、低温で導入すると主に可溶性タンパク質を産生し、これは、ＣＰＰのループへの挿入がＰＴＰ１Ｂの全体的な折り畳みを阻害しないことを示している（図２）。
【0128】
細胞溶解物のホスファターゼ活性を、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ；０．５ｍＭ）を基質として使用することによって、定量した。１０個の変異体のうち４つは、野生型ＰＴＰ１Ｂの２５～６０％の触媒活性を示したが、残りは活性が低かった（図３）。細胞溶解物のＰＴＰ活性は、所与の変異体の発現レベルと比活性の両方に左右された。
【0129】
活性の最も高い４つのＰＴＰ１Ｂ変異体（１Ｗ、１Ｒ、２Ｒ、及び４Ｒ）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で大規模発現させ、アフィニティークロマトグラフィーによってほぼ均質になるまで精製した。４つの変異体は、異なる可溶性タンパク質の収量を示しており、これは、折り畳み効率及びタンパク質分解安定性が異なることに起因すると思われる（表２）。変異体の比活性を精製タンパク質で決定し、野生型ＰＴＰ１Ｂと比較した。変異体１Ｒを除く他の３つの変異体は、野生型ＰＴＰ１Ｂと比較して、同等またはより高い触媒活性を示した（表２）。
【0130】
【表7】
【0131】
ＰＴＰ１Ｂ変異体の細胞膜透過性を評価するために、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を野生型または変異型ＰＴＰ１Ｂ（１Ｒ、１Ｗ、２Ｒ及び４Ｒ）で２時間処理し、溶解し、そのグローバルｐＹレベルを抗ｐＹ抗体４Ｇ１０による免疫ブロット法によって調べた。未処理の細胞及び野生型ＰＴＰ１Ｂで処理した細胞は、非常に類似したｐＹタンパク質レベルを示したが、ＰＴＰ１Ｂの変異型で処理した後の細胞は、低いｐＹレベルを示し、変異体２Ｒ及び４Ｒでは最大の減少が観察された（図４Ａ）。更に、異なる濃度の２Ｒ変異体で処理した３Ｔ３細胞は、ほとんどのタンパク質のｐＹレベルについて用量依存的な減少を示した（図４Ｂ）。これらのデータは、野生型ＰＴＰ１Ｂではなく、ＰＴＰ１Ｂ変異体が３Ｔ３細胞のサイトゾルに入り、細胞内タンパク質上のチロシン残基を脱リン酸化する生物活性があったことを示している。
【0132】
実施例３：細胞膜透過性ナノボディ
この研究において、ＣＰＰループ挿入戦略をナノボディに適用した。ＧＦＰ結合ナノボディ（ＧＢＮ）をモデル系として選択した。高度に保存された非ＣＤＲループとは異なり、ＧＢＮのＣＤＲ１及びＣＤＲ３ループは、ＣＰＰ挿入に耐性があることがわかった。操作したナノボディは、効率的に哺乳類細胞に入り、生細胞内でＧＦＰに特異的に結合した。
この研究において、ＣＰＰループ挿入戦略をナノボディに適用した。ＧＦＰ結合ナノボディ（ＧＢＮ）をモデル系として選択した。高度に保存された非ＣＤＲループとは異なり、ＧＢＮのＣＤＲ１及びＣＤＲ３ループは、ＣＰＰ挿入に耐性があることがわかった。操作したナノボディは、効率的に哺乳類細胞に入り、生細胞内でＧＦＰに特異的に結合した。
【0133】
細胞膜透過性ＧＦＰ結合ナノボディの構築。ＣＰＰループ挿入研究にＧＢＮを選択したのは、ＧＦＰ：ＧＢＮ複合体の構造及び結合熱力学が十分に特徴付けられているからである（Ｋｕｂａｌａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＧＦＰ：ＧＦＰ－ｎａｎｏｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ：ａ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９（１２），２３８９－４０１）。ラクダナノボディは、高度に保存されたコア構造及び３つの可変相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる典型的な免疫グロブリンの折り畳みを有する（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＆ Ｃｏｌｗｅｌｌ（２０１８）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎａｎｏｂｏｄｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄａｔａ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，８６（７），６９７－７０６）。ＧＦＰ／ＧＢＮ複合体の結晶構造は、３つのＣＤＲループが全て抗原結合に関与することを示している。標的結合に対する潜在的影響を最小限に抑えるために、まず、４つの非ＣＤＲループをＣＰＰ挿入部位に選択した（表３）。ＣＰＰモチーフＲＲＲＲＷＷＷ（配列番号１１８）またはその逆配列ＷＷＷＲＲＲＲ（配列番号１１７）を各ループに挿入した。残念ながら、非ＣＤＲループ１及び２へのＣＰＰ挿入は、不溶性タンパク質を産生し、ループ４への挿入は、標的タンパク質の発現に失敗し、ループ３の挿入変異体では、分子クローニングがうまくいかなかった（表４）。これらの結果は、高度に保存されたこれらの非ＣＤＲ領域の配列完全性が、タンパク質構造を維持するために重要であることを示唆している。
【0134】
【表8】
【0135】
【表9】
【0136】
次に、ＲＲＲＲＷＷＷ（配列番号１１８）またはＷＷＷＲＲＲＲ（配列番号１１７）のＣＰＰ配列を３つのＣＤＲループに挿入して、更に６つの変異体を作製した（表３）。ＣＰＰを挿入する正確な部位は、いくつかの検討事項に基づいて決定した。まず、挿入は、通常「ターン構造」を形成する２つのアミノ酸の間になされ、天然型タンパク質構造の破壊を最小限に抑え、挿入された配列の構造的制約を最大にするようにする。溶媒に最も露出した２つの残基の間に挿入すると、ＣＰＰ側鎖が溶媒側に向くことが予想される。第２に、ＧＢＮ１Ｒ、ＧＢＮ１Ｗ、ＧＢＮ２Ｗ、及びＧＢＮ３Ｒ変異体に例示されるように（表３）、元のループ配列のカチオン性または疎水性残基は、概して、ＣＰＰ配列の一部として維持して、導入されるアミノ酸置換数を最小限に抑えた。最後に、ＣＤＲ２への両方の挿入について、ＷＴ配列のアスパラギン酸を除去して、正電荷のＣＰＰと干渉しないようにした。６つのＣＤＲ挿入変異体をワンステップＰＣＲ法によって良好に構築した（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ａ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４９，８５－９０）。変異体のうちの３つ（ＧＢＮ１Ｗ、ＧＢＮ３Ｗ、及びＧＢＮ３Ｒ）は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させると、可溶性タンパク質を産生した（表４）。これらの変異体をニッケルアフィニティークロマトグラフィーによってほぼ均質になるまで精製した。
【0137】
実施例４：細胞膜透過性ナノボディの特性評価
ＧＢＮ変異体によるＧＦＰ結合
変異型ナノボディのＧＦＰへの結合能をゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。野生型または変異型ナノボディをＧＦＰと３：１のモル比でインキュベートし、混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムに通した。予想した通り、ＧＢＮＷＴ及びＧＦＰは、２つのタンパク質の１：１複合体に対応する約４５ｋＤのピークとして共溶出した（図５Ａ）。過剰な未結合ナノボディに対応する約１５ｋＤの第２のピークも観察された。各溶出種の同定は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。喜ばしいことに、ＧＢＮ３Ｗ及びＧＢＮ３Ｒ変異体もまたＧＦＰとの１：１複合体を形成し、これは、ＧＦＰ結合に関与するＣＤＲ３の構造変化にかかわらず、いずれも実質的なＧＦＰ結合活性を保持していたことを示している（図５Ｂ）。陰性対照として、ＢＳＡは、別のピークとして溶出され、ＧＢＮＷＴ（図５Ｃ）またはＧＢＮ３Ｗ（図５Ｄ）のいずれとも複合体を形成しなかった。ＧＢＮ３Ｗ及びＧＢＮ３Ｒは、ＧＢＮＷＴよりもはるかに大きな溶出量を示したが、これは、ＣＰＰ挿入後にタンパク質の疎水性が増大し、ゲル濾過樹脂への結合が強くなったためと思われる（図５Ｄ）。
ＧＢＮ変異体によるＧＦＰ結合
変異型ナノボディのＧＦＰへの結合能をゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。野生型または変異型ナノボディをＧＦＰと３：１のモル比でインキュベートし、混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムに通した。予想した通り、ＧＢＮＷＴ及びＧＦＰは、２つのタンパク質の１：１複合体に対応する約４５ｋＤのピークとして共溶出した（図５Ａ）。過剰な未結合ナノボディに対応する約１５ｋＤの第２のピークも観察された。各溶出種の同定は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。喜ばしいことに、ＧＢＮ３Ｗ及びＧＢＮ３Ｒ変異体もまたＧＦＰとの１：１複合体を形成し、これは、ＧＦＰ結合に関与するＣＤＲ３の構造変化にかかわらず、いずれも実質的なＧＦＰ結合活性を保持していたことを示している（図５Ｂ）。陰性対照として、ＢＳＡは、別のピークとして溶出され、ＧＢＮＷＴ（図５Ｃ）またはＧＢＮ３Ｗ（図５Ｄ）のいずれとも複合体を形成しなかった。ＧＢＮ３Ｗ及びＧＢＮ３Ｒは、ＧＢＮＷＴよりもはるかに大きな溶出量を示したが、これは、ＣＰＰ挿入後にタンパク質の疎水性が増大し、ゲル濾過樹脂への結合が強くなったためと思われる（図５Ｄ）。
【0138】
次に、表面プラズモン共鳴を利用して、ＧＦＰとＧＢＮ変異体との間の相互作用を定量した。ＧＦＰをセンサーチップ上に固定化し、漸増濃度のＧＢＮ変異体を注入したところ、濃度依存的にレスポンスユニット（ＲＵ）が上昇した。野生型及び３つのループ挿入変異体は、固定化されたＧＦＰと強い相互作用を示し、会合速度は速く（１０４Ｍ－１ｓ－１）、解離速度は遅かった（１０－４ｓ－１）。ＧＢＮＷＴは、１８．９ｎＭの計算されたカイネティクスの解離速度定数を有したが、３つの変異体も同様のＫＤ値（２０～３５ｎＭ）を示した。平衡Ｋｄ値は、４つ全てのナノボディでいくらか高く、２３３ｎＭ（ＧＢＮＷＴ）～７１２ｎＭ（ＧＢＮ１Ｗ）の範囲であった（表５）。しかし、これらの結果は、ループ挿入がＧＦＰ結合能を阻害しなかったことを示している。
【0139】
【表10】
【0140】
ＧＢＮバリアントの細胞侵入
ＧＦＰ結合親和性が高いことから、ＧＢＮ３Ｗ及びＧＢＮ３Ｒを更なる研究のために選択した。ＧＢＮＷＴ、ＧＢＮ３Ｗ、及びＧＢＮ３Ｒ（２．５μＭ）の表面リシン残基（複数可）をローダミンで標識し、ＨｅＬａ細胞とともに１．５時間インキュベートし、洗浄し、生細胞共焦点顕微鏡によってイメージングした。ＧＢＮＷＴ（図６Ａ）は、顕著な内在化を示さなかったが、ＧＢＮ３Ｗ（図６Ｂ）及びＧＢＮ３Ｒ（図６Ｃ）は、強く部分的に拡散した細胞内蛍光を発生し、後者のほうが細胞侵入がいくらか効率的であった。
ＧＦＰ結合親和性が高いことから、ＧＢＮ３Ｗ及びＧＢＮ３Ｒを更なる研究のために選択した。ＧＢＮＷＴ、ＧＢＮ３Ｗ、及びＧＢＮ３Ｒ（２．５μＭ）の表面リシン残基（複数可）をローダミンで標識し、ＨｅＬａ細胞とともに１．５時間インキュベートし、洗浄し、生細胞共焦点顕微鏡によってイメージングした。ＧＢＮＷＴ（図６Ａ）は、顕著な内在化を示さなかったが、ＧＢＮ３Ｗ（図６Ｂ）及びＧＢＮ３Ｒ（図６Ｃ）は、強く部分的に拡散した細胞内蛍光を発生し、後者のほうが細胞侵入がいくらか効率的であった。
【0141】
サイトゾル侵入効率を評価するために、ナノボディの表面リシン（複数可）をナフトフルオレセイン（ＮＦ）で標識し、５μＭのＮＦ標識ナノボディでＨｅＬａ細胞を２時間処理し、フローサイトメトリーによって解析した。細胞膜透過性ペプチドＴａｔ及びＣＰＰ９を陽性対照として使用した。ＮＦは、ｐＨ感受性色素であり、酸性のエンドソーム及びリソソームコンパートメント内では非蛍光である。そのため、フローサイトメトリーによって測定された蛍光強度は、細胞表面で会合したタンパク質及びエンドソーム／リソソームからサイトゾルへ離脱したタンパク質を反映する。細胞表面結合タンパク質からの影響を排除するために、細胞懸濁液のｐＨをフローサイトメトリーの直前に素早く５．０に調整し、あらゆる細胞外ＮＦの蛍光を消した。図７に示されるように、酸性ｐＨでは、ＧＢＮ３Ｗ及びＧＢＮ３Ｒで処理したＨｅＬａ細胞の全蛍光強度が低下したことから、一部のナノボディが細胞膜と会合することを示している。しかしながら、ｐＨ５であっても、ＧＢＮ３Ｗ及びＧＢＮ３Ｒで処理した細胞は、優れたサイトゾル侵入活性を有するＣＰＰ９と同等かまたは更に強い蛍光を示しており（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｙｃｌｉｃ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５（１８），２６０１－２６１２）、ＧＢＮ変異体がＨｅＬａ細胞のサイトゾルに効率的に侵入したことが示唆される。予想した通り、Ｔａｔ及びＧＢＮＷＴは、酸性または中性ｐＨのいずれにおいても、極めて低いサイトゾル侵入を示した。
【0142】
ＧＦＰとＧＢＮ変異の共局在化
内在化したナノボディが生細胞で機能するかどうかを決定するために、サイトゾルＧＦＰとの共局在化を分析した。ミトコンドリア外膜に局在するＧＦＰ融合タンパク質をＨｅＬａ細胞に一過性にトランスフェクトした。２４時間後、細胞をローダミン標識ナノボディで処理し、共焦点顕微鏡によってイメージングした。ローダミン標識ＧＢＮ３Ｒで処理した細胞は、細胞膜上に強いタンパク質凝集を示し、ＧＢＮ３Ｒは、細胞内に発現されたＧＦＰと共局在しなかった（データ示さず）。対照的に、ＧＢＮ３Ｗは、非常に強い細胞内蛍光を示し、ミトコンドリア結合ＧＦＰと部分的に共局在し、ピアソンの相関係数は約０．７であった（図８）。これらのデータは、内在化したＧＢＮ３Ｗの一部がエンドソームから離脱し、ミトコンドリア表面に局在するＧＦＰに結合したことを示している。ＧＢＮの少なくとも一部は、エンドソーム／リソソーム内に保持され、及び／または細胞表面と会合するとみられ、Ｒ値は＜１．０となった。
内在化したナノボディが生細胞で機能するかどうかを決定するために、サイトゾルＧＦＰとの共局在化を分析した。ミトコンドリア外膜に局在するＧＦＰ融合タンパク質をＨｅＬａ細胞に一過性にトランスフェクトした。２４時間後、細胞をローダミン標識ナノボディで処理し、共焦点顕微鏡によってイメージングした。ローダミン標識ＧＢＮ３Ｒで処理した細胞は、細胞膜上に強いタンパク質凝集を示し、ＧＢＮ３Ｒは、細胞内に発現されたＧＦＰと共局在しなかった（データ示さず）。対照的に、ＧＢＮ３Ｗは、非常に強い細胞内蛍光を示し、ミトコンドリア結合ＧＦＰと部分的に共局在し、ピアソンの相関係数は約０．７であった（図８）。これらのデータは、内在化したＧＢＮ３Ｗの一部がエンドソームから離脱し、ミトコンドリア表面に局在するＧＦＰに結合したことを示している。ＧＢＮの少なくとも一部は、エンドソーム／リソソーム内に保持され、及び／または細胞表面と会合するとみられ、Ｒ値は＜１．０となった。
【0143】
核局在化シグナルのＧＢＮ３Ｗへの融合
ＧＦＰとＧＢＮの共局在化を更に試験するために、ｃ－Ｍｙｃ核局在化シグナル（ＮＬＳ；ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１６６））をＧＢＮＷＴ及びＧＢＮ３ＷのＣ末端に融合し、それぞれＧＢＮＷＴ－ＮＬＳ及びＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳを作製した。Ｃ末端ＮＬＳの付加は、サイズ排除クロマトグラフィーでのＧＦＰ及びＧＢＮバリアントの共溶出によって示されるように、ＧＦＰ結合に影響しなかった（図９）。ＧＦＰを安定的に発現するＨｅＬａ細胞を、ＧＢＮＷＴ－ＮＬＳ、ＧＢＮ３Ｗ、またはＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳで処理した。サイトゾル侵入及びＧＦＰ結合後、ＮＬＳは、ＧＦＰ／ＧＢＮ複合体の核内蓄積をもたらし、核内の緑色蛍光が増加することが予想された。予想した通り、未処理細胞は、細胞質及び核全体にわたって不均一なＧＦＰ蛍光を示し（図１０Ａ）、ＧＢＮＷＴ－ＮＬＳまたはＧＢＮ３Ｗによる細胞の処理では、細胞に侵入することも核に局在化することもできないことから、ＧＦＰ分布は変わらなかった（それぞれ図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。予想に反して、ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳもＧＦＰの有意な核内蓄積をもたらさなかった（図１０Ｄ）。いくつかの要因がこの失敗を引き起こしたと思われる。まず、Ｃ末端ＮＬＳがＧＢＮのサイトゾル侵入を阻害する可能性がある。第２に、Ｃ末端のＮＬＳ配列が機能的なＮＬＳではない可能性がある。最後に、内在化したＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳの量がサイトゾルＧＦＰの量に対して少なすぎ、ＧＦＰの細胞内分布を変えることができなかった可能性がある。
ＧＦＰとＧＢＮの共局在化を更に試験するために、ｃ－Ｍｙｃ核局在化シグナル（ＮＬＳ；ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１６６））をＧＢＮＷＴ及びＧＢＮ３ＷのＣ末端に融合し、それぞれＧＢＮＷＴ－ＮＬＳ及びＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳを作製した。Ｃ末端ＮＬＳの付加は、サイズ排除クロマトグラフィーでのＧＦＰ及びＧＢＮバリアントの共溶出によって示されるように、ＧＦＰ結合に影響しなかった（図９）。ＧＦＰを安定的に発現するＨｅＬａ細胞を、ＧＢＮＷＴ－ＮＬＳ、ＧＢＮ３Ｗ、またはＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳで処理した。サイトゾル侵入及びＧＦＰ結合後、ＮＬＳは、ＧＦＰ／ＧＢＮ複合体の核内蓄積をもたらし、核内の緑色蛍光が増加することが予想された。予想した通り、未処理細胞は、細胞質及び核全体にわたって不均一なＧＦＰ蛍光を示し（図１０Ａ）、ＧＢＮＷＴ－ＮＬＳまたはＧＢＮ３Ｗによる細胞の処理では、細胞に侵入することも核に局在化することもできないことから、ＧＦＰ分布は変わらなかった（それぞれ図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。予想に反して、ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳもＧＦＰの有意な核内蓄積をもたらさなかった（図１０Ｄ）。いくつかの要因がこの失敗を引き起こしたと思われる。まず、Ｃ末端ＮＬＳがＧＢＮのサイトゾル侵入を阻害する可能性がある。第２に、Ｃ末端のＮＬＳ配列が機能的なＮＬＳではない可能性がある。最後に、内在化したＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳの量がサイトゾルＧＦＰの量に対して少なすぎ、ＧＦＰの細胞内分布を変えることができなかった可能性がある。
【0144】
ＧＢＮＷＴ－ＮＬＳ及びＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳが細胞に侵入することができるかどうかを決定するために、ナノボディをローダミンで標識し、５μＭのローダミン標識ナノボディでＨｅＬａ細胞を処理し、続いて、共焦点顕微鏡によるイメージングを行った。ＧＢＮＷＴと同様に（予想した通り）、ＧＢＮＷＴ－ＮＬＳは、細胞に侵入しなかった（図１１Ａ）。興味深いことに、Ｃ末端にＮＬＳを付加すると、ＧＢＮ３Ｗのサイトゾル侵入効率が更に上がり、ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳは、細胞質全体にわたって容易に視認可能な拡散した蛍光を発生しているが、核内では発生していない（図１１Ｂ）。これは、正電荷のｃ－Ｍｙｃ ＮＬＳがＧＢＮ３Ｗのエンドソーム離脱を促進することができるが、このコンストラクトでは機能的なＮＬＳではないことを示している。
【0145】
ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳは、ＧＢＮ３Ｗと比べて向上したサイトゾル侵入を示したことから、細胞内で発現されたＧＦＰと共局在する能力を調べた。核内（特に、核小体）に局在するＧＦＰ－フィブリラリンを一過性にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞において、ローダミン標識ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳは、ＧＦＰとの共局在を示さず、これは、後者が核に入ることができないためと思われる（図１２Ａ）。一方、ミトコンドリア外膜上に局在するＧＦＰ－ＭｆｆをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合、ＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳは、ＧＦＰ－Ｍｆｆと部分的に共局在した（図１２Ａ）。内在化したＧＢＮ３Ｗ－ＮＬＳは、明らかに２つの異なる種類の細胞内蛍光パターンを生成する。ＧＦＰシグナルと重複しない点状の強いシグナルは、おそらく、ナノボディがエンドソーム及びリソソームの内部にまだ閉じ込められていることを表し、弱いＧＦＰ共局在化シグナルは、サイトゾルへ離脱してミトコンドリア局在化ＧＦＰ－Ｍｆｆに結合したナノボディを表している。
【0146】
実施例５：細胞膜透過性ＧＦＰ
本明細書に記載されるＣＰＰループ挿入戦略を改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）で試験した。ＥＧＦＰは、その固有の蛍光により、適切に折り畳まれた変異体の同定及び細胞侵入効率の評価が容易である。ＥＧＦＰのループ９（アミノ酸１７１～１７６）は、ペプチド挿入に高い耐性を持つことがこれまでに示されている（Ｐａｖｏｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＧＦＰ－ｂａｓｅｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰＮＡＳ ２００９，１０６，１１８９５－１１９００）。ＣＰＰモチーフＷＷＷＲＲＲ（配列番号１２３）を両方の配向でＥＧＦＰのＡｓｐ１７３とＧｌｙ１７４の間に挿入した（図１３Ａ）。ＲＲＲＷＷＷ（配列番号１２４）挿入の場合、ループ中の２つの酸性残基Ｇｌｕ１７２及びＡｓｐ１７３を除去した。これは、そうでなければ、部分的にＣＰＰの正電荷を中和し、その細胞膜透過活性を低下させる可能性がある。偶然にも、所望のコンストラクトに加えて、挿入変異導入により、余分なアルギニン残基ＲＲＲＲＷＷＷ（配列番号１１８）を含有するコンストラクトも生成された。これは、細菌細胞におけるＰＣＲ産物の相同組み換えでフレームシフト変異が生じた結果と思われる。本研究で生成されたＥＧＦＰ挿入変異体及びその特性を表５Ａにまとめる。
本明細書に記載されるＣＰＰループ挿入戦略を改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）で試験した。ＥＧＦＰは、その固有の蛍光により、適切に折り畳まれた変異体の同定及び細胞侵入効率の評価が容易である。ＥＧＦＰのループ９（アミノ酸１７１～１７６）は、ペプチド挿入に高い耐性を持つことがこれまでに示されている（Ｐａｖｏｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＧＦＰ－ｂａｓｅｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰＮＡＳ ２００９，１０６，１１８９５－１１９００）。ＣＰＰモチーフＷＷＷＲＲＲ（配列番号１２３）を両方の配向でＥＧＦＰのＡｓｐ１７３とＧｌｙ１７４の間に挿入した（図１３Ａ）。ＲＲＲＷＷＷ（配列番号１２４）挿入の場合、ループ中の２つの酸性残基Ｇｌｕ１７２及びＡｓｐ１７３を除去した。これは、そうでなければ、部分的にＣＰＰの正電荷を中和し、その細胞膜透過活性を低下させる可能性がある。偶然にも、所望のコンストラクトに加えて、挿入変異導入により、余分なアルギニン残基ＲＲＲＲＷＷＷ（配列番号１１８）を含有するコンストラクトも生成された。これは、細菌細胞におけるＰＣＲ産物の相同組み換えでフレームシフト変異が生じた結果と思われる。本研究で生成されたＥＧＦＰ挿入変異体及びその特性を表５Ａにまとめる。
【0147】
【表11】
【0148】
ＥＧＦＰの野生型及び変異型の両形態をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、高収率でほぼ均質になるまで精製した。変異体タンパク質は、野生型ＥＧＦＰと比べてわずかに減少した蛍光強度（１０～５０％）を示したが、その最大励起及び蛍光は本質的に変わらないままであった（データ示さず）。
【0149】
ＥＧＦＰ及び挿入変異体の細胞侵入効率を決定するために、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下、５μＭのタンパク質でＨｅＬａ細胞を２時間処理し、洗浄し、フローサイトメトリーによって解析した。ＥＧＦＰＷ３Ｒ３は、ＷＴ ＥＧＦＰと比較して細胞取り込みの改善を示さなかったが、ＥＧＦＰＲ３Ｗ３及びＥＧＦＰＲ４Ｗ３は、ＥＧＦＰよりも８倍及び１３倍高い効率で細胞に侵入した（表５Ａ）。フローサイトメトリーの結果を確認するために、５μＭのＥＧＦＰ変異体（１％ＦＢＳ）でＨｅＬａ細胞を２時間処理し、生細胞共焦点顕微鏡によって細胞をイメージングした。最も強い蛍光は、ＥＧＦＰＲ４Ｗ３で処理した細胞で観察され、ＥＧＦＰＲ３Ｗ３及びＥＧＦＰＷ３Ｒ３が続いたが、ＷＴ ＥＧＦＰで処理した細胞は、検出可能な細胞内蛍光を示さなかった（図１３Ｂ）。内在化したタンパク質のどの程度がサイトゾルに到達したかを決定するために、ＷＴ ＥＧＦＰ及びＥＧＦＰＲ４Ｗ３をｐＨ感受性色素ＮＦで標識し、標識タンパク質で処理したＨｅＬａ細胞を再びＮＦチャンネルでフローサイトメトリーによって解析した。ＮＦ標識したＷＴ ＥＧＦＰとＥＧＦＰＲ４Ｗ３の両方で検出可能な細胞内蛍光が得られたことから、いずれのタンパク質もＨｅＬａ細胞のサイトゾルに入ったことが示唆される。ＥＧＦＰＲ４Ｗ３で処理した細胞は、ＷＴ ＥＧＦＰで処理した細胞よりも約２倍高い蛍光を示した（データ示さず）。同じ条件下で、非標識ＥＧＦＰタンパク質で処理した細胞は、本質的にバックグラウンドのＮＦシグナルを有したことから、ＥＧＦＰの固有の蛍光がＮＦシグナルと干渉しないことが確認された。ＥＧＦＰＷ３Ｒ３の細胞侵入がＥＧＦＰＲ３Ｗ３よりも劣るのは、前者のループ９に２つの負電荷残基が存在すること（表５）、ＲＲＲＷＷＷ（配列番号１２４）よりもＷＷＷＲＲＲ（配列番号１２３）による膜結合の効率が低いこと、またはその両方によって生じるものと思われる。
【0150】
実施例６：酵素補充療法の候補としてのプリンヌクレオシドホスホリラーゼの細胞内送達
ＰＮＰのホモ三量体構造の調査により、これも活性部位から遠位にある３つの溶媒露出ループ、すなわち、Ｈｉｓ２０－Ｐｒｏ２５、Ａｓｎ７４－Ｇｌｙ７５、及びＧｌｙ１８２－Ｌｅｕ１８７が明らかになった（ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｙｃｌｏｖｉｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３，３０８，５５３－５５９）。これらのループ領域のそれぞれにＣＰＰモチーフＲＲＲＲＷＷＷ（配列番号１１８）を挿入して、３つのＰＮＰバリアントを作製した（表６）。３番目の挿入変異体（１８２～１８７）については、酸性残基（Ｇｌｕ１８３）を除去して、ループ配列の全体的な正電荷を最大にした。異なる導入条件下でのパイロット発現実験により、部位１または２でのＣＰＰ挿入では、不溶性タンパク質が得られ、一方、部位３での挿入では、部分的に可溶性のタンパク質ＰＮＰ３Ｒが生成されたことが明らかになり、ＰＮＰ３Ｒを野生型ＰＮＰと同じ手順に従ってほぼ均質になるまで精製した。ＰＮＰ３Ｒは、野生型酵素と同様の触媒活性を有する（表６）。
ＰＮＰのホモ三量体構造の調査により、これも活性部位から遠位にある３つの溶媒露出ループ、すなわち、Ｈｉｓ２０－Ｐｒｏ２５、Ａｓｎ７４－Ｇｌｙ７５、及びＧｌｙ１８２－Ｌｅｕ１８７が明らかになった（ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｙｃｌｏｖｉｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３，３０８，５５３－５５９）。これらのループ領域のそれぞれにＣＰＰモチーフＲＲＲＲＷＷＷ（配列番号１１８）を挿入して、３つのＰＮＰバリアントを作製した（表６）。３番目の挿入変異体（１８２～１８７）については、酸性残基（Ｇｌｕ１８３）を除去して、ループ配列の全体的な正電荷を最大にした。異なる導入条件下でのパイロット発現実験により、部位１または２でのＣＰＰ挿入では、不溶性タンパク質が得られ、一方、部位３での挿入では、部分的に可溶性のタンパク質ＰＮＰ３Ｒが生成されたことが明らかになり、ＰＮＰ３Ｒを野生型ＰＮＰと同じ手順に従ってほぼ均質になるまで精製した。ＰＮＰ３Ｒは、野生型酵素と同様の触媒活性を有する（表６）。
【0151】
【表12】
【0152】
ＰＮＰ３Ｒの細胞侵入は、まず、５μＭのフルオレセイン標識ＰＮＰ３Ｒまたは野生型ＰＮＰ（ＰＮＰＷＴ）でＨｅＬａ細胞を５時間処理し、生細胞共焦点顕微鏡によって細胞をイメージングすることで調べた。ＰＮＰ３Ｒで処理した細胞は、細胞内部に容易に視認可能な緑色蛍光シグナルを示したが、ＰＮＰＷＴで処理した細胞は、同じ実験条件下で、検出可能な蛍光を示さなかった（図１４Ａ）。なお、タンパク質の沈殿または変性を最小限に抑えるために、タンパク質は、意図的に低い化学量論（０．１～０．２色素／タンパク質）で標識したことに留意されたい。ＰＮＰ３Ｒの細胞侵入効率を更に評価するために、ＰＮＰ欠損マウスＴリンパ球（ＮＳＵ－１）を１μＭのＰＮＰＷＴまたはＰＮＰ３Ｒで２時間処理し、徹底的に洗浄して細胞外タンパク質を除去した。細胞を溶解し、サイトゾル画分におけるＰＮＰ活性を、市販のＰＮＰ酵素アッセイキットを使用して定量した。未処理のＮＳＵ－１細胞は有意なＰＮＰ活性を有しないが、ＰＮＰ３ＲによるＮＳＵ－１細胞の処理は、正常Ｓ４９細胞（１００％）よりも１．３５倍高いＰＮＰ活性となった（図１４Ｂ）。同じ条件下で、ＰＮＰＷＴで処理したＮＳＵ－１細胞は、Ｓ４９細胞と比べて１６％の活性を示した。後者の活性は、ＮＳＵ－１細胞が非付着性細胞であり、洗浄中に細胞外液を完全に除去することが困難であったことから、洗浄手順による細胞外ＰＮＰ活性の除去が不完全であったことに起因すると思われる。
【0153】
最後に、ＰＮＰ欠損によって生じるＮＳＵ－１細胞の代謝欠陥をＰＮＰ３Ｒが修正する能力について試験した。ＰＮＰ欠損細胞（例えば、ＮＳＵ－１）は、デオキシグアノシン（ｄＧ）毒性に感受性である。図１４Ｃに示されるように、ＮＳＵ－１細胞は、２５μＭのｄＧの存在下では成長できなかったが、ｄＧの不在下では、細胞密度が７２時間で１×１０５から２．３×１０６細胞／ｍＬに増加した。ＮＳＵ－１細胞を３μＭのＰＮＰ３Ｒで６時間前処理し、徹底的に洗浄してあらゆる細胞外ＰＮＰ３Ｒを除去し、次いで、２５μＭのｄＧで刺激した場合、未処理細胞（ｄＧなし、タンパク質なし）と同様の成長曲線を示した。同じ条件下で、ＰＮＰＷＴで処理したＮＳＵ－１細胞は、未処理の対照と比べてごくわずかな成長（１３％）しか示さなかったが、これは、成長培地からのＰＮＰＷＴの不完全な除去に起因すると思われる。したがって、ＰＮＰＷＴではなく、ＰＮＰ３Ｒが、ＰＮＰ欠損細胞をｄＧ毒性から効果的に救済することができる。ＰＮＰ３Ｒは、新規の細胞内酵素補充療法として更に発展する可能性がある。これまでの酵素補充療法は全て細胞外酵素またはリソソーム酵素を伴うものであった（Ｃｏｎｃｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ：ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｉｔａｌ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．２０１８，４４，１２０）。
【0154】
実施例７：ループ挿入変異体の血清安定性
両親媒性ＣＰＰ配列（例えば、ＲＲＲＲＷＷＷ（配列番号１１８））を表面ループに挿入すると、タンパク質の熱力学的安定性が低下するだけでなく、プロテアーゼ（例えば、トリプシン及びキモトリプシン）に対する新しい切断部位候補が生じる可能性がある。どちらの要因も変異体タンパク質の代謝安定性を潜在的に低下させる可能性がある。野生型ＥＧＦＰ、ＰＴＰ１Ｂ、及びＰＮＰならびにその生物学的に活性な変異体のタンパク質分解安定性を、ヒト血清中で様々な時間（０～１６時間）インキュベートし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析によって、残ったインタクトタンパク質の量を定量することによって試験した。野生型タンパク質は全て血清中で非常に安定しており、１６時間を超えるｔ１／２値を示した（図１５）。試験した７つの変異体タンパク質のうち、ＥＧＦＰＷ３Ｒ３、ＥＧＦＰＲ３Ｗ３、ＥＧＦＰＲ４Ｗ３、ＰＴＰ１Ｂ２Ｒ、ＰＴＰ１Ｂ４Ｒ、及びＰＮＰ３Ｒは、野生型対応物と比べて、同等かまたはわずかに低下した安定性を示し、ＰＴＰ１Ｂ１Ｗのみが野生型タンパク質よりも迅速な分解を示した（ｔ１／２≦５時間）。ＰＮＰの残余酵素活性をインキュベーション時間の関数としてモニタリングした場合にも、同様の結果が得られた（図１６）。線状ＣＰＰ配列は、一般に、非常に短い血清半減期（典型的に≦３０分）を有するので（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅａｒｌｙ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ａ Ｃｙｃｌｉｃ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｌｌｏｗｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｃａｒｇｏ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，５３，４０３４－４０４６及びＱｉａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ ＰＤＺ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ Ｒｅｓｃｕｅｓ ＣＦＴＲ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５４，５８７４－５８７８）、これらのデータは、変異体タンパク質の全体的な安定性は、特定のＣＰＰ配列、挿入部位、及び宿主タンパク質の性質に依存する可能性はあるが、両親媒性ＣＰＰ配列をタンパク質ループに挿入すると、タンパク質分解安定性が大幅に向上し、代謝的に安定な変異体タンパク質が生成されることを示している。
両親媒性ＣＰＰ配列（例えば、ＲＲＲＲＷＷＷ（配列番号１１８））を表面ループに挿入すると、タンパク質の熱力学的安定性が低下するだけでなく、プロテアーゼ（例えば、トリプシン及びキモトリプシン）に対する新しい切断部位候補が生じる可能性がある。どちらの要因も変異体タンパク質の代謝安定性を潜在的に低下させる可能性がある。野生型ＥＧＦＰ、ＰＴＰ１Ｂ、及びＰＮＰならびにその生物学的に活性な変異体のタンパク質分解安定性を、ヒト血清中で様々な時間（０～１６時間）インキュベートし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析によって、残ったインタクトタンパク質の量を定量することによって試験した。野生型タンパク質は全て血清中で非常に安定しており、１６時間を超えるｔ１／２値を示した（図１５）。試験した７つの変異体タンパク質のうち、ＥＧＦＰＷ３Ｒ３、ＥＧＦＰＲ３Ｗ３、ＥＧＦＰＲ４Ｗ３、ＰＴＰ１Ｂ２Ｒ、ＰＴＰ１Ｂ４Ｒ、及びＰＮＰ３Ｒは、野生型対応物と比べて、同等かまたはわずかに低下した安定性を示し、ＰＴＰ１Ｂ１Ｗのみが野生型タンパク質よりも迅速な分解を示した（ｔ１／２≦５時間）。ＰＮＰの残余酵素活性をインキュベーション時間の関数としてモニタリングした場合にも、同様の結果が得られた（図１６）。線状ＣＰＰ配列は、一般に、非常に短い血清半減期（典型的に≦３０分）を有するので（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅａｒｌｙ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ａ Ｃｙｃｌｉｃ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｌｌｏｗｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｃａｒｇｏ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，５３，４０３４－４０４６及びＱｉａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ ＰＤＺ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ Ｒｅｓｃｕｅｓ ＣＦＴＲ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５４，５８７４－５８７８）、これらのデータは、変異体タンパク質の全体的な安定性は、特定のＣＰＰ配列、挿入部位、及び宿主タンパク質の性質に依存する可能性はあるが、両親媒性ＣＰＰ配列をタンパク質ループに挿入すると、タンパク質分解安定性が大幅に向上し、代謝的に安定な変異体タンパク質が生成されることを示している。
【0155】
参照による援用
本明細書で引用される全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により援用される。しかしながら、本明細書で引用される任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願の言及は、世界のいかなる国においても、それらが有効な先行技術を構成すること、または共通の一般知識の一部を形成することに対して、承認または任意の形式の提案をなすものではなく、かつそう解釈されるべきではない。
本明細書で引用される全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により援用される。しかしながら、本明細書で引用される任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願の言及は、世界のいかなる国においても、それらが有効な先行技術を構成すること、または共通の一般知識の一部を形成することに対して、承認または任意の形式の提案をなすものではなく、かつそう解釈されるべきではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】