知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司の特許一覧 ▶ 上海恒瑞医薬有限公司の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-07
(54)【発明の名称】ピリドピリミジン系誘導体の結晶形及びその調製方法
(51)【国際特許分類】
C07D 471/04 20060101AFI20230228BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20230228BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20230228BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20230228BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20230228BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20230228BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230228BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230228BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230228BHJP
【ＦＩ】
C07D471/04 118Z
C07D471/04 CSP
A61K31/519
A61P31/16
A61P31/18
A61P31/22
A61P31/20
A61P37/02
A61P35/00
A61P31/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022540974
(86)(22)【出願日】2020-12-31
(85)【翻訳文提出日】2022-07-01
(86)【国際出願番号】 CN2020142037
(87)【国際公開番号】W WO2021136488
(87)【国際公開日】2021-07-08
(31)【優先権主張番号】202010002822.9
(32)【優先日】2020-01-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519352757
【氏名又は名称】江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡ ＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】ＮＯ．７ ＫＵＮＬＵＮＳＨＡＮ ＲＯＡＤ， ＥＣＯＮＯＭＩＣ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＺＯＮＥ， ＬＩＡＮＹＵＮＧＡＮＧ， ＪＩＡＮＧＳＵ ２２２０４７， ＣＨＩＮＡ
(71)【出願人】
【識別番号】516174208
【氏名又は名称】上海恒瑞医薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】ＮＯ． ２７９ ＷＥＮＪＩＮＧ ＲＯＡＤ， ＭＩＮＨＡＮＧ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２００２４５， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】▲呉▼ ▲チー▼
(72)【発明者】
【氏名】杜 振▲興▼
(72)【発明者】
【氏名】王 捷
(72)【発明者】
【氏名】王 林
(72)【発明者】
【氏名】▲陸▼ ▲偉▼▲棟▼
(72)【発明者】
【氏名】邵 ▲啓▼云
(72)【発明者】
【氏名】▲馮▼ 君
(72)【発明者】
【氏名】▲賀▼ 峰
【テーマコード（参考）】
4C065
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C065AA04
4C065BB10
4C065CC01
4C065DD03
4C065EE02
4C065HH02
4C065LL06
4C065LL07
4C065PP12
4C065PP15
4C065QQ07
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086AA04
4C086CB10
4C086GA15
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB07
4C086ZB26
4C086ZB33
4C086ZC41
4C086ZC55
(57)【要約】
本開示は、ピリドピリミジン系誘導体の結晶形及びその調製方法に関し、具体的には、本開示は、式（Ｉ）で表される化合物の結晶形及び調製方法に関する。本開示の新規な結晶形は、良好な物理化学的特性を有し、臨床治療により有利となる。
【化１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
粉末Ｘ線回折パターンは、８．６１０、９．７４０、１３．９０３、１５．３１３、１６．３５４、１７．６７５、１７．８７９、１９．１８４、１９．９０５、２０．９０１、２１．３６５、２２．３１９及び２３．０５７の２θ角に特徴的なピークを有する、 式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形：【化1】
【請求項2】
粉末Ｘ線回折パターンは、８．６１０、９．７４０、１０．９４９、１３．３１４、１３．９０３、１５．３１３、１６．０６０、１６．３５４、１６．７９４、１７．６７５、１７．８７９、１９．１８４、１９．９０５、２０．９０１、２１．３６５、２２．３１９、２３．０５７、２３．７４８、２４．４３０、２５．４２８、２６．５７６、２７．２７０、２７．８６３、２８．９５７、２９．８４２及び３１．５０６の２θ角に特徴的なピークを有する、請求項１に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形。
【請求項3】
粉末Ｘ線回折パターンは、図２に示される、請求項１に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形。
【請求項4】
粉末Ｘ線回折パターンは、４．６０、８．７７、９．９０、１３．８６、１５．４５、１６．４４、１７．７４、１８．０３、１９．３１、１９．９１、２１．０７、２１．５２、２２．４８及び２３．２２の２θ角に特徴的なピークを有する、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形：
【化2】
【請求項5】
粉末Ｘ線回折パターンは、４．６０、８．７７、９．２０、９．９０、１１．１７、１３．８６、１４．５１、１５．４５、１６．４４、１７．７４、１８．０３、１８．１９、１８．５１、１９．３１、１９．９１、２０．０７、２１．０７、２１．５２、２２．４８、２３．２２、２４．００、２４．６１、２５．６４、２６．７８、２７．４３、２８．０４、２９．３１、３１．２１、３２．０９、３２．５７、３３．２３及び３４．０１の２θ角に特徴的なピークを有する、請求項４に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形。
【請求項6】
粉末Ｘ線回折パターンは、図４に示される、請求項４に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形。
【請求項7】
前記２θ角の許容差範囲は±０．２である、請求項１～６の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物の結晶形。
【請求項8】
式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、揮発させて結晶化させるステップであって、前記溶媒は、メタノール、ｎ－ヘプタン、シクロヘキサン、ｎ－ヘキサン、石油エーテル及びｎ－プロパノールの１種又は複数種から選ばれるステップ、又は、式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、昇温溶解し、降温して結晶化させるステップであって、前記溶媒は酢酸エチルであるステップを含む、請求項１～３の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形の調製方法。
【請求項9】
式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、揮発させて結晶化させるステップであって、前記溶媒は、水、イソプロパノール、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトフェノン、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種から選ばれるステップ、又は、式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、昇温溶解し、降温して結晶化させるステップであって、前記溶媒は、イソプロパノール又はジメチルスルホキシドから選ばれるステップを含む、請求項４～６の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形の調製方法。
【請求項10】
請求項１～３の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形及び／又は請求項４～６の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形、及び１種又は複数種の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項11】
請求項１～３の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形及び／又は請求項４～６の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形と１種又は複数種の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の混合によって調製して得られる、医薬組成物。
【請求項12】
ＴＬＲ８をアゴナイズするための薬剤の調製における請求項１～７の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形若しくはＢ結晶形又は請求項１０、１１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項13】
ウイルスによって引き起こされる感染症を治療するための薬剤の調製における請求項１～７の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形若しくはＢ結晶形又は請求項１０、１１に記載の医薬組成物の使用であって、前記ウイルスは、好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス及びヒト免疫不全ウイルスの１種又は複数種である、使用。
【請求項14】
免疫系を調節するための薬剤の調製における請求項１～７の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形若しくはＢ結晶形又は請求項１０、１１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項15】
腫瘍を治療又は予防するための薬剤の調製における請求項１～７の何れか１項に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形若しくはＢ結晶形又は請求項１０、１１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項16】
式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形及び／又はＢ結晶形を１種又は複数種の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と混合するステップを含む、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、出願日が２０２０年１月２日である中国特許出願ＣＮ２０２０１０００２８２２．９の優先権を主張する。上記中国特許出願の全文は本願に援用される。
【0002】
本開示は、ピリドピリミジン系誘導体の結晶形及びその調製方法に関し、具体的には式（Ｉ）で表される化合物の結晶形及び調製方法に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｔｏｌｌ様受容体（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＬＲｓ）は、先天性免疫に関与する重要な受容体である。ＴＬＲｓは、マクロファージ細胞及び樹状細胞のような歩哨細胞において通常発現され、微生物から産生される構造的に保存された分子を認識できる単量体の膜貫通非触媒受容体である。これらの微生物が皮膚又は腸粘膜のような物理的障壁を一旦突破すると、ＴＬＲｓによって認識され、更に免疫細胞応答を活性化する（Ｍａｈｌａ，Ｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２４８（２０１３））。免疫系が病原微生物を広く認識する能力を有するのは、ある程度、Ｔｏｌｌ様免疫受容体が広く存在しているためである。
【0004】
哺乳動物において少なくとも１０種類の異なるＴＬＲｓを有する。いくつかのこのような受容体のリガンド及び対応する信号伝達カスケードは、既に同定された。ＴＬＲ８は、ＴＬＲｓ（ＴＬＲｓ３、７、８及び９）サブグループのメンバーであり、非自己核酸を一意に認識する細胞のエンドソームコンパートメントに局在する。ＴＬＲ８は、ヒトにおいて主に単核細胞、ＮＫ細胞及び骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）によって発現される。ＴＬＲ８アゴニストは、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γなどの種々の異なる炎症誘発性サイトカインの放出を引き起こすことができる。
【0005】
ＴＬＲ８は、生体の自然免疫及び獲得免疫においていずれも重要な役割を果たしている。ＴＬＲ８アゴニストは、免疫調節剤として、卵巣癌、黒色腫、非小細胞肺癌、肝細胞癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎細胞癌、骨髄腫、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、潰瘍性結腸炎、肝線維症、ＨＢＶ、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ウイルス、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ、ＨＩＶ又はインフルエンザのウイルス感染などの免疫に関連する種々の異なる疾患の治療に用いることができる。
【0006】
ＴＬＲ８がＴＬＲ７と高い相同性を有するため、ＴＬＲ８アゴニストは多くの場合、ＴＬＲ７アゴニストでもある。従って、ＴＬＲ８とＴＬＲ７の二重アゴニストは、例えばＷＯ２００９１１１３３７、ＷＯ２０１１０１７６１１、ＷＯ２０１１０６８２３３、ＷＯ２０１１１３９３４８、ＷＯ２０１２０６６３３６、ＷＯ２０１３０３３３４５及びＷＯ２０１７０４６１１２のような多くの特許において報告されている。ＴＬＲ８選択的アゴニストについての報告が少なく、主にＶｅｎｔｉＲＸ社のＶＴＸ－２３３７（ＷＯ２００７０２４６１２）及びＧｉｌｅａｄ社のＧＳ－９６８８（ＷＯ２０１６１４１０９２）があるが、この２つの化合物は、ＴＬＲ７に対して依然として一定の活性を有し、Ｃｙｐ及びｈＥＲＧに対して選択性も悪い。従って、安全且つ治療的により効果的なＴＬＲ８アゴニストの研究及び開発を続ける必要がなおある。
【0007】
ＷＯ２０２０００７２７５（出願番号ＰＣＴ／ＣＮ／２０１９／０９４３１０）は、式（Ｉ）で表される化合物に関し、当該化合物は（Ｒ）－２－（（２－アミノ－７－（６－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）ピリジン－３－イル）ピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オールという化学名の新型ＴＬＲ８アゴニストであり、臨床有効性又は適応症、及び安全性などの点でいずれも改善され、その構造が下記のとおりである：
【0008】
【化1】
【0009】
薬学的活性成分の結晶構造は、薬剤の化学的安定性に影響を与える傾向があり、結晶化条件及び保存条件によっては化合物の結晶構造を変化させる可能性があり、他の形態の結晶形の生成を伴うこともある。一般的には、非晶質の薬剤製品は、規則的な結晶構造を有さず、例えば生成物安定性が悪く、析出した結晶が細かく、濾過しにくく、固結しやすく、流動性に劣るなどの他の欠陥を有する傾向がある。従って、上記生成物の様々な性質を改善する必要があるため、結晶形の純度が高くて良好な化学的安定性を有する新規な結晶形を発見するために深く検討する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】国際公開第２００９／１１１３３７号
【特許文献2】国際公開第２０１１／０１７６１１号
【特許文献3】国際公開第２０１１／０６８２３３号
【特許文献4】国際公開第２０１１／１３９３４８号
【特許文献5】国際公開第２０１２／０６６３３６号
【特許文献6】国際公開第２０１３／０３３３４５号
【特許文献7】国際公開第２０１７／０４６１１２号
【特許文献8】国際公開第２００７／０２４６１２号
【特許文献9】国際公開第２０１６／１４１０９２号
【特許文献10】国際公開第２０２０／００７２７５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本開示は、良好な安定性を有し、臨床により良く適用できる式（Ｉ）で表される化合物の新規な結晶形を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本開示の一態様は、粉末Ｘ線回折パターンが８．６１０、９．７４０、１３．９０３、１５．３１３、１６．３５４、１７．６７５、１７．８７９、１９．１８４、１９．９０５、２０．９０１、２１．３６５、２２．３１９及び２３．０５７の２θ角に特徴的なピークを有する、式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形を提供する：
【0013】
【化2】
【0014】
いくつかの実施形態において、本開示は、粉末Ｘ線回折パターンが８．６１０、９．７４０、１０．９４９、１３．３１４、１３．９０３、１５．３１３、１６．０６０、１６．３５４、１６．７９４、１７．６７５、１７．８７９、１９．１８４、１９．９０５、２０．９０１、２１．３６５、２２．３１９、２３．０５７、２３．７４８、２４．４３０、２５．４２８、２６．５７６、２７．２７０、２７．８６３、２８．９５７、２９．８４２及び３１．５０６の２θ角に特徴的なピークを有する、式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形を提供する。
【0015】
いくつかの実施形態において、本開示は、粉末Ｘ線回折パターンが図２に示される、式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形を提供する。
【0016】
本開示は、
式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、揮発させて結晶化させるステップであって、前記溶媒は、メタノール、ｎ－ヘプタン、シクロヘキサン、ｎ－ヘキサン、石油エーテル、ｎ－プロパノールの１種又は複数種であってもよいステップ、又は、
式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、昇温溶解し、降温して結晶化させるステップであって、前記溶媒は酢酸エチルであってもよいステップを含む、上記式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形の調製方法を更に提供する。
式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、揮発させて結晶化させるステップであって、前記溶媒は、メタノール、ｎ－ヘプタン、シクロヘキサン、ｎ－ヘキサン、石油エーテル、ｎ－プロパノールの１種又は複数種であってもよいステップ、又は、
式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、昇温溶解し、降温して結晶化させるステップであって、前記溶媒は酢酸エチルであってもよいステップを含む、上記式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形の調製方法を更に提供する。
【0017】
本開示の一態様は、粉末Ｘ線回折パターンが４．６０、８．７７、９．９０、１３．８６、１５．４５、１６．４４、１７．７４、１８．０３、１９．３１、１９．９１、２１．０７、２１．５２、２２．４８及び２３．２２の２θ角に特徴的なピークを有する、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形を提供する：
【0018】
【化3】
【0019】
いくつかの実施形態において、本開示は、粉末Ｘ線回折パターンが４．６０、８．７７、９．２０、９．９０、１１．１７、１３．８６、１４．５１、１５．４５、１６．４４、１７．７４、１８．０３、１８．１９、１８．５１、１９．３１、１９．９１、２０．０７、２１．０７、２１．５２、２２．４８、２３．２２、２４．００、２４．６１、２５．６４、２６．７８、２７．４３、２８．０４、２９．３１、３１．２１、３２．０９、３２．５７、３３．２３及び３４．０１の２θ角に特徴的なピークを有する、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形を提供する。
【0020】
いくつかの実施形態において、本開示は、粉末Ｘ線回折パターンが図４に示される、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形を提供する。
【0021】
本開示は、
式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、揮発させて結晶化させるステップであって、前記溶媒は、水、イソプロパノール、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトフェノン、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種であってもよいステップ、又は、
式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、昇温溶解し、降温して結晶化させるステップであって、前記溶媒は、イソプロパノール又はジメチルスルホキシドであってもよいステップを含む、上記式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形の調製方法を更に提供する。
式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、揮発させて結晶化させるステップであって、前記溶媒は、水、イソプロパノール、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトフェノン、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種であってもよいステップ、又は、
式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒と混合し、昇温溶解し、降温して結晶化させるステップであって、前記溶媒は、イソプロパノール又はジメチルスルホキシドであってもよいステップを含む、上記式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形の調製方法を更に提供する。
【0022】
粉末Ｘ線回折パターン（ＸＲＰＤ）、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）によって本開示のように得られた結晶形に構造決定、結晶形の研究を行う。
【0023】
いくつかの実施形態において、いくつかの溶媒を用いて調製してＡ結晶形とＢ結晶形の混晶を得ることができ、例えば、式（Ｉ）で表される化合物を適量の溶媒（例えば、アセトン、酢酸イソプロピル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、２－ブタノン、メチルイソブチルケトン、ニトロメタン、酢酸エチル／ｎ－ヘプタン、酢酸ブチル、パラキシレン、プロピレングリコールモノメチルエーテル、イソアミルアルコール、水／エタノール、水／アセトン、酢酸エチル／エタノール、クロロホルムなど）と混合し、揮発させて結晶化させて得られる。その粉末Ｘ線回折パターンは、図６に示される。
【0024】
本開示に係る結晶形の晶析方法は、例えば揮発による晶析、降温による晶析又は室温下での晶析のような従来のものである。
【0025】
本開示に係る結晶形の調製方法で使用される出発原料は、任意の形態の式（Ｉ）で表される化合物であってもよく、具体的な形態は、非晶質、任意の結晶形、水和物、溶媒和物などを含むが、これらに限定されない。
【0026】
本開示は、上記式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形及び／又はＢ結晶形、及び１種又は複数種の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む、医薬組成物を更に提供する。
【0027】
本開示は、上記式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形及び／又はＢ結晶形と１種又は複数種の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の混合によって調製して得られる、医薬組成物を更に提供する。
【0028】
本開示は、上記式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形及び／又はＢ結晶形を１種又は複数種の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と混合するステップを含む、医薬組成物の調製方法を更に提供する。
【0029】
本開示は、ＴＬＲ８をアゴナイズするための薬剤の調製における本開示に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形若しくはＢ結晶形又は医薬組成物の使用を更に提供する。
【0030】
本開示は、ウイルスによって引き起こされる感染症を治療するための薬剤の調製における本開示に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形若しくはＢ結晶形又は医薬組成物の使用であって、前記ウイルスが好ましくはＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス及びヒト免疫不全ウイルスの１種又は複数種である使用を更に提供する。
【0031】
本開示は、免疫系を調節するための薬剤の調製における本開示に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形若しくはＢ結晶形又は医薬組成物の使用を更に提供する。
【0032】
本開示は、腫瘍を治療又は予防するための薬剤の調製における本開示に記載の式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形若しくはＢ結晶形又は医薬組成物の使用を更に提供する。
【0033】
本願の明細書及び特許請求の範囲において、別途説明がない限り、本明細書で使用される科学及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。しかし、本開示をより良く理解するように、以下にいくつかの関連する用語の定義及び解釈が提供される。なお、本願により提供される用語の定義及び解釈が当業者によって一般的に理解される意味と矛盾する場合、本願により提供される用語の定義及び解釈が優先するものとする。
【0034】
本開示に記載の「スラリー化」とは、溶媒における物質の溶解性が悪いが、溶媒における不純物の溶解性が良いという特性を利用して精製する方法を指し、スラリー化による精製は、脱色し、結晶形を変更し又は少量の不純物を除去することができる。
【0035】
本開示に記載の「粉末Ｘ線回折パターン又はＸＲＰＤ」とは、ブラッグ式２ｄｓｉｎθ＝ｎλ（式において、λはＸ線の波長であり、回折の次数ｎは、任意の正の整数であり、通常、１次回折ピークを取り、ｎ＝１）に基づき、Ｘ線が掃引角θ（入射角の余角、ブラッグ角とも呼ばれる）で結晶に入射し、又は一部の結晶試料におけるｄ格子面間距離を有する特定の原子面に入射する場合、ブラッグ式を満たすことができ、これにより、この組の粉末Ｘ線回折パターンを測定することを意味する。
【0036】
本開示に記載の「粉末Ｘ線回折パターン又はＸＲＰＤ」は、粉末Ｘ線回折計においてＣｕ－Ｋα放射を使用することによって得られたパターンである。
【0037】
本開示に記載の「示差走査熱量分析又はＤＳＣ」とは、試料の昇温又は恒温中、熱効果に関連する全ての物理的変化及び化学的変化を特徴付け、試料の相転移情報を取得するために、試料と参照物との間の温度差及び熱流差を測定することを指す。
【0038】
本開示に記載の「２θ又は２θ角度」とは、回折角を指し、θはブラッグ角であり、単位は°又は度であり、２θの許容差範囲は±０．３、±０．２又は±０．１である。
【0039】
本開示に記載の「格子面間隔又は格子面間隔（ｄ値）」とは、空間格子において互いに平行ではなく、隣接する２つの格子の点を連結する３つの単位ベクトルａ、ｂ、ｃを選択し、この３つの単位ベクトルが格子を並置された平行六面体単位に分割することを指し、格子面間隔と呼ばれる。空間格子は、決定された平行六面体単位で結線して分割され、１組の直線格子が得られ、空間格子又は結晶格子と呼ばれる。格子及び結晶格子は、それぞれ幾何学的な点及び線で結晶構造の周期性を反映し、異なる結晶面は、その面間隔（即ち、隣接する２つの平行結晶面間の距離）がそれぞれ異なり、単位は、Å又はオングストロームである。
【発明の効果】
【0040】
本発明の有益な効果
本開示で調製された式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形、Ｂ結晶形は、純度が高く、光照射、高温、高湿の条件で結晶形の安定性が良好であり、ＨＰＬＣ純度の変化が小さく、物理化学的安定性が高く、原料の保存及び使用により有利となる。
本開示で調製された式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形、Ｂ結晶形は、純度が高く、光照射、高温、高湿の条件で結晶形の安定性が良好であり、ＨＰＬＣ純度の変化が小さく、物理化学的安定性が高く、原料の保存及び使用により有利となる。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1】式（Ｉ）で表される化合物の非晶質のＸＲＰＤパターンである。
【図2】式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形のＸＲＰＤパターンである。
【図3】式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形のＤＳＣパターンである。
【図4】式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形のＸＲＰＤパターンである。
【図5】式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形のＤＳＣパターンである。
【図6】式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形とＢ結晶形の混晶のＸＲＰＤパターンである。
【発明を実施するための形態】
【0042】
以下、実施例と組み合わせて本開示をより詳しく説明するが、本開示の実施例は、本開示の技術案を説明するものに過ぎず、本開示の実質や範囲を限定するものではない。
【0043】
試験に使用される機器の試験条件：
【0044】
１、示差走査型熱量計（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ，ＤＳＣ）
機器の型番：Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ １ ＳＴＡＲｅ Ｓｙｓｔｅｍ。
パージガス：窒素。
昇温速度：１０．０℃／ｍｉｎ。
温度範囲：４０～３００℃。
機器の型番：Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ １ ＳＴＡＲｅ Ｓｙｓｔｅｍ。
パージガス：窒素。
昇温速度：１０．０℃／ｍｉｎ。
温度範囲：４０～３００℃。
【0045】
２、示差走査型熱量計（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ，ＤＳＣ）
機器の型番：Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ ３＋。
パージガス：窒素。
昇温速度：１０．０℃／ｍｉｎ。
温度範囲：２５～３００℃。
機器の型番：Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ ３＋。
パージガス：窒素。
昇温速度：１０．０℃／ｍｉｎ。
温度範囲：２５～３００℃。
【0046】
３、Ｘ線回折スペクトル（Ｘ－ｒａｙ Ｐｏｗｄｅｒ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ，ＸＲＰＤ）
機器の型番：ＢＲＵＫＥＲ Ｄ８ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ 粉末Ｘ線回折計。
放射線：単色Ｃｕ－Ｋα放射線（Ｃｕ－Ｋα１の波長は１．５４０６Åであり、Ｃｕ－Ｋα２の波長は１．５４４３９Åであり、Ｃｕ－Ｋαの波長は、Ｋα１とＫα２の加重平均値λ＝１．５４１８Åを取る）。
走査方式：θ／２θ、走査範囲：５～４８°。
電圧：４０ＫＶ、電流：４０ｍＡ。
機器の型番：ＢＲＵＫＥＲ Ｄ８ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ 粉末Ｘ線回折計。
放射線：単色Ｃｕ－Ｋα放射線（Ｃｕ－Ｋα１の波長は１．５４０６Åであり、Ｃｕ－Ｋα２の波長は１．５４４３９Åであり、Ｃｕ－Ｋαの波長は、Ｋα１とＫα２の加重平均値λ＝１．５４１８Åを取る）。
走査方式：θ／２θ、走査範囲：５～４８°。
電圧：４０ＫＶ、電流：４０ｍＡ。
【0047】
４、Ｘ線回折スペクトル（Ｘ－ｒａｙ Ｐｏｗｄｅｒ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ，ＸＲＰＤ）
機器の型番：ＢＲＵＫＥＲ Ｄ８ Ｆｏｃｕｓ 粉末Ｘ線回折計。
放射線：単色Ｃｕ－Ｋα放射線（Ｃｕ－Ｋα１の波長は１．５４０６Åであり、Ｃｕ－Ｋα２の波長は１．５４４３９Åであり、Ｃｕ－Ｋαの波長は、Ｋα１とＫα２の加重平均値λ＝１．５４１８Åを取る）。
走査方式：θ／２θ、走査範囲：２～４０°。
電圧：４０ＫＶ、電流：４０ｍＡ。
機器の型番：ＢＲＵＫＥＲ Ｄ８ Ｆｏｃｕｓ 粉末Ｘ線回折計。
放射線：単色Ｃｕ－Ｋα放射線（Ｃｕ－Ｋα１の波長は１．５４０６Åであり、Ｃｕ－Ｋα２の波長は１．５４４３９Åであり、Ｃｕ－Ｋαの波長は、Ｋα１とＫα２の加重平均値λ＝１．５４１８Åを取る）。
走査方式：θ／２θ、走査範囲：２～４０°。
電圧：４０ＫＶ、電流：４０ｍＡ。
【0048】
そのうち、２θが小数２位を保留するデータは、ＢＲＵＫＥＲ Ｄ８ Ｆｏｃｕｓ粉末Ｘ線回折計によって測定される。
【0049】
実施例において、特に説明しない限り、反応はいずれもアルゴン雰囲気又は窒素雰囲気において行うことができる。
【0050】
アルゴン雰囲気又は窒素雰囲気とは、反応フラスコに容量約１Ｌのアルゴン又は窒素バルーンが接続されていることを指す。
【0051】
水素雰囲気とは、反応フラスコに容量約１Ｌの水素バルーンが接続されていることを指す。
【0052】
加圧水素化反応には、Ｐａｒｒ ３９１６ＥＫＸ型水素化装置及び清藍ＱＬ－５００型水素発生器又はＨＣ２－ＳＳ型水素化装置が使用される。
【0053】
水素化反応は、一般に真空排気して、水素を注入し、３回繰り返して操作する。
【0054】
マイクロ波反応には、ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ－Ｓ ９０８８６０型マイクロ波反応器が使用される。
【0055】
実施例において、特に説明しない限り、溶液とは水溶液を指す。
【0056】
実施例において、特に説明しない限り、反応温度は室温であり、２０℃～３０℃である。
【0057】
実施例における反応過程の監視は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により行われ、反応に使用される展開溶媒、化合物を精製するために使用されるカラムクロマトグラフィーの溶出液系及び薄層クロマトグラフィーの展開溶媒系は、Ａ：ジクロロメタン／メタノール系、Ｂ：ｎ－ヘキサン／酢酸エチル系、Ｃ：石油エーテル／酢酸エチル系を含み、溶剤の体積比は化合物の極性によって調節されるが、少量のトリエチルアミン及び酢酸などの塩基性又は酸性試薬を加えて調節されてもよい。
【0058】
実施例１
【0059】
【化4】
【0060】
ステップ１
（Ｒ）－２－（（７－ブロモ－２－クロロピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オール １ｃ
化合物１ａ（４００ｍｇ，１．４３４ｍｍｏｌ，特許出願ＷＯ２０１４０２２７２８に開示の方法によって調製して得られた）を１０ｍＬのテトラヒドロフランに加え、（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルヘキサン－１－オール１ｂ（３７７ｍｇ，２．８７３ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５５６ｍｇ，４．３０２ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で封管して撹拌して１６時間反応させ、反応が終了し、室温まで冷却させ、濾過して不溶解物を除去し、濾液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶出剤系Ａで得られた残留物を精製し、表題生成物１ｃ（４．０ｇ，収率５５．３％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：３７３．１［Ｍ＋１］。
（Ｒ）－２－（（７－ブロモ－２－クロロピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オール １ｃ
化合物１ａ（４００ｍｇ，１．４３４ｍｍｏｌ，特許出願ＷＯ２０１４０２２７２８に開示の方法によって調製して得られた）を１０ｍＬのテトラヒドロフランに加え、（Ｒ）－２－アミノ－２－メチルヘキサン－１－オール１ｂ（３７７ｍｇ，２．８７３ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５５６ｍｇ，４．３０２ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で封管して撹拌して１６時間反応させ、反応が終了し、室温まで冷却させ、濾過して不溶解物を除去し、濾液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶出剤系Ａで得られた残留物を精製し、表題生成物１ｃ（４．０ｇ，収率５５．３％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：３７３．１［Ｍ＋１］。
【0061】
ステップ２
（Ｒ）－２－（（７－ブロモ－２－（（２，４－ジメトキシベンジル）アミノ）ピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オール １ｄ
化合物１ｃ（２５０ｍｇ，０．６６９ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのテトラヒドロフランに加え、２，４－ジメトキシベンジルアミン（５６０ｍｇ，３．３４９ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２５９ｍｇ，２．００４ｍｍｏｌ）を加え、封管して１００℃で１６時間撹拌し、反応液に２０ｍＬの水を加え、ジクロロメタンで抽出し（２０ｍＬ×３）、有機相を合わせ、有機相をそれぞれ水（２０ｍＬ）、飽和塩化ナトリウム溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、濾液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶出剤系Ｂで得られた残留物を精製し、表題生成物１ｄ（２９５ｍｇ，収率８７．５％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５０４．１［Ｍ＋１］
（Ｒ）－２－（（７－ブロモ－２－（（２，４－ジメトキシベンジル）アミノ）ピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オール １ｄ
化合物１ｃ（２５０ｍｇ，０．６６９ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのテトラヒドロフランに加え、２，４－ジメトキシベンジルアミン（５６０ｍｇ，３．３４９ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２５９ｍｇ，２．００４ｍｍｏｌ）を加え、封管して１００℃で１６時間撹拌し、反応液に２０ｍＬの水を加え、ジクロロメタンで抽出し（２０ｍＬ×３）、有機相を合わせ、有機相をそれぞれ水（２０ｍＬ）、飽和塩化ナトリウム溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、濾液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶出剤系Ｂで得られた残留物を精製し、表題生成物１ｄ（２９５ｍｇ，収率８７．５％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：５０４．１［Ｍ＋１］
【0062】
ステップ３
（Ｒ）－２－（（２－（（２，４－ジメトキシベンジル）アミノ）－７－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オール １ｅ
化合物１ｄ（２９５ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）を５ｍＬのエチレングリコールジメチルエーテルに加え、ビス（ピナコラト）ジボロン（２２３ｍｇ，８７８．１６９μｍｏｌ）を加え、１，１′－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（４３ｍｇ，０．０５９ｍｍｏｌ）を加え、酢酸カリウム（１７３ｍｇ，１．７６ｍｍｏｌ）を加え、アルゴンガスを３回置換し、８０℃に昇温させて撹拌しながら２時間反応させた。反応液を減圧濃縮した後、反応系に２０ｍＬの水を加え、ジクロロメタンで抽出し（１０ｍＬ×３）、有機相を合わせ、有機相をそれぞれ水（２０ｍＬ）、飽和塩化ナトリウム溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、濾液を減圧濃縮して粗表題生成物１ｅ（３２２ｍｇ，収率１００％）を得た。
（Ｒ）－２－（（２－（（２，４－ジメトキシベンジル）アミノ）－７－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オール １ｅ
化合物１ｄ（２９５ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）を５ｍＬのエチレングリコールジメチルエーテルに加え、ビス（ピナコラト）ジボロン（２２３ｍｇ，８７８．１６９μｍｏｌ）を加え、１，１′－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（４３ｍｇ，０．０５９ｍｍｏｌ）を加え、酢酸カリウム（１７３ｍｇ，１．７６ｍｍｏｌ）を加え、アルゴンガスを３回置換し、８０℃に昇温させて撹拌しながら２時間反応させた。反応液を減圧濃縮した後、反応系に２０ｍＬの水を加え、ジクロロメタンで抽出し（１０ｍＬ×３）、有機相を合わせ、有機相をそれぞれ水（２０ｍＬ）、飽和塩化ナトリウム溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、濾液を減圧濃縮して粗表題生成物１ｅ（３２２ｍｇ，収率１００％）を得た。
【0063】
ステップ４
（Ｒ）－２－（（２－（（２，４－ジメトキシベンジル）アミノ）－７－（６－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）ピリジン－３－イル）ピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オール １ｇ
化合物１ｅ（６５０ｍｇ，１．１７８ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの１，４－ジオキサン及び４ｍＬの水に加え、１－（（５－ブロモピリジン－２－イル）メチル）－４－メチルピペラジン１ｆ（３１８ｍｇ，１．１７０ｍｍｏｌ，特許出願ＷＯ２００２００２６０５２に開示の方法によって調製して得られた）を加え、１，１′－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（８６ｍｇ，０．１１７ｍｍｏｌ）を加え、炭酸カリウム（４８９ｍｇ，３．５３８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴンガスを３回置換し、８０℃に昇温させて撹拌しながら２時間反応させた。反応液を減圧濃縮した後、反応系に３０ｍＬの水を加え、ジクロロメタンで抽出し（３０ｍＬ×３）、有機相を合わせ、有機相をそれぞれ水（３０ｍＬ）、飽和塩化ナトリウム溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、濾液を減圧濃縮してシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶出剤系Ｂで得られた残留物を精製して表題生成物１ｇ（６５０ｍｇ，収率８９．７０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：６１５．１［Ｍ＋１］。
（Ｒ）－２－（（２－（（２，４－ジメトキシベンジル）アミノ）－７－（６－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）ピリジン－３－イル）ピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オール １ｇ
化合物１ｅ（６５０ｍｇ，１．１７８ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの１，４－ジオキサン及び４ｍＬの水に加え、１－（（５－ブロモピリジン－２－イル）メチル）－４－メチルピペラジン１ｆ（３１８ｍｇ，１．１７０ｍｍｏｌ，特許出願ＷＯ２００２００２６０５２に開示の方法によって調製して得られた）を加え、１，１′－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（８６ｍｇ，０．１１７ｍｍｏｌ）を加え、炭酸カリウム（４８９ｍｇ，３．５３８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴンガスを３回置換し、８０℃に昇温させて撹拌しながら２時間反応させた。反応液を減圧濃縮した後、反応系に３０ｍＬの水を加え、ジクロロメタンで抽出し（３０ｍＬ×３）、有機相を合わせ、有機相をそれぞれ水（３０ｍＬ）、飽和塩化ナトリウム溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、濾液を減圧濃縮してシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶出剤系Ｂで得られた残留物を精製して表題生成物１ｇ（６５０ｍｇ，収率８９．７０％）を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：６１５．１［Ｍ＋１］。
【0064】
ステップ５
（Ｒ）－２－（（２－アミノ－７－（６－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）ピリジン－３－イル）ピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オール Ｉ
化合物１ｇ（６５０ｍｇ，０．１３８ｍｍｏｌ）を５ｍＬのトリフルオロ酢酸に加え、室温で３時間を反応させ、反応液を減圧濃縮し、反応液に２０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムを加え、ジクロロメタン（２０ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、濾液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶出剤系Ｂで得られた残留物を精製し、生成物Ｉ（３２０ｍｇ，収率６５．１４％）を得た。粉末Ｘ線回折によって検出した後、当該化合物は非晶質であり、ＸＲＰＤスペクトルは、図１に示される。
ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：４６５．１［Ｍ＋１］
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．８７－８．８８（ｄ，１Ｈ），８．６０－８．６１（ｍ，１Ｈ），８．１４－８．１６（ｄ，１Ｈ），７．７９－７．８０（ｓ，１Ｈ），７．５１－７．５３（ｄ，１Ｈ），７．２０（ｓ，１Ｈ），６．３６（ｂｒ，２Ｈ），５．１２－５．１５（ｔ，１Ｈ），３．６６（ｓ，２Ｈ），３．６８－３．７０（ｍ，１Ｈ），３．４８－２．５３（ｍ，１Ｈ），２．３２－３．４２（ｍ，８Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），１．９０－１．９２（ｍ，２Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ），１．２２－１．２３（ｍ，４Ｈ），０．８０－０．８４（ｍ，３Ｈ）。
（Ｒ）－２－（（２－アミノ－７－（６－（（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル）ピリジン－３－イル）ピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）－２－メチルヘキサン－１－オール Ｉ
化合物１ｇ（６５０ｍｇ，０．１３８ｍｍｏｌ）を５ｍＬのトリフルオロ酢酸に加え、室温で３時間を反応させ、反応液を減圧濃縮し、反応液に２０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムを加え、ジクロロメタン（２０ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、濾液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶出剤系Ｂで得られた残留物を精製し、生成物Ｉ（３２０ｍｇ，収率６５．１４％）を得た。粉末Ｘ線回折によって検出した後、当該化合物は非晶質であり、ＸＲＰＤスペクトルは、図１に示される。
ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：４６５．１［Ｍ＋１］
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．８７－８．８８（ｄ，１Ｈ），８．６０－８．６１（ｍ，１Ｈ），８．１４－８．１６（ｄ，１Ｈ），７．７９－７．８０（ｓ，１Ｈ），７．５１－７．５３（ｄ，１Ｈ），７．２０（ｓ，１Ｈ），６．３６（ｂｒ，２Ｈ），５．１２－５．１５（ｔ，１Ｈ），３．６６（ｓ，２Ｈ），３．６８－３．７０（ｍ，１Ｈ），３．４８－２．５３（ｍ，１Ｈ），２．３２－３．４２（ｍ，８Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），１．９０－１．９２（ｍ，２Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ），１．２２－１．２３（ｍ，４Ｈ），０．８０－０．８４（ｍ，３Ｈ）。
【0065】
実施例２
実施例１で得られた式（Ｉ）で表される化合物（２００ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの酢酸エチルに加え、還流するまで昇温させ、撹拌して溶解させた後、溶液をゆっくりと室温まで降温させ、撹拌し、濾過し、濾過ケーキを酢酸エチルで洗浄し、濾過ケーキを収集し、真空下で乾燥し、式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形を１００ｍｇ得て、その特徴的なピーク位置は、下記表のように示される。
実施例１で得られた式（Ｉ）で表される化合物（２００ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの酢酸エチルに加え、還流するまで昇温させ、撹拌して溶解させた後、溶液をゆっくりと室温まで降温させ、撹拌し、濾過し、濾過ケーキを酢酸エチルで洗浄し、濾過ケーキを収集し、真空下で乾燥し、式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形を１００ｍｇ得て、その特徴的なピーク位置は、下記表のように示される。
【0066】
【表1】
【0067】
実施例３
式（Ｉ）で表される化合物（４００ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）を８ｍＬのイソプロパノールに加え、固体が溶解して清澄になるまで加熱還流し、室温まで自然冷却して撹拌し、濾過し、濾過ケーキをイソプロパノールで洗浄し、濾過ケーキを収集し、真空下で乾燥し、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形を２００ｍｇ得て、その特徴的なピーク位置は、下記表のように示される。
式（Ｉ）で表される化合物（４００ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ）を８ｍＬのイソプロパノールに加え、固体が溶解して清澄になるまで加熱還流し、室温まで自然冷却して撹拌し、濾過し、濾過ケーキをイソプロパノールで洗浄し、濾過ケーキを収集し、真空下で乾燥し、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形を２００ｍｇ得て、その特徴的なピーク位置は、下記表のように示される。
【0068】
【表2】
【0069】
実施例４
式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形とＢ結晶形を開口したクリーンな秤量フラスコに入れ、加熱（４０℃，６０℃）、光照（４５００ｌｘ±５００ｌｘ）、高湿（９０％±５％，７５％±５％）条件下での試料の安定性を考察し、サンプリング考察期間は３０日であった。
式（Ｉ）で表される化合物のＡ結晶形とＢ結晶形を開口したクリーンな秤量フラスコに入れ、加熱（４０℃，６０℃）、光照（４５００ｌｘ±５００ｌｘ）、高湿（９０％±５％，７５％±５％）条件下での試料の安定性を考察し、サンプリング考察期間は３０日であった。
【0070】
【表3】
【0071】
【表4】
【0072】
実施例５
式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形を取って３ヶ月の長期間（２５℃，６０％ＲＨ）、加速（４０℃，７５％ＲＨ）安定性考察を行い、結果は、下記表のように示される。
式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形を取って３ヶ月の長期間（２５℃，６０％ＲＨ）、加速（４０℃，７５％ＲＨ）安定性考察を行い、結果は、下記表のように示される。
【0073】
【表5】
【0074】
実験結果により、式（Ｉ）で表される化合物のＢ結晶形を長期間（２５℃，６０％ＲＨ）、加速（４０℃，７５％ＲＨ）安定性条件下で３ヶ月間放置した後、その物理化学的安定性が良好であることが示されている。
【0075】
試験例：
生物学的評価
試験例１、本開示に係る化合物によるヒト由来ＴＬＲ８及びＴＬＲ７へのアゴニスト活性の測定
本開示に係る化合物によるＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ｈＴＬＲ８安定導入細胞により発現されたｈＴＬＲ８への活性化作用は、以下の実験方法によって測定される。
生物学的評価
試験例１、本開示に係る化合物によるヒト由来ＴＬＲ８及びＴＬＲ７へのアゴニスト活性の測定
本開示に係る化合物によるＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ｈＴＬＲ８安定導入細胞により発現されたｈＴＬＲ８への活性化作用は、以下の実験方法によって測定される。
【0076】
一、実験の材料と機器
１．ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，１０５６４－０２９）、
２．ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ，１００９９）、
３．トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｔ８１５４－１００ＭＬ）、
４．Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３多機能マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃμｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、
５．ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ｈＴＬＲ８細胞系（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｈｋｂ－ｈＴＬＲ８）、又はＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ｈＴＬＲ７細胞系（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｈｋｂ－ｈＴＬＲ７）、
６．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｈｂ－ｄｅｔ３）、
７．リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（上海源培生物科技株式会社，Ｂ３２０）。
１．ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，１０５６４－０２９）、
２．ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ，１００９９）、
３．トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｔ８１５４－１００ＭＬ）、
４．Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３多機能マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃμｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、
５．ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ｈＴＬＲ８細胞系（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｈｋｂ－ｈＴＬＲ８）、又はＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ｈＴＬＲ７細胞系（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｈｋｂ－ｈＴＬＲ７）、
６．ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｈｂ－ｄｅｔ３）、
７．リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（上海源培生物科技株式会社，Ｂ３２０）。
【0077】
二、実験の手順
ａ．ヒト由来ＴＬＲ８へのアゴニスト活性の測定
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出培地を配置し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出乾燥粉末を１袋取り、５０ｍＬのエンドトキシン除去水を加えて溶解させ、更に３７℃のインキュベーターに入れ、１０分後に滅菌濾過した。まず、化合物を２０ｍＭの原液に配合し、更に純粋なＤＭＳＯで最高濃度が６×１０６ｎＭになるまで希釈した後、３倍勾配希釈し、合計１０ポイントであり、培地で先に化合物を２０倍希釈した後、各ウェルに希釈後の化合物を２０μＬ加えた。
ａ．ヒト由来ＴＬＲ８へのアゴニスト活性の測定
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出培地を配置し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出乾燥粉末を１袋取り、５０ｍＬのエンドトキシン除去水を加えて溶解させ、更に３７℃のインキュベーターに入れ、１０分後に滅菌濾過した。まず、化合物を２０ｍＭの原液に配合し、更に純粋なＤＭＳＯで最高濃度が６×１０６ｎＭになるまで希釈した後、３倍勾配希釈し、合計１０ポイントであり、培地で先に化合物を２０倍希釈した後、各ウェルに希釈後の化合物を２０μＬ加えた。
【0078】
ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ｈＴＬＲ８細胞を取り、まず、上清を除去し、予熱されたＰＢＳを２～５ｍＬ加え、インキュベーターに１～２分間放置され、細胞を軽くピペッティングし、トリパンブルーで染色してカウントした。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出培地で細胞を再懸濁して濃度が２．２×１０５細胞／ｍＬになるまで調整し、１８０μＬの細胞を２０μＬの薬剤が加えられた上記９６ウェル細胞培養プレートに加え、３７℃で６～１６時間培養した。
【0079】
プレートリーダーで読み取り、波長は６２０ｎｍであった。対応するＯＤ値を得ることができ、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍによって計算して薬剤のＥＣ５０値を得た。
【0080】
ｂ．ヒト由来ＴＬＲ７へのアゴニスト活性の測定
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出培地を配置し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出乾燥粉末を１袋取り、５０ｍＬのエンドトキシン除去水を加えて溶解させ、更に３７℃のインキュベーターに入れ、１０分後に滅菌濾過した。まず、化合物を２０ｍＭの原液に配合し、更に純粋なＤＭＳＯで最高濃度が６×１０６ｎＭになるまで希釈し、３倍勾配希釈し、合計１０ポイントであった。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出培地を配置し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出乾燥粉末を１袋取り、５０ｍＬのエンドトキシン除去水を加えて溶解させ、更に３７℃のインキュベーターに入れ、１０分後に滅菌濾過した。まず、化合物を２０ｍＭの原液に配合し、更に純粋なＤＭＳＯで最高濃度が６×１０６ｎＭになるまで希釈し、３倍勾配希釈し、合計１０ポイントであった。
【0081】
培地で先に配合された上記化合物を２０倍希釈した後、各ウェルに希釈後の化合物を２０μＬ加えた。
【0082】
ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ｈＴＬＲ７細胞を取り、まず、上清を除去し、更に予熱されたＰＢＳを２～５ｍＬ加え、インキュベーターに１～２分間放置され、細胞を軽くピペッティングし、トリパンブルーで染色してカウントした。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ検出培地で細胞を再懸濁して濃度が２．２×１０５細胞／ｍＬになるまで調整し、１８０μＬの細胞を２０μＬの薬剤が加えられた上記９６ウェル細胞培養プレートに加え、３７℃で６～１６時間培養した。
【0083】
プレートリーダーで読み取り、波長は６２０ｎｍであった。対応するＯＤ値を得ることができ、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍによって計算して薬剤のＥＣ５０値を得た。
【0084】
本開示に係る化合物によるヒト由来ＴＬＲ８及びＴＬＲ７への活性化作用は、以上の試験によって測定することができ、測定されたＥＣ５０値は、表１－１に示される。
【0085】
【表6】
【0086】
結論によれば、本開示に係る化合物は、ヒト由来ＴＬＲ８に対して優れた活性化作用を有し、ヒト由来ＴＬＲ７に対して活性化作用を有さず、本開示に係る化合物がＴＬＲ８に対して選択性を有することを示す。
【0087】
試験例２、本開示に係る化合物によるヒト肝ミクロソームＣＹＰ３Ａ４のミダゾラム代謝部位の酵素活性への阻害作用
ヒト肝ミクロソームＣＹＰ３Ａ４のミダゾラム代謝部位に対する本開示に係る化合物の酵素活性は、以下の実験方法によって測定される。
ヒト肝ミクロソームＣＹＰ３Ａ４のミダゾラム代謝部位に対する本開示に係る化合物の酵素活性は、以下の実験方法によって測定される。
【0088】
一、実験の材料と機器
１．リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、
２．ＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ Ｎ－１６３０）、
３．ヒト肝ミクロソーム（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｅｎｔｅｓｔ）、
４．ＡＢＩ ＱＴｒａｐ ４０００液体クロマトグラフィー質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）、
５．Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｃ８－３カラム，４．６×５０ｍｍ，５μｍ（Ｄｉｋｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）、
６．ＣＹＰプローブ基質（１５μＭのミダゾラム，ＳＩＧＭＡ ＵＣ４２９）及び陽性対照阻害剤（ケトコナゾール，ＳＩＧＭＡ Ｋ１００３）。
１．リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、
２．ＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ Ｎ－１６３０）、
３．ヒト肝ミクロソーム（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｅｎｔｅｓｔ）、
４．ＡＢＩ ＱＴｒａｐ ４０００液体クロマトグラフィー質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）、
５．Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｃ８－３カラム，４．６×５０ｍｍ，５μｍ（Ｄｉｋｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）、
６．ＣＹＰプローブ基質（１５μＭのミダゾラム，ＳＩＧＭＡ ＵＣ４２９）及び陽性対照阻害剤（ケトコナゾール，ＳＩＧＭＡ Ｋ１００３）。
【0089】
二、実験の手順
１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液を調製し、当該緩衝液を用いて２．５ｍｇ／ｍＬのミクロソーム溶液及び５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を調製し、ＰＢＳで５Ｘ濃度の化合物作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで５Ｘ濃度のケトコナゾール作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで濃度が１５μＭのミダゾラム作動液に希釈した。
１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液を調製し、当該緩衝液を用いて２．５ｍｇ／ｍＬのミクロソーム溶液及び５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を調製し、ＰＢＳで５Ｘ濃度の化合物作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで５Ｘ濃度のケトコナゾール作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで濃度が１５μＭのミダゾラム作動液に希釈した。
【0090】
２．５ｍｇ／ｍＬのミクロソーム溶液、１５μＭのミダゾラム作動液、ＭｇＣｌ２溶液及び化合物作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ，濃度ごとに異なる反応系を設置した）をそれぞれ２０μＬ取り、均一に混合した。陽性対照群において化合物の代わりに同一濃度のケトコナゾールを使用した。同時に５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液と共に３７℃で５分間プレインキュベートした。５分後にＮＡＤＰＨを２０μＬ取って各ウェルに加え、反応を開始させ、３０分間インキュベートした。全てのインキュベート試料に２つずつの試料を用意した。３０分後に全ての試料に内部標準含有のアセトニトリルを２５０μＬ加え、均一に混合し、８００ｒｐｍで１０分間振った後、３７００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。８０μＬの上清液をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に移した。
【0091】
数値をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍによって計算して得られたＣＹＰ３Ａ４のミダゾラム代謝部位に対する薬剤のＩＣ５０値は、表１－２に示される。
【0092】
【表7】
【0093】
結論によれば、本開示に係る化合物は、ヒト肝ミクロソームＣＹＰ３Ａ４のミダゾラム代謝部位に対して阻害作用を有さず、より高い安全性を示し、ＣＹＰ３Ａ４代謝のミダゾラム代謝部位に基づく代謝的薬剤相互作用を生じないことを示唆している。
【0094】
試験例３、本開示に係る化合物によるヒト肝ミクロソームＣＹＰ２Ｄ６の酵素活性への阻害作用
ヒト肝ミクロソームＣＹＰ２Ｄ６に対する本開示に係る化合物の酵素活性は、以下の実験方法によって測定される。
ヒト肝ミクロソームＣＹＰ２Ｄ６に対する本開示に係る化合物の酵素活性は、以下の実験方法によって測定される。
【0095】
一、実験の材料と機器
１．リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、
２．ＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ Ｎ－１６３０）、
３．ヒト肝ミクロソーム（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｅｎｔｅｓｔ）、
４．ＡＢＩ ＱＴｒａｐ ４０００液体クロマトグラフィー質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）、
５．Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｃ８－３カラム，４．６×５０ｍｍ，５μｍ（Ｄｉｋｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）、
６．ＣＹＰプローブ基質（２０μＭのデキストロメトルファン，ＳＩＧＭＡ Ｑ０７５０）及び陽性対照阻害剤（キニジン，ＳＩＧＭＡ Ｄ９６８４）。
１．リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、
２．ＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ Ｎ－１６３０）、
３．ヒト肝ミクロソーム（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｅｎｔｅｓｔ）、
４．ＡＢＩ ＱＴｒａｐ ４０００液体クロマトグラフィー質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）、
５．Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｃ８－３カラム，４．６×５０ｍｍ，５μｍ（Ｄｉｋｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）、
６．ＣＹＰプローブ基質（２０μＭのデキストロメトルファン，ＳＩＧＭＡ Ｑ０７５０）及び陽性対照阻害剤（キニジン，ＳＩＧＭＡ Ｄ９６８４）。
【0096】
二、実験の手順
１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液を調製し、当該緩衝液を用いて２．５ｍｇ／ｍＬのミクロソーム溶液及び５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を調製し、ＰＢＳで５Ｘ濃度の化合物作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで５Ｘ濃度のキニジン作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで濃度が２０μＭのデキストロメトルファン作動液に希釈した。
１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液を調製し、当該緩衝液を用いて２．５ｍｇ／ｍＬのミクロソーム溶液及び５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を調製し、ＰＢＳで５Ｘ濃度の化合物作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで５Ｘ濃度のキニジン作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで濃度が２０μＭのデキストロメトルファン作動液に希釈した。
【0097】
２．５ｍｇ／ｍＬのミクロソーム溶液、２０μＭのデキストロメトルファン作動液、ＭｇＣｌ２溶液及び化合物作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ，濃度ごとに異なる反応系を設置した）をそれぞれ２０μＬ取り、均一に混合した。陽性対照群において化合物の代わりに同一濃度のキニジンを使用した。同時に５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液と共に３７℃で５分間プレインキュベートし、５分後にＮＡＤＰＨを２０μＬ取って各ウェルに加え、反応を開始させ、３０分間プレインキュベートした。全てのインキュベート試料に２つずつの試料を用意した。３０分後に全ての試料に内部標準含有のアセトニトリルを２５０μＬ加え、均一に混合し、８００ｒｐｍで１０分間振った。３７００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。８０μＬの上清液をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に移した。
【0098】
数値をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍによって計算して得られたＣＹＰ２Ｄ６代謝部位に対する薬剤のＩＣ５０値は、表１－３に示される。
【0099】
【表8】
【0100】
結論によれば、本開示に係る化合物は、ヒト肝ミクロソームＣＹＰ２Ｄ６の酵素活性に対する阻害作用が低く、より高い安全性を示し、ＣＹＰ２Ｄ６に基づく代謝的薬剤相互作用を生じないことを示唆している。
【0101】
試験例４、本開示に係る化合物によるヒト肝ミクロソームＣＹＰ３Ａ４のテストステロン代謝部位の酵素活性への阻害作用
ヒト肝ミクロソームＣＹＰ３Ａ４のテストステロン代謝部位に対する本開示に係る化合物の酵素活性は、以下の実験方法によって測定される。
ヒト肝ミクロソームＣＹＰ３Ａ４のテストステロン代謝部位に対する本開示に係る化合物の酵素活性は、以下の実験方法によって測定される。
【0102】
一、実験の材料と機器
１．リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、
２．ＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ Ｎ－１６３０）、
３．ヒト肝ミクロソーム（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｅｎｔｅｓｔ）、
４．ＡＢＩ ＱＴｒａｐ ４０００液体クロマトグラフィー質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）、
５．Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｃ８－３カラム，４．６×５０ｍｍ，５μｍ（Ｄｉｋｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）、
６．ＣＹＰプローブ基質（テストステロン／１００μＭ，ＳＩＧＭＡ Ｋ１００３）及び陽性対照阻害剤（ケトコナゾール，Ｄｒ． Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ ＧｍｂＨ，Ｃ１７３２２５００）。
１．リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、
２．ＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ Ｎ－１６３０）、
３．ヒト肝ミクロソーム（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｅｎｔｅｓｔ）、
４．ＡＢＩ ＱＴｒａｐ ４０００液体クロマトグラフィー質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）、
５．Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｃ８－３カラム，４．６×５０ｍｍ，５μｍ（Ｄｉｋｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）、
６．ＣＹＰプローブ基質（テストステロン／１００μＭ，ＳＩＧＭＡ Ｋ１００３）及び陽性対照阻害剤（ケトコナゾール，Ｄｒ． Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ ＧｍｂＨ，Ｃ１７３２２５００）。
【0103】
二、実験の手順
１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液を調製し、当該緩衝液を用いて２．５ｍｇ／ｍＬのミクロソーム溶液及び５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を調製し、ＰＢＳで５Ｘ濃度の化合物作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで５Ｘ濃度のケトコナゾール作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで濃度が５０μＭのデキストロメトルファン作動液に希釈した。
１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液を調製し、当該緩衝液を用いて２．５ｍｇ／ｍＬのミクロソーム溶液及び５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を調製し、ＰＢＳで５Ｘ濃度の化合物作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで５Ｘ濃度のケトコナゾール作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ）を勾配希釈した。ＰＢＳで濃度が５０μＭのデキストロメトルファン作動液に希釈した。
【0104】
２．５ｍｇ／ｍＬのミクロソーム溶液、５０μＭのテストステロン作動液、ＭｇＣｌ２溶液及び化合物作動液（１５０、５０、１５、５、１．５、０．１５、０．０１５、０μＭ，濃度ごとに異なる反応系を設置した）をそれぞれ２０μＬ取り、均一に混合した。陽性対照群において化合物の代わりに同一濃度のケトコナゾールを使用した。同時に５ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液と共に３７℃で５分間プレインキュベートした。５分後にＮＡＤＰＨを２０μＬ取って各ウェルに加え、反応を開始させ、３０分間インキュベートした。全てのインキュベート試料に２つずつの試料を用意した。３０分後に全ての試料に内部標準含有のアセトニトリルを２５０μＬ加え、均一に混合し、８００ｒｐｍで１０分間振った。３７００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。８０μＬの上清液をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に移した。
【0105】
数値をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍによって計算して得られたＣＹＰ３Ａ４のテストステロン代謝部位に対する薬剤のＩＣ５０値は、表１－４に示される。
【0106】
【表9】
【0107】
結論によれば、本開示に係る化合物は、ヒト肝ミクロソームＣＹＰ３Ａ４のテストステロン代謝部位に対して阻害作用を有さず、より高い安全性を示し、ＣＹＰ３Ａ４のテストステロン代謝部位に基づく代謝的薬剤相互作用を生じないことを示唆している。
【0108】
試験例５、本開示に係る化合物による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激してＩＬ１２及びＩＦＮγを分泌させる能力の測定
本開示に係る化合物によるＰＢＭＣを刺激してＩＬ１２及びＩＦＮγを分泌させる能力は、以下の実験方法によって測定される。
本開示に係る化合物によるＰＢＭＣを刺激してＩＬ１２及びＩＦＮγを分泌させる能力は、以下の実験方法によって測定される。
【0109】
一、実験の材料と機器
１．ＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１８７５）、
２．ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１００９９－１４１）、
３．Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥ，１７－５４４２－０２）、
４．トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｔ８１５４－１００ＭＬ）、
５．ＳｅｐＭａｔｅＴＭ－５０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，１５４６０）、
６．Ｂｒｉｇｈｔ－ＬｉｎｅＴＭ血球計（Ｓｉｇｍａ，Ｚ３５９６２９－１ＥＡ）、
７．９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５９９）、
８．９６ウェルｖ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３８９４）、
９．Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｎｅｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＥＨＣ１５２．９６）、
１０．Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ ｋｉｔ（ｃｉｓｂｉｏ，６２ＨＩＦＮＧＰＥＧ）、
１１．ＰＨＥＲＡＳｔａｒ多機能マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ，ＰＨＥＲＡＳｔａｒ）。
１．ＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１８７５）、
２．ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１００９９－１４１）、
３．Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥ，１７－５４４２－０２）、
４．トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｔ８１５４－１００ＭＬ）、
５．ＳｅｐＭａｔｅＴＭ－５０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，１５４６０）、
６．Ｂｒｉｇｈｔ－ＬｉｎｅＴＭ血球計（Ｓｉｇｍａ，Ｚ３５９６２９－１ＥＡ）、
７．９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５９９）、
８．９６ウェルｖ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３８９４）、
９．Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｎｅｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＥＨＣ１５２．９６）、
１０．Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ ｋｉｔ（ｃｉｓｂｉｏ，６２ＨＩＦＮＧＰＥＧ）、
１１．ＰＨＥＲＡＳｔａｒ多機能マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ，ＰＨＥＲＡＳｔａｒ）。
【0110】
二、実験の手順
化合物を純粋なＤＭＳＯで希釈し、最高濃度が５ｍＭであり、４倍勾配希釈し、合計９ポイントであった。その後、４μＬの化合物を１９６μＬの１０％ＦＢＳ含有のＲＭＰＩ １６４０培地に加え、均一に混合した。５０μＬを取って新しい９６ウェル細胞培養プレートに入れた。
化合物を純粋なＤＭＳＯで希釈し、最高濃度が５ｍＭであり、４倍勾配希釈し、合計９ポイントであった。その後、４μＬの化合物を１９６μＬの１０％ＦＢＳ含有のＲＭＰＩ １６４０培地に加え、均一に混合した。５０μＬを取って新しい９６ウェル細胞培養プレートに入れた。
【0111】
全ての試薬を室温に平衡化させ、２５０ｍＬの培養フラスコに６０ｍＬの血液及び等体積のＰＢＳ＋２％ＦＢＳを加え、軽くピペッティングして均一に混合して希釈させた。５０ｍＬのＰＢＭＣ分離チューブＳｅｐＭａｔｅＴＭ－５０に１５ｍＬのリンパ球分離液Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭを加えた後、希釈後の血液を３０ｍＬ加えた。１２００ｇで室温で１０分間遠心分離した。上清を取った後、３００ｇで８分間遠心分離した。１０％ＦＢＳ含有のＲＭＰＩ１６４０培地で再懸濁してカウントし、ＰＢＭＣの数を３．３３×１０６細胞／ｍＬに調整し、１５０μＬを取って化合物が加えれた細胞培養プレートに置き、３７℃で、５．０％のＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養した。細胞培養プレートを遠心分離機に入れ、１２００ｒｐｍで、室温で１０分間遠心分離し、各ウェルから１５０μＬの上清を取った。
【0112】
Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１２検出試薬キットの試薬を常温まで平衡化させ、試薬キットの説明書に従い、標準品の最高濃度は２０００ｐｇ／ｍＬであり、２倍勾配希釈し、合計８ポイントであった。測定される試料を２０倍希釈した。その後１００μＬ／ｗｅｌｌで予めコーティングされたプレートに加えた。３７℃で９０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗生物質化され抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えた。３７℃で６０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合酵素を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えた。３７℃で３０分間インキュベートし、プレートを洗浄し、ＴＭＢを加え、室温で５分間インキュベートした。最後に停止溶液を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
【0113】
Ｈｕｍａｎ ＩＦＮγ検出試薬キットの試薬を常温に平衡化させ、遮光条件下で試薬キットの説明書に従い、標準品及び検出抗体を調製した。各ウェルに遠心分離により得られた上清液を１６μＬ加え、更に各ウェルに新しく調製された混合検出抗体を４μＬ加え、振とうして均一に混合し、暗所にて室温で一晩インキュベートし、ＰＨＥＲＡＳｔａｒは、ｈｔｒｆプログラムによって読み取られた。
【0114】
ＰＢＭＣを刺激して化合物が加えられていない群の平均値より３倍高いＳＤ（化合物が加えられていない群のＳＤ）を生成できることに対応する化合物濃度を当該化合物のＭＥＣ（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）値と定義した。
【0115】
本開示に係る化合物によるＰＢＭＣを刺激してＩＬ１２及びＩＦＮγを分泌させる能力は、以上の試験によって測定され、測定されたＭＥＣ値は、表１－５に示される。
【0116】
【表10】
【0117】
結論によれば、ＰＢＭＣを刺激してＩＬ１２及びＩＦＮγを分泌させる活性のデータから見れば、本開示に係る化合物は、有効濃度が低いという利点を有する。
【0118】
試験例６
１、実験目的
全自動パッチクランプを利用してｈＥＲＧカリウムチャネルをトランスフェクションした安定細胞株において本開示に係る化合物によるｈＥＲＧカリウム電流への遮断作用を試験した。
１、実験目的
全自動パッチクランプを利用してｈＥＲＧカリウムチャネルをトランスフェクションした安定細胞株において本開示に係る化合物によるｈＥＲＧカリウム電流への遮断作用を試験した。
【0119】
２、実験方法
２．１ 実験材料と機器
２．１．１ 実験材料：
２．１ 実験材料と機器
２．１．１ 実験材料：
【0120】
【表11】
【0121】
２．１．２ 実験機器：
【0122】
【表12】
【0123】
２．２ 全自動パッチクランプ実験ステップ
ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ安定細胞株を１：４の密度でＭＥＭ／ＥＢＳＳ培地（１０％ＦＢＳ，４００μｇ／ｍＬのＧ４１８，１％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×），１％のピルビン酸ナトリウム溶液）で継代培養し、培養から４８～７２時間以内に全自動パッチクランプ実験を行った。実験当日に細胞を０．２５％トリプシンで消化した後、遠心分離によって細胞を収集し、細胞外液（１４０ｍＭのＮａＣｌ，４ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ２，２ｍＭのＣａＣｌ２，５ｍＭＤのデキストロース一水和物，１０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，２９８ｍＯｓｍｏｌ）で細胞を再懸濁して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液をＰａｔｃｈｌｉｎｅｒ機器の細胞バンクに置き、Ｐａｔｃｈｌｉｎｅｒ機器は、負圧制御装置によって細胞をチップ（ＮＰＣ－１６）に置き、負圧によって単一細胞をチップのウェルに吸引した。全細胞パターンを形成した後、機器は、設定されたｈＥＲＧ電流電圧プログラムに応じてｈＥＲＧ電流を得て、その後、機器は、自動的に低濃度から高濃度へ、化合物の灌流を行った。ＨＥＡＫ Ｐａｔｃｈｍａｓｔｅｒ、ＨＥＡＫ ＥＰＣ１０パッチクランプ増幅器（Ｎａｎｉｏｎ）とＰａｔｈｌｉｎｅｒｓｏｆｔｗａｒｅ及びＰａｔｈｃｏｎｔｒｏｌ ＨＴｓｏｆｔｗａｒｅにより提供されたデータ分析ソフトウェアにより、化合物の各濃度下での電流及びブランク対照電流を分析した。
ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ安定細胞株を１：４の密度でＭＥＭ／ＥＢＳＳ培地（１０％ＦＢＳ，４００μｇ／ｍＬのＧ４１８，１％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×），１％のピルビン酸ナトリウム溶液）で継代培養し、培養から４８～７２時間以内に全自動パッチクランプ実験を行った。実験当日に細胞を０．２５％トリプシンで消化した後、遠心分離によって細胞を収集し、細胞外液（１４０ｍＭのＮａＣｌ，４ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ２，２ｍＭのＣａＣｌ２，５ｍＭＤのデキストロース一水和物，１０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，２９８ｍＯｓｍｏｌ）で細胞を再懸濁して細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液をＰａｔｃｈｌｉｎｅｒ機器の細胞バンクに置き、Ｐａｔｃｈｌｉｎｅｒ機器は、負圧制御装置によって細胞をチップ（ＮＰＣ－１６）に置き、負圧によって単一細胞をチップのウェルに吸引した。全細胞パターンを形成した後、機器は、設定されたｈＥＲＧ電流電圧プログラムに応じてｈＥＲＧ電流を得て、その後、機器は、自動的に低濃度から高濃度へ、化合物の灌流を行った。ＨＥＡＫ Ｐａｔｃｈｍａｓｔｅｒ、ＨＥＡＫ ＥＰＣ１０パッチクランプ増幅器（Ｎａｎｉｏｎ）とＰａｔｈｌｉｎｅｒｓｏｆｔｗａｒｅ及びＰａｔｈｃｏｎｔｒｏｌ ＨＴｓｏｆｔｗａｒｅにより提供されたデータ分析ソフトウェアにより、化合物の各濃度下での電流及びブランク対照電流を分析した。
【0124】
２．３ 試験結果
本開示に係る化合物によるｈＥＲＧカリウム電流への遮断作用は、以上の試験によって測定され、測定されたＩＣ５０値は、表１－６に示される。
本開示に係る化合物によるｈＥＲＧカリウム電流への遮断作用は、以上の試験によって測定され、測定されたＩＣ５０値は、表１－６に示される。
【0125】
【表13】
【0126】
結論によれば、本開示に係る化合物は、ｈＥＲＧに対する阻害作用が低く、ｈＥＲＧチャネルによって引き起された副作用を低下させることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】