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特表2023-509181ＥＢウイルスＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるポリペプチド及び検出におけるその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-07

(54)【発明の名称】ＥＢウイルスＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるポリペプチド及び検出におけるその使用

(51)【国際特許分類】

C12N 15/38 20060101AFI20230228BHJP

C07K 14/05 20060101ALI20230228BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20230228BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20230228BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20230228BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20230228BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20230228BHJP

G01N 33/574 20060101ALI20230228BHJP

C07K 16/08 20060101ALN20230228BHJP

【ＦＩ】

C12N15/38

C07K14/05 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

G01N33/574 A

C07K16/08

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022540998

(86)(22)【出願日】2020-12-25

(85)【翻訳文提出日】2022-08-31

(86)【国際出願番号】 CN2020139310

(87)【国際公開番号】W WO2021136082

(87)【国際公開日】2021-07-08

(31)【優先権主張番号】202010001204.2

(32)【優先日】2020-01-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512287595

【氏名又は名称】シアメンユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】ＸＩＡＭＥＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．４２２ＳｉｍｉｎｇＮａｎＲｏａｄ，ＳｉｍｉｎｇＤｉｓｔｒｉｃｔＸｉａｍｅｎＦｕｊｉａｎ，３６１００５ＣＨＩＮＡ

(71)【出願人】

【識別番号】520192784

【氏名又は名称】シァメン・イノドックス・バイオテック・カンパニー・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田達則

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居良太郎

(72)【発明者】

【氏名】リーティントン

(72)【発明者】

【氏名】コーションシアン

(72)【発明者】

【氏名】クオシアオイー

(72)【発明者】

【氏名】ホンツォンミン

(72)【発明者】

【氏名】ソンリウウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ウェンシュンホア

(72)【発明者】

【氏名】タンチアパオ

(72)【発明者】

【氏名】チャンチュン

(72)【発明者】

【氏名】シアニンシャオ

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA46

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA03

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、抗ＥＢウイルス（ＥＢＶ）抗体レベルに基づいて鼻咽頭がんを診断する方法、及び本方法に使用されるキットを提供する。また、上述の診断に使用されるＥＢウイルス中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるポリペプチド、及び鼻咽頭がんを診断するためのその使用も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも７つの連続したアミノ酸残基で構成され、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５～１１、アミノ酸残基１６～２３、アミノ酸残基３１～３９、又はアミノ酸残基５３～６０から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又はすべて４つ）の配列を含む、単離されたポリペプチド又はそのバリアントであって、
ここで、バリアントは、１つまたはいくつか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９）のアミノ酸残基の置換（例えば、例えば、保存的置換または非保存的置換）によってのみ誘導され、それが由来するポリペプチドの生物学的機能（例えば、抗ＥＢＶ抗体によって認識および結合される活性）を保持し；
好ましくは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質は、配列番号１０１に示される配列を有する、上記単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項2】

単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５３～６０、アミノ酸残基５～２３、アミノ酸残基１６～３９、アミノ酸残基３１～６０、アミノ酸残基５～３９、アミノ酸残基１６～６０、又はアミノ酸残基５～６０を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項3】

単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも８個の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５３～６０を含み；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５３～６１を含み；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５１～６５を含み；
好ましくは、アミノ酸残基５１～６５が配列番号９７に示される配列を有し；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項１又は２に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項4】

単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも１９個の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５～２３を含み；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１～２５を含み；
好ましくは、アミノ酸残基１～２５が配列番号１０２に示される配列を有し；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項１又は２に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項5】

単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも２４個の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１６～３９を含み；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１４～５２を含み：
好ましくは、アミノ酸残基１４～５２が配列番号８８に示される配列を有し；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも３９個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項１又は２に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項6】

単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも３０個の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基３１～６０を含み、
好ましくは、単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基３１～６１を含む、請求項１又は２に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項7】

単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも３５個の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５～３９を含み；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１～５２を含み；
好ましくは、アミノ酸残基１～５２が配列番号９１に示される配列を有し；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも５３個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項１又は２に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項8】

単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも４５個の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１６～６０を含み；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１６～６１を含み；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１４～７４、アミノ酸残基１１～６５、又はアミノ酸残基１１～７４を含み；
好ましくは、アミノ酸残基１４～７４が配列番号９０に示される配列を有し；
好ましくは、アミノ酸残基１１～６５が配列番号１０３に示される配列を有し；
好ましくは、アミノ酸残基１１～７４が配列番号１０４に示される配列を有し；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも６１個、少なくとも５５個、又は少なくとも６４個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項１又は２に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項9】

単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも５６個の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５～６０を含み；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５～６１を含み；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１～７４を含み；
好ましくは、アミノ酸残基１～７４が配列番号８９に示される配列を有し；
好ましくは、ポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも７４個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項１又は２に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項10】

単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸５１～５６、アミノ酸残基１～２５、アミノ酸残基１４～５２、アミノ酸残基１～５２、アミノ酸残基１４～７４、アミノ酸残基１１～６５、アミノ酸残基１１～７４、又はアミノ酸残基１～７４からなる群から選択される配列からなる、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項11】

バリアントが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質に示されるアミノ酸位置に対して、以下の位置：６、９、１０、１１、１６、３１、３３、３８、３９、５３、５４、５６、５７、５８、５９、９５、９６、９７位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含まない、請求項１～１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのバリアント。

【請求項12】

バリアントが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質に示されるアミノ酸位置に対して、以下の位置：５、７、８、１２、１３、１４、１５、１９、２２、２４、２５、３２、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、５２、５５、６０、６１、８９、９１、９３または９８位に対応する１つ以上（例えば、１、２、３又は４つ）のアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含み、
好ましくは、バリアントが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質に示されるアミノ酸位置に対して、以下の位置：５、７、８、１２、１３、１４、２２、３２、３４、３５、３６、４０、４１、４２、５２、５５、６０、６１、８９、９１、９３または９８位に対応する１つ以上（例えば、１、２、３又は４つ）のアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのバリアント。

【請求項13】

バリアントが、５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、７位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、８位に対応する位置でのアミノ酸のＧによる置換、１２位に対応する位置でのアミノ酸のＧ、Ｔ、Ｄ又はＳによる置換、１３位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、１４位に対応する位置でのアミノ酸のＧによる置換、１５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、２２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、２４位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、２５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３４位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３６位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３７位に対応する位置でのアミノ酸のＡ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＲによる置換、４０位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、４１位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、４２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、５２位に対応する位置でのアミノ酸のＫ、Ｈ、Ａ、ＳまたはＤによる置換、５５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、６０位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、６１位に対応する位置でのアミノ酸のＫ、Ｈ、ＳまたはＡによる置換、８９位に対応する位置でのアミノ酸のＡ又はＴによる置換、９１位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、９３位に対応する位置でのアミノ酸のＱによる置換、９８位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換からなる群から選択される１つ又はいくつか（例えば、１、２、３又は４つ）のアミノ酸置換を含み、
好ましくは、バリアントが、５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、７位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、８位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、１２位に対応する位置でのアミノ酸のＧ、Ｔ，ＤまたはＳによる置換、１３位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、１４位に対応する位置でのアミノ酸のＧによる置換、２２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、２５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３４位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３６位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、４０位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、４１位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、４２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、５２位に対応する位置でのアミノ酸のＫ、Ｈ、Ａ、ＳまたはＤによる置換、５５位に対応する位置でのアミノ酸のＳによる置換、６０位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、６１位に対応する位置でのアミノ酸のＫ、Ｈ、Ｓ又はＡによる置換、８９位に対応する位置でのアミノ酸のＡ又はＴによる置換、９１位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、９３位に対応する位置でのアミノ酸のＱによる置換、９８位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換からなる群から選択される１つ又はいくつか（例えば、１、２、３又は４つ）のアミノ酸置換を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのバリアント。

【請求項14】

単離されたポリペプチドが、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の９７以下（例えば、９６以下、９５以下、９４以下、９３以下、９２以下、９１以下、９０以下、８９以下、８８以下、８７以下、８６以下、８５以下、８４以下、８３以下、８２以下、８１以下、８０以下、７９以下、７８以下、７６以下、７５以下、または７４以下）の連続したアミノ酸残基からなる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのバリアント。

【請求項15】

単離されたポリペプチド又はそのバリアントが、固体支持体の表面に結合しているか、又は固体支持体に結合することができる修飾基を有し；
好ましくは、修飾基がビオチン又はアビジンであり；
好ましくは、固体支持体が、磁性ビーズ又はマイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）からなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項16】

単離されたポリペプチド又はそのバリアントが検出可能な標識を有し；
好ましくは、検出可能な標識が、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）、蛍光色素又はビオチンからなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。

【請求項17】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。

【請求項18】

請求項１７に記載の単離された核酸分子を含むベクター。

【請求項19】

請求項１７に記載の単離された核酸分子又は請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項20】

補足試薬を含むキットであって、捕獲試薬が、請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択され；
好ましくは、キットは、試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを検出し、場合により対象が鼻咽頭がんを有するか又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定するための捕捉試薬として単離されたポリペプチド又はそのバリアントを使用するための指示書をさらに含み；
好ましくは、捕捉試薬は、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択され；
好ましくは、対象は、哺乳動物、例えばヒトである、上記キット。

【請求項21】

検出試薬をさらに含み、検出試薬が、請求項１６に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、請求項２０に記載のキット。

【請求項22】

検出試薬をさらに含み、検出試薬が、検出可能な標識を有する二次抗体から選択され；
好ましくは、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）、蛍光色素又はビオチンからなる群から選択され；
好ましくは、二次抗体は、検出される抗体が由来する種（例えば、ヒト）の抗体に特異的であり；
好ましくは、二次抗体は抗免疫グロブリン抗体であり；
好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、及び抗ＩｇＡ抗体からなる群から選択される。請求項２０に記載のキット。

【請求項23】

キットが、（ｉ）試料を収集又は保存するためのデバイス（例えば、採血デバイス）；（ｉｉ）検出を行うために必要な追加の試薬（例えば、緩衝液、希釈液、ブロッキング溶液、及び／又は標準）からなる群から選択される１つ以上の試薬又はデバイスをさらに含む、請求項２０～２２のいずれか１項に記載のキット。

【請求項24】

対象が鼻咽頭がんであるかどうか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定するための方法であって、
（１）対象由来の試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定し；および
（２）該レベルを参照値と比較する
ことを含み、
好ましくは、該レベルが参照値を上回る場合、対象が鼻咽頭がんであるか、または鼻咽頭がんのリスクがあると考えられ；
好ましくは、試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルは、免疫学的アッセイによって決定され；
好ましくは、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ又はラジオイムノアッセイからなる群から選択される、上記方法。

【請求項25】

アッセイが、捕捉試薬として請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントを使用することを含み、
好ましくは、捕捉試薬は、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

工程（１）が、
（１ａ）対象由来の試料を捕捉試薬と接触させて、抗原－抗体免疫複合体を得る工程であって、捕捉試薬が、請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される工程；
（１ｂ）工程（１ａ）で得られた抗原－抗体免疫複合体の量を決定する工程
を含み、
好ましくは、工程（１ｂ）において、免疫複合体の量は免疫学的アッセイによって決定され；
好ましくは、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ又はラジオイムノアッセイからなる群から選択され；
好ましくは、捕捉試薬は、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

工程（１ｂ）において、検出試薬が免疫複合体の量を検出するために使用され、検出試薬が、請求項１６に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

工程（１ｂ）において、検出試薬が免疫複合体の量を検出するために使用され、検出試薬が検出可能な標識を有する二次抗体から選択され
好ましくは、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）、蛍光色素又はビオチンからなる群から選択され；
好ましくは、二次抗体は、検出される抗体が由来する種（例えば、ヒト）の抗体に特異的であり；
好ましくは、二次抗体は抗免疫グロブリン抗体であり；
好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体又は抗ＩｇＡ抗体からなる群から選択され、好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は抗ＩｇＧ抗体である、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

試料が、血液試料、例えば、全血、血漿又は血清である、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

対象がヒトである、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

工程（１）の前に、対象からの試料を提供し；及び／又は
工程（２）の後に、鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあると考えられる対象に、鼻咽頭がんを治療することができる治療的に有効な量の抗腫瘍療法（例えば、化学療法、放射線療法、及び／又は免疫療法）を投与する
ことをさらに含む、請求項２４～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

キットの製造において、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコード化されたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができる試薬の使用であって、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定するために使用され；
好ましくは、試薬は、免疫学的アッセイによってＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができ；好ましくは、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ又はラジオイムノアッセイからなる群から選択され；
好ましくは、対象はヒトであり；
好ましくは、試料は、血液試料、例えば、全血、血漿又は血清であり；
好ましくは、キットは、請求項２４に記載の方法によって、対象が鼻咽頭がんであるか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定する、上記使用。

【請求項33】

ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができる試薬が、請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される捕獲試薬を含み、
好ましくは、捕捉試薬は、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択され；
好ましくは、キットは、請求項２５又は２６に記載の方法によって、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定する、請求項３２に記載の使用。

【請求項34】

ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができる試薬がさらに検出試薬を含み、検出試薬が、請求項１６に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択され、
好ましくは、キットは、請求項２７に記載の方法によって、対象が鼻咽頭がんであるか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定する、請求項３３に記載の使用。

【請求項35】

ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができる試薬が、さらに検出試薬を含み、検出試薬が、検出可能な標識を有する二次抗体から選択され、
好ましくは、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）、蛍光色素又はビオチンからなる群から選択され；
好ましくは、二次抗体は、検出される抗体が由来する種（例えば、ヒト）の抗体に特異的であり；
好ましくは、二次抗体は抗免疫グロブリン抗体であり；
好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体又は抗ＩｇＡ抗体からなる群から選択され、好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は抗ＩｇＧ抗体であり；
好ましくは、キットは、請求項２８に記載の方法によって、対象が鼻咽頭がんであるか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定する、請求項３３に記載の使用。

【請求項36】

試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体を検出するための方法であって、
（１）試料を捕捉試薬と接触させて抗原－抗体免疫複合体を得る工程であって、ここで、捕捉試薬は、請求項１～１４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される工程；
（２）工程（１）で得られた抗原－抗体免疫複合体の量を決定する工程
を含み、
好ましくは、工程（２）において、免疫複合体の量は、免疫学的アッセイによって決定され；
好ましくは、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ又はラジオイムノアッセイからなる群から選択され；
好ましくは、捕捉試薬は、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、上記方法。

【請求項37】

工程（２）において、検出試薬を用いて免疫複合体の量を決定し、検出試薬が請求項１６に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

工程（２）において、検出試薬を用いて免疫複合体の量を決定し、検出試薬が検出可能な標識を有する二次抗体から選択され；
好ましくは、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）、蛍光色素又はビオチンからなる群から選択され；
好ましくは、二次抗体は、検出される抗体が由来する種（例えば、ヒト）の抗体に特異的であり；
好ましくは、二次抗体は抗免疫グロブリン抗体であり；
好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体又は抗ＩｇＡ抗体からなる群から選択され、好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は抗ＩｇＧ抗体である、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

キットが試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体を検出するために使用される、キットの製造における請求項１～１６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、免疫学的検出、特に腫瘍の免疫学的診断の分野に関する。具体的には、本発明は、抗エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）抗体のレベルに基づいて鼻咽頭がんを診断する方法、及び本方法で使用するためのキットを提供する。また、本発明は、上記診断に使用されるＥＢＶＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるポリペプチド、及び鼻咽頭がんの診断におけるその使用を提供する。

【背景技術】

【0002】

背景技術
鼻咽頭がんは、上咽頭腔の上壁及び外側壁に発生する悪性腫瘍であり、その発生率は耳、鼻及び咽頭の悪性腫瘍の中で第１位である。中国は鼻咽頭がんの高発生地域であり、広東及び広西で最も高い発生率を示す［１］。鼻咽頭がんの発生は、ＥＢＶ感染、遺伝因子、環境因子などの多くの因子に関係する［２］。鼻咽頭がんの初期症状は明らかではなく、発生部位が比較的隠れているため、ほとんどの鼻咽頭がんは進行期まで発見できない［３］。しかしながら、早期鼻咽頭がんの５年生存率は９０％以上に達するが、進行鼻咽頭がんの予後は有意に低い［３］。一方、早期鼻咽頭がんは局所放射線療法で治療可能であり、進行鼻咽頭がんは化学療法による治療を必要とする。したがって、早期診断は、鼻咽頭がん患者の生存率及び生活の質を改善するための鍵である。

【0003】

早くも１９７６年に、ＷｅｒｎｅｒＨｅｎｌｅらは、鼻咽頭がん患者の血清中のＥＢＶＩｇＡ抗体が有意に増加したことを明らかにした［４］。その後、鼻咽頭がん患者の血清中のＥＢＮＡ１、ＥＡ－Ｄ、ＶＣＡ、及び他のタンパクに対する抗体レベルが有意に上昇することが複数の研究で明らかにされた［５－１２］。初期のＥＢＶ抗体検出は主に免疫蛍光法に基づくもので、処理能力が低く、時間がかかり、主観性が高いため、大規模スクリーニング［１３－１５］の必要性を満たすことは困難であった。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の開発に伴い、各国の研究者らは検出スループットと客観性を大幅に向上させた多数のＥＢＶ抗体ＥＬＩＳＡ検出キットを確立した［１６－２３］。さらに、ＥＢＮＡ１－ＩｇＡとＶＣＡ－ＩｇＡの組み合わせが最も広く使用されている様々な血清学的マーカーの組み合わせによって、鼻咽頭がんスクリーニングの感度及び特異度がさらに改善される可能性があることも複数の研究で明らかにされている［２４－２６］。プロスペクティブコホート研究の結果から、スクリーニングによって鼻咽頭がんの早期診断率が１０～２０％から６０％以上に上昇する可能性があることが示された［２７－２９］。これに基づき、著者らの研究グループは２段階スクリーニング戦略を提案した。すなわち、ＥＢＮＡ１－ＩｇＡとＶＣＡ－ＩｇＡを用いた組み合わせスクリーニングに基づいて、第一段階で同定された高リスク集団においてＥＡＤ－ＩｇＡのさらなる検出を行い、ＥＡＤ－ＩｇＡ陽性患者を鼻咽頭内視鏡で確認した。２段階スクリーニングでは、鼻咽頭がんスクリーニングの陽性予測値が４．６９％から１８．５２％に上昇した［３０］。

【0004】

ＥＢＶ抗体レベルに加えて、鼻咽頭がん患者の血中のＥＢＶＤＮＡ及びマイクロＲＮＡのレベルも有意に上昇した［３１－３３］。香港のＡｌｌａｎＣｈａｎらが実施したプロスペクティブ研究の結果から、ＥＢＶＤＮＡの持続陽性結果を鼻咽頭がんスクリーニングの標準として用いることにより、鼻咽頭がんスクリーニングの特異度が有意に改善されることが示された。初回スクリーニングでＥＢＶＤＮＡ陽性であった１１１２人の患者（５．５％）のうち、ＥＢＶＤＮＡの持続陽性を示したのはわずか３０９人で、そのうち３４人が最終的に鼻咽頭がんと診断された［３４］。スクリーニング基準としてＥＢＶの陽性結果が持続した場合、感度及び特異度はそれぞれ９７．１％及び９８．６％に達し、陽性予測値は３．０６％から１１％に上昇し、鼻咽頭がんの早期診断率はスクリーニングによって２０％から７１％に上昇した［３４］。

【0005】

１段階のスクリーニングと比較して、２段階のスクリーニングの陽性予測値は有意に改善され、大規模な鼻咽頭がんスクリーニングの必要性を満たすことができる。しかしながら、２段階スクリーニングのプロセスはより複雑であり、血清学的スクリーニング又はＤＮＡスクリーニングのいずれにもコストがかかる。さらに、ＤＮＡの陽性結果が持続すると、さらに採血が必要となり、スクリーニングの困難さがさらに増す。したがって、血清学的抗体スクリーニングのワン工程法は有意に費用対効果が高いが［３５］、２段階スクリーニングがより費用対効果が高いかどうかについては、さらなる評価が必要である。さらに、鼻咽頭がんスクリーニングの現在報告されている方法の最も高い陽性予測値は１８．５２％に過ぎず、スクリーニングを受けた高リスク集団の非鼻咽頭がん患者の少なくとも７１．４８％が上咽頭内視鏡検査を受けるべきである。しかしながら、上咽頭内視鏡は、鼻咽頭がんスクリーニングのスケールを直接制限する長い時間を要すると同時に、スクリーニングで陽性である非鼻咽頭がん患者にも心理的負担をもたらす。

【0006】

従って、既存の方法よりも高い特異性及び陽性予測値を有し、大規模スクリーニングの必要性を満たすために高いスループット及び低コストの特徴を有し、それによってスクリーニングから利益を得ることができる人の数を増加させる鼻咽頭がんのための新しいスクリーニング方法を開発することが、当技術分野において依然として必要である。

【発明の概要】

【0007】

本発明の内容
広範な研究の後、本出願の発明者らは、鼻咽頭がん患者が、対象の血清中のＥＢＶＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体レベルに基づいて、健常な対照と効率的に区別することができることを予期せず発見した（これは、例えば、コーティングのための抗原としてＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるタンパク質又はポリペプチド断片を用いる間接法又は二重抗原サンドイッチ法により検出することができる）。加えて、本発明者らは、かなりの創造的努力により、捕獲試薬（例えば、ＥＬＩＳＡにおけるコーティングのための抗原）として特に適したＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるポリペプチド断片を得た。したがって、本発明者らは、ＥＢＶＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体レベルの検出に基づいて鼻咽頭がんを診断するための方法及びプラットフォームを確立することに成功し、鼻咽頭がんスクリーニングの特異性及び陽性予測値を有意に改善することができる。

【0008】

単離されたポリペプチド又はそのバリアント
第１の実施形態において、本発明は、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質の少なくとも７つの連続するアミノ酸残基からなり、以下の配列：ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５－１１、アミノ酸残基１６－２３、アミノ酸３１－３９、またはアミノ酸残基５３－６０（例えば、アミノ酸残基５３－６１）の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つすべて）を含む、単離されたポリペプチドまたはその変異体を提供し；
ここで、バリアントは、それが由来するポリペプチドと、１つまたはいくつか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個）のアミノ酸残基であり、それが由来するポリペプチドの生物学的機能（例えば、抗ＥＢＶ抗体によって認識および結合される活性）を保持する。

【0009】

ある実施形態において、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質は、配列番号１０１に示される配列を有する。

【0010】

本明細書において、本発明のポリペプチド又はそのバリアントの生物学的機能は、限定されるものではないが、エピトープペプチドとしての抗ＥＢＶ抗体（例えば、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体）によって認識され、結合される活性を含む。

【0011】

特定の実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５３～６０（例えば、アミノ酸残基５３～６１）、アミノ酸残基５～２３、アミノ酸残基１６～３９、アミノ酸残基３１～６０（例えば、アミノ残基３１～６１）、アミノ酸残基５～３９、アミノ酸残基１６～６０（例えば、アミノ酸残基１６～６１）、またはアミノ酸残基５～６０（例えば、アミノ酸残基５～６１）を含む。

【0012】

一実施形態において、単離されたポリペプチドは、少なくとも８個（例えば、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個）の連続したアミノからなる。ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基であり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５３～６０を含む。

【0013】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５３～６１を含む。

【0014】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５１～６５を含む。

【0015】

ある実施形態において、アミノ酸残基５１～６５は、配列番号９７に示される配列を有する。

【0016】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基からなる。

【0017】

１つの実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも１９個（例えば、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個）の隣接アミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５－２３を含む。

【0018】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１～２５を含む。

【0019】

ある実施形態において、アミノ酸残基１～２５は、配列番号１０２に示される配列を有する。

【0020】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基からなる。

【0021】

一実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質の。少なくとも２４個（例えば、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個）からなる。ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質の少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、または少なくとも３９個の連続したアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基１６～３９を含む。

【0022】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１４～５２を含む。

【0023】

ある実施形態において、アミノ酸残基１４～５２は、配列番号８８に示される配列を有する。

【0024】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも３９個の連続したアミノ酸残基からなる。

【0025】

１つの実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも３０個の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基３１～６０を含む。

【0026】

ある実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基３１～６１を含む。

【0027】

一実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされた野生型タンパク質の少なくとも３５個（例えば、少なくとも３６個、少なくとも３７個、少なくとも３８個、少なくとも３９個、少なくとも４０個、少なくとも４１個、少なくとも４２個、少なくとも４３個、少なくとも４４個）の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５～３９を含む。

【0028】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１～５２を含む。

【0029】

ある実施形態において、アミノ酸残基１～５２は、配列番号９１に示される配列を有する。

【0030】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも５３個の連続したアミノ酸残基からなる。

【0031】

一実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質の少なくとも４５個（例えば、少なくとも４６個、少なくとも４７個、少なくとも４８個、少なくとも４９個、少なくとも５０個、少なくとも５１個、少なくとも５２個、少なくとも５３個、少なくとも５４個、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、または少なくとも６４）の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１６～６０を含む。

【0032】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１６～６１を含む。

【0033】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１４～７４（例えば、配列番号９０に示される配列）を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも６１個の連続したアミノ酸残基からなる。

【0034】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１１～６５（例えば、配列番号１０３に示される配列）を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも５５個の連続するアミノ酸残基からなる。

【0035】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１１～７４（例えば、配列番号１０４に示される配列）を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも６４個の連続したアミノ酸残基からなる。

【0036】

一実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質の少なくとも５６個（例えば、少なくとも５７個、少なくとも５８個、少なくとも５９個、少なくとも６０個、少なくとも６１個、少なくとも６２個、少なくとも６３個、少なくとも６４個、少なくとも６５個、少なくとも６６個、少なくとも６７個、少なくとも６８個、少なくとも６９個、少なくとも７０個、少なくとも７１個、少なくとも７２個、少なくとも７３個、または少なくとも７４個）の連続したアミノ酸残基からなり、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５～６０を含む。

【0037】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５～６１を含む。

【0038】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基１～７４を含む。

【0039】

ある実施形態において、アミノ酸残基１～７４は、配列番号８９に示される配列を有する。

【0040】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも７４個の連続したアミノ酸残基からなる。

【0041】

特定の例示的実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５１～５６、アミノ酸残基１～２５、アミノ酸残基１４～５２、アミノ酸残基１～５２、アミノ酸残基１４～７４、アミノ酸残基１１～６５、アミノ酸残基１１～７４、又はアミノ酸残基１～７４からなる群から選択される配列からなる。特定の例示的実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号８８～９１、９７、１０２～１０４からなる群から選択される配列からなる。

【0042】

ある実施形態において、本発明のバリアントは、１、２、３又は４個のアミノ酸残基の置換（例えば、保存的置換又は非保存的置換）によってのみ誘導されるポリペプチドと異なり、それが由来するポリペプチドの生物学的機能（例えば、抗ＥＢＶ抗体によって認識され、結合される活性）を保持する。

【0043】

特定の実施形態において、バリアントは、次の位置に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含まない：ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質に示されるアミノ酸位置に対して、６、９、１０、１１、１６、３１、３３、３８、３９、５３、５４、５６、５７、５８、５９、９５、９６、９７位。

【0044】

特定の実施形態において、バリアントは、以下の位置に対応する１つ以上（例えば、１、２、３、または４つ）のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む：ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質に示されるアミノ酸位置に対して、５、７、８、１２、１３、１４、１５、１９、２２、２４、２５、３２、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、５２、５５、６０、６１、８９、９１、９３または９８位。

【0045】

特定の実施形態において、バリアントは、以下の位置に対応する１つ以上（例えば、１、２、３、または４）のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む：ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質に示されるアミノ酸位置に対して、５、７、８、１２、１３、１４、２２、２５、３２、３４、３５、３６、４０、４１、４２、５２、５５、６０、６１、８９、９１、９３または９８位。

【0046】

特定の実施形態において、バリアントは、以下からなる群から選択される１つまたはいくつか（例えば、１、２、３、または４）のアミノ酸置換を含む：５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、７位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、８位に対応する位置でのアミノ酸のＧによる置換、１２位に対応する位置でのアミノ酸のＧ、Ｔ、Ｄ又はＳによる置換、１３位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、１４位に対応する位置でのアミノ酸のＧによる置換、１５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、２２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、２４位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、２５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３４位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３６位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３７位に対応する位置でのアミノ酸のＡ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＲによる置換、４０位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、４１位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、４２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、５２位に対応する位置でのアミノ酸のＫ、Ｈ、Ａ、ＳまたはＤによる置換、５５位に対応する位置でのアミノ酸のＳによる置換、６０位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、６１位に対応する位置でのアミノ酸のＫ、Ｈ、ＳまたはＡによる置換、８９位に対応する位置でのアミノ酸のＡまたはＴによる置換、９１位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、９３位に対応する位置でのアミノ酸のＱによる置換、９８位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換。

【0047】

特定の実施形態において、バリアントは、以下からなる群から選択される１つまたはいくつか（例えば、１、２、３、または４）のアミノ酸置換を含む：５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、７位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、８位に対応する位置でのアミノ酸のＧによる置換、１２位に対応する位置でのアミノ酸のＧ、Ｔ、ＤまたはＳによる置換、１３位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、１４位に対応する位置でのアミノ酸のＧによる置換、２２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、２５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３４位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３５位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、３６位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、４０位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、４１位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、４２位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、５２位に対応する位置でのアミノ酸のＫ、Ｈ、Ａ、ＳまたはＤによる置換、５５位に対応する位置でのアミノ酸のＳによる置換、６０位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、６１位に対応する位置でのアミノ酸のＫ、Ｈ、ＳまたはＡによる置換、８９位に対応する位置でのアミノ酸のＡまたはＴによる置換、９１位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換、９３位に対応する位置でのアミノ酸のＱによる置換、９８位に対応する位置でのアミノ酸のＡによる置換。

【0048】

特定の実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされる野生型タンパク質の９７個以下（例えば、９６個以下、９５個以下、９４個以下、９３個以下、９２個以下、９１個以下、９０個以下、８９個以下、８８個以下、８７個以下、８６個以下、８５個以下、８４個以下、８３個以下、８２個以下、８１個以下、８０個以下、７９個以下、７８個以下、７６個以下、７５個以下、または７４個以下）の連続するアミノ酸残基からなる。

【0049】

ある実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の１５～８０個（例えば、１５～７４個）の連続するアミノ酸残基からなる。ある実施形態において、単離されたポリペプチドは、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の３９～７４個の連続するアミノ酸残基からなる。

【0050】

１つの実施形態において、単離されたポリペプチド又はそのバリアントは、固体支持体の表面に結合されるか、又は固体支持体に結合され得る修飾基を有する。ある実施形態において、単離されたポリペプチド又はそのバリアントのＣ末端は、固体支持体の表面に結合されるか、又は固体支持体に結合され得る修飾基を有する。ある実施形態において、修飾基は、ビオチン又はアビジンである。ある実施形態において、固体支持体は、磁気ビーズ又はマイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）から選択される。

【0051】

別の実施形態において、単離されたポリペプチド又はそのバリアントは、検出可能な標識を有する。ある実施形態において、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）、蛍光色素、又はビオチンからなる群より選択される。

【0052】

ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチド又はそのバリアントは、その製造方法によって限定されず、例えば、遺伝子工学的方法（組換え技術）又は化学合成方法によって製造することができる。

【0053】

別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。

【0054】

別の実施形態において、本発明はまた、上記のように単離された核酸分子を含むベクターを提供する。本発明のベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。好ましい実施形態において、本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、コスミドなどである。

【0055】

別の実施形態において、本発明はまた、本発明の単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞を提供する。このような宿主細胞には、限定されないが、大腸菌細胞などの原核細胞、酵母細胞などの真核細胞、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞（例えば、マウス細胞、ヒト細胞等）が含まれる。本発明の細胞はまた、２９３Ｔ細胞のような細胞株であってもよい。

【0056】

別の実施形態において、本発明はまた、本発明のポリペプチド又はそのバリアントを調製する方法を提供し、該方法は、ポリペプチド又はそのバリアントの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養し、培養宿主細胞の培養物からポリペプチド又はそのバリアントを回収することを含む。

【0057】

検出キット
第２の実施形態において、本発明は、捕捉試薬を含むキットを提供し、捕捉試薬は、第１の実施形態の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される。ある実施形態において、キットは、さらに、試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコード化されたタンパク質に特異的な抗体を検出する捕捉試薬として単離されたポリペプチド又はその変異体を使用するための指示、又は、対象由来の試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコード化されたタンパク質に特異的な抗体レベルを検出するための捕捉試薬として単離されたポリペプチド又はその変異体を使用するための指示、を含み、それによって、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかを決定する。

【0058】

ある実施形態において、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。

【0059】

いくつかの実施形態において、捕捉試薬は、固体支持体の表面に付着される。ある実施形態において、捕捉試薬のＣ末端は、固体支持体に結合される。本明細書で使用される場合、固体支持体には、高分子材料、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリアクリルアミド若しくはセルロース、で作製またはコーティングされた凹型ウェルプレート、試験管、ビーズ（例えば、ラテックス粒子）またはメンブレン（例えば、ニトロセルロースメンブレン）、あるいはは官能基（アミノ、カルボキシル、ビオチン、アビジンなど）でプレコートされた磁気ビーズが含まれる。ある実施形態において、固体支持体は、磁気ビーズ又はマイクロタイタープレート（例えば、マイクロウェルプレート又はＥＬＩＳＡプレート）から選択される。

【0060】

他の実施形態において、捕獲試薬は、固体支持体に結合することができる修飾基を有する。ある実施形態において、捕獲試薬のＣ末端は、固体支持体に結合することができる修飾基を有する。そのような実施形態において、キットは、固体支持体上に捕捉試薬をコーティングするためのコーティング緩衝液（例えば、炭酸塩緩衝液、リン酸緩衝液、トリス－ＨＣＬ緩衝液、又はホウ酸緩衝液）のようなコーティング試薬をさらに含み得る。固体支持体上のタンパク質又はポリペプチドをコーティングする方法は当技術分野で周知であり、その例としては、物理的吸着、アミノ化又はカルボキシル化表面を介した共有結合カップリング、又はアビジン－ビオチンシステムによって媒介される結合、ポリリジンで予めコーティングされた表面、又はプロテインＡ又はプロテインＧで予めコーティングされた表面が挙げられる。

【0061】

ある実施形態において、キットは、別々の容器内又は単一容器ユニットの別々の区画内に、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた少なくとも固体支持体、及び上記捕捉試薬を含む。

【0062】

いくつかの実施形態において、対象からの試料中の抗エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）抗体レベルを検出することによって、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかを決定する方法は、ダブル抗原サンドイッチ法によって実施される。二重抗原サンドイッチ法による試料中の抗体レベルの検出は、当業者に周知である。このような検出において、「捕捉抗原」及び「検出抗原」は、試料中の抗体が、２つの特異的抗原間の架橋を形成することを可能にし、従って、２つの抗原は、通常、同一であるか、同一のコアエピトープを有するか、又は免疫学的交差反応性を有し、１つの抗体が２つの抗原に結合することを可能にする。

【0063】

従って、ある実施形態において、キットは、検出試薬をさらに含み、検出試薬は、第１の実施形態の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される。

【0064】

ある実施形態において、検出試薬は、検出可能な標識を有する。ある実施形態において、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）、蛍光色素、又はビオチンからなる群より選択される。特定の例示的実施形態において、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）から選択される。

【0065】

ある実施形態において、検出試薬及び捕捉試薬は、同一又は実質的に同一のポリペプチド配列を含む。ある実施形態において、用語「実質的に同一」は、検出試薬及び捕捉試薬に含まれる２つのポリペプチド配列が同一のコア断片を含み、コア断片が、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５～１１、アミノ酸残基１６～２３、アミノ酸残基３１～３９、及び／又はアミノ酸残基５３～６０（例えば、アミノ酸残基５３～６１）からなる群から選択されることを指す。ある実施形態において、用語「実質的に同一」は、検出試薬及び捕捉試薬に含まれる２つのポリペプチド配列が、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５３～６０（例えば、アミノ酸残基５３～６１）、アミノ酸残基５～２３、アミノ酸残基１６～３９、アミノ酸残基５～３９、アミノ酸残基１６～６０（例えば、アミノ酸残基１６～６１アミノ酸残基）、又はアミノ酸残基５～６０（例えば、アミノ酸残基５～６１）の両方を含むことを指す。ある実施形態において、用語「実質的に同一」は、検出試薬及び捕捉試薬に含まれる２つのポリペプチド配列が、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５１～５６、アミノ酸残基１～２５、アミノ酸残基１４～５２、アミノ酸残基１～５２、アミノ酸残基１４～７４、アミノ酸残基１１～６５、アミノ酸残基１１～７４、又はアミノ酸残基１～７４の両方を含むことを指す。

【0066】

他の実施形態において、対象からの試料中の抗エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）抗体のレベルを検出することによって、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかを決定する方法は、間接的方法によって実施される。間接的方法による試料中の抗体のレベルの検出は、当業者に周知である。そのような検出において、「捕捉抗原」は、まず、試料中の抗体と免疫複合体を形成し、次いで、捕捉された抗体は、二次抗体（例えば、抗免疫グロブリン抗体）によって検出される。

【0067】

従って、ある実施形態において、キットは、検出試薬をさらに含み、検出試薬は、検出可能な標識を有する二次抗体から選択される。ある実施形態において、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）、蛍光色素、又はビオチンからなる群より選択される。特定の例示的実施形態において、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）から選択される。

【0068】

ある実施形態において、二次抗体は、試験される抗体が由来する種（例えば、ヒト）の抗体に特異的である。

【0069】

ある実施形態において、二次抗体は、抗免疫グロブリン抗体である。

【0070】

ある例示的実施形態において、キットは、抗ＥＢＶＩｇＧ抗体を検出するために使用される。そのような実施形態において、抗免疫グロブリン抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体のような抗ＩｇＧ抗体から選択される。

【0071】

ある例示的実施形態において、キットは、抗ＥＢＶＩｇＭ抗体を検出するために使用される。そのような実施形態において、抗免疫グロブリン抗体は、抗ヒトＩｇＭ抗体のような抗ＩｇＭ抗体から選択される。

【0072】

ある例示的実施形態において、キットは、抗ＥＢＶＩｇＡ抗体を検出するために使用される。そのような実施形態において、抗免疫グロブリン抗体は、抗ヒトＩｇＡ抗体のような抗ＩｇＡ抗体から選択される。

【0073】

ある実施形態において、本発明のキットは、さらに、（ｉ）対象から試料を収集又は保存するためのデバイス（例えば、採血デバイス）；（ｉｉ）検出を実施するために必要な追加の試薬（例えば、緩衝液、希釈液、ブロッキング溶液、及び／又は標準）からなる群から選択される１つ以上の試薬又はデバイスを含んでもよい。

【0074】

検出の用途及び方法
第３の実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体を検出するための方法を提供する：
（１）試料を捕捉試薬と接触させて抗原－抗体免疫複合体を得；ここで、捕捉試薬は、第１の実施形態において記載された単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される；
（２）工程（１）で得られた抗原－抗体免疫複合体の量の決定。

【0075】

ある実施形態において、工程（２）において、免疫複合体の量は、免疫学的アッセイによって決定される。

【0076】

ある実施形態において、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、又はラジオイムノアッセイから選択される。

【0077】

いくつかの実施形態において、捕捉試薬は、固体支持体の表面に付着される。

【0078】

他の実施形態において、捕獲試薬は、固体支持体に結合することができる修飾基を有する。そのような実施形態において、工程（１）の前に、本方法は、固体支持体の表面上に捕捉試薬をコーティングする工程をさらに含む。

【0079】

ある実施形態において、捕捉試薬のＣ末端は、固体支持体の表面に結合されるか、又は固体支持体に結合され得る修飾基を有する。

【0080】

いくつかの実施形態において、検出は、二重抗原サンドイッチ法によって実施される。二重抗原サンドイッチ法による試料中の抗体のレベルの検出は、当業者に周知である。このような検出において、「捕捉抗原」及び「検出抗原」は、試料抗体が２つの特異的抗原の間の架橋を形成することを可能にする。このように、２つの抗原は、通常、同一であるか、同一のコアエピトープを有するか、又は免疫学的交差反応性を有し、１つの抗体が２つの抗原に結合することを可能にする。

【0081】

従って、ある実施形態において、工程（２）において、免疫複合体の量は、第１の実施形態において記載される単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される検出試薬を使用することによって検出される。

【0082】

ある実施形態において、検出試薬は、第１の実施形態の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択され、単離されたポリペプチド又はそのバリアントは、検出可能な標識を有する。ある実施形態において、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）、蛍光色素、又はビオチンからなる群より選択される。特定の例示的実施形態において、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）から選択される。

【0083】

【0084】

他の実施形態において、検出は間接的方法によって行われる。間接的方法による試料中の抗体のレベルの検出は、当業者に周知である。このような検出において、「捕捉抗原」は、まず、試料中の抗体と免疫複合体を形成し、次いで、捕捉された抗体は、二次抗体（例えば、抗免疫グロブリン抗体）によって検出される。

【0085】

従って、ある実施形態において、工程（２）において、検出可能な標識を有する二次抗体から選択される検出試薬を用いて、免疫複合体の量が検出される。

【0086】

ある実施形態において、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）、蛍光色素、又はビオチンからなる群より選択される。

【0087】

ある実施形態において、二次抗体は、試験される抗体が由来する種（例えば、ヒト）の抗体に特異的である。

【0088】

ある実施形態において、二次抗体は、抗免疫グロブリン抗体である。

【0089】

特定の例示的実施形態において、検出される抗体は、ＩｇＧ抗体である。そのような実施形態において、抗免疫グロブリン抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体のような抗ＩｇＧ抗体から選択される。

【0090】

特定の例示的実施形態において、検出される抗体は、ＩｇＭ抗体である。そのような実施形態において、抗免疫グロブリン抗体は、抗ヒトＩｇＭ抗体のような抗ＩｇＭ抗体から選択される。

【0091】

特定の例示的実施形態において、検出される抗体は、ＩｇＡ抗体である。そのような実施形態において、抗免疫グロブリン抗体は、抗ヒトＩｇＡ抗体のような抗ＩｇＡ抗体から選択される。

【0092】

別の実施形態において、本発明はまた、試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体を検出するためのキットの製造における、第１の実施形態の単離されたポリペプチド又はそのバリアントの使用に関する。ある実施形態において、キットは、第３の実施形態に記載される方法によって、試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体を検出する。

【0093】

診断上の使用及び方法
第４の実施形態において、本発明は、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかを決定するための方法を提供し、以下を含む：
（１）対象由来の試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定すること。
（２）参照値とレベルの比較。

【0094】

ある実施形態において、レベルが参照値を超える場合、対象は、鼻咽頭がんを有するか、又はそのリスクがあると考えられる。

【0095】

ここで、参照値は、鼻咽頭がんのない対象又は健常な対象（例えば、検出可能な疾患がなく、がん又は鼻咽頭がんの病歴がない対象）から得られた値、又は鼻咽頭がんのない対象又は健常な対象から得られた対応する試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコード化されたタンパク質に特異的な抗体のレベルである。

【0096】

ある実施形態において、試料は、全血、血漿、又は血清などの血液試料である。

【0097】

ある実施形態において、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。

【0098】

ある実施形態において、試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルは、免疫学的アッセイによって決定される。ある実施形態において、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、又はラジオイムノアッセイからなる群より選択される。

【0099】

ある実施形態において、検出は、捕捉試薬として、第１の実施形態の単離されたポリペプチド又はそのバリアントを使用することを含む。

【0100】

ある実施形態において、工程（１）は、以下の工程を含む。
（１ａ）対象由来の試料を捕捉試薬と接触させて抗原－抗体免疫複合体を得；ここで、捕捉試薬は、第１の実施形態において記載された単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される；
（１ｂ）工程（１ａ）で得られた抗原－抗体免疫複合体の量を決定する工程。

【0101】

ある実施形態において、工程（１ｂ）において、免疫複合体の量は、免疫学的アッセイによって決定される。ある実施形態において、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、又はラジオイムノアッセイから選択される。

【0102】

いくつかの実施形態において、捕捉試薬は、固体支持体の表面に付着される。

【0103】

【0104】

ある実施形態において、捕捉試薬のＣ末端は、固体支持体の表面に結合されるか、又は固体支持体に結合され得る修飾基を有する。

【0105】

いくつかの実施形態において、検出は、二重抗原サンドイッチ法によって実施される。二重抗原サンドイッチ法による試料中の抗体のレベルの検出は、当業者に周知である。このような決定において、「捕捉抗原」及び「検出抗原」は、試料中の抗体が２つの特異的抗原の間に架橋を形成することを可能にし、従って、２つの抗原は、通常、同一であるか、同一のコアエピトープを有するか、又は免疫学的交差反応性を有し、１つの抗体が２つの抗原に結合することを可能にする。

【0106】

従って、ある実施形態において、工程（１ｂ）において、免疫複合体の量は、検出試薬を用いて検出され、検出試薬は、第１の実施形態において記載された単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される。

【0107】

【0108】

【0109】

他の実施形態において、検出は間接的方法によって行われる。間接的方法による試料中の抗体のレベルの検出は、当業者に周知である。そのような検出において、「捕捉抗原」は、まず、試料中の抗体と免疫複合体を形成し、次いで、捕捉された抗体は、二次抗体（例えば、抗免疫グロブリン抗体）によって検出される。

【0110】

従って、ある実施形態において、工程（１ｂ）において、ある量の免疫複合体が、検出試薬を用いて検出され、検出試薬は、検出可能な標識を有する二次抗体から選択される。

【0111】

【0112】

ある実施形態において、二次抗体は、試験される抗体が由来する種（例えば、ヒト）の抗体に特異的である。

【0113】

ある実施形態において、二次抗体は、抗免疫グロブリン抗体である。

【0114】

【0115】

【0116】

【0117】

ある実施形態において、本方法は、工程（１）の前に、対象からの試料を提供する工程をさらに含む。

【0118】

ある実施形態において、本方法は、工程（２）の後、鼻咽頭がんを治療することができる抗腫瘍療法（例えば、化学療法、放射線療法、及び／又は免疫療法）の治療有効量を、鼻咽頭がんを有するか又は鼻咽頭がんのリスクがあると考えられる対象に投与する工程をさらに含む。

【0119】

特定の実施形態において、鼻咽頭がんを治療することができる抗腫瘍療法は、手術、放射線療法（例えば、外部放射線療法ＥＢＲＴ、小線源治療）、または化学療法（例えば、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、メトトレキサート）、標的療法（例えば、セツキシマブ）、免疫療法（例：ＰＤ－１ｍＡｂ）、および様々な治療法の組み合わせ（例えば、放射線療法＋化学療法、放射線療法＋手術）からなる群から選択される。

【0120】

別の実施形態において、本発明はまた、キットの製造におけるＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体レベルを検出することができる試薬の使用に関し、このキットは、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかを決定するために使用される。

【0121】

ある実施形態において、試薬は、免疫学的アッセイによってＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体レベルを検出することができる。ある実施形態において、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、又はラジオイムノアッセイからなる群より選択される。

【0122】

ある実施形態において、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。

【0123】

ある実施形態において、試料は、全血、血漿、又は血清などの血液試料である。

【0124】

ある実施形態において、キットは、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかを、以下の方法によって決定する：
（１）対象由来の試料中のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体レベルを検出すること。
（２）参照値とレベルの比較。

【0125】

ある実施形態において、そのレベルが参照値より高い場合、対象は、鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあると考えられる。

【0126】

ある実施形態において、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体レベルを検出することができる試薬は、捕捉試薬を含み、捕捉試薬は、第１の実施形態の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される。

【0127】

特定の実施形態において、上記工程（１）は、以下の工程を含む。
（１ａ）対象由来の試料を捕捉試薬と接触させて抗原－抗体免疫複合体を得；ここで、捕捉試薬は、第１の実施形態において記載された単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される；
（１ｂ）工程（１ａ）で得られた抗原－抗体免疫複合体の量を決定する工程。
ある実施形態において、工程（１ｂ）において、免疫複合体の量は、免疫学的アッセイによって決定される。ある実施形態において、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、又はラジオイムノアッセイから選択される。

【0128】

いくつかの実施形態において、捕捉試薬は、固体支持体の表面に付着される。

【0129】

他の実施形態において、捕獲試薬は、固体支持体に結合することができる修飾基を有する。そのような実施形態において、上記工程（１）の前に、本方法は、固体支持体の表面上に捕捉試薬をコーティングする工程をさらに含む。

【0130】

ある実施形態において、捕捉試薬のＣ末端は、固体支持体の表面に結合されるか、又は固体支持体に結合され得る修飾基を有する。

【0131】

いくつかの実施形態において、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができる試薬は、検出試薬をさらに含み、検出試薬は、第１の実施形態において記載された単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される。

【0132】

ある実施形態において、上記工程（１ｂ）において、検出試薬は、免疫複合体の量を検出するために使用される。

【0133】

【0134】

【0135】

他の実施形態において、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体レベルを検出することができる試薬は、検出試薬をさらに含み、検出試薬は、検出可能な標識を有する二次抗体から選択される。

【0136】

ある実施形態において、上記工程（１ｂ）において、検出試薬は、免疫複合体の量を検出するために使用される。

【0137】

【0138】

ある実施形態において、二次抗体は、試験される抗体が由来する種（例えば、ヒト）の抗体に特異的である。

【0139】

ある実施形態において、二次抗体は、抗免疫グロブリン抗体である。

【0140】

【0141】

【0142】

【0143】

用語の定義
本発明では、特に断らない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用されるウイルス学、生化学、及び免疫学の実験手順は、全て、対応する分野で広く使用されるルーチン手順である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連用語の定義及び説明を以下に提供する。

【0144】

本明細書で使用される場合、用語「ＢＮＬＦ２ｂ」は、当業者に周知であるＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）のＢＮＬＦ２ｂ遺伝子を指す（例えば、ＮＣＢＩＧＥＮＢＡＮＫデータベース受託番号：ＣＡＡ２４８１１．１を参照されたい）。ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる全長タンパク質は９８個のアミノ酸を含み、その配列は配列番号１０１に示される。本明細書において、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる全長タンパク質は、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質、又はＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるタンパク質とも呼ばれ得る。

【0145】

本明細書で使用されるように、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を参照する場合、それは配列番号１０１に示される配列を参照して記載される。例えば、発現「ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基５３～６０」は、配列番号１０１に示されるポリペプチドのアミノ酸残基５３～６０を指す。しかしながら、当業者は、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列において、突然変異又は変異は、その生物学的機能に影響を与えることなく、天然に生成され得るか、又は人工的に導入され得ることを理解する。従って、本発明においては、用語「ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされたタンパク質」及び類似の発現は、例えば、配列番号１０１に示される配列及びその天然又は人工の変異体を含む、全てのかかる配列を含むものとする。また、ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされたタンパク質の配列断片を記載する場合、配列番号１０１の配列断片のみならず、その天然又は人工バリアントの対応する配列断片も含む。例えば、「ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたタンパク質のアミノ酸残基５３～６０」の発現は、配列番号１０１のアミノ酸残基５３～６０、及びその（天然又は人工）変異体における対応する断片を含む。本発明によれば、「対応する配列断片」又は「対応する断片」という表現は、配列が最適に整列されたとき、すなわち、配列が整列されて最高の同一性パーセントを得るときに、比較される配列の等価な位置に位置する断片を指す。

【0146】

本明細書で使用される場合、用語「特異的結合」は、２つの分子（すなわち、結合分子及び標的分子）間の非ランダム結合反応、例えば、抗体とそれが向けられる抗原との間の反応を指す。２つの分子間の結合親和性はＫ_Ｄ値で表すことができる。Ｋ_Ｄ値は、Ｋ_Ｄ（特異的結合分子－標的分子相互作用の解離速度；ｋｏｆｆとしても知られる）とｋａ（特異的結合分子－標的分子相互作用の会合速度；ｋｏｎとしても知られる）の比から導かれる解離定数、又はモル濃度（Ｍ）として表されるｋｄ／ｋａを指す。Ｋ_Ｄが小さければ小さいほど、２つの分子間の結合は強くなり、親和性は高くなる。ある実施形態において、抗原（又は抗原に特異的な抗体）に特異的に結合する抗体は、抗体が約１０^－５Ｍ未満、例えば約１０^－６Ｍ未満、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ又は１０^－１０Ｍ以下の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合することを指す。Ｋ_Ｄ値は、バイコア装置における表面プラズモン共鳴を用いるなど、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。

【0147】

本明細書で使用される場合、用語「免疫学的アッセイ」は、抗原－抗体間の特異的相互作用／結合親和性を利用するアッセイを指し、これは、一般に、試料中の特異的抗原又は抗体の存在又はレベルを検出するために使用することができる。そのような免疫学的アッセイは、当業者に周知であり、限定されるものではないが、酵素免疫アッセイ、化学発光免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫アッセイ、ウエスタンブロッティング、免疫濁度法、表面プラズモン共鳴法などを含む。ある実施形態において、免疫学的アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイ、エリスポットアッセイ、又はＣＬＥＩＡアッセイなどの酵素免疫アッセイである。免疫学的アッセイの詳細については、例えば、Fundamental Immunology, Ch. 7 Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, N.Y. (1989)を参照されたい。

【0148】

本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又は抗体によって特異的に結合される抗原上の部位を指す。「エピトープ」は、当技術分野において「抗原決定基」としても公知である。例えば、エピトープは典型的には、固有の空間コンフォメーションで少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続アミノ酸を含み、それは「線状」または「立体」であり得る。線状エピトープでは、タンパク質と相互作用する分子（例えば抗体）との間のすべての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。コンホメーションエピトープにおいては、相互作用部位は、タンパク質中で互いに分離されたアミノ酸残基を横切って存在する。

【0149】

本明細書で使用される場合、用語「検出可能な標識」は、蛍光、分光、光化学、生化学、免疫学、電気、光学又は化学的手段によって検出可能な任意の物質であり得る。そのような標識は、免疫学的検出（例えば、酵素結合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイなど）における使用に適していることが特に好ましい。そのような標識は当技術分野で周知であり、限定されないが、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３２Ｐ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、ローダミン、量子ドットまたはシアニン誘導体（例えば、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ７５０）、発光物質（例えば、アクリジンエステル化合物などの化学発光物質）、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））、金コロイドまたは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色標識、および上記標識で修飾されたアビジン（例えば、ストレプトアビジン）に結合させるためのビオチンが含まれる。このような標識の使用を教示する特許には、限定されないが、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号（それらのすべては参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。本発明に包含される標識は、当技術分野で公知の方法によって検出することができる。例えば、放射性標識は、写真フィルム又はシンチレーション計算機を用いて検出することができ、蛍光標識は、発光を検出するために光検出器を用いて検出することができる。酵素標識は、一般に、基質を酵素に提供し、基質上の酵素の作用によって生成された反応生成物を検出することによって検出され、熱量測定標識は、着色標識を単純に可視化することによって検出される。ある実施形態において、上記のような検出可能な標識を、異なる長さのリンカーを介して検出抗体又は抗原に付着させて、潜在的な立体障害を低減することができる。

【0150】

本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、一般に２対のポリペプチド鎖（各対は１つの軽鎖（ＬＣ）及び１つの重鎖（ＨＣ）を有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖はκ（κ）軽鎖とλ（λ）軽鎖に分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、εに分類できるので、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥと定義される。軽鎖及び重鎖内では、可変領域及び定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与するのではなく、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系第一成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子との免疫グロブリンの結合を媒介するなどの種々のエフェクター機能を示す。ＶＨ及びＶＬ領域はまた、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域を散在させた、高い可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に細分することもできる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端までのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、抗原結合部位を形成する。

【0151】

本明細書で使用される場合、用語「単離された」又は「単離されている」は、自然状態から人工的に得られたものを指す。「単離された」物質又は成分が天然に存在する場合には、それは、その自然環境の変化、又はその物質の自然環境からの分離、又はその両方によることがある。例えば、ある単独のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、生きている動物中に天然に存在し、この天然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、「単離される」と呼ばれる。「単離された」又は「単離されている」という用語は、人工物質又は合成物質の混合物、又は物質の活性に影響を及ぼさない他の不純物の存在を排除するものではない。

【0152】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸送達ビヒクルを指す。ベクターが挿入されたポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質の発現を可能にする場合、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入又はトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができ、それによって運ばれる遺伝物質エレメントを宿主細胞内で発現させることができる。ベクターは当業者に周知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体；λファージ又はＭ１３ファージなどのファージ及び動物ウイルスを含むが、これらに限定されない。ベクターとして使用できる動物ウイルスには、限定されないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、限定されるものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、及びレポーター遺伝子を含む、発現を制御する種々のエレメントを含むことができる。さらに、ベクターは複製起点を含んでもよい。

【0153】

本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターを導入することができる細胞を指し、限定されないが、原核細胞、例えば、大腸菌または枯草菌、真菌細胞、例えば、酵母細胞またはアスペルギルス、昆虫細胞、例えば、Ｓ２ショウジョウバエ細胞またはＳｆ９、あるいは動物細胞、例えば、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ヒト細胞が含まれる。

【0154】

本明細書で使用される場合、用語「同一性」は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の一致度を指す。比較のための２つの配列がある部位に同じ塩基又はアミノ酸のモノマーサブユニットをもつ場合（たとえば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれがある部位にアデニンをもつ場合、又は２つのポリペプチドのそれぞれがある部位にリシンをもつ場合）、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性％は、比較のための全部位数×１００に対して２つの配列が共有する同一部位の数の関数である。例えば、２つの配列の１０個の部位のうち６個が一致する場合、これらの２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴ及びＣＡＧＧＴＴは５０％の同一性を共有する（６つの部位のうち３つは一致する）。一般に、２つの配列の比較は、最大の同一性を生じるような方法で行われる。このようなアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970）の方法に基づくアラインプログラムのようなコンピュータプログラムを用いて行うことができる。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重量残留テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを用いて決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ）のアルゴリズムによって決定することができる。さらに、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップの重み、１、２、３、４、５、または６の長さの重みを用いる、ＧＣＧソフトウェア（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３（１９７０））のアルゴリズムによって、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージを決定することができる。

【0155】

本明細書で使用される場合、用語「保存的置換」とは、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの予想される特性に不利に影響を及ぼさず、又は変化しないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような当技術分野で公知の標準的技術によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、物理的又は機能的に類似の残基（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力を含む化学的性質など）で対応するアミノ酸残基と置換される置換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、酸性側鎖を持つアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸など）、荷電していない極性側鎖を持つアミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を持つアミノ酸（スレオニン、バリン、イソロイシンなど）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなど）が含まれる。したがって、対応するアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるBrummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); and Burks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997)を参照されたい。

【0156】

本明細書でカバーする２０種類の従来のアミノ酸は、従来の用法に従うように書かれている。例えば、参照により本明細書に組み込まれるImmunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))を参照されたい。本発明において、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同じ意味を有し、互換的に使用される。また、本発明において、アミノ酸は、一般に、当該技術分野で周知の１文字及び３文字の略号によって表される。例えば、アラニンはＡ又はＡｌａで表すことができる。

【0157】

本明細書で使用する「対象」という用語は、限定されるものではないが、種々の動物、特にヒトのような哺乳動物を含む。

【0158】

有益な効果
本発明は、ＥＢＶＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体のレベルが、鼻咽頭がんの診断又は鼻咽頭がんのリスクの評価に使用可能であり、その診断性能が、鼻咽頭がんスクリーニングの特異性及び陽性予測値を有意に改善することができる既存のマーカーよりも有意に優れていることを初めて発見する。また、本発明は、ＥＢＶＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質又はポリペプチド断片に基づく鼻咽頭がんの血清学的スクリーニングキットを初めて提供する。

【0159】

従来技術と比較して、本発明の技術的解決策は、ＥＢＶ抗体の既知の組み合わせ検出に匹敵する検出感度、及びより良好な検出特異性を達成することができ、迅速かつ高スループット検出を実現することができ、それにより、有意な臨床的価値を有する。

【0160】

本発明の実施形態は、図面及び実施例を参照して以下に詳細に説明されるが、当業者は、以下の図面及び実施例は、本発明の範囲を制限するのではなく、本発明を例示するためにのみ使用されることを理解するであろう。本発明の種々の目的及び有利な実施形態は、添付の図面及び好ましい実施形態の以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0161】

【図1】図１は、実施例２及び３における８７のＥＢＶポリペプチド（番号１－８７）と、鼻咽頭がん（ＮＰＣ）の１つのプール血清試料及び健常な対照（Ｈ１－Ｈ３）の３つの血清試料におけるＩｇＡ及びＩｇＧ抗体の反応性を示す。左図はＩｇＡ抗体、右図はＩｇＧ抗体、横軸は異なる血清試料、縦軸は異なるＥＢＶポリペプチドを表し、色が濃いほど反応性が高い。

【図2】図２は、実施例２及び３における異なるＥＢＶポリペプチドを有する鼻咽頭がん患者及び健常対照者由来の血清試料中の抗体の反応性を示し、横座標はＥＢＶポリペプチドを表し、縦座標は反応ＯＤ値（対数スケール）を表す。

【図3】図３は、実施例４におけるＢＮＬＦ２ｂコード化タンパク質ａａ１４－５２と鼻咽頭がん患者及び健常対照者の血清試料におけるＩｇＧ抗体の反応性を示す。図３Ａは、異なる試料の検出されたＯＤ値（対数目盛）を示す。図３ＢはＲＯＣ曲線分析の結果を示し、横座標は１００特異性％、縦座標は感度％を表す。

【図4】図４は、実施例４におけるＢＮＬＦ２ｂコード化タンパク質ａａ１－７４と鼻咽頭がん患者及び健常な対照の血清試料におけるＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の反応性を示す。図４Ａは検出されたＯＤ値を示し、横座標は血清分類を示し、縦座標はＯＤ値（対数目盛）であり；図４ＢはＲＯＣ曲線分析の結果を示し、横座標は１００特異性％、縦座標は感度％を示す。図４Ｃは、健常対照の血清試料中のＩｇＡ及びＩｇＭ抗体のＢＮＬＦ２ｂコード化タンパク質ａａ１－７４との反応性を示し、横座標は抗体型を示し、縦座標はＯＤ値（対数目盛）を示す。

【図5】図５は、実施例５におけるＢＮＬＦ２ｂ抗体についての二重抗原サンドイッチ法による、鼻咽頭がんの５０の血清試料及び健常対照の５００の血清試料の検出結果を示す。図５Ａは検出ＯＤ値、横座標は血清分類、縦座標はＯＤ値（対数目盛）；図５ＢはＲＯＣ曲線分析の結果、横座標は１００特異性％、縦座標は感度％を示す。

【図6】図６は、鼻咽頭がんの７４の血清試料及び健常対照の２５０の血清試料のＥＢＮＡ１／ＩｇＡ検出及びＶＣＡ／ＩｇＡ検出、ならびに実施例６における２の組み合わせ検出によって算出された鼻咽頭がんの確率を示す。横座標は血清分類を表し、縦座標は図に示す。図６Ａ及び図６Ｂは、検出されたＯＤ値（対数目盛）、及び図中の座標を表す。図６Ｃは鼻咽頭がんの確率を表す。

【図7】図７は、実施例６におけるＢＮＬＦ２ｂ抗体についての二重抗原サンドイッチ法により検出された鼻咽頭がん患者及び健常対照者の血清試料の検出結果を示し、横座標は血清分類を表し、縦座標は反応ＯＤ値を表す。

【図8】図８は、実施例６におけるＢＮＬＦ２ｂ抗体のための二重抗原サンドイッチ法及びＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡの複合検出のＲＯＣ曲線を示し、横座標は１００特異性％を表し、縦座標は感度％を表す。

【図9】図９は、実施例１０におけるＢＮＬＦ２ｂコード化タンパク質の異なるペプチド断片と鼻咽頭がんの血清試料中のＩｇＧ抗体の反応性を示し、ここで横座標は異なるＢＮＬＦ２ｂポリペプチドを表し、縦座は鼻咽頭がんのプール血清試料のシリアル番号を表し、色が濃いほど反応性が高い。

【図10】図１０は、鼻咽頭がんの２つのプールされた血清試料におけるＩｇＧ抗体の実施例１０におけるＢＮＬＦ２ｂコード化タンパク質の異なるペプチドセグメントとの反応性を示し、ここで、ＡからＤは、鼻咽頭がんの血清試料のａａ１－２５セグメントにおける切断されたペプチド、ａａ３１－４５セグメントにおける切断されたペプチド、ａａ５１－６５セグメントにおける切断されたペプチド、及びａａ８１－９８セグメントにおける切断されたペプチドのそれぞれに対する反応性を表し、横軸は、ポリペプチド位置（例えば、１－２５アミノ酸が１－２５を表す）を表し、縦軸は、未切断セグメントの検出されたＯＤ値に対する検出されたＯＤ値の比を表す。

【図11】図１１は、実施例１０におけるａａ１－２５セグメント内の異なる切断されたポリペプチドを有する鼻咽頭がんの血清試料の反応性を示す。図１１Ａは、ａａ１－２５、ａａ１－１５及びａａ１１－２５、及び図と鼻咽頭がん患者の異なる血清試料の反応性を示す。図１１Ｂは、これらの血清試料のａａ１－２５及びその切断されたポリペプチドとの反応性を示す。横軸は合成ペプチドのアミノ酸位置を表し、縦軸は鼻咽頭がん血清の数を表し、色が濃いほど反応性が高い。

【図12】図１２は、実施例１０におけるＢＮＬＦ２ｂコード化タンパク質突然変異体を有する鼻咽頭がん患者におけるＩｇＧ抗体の反応性を示し、ここで、Ａ～Ｄは、鼻咽頭がんの血清試料のａａ１～２５セグメント内の突然変異体、ａａ３１～４５セグメント内の突然変異体、ａａ５１～６５セグメント内の突然変異体、及びａ８１～９８セグメント内の突然変異体との反応性を表し、横軸は突然変異位置を表し、縦軸は、対応する突然変異なしセグメントの検出されたＯＤ値に対する検出されたＯＤ値の比を表す。

【図13】図１３は、実施例１１における異なるＢＮＬＦ２ｂコード化ポリペプチドを有する鼻咽頭がん患者及び健常対照者の血清試料におけるＩｇＧ抗体の反応性を示し、ここで横座標はポリペプチド断片を表し、縦座標は検出されたＯＤ値を表す。

【発明を実施するための形態】

【0162】

配列情報

【0163】

【表1-1】

【0164】

【表1-2】

【実施例】

【0165】

実施例１：エプスタイン－バーウイルス遺伝子にコードされたポリペプチドの合成
ＧｅｎＢａｎｋ（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：Ｖ０１５５５．２）のＥＢＶＢ９５－８株の８６オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報に基づき、各タンパク質のＢ細胞エピトープをバイオインフォマティクスツールによりオンラインで予測した；予測結果によれば、各タンパク質に対して１～２個の可能性のあるＢ細胞エピトープペプチドを選択し、合成のためにＸｉａｍｅｎＪｉｎｇｊｕＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．に委託した。合成中、ビオチンをポリペプチドのＮ末端に結合させ、その後の実験を容易にした。最後に、８７のＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス遺伝子にコードされたポリペプチド（配列番号１～８７）の合成に成功し、これらのポリペプチドは６８のＯＲＦに由来し、その特異的情報を表１に示した。

【0166】

実施例２：ＥＢＶポリペプチドと血清ＩｇＡ抗体との反応性の評価
実施例１で得られたビオチン標識ポリペプチド（１～８７番）をそれぞれ５００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ストレプトアビジン被覆９６ウェルマイクロウェルプレートにウェル当たり１００μＬで添加し、３７℃で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで２回洗浄し、ブロッキング液２００μＬを各ウェルに加え、３７℃で２時間ブロッキングした後、ブロッキング液を捨て、１：２０希釈鼻咽頭がん患者血清又は陰性対照血清１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、１：２０，０００希釈のＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加え、３７℃で３０分間反応を続け、ＰＢＳＴで５回洗浄した後、各ウェルにＴＭＢ発色溶液１００μＬを加え、３７℃で１５分間インキュベートした後、各ウェルに５０μＬの停止溶液を加え、混合後、４５０及び６３０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。

【0167】

結果を図１に示した。８７のポリペプチドのうち、８つのポリペプチドは、鼻咽頭がんプール血清との反応に対して０．３を超えるＯＤ値を有した（表２－１）。これらの８つのポリペプチドのうち、ＢＳＲＬ１、ＢＬＦ１ｂ、ＢＧＬＦ３、ＢＤＬＦ２及びＢＶＲＦ２遺伝子によりコードされる５つのポリペプチドは、以前の研究で鼻咽頭がんの補助診断について報告されていなかった。

【0168】

さらに、３６の陰性血清試料を通してこれら５つのポリペプチドの特異性を評価し、結果を図に示した。ＢＳＲＦ１、ＢＧＬＦ３及びＢＶＲＦ２遺伝子によりコードされる３つのポリペプチドの特異性は比較的良好であった。同時に、鼻咽頭がんの１２の血清試料を通して上記３つのポリペプチドの検出感度を評価し、その結果を図２に示した。これら３つのポリペプチドの反応性は低く、ＢＳＲＦ１及びＢＶＲＦ２にコードされたポリペプチドは６つの血清試料と０．１より高い反応性を示したが、ＢＧＬＦ３にコードされたポリペプチドはわずか３つの血清試料と０．１より高い反応性を示した。

【0169】

【表2】

【0170】

【表3】

【0171】

実施例３：ＥＢＶポリペプチドと血清ＩｇＧ抗体との反応性の評価
実施例１で合成した８７ポリペプチド（１～８７）と血清ＩｇＧとの反応性を実施例２の方法に従って検出し、ここで、１：５０００で希釈したＨＲＰ標識マウス抗ヒトＩｇＧ（ＷａｎｙｕＭｅｉｌａｎ、北京）を用いてヤギ抗ヒトＩｇＡを置換した。結果を図１に示した。これらのポリペプチドのうち、ＢＺＬＦ１及びＢＲＬＦ１などの遺伝子によりコードされる５つのポリペプチドは、鼻咽頭がんのプール血清と０．１より高い反応性を有し（表３－１）、ＢＮＬＦ１（ＺＴＡ）、ＢＲＬＦ１（ＲＴＡ）及びＢＩＬＦ２（ｇｐ７８）が報告されていた。

【0172】

さらに、３６の陰性血清試料を介してＢＶＲＦ２－及びＢＮＬＦ２ｂ－コード化ポリペプチドの特異性を評価し、その結果を図に示した。ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたポリペプチドと３６の陰性血清試料との反応のＯＤ値が全て０．０３４より低かった表２及び表３－２は、良好な特異性を示している。同時に、１２の鼻咽頭がん血清試料によりＢＮＬＦ２ｂ遺伝子にコードされたポリペプチドの検出感度を評価し、その結果を図に示した。２例では、鼻咽頭がん患者１２例の血清検体のうち６例でＯＤ値が０．１を超えていた。

【0173】

【表4】

【0174】

【表5】

【0175】

実施例４：抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体の間接法の確立と予備的性能評価
さらに、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアパッケージ中のＰｒｏｔｅａｎソフトウェアを介してＢＮＬＦ２ｂ（配列番号１０１）によりコードされるタンパク質の親水性、疎水性及び抗原性を分析し、間接的検出のためのコーティング抗原として使用された２つのポリペプチドａａ１４－５２（配列番号８８）及びａａ１－７４（配列番号８９）を合成した。

【0176】

４．１ポリペプチドａ１４－５２に基づく間接的検出
ポリペプチドａａ１４－５２を炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で１２５ｎｇ／ｍｌに希釈し、１００μＬ／ウェルでコーティングした。実施例３の方法によれば、鼻咽頭がん患者の８６の血清試料及び健常なヒトの１９５の血清試料が検出に使用された。結果を図３Ａに示し、ａａ１４－５２をコーティング抗原として用いた場合、鼻咽頭がん患者の８６血清試料中５７試料はＯＤ値が０．１を超え、健常人の１９５血清試料中全てのＯＤ値が０．０２５未満であった。同時に、ＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡ組み合わせスクリーニング（組み合わせ検出方法については実施例６を参照のこと）により高リスクであるが最終的に非鼻咽頭がんと診断された１２２人の対象の血清試料を検出するために同じ方法を使用し、その結果を図に示した。３ＡではＯＤ値が０．１を超えたのは３例のみであった。ＭｅｄＣａｌｃ１６．２．１ソフトウェア（ＭｅｄＣａｌｃＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｏｓｔｅｎｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によるＲＯＣ曲線解析を、ポリペプチドａ１４－５２に基づく上述の間接検出のデータについて実施し、その結果を図に示した。曲線下面積ＡＵＣが０．９４２、カットオフ値が０．０２５、Ｙｏｕｄｅｎ指数が０．８０、特異度が１００％、感度が８０．２３％（６９／８６）であった３Ｂ。

【0177】

４．２ポリペプチドａａ１－７４に基づく間接検出
コーティング抗原としてポリペプチドａａ１－７４を用いて、４．１と同じ方法で、健常人の６３の血清試料及び鼻咽頭がんの２２１の血清試料を検出した。図４Ａに示すように、鼻咽頭がん患者６３例の血清試料のうち５５例はＯＤ値が０．１を超えていたが、健常な対照の２２１例の血清試料のうち、ＯＤ値が０．１を超えていたのは１０例のみであった。ポリペプチドａａ１－７４に基づく上述の間接法のＲＯＣ曲線分析をさらに実施し、その結果を図４Ｂに示した。この方法が鼻咽頭がん患者を健常人から効率的に識別できることを示し、ＡＵＣは０．９５０であった。カットオフ値を０．１に設定した場合、感度は８７．３０％（５５／６３）、特異度は９５．４８％（２１１／２２１）であった。

【0178】

さらに、ポリペプチドａａ１－７４は、間接法により健常な対照の２２１の血清試料中のＩｇＡ及びＩｇＭ抗体のレベルを検出するためのコーティング抗原としても使用され、ＩｇＡ抗体検出には１：２００００希釈ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用し、ＩｇＭ抗体検出には１：５００００希釈ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ（ＷａｎｙｕＭｅｉｌａｎ、北京）を使用した。結果を図４Ｃに示した。抗ＢＮＬＦ２ｂＩｇＡ抗体及び抗ＢＮＬＦ２ｂＩｇＭ抗体の検出は良好な特異性を示し、４及び７の血清試料のみがそれぞれ０．１より高い検出値を示し、特異性はそれぞれ９８．１９％（２１７／２２１）及び９６．８３％（２１４／２２１）であった。

【0179】

鼻咽頭がんと非鼻咽頭がんを区別する上述の方法の性能を表４に示した。その結果、コーティング抗原としてポリペプチドａ１４－５２を用いたＩｇＧ抗体の間接法、又はコーティング抗原としてポリペプチドａ１－７４を用いたＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ抗体の間接法が、鼻咽頭がんを健常対照と効果的に区別でき、良好な検出感度及び特異性を有するかどうかが示された。

【0180】

【表6】

【0181】

実施例５：抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体の二重抗原サンドイッチ法の確立
実施例４の結果は、３種類の抗体ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧが全て鼻咽頭がんのリスク予測において良好な特異性を有することを示したため、ＢＮＬＦ２ｂに対する全抗体を検出することにより、鼻咽頭がんのリスクを予測することができた。これに基づき、本実施例では、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体を検出するためのダブル抗原サンドイッチ法を確立し、鼻咽頭がんのスクリーニングにおけるその性能を評価した。

【0182】

ＢＮＬＦ２ｂコード化ポリペプチドａａ１－７４を炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈し、ウェル当たり１００μＬで標準９６ウェルマイクロウェルプレートに添加し、３７℃で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで２回洗浄し、ブロッキング溶液２００μＬを各ウェルに加え、ブロッキングを３７℃で２時間行った。ブロッキング後、ブロッキング溶液を廃棄し、６７ｎｇ／ｍｌビオチン化ポリペプチドａａ１－７４及び５０μＬの鼻咽頭がん患者血清又は陰性対照血清を含む５０μＬの希釈液を各ウェルに添加し、反応を３７℃で６０分間行った。反応後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、１：５０００希釈ＨＲＰ標識ストレプトアビジン及び１：１５０００希釈ＨＲＰ標識ａａ１－７４を加え、３７℃で３０分間反応を続け、ＰＢＳＴで５回洗浄した後、各ウェルにＴＭＢ発色溶液１００μＬを加え、３７℃で１５分間インキュベートした後、各ウェルに５０μＬの停止溶液を加え、混合後、４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。この方法を用いて、鼻咽頭がん患者の５０の血清試料及び健常人の５００の血清試料を検出し、その結果を図５Ａに示した。鼻咽頭がん患者５０例中４６例でＯＤ値が０．１を超え、陰性血清５００例中１例のみでＯＤ値が０．１を超えていた。上記の結果をさらにＲＯＣ曲線分析に供し、その結果を図に示した。曲線下面積が０．９７７であり、カットオフ値が０．１の場合、試薬の感度及び特異度はそれぞれ９２．０％及び９９．８％であり、Ｙｏｕｄｅｎ指数は０．９１であった。

【0183】

加えて、鼻咽頭がんの診断における異なるＢＮＬＦ２ｂペプチドの性能を比較するために、ａａ１～７４に加えて、２つのペプチドａ１～５２（配列番号９１）及びａａ１４～７４（配列番号９０）を合成し、それらの両方をＣ末端でビオチン標識した。鼻咽頭がん患者の別の１７５点の血清試料が、同じ方法に従って採取され、検出された。その結果を以下の表に示した。カットオフ値が０．１の場合、３つのポリペプチドの全ての感度は８５％より高く、この方法は被覆抗原としてａａ１－５２、ａａ１４－７４又はａａ１－７４を用いることにより高い検出感度と特異性を有することを示した。

【0184】

【表7】

【0185】

実施例６：抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体の二重抗原サンドイッチ法と既存の鼻咽頭がんスクリーニング試薬の比較
ＺｈｏｎｇｓｈａｎＢｉｏのＥＢＮＡ１／ＩｇＡ検出キット、ＥＵ（Ｃａｔ番号：ＥＩ２７９１－９６０１Ａ）のＶＣＡ／ＩｇＡ検出キット、及び実施例５の二重抗原サンドイッチ法（ａａ１－７４）を用いて、鼻咽頭がん患者の７４の血清試料と健常人の２５０の血清試料の同時検出を行った。ＥＢＮＡ１／ＩｇＡの検出結果を図６Ａに示し、及びＶＣＡ／ＩｇＡの検出結果を図６Ｂに示した。通常、スクリーニング指標としてＥＢＮＡ１／ＩｇＡとＶＣＡ／ＩｇＡを組み合わせて使用し、２つの抗体を組み合わせて使用した場合、鼻咽頭がんの確率は、ＬｏｇｉｔＰ＝－３．９３４＋２．２０３×ＶＣＡ／ＩｇＡ＋４．７９７×ＥＢＮＡ１／ＩｇＡ（Liu, Z., et al. 2013, Am J Epidemiol）と算出され、カットオフ値は０．９８であった。ＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡの組み合わせ検出の結果を図６Ｃに示した。鼻咽頭がん患者７４人中６９人及び健常人２５０人中８人が０．９８より高い確率を有し、感度及び特異度はそれぞれ９３．６４％及び９６．８０％であった。

【0186】

抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体の検出結果を図７に示した。ここでは、鼻咽頭がん患者の血清試料７０例と健常人の血清試料１例のＯＤ値が０．１を超え、０．１をカットオフ値とした場合、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出の感度と特異度は、それぞれ９４．５９％と９９．６０％であった。結果をさらにＳＰＳＳソフトウェアを用いたカイ２乗検定により分析し、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体の検出とＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡの組み合わせは感度に有意差を示さなかったが（Ｐ＝１．００）、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体はＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡの組み合わせより有意に高い特異性を示した（Ｐ＝０．０３７）。

【0187】

上記の抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出及びＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡの組み合わせの結果について、それぞれＲＯＣ曲線分析を行った。結果を図８に示した。抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出とＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡの組み合わせのＡＵＣ値がそれぞれ０．９７と０．９９であり、全体的に有意差はなかったが（Ｐ＝０．３１６）、特異度が９４．５９％以下の場合、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出は常に組み合わせ検出より高い感度を示した。さらに、鼻咽頭がん患者７４人中２８人がＩ／ＩＩ期であり、この２８人のうち１人はＢＮＬＦ２ｂ検出及びＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡの組み合わせの両方で偽陰性であり、従って感度は９６．４３％であった。

【0188】

実施例５及び実施例６のデータを組み合わせて計算したところ、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出の感度は９３．５５％（１１６／１２４）、特異度は９９．７３％（７４８／７５０）であった。文献（Liu, Z., et al. 2013, Am J Epidemiol）の発生率計算式によると、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出の陽性予測値は３３．２％で、ＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡ複合検出の陽性予測値（４．４％，３８／８６２）と比較して有意な改善を示した（Ｐ＜０．０００１）。上記の結果は、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出が、ＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡスクリーニング法の既存の組み合わせと比較して、鼻咽頭がんスクリーニングの特異性及び陽性予測値を有意に改善できることを示した。

【0189】

実施例７：鼻咽頭がんスクリーニングにおける抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体二重抗原サンドイッチ法の適用
集団スクリーニングは広東省中山市（府社と南朗鎮）の高発生率地域の２つの町で実施され、計１３２５人が登録され、府社で４９６人、南朗鎮で８２９人が登録された。実施例６の方法（以下、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出と称する）に従い、これらの試料をＥＢＮＡ１／ＩｇＡ、ＶＣＡ／ＩｇＡ、及び抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体について並行して検出した；ＥＢＮＡ１／ＩｇＡとＶＣＡ／ＩｇＡ（ＬｏｇｉｔＰ＝－３．９３４＋２．２０３×ＶＣＡ／ＩｇＡ＋４．７９７×ＥＢＮＡ１／ＩｇＡ）の組み合わせにより、鼻咽頭がんを発症する確率を算出した。その結果、１３２５名のうち、ＥＢＮＡ１／ＩｇＡ、ＶＣＡ／ＩｇＡ、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体陽性者はそれぞれ１６３名、２１８名、３２名であった。０．９８を超える確率指数を有する１２６人のうち、５人が最終的に鼻咽頭がんと診断されたが、０．９８未満の確率を有する人のうち、腫瘍登録システムによると、鼻咽頭がんと事前に診断された者はいなかった。鼻咽頭がんと診断された５検体のうち、ＶＣＡ／ＩｇＡは１検体のみ検出できたが、他の方法は１００％検出できた。１３２０の非鼻咽頭がん検体において、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出の特異性及び陽性予測値は、それぞれ９７．９５％及び１５．６３％であり、ＥＢＮＡ１／ＩｇＡ、ＶＣＡ／ＩｇＡ及びそれらの組み合わせよりも高かった。

【0190】

【表8】

【0191】

実施例８：抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体二重抗原サンドイッチ法と既存の鼻咽頭がんスクリーニング試薬の併用
実施例６及び実施例７のデータを合わせると、鼻咽頭がん７９例、非鼻咽頭がん１５７０例であった。鼻咽頭がん検体７９検体の検出結果を表７－１に示すが、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出陽性例はＥＢＮＡ１／ＩｇＡ、ＶＣＡ／ＩｇＡ、確率でそれぞれ７０例、６７例、７２例であった。非鼻咽頭がん１５７０例の検出結果を表７－２に示したが、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出陽性例はＥＢＮＡ／ＩｇＡ、ＶＣＡ／ＩｇＡ、確率ともに５例、５例、４例であった。ＥＢＮＡ／ＩｇＡ、ＶＣＡ／ＩｇＡ、ＥＢＮＡ／ＩｇＡ／ＶＣＡ／ＩｇＡによる抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出のさらなる組み合わせ検出の結果を表７－３に示し、ＥＢＮＡ／ＩｇＡと組み合わせた検出後、陽性予測値は１５．１５％から５０％に増加し、検出と組み合わせた後、陽性予測値は１５．１５％から５５．５６％に増加したことを示した。

【0192】

【表9】

【0193】

【表10】

【0194】

【表11】

【0195】

さらに、中山人民病院のＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡの組み合わせにより予備的スクリーニングコホートで高リスクと同定された２２７症例（試料ＩＩ）を収集し、そのうち８例が上咽頭内視鏡により鼻咽頭がんと診断された。結果を表８に示し、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体陽性２４例、そのうち７例が鼻咽頭がんであり、併用検出の感度及び陽性予測値はそれぞれ８７．５０％及び２９．１７％であった。

【0196】

試料ＩＩ及び試料Ｉを合わせると、試料Ｉは、実施例６の２５０人の健常対照者において確率＞０．９８の８症例、及び実施例７の１３２５人のスクリーニングコホートにおいて確率＞０．９８の１２６症例（５症例は鼻咽頭がん）を含んでいた。２つの試料を統合した後、合計１３例の鼻咽頭がん症例と３４８例の非鼻咽頭がん症例が得られ、ＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡの組み合わせの陽性予測値は３．６０％であった。これに基づき、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出後、１３例の鼻咽頭がんのうち１２例が陽性であったが、非鼻咽頭がん３４８例中２１例のみが陽性であったため、併用検出の陽性予測値は３６．３６％に上昇した（表８）。従って、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体とＥＢＮＡ１／ＩｇＡ＋ＶＣＡ／ＩｇＡの組み合わせ検出は、鼻咽頭がんスクリーニングの特異性と陽性予測値をさらに改善することができた。仕事量を減らすために、抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体を最初に検出し、続いてＥＢＮＡ１／ＩｇＡ及びＶＣＡ／ＩｇＡをさらに検出することができた。

【0197】

【表12】

【0198】

実施例９：鼻咽頭がんの補助診断における抗ＢＮＬＦ２ｂ抗体二重抗原サンドイッチ法の適用
鼻咽頭がんの臨床症状は、他の頭頸部疾患との鑑別には不十分である。臨床的に疑われる症例は、主に鼻咽頭内視鏡検査及び病理学的検査により診断される。鼻咽頭がんが疑われた６３例を収集し、そのうち３１例が最終的に鼻咽頭がんと診断された。これら６３例の検体を実施例６の方法による二重抗原サンドイッチ法により検出した結果、鼻咽頭がん３１例中０．１、３０例のカットオフ値がＢＮＬＦ２ｂ抗体陽性であったのに対し、非鼻咽頭がん３２例中２例のみがＢＮＬＦ２ｂ抗体陽性であった。ＢＮＬＦ２ｂ抗体検出は９６．７８％（３０／３１）の感度、９３．７５％（３０／３２）の特異度、９３．７５％（３０／３２）の陽性予測値を示した。以上の結果から、外来症例では、ＢＮＬＦ２ｂ抗体の検出により、不要な鼻咽頭内視鏡検査の数が有意に減少し、患者の経済的及び身体的負担が軽減されることが示された。

【0199】

実施例１０：ＢＮＬＦ２ｂコード化タンパク質の免疫優性エピトープの研究
ＢＮＬＦ２ｂ遺伝子は、全部で９８個のアミノ酸（配列番号１０１）をコードする。ＢＮＬＦ２ｂによりコードされるタンパク質の免疫優性エピトープを分析するために、著者らは９つの重複ポリペプチドを設計した。各ポリペプチドは１５個のアミノ酸を有し（最後のポリペプチドは１８個のアミノ酸を有し）、２つの隣接するポリペプチドは５個のアミノ酸によって重なり合い、Ｃ末端はその後の検出のためにビオチンで標識された（配列番号９２－１００）。実施例３の方法によれば、上述のポリペプチド断片をコーティング抗原として用いることにより、鼻咽頭がん患者の１：３００希釈血清試料中のＩｇＧの検出を行った。結果を図９に示した。これは、ＢＮＬＦ２ｂコードタンパク質のエピトープが主に４つのセグメント：ａａ１－２５、ａａ３１－４５、ａａ５１－６５及びａａ８１－９８に位置することを示した。

【0200】

さらに、実施例３の方法に従った鼻咽頭がんの４３の血清試料を介して、鼻咽頭がんスクリーニングにおける４つのセグメントポリペプチドａａ１－２５（配列番号１０２）、ａａ３１－４５（配列番号９５）、ａａ５１－６５（配列番号９７）、ａａ８１－９８（配列番号１００）の感度を予め評価した。その結果、カットオフ値が０．１の場合、検出感度はａａ５１－６５に対して７６．７％（３３／４３）、ａａ１－２５に対して７２．１％（３１／４３）であり、他の２つのペプチドの感度は５５．８％（２４／４３）であった。ａａ１４－５２及びａａ１－７４の感度は９０．７％（３９／４３）及び９３．０％（４０／４３）であり、３つの血清試料についてはａａ１－７４の検出に失敗したが、４つのポリペプチドの全ては陰性であり、ａａ１４－５２及びａａ１－７４の血清試料の反応はａａ５１－６５と共に０．３９３であった。

【0201】

これらのエピトープを構成する重要なアミノ酸をさらに決定するために、ａａ１－２５、ａａ３１－４５、ａａ５１－６５及びａａ８１－９８に基づいてＮ末端及びＣ末端切断をさらに行い、一連のポリペプチドを合成した。この実験では、鼻咽頭がんの４０の血清試料を混合してプール血清の２つの試料を形成し、１：３００希釈後、実施例３の方法に従ってＩｇＧ検出を行い、結果を図１０に示した。

【0202】

（１）ａａ１－２５セグメント（図１０Ａ）：Ｃ末端が変化せず、Ｎ末端が１６位に切断された場合、鼻咽頭がん血清中のＩｇＧに結合することができたが、１９位に切断された場合、鼻咽頭がん血清中のＩｇＧとの反応性は完全に失われた；同様に、Ｎ末端が変化せず、Ｃ末端が７位に切断された場合、ポリペプチドは鼻咽頭がん血清中のＩｇＧと反応することができたが、Ｃ末端が４位に切断された場合、鼻咽頭がん血清中のＩｇＧとの反応性は完全に失われた。したがって、ａａ１－１５及びａａ１１－２５は、それぞれ鍵アミノ酸ａａ５－７及びａａ１６－１８を有する２つの独立したエピトープを含んでいた。
（２）ａａ３１－４５セグメント（図１０Ｂ）：Ｎ末端切断を有するかＣ末端切断を有するかにかかわらず、ポリペプチドは３７～３９位のアミノ酸ＥＤＲなしで鼻咽頭がん血清中のＩｇＧとの反応性を完全に失った。従って、ＫＥＲ（ａａ３１－３３）とＥＤＲ（ａａ３７－３９）はこのエピトープを構成する重要なアミノ酸であった。
（３）ａａ５１－６５セグメント（図１０Ｃ）：Ｎ末端がａａ５４－５６を含まない場合、又はＣ末端がａａ６０を含まない場合、ポリペプチドは鼻咽頭がん血清との反応性を完全に失った。
（４）ａａ８１－９８セグメント（図１０Ｄ）：Ｎ末端がａａ８７－８９を含まない場合、又はＣ末端がａａ９６－９８を含まない場合、ポリペプチドは鼻咽頭がん血清との反応性を完全に失った。

【0203】

ａａ１－２５セグメントがａａ１－１５及びａａ１１－２５セグメントに及ぶエピトープを含むかどうかを分析するために、ａａ１－１５、ａａ１１－２５及びａａ１－２５をそれぞれ被覆抗原として用いることにより、鼻咽頭がんの４３の血清試料中にＩｇＧを検出した。結果を図１１Ａに示した。１４の血清試料がａａ１～２５との反応のＯＤ値を有し、ａａ１～１５とａａ１１～２５との反応の値の合計よりも高かったことを示した。１４の血清試料を、コーティング抗原としてａａ１－２５セグメント中の異なる切断ポリペプチドを用いることによってさらに検出し、結果を図１１Ｂに示した。陽性血清と反応し得るポリペプチドが少なくともａａ１０－１６を含有することを示した。

【0204】

加えて、上記の４つの主要セグメントに対して、自然及び人工変異体を含む一連の変異体も合成した。実施例３の方法によれば、これらの変異体は、鼻咽頭がんの１：３００希釈プール血清試料中のＩｇＧとの反応性を検出するためのコーティング抗原として使用され、結果が図１２に示された。

【0205】

（１）ａａ１－２５（図１２Ａ）：６、９～１１および１６位のアミノ酸の突然変異後に最も明らかな減少が観察された。１２位にはＴ、Ｄ及びＳの３つの自然の突然変異があり、これら３つのアミノ酸へのアラニンの変異は、ａａ１－２５と鼻咽頭がん血清との反応性を有意に低下させなかった。さらに、５、７、８、１３、１４、１５、１９、２２、２４、および２５位のアミノ酸変異は、比較的ほとんど影響を示さなかった。
（２）ａａ３１－４５（図１２Ｂ）：Ｋ３１、Ｒ３３、およびＤ３８とＲ３９がアラニンに変異された後、ポリペプチドの鼻咽頭がん血清との反応性は著しく低下し、これらのアミノ酸がエピトープを構成する重要なアミノ酸であることが示された；さらに、３２、３４、３５、３６、３７、４０、４１、および４２位のアミノ酸変異は、比較的ほとんど影響を示さなかった。
（３）ａａ５１－６５（図１２Ｃ）：Ｒ５３とＮ５４、およびａａ５６－５９がアラニンに変異した場合、ポリペプチドの鼻咽頭がん血清との反応性は有意に低下したが、５２、５５、６０および６１位は比較的影響が少なかった。
（４）ａａ８１－９８（図１２Ｄ）：ａａ９５－９７の３つのアミノ酸がアラニンに変異した場合、ポリペプチドの鼻咽頭がん血清との反応性は最も顕著に低下した。さらに、８９、９１、９３、および９８位のアミノ酸変異は、比較的ほとんど影響を示さなかった。

【0206】

上記の結果は、ＢＮＬＦ２ｂにコードされたタンパク質のａａ５－１１、ａａ１６－２３、ａａ３１－３３、ａａ３７－３９、ａ５３－６０及びａａ８９－９８がコアセグメントであることを示した。

【0207】

実施例１１：鼻咽頭がんスクリーニング性能に及ぼすＢＮＬＦ２ｂコード化タンパク質の異なるエピトープの併用の効果
上記ａ１４－５２、ａａ１－７４、ａａ１－５２及びａａ１－２５の合成ポリペプチドに基づき、別の２つのポリペプチドａａ１１－６５（配列番号１０３）及びａａ１１－７４（配列番号１０４）をさらに合成し、それらのＣ－末端でビオチン標識した。実施例３の方法によれば、これらのポリペプチドの、鼻咽頭がん患者の８４の血清試料及び健常なヒトの１６８の血清試料との反応が、それぞれ検出された。鼻咽頭がんの血清試料との６つのポリペプチドの反応性は、健常対照との反応性よりも有意に高かった（図１３）。ＭｅｄｃａｌソフトウェアによるＲＯＣ曲線分析の結果は、６つのポリペプチドのすべてが０．９５を超える曲線下面積、８９％を超える感度及び９６％を超える特異性を有することを示した（表９）。上記の結果は、１つ以上のコアセグメント（ａａ５－１１、ａａ１６－２３、ａａ３１－３３、ａ３７－３９、ａ５３－６０）を含むＢＮＬＦ２ｂコード化ポリペプチド断片が鼻咽頭がんの優れたスクリーニング性能を有することを示した。

【0208】

【表13】