ホーム > 特許ランキング > ＡｌｐｈａＢｅｔａ ＡＢ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-07
(54)【発明の名称】アルツハイマー病の治療のための化合物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230228BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230228BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230228BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230228BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230228BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230228BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230228BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
A61K38/17
A61K48/00
A61P25/28
A61P43/00 105
A61K31/7088
C07K14/47 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022541987
(86)(22)【出願日】2021-01-07
(85)【翻訳文提出日】2022-09-02
(86)【国際出願番号】 EP2021050168
(87)【国際公開番号】W WO2021140140
(87)【国際公開日】2021-07-15
(31)【優先権主張番号】20150738.1
(32)【優先日】2020-01-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511180101
【氏名又は名称】アルファベータ・エービー
【氏名又は名称原語表記】ＡｌｐｈａＢｅｔａ ＡＢ
(74)【代理人】
【識別番号】100108855
【弁理士】
【氏名又は名称】蔵田 昌俊
(74)【代理人】
【識別番号】100179062
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 正
(74)【代理人】
【識別番号】100199565
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 茂
(74)【代理人】
【識別番号】100212705
【弁理士】
【氏名又は名称】矢頭 尚之
(74)【代理人】
【識別番号】100219542
【弁理士】
【氏名又は名称】大宅 郁治
(74)【代理人】
【識別番号】100153051
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 直樹
(74)【代理人】
【識別番号】100162570
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 早苗
(72)【発明者】
【氏名】ヨハンソン、ヤン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA20
4C084BA21
4C084BA22
4C084BA35
4C084CA18
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA161
4C084ZA162
4C084ZB211
4C084ZB212
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA16
4C086ZB21
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
Bri2 BRICHOSに少なくとも７０％の配列同一性を有する９０～２００アミノ酸残基の部分を含む単離されたタンパク質であって、全長Bri2 wt中の２２１位のＡｒｇに対応するアミノ酸残基がＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓではない、単離されたタンパク質。タンパク質は、アルツハイマー病の治療に使用するための医薬として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する９０～２００アミノ酸残基の部分を含む単離されたタンパク質であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位に対応するアミノ酸残基がＧｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択される、単離されたタンパク質。
【請求項2】
前記配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位に対応するアミノ酸残基がＧｌｕである、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項3】
前記部分が、配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１又は２に記載の単離されたタンパク質。
【請求項4】
５００アミノ酸残基以下からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項5】
配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質をコードする配列を含む核酸。
【請求項7】
医薬としての使用のための、配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する９０～２００アミノ酸残基の部分を含む単離されたタンパク質であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位に対応するアミノ酸残基がＡｒｇ、Ｌｙｓ若しくはＨｉｓではない、単離されたタンパク質、又は前記単離されたタンパク質をコードする核酸。
【請求項8】
前記配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位に対応するアミノ酸残基が、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択される、請求項７に記載の使用のための単離されたタンパク質又は核酸。
【請求項9】
前記配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位に対応するアミノ酸残基が、Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択される、請求項８に記載の使用のための単離されたタンパク質又は核酸。
【請求項10】
前記配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位に対応するアミノ酸残基がＧｌｕである、請求項９に記載の使用のための単離されたタンパク質又は核酸。
【請求項11】
前記部分が、配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項７～１０のいずれか一項に記載の使用のための単離されたタンパク質又は核酸。
【請求項12】
５００アミノ酸残基以下からなる、請求項７～１１のいずれか一項に記載の使用のための単離されたタンパク質又は核酸。
【請求項13】
配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の使用のための単離されたタンパク質又は核酸。
【請求項14】
アルツハイマー病の治療における使用のための、請求項７～１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質又は核酸。
【請求項15】
請求項７～１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質又は核酸の治療的有効量を含む医薬組成物。
【請求項16】
医薬として使用するための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
アルツハイマー病の治療に使用するための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項18】
アルツハイマー病を治療する医薬の製造のための、請求項７～１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質又は核酸の使用。
【請求項19】
請求項７～１３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質若しくは核酸又は請求項１５に記載の医薬組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、それを必要とする、ヒトを含む前記哺乳動物においてアルツハイマー病を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、哺乳動物、例えばヒトにおけるアルツハイマー病の治療及び医学的処置のための医薬に関する。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー病は、ヒトの認知症の最も一般的な原因の１つである。それは、罹患した個体の脳における神経細胞変性に関連する慢性で致死性の疾患であり、アミロイドβペプチド（Ａβペプチド）の細胞外沈着からなるアミロイドプラークの存在によって特徴づけられる。
【0003】
Ａβ前駆体タンパク質（ＡβＰＰ）のタンパク質分解は、さまざまな長さのＡβペプチドを生成し、そのうちＡβ４２は最も凝集しやすく毒性である。Ａβ４２凝集の動態は、近年明確になった核形成依存性微視的事象に従う。一次核形成の際にＡβ４２単量体は会合して核を形成し、それから線維が伸長を開始できる。二次核形成の際に単量体は、線維の表面に付着し、新たな核の形成を触媒し、指数関数的な線維の成長をもたらす。この単量体依存性二次核形成自己触媒的経路は、毒性Ａβ４２種の主な供給源である。ＡＤの治療を見いだすことにおける重要な課題は、全体的な凝集及びプラーク形成に注目することではなく、Ａβ４２の神経毒性を具体的に低減することである。
【0004】
凝集を妨げる１つの戦略は、機能的にシャペロンと定義されている分子を利用することである。シャペロンは、複雑な細胞内環境でタンパク質の正しいフォールディングを助けることで重要な役割を果たしている。多数の分子シャペロン、例えばヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ）は、フォールディング工程において重要であることが公知で、広範に研究されている。これらのシャペロンの一部は、明らかに、特定のポリペプチドのアミロイド線維形成と相互作用でき、影響を与えることができる。
【0005】
BRICHOSドメインは、いくつかのヒト前駆体タンパク質、最初にBri2、コンドロモジュリン－１及びプロサーファクタントタンパク質Ｃ（proSP-C）において見いだされた。Sanchez-Pulido et al., Trends Biochem Sci 27(7): 329-332,2002は、BRICHOSドメインについて概説している。BRICHOSドメインは、生合成中にそれぞれのプロタンパク質の凝集しやすい領域（クライアント）のアミロイド形成を妨げることが示唆されている。proSP-C及びBri2由来の組換えヒト（rh）BRICHOSドメインは、メジン（medin）、膵島アミロイドポリペプチド、Ａβ４０及びＡβ４２といった非クライアントタンパク質のアミロイド形成の効果的な阻害剤でもある。
【0006】
国際公開第2011/162655号は、Bri2のBRICHOSドメインが、Ａβペプチド及びＡＢｒｉ／ＡＤａｎペプチドの、アミロイド線維形成及び凝集を減少させることを開示している。
【0007】
Bri2は、中枢神経系（ＣＮＳ）で産生され、ヒトでは海馬及び皮質のニューロンで発現し、ＡＤ患者では老年性プラークと共局在する。Bri2の公知の配列として、アミメウナギ（Erpetoichtys calabaricus）（NCBI受託番号：XP_028655526）及びコチョウザメ（Acipenser ruthenus）（UniProt／TrEMBL受託番号：A0A444U9X2）由来の配列が挙げられる。BRICHOSドメインは、生理的条件下でBri2前駆体タンパク質からタンパク質分解によって遊離される。組換えヒト（rh）Bri2 BRICHOSは、in vitroでＡβ４２線維形成を阻害することに、並びに海馬切片調製物及びショウジョウバエモデルにおいて関連する神経毒性を軽減することに効果がある。rh proSP-C BRICHOSは、Ａβ４２線維形成において二次核形成ステップを具体的に妨害する。rh Bri2 BRICHOSは、伸長及び二次核形成事象を調節するが、Bri2 BRICHOSの異なるアセンブリ状態は、Ａβ線維形成に異なる影響を与える。Bri2 BRICHOS単量体は、Ａβ４２によるニューロンネットワーク活性の破壊を予防することに最も強力であり、二量体はＡβ４２全体の線維形成を最も効率的に抑制し、オリゴマーは非線維性タンパク質凝集を阻害する（Chen et al., Nat. Commun., 8: 2081 (2017)）。Bri2 BRICHOS単量体は、長期間安定ではなく、in vitroのリン酸緩衝液中又はマウス血清中で、濃度に依存的して高分子量オリゴマーを形成し、Ａβ４２線維形成に対する効力の低減が伴う。健常対照と比較してＡＤ脳において、さまざまなBri2形態の量の増加が見いだされたことから、Bri2 BRICHOS単量体から高分子量オリゴマーへの転換はＡＤに関連する可能性がある。これらの結果は、単量体の量が増加するようにBri2 BRICHOSアセンブリ状態の分布を調節することが、Ａβ４２の神経毒性に対抗するための概念であることを示唆している、例えば国際公開第2012/138284号を参照。
【0008】
当技術分野におけるこれらの進歩にもかかわらず、哺乳動物、例えばヒトにおけるアミロイドタンパク質線維の形成に関連する状態を治療するための改善された別の治療法に対し強い必要性がある。
【発明の概要】
【0009】
本発明の目的は、線維化しやすいタンパク質がアミロイド線維に凝集するのを減少させる、又は、線維化しやすいタンパク質のアミロイド線維への凝集を妨げることである。
【0010】
本発明の目的はまた、線維化しやすいタンパク質の哺乳動物の脳における細胞外沈着からなるアミロイドプラークの形成を減少させることである。
【0011】
本発明の目的はまた、アルツハイマー病の治療のための新たな選択肢を提供することである。
【0012】
更に別の目的は、アルツハイマー病の治療のための化合物、化合物の組合せ及びそのような化合物を含む医薬組成物を提供することである。
【0013】
本発明の目的は、Ａβ４２の神経毒性に対抗するために単量体の量を増加させるように、Bri2 BRICHOSアセンブリ状態の分布を調節することである。
【0014】
本発明は、ヒト由来Bri2のBRICHOSドメインに高い同一性を有するシャペロンタンパク質の単量体が、アルツハイマー病の医学的処置のために有用であるとの知見に一般に基づいている。本発明者らは、単量体性状態を安定化させるBri2 BRICHOSの単一点変異体を設計する。この変異体単量体は、Ａβ４２の神経毒性を強力に予防し、具体的に線維形成の際に二次核形成を抑制し、重要なことに、Ａβ４２の神経毒性に対する野生型（wt）タンパク質を顕著に増強する。
【0015】
続く記載から明らかになるこれらの及び他の目的のために、本発明は異なる側面による新たな単離されたタンパク質；タンパク質を含む医薬組成物；アルツハイマー病の治療における医薬使用としてのタンパク質の使用；及びタンパク質の投与を含むアルツハイマー病を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【0017】
配列表
配列番号１ ヒトBri2
配列番号２ ＮＴ＊－Bri2 BRICHOS変異体
配列番号３ Bri2 BRICHOS［Ｂｒｉ２（１１３～２３１）］
配列番号４ Bri2 BRICHOS［Ｂｒｉ２（１１３～２３１）］変異体
配列番号５ ヒトBri2（１～８９）
配列番号６ ヒトBri23［Ｂｒｉ２（２４４～２６６）］
配列番号７ ヒトBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ［Ｂｒｉ２（１３７～２３１）］
配列番号８ チンパンジーBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ
配列番号９ ウシBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ
配列番号１０ ブタBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ
配列番号１１ マウスBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ
配列番号１２ ラットBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ
配列番号１３ ヒトBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ［Ｂｒｉ２（１３７～２３１）］変異体
配列番号１４ フォワードＰＣＲプライマー
配列番号１５ リバースＰＣＲプライマー
配列番号１６ ＮＴ＊－Bri2 BRICHOS変異体［ＤＮＡ］
配列番号１ ヒトBri2
配列番号２ ＮＴ＊－Bri2 BRICHOS変異体
配列番号３ Bri2 BRICHOS［Ｂｒｉ２（１１３～２３１）］
配列番号４ Bri2 BRICHOS［Ｂｒｉ２（１１３～２３１）］変異体
配列番号５ ヒトBri2（１～８９）
配列番号６ ヒトBri23［Ｂｒｉ２（２４４～２６６）］
配列番号７ ヒトBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ［Ｂｒｉ２（１３７～２３１）］
配列番号８ チンパンジーBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ
配列番号９ ウシBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ
配列番号１０ ブタBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ
配列番号１１ マウスBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ
配列番号１２ ラットBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ
配列番号１３ ヒトBri2Ｂｒｉｃｈｏｓ［Ｂｒｉ２（１３７～２３１）］変異体
配列番号１４ フォワードＰＣＲプライマー
配列番号１５ リバースＰＣＲプライマー
配列番号１６ ＮＴ＊－Bri2 BRICHOS変異体［ＤＮＡ］
【発明を実施するための形態】
【0018】
膜内在性タンパク質２Ｂ（ＩＴＭ２Ｂ）とも呼ばれるBri2（配列番号１）は、残基１３７～２３１の進化的に保存されたBrichosドメインを含有する（図１、配列番号７～１２）。あるいは、Bri2のBrichosドメインは、残基１１３～２３１と見なしてもよい（配列番号３）。
【0019】
本発明は、ヒト由来Bri2のBRICHOSドメインに高い同一性を有するシャペロンタンパク質の単量体が、アルツハイマー病の医学的処置のために有用であるとの知見に一般に基づいている。本発明者らは、単量体性状態を安定化させるBri2 BRICHOSの単一点変異体を設計する。それは、マウス血清中での長期間のインキュベーションで安定であり、血液脳関門（ＢＢＢ）透過性である。この変異体単量体は、Ａβ４２の神経毒性を予防することにおいて強力であり、具体的に線維形成の際に二次核形成を抑制し、重要なことに、野生型（wt）タンパク質をＡβ４２の神経毒性に対して顕著に増強する。Bri2 BRICHOSの単一点変異体の全身投与は、ＡＤマウスの記憶応答及び行動において改善を示す。これは、アストロサイト媒介神経炎症の低減も示す。
【0020】
確立したアルツハイマー様病態を有する加齢Ａβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ノックインマウスの、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの反復静脈内注入を用いた処置が、Ａβ４２オリゴマー生成及びin vitroで予測される神経毒性の低減と定量的に一致する程度に、オープンフィールド活性を改善し、アストログリオーシス、ミクログリオーシス及びＡβプラーク負荷を低減することも本明細書で実証された。これらの結果は、in vitroでＡβ４２媒介毒性に対するシャペロン効果が、進行した病態を有するアルツハイマーマウスモデルにおいて臨床的に意義のある処置に転換され得ることを示している。
【0021】
第１の側面によれば、配列番号７で示されるアミノ酸配列又は配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するヒト由来Bri2のBrichosドメインの１つに少なくとも７０％の配列同一性を有する９０～２００アミノ酸残基の部分を含むタンパク質からなる群から選択される単離されたタンパク質が提供され、ここで配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位（Ａｒｇ）対応するアミノ酸残基は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓではない。疑義を避けるために、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位におけるＡｒｇ残基は、配列番号３で示されるアミノ酸配列の１０９位におけるＡｒｇ残基、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列の８５位におけるＡｒｇ残基に対応する。
【0022】
この明細書及び特許請求の範囲全体を通じて使用される場合に、用語「％の配列同一性」は、次のとおり算出される。クエリー配列は、CLUSTAL Wアルゴリズムを使用して標的配列とアラインする（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)）。比較は、最も短いアラインされた配列に対応するウインドウにわたって行う。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列中に同一の対応関係を有するクエリー配列中の位置の百分率が％の配列同一性として報告される。
【0023】
この明細書及び特許請求の範囲全体を通じて使用される場合に、用語「％類似性」は、疎水性残基Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ及びＣｙｓが類似であり；塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓが類似であり；酸性残基Ｇｌｕ及びＡｓｐが類似であり；並びに親水性無荷電残基Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒが類似であること以外は、「％の配列同一性」で記載のとおりに求められる。残りの天然アミノ酸Ｇｌｙは、この文脈においていかなる他のアミノ酸とも類似していない。
【0024】
本明細書全体を通じて別の態様は、同一性の特定の百分率の代わりに類似性の対応する百分率を実現させる。他の態様は、同一性の特定の百分率及び、各配列についての同一性の好ましい百分率の群から選択される別のより高い類似性の百分率を実現させる。例えば、単離されたタンパク質配列は、別のタンパク質配列に７０％類似であってよい；又はそれは別の配列と７０％同一であってよい；又はそれは別の配列に７０％同一であってよく、更に９０％類似であってよい。
【0025】
疑義を避けるために、ヒト由来Bri2のBrichosドメインに少なくとも所与の同一性を有するアミノ酸配列は、７０以上、例えば８０以上、例えば９０以上のアミノ酸残基からなる。好ましいサイズは、７０～１４０アミノ酸残基、例えば８０～１４０アミノ酸残基、例えば９０～１４０アミノ酸残基である。
【0026】
ヒト（配列番号７）、チンパンジー（配列番号８）、ウシ（配列番号９）、ブタ（配列番号１０）、マウス（配列番号１１）及びラット（配列番号１２）由来Bri2のBrichosドメインが高度に保存されていることが注目される、図１の配列比較を参照。いかなる特定の理論にも束縛されることなく、BrichosドメインがＡβペプチドに関して望ましい活性を保有することが考えられる。単離されたタンパク質が、配列番号７で示されるアミノ酸配列及び配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むヒト由来Bri2のBrichosドメインのいずれか１つに、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質からなる群から選択されることが好ましい。好ましい態様では、単離されたタンパク質は、ヒト（配列番号７）、チンパンジー（配列番号８）、ウシ（配列番号９）、ブタ（配列番号１０）、マウス（配列番号１１）及びラット（配列番号１２）由来Bri2のBrichosドメインにおいて保存されている全てのアミノ酸残基、すなわち配列番号７で示されるアミノ酸配列の残基４２、７６及び８２（全長Bri2、配列番号１で示されるアミノ酸配列の残基１７８、２１２及び２１８に対応する）を除く全てのアミノ酸残基を含有する。特定の態様では、単離されたタンパク質は、配列番号７で示されるアミノ酸配列及び配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むヒト由来Bri2のBrichosドメインのいずれか１つを含むタンパク質からなる群から選択され、すなわちそれはこれらのBrichosドメインの１つを含有するが、ここで配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位（Ａｒｇ）に対応するアミノ酸残基はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓではない。
【0027】
ある変形例では、単離されたタンパク質は、ヒト由来Bri2（配列番号１）に少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又は１００％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択されるが、ここで配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位（Ａｒｇ）に対応するアミノ酸残基はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓではない。特定の態様では、単離されたタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列であるが、ここで配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位（Ａｒｇ）に対応するアミノ酸残基はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓではない。
【0028】
特定の態様では、単離されたタンパク質は、配列番号７で示されるアミノ酸配列及び配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むヒト由来Bri2のBrichosドメインのいずれか１つからなる群から選択され、すなわちそれはこれらのBrichosドメインの１つを含有するが、ここで配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位（Ａｒｇ）に対応するアミノ酸残基はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓではない。
【0029】
この明細書に開示した単離されたタンパク質では、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位に対応するアミノ酸残基は、好ましくはＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から、より好ましくはＧｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択される。
【0030】
この明細書に開示した単離されたタンパク質では、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位に対応するアミノ酸残基は、好ましくはＧｌｕである。あるいは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２２１位に対応するアミノ酸残基は、Ａｓｐであってもよい。
【0031】
この明細書で開示したある単離されたタンパク質では、部分は、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する。特異的に単離されたタンパク質の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
【0032】
この明細書で開示した単離されたタンパク質の好ましい群は、その単量体画分である。単量体画分を提供する好ましい１つの方法は、サイズ排除クロマトグラフィーによる分離である。この明細書で開示した単離されたタンパク質の試料中で、少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％又は少なくとも７５％の単離されたタンパク質が単量体として存在することが好ましい。この明細書で開示した単離されたタンパク質の試料中で、本質的に全ての単離されたタンパク質が単量体として存在することが更に好ましい。
【0033】
単離されたタンパク質は、ヒト由来Bri2の残基１～８９（配列番号５）に少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を好ましくは含まない。ある特定の態様では、単離されたタンパク質は、ヒト由来Bri2の残基１～８９（配列番号５）に少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含まない。これは、単離されたタンパク質がBri2のBrichosドメイン及び任意の１つ以上の他のアミノ酸配列と高い類似性又は同一性を示すコアアミノ酸配列を含有することを意味し、他のアミノ酸配列は、ヒト由来Bri2の残基１～８９（配列番号５）に高い類似性又は同一性を示さなくてもよい。
【0034】
疑義を避けるために、１０アミノ酸残基より短いアミノ酸配列は、単離されたタンパク質から除外される文脈では関連すると見なされない。したがって、単離されたタンパク質は、ヒト由来Bri2の残基１～８９（配列番号５）に少なくとも所与の同一性を有する１０アミノ酸残基以上からなるアミノ酸配列は含まない。
【0035】
さらに、単離されたタンパク質は、ヒト由来Bri2の残基２４４～２６６、すなわちヒトBri23（配列番号６）に少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を好ましくは含まない。ある特定の態様では、単離されたタンパク質は、残基ヒトBri23（配列番号６）に少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含まない。上述のとおりこれは、単離されたタンパク質がBri2のBrichosドメイン及び任意の１つ以上の他のアミノ酸配列と高い類似性又は同一性を示すコアアミノ酸配列を含有することを意味し、他のアミノ酸配列は、ヒトBri23（配列番号６）に高い類似性又は同一性を示さなくてもよい。
【0036】
疑義を避けるために、１０アミノ酸残基より短いアミノ酸配列は、単離されたタンパク質から除外される文脈では関連すると見なされない。したがって単離されたタンパク質は、ヒトBri23（配列番号６）に少なくとも所与の同一性を有する１０アミノ酸残基以上からなるアミノ酸配列は含まない。
【0037】
上述したBri2 BRICHOS配列に高い同一性を有するコアアミノ酸配列を含むタンパク質は、コアアミノ酸配列の機能、すなわちＡβペプチドとの相互作用に干渉しない追加的アミノ酸配列を更に含んでよい。追加的アミノ酸配列は、コアアミノ酸配列のＮ末端に、コアアミノ酸配列のＣ末端に、又は両者に接続されてもよい。それは、アミノ酸側鎖を介して、例えばジスルフィド結合を介して接続されてもよい。追加的アミノ酸配列は、本質的に非機能性であってもよく、又は生じたタンパク質に追加的な機能、例えば溶解性、安定性又は望ましい親和性を提供してもよい。コアアミノ酸配列及び任意の追加的アミノ酸配列は、翻訳後化学的修飾を含んで化学的に修飾されてよい。
【0038】
ある特定の態様では、単離されたタンパク質は、５００以下、例えば３００以下、例えば２５０以下、例えば２００以下、例えば１５０以下又は１００アミノ酸残基からなる。ある特定の態様では、単離されたタンパク質は、９０以上、例えば１００アミノ酸残基以上からなる。好ましいサイズは、９０～３００アミノ酸残基、例えば９０～２００又は９０～１４０アミノ酸残基である。
【0039】
単量体性Bri2 BRICHOS種は、Ａβ４２誘発神経毒性を最も効率的に妨げ、それによりオリゴマーへのそれらのアセンブリは、抗Ａβ４２神経毒性の低減を生じる。本研究では、本発明者らは、安定な単量体を形成し、rh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーに単量体を遊離させるＲ２２１Ｅ Bri2 BRICHOS変異体を設計した。rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体は、Ａβ４２凝集の際の毒性種の主な供給源の構成することが以前示されている二次核形成を選択的に遮断することによって、Ａβ４２誘発神経毒性を効率的に軽減する。さらに、wtオリゴマーを分解するrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の能力は、Ａβ４２線維化を遅延させる能力を改善し、重要なことに、海馬切片調製物へのＡβ４２毒性を低減する（図２）。
【0040】
タンパク質毒性に対抗する手段として、アミロイド形成のシャペロン媒介予防、既存の凝集物の脱凝集及び凝集物隔離が挙げられる。本発明者らは、Ａβ４２線維化の際の特定の核形成事象での小さなBri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の阻害効率、及び毒性種の隔離可能性を描出する模式的モデルにおいて本発明者らの結果を合理的に説明した（図６Ａ）。
【0041】
図６は、Bri2 BRICHOSアセンブリ状態をシフトすることによるＡβ４２の神経毒性に対するシャペロン活性の増強についてのモデルを提供する：
（Ａ）Ａβ４２は、それぞれ、速度定数ｋｎ、ｋ＋及びｋ２で、一次核形成、伸長及び二次核形成を介して線維を形成する。Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体（実線矢印）はｋ＋及びｋ２を減弱し、単量体（点線矢印）は主にｋ２を低減する。二次核形成は、新たな核形成単位の形成を触媒し、それは線維形成のためのポジティブフィードバックループとして作用し（曲線の矢印）、この機序は神経毒性Ａβ４２種の生成の強化に関連している可能性がある。さらに、Bri2 BRICHOS単量体の分子サイズは、神経毒性Ａβ４２種の構造的構成要素である可能性があるβ構造Ａβ４２分子の単層によくフィットする。反対に、二量体のサイズは、線維末端（PDB受託番号：5KK3）の横断面の面積によく合致し、線維末端伸長速度の減弱を促進している可能性がある。したがって、ｋ２の特異的な低減を伴う構造的特性は、Bri2 BRICHOS単量体をＡβ４２に関連する神経毒性の予防において最も効率的にする可能性がある。
（Ｂ）rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅは、単量体及びより少量のオリゴマー（破線で示される円内の仮説モデル）を形成する一方で、rh wt Bri2 BRICHOSは単量体と平衡にある高分子量オリゴマー（電子顕微鏡データバンク受託番号：EMD-3918）に主にアセンブルする。rh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体とのインキュベーションは、オリゴマーを不安定化し、動力学的平衡を単量体性状態にシフトし、Ａβ４２の神経毒性の予防における全体的な効力の増加をもたらす（図２）。したがって、このモデルは、単一点変異Ｒ２２１ＥがどのようにBri2 BRICHOSのアセンブリ状態を調節し、それによりＡβ４２線維形成へのその効果を調節し、Ａβ４２に関連する神経毒性に対する活性を強化するのかを理解するための基礎を提供する。
（Ａ）Ａβ４２は、それぞれ、速度定数ｋｎ、ｋ＋及びｋ２で、一次核形成、伸長及び二次核形成を介して線維を形成する。Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体（実線矢印）はｋ＋及びｋ２を減弱し、単量体（点線矢印）は主にｋ２を低減する。二次核形成は、新たな核形成単位の形成を触媒し、それは線維形成のためのポジティブフィードバックループとして作用し（曲線の矢印）、この機序は神経毒性Ａβ４２種の生成の強化に関連している可能性がある。さらに、Bri2 BRICHOS単量体の分子サイズは、神経毒性Ａβ４２種の構造的構成要素である可能性があるβ構造Ａβ４２分子の単層によくフィットする。反対に、二量体のサイズは、線維末端（PDB受託番号：5KK3）の横断面の面積によく合致し、線維末端伸長速度の減弱を促進している可能性がある。したがって、ｋ２の特異的な低減を伴う構造的特性は、Bri2 BRICHOS単量体をＡβ４２に関連する神経毒性の予防において最も効率的にする可能性がある。
（Ｂ）rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅは、単量体及びより少量のオリゴマー（破線で示される円内の仮説モデル）を形成する一方で、rh wt Bri2 BRICHOSは単量体と平衡にある高分子量オリゴマー（電子顕微鏡データバンク受託番号：EMD-3918）に主にアセンブルする。rh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体とのインキュベーションは、オリゴマーを不安定化し、動力学的平衡を単量体性状態にシフトし、Ａβ４２の神経毒性の予防における全体的な効力の増加をもたらす（図２）。したがって、このモデルは、単一点変異Ｒ２２１ＥがどのようにBri2 BRICHOSのアセンブリ状態を調節し、それによりＡβ４２線維形成へのその効果を調節し、Ａβ４２に関連する神経毒性に対する活性を強化するのかを理解するための基礎を提供する。
【0042】
二次核形成によって促進される新たな核形成単位の生成は、小さな神経毒性Ａβ４２種の形成に関連すると示唆されており、それにより二次核形成事象の特異的な予防はＡβ４２誘発神経毒性に対して有益であってよい。さらに、近年の研究は、二次核形成速度の強化によって主に生じる全体的な凝集速度における増加を生じる薬剤も、追加的相互作用が生じる限り、Ａβ４２毒性を抑制するために有益であり得ることを示している。Ａβ４２が引き起こす毒性の詳細な機序はいまだ調査中である一方で、効果がある毒性調節因子は、異常な相互作用のために利用される表面を遮蔽するように神経毒性オリゴマーのＡβ４２種と具体的に相互作用するために特に適していてよい。次いで、これらの相互作用は、基礎をなす神経毒性機序（複数可）、例えば受容体への直接結合又は膜破壊を遅らせてよい。興味深いことに、クラスタリン、Ｈｓｐ７０及びαＢ－クリスタリンを含む、細胞内及び細胞外のシャペロンが、Ａβを含むいくつかの異なるアミロイド原性ペプチドのオリゴマーに結合でき、それにより反応性表面を遮蔽するより大きな種へのそれらのアセンブリを誘導することが示された。この機序がBRICHOSドメインに同様にあてはまるかどうかは依然として検討されているが、電子顕微鏡データはrh Bri2 BRICHOS単量体がオリゴマーのＡβ４２種と相互作用することを示唆している。
【0043】
本発明者らは、現在の研究において、Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体が二次核形成速度を主に減弱する一方で、二量体は伸長及び二次核形成速度に実質的に影響を与えていることを見いだした（図３及び図６Ａ）。これは、Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の存在下で核形成単位の生成数の低減を生じるが、二量体は生じない（図４Ａ）。Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体の分子サイズは、近年発表されたＡβ４２線維構造の横断面の表面によく合致し、Bri2 BRICHOS二量体が、二次核形成速度ｋ２に加えて伸長速度ｋ＋も効率的に減弱する理由の考えられる説明を提供している。単量体と比較したBri2 BRICHOS二量体の異なる特異性も、二次核形成と伸長事象とがＡβ４２凝集物上の別個部位で生じることを支持している。可溶性神経毒性Ａβ４２種の構造的詳細は依然として不明である一方で、毒性Ａβ４２種／オリゴマーのβ構造は報告されている。本発明者らは、Bri2 BRICHOS単量体の分子サイズが、神経毒性Ａβ４２種を築き得るβ構造Ａβ４２分子の単層によくフィットすることを観察した（図６Ａ）。したがって、新たな核形成単位の生成を効率的に低減する能力は、推定神経毒性Ａβ４２種との相互作用のためによく合致した分子サイズと併せて、海馬γ振動へのＡβ４２誘発神経毒性を予防することにBri2 BRICHOS単量体を最も効率的にしている可能性がある（図４Ｂ）。
【0044】
加齢はＡＤの主要リスク因子であるが、詳細な基礎となる機序は不明である。老化の際のシャペロンネットワーク減退は、多数の老化関連疾患に影響を与えると考えられている。老化生物では、ミスフォールドしたタンパク質と機能性シャペロンとの間のバランスは乱されている。さまざまなBri2形態の量の増加が健常対照と比較してＡＤ脳において観察された。シャペロン活性の改善は、局所濃度の増加によって達成され得るが、シャペロンが正確にバランスを保たれていることから、あるシャペロンの過剰産生は疾患を生じる可能性がある。したがって、あるシャペロンネットワークの能力を増大する概念は、プロテオーム劣化（deterioration）に関連する病態を予防する及び治療する可能性を有する。本発明者らの現在の研究では、Ａβ４２誘発神経毒性に対するrh Bri2 BRICHOS活性の増大が、より長いオリゴマーからの単量体性種の形成の結果として生じることが示されている（図２）。したがって結果は、Ａβ４２誘発神経毒性に対する内在性Bri2 BRICHOS活性を強化するための合理的な概念を示唆している。
【0045】
別の側面によれば、この明細書で開示した単離されたタンパク質をコードする配列を含む核酸が提供される。代表的な核酸は、ＮＴ＊－Bri2 BRICHOS変異体をコードする配列番号１６で示される核酸配列であり、並びに配列番号４及び配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するBri2 BRICHOS変異体をコードする配列番号１６で示される核酸配列の部分配列である。
【0046】
さらなる側面によれば、この明細書で開示した単離されたタンパク質又はこの明細書で開示した核酸の治療的有効量を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、そのための好適な医薬用担体も含有する。
【0047】
医薬組成物は医薬として有用である。医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物におけるアルツハイマー病の治療において有用である。
【0048】
関連する側面によれば、ヒトを含む哺乳動物におけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための単離されたタンパク質の使用が提供される。
【0049】
医薬組成物において有用である単離されたタンパク質の好ましい群は、その単量体画分である。単量体画分を提供する好ましい１つの方法は、サイズ排除クロマトグラフィーによる分離である。医薬組成物では、単離されたタンパク質の少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％又は少なくとも７５％が単量体として存在することが好ましい。医薬組成物では、本質的に全ての単離されたタンパク質が単量体として存在することが更に好ましい。
【0050】
単離されたタンパク質は医薬組成物に組み込まれ得る。そのような組成物は、通常、単離されたタンパク質及び好適な薬学的に許容される担体を含む。この明細書では、「好適な医薬用担体」として、薬剤投与に適合性である溶媒、分散媒、コーティング剤、等張及び吸収遅延剤などが挙げられる。補充的な活性化合物も組成物に組み込まれ得る。
【0051】
医薬組成物は、投与のその目的の経路と適合性であるように調合される。投与の経路の例として、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、くも膜下腔内、及び脳室内（例えば、脳槽（cisternal space）に外科的に配置され、インラインフィルターを有するOmayaリザーバー－シャントを使用）投与が挙げられる。
【0052】
組成物について有用である可能性がある非経口送達システムとして、緩速溶解（slow-dissolving）ポリマー粒子、植込み型インフュージョンシステム及びリポソームが挙げられる。非経口適用のために使用される溶液又は懸濁物として、次の構成成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化物質、例えばアルコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸、クエン酸又はリン酸、及び張性の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウム又はブドウ糖、が挙げられ得る。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジ又は複数用量バイアルに封入され得る。
【0053】
アルツハイマー病の治療は、中枢神経系への、好ましくは脳への単離されたタンパク質の直接送達によって達成してもよい。
【0054】
注入可能な使用のために好適な医薬組成物として、滅菌注入可能な溶液又は分散剤の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性である場合）又は分散剤及び滅菌散剤が挙げられる。静脈内投与のために好適な担体として、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（登録商標）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において組成物は、滅菌でなければならず、たやすくシリンジを通過できる程度に流動性であるべきである。それは、製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、微生物、例えば細菌及び真菌の混入に備えて保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）並びにこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、単離されたタンパク質の粒子へのコーティング（例えば、レシチン）によって、分散剤の場合では必要な粒子サイズの維持によって及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アルコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤を含むことが好ましい。そのような薬剤の例として、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール及びソルビトール、並びに塩化ナトリウムが挙げられる。注入可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを組成物中に含ませることによってもたらされ得る。
【0055】
滅菌注入可能な溶液は、必要な量の単離されたタンパク質を必要に応じて上述した成分の１つ又は組合せと共に適当な溶媒中に組み込むことに続く、滅菌ろ過によって調製され得る。一般に分散剤は、基本的な分散媒体及び上述したものから必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に単離されたタンパク質を組み込むことによって調製される。滅菌注入可能な溶液の調製のための滅菌散剤の場合では、好ましい調製方法は、単離されたタンパク質に加えて任意の望ましい成分の粉末を、それらの予め滅菌ろ過された溶液からもたらす真空乾燥及び凍結乾燥である。
【0056】
一態様では単離されたタンパク質は、身体からの急速な排出に対して化合物を保護する担体、例えば、インプラント及びマイクロ封入送達システムが挙げられる放出制御調合物を含んで調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用され得る。そのような調合物の調製のための方法は、当業者に明らかである。リポソーム懸濁物（アルツハイマー病によって具体的に影響を受けた細胞にモノクローナル抗体を用いて標的化されたリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法により調製され得る。
【0057】
容易な投与及び均一な投薬量のために単位剤形で経口又は非経口組成物に調合することが有利である。この明細書では、単位剤形は、治療される対象への統一された投薬に適する物理的に分離した単位を指し、各単位は望ましい治療的効果を生じるように算出された予め定められた量の単離されたタンパク質を、必要な医薬用担体と共に含有する。
【0058】
単離されたタンパク質の毒性及び治療的効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。好適な動物モデル、例えば、Sturchler-Pierrat et al, Rev Neurosci, 10: 15-24, 1999；Seabrook et al, Neuropharmacol 38: 1-17, 1999；DeArmond et al, Brain Pathology 5: 77-89, 1995； Telling, Neuropathol Appl Neurobiol 26: 209-220, 2000;及びPrice et al, Science 282: 1079-1083, 1998においてアミロイドーシスについて記載されたものが使用され得る。
【0059】
毒性と治療的効果との間の用量の比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。高い治療指数を示す化合物は好ましい。毒性を示す化合物も使用されてよいが、非罹患細胞への潜在的な損傷を最小化し、それにより毒性を低減するために、そのような化合物を罹患した組織の部位に標的化する送達系を設計するには注意を要する。
【0060】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトでの使用のための広範な投薬量を調合することに使用され得る。好ましくは化合物の投薬量は、毒性をほとんど又は全く有さないＥＤ５０を含む血漿中濃度の範囲内である。
【0061】
投薬量は、使用される投薬形態及び利用される投与の経路に応じたこの範囲内で変動してよい。使用される化合物について、治療的有効用量は、例えば線維形成の速度又は細胞死の割合が観察される細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する検査化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度を達成するように動物モデルにおいて調合されてよい。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用され得る。血漿中の量は、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定されてよい。
【0062】
この明細書で説明するように、単離されたタンパク質の治療的有効量（すなわち、有効投薬量）は、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１～５０ｍｇ／ｋｇ体重である。化合物は、対象に長期間にわたって、例えば対象の生涯にわたって投与され得る。１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの投薬量は、例えば脳で作用するように指定された抗体の場合、通常適当である。
【0063】
一部の場合では化合物は、一定期間投与され得る。化合物は、慢性的にも投与され得る。当業者は、これだけに限らないが、疾患又は障害の重症度、治療歴、全身状態及び／又は対象の年齢並びに他の疾患の存在を含む、特定の要因が対象を効果的に治療するために必要な投薬量及び時期に影響を与える場合があることを理解する。さらに、治療的有効量の化合物を用いた対象の治療は、単回の治療を含み得る、又は好ましくは一連の治療を含み得る。
【0064】
ヒトＡＰＰを発現しているマウスへの又はヒトへの投与のための組換えの単離されたタンパク質は、いくつかの方法によって製造され得る。組換えタンパク質は、この明細書で記載したように精製できる。
【0065】
単離されたタンパク質が、アルツハイマー病を治療するために動物（例．ヒト）に投与される場合、医師、獣医師又は研究者は、例えば最初に比較的低い用量を、続いて適当な応答が得られるまで用量を増加させて処方してよい。加えて、具体的な動物対象に対する特定の用量が、使用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全身状態、性別及び食事、投与の時期、投与の経路、排出速度、併用する薬物及び調節される発現又は活性の程度を含む、種々の要因に依存することが理解される。
【0066】
医薬組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック又はディスペンサーに含まれ得る。例えば説明書は、アルツハイマー病を有する又はそのリスクがある個体を治療するために組成物を使用するための指示を含み得る。
【0067】
別の側面によれば、単離されたタンパク質又は医薬組成物の治療的有効量の前記哺乳動物への投与を含む、それを必要とする、ヒトを含む哺乳動物におけるアルツハイマー病を治療する方法が提供される。
【0068】
治療方法において有用である単離されたタンパク質の好ましい群は、その単量体画分である。単量体画分を提供する好ましい１つの方法は、サイズ排除クロマトグラフィーによる分離である。治療では、単離されたタンパク質の少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％又は少なくとも７５％が単量体として投与されることが好ましい。本質的に全ての単離されたタンパク質が単量体として投与されることが更に好ましい。
【0069】
特定の態様では、治療は予防的処置であってよい。他の特定の態様では、治療は対症療法的処置であってよい。ある特定の態様では、治療は治癒的処置であってよい。
【0070】
本開示は、アルツハイマー病のリスクがある（又は疑われる）対象を処置する予防的及び治療的方法を提供する。この明細書では、用語「治療」は、疾患、疾患の症状又は疾患になりやすい傾向を治癒する、治す、軽減する、緩和する、変更する、治療する、回復させる、改善する又は影響を与える目的で、アルツハイマー病、疾患の症状又は疾患になりやすい傾向を有する、患者への単離されたタンパク質の適用若しくは投与、又は患者から単離された組織若しくは細胞株への単離されたタンパク質の適用若しくは投与として定義される。
【0071】
一側面では、ポリペプチドの凝集を低減する単離されたタンパク質を対象に投与することによって、Ａβペプチドによって生じる線維形成に関連する疾患又は状態を予防する（すなわち、罹患するリスクを減少させる、又は疾患若しくは状態に関連する症状が出現する割合を減少させる）ための方法が提供される。アルツハイマー病のリスクがある対象は、例えば、当技術分野において公知の適当な診断又は予後徴候アッセイのいずれか又は組合せによって同定され得る。予防的薬剤の投与は、疾患が予防される、あるいはその進行が遅くなるように、疾患の特徴的な症状の出現前であってよい。
【0072】
単離されたタンパク質は、アルツハイマー病に関連する線維形成に関係する障害を予防、処置又は回復させるための治療的有効量で患者に投与され得る。治療的有効用量は、障害の症状の回復をもたらすために十分な化合物の量を指す。そのような化合物の毒性及び治療的効能は、上述した標準的な薬学的手順によって決定され得る。
【0073】
タンパク質が遺伝子治療によって、例えば単離されたタンパク質が中枢神経系中の細胞によって発現されるように、神経系、好ましくは脳の細胞をトランスフェクトするために発現ベクター、プラスミド又はウイルスを使用することによって投与され得ることも検討される。これは、アルツハイマー病の治療のために有用である。
【0074】
本発明は、以下の非限定的な実施例により更に例示される。
【実施例】
【0075】
材料及び方法
Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ及びＡＵ１タグ化Bri2 BRICHOS wtの製造
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）を生成するために、プライマー５’－ＣＡＣＣＴＧＧＧＴＴＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＣＴＧＴＧＴＣＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣ－３’（配列番号１４）及び５’－ＧＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１５）を合成した。ＰＣＲ鋳型としてwt ＮＴ＊－Bri2 BRICHOS（Bri2残基１１３～２３１が続く溶解性タグＮＴ＊に対応する）プラスミドを用いて、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent、米）を用いてBri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅを得、配列を確認した（GATC Bioteq、独）。
Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ及びＡＵ１タグ化Bri2 BRICHOS wtの製造
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）を生成するために、プライマー５’－ＣＡＣＣＴＧＧＧＴＴＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＣＴＧＴＧＴＣＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣ－３’（配列番号１４）及び５’－ＧＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１５）を合成した。ＰＣＲ鋳型としてwt ＮＴ＊－Bri2 BRICHOS（Bri2残基１１３～２３１が続く溶解性タグＮＴ＊に対応する）プラスミドを用いて、QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent、米）を用いてBri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅを得、配列を確認した（GATC Bioteq、独）。
【0076】
配列番号１６で示される核酸配列を有する及びＨｉｓ６－ＮＴ＊－トロンビン切断部位－Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号２）をコードする構築物をSHuffle T7コンピテント大腸菌（E. coli）細胞にトランスフェクトした。細胞を１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地中、３０℃でＯＤ６００ｎｍの約０．９までインキュベートし、２０℃まで低下後、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．５ｍＭで加え、細胞を一晩インキュベートした。次に細胞を７，０００×ｇ遠心分離、４℃で収集し、細胞沈殿物を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、５分間、氷上で超音波処理（２秒間オン、２秒間オフ、出力６５％）した。可溶化液を４℃で３０分間遠心分離し（２４，０００×ｇ）、標的タンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを用いて精製した。Ｈｉｓ６－ＮＴ＊部分を除去するために、融合タンパク質を、トロンビン（１：１０００、酵素対基質、w/w）を用いて一晩４℃で切断し、第２のＮｉ－ＮＴＡカラムにロードした。得られたBri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅタンパク質は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有した。さまざまなrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種（単量体、二量体、オリゴマー）をAKTA system（GE Healthcare、英）を使用して、Superdex 200 PG、200 GL又は75 PGカラム（GE Healthcare、英）によって分離及び分析した。
【0077】
特異的免疫検出のために、ＡＵ１タグ（ＤＴＹＲＹＩ）又はｍＣｈｅｒｒｙドメインをＰＣＲ増幅によってrh wt Bri2 BRICHOSのＣ末端に融合した。Ｈｉｓ６－ＮＴ＊－トロンビン切断部位－Bri2 BRICHOS wt－ＡＵ１又はＨｉｓ６－ＮＴ＊－トロンビン切断部位－Bri2 BRICHOS wt－ｍＣｈｅｒｒｙをコードする構築物を発現させ、Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅについてのものと同じプロトコールを用いて精製した。rh wt Bri2 BRICHOS－ＡＵ１又はrh wt Bri2 BRICHOS－ｍＣｈｅｒｒｙオリゴマーをSuperdex 200 PGカラム（GE Healthcare、英）によって単離した。
【0078】
Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体のＥＳＩ－ＭＳ
ＥＳＩ－ＭＳ分析の前に、ＳＥＣによって単離したrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体を、BioSpin微量遠心機カラム（BioRad、米）を使用して２００ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ７．５に緩衝液交換した。単量体性サブユニットの最終濃度は２０μＭであった。スペクトルを高質量分析のために変更したWaters Synapt G1質量分析計（Waters, Milford, MA）で記録した。試料を施設内で作製した金コートホウケイ酸キャピラリーを使用して質量分析計に導入した。装置の設定：キャピラリー電圧１．５Ｖ、試料コーン電圧３０Ｖ、抽出コーン電圧４Ｖ、コリジョントラップ電圧５０Ｖ及びトランスファー電圧１０Ｖ。ソース圧力は７ｍｂａｒで、トラップガスはＮ２、流量８ｍＬ／ｈであった。データ分析をWaters MassLynx 4.1ソフトウェアを使用して実施した。
ＥＳＩ－ＭＳ分析の前に、ＳＥＣによって単離したrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体を、BioSpin微量遠心機カラム（BioRad、米）を使用して２００ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ７．５に緩衝液交換した。単量体性サブユニットの最終濃度は２０μＭであった。スペクトルを高質量分析のために変更したWaters Synapt G1質量分析計（Waters, Milford, MA）で記録した。試料を施設内で作製した金コートホウケイ酸キャピラリーを使用して質量分析計に導入した。装置の設定：キャピラリー電圧１．５Ｖ、試料コーン電圧３０Ｖ、抽出コーン電圧４Ｖ、コリジョントラップ電圧５０Ｖ及びトランスファー電圧１０Ｖ。ソース圧力は７ｍｂａｒで、トラップガスはＮ２、流量８ｍＬ／ｈであった。データ分析をWaters MassLynx 4.1ソフトウェアを使用して実施した。
【0079】
ＣＤ分光法、ビスＡＮＳ蛍光及びＣＳ熱凝集ＣＤスペクトルを２６０～１９０ｎｍ、２５℃、１ｍｍ路長石英キュベット中、Aviv 410 Spectrometer（Lakewood, NJ、米）を用いてタンパク質濃度１２μＭで記録した。波長工程は０．５ｎｍであり、平均化時間０．３秒間、時定数１００ｍｓ、バンド幅１ｎｍであった。示したスペクトルは、３回の連続したスキャンの平均である。単量体性サブユニットから計算したさまざまなrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の１μＭを、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で２μＭのビスＡＮＳ（4,4’-ビス(フェニルアミノ)-[1,1’-ビナフタレン]-5,5’-ジスルホン酸二カリウム塩）と１０分間、２５℃でインキュベートし、蛍光をSLM-Aminco AB-2分光蛍光計及び恒温キュベットホルダー（Thermo Spectronic, Waltham, MA、米）を用いて記録した。蛍光発光スペクトルを４２０～６００ｎｍで３９５ｎｍでの励起後に記録した。ブタ心臓由来ＣＳ（Sigma-Aldrich、独）を４０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）中で６００ｎＭに希釈し、次にさまざまな濃度の種々のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種を含む及び含まない状態で４５℃で平衡化させた。凝集動態をマイクロプレートリーダー（BMG LabtechからのFLUOStar Galaxy, Offenberg、独）を使用して静止状態条件、４５℃でのインキュベーション中の３６０ｎｍでの吸光度のみかけの増加を読み取ることによって３回反復で測定した。
【0080】
Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅインキュベーション
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）オリゴマー、二量体及び単量体を２０μＭ濃度（単量体性サブユニットに関して）で、ＴｈＴアッセイ緩衝液（０．２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０２％のＮａＮ３を含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）中３７℃でインキュベートした。０、１、４及び２４時間後に試料を取り、還元及び非還元条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥによってアセンブリ状態について分析した。１０μＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅオリゴマー及び単量体をＴｈＴアッセイ緩衝液中、３７℃で一晩インキュベートし、未変性ＰＡＧＥによって分析した。２０μＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体も、０．２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０２％ＮａＮ３を含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０中で、３７℃で一晩インキュベートし、未変性ＰＡＧＥによって分析した。
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）オリゴマー、二量体及び単量体を２０μＭ濃度（単量体性サブユニットに関して）で、ＴｈＴアッセイ緩衝液（０．２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０２％のＮａＮ３を含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）中３７℃でインキュベートした。０、１、４及び２４時間後に試料を取り、還元及び非還元条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥによってアセンブリ状態について分析した。１０μＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅオリゴマー及び単量体をＴｈＴアッセイ緩衝液中、３７℃で一晩インキュベートし、未変性ＰＡＧＥによって分析した。２０μＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体も、０．２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０２％ＮａＮ３を含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０中で、３７℃で一晩インキュベートし、未変性ＰＡＧＥによって分析した。
【0081】
Ａβ４２単量体調製及びＴｈＴアッセイ
Ａβ４２と呼ばれる組換えＭｅｔ－Ａβ（１～４２）をＢＬ２１＊（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌（E. coli）（Ｂ株）細胞で産生し、イオン交換によって精製した。精製したＡβ４２タンパク質を一晩凍結乾燥し、７ＭのＧｄｎ－ＨＣｌ中に再溶解し、次に単量体単離のために０．２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０２％のＮａＮ３を含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０中でSuperdex 75カラム（GE Healthcare、英）に注入した。Ａβ４２濃度を２８０及び３００ｎｍでの吸光度から、（Ａ２８０～Ａ３００）について１，４２４Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を使用して算出した。精製したＡβ４２単量体を低結合エッペンドルフチューブ（Axygene）にアリコートした。アミロイド線維形成の動態の分析のために、３μＭのＡβ４２単量体、１０μＭのＴｈＴ及び、さまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体又は二量体（全ての濃度は単量体性サブユニットを指す）をＡβ４２と比較してモル比０、１０、３０、５０、７０及び１００％で含有する８０μＬ溶液を、透明底及び非結合表面の９６ウエル黒色ポリスチレンマイクロプレート（Corning Glass 3881、米）の半分の領域の各ウエルに加え、静止状態条件下、３７℃でインキュベートした。蛍光を４４０ｎｍ励起フィルター及び４８０ｎｍ発光フィルター（FLUOStar Galaxy from BMG Labtech, Offenberg、独）を使用して記録した。一定濃度（０．９μＭ）のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及び二量体の存在下でのさまざまな濃度のＡβ４２の凝集動態を同じ様式で測定した。Ａβ４２シード調製のために、３μＭのＡβ４２単量体を３７℃で約２０時間インキュベートし、次に生成された線維を水浴中、３分間超音波処理した。シードの存在下でのＡβ４２線維形成動態の分析のために、３μＭのＡβ４２、１０μＭのＴｈＴ、さまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体又は二量体をＡβ４２単量体と比較して、０、１０、３０、５０、７０及び１００％で含有する８０μＬ溶液及び０．６μＭのシード（元のＡβ４２単量体濃度から算出）を、４℃で９６ウエルプレートの半分の領域の各ウエルに３回反復で加え、静止状態条件下、３７℃で直ちにインキュベートした。蛍光を上述のとおり記録した。伸長速度定数ｋ＋（以下を参照）をrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体又は二量体の存在下で、高度にシードされた（highly seeded）実験から算出した。凹面の凝集トレースの初期の傾きを最初の２５～３０分間のトレースの線形フィットによって決定した。凝集トレースを、全ての実験について３～４回反復を使用して正規化及び平均化し、１つのデータセットを明示するデータは同じプレートから記録した。
Ａβ４２と呼ばれる組換えＭｅｔ－Ａβ（１～４２）をＢＬ２１＊（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌（E. coli）（Ｂ株）細胞で産生し、イオン交換によって精製した。精製したＡβ４２タンパク質を一晩凍結乾燥し、７ＭのＧｄｎ－ＨＣｌ中に再溶解し、次に単量体単離のために０．２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０２％のＮａＮ３を含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０中でSuperdex 75カラム（GE Healthcare、英）に注入した。Ａβ４２濃度を２８０及び３００ｎｍでの吸光度から、（Ａ２８０～Ａ３００）について１，４２４Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を使用して算出した。精製したＡβ４２単量体を低結合エッペンドルフチューブ（Axygene）にアリコートした。アミロイド線維形成の動態の分析のために、３μＭのＡβ４２単量体、１０μＭのＴｈＴ及び、さまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体又は二量体（全ての濃度は単量体性サブユニットを指す）をＡβ４２と比較してモル比０、１０、３０、５０、７０及び１００％で含有する８０μＬ溶液を、透明底及び非結合表面の９６ウエル黒色ポリスチレンマイクロプレート（Corning Glass 3881、米）の半分の領域の各ウエルに加え、静止状態条件下、３７℃でインキュベートした。蛍光を４４０ｎｍ励起フィルター及び４８０ｎｍ発光フィルター（FLUOStar Galaxy from BMG Labtech, Offenberg、独）を使用して記録した。一定濃度（０．９μＭ）のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及び二量体の存在下でのさまざまな濃度のＡβ４２の凝集動態を同じ様式で測定した。Ａβ４２シード調製のために、３μＭのＡβ４２単量体を３７℃で約２０時間インキュベートし、次に生成された線維を水浴中、３分間超音波処理した。シードの存在下でのＡβ４２線維形成動態の分析のために、３μＭのＡβ４２、１０μＭのＴｈＴ、さまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体又は二量体をＡβ４２単量体と比較して、０、１０、３０、５０、７０及び１００％で含有する８０μＬ溶液及び０．６μＭのシード（元のＡβ４２単量体濃度から算出）を、４℃で９６ウエルプレートの半分の領域の各ウエルに３回反復で加え、静止状態条件下、３７℃で直ちにインキュベートした。蛍光を上述のとおり記録した。伸長速度定数ｋ＋（以下を参照）をrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体又は二量体の存在下で、高度にシードされた（highly seeded）実験から算出した。凹面の凝集トレースの初期の傾きを最初の２５～３０分間のトレースの線形フィットによって決定した。凝集トレースを、全ての実験について３～４回反復を使用して正規化及び平均化し、１つのデータセットを明示するデータは同じプレートから記録した。
【0082】
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体とwtオリゴマーとの同時インキュベーション
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体（５μＭ）、rh wt Bri2 BRICHOSオリゴマー（５μＭ）及び混合物（rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及びrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマー、５μＭ：５μＭ又は９μＭ：４．５μＭ）を、３７℃で一晩インキュベートした。次に活性（同じ合計rh Bri2 BRICHOS濃度で）を、海馬切片においてＴｈＴアッセイによってＡβ４２線維形成に対して及びγ振動測定によってＡβ４２の神経毒性の予防について検査した（以下を参照）。試料を未変性ＰＡＧＥ及びウサギ抗ＡＵ１抗体（１：１０００、Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を使用するウエスタンブロットによっても分析した。
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体（５μＭ）、rh wt Bri2 BRICHOSオリゴマー（５μＭ）及び混合物（rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及びrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマー、５μＭ：５μＭ又は９μＭ：４．５μＭ）を、３７℃で一晩インキュベートした。次に活性（同じ合計rh Bri2 BRICHOS濃度で）を、海馬切片においてＴｈＴアッセイによってＡβ４２線維形成に対して及びγ振動測定によってＡβ４２の神経毒性の予防について検査した（以下を参照）。試料を未変性ＰＡＧＥ及びウサギ抗ＡＵ１抗体（１：１０００、Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を使用するウエスタンブロットによっても分析した。
【0083】
Ａβ４２凝集動態の分析
さまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体又は二量体の存在下でのＡβ４２の巨視的凝集プロファイルを、実験によるシグモイド方程式にフィットさせた：
さまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体又は二量体の存在下でのＡβ４２の巨視的凝集プロファイルを、実験によるシグモイド方程式にフィットさせた：
【0084】
【数1】
【0085】
式中、τ１／２は凝集半減時間であり、ｒｍａｘは最大成長速度であり、Ａは振幅でありＦ０は基底値である。式（１）を適用することによって、τ１／２及びｒｍａｘをrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種を含む及び含まない凝集トレースについて評価した。
【0086】
合計線維塊濃度、Ｍ（ｔ）の凝集トレースは、次の積分速度則（integrated rate law）によって記載し：
【0087】
【数2】
【0088】
式中、追加的な係数はλ及びκの関数であり：
【0089】
【数3】
【0090】
それらは、微視的速度定数の２つの組合せである
【0091】
【数4】
【0092】
微視的速度定数ｋｎ、ｋ＋及びｋ２は、それぞれ一次核形成、伸長及び二次核形成速度定数であり、パラメーターｎＣ及びｎ２は、それぞれ一次及び二次核形成についての反応次数である。
【0093】
本発明者らは、巨視的凝集プロファイルを記載するために式（２）を適用し、シャペロンの非存在及び存在下での線維形成の時間発展を記載するために必要な一連の微視的速度定数ｋ＋ｋ２及びｋｎｋ＋を比較することによって、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅによって阻害される微視的事象を同定した。
【0094】
最初に一定rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ濃度を用いて異なる初期Ａβ４２単量体濃度での動態トレースを全体的にフィットさせ、ここで√（ｋｎｋ＋）及び√（ｋ＋ｋ２）は、全ての濃度にわたって同じ値に制約される。次に、一定Ａβ４２濃度で異なるrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ濃度を用いた動態データを、この動態核形成モデル（図３）を適用することによって全体的に分析し、ここで√（ｋｎｋ＋）及び√（ｋ＋ｋ２）は全ての濃度にわたるフリーフィッティングパラメーターである。本発明者らは、一定Ａβ４２濃度及び異なるrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ濃度での動態データセットのグローバルフィットも実施し、ここでフィットは、１つのフィッティングパラメーターが全てのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ濃度にわたって一定値に保持される一方で、第２のパラメーターのみがフリーパラメーターであるように制約された。この手順は、単一の速度定数、すなわちｋｎ、ｋ＋又はｋ２が、唯一のフィッティングパラメーターであることをもたらした。
【0095】
核形成単位の生成を例示するために、本発明者らは、ｒｎ（ｔ）＝ｋｎｍ（ｔ）ｎｃ＋ｋ２Ｍ（ｔ）ｍ（ｔ）ｎ２によって、核形成速度ｒｎ（ｔ）による単量体からの新たな線維の生成速度の時間発展を算出した。核形成速度ｒｎ（ｔ）を反応にわたって積分することによって核形成単位の数を算出した。
【0096】
Ａβ４２線維の免疫金染色及び透過型電子顕微鏡分析
５μＭのＡβ４２単量体を３７℃で５０％のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体又は二量体を用いて約１５時間インキュベートし、線維を４℃、２２，０００×ｇでの１時間の遠心分離によって回収した。線維を２０μＬの１×ＴＢＳ中に慎重に再懸濁し、その内２μＬをフォルムバーコートニッケルグリッドにアプライし、約５分間インキュベートした。Kleenexペーパータオルの端を用いて過剰な溶液を除去した。ブロッキングをＴＢＳ中１％のＢＳＡでの３０分間のインキュベーションによって実施し、その後グリッドをＴＢＳによって３×１０分間洗浄した。次にグリッドをヤギ抗Bri2 BRICHOS抗体（１：２００希釈）を用いて一晩、４℃でインキュベートし、３×１０分間、ＴＢＳを用いて洗浄した。最後にグリッドを１０ｎｍ金粒子（BBI Solutions、英；EM.RAG10）にカップリングした抗ヤギＩｇＧ二次抗体（１：４０希釈）を用いて２時間、室温でインキュベートし、５×１０分間、１×ＴＢＳを用いて洗浄した。過剰な溶液をKleenexペーパータオルの端を用いてグリッド表面から除去した。染色のために、２μＬの２．５％の酢酸ウラニルを各グリッドに加え（約２０秒間保持）、過剰な溶液を除去した。グリッドを約２０秒間乾燥させ、透過型電子顕微鏡（TEM, Jeol JEM2100F, 200 kV）によって分析した。
５μＭのＡβ４２単量体を３７℃で５０％のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体又は二量体を用いて約１５時間インキュベートし、線維を４℃、２２，０００×ｇでの１時間の遠心分離によって回収した。線維を２０μＬの１×ＴＢＳ中に慎重に再懸濁し、その内２μＬをフォルムバーコートニッケルグリッドにアプライし、約５分間インキュベートした。Kleenexペーパータオルの端を用いて過剰な溶液を除去した。ブロッキングをＴＢＳ中１％のＢＳＡでの３０分間のインキュベーションによって実施し、その後グリッドをＴＢＳによって３×１０分間洗浄した。次にグリッドをヤギ抗Bri2 BRICHOS抗体（１：２００希釈）を用いて一晩、４℃でインキュベートし、３×１０分間、ＴＢＳを用いて洗浄した。最後にグリッドを１０ｎｍ金粒子（BBI Solutions、英；EM.RAG10）にカップリングした抗ヤギＩｇＧ二次抗体（１：４０希釈）を用いて２時間、室温でインキュベートし、５×１０分間、１×ＴＢＳを用いて洗浄した。過剰な溶液をKleenexペーパータオルの端を用いてグリッド表面から除去した。染色のために、２μＬの２．５％の酢酸ウラニルを各グリッドに加え（約２０秒間保持）、過剰な溶液を除去した。グリッドを約２０秒間乾燥させ、透過型電子顕微鏡（TEM, Jeol JEM2100F, 200 kV）によって分析した。
【0097】
Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅを用いた電気生理学的研究
実験をNorra Stockholm’s Djurfoersoeksetiska Naemnd（dnr N45/13）によって承認された倫理的許可に従って実行した。雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（生後１４～２３日、Charles River、独から供給）を実験で使用した。動物を頭切除術によって屠殺する前にイソフルランを使用して深く麻酔した。
実験をNorra Stockholm’s Djurfoersoeksetiska Naemnd（dnr N45/13）によって承認された倫理的許可に従って実行した。雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（生後１４～２３日、Charles River、独から供給）を実験で使用した。動物を頭切除術によって屠殺する前にイソフルランを使用して深く麻酔した。
【0098】
脳を解剖し、解剖用に変更した氷冷ＡＣＳＦ（人工脳脊髄液）中に置いた。本溶液は、８０ｍＭのＮａＣｌ、２４ｍＭのＮａＨＣＯ３、２５ｍＭのグルコース、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭのアルコルビン酸、３ｍＭのピルビン酸Ｎａ、２．５ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣａＣｌ２及び７５ｍＭのスクロースを含有した。両半球の腹側海馬の水平方向切片（３５０μｍ厚）をLeica VT1200Sビブラトーム（Microsystems, Stockholm、瑞）を用いて作製した。スライス直後に切片を標準的ＡＣＳＦ：１２４ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコース、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３．５ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１．５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するサブマージインキュベーションチャンバーに移した。チャンバーを３４℃に、解剖後少なくとも２０分間保持した。続いて室温（約２２℃）で最低４０分間冷ました。タンパク質（Ａβ４２、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）種及びこれらの組合せ）を、細胞外記録のためにスライスをインターフェース型記録チャンバーに移す前に、１５分間インキュベーション溶液に加えた。インキュベーションの際に、ＡＣＳＦにカーボンガス（５％のＣＯ２、９５％のＯ２）を、通気でスライスに連続的に供給した。
【0099】
記録を、海馬ＣＡ３領域で３～５ＭΩの抵抗に寄せたホウケイ酸ガラス微小電極を用いて実行した。局所電場電位（ＬＦＰ）をインターフェース型チャンバー（灌流量１分間あたり４．５ｍＬ）において３２℃で錐体細胞層に置いたＡＣＳＦを満たした微小電極を使用して記録した。ＬＦＰγ振動を、槽にカイニン酸（ＫＡ）（１００ｎＭ、Tocris）に添加することによって引き起こした。全ての記録が実行される前に振動を２０分間安定化させた。いかなるＡβ４２、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種又はこれらの組合せも、γ振動の安定化の際又はその後の電気生理学的記録の際のいずれの記録チャンバー内にも存在しなかった。インターフェースチャンバー記録溶液は、１２４ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコース、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３．５ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１．５ｍＭのＣａＣｌ２を含有した。
【0100】
インターフェースチャンバーＬＦＰ記録を、４チャネル増幅器／シグナル調整装置Ｍ１０２増幅器（Electronics lab, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Cologne, Cologne、独）を用いて実施した。信号を１０ｋＨｚでサンプリングし、Hum Bug ５０Ｈｚノイズ除去装置（ＬＦＰシグナルのみ；Quest Scientific, North Vancouver, BC, Canada）、１ｋＨｚのソフトウェア低域フィルターを使用して調整し、Digidata 1322A及びClampex 9.6ソフトウェア（Molecular Devices, CA、米）を使用してデジタル化及び保存した。
【0101】
出力スペクトル密度プロット（６０秒長ＬＦＰ記録から）を、Axograph X（Kagi, Berkeley, CA、米）を使用して８，１９２ポイントの平均フーリエセグメントにおいて算出した。振動出力を２０～８０Ｈｚの出力スペクトル密度を積分することによって算出した。データを平均±平均値の標準誤差として報告する。統計解析のためにスチューデントのｔ検定（独立）を使用した。有意水準は＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１である。全ての実験を、同じ動物／調製物の並行対照を用いて実施した。
【0102】
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種及びＡβ４０を用いたＮＭＲ研究
凍結乾燥１５Ｎ－Ａβ４０を１０ｍＭのＮａＯＨ中に２ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解し、２分間、水－氷浴中で超音波処理した。溶液を１６ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、０．０２％のＮａＮ３、０．２ｍＭのＥＤＴＡ及び５％のＤ２Ｏ中に７５μＭの最終Ａβ濃度になるように希釈した。１Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを８℃、低温貯蔵プローブを備えた500 MHz Bruker分光計で、２，０４８×１２８コンプレックスポイント及び３２スキャンを使用して記録した。
凍結乾燥１５Ｎ－Ａβ４０を１０ｍＭのＮａＯＨ中に２ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解し、２分間、水－氷浴中で超音波処理した。溶液を１６ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、０．０２％のＮａＮ３、０．２ｍＭのＥＤＴＡ及び５％のＤ２Ｏ中に７５μＭの最終Ａβ濃度になるように希釈した。１Ｈ－１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを８℃、低温貯蔵プローブを備えた500 MHz Bruker分光計で、２，０４８×１２８コンプレックスポイント及び３２スキャンを使用して記録した。
【0103】
ＢＢＢ通過の分析
３カ月齢Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Taconic、丁）雄マウスを、管理された湿度及び温度下、１２時間明暗周期、群での収容（ケージあたり７匹）、餌及び水を自由摂食で飼った。全ての動物実験は、Soedra Stockholm’s Djurfoersoeksetiska Naemnd（dnr S 6-15）及びLinkoeping’s etiska naemnd（ID855）の倫理委員会によって承認された。マウスに、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体、２０ｍｇ／ｋｇ又は同量のＰＢＳの単回i.v.注入を側面尾静脈に３０ゲージ針を有する０．３ｍＬシリンジを使用して受けさせた。注入前にマウスをシングルケージ中、加熱ランプ下に５分間、尾静脈を拡張させるために置いた。マウスをイソフルランで麻酔し、４０ｍＬの食塩水（０．９％のＮａＣｌ）を用いて、注入後１、２又は６時間心臓内灌流した。迅速に脳を除去し、ドライアイス中で瞬間凍結し、分析まで－８０℃で保存した。
３カ月齢Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ（Taconic、丁）雄マウスを、管理された湿度及び温度下、１２時間明暗周期、群での収容（ケージあたり７匹）、餌及び水を自由摂食で飼った。全ての動物実験は、Soedra Stockholm’s Djurfoersoeksetiska Naemnd（dnr S 6-15）及びLinkoeping’s etiska naemnd（ID855）の倫理委員会によって承認された。マウスに、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４）単量体、２０ｍｇ／ｋｇ又は同量のＰＢＳの単回i.v.注入を側面尾静脈に３０ゲージ針を有する０．３ｍＬシリンジを使用して受けさせた。注入前にマウスをシングルケージ中、加熱ランプ下に５分間、尾静脈を拡張させるために置いた。マウスをイソフルランで麻酔し、４０ｍＬの食塩水（０．９％のＮａＣｌ）を用いて、注入後１、２又は６時間心臓内灌流した。迅速に脳を除去し、ドライアイス中で瞬間凍結し、分析まで－８０℃で保存した。
【0104】
血液を、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体を注入した５、３０、６０、１２０及び３６０分後に、尾静脈から回収した。側面尾静脈を２７ゲージ針を使用して穿刺し、血液５０～１００μＬを各時点で回収した。血液を凝固させ、４℃、１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離して血清を回収し、－２０℃で保存した。分析の前に試料を１×ＰＢＳ中１：５に希釈した。
【0105】
マウス組織を、プロテアーゼ阻害剤を補充した５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％（v/v）のTriton（登録商標）X-100、０．１％（w/v）のＳＤＳ及び１０ｍＭのＥＤＴＡ中でホモジナイズした。脳試料を４℃、３０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離し、次に上清を回収し、－２０℃で保存した。タンパク質濃度をブラッドフォード法によって決定した。血清及び脳試料を２％のＳＤＳ、０．０３ＭのＴｒｉｓ、５％の2-メルカプトエタノール、１０％のグリセリン、ブロモフェノールブルーを含有する変性緩衝液中に調製し、１０分間、９６℃で加熱した。１ウエルあたり総タンパク質１００μｇがロードされるように、血清及び脳ホモジネートについての試料容量を正規化した。試料を１０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル、還元条件で分離し、ニトロセルロース膜（GE Healthcare）にブロットした。ブロット後、膜を５％のミルク／ＰＢＳ中で１時間ブロッキングし、５％のミルク、０．１％のTween（登録商標）／ＰＢＳ中で、ヤギ抗Bri2 BRICHOS抗体（１：３００）を用いた一晩、４℃でのインキュベーションが続いた。膜を３回、０．１％のTween（登録商標）／ＰＢＳを用いて洗浄し、二次抗ヤギ抗体（１：１００００）を用いて１時間、ＲＴでインキュベートした。洗浄後、蛍光画像化システム（Li-Cor, Odysey CLx）を使用して画像を取得した。
【0106】
血清半減期をImageJを用いたrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体性結合強度のデンシトメトリー分析後に算出した。濃度を相対強度として表し、各曲線について５分での試料強度に正規化した。みかけの半減期をGraphPad Prismを使用して非線形単相減衰分析によって得た。
【0107】
アルツハイマー様病態を有するマウスにおけるBri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの効果
アルツハイマー様病態を有する老化ＡＰＰＮＬＦマウスにおけるrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの効果を調査した。ＡＰＰＮＬＦマウスはＡＰＰを生理学的レベルで発現し、Swedish（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）及びBeyreuther／Iberian（Ｉ７１６Ｆ）変異を含有する（Saito et al., Nature Neuroscience 17(5): 661-663 (2014)）。モデルは、ＡＰＰを過発現することなくＡβ４２を過産生することから好ましい。
アルツハイマー様病態を有する老化ＡＰＰＮＬＦマウスにおけるrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの効果を調査した。ＡＰＰＮＬＦマウスはＡＰＰを生理学的レベルで発現し、Swedish（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）及びBeyreuther／Iberian（Ｉ７１６Ｆ）変異を含有する（Saito et al., Nature Neuroscience 17(5): 661-663 (2014)）。モデルは、ＡＰＰを過発現することなくＡβ４２を過産生することから好ましい。
【0108】
研究設計
Swedish（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）及びBeyreuther／Iberian（Ｉ７１６Ｆ）変異を保有するＡｐｐノックイン雌マウス（ＡｐｐＮＬ－Ｆマウス）を動物施設Huddinge campus, Karolinska Institutetで１９カ月まで高齢化させた。マウスを３～５個体の群でケージに入れ、明暗条件は１２時間：１２時間（８：００に点灯）であった。マウスを、ＰＢＳ又はrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ投与に、ｎ＝１０匹／群で無作為に分けた。マウスに、ＰＢＳ又はrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４；２０ｍｇ／ｋｇ体重）注入を静脈内に毎週２回、１０週間受けさせた。マウスを２～４％のイソフルランを使用して麻酔し、ＰＢＳ又はrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅをゆっくりとインフュージョンして注入した。各群から２匹のマウスが、１４回～１６回目の注入後に死んだ。研究は、処置の効果を判定するために一連の行動及び生化学アッセイを使用した。行動及び生化学アッセイを評価する実験者は、介入群には盲検であった。行動実験は、明期（１０：００～１８：００）で実施した。全ての生物学的反復の数は、各方法セクションに示されている。外れ値は、Rout法（Ｑ＝１％）又はPrism 8（GraphPad software Inc., CA、米）を使用するGrubbs方法（α＝０．２）を使用して検出し、除外した。同齢wtマウス、２３～２５カ月齢を一部のデータの比較のために使用した。
Swedish（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）及びBeyreuther／Iberian（Ｉ７１６Ｆ）変異を保有するＡｐｐノックイン雌マウス（ＡｐｐＮＬ－Ｆマウス）を動物施設Huddinge campus, Karolinska Institutetで１９カ月まで高齢化させた。マウスを３～５個体の群でケージに入れ、明暗条件は１２時間：１２時間（８：００に点灯）であった。マウスを、ＰＢＳ又はrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ投与に、ｎ＝１０匹／群で無作為に分けた。マウスに、ＰＢＳ又はrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（配列番号４；２０ｍｇ／ｋｇ体重）注入を静脈内に毎週２回、１０週間受けさせた。マウスを２～４％のイソフルランを使用して麻酔し、ＰＢＳ又はrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅをゆっくりとインフュージョンして注入した。各群から２匹のマウスが、１４回～１６回目の注入後に死んだ。研究は、処置の効果を判定するために一連の行動及び生化学アッセイを使用した。行動及び生化学アッセイを評価する実験者は、介入群には盲検であった。行動実験は、明期（１０：００～１８：００）で実施した。全ての生物学的反復の数は、各方法セクションに示されている。外れ値は、Rout法（Ｑ＝１％）又はPrism 8（GraphPad software Inc., CA、米）を使用するGrubbs方法（α＝０．２）を使用して検出し、除外した。同齢wtマウス、２３～２５カ月齢を一部のデータの比較のために使用した。
【0109】
Swedish及びBeyreuther／Iberian変異に加えてArctic（Ｅ６９３Ｇ）変異を保有するＡｐｐノックイン雌マウス（ＡｐｐＮＬ－Ｇ－Ｆマウス）を３カ月齢で開始して１２週間、ＰＢＳ又はrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ（１０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注入で５日ごとに処置した（合計１７回注入）、ｎ＝１２／群。
【0110】
全ての動物取扱及び実験手順は、地域の倫理指針に従って実行し、Soedra Stockholm’s Djurfoersoeksetiska Naemnd（dnr S 6-15）及びLinkoeping’s animal ethical board（ID 855）によって承認された。
【0111】
行動研究
Ｙ迷路 Ｙ迷路装置は、灰色プラスチックで作られ、中央プラットフォーム（１５×１５×１５ｃｍ）から拡張された３個のコンパートメント（３６×１５ｃｍ）からなる。各マウスを迷路の中央に向けて１つのアームに置き、次に５分間自由に探索させた。全ての匂いの手がかりを除去するために装置を各セッション間に７０％のエタノールを用いて清掃した。マウスの自発的行動を変化の数／（合計エントリー－１）で割ることによって手作業で判定した。
Ｙ迷路 Ｙ迷路装置は、灰色プラスチックで作られ、中央プラットフォーム（１５×１５×１５ｃｍ）から拡張された３個のコンパートメント（３６×１５ｃｍ）からなる。各マウスを迷路の中央に向けて１つのアームに置き、次に５分間自由に探索させた。全ての匂いの手がかりを除去するために装置を各セッション間に７０％のエタノールを用いて清掃した。マウスの自発的行動を変化の数／（合計エントリー－１）で割ることによって手作業で判定した。
【0112】
高架式十字迷路 装置は、中央プラットフォーム（５×５ｃｍ）から拡張された２個の反対方向のオープンアーム（３０×５ｃｍ）及び２個の反対方向のクローズアーム（３０×５ｃｍ、高さ１５ｃｍの透明の壁に囲まれている）からなった。迷路は、拡散光を有する部屋において床から４０ｃｍ上にあげた。マウスをオープンアームに向けて装置の中央に個別に置き、装置を自由に５分間探索させた。全ての匂いの手がかりを除去するために、装置を各セッション間に７０％エタノールを用いて清掃した。オープンアーム（複数可）で過ごした時間及びオープンアームに入った数をビデオトラッキングEthoVision（登録商標）XTソフトウェア、Noldus（Wageningen、蘭）によって測定した。
【0113】
オープンフィールド及び新規物体認識 オープンフィールド活動領域は、２０ｃｍの壁を有する四角いプラスチックボックス（３５×３５）であった。各マウスを不透明な壁に向けて角に穏やかに置き、馴化のために自由に５分間探索させた。２時間の間隔後に、ボックスの角近くに対角線上で置いた２個の類似の試料物体（レゴ）を有する同じオープンボックスにマウスを置き、それらを自由に探索させた。翌日、物体の１つを新たな物体（エッグタイマー）で置き換え、マウスに２個の物体を５分間自由に探索させた。各マウスの行動をビデオで監視し、EthoVision（登録商標）XTソフトウェア、Noldus（Wageningen、蘭）を使用して分析した。活動領域を各セッション後に７０％エタノールを用いて清掃した。馴化相を、EthoVisionソフトウェアの活動トラッキング特性を使用してマウスの活動性を分析するために使用した。マウスの探索行動を習熟相の際に類似の物体について使った時間から分析した。識別指数を新たな物体を探索することに使用した時間を両者の物体を探索するために使用した合計時間で割って算出した。
【0114】
モリス水迷路 マウスを隠された避難プラットフォーム（直径１０ｃｍ、高さ３０ｃｍ）を突き止めるように環状プール（直径１．２ｍ、高さ６０ｃｍ）（Ugobasile、伊）で訓練した。プールを、北東、北西、南東及び南西として同定される４個の等しい四分円にコンピューター上で分割した。タンクを温度２１±２℃の水道水でプラットフォームの上１ｃｍまで満たし、水をミルクで不透明にした。タンクをタンクの底近くの４個のライトで照らした。プラットフォームを固定位置（北西四分円の中央）でタンクに置いた。プールを、拡散光及び実験者及び多数の迷路外視覚刺激を隠すためのカーテンを有する大きな部屋に置いた。取得層の際に、各マウスを１日あたり４回試行で、連続した４日間、３０分間の試行間隔で訓練した。マウスを次の出発点：北、東、南又は西の１つからプールの壁に向けて放し、プラットフォームを６０秒間探させた。各日で、出発点は一定のままにした。マウスが６０秒後にプラットフォームを見いだせなかった場合、穏やかにプラットフォームの方に誘導し、１５秒間とどまらせた。プローブ試行の際に、参照記憶を、全てのマウスについて同じ解放ポイントを使用して、５日目、最後の取得試行の２４時間後にプラットフォームを除去することによって評価した。ビデオカメラをプールの中央の上に置き、EthoVision（登録商標）XTビデオトラッキングシステムNoldus（Wageningen、蘭）に繋いだ。隠されたプラットフォームを見つけるまでの待機時間を、学習の測定として使用した。プローブ試行について、標的四分円において過ごした合計時間を取得した空間記憶の保持測定として使用した。
【0115】
恐怖条件づけ マウスを、消音白色チェストで囲まれたステンレススチールグリッド床（Kinder Scientific、米）の条件づけチャンバー（１７×１０×１０ｃｍ）内で訓練及び検査した。条件づけ日に各マウスを条件づけチャンバー内に個別に置き、２分間自由に探索させ、３０秒間の音（６５ｄＢ）及び穏やかな足へのショック（０．５ｍＡ、２秒）が続いた。もう１回の音及び足へのショックを１分間の刺激間隔で提示し、マウスを最後の足へのショックの３０秒後にそれらのホームケージに戻した。全ての匂いの手がかりを除去するために、チャンバーを各セッション間に７０％エタノールを用いて清掃した。条件づけ１日後、マウスを同じチャンバーに置き、コンテキストベースのすくみ（context based freezing）のための足への刺激を与えずに３分間自由に探索させた。３日目にマウスを、消音白色チェストの中に置いた黒色四角チャンバー内に置き、２分間自由に探索させ、２分間の音が続き、その際にすくみ応答を刺激ベースの恐怖条件づけについて評価した。各検査においてすくみ時間を、Motor Monitorソフトウェア（Kinder Scientific、米）を使用して算出した。活動性を補正したすくみを、ベースライン（コンテキスト恐怖条件づけのための条件づけ日の最初の２分間、及び刺激恐怖条件づけのための３日目の最初の２分間）を合計すくみ時間から減算することによって算出した。
【0116】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
マウス皮質及び海馬をＴＲＩＳ可溶性（ＴＳ）画分及び塩酸グアニジン可溶性（ＧＳ）に分けた。ＡβＸ－４０及びＡβＸ－４２を、Ａβ ＥＬＩＳＡキット（IBL、日）を製造者の説明書に従って使用して定量した。
マウス皮質及び海馬をＴＲＩＳ可溶性（ＴＳ）画分及び塩酸グアニジン可溶性（ＧＳ）に分けた。ＡβＸ－４０及びＡβＸ－４２を、Ａβ ＥＬＩＳＡキット（IBL、日）を製造者の説明書に従って使用して定量した。
【0117】
チオフラビン－Ｓ染色
パラフィン包埋脳組織から、ミクロトームを使用して５μｍ厚の切片を切断し、Superfrost Plus顕微鏡スライドガラス上に得て、３７℃で一晩乾燥させた。切片をキシレン中及びエタノールの濃度を減少（９９～７０％）させて洗浄することによって脱パラフィンし、蒸留水中に調製した１％のろ過チオフラビン－Ｓを用いた１時間、暗所、室温での染色が続いた。切片をエタノール７０％及び９５％中で洗浄し、蒸留水での洗浄が続いた。次に切片をヘキスト核染色とインキュベートし、ＰＢＳ－Ｔを用いた３回洗浄が続き、PermaFluor水溶性封入剤で覆った。次に切片（切片４個／マウス）を、Nikon Eclipse E800共焦点顕微鏡を用いて視覚化し、倍率２倍で画像化した（Nikon DS-Qi2カメラ）。プラークを皮質と海馬領域の両者の総表面から計数（盲検の観察者によって）した。
パラフィン包埋脳組織から、ミクロトームを使用して５μｍ厚の切片を切断し、Superfrost Plus顕微鏡スライドガラス上に得て、３７℃で一晩乾燥させた。切片をキシレン中及びエタノールの濃度を減少（９９～７０％）させて洗浄することによって脱パラフィンし、蒸留水中に調製した１％のろ過チオフラビン－Ｓを用いた１時間、暗所、室温での染色が続いた。切片をエタノール７０％及び９５％中で洗浄し、蒸留水での洗浄が続いた。次に切片をヘキスト核染色とインキュベートし、ＰＢＳ－Ｔを用いた３回洗浄が続き、PermaFluor水溶性封入剤で覆った。次に切片（切片４個／マウス）を、Nikon Eclipse E800共焦点顕微鏡を用いて視覚化し、倍率２倍で画像化した（Nikon DS-Qi2カメラ）。プラークを皮質と海馬領域の両者の総表面から計数（盲検の観察者によって）した。
【0118】
組織調製及び免疫蛍光
スライドガラス上のマウス組織切片をキシレン中及びエタノールの濃度を減少（９９～７０％）させて洗浄することによって脱パラフィンした。抗原賦活のためにスライドをクエン酸緩衝溶液（０．１Ｍクエン酸及び０．１Ｍクエン酸ナトリウム）中１１０℃で５分間圧力煮沸し、次に水道水に続いてＰＢＳ－Tween（登録商標）０．０５％を用いて各５分間洗浄した。次に切片を、ＴＮＢブロッキング緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．５％のブロッキング試薬；PerkinElmer、米）又はＮＧＳ（正常ヤギ血清、Vector Laboratories、米）を用いて３０分間、室温でインキュベートした。
スライドガラス上のマウス組織切片をキシレン中及びエタノールの濃度を減少（９９～７０％）させて洗浄することによって脱パラフィンした。抗原賦活のためにスライドをクエン酸緩衝溶液（０．１Ｍクエン酸及び０．１Ｍクエン酸ナトリウム）中１１０℃で５分間圧力煮沸し、次に水道水に続いてＰＢＳ－Tween（登録商標）０．０５％を用いて各５分間洗浄した。次に切片を、ＴＮＢブロッキング緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．５％のブロッキング試薬；PerkinElmer、米）又はＮＧＳ（正常ヤギ血清、Vector Laboratories、米）を用いて３０分間、室温でインキュベートした。
【0119】
次に、脳切片をＴＮＢ緩衝液中、抗Ａβ（82E1；IBL、米）１：２０００、ＴＮＢ緩衝液中、抗ＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質；Agilant technologies、米）１：５００又はＮＧＳ中、抗Ｉｂａ１（Fujifilm Wako、日）１：２５０と共に４℃で一晩インキュベートした。その後、切片をＴＮＢ緩衝液又はＮＧＳ中ビオチン化抗マウス又は抗ウサギ抗体（Vector Laboratories；英）１：２００と共に２時間、室温でインキュベートし、次にＴＮＢ緩衝液又はＮＧＳ中、ＨＲＰ－コンジュゲートストレプトアビジン（PerkinElmer；米）１：１００と共に３０分間インキュベートした。シグナル増幅のために、試料を増幅試薬中チラミド（PerkinElmer；米）１：５０で１０分間インキュベートした。
【0120】
最終的に、試料をヘキスト溶液、ＰＢＳ－Ｔ中１：３０００を用いてゆっくり撹拌しながら１５分間インキュベートし、PermaFluor Aqueous Mounting Medium（ThermoScientific、米）を用いた封入及び一晩の乾燥が続いた。各インキュベーション工程の間に、試料をＰＢＳ－Ｔ中で３回、５分間ゆっくり撹拌しながら洗浄した。次に切片（マウス１匹あたり４個）をNikon Eclipse E800共焦点顕微鏡を使用して視覚化し、ImageJソフトウェア（National Institutes of Health, MD）でのさらなる分析のために倍率２×及び１０×でNikon DS-Qi2カメラを用いて画像化した。
【0121】
ウエスタンブロット
皮質及び海馬組織（ｎ＝４～７個／群）を、完全プロテアーゼ阻害剤混合物（Sigma-Aldrich、米）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Thermo Fisher Scientific、米）中にホモジナイズした。得られた上清をブラッドフォードプロテインアッセイ（Bio-Rad、米）を使用するタンパク質濃度決定に供した。次に５０μｇタンパク質を４～２０％のプレキャストゲル（Bio-Rad、米）にロードし、０．２μｍニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜（Amersham（登録商標）Hybond（登録商標）、GE healthcare、独）に移した。膜をＴＢＳ－Ｔ（０．０５％のTween（登録商標）20）中の５％のスキムミルクでブロッキングし、抗ＧＦＡＰ（Agilant technologies、米）１：３０００、抗ＡＩＦ－１／Ｉｂａ１（Novus biologicals、米）１：１０００又は抗Ａβ１－１６（6E10；Biolegend、米）１：１０００を用いて調べ、４℃で一晩保持し、次に抗マウス若しくは抗ウサギＣｙ３ １：２５００（GE Healthcare、英）、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ－コンジュゲート １：５０００（GE Healthcare、英）又は蛍光標識抗ウサギ二次抗体１：１００００（Li-COR Biosciences、米）と共にインキュベートした。膜を各インキュベーション工程後に、ＴＢＳ－Ｔを用いて３回洗浄した。
皮質及び海馬組織（ｎ＝４～７個／群）を、完全プロテアーゼ阻害剤混合物（Sigma-Aldrich、米）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Thermo Fisher Scientific、米）中にホモジナイズした。得られた上清をブラッドフォードプロテインアッセイ（Bio-Rad、米）を使用するタンパク質濃度決定に供した。次に５０μｇタンパク質を４～２０％のプレキャストゲル（Bio-Rad、米）にロードし、０．２μｍニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜（Amersham（登録商標）Hybond（登録商標）、GE healthcare、独）に移した。膜をＴＢＳ－Ｔ（０．０５％のTween（登録商標）20）中の５％のスキムミルクでブロッキングし、抗ＧＦＡＰ（Agilant technologies、米）１：３０００、抗ＡＩＦ－１／Ｉｂａ１（Novus biologicals、米）１：１０００又は抗Ａβ１－１６（6E10；Biolegend、米）１：１０００を用いて調べ、４℃で一晩保持し、次に抗マウス若しくは抗ウサギＣｙ３ １：２５００（GE Healthcare、英）、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ－コンジュゲート １：５０００（GE Healthcare、英）又は蛍光標識抗ウサギ二次抗体１：１００００（Li-COR Biosciences、米）と共にインキュベートした。膜を各インキュベーション工程後に、ＴＢＳ－Ｔを用いて３回洗浄した。
【0122】
ＡＰＰ及びＣＴＦａ／β断片について、皮質組織を４×Pipes緩衝液（Sigma Aldrich、米）中でホモジナイズし、７００００ｒｐｍ、３０分間の超遠心分離が続いた。得られた沈殿物をPipes緩衝液に再懸濁し、ブラッドフォードプロテインアッセイを使用してタンパク質濃度を測定した。２．５μｇ／μｌタンパク質を３７℃で３０分間インキュベートし、クロロホルム／メタノール、２：１（v/v）による３０分間、穏やかに混合しながらの抽出が続いた。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分間）後に得られた白色界面に、クロロホルム／メタノール、２：１（v/v）を加えて１時間穏やかに混合し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分間）が続いた。沈殿物を、スピードバックを使用して２分間乾燥させ、試料緩衝液（９Ｍ尿素を含有するＳＤＳ試料緩衝液）中に再懸濁し、一晩室温で保持した。次に４０μｇタンパク質を８～１６％のプレキャストゲル（Bio-Rad、米）にロードし、０．２μｍニトロセルロース膜に移し、ＡＰＰのＣＴＦａ／β断片の検出のために抗ＡＰＰのＣ末端抗体（Sigma Aldrich、米）１：５０００を用いて調べた。抗β－アクチン（Sigma Aldrich、米）１：３５００又は抗ＧＡＰＤＨ（Sigma Aldrich、米）１：５０００をローディング対照として使用した。タンパク質バンドをAmersham imager 600（GE Healthcare）又はOdyssey CLx（Li-COR Biosciences、米）を使用して視覚化し、バンド強度をImage Jソフトウェアを用いて測定し、ローディング対照を用いて正規化した。
【0123】
統計解析
全ての統計的比較は、Prism 8（GraphPad software Inc., CA、米）を使用して実施した。正規性をシャピロ－ウイルク検定を使用して調べた。異なる時点の点にわたるデータを多重比較のためにボンフェローニ補正を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。全ての他のデータは、多重ｔ検定又は両側スチューデントのｔ検定によって分析した。誤差伝播を免疫染色実験のための同じマウス由来の切片間の変動について説明するために使用した。概算の変動性を平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として報告し、ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。
全ての統計的比較は、Prism 8（GraphPad software Inc., CA、米）を使用して実施した。正規性をシャピロ－ウイルク検定を使用して調べた。異なる時点の点にわたるデータを多重比較のためにボンフェローニ補正を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。全ての他のデータは、多重ｔ検定又は両側スチューデントのｔ検定によって分析した。誤差伝播を免疫染色実験のための同じマウス由来の切片間の変動について説明するために使用した。概算の変動性を平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として報告し、ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。
【0124】
相関分析
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ及びＰＢＳ処置群における相関 相関をＰＢＳ処置対照群及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅを用いて処置したマウスの全てのマウスについてピアソン相関係数としてペアワイズで算出した。試料サイズは、マウス３～８匹であった。関連性のある相関及び傾向の同定のために、本発明者らは、比較のために相関係数及び両側Ｐ値（ｐ＜０．０５又はｐ＜０．２）を考慮した。
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ及びＰＢＳ処置群における相関 相関をＰＢＳ処置対照群及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅを用いて処置したマウスの全てのマウスについてピアソン相関係数としてペアワイズで算出した。試料サイズは、マウス３～８匹であった。関連性のある相関及び傾向の同定のために、本発明者らは、比較のために相関係数及び両側Ｐ値（ｐ＜０．０５又はｐ＜０．２）を考慮した。
【0125】
マウス脳におけるBRICHOS／Ａβ４２比から予測されるin vivoでの結果とin vitro及びex vivoでの結果との相関 プラークロード、プラーク数、アストログリオーシス及びミクログリオーシスに対するrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置の効果、ここで正の処置効果は量の減少に対応し、相対的効果は比BRICHOS／ＰＢＳとして算出された一方で、行動研究については、処置での正の効果は量の増加に対応し、効果は比ＰＢＳ／BRICHOSとして算出した。比のエラーバーは、個々の測定値のＳＥＭの伝播に対応する。ｐ値＞０．２を有する比較、及び恐怖条件づけ研究由来のデータ（有意な処置効果がないことから）は、分析に含めなかった。
【0126】
in vitroで生成されたオリゴマーの数を、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置群の皮質脳ホモジネート中のＧＳ－可溶性Ａβ４２の量から概算し、１．０４ｇ／ｍｌの脳密度を推定した。さらに、脳におけるBRICHOS：Ａβ４２の比を２時間後の野生型rh Bri2 BRICHOSのＢＢＢ通過の程度（４００±１５０ｎＭ）に基づいて概算し、ＡｐｐＮＬ－ＦマウスにおけるBRICHOS：Ａβ４２についての比０．１４±０．０６を得た。
【0127】
海馬γ振動へのex vivo毒性への効果の概算は、１００％の野生型又はrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体のいずれかのＡβ４２への添加が未処置対照と同じγ振動値をもたらし、rh野生型Bri2 BRICHOS単量体濃度にほぼ線形の応答が見いだされた、以前の結果に基づいている。したがって本発明者らは、概算したin vivoでのBRICHOS：Ａβ４２比由来のex vivo毒性への効果を算出するために、この線形関係を適用した。誤差は、線形関係を仮定して、対照、Ａβ４２単独及び１００％のBRICHOSデータセット由来の相対誤差から概算した。
【0128】
ヒトＡＤ患者におけるＡβ４２の量を、５５．４％の灰白質及び４４．６％の白質の加重平均を使用して、灰白質及び白質についての公表された値から概算した。同じ計算及び、ヒトにおいてBRICHOSがマウスにおいてと同じＢＢＢ透過性を有することを含む仮定を適用して、新たな核形成単位の低減について上述のとおり、ヒトＡＤ Ａβ４２レベルに対するin vivo効果は、誤差推定のためのＡβ４２の量の公表された標準偏差値を含んで概算され得る。
【0129】
結果
Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅは、安定な単量体及び不安定なオリゴマーを形成する。
Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅは、安定な単量体及び不安定なオリゴマーを形成する。
【0130】
rh proSP-C BRICHOSの結晶構造、BRICHOSドメインの唯一利用可能な高解像度構造は、ヘリックス２からの残基が隣接サブユニットのポケットに向いているホモ三量体を示す。proSP-C BRICHOS構造に基づくBri2 BRICHOSサブユニットの構造モデルでは、Ａｒｇ２２１はヘリックス２で表面に露出しており、隣接サブユニットのポケットを向いている可能性がある。Ａｒｇ２２１Ｇｌｕ変異が反対の表面静電ポテンシャルを導入し、オリゴマーを不安定化させ、安定サブユニット単量体を生成すると考えられる。
【0131】
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅを、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端ドメインに基づいて最近開発された溶解性タグ、ＮＴ＊との融合で産生した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、精製したＮＴ＊－Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅをオリゴマー、二量体及び単量体に分離した。wtタンパク質とは対照的に、変異体は、大部分は単量体を形成し、Ａｒｇ２２１がBri2 BRICHOSオリゴマー形成に実際に寄与していることを示唆している。ＮＴ＊タグのタンパク質分解性遊離後に、単離されたrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅオリゴマーは、サブユニット間ジスルフィド結合によって部分的に連結され、二量体はジスルフィド依存性である。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）は、ＳＥＣによって単離されたrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の四次構造を確認した。ＥＳＩ－ＭＳによって決定された質量、１４０５０．２Ｄａは、２個の保存されたＣｙｓが分子内ジスルフィド結合を形成している単量体の算出された質量、１４０５０．１Ｄａと完全に一致している。円二色性（ＣＤ）分光法は、単量体性rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの全体的な二次構造がwt単量体に類似していることを示した。オリゴマーの形成と関連して、ネガティブＣＤピークは約２０５～２１０ｎｍ右にシフトし、rh wt Bri2 BRICHOSについて観察されたパターンと同等の構造的安定性を示している。単離されたrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体、二量体及びオリゴマーは、ビスＡＮＳに結合し、遊離ビスＡＮＳと比較して蛍光発光強度における顕著な増加及び約５３３ｎｍから４８０～４９０ｎｍへの発光最大値の青色シフトによって証明される。これは、wt種についての状況と類似の、全てのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種が疎水性表面を露出していることを示している。さまざまなアセンブリ状態のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの、非線維性タンパク質凝集を妨げる能力を、熱変性クエン酸合成酵素（ＣＳ）に対して評価した。二量体及び単量体は、ＣＳ凝集を抑制することにおいて比較的非効率的であった一方で、wt種の場合と同様に、オリゴマーはＣＳの凝集を効率的に低減する。本明細書全体を通じて、さまざまなrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の濃度は、その単量体性サブユニットを参照している。
【0132】
単離されたrh wt Bri2 BRICHOS単量体は、ＳＥＣによって示されたとおり濃度の増加で二量体を形成する一方で、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体は、濃度の増加でＳＥＣ上での移動の変化を示さなかった。同様にrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の２０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ８．０）中、３７℃、一晩のインキュベーションに続く未変性ＰＡＧＥは、それらが単量体性状態を維持していることを示し、wtタンパク質の場合とは異なる。未変性ＰＡＧＥによる分析は、単量体及び他の低ｎ種が、３７℃での一晩インキュベーション後にrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅオリゴマーから遊離される一方で、rh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーがインキュベーションの際に小さな種を自発的に遊離しないことを示している。
【0133】
Bri2 BRICHOSオリゴマーの不安定化は、抗Ａβ４２神経毒性活性を増大させる。
【0134】
rh Bri2 BRICHOSオリゴマーの不安定化のＡβ４２に関連する神経毒性の軽減への効果を調査するために、本発明者らは、マウス海馬切片におけるγ振動のＡβ４２誘発低減を予防することにおける有効性を検査した。ガンマ振動は、学習、記憶、認知及び他の更に高度な処理過程に関連し、ＡＤ患者において観察される認知低下は、γ振動の減少と共に進行する。ここでγ振動は、wt Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の水平方向の海馬切片において、スライスを１００ｎＭのカイニン酸（ＫＡ）で表面灌流し、次にそれらを３０分間安定化させることによって誘導した。
【0135】
図２Ａは、５０ｎＭのＡβ４２、５０ｎＭのＡβ４２＋プレインキュベートされた２５ｎＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体、５０ｎＭのＡβ４２＋プレインキュベートされた２５ｎＭのrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマー、５０ｎＭのＡβ４２＋プレインキュベートされた５０ｎＭのrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマー、５０ｎＭのＡβ４２＋プレインキュベートされた５０ｎＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅオリゴマー並びに、５０ｎＭのＡβ４２＋２５ｎＭのrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマー及び２５ｎＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体のプレインキュベートされた混合物の１５分間インキュベーション後の、対照条件（灰色）下でのトレース例及び出力スペクトル例（ｉ及びｉｉ）を示す。実験からの正規化γ振動出力の概要ヒストグラム（ｉｉｉ及びｉｖ）も示す。ヒストグラムの下の数字は生物学的反復の数を記し、データは平均値±平均値の標準誤差として報告する。対照対Ａβ４２：ｐ＜０．０００１、ｎｓ、有意差なし、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【0136】
５０ｎＭのＡβ４２を用いた１５分間の海馬切片のプレインキュベーションは、続くＫＡ適用によって生成されたγ振動の出力を顕著に低減した（図２Ａ）。５０ｎＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅオリゴマーの５０ｎＭのＡβ４２と併せた添加は、未処置対照におけるものと異ならない振動をもたらした一方で、５０ｎＭのＡβ４２を含むrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーの添加は、未処置対照及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅオリゴマー及びＡβ４２を用いた処置後に得られたγ振動と比較して有意に低いγ振動をもたらした（図２Ａｉ、ｉｉｉ）。これらの観察は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅオリゴマーの不安定化及び小さな種の遊離が抗Ａβ４２神経毒性活性を増加させることを示唆している。次に本発明者らは、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体がrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマー形成に干渉でき、それにより、単量体の比を増加させると仮定し、これはＡβ４２の神経毒性を相殺する効力を増加させると期待される。
【0137】
この仮説を検査するために、本発明者らは、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及びrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーを同時にインキュベーションし、その後Bri2 BRICHOSアセンブリ状態の分布並びに、Ａβ４２線維形成及び神経毒性への効果を評価した。wtとＲ２２１Ｅ rh Bri2 BRICHOS単量体との間の識別を可能にするために、本発明者らは、非タグ化wtタンパク質と同様に挙動し、抗ＡＵ１抗体を使用して選択的に免疫検出できるＡＵ１タグを含有するrh wt Bri2 BRICHOS構築物を使用した。図２Ｂでは、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及び、免疫検出のためのＡＵ１タグを含有するrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマー（５：５μＭ及び９：４．５μＭ）を３７℃で一晩同時インキュベートし、未変性ＰＡＧＥ及び抗ＡＵ１タグ抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。破線で示される四角はwt Bri2 BRICHOS単量体の移動を示す。未変性ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析は、rh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーの、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体との同時インキュベーションが、小さな種、特に単量体の遊離をもたらすことを示している（図２Ｂ）。本発明者らは、wt rh Bri2 BRICHOSオリゴマーから単量体を遊離するrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの能力を更に研究するために、Bri2 BRICHOSのｍＣｈｅｒｒｙとの融合物を使用した。rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体とrh Bri2 BRICHOS－ｍＣｈｅｒｒｙオリゴマーの同時インキュベーションは、変異体とwtオリゴマーとの間で、モル比約２：１で飽和するwt単量体の濃度依存性遊離を生じさせる。rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の添加も、rh wt Bri2 BRICHOSの抗Ａβ４２神経毒性有効性を増加させる（図２Ａ）。本発明者らは、２５ｎＭのrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーと２５ｎＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体を一晩、３７℃で同時にインキュベートし、混合物は、混合物と同じ方法でプレインキュベートされた５０ｎＭのrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーよりも更に強力にγ振動出力のＡβ４２誘発低減を減弱した（図２Ａ）。注目すべきことに混合物の性能の強化は、２つの単一の種の性能を単に加えることによっては説明できず（図２Ａ）、Ａβ４２線維化動態は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及びrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーのインキュベートされた混合物によって、いずれかの種単独での同じ合計濃度によってよりも更に強く遅延された（図２Ｃ）。図２Ｃは、３μＭのrh wt Bri2 BRICHOSオリゴマー、３μＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体、又は、１．５μＭのwtオリゴマーと１．５μＭのＲ２２１Ｅ単量体のプレインキュベートされた混合物の存在下での、３μＭのＡβ４２単独のＴｈＴ動態分析を示している。これらの結果は、オリゴマーから単量体へのBri2 BRICHOSの分布のシフトが、抗Ａβ４２神経毒性能力を強める方法であることを示唆している。
【0138】
Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体は、Ａβ４２線維化の二次核形成を選択的に阻害する。
【0139】
rh wt Bri2 BRICHOSオリゴマーからの小さな種の遊離の根底となる分子機構及び、これがＡβ４２の神経毒性に対する能力の増加にどのように関連するかを見いだすために、本発明者らは、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及び二量体のＡβ４２線維形成への効果を調査した。本発明者らは、さまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の非存在下及び存在下でのＡβ４２線維形成の動態をモニターするためにチオフラビンＴｈＴ蛍光を使用した。
【0140】
図３は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及び二量体のＡβ４２線維形成の微視的事象への効果を例示する：
（Ａ～Ｂ）フリーフィッティングパラメーターとして複合速度定数（combined rate constant）
（Ａ～Ｂ）フリーフィッティングパラメーターとして複合速度定数（combined rate constant）
【0141】
【数5】
【0142】
及び√（ｋ＋ｋ２）を用いた、０、１０、３０、５０、７０及び１００％のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体（Ａ）及び二量体（Ｂ）の存在下での、３μＭのＡβ４２の正規化及び平均化した凝集トレース（×印）の個別のフィット（実線）。フィット（挿入図）から得られた相対的複合速度定数の依存度は、両者のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の二次核形成（ｋ＋ｋ２）への強い効果があるが、一次（ｋｎｋ＋）経路にはないことを明らかにしている。
（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）において示したさまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の存在下でのＡβ４２凝集トレースのフィッティングから抽出したｒｍａｘ及びτ１／２（挿入図）についての値。
（Ｄ～Ｅ）０、１０、３０、５０、７０及び１００％のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体（Ｄ）及び二量体（Ｅ）の存在下での０．６μＭの実施されたＡβ４２線維用いた３μＭのＡβ４２のシードされた凝集トレース。
（Ｆ）（Ｄ）及び（Ｅ）における高度にシードされた凝集動態から決定された伸長速度（ｋ＋）。
（Ｇ～Ｈ）５μＭのＡβ４２を、５０％のモル比のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体（Ｇ）又は二量体（Ｈ）と共に及び伴わずに一晩、３７℃でインキュベートした。試料をヤギ抗Bri2 BRICHOS抗体及び金標識二次抗体を用いて処置し、ＴＥＭによって特徴づけた。スケールバーは１００ｎｍである。矢印は線維末端を示す。
（Ｉ）rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及び二量体での同時線維化後の、８個のＡβ４２線維末端の３０ｎｍ以内に位置付けられたそれぞれの金粒子の数。データは平均値±標準偏差として報告する。＊＊＊ｐ＜０．００１。
（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）において示したさまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の存在下でのＡβ４２凝集トレースのフィッティングから抽出したｒｍａｘ及びτ１／２（挿入図）についての値。
（Ｄ～Ｅ）０、１０、３０、５０、７０及び１００％のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体（Ｄ）及び二量体（Ｅ）の存在下での０．６μＭの実施されたＡβ４２線維用いた３μＭのＡβ４２のシードされた凝集トレース。
（Ｆ）（Ｄ）及び（Ｅ）における高度にシードされた凝集動態から決定された伸長速度（ｋ＋）。
（Ｇ～Ｈ）５μＭのＡβ４２を、５０％のモル比のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体（Ｇ）又は二量体（Ｈ）と共に及び伴わずに一晩、３７℃でインキュベートした。試料をヤギ抗Bri2 BRICHOS抗体及び金標識二次抗体を用いて処置し、ＴＥＭによって特徴づけた。スケールバーは１００ｎｍである。矢印は線維末端を示す。
（Ｉ）rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及び二量体での同時線維化後の、８個のＡβ４２線維末端の３０ｎｍ以内に位置付けられたそれぞれの金粒子の数。データは平均値±標準偏差として報告する。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【0143】
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体は、準化学量論的濃度でＡβ４２線維形成の用量依存性漸減を示し、凝集動態は典型的なシグモイド挙動に従う（図３Ａ）。線維化半減時間τ１／２はrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体濃度の増加と共に増加する一方で、凝集の最大速度ｒｍａｘは、単一指数的減少を示す（図３Ａ、図３Ｃ）。rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体は単量体と類似の効果を示すが、Ａβ４２線維形成の全体速度を抑制することでは更に効果がある（図３Ｂ、図３Ｃ）。γ値であるτ１／２αｍ（０）γ（式中、ｍ（０）は初期Ａβ４２単量体濃度である）は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の非存在及び存在下で類似であり、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの存在下でも、Ａβ４２線維化が主に単量体依存性二次経路に従うことを示唆している。成熟線維の塊の指標である最終ＴｈＴ蛍光強度は、Ａβ４２濃度に対して直線的に増加し、さまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の存在下で有意に変化しない。
【0144】
Ａβ４２線維化動態は、一連の微視的速度定数によって記載される、すなわち一次（ｋｎ）及び二次（単量体依存性ｋ２及び単量体非依存性ｋ－）核形成並びに伸長（ｋ＋）。さまざまなrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種によって最も影響を受けるＡβ４２の線維化経路における微視的工程を同定するために、本発明者らは、一次に対する複合速度定数√（ｋｎｋ＋）及び二次核形成事象に対する√（ｋ＋ｋ２）をそれぞれ決定した。本発明者らは、動態モデルをさまざまなＡβ４２濃度及び一定のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ濃度に全体的にフィットさせた。ここで、√（ｋｎｋ＋）及び√（ｋ＋ｋ２）は、全ての濃度で同じ値に制約される。本発明者らは、フィッティングパラメーター√（ｋｎｋ＋）がいずれかのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の存在下でＡβ４２単独と類似であることを見いだし、主に二次経路がrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅによって調節されていることを示唆している。結果は、ｋ＋ｋ２に関連する核形成事象、すなわち線維伸長又は／及び二次核形成を阻害することにおいてrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体が単量体よりも効率的であることも示している。Ａβ４２線維化へのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの効果を定量的に解明するために、次に本発明者らは一定のＡβ４２濃度及びさまざまなrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ濃度を用いて得られたデータセットに、個々に動態モデルをフィットさせた（図３Ａ～図３Ｃ）。分析は、√（ｋ＋ｋ２）がrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅによって有意に変化する一方で、√（ｋｎｋ＋）は変化しないことを明らかにし（図３Ａ、図３Ｂ、挿入図）、二次核形成が、影響を受ける主な経路であることを再度示唆している。個々のフィッティングも、二量体が√（ｋ＋ｋ２）を低減することにおいて単量体よりも更に強力であることを示した（図３Ａ、図３Ｂ、挿入図）。
【0145】
個別の微視的速度定数ｋ＋、ｋｎ及びｋ２の摂動は、それらの相対的寄与が、神経毒性Ａβ４２オリゴマー種の生成に関係する可能性がある新たに形成される核形成単位の数を決定することから最も関連する。個別の微視的工程への効果を評価するために、本発明者らは、一定のＡβ４２及びさまざまなrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ濃度での動態データセットのグローバルフィットを実施し、ここで、１つだけの単一速度定数、すなわちｋｎ、ｋ＋又はｋ２がフィッティングパラメーターであるようにフィットは制約された。単一のフィッティングパラメーターとしての一次核形成速度ｋｎ又は伸長ｋ＋は、両者のrh Bri2 BRICHOS種に対して不十分なフィットを生じ、これは、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの単量体及び二量体のいずれもＡβ４０単量体と相互作用しないことを示すＮＭＲデータによって更に確認された。単一のフリーフィッティングパラメーターとしてのｋ２を用いて、動態をrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体について適切に記載したが、二量体についてはしなかった。したがって本発明者らは、rh Bri2 Ｒ２２１Ｅ単量体が、Ａβ４２線維形成の際に二次核形成を主に阻害すると結論付ける。対照的に二量体は、二次核形成（ｋ２）及び線維末端伸長（ｋ＋）を阻害する。
【0146】
伸長工程がさまざまなrh Bri2 BRICHOS種の存在下でどのように影響を受けるのかを更に研究するために、本発明者らは、高い初期線維シード濃度の存在下、一次及び二次核形成事象が無視でき、線維伸長のみが線維塊の増加に寄与する条件下で、凝集動態を決定した。これらの条件下で線維化トレースは、通常、凹面凝集挙動に従い（図３Ｄ、図３Ｅ）、ここで初期の傾きは伸長速度ｋ＋に正比例する。これらのシーディング実験は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体が、伸長速度を用量依存的様式で有意に減少させ、低濃度ですでに線維末端伸長が著しく遅らされていることを明らかにした（図３Ｅ、図３Ｆ）。対照的に、rh Bri2 Ｒ２２１Ｅ単量体は、線維末端伸長にわずかな効果を示しただけであった（図３Ｄ、図３Ｆ）。このことは、両者のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種が、表面触媒二次核形成への効果を介してＡβ４２線維化を低減する一方で、線維末端伸長はrh Bri2 BRICHOS二量体によってのみ実質的に影響されることを示している。
【0147】
さまざまな効果が、単量体及び二量体が線維末端にさまざまに会合することに関連している。このことを検討するために本発明者らは、抗Bri2 BRICHOS免疫金染色及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用した。本発明者らは、単量体及び二量体が大量に及び類似の密度でＡβ４２線維表面に結合し（図３Ｇ、図３Ｈ）、これが動態分析を支持し、両者のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の二次核形成への効果の基礎を提供していることを見いだした。さらに、Ａβ４２線維末端に結合するrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体の数は、単量体についてよりも有意に高く（図３Ｉ）、主に二量体が線維末端伸長を調節しているという動態分析からの結果を実証している。
【0148】
Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体は、Ａβ４２の神経毒性を効率的に妨げる。
【0149】
新たな核形成単位の数が二次核形成の阻害によって減少するが、伸長を阻害することによって増加することから、Ａβ４２二次核形成及び伸長の相対的阻害は、毒性低分子量種の形成の低減と関連する可能性がある。したがって図３Ｆに示される結果は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体及び単量体の存在下で、それぞれ形成された毒性Ａβ４２種の予測される量について重要な意義を有し得る。新たなＡβ４２核形成単位の量は、一定濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの存在下及び非存在下でさまざまなＡβ４２濃度のグローバルフィットから決定された複合速度定数、及びシードされた凝集実験から決定したさまざまなrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種の３０％のモル等価でのＡβ４２線維伸長速度から最初に算出した（図３Ｄ～図３Ｆ）。
【0150】
図４は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及び二量体のＡβ４２オリゴマー形成及び神経毒性への効果を例示する：
（Ａ）上パネル：誘導されたグローバルフィッティング動態パラメーター及び図３Ｆにおける伸長速度（ｋ＋）から概算された、３０％のモル比のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及び二量体の非存在及び存在下で形成されたＡβ４２核形成単位の相対数。
下パネル：図３Ａ、図３Ｂから誘導された個別のフィッティングパラメーター及び図３Ｆからの伸長速度（ｋ＋）から概算された、さまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体（右バー）及び二量体（左バー）の存在下で形成されたＡβ４２核形成単位の相対数。
（Ｂ）対照条件（ＫＡ）下でのマウス海馬γ振動出力の概要ヒストグラム、５０ｎＭのＡβ４２を用いた１５分間のインキュベーション後、及び５０ｎＭのＡβ４２＋５０ｎＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体又は二量体を用いた１５分間のインキュベーション後。ヒストグラムの下の数字は生物学的反復の数を記し、データは平均値±平均値の標準誤差として報告する。対照対Ａβ４２：ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし、＊＊ｐ＜０．０１。
（Ａ）上パネル：誘導されたグローバルフィッティング動態パラメーター及び図３Ｆにおける伸長速度（ｋ＋）から概算された、３０％のモル比のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体及び二量体の非存在及び存在下で形成されたＡβ４２核形成単位の相対数。
下パネル：図３Ａ、図３Ｂから誘導された個別のフィッティングパラメーター及び図３Ｆからの伸長速度（ｋ＋）から概算された、さまざまな濃度のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体（右バー）及び二量体（左バー）の存在下で形成されたＡβ４２核形成単位の相対数。
（Ｂ）対照条件（ＫＡ）下でのマウス海馬γ振動出力の概要ヒストグラム、５０ｎＭのＡβ４２を用いた１５分間のインキュベーション後、及び５０ｎＭのＡβ４２＋５０ｎＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体又は二量体を用いた１５分間のインキュベーション後。ヒストグラムの下の数字は生物学的反復の数を記し、データは平均値±平均値の標準誤差として報告する。対照対Ａβ４２：ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし、＊＊ｐ＜０．０１。
【0151】
結果（図４Ａ、上パネル）は、核形成単位の生成が３０％のrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の存在下で約２５％低減される一方で、二量体は効果を有さなかったことを示した。この阻害効果が、高い相対Bri2 BRICHOS濃度でも有効であるかどうかを調査するために、次に本発明者らは、グローバルフィットから得た値と比較してより大きな不確実性に悩まされる個別のフィット（図３Ａ～図３Ｂ）から得た複合速度定数から、核形成単位の生成及び伸長速度（図３Ｆ）を概算した。実際に核形成単位の生成は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の存在下で、用量依存的様式で７０％まで低減される（図４Ａ、下パネル）。したがって結果は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体が、rh proSP-C BRICHOSに匹敵する性能でＡβ４２核形成単位の形成を有意に低減する一方で、二量体は低減しないことを示唆している。
【0152】
Ａβ４２に関連する神経毒性を低減するrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの能力が核形成単位の生成と相関するかどうかを調査するために、本発明者らは、マウス海馬切片においてγ振動のＡβ４２誘発低減を妨げることにおけるrh Bri2 BRICHOS単量体及び二量体の有効性を検査した。本発明者らは、５０ｎＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の５０ｎＭのＡβ４２への添加が、Ａβ誘発神経毒性を予防し、γ振動の出力が未処置対照のレベルに達したことを見いだした（図４Ｂ）。対照的に５０ｎＭのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ二量体の５０ｎＭのＡβ４２への添加は、Ａβ４２誘発毒性の有意な予防を生じなかった（図４Ｂ）。このことは、単量体がＡβ４２誘発毒性に対して効率的であることを示し、二次核形成の阻害が、毒性のＡβ４２オリゴマー形成を有意に低減する動態分析を支持している。
【0153】
図５は、マウス海馬切片におけるさまざまなrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ種のＡβ４２毒性への効果を例示する。対照条件下（ＫＡ）でのマウス海馬γ振動出力の概要ヒストグラム、５０ｎＭのＡβ４２を用いた１５分間のインキュベーション後、５０ｎＭのＡβ４２＋１００ｎＭの二量体又は１００ｎＭの単量体を用いた１５分間のインキュベーション後。ヒストグラムの下の数字は生物学的反復の数を記し、データは平均値±平均値の標準誤差として報告する。＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意差なし。注目すべきことに、５０ｎＭ～１００ｎＭへのrh Bri2 BRICHOS二量体の濃度の増加は、Ａβ４２誘発毒性の有意な予防をもたらした（図５）。
【0154】
これらの結果は、作用機序及びＡβ４２と比較した分子比に依存する神経毒性への効果に関するＡβ４２線維形成の阻害剤の最終的な結果を示している。
【0155】
Bri2 BRICHOS Ｒ２２１ＥはＢＢＢを透過する安定な単量体を形成する。
【0156】
図７は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１ＥがＢＢＢを通過する安定な単量体を形成することを例示する：
（Ａ）マウス血清中、３７℃でさまざまな時間インキュベートしたrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のウエスタンブロット。レーンＣは、インキュベートされていないrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体を含有する。
（Ｂ）注入後のさまざまな時点で得られたウエスタンブロットバンドのデンシトメトリーによって決定された、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体のマウス血清中での半減期。ゲル及び減衰曲線は１つの代表的な実験を示し、挿入図は５匹の動物において決定された半減期の散布図を示す。Ｍはタンパク質ラダーを示す。
（Ｃ）rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体又はＰＢＳの静脈内注入の１、２又は６時間後に回収した脳ホモジネートの還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のウエスタンブロット。レーンＣはrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の移動を示す。矢印は、脳ホモジネート試料中のバンドを指している。
（Ａ）マウス血清中、３７℃でさまざまな時間インキュベートしたrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のウエスタンブロット。レーンＣは、インキュベートされていないrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体を含有する。
（Ｂ）注入後のさまざまな時点で得られたウエスタンブロットバンドのデンシトメトリーによって決定された、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体のマウス血清中での半減期。ゲル及び減衰曲線は１つの代表的な実験を示し、挿入図は５匹の動物において決定された半減期の散布図を示す。Ｍはタンパク質ラダーを示す。
（Ｃ）rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体又はＰＢＳの静脈内注入の１、２又は６時間後に回収した脳ホモジネートの還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のウエスタンブロット。レーンＣはrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の移動を示す。矢印は、脳ホモジネート試料中のバンドを指している。
【0157】
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの単量体を３７℃、マウス血清中ex vivoでインキュベートし、２４時間後に単量体は本質的に未変化の強度で残っており（７Ａ）、一方rh wt Bri2 BRICHOSは同じ条件下で大部分がオリゴマーに転換されている（Chen et al., Nat Commun 8: 2081 (2017)）。
【0158】
rh BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体を２０ｍｇ／ｋｇの用量でＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスに静脈内注入し、一方対照マウスにはＰＢＳのみを注射し、血清中の半減期及びＢＢＢ透過性を血清及び脳ホモジネートのウエスタンブロットからそれぞれ評価した。in vivoでrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の血清半減期は５３±１９分間であり（図７Ｂ）、rh wt Bri2 BRICHOS単量体、二量体又はオリゴマーの半減期よりも長い（約３０～４０分間）。rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅを、注入の２時間後にウエスタンブロットによって脳ホモジネート中で検出し（図７Ｃ）、wtタンパク質と同様にrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１ＥがＢＢＢを透過することを示している。
【0159】
アルツハイマー様病態を有するマウスにおけるBri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの効果
アルツハイマー様病態を有する老化ＡＰＰＮＬＦマウスにおけるrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの効果を調査した。
アルツハイマー様病態を有する老化ＡＰＰＮＬＦマウスにおけるrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの効果を調査した。
【0160】
図９は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ投与マウスが、皮質領域の塩酸グアニジン（Ａ）可溶性画分においてＡβ４２の低減傾向を示す一方で、ＴＲＩＳ可溶性画分（Ｂ）においてＡβ４２に効果が見られなかったことを例示している。rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ投与マウスも、ＧＦＡＰ（Ｃ）、炎症に関係するアストログリア細胞マーカーの発現の低減を示し、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ非経口処置が老化ＡＤマウスにおいて、神経炎症を低下させることを示唆している。
【0161】
したがって、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの全身投与は、ＡＤマウスのアストロサイト媒介神経炎症の低減を示す。
【0162】
身体活動性及びオープンフィールド探索は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ投与ＡＰＰ
ＮＬ－Ｆ
マウスにおいて改善する。
【0163】
ＡＰＰＮＬ－Ｆマウスに１０週間でrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ単量体の注入を合計２０回与え、ＰＢＳ注入対照と比較して望ましくない副作用又は体重減少の巨視的兆候を生じなかった。rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅは、ＰＢＳ注入対照マウスと比較してマウスの身体活動性を改善し、それらの身体活動性は同齢wtマウスについての値に近づいていた（図８Ａ～図８Ｂ）。
【0164】
図８は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅが、ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスにおいて不安レベルにおける変化を伴わずに、身体活動性及び探索を改善することを例示している。ヒストグラムは、平均活動性（図８Ａ）及び速度（図８Ｂ）を示す。データは、ＰＢＳ及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスについて並びに同齢wt対照について平均値±ＳＥＭとして示している。独立パラメトリック両側ｔ検定を全ての分析についてのｐ値を算出するために使用した。ＰＢＳ群での４．９９値はパネル（Ｂ）についての外れ値として除外した。
【0165】
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置Ａｐｐノックインマウスにおける嫌悪学習及び記憶
恐怖条件づけ（ＦＣ）検査は、嫌悪学習及び記憶応答をrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ投与を伴う及び伴わない状態でＡＰＰＮＬ－Ｆマウスにおいて評価するために実施した。処置ＡｐｐＮＬ－Ｆコホートでは、本発明者らはコンテキスト及び刺激ＦＣについてrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅマウスと比較して、ＰＢＳ対照においてすくみ行動の増加傾向を観察した。
恐怖条件づけ（ＦＣ）検査は、嫌悪学習及び記憶応答をrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ投与を伴う及び伴わない状態でＡＰＰＮＬ－Ｆマウスにおいて評価するために実施した。処置ＡｐｐＮＬ－Ｆコホートでは、本発明者らはコンテキスト及び刺激ＦＣについてrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅマウスと比較して、ＰＢＳ対照においてすくみ行動の増加傾向を観察した。
【0166】
Swedish及びIberian変異に加えてArctic変異を保有するＡｐｐＮＬ－Ｇ－Ｆノックインマウスは、ＡｐｐＮＬ－Ｆノックインマウスと比較して行動欠陥を含む、より強く、より早期のＡＤ様病態を示す。本発明者らは、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１ＥをＡｐｐＮＬ－Ｇ－Ｆノックインマウスに、３カ月齢（Ａβ病態が発症し始める）から５日ごとに１２週間、合計１７回注入で、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、その後Ｙ迷路でそれらを検査し、新規物体認識（ＮＯＲ）における物体認識記憶を評価した。このことは、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置でのＹ迷路における交替頻度の有意な（ｐ＜０．０５）改善（図１０Ａ）及び新規物体識別の改善（図１０Ｂ）を示した。図１０におけるデータは、平均値±ＳＥＭとして表されている。二元ＡＮＯＶＡ及び独立パラメトリック両側ｔ検定を、ｐ値を算出するために使用した。
【0167】
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置を用いたＡｐｐ
ＮＬ－Ｆ
マウスにおけるＡβプラーク負荷の減弱
海馬及び皮質中のＴｒｉｓ又は塩酸グアニジン可溶性Ａβ４０及びＡβ４２の量をＥＬＩＳＡによって分析し、ＰＢＳ及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスの間でいずれの脳領域においてもＡβ４０及びＡβ４２の量に変化がないことを明らかにした。対照的に、アミロイドに対するチオフラビンＳ色素又はＡβ抗体を使用する免疫染色を用いた脳組織の染色は、ＰＢＳ対照と比較して、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスが皮質に低いチオフラビンＳ陽性プラークカウントを有し（図１１Ａ）、皮質において低い合計Ａβ陽性プラークロードを示す（図１１Ｂ）ことを明らかにした。データは、平均値±ＳＥＭとして表した。独立パラメトリック両側ｔ検定を、ｐ値を算出するために使用した。
海馬及び皮質中のＴｒｉｓ又は塩酸グアニジン可溶性Ａβ４０及びＡβ４２の量をＥＬＩＳＡによって分析し、ＰＢＳ及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスの間でいずれの脳領域においてもＡβ４０及びＡβ４２の量に変化がないことを明らかにした。対照的に、アミロイドに対するチオフラビンＳ色素又はＡβ抗体を使用する免疫染色を用いた脳組織の染色は、ＰＢＳ対照と比較して、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスが皮質に低いチオフラビンＳ陽性プラークカウントを有し（図１１Ａ）、皮質において低い合計Ａβ陽性プラークロードを示す（図１１Ｂ）ことを明らかにした。データは、平均値±ＳＥＭとして表した。独立パラメトリック両側ｔ検定を、ｐ値を算出するために使用した。
【0168】
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置後のＡＰＰ
ＮＬ－Ｆ
マウスにおけるアストログリオーシスの低減
皮質及び海馬におけるアストログリオーシスをグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の量によって、並びにrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ及びＰＢＳ投与ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスの切片の免疫染色によって評価した。β－アクチンを用いた正規化後、ＧＦＡＰの量は、ＰＢＳ対照と比較してrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスの海馬脳ホモジネートにおいて有意に（ｐ＜０．０１）低減しており、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスの皮質においてＧＦＡＰの量の低下傾向があった（図１２Ａ）。さらに、脳切片のＧＦＡＰ免疫染色は、ＰＢＳ対照と比較して皮質においてrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ投与マウスのＧＦＡＰ陽性アストロサイトが顕著に低減していた（ｐ＝０．０２）ことを示した（図１２Ｂ）。ＧＦＡＰ陽性アストロサイトを含む領域は、円形クラスターとしてしばしば出現し、それらがプラークを囲んでいる可能性があることを示している。これに対処するために本発明者らは、脳組織をＧＦＡＰ及びＡβについて二重染色し、結果はＡβプラーク周辺のＧＦＡＰ陽性細胞の豊富な局所化を示している（図１２Ｃ）。ＧＦＡＰ及びＡβ共局在の程度は、ＰＢＳ対照と比較して、海馬及び皮質においてrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスで有意に（ｐ＝０．０３又はｐ＜０．００１）低減されていた（図１２Ｃ）。データは、ＰＢＳ及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスについて平均値±ＳＥＭとして示している。独立パラメトリック両側ｔ検定を、全ての分析についてのＰ値を算出するために使用した。
皮質及び海馬におけるアストログリオーシスをグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の量によって、並びにrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ及びＰＢＳ投与ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスの切片の免疫染色によって評価した。β－アクチンを用いた正規化後、ＧＦＡＰの量は、ＰＢＳ対照と比較してrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスの海馬脳ホモジネートにおいて有意に（ｐ＜０．０１）低減しており、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスの皮質においてＧＦＡＰの量の低下傾向があった（図１２Ａ）。さらに、脳切片のＧＦＡＰ免疫染色は、ＰＢＳ対照と比較して皮質においてrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ投与マウスのＧＦＡＰ陽性アストロサイトが顕著に低減していた（ｐ＝０．０２）ことを示した（図１２Ｂ）。ＧＦＡＰ陽性アストロサイトを含む領域は、円形クラスターとしてしばしば出現し、それらがプラークを囲んでいる可能性があることを示している。これに対処するために本発明者らは、脳組織をＧＦＡＰ及びＡβについて二重染色し、結果はＡβプラーク周辺のＧＦＡＰ陽性細胞の豊富な局所化を示している（図１２Ｃ）。ＧＦＡＰ及びＡβ共局在の程度は、ＰＢＳ対照と比較して、海馬及び皮質においてrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスで有意に（ｐ＝０．０３又はｐ＜０．００１）低減されていた（図１２Ｃ）。データは、ＰＢＳ及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスについて平均値±ＳＥＭとして示している。独立パラメトリック両側ｔ検定を、全ての分析についてのＰ値を算出するために使用した。
【0169】
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置でのＡｐｐ
ＮＬ－Ｆ
マウスにおけるミクログリオーシスの減弱
皮質及び海馬由来の脳組織ホモジネートを、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ及びＰＢＳ投与ＡｐｐＮＬ－ＦマウスにおけるＩｂａ１レベルを評価するために分析した。rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスの皮質におけるＩｂａ１のレベルは、ＰＢＳ対照と比較して低減されていた（ｐ＝０．０５）が、海馬領域では検出可能な差異はなかった。脳切片のＩｂａ１免疫染色は、両者の脳領域において染色の低減を示し、皮質領域において有意に（ｐ＝０．０１）低減して、ＰＢＳ対照と比較してrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスにおいてより少ないＩｂａ１陽性ミクログリア細胞を示している（図１３）。
皮質及び海馬由来の脳組織ホモジネートを、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ及びＰＢＳ投与ＡｐｐＮＬ－ＦマウスにおけるＩｂａ１レベルを評価するために分析した。rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスの皮質におけるＩｂａ１のレベルは、ＰＢＳ対照と比較して低減されていた（ｐ＝０．０５）が、海馬領域では検出可能な差異はなかった。脳切片のＩｂａ１免疫染色は、両者の脳領域において染色の低減を示し、皮質領域において有意に（ｐ＝０．０１）低減して、ＰＢＳ対照と比較してrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスにおいてより少ないＩｂａ１陽性ミクログリア細胞を示している（図１３）。
【0170】
rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置を伴う及び伴わないＡｐｐＮＬ－Ｆマウスにおける、プラークとアストロサイト及びミクログリア活性化についてのマーカーとの間の相関
前臨床研究は、可溶性Ａβオリゴマーがミクログリアを活性化でき、サイトカインの分泌を促進できることを報告した。ＡＤ対象でのミクログリアマーカー及びピッツバーグ化合物Ｂ（ＰＩＢ）、Ａβ沈着についてのマーカーのポジトロン断層撮影画像化は、これらのマーカーが皮質に共局在していることを示し、認知状態とミクログリア活性化との間の逆相関を明らかにした。さらに、ミクログリア活性化及びアストログリオーシスは、ＡＤにおける早期の現象の可能性があるが、ＰＩＢ陽性アミロイド沈着の個々のレベルとミクログリア活性化とは相関しない。このことは、本発明者らのデータからプラークとアストロサイト及びミクログリア活性化との間の潜在的な関係を明らかにするように本発明者らを促した。これにより本発明者らは、ＰＢＳ処置対照群及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置群それぞれのマウスについて、皮質及び海馬におけるプラークロード（Ａβ免疫染色）、アミロイドプラークカウント（チオフラビンＳ染色）、アストログリオーシス（ＧＦＡＰ免疫染色）、ミクログリオーシス（Ｉｂａ１免疫染色）並びに共局在（Ａβ及びＧＦＡＰ免疫染色）でペアワイズ相関を行った。
前臨床研究は、可溶性Ａβオリゴマーがミクログリアを活性化でき、サイトカインの分泌を促進できることを報告した。ＡＤ対象でのミクログリアマーカー及びピッツバーグ化合物Ｂ（ＰＩＢ）、Ａβ沈着についてのマーカーのポジトロン断層撮影画像化は、これらのマーカーが皮質に共局在していることを示し、認知状態とミクログリア活性化との間の逆相関を明らかにした。さらに、ミクログリア活性化及びアストログリオーシスは、ＡＤにおける早期の現象の可能性があるが、ＰＩＢ陽性アミロイド沈着の個々のレベルとミクログリア活性化とは相関しない。このことは、本発明者らのデータからプラークとアストロサイト及びミクログリア活性化との間の潜在的な関係を明らかにするように本発明者らを促した。これにより本発明者らは、ＰＢＳ処置対照群及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置群それぞれのマウスについて、皮質及び海馬におけるプラークロード（Ａβ免疫染色）、アミロイドプラークカウント（チオフラビンＳ染色）、アストログリオーシス（ＧＦＡＰ免疫染色）、ミクログリオーシス（Ｉｂａ１免疫染色）並びに共局在（Ａβ及びＧＦＡＰ免疫染色）でペアワイズ相関を行った。
【0171】
ＰＢＳ処置マウス及びrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスにおいて、ＧＦＡＰ及びＩｂａ１染色は、皮質及び海馬で正に相関する（図１２Ｂ及び図１３に示すデータに基づく）。このことは、これらのマーカーの両者が中枢神経系への侵襲を報告していることから予測され、関連性のある相関が、比較的少数のマウスが使用されたにもかかわらず本発明者らの研究において見いだされたことを支持している。この観察は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置がＰＢＳ対照と比較して相関を一般に抑制しないことを示している（更に以下を参照）。ＰＢＳ処置マウスでは、Ａβ陽性プラークの面積（プラークロード）がＧＦＡＰ及びＩｂａ１染色と、並びにＡβ及びＧＦＡＰ共局在と正に相関する傾向が、特に皮質においてある（図１１Ｂ、図１２Ｂ～図１２Ｃ及び図１３において示されたデータに基づく）。驚くべきことに、チオフラビンＳ陽性プラークの数（プラークカウント）は、ＰＢＳ処置マウスにおいてＧＦＡＰ及びＩｂａ１染色並びにＡβ及びＧＦＡＰ共局在と一般に負に相関する（図１１Ａ、図１２Ｂ～図１２Ｃ及び図１３において示されたデータに基づく）。さらに、Ａβプラークロード及びチオフラビンＳプラークカウントは、ＰＢＳ処置マウスにおいて互いに逆相関する傾向がある（図１１Ａ～図１１Ｂにおいて示されたデータに基づく）。
【0172】
ＰＢＳ処置対照ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスでの状況とは対照的に、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスは、ＡβプラークロードとチオフラビンＳプラークカウントとの間に相関を示さない（図１１Ａ～図１１Ｂにおいて示されたデータに基づく）。さらに、ＰＢＳマウスにおいて見られたチオフラビンＳプラークカウントとＧＦＡＰ及びＩｂａ１染色との間の負の相関の傾向は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスでは見られず（図１１Ａ及び図１２Ｂにおいて示されたデータに基づく；図１１Ａ及び図１３）、ＰＢＳマウスにおけるＡβプラークロードとＧＦＡＰ及びＩｂａ１染色との間の正の相関の傾向は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置マウスでは目立たない（図１１Ｂ及び図１２Ｂにおいて示されたデータに基づく；図１１Ｂ及び図１３）。
【0173】
ＡＰＰ
ＮＬ－Ｆ
マウスでのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ処置の効果は、脳BRICHOS／Ａβ４２比から概算されるin vitroでの新たなＡβ４２核形成単位の生成及びex vivoでのＡβ４２誘発神経毒性の低減と一致する。
【0174】
rh Bri2 BRICHOSは、単量体依存性二次核形成事象によって新たな核形成単位の生成を減弱する固有の能力を示し、in vitro線維形成の際に神経毒性Ａβ４２オリゴマーに転換できる可能性がある。さらにrh Bri2 BRICHOSは、ex vivoで海馬切片におけるγ振動のＡβ４２誘発低減を遮断し、Ａβ４２線維化の分子研究においてモデル化合物として現れた。rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ投与後にin vivoで今回観察された処置の効果が、in vitroでBRICHOSについて決定された分子機序によって媒介され得るかどうかを調査するために、本発明者らは、新たな核形成単位の減弱の観点からのＡβ４２オリゴマーの生成の低減の程度と、in vitro及びex vivoでそれぞれ測定されたrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅによるγ振動のＡβ４２誘発悪化の低減との間に、定量的一致があるかどうかを検討し、効果はＡｐｐＮＬ－Ｆマウスにおいて見られた。
【0175】
この目的のために本発明者らは、野生型マウスにおいて測定された野生型rh Bri2 BRICHOSのＢＢＢ通過の程度から、処置ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスの脳におけるrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの量を概算し［Tambaro et al., J Biol Chem. 294, 2606-2615 (2019)］、潜在的なin vivoでのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ／Ａβ４２比を決定するために、ＡｐｐＮＬ－Ｆ脳ホモジネート中のＡβ４２の測定された量を使用した。次に本発明者らは、以前に公表されたデータ［Chen et al., Nat. Commun. 8, 2081, (2017); Chen, et al. Commun Biol. 3, 32 (2020)］を使用して、どの程度のin vitroでの核形成単位生成の低減及びＡβ４２の低下が、ex vivoで海馬切片においてγ振動にそれぞれ効果を誘発し、このrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ／Ａβ４２比に対応するかを概算した。注目すべきことに、in vitroでのオリゴマー生成の予測された低減及び概算されたin vivoでのrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ／Ａβ４２比に対応するex vivoでのＡβ４２媒介神経毒性の低下は、ウエスタンブロットによる皮質におけるＡβ陽性及びチオフラビンＳ陽性プラーク、ＧＦＡＰ染色、Ｉｂａ１レベルの低減並びにrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅ後にＡｐｐＮＬ－Ｆマウスにおいて観察された身体活動性の増加とよく一致する。Ａβの共局在の程度及びＧＦＡＰ染色及びＩｂａ１染色について、in vivoでの低減は一見したところin vitroデータから予測されるよりも明らかであり、カスケードを増幅することがin vivoでのアストログリア及びミクログリアの活性化に関与することに関連する可能性がある。
【0176】
結論
本発明者らの結果は、ＡｐｐＮＬ－Ｆノックインマウスにおける身体活動性、Ａβプラーク負荷並びにアストロサイト及びミクログリア活性化が、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの静脈内投与によって有意に改善され得ることを示している。
本発明者らの結果は、ＡｐｐＮＬ－Ｆノックインマウスにおける身体活動性、Ａβプラーク負荷並びにアストロサイト及びミクログリア活性化が、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅの静脈内投与によって有意に改善され得ることを示している。
【0177】
特に本発明者らの結果は、表面触媒二次核形成経路による新たな核形成単位の生成が、ＡｐｐＮＬ－Ｆマウスにおいて観察されたＡβ誘発アストロサイト及びミクログリア活性化によって示されるとおり毒性効果を生じ得ること、並びにrh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅを用いた静脈内処置が、in vivoで神経毒性経路を効率的に低減することを支持している。
【0178】
本発明者らの観察は、rh Bri2 BRICHOS Ｒ２２１Ｅを用いたＡｐｐＮＬ－Ｆノックインマウスの静脈内処置が、Ａβ抗体及びチオフラビンＳ陽性プラークに影響を与え、ミクログリア及びアストロサイトの活性化の低減を生じることを支持している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】