特表 2023-509354 抗体ニモツズマブの安定で高濃度の製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-08

(54)【発明の名称】抗体ニモツズマブの安定で高濃度の製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20230301BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230301BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20230301BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20230301BHJP

   A61K 47/14 20170101ALI20230301BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20230301BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20230301BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230301BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20230301BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61P35/00

A61K47/22

A61K47/02

A61K47/14

A61K47/18

A61K47/26

A61K9/08

A61K9/19

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022536924

(86)(22)【出願日】2020-12-10

(85)【翻訳文提出日】2022-08-05

(86)【国際出願番号】 CU2020050007

(87)【国際公開番号】W WO2021121444

(87)【国際公開日】2021-06-24

(31)【優先権主張番号】CU-2019-0104

(32)【優先日】2019-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】500185689

【氏名又は名称】セントロ ド インムノロジア モレキュラー

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヘルナンデス テレーロ、ヤイコ サッダン

(72)【発明者】

【氏名】フェルナンデス サエス オルガ リデア

(72)【発明者】

【氏名】サント トマス ポムパ、フリオ フェリペ

(72)【発明者】

【氏名】セデーニョ アリアス、メルセデス

(72)【発明者】

【氏名】ラシダ デ ラ ルス ヘルナンデス、カティヤ

(72)【発明者】

【氏名】ボッジアーノ アヨ、タミー

(72)【発明者】

【氏名】レオン モンソン、カレット

(72)【発明者】

【氏名】カスティージョ ヴィトロク、アドルフォ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076AA30

4C076BB15

4C076BB16

4C076CC27

4C076DD09E

4C076DD09F

4C076DD26Z

4C076DD51

4C076DD60Q

4C076DD60Z

4C076DD67Q

4C076EE23E

4C076EE23F

4C076FF11

4C076FF15

4C076FF16

4C076FF61

4C076FF63

4C085AA14

4C085EE01

4C085GG03

4C085GG04

(57)【要約】

本発明は、バイオテクノロジー及び医学の分野に関し、５０～２００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のヒト化モノクローナル抗体ニモツズマブを含む高濃度医薬製剤を記載する。これらの溶液の低い粘度値は、がん治療において皮下又は筋肉内に使用することを可能にする。これらの製剤は、液体形態及び凍結乾燥形態の両方で安定である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ニモツズマブの高濃度で安定な医薬製剤であって、
ａ）１００～２１０ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度のニモツズマブｍＡｂ、
ｂ）６．５±０．５のｐＨ範囲で、５～３０ｍＭの範囲内の濃度の緩衝物質、
ｃ）０．０２～０．０６％の範囲内の界面活性剤、
ｄ）３０～１５０ｍＭの範囲内のアミノ酸又はその混合物、及び
ｅ）任意選択的に２～６％の範囲内の安定化剤としての炭水化物
を含むことを特徴とする、上記医薬製剤。

【請求項2】

緩衝物質が、
ヒスチジン緩衝液、及び
リン酸ナトリウム
からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項3】

界面活性剤が、
ポリソルベート２０、及び
ポリソルベート８０
からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項4】

アミノ酸が、
Ｌ－メチオニン、及び
グリシン
からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項5】

炭水化物がスクロースである、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項6】

液体形態の、請求項１～５のいずれかに記載の医薬製剤。

【請求項7】

凍結乾燥形態の、請求項１～５のいずれかに記載の医薬製剤。

【請求項8】

１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で５ｃＰ以下の粘度を有することを特徴とする、請求項６に記載の医薬製剤。

【請求項9】

がんを治療するための、請求項１～８のいずれかに記載の医薬製剤の使用。

【請求項10】

それを必要とする患者を治療する方法であって、請求項１～８のいずれかに記載の医薬製剤を、２００ｍｇ／７０ｋｇ～４００ｍｇ／７０ｋｇの用量レベルで、１．３～２ｍＬの注射量を用いて皮下投与することを含み、医薬製剤の用量を分割して２つ以上の別個の注射部位に投与することができる、上記方法。

【請求項11】

それを必要とする患者を治療する方法であって、請求項１～８のいずれかに記載の医薬製剤を、１５０ｍｇ／７０ｋｇ～１０００ｍｇ／７０ｋｇの用量レベルで、１．３～５ｍＬの注射量を用いて、筋肉内投与することを含む、上記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジー及び医学の分野に関し、特に、がん治療としての皮下（ＳＣ）又は筋肉内（ＩＭ）投与を意図したヒト化モノクローナル抗体ニモツズマブの高濃度で安定な製剤を得ることに関する。

【背景技術】

【0002】

ニモツズマブは、ヒト上皮成長因子受容体Ｈｅｒ１を認識するヒト化ＩｇＧ１アイソタイプモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。これは、マウス起源ｍＡｂ ｉｏｒ ｅｇｆ／ｒ３の超可変領域のＤＮＡ、ならびにヒト起源（それぞれＲＥＩ及びＮＥＷＭ）の重鎖及び軽鎖の可変領域及び定常領域のフレームをクローニングすることによって得られた（Ｍａｔｅｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：７１－８１）。ニモツズマブの有効性は、頭頸部腫瘍（Ｃｒｏｍｂｅｔ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２２：１６４６－１６５４）、神経膠腫（Ｒａｍｏｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．５：３７５－３７９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ．１３：１０４９－１０５８）及び食道腫瘍（Ｒａｍｏｓ－Ｓｕｚａｒｔｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ １３：６００－６０５）を有する患者における臨床試験において実証されている。この抗体（Ａｂ）は、現在、鼻咽頭がん、局所進行食道がん、及び食道扁平上皮がん（Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１：２８－３７）における第ＩＩＩ相臨床試験で試験されている。

【0003】

ｍＡｂニモツズマブの投与は、該ｍＡｂが５ｍｇ／ｍＬの濃度である液体製剤を使用して、注入として静脈内（ＩＶ）経路によって行われる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｃｍｅｄ．ｃｕ／ｒｅｇｉｓｔｒｏ／ｒｃｐ／ｃｉｍａｈｅｒ－ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）。この投与は、０．９％ ＮａＣｌ溶液のバッグに５ｍｇ／ｍＬの濃度のニモツズマブのバイアル４本を溶解することによって行われる。ニモツズマブの市販製剤の組成はまた、約７のｐＨで１５ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．０２％のポリソルベート８０を含む（Ｒｅｖｉｓｔａ Ｃｕｂａｎａ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ．２０１２；４６（３）：３７９－３８０）。臨床環境でのニモツズマブは、放射線療法及び化学療法と組み合わせて、２００ｍｇ（膵臓がんでは４００ｍｇ）の用量で週に１回、６週間投与される。次いで、患者の臨床状態が許容するまで、２００ｍｇの維持用量を１５日ごとに投与する。したがって、病院環境外の患者におけるニモツズマブのこの連用を容易にする投与経路を有することが重要である。

【0004】

知られているように、ＩＶ投与には、投与を行うのに必要な長期間、投与手順を訓練された資格のある人員の必要性、感染のリスク及び重度の有害反応などのいくつかの欠点がある（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｆ．Ｈａｌｌｅｒ（２００７）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（１０）：１１８－１３２）。

【0005】

このため、ｍＡｂのＳＣ投与に対する世界的な傾向が増加している（Ｖｉｏｌａ Ｍ、Ｓｅｑｕｅｉｒａ Ｊら（２０１８）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ；２８６：３０１－３１４）。なぜなら、この経路は、単一バイアルを必要な量で操作及び投与することがより容易であるので（Ｈａｌｌｅｒ ＭＦ（２００７）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（１０）：１１８－１３２）、投与を行うのに必要な時間及び投与される体積の減少、感染リスクの減少、ならびにさらには患者による薬剤の自己投与の可能性などの利点を提供するからである。ＩＭ投与も、ＩＶ投与と比較して、より低い治療コスト及び必要とされる集中治療が少ないなどの利点を有する。一方、ＩＭ経路は、ＩＶ経路よりも感染のリスクが低く、投与時間が短い。また、ＩＭ経路で薬剤を投与する場合、有害作用や過量投与が生じる可能性が低いことが知られている。ＩＭ投与後の薬剤の吸収及びバイオアベイラビリティは非常に高く、ＩＶ経路を使用した場合に報告された値とほぼ同じくらい高い値であることにも留意すべきである。（Ｊｉｎｇ－ｆｅｎ Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｉｅｎｔ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ，２０１５，９：９２３－９４２）。

【0006】

ＳＣ製剤において現在臨床で使用されているｍＡｂの中には、トラスツズマブ（米国特許第９，３４５，６６１号明細書）及びリツキシマブ（米国特許第１０，２８０，２２７号明細書）があり、両方の製剤において、ヒアルロニダーゼ酵素が、注射量を１．５ｍＬ超まで増加させ、ｍＡｂの良好な体内分布を達成するために使用され、したがって、療法効果を発揮するのに必要な用量に確実に到達する（Ｓｈｐｉｌｂｅｒｇ，Ｏ．ａｎｄ Ｃ．Ｊａｃｋｉｓｃｈ．（２０１３）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．１０９：１５５６－１５６１）。

【0007】

ヒアルロニダーゼ酵素を使用する別の高濃度製剤は、特許出願ＣＮ １０７８９８７５６Ａ号明細書に記載されている製剤である。この特許では、ＳＣ又はＩＭ使用のための高濃度のニモツズマブｍＡｂの製剤が特許請求されている。特許に報告されているように、この製剤中のヒアルロニダーゼの存在は、必要な透過性が達成されることを確実にするために必要である。

【0008】

抗ＥＧＦＲ ｍＡｂを含む限外濾過によって得られる高濃度液体製剤が特許請求されている国際公開第２０１１０８０２０９号パンフレットに記載されている製剤のような、上皮成長因子に対するｍＡｂの高濃度製剤の以前の報告がある。この特許では、特許請求されている製剤をニモツズマブｍＡｂに使用することができると述べられているが、この特許請求の範囲を裏付ける実際的な証拠は提供されていない。この特許出願では、１ｍｇ／ｍｌ～２００ｍｇ／ｍｌの範囲のｍＡｂの濃度が特許請求されているが、最大５０ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ ｈｕ－ＩＣＲ ６２の濃度にのみ到達する。さらに、この特許出願で特許請求されている賦形剤及び濃度の範囲は、最新技術で最も一般的に使用される賦形剤及び濃度のほとんど全てを含むため、広すぎる。本発明では、国際公開第２０１１０８０２０９号パンフレットで特許請求されている範囲に含まれる賦形剤及び濃度のいくつかの組み合わせは、ニモツズマブｍＡｂにとって最も安定な、又は最良の製剤選択肢ではないことが実証された。

【0009】

ＩＭ経路によって投与されるｍＡｂの主な例として、パリビズマブ（ｐａｌｉｖｕｚｕｍａｂ）ｍＡｂがある。このｍＡｂは、水中で再構成された後、ヒスチジン、グリシン及びマンニトールなどの賦形剤に加えて１００ｍｇ／ｍＬの濃度のパリビズマブ（ｐａｌｉｖｕｚｕｍａｂ）ｍＡｂを有し、呼吸器合胞体ウイルスの治療のために１５ｍｇ／ｋｇ用量で使用される凍結乾燥製剤として提示される。

【0010】

安定性、低濁度及び粘度を維持するｍＡｂの製剤を達成することは、適切なスクリーニング方法論を必要とする課題である。高濃度で上記の要件を満たすためにｍＡｂに必要とされる賦形剤及び条件の正しい組み合わせを見出すという課題は些末なことではない。各々の組み合わせが異なり、それらの主要な分解機序に関して異なる挙動をするため、これまでのところ、どの組み合わせが特定のｍＡｂにとって最も効果的であるかを事前に予測することは可能ではないからだ（Ｍａｎｎｉｎｇ ＭＣ ｅｔ ａｌ．（２０１８）タンパク質化学及び構造生物学の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１１２：１－５９、Ｖｉｏｌａ Ｍ，Ｓｅｑｕｅｉｒａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ；２８６：３０１－３１４）。

【0011】

本発明の発明者らは、ｍＡｂの安定性、低濁度及び低粘度を保証する賦形剤の特定の組み合わせを有する、これまでに報告されたものとは異なるニモツズマブｍＡｂのための製剤を見出した。これらの製剤はまた、ＳＣ製剤の安定性及び透過性を保証するためにヒアルロニダーゼ酵素を使用する必要がないので、より複雑ではない。これらの特定の製剤では、１００～１８０ｍｇ／ｍＬの濃度のニモツズマブも達成され、したがって、投与体積を増加させることなくｍＡｂ用量を増加させることが可能になる。ＳＣ又はＩＭ経路によるこれらの製剤の投与は、慢性投与が必要な場合、ＳＣ経路の場合には２００ｍｇ～３６０ｍｇの用量で、ＩＭ経路の場合には２００～７２０ｍｇの用量で、これらの使用を容易にし、患者によって自己投与することができるというさらなる利点を有する。

【発明の概要】

【0012】

一実施形態では、本発明の目的は、１００～２１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のニモツズマブｍＡｂ、５～３０ｍＭの範囲の緩衝物質、６．５±０．５のｐＨ値、０．０２～０．０６％の範囲の界面活性剤、３０～１５０ｍＭの範囲のアミノ酸又はその混合物、及び任意選択的に２～６％の範囲の安定剤としての炭水化物を含む、ニモツズマブモノクローナルＡｂの高濃度で安定な医薬製剤である。

【0013】

特に、上記製剤の緩衝物質は、ヒスチジン緩衝液及びリン酸ナトリウムから選択される。界面活性剤は、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０から選択される。アミノ酸は、Ｌ－メチオニン及びグリシンから選択される。製剤に使用される炭水化物はスクロースである。

【0014】

より具体的には、上記製剤は、液体形態又は凍結乾燥形態であり得る。１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の液体製剤は、５ｃＰ以下の粘度を有する。

【0015】

本発明のさらなる目的は、がんの治療における上記の医薬製剤の使用である。特に、それを必要とする患者を治療する方法であって、本発明に記載の医薬製剤を、２００ｍｇ／７０ｋｇ～７５０ｍｇ／７０ｋｇの用量で、ＳＣ又はＩＭ経路によって投与することを含む方法が記載される。このｍＡｂのＳＣ投与は、１．３～２ｍＬの注射量、及び１５０～２００ｍｇ／ｍＬの濃度を用いて行われる。さらに、ｍＡｂは、より高い用量のｍＡｂが必要とされる場合、１つ以上の注射部位に投与することができる。ＩＭ経路の場合、１５０ｍｇ／ｍＬ濃度で１．３～５ｍＬの注射量で、２００～７５０ｍｇ／７０ｋｇの用量が達成される。２００ｍｇ／ｍＬの濃度及び１．３～５ｍＬの筋肉内体積を使用する場合、２６０～１０００ｍｇ／７０ｋｇの用量が達成される。

【発明を実施するための形態】

【0016】

ニモツズマブｍＡｂの安定な高濃度製剤の取得
本発明は、本明細書においてｈＲ３とも呼ばれる高濃度のｍＡｂニモツズマブの製剤に関する。本発明に記載される製剤中のニモツズマブの濃度は、１００～２１０ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは１００～１８０ｍｇ／ｍｌの範囲である。本特許出願に開示されるニモツズマブ製剤は、緩衝物質、界面活性剤、アミノ酸、及び任意選択的に炭水化物を含む。緩衝物質は、製剤のｐＨを６．５±０．５のｐＨ範囲に維持することを可能にする５～３０ｍＭの範囲のヒスチジン又はリン酸ナトリウムであり得る。本発明の製剤は、界面活性剤としてポリソルベート２０又はポリソルベート８０を０．０２～０．０６％の濃度範囲で含み得る。炭水化物は、２～６％の濃度範囲のスクロース及びトレハロースであり得る。さらに、アミノ酸は、３０～１５０ｍＭの濃度範囲のＬ－メチオニンもしくはグリシン又はその両方から選択される。

【0017】

これらの製剤を得るために、３０～５０ｋＤの孔径を有するセルロース膜を有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ限外濾過－ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）システムを使用することができる。試料をダイアフィルトレーション又は濃縮するために、２～８℃の温度で９００×ｇ～１１００×ｇの範囲の遠心分離速度を使用することができる。試料は滅菌濾過に供し、試料の体積に応じて使用するフィルターの種類を選択する。本発明に記載の製剤を調製する別の方式は、実験室規模又はパイロット規模の接線流濾過システムによるものである。この目的のために、３０及び５０ｋＤの孔径の膜を使用することができる。緩衝液を変更するための試料のダイアフィルトレーションは、１０～１５ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）の最終緩衝液を使用して行われる。試料を濃縮するために、初期体積は、所望の濃度に対応する計算体積よりも小さい体積に減少させなければならない。

【0018】

これらの製剤は、最良の緩衝液及びｐＨ値が選択される第１の段階からなる段階的スクリーニング戦略によって得ることができる。第２の段階では、最も適切な塩、界面活性剤及び炭水化物が選択され、続いて第３の段階では、製剤にとって最良のアミノ酸が選択される。使用することができる別の方法は、要因計画に従った異なる種類の賦形剤又はそれらの組み合わせの使用からなる同時スクリーニングである。この方法を使用した場合、同じ製剤中の２つ又は３つを超える賦形剤間に相互作用が起こる可能性がある。

【0019】

別の態様では、本発明は、上記の製剤を凍結乾燥及び再構成する方法、ならびに安定な等張再構成製剤を調製する方法を提供する。上記方法は、再構成製剤中のｍＡｂ濃度が少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ～２１０ｍｇ／ｍＬ、すなわち、凍結乾燥前の混合物中のｍＡｂ濃度より３～５倍高くなるように、上記緩衝液中のｍＡｂと安定剤との凍結乾燥混合物を再構成することを含む。

【0020】

ニモツズマブの高濃度製剤の安定性の決定
最も安定した製剤変形例及び安定性に対する各賦形剤の影響を検証するために、安定性を予測するパラメータの研究を動的光散乱（ＤＬＳ）によって行う。上述のこれらのパラメータは、拡散相互作用パラメータ（ｋＤ）、ゼータ電位及び凝集温度（Ｔａｇｇ）である。ｋＤの測定は、１２ｍｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌの濃度のニモツズマブの拡散係数を測定することによって行う。Ｔａｇｇは、２５～７６℃の温度傾斜で初期試料から決定され、ゼータ電位は、初期濃度で試料を測定することによって決定される。

【0021】

最良の製剤を決定するために使用される別の方法は、ストレス試験であり、この場合、試料は、１０～２０日間、恒温槽内で５０℃の温度に供され、次いで、物理化学的及び生物学的決定によって異なる時間間隔で分析される。

【0022】

これらの決定の中には濁度があり、濁度は、３４０～４５０ｎｍのＵＶスペクトルにおける試料の吸光度で測定され、大きな凝集体の検出を可能にする。別の例は、溶液中の凝集体又は粒子の形成を検出するために、無傷の未希釈試料の初期濃度を測定することによって行われるＤＬＳによる粒径の決定である。粘度測定は、１００～５００ｎｍの公称径範囲、好ましくは２００ｎｍの公称径のＤＬＳ径標準を使用して、高濃度試料の場合に行う。

【0023】

試料はまた、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、ストレス試験中に断片形成があったかどうかを判定する。７．５％のポリアクリルアミドゲル及びクーマシーブルー又は硝酸銀染色を用いて、非還元条件下で試験を行った。サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によるモノマー純度の決定も行う。

【0024】

ｍＡｂの生物学的活性は、ニモツズマブの参照物質に対する相対効力によって決定され、フローサイトメトリーによって、又はヒトＨｅｒ１を発現する細胞系統における細胞増殖の阻害によって測定することができる。

【0025】

治療方法
本発明の製剤目的は、頭頸部、神経膠腫、食道、肺及び膵臓腫瘍を有する患者を治療するために使用することができる。療法的使用に関して、上記製剤は、療法作用を増強するために、単独療法として、又は放射線療法もしくは化学療法などの腫瘍の治療に使用される従来の療法と組み合わせて、疾患を有する対象に投与されなければならない。

【0026】

これらの製剤の投与は、ＳＣ又はＩＭ経路によって行われる。ＳＣ経路の場合、２００ｍｇ／７０ｋｇ用量のために、１．３３ｍＬの最小試料体積が使用されるべきである。より大きい用量の場合、注射量は、３００／７０ｋｇの最大用量に達するまで、２ｍＬまで増加させることができる。３００ｍｇ／７０ｋｇを超える用量の投与が必要な場合、１５０ｍｇ／ｍＬを超える濃度のｍＡｂを使用することができ、又は用量を分割して２つの別個の注射部位に投与することができる。上記投与に使用することができる注射部位は、限定されるものではないが、三角筋領域、腹部領域及び大腿の前面領域である。診療所で使用される用量が週に２００ｍｇである場合、１３４ｍｇ／ｍＬの濃度のニモツズマブが、治療を施すのに十分であろう。より高い用量が必要とされる場合、２１０ｍｇ／ｍＬまでのより高い濃度のニモツズマブを使用することができる。例えば、４００ｍｇの用量を必要とする膵臓がんの治療には、２つの別個の注射部位が使用されるべきである。

【0027】

文献中の報告によれば、許容される最大ＩＭ投与体積は５ｍＬであり、したがって、この投与経路を使用する場合、注射量は１．３～５ｍＬであり得、ｍＡｂの濃度が１５０ｍｇ／ｍＬの場合、２００～７５０ｍｇ／７０ｋｇの用量となる。２００ｍｇ／ｍＬの濃度を使用する場合、用量は１０００ｍｇ／７０ｋｇまでであり得る。

【0028】

本発明を、以下の例及び図面を用いてさらに詳述する。しかしながら、これらの例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】ＤＬＳによって決定されたｈＲ３ ｍＡｂ製剤変形例のｋＤ値を示す図である。

【図2】ＤＬＳによって決定されたｈＲ３ ｍＡｂ含有アミノ酸の異なる製剤のｋＤ値を示す図である。

【図3】アミノ酸を含有するｈＲ３ ｍＡｂ製剤のＤＬＳによって測定した粒径を示す図である。

【図4】４℃で３ヶ月間保存した１５０ｍｇ／ｍＬの濃度のｈＲ３ ｍＡｂ製剤のＤＬＳによって測定した粒径を示す図である。

【図5】４℃で３ヶ月間保存した１５０ｍｇ／ｍＬの濃度のｈＲ３ ｍＡｂ製剤のＤＬＳによって測定した粘度を示す図である。

【図6】４℃で３ヶ月間保存した１５０ｍｇ／ｍＬの濃度のｈＲ３ ｍＡｂ製剤のＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定したモノマー純度を示す図である。

【図7】無胸腺Ｂａｌｂ／ｃマウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶ及びＳＣ経路投与したニモツズマブｍＡｂの抗腫瘍効果を示す図である。

【実施例】

【0030】

例１．ニモツズマブｍＡｂのための製剤賦形剤のスクリーニング。
表１に示すように、４因子及び１／２画分の要因計画から９つの製剤変形例を調製した。ｈＲ３ｓｏｌ９変形例は、ｈＲ３ ｍＡｂの元の製剤に対応する。溶液を調製した後、孔径０．２μｍの膜フィルターに通して濾過し、４℃で保存した。

【表1】

【0031】

溶液が調製されると、５０ｋＤの孔径、再生セルロース膜、１５ｍＬの試料体積のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔにおいて、ＵＦ／ＤＦによって緩衝液交換を行った。試料を４℃の温度で９３６×ｇで遠心分離した。ｍＡｂ ｈＲ３を、１５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ７溶液中の出発生成物として使用した。１０ｍｇ／ｍＬのＡｂ濃度で製剤を調製した後、拡散相互作用パラメータ（ｋＤ）の測定をＤＬＳによって行った。

【0032】

図１に見られるように、より高いｋＤ値を有する変形例、したがって、より安定なタンパク質－タンパク質相互作用を有し、凝集する傾向がより少ない変形例は、ｈＲ３ｓｏｌ８及びｈＲ３ｓｏｌ３変形例であり、続いてｈＲ３ｓｏｌ４変形例であり、これは製剤中の炭水化物の安定化効果を示す。この試験の過程で、ｈＲ３ｓｏｌ８変形例のｋＤ値がｈＲ３ｓｏｌ３変形例のｋＤ値よりもはるかに高いことも観察され、これはヒスチジンとスクロースとの組み合わせがホスファートとトレハロースとの組み合わせよりも高い安定性を有することを示唆している。最良の変形例のいずれにおいてもＮａＣｌは存在せず、これはＮａＣｌがｈＲ３ｍＡｂの安定性を損なうことを示す。

【0033】

どの変形例が最も安定であるかを検証することを目的とした別の実験は、５０℃で１４日間行われたストレス試験であった。ストレスに供した後の試料をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析して、モノマーの純度を決定した。表２は、最も高いモノマー純度を有する変形例がｈＲ３ｓｏｌ８及びｈＲ３ｓｏｌ３であったことを示し、これはｋＤ値測定の結果と一致する。最も低いモノマー純度を有する変形例はｈＲ３ｓｏｌ９及びｈＲ３ｓｏｌ２、すなわち、それらの組成物中に塩化ナトリウムを有する変形例であり、これは、使用される緩衝液の種類にかかわらず、安定性に対するこの賦形剤の負の効果を示した以前の結果をさらに裏付けている。

【表2】

【0034】

以前に得られた結果に基づいて、最も安定なｈＲ３ ｍＡｂ製剤変形例は、塩化ナトリウムの非存在下でスクロース及びトレハロースなどのいくつかの炭水化物を有するものであると結論付けられた。さらに、スクロースとヒスチジンとの組み合わせは、ホスファートとトレハロースとの組み合わせよりもかなり安定である。

【0035】

例２．ｈＲ３ ｍＡｂの製剤化のためのアミノ酸のスクリーニング。
賦形剤のスクリーニング後に得られた２つの最良の変形例から異なる溶液を調製し、アミノ酸（Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、グリシン）をそれぞれに添加した。調製方法は、賦形剤のスクリーニングについて例１に記載したものと同様であった。表３は、異なるアミノ酸を含有するｈＲ３ ｍＡｂの製剤変形例を示す。

【表3】

【0036】

ＤＬＳによって行ったｋＤ測定の結果を図２に示す。観察され得るように、最も高いｋＤ値を有する変形例は、ｈＲ３ｓｏｌ８０、ｈＲ３ｓｏｌ８１、ｈＲ３ｓｏｌ８２及びｈＲ３ｓｏｌ３２であり、これらの中で最も安定な変形例は、ヒスチジン緩衝液を有するものであった。両方の緩衝液において、メチオニンの存在は、他のアミノ酸では生じない高いｋＤ値をもたらすことにも留意すべきである。

【0037】

異なる製剤を恒温槽内で５０℃で１５日間ストレスに供し、０、５、１２及び１５日目にＤＬＳによって粒径を測定した。図３は、これらの測定の結果を示す。見られるように、粒径がより小さい変形例、したがって凝集がより少ない変形例は、ｈＲ３ｓｏｌ８０、ｈＲ３ｓｏｌ８２及びｈＲ３ｓｏｌ８３変形例であった。これにより、ヒスチジン緩衝液を有する製剤がリン酸緩衝液を有する製剤よりも安定であること、及びＬ－メチオニン又はグリシンを含有する変形例がＬ－アルギニンを含有する変形例よりも安定であることが見出されたことが確認される。

【0038】

さらに、表４は、５０℃でストレスに供した製剤のモノマー純度値を示す。

【表4】

【0039】

表４は、ストレスに供した後の最も高いモノマー純度を有する変形例はｈＲ３ｓｏｌ８２及びｈＲ３ｓｏｌ８０であることを示す。この結果は、ヒスチジン緩衝液を有する変形例が、リン酸緩衝液を有する変形例よりも安定であることを示す。メチオニンを含む製剤は、アミノ酸を含まない製剤よりも安定性が高いことも示唆される。最も低い純度を有する製剤は、ｈＲ３ｓｏｌ８１及びｈＲ３ｓｏｌ９０であった。これは、Ｌ－アルギニン及び塩化ナトリウムの両方がｈＲ３ ｍＡｂ製剤に対して不安定化効果を有することを示唆する。以前の結果によれば、ｐＨ６のヒスチジン緩衝液、スクロース、ポリソルベート８０及びＬ－メチオニンを有するｈＲ３ ｍＡｂ製剤が最も安定である。

【0040】

これらの結果は、特許国際公開第２０１１０８０２０９号パンフレットの特許請求されている組み合わせの範囲内にあるｈＲ３ｓｏｌ２、ｈＲ３ｓｏｌ６、ｈＲ３ｓｏｌ３１、ｈＲ３ｓｏｌ８１及びｈＲ３ｓｏｌ９０変形例は、それらの低い安定性がそれらの有効性及び患者へのそれらの投与の安全性に悪影響を及ぼすので、ニモツズマブｍＡｂに推奨されないことを実証している。上記は、タンパク質間の構造的差異のために、あるタンパク質に対して安定な製剤が別のタンパク質に対して必ずしも安定ではないという文献に報告された概念を支持する。

【0041】

例３．４℃で保存した高濃度のｈＲ３ ｍＡｂの貯蔵寿命安定性研究
４℃で保存した１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ濃度のｈＲ３ｓｏｌ８０、ｈＲ３ｓｏｌ８２及びｈＲ３ｓｏｌ９０変形例の安定性の特性評価を行った。試料は、０ヶ月及び３ヶ月で、ＤＬＳによる粒径及び粘度の物理化学的分析、ならびにＨＰＬＣによるモノマー純度分析を受けた。

【0042】

図４は、異なる変形例のＤＬＳによって測定した粒径の結果を示す。図で観察され得るように、製剤の各々において、直径は３ヶ月間一定のままであり、これは、高濃度の試料における凝集の非発生を示す。しかしながら、ｈＲ３ｓｏｌ９０変形例の粒径は初期で約２５ｎｍであり、他の製剤の粒径よりも大きいことに留意すべきである。これは、この変形例が、ｈＲ３ｓｏｌ８０及びｈＲ３ｓｏｌ８２変形例と比較して分子間で自己会合する傾向が大きいことを示唆している。

【0043】

図５は、２００ｎｍ粒径標準を用いてＤＬＳによって測定した粘度値を示す。全ての場合において、粘度は非常に小さな変動しか有さず、これは分子間の凝集効果又は自己会合がないことを示している。さらに、全ての値が５ｃＰ未満であり、これは適切な注射可能性（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）及び製造性を達成するために確立された限界をはるかに下回る（Ｌｉ Ｌｉ，Ｓａｎｄｅｅｐ Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ（２０１４）３１：３１６１－３１７８）ことを強調することは非常に重要である。また、粘度値は、１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の他のＡｂについて報告された粘度値よりも低い。

【0044】

図６は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定したモノマー純度のグラフを示す。観察され得るように、モノマーの純度は相当の変化を示さず、これは、４℃で保存した１５０ｍｇ／ｍＬの濃度のｈＲ３ ｍＡｂの製剤が安定であることを示唆している。

【0045】

さらに、ｈＲ３ ｍＡｂ製剤の生物学的活性を、時間０及び３ヶ月でストレスに曝露することなく１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で決定した。生物学的活性を、フローサイトメトリーアッセイによるｈＲ３ ｍＡｂによるヒト上皮成長因子受容体（Ｈｅｒ１）の認識及び細胞増殖アッセイの阻害によって測定した。フローサイトメトリーアッセイを行うために、ウェルあたり２×１０５個のＨ２９２細胞を使用し、１／３希釈で８１μｇ／ｍＬから濃度曲線を作成し、次いで平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。半数効果濃度（ＥＣ５０）をＭＦＩ値から決定し、市販のｈＲ３参照物質と比較して相対効力を得た。Ｈ２９２細胞を用い、細胞増殖試薬ＷＳＴ－１溶液を色素として使用して、細胞増殖アッセイを行った。得られた吸光度を市販のｈＲ３参照物質と比較して、相対効力を決定した。時間０での両方の測定からの結果を表５に示し、研究開始後３ヶ月で実施した結果を表６に示す。

【表5】

【0046】

表５は、ｈＲ３ｓｏｌ８０、ｈＲ３ｓｏｌ８２及びｈＲ３ｓｏｌ９０変形例の相対効力が、フローサイトメトリーアッセイによって測定して７９～８３％であったことを示し、これは、それらが高濃度でさえそれらの生物学的活性を維持することを示す。一方、細胞増殖アッセイの阻害で得られた相対効力値は、９３～１０４％であり、これは、サイトメトリーからの結果を確認し、高濃度の試料がそれらの生物学的活性を保持していることを実証する。各値は、各アッセイにおける固有の変動性に起因して、異なる信頼区間内にあることを考慮に入れるべきである。それにもかかわらず、値は各アッセイに許容可能な範囲内である。

【表6】

【0047】

表６は、４℃で３ヶ月保存した、１５０ｍｇ／ｍＬの濃度のｈＲ３製剤の生物学的活性の結果を示す。注目され得るように、最も高い相対効力値を有する試料はｈＲ３ｓｏｌ８０及びｈＲ３ｓｏｌ９０であり、その値は、サイトメトリーアッセイによる認識において７８～８１％、増殖アッセイの阻害において７７～８６％であった。

【0048】

例４．１５０ｍｇ／ｍＬの濃度のｈＲ３ ｍＡｂの最良の製剤変形例の５０℃でのストレス試験。
製剤変形例ｈＲ３ｓｏｌ８０、ｈＲ３ｓｏｌ８２及びｈＲ３ｓｏｌ９０において、ｈＲ３は、５０ｋＤ孔径、再生セルロース膜、１５ｍＬ試料体積のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ Ｕｎｉｔｓにおいて、ＵＦ／ＤＦによって１５０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。試料を４℃の温度で９３６ｇで遠心分離した。１５０ｍｇ／ｍＬの濃度に達したら、試料を０．２μｍ孔径フィルターで濾過し、５０℃の恒温槽に入れた。異なる製剤のサンプリングを０、４、１０及び１５日目に行って、物理化学的パラメータを測定した。表７は、異なるサンプリング日に行ったモノマー純度測定の結果を示す。

【表7】

【0049】

表７に見られるように、４日間のストレス後、ｈＲ３ｓｏｌ９０変形例は完全に沈殿して白色固体を形成し、一方、ｈＲ３ｓｏｌ８０変形例は４５．３％のモノマー純度を有し、ｈＲ３ｓｏｌ８２変形例は５８．９％のモノマー純度を有した。この結果から結論付けることができるように、高濃度で最も安定な製剤はｈＲ３ｓｏｌ８２であり、一方、最も安定性が低い製剤はｈＲ３ｓｏｌ９０である。この結果は、低濃度で得られた結果と一致する。１０日間のストレスで、ｈＲ３ｓｏｌ８０変形例は黄色のゲルを形成し、一方、ｈＲ３ｓｏｌ８２変形例は４３．９％のモノマー純度で溶液状態で継続する。１５日目に行われたサンプリングでは、ｈＲ３ｓｏｌ８２変形例も黄色のゲルを形成する。以前の結果は、組成物中にＬ－メチオニンを有するｈＲ３ｓｏｌ８２製剤が、このアミノ酸を欠く変形例よりも高濃度でより安定であることを実証している。これらの結果は、長期的に最も安定な製剤がｈＲ３ｓｏｌ８０及びｈＲ３ｓｏｌ８２であり、一方、ｈＲ３ｓｏｌ９０製剤が最も安定性が低い製剤であることを示唆している。

【0050】

表８は、ストレス曝露なしの１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の試料中のモノマー及びダイマーの割合を示す。

【表8】

【0051】

表に観察され得るように、ｈＲ３ｓｏｌ８２製剤は、最も高いモノマー割合（９４．１％）を有する製剤及び最も低いダイマー割合（５．２％）を有する製剤であり、これは、この製剤が、安定性を促進する、製剤に含まれる分子間の会合数の減少に向かう傾向を有することを実証している。ｈＲ３ｓｏｌ８０及びｈＲ３ｓｏｌ９０変形例は、それぞれ９３．０％及び９２．０％のモノマー割合を有する。

【0052】

１５０ｍｇ／ｍＬの濃度のｈＲ３ ｍＡｂ製剤の生物学的活性も、５０℃でストレスに供する前にフローサイトメトリーによって、及び細胞増殖アッセイの阻害によって決定した。両方の決定を行うために、例３に記載されたものと同じ方法を使用した。

【0053】

例５ Ｂａｌｂ／ｃマウスに異なる用量レベルでＳＣ経路によって投与されたニモツズマブｍＡｂのバイオアベイラビリティ。
同じＡｂ及び投与経路が使用され、製剤成分の変化がＡｂの薬物動態挙動に有意に影響しないことを考慮して、ｈＲ３ｓｏｌ９０変形例を用いてバイオアベイラビリティ研究を行った。このアッセイを行うために、約２０ｇの体重の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。動物を、ＳＣによってｈＲ３ｓｏｌ９０製剤の４つの異なる用量レベル（２５、５０、１００及び２００ｍｇ／ｋｇ体重）を受けた４つの群に分けた。その投与前に、ｍＡｂを同位体ヨウ素１２５（^１２５Ｉ）で標識した。次いで、各個々のマウスの血液を抽出し、血液中のＡｂ濃度に比例する放射能を測定した。表９は、２５ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量と比較して異なる用量レベルで得られたバイオアベイラビリティ値を示す。バイオアベイラビリティ（Ｆ）の計算には以下の式を使用する：
Ｆ＝（ＳＣ－ＡＵＣ／ＩＶ－ＡＵＣ）＊（ＩＶｄ／ＳＣｄ）、式中、
ＳＣ－ＡＵＣは、ＳＣ経路のＡＵＣ（曲線下面積）、
ＩＶ－ＡＵＣは、ＩＶ経路のＡＵＣ（曲線下面積）、
ＩＶｄは、ＩＶ用量、
ＳＣｄは、ＳＣ用量を表す。
ＩＶ経路の場合、親薬物の１００％が全身循環に入るので、バイオアベイラビリティは１である。

【表9】

【0054】

表９の結果は、全ての場合において、バイオアベイラビリティがこの種類の投与経路に許容される７５％を超えたことを示している。用量が増加するにつれてバイオアベイラビリティが実際には増加しないとしても、ｍＡｂの総質量及びＡＵＣ（曲線下面積）は増加することに留意すべきである。これらの結果をヒトに外挿すると、例えば、１００ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量の場合、これは、バイオアベイラビリティが７８．７％であっても、血流に到達するであろうｍＡｂの総質量が６３０ｍｇであり、診療所で使用される用量（２００ｍｇ）の３倍を超えることを意味する。

【0055】

例６．無胸腺Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでＩＶ及びＳＣ経路によって投与されたニモツズマブｍＡｂの抗腫瘍効果。
体重約２０ｇの雌の無胸腺Ｂａｌｂ／ｃマウスを各５匹の動物の３つの群に分けた。全ての群が２×１０６個のＡ４３１細胞を０日目ならびに１０、１２、１４及び１６日目に受け、群１には１ｍｇの総ｈＲ３ｓｏｌ９０製剤質量をＳＣ経路で投与し、群２は１ｍｇの総ニモツズマブｍＡｂ質量をＩＶ経路で受け、対照群である群３はリン酸緩衝生理食塩水を受けた。

【0056】

図７は、ＳＣ経路及びＩＶ経路によってニモツズマブを投与されたマウスにおける腫瘍体積が類似していたことを示す。これは、各経路の吸収速度及び薬物動態特性が異なるという事実にもかかわらず、これらの２つの経路を使用した場合に治療の有効性に差がなかったことを実証している。一方、対照群ははるかに高い腫瘍成長速度を有し、これは他の２つの群の成長速度とはさらに有意に異なっていた。これは、ＳＣ経路によるニモツズマブｍＡｂの投与の有効性を実証する。

【0057】

例７．１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の凍結乾燥ニモツズマブｍＡｂの純度。
ｈＲ３ｓｏｌ８０、ｈＲ３ｓｏｌ８２及びｈＲ３ｓｏｌ９０製剤を１５０ｍｇ／ｍＬの濃度及び５００μＬの体積で凍結乾燥した。このために、－３０℃の温度の実験室凍結乾燥機を使用し、乾燥粉末が得られるまで３０時間真空にした。次いで、初期濃度に達するまで製剤を５００μｌの超純水中で再構成し、透明な、粒子を含まない溶液を得た。

【0058】

表１０は、凍結乾燥し、続いて再構成した後の異なるニモツズマブｍＡｂ製剤から得られた純度データを示す。

【表10】

【0059】

観察され得るように、凍結乾燥及び再構成された後のｈＲ３ｓｏｌ８２製剤は、９８％を超えるモノマー純度に達し、一方、ｈＲ３ｓｏｌ８０変形例は約９４％のモノマー純度、ｈＲ３ｓｏｌ９０変形例は９３％を超えるモノマー純度に達した。ダイマーの割合は製剤の種類に応じて変化することにも留意すべきである。さらに、表は、これらの凍結乾燥及び再構成製剤のモノマー＋ダイマーの純度が全ての場合で９９％超であったことを示しており、これは、ニモツズマブｍＡｂが凍結乾燥工程中にストレスを受けてもその安定性を失わないことを示している。ニモツズマブｍＡｂは、このｍＡｂの特徴に起因してモノマーとダイマーとの間にバランスを有し、このバランスは、溶液中で生じる相互作用の種類に応じて変化し得ることに留意されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】