▶ ディザル（ジァンスー）ファーマシューティカル・カンパニー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-08
(54)【発明の名称】新規抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230301BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230301BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230301BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230301BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230301BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230301BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230301BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230301BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230301BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230301BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230301BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20230301BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230301BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20230301BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20230301BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230301BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230301BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61P35/00
A61K47/68
A61K38/07
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K39/395 P
A61K39/395 D
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K49/00
A61K51/10 200
A61K45/00
G01N33/574 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022539173
(86)(22)【出願日】2020-12-23
(85)【翻訳文提出日】2022-08-22
(86)【国際出願番号】 CN2020138580
(87)【国際公開番号】W WO2021129655
(87)【国際公開日】2021-07-01
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/127902
(32)【優先日】2019-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518099859
【氏名又は名称】ディザル（ジァンスー）ファーマシューティカル・カンパニー・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(72)【発明者】
【氏名】ワン，メイ
(72)【発明者】
【氏名】グオ，チウリ
(72)【発明者】
【氏名】バイ，ユー
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，チェンファン
(72)【発明者】
【氏名】チャン，シャオリン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB22
4C076BB25
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA17
4C084BA01
4C084BA10
4C084BA14
4C084BA23
4C084BA41
4C084BA42
4C084DA27
4C084MA52
4C084MA57
4C084MA59
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB212
4C084ZB261
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA15
4C085AA16
4C085AA26
4C085BB22
4C085BB31
4C085BB36
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC02
4C085CC05
4C085CC31
4C085DD62
4C085DD63
4C085DD88
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG08
4C085GG10
4C085HH03
4C085KA03
4C085KA26
4C085KA29
4C085KB82
4C085LL18
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA71
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体またはその抗原結合断片、それをコードする単離されたポリヌクレオチド、それを含む医薬組成物、およびその使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される１個、２個もしくは３個の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに／または配列番号２、配列番号４および配列番号６からなる群から選択される１個、２個もしくは３個の軽鎖ＣＤＲ配列を含む単離された抗体であって、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂの両方に特異的に結合することが可能である、抗体。
【請求項2】
ＦＧＦＲ２ｃに対して検出可能な結合親和性を有さない、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
配列番号５の重鎖ＣＤＲ３、および／または配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／もしくは配列番号２、配列番号４および配列番号６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはｂ）配列番号１、配列番号７、および配列番号５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／もしくは配列番号２、配列番号４および配列番号６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項5】
配列番号８、配列番号１２、もしくは配列番号１６を含む重鎖可変領域または配列番号８、配列番号１２、もしくは配列番号１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む、請求項１～４のいずれかに記載の抗体。
【請求項6】
配列番号１０もしくは配列番号１４を含む軽鎖可変領域または配列番号１０もしくは配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む、請求項１～５のいずれかに記載の抗体。
【請求項7】
ａ）配列番号８を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域、ｂ）配列番号１２を含む重鎖可変領域および配列番号１４を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号１６を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１～６のいずれかに記載の抗体。
【請求項8】
ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに対して特異的な結合親和性を依然として保持する１つまたは複数のアミノ酸残基置換または修飾をさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載の抗体。
【請求項9】
置換または修飾の少なくとも１つが、ＣＤＲ配列の１つもしくは複数に、および／またはＶＨもしくはＶＬ配列の１つもしくは複数に存在するか、またはＶＨもしくはＶＬ配列の１つもしくは複数に存在するが、ＣＤＲ配列のいずれかの外側に存在する、請求項８に記載の抗体。
【請求項10】
免疫グロブリン定常領域、任意選択でヒト免疫グロブリンの定常領域、または任意選択でヒトＩｇＧの定常領域をさらに含む、請求項１～９のいずれかに記載の抗体。
【請求項11】
定常領域が、ａ）グリコシル化部位を導入もしくは除去する、
ｂ）遊離システイン残基を導入する、
ｃ）活性化Ｆｃ受容体への結合を増強する、および／または
ｄ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強する
１つまたは複数の修飾を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項12】
糖鎖操作されている、請求項１１に記載の抗体。
【請求項13】
糖鎖操作された抗体が、その操作されていない対応物よりも増強されたＡＤＣＣ活性を示す、請求項１２に記載の抗体。
【請求項14】
脱フコシル化されている、請求項１３に記載の抗体。
【請求項15】
Ａｓｎ２９７にてフコースを欠如している、請求項１４に記載の抗体。
【請求項16】
増強されたＡＤＣＣが、ＦＧＦＲ２ｂ発現細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、または７５％より高い溶解を特徴とする、請求項１５に記載の抗体。
【請求項17】
キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１～１６のいずれかに記載の抗体。
【請求項18】
ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓダイアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体である、請求項１～１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項19】
ヒトＦＧＦＲ２ｂに、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合に１×１０－９Ｍ以下のＫＤ値で特異的に結合することが可能である、請求項１～１８のいずれかに記載の抗体。
【請求項20】
ヒトＦＧＦＲ１ｂに、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合に５×１０－９Ｍ以下のＫＤ値で特異的に結合することが可能である、請求項１～１９のいずれかに記載の抗体。
【請求項21】
細胞表面上に発現されたヒトＦＧＦＲ２ｂに、フローサイトメトリーによって測定される場合に１０ｎＭ以下のＥＣ５０で特異的に結合することが可能である、請求項１～２０のいずれかに記載の抗体。
【請求項22】
ヒトＦＧＦＲ２ｂ、カニクイザルＦＧＦＲ２ｂ、ラットＦＧＦＲ２ｂ、およびマウスＦＧＦＲ２ｂに特異的に結合することが可能である、請求項１～２１のいずれかに記載の抗体。
【請求項23】
細胞表面上に発現されたヒトＦＧＦＲ２ｂに特異的に結合し、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム比色アッセイによって測定される場合に１５ｎＭ以下の５０％成長阻害濃度（ＧＩ５０）で前記細胞の増殖を阻害することが可能である、請求項１～２２のいずれかに記載の抗体。
【請求項24】
１つまたは複数のコンジュゲート部分に連結されている、請求項１～２３のいずれかに記載の抗体。
【請求項25】
コンジュゲート部分が、治療剤、放射性同位体、検出可能な標識、薬物動態修飾部分、または精製部分を含む、請求項２４に記載の抗体。
【請求項26】
治療剤が、細胞傷害剤を含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項27】
コンジュゲート部分が、直接的に、またはリンカーを介して共有結合されている、請求項２５または２６に記載の抗体。
【請求項28】
リンカーが、ヒドラジンリンカー、ジスルフィドリンカー、二官能性リンカー、ジペプチドリンカー、グルクロニドリンカー、チオエーテルリンカーであり、任意選択で、リンカーが、リソソームで切断可能なジペプチド、例えば、バリン－シトルリン（ｖｃ）である、請求項２７に記載の抗体。
【請求項29】
コンジュゲート部分が、表面に露出されたアミノ酸残基の特定のタイプにランダムに結合され、任意選択で、特定の残基が、システイン残基、またはリジン残基である、請求項２４～２８のいずれかに記載の抗体。
【請求項30】
コンジュゲート部分が、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、短鎖ペプチドタグ、またはＡｓｎ２９７グリカンを介して、抗体分子における明確に規定された部位に結合される、請求項２４～２９のいずれかに記載の抗体。
【請求項31】
ＦＧＦＲ２ｂへのおよび／またはＦＧＦＲ１ｂへの結合に関して、請求項１～３０のいずれかに記載の抗体と競合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項32】
請求項１～３１のいずれかに記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項33】
配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項34】
相同配列が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１７によってコードされるのと同じタンパク質をコードする、請求項３３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項35】
請求項３２～３４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項36】
請求項３５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項37】
糖鎖操作された抗体または抗原結合断片を産生することが可能である、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項38】
機能性アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の欠如、異種β１，４－ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）の過剰発現、原核生物ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼの発現、または機能性ＧＤＰ－フコーストランスポーター（ＧＦＴ）の欠如を特徴とする、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項39】
請求項１～３１のいずれかに記載の抗体を産生する方法であって、請求項３６～３８のいずれかに記載の宿主細胞を、請求項３５に記載の発現ベクターが発現される条件下で培養する工程を含む、方法。
【請求項40】
宿主細胞によって産生された抗体を精製する工程をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
請求項１～３１のいずれかに記載の抗体、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項42】
対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を処置する方法であって、治療有効量の請求項１～３１のいずれかに記載の抗体、または請求項４１に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項43】
疾患または状態が癌であり、任意選択で、癌が、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂを発現または過剰発現することを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
癌が、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌、腎細胞癌、頭頸部癌、中皮腫、黒色腫、肉腫、および脳腫瘍である、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
投与が、経口、経鼻、静脈内、皮下、舌下、または筋内投与を介する、請求項４２～４４のいずれかに記載の方法。
【請求項46】
対象がヒトである、請求項４２～４５のいずれかに記載の方法。
【請求項47】
試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を検出する方法であって、試料を請求項１～３１のいずれかに記載の抗体と接触させる工程と、試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程とを含む、方法。
【請求項48】
対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を診断する方法であって、ａ）対象から得られる試料を、請求項１～３１のいずれかに記載の抗体と接触させる工程と、
ｂ）試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程と、
ｃ）ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を、対象におけるＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態の実在または状況と相関させる工程と
を含む、方法。
【請求項49】
対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を予後判定する方法であって、ａ）対象から得られる試料を、請求項１～３１のいずれかに記載の抗体と接触させる工程と、
ｂ）試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程と、
ｃ）ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を、対象の、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂアンタゴニストに対する潜在的応答性と相関させる工程と
を含む、方法。
【請求項50】
処置を必要とする対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を処置するための薬剤の製造における、請求項１～３１のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項51】
ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を検出するための診断試薬の製造における、請求項１～３１のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項52】
請求項１～３１のいずれかに記載の抗体を含む、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂを検出するためのキット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[0001]本開示は一般に、新規抗ヒトＦＧＦＲ２ｂ抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
[0002]線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）は、４つの構造的に関連した遺伝子（ＦＧＦＲ１～ＦＧＦＲ４）によってコードされる膜貫通チロシンキナーゼである。ＦＧＦＲは、それらのｍＲＮＡの多重選択的スプライシングを特徴とし、様々なアイソフォームをもたらす（Ｏｒｎｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５２９２頁、１９９６年；またヒトＦＧＦＲ２およびそのアイソフォームの配列に関するＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ２１８０２およびアイソフォームＰ２１８０２－１～Ｐ２１８０２－２３；ヒトＦＧＦＲ１およびそのアイソフォームの配列に関するＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１１３６２およびアイソフォームＰ１１３６２－１～Ｐ１１３６２－２１も参照）。ＦＧＦＲは、種々のＩｇ様ドメイン（αアイソフォームは、３つ全てのＩｇ様ドメインＤ１、Ｄ２、およびＤ３を含有し、βアイソフォームは、２つのＩｇ様ドメインＤ２およびＤ３ドメインのみを含有するが、Ｄ１を有さない）、膜貫通ドメイン、および細胞内チロシンキナーゼ触媒ドメインで構成される細胞外リガンド結合セクションからなる共通の構造的特徴を有する。ＦＧＦは、主に受容体のＤ２およびＤ３における領域を通じて受容体に結合する。ＦＧＦＲ１～ＦＧＦＲ３において、全ての形態が、Ｄ３の最初の半分を含有し、Ｄ３の最初の半分のみを含有するアイソフォームは、ＩＩＩａ形態と表示される一方で、２つの選択的エクソンは、Ｄ３の第２の半分に利用することができ、ＩＩＩｂ形態およびＩＩＩｃ形態を生じる。例えば、ＦＧＦＲ－１では、第３のＩｇ様ドメインをコードするエクソンの選択的スプライシングは、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ（またはまさにＦＧＦＲ１ｂおよびＦＧＦＲ１ｃ）スプライス形態を産生し、これが、別個のリガンド結合優先度を有する。ＦＧＦＲ２に関して、これらの形態は、それぞれＦＧＦＲ２ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ（またはまさにＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ２ｃ）と表示される。ＦＧＦＲ２ｂは、上皮起源の細胞においてのみ産生され、ＦＧＦＲ２ｃは、間葉細胞においてのみ産生される。ＦＧＦＲ２のＦＧＦＲ２ｂ形態は、ＦＧＦ１に関する高親和性受容体であり、ＫＧＦファミリーメンバー（例えば、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２２、および特にＦＧＦ７）に関して特異的な受容体であるのに対して、ＦＧＦＲ２ｃは、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２の両方に良好に結合するが、ＫＧＦファミリーメンバーを結合しない（Ｍｉｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２４６頁、１９９２年）。
【0003】
[0003]ＦＧＦＲへの結合時のＦＧＦは、特に胚発生中に、増殖、遊走および分化を含む各種細胞型において様々な応答を媒介し（Ｏｒｎｉｔｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５２９２頁、１９９６年）、成体では、組織恒常性および修復に関与している。ＫＧＦ（ＦＧＦ７）およびＫＧＦＲ（ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ）は、膵癌、胃癌、卵巣癌および乳癌等の様々なタイプの癌に関与すると見出されている。ＦＧＦ７およびＦＧＦＲ２ｂは、膵癌において過剰発現され（Ｉｓｈｉｗａｔａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３：２１３頁、１９９８年）、それらの同時発現は、乏しい予後と相関する（Ｃｈｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：１９６４頁、２００７年）。ＦＧＦＲ２の増幅および過剰発現は、特に乏しい予後を有する未分化のびまん型の胃癌と強力に関連付けられ、小分子化合物によるＦＧＦＲ２活性の阻害は、かかる癌細胞の増殖を強力に阻害した（Ｋｕｎｉｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：２３４０頁、２００８年；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３１：１５３０頁、２００６年）。ＦＧＦＲ２ｂリガンドＦＧＦ１、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０は、ＥＯＣ細胞系において、増殖、運動性および細胞死からの防御を誘導し（Ｓｔｅｅｌｅら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２４：４５頁、２００６年）、ＦＧＦＲ２ｂが、卵巣癌において悪性表現型に寄与し得ることを示唆した。ＦＧＦＲ２ｂは、乳癌の約５％で高度に発現され（ＦｉｎｃｈおよびＲｕｂｉｎ ２００６年）、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋを介してシグナル伝達カスケードを媒介する（Ｍｏｆｆａ、Ｔａｎｎｈｅｉｍｅｒら ２００４年）。頻発する活性化ＦＧＦＲ２突然変異（例えば、Ｓ２５２Ｗ）はまた、各種癌と関連付けられることが発見されている。
【0004】
[0004]ＦＧＦＲ１の増幅または活性化は、口腔扁平上皮癌（Ｆｒｅｉｅｒら、Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．４３（１）：６０～６頁、２００７年）、乳癌（Ｔｕｒｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１；７０（５）：２０８５～９４頁、２０１０年）、食道扁平上皮癌（Ｉｓｈｉｚｕｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．９；２９６（１）：１５２～５頁、２００２年）、卵巣癌（Ｇｏｒｒｉｎｇｅら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５；１３（１６）：４７３１～９頁、２００７年）、膀胱癌（Ｓｉｍｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１；６１（１１）：４５１４～９頁、２００１年）、前立腺癌（Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１；９（１４）：５２７１～８１頁 ２００３年）、および主に扁平上皮亜型の肺癌（Ｄｕｔｔら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．６ （６）：ｅ２０３５１頁、２０１１年；Ｗｅｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ．６；４５０（７１７１）：８９３～８頁、２００７；Ｗｅｉｓｓら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．１５；２（６２）：６２ｒａ９３、２０１０年）を含む多く癌において報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
[0005]新規抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体が非常に必要とされる。特に、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂの両方に結合することが可能である抗体は報告されていないと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
[0004]本開示全体にわたって、冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、冠詞の文法的対象の１つまたは１つよりも多い対象（即ち、少なくとも１つ）を指すのに本明細書で使用される。例として、「抗体」は、１つの抗体または１つよりも多い抗体を意味する。
【0007】
[0005]本開示は、新規モノクローナル抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体、それらのアミノ酸およびヌクレオチド配列、ならびにそれらの使用を提供する。
[0006]１つの態様では、本開示は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される１個、２個もしくは３個の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに／または配列番号２、配列番号４および配列番号６からなる群から選択される１個、２個もしくは３個の軽鎖ＣＤＲ配列を含む単離された抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体であって、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂの両方に特異的に結合することが可能である、抗体を提供する。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ＦＧＦＲ２ｃに対して検出可能な結合親和性を有さない。
[0006]１つの態様では、本開示は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される１個、２個もしくは３個の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに／または配列番号２、配列番号４および配列番号６からなる群から選択される１個、２個もしくは３個の軽鎖ＣＤＲ配列を含む単離された抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体であって、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂの両方に特異的に結合することが可能である、抗体を提供する。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ＦＧＦＲ２ｃに対して検出可能な結合親和性を有さない。
【0008】
[0007]一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号５の重鎖ＣＤＲ３、および／または配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される１個、２個もしくは３個の重鎖ＣＤＲ配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号２、配列番号４および配列番号６からなる群から選択される１個、２個もしくは３個の軽鎖ＣＤＲ配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号１、配列番号３、および配列番号５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号２、配列番号４および配列番号６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号１、配列番号７、および配列番号５を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または配列番号２、配列番号４および配列番号６を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【0009】
[0008]一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号８、配列番号１２、もしくは配列番号１６を含む重鎖可変領域または配列番号８、配列番号１２、もしくは配列番号１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号１０もしくは配列番号１４を含む軽鎖可変領域または配列番号１０もしくは配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号８を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号１２を含む重鎖可変領域および配列番号１４を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、配列番号１６を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む。
【0010】
[0009]一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに対して特異的な結合親和性を依然として保持する１つまたは複数のアミノ酸残基置換または修飾をさらに含む。一部の実施形態において、置換または修飾の少なくとも１つが、ＣＤＲ配列の１つもしくは複数に、および／またはＶＨもしくはＶＬ配列の１つもしくは複数に存在するか、またはＶＨもしくはＶＬ配列の１つもしくは複数に存在するが、ＣＤＲ配列のいずれかの外側に存在する。
【0011】
[00010]一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、免疫グロブリン定常領域、任意選択でヒト免疫グロブリンの定常領域、好ましくはヒトＩｇＧの定常領域、より好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域をさらに含む。
【0012】
[00011]一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、その定常領域内に、ａ）グリコシル化部位を導入もしくは除去する、ｂ）遊離システイン残基を導入する、
ｃ）活性化Ｆｃ受容体への結合を増強する、および／またはｄ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強する１つまたは複数の修飾をさらに含む。
ｃ）活性化Ｆｃ受容体への結合を増強する、および／またはｄ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強する１つまたは複数の修飾をさらに含む。
【0013】
[00012]一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、糖鎖操作されている（ｇｌｙｃｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、脱フコシル化されている（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）。一部の実施形態において、本明細書に提供される脱フコシル化された抗体は、Ａｓｎ２９７にてフコースを欠如している。一部の実施形態において、糖鎖操作された抗体は、その操作されていない対応物よりも増強されたＡＤＣＣ活性を示す。一部の実施形態において、増強されたＡＤＣＣは、ＦＧＦＲ２ｂ発現細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、または７５％より高い溶解を特徴とする。
【0014】
[00013]一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。一部の他の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト化抗体である。
[00014]一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、１つまたは複数のコンジュゲート部分に連結されている。ある特定の実施形態において、コンジュゲート部分は、治療剤、放射性同位体、検出可能な標識、薬物動態修飾部分、または精製部分を含む。一部の実施形態において、コンジュゲート部分は、直接的に、またはリンカーを介して共有結合されている。
[00014]一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、１つまたは複数のコンジュゲート部分に連結されている。ある特定の実施形態において、コンジュゲート部分は、治療剤、放射性同位体、検出可能な標識、薬物動態修飾部分、または精製部分を含む。一部の実施形態において、コンジュゲート部分は、直接的に、またはリンカーを介して共有結合されている。
【0015】
[00015]別の態様において、本開示は、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに対する結合に関して、上述の抗体と競合する単離された抗体またはそれらの抗原結合断片をさらに提供する。
【0016】
[00016]一態様において、本開示は、本明細書で提供される抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１７、および配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、相同配列は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１７によってコードされるのと同じタンパク質をコードする。
【0017】
[00017]別の態様において、本開示は、本明細書で提供される単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
[00018]さらに別の態様において、本開示は、本開示の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
[00018]さらに別の態様において、本開示は、本開示の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0018】
[00019]さらに別の態様において、本開示は、本明細書で提供される抗体を産生する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、本開示の宿主細胞を、本開示の発現ベクターが発現される条件下で培養する工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、宿主細胞によって産生された抗体を精製する工程をさらに含む。
【0019】
[00020]さらに別の態様において、本開示は、本明細書で提供される抗体、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
[00021]別の態様において、本開示は、対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を処置する方法であって、治療有効量の本開示の抗体または医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
[00021]別の態様において、本開示は、対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を処置する方法であって、治療有効量の本開示の抗体または医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
【0020】
[00022]一部の実施形態において、疾患または状態は癌であり、任意選択で、癌は、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂを発現または過剰発現することを特徴とする。
[00023]一部の実施形態において、投与は、経口、経鼻、静脈内、皮下、舌下、または筋内投与を介する。一部の実施形態において、対象はヒトである。
[00023]一部の実施形態において、投与は、経口、経鼻、静脈内、皮下、舌下、または筋内投与を介する。一部の実施形態において、対象はヒトである。
【0021】
[00024]別の態様において、本開示は、試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を検出する方法であって、試料を本開示の抗体と接触させる工程と、試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程とを含む、方法を提供する。
【0022】
[00025]別の態様において、本開示は、対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を診断する方法であって、ａ）対象から得られる試料を、本開示の抗体と接触させる工程と、ｂ）試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程と、ｃ）ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を、対象におけるＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態の実在または状況と相関させる工程とを含む、方法を提供する。
【0023】
[00026]別の態様において、本開示は、対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を予後判定する（ｐｒｏｇｎｏｓｉｎｇ）方法であって、
ａ）対象から得られる試料を、本開示の抗体と接触させる工程と、ｂ）試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程と、ｃ）ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を、対象の、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂアンタゴニストに対する潜在的応答性と相関させる工程を含む、方法を提供する。
ａ）対象から得られる試料を、本開示の抗体と接触させる工程と、ｂ）試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程と、ｃ）ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を、対象の、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂアンタゴニストに対する潜在的応答性と相関させる工程を含む、方法を提供する。
【0024】
[00027]別の態様において、本開示は、対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ発現の調節から利益を受ける疾患または状態を処置するための薬剤の製造における、本開示の抗体の使用を提供する。
【0025】
[00028]別の態様において、本開示は、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を検出するための診断試薬の製造における、本開示の抗体の使用を提供する。
【0026】
[00029]さらに別の態様において、本開示は、本開示の抗体を含む、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂを検出するためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】[00030]ＣＤＲに下線を付した、全Ａｂ ｈｕ２１－２６（図中では「ｈｕ２１－２６」と表示される）の軽鎖（Ａ）および重鎖（Ｂ）のアミノ酸配列。
【図2】[00031]参照比較用の対照抗体としてＥＰＡ１４４を用いた、ヒトＦＧＦＲ２ｂまたはヒトＦＧＦＲ１ｂに対するＡｂ ２１ｃ、Ａｂ ｈｕ２１－２１、およびａｆｈｕ２１－２６（それぞれ、図中では「２１ｃ」、「ｈｕ２１－２１」および「ａｆｈｕ２１－２６」と表示される）のＢｉａｃｏｒｅ結合Ｋａ、Ｋｏｆｆ、および親和性ＫＤ。
【図3】[00032]ＫＡＴＯＩＩＩ細胞でのキメラＡｂ ２１ｃの、ＦＧＦＲ２ｂへの用量依存的結合のフローサイトメトリー。
【図4】[00033]Ａｂ ２１ｃの、ヒト、カニクイザル、およびラット／マウスＦＧＦＲ２ｂへの種間結合。
【図5】[00034]ヒトＦＧＦＲの各種ファミリーメンバーに対するマウスＡｂ ２１（図中では「２１」と表示される）の結合選択性。
【図6】[00035]陰性対照としてアイソタイプヒトＩｇＧ１を用いた、Ａｂ ２１ｃによるヒトＦＧＦＲ２ｂで安定にトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞のＦＧＦ７誘導性細胞増殖の阻害。
【図7】[00036]Ａｂ ２１ｃによるＦＧＦＲ２ｂリン酸化およびその下流の標的ＥＲＫリン酸化の用量依存的ダウンレギュレーション。
【図8】[00037]３７℃で２時間および４時間のＫＡＴＯＩＩＩ細胞とのインキュベーション後のマウスＡｂ ２１の細胞内分布の共焦点画像によって示される抗体内部移行。４℃で２時間および４時間のＫＡＴＯＩＩＩ細胞とのインキュベーション後のマウスＡｂ ２１の細胞内分布の共焦点画像を陰性ベースライン対照として使用した。
【図9】[00038]脱フコシル化されたＡｂ ｈｕ２１－２６（図中では「ａｆｈｕ２１－２６」と表示される）およびフコシル化された抗体Ａｂ ２１ｃの、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞に対するＡＤＣＣ活性。
【図10】[00039]ＳＮＵ１６胃癌異種移植片モデル（Ａ）およびＬＣ０３８患者由来異種移植片肺癌モデル（Ｂ）における週に２度１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与したＡｂ ａｆｈｕ２１－２６のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性。ＥＰＡ１４４を比較として使用した。
【図11】[00040]ＨＩＣ－ＨＰＬＣを使用した、コンジュゲートされていないａｆｈｕ２１－２６（下部曲線）およびＡＤＣコンジュゲートａｆｈｕ２１－２６－ＭＭＡＥ（上部曲線）の薬物－抗体比分析。
【図12】[00041]（Ａ）ＬＣ０３８患者由来異種移植片肺癌モデルにおけるａｆｈｕ２１－２６－ＭＭＡＥの、および（Ｂ）ＳＮＵ１６胃癌異種移植片モデルにおけるＡｂ ２１ｃ－ＭＭＡＥ、Ａｂ ２１ｃ－ＭＭＡＦのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性。動物は、毎週静脈内投与された。
【発明を実施するための形態】
【0028】
[00042]本開示の下記の説明は、単に本開示の各種実施形態を説明することを意図されるに過ぎない。したがって、論述される特定の修飾は、本開示の範囲に対する限定と解釈されるべきではない。本開示の範囲を逸脱することなく、様々な等価体、変更、および修正がなされ得ることは当業者に明らかであり、かかる等価な実施形態は本明細書に包含されるべきであることが理解されよう。刊行物、特許および特許出願を含む本明細書で引用される参考文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0029】
[00043]定義
[00044]「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、二価抗体、一価抗体、多特異性抗体、二特異性抗体ならびに特異的な抗原に結合するそれらの抗原結合断片を包含する。天然のインタクトな抗体は、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。哺乳動物重鎖は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューとして分類され、重鎖はそれぞれ、可変領域（ＶＨ）ならびに第１、第２、および第３の定常領域（それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）からなり、哺乳動物軽鎖は、λまたはκとして分類される一方で、軽鎖はそれぞれ、可変領域（ＶＬ）および定常領域からなる。抗体は、「Ｙ」形状を有し、Ｙの基部は、ジスルフィド結合を介して一緒に結合された２つの重鎖の第２および第３の定常領域からなる。Ｙの各アームは、単一軽鎖の可変領域および定常領域に結合された単一重鎖の可変領域および第１の定常領域を包含する。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与している。両鎖における可変領域は概して、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度可変ループを含有する。本明細書に開示される抗体に関するＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの慣例によって規定または同定され得る（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ、Ｂ．、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７３（４）、９２７頁（１９９７年）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２月５日；１８６（３）：６５１～６３頁（１９８５年）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．１２月２１日～２８日；３４２（６２５２）：８７７～８３頁（１９８９年）；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１年）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２７：５５～７７頁（２００３年）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１（３）、（２００５年）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ（第２版）；ｃｈａｐｔｅｒ ２６、４８１～５１４頁（２０１５年））。３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として既知のフランキングストレッチ間に挿入されており、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲよりも高度に保存されており、高頻度可変ループを支持するようにスキャフォールドを形成する。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与されないが、各種エフェクター機能を示す。抗体は、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、クラスに割り当てられる。抗体の５つの主要なクラスまたはアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、それらは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミュー重鎖の存在を特徴とする。主要抗体クラスの幾つかは、ＩｇＧ１（ガンマ１重鎖）、ＩｇＧ２（ガンマ２重鎖）、ＩｇＧ３（ガンマ３重鎖）、ＩｇＧ４（ガンマ４重鎖）、ＩｇＡ１（アルファ１重鎖）、またはＩｇＡ２（アルファ２重鎖）等のサブクラスに分類される。
[00044]「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、二価抗体、一価抗体、多特異性抗体、二特異性抗体ならびに特異的な抗原に結合するそれらの抗原結合断片を包含する。天然のインタクトな抗体は、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。哺乳動物重鎖は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューとして分類され、重鎖はそれぞれ、可変領域（ＶＨ）ならびに第１、第２、および第３の定常領域（それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）からなり、哺乳動物軽鎖は、λまたはκとして分類される一方で、軽鎖はそれぞれ、可変領域（ＶＬ）および定常領域からなる。抗体は、「Ｙ」形状を有し、Ｙの基部は、ジスルフィド結合を介して一緒に結合された２つの重鎖の第２および第３の定常領域からなる。Ｙの各アームは、単一軽鎖の可変領域および定常領域に結合された単一重鎖の可変領域および第１の定常領域を包含する。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与している。両鎖における可変領域は概して、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度可変ループを含有する。本明細書に開示される抗体に関するＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの慣例によって規定または同定され得る（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ、Ｂ．、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７３（４）、９２７頁（１９９７年）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２月５日；１８６（３）：６５１～６３頁（１９８５年）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．１２月２１日～２８日；３４２（６２５２）：８７７～８３頁（１９８９年）；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１年）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２７：５５～７７頁（２００３年）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１（３）、（２００５年）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ（第２版）；ｃｈａｐｔｅｒ ２６、４８１～５１４頁（２０１５年））。３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として既知のフランキングストレッチ間に挿入されており、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲよりも高度に保存されており、高頻度可変ループを支持するようにスキャフォールドを形成する。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与されないが、各種エフェクター機能を示す。抗体は、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、クラスに割り当てられる。抗体の５つの主要なクラスまたはアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、それらは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミュー重鎖の存在を特徴とする。主要抗体クラスの幾つかは、ＩｇＧ１（ガンマ１重鎖）、ＩｇＧ２（ガンマ２重鎖）、ＩｇＧ３（ガンマ３重鎖）、ＩｇＧ４（ガンマ４重鎖）、ＩｇＡ１（アルファ１重鎖）、またはＩｇＡ２（アルファ２重鎖）等のサブクラスに分類される。
【0030】
[00045]「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数のＣＤＲを含むインタクトな抗体の一部から形成される抗体断片、または抗原に結合し得るが、インタクトな天然の抗体構造を含まない任意の他の抗体断片を指す。抗原結合断片の例として、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィドで安定化されたＦｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィドで安定化されたダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆｖ－Ｆｃ抗体（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、二特異性抗体、多特異性抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体が挙げられるが、限定されない。抗原結合断片は、親抗体が結合する同じ抗原に結合することが可能である。
【0031】
[00046]抗体に関する「Ｆａｂ」は、ジスルフィド結合によって単一重鎖の可変領域および第１の定常領域に結合された単一軽鎖（可変領域および定常領域の両方）からなる抗体の当該部分を指す。
【0032】
[00047]「Ｆａｂ」は、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂ断片を指す。
[00048]「Ｆ（ａｂ’）２」は、Ｆａｂ’の二量体を指す。抗体に関する「Ｆｖ」は、完全抗原結合部位を保有する抗体の最小断片を指す。Ｆｖ断片は、単一重鎖の可変領域に結合された単一軽鎖の可変領域からなる。
[00048]「Ｆ（ａｂ’）２」は、Ｆａｂ’の二量体を指す。抗体に関する「Ｆｖ」は、完全抗原結合部位を保有する抗体の最小断片を指す。Ｆｖ断片は、単一重鎖の可変領域に結合された単一軽鎖の可変領域からなる。
【0033】
[00049]「ｄｓＦｖ」は、単一軽鎖の可変領域と、単一重鎖の可変領域との間の結合がジスルフィド結合であるジスルフィドで安定化されたＦｖ断片を指す。一部の実施形態において、「（ｄｓＦｖ）２」または「（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）」は、３つのペプチド鎖：ジスルフィド結合を介して、それぞれ、ペプチドリンカー（例えば、長い可撓性リンカー）によって連結され、また２つのＶＬ部分に結合された２つのＶＨ部分を含む。一部の実施形態において、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’は二特異性であり、そこでは、各ジスルフィド対形成重鎖および軽鎖は、異なる抗原特異性を有する。
【0034】
[00050]「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、直接的に、またはペプチドリンカー配列を介して互いに結合された軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる操作された抗体を指す（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５：５８７９頁（１９８８年））。
【0035】
[00051]抗体に関する「Ｆｃ」は、ジスルフィド結合を介して、第２の重鎖の第２および第３の定常領域に結合された第１の重鎖の第２および第３の定常領域からなる抗体の当該部分を指す。抗体のＦｃ部分は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）等の各種エフェクター機能に関与するが、抗原結合において機能しない。
【0036】
[00052]「単鎖Ｆｖ－Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」は、抗体のＦｃ領域に結合されたｓｃＦｖからなる操作された抗体を指す。
[00053]「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、または「ＨＣＡｂ」は、２つのＶＨドメインを含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２月１０日；２３１（１－２）：２５～３８頁（１９９９年）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６月；７４（４）：２７７～３０２頁（２００１年）；国際公開第９４／０４６７８号；国際公開第９４／２５５９１号；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体は、本来ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）（ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマ）に由来する。 ラクダ化抗体は、軽鎖を欠如するが、真正抗原結合レパトアを有する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．６月３日；３６３（６４２８）：４４６～８頁（１９９３年）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら「Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃａｍｅｌｉｄａｅ；ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．４月；５４（１）：３９～４７頁（２００２年）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．５月；１０９（１）：９３～１０１頁（２００３年））。重鎖抗体の可変ドメイン（「ＶＨＨドメイン」）は、適応免疫応答によって生成される最小の既知抗原結合単位を表す（Ｋｏｃｈ－Ｎｏｌｔｅ Ｆ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１１月；２１（１３）：３４９０～８頁．Ｅｐｕｂ ２００７年６月１５日（２００７年））。
[00053]「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、または「ＨＣＡｂ」は、２つのＶＨドメインを含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２月１０日；２３１（１－２）：２５～３８頁（１９９９年）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６月；７４（４）：２７７～３０２頁（２００１年）；国際公開第９４／０４６７８号；国際公開第９４／２５５９１号；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体は、本来ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）（ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマ）に由来する。 ラクダ化抗体は、軽鎖を欠如するが、真正抗原結合レパトアを有する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．６月３日；３６３（６４２８）：４４６～８頁（１９９３年）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら「Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃａｍｅｌｉｄａｅ；ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．４月；５４（１）：３９～４７頁（２００２年）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．５月；１０９（１）：９３～１０１頁（２００３年））。重鎖抗体の可変ドメイン（「ＶＨＨドメイン」）は、適応免疫応答によって生成される最小の既知抗原結合単位を表す（Ｋｏｃｈ－Ｎｏｌｔｅ Ｆ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１１月；２１（１３）：３４９０～８頁．Ｅｐｕｂ ２００７年６月１５日（２００７年））。
【0037】
[00054]「ナノボディ」は、従来のＩｇＧの重鎖抗体由来の１つのＶＨドメイン、および２つの重鎖定常ドメイン、例えばＣＨ２およびＣＨ３からなる抗体断片を指す。
[00055]「ダイアボディ」または「ｄＡｂ」は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を含み、ここで、断片は、同じポリペプチド鎖中でＶＬドメインに結合されたＶＨドメイン（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）を含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．７月１５日；９０（１４）：６４４４～８頁（１９９３年）；欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号を参照）。短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成を不可能にさせるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと対形成せざるを得ず、それにより、２つの抗原結合部位を創出する。抗原結合部位は、同じ抗原または異なる抗原（またはエピトープ）を標的とし得る。ある特定の実施形態において、「二特異性ｄｓダイアボディ」は、２つの異なる抗原（またはエピトープ）を標的とするダイアボディである。
[00055]「ダイアボディ」または「ｄＡｂ」は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を含み、ここで、断片は、同じポリペプチド鎖中でＶＬドメインに結合されたＶＨドメイン（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）を含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．７月１５日；９０（１４）：６４４４～８頁（１９９３年）；欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号を参照）。短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成を不可能にさせるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと対形成せざるを得ず、それにより、２つの抗原結合部位を創出する。抗原結合部位は、同じ抗原または異なる抗原（またはエピトープ）を標的とし得る。ある特定の実施形態において、「二特異性ｄｓダイアボディ」は、２つの異なる抗原（またはエピトープ）を標的とするダイアボディである。
【0038】
[00056]ある特定の実施形態において、「ｓｃＦｖ二量体」は、一方の部分のＶＨが他方の部分のＶＬと調和して、同じ抗原（またはエピトープ）または異なる抗原（またはエピトープ）を標的とし得る２つの結合部位を形成するように別のＶＨ－ＶＬ部分と二量体化されたＶＨ－ＶＬ（ペプチドリンカーによって連結された）を含む二価ダイアボディまたは二価ＳｃＦｖ（ＢｓＦｖ）である。他の実施形態において、「ｓｃＦｖ二量体」は、ＶＨ１およびＶＬ１が調和して、ＶＨ２およびＶＬ２が調和して、調和された対がそれぞれ、異なる抗原特異性を有するようにＶＬ１－ＶＨ２（ペプチドリンカーによって連結された）と結合されたＶＨ１－ＶＬ２（同様にペプチドリンカーによって連結された）を含む二特異性ダイアボディである。
【0039】
[00057]「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する抗体断片を指す。場合によっては、２つまたはそれよりも多いＶＨドメインがペプチドリンカーと共有結合されて、二価または多価ドメイン抗体を創出する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨドメインは、同じ抗原または異なる抗原を標的とし得る。
【0040】
[00058]「キメラ」という用語は、本明細書で使用する場合、１つの種に由来する重および／または軽鎖の一部、および異なる種に由来する重および／または軽鎖の残部を有する抗体または抗原結合断片を意味する。実例では、キメラ抗体は、ヒトに由来される定常領域およびマウス等の非ヒト動物由来の可変領域を含み得る。一部の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、またはハムスターである。
【0041】
[00059]「ヒト化」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体または抗原結合断片が、非ヒト動物に由来するＣＤＲ、ヒトに由来されるＦＲ領域を含み、適用可能である場合、定常領域はヒトに由来されることを意味する。
【0042】
[00060]「二価」という用語は、本明細書で使用する場合、２つの抗原結合部位を有する抗体または抗原結合断片を指し、「一価」という用語は、唯一の抗原結合部位を有する抗体または抗原結合断片を指し、「多価」という用語は、多重抗原結合部位を有する抗体または抗原結合断片を指す。
【0043】
[00061]本明細書で使用する場合、「二特異性」抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体に由来する断片を有し、２つの異なるエピトープに結合することが可能な人工抗体または抗原結合断片を指す。２つのエピトープは、同じ抗原上に存在し得るか、または２つのエピトープは、２つの異なる抗原上に存在し得る。
【0044】
[00062]別記されない限り、「ＦＧＦＲ」という用語は、本明細書で使用する場合、線維芽細胞増殖因子受容体ファミリーメンバー（ＦＧＦＲ１～ＦＧＦＲ４）のいずれかまたは全てを包含し、ＦＧＦＲの任意の形態、例えば、１）例えば対立遺伝子変異体を含む、天然の未処理ＦＧＦＲ分子、「完全長」ＦＧＦＲ鎖またはＦＧＦＲの天然に存在する変異体、２）細胞における処理に起因するＦＧＦＲの任意の形態、例えば、種々のスプライシング形態、例えば、ＦＧＦＲ１ｂ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ａ、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ２ｃ等、または３）組換え法により生成されたＦＧＦＲサブユニットの断片（例えば、切断形態、細胞外／膜貫通ドメイン）または修飾形態（例えば、突然変異形態、グリコシル化／ＰＥＧ化、Ｈｉｓ－タグ／免疫蛍光融合形態）を包含すると意図される。「ＦＧＦＲ」は本明細書で使用する場合、霊長類（例えば、ヒト、サル）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源に由来し得る。
【0045】
[00063]「ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ」および「ＦＧＦＲ２ｂ」という用語は、交換可能に使用され、ＦＧＦＲ２のサブタイプＩＩＩｂスプライス形態を指す。ＦＧＦＲ２ｂの例示的な配列として、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ヒト）ＦＧＦＲ２ｂタンパク質（例えば、シグナルペプチドを有する前駆物質配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０７５２５９．４）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ラット）ＦＧＦＲ２ｂタンパク質（例えば、完全配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１１０３３６３．１）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）ＦＧＦＲ２ｂタンパク質（例えば、完全配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿９６３８９５．２）が挙げられる。
【0046】
[00064]「ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ」または「ＦＧＦＲ２ｃ」は、交換可能に使用され、ＦＧＦＲ２のサブタイプＩＩＩｃスプライス形態を指す。ＦＧＦＲ２ｃの例示的な配列として、ヒトＦＧＦＲ２ｃタンパク質（例えば、前駆物質配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００１３２．３）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ラット）ＦＧＦＲ２ｃタンパク質（例えば、完全配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１１０３３６２．１）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）ＦＧＦＲ２ｃタンパク質（例えば、完全配列、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０３４３３７．２）が挙げられる。
【0047】
[00065]「ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ」および「ＦＧＦＲ１ｂ」という用語は、交換可能に使用され、ＦＧＦＲ１のサブタイプＩＩＩｂスプライス形態を指す。ＦＧＦＲ１ｂの例示的な配列として、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ヒト）ＦＧＦＲ１ｂタンパク質（例えば、シグナルペプチドを有する前駆物質配列、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｐ１１３６２－１９）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）ＦＧＦＲ１ｂタンパク質（例えば、シグナルペプチドを有する前駆物質配列、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｐ１６０９２－５）が挙げられる。
【0048】
[00066]「抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体」という用語は、ＦＧＦＲ２ｂに特異的に結合することが可能な抗体を指す。一部の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂの両方に特異的に結合することが可能であるが、ＦＧＦＲ２ｃおよびＦＧＦＲ１ｃに結合しないか、またはＦＧＦＲ２ｃおよびＦＧＦＲ１ｃにあまり結合しない（例えば、ＦＧＦＲ２ｃまたはＦＧＦＲ１ｃに対する結合親和性は、ＦＧＦＲ２ｂまたはＦＧＦＲ１ｂに対する結合親和性よりも少なくとも１０倍低いか、または少なくとも５０倍低いか、または少なくとも１００倍低いか、または少なくとも２００倍低い）。一部の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ｃに対して検出可能な結合親和性を有さない。
【0049】
[00067]「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は本明細書で使用する場合、例えば抗体と抗原との間等の２つの分子間の非ランダム結合反応を指す。本明細書で提供される抗体および抗原結合断片の結合親和性は、ＫＤ値によって表すことができ、ＫＤ値は、抗原と抗原結合分子（例えば、抗体および抗原結合断片）との間の結合が平衡に達する場合の解離速度対結合速度の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を表す。抗原結合親和性（例えば、ＫＤ）は、例えばＢｉａｃｏｒｅ技法（これは、表面プラズモン共鳴技術に基づく、例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｈａｐｔｅｒ １９、ｕｎｉｔ １９．１４頁、２００６年を参照）、Ｋｉｎｅｘａ技法（例えば、Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．ら、Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、２（６）：６４７～６５７頁（２００４年）を参照）、およびフローサイトメトリーを含む、当該技術分野で既知の適切な方法を使用して適切に決定され得る。
【0050】
[00068]「結合に関して競合する」能力は本明細書で使用する場合、抗体または抗原結合断片の、任意の検出可能な程度で（例えば、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％分）２つの分子（例えば、ヒトＦＧＦＲ２ｂおよび抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体）間の結合相互作用を阻害する能力を指す。過度の実験を伴わずに、所与の抗体が、本開示の抗体（例えば、Ａｂ ２１、Ａｂ ２１ｃ、Ａｂ ｈｕ２１－２１、またはＡｂ ｈｕ２１－２６、以下で規定される）とＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに対する結合に関して競合するかどうかを決定することが可能であることは、当業者に理解されよう。
【0051】
[00069]「エピトープ」という用語は本明細書で使用する場合、抗体が結合する抗原上の原子またはアミノ酸の特異的な基を指す。
[00070]アミノ酸配列に関する「保存的置換」は、アミノ酸残基を、類似した生理化学的特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置き換えることを指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）間で、中性親水性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）間で、酸性側鎖を有する残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）間で、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇ）間で、または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ）間で行うことができる。当該技術分野で既知であるように、保存的置換は通常、タンパク質コンホメーション構造において著しい変化を引き起こさず、その結果、タンパク質の生物活性を保持することができる。
[00070]アミノ酸配列に関する「保存的置換」は、アミノ酸残基を、類似した生理化学的特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置き換えることを指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）間で、中性親水性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）間で、酸性側鎖を有する残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）間で、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇ）間で、または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ）間で行うことができる。当該技術分野で既知であるように、保存的置換は通常、タンパク質コンホメーション構造において著しい変化を引き起こさず、その結果、タンパク質の生物活性を保持することができる。
【0052】
[00071]「相同体」および「相同性」という用語は本明細書で使用する場合、交換可能に使用され、最適にアラインさせた場合に別の配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する核酸配列（またはその相補鎖）またはアミノ酸配列を指す。
【0053】
[00072]アミノ酸配列（または核酸配列）に関する「配列同一性パーセント（％）」は、最大数の同一アミノ酸（または核酸）を達成するように、配列をアラインさせて、必要に応じて、ギャップを導入した後に参照配列におけるアミノ酸（または核酸）残基に対して同一である候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基のパーセントとして定義される。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基であるとみなされてもよく、またはみなされなくてもよい。アラインメントは、アミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントを決定する目的で、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（アメリカ国立生物工学情報センター（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで利用可能、またＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３～４１０頁（１９９０年）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９～３４０２（１９９７年）も参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のウェブサイトで利用可能、またＨｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：３８３～４０２頁（１９９６年）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（オックスフォード、イギリス）、２３（２１）：２９４７～８頁（２００７年）も参照）、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に利用可能なツールを使用して達成することができる。当業者は、ツールによって提供されるデフォルトパラメーターを使用してもよく、または例えば適切なアルゴリズムを選択すること等によって、必要に応じてアラインメントに関するパラメーターをカスタマイズしてもよい。
【0054】
[00073]「単離された」物質は、ヒトの手によって天然状態から変更されている。「単離された」組成物または物質が天然に存在する場合、「単離された」組成物または物質は、その本来の環境から変化もしくは除去されているか、またはその両方である。例えば、生存している動物中に天然で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」おらず、それが実質的に純粋な状態で存在するようにその天然状態の共存している材料から十分に分離された場合に、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されている」。「単離されたポリヌクレオチド配列」は、単離されたポリヌクレオチド分子の配列を指す。ある特定の実施形態において、「単離された抗体」は、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィ法（例えば、イオン交換クロマトグラフィまたは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される場合に、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の純度を有する抗体を指す。
【0055】
[00074]「エフェクター機能」は本明細書で使用する場合、抗体のＦｃ領域の、Ｃ１複合体およびＦｃ受容体等のそのエフェクターに対する結合に起因する生物活性を指す。例示的なエフェクター機能として、抗体とＣ１複合体上のＣ１ｑとの相互作用によって誘導される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；抗体のＦｃ領域の、エフェクター細胞上のＦｃ受容体への結合によって誘導される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；およびファゴサイトーシスが挙げられる。
【0056】
[00075]「抗体依存性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現するエフェクター細胞が、標的細胞上の結合された抗体または抗原結合断片を認識して、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。「ＡＤＣＣ活性」は、標的細胞上に結合された抗体または抗原結合断片の、上述するようなＡＤＣＣ反応を誘発する能力を指す。
【0057】
[00076]「標的細胞」は、Ｆｃ領域を含む抗体が、一般的にＦｃ領域に対してＣ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。「エフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃ受容体を発現して、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現して、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、当該技術分野で既知であるように、それらの天然の供給源から、例えば血液またはＰＢＭＣから単離され得る。
【0058】
[00077]本明細書で使用する場合、「ベクター」は、そこに含有される所望の核酸断片の複製／クローニングを可能にするか、または適切な細胞宿主に導入される場合にかかる所望の核酸断片によってコードされるタンパク質の発現を可能にするポリヌクレオチド分子を指す。ベクターの例として、クローニングベクターおよび発現ベクターの両方が挙げられる。「発現ベクター」という用語は本明細書で使用する場合、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、当該タンパク質の発現をもたらすように作動可能に挿入され得るビヒクルを指す。発現ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能エレメント、およびレポーター遺伝子を含む、発現を制御するための様々なエレメントを含有し得る。さらに、ベクターは複製起点を含有し得る。
【0059】
[00078]「宿主細胞」という語句は本明細書で使用する場合、外因性ポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターが導入された細胞を指す。
[00079]状態を「処置すること」または「処置」は本明細書で使用する場合、状態を防止もしくは軽減すること、状態の発症の開始もしくは速度を緩徐化すること、状態の発症のリスクを低減すること、状態と関連付けられる症状の発症を防止もしくは遅延させること、状態と関連付けられる症状を低減もしくは終了させること、状態の完全もしくは部分的退行をもたらすこと、状態を治癒すること、またはそれらの幾つかの組合せが挙げられる。
[00079]状態を「処置すること」または「処置」は本明細書で使用する場合、状態を防止もしくは軽減すること、状態の発症の開始もしくは速度を緩徐化すること、状態の発症のリスクを低減すること、状態と関連付けられる症状の発症を防止もしくは遅延させること、状態と関連付けられる症状を低減もしくは終了させること、状態の完全もしくは部分的退行をもたらすこと、状態を治癒すること、またはそれらの幾つかの組合せが挙げられる。
【0060】
[00080]「ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連」疾患または状態は本明細書で使用する場合、ＦＧＦＲ２ｂモジュレーターおよび／もしくはＦＧＦＲ１ｂモジュレーターを用いた処置に対して感受性があるか、またはＦＧＦＲ２ｂおよび／もしくはＦＧＦＲ１ｂの発現もしくは過剰発現と関連付けられる任意の疾患または状態を指す。一部の実施形態において、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連の疾患または状態は、癌、任意選択で、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの発現または上昇された発現に関して陽性である癌である。
【0061】
[00081]「癌」は本明細書で使用する場合、悪性細胞成長または新生物、異常増殖、浸潤または転移を特徴とする任意の医学的状態を指し、固形腫瘍および非固形癌の両方を包含する。本明細書で使用する場合、「固形腫瘍」は、腫瘍性および／または悪性細胞の固形塊を指す。「非固形癌」は、白血病、リンパ腫、骨髄腫および他の血液悪性疾患等の血液悪性疾患を指す。癌または腫瘍の例として、血液学的悪性疾患（例えば、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫およびＢ細胞リンパ腫）、口腔癌（例えば、唇、舌または咽頭の）、消化器（例えば、食道、胃、小腸、結腸、大腸、または直腸）における腫瘍、腹膜、肝臓および胆汁道、膵臓、喉頭または肺（小細胞または非小細胞）等の呼吸器系、骨、結合組織、皮膚（例えば、黒色腫）、胸部、生殖器（卵管、子宮、子宮頸部、精巣、卵巣、または前立腺）、泌尿器（例えば、膀胱または腎臓）、脳および甲状腺等の内分泌腺が挙げられる。ある特定の実施形態において、癌は、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、肺癌（小細胞または非小細胞）、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌（肝癌）、腎細胞癌（腎癌）、頭頸部癌、中皮腫、黒色腫、肉腫、および脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫等の神経膠腫）から選択される。
【0062】
[00082]「薬学的に許容可能な」という用語は、指定の担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（複数可）、および／または塩が概して、製剤を含む他の成分と化学的および／または物理的に適合性であり、またそれらのレシピエントと生理学的に適合性であることを示す。
【0063】
[00083]抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体
[00084]本開示は、Ａｂ ２１の１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個）のＣＤＲ配列を含む抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体を提供する。表１は、Ａｂ ２１のＣＤＲ配列を示す。「Ａｂ ２１」という用語は本明細書で使用する場合、配列番号１２の重鎖可変領域、および配列番号１４の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。Ａｂ ２１は、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂの両方に特異的に結合する。
[00084]本開示は、Ａｂ ２１の１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個）のＣＤＲ配列を含む抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体を提供する。表１は、Ａｂ ２１のＣＤＲ配列を示す。「Ａｂ ２１」という用語は本明細書で使用する場合、配列番号１２の重鎖可変領域、および配列番号１４の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。Ａｂ ２１は、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂの両方に特異的に結合する。
【0064】
[00085]
【0065】
【表1】
【0066】
[00086]ＣＤＲは、抗原結合に関与すると知られているが、６個のＣＤＲが全て、不可欠または不変であるとは限らないことが見出されている。換言すると、Ａｂ ２１における１つまたは複数のＣＤＲを置き換えること、または変更すること、または修飾することが可能であるが、ＦＧＦＲに対する、特にＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂに対する特異的結合親和性を実質的に保持する。
【0067】
[00087]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、表１に提供されるような１つまたは複数のＣＤＲ領域において１つまたは複数の修飾または置換を含み得る。かかる変異体は、それらの親抗体のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに対する特異的結合親和性を保持するが、より高い抗原結合親和性またはグリコシル化の見込みの低減等の特性の１つまたは複数の改善を有し得る。
【0068】
[00088]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、ＣＤＲ領域内（または可変領域内）の１つまたは複数のＡｓｎまたはＡｓｐホットスポットを除去するよう修飾されてもよい。かかるＡｓｎおよびＡｓｐホットスポットは、抗体の分解を招く可能性があり、したがって、抗体の安定性を低減させる。ＣＤＲ領域内の例示的な推定ホットスポットモチーフとして、Ａｓｎ－Ｇｌｙ、Ａｓｎ－Ｔｈｒ、Ａｓｎ－Ｓｅｒ、Ａｓｎ－Ａｓｎ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ、Ａｓｐ－Ｔｈｒ、Ａｓｐ－Ｓｅｒ、Ａｓｐ－Ａｓｐ、およびＡｓｐ－Ｈｉｓが挙げられる。ある特定の実施形態において、Ａｂ ２１のＨＣＤＲ２は、Ａｓｎ－Ｇｌｙ（ＮＧ）ホットスポットを除去するよう修飾される。ある特定の実施形態において、修飾ＨＣＤＲ２は、配列番号７（ＡＩＹＰＥＮＲＤＩＮＹＮＱＫＦＫＧ）を含む。
【0069】
[00089]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、配列番号５の重鎖ＣＤＲ３配列、および任意選択で、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。重鎖ＣＤＲ３領域は、抗原結合部位の中心に位置し、したがって、抗原と最も多く接触すると考えられ、抗体の、抗原に対する親和性に最も多くの自由エネルギーを提供する。また、重鎖ＣＤＲ３は、多重多様化メカニズムによる長さ、アミノ酸組成およびコンホメーションの観点から抗原結合部位の群を抜いて多様なＣＤＲであると考えられる（Ｔｏｎｅｇａｗａ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ．３０２：５７５～８１頁．（１９８３年））。重鎖ＣＤＲ３における多様性は、大部分の抗体特異性（Ｘｕ ＪＬ，Ｄａｖｉｓ ＭＭ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１３：３７～４５頁（２０００年））ならびに望ましい抗原結合親和性（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ，ら Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６３：５５１～６７頁（１９９６年））を生み出すのに十分である。
【0070】
[00090]ある特定の実施形態では、抗体がＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合し得る限りは、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、適切なフレームワーク領域（ＦＲ）配列をさらに含む。表１で提供されるＣＤＲ配列は、マウス抗体から得られるが、表１で提供されるＣＤＲ配列は、とりわけ組換え技法等の当該技術分野で既知の適切な方法を使用して、マウス、ヒト、ラット、ウサギ等の任意の適切な種の任意の適切なＦＲ配列にグラフトされ得る。
【0071】
[00091]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、ヒト化されている。本明細書で提供される例示的なヒト化抗体として、Ａｂ Ｈｕ２１－２１およびＡｂ ｈｕ２１－２６が挙げられる。
【0072】
[00092]「Ａｂ ｈｕ２１－２１」は本明細書で使用する場合、配列番号１６の重鎖可変領域、および配列番号１０の軽鎖可変領域を有する、Ａｂ ２１に基づくヒト化抗体を指す。
【0073】
[00093]「Ａｂ ｈｕ２１－２６」は本明細書で使用する場合、配列番号８の重鎖可変領域、および配列番号１０の軽鎖可変領域を有する、Ａｂ ２１に基づくヒト化抗体を指す。Ａｂ ｈｕ２１－２６の重鎖可変領域配列（配列番号８）は、ＨＣＤＲ２におけるＮＧホットスポットを除去するＧ５６Ｒ突然変異を除いて、その他の点ではＡｂ ｈｕ２１－２１の重鎖可変領域配列（配列番号１６）と同一である。
【0074】
[00094]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、免疫グロブリン定常領域、任意選択でヒト免疫グロブリン、任意選択でヒトＩｇＧをさらに含む。一部の実施形態において、免疫グロブリン定常領域は、重鎖および／または軽鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、および／またはＣＨ２－ＣＨ３領域を含む。ある特定の実施形態において、重鎖定常領域は、Ｆｃ領域を含む。ある特定の実施形態において、軽鎖定常領域は、ＣκまたはＣλを含む。
【0075】
[00095]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体である。「Ａｂ ２１ｃ」は本明細書で使用する場合、それぞれヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域に融合された、配列番号１２のマウス重鎖可変領域、および配列番号１４のマウス軽鎖可変領域を含む、Ａｂ ２１に基づくキメラ抗体を指す。
【0076】
[00096]表２および表３は、例示的な抗体の可変領域配列を示す。
[00097]
[00097]
【0077】
【表2】
【0078】
[00098]
【0079】
【表3-1】
【0080】
【表3-2】
【0081】
[00099]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、本明細書で提供される１つまたは複数の可変領域配列において１つまたは複数の修飾または置換を含有し得るが、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに対する特異的結合親和性を保持する。ある特定の実施形態において、ＣＤＲ配列、ＦＲ配列、または可変領域配列における置換（複数可）の少なくとも１つ（または全て）は、保存的置換（複数可）を含む。
【0082】
[000100]当該技術分野で既知の各種方法を使用して、この目的を達成することができる。例えば、抗体変異体（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ変異体）のライブラリーを生成して、ファージディスプレイ技術を用いて発現させた後、ヒトＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに対する結合親和性に関してスクリーニングすることができる。別の例に関して、コンピューターソフトウェアを使用して、抗体の、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂへの結合をバーチャルでシミュレーションして、結合界面を形成する抗体上のアミノ酸残基を同定することができる。かかる残基は、結合親和性の低減を防止するように置換において回避され得るか、またはより強力な結合を提供するために置換に関して標的とされ得る。
【0083】
[000101]ある実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、配列番号１～配列番号７内の１つまたは複数のＣＤＲ配列、および／または１つまたは複数のＦＲ配列において１つまたは複数のアミノ酸残基置換を含む。ある特定の実施形態において、合計で１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個以下の置換が、ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列に成される。
【0084】
[000102]ある特定の実施形態において、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、配列番号１～配列番号７に列挙される配列（単数または複数）に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する１個、２個、３個、４個、５個、または６個のＣＤＲ配列を含み、その一方で、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに対する結合親和性を、その親抗体と類似したレベルまたはさらにはそれよりも高いレベルで保持する。
【0085】
[000103]ある特定の実施形態において、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、表２に列挙される配列（単数または複数）に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する１つまたは複数の可変領域配列を含み、その一方で、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに対する結合親和性を、その親抗体と類似したレベルまたはさらにはそれよりも高いレベルで保持する。一部の実施形態において、総計１個～１０個のアミノ酸が、表２において列挙される可変領域配列において置換、挿入、または欠失されている。一部の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲの外側の領域において（例えば、ＦＲにおいて）起こる。
【0086】
[000104]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ等のエフェクター機能を誘導することが可能な定常領域を含む。ＡＤＣＣおよびＣＤＣ等のエフェクター機能は、ＦＧＦＲを発現する細胞に対する細胞傷害をもたらすことができ、Ｆｃ受容体結合アッセイ、Ｃ１ｑ結合アッセイ、および細胞溶解アッセイ等の各種アッセイを使用して評価することができる。ある特定の実施形態において、定常領域は、ＡＤＣＣを誘導することが知られているＩｇＧ１アイソタイプを有する。
【0087】
[000105]ある特定の実施形態において、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、増強されたＡＤＣＣを付与する定常領域における１つまたは複数の修飾を含む。本明細書で使用する場合、「増強されたＡＤＣＣ」という用語は、上記で規定されるＡＤＣＣのメカニズムによる、所与の時間で、標的細胞を囲む培地中で所与の濃度の抗体で溶解される標的細胞の数の増加、および／またはＡＤＣＣのメカニズムによる、所与の時間で所与数の標的細胞の溶解を達成するのに必要とされる標的細胞を囲む培地中での抗体の濃度の低減のいずれかとして定義される。
【0088】
[000106]目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３、７０５９～７０６３頁（１９８６年）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２、１４９９～１５０２頁（１９８５年）、米国特許第５，８２１，３３７号；またはＢｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６、１３５１～１３６１頁（１９８７年）に記載されるもののようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイが実施され得る。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、マウンテンビュー、ＣＡ）およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ＷＩ）を参照）。さらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２～６５６頁（１９９８年）に開示されるもの等の動物モデルにおいて評価され得る。
【0089】
[000107]ＡＤＣＣ増強に関する各種方法は、従来技術で記載されている。例えば、Ｆｃ領域におけるアミノ酸残基のサブセットが、下記のアミノ酸残基（ＥＵナンバリングの残基）等のＦｃγＲｓへの結合に関与することが実証されている：Ｆｃ領域における（１）Ｌｙｓ２７４～Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７～Ａｒｇ４１６（Ｓａｒｍａｙら（１９８４年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１：４３～５１頁およびＧｅｒｇｅｌｙら（１９８４年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔａｎｓ．、１２：７３９～７４３頁）；（２）Ｌｅｕ２３４～Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５～Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７～Ｔｈｒ２９９、およびＡｌａ３２７～Ｉｌｅ３３２（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ、４０６：２６７～２７３頁）、および（３）Ｔ２５６、Ｋ２９０、Ｓ２９８、Ｅ３３３、Ｋ３３４、Ａ３３９（Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：６５９１～６６０４頁；および米国特許出願公開第２００４／０２２８８５６号）は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの結合に関与する。上記で列挙したアミノ酸残基は、例えばＳｈｉｅｌｄｓら（２００１年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ９（２）、６５９１～６６０４頁において、ＡＤＣＣアッセイを増強するように突然変異させることができ、Ｆｃ変異体Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、およびＡ３３９Ｔは、天然の配列と比較した場合にＡＤＣＣ活性を増強することが証明されている。
【0090】
[000108]あるいは、増強されたＡＤＣＣ活性は、グリコシル化形態の抗体を操作することによって得られ得る。多数のグリコシル化形態が、エフェクター細胞のＦｃ受容体へのその結合を増強することにより、抗体のＡＤＣＣ活性を増強すると報告されている。種々のグリコシル化形態は、種々の糖類（例えば、フコース等の１つのタイプの糖を欠如するか、またはマンノース等の高レベルの１つのタイプの糖を有する）を用いるか、または種々の構造（例えば、様々な分岐状構造、例えば二分岐（２つの分岐）、三分岐（３つの分岐）または四分岐（４つの分岐）構造）を有する、抗体に結合されたグリカンの幾つかの形態のいずれかを含む。
【0091】
[000109]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、糖鎖操作されている。「糖鎖操作された」抗体または抗原結合断片は、その糖鎖操作されていない対応物と比較した場合に、グリコシル化形態の変化である増加もしくは減少されたグリコシル化レベル、またはその両方を有し得る。ある特定の実施形態において、糖鎖操作された抗体は、その操作されていない対応物よりも増強されたＡＤＣＣ活性を示す。一部の実施形態において、増強されたＡＤＣＣ活性は、ＦＧＦＲ２ｂ発現細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、または７５％よりも高い溶解を特徴とする。
【0092】
[000110]抗体は、ペプチド骨格に対する任意の操作（例えば、アミノ酸配列に対する、および／または個々のアミノ酸の側鎖基に対する修飾）、および／または宿主細胞系を通じた翻訳後修飾に対する操作（例えば、グリコシル化パターンに対する修飾）を含む、当該技術分野で既知の方法によって糖鎖操作され得る。抗体のグリコシル化を操作することによってＡＤＣＣ活性を変更させる方法もまた、当該技術分野で記載されており、例えば、Ｗｅｉｋｅｒｔら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１１６～１２１頁；Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．ら（２００２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：２６７３３～２６７４０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａら（２００３年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７８、３４６６～３４７３；Ｆｅｒｒａｒａら（２００６年）、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９３、８５１～８６１頁；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら（２００４年）、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ．、８７、６１４～６２２頁；Ｎｉｗａら（２００６年）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６、１５１～１６０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、（２００３年）、２７８：３４６６～３４７３頁を参照されたい。
【0093】
[000111]一部の実施形態において、本明細書で提供される糖鎖操作された抗体は、脱フコシル化されている（即ち、フコースを含有しない）。脱フコシル化された（即ち、フコース欠乏性、またはフコシル化されていない）抗体は、ＦｃγＲＩＩＩに対して増加された結合を示し、したがって、より高いＡＤＣＣ活性を誘発することが、幾つかの研究により示されている（Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：２６７３３～２６７４０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：３４６６～３４７３頁；および欧州特許出願公開第１１７６１９５号）。一部の実施形態において、本明細書で提供される脱フコシル化された抗体は、重鎖のアスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７）（Ｋａｂａｔナンバリングに基づく）でフコースを欠如している。Ａｓｎ２９７は、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体のＦｃ領域の各ＣＨ２ドメインにおいて見出される保存されたＮ連結グリコシル化部位である（Ａｒｎｏｌｄら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５６４：２７～４３頁、２００５年）。
【0094】
[000112]一部の実施形態において、本明細書で提供される糖鎖操作された抗体は、高マンノースグリコシル化形態（例えば、マンノースｅ５、マンノース７、８、９グリカン）を特徴とする。高マンノースグリコシル化形態は、ＡＤＣＣ活性を増強することが証明されている（Ｙｕら（２０１２年）、Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｍＡｂｓ ４：４、４７５～４８７頁）。
【0095】
[000113]一部の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、その定常領域内に、ａ）グリコシル化部位を導入または除去する、ｂ）遊離システイン残基を導入する、ｃ）活性化Ｆｃ受容体への結合を増強する、および／またはｄ）ＡＤＣＣを増強する１つまたは複数の修飾をさらに含む。
【0096】
[000114]抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体またはその抗原結合断片は、炭水化物部分（例えば、オリゴ糖構造）が結合され得る側鎖を有する１つまたは複数のアミノ酸残基を含み得る。抗体のグリコシル化は通常、Ｎ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結は、炭水化物部分の、アスパラギン残基、例えば、アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－トレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）等のトリペプチド配列におけるアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。Ｏ連結されたグリコシル化は、糖Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸への、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合を指す。天然のグリコシル化部位の除去は、例えば、抗体の配列中に存在する上述のトリペプチド配列（Ｎ連結されたグルコシル化部位に関して）またはセリンもしくはトレオニン残基（Ｏ連結されたグリコシル化部位に関して）の１つが置換されるようにアミノ酸配列を変更することによって、利便性よく遂行され得る。新たなグリコシル化部位は、かかるトリペプチド配列またはセリンもしくはトレオニン残基を導入することによって、類似した様式で創出することができる。
【0097】
[000115]本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体はまた、１つまたは複数の導入された遊離システインアミノ酸残基を含む、システインが操作されている変異体を包含する。遊離システイン残基は、ジスルフィド架橋の一部ではないものである。システインが操作されている変異体は、例えば、操作されているシステインの部位で、例えばマレイミドまたはハロアセチルを通じた細胞傷害性および／または造影用化合物、標識、またはとりわけ放射性同位体とのコンジュゲーションに有用である。遊離システイン残基を導入するように抗体を操作する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、国際公開第２００６／０３４４８８号を参照されたい。
【0098】
[000116]本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体はまた、そのＦｃ領域および／またはヒンジ領域で１つまたは複数のアミノ酸残基修飾または置換を含むＦｃ変異体を包含する。ある特定の実施形態において、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対するｐＨ依存的結合を改善する１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含む。かかる変異体は、それが輸送用リソソームにおける分解から逃れて、続いて、細胞から移動および放出されるのを可能にする酸性ｐＨでＦｃＲｎに結合するため、延長された薬物動態的半減期を有し得る。ＦｃＲｎとの結合親和性を改善するように抗体およびその抗原結合断片を操作する方法は、当該技術分野で周知されており、例えば、Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、６（１）：６３～７３頁（１９９８年）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅ １、Ｃｈａｐｔｅｒ ２７：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＫ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社により出版、２０１０年；Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７０：３２６９～３２７７頁（２０１０年）；およびＨｉｎｔｏｎ、Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７６：３４６～３５６頁（２００６年）を参照されたい。
【0099】
[000117]結合特性
[000118]本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合することが可能である。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、１０－６Ｍ以下（例えば、５×１０－７Ｍ以下、２×１０－７Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、４×１０－９Ｍ以下、３×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、９×１０－１０Ｍ以下、８×１０－１０Ｍ以下、７×１０－１０Ｍ以下、６×１０－１０Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、４×１０－１０Ｍ以下、３×１０－１０Ｍ以下、２．５×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、１．５×１０－１０Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、９×１０－１１Ｍ以下、５×１０－１１Ｍ以下、４×１０－１１Ｍ以下、３×１０－１１Ｍ以下、２×１０－１１Ｍ以下、または１０－１１Ｍ以下）の結合親和性（ＫＤ）でヒトＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合する。
[000118]本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合することが可能である。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、１０－６Ｍ以下（例えば、５×１０－７Ｍ以下、２×１０－７Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、４×１０－９Ｍ以下、３×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、９×１０－１０Ｍ以下、８×１０－１０Ｍ以下、７×１０－１０Ｍ以下、６×１０－１０Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、４×１０－１０Ｍ以下、３×１０－１０Ｍ以下、２．５×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、１．５×１０－１０Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、９×１０－１１Ｍ以下、５×１０－１１Ｍ以下、４×１０－１１Ｍ以下、３×１０－１１Ｍ以下、２×１０－１１Ｍ以下、または１０－１１Ｍ以下）の結合親和性（ＫＤ）でヒトＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合する。
【0100】
[000119]一部の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、５×１０－９Ｍ以下、４×１０－９Ｍ以下、３×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、４×１０－１０Ｍ以下、３×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、５×１０－１１Ｍ以下、または４×１０－１１Ｍ以下、３×１０－１１Ｍ以下、２×１０－１１Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）でヒトＦＧＦＲ２ｂに特異的に結合することが可能である。
【0101】
[000120]一部の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、５×１０－９Ｍ以下、４×１０－９Ｍ以下、３×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、４×１０－１０Ｍ以下、３×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、５×１０－１１Ｍ以下、または４×１０－１１Ｍ以下、３×１０－１１Ｍ以下、２×１０－１１Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）でヒトＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合することが可能である。
【0102】
[000121]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、カニクイザルＦＧＦＲ対応物、ラットＦＧＦＲ対応物、およびマウスＦＧＦＲ対応物と交差反応する。
【0103】
[000122]抗体の、ヒトＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂへの結合はまた、「最大半数効果濃度」（ＥＣ５０）値によって表すことができ、それは、その最大効果（例えば、結合または阻害等）の５０％が観察される抗体の濃度を指す。ＥＣ５０値は、当該技術分野で既知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーアッセイ、および他の結合アッセイ等のサンドイッチアッセイによって測定することができる。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、ＥＬＩＳＡによる５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下のＥＣ５０（即ち、５０％結合濃度）でヒトＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合する。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、フローサイトメトリーによる１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下または０．３ｎＭ以下のＥＣ５０（即ち、５０％結合濃度）でヒトＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合する。
【0104】
[000123]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体はまた、カニクイザルＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに、および／またはラット／マウスＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合することが可能である。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体の、ヒトＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂへの結合親和性は、ラット／マウスＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの結合親和性に類似している。
【0105】
[000124]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、診断用途および／または治療用途を提供するのに十分であるヒトＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに対する特異的結合親和性を有する。
【0106】
[000125]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、ヒトＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの、そのリガンドへの結合を阻止し、それにより例えばＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ発現細胞の増殖の阻害を含む生物学的活性を提供する。
【0107】
[000126]増殖阻害効果は、「５０％成長阻害濃度」（ＧＩ５０）値によって表すことができ、それは、その最大増殖阻害効果の５０％が観察される抗体の濃度を指す。ＧＩ５０値は、当該技術分野で既知の方法、例えば、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）比色アッセイ（米国特許第５，１８５，４５０号に記載されるものを参照）、臭化３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ（Ｂｅｒｒｉｄｇｅら Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．２００５年；１１：１２７～５２頁を参照）、アラマーブルーアッセイ（米国特許第５，５０１，９５９号に記載されるものを参照）およびＡｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｉｔｔａｍｐａｌａｍら編 ２００４年）に記載されるような任意の他の方法によって測定することができる。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、ＭＴＳによって測定される場合、１５ｎＭ以下、１４ｎＭ以下、１３ｎＭ以下、１２ｎＭ以下、１１ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下の５０％成長阻害濃度（ＧＩ５０）でそれらの表面上で発現されるヒトＦＧＦＲ２ｂを有する細胞の増殖を阻害することが可能である。
【0108】
[000127]抗原結合断片
[000128]本開示はまた、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合することができる抗原結合断片を提供する。様々なタイプの抗原結合断片が当該技術分野で既知であり、例えばＣＤＲおよび可変配列が配列番号１～配列番号７および表２に示される例示的な抗体、および修飾または置換を含有するそれらの種々の変異体を含む、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体に基づいて開発され得る。
[000128]本開示はまた、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合することができる抗原結合断片を提供する。様々なタイプの抗原結合断片が当該技術分野で既知であり、例えばＣＤＲおよび可変配列が配列番号１～配列番号７および表２に示される例示的な抗体、および修飾または置換を含有するそれらの種々の変異体を含む、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体に基づいて開発され得る。
【0109】
[000129]ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗原結合断片は、ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、二特異性抗体、ｄｓダイアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体である。
【0110】
[000130]各種技法が、かかる抗原結合断片の産生に使用され得る。実例となる方法として、インタクトな抗体の酵素的消化（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７～１１７頁（１９９２年）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１頁（１９８５年）を参照）、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）等の宿主細胞による組換え発現（例えば、Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片に関して）、上記で論述されるようなファージディスプレイライブラリーからのスクリーニング（例えば、ＳｃＦｖに関して）、およびＦ（ａｂ’）２断片を形成するための２つのＦａｂ’－ＳＨ断片の化学的カップリング（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３～１６７頁（１９９２年））が挙げられる。抗体断片の産生に関する他の技法は、当業者に明らかである。
【0111】
[000131]ある特定の実施形態において、抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖの生成は、例えば、国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号に記載されている。ＳｃＦｖは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかでエフェクタータンパク質に融合されて、融合タンパク質を提供し得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ著を参照）。
【0112】
[000132]コンジュゲート
[000133]一部の実施形態において、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、コンジュゲート部分をさらに含む。コンジュゲート部分は、本明細書で提供される抗体に連結され得る。コンジュゲート部分は、抗体に結合され得る非タンパク質性または消化性部分である。様々なコンジュゲート部分は、本明細書で提供される抗体に連結され得ると意図される（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ．（著）、Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、（１９８９年）を参照）。コンジュゲート部分は、数ある方法の中でも共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、錯体形成、会合、混合または添加によって抗体に連結され得る。
[000133]一部の実施形態において、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、コンジュゲート部分をさらに含む。コンジュゲート部分は、本明細書で提供される抗体に連結され得る。コンジュゲート部分は、抗体に結合され得る非タンパク質性または消化性部分である。様々なコンジュゲート部分は、本明細書で提供される抗体に連結され得ると意図される（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ．（著）、Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、（１９８９年）を参照）。コンジュゲート部分は、数ある方法の中でも共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、錯体形成、会合、混合または添加によって抗体に連結され得る。
【0113】
[000134]ある特定の実施形態において、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、リンカーを介して１つまたは複数のコンジュゲートに連結される。ある特定の実施形態において、リンカーは、ヒドラジンリンカー、ジスルフィドリンカー、二官能性リンカー、ジペプチドリンカー、グルクロニドリンカー、またはチオエーテルリンカーである。ある特定の実施形態において、リンカーは、リソソームで切断可能なジペプチド、例えば、バリン－シトルリン（ｖｃ）である。
【0114】
[000135]コンジュゲート部分は、治療剤（例えば、細胞傷害剤）、放射性同位元素、検出可能な標識（例えば、ランタニド、発光標識、蛍光標識、または酵素－基質標識）、薬物動態的修飾部分、または精製部分（例えば、磁気ビーズまたはナノ粒子）であり得る。
【0115】
[000136]検出可能な標識の例として、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、またはテキサスレッド）、酵素－基質標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼまたはβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ）、放射性同位体、発光標識、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子または検出用の金が挙げられ得る。
【0116】
[000137]放射性同位体の例として、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐおよび他のランタニドが挙げられ得る。放射性同位体で標識された抗体は、受容体標的造影実験において有用である。
【0117】
[000138]ある特定の実施形態において、薬物動態的修飾部分は、抗体の半減期を増加させるのを助長するクリアランス修飾剤であり得る。実例となる例として、ＰＥＧ、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体等の水溶性ポリマーが挙げられる。ポリマーは、任意の分子量を有してもよく、分岐状または未分岐状であり得る。抗体に結合されるポリマーの数は多様であってよく、１つよりも多いポリマーが結合される場合、１つよりも多いポリマーは、同じ分子または異なる分子であり得る。
【0118】
[000139]ある特定の実施形態において、コンジュゲート部分は、磁気ビーズまたはナノ粒子等の精製部分であり得る。
[000140]抗体－薬物コンジュゲート
[000141]ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるコンジュゲートは、細胞傷害剤にコンジュゲートされた上記抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体のいずれかを含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。換言すると、コンジュゲート部分は、細胞傷害剤を含む。
[000140]抗体－薬物コンジュゲート
[000141]ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるコンジュゲートは、細胞傷害剤にコンジュゲートされた上記抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体のいずれかを含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。換言すると、コンジュゲート部分は、細胞傷害剤を含む。
【0119】
[000142]ＡＤＣは、例えば、癌の処置における細胞傷害剤の局所送達に有用であり得る。このことにより、細胞傷害剤の、腫瘍への標的送達およびそこでの細胞内蓄積が可能となり、これは、これらのコンジュゲートされていない細胞傷害剤の全身投与が許容できないレベルの毒性を正常細胞にもたらし、また腫瘍細胞が排除されるよう求められ得る場合に特に有用である（Ｂａｌｄｗｉｎら、（１９８６年）、Ｌａｎｃｅｔ、６０３～０５頁；Ｔｈｏｒｐｅ、（１９８５年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、８４；Ｐｉｎｃｈｅｒａら（著）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４７５～５０６頁；Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９年）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５～６１４頁；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ～Ｄｕｖａｚ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７年）Ａｄｖ．Ｄｒｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１～１７２頁；および米国特許第４，９７５，２７８号）。
【0120】
[000143]「細胞傷害剤」は、癌細胞にとって有害であるか、または癌細胞に損傷を与え得るか、もしくは癌細胞を死滅させ得る任意の作用物質であり得る。ある特定の実施形態において、細胞傷害剤は、任意選択で化学療法剤（例えば、成長阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリン結合剤、または他の抗癌薬）、毒素、または高反応性放射性同位元素である。
【0121】
[000144]細胞傷害剤の例として、例えばジフテリア毒素、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシン、アブリン、モデッシン、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）、タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＲＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン類等の大分子細菌毒素および植物毒素が挙げられる（例えば、国際公開第９３／２１２３２号を参照）。かかる大分子毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８頁に記載されるように、当該技術分野で既知の方法を使用して、本明細書で提供される抗体にコンジュゲートされ得る。
【0122】
[000145]細胞傷害剤はまた、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００年）Ｊｏｕｒ．ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３～１５８１頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６～７９１頁）、マンタンシノイド（ＥＰ １３９１２１３号；Ｌｉｕら、（１９９６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８～８６２３頁）、カリケアミシン（Ｌｏｄｅら（１９９８年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８頁；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６～３３４２頁）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、カリケアミシン、マイタンシノイド、ドラスタイン、アウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ））、トリコテセン、およびＣＣ１０６５、および細胞傷害活性を有するそれらの誘導体等の小分子毒素および化学療法薬であり得る。かかる毒素は、細胞傷害活性を有するそれらの誘導体等の小分子毒素および化学療法薬であり得る。かかる毒素は、例えば、米国特許第７，９６４，５６６号；Ｋｌｉｎｅ，Ｔ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２（１１）：３４８０～３４９３頁に記載されるように、当該技術分野で既知の方法を使用して、本明細書で提供される抗体にコンジュゲートされ得る。
【0123】
[000146]細胞傷害剤はまた、高放射性同位元素であってもよい。例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性同位体の、抗体へのコンジュゲーションの方法は、例えば、適切な配位子試薬を介して、当該技術分野で既知である（例えば、国際公開第９４／１１０２６号；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻および第２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら、編．Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１年）を参照）。配位子試薬は、放射性同位体金属を結合し得るか、キレート化し得るか、または他の状況では組み合わせ得るキレート配位子を有し、また抗体または抗原結合断片のシステインのチオールと反応性である官能基を有する。例示的なキレート配位子として、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡおよびＴＥＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社、ダラス、テキサス州）が挙げられる。
【0124】
[000147]ある特定の実施形態において、抗体は、リンカー、例えば、ヒドラジンリンカー、ジスルフィドリンカー、二官能性リンカー、ジペプチドリンカー、グルクロニドリンカー、またはチオエーテルリンカーを介してコンジュゲート部分に結合される。
【0125】
[000148]例示的な二官能性リンカーとして、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオム（ｄｉｆｌｕｏｍ）－２，４－ジニトロベンゼン）が挙げられる。
【0126】
[000149]ある特定の実施形態において、リンカーは、特定の生理学的環境下で切断可能であり、それにより、細胞における細胞傷害剤の放出を促進する。例えば、リンカーは、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーであり得る（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７～１３１頁（１９９２年）；米国特許第５，２０８，０２０号）。一部の実施形態において、リンカーは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチド等のアミノ酸残基を含み得る。リンカーにおけるアミノ酸残基は、天然アミノ酸残基であり得るか、または天然に存在しないアミノ酸残基であり得る。かかるリンカーの例として、バリン－シトルリン（ｖｅまたはｖａｌ－ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ－ｐｈｅ）、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）、グリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）、バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「ｖｃ－ＰＡＢ」）が挙げられる。アミノ酸リンカー構成成分は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、カテプシンＣおよびカテプシンＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に関するそれらの選択性で設計および最適化することができる。
【0127】
[000150]ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＡＤＣでは、抗体（または抗原結合断片）は、１つまたは複数の細胞傷害剤に、約１対約２０、約１対約６、約１対約３、約１対約２、約１対約１、約２対約５、または約３対約４の抗体：剤の比でコンジュゲートされる。
【0128】
[000151]本明細書で提供されるＡＤＣは、当該技術分野で既知の任意の適切な方法によって調製され得る。ある特定の実施形態において、抗体の求核性基は、まず二官能性リンカー試薬と反応された後、細胞傷害剤に連結されるか、または逆に、即ち、まず細胞傷害剤の求核性基を二官能性リンカーと反応させた後、抗体に連結させる。
【0129】
[000152]ある特定の実施形態において、細胞傷害剤は、本明細書で提供される抗体の遊離システインのシステインチオールと反応し得るチオール反応性官能基を含有し得る（または含有するよう修飾され得る）。例示的なチオール反応性官能基として、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、ハロアセチル、スクシンイミジルエステル（例えば、ＮＨＳ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）、イソチオシアネート、塩化スルホニル、２，６－ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、またはホスホルアミダイトが挙げられる（Ｈａｕｇｌａｎｄ、２００３年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ、１９９２年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ、１９９７年、Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ロンドン；Ｍｅａｎｓ（１９９０年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６年）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、４０～５５頁、６４３～６７１頁）。
【0130】
[000153]細胞傷害剤または抗体は、リンカー試薬と反応した後、コンジュゲートされて、ＡＤＣを形成し得る。例えば、細胞傷害剤のＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）は、実施され、単離され、精製され、および／もしくは特徴付けられ得るか、または細胞傷害剤のＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）は、原位置で形成されて、抗体の求核性基と反応され得る。
【0131】
[000154]一部の実施形態において、細胞傷害剤および抗体は、原位置での活性化および反応によって連結されて、一工程でＡＤＣを形成し得る。別の例では、抗体は、ビオチンにコンジュゲートされた後、アビジンにコンジュゲートされる第２のコンジュゲートに間接的にコンジュゲートされ得る。
【0132】
[000155]ある特定の実施形態において、コンジュゲート部分は、抗体における特定のタイプの表面に露出されたアミノ酸残基、例えば、システイン残基またはリジン残基に無作為に結合される。
【0133】
[000156]ある特定の実施形態において、コンジュゲート部分は、明確に規定された部位に結合されて、薬物対抗体比（ＤＡＲ）および結合部位に関して高い均質性およびバッチ間の一貫性を有するＡＤＣ集団を提供する。ある特定の実施形態において、コンジュゲート部分は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、短鎖ペプチドタグ、またはＡｓｎ２９７グリカンを介して抗体分子における明確に規定された部位に結合される。例えば、コンジュゲーションは、エピトープ結合部分の外側の特定の部位に存在し得る。
【0134】
[000157]部位特異的結合は、抗体の特定の部位にある天然のアミノ酸を、薬物部分がコンジュゲートされ得るシステイン等のアミノ酸と置換することによって、または抗体の特定の部位の前／後に、薬物部分がコンジュゲートされ得るシステイン等のアミノ酸を導入することによって達成され得る（例えば、Ｓｔｉｍｍｅｌら（２０００年）、ＪＢＣ、２７５（３９）：３０４４５～３０４５０頁；Ｊｕｎｕｔｕｌａら（２００８年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６（８）：９２５～９３２頁；および国際公開第２００６／０６５５３３号を参照）。あるいは、部位特異的コンジュゲーションは、Ａｘｕｐら（（２０１２年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０９（４０）：１６１０１～１６１１６頁）に記載されるように、抗体をそれらの重鎖および／または軽鎖における特定の部位にて、非天然アミノ酸（例えば、ｐ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＦ）、Ｎ６－（（２－アジドエトキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、およびセレノシステイン（Ｓｅｃ））を含有するよう操作することによって達成されてもよく、ここで、非天然アミノ酸は、オルトゴナル化学がリンカー試薬および薬物を結合するよう設計され得るというさらなる利点を提供する。２つの上述の部位特異的コンジュゲーション法において有用な例示的な特定の部位（例えば、軽鎖Ｖ２０５、重鎖Ａ１１４、Ｓ２３９、Ｈ２７４、Ｑ２９５、Ｓ３９６等）は、多くの先行技術、例えば、Ｓｔｒｏｐら（２０１３年）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０、１６１～１６７頁；Ｑｕｎ Ｚｈｏｕ（２０１７年）、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ、５、６４；Ｄｉｍａｓｉら（２０１７年）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，１４，１５０１～１５１６頁；国際公開第２０１３／０９３８０９号および国際公開第２０１１／００５４８１号に記載されている。別の部位特異的ＡＤＣコンジュゲーション法は、グリカン媒介性コンジュゲーションであり、そこでは、比較的疎水性の細胞傷害剤を、抗体のアミノ酸骨格にカップリングする代わりに、薬物－リンカーが、ＣＨ２ドメイン中に位置されるＡｓｎ２９７グリカン（例えば、フコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、シアル酸）にコンジュゲートされ得る。また、特有の短鎖ペプチドタグ（例えば、ＬＬＱＧ、ＬＰＥＴＧ、ＬＣｘＰｘＲ）を、特定の部位（例えば、Ｎ末端またはＣ末端領域における部位）を介して抗体に導入する試みが成されており、続いてそれにより、ペプチドタグ中の特定のアミノ酸を官能化して、薬物－リンカーにカップリングさせることが可能になる（Ｓｔｒｏｐら（２０１３年）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０、１６１～１６７頁；Ｂｅｅｒｌｉら（２０１５年）、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、１０、ｅ０１３１１７７；Ｗｕら（２００９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６、３０００～３００５頁；Ｒａｂｕｋａ（２０１２年）、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７，１０５２～１０６７頁）。
【0135】
[000158]ポリヌクレオチドおよび組換え法
[000159]本開示は、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
[000159]本開示は、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0136】
[000160]「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用する場合、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）および一本鎖または二本鎖形態のいずれかのそれらのポリマーを指す。特に限定されない限りは、当該用語は、参照核酸として類似した結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドに類似した様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有するポリヌクレオチドを包含する。別記されない限り、特定のポリヌクレオチド配列はまた、それらの保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補配列ならびに明確に示された配列を含蓄する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５～２６０８頁（１９８５年）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１～９８頁（１９９４年）を参照）。
【0137】
[000161]ある特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７で示されるような１つまたは複数のヌクレオチド配列、および／または少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するその相同配列、および／または唯一の縮重置換を有するその変異体を含み、本明細書で提供される例示的な抗体の可変領域をコードする。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定される。コードＤＮＡはまた、合成法によって得られ得る。
【0138】
[000162]抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体（例えば、表３に示されるような配列を含む）をコードする単離されたポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の組換え技法を使用して、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）用または発現用のベクターに挿入され得る。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成成分として概して、下記の：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および転写終結配列の１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターはまた、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質コーティングを含むがこれらに限定されない、細胞へのその進入を助長する材料を含み得る。
【0139】
[000163]本開示は、抗体をコードする本明細書で提供される核酸配列、核酸配列に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および少なくとも１つの選択マーカーを含有するベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を提供する。ベクターの例として、プラスミド、ファージミド、コスミド、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージ等のバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターとして使用される動物ウイルスのカテゴリーとして、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。例示的なプラスミドとして、ｐｃＤＮＡ３．３、ｐＭＤ１８－Ｔ、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ－Ｈｙｇ－ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ－ＳＣＲＩＰＴ．ＲＴＭ．、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ ２．１、ｐＥＦ－１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ－Ｂｏｓ等が挙げられる。
【0140】
[000164]抗体または抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターは、クローニングまたは遺伝子発現用の宿主細胞に導入され得る。本明細書におけるベクター中でＤＮＡをクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母、または上述のより高等の真核生物細胞である。この目的に適した原核生物として、グラム陰性またはグラム陽性生物等の真正細菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびにバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバシラス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ならびにストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
【0141】
[000165]原核生物に加えて、糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）または酵母等の真核生物の微生物は、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体をコードするベクター用の適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母は、より低級の真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；例えばＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ウィッカーハミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）等のクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２，２２６号）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３，０７０号）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニュデランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）等の糸状菌等の多数の他の属、種、および株が一般に利用可能であり、本明細書で有用である。
【0142】
[000166]本明細書で提供される抗体または抗原断片の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、セッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）等の宿主由来の相当する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用の様々なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ－５株が公的に利用可能であり、かかるウイルスは、本発明による本明細書におけるウイルスとして、特にツマジロクサヨトウ細胞のトランスフェクション用に使用され得る。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる。
【0143】
[000167]しかしながら、脊椎動物細胞に最も興味が集まり、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖が、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎系（２９３細胞または浮遊培養における成長用にサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁（１９７７年））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウス骨髄腫細胞系（ＮＳ０、ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７３：３～４６頁；Ｓｐ２／０－Ａｇ１４、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８１）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３～２５１頁（１９８０年））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４～６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。一部の好適な実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、またはＮＳ０細胞等の哺乳動物培養細胞である。
【0144】
[000168]一部の実施形態において、宿主細胞は、糖鎖操作された抗体を産生することが可能である。例えば、宿主細胞系は、翻訳後修飾中に所要のグリコシル化機構を提供することができる。かかる宿主細胞系の例として、グルコサミニルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））、グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ））、シアリルトランスフェラーゼ（例えば、α（２，３）－シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ））、マンノシダーゼ（例えば、α－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ））、フコシルトランスフェラーゼ（例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８）、（１，３）フコシルトランスフェラーゼ）、原核生物ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－へキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）、ＧＤＰ－フコーストランスポーター（ＧＦＴ）等の、天然に、または遺伝子操作を通じてグリコシル化関連酵素の変更された（増加または減少した）活性を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0145】
[000169]一部の実施形態において、宿主細胞は、機能性ＦＵＴ８の欠如、異種ＧｎＴＩＩＩの過剰発現、原核生物ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）の発現、または機能性ＧＦＴの欠如を特徴とする。ＦＵＴ８ノックアウト宿主細胞系は、フコシル化欠損であり、脱フコシル化された抗体を産生する。宿主細胞系におけるＧｎＴＩＩＩの過剰発現（例えば、Ｒｏｃｈｅ社によるＧｌｙｃａｒｔ技術を参照）は、抗体の分割されたフコシル化されていないグリコシル化形態の形成をもたらす。ＲＭＤの発現（例えば、ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧ社のＧｌｙｍａｘＸ（登録商標）系で見られるような）は、フコースデノボ生合成を阻害して、結果として、かかる宿主細胞系によって生成される抗体もまた、フコシル化の低減を示す。ＣＨＯ細胞系におけるＧＦＴノックアウト（例えば、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍａｂｗｏｒｋｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ社による技術を参照）は、フコースデノボ生合成経路およびフコースサルベージ生合成経路の両方を阻止して、フコシル化の低減をもたらす。
【0146】
[000170]宿主細胞は、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体産生用の上述の発現またはクローニングベクターで形質転換されて、必要に応じてプロモーターを導入するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するように修飾された従来の栄養培地中で培養される。別の実施形態において、抗体は、当該技術分野において既知の相同組換えによって産生され得る。
【0147】
[000171]本明細書で提供される抗体を産生するのに使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ社）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ社）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社）等の市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５同；または同第５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；または米国特許再発行第３０，９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞用の培養培地として使用され得る。これらの培地はいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬）、微量元素（ミリモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源で補充されてもよい。任意の他の必要なサプリメントもまた、当業者に既知の適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現に関して選択される宿主細胞を用いる場合にこれまで使用されたものであり、当業者に明らかである。
【0148】
[000172]組換え技法を使用する場合、抗体は、細胞内で、細胞周辺腔で産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１の工程として、宿主細胞または溶解された断片のいずれかの粒子状細片が、例えば遠心分離または超遠心分離によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３～１６７頁（１９９２年）は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順について記載している。簡潔に述べると、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍される。細胞細片は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は概して、まず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ超遠心分離ユニットを使用して濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤が先述の工程のいずれかにおいて含まれてもよく、不定の汚染菌の成長を防止するために、抗生物質が含まれてもよい。
【0149】
[000173]細胞から調製される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ－セルロースイオン交換クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム沈殿、塩析、およびアフィニティクロマトグラフィを使用して精製することができ、アフィニティクロマトグラフィが、好ましい精製技法である。
【0150】
[000174]ある特定の実施形態において、固相上に固定化されたプロテインＡは、抗体およびその抗原結合断片の免疫親和性精製に使用される。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトガンマ１、ガンマ２、またはガンマ４重鎖に基づく抗体を精製するのに使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１～１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプに、およびヒトガンマ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７ １５７５頁（１９８６年））。親和性リガンドが結合されるマトリックスは、最も多くの場合アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。制御多孔質ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて達成され得るより迅速な流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社、フィリップスバーグ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィ、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィ、等電点電気泳動（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿等のタンパク質精製に関する他の技法もまた、回収されるべき抗体に応じて利用可能である。
【0151】
[000175]任意の予備精製工程（複数可）後に、目的の抗体および汚染物を含む混合物は、約２．５～４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに付されてもよく、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０～０．０２５Ｍの塩）で実施され得る。
【0152】
[000176]医薬組成物
[000177]本開示はさらに、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体および１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
[000177]本開示はさらに、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体および１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【0153】
[000178]本明細書に開示される医薬組成物における使用のための薬学的に許容可能な担体として、例えば、薬学的に許容可能な液体、ゲル、または固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張剤、緩衝液、酸化防止剤、麻酔薬、懸濁化／分散剤、封鎖またはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または無毒性補助物質、当該技術分野で既知の他の構成成分、またはそれらの各種組合せが挙げられ得る。
【0154】
[000179]適切な構成成分として、例えば、酸化防止剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝液、防腐剤、潤滑剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤または糖およびシクロデキストリン等の安定剤が挙げられ得る。適切な酸化防止剤として、例えば、メチオニン、アルコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、および／または没食子酸プロピルが挙げられ得る。本明細書に開示される場合、本明細書で提供されるような抗体または抗原結合断片およびコンジュゲートを含む組成物中にメチオニン等の１つまたは複数の酸化防止剤を含むことにより、抗体または抗原結合断片の酸化が減少される。この酸化の低減は、結合親和性の損失を防止または低減して、それにより抗体安定性を改善し、品質保持期限を最大限にする。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書に開示されるような１つまたは複数の抗体およびメチオニン等の１つまたは複数の酸化防止剤を含む組成物が提供される。さらに、抗体または抗原結合断片を、１つまたは複数の、メチオニン等の酸化防止剤と混合することによって、本明細書で提供されるような抗体または抗原結合断片の酸化防止する方法、本明細書で提供されるような抗体または抗原結合断片の品質保持期限を延ばす方法、および／または本明細書で提供されるような抗体または抗原結合断片の有効性を改善する方法が提供される。
【0155】
[000180]さらに説明するために、薬学的に許容可能な担体として、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、等張性デキストロース注射、滅菌水注射、またはデキストロースおよび乳酸化リンゲル注射等の水性ビヒクル、植物由来の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油、または落花生油等の非水性ビヒクル、静菌または静真菌濃度の抗菌剤、塩化ナトリウムまたはデキストロース等の等張剤、リン酸またはクエン酸緩衝液等の緩衝液、重硫酸ナトリウム等の酸化防止剤、プロカイン塩酸塩等の局所麻酔薬、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン等の懸濁化剤および分散剤、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０（ＴＷＥＥＮ－８０）等の乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）もしくはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）等の封鎖剤またはキレート剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸が挙げられ得る。フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンズアルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む担体として利用される抗菌剤は、複数回投薬容器中で医薬組成物に添加され得る。適切な賦形剤として、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールが挙げられ得る。適切な無毒性補助物質として、例えば、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解度増強薬、または酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、またはシクロデキストリン等の作用物質が挙げられ得る。
【0156】
[000181]医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、丸剤、カプセル、錠剤、徐放製剤、または粉末であり得る。経口製剤として、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等の医薬品グレード等の標準的な担体が挙げられ得る。
【0157】
[000182]ある特定の実施形態において、医薬組成物は、注射可能組成物に製剤化される。注射可能な医薬組成物は、例えば液体溶液、懸濁液、エマルジョン、または液体溶液、懸濁液、もしくはエマルジョンを生成するのに適した固体形態等の任意の従来の形態で調製され得る。注射用の調製物として、即注射可能な滅菌および／または非発熱性溶液、皮下錠剤を含む使用直前に溶媒と即組み合わせられる凍結乾燥粉末等の滅菌乾燥可溶性生成物、即注射可能な滅菌懸濁液、使用直前にビヒクルと即組み合わせられる滅菌乾燥不溶性生成物、ならびに滅菌および／または非発熱性エマルジョンが挙げられ得る。溶液は、水性または非水性のいずれかであり得る。
【0158】
[000183]ある特定の実施形態において、単位用量の非経口調製物は、アンプル、バイアルまたは針付きのシリンジ中に包装される。当該技術分野で既知であり、また実践されているように、非経口投与用の調製物は全て、滅菌かつ非発熱性であるべきである。
【0159】
[000184]ある特定の実施形態において、滅菌凍結乾燥粉末は、本明細書に開示されるような抗体または抗原結合断片を適切な溶媒中に溶解させることによって調製される。溶媒は、粉末もしくは粉末から調製される再構成溶液の安定性または他の薬理学的構成要素を改善する賦形剤を含有し得る。使用され得る賦形剤として、水、デキストロース、ソルビタル、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の適切な作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒は、一実施形態においてほぼ中性ｐＨの、クエン酸塩、リン酸ナトリウムもしくはカリウムまたは当業者に既知の他のかかる緩衝液等の緩衝液を含有し得る。続いて、当業者に既知の標準的条件下での溶液の滅菌ろ過、続く凍結乾燥により望ましい製剤が提供される。一実施形態において、得られた溶液は、凍結乾燥用のバイアルに分配される。各バイアルは、抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体またはその組成物の単回投与量または複数回投与量を含有し得る。用量または１組の用量に必要とされる量を上回る（例えば、約１０％）少量でバイアルを過充填することは、正確な試料引き抜きおよび正確な投薬を促進するために許容可能である。凍結乾燥粉末は、適切な条件下で、例えば約４℃～室温で保管され得る。
【0160】
[000185]凍結乾燥粉末の、注射用の水による再構成は、非経口投与における使用のための製剤を提供する。一実施形態において、再構成に関して、滅菌および／または非発熱性の水または他液体の適切な担体は、凍結乾燥粉末に添加される。正確な量は、施される選択された治療法に依存し、経験的に決定され得る。
【0161】
[000186]使用方法
[000187]本開示は、治療有効量の本明細書で提供されるような抗体または抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与し、それによりＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連状態または障害を処置または防止する工程を含む治療方法を提供する。一部の実施形態において、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連状態または障害は癌であり、任意選択で、癌は、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂを発現または過剰発現することを特徴とする。
[000187]本開示は、治療有効量の本明細書で提供されるような抗体または抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与し、それによりＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連状態または障害を処置または防止する工程を含む治療方法を提供する。一部の実施形態において、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連状態または障害は癌であり、任意選択で、癌は、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂを発現または過剰発現することを特徴とする。
【0162】
[000188]癌の例として、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、肺癌（小細胞または非小細胞）、結腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、食道癌、肝細胞癌（肝癌）、腎細胞癌（腎癌）、頭頸部癌、中皮腫、黒色腫、肉腫、および脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫等の神経膠腫）、および血液学的悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【0163】
[000189]一部の実施形態において、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連状態または障害は、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂを発現または過剰発現することを特徴とする癌である。
【0164】
[000190]ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ発現または過剰発現は、診断または予後アッセイにおいて、対象由来の生物学的試料（例えば、癌細胞もしくは組織、または腫瘍浸潤免疫細胞に由来する試料）中のＦＧＦＲのレベルの増加を評価することによって決定され得る。各種方法が使用され得る。例えば、診断または予後アッセイは、細胞の表面上に存在するＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの発現レベルを評価するのに使用され得る（例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣを介して）。あるいは、またはさらに、例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、１９９８年１０月に公開された国際公開第９８／４５４７９号を参照）、サザンブロッティング、またはリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２：７３～８０頁（１９９０年））技法を介して、細胞中のＦＧＦＲコード核酸のレベルを測定し得る。上記アッセイの他に、各種ｉｎ ｖｉｖｏアッセイが当業者に利用可能である。例えば、患者の体内の細胞を、検出可能標識、例えば放射性同位元素で任意選択に標識される抗体に曝露させてもよく、抗体の、患者における細胞への結合は、例えば放射能に関して外部スキャンすることによって、または抗体に予め曝露された患者から採取したバイオプシーを分析することによって評価することができる。
【0165】
[000191]治療有効量の本明細書で提供されるような抗体または抗原結合断片は、例えば対象の体重、年齢、既往歴、現在の薬物療法、健康状態ならびに交差反応、アレルギー、感受性および有害な副作用の可能性、ならびに投与経路および疾患発症の程度等の当該技術分野で既知の各種要因に依存する。投与量は、これらのおよび他の状況または要件によって示されるように当業者（例えば、医師または獣医）によって比例的に低減または増加され得る。
【0166】
[000192]ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるような抗体または抗原結合断片は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの治療有効投与量で投与され得る。これらの実施形態の幾つかにおいて、抗体または抗原結合断片は、約５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の投与量で投与され、これらの実施形態の幾つかにおいて、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、５ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、３ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、１ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、０．５ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、または０．１ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満である。ある特定の実施形態において、投与の投与量は、処置の間に変化し得る。例えば、ある特定の実施形態において、初期投与の投与量は、続く投与の投与量よりも高い場合がある。ある特定の実施形態において、投与の投与量は、対象の反応に応じた処置の間にわたって変動し得る。
【0167】
[000193]投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するよう調整され得る。例えば、単回用量が投与されてもよく、または幾つかの分割用量が、時間をかけて投与されてもよい。
【0168】
[000194]本明細書に開示される抗体は、例えば非経口（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注入を含む静脈内注射、筋内注射または皮内注射）または非経口でない（例えば、経口、鼻腔内、眼内、舌下、直腸または局所）経路等の当該技術分野で既知の任意の経路によって投与され得る。
【0169】
[000195]幾つかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、単独で、または１つもしくは複数のさらなる治療手段もしくは治療剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書に開示される抗体は、別の治療剤、例えば化学療法剤または抗癌薬と組み合わせて投与され得る。
【0170】
[000196]これらの実施形態の幾つかにおいて、１つまたは複数のさらなる治療剤と組み合わせて投与される本明細書に開示されるような抗体または抗原結合断片は、１つまたは複数のさらなる治療剤と同時に投与されてもよく、これらの実施形態の幾つかにおいて、抗体または抗原結合断片およびさらなる治療剤（複数可）は、同じ医薬組成物の一部として投与されてもよい。しかしながら、別の治療剤と「組み合わせて」投与される抗体または抗原結合断片は、剤と同時に、または剤と同じ組成物中で投与される必要はない。別の剤の前または後に投与される抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片および第２の剤が異なる経路を介して投与される場合でも、その語句が本明細書で使用される場合、当該剤と「組み合わせて」投与されるとみなされる。可能であれば、本明細書に開示される抗体と組み合わせて投与されるさらなる治療剤は、さらなる治療剤の製品情報シートに列挙されるスケジュールに従って、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５７版；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ社；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；第５７版（２００２年１１月））または当該技術分野で周知のプロトコールに従って投与される。
【0171】
[000197]本開示は、さらに抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体を使用する方法を提供する。
[000198]一部の実施形態において、本開示は、試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を検出する方法であって、試料を抗体と接触させる工程と、試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程とを含む、方法を提供する。
[000198]一部の実施形態において、本開示は、試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を検出する方法であって、試料を抗体と接触させる工程と、試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程とを含む、方法を提供する。
【0172】
[000199]一部の実施形態において、本開示は、対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ－１ｂ関連疾患または状態を診断する方法であって、ａ）対象から得られる試料を、本明細書で提供される抗体と接触させる工程と、ｂ）試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程と、ｃ）ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を、対象におけるＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態の実在または状況と相関させる工程とを含む方法を提供する。
【0173】
[000200]一部の実施形態において、本開示は、対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を予後判定する方法であって、ａ）対象から得られる試料を、本明細書で提供される抗体と接触させる工程と、ｂ）試料中のＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を決定する工程と、ｃ）ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂの存在または量を、対象の、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂアンタゴニストに対する潜在的応答性と相関させる工程とを含む、方法を提供する。
【0174】
[000201]一部の実施形態において、本開示は、任意選択で検出可能な部分とコンジュゲートされた、本明細書で提供される抗体を含むキットを提供する。キットは、ＦＧＦＲ２ｂおよび／もしくはＦＧＦＲ１ｂの検出またはＦＧＦＲ２ｂおよび／もしくはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患の診断に有用であり得る。
【0175】
[000202]一部の実施形態において、本開示は、対象においてＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ発現の調節から利益を受ける疾患または状態を処置するための薬剤の製造における、ＦＧＦＲ２ｂおよび／またはＦＧＦＲ１ｂ関連疾患または状態を診断／予後判定するための診断／予後試薬の製造における、本明細書で提供される抗体の使用を提供する。
【0176】
[000203]下記の実施例は、特許請求される本発明をより良好に説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。以下で記載される特定の組成物、材料、および方法は全て、全体的にまたは部分的に、本発明の範囲の範疇に収まる。これらの特定の組成物、材料、および方法は、本発明を限定すると意図されず、単に本発明の範囲の範疇に収まる特定の実施形態を説明するに過ぎない。当業者は、本発明能力を行使せずに、また本発明の範囲を逸脱することなく、等価な組成物、材料、および方法を開発し得る。依然として本発明の限界内に留まりながら、本明細書に記載される手順において多くの変形が成され得ることを理解されよう。かかる変形が本発明の範囲内に包含されることは、本発明者らの意向である。
【実施例】
【0177】
実施例１
細胞および試薬
[000204]ＦＧＦＲ２ｂ発現を伴うヒト胃癌細胞系ＫＡＴＯ ＩＩＩおよびＳＮＵ１６、ならびにＢａ／Ｆ３細胞（プレＢリンパ球）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ヒト食道癌細胞系ＫＹＳＥ１８０は、北京大学から寄贈された。上述のヒト細胞系は、供給元の推奨に従って培養した。ヒト腫瘍組織は、規則に沿って患者の同意を得てＺｈｏｎｇｓｈａｎ病院（中国）から入手し、ヒト肺癌患者由来の異種移植片モデルＬＣ０３８を開発するのに使用した。
細胞および試薬
[000204]ＦＧＦＲ２ｂ発現を伴うヒト胃癌細胞系ＫＡＴＯ ＩＩＩおよびＳＮＵ１６、ならびにＢａ／Ｆ３細胞（プレＢリンパ球）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ヒト食道癌細胞系ＫＹＳＥ１８０は、北京大学から寄贈された。上述のヒト細胞系は、供給元の推奨に従って培養した。ヒト腫瘍組織は、規則に沿って患者の同意を得てＺｈｏｎｇｓｈａｎ病院（中国）から入手し、ヒト肺癌患者由来の異種移植片モデルＬＣ０３８を開発するのに使用した。
【0178】
[000205]抗体生成期間中の抗体スクリーニング用の細胞ベースのアッセイを樹立するために、Ｂａ／Ｆ３細胞を、ＦＧＦＲ２ｂまたはＦＧＦＲ２ｃを発現するよう操作した。Ｂａ／Ｆ３細胞を、ヒトＦＧＦＲ２の２ｂまたは２ｃアイソフォームをコードするプラスミドでトランスフェクトした。Ｇ４１８による選択後に、ＦＧＦＲ２ｂまたはＦＧＦＲ２ｃの高い発現を有する単一クローンを単離した。
【0179】
[000206]ヒトＦＧＦＲ２ｂのベータ－アイソフォーム（ＩｇＤ２およびＩｇＤ３ドメイン）を、ＤＮＡプラスミドにおいてＦＧＦＲ２ｂの細胞外ドメイン（「ＥＣＤドメイン」）残基６５～２６７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１３８３９１）をヒトＦｃ領域（残基１００～３３０）に融合することによって免疫接着分子として発現させた。タンパク質は、ヒト２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をトランスフェクトすることによって発現させて、プロテインＡ／Ｇカラムを使用して培養培地から精製した。
【0180】
[000207]カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＦＧＦＲ２ｂ ＥＣＤドメインのｃＤＮＡを標準的な技法によってｃｙｎｏ皮膚ｍＲＮＡからクローニングして、アミノ酸１～２５３をマウスＦｃに融合して、発現用のｃｙｎｏ ＦＧＦＲ２ｂ－Ｆｃを創出した。マウスＦｃと融合させたヒト（ｈｕ）ＦＧＦＲ２ｂ（ＮＰ＿００１１３８３９１の６５～２６７）またはラットＦＧＦＲ２ｂ（ＮＰ＿００１１０３３６３．１の５６～３０８）のＥＣＤドメイン残基もまた発現させた。ラットおよびマウスＦＧＦＲ２ｂ ＥＣＤは同一である。
【0181】
[000208]組換えＦＧＦＲ１ｂ－Ｆｃ、ＦＧＦＲ１ｃ－Ｆｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ１ｃ－Ｆｃ、ＦＧＦＲ３ｂ－Ｆｃ、ＦＧＦＲ３ｃ－ＦｃおよびＦＧＦＲ４－Ｆｃタンパク質を含む他のヒトＦＧＦＲファミリーメンバーのヒトＦｃ融合タンパク質は全て、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。ＦＧＦＲ２ｂ－Ｆｃのアルファ－アイソフォーム、ＦＧＦもまたＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。ヘパリンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した（Ｓｉｇｍａ社、＃Ｈ３１４９－５００ＫＵ－９）。ＰＢＭＣは、ＡｌｌＣｅｌｌ社から購入した（＃ＬＰ１８０３２２）。
【0182】
[000209]臨床病期抗ヒトＦＧＦＲ２ｂ特異的抗体ＦＰＡ１４４は、関連特許出願である国際公開第２０１５／０１７６００ Ａ１号に従って発現させた。
実施例２
抗ＦＧＦＲモノクローナルＡｂの生成
[000210]Ｂａｌｂ／ｃマウスまたはＳＪＬマウスを、ＣＦＡ／ＩＦＡにおいてヒトＦＧＦＲ２ｂ（ベータ）－Ｆｃで、初期用量５０μｇ／マウス、続く２５μｇ／マウスで、または初期用量１０μｇ／マウス、続く５μｇ／マウスにて腹腔内で免疫化した。ヒトＦＧＦＲ２ｂ－ＦｃまたはヒトＦＧＦＲ２ｃ－Ｆｃに対する血清力価をＥＬＩＳＡによって決定した。最終的な注射の４日後に、膝窩リンパ系細胞を抽出して、マウス骨髄腫細胞と融合させた。融合の１０日後、ハイブリドーマ培養物上清を、ＥＬＩＳＡによって、まずＦＧＦＲ２ｂ（ベータ）－Ｆｃ対ＮＣ－Ｆｃ（陰性対照としてのＦｃ断片）結合に関してスクリーニングした。ＦＧＦＲ２ｂ（ベータ）－Ｆｃに結合するが、ＮＣ－Ｆｃに結合しない抗体を有するハイブリドーマを選択した。一次スクリーニングを通過したハイブリドーマを、ＦＡＣＳによるＢａＦ３／ＦＧＦＲ－２ｂ細胞およびＢａＦ３／ＦＧＦＲ－２ｃへの結合、ＦＧＦリガンド結合の遮断、および細胞死滅を含む二次スクリーニングパネルに付した。Ａｂ２１と称されるクローンを含む幾つかの陽性クローンをこのようにして選択した。これらの選択されたクローンによって産生されるモノクローナル抗体のアイソタイプを、アイソタイプ特異的な抗体を使用して決定した。
実施例２
抗ＦＧＦＲモノクローナルＡｂの生成
[000210]Ｂａｌｂ／ｃマウスまたはＳＪＬマウスを、ＣＦＡ／ＩＦＡにおいてヒトＦＧＦＲ２ｂ（ベータ）－Ｆｃで、初期用量５０μｇ／マウス、続く２５μｇ／マウスで、または初期用量１０μｇ／マウス、続く５μｇ／マウスにて腹腔内で免疫化した。ヒトＦＧＦＲ２ｂ－ＦｃまたはヒトＦＧＦＲ２ｃ－Ｆｃに対する血清力価をＥＬＩＳＡによって決定した。最終的な注射の４日後に、膝窩リンパ系細胞を抽出して、マウス骨髄腫細胞と融合させた。融合の１０日後、ハイブリドーマ培養物上清を、ＥＬＩＳＡによって、まずＦＧＦＲ２ｂ（ベータ）－Ｆｃ対ＮＣ－Ｆｃ（陰性対照としてのＦｃ断片）結合に関してスクリーニングした。ＦＧＦＲ２ｂ（ベータ）－Ｆｃに結合するが、ＮＣ－Ｆｃに結合しない抗体を有するハイブリドーマを選択した。一次スクリーニングを通過したハイブリドーマを、ＦＡＣＳによるＢａＦ３／ＦＧＦＲ－２ｂ細胞およびＢａＦ３／ＦＧＦＲ－２ｃへの結合、ＦＧＦリガンド結合の遮断、および細胞死滅を含む二次スクリーニングパネルに付した。Ａｂ２１と称されるクローンを含む幾つかの陽性クローンをこのようにして選択した。これらの選択されたクローンによって産生されるモノクローナル抗体のアイソタイプを、アイソタイプ特異的な抗体を使用して決定した。
【0183】
実施例３
Ａｂ ２１のヒト化
[000211]Ａｂ ２１の重鎖および軽鎖可変（ＶＨ、ＶＬ）領域配列を、標準的なＲＡＣＥ技術を使用して決定した。総ＲＮＡを、選択されたハイブリドーマ細胞系から抽出した。続いて、５’末端を含有する完全長の第１鎖ｃＤＮＡを、製造業者の指示書に従ってＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、パロアルト、ＣＡ）またはＧｅｎｅ Ｒａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して生成して、ＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物を単離して、精製した後、ＴＡクローニングして、配列決定した。
Ａｂ ２１のヒト化
[000211]Ａｂ ２１の重鎖および軽鎖可変（ＶＨ、ＶＬ）領域配列を、標準的なＲＡＣＥ技術を使用して決定した。総ＲＮＡを、選択されたハイブリドーマ細胞系から抽出した。続いて、５’末端を含有する完全長の第１鎖ｃＤＮＡを、製造業者の指示書に従ってＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、パロアルト、ＣＡ）またはＧｅｎｅ Ｒａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して生成して、ＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物を単離して、精製した後、ＴＡクローニングして、配列決定した。
【0184】
[000212]次に、キメラ抗体Ａｂ ２１ｃを、マウスＡｂ ２１のＶＨおよびＶＬをヒトＦｃにグラフトすることによって生成した。そして、分子生物学の標準的な方法を使用して、Ａｂ ２１のヒト化を設計、構築および発現した。簡潔に述べると、マウスＡｂ ２１のＣＤＲをヒトアクセプターフレームワークにグラフトした。続いて、コンピューターモデルがＣＤＲとの著しい接触を示唆するフレームワーク位置で、マウス抗体由来のアミノ酸残基を、ヒトフレームワークアミノ酸残基に代わって置換した（Ｋａｂａｔナンバリングを使用した重鎖のＭ６９Ｌ、Ａ９３ＴおよびＲ９４Ｓを含み、軽鎖では置換されていない）。これにより、Ａｂ ｈｕ２１－２１と呼ばれるＡｂ ２１のヒト化抗体が提供された。Ａｂ ｈｕ２１－２１の重鎖のＣＤＲ２におけるアミノ酸Ａｓｎ－Ｇｌｙ（ＮＧ）を、アミノ酸Ａｓｎ－Ａｒｇ（ＮＲ）でさらに置換して、Ａｂ ｈｕ２１－２６と呼ばれる変異体を提供した。Ａｂ２１、Ａｂ ２１ｃ、Ａｂ ｈｕ２１－２１、およびＡｂ ｈｕ２１－２６のＣＤＲ領域配列および可変領域配列の重鎖および／または軽鎖を、上述の表１～表３に示す。
【0185】
[000213]ヒトＩｇＧ１を有する全成熟Ａｂ ｈｕ２１－２６軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を図１に示す。
実施例４
Ａｂ ｈｕ２１－２６の脱フコシル化およびグリカン分析
[000214]Ａｂ ｈｕ２１－２６の脱フコシル化されたバージョン（「ａｆｈｕ２１－２６」と呼ばれる、ここで接頭辞「ａｆ」は「脱フコシル化された」の省略である）を生成するために、１，６－フコシルトランスフェラーゼノックアウト（ＦＵＴ８－／－）ＣＨＯＫ１細胞（Ｗｕｘｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、中国、上海）を宿主細胞系として使用して、フコースを含まない抗体（即ち、脱フコシル化された抗体）を産生した。ヒトＩｇＧ１定常Ｆｃを有するＡｂ ｈｕ２１－２６モノクローナル抗体の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをＦＵＴ８－／－ＣＨＯＫ１に一過的にトランスフェクトして、脱フコシル化された抗体を産生した。
実施例４
Ａｂ ｈｕ２１－２６の脱フコシル化およびグリカン分析
[000214]Ａｂ ｈｕ２１－２６の脱フコシル化されたバージョン（「ａｆｈｕ２１－２６」と呼ばれる、ここで接頭辞「ａｆ」は「脱フコシル化された」の省略である）を生成するために、１，６－フコシルトランスフェラーゼノックアウト（ＦＵＴ８－／－）ＣＨＯＫ１細胞（Ｗｕｘｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、中国、上海）を宿主細胞系として使用して、フコースを含まない抗体（即ち、脱フコシル化された抗体）を産生した。ヒトＩｇＧ１定常Ｆｃを有するＡｂ ｈｕ２１－２６モノクローナル抗体の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをＦＵＴ８－／－ＣＨＯＫ１に一過的にトランスフェクトして、脱フコシル化された抗体を産生した。
【0186】
[000215]ａｆｈｕ２１－２６をプロテインＡおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣによって精製し、透析して、製剤緩衝液に交換し、－８０℃で保管した。
[000216]産生したａｆｈｕ２１－２６のグリカン分析を、ＬＣ－ＭＳを使用して実施した。簡潔に述べると、１０μＬ中の抗体１０μｇを、１２ユニット／μＬのＩｄｅＳ酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ ＡＢ社）１μＬで、３７℃にて１時間消化した後、８Ｍ 塩酸グアニジン３７．５μＬ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ２．５μＬ、および１Ｍ ＤＴＴ １μＬを順次添加して、混合して、１０～３０℃で３０分間インキュベートした。完全に還元した抗体を逆相ＨＰＬＣ法によって分離した。続いて、グリカンプロファイルをＬＣ－ＭＳを使用して分析した。各ピークの質量を決定して、各グリカンを同定するのに使用し、結果を以下の表４に示した。
[000216]産生したａｆｈｕ２１－２６のグリカン分析を、ＬＣ－ＭＳを使用して実施した。簡潔に述べると、１０μＬ中の抗体１０μｇを、１２ユニット／μＬのＩｄｅＳ酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ ＡＢ社）１μＬで、３７℃にて１時間消化した後、８Ｍ 塩酸グアニジン３７．５μＬ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ２．５μＬ、および１Ｍ ＤＴＴ １μＬを順次添加して、混合して、１０～３０℃で３０分間インキュベートした。完全に還元した抗体を逆相ＨＰＬＣ法によって分離した。続いて、グリカンプロファイルをＬＣ－ＭＳを使用して分析した。各ピークの質量を決定して、各グリカンを同定するのに使用し、結果を以下の表４に示した。
【0187】
[000217]
【0188】
【表4】
【0189】
[000218]結果により、表５に示されるようにＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆは検出不可能であり、抗体はほぼ１００％脱フコシル化されていることが実証された。
[000219]
[000219]
【0190】
【表5】
【0191】
実施例５
抗体の結合特性
[000220]抗体の、ヒトＦＧＦＲ２ｂまたはヒトＦＧＦＲ１ｂ抗原への結合を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ社）によって決定した。簡潔に述べると、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をまず、５０ｍＭ Ｎ－ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）：２００ｍＭ ＥＣＤドメインの１：１の新鮮な混合物の４分の注射によって活性化させた。次に、ｈＦＧＦＲ２ｂ－ＦｃまたはｈＦＧＦＲ１ｂ－Ｆｃを、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）およびブロック試薬として１Ｍエタノールアミンを使用して、活性化したＣＭ５センターチップに固定化した。約２０～３０レスポンス単位（ＲＵ、１ＲＵは、１平方ミリメートル当たりタンパク質１ｐｇの結合を表す）の抗原タンパク質を捕捉した。
抗体の結合特性
[000220]抗体の、ヒトＦＧＦＲ２ｂまたはヒトＦＧＦＲ１ｂ抗原への結合を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ社）によって決定した。簡潔に述べると、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をまず、５０ｍＭ Ｎ－ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）：２００ｍＭ ＥＣＤドメインの１：１の新鮮な混合物の４分の注射によって活性化させた。次に、ｈＦＧＦＲ２ｂ－ＦｃまたはｈＦＧＦＲ１ｂ－Ｆｃを、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）およびブロック試薬として１Ｍエタノールアミンを使用して、活性化したＣＭ５センターチップに固定化した。約２０～３０レスポンス単位（ＲＵ、１ＲＵは、１平方ミリメートル当たりタンパク質１ｐｇの結合を表す）の抗原タンパク質を捕捉した。
【0192】
[000221]抗体をＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中に希釈して、一連の濃度（０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、１５０、２００ｎＭ）で注射して、ＣＭ５センサーチップの表面再生が、各ランニングサイクルに含まれた。結合定数、解離定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン１．０）を用いて算出した。図２に示されるように、Ａｂ ２１ｃ（キメラ）およびそのヒト化変異体Ａｂ ｈｕ２１－２１およびＡｂ ｈｕ２１－２６は、２２０～４８９ｐＭの範囲のＫＤ値でヒトＦＧＦＲ２ｂに対して強力な結合親和性を示し、これは、陽性対照として使用される抗体ＦＰＡ１４４よりも良好である。さらに、Ａｂ ２１ｃは、ＦＧＦＲ１ｂ結合に関して抗体ＦＰＡ１４４と区別される。Ａｂ ２１ｃは、抗体ＦＰＡ１４４の、ＫＤ値２２５ｎＭでのヒトＦＧＦＲ１ｂへの非常に弱い結合と比較して、ヒトＦＧＦＲ１ｂにＫＤ値３．６９ｎＭで強力に結合する。Ａｂ ２１ｃと同様に、Ａｂ ｈｕ２１－２１およびＡｂ ｈｕ２１－２６はともに、同様にヒトＦＧＦＲ１ｂへの特異的結合を示した（データは示していない）。
【0193】
[000222]選択した抗体が、細胞膜上のＦＧＦＲ２ｂの内因性形態に結合することができることを確認するために、ＦＧＦＲ２ｂを発現するＫＡＴＯＩＩＩ細胞を使用して、フローサイトメトリーを実施した。抗体は全て、１０％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ社 ＃０１７－０００－１２１）を有するＰＢＳ緩衝液中で調製した。５００，０００個のＫＡＴＯＩＩＩ細胞を種々の濃度の抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体１００μｌとともに、４℃で６０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄して、１０μｇ／ｍｌの二次ＩｇＧ－ＡＬｅｘａ４８８抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ社 ＃７０９５４６１４９）１００μｌ中で、４℃で暗所にて３０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄して、洗浄緩衝液を用いて再懸濁させて、フローサイトメーターで分析した。ＦＡＣＳデータにより、Ａｂ ２１ｃは、図３に示されるように、ＥＣ５０値およそ８ｎＭでＫＡＴＯＩＩＩ細胞に強力に結合することが明らかに示された。Ａｂ ２１ｃと同様に、Ａｂ ｈｕ２１－２１およびＡｂ ｈｕ２１－２６はともに、同様にＫＡＴＯＩＩＩ細胞への特異的結合を示した（データは示していない）。
【0194】
[000223]Ａｂ ２１ｃの、組換えｃｙｎｏ、ラット／マウス、およびヒトＦＧＦＲ２ｂ－Ｆｃ融合タンパク質への種間結合を、ＥＬＩＳＡを用いて行った。簡潔に述べると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中で０．１μｇ／ｍｌの組換えヒトＦＧＦＲ２ｂ－Ｆｃ、組換えラット／マウスＦＧＦＲ２ｂ－Ｆｃ、または組換えｃｙｎｏＦＧＦＲ２ｂ－Ｆｃタンパク質約１００μｌ／ウェルを用いて一晩コーティングした。次に、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ中の２％ＢＳＡ中でブロックして、抗体試料とともに室温で６０分間インキュベーションして、続いて１×ＴＢＳＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、＃９９９７）中で２回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲートとともに室温で６０分間インキュベーションした。ＨＲＰ活性を、テトラメチルベンジジン基質（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、＃７００４）を用いて検出して、反応は、停止溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、＃７００２）を用いて停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。図４に示されるように、異なる種のＦＧＦＲ２ｂへのＡｂ ２１ｃに関する結合ＥＣ５０において著しい差は見られない。Ａｂ ２１ｃは、ラット／マウスＦＧＦＲ２ｂに対して最も高い結合親和性を有し、続いてヒトＦＧＦＲ２ｂ、次にｃｙｎｏＦＧＦＲ２ｂと続く。Ａｂ ２１ｃと同様に、Ａｂ ｈｕ２１－２１およびＡｂ ｈｕ２１－２６はともに、同様に種々の種のＦＧＦＲ２ｂへの特異的結合を示した（データは示していない）。
【0195】
[000224]同様に、Ａｂ ２１の、様々なＦＧＦＲファミリーメンバーであるＦＧＦＲ１ｂ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ３ｂ、ＦＧＦＲ４との結合特異性を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて特性化した。データを図５に示す。ＥＬＩＳＡ分析の結果に従って、Ａｂ ２１は、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂに特異的に結合し、これは、図２に示されるデータと一致しており、Ａｂ ２１は、任意の他のＦＧＦＲファミリーメンバーには結合しない。Ａｂ ２１ｃと同様に、Ａｂ ｈｕ２１－２１およびＡｂ ｈｕ２１－２６はともに、ＥＬＩＳＡ分析において、同様にＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ１ｂへの特異的結合を示したが、任意の他のＦＧＦＲファミリーメンバーへの特異的結合は示さなかった（データは示していない）。
【0196】
実施例６
ｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害活性
[000225]リガンド誘導性細胞増殖に対する抗体の阻害活性を、ＦＧＦＲ２ｂ操作Ｂａ／Ｆ３細胞クローン（Ｂａ／Ｆ３－ＦＧＦＲ２ｂ）において実行した。細胞を、ヘパリン（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で１０％ウシ胎児血清および組換えヒトＦＧＦタンパク質（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で３０，０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。一晩のインキュベーション後、種々の濃度の抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体をアッセイプレートに添加して、さらに７２時間インキュベートした。７２時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬２０μｌを各ウェルに添加して、プレートを室温で２時間インキュベートした。吸光度を測定するために、１０％ＳＤＳ ２５μｌを各ウェルに添加して、反応を停止させた。Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ ２０Ｍで、４９０ｎｍおよび６５０ｎｍ（参照波長）にて吸光度を測定した。Ａｂ ２１ｃは、ＧＩ５０約１０ｎＭで、ＦＧＦ７誘導性ＢａＦ３細胞増殖を強力に阻害することができる。Ａｂ－２１ｃのこの阻害活性データを、Ｐｒｉｓｍを使用して処理して、図６にグラフを示した。Ａｂ ２１ｃと同様に、Ａｂ ｈｕ２１－２１およびＡｂ ｈｕ２１－２６はともに、同様にＦＧＦ７誘導性ＢａＦ３細胞増殖の強力な阻害を示した（データは示していない）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害活性
[000225]リガンド誘導性細胞増殖に対する抗体の阻害活性を、ＦＧＦＲ２ｂ操作Ｂａ／Ｆ３細胞クローン（Ｂａ／Ｆ３－ＦＧＦＲ２ｂ）において実行した。細胞を、ヘパリン（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で１０％ウシ胎児血清および組換えヒトＦＧＦタンパク質（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で３０，０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。一晩のインキュベーション後、種々の濃度の抗ＦＧＦＲ２ｂ抗体をアッセイプレートに添加して、さらに７２時間インキュベートした。７２時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬２０μｌを各ウェルに添加して、プレートを室温で２時間インキュベートした。吸光度を測定するために、１０％ＳＤＳ ２５μｌを各ウェルに添加して、反応を停止させた。Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ ２０Ｍで、４９０ｎｍおよび６５０ｎｍ（参照波長）にて吸光度を測定した。Ａｂ ２１ｃは、ＧＩ５０約１０ｎＭで、ＦＧＦ７誘導性ＢａＦ３細胞増殖を強力に阻害することができる。Ａｂ－２１ｃのこの阻害活性データを、Ｐｒｉｓｍを使用して処理して、図６にグラフを示した。Ａｂ ２１ｃと同様に、Ａｂ ｈｕ２１－２１およびＡｂ ｈｕ２１－２６はともに、同様にＦＧＦ７誘導性ＢａＦ３細胞増殖の強力な阻害を示した（データは示していない）。
【0197】
[000226]抗体によるＦＧＦＲ２ｂシグナル伝達経路の阻害を検討した。ＳＮＵ１６細胞を、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地中で成長させ、続いて３０，０００個／ウェルで播種して、無血清ＲＰＭＩ／０．１％ＢＳＡ中で一晩飢餓させた。次に、細胞を、こすり取ることによって収集して、冷ＰＢＳ中で１回洗浄した後、２×ＳＤＳ溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、２０％グリセロールおよび１×プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ社））中に溶解した。続いて、溶解物を１００℃で１０分間沸騰させた。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）によって、タンパク質濃度を検出し、等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに負荷して、続いてタンパク質を、ｉＢｏｌｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してニトロセルロース膜に転写した後、それを、ＦＧＦＲ２およびその下流の遺伝子ＥＲＫのリン酸化に関するウェスタンブロッティング分析に付した。図７に示されるように、Ａｂ ２１ｃ処置は、ＳＮＵ１６細胞において用量依存的様式で、リン酸化ＦＧＦＲ２およびリン酸化ＥＲＫのダウンレギュレーションをもたらす。Ａｂ ２１ｃと同様に、Ａｂ ｈｕ２１－２１およびＡｂ ｈｕ２１－２６はともに、同様にリン酸化ＦＧＦＲ２およびリン酸化ＥＲＫのダウンレギュレーションを示した（データは示していない）。
【0198】
[000227]抗体の内部移行を共焦点顕微鏡法によって検出した。簡潔に述べると、共焦点顕微鏡法の当日に、細胞を、酵素を含まない解離溶液を使用して収集して、各チューブに関して５×１０５個の細胞の密度で調製した。細胞を洗浄して、ブロッキング緩衝液（１０％ロバ血清）１００μｌを用いて４℃で３０分間再懸濁した。次に、細胞を２回洗浄して、１０μｇ／ｍｌのＡｂ ２１の１００μｌとともに４℃で６０分間インキュベートした。細胞を洗浄して、バイアル中の複数のアリコートに分割して、そのうちの幾つかを４℃で保持して、残りのものを３７℃で保持した。指示した時点で、バイアルの１つを４℃から取り出して、またバイアルの１つを３７℃から取り出した。洗浄および再懸濁後、細胞を固定して、続いて１０％ロバ血清１００μｌでブロックした後、洗浄して、１０μｇ／ｍｌのロバ抗ヒトＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８とともに４℃で暗所にて３０分間インキュベーションした。細胞を洗浄および再懸濁して、細胞懸濁液５μｌをスライドガラス上に広げて（単層細胞を得る目的）、５５℃の高温面で乾かして、１×ＤＡＰＩ ５μｌで処置した後、カバーガラスで封着した。次に、共焦点画像を撮った。図８に示されるように、内部移行が起こり得ない４℃では、Ａｂ ２１は、細胞表面上で観察されるに過ぎない。内部移行を可能にする３７℃条件を２時間または４時間受けた後には、抗体は、細胞内で見出され（矢印で示した）、抗体内部移行が起きたことを示唆した。Ａｂ ２１と同様に、Ａｂ ２１ｃ、Ａｂ ｈｕ２１－２１およびＡｂ ｈｕ２１－２６は全て、同様に細胞において抗体内部移行を誘導した（データは示していない）。
【0199】
[000228]抗体のＡＤＣＣ活性を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施した。ＡＤＣＣアッセイは、エフェクター細胞としてＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＮＫ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社、＃１７９５５）によってヒトＰＢＭＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社、ＣＡＴ＃ＰＢ０００４Ｆ）から単離した原発性ＮＫ細胞を、エフェクター対標的（Ｅ／Ｔ）細胞比８：１で使用して実施した。ヒトＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ＋ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ＋ピルビン酸ナトリウム １ｍＭを含有するＲＰＭＩ１６４０中で解凍して、その翌日にＦＡＣＳアッセイを実行した。標的細胞ＫＡＴＯＩＩＩを細胞マーカーＣＦＳＥ－ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｃ３４５５４）で３０分間染色した後、エフェクターおよび抗体の存在下で３７℃にて５時間インキュベートした。次に、細胞を、生存度マーカーＶｉａｂｉｌｉｔｙ染色－ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢＤ社、＃５６５３８８）を用いて染色した。細胞傷害性溶解は、ＣＦＳＥ染色および生存度マーカー染色の両方に関して陽性である細胞をゲーティングすることによってＦＡＣＳにより決定した。データを図９に示した。ａｆｈｕ２１－２６は、Ａｂ ２１ｃと比較した場合に非常に良好なＡＤＣＣ活性を示し、脱フコシル化が、最大溶解パーセントおよびＥＣ５０の両方においてＡｂ ２１ｃのＡＤＣＣ活性を改善することを示した。類似した結果がまた、同様にａｆｈｕ２１－２１に関しても得られる。
【0200】
実施例７
腫瘍マウスモデルにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
[000229]免疫不全ヌードマウスをＶｉｔａＲｉｖｅｒ社から購入した。動物研究は全て、ＩＡＣＵＣによって認可され、内規および地方規制の要件に従って実施した。
腫瘍マウスモデルにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
[000229]免疫不全ヌードマウスをＶｉｔａＲｉｖｅｒ社から購入した。動物研究は全て、ＩＡＣＵＣによって認可され、内規および地方規制の要件に従って実施した。
【0201】
[000230]ＳＮＵ１６ヒト胃癌細胞系由来異種移植片（ＣＤＸ）マウスモデルを、まず細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養すること、次に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ／マウスと混合して１×１０７個の細胞／２００μｌでマウスの背面側腹部に細胞を皮下接種することによって樹立し、異種移植片腫瘍が３００～５００ｍｍ３のサイズに達したら、それらを切除して、同じサイズの断片に切断して、ヌードマウスの新たな群に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。ＬＣ０３８ヒト肺癌患者由来異種移植片（ＰＤＸ）マウスモデルを同様の様式で樹立した。簡潔に述べると、患者由来の外科的に取り出した組織（Ｆ０）を、同じサイズの断片に切断して、手術後２時間以内に免疫無防備状態のヌードマウスに皮下移植した（Ｆ１マウス）。異種移植片腫瘍が４００～６００ｍｍ３のサイズに達したら、それらを切除して、断片に切断して、継代培養のためにヌードマウスに移植し、それはＦ２であり、以下同様であった。
【0202】
[000231]腫瘍小結節を、キャリパーを用いて二次元で測定し、下記の式を使用して、腫瘍体積を算出した：腫瘍体積＝（長さ×幅２）×０．５２。腫瘍体積が１５０～２５０ｍｍ３に達したら、腫瘍保有マウスを処置群に無作為抽出した。続いて、マウスをアイソタイプ対照（即ち、ＩｇＧ１）または検査抗体（即ち、ＦＰＡ１４４、ａｆｈｕ２１－２６）のいずれかで、無作為抽出の翌日から週に１回／２回処置した。マウスの腫瘍体積および体重を週に２回測定し、生データを記録した。対照群と処置群との間の腫瘍体積の平均変化を比較することによって、処置の開始からの腫瘍成長阻害を評価した。計算は、各群における相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の幾何平均または算術平均に基づいた。ＲＴＶは、処置日の腫瘍体積を初期腫瘍体積で除算することによって算出した。
【0203】
[000232]ａｆｈｕ２１－２６または抗体ＦＰＡ１４４処置を用いたＳＮＵ１６細胞およびＬＣ０３８ ＰＤＸ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長曲線を、それぞれ図１０Ａおよび図１０Ｂに示した。両モデルにおいて、Ａｆｈｕ２１－２６は、抗体ＦＰＡ１４４よりも良好な抗腫瘍活性を示す。同様の結果が、同様にａｆｈｕ２１－２１でも得られる。
【0204】
実施例８
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の産生およびその特性
[000233]ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍｌのＡｂ ２１ｃ ３ｍｌに、新鮮なＴＣＥＰをＴＣＥＰ／Ａｂのモル比２．２で添加した。３７℃の水浴中で１２０分インキュベーションした後、１／１０（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を、抗体溶液に添加した。続いて、ＤＭＡ中の１０ｍＭ ｍｃ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（ｍｃ＝マレイミドカプロイル；ｖｃ＝バリン－シトルリンリンカー）を、Ａｂ溶液にＭＭＡＥ対抗体のモル比６で添加した。溶液を室温で一晩保持した後、ＰＤ－１０カラムを１×ＰＢＳ ２５ｍｌで平衡化した。次に、コンジュゲーション混合物をＰＤ－１０カラムに負荷して、ＡＤＣを精製した。ＡＤＣの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＨＩＣ－ＨＰＬＣを、それぞれＡＤＣの凝集の品質管理分析および薬物－抗体比（ＤＡＲ）に使用した。平均ＤＡＲは、標準的な方法に従って算出した。ＡＤＣコンジュゲート２１ｃ－ＭＭＡＦおよびａｆｈｕ２１－２６－ＭＭＡＥを同様に生成した。ａｆｈｕ２１－２６－ＭＭＡＥのＨＩＣ－ＨＰＬＣヒストグラムを図１１に示す。算出したＤＡＲは３．７６であり、これは、認可されたＡＤＣ薬ブレンツキシマブベドチンのＤＡＲと同様である。
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の産生およびその特性
[000233]ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍｌのＡｂ ２１ｃ ３ｍｌに、新鮮なＴＣＥＰをＴＣＥＰ／Ａｂのモル比２．２で添加した。３７℃の水浴中で１２０分インキュベーションした後、１／１０（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を、抗体溶液に添加した。続いて、ＤＭＡ中の１０ｍＭ ｍｃ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（ｍｃ＝マレイミドカプロイル；ｖｃ＝バリン－シトルリンリンカー）を、Ａｂ溶液にＭＭＡＥ対抗体のモル比６で添加した。溶液を室温で一晩保持した後、ＰＤ－１０カラムを１×ＰＢＳ ２５ｍｌで平衡化した。次に、コンジュゲーション混合物をＰＤ－１０カラムに負荷して、ＡＤＣを精製した。ＡＤＣの濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＨＩＣ－ＨＰＬＣを、それぞれＡＤＣの凝集の品質管理分析および薬物－抗体比（ＤＡＲ）に使用した。平均ＤＡＲは、標準的な方法に従って算出した。ＡＤＣコンジュゲート２１ｃ－ＭＭＡＦおよびａｆｈｕ２１－２６－ＭＭＡＥを同様に生成した。ａｆｈｕ２１－２６－ＭＭＡＥのＨＩＣ－ＨＰＬＣヒストグラムを図１１に示す。算出したＤＡＲは３．７６であり、これは、認可されたＡＤＣ薬ブレンツキシマブベドチンのＤＡＲと同様である。
【0205】
[000234]ＬＣ０３８ ＰＤＸモデルおよびＳＮＵ１６異種移植片等の各種腫瘍異種移植片モデルにおけるＡＤＣの抗腫瘍活性を評価した。ａｆＨｕ２１－２６－ＭＭＡＥ、２１ｃ－ＭＭＡＦ、および２１ｃ－ＭＭＡＥによる処置は全て、両腫瘍モデルにおいて腫瘍退縮を誘導した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】