特表 2023-509443 改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトならびに副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）および／または副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）の処置または予防のための使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-08

(54)【発明の名称】改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトならびに副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）および／または副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）の処置または予防のための使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20230301BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230301BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20230301BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230301BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230301BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230301BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20230301BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20230301BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230301BHJP

   C12N 5/079 20100101ALN20230301BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20230301BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/12 ZNA

A61K31/711

A61K48/00

A61K35/76

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A61P25/02

A61P3/00

A61P25/00

C12N5/079

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022540917

(86)(22)【出願日】2020-12-31

(85)【翻訳文提出日】2022-08-30

(86)【国際出願番号】 US2020067664

(87)【国際公開番号】W WO2021138559

(87)【国際公開日】2021-07-08

(31)【優先権主張番号】62/955,667

(32)【優先日】2019-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＬＡＢＲＡＳＯＬ

(71)【出願人】

【識別番号】522263415

【氏名又は名称】スワンバイオ セラピューティクス リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＷＡＮＢＩＯ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ

【住所又は居所原語表記】８ Ｂｌｏｏｍｓｂｕｒｙ Ｓｔｒｅｅｔ， ２ｎｄ Ｆｌｏｏｒ， Ｌｏｎｄｏｎ Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＷＣＩＢ ３ＳＲ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】コザルスキー，カレン

(72)【発明者】

【氏名】グウェン－オズカン，ツグバ

(72)【発明者】

【氏名】トレチャコフ，アンナ

(72)【発明者】

【氏名】クラーク，サーン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA201

4C084ZB211

4C084ZC211

4C084ZC411

4C086AA01

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB21

4C086ZC41

4C087AA01

4C087BC83

4C087MA17

4C087MA56

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA20

4C087ZB21

4C087ZC21

4C087ZC41

(57)【要約】

本開示は、一般に、それを必要とする対象に投与された場合に標的（例えば、ニューロンまたはグリア）細胞におけるＡＬＤタンパク質の発現を提供する、ポリヌクレオチドおよびＡＡＶベクターに関する。本開示は、さらに、かかるポリヌクレオチドまたはベクターを含む組成物に関する。これらのポリヌクレオチド、ベクターおよび組成物は、それを必要とする対象において、ＡＬＤまたはＡＭＮの処置および予防のために用いることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｒＡＡＶビリオンからのウイルスキャプシド中にパッケージングされていてもよい組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムを含む、単離されたポリヌクレオチドであって、
ここで、前記ｒＡＡＶベクターゲノムは：
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；
（ｂ）発現カセット、ここで、発現カセットは、少なくとも、（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、（ｉｉ）ポリＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド、（ｉｉｉ）１つ以上のターミネーター、および（ｉｖ）前記ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナルを含む；ならびに
（ｃ）３’ＩＴＲ、
を含むか、またはこれらからなり、
およびここで、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まないか、またはそれは、Ｘタンパク質が発現されないか、またはこれが不活性な形態において発現されることをもたらす、少なくとも１つの変異を含む、修飾されたＷＰＲＥを含み、
任意にここで、５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ ＡＡＶｒｈ１０の５’および３’ＩＴＲから誘導される、
前記単離されたポリヌクレオチド。

【請求項2】

ＷＰＲＥを含まない、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、ここで：
（ｉ）５’ＩＴＲは、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲから誘導されるか；および／または
（ｉｉ）３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲから誘導され、
任意にここで：
（ｉ）５’ＩＴＲは、配列番号３０１、４０１、６０１、６１１、１０００１、１０１０１もしくは１０２０１の核酸配列を含む；および／または
（ｉｉ）３’ＩＴＲは、配列番号３０２、４０２、６０２、６１２、１００１８、１０１１８もしくは１０２１８の核酸配列を含む、
前記単離されたポリヌクレオチド。

【請求項4】

請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、ここで：
（ｉ）５’ＩＴＲが、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの切断型形態である：および／または
（ｉｉ）３’ＩＴＲが、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲの切断型形態である、
任意にここで：
（ｉ）５’ＩＴＲの切断型形態は、配列番号２、１０５０１、１１００１、１１１０１、１１２０１、１１３０１、１１５０１もしくは１１７０１の核酸配列を含む；および／または
（ｉｉ）３’ＩＴＲの切断型形態は、配列番号２８、１０５１８、１１０１８、１１１１８、１１２１８、１１３１８、１１５１８もしくは１１７１８の核酸配列を含む、
前記単離されたポリヌクレオチド。

【請求項5】

標的細胞が、ニューロンまたはグリア細胞を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項6】

プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスからのＨ５、Ｐ７．５およびＰＩ １プロモーター、伸長因子１－アルファ（ＥＦｌａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核細胞翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、ヒートショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、ヒートショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、任意に、ニワトリβ－アクチンプロモーター；組織特異的プロモーター、Ｂ２９プロモーター、ｒｕｎｔ転写因子（ＣＢＦａ２）プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＹＰ４５０ ３Ａ４プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ１プロモーター、エンドグリンプロモーター、線維芽細胞特異的タンパク質１プロモーター（ＦＳＰ１）プロモーター、フィブロネクチンプロモーター、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）プロモーター、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、インスリンプロモーター、インテグリンアルファ２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモーター、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ－２）プロモーター、インターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）プロモーター、ケラチン５プロモーター（ケラチノサイト発現）、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター、筋分化１（ＭＹＯＤ１）プロモーター、ネフリンプロモーター、骨ガンマカルボキシグルタミン酸タンパク質２（ＯＧ－２）プロモーター、３－オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ２Ｂ（Ｏｘｃｔ２Ｂ）プロモーター、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ－Ｂ）プロモーター、シナプシンプロモーター、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）プロモーター、Ｊｅｔプロモーター、グルクロニダーゼベータ（ＧＵＳＢ）プロモーターまたはＭＮＤプロモーターから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項7】

プロモーターが、ニワトリβ－アクチンプロモーターを含み、任意にここで、ニワトリβ－アクチンプロモーターは、配列番号１０、１０００７、１０１０７、１０２０７、１０５０７、１１００７、１１１０７、１１２０７、１１３０７、１１５０７もしくは１１７０７の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項8】

プロモーターが、エンハンサーに対して作動可能に連結されており、ここで、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＬＳＰエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、ｅｎ３４エンハンサー、ＡｐｏＥエンハンサー、アルファフェトタンパク質エンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーまたは骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項9】

プロモーターが、ＣＭＶエンハンサーに対して作動可能に連結されており、任意にここで、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号７、１０００５、１０１０５、１０２０５、１０５０５、１１００５、１１１０５、１１２０５、１１３０５、１１５０５もしくは１１７０５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項10】

請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、
任意に５’末端から３’末端への方向において、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、β－アクチンエクソン、キメラ性イントロン、およびウサギβ－グロビンエクソンを含み、ここで、プロモーターが、ニワトリβ－アクチンプロモーターであり、
任意にここで：
（ｉ）ＣＭＶエンハンサーは、配列番号７、１０００５、１０１０５、１０２０５、１０５０５、１１００５、１１１０５、１１２０５、１１３０５、１１５０５もしくは１１７０５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み；
（ｉｉ）ニワトリβ－アクチンプロモーターは、配列番号１０、１０００７、１０１０７、１０２０７、１０５０７、１１００７、１１１０７、１１２０７、１１３０７、１１５０７もしくは１１７０７の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み；
（ｉｉｉ）β－アクチンエクソンは、配列番号１１、１０００８、１０１０８、１０２０８、１０５０８、１１００８、１１１０８、１１２０８、１１３０８、１１５０８もしくは１１７０８の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み；および／または
（ｉｖ）キメラ性イントロンは、配列番号１２、１０００９、１０１０９、１０２０９、１０５０９、１１００９、１１１０９、１１２０９、１１３０９、１１５０９もしくは１１７０９の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み；
（ｖ）ウサギβ－グロビンエクソンは、配列番号１００８５、１０１８５、１０２８５、１０５８５、１１０８５、１１１８５、１１２８５、１１３８５、１１５８５もしくは１１７８５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、
前記単離されたポリヌクレオチド。

【請求項11】

ＡＢＣＤ１ポリペプチドが、配列番号１４、２０４、３０４、４０４、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、１００１２、１０１１２、１０２１２、１０５１２、１１０１２、１１１１２、１１２１２、１１３１２、１１５１２もしくは１１７１２の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項12】

ＡＢＣＤ１コード配列が、配列番号２０４の核酸配列と比較して減少した数の代替的オープンリーディングフレームを含むか、または、任意の代替的オープンリーディングフレームを含まない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項13】

ＡＢＣＤ１コード配列が、主に（５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％を超える）または全体が、ヒト優先コドンを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項14】

ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１４、２０４、３０４、４０４、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、１００１２、１０１１２、１０２１２、１０５１２、１１０１２、１１１１２、１１２１２、１１３１２、１１５１２もしくは１１７１２の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項15】

ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドのすぐ上流にＫｏｚａｋ配列をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、任意にここで、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号１０５１１、１１２１１もしくは１１３１１の核酸配列、または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列：

【化1】

へのアプローチを表す任意の配列を含む、前記単離されたポリヌクレオチド。

【請求項16】

ターミネーターが、ＵＡＧ、ＵＡＡおよび／またはＵＧＡから選択され、任意にここで、ターミネーターは、配列番号１００７１、１０１７１、１０２７１、１０５７１、１１０７１、１１１７１、１１２７１、１１３７１、１１５７１もしくは１１７７１の核酸配列を含み、さらに任意にここで、ターミネーターは、配列番号１０５７２、１１２７２もしくは１１３７２の核酸配列をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項17】

ポリＡシグナルが、ＳＶ４０ポリＡシグナルを含み、任意にここで、ＳＶ４０ポリＡシグナルは、配列番号２７、１００１４、１０１１４、１０２１４、１０５１４、１１０１４、１１２１４もしくは１１７１４の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項18】

ポリＡシグナルが、ｂＧＨポリＡシグナルを含み、任意にここで、ｂＧＨポリＡシグナルは、配列番号１００１６、１０１１６、１０２１６、１１０１６、１１１１６、１１２１６、１１３１６、１１５１６もしくは１１７１６の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項19】

ポリＡシグナルが、配列番号２０６、３０６、４０５、１００３５、１０１３５、１０２３５、１１０３５、１１２３５もしくは１１７３５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項20】

請求項１～１９のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、ここで：
（ａ）において、５’ＩＴＲは、配列番号３０１、４０１、６０１、６１１、１０００１、１０１０１、１０２０１、２、１０５０１、１１００１、１１１０１、１１２０１、１１３０１、１５０１もしくは１１７０１の核酸配列を含み；
（ｂ）において、
（ｉ）プロモーターは、配列番号１０、１０００７、１０１０７、１０２０７、１０５０７、１１００７、１１１０７、１１２０７、１１３０７、１１５０７もしくは１１７０７の核酸配列を含み、
（ｉｉ）ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４、２０４、３０４、４０４、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、１００１２、１０１１２、１０２１２、１０５１２、１１０１２、１１１１２、１１２１２、１１３１２、１１５１２もしくは１１７１２の核酸配列を含み、および
（ｉｉｉ）ポリＡシグナルは、配列番号２７、１００１４、１０１１４、１０２１４、１０５１４、１１０１４、１１２１４、１１７１４、１００１６、１０１１６、１０２１６、１１０１６、１１１１６、１１２１６、１１３１６、１１５１６、１１７１６、２０６、３０６、４０５、１００３５、１０１３５、１０２３５、１１０３５、１１２３５もしくは１１７３５の核酸配列を含み；および
（ｃ）において、３’ＩＴＲは、配列番号３０２、４０２、６０２、６１２、１００１８、１０１１８、１０２１８、２８、１０５１８、１１０１８、１１１１８、１１２１８、１１３１８、１１５１８もしくは１１７１８核酸配列を含む、
前記単離されたポリヌクレオチド。

【請求項21】

ｒＡＡＶベクターゲノムが、配列番号３００、４００、１００５０、１０１５０、１０２５０、１０５５０、１１０５０、１１１５０、１１２５０、１１３５０、１１５５０、１１７５０、１００６０、１０１６０、１０２６０、１０５６０、１１０６０、１１１６０、１１２６０、１１３６０、１１５６０もしくは１１７６０の核酸配列、または配列番号１００の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列のヌクレオチド１～３７１３を含むか、またはこれからなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項22】

請求項２または３～１９のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、ｒＡＡＶベクターゲノムが、Ｘタンパク質の発現を排除するか、または不活化された、または非機能的なＸタンパク質の発現をもたらす少なくとも１つの変異を含む、修飾されたウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含み、
任意にここで、不活化された、または非機能的なＸタンパク質は、切断型Ｘタンパク質であり、
さらに任意にここで、修飾されたＷＰＲＥは、配列番号３０５または１００７５の核酸配列を含む、
前記単離されたポリヌクレオチド。

【請求項23】

ｒＡＡＶベクターゲノムは、配列番号３００、１００５０、または１００６０の核酸配列を含むか、またはこれからなる、請求項２２に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項24】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、これは、任意に抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドであり、任意にここで、抗生物質耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子であり、
さらに任意にここで、プラスミドは、ｐＵＣ５７またはｐＵＣ１１８骨格を含む、
前記単離されたポリヌクレオチド。

【請求項25】

プラスミドｐＳＢＴ１０１（配列番号１０１００）、ｐＯＢ１００５（配列番号１０５００）、ｐＯＢ１０１０（配列番号１１０００）、ｐＯＢ１０１１（配列番号１１１００）、ｐＯＢ１０１２（配列番号１１２００）、ｐＯＢ１０１３（配列番号１１３００）、ｐＯＢ１０１５（配列番号１１５００）、またはｐＯＢ１０１７（配列番号１１７００）を含むか、これからなるか、またはこれから誘導される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項26】

配列番号１００、１００００、１０１００、１０２００、１０５００、１１０００、１１１００、１１２００、１１３００、１１５００もしくは１１７００の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはこれからなる、請求項１～２５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項27】

以下：
（Ａ）請求項１～２７のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド、
これは、任意に、
（Ｂ）トランスフェクション試薬；
（Ｃ）ＡＡＶキャプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；
（Ｄ）ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；
（Ｅ）Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡからなる群より選択されるアデノウィルスヘルパー遺伝子を含む、ポリヌクレオチド；または
（Ｆ）薬学的に許容し得る担体または賦形剤、
のうちのいずれか１つ以上をさらに含み、
さらに任意にここで：
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０のｃａｐ遺伝子、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ１０のｃａｐ遺伝子であるか、またはこれから誘導される；および／または
（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０のｒｅｐ遺伝子、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ１０のｒｅｐ遺伝子であるか、またはこれから誘導される、
を含む、組成物。

【請求項28】

ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が：
（Ｉ）ＡＡＶ９のｃａｐ遺伝子であるか、またはこれから誘導され、任意にここで、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶ９ ＶＰ２キャプシドタンパク質および／またはＡＡＶ９ ＶＰ３キャプシドタンパク質をコードし、さらに任意にここで：
（Ｉ－１）ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質は、配列番号７３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（Ｉ－２）ＡＡＶ９ ＶＰ２キャプシドタンパク質は、配列番号７３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または
（Ｉ－３）ＡＡＶ９ ＶＰ３キャプシドタンパク質は、配列番号７３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ＩＩ）ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子であるか、またはこれから誘導され。任意にここで、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶ２ ＶＰ２キャプシドタンパク質および／またはＡＡＶ２ ＶＰ３キャプシドタンパク質をコードし、さらに任意にここで：
（ＩＩ－１）ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質は、配列番号８３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ＩＩ－２）ＡＡＶ２ ＶＰ２キャプシドタンパク質は、配列番号８３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または
（ＩＩ－３）ＡＡＶ２ ＶＰ３キャプシドタンパク質は、配列番号８３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または、
（ＩＩ）ＡＡＶｒｈ１０のｃａｐ遺伝子であるか、またはこれから誘導され。任意にここで、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ２キャプシドタンパク質および／またはＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ３キャプシドタンパク質をコードし、さらに任意にここで：
（ＩＩ－１）ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ１キャプシドタンパク質は、配列番号９３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ＩＩ－２）ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ２キャプシドタンパク質は、配列番号９３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または
（ＩＩ－３）ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ３キャプシドタンパク質は、配列番号９３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が：
（ｉ）ＡＡＶ ｐ５プロモーターおよび／もしくはＡＡＶ ｐ１９プロモーター下においてコードされている；ならびに／または
（ｉｉ）ＡＡＶ ＲＥＰ７８複製タンパク質、ＡＡＶ ＲＥＰ６８複製タンパク質、ＡＡＶ ＲＥＰ５２複製タンパク質、および／またはＡＡＶ ＲＥＰ４０複製タンパク質のうちの１つ以上をコードし、
任意にここで：
（ｉ）ＡＡＶ ＲＥＰ７８の転写は、ＡＡＶｐ５プロモーターにより制御される；
（ｉｉ）ＡＡＶ ＲＥＰ６８の転写は、ＡＡＶｐ５プロモーターにより制御される；
（ｉｉｉ）ＡＡＶ ＲＥＰ５２の転写は、ＡＡＶｐ１９プロモーターにより制御される；および／または
（ｉｖ）ＡＡＶ ＲＥＰ４０の転写は、ＡＡＶｐ１９プロモーターにより制御される、
請求項２７または２８に記載の組成物。

【請求項30】

ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子であるか、またはこれから誘導される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の組成物であって、
任意にここで：
（Ｉ）ｒｅｐ遺伝子の転写は、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターおよび／またはＡＡＶ２ ｐ１９プロモーターにより制御され；および／または
（ＩＩ）ｒｅｐ遺伝子は、以下をコードする：
（ｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ７８、任意にここで、転写は、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターにより制御される；
（ｉｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ６８、任意にここで、転写は、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターにより制御される；
（ｉｉｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ５２、任意にここで、転写は、ＡＡＶ２ ｐ１９プロモーターにより制御される；および／または
（ｉｖ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ４０、任意にここで、転写は、ＡＡＶ２ ｐ１９プロモーターにより制御される、
さらに任意にここで：
（Ｉ）ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターは、配列番号７１０の核酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み、および／またはＡＡＶ２ ｐ１９プロモーターは、配列番号７２０の核酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む；ならびに／あるいは
（ＩＩ）（ｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ７８は、配列番号７１１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ６８は、配列番号７１２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉｉｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ５２は、配列番号７２１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または（ｉｖ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ４０は、配列番号７２２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記組成物。

【請求項31】

ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子が、プラスミドによりコードされ、任意にここで、プラスミドは、ＡＡＶ２／９プラスミドであり、これはさらに任意に、配列番号７００の核酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項32】

アデノウィルスヘルパー遺伝子が、以下：
（Ｉ）任意に（ｉ）ＶＡ－ＲＮＡ領域Ｉおよび／または（ｉｉ）ＶＡ－ＲＮＡ領域ＩＩを含む、領域ＶＡ－ＲＮＡ；
（ＩＩ）任意に以下：（ｉ）Hexon、（ｉｉ）２３Ｋエンドプロテアーゼ、（ｉｉｉ）Ｅ２Ａ／ＤＢＰ、（ｉｖ）Hexonアセンブリー（１００Ｋ）、（ｖ）Hexonアセンブリー（３3K)、（ｖｉ）Hexonアセンブリー（２２Ｋ）、および／もしくは（ｖｉｉ）Hexonに関連する前駆体をコードする、領域Ｅ２；ならびに／または
（ＩＩＩ）任意に以下：（ｉ）Fiber、（ｉｉ）Ｅ４ ＯＲＦ１、（ｉｉｉ）Ｅ４ ＯＲＦ２、（ｉｖ）Ｅ４ ＯＲＦ３、（ｖ）Ｅ４ ＯＲＦ４、（ｖｉ）Ｅ４ ＯＲＦ６、および／もしくは（ｖｉｉ）Ｅ４ ＯＲＦ６／７をコードする、領域Ｅ４、
を含む、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

アデノウィルスヘルパー遺伝子が、アデノウィルス５（Ａｄ５）の遺伝子であるか、またはこれから誘導され、これは、任意に以下を含む：
（Ｉ）Ａｄ５領域ＶＡ－ＲＮＡ、任意にここで、Ａｄ５領域ＶＡ－ＲＮＡは、配列番号２０１０の核酸配列を含み、ならびに／または（ｉ）任意に配列番号２０１１の核酸配列を含む、ＶＡ－ＲＮＡ領域Ｉ、および／もしくは（ｉｉ）任意に配列番号２０１２の核酸配列を含む、ＶＡ－ＲＮＡ領域ＩＩを含み；
（ＩＩ）Ａｄ５領域Ｅ２、任意にここで、Ａｄ５領域Ｅ２は、配列番号２０２０の核酸配列を含み、および／または、以下をコードする：（ｉ）任意に配列番号２０２１のアミノ酸配列を含む、Hexon、（ｉｉ）任意に配列番号２０２２のアミノ酸配列を含む、２３Ｋエンドプロテアーゼ、（ｉｉｉ）任意に配列番号２０２３のアミノ酸配列を含む、Ｅ２Ａ／ＤＢＰ、（ｉｖ）任意に配列番号２０２４のアミノ酸配列を含む、Hexonアセンブリー（１００Ｋ）、（ｖ）任意に配列番号２０２５のアミノ酸配列を含む、Hexonアセンブリー（３３Ｋ）、（ｖｉ）任意に配列番号２０２６のアミノ酸配列を含む、Hexonアセンブリー（２２Ｋ）、および／もしくは（ｖｉｉ）任意に配列番号２０２７のアミノ酸配列を含む、Hexonに関連する前駆体；ならびに／あるいは
（ＩＩＩ）Ａｄ５領域Ｅ４、任意にここで、Ａｄ５領域Ｅ４は、配列番号２０３０の核酸配列を含み、および／または、以下をコードする：（ｉ）任意に配列番号２０３１のアミノ酸配列を含む、Fiber、（ｉｉ）任意に配列番号２０３２のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ１、（ｉｉｉ）任意に配列番号２０３３のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ２、（ｉｖ）任意に配列番号２０３４のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ３、（ｖ）任意に配列番号２０３５のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ４、（ｖｉ）任意に配列番号２０３６のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ６、および／もしくは（ｖｉｉ）任意に配列番号２０３７のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ６／７、
請求項３２に記載の組成物。

【請求項34】

アデノウィルスヘルパー遺伝子が、アデノウィルス２（Ａｄ２）であるか、またはこれから誘導され、これは、任意に以下を含む：
（Ｉ）Ａｄ２領域ＶＡ－ＲＮＡ、任意にここで、Ａｄ２領域ＶＡ－ＲＮＡは、配列番号３０１０の核酸配列を含み、ならびに／または、（ｉ）任意に配列番号３０１１の核酸配列を含む、ＶＡ－ＲＮＡ領域Ｉ、および／もしくは（ｉｉ）任意に配列番号３０１２の核酸配列を含む、ＶＡ－ＲＮ領域ＩＩを含む；
（ＩＩ）Ａｄ２領域Ｅ２、任意にここで、Ａｄ２領域Ｅ２は、配列番号３０２０の核酸配列を含み、および／または、以下をコードする：（ｉ）２３Ｋエンドプロテアーゼ、任意に配列番号３０２２のアミノ酸配列を含む、（ｉｉ）Ｅ２Ａ／ＤＢＰ、任意に配列番号３０２３のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）Hexonアセンブリー（１００Ｋ）、任意に配列番号３０２４のアミノ酸配列を含む、（ｉｖ）Hexonアセンブリー（３３Ｋ）、任意に配列番号３０２５のアミノ酸配列を含む、（ｖ）任意に配列番号３０２６のアミノ酸配列を含む、Hexonアセンブリー（２２Ｋ）、および／または（ｖｉ）任意に配列番号３０２７のアミノ酸配列を含む、Hexonに関連する前駆体；および／または
（ＩＩＩ）Ａｄ２領域Ｅ４、任意にここで、Ａｄ２領域Ｅ４は、配列番号３０３０の核酸配列を含み、および／または、以下をコードする：（ｉ）任意に配列番号３０３２のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ１、（ｉｉ）任意に配列番号３０３３のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ２、（ｉｉｉ）任意に配列番号３０３４のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ３、（ｉｖ）任意に配列番号３０３５のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ４、（ｖ）任意に配列番号３０３６のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ６、および／または（ｖｉ）任意に配列番号３０３７のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ６／７、
請求項３２に記載の組成物。

【請求項35】

アデノウィルスヘルパー遺伝子が、ｐＡＬＤ－Ｘ８０および／またはｐＨＥＬＰ＿ＫａｎＶ４ｎによりコードされる、請求項３２に記載の組成物。

【請求項36】

以下：
（Ｉ）ＡＡＶキャプシド；および
（ＩＩ）請求項１～２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノムによるｒＡＡＶベクターゲノム
を含むか、またはこれらからなる、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであって、
任意にここで、ｒＡＡＶベクターゲノムの核酸配列は、配列番号１００５０、１０１５０、１０５５０、１１０５０、１１１５０、１１２５０、１１３５０、１１５５０、１１７５０、１００６０、１０１６０、１０５６０、１１０６０、１１１６０、１１２６０、１１３６０、１１５６０もしくは１１７６０核酸配列を含むか、またはこれからなり、
さらに任意にここで、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０キャプシド、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ１０キャプシド、またはそのバリアントであるか、またはこれから誘導される、
前記組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター。

【請求項37】

以下：
（ｉ）ＡＡＶ９キャプシドまたはＡＡＶ９キャプシドから誘導されるＡＡＶキャプシドであって、これは、任意にＡＡＶ９ ＶＰ１、ＡＡＶ９ ＶＰ２および／またはＡＡＶ９ ＶＰ３であり、さらに任意にここで：
（ａ）ＡＡＶ９ ＶＰ１は、配列番号７３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；
（ｂ）ＡＡＶ９ ＶＰ２は、配列番号７３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；および／または
（ｃ）ＡＡＶ９ ＶＰ３は、配列番号７３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；
（ｉｉ）ＡＡＶ２キャプシドまたはＡＡＶ２キャプシドから誘導されるＡＡＶキャプシドであって、これは、任意に、ＡＡＶ２ ＶＰ１、ＡＡＶ２ ＶＰ２および／またはＡＡＶ２ ＶＰ３であり、さらに任意にここで：
（ａ）ＡＡＶ２ ＶＰ１は、配列番号８３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；
（ｂ）ＡＡＶ２ ＶＰ２は、配列番号８３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；および／または
（ｃ）ＡＡＶ２ ＶＰ３は、配列番号８３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；
（ｉｉｉ）ＡＡＶｒｈ１０キャプシドまたはＡＡＶｒｈ１０キャプシドから誘導されるＡＡＶキャプシドであって、これは、任意に、ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ１、ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ２および／またはＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ３であり、さらに任意にここで：
（ａ）ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ１は、配列番号９３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；
（ｂ）ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ２は、配列番号９３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；および／または
（ｃ）ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ３は、配列番号９３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる、
を含む、請求項３６に記載のｒＡＡＶベクター。

【請求項38】

以下：
（Ａ）請求項３６または３７に記載のｒＡＡＶベクターの予防または治療有効量；および
（Ｂ）薬学的に許容し得る担体；
を含む、in vivoでの投与のために好適な組成物。

【請求項39】

約１×１０^１３ＧＣ～約１×１０^１５ＧＣのｒＡＡＶベクターの用量を含む、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

凝集体において、合計約１×１０^１３ＧＣ～約１×１０^１５ＧＣのｒＡＡＶベクターの用量を含む、請求項３８に記載のいくつかの組成物。

【請求項41】

ｒＡＡＶベクターの用量が、約１０ｍＬ～約１５０ｍＬの容積中に含まれる、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の組成物（単数）または組成物（複数）。

【請求項42】

ｒＡＡＶベクターの用量が、約１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約６０ｍＬ、約７０ｍＬ、約８０ｍＬ、約９０ｍＬ、約１００ｍＬ、約１１０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１３０ｍＬ、約１４０ｍＬ、または約１５０ｍＬの容積中に含まれる、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の組成物（単数）または組成物（複数）。

【請求項43】

髄腔内、脳室内（ＩＣＶ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、血管内、筋肉内、または大槽内投与のために好適である、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の組成物（単数）または組成物（複数）。

【請求項44】

髄腔内投与のために好適である、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の組成物（単数）または組成物（複数）。

【請求項45】

ポンプによる髄腔内投与のために好適である、請求項４４に記載の組成物（単数）または組成物（複数）。

【請求項46】

それを必要とする対象において、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）および／または副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）を処置もしくは予防する、および／またはＡＬＤおよび／またはＡＭＮに関連する症状を寛解させる方法であって、それを必要とする対象に、請求項３６または３７に記載の少なくとも１つのｒＡＡＶベクターの予防もしくは治療有効量、または請求項３９～４５のいずれか一項に記載の組成物（単数）または組成物（複数）を投与することを含む、前記方法。

【請求項47】

対象が、ヒトである、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

対象において、脳、脊髄および副腎皮質の血漿および組織における高レベルの極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の蓄積、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、または罹患した後根神経節ニューロンに起因する末梢性ニューロパチーなどの１つ以上の症状を緩和するか、軽減するか、またはこれを安定化させる、請求項４６または４７に記載の方法。

【請求項49】

ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターを含む組成物（単数）または組成物（複数）が、対象に投与される、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、または組成物（単数）もしくは組成物（複数）が、髄腔内、脳室内（ＩＣＶ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、血管内、筋肉内、または大槽内投与により送達される、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

送達が、髄腔内投与によるものである、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

髄腔内投与が、ポンプにより媒介される、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

合計の投与されたｒＡＡＶベクターの用量が、約１×１０^１３ＧＣ～約１×１０^１５ＧＣである、請求項４６～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、または組成物（単数）もしくは組成物（複数）が、約１０ｍＬ～約１５０ｍＬの容積において投与される、請求項４６～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、または組成物（単数）もしくは組成物（複数）が、約１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約６０ｍＬ、約７０ｍＬ、約８０ｍＬ、約９０ｍＬ、約１００ｍＬ、約１１０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１３０ｍＬ、約１４０ｍＬ、または約１５０ｍＬ、好ましくは約１００ｍＬの容積において投与される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、または組成物（単数）もしくは組成物（複数）が、単一用量または複数用量において投与される、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２、またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを含む、請求項４６～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

単離されたポリヌクレオチドの投与が、ニューロン、神経膠細胞、またはニューロンおよび神経膠細胞において、ＡＢＣＤ１導入遺伝子の発現をもたらす、請求項４６～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

単離されたポリヌクレオチドが、アデノウィルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介して送達される、請求項４６～５８のいずれか一項に記載の方法

【請求項60】

少なくとも１つのｒＡＡＶベクターまたはそれを含む組成物の複数用量が、対象に投与され、ここで、投与は、同時に、または異なる時間に、および／または長期間にわたり、投与される、請求項４６～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

ウイルスベクターを作製する方法であって、請求項１～２６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドを、パッケージング細胞中に導入することを含み、ここで、任意に、ウイルスベクターは、請求項３６または３７に記載のｒＡＡＶベクターであり、
パッケージング細胞中に：
（ａ）ＡＡＶキャプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；および／または
（ｃ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子、任意にＥ１、Ｅ２、Ｅ４および／またはＶＡ ＲＮＡを含む、ポリヌクレオチド；
を導入することをさらに含む、
前記方法。

【請求項62】

ウイルスベクターを作製する方法であって、請求項１～２６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノムを含むパッケージング細胞を培養することを含む、任意にここで、ウイルスベクターは、請求項３６または３７に記載のｒＡＡＶベクターであり、さらに任意にここで、パッケージング細胞は：（ａ）ＡＡＶキャプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；および／または
（ｃ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子、任意にＥ１、Ｅ２、Ｅ４および／またはＶＡ ＲＮＡを含む、ポリヌクレオチド；
を含む、
前記方法。

【請求項63】

ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子が：
（Ｉ）ＡＡＶ９のｃａｐ遺伝子であるか、またはこれから誘導され、任意にここで、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶ９ ＶＰ２キャプシドタンパク質および／またはＡＡＶ９ ＶＰ３キャプシドタンパク質をコードし、さらに任意にここで：
（Ｉ－１）ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質は、配列番号７３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（Ｉ－２）ＡＡＶ９ ＶＰ２キャプシドタンパク質は、配列番号７３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または
（Ｉ－３）ＡＡＶ９ ＶＰ３キャプシドタンパク質は、配列番号７３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ＩＩ）ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子であるか、またはこれから誘導され、任意にここで、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶ２ ＶＰ２キャプシドタンパク質および／またはＡＡＶ２ ＶＰ３キャプシドタンパク質をコードし、さらに任意にここで：
（ＩＩ－１）ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質は、配列番号８３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ＩＩ－２）ＡＡＶ２ ＶＰ２キャプシドタンパク質は、配列番号８３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または
（ＩＩ－３）ＡＡＶ２ ＶＰ３キャプシドタンパク質は、配列番号８３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；あるいは、
（ＩＩ）ＡＡＶｒｈ１０のｃａｐ遺伝子であるか、またはこれから誘導され、任意にここで、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ２キャプシドタンパク質および／またはＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ３キャプシドタンパク質をコードし、さらに任意にここで：
（ＩＩ－１）ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ１キャプシドタンパク質は、配列番号９３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ＩＩ－２）ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ２キャプシドタンパク質は、配列番号９３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含みは、および／または
（ＩＩ－３）ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ３キャプシドタンパク質は、配列番号９３３アミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項６１または６２に記載の方法。

【請求項64】

請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで：
（ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の転写は、ＡＡＶ ｐ５プロモーターおよび／もしくはＡＡＶ ｐ１９プロモーターにより制御され；ならびに／または
（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ ＲＥＰ７８複製タンパク質、ＡＡＶ ＲＥＰ６８複製タンパク質、ＡＡＶ ＲＥＰ５２複製タンパク質、および／またはＡＡＶ ＲＥＰ４０複製タンパク質のうちの１つ以上をコードし、
任意にここで：
（ｉ）ＡＡＶ ＲＥＰ７８の転写は、ＡＡＶｐ５プロモーターにより制御される；
（ｉｉ）ＡＡＶ ＲＥＰ６８の転写は、ＡＡＶｐ５プロモーターにより制御される；
（ｉｉｉ）ＡＡＶ ＲＥＰ５２の転写は、ＡＡＶｐ１９プロモーターにより制御される；および／または
（ｉｖ）ＡＡＶ ＲＥＰ４０の転写は、ＡＡＶｐ１９プロモーターにより制御される、
前記方法。

【請求項65】

ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子が、ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子であるか、またはこれから誘導され、
任意にここで：
（Ｉ）ｒｅｐ遺伝子の転写は、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターおよび／またはＡＡＶ２ ｐ１９プロモーターにより制御され；および／または
（ＩＩ）ｒｅｐ遺伝子は：
（ｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ７８、任意にここで、転写は、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターにより制御される；
（ｉｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ６８、任意にここで、転写は、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターにより制御される；
（ｉｉｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ５２、任意にここで、転写は、ＡＡＶ２ ｐ１９プロモーターにより制御される；および／または
（ｉｖ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ４０、任意にここで、転写は、ＡＡＶ２ ｐ１９プロモーターにより制御される、
をコードし、
さらに任意にここで：
（Ｉ）ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターは、配列番号７１０の核酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み、および／またはＡＡＶ２ ｐ１９プロモーターは、配列番号７２０の核酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む；ならびに／あるいは
（ＩＩ）（ｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ７８は、配列番号７１１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ６８は、配列番号７１２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｉｉｉ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ５２は、配列番号７２１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または（ｉｖ）ＡＡＶ２ ＲＥＰ４０は、配列番号７２２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項６１～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

請求項６１～６５のいずれか一項に記載の方法であって、ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子は、プラスミドによりコードされ、任意にここで、プラスミドは、ＡＡＶ２／９プラスミドであり、これはさらに任意に、配列番号７００の核酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む、前記方法。

【請求項67】

１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子が、以下：
（Ｉ）任意に（ｉ）ＶＡ－ＲＮＡ領域Ｉおよび／または（ｉｉ）ＶＡ－ＲＮＡ領域ＩＩを含む、領域ＶＡ－ＲＮＡ；
（ＩＩ）任意に以下をコードする、領域Ｅ２：（ｉ）Hexon、（ｉｉ）２３Ｋエンドプロテアーゼ、（ｉｉｉ）Ｅ２Ａ／ＤＢＰ、（ｉｖ）Hexonアセンブリー（１００Ｋ）、（ｖ）Hexonアセンブリー（３３Ｋ）、（ｖｉ）Hexonアセンブリー（２２Ｋ）、および／または（ｖｉｉ）Hexonに関連する前駆体；および／または
（ＩＩＩ）任意に以下をコードする、領域Ｅ４：（ｉ）Fiber、（ｉｉ）Ｅ４ ＯＲＦ１、（ｉｉｉ）Ｅ４ ＯＲＦ２、（ｉｖ）Ｅ４ ＯＲＦ３、（ｖ）Ｅ４ ＯＲＦ４、（ｖｉ）Ｅ４ ＯＲＦ６、および／または（ｖｉｉ）Ｅ４ ＯＲＦ６／７、
を含む、
請求項６１～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子が、アデノウィルス５（Ａｄ５）であるか、またはこれから誘導され、これは、任意に、以下：
（Ｉ）Ａｄ５領域ＶＡ－ＲＮＡ、任意にここで、Ａｄ５領域ＶＡ－ＲＮＡは、配列番号２０１０の核酸配列を含み、ならびに／または、（ｉ）任意に配列番号２０１１の核酸配列を含む、ＶＡ－ＲＮＡ領域Ｉ、および／もしくは（ｉｉ）任意に配列番号２０１２の核酸配列を含む、ＶＡ－ＲＮＡ領域ＩＩを含み；
（ＩＩ）Ａｄ５領域Ｅ２、任意にここで、Ａｄ５領域Ｅ２は、配列番号２０２０の核酸配列を含み、および／または、以下をコードする：（ｉ）任意に配列番号２０２１のアミノ酸配列を含む、Hexon、（ｉｉ）任意に配列番号２０２２のアミノ酸配列を含む、２３Ｋエンドプロテアーゼ、（ｉｉｉ）任意に配列番号２０２３のアミノ酸配列を含む、Ｅ２Ａ／ＤＢＰ、（ｉｖ）任意に配列番号２０２４のアミノ酸配列を含む、Hexonアセンブリー（１００Ｋ）、（ｖ）任意に配列番号２０２５のアミノ酸配列を含む、Hexonアセンブリー（３３Ｋ）、（ｖｉ）任意に配列番号２０２６のアミノ酸配列を含む、Hexonアセンブリー（２２Ｋ）、および／または（ｖｉｉ）任意に配列番号２０２７のアミノ酸配列を含む、Hexonに関連する前駆体；および／または
（ＩＩＩ）Ａｄ５領域Ｅ４、任意にここで、Ａｄ５領域Ｅ４は、配列番号２０３０の核酸配列を含み、および／または、以下をコードする：（ｉ）任意に配列番号２０３１のアミノ酸配列を含む、Fiber、（ｉｉ）任意に配列番号２０３２のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ１、（ｉｉｉ）任意に配列番号２０３３のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ２、（ｉｖ）任意に配列番号２０３４のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ３、（ｖ）任意に配列番号２０３５のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ４、（ｖｉ）任意に配列番号２０３６のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ６、および／または（ｖｉｉ）任意に配列番号２０３７のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ６／７、
を含む、
請求項６１～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子が、アデノウィルス２（Ａｄ２）であるか、またはこれから誘導され、これは、任意に、以下：
（Ｉ）Ａｄ２領域ＶＡ－ＲＮＡ、任意にここで、Ａｄ２領域ＶＡ－ＲＮＡは、配列番号３０１０の核酸配列を含み、ならびに／または（ｉ）任意に配列番号３０１１の核酸配列を含む、ＶＡ－ＲＮＡ領域Ｉ、および／もしくは（ｉｉ）任意に配列番号３０１２の核酸配列を含む、ＶＡ－ＲＮ領域ＩＩ、を含み；
（ＩＩ）Ａｄ２領域Ｅ２、任意にここで、Ａｄ２領域Ｅ２は、配列番号３０２０の核酸配列を含み、および／または、以下をコードする：（ｉ）任意に配列番号３０２２のアミノ酸配列を含む、２３Ｋエンドプロテアーゼ、（ｉｉ）任意に配列番号３０２３のアミノ酸配列を含む、Ｅ２Ａ／ＤＢＰ、（ｉｉｉ）任意に配列番号３０２４のアミノ酸配列を含む、Hexonアセンブリー（１００Ｋ）、（ｉｖ）任意に配列番号３０２５のアミノ酸配列を含む、Hexonアセンブリー（３３Ｋ）、（ｖ）任意に配列番号３０２６のアミノ酸配列を含む、Hexonアセンブリー（２２Ｋ）、および／または（ｖｉ）任意に配列番号３０２７のアミノ酸配列を含む、Hexonに関連する前駆体；および／または
（ＩＩＩ）Ａｄ２領域Ｅ４、任意にここで、Ａｄ２領域Ｅ４は、配列番号３０３０の核酸配列を含み、および／または、以下をコードする：（ｉ）任意に配列番号３０３２のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ１、（ｉｉ）任意に配列番号３０３３のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ２、（ｉｉｉ）任意に配列番号３０３４のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ３、（ｉｖ）任意に配列番号３０３５のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ４、（ｖ）任意に配列番号３０３６のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ６、および／または（ｖｉ）任意に配列番号３０３７のアミノ酸配列を含む、Ｅ４ ＯＲＦ６／７、
を含む、
請求項６１～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子が、ｐＡＬＤ－Ｘ８０および／またはｐＨＥＬＯ＿ＫａｎＶ４によりコードされる、請求項６１～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

請求項１～２６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノムを含む、細胞であって、任意にここで、以下：
（ａ）ＡＡＶキャプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；および／または
（ｃ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子、任意にＥ１、Ｅ２、Ｅ４および／またはＶＡ ＲＮＡを含む、ポリヌクレオチド
を含む、前記細胞。

【請求項72】

請求項７１に記載の細胞であって、ここで：
（ａ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、請求項６３に記載のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子によるものであり；
（ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、請求項６４または６５に記載のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子によるものであり；および／または
（ｃ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子は、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子であり、
任意にここで：
（ｉ）ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子は、プラスミドによりコードされ、任意にここで、プラスミドは、ＡＡＶ２／９プラスミドであり、これはさらに任意に、配列番号７００の核酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み；および／または
（ｉｉ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子は、ｐＡＬＤ－Ｘ８０および／またはｐＨＥＬＯ＿ＫａｎＶ４によりコードされる、
前記細胞。

【請求項73】

配列番号２、１０５０１、１１００１、１１１０１、１１２０１、１１３０１、１１５０１もしくは１１７０１の核酸配列を含むか、またはこれからなる、ＡＡＶ ５’ＩＴＲバリアント。

【請求項74】

配列番号２８、１０５１８、１１０１８、１１１１８、１１２１８、１１３１８、１１５１８もしくは１１７１８の核酸配列を含むか、またはこれからなる、ＡＡＶ ３’ＩＴＲバリアント。

【請求項75】

ｒＡＡＶベクターゲノムを含む、単離されたポリヌクレオチドであって、ｒＡＡＶベクターゲノムが、以下：
（ａ）請求項７３に記載のＡＡＶ ５’ＩＴＲバリアント；
（ｂ）発現カセット、ここで、発現カセットは、少なくとも（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、（ｉｉ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）１つ以上のターミネーター、および（ｉｖ）前記ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナルを含む；ならびに
（ｃ）請求項７４に記載のＡＡＶの３’ＩＴＲバリアント、
を含むか、またはこれらからなる、
前記単離されたポリヌクレオチド。

【請求項76】

請求項７５に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、これは、プラスミドであり、任意にここで、プラスミドは、ｐＵＣ１１８骨格を含む、前記単離されたポリヌクレオチド。

【請求項77】

以下：
（Ａ）請求項７５または７６に記載の単離されたポリヌクレオチド；
を含む、組成物であって、
任意に、以下：
（Ｂ）トランスフェクション試薬；
（Ｃ）ＡＡＶキャプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；
（Ｄ）ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；
（Ｅ）Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４および／またはＶＡ ＲＮＡからなる群より選択される、１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子を含む、ポリヌクレオチド；または
（Ｆ）薬学的に許容し得る担体または賦形剤、
のうちのいずれか１つ以上をさらに含み、
さらに任意にここで：
（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ１０のｃａｐ遺伝子から誘導される；および／または
（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ１０のｒｅｐ遺伝子から誘導される、
前記組成物。

【請求項78】

請求項７７に記載の組成物であって、ここで：
（ａ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、請求項６３に記載のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子であり；
（ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、請求項６４または６５に記載のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であり；および／または
（ｃ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子は、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝であり、
任意にここで：
（ｉ）ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子は、プラスミドによりコードされ、任意にここで、プラスミドは、ＡＡＶ２／９プラスミドであり、これはさらに任意に、配列番号７００の核酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み；および／または
（ｉｉ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子は、ｐＡＬＤ－Ｘ８０および／またはｐＨＥＬＯ＿ＫａｎＶ４によりコードされる、
前記組成物。

【請求項79】

請求項７５または７６に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む細胞、任意にパッケージング細胞であって、さらに任意にここで、ＡＡＶ ｃａｐおよび／またはＡＡＶ ｒｅｐをコードするポリヌクレオチドを含む、前記細胞。

【請求項80】

以下：
（Ｉ）ＡＡＶキャプシド；および
（ＩＩ）請求項７５または７６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターゲノム；
を含むか、またはこれからなる、ｒＡＡＶベクターであって、
任意にここで、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０キャプシド、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ１０キャプシド、またはそのバリアントである、
前記ｒＡＡＶベクター。

【請求項81】

ＡＡＶキャプシドが、請求項３６または３７に記載のＡＡＶキャプシドである、ｒＡＡＶベクター。

【請求項82】

in vivoでの投与のために好適な組成物（単数）または組成物（複数）であって、以下：
（Ａ）請求項８０または８１に記載のｒＡＡＶベクターの予防または治療有効量；および
（Ｂ）薬学的に許容し得る担体；
を含む、前記組成物。

【請求項83】

それを必要とする対象における遺伝子治療の方法であって、それを必要とする対象に、請求項８０または８１に記載の少なくとも１つのｒＡＡＶベクターまたは請求項８２に記載の組成物（単数）もしくは組成物（複数）の予防または治療有効量を投与することを含む、前記方法。

【請求項84】

ウイルスベクターを作製する方法であって、請求項７５または７６に記載の単離されたポリヌクレオチドをパッケージング細胞中に導入することを含み、
任意にここで、ウイルスベクターは、請求項８０または８１に記載のｒＡＡＶであり、
および任意に、以下：
（ａ）ＡＡＶキャプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；および／または
（ｃ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子、任意にＥ１、Ｅ２、Ｅ４および／またはＶＡ ＲＮＡを含む、ポリヌクレオチド；
をパッケージング細胞中に導入することをさらに含む、
前記方法。

【請求項85】

ウイルスベクターを作製する方法であって、請求項７５または７６に記載のｒＡＡＶベクターゲノムを含むパッケージング細胞を培養することを含み、
任意にここで、ウイルスベクターは、請求項８０または８１に記載のｒＡＡＶベクターであり、
さらに任意にここで、パッケージング細胞は、以下：
（ａ）ＡＡＶキャプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；および／または
（ｃ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子、任意にＥ１、Ｅ２、Ｅ４および／またはＶＡ ＲＮＡを含む、ポリヌクレオチド；
を含む、
前記方法。

【請求項86】

請求項８４または８５に記載の方法であって、ここで：
（ａ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、請求項６３に記載のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子であり；
（ｂ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、請求項６４または６５に記載のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子であり；および／または
（ｃ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子は、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子であり；
任意にここで：
（ｉ）ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子は、プラスミドによりコードされ、任意にここで、プラスミドは、ＡＡＶ２／９プラスミドであり、これはさらに任意に、配列番号７００の核酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み；および／または
（ｉｉ）１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子は、ｐＡＬＤ－Ｘ８０および／またはｐＨＥＬＯ＿ＫａｎＶ４によりコードされる、
前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本願は、２０１９年１２月３１日に出願された米国仮出願番号：６２／９５５，６６７、表題「IMPROVED AAV-ABCD1 CONSTRUCTS AND USE FOR TREATMENT OR PREVENTION OF ADRENOLEUKODYSTROPHY (ALD) AND/OR ADRENOMYELONEUROPATHY (AMN)」、に対する優先権を主張し、該仮出願の内容は、その全体において本明細書において参考として援用される。

【0002】

配列表の開示
本願は、２０２０年１２月３１日に作成された１，１２４，２３５バイトのサイズを有する「1160547o001000.txt」と名付けられたファイルにおいて配列表を含み、これは、その全体において本明細書により参考として援用される。

【背景技術】

【0003】

背景
本発明は、ＣｏＡ活性化型極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の分解のためのペルオキシソーム中への輸送を担当する副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤＰ）をコードする、ペルオキシソーム膜ＡＴＰ結合カセットトランスポーター（ＡＢＣＤ１）遺伝子における変異により引き起こされる、進行性の一遺伝子性神経変性疾患である、Ｘ連鎖型副腎白質ジストロフィー（Ｘ－ＡＬＤ）を処置するための遺伝子治療を記載する。ヒトＡＬＤＰは、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００００３３またはＮＭ＿００００３３．４により同定される核酸配列によりコードされる。

【0004】

ＡＬＤＰは、ペルオキシソーム膜内在性のタンパク質であり、ＡＴＰ結合ドメインがペルオキシソーム膜の細胞質側表面に向かって位置し、ペルオキシソーム膜を越えてペルオキシソームマトリックス中へＶＬＣＦＡ－ＣｏＡを輸送することを担当している。ＡＬＤＰの欠損は、ＶＬＣＦＡの分解の障害をもたらす。結果として、Ｘ－ＡＬＤ患者は、血液（これは、血漿または血清のいずれからも検出され得る）、および脳、脊髄、副腎皮質の組織、および他の組織において、高レベルの極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）、例えば、炭素数２０より長い鎖長を有する（すなわち、Ｃ＞２０、例えば「Ｃ２４：０」および「Ｃ２６：０」）飽和ＶＬＣＦＡの蓄積を示す。

【0005】

Ｘ－ＡＬＤの臨床表現型として、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）および大脳型副腎白質ジストロフィー（ＣＣＡＬＤ）が挙げられる。症状は、小児期または成人期において開始し得る。成人ＡＬＤ患者は、典型的には、２０代において、衰弱性の神経障害である副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）を発症する（Engelen et al., Orphanet J Rare Dis. 2012; 7: 51）。Ａｂｃｄ１ノックアウトマウスは、ＡＭＮと類似の表現型を生じ、脊髄の軸索変性、ならびに後根神経節ニューロン（ＤＲＧ）の罹患に起因する末梢性ニューロパチーを示す（Pujol et al., Hum Mol Genet. 2002; 11:499-505）。

【0006】

小児期大脳型副腎白質ジストロフィー（ＣＣＡＬＤ）は、非常に希少であり、ときには迅速に進行する、男児（発症年齢の年齢中位数７；範囲３～１５歳）におけるＸ連鎖型遺伝性神経障害であって、処置されない場合、診断後中央値で５年以内に、植物状態、最終的には死亡に至る。ＣＣＡＬＤは、しばしば、初期にはアジソン病様を呈するが、診断は、通常、注意力、思考、集中、および他の大脳の機能の「突然」の低下に基づいて行われ、これは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）における大脳の脱髄の確証的知見を伴う。脱髄の前は、患者の脳のＭＲＩは正常であり、神経発生的な異常は存在しない。臨床経過は、初めは「ゆっくり」であり得るが、迅速に進行性となり得、脳内のミエリンの広範な消失により、不可逆性となり得る。用語「ゆっくり」および「突然」は、脱髄の期間は本当にはわからないが、認知および運動機能の迅速な低下は、いつでも、未知の理由のために起こり得るという点において、相対的である。実際に、疾患の臨床症状が非常に少ない場合において、ＭＲＩでの変化が、症状に先行し、広範な脱髄を伴って甚だしく異常である場合がある。米国におけるＸ連鎖のＡＬＤの発生率は、約１：２１，０００人（男性出生数）であり、約３５％がＣＣＡＬＤを発症する；約３５～４０人の男児が、毎年ＣＣＡＬＤを診断される。疾患の原因は、副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＬＤＰ）遺伝子生成物の機能不全または不在をもたらす、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）遺伝子の変異である。ＡＬＤＰは、細胞ペルオキシソームに局在し、ここで、それは、細胞の構造および機能を維持するために用いられるより短い脂肪酸へのベータ酸化を介して、極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）（鎖長＞炭素数２０）の分解に関与する。

【0007】

現在、ＡＬＤは、機能的なＡＬＤＰを生成する細胞を供給する同種造血幹細胞移植（ＨＣＴ）により処置され、機能的なＡＬＤＰを生成する細胞を用いる完全に一致する血縁ドナーのヒト幹細胞移植は、潜在的には、脱髄の進行を寛解させるかまたはこれを停止させることができる。しかし、同種ＨＣＴが疾患を安定させるには１２～１８か月間を必要とし、疾患の進行性の性質のために、移植は、診断後可能な限り早く行うべきである。このことは、ときに、血縁または非血縁の一致する骨髄幹細胞ドナーを見つけるために必要とされるリードタイムのために問題となる。同種幹細胞の使用はまた、移植不全、ならびに急性および慢性の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発症のリスクを示す。これらの合併症は、死をもたらし得、非血縁ドナーが同種造血幹細胞のソースとして利用される場合に発生率が増加する。

【0008】

ＡＬＤＰ置換の別のソースは、一致するか、より典型的には、部分的に一致する臍帯血細胞移植の使用である。しかし、臍帯血幹細胞（ＣＢＳＣ）の使用は、移植不全のリスク、および輸血によるサポートの延長を必要とする生着までの時間の延長を伴い、問題がある。実際に、全ての形態の同種ＨＣＴが、１０～１５％の移植関連死亡率のリスク、および３０％までの慢性移植変態宿主病のリスクを伴う。

【0009】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、不完全な非病原性のヒトパルボウイルスであり、それらの温和な免疫応答および病原性の欠落のために、遺伝子送達のために一般的に用いられる。ＡＡＶウイルスは、長期の導入遺伝子発現を指揮することができるが、一般に、宿主ゲノム中に永続的には組み込まれない。かかる能力により、ＡＡＶは、安全かつ効果的な遺伝子治療のための実行可能な選択肢を提供する。ヒトＡＢＣＤ１遺伝子の送達のための、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型９（ｒＡＡＶ９）ベクターを用いるin vitroおよびin vivoでの中枢神経系細胞の形質導入は、先に報告されているが、より安全でありより効果的な副腎白質ジストロフィー治療のために、当該分野においてまだ対処されていない必要性が存在する。異なるＡＡＶ血清型は異なる細胞向性を示すことから、トランスフェクション系を確立するために、最適な血清型を選択することが重要である。本発明は、安全かつ効果的な、すなわち、Ｘ－ＡＬＤまたはＡＭＮを罹患する患者において非毒性のレベルのＡＢＣＤ１を送達するために用いることができる、改善されたアデノ随伴ウイルスベクターおよび送達系を提供することにより、これらの問題および他の問題に対する解答を提供する。

【発明の概要】

【0010】

発明の簡単な要旨
新規の、および改善されたＡＡＶ ＤＮＡコンストラクトの投与を含む、ＡＬＤまたはＡＭＮを処置または予防するための安全および効果的な方法および材料を提供することは、本発明の特定の目的である。

【0011】

本発明は、改善されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）コンストラクトを提供する。本発明はまた、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）遺伝子をコードするｒＡＡＶベクターゲノムを含むプラスミド（「ｒＡＡＶゲノムベクター」）、およびＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする第２のプラスミド（「Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド」）、および１つ以上のウイルスヘルパープラスミドのコトランスフェクションを通して、改善された組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを生成するための方法を提供する。本発明はまた、これらのＡＡＶコンストラクトを含む細胞および組成物を提供し、これらは、それを必要とする対象における副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄ニューロパチーの処置および／または予防において用いることができる。

【0012】

本発明はさらに、ＡＬＤタンパク質（「ＡＬＤＰ」、本明細書においてまた「ＡＢＣＤ１」タンパク質としても言及される）を発現するＡＢＣＤ１遺伝子をコードする、かかる改善されたＡＡＶコンストラクトを作製するための方法を提供する。また、本発明は、それを必要とする対象における副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄ニューロパチーの処置および／または予防のために、対象においてＡＬＤタンパク質を発現する改善されたＡＡＶコンストラクトならびにそれを含む細胞および組成物を用いる方法、例えば、かかる改善されたＡＡＶコンストラクトが、例えば、髄腔内、脳室内（ＩＣＶ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、血管内、筋肉内、または大槽内投与により投与される方法を提供する。

【0013】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；（ｃ）修飾されたウッドチャック転写後調節エレメント、ここで、Ｘタンパク質は、不活化されている（ＷＰＲＥ ｘ－ｉｎａｃｔ）；（ｄ）少なくとも１つのターミネーター；（ｅ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｆ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0014】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）（ｃ）に作動可能に連結されたエンハンサー；（ｃ）その３’末端においてイントロンをさらに含み、（ｄ）に作動可能に連結された、プロモーター；（ｄ）ヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチド；（ｅ）修飾されたウッドチャック転写後調節エレメント、ここで、Ｘタンパク質は、不活化されている（ＷＰＲＥ ｘ－ｉｎａｃｔ）；（ｆ）少なくとも１つのターミネーター；（ｇ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｈ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0015】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）その５’末端においてエンハンサーをまたはその３’末端においてイントロンをさらに含む、ヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、プロモーター；（ｃ）修飾されたウッドチャック転写後調節エレメント、ここで、Ｘタンパク質は、不活化されている（ＷＰＲＥ ｘ－ｉｎａｃｔ）；（ｄ）少なくとも１つのターミネーター；（ｅ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｆ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0016】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）ヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；（ｃ）少なくとも１つのターミネーター；（ｄ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｅ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0017】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）（ｃ）に作動可能に連結されたエンハンサー；（ｃ）その３’末端においてイントロンをさらに含む、プロモーター；（ｄ）ヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている；（ｅ）少なくとも１つのターミネーター；（ｆ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｇ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0018】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）その５’末端においてエンハンサーをまたはその３’末端においてイントロンをさらに含む、ヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、プロモーター；（ｃ）少なくとも１つのターミネーター；（ｄ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｅ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0019】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）その５’末端において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（「ＣＣＡＣＣ」または「ＧＣＣＡＣＣ」、または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列：

【化1】

へのアプローチを表す任意の配列）をさらに含む、ヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；（ｃ）少なくとも１つのターミネーター；（ｄ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｅ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0020】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）（ｃ）に作動可能に連結されたエンハンサー；（ｃ）その３’末端においてイントロンをさらに含み、（ｄ）に作動可能に連結された、プロモーター；（ｄ）その５’末端において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（「ＣＣＡＣＣ」または「ＧＣＣＡＣＣ」、または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列：

【化2】

へのアプローチを表す任意の配列）をさらに含む、ヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチド；（ｅ）少なくとも１つのターミネーター；（ｆ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｇ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0021】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）その５’末端において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（「ＣＣＡＣＣ」または「ＧＣＣＡＣＣ」、または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列：

【化3】

へのアプローチを表す任意の配列）をさらに含む、ヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター；（ｃ）任意に、Ｋｏｚａｋ配列の５’末端におけるエンハンサー、またはプロモーターの３’末端におけるイントロン；（ｄ）少なくとも１つのターミネーター；（ｅ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｆ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0022】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）ＡＢＣＤ１コード配列中に３、６または９個のヌクレオチドの変化を含むヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドの上流で、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（「ＣＣＡＣＣ」または「ＧＣＣＡＣＣ」、または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列：

【化4】

へのアプローチを表す任意の配列）に作動可能に連結されたプロモーター；（ｃ）少なくとも１つのターミネーター；（ｄ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｅ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0023】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）（ｃ）に作動可能に連結されたエンハンサー；（ｃ）その３’末端（ｄ）においてイントロンを含むプロモーターであって、ＡＢＣＤ１コード配列中に３、６または９個のヌクレオチドの変化を含むヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドの上流で、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（「ＣＣＡＣＣ」または「ＧＣＣＡＣＣ」、または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列：

【化5】

へのアプローチを表す任意の配列）を含むもの；（ｅ）少なくとも１つのターミネーター；（ｆ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｇ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0024】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を含むｒＡＡＶゲノムベクターを企図する：（ａ）５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）；（ｂ）ＡＢＣＤ１コード配列中に３、６または９個のヌクレオチドの変化を含むヒトＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドの上流で、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（「ＣＣＡＣＣ」または「ＧＣＣＡＣＣ」、または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列：

【化6】

へのアプローチを表す任意の配列）に作動可能に連結されたプロモーター；（ｃ）任意に、Ｋｏｚａｋ配列の５’末端におけるエンハンサー、またはプロモーターの３’末端におけるイントロン；（ｄ）少なくとも１つのターミネーター；（ｅ）少なくとも１つのポリＡシグナル；および（ｆ）３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）。

【0025】

態様のうちのいずれかにおいて、少なくとも１つのターミネーターが、ＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて含まれていてもよい。

【0026】

いくつかの態様において、ｒＡＡＶゲノムは、エンハンサー、プロモーター、β－アクチンエクソン、イントロン、および／またはβ－グロビンエクソンを、任意に５’末端から３’末端への方向において含む。

【0027】

態様のうちのいくつかにおいて、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーである。

【0028】

態様のうちのいくつかにおいて、プロモーターは、ニワトリベータアクチンプロモーターである。

【0029】

態様のうちのいくつかにおいて、β－アクチンエクソンは、ニワトリベータアクチンの選択的転写物のうちの一方から誘導され、キメラ性イントロンは、ニワトリベータアクチンの第１イントロンからのドナーおよびウサギベータ－グロビン第２イントロンからのアクセプターからなる。

【0030】

態様のうちのいくつかにおいて、イントロンは、キメラ性イントロンである。

【0031】

態様のうちのいくつかにおいて、β－グロビンエクソンは、ウサギβ－グロビンエクソン、例えば、ウサギβ－グロビン第３エクソンである。

【0032】

態様のうちのいずれかにおいて、ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ｂＧＨポリＡシグナル、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。ポリＡシグナルはまた、本明細書において、「ｐＡ」としても言及される。

【0033】

他の態様において、本発明は、部分的に、（ａ）プロモーター（ｂ）複製遺伝子；（ｃ）キャプシド遺伝子を含む、ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドを企図する。

【0034】

いくつかの態様において、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドは、ｐ５、ｐ１９、またはｐ４０プロモーターのうちの１つ以上を含む。

【0035】

いくつかの態様において、複製遺伝子は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０の、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする複製遺伝子またはそのバリアントから選択される。

【0036】

いくつかの態様において、複製遺伝子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０の複製遺伝子であるか、またはこれから誘導される。

【0037】

いくつかの態様において、複製遺伝子（Ｒｅｐ遺伝子）が、ＡＡＶ２のものから誘導される場合、２つの複製遺伝子生成物、ＲＥＰ７８およびＲＥＰ６８は、ｐ５プロモーターにより転写されてもよく、２つの複製遺伝子生成物、ＲＥＰ５２およびＲＥＰ４０は、ｐ１９プロモーターにより転写されてもよい。いくつかの態様において、キャプシド遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０の、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質をコードするキャプシド遺伝子またはそのバリアントから選択される。

【0038】

いくつかの態様において、キャプシド遺伝子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ．１０（本明細書においてまたＡＡＶｒｈ１０としても言及される）のキャプシド遺伝子であるか、またはこれから誘導される。

【0039】

いくつかの態様において、キャプシド遺伝子（Ｃａｐ遺伝子）が、ＡＡＶ９のものから誘導される場合、ＡＡＶ９の３つの複製遺伝子生成物ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、ｐ４０プロモーターにより（すなわち、その制御下において）転写されてもよい。

【0040】

いくつかの態様において、キャプシド遺伝子（Ｃａｐ遺伝子）が、ＡＡＶ２のものから誘導される場合、ＡＡＶ２の３つの複製遺伝子生成物ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が、生成され得る。
^１本発明者らがここで「第１」、「第２」または「第３」のエクソンに言及する場合、これは、５’末端からの転写物における「第１」、「第２」または「第３」のエクソンを指す。

【0041】

いくつかの態様において、キャプシド遺伝子（Ｃａｐ遺伝子）が、ＡＡＶｒｈ．１０のものから誘導される場合、ＡＡＶｒｈ．１０の３つの複製遺伝子生成物ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が、生成され得る。

【0042】

いくつかの態様において、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドは、全体的に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０から誘導されてもよいが、一方、いくつかの態様において、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドは、ＡＡＶ２からの１つ以上のエレメント／遺伝子、およびＡＡＶ９からの１つ以上のエレメント／遺伝子を含むＡＡＶ２／９などの、ハイブリッド血清型のものであってもよい。ある態様において、Ｒｅｐ／ＣａｐプラスミドがＡＡＶ２／９血清型のものである場合、Ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２のものであってもよく、Ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９のものであってもよい。

【0043】

いくつかの態様において、５’および３’逆位末端反復配列（ＩＴＲＳ）は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０から天然に生じる。

【0044】

いくつかの態様において、５’および３’逆位末端反復配列（ＩＴＲＳ）は、ＡＡＶ２である。

【0045】

いくつかの態様において、５’および３’逆位末端反復配列（ＩＴＲＳ）は、天然のＡＡＶ２ ＩＴＲと比較して、５’末端において１５ヌクレオチド（「ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴ」）、および３’末端において最後の１５ヌクレオチド（「ＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ」）、短縮される。この（２つの取り除かれた１５ヌクレオチドの配列のセット）は、Ａ領域をほぼ全て含む。

【0046】

他の態様において、本発明は、部分的に、ｒＡＡＶ生成において役立つヘルパーウイルスまたはウイルスヘルパープラスミドを企図する。いくつかの態様において、ヘルパーウイルスは、アデノウィルス、単純ヘルペスウイルスまたはパピローマウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスヘルパープラスミドは、アデノウィルス、単純ヘルペスウイルスまたはパピローマウイルス１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの態様において、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、野生型（ＷＴ）、またはバリアントアデノウィルス、例えばアデノウィルス５（Ａｄ５）（例えば、アクセッション番号ＡＣ＿０００００８．１または配列番号２０００）またはアデノウィルス２（Ａｄ２）（例えば、アクセッション番号Ｊ０１９１７．１または配列番号３０００）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、例えば、ヒトＨＳＶ Ｉ型（例えば、アクセッション番号ＮＣ＿００１８０６）、パピローマウイルス、またはワクシニアウイルス（例えば、アクセッション番号ＮＣ＿００６９９８）から誘導されるか、またはその１つ以上の遺伝子を含む。

【0047】

いくつかの態様において、ヘルパーウイルスまたはウイルスヘルパープラスミドは、アデノウィルスからのＥ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４および／またはＶＡ ＲＮＡ領域配列を含む。

【0048】

いくつかの態様において、かかるヘルパーウイルスまたはウイルスヘルパープラスミドは、ｒＡＡＶベクターのパッケージング、生成および／または機能を促進する、１つ以上の遺伝子または遺伝子生成物（またはエレメントもしくは因子）を提供する。

【0049】

いくつかの態様において、ヘルパーウイルスまたはウイルスヘルパープラスミドがＡｄ５から誘導される場合（例えば、本明細書において「ｐＡＬＤ－Ｘ８０」として言及されるプラスミド）、ヘルパーウイルスまたはプラスミドは、Ａｄ５領域ＶＡ－ＲＮＡ、Ａｄ５領域Ｅ２、および／またはＡｄ５領域Ｅ４を含んでもよい。ある態様において、Ａｄ５領域ＶＡ－ＲＮＡは、ＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）および／またはＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ ＩＩ）を含んでもよい。ある態様において、Ａｄ５領域Ｅ２は、Hexon（Ｃ末端フラグメント）、２３Ｋエンドプロテアーゼ、Ｅ２Ａ／ＤＢＰ、Hexonアセンブリー（１００Ｋ）、Hexonアセンブリー（３３Ｋ）、Hexonアセンブリー（２２Ｋ）、および／またはHexonに関連する前駆体を含んでもよい。ある態様において、Ａｄ５領域Ｅ４は、Fiber、Ｅ４ ＯＲＦ１、Ｅ４ ＯＲＦ２、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ６、および／またはＥ４ ＯＲＦ６／７をコードしていてもよい。

【0050】

いくつかの態様において、ヘルパーウイルスまたはプラスミドがＡｄ２から誘導される場合（例えば、本明細書において「ｐＨＥＬＰ＿ＫａｎＶ４」として言及されるプラスミド）、ヘルパーウイルスまたはプラスミドは、Ａｄ２領域ＶＡ－ＲＮＡ、Ａｄ２領域Ｅ２、および／またはＡｄ２領域Ｅ４を含んでもよい。ある態様において、Ａｄ２領域ＶＡ－ＲＮＡは、ＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）および／またはＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ ＩＩ）を含んでもよい。ある態様において、Ａｄ２領域Ｅ２は、Hexonをコードしなくともよく、２３Ｋエンドプロテアーゼ（Ｃ末端フラグメント）、Ｅ２Ａ／ＤＢＰ、Hexonアセンブリー（１００Ｋ）、Hexonアセンブリー（３３Ｋ）、Hexonアセンブリー（２２Ｋ）、および／またはHexonに関連する前駆体をコードしていてもよい。ある態様において、Ａｄ２領域Ｅ４は、Fiberをコードしなくともよく、Ｅ４ ＯＲＦ１、Ｅ４ ＯＲＦ２、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ６および／またはＥ４ ＯＲＦ６／７をコードしていてもよい。

【0051】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、以下を企図する：
ｒＡＡＶビリオンからのウイルスキャプシド中にパッケージングされていてもよい組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムを含む、単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、前記ｒＡＡＶベクターゲノムは、以下を含むか、またはこれらからなる：
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；
（ｂ）発現カセット、ここで、発現カセットは、少なくとも以下を含む：
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、
（ｉｉ）ポリＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド、
（ｉｉｉ）１つ以上のターミネーター、および
（ｉｖ）前記ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナル；
ならびに
（ｃ）３’ＩＴＲ。
ｒＡＡＶベクターゲノムは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まなくともよく、あるいは、Ｘタンパク質が発現されないか、またはこれが不活性な形態において発現されることをもたらす、少なくとも１つの変異を含む、修飾されたＷＰＲＥ（ＷＰＲＥｘ－ｉｎａｃｔ）を含んでもよい。

【0052】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、前述のＡＡＶゲノムベクターのうちのいずれかを前述のＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドのうちのいずれかおよび前述のウイルスヘルパープラスミドのうちのいずれかと共に用いて作製することができる、ｒＡＡＶベクターを企図する。

【0053】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、（Ｉ）前述のＡＡＶキャプシドのうちのいずれか、および（ＩＩ）前述のＡＡＶゲノムのうちのいずれかを含む、ｒＡＡＶベクターを企図する。

【0054】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、（Ａ）ｒＡＡＶゲノムベクターのうちのいずれか、および任意に以下のうちの１つ以上を含む、組成物を企図する：（Ｂ）前述のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子のうちのいずれかを含むポリヌクレオチド；（Ｃ）前述のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子のうちのいずれかを含むポリヌクレオチド；（Ｄ）前述のアデノウィルスヘルパー遺伝子のうちのいずれかを含むポリヌクレオチド；および／または（Ｅ）薬学的に許容し得る担体または賦形剤。いくつかの場合において、かかる組成物は、前述のｒＡＡＶベクターのうちのいずれかを生成するために用いることができる。

【0055】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、（Ｉ）前述のｒＡＡＶベクターのうちのいずれか、および（ＩＩ）薬学的に許容し得る担体を含む、組成物を企図する。いくつかの場合において、かかる組成物は、本明細書において開示される疾患状態、例えば副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）または副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）を処置および予防する方法のうちのいずれかにおいて、用いることができる。

【0056】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、前述のＡＡＶコンストラクトのうちのいずれかを作製する方法を企図する。

【0057】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、それを必要とする対象における副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）または副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）の処置のために、前述のＡＡＶコンストラクトのうちのいずれかを用いるかまたは投与する方法を企図する。

【0058】

いくつかの態様において、本発明は、部分的に、前述のＡＡＶコンストラクトのうちのいずれかを、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて用いるかまたは投与する方法を企図する。

【図面の簡単な説明】

【0059】

【図1】図１Ａ～Ｂは、それぞれＷＰＲＥ、修飾されたＷＰＲＥ（Ｘタンパク質の不活化をもたらす変異を含む）、またはＷＰＲＥを欠失するＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ビリオンを含む様々なＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ビリオン（ＡＡＶ９キャプシドの使用に起因して「ＡＡＶ９」として言及される）を投与されたＡＢＣＤ１ノックアウト（ＫＯ）マウスにおける、脊髄試料におけるＡＢＣＤ１発現を比較するin vivoでの実験の結果を含み、ここで、ＡＢＣＤ１発現は、脊髄試料において、ウェスタンブロット法を用いて検出した。

【0060】

【図2】図２Ａ～Ｃは、さらなるin vivoでの実験のウェスタンブロットデータを含み、ここで、ＡＢＣＤ１ノックアウトマウスは、それぞれ、異なる投与量の、ＷＰＲＥ（「オリジナル」として同定される）、修飾されたＷＰＲＥ（Ｘタンパク質の不活化をもたらす変異を含む、「Ｘ－不活化されたもの」として同定される）を含むＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ビリオン、またはＷＰＲＥを欠失するＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ビリオンを投与され、ここで、ＡＢＣＤ１発現は、処置されたＡＢＣＤ１ノックアウトマウスから得られた脊髄試料において、ウェスタンブロット法を用いて検出した。

【0061】

【図3】図３Ａ～３Ｃは、異なる投与量（３×１０^１１または１×１０^１１ゲノムコピー／マウス）の、それぞれ、ＷＰＲＥを含む（「オリジナル」として同定される）か、修飾されたＷＰＲＥを含む（Ｘタンパク質の不活化をもたらす変異を含み、「Ｘ－不活化されたもの」として同定される）ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ビリオン、またはＷＰＲＥを欠失するＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ビリオンを投与された、ＡＢＣＤ１ノックアウトマウスの脊髄試料における、ＡＢＣＤ１発現の用量応答を比較する；ここで、ＡＢＣＤ１発現は、やはり、異なる用量を投与されたＡＢＣＤ１ノックアウトマウスから得られた脊髄試料において、ウェスタンブロット法を用いて検出された。ＡＢＣＤ１発現は、ＷＰＲＥを欠失するビリオンにおいて、より低かった。

【0062】

【図4】図４Ａ～４Ｂは、ＷＰＲＥを含む（「オリジナル」）、または修飾されたＷＰＲＥを含む（Ｘタンパク質の不活化をもたらす変異を含む、「ｘ－ｉｎａｃｔ」）異なるＡＡＶ９－ＡＢＣＤ１ビリオンで形質導入された混合グリア培養物中のＶＬＣＦＡレベルを比較し、ここで、ＶＬＣＦＡレベルは、ＶＬＣＦＡ分析のために採取された細胞から、形質導入の４日後に検出された。示されるとおり、ＶＬＣＦＡレベルは、異なるＡＡＶ９．ＡＢＣＤ１ビリオンで形質導入された混合グリア培養物におけるものとほぼ同じ程度まで低下している。全てのＡＡＶベクターは、用量依存的な様式において、ＶＬＣＦＡを低下させた。

【0063】

【図5】図５は、ｐＳＢＴ１０１の模式的地図を含み、これは、他の配列の中でも、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ベータ－アクチンエクソン、キメラ性イントロン、ウサギベータ－グロビンエクソン、ｈＡＢＣＤ１ ５’ＵＴＲ、ヒトＡＢＣＤ１コード配列、ｈＡＢＣＤ１ ３’ＵＴＲ、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲ、およびＡｍｐＲプロモーターに作動可能に連結されたＫａｎＲマーカーを含み；ここで、かかる配列が、ｐＵＣ５７骨格上に含まれる。

【0064】

【図6】図６は、ｐＯＢ１００５の模式的地図を含み、これは、他の配列の中でも、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲバリアント（野生型５’ＩＴＲまたはｐＳＢＴ１０１の５’ＩＴＲより短い）、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ベータ－アクチンエクソン、ベータ－アクチンエクソン、キメラ性イントロン、ウサギベータ－グロビンエクソン、その５’末端においてＫＯＺＡＫ配列をさらに含むヒトＡＢＣＤ１コード配列、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲバリアント（野生型３’ＩＴＲまたはｐＳＢＴ１０１の３’ＩＴＲより短い）、およびＡｍｐＲプロモーターに作動可能に連結されたＫａｎＲマーカーを含み；ここで、かかる配列が、ｐＵＣ１１８骨格上に含まれる。

【0065】

【図7】図７は、ｐＯＢ１０１０の模式的地図を含み、これは、他の配列の中でも、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲバリアント（野生型５’ＩＴＲまたはｐＳＢＴ１０１の５’ＩＴＲより短い）、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ベータ－アクチンエクソン、キメラ性イントロン、ウサギベータ－グロビンエクソン、ｈＡＢＣＤ１ ５’ＵＴＲ、ヒトＡＢＣＤ１コード配列、ｈＡＢＣＤ１ ３’ＵＴＲ、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲ、およびＡｍｐＲプロモーターに作動可能に連結されたＫａｎＲマーカーを含み；ここで、かかる配列が、ｐＵＣ１１８骨格上に含まれる。

【0066】

【図8】図８Ａ～Ｂは、ｐＳＢＴ１０１またはｐＯＢ１００５でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（およびトランスフェクトされていないＨＥＫ２９３対照細胞）において行われた一過性トランスフェクション実験における、ＡＢＣＤ１発現レベルを比較し、ここで、プラスミドは、並んでトランスフェクトされ、発現は、細胞ライセート中でウェスタンブロッティングにより評価され、ブロットは、濃度測定を用いて定量された。ウェスタンブロット分析においては、抗ＡＬＤタンパク質抗体クローンＯＴＩ４Ｃ２（OriGene）を用いた。結果は、ｐＯＢ１００５プラスミドが、より良好なＡＢＣＤ１発現をもたらしたことを示す。

【0067】

【図9】図９は、ｐＳＢＴ１０１およびｐＯＢ１００５のＡＡＶ中へのパッケージング能力（packageability）を、力価（ｇｃ／ｍｌ）、生産性（ｇｃ／細胞）および収量（ｇｃ）に基づいて比較する。

【0068】

【図10A】図１０Ａは、５’ＩＴＲから３’ＩＴＲへのコンストラクトの模式図を、オリジナルのＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥウイルス粒子、ＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥＸｉｎａｃｔウイルス粒子、およびＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１（ＷＰＲＥなし）ウイルス粒子（本明細書においてまた「ＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１」としても言及される）、５’ＩＴＲから３’ＩＴＲへのものと比較する。「ＣＭＶ－ｅ」、「ＣＢＡ－ｐ」、「ＢＡ－ｅｘ」、「Ｃｈｍ－ｉｎｔ」および「ＲＢＧ－ｅｘ」は、５’ＩＴＲ－３’ＩＴＲ中に含まれるエレメントであり、それぞれ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ベータアクチンエクソン、キメラ性イントロン、およびウサギベータ－グロビンエクソンを意味する。「ＡＢＣＤ１」は、ＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドである。「ＳＶ４０ｐＡ」および「ｂＧＨｐＡ」は、それぞれ、ＳＶ４０ポリＡシグナルおよびベータ増殖ホルモンポリＡシグナルを意味する。

【0069】

【図10B】図１０Ｂは、以下に割り当てられた配列番号をまとめる表を提供する：対応するｒＡＡＶゲノムベクター（示されたｒＡＡＶウイルス粒子を生成するために用いることができるプラスミド）の５’ＩＴＲ－３’ＩＴＲ中に含まれる異なるエレメントの配列；対応するｒＡＡＶゲノムベクター中に含まれる５’ＩＴＲ－３’ＩＴＲ配列；対応するｒＡＡＶゲノムベクター中に含まれるｒＡＡＶベクターゲノム配列（すなわち、示されたｒＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングされた配列）；および対応するｒＡＡＶゲノムベクターの全長プラスミド配列。例えばＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１－ＸｉｎａｃｔのためのｒＡＡＶゲノムベクターは、配列番号１００００の核酸配列を有し、これは、配列番号１００５０の５’ＩＴＲ－３’ＩＴＲ配列を含み、これは、５’ＩＴＲ（配列番号１０００１）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号１０００５）、ベータアクチンエクソン（配列番号１０００８）、その他などの様々なエレメントを含む。「総ポリＡシグナル」とは、ＳＶ４０ポリＡシグナルの開始からｂＧＨポリＡシグナルの終了までに広がる領域を指す。ｒＡＡＶウイルスＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１－Ｘｉｎａｃｔのベクターゲノムは、配列番号１００６０の核酸配列を有する。ベクターＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１－ＸｉｎａｃｔおよびＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１［ＷＰＲＥなし］についての配列番号の割り当ては、図１１Ａ～１１Ｂにおいてさらに可視的に表す。

【0070】

【図11A】図１１Ａは、ＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ Ｘｉｎａｃｔコンストラクトの模式図を、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、β－アクチンエクソン、キメラ性イントロン、ウサギベータ－グロビンエクソン、ＡＢＣＤ１５’ＵＴＲ、ＡＢＣＤ１遺伝子、ＡＢＣＤ１３’ＵＴＲ、ＷＰＲＥ Ｘ ｉｎａｃｔ（これは、不活化されたＸタンパク質の部分的なオープンリーディングフレームを発現するように修飾されたＷＰＲＥである）、ＳＶ４０ポリＡ、ｂＧＨポリＡ、３’ＩＴＲ、ＡＢＣＤ１遺伝子中に含まれるターミネーター１、総ポリＡ（すなわち、ＳＶ４０ｐＡ～ｂＧＨｐＡ）の核酸配列、および５’ＩＴＲ～３’ＩＴＲ配列に割り当てられた配列番号と共に提供する。

【0071】

【図11B】図１１Ｂは、ＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１コンストラクト（ＷＰＲＥなし）の５’ＩＴＲから３’ＩＴＲまでの模式図、ならびに５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、β－アクチンエクソン、キメラ性イントロン、ウサギベータ－グロビンエクソン、ＡＢＣＤ１５’ＵＴＲ、ｈＡＢＣＤ１ ｃＤＮＡ、ＡＢＣＤ１遺伝子中に含まれるターミネーター１、ＡＢＣＤ１３’ＵＴＲ、ＳＶ４０ポリＡ、ｂＧＨポリＡ、総ポリＡ（すなわち、ＳＶ４０ｐＡ～ｂＧＨｐＡ）、３’ＩＴＲの核酸配列、および５’ＩＴＲ～３’ＩＴＲ全体の配列に割り当てられた配列番号を含む。

【図12A】図１２Ａは、様々なウイルス粒子ＳＢＴ１０１、ＯＢ１００５、ＯＢ１０１０、ＯＢ１０１１、ＯＢ１０１２、ＯＢ１０１３、ＯＢ１０１５、ＯＢ１０１０７およびＯＢ１００８の５’ＩＴＲ～３’ＩＴＲコンストラクトの、５’ＩＴＲから３’ＩＴＲまでの模式図を比較する。「ＣＭＶ－ｅ」、「ＣＢＡ－ｐ」、「ＢＡ－ｅｘ」、「Ｃｈｍ－ｉｎｔ」、および「ＲＢＧ－ｅｘ」は、５’ＩＴＲ－３’ＩＴＲ中に含まれるエレメントであり、それぞれ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ベータアクチンエクソン、キメラ性イントロン、およびウサギベータ－グロビンエクソンを意味する。「ＳＶ４０ｐＡ」および「ｂＧＨｐＡ」は、それぞれ、ＳＶ４０ポリＡシグナルおよびベータ増殖ホルモンポリＡシグナルを意味する。「ＡＢＣＤ１」は、ＡＢＣＤ１遺伝子をコードするポリヌクレオチドである。「ＡＢＣＤ１／３ｎｔ」および「ＡＢＣＤ１／９ｎｔ」は、「ＡＢＣＤ１」と比較して、それぞれ３か所および９か所において頃なる核酸を含む。示されたｒＡＡＶウイルス粒子およびプラスミド骨格のベクターゲノムをコードするプラスミド（ｒＡＡＶゲノムベクター）の名称もまた、示される。

【図12B】図１２Ｂは、以下に対して割り当てられた配列番号をまとめる表を提供する：対応するｒＡＡＶゲノムベクター（示されたｒＡＡＶウイルス粒子を生成するために用いることができるプラスミド）の５’ＩＴＲ－３’ＩＴＲ中に含まれる様々なエレメントの配列；対応するｒＡＡＶゲノムベクター中に含まれる５’ＩＴＲ－３’ＩＴＲ配列；対応するｒＡＡＶゲノムベクター中に含まれるｒＡＡＶベクターゲノム配列（すなわち、示されたｒＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングされる配列）；および対応するｒＡＡＶゲノムベクターの全長プラスミド配列。例えば、ＯＢ１０１０のためのｒＡＡＶゲノムベクター、すなわちプラスミドｐＯＢ１０１０は、配列番号１１０００の核酸配列を有し、これは、配列番号１１０５０の５’ＩＴＲ－３’ＩＴＲ配列を含み、これは、５’ＩＴＲ（配列番号１１００１）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号１１００５）、ベータアクチンエクソン（配列番号１１００８）、その他などの多様なエレメントを含む。「総ポリＡシグナル」とは、ＳＶ４０ポリＡシグナルの開始からｂＧＨポリＡシグナルの終了まで広がる領域を指す。ｐＯＢ１０１０により生成されるｒＡＡＶウイルスベクターのベクターゲノムは、配列番号１１０６０の核酸配列を有する。

【図12C】対応するベクターについてのこれらの配列番号の割り当てを、図１２Ｃ～１２Ｊにおいてさらに可視化し、これらは、様々なウイルス粒子、ＳＢＴ１０１（図１２Ｃ）、ＯＢ１００５（図１２Ｄ）、ＯＢ１０１０（図１２Ｅ）、ＯＢ１０１１（図１２Ｆ）、ＯＢ１０１２（図１２Ｇ）、ＯＢ１０１３（図１２Ｈ）、ＯＢ１０１５（図１２Ｉ）およびＯＢ１０１０７（図１２Ｊ）のゲノムのエレメントに割り当てられた配列番号を可視的に説明する。

【図12D】対応するベクターについてのこれらの配列番号の割り当てを、図１２Ｃ～１２Ｊにおいてさらに可視化し、これらは、様々なウイルス粒子、ＳＢＴ１０１（図１２Ｃ）、ＯＢ１００５（図１２Ｄ）、ＯＢ１０１０（図１２Ｅ）、ＯＢ１０１１（図１２Ｆ）、ＯＢ１０１２（図１２Ｇ）、ＯＢ１０１３（図１２Ｈ）、ＯＢ１０１５（図１２Ｉ）およびＯＢ１０１０７（図１２Ｊ）のゲノムのエレメントに割り当てられた配列番号を可視的に説明する。

【図12E】対応するベクターについてのこれらの配列番号の割り当てを、図１２Ｃ～１２Ｊにおいてさらに可視化し、これらは、様々なウイルス粒子、ＳＢＴ１０１（図１２Ｃ）、ＯＢ１００５（図１２Ｄ）、ＯＢ１０１０（図１２Ｅ）、ＯＢ１０１１（図１２Ｆ）、ＯＢ１０１２（図１２Ｇ）、ＯＢ１０１３（図１２Ｈ）、ＯＢ１０１５（図１２Ｉ）およびＯＢ１０１０７（図１２Ｊ）のゲノムのエレメントに割り当てられた配列番号を可視的に説明する。

【図12F】対応するベクターについてのこれらの配列番号の割り当てを、図１２Ｃ～１２Ｊにおいてさらに可視化し、これらは、様々なウイルス粒子、ＳＢＴ１０１（図１２Ｃ）、ＯＢ１００５（図１２Ｄ）、ＯＢ１０１０（図１２Ｅ）、ＯＢ１０１１（図１２Ｆ）、ＯＢ１０１２（図１２Ｇ）、ＯＢ１０１３（図１２Ｈ）、ＯＢ１０１５（図１２Ｉ）およびＯＢ１０１０７（図１２Ｊ）のゲノムのエレメントに割り当てられた配列番号を可視的に説明する。

【図12G】対応するベクターについてのこれらの配列番号の割り当てを、図１２Ｃ～１２Ｊにおいてさらに可視化し、これらは、様々なウイルス粒子、ＳＢＴ１０１（図１２Ｃ）、ＯＢ１００５（図１２Ｄ）、ＯＢ１０１０（図１２Ｅ）、ＯＢ１０１１（図１２Ｆ）、ＯＢ１０１２（図１２Ｇ）、ＯＢ１０１３（図１２Ｈ）、ＯＢ１０１５（図１２Ｉ）およびＯＢ１０１０７（図１２Ｊ）のゲノムのエレメントに割り当てられた配列番号を可視的に説明する。

【図12H】対応するベクターについてのこれらの配列番号の割り当てを、図１２Ｃ～１２Ｊにおいてさらに可視化し、これらは、様々なウイルス粒子、ＳＢＴ１０１（図１２Ｃ）、ＯＢ１００５（図１２Ｄ）、ＯＢ１０１０（図１２Ｅ）、ＯＢ１０１１（図１２Ｆ）、ＯＢ１０１２（図１２Ｇ）、ＯＢ１０１３（図１２Ｈ）、ＯＢ１０１５（図１２Ｉ）およびＯＢ１０１０７（図１２Ｊ）のゲノムのエレメントに割り当てられた配列番号を可視的に説明する。

【図12I】対応するベクターについてのこれらの配列番号の割り当てを、図１２Ｃ～１２Ｊにおいてさらに可視化し、これらは、様々なウイルス粒子、ＳＢＴ１０１（図１２Ｃ）、ＯＢ１００５（図１２Ｄ）、ＯＢ１０１０（図１２Ｅ）、ＯＢ１０１１（図１２Ｆ）、ＯＢ１０１２（図１２Ｇ）、ＯＢ１０１３（図１２Ｈ）、ＯＢ１０１５（図１２Ｉ）およびＯＢ１０１０７（図１２Ｊ）のゲノムのエレメントに割り当てられた配列番号を可視的に説明する。

【図12J】対応するベクターについてのこれらの配列番号の割り当てを、図１２Ｃ～１２Ｊにおいてさらに可視化し、これらは、様々なウイルス粒子、ＳＢＴ１０１（図１２Ｃ）、ＯＢ１００５（図１２Ｄ）、ＯＢ１０１０（図１２Ｅ）、ＯＢ１０１１（図１２Ｆ）、ＯＢ１０１２（図１２Ｇ）、ＯＢ１０１３（図１２Ｈ）、ＯＢ１０１５（図１２Ｉ）およびＯＢ１０１０７（図１２Ｊ）のゲノムのエレメントに割り当てられた配列番号を可視的に説明する。

【0072】

【図13A】図１３Ａ～１３Ｅは、例８において本開示による様々なｒＡＡＶを用いて得られた例示的なＡＢＣＤ１タンパク質発現レベルを提供する。図１３Ａ～１３Ｄは、ＭＯＩに対してプロットされたＡＢＣＤ１タンパク質レベルを、各々のＡＡＶベクターについての、各々の図において記載されるようにフィットさせた用量－発現曲線、概算された相対的な潜在能力（図１３Ａ～１３ＣにおけるｐＯＢ１００８に対して相対的、および図１３ＤにおけるＳＢＴ１０１に対して相対的）、標準誤差、９５％信頼区間、およびＥＣ５０値と共に提供する。試験ｒＡＡＶを生成するために用いられたプラスミドを、下のボックスにおいて示す。

【図13B】図１３Ａ～１３Ｅは、例８において本開示による様々なｒＡＡＶを用いて得られた例示的なＡＢＣＤ１タンパク質発現レベルを提供する。図１３Ａ～１３Ｄは、ＭＯＩに対してプロットされたＡＢＣＤ１タンパク質レベルを、各々のＡＡＶベクターについての、各々の図において記載されるようにフィットさせた用量－発現曲線、概算された相対的な潜在能力（図１３Ａ～１３ＣにおけるｐＯＢ１００８に対して相対的、および図１３ＤにおけるＳＢＴ１０１に対して相対的）、標準誤差、９５％信頼区間、およびＥＣ５０値と共に提供する。

【図13C】図１３Ａ～１３Ｅは、例８において本開示による様々なｒＡＡＶを用いて得られた例示的なＡＢＣＤ１タンパク質発現レベルを提供する。図１３Ａ～１３Ｄは、ＭＯＩに対してプロットされたＡＢＣＤ１タンパク質レベルを、各々のＡＡＶベクターについての、各々の図において記載されるようにフィットさせた用量－発現曲線、概算された相対的な潜在能力（図１３Ａ～１３ＣにおけるｐＯＢ１００８に対して相対的、および図１３ＤにおけるＳＢＴ１０１に対して相対的）、標準誤差、９５％信頼区間、およびＥＣ５０値と共に提供する。

【図13D】図１３Ａ～１３Ｅは、例８において本開示による様々なｒＡＡＶを用いて得られた例示的なＡＢＣＤ１タンパク質発現レベルを提供する。図１３Ａ～１３Ｄは、ＭＯＩに対してプロットされたＡＢＣＤ１タンパク質レベルを、各々のＡＡＶベクターについての、各々の図において記載されるようにフィットさせた用量－発現曲線、概算された相対的な潜在能力（図１３Ａ～１３ＣにおけるｐＯＢ１００８に対して相対的、および図１３ＤにおけるＳＢＴ１０１に対して相対的）、標準誤差、９５％信頼区間、およびＥＣ５０値と共に提供する。

【図13E】図１３Ａ～１３Ｅは、例８において本開示による様々なｒＡＡＶを用いて得られた例示的なＡＢＣＤ１タンパク質発現レベルを提供する。図１３Ｅは、例示的なウェスタンブロットウェルおよび相対的強度のデータを示す。

【0073】

【図14】図１４は、例９において観察されたｒＡＡＶベクターｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１５、およびｐＯＢ１０１７による例示的なＶＬＣＦＡの減少を比較する。ＭＯＩに対してプロットされたＬｙｓｏ－ＰＣ Ｃ２６／Ｃ２２比を、各々のＡＡＶベクターについての、各々の図において記載されるようにフィットさせた用量－発現曲線、概算された相対的な潜在能力（ＯＢ１０１０に対して相対的）、標準誤差、９５％信頼区間、およびＥＣ５０値と共に提供する。試験ｒＡＡＶを生成するために用いられたプラスミドを、下のボックスにおいて示す。

【0074】

【図15A】図１５Ａ～１５Ｃは、例１０において観察された、ＡＢＣＤ１ ＫＯ混合グリア細胞におけるＶＬＣＦＡの減少における、例示的な用量依存性を提供する。図１５Ａは、低用量、中用量、および高用量（それぞれ、３．３×１０^４、１．０ｘ１０^５、および５×１０^５ウイルスゲノム／細胞）のＯＢ１０１０が、ｒＡＡＶ生成のベンダー（異なる精製方法）にかかわらず、ｒＡＡＶ用量依存的なＣ２６：０／Ｃ２２：０比の減少およびＣ２６：０の量の減少を提供したことを示す。

【図15B】図１５Ａ～１５Ｃは、例１０において観察された、ＡＢＣＤ１ ＫＯ混合グリア細胞におけるＶＬＣＦＡの減少における、例示的な用量依存性を提供する。図１５Ｂは、ＶＬＣＦＡ低下効果、Ｃ２６：０／Ｃ２２：０比の減少およびＣ２４：０／Ｃ２２：０比の減少が、ＡＢＣＤ１タンパク質発現レベルに依存することを示す。

【図15C】図１５Ａ～１５Ｃは、例１０において観察された、ＡＢＣＤ１ ＫＯ混合グリア細胞におけるＶＬＣＦＡの減少における、例示的な用量依存性を提供する。図１５Ｃは、多様なＶＬＣＦＡ低下効果、Ｃ２６：０およびＣ２４：０の量の減少、ならびにＣ２６：０／Ｃ２２：０およびＣ２４：０／Ｃ２２：０比の減少が、ＡＢＣＤ１タンパク質発現レベルに依存することをさらに示す。図１５Ｃはまた、ＡＢＣＤ１タンパク質レベルは、一方で、Ｃ２２：０の量に影響を及ぼさず、Ｃ１６：０量を増加させることを示す。

【0075】

【図16】図１６は、例１１において観察されたＳＢＴ１０１により誘発される例示的なin vivoでの効果を提供する。提供されるのは、脊髄におけるｒＡＡＶ用量依存的ベクターゲノムレベル（左）、脊髄における用量依存的ＡＢＣＤ１タンパク質発現（中央）、および脊髄におけるミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）レベルの用量依存的回復（右）である。ｍｔＲＮＡレベルの回復は、ＶＬＣＬＡのベータ酸化の回復についての代替マーカーである。

【0076】

【図17】図１７は、例１２におけるｒＡＡＶのパッケージング能力の比較からの例示的な結果を提供する。同じ生成スケールにより、ｐＯＢ１０１０、ｐＳＢＴ１０１、およびｐＯＢ１００８プラスミドを用いて得られたウイルス力価を、示された方法（ｄｄＰＣＲおよびｑＰＣＲ）により決定して提供する。

【発明を実施するための形態】

【0077】

発明の詳細な説明
定義
別段に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾が存在する場合、定義を含む本願が支配するであろう。

【0078】

本明細書において用いられる場合、用語「アデノウィルス随伴ウイルスベクター」、「アデノウィルス随伴ウイルス性ベクター」、または「ＡＡＶベクター」は、（ｉ）ＡＡＶから誘導される少なくとも１つのキャプシドタンパク質、および（ｉｉ）目的の遺伝子をコードする組み換えベクターゲノムを含む、組み換えウイルス粒子を包含する。ＡＡＶベクターにおいて、組み換えゲノムは、典型的には、キャプシド中にパッケージングまたは封入されて、組み換えＡＡＶビリオンを形成する。「ＡＡＶベクター」はまた、本明細書において、「ＡＡＶ粒子」、「組み換えＡＡＶ」、「ｒＡＡＶ」、「組み換えＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶベクター」、「組み換えＡＡＶ粒子」、または「ｒＡＡＶ粒子」としても言及され得る。ｒＡＡＶベクターの組み換えベクターゲノムは、本明細書において、「ＡＡＶベクターゲノム」、「組み換えＡＡＶゲノム」、「ｒＡＡＶゲノム」、「組み換えＡＡＶベクターゲノム」、「ｒＡＡＶベクターゲノム」、または単に「ベクターゲノム」または「組み換えベクターゲノム」として言及され得る。

【0079】

本明細書において用いられる場合、「発現カセット」とは、ヒトＡＢＣＤ１タンパク質についてのコード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、これは、それに対する他の調節配列を含んでもよく、このカセットは、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のキャプシド中にパッケージングされてもよい。典型的には、ＡＡＶベクターを作製するためのかかる発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルまたはＩＴＲに隣接した、本明細書において記載される配列、および本明細書において記載されるもののような他の発現制御配列を含む。例えば、ＡＡＶウイルスベクターについて、パッケージングシグナルは、５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲである。ＡＡＶキャプシド中にパッケージングされる場合、ＩＴＲは、発現カセットと組み合わされて、本明細書において、「組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノム」または「ベクターゲノム」として言及され得る。

【0080】

本明細書において用いられる場合、用語「調節配列」、「転写制御配列」または「発現制御配列」とは、イニシエーター配列、エンハンサー配列およびプロモーター配列などのＤＮＡ配列であって、それが作動可能に連結されるタンパク質をコードする核酸配列の転写を引き起こすか、抑制するか、または別段にこれを制御するものを指す。

【0081】

本明細書において用いられる場合、用語「作動可能に連結される」または「動作可能に（operatively）関連する」とは、ヒトＡＢＣＤ１をコードする核酸配列と連続した発現制御配列、ならびに／または、トランスで、または離れて、その転写および発現を制御するように作用する発現制御配列の両方を指す。

【0082】

一側面において、本明細書において記載される発現カセットのうちのいずれかを含むベクターが提供される。本明細書において記載される場合、かかるベクターは、多様な起源のプラスミドであってよく、本明細書においてさらに記載されるように、組み換え複製欠損ウイルスのためのある態様において有用である。

【0083】

「ベクター」とは、本明細書において用いられる場合、外来または異種の、または操作された核酸導入遺伝子を挿入することができる核酸分子であった、これは、次いで適切な宿主細胞中に導入することができる。ベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点、および組み換えＤＮＡを挿入することができる１つ以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを伴う細胞をベクターを伴わない細胞から選択することができる手段を有し、例えば、それらは、薬物耐性遺伝子をコードする。一般的なベクターとして、プラスミド、ウイルスゲノム、および（主に酵母および細菌において）「人工染色体」が挙げられる。特定のプラスミドは、本明細書において記載される。

【0084】

一態様において、ベクターは、その記載される発現カセットを含む、非ウイルス性プラスミド、例えば、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質核酸組成物、ポリグルカン組成物および他のポリマー、脂質および／またはコレステロールベースの核酸抱合体、ならびに本明細書において記載されるような他のコンストラクトを含む、多様な組成物およびナノ粒子とカップリングされた、「ネイキッドＤＮＡ」、「ネイキッドプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡおよびｍＲＮＡである。例えば、X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774-787；ウェブ公開：２０１１年３月２１日；ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２およびＷＯ２０１２／１７０９３０を参照：これらの全ては、本明細書において参考として援用される。かかる非ウイルス性ヒトＡＢＣＤ１ベクターは、本明細書において記載される経路により投与することができる。本明細書において用いられる場合、用語「対象」とは、本明細書において用いられる場合、ヒト、獣医学または農場の動物、飼育動物またはペット、および臨床研究のために通常用いられる動物を含む、哺乳動物を意味する。好ましい態様において、これらの方法および組成物の対象は、ヒトである。なお他の好適な対象として、限定することなく、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類およびその他が挙げられる。本明細書において用いられる場合、用語「対象」は、「患者」と交換可能に用いられる。

【0085】

処置される対象は、副腎白質ジストロフィーおよび／もしくは副腎脊髄ニューロパチーを診断された個体を含んでもよく、血漿中の高レベルの極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の蓄積などのＡＬＤもしくはＡＭＮの発症に関連する症状を示すものであってもよく、または、家族歴に起因してＡＬＤもしくはＡＭＮを発症するリスクがあるものであってもよく、または、個体は、遺伝子検査の間に、ＡＢＣＤ１遺伝子において１つ以上の変異、例えば、ＡＬＤもしくはＡＭＮの発症と相関することが見出されている変異を含むことが決定されたものであってもよい。

【0086】

述べられたように、ＡＡＶの構築におけるＡＢＣＤ１コード配列は、任意に、コドンのうちのより多くの数またはパーセンテージがヒト優先コドンを含むように、コドン最適化されていてもよい。核酸配列の文脈における「パーセント（％）同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一」という用語は、一致についてアラインメントされた場合に、２つの配列中の同じである残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長にわたるものであってよく、または少なくとも約５００～５０００ヌクレオチドのフラグメントが所望される。しかし、より小さなフラグメントの間、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４ヌクレオチド、少なくとも約２８～３２ヌクレオチド、少なくとも約３６ヌクレオチドまたはそれより多くのヌクレオチドの同一性もまた、所望される場合がある。

【0087】

パーセント同一性は、タンパク質の全長にわたるアミノ酸配列、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、またはそれらのペプチドフラグメント、または対応する核酸配列コード配列について、容易に決定することができる。好適なアミノ酸フラグメントは、少なくとも約８アミノ酸の長さであってよく、約７００アミノ酸までであってよい。一般に、２つの異なる配列の間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」または「類似性」は、「アラインメントされた」配列に対する参照において決定される。「アラインメントされた」配列または「アラインメント」とは、参照配列と比較して失われたまたは付加的な塩基またはアミノ酸についての補正をしばしば含む、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。

【0088】

同一性は、配列のアラインメントを準備することにより、ならびに当該分野において公知のまたは市販の多様なアルゴリズムおよび／またはコンピュータープログラムの使用を通して、決定することができる［例えば、BLAST、ExPASy；Clustal；FASTA；例えば、Needleman-Wunschアルゴリズム、Smith-Watermanアルゴリズムを用いて］。アラインメントは、多様な公共で利用可能または市販の多重配列アラインメントプログラムのうちのいずれかを用いて行われる。配列アラインメントプログラムは、アミノ酸配列について利用可能である：例えば、「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BloCKMAKER」、「MEME」および「Match-Box」プログラム。一般に、これらのプロセスのうちのいずれかをデフォルトのセッティングにおいて用いるが、当業者は、これらのセッティングを、必要に応じて変更することができる。あるいは、当業者は、少なくとも参照されたアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののようなレベルの同一性またはアラインメントを提供する、別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用することができる。例えば、J. D. Thomson et al,「A comprehensive comparison of multiple sequence alignments」、Nucl. Acids. Res.,27(l3):2682-2690 (1999)を参照。

【0089】

多重配列アラインメントプログラムはまた、核酸配列についても利用可能である。かかるプログラムの例として、「Clustal Omega」、「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」、「BLAST」、「MAP」および「MEME」が挙げられ、これらは、インターネット上のウェブサーバーを通してアクセス可能である。かかるプログラムのための他のソースは、当業者に公知である。あるいは、SnapGeneを用いることができる。また、ヌクレオチド配列同一性を測定するために用いることができる当該分野において公知の多数のアルゴリズムが存在し、これは、上記のプログラムにおいて含まれるものを含む。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、GCGバージョン6.1におけるFasta（商標）プログラムを用いて比較することができる。Fasta（商標）は、クエリーとサーチの配列の間の最良の重複の領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列の間のパーセント配列同一性は、Fasta（商標）を、GCGバージョン6.1において提供されるそのデフォルトのパラメーター（ワードサイズ＝６、スコア付けマトリックスのためのおよびNOPAMファクター）により用いて決定することができ、これは、本明細書において参考として援用される。

【0090】

用語「外来」とは、核酸配列またはタンパク質を記載するために用いられる場合、当該核酸またはタンパク質が、染色体または宿主細胞上のそれが存在する位置において、天然では存在しないことを意味する。外来核酸配列はまた、同じ宿主細胞または対象から誘導されるか、またはこれに挿入される配列であるが、非天然の状態、例えば異なるコピー数において、または異なる調節エレメントの制御下において存在するものを指す。

【0091】

用語「異種」とは、核酸配列またはタンパク質を記載するために用いられる場合、当該核酸またはタンパク質が、それが発現される宿主細胞または対象とは異なる生物か、または同じ生物の異なる種から誘導されたことを意味する。用語「異種」は、プラスミド、発現カセットまたはベクター中のタンパク質または核酸に対する言及により用いられる場合、当該タンパク質または核酸が、問題のタンパク質または核酸が天然においては互いに同じ関係においては見出されない、別の配列または部分配列と共に存在することを示す。

【0092】

用語「単離された」とは、材料が、そのオリジナルの環境（例えば、それが天然に存在するものである場合は、天然の環境）から取り除かれることを意味する。例えば、生きた動物において存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系において共在する材料のうちの一部または全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その後に天然の系に再導入されたとしても、単離されている。かかるポリヌクレオチドは、ベクターの部分であり得るか、および／またはかかるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の部分であり得るが、かかるベクターまたは組成物が、その天然の環境の部分ではないという点において、なお単離されている。

【0093】

用語「ターミネーター」とは、本明細書において用いられる場合、翻訳を終結させる核酸配列を包含する。例えば、ターミネーターは、それぞれ、ＤＮＡ配列「ＴＡＧ」、「ＴＧＡ」、または「ＴＡＡ」に対応するＲＮＡ配列「ＵＡＧ」、「ＵＧＡ」、または「ＵＡＡ」であってよい。

【0094】

本明細書において用いられる場合、用語「代替的オープンリーディングフレーム（alternative open reading frame）」、「代替的リーディングフレーム」、または「代替的フレーム」は、各々、目的の遺伝子（例えばＡＢＣＤ１）のコード配列中に存在する潜在的なタンパク質コード配列を指す。代替的オープンリーディングフレームは、典型的には、センス（またはアンチセンス）方向において、ＡＢＣＤ１遺伝子とは異なるリーディングフレームにおける、例えば＋１または＋２フレームにおける、開始コドン（ＡＴＧ）から始まる。ＡＢＣＤ１と同じ方向における代替的リーディングフレームは、潜在的に免疫原性である代替的生成物の転写をもたらし得るか、および／またはＡＢＣＤ１遺伝子の翻訳の減少をもたらし得る。代替的オープンリーディングフレームは、代替的フレーム中に存在するＡＴＧ配列を取り除く１つ以上の変異を導入することにより、除去することができ、これらの変異は、好ましくは、ＡＢＣＤ１遺伝子コード配列に関してサイレントである（あるいは、ＡＢＣＤ１配列中に保存的変異などの変異を導入してもよい）。あるいは、または加えて、コードされるポリペプチドが、好ましくは１アミノ酸のみ、または数アミノ酸、短縮されるように、代替的リーディングフレームにおいて、例えば、代替的オープンリーディングフレームにおいて存在するＡＴＧの下流数コドン以内に、停止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧ）を導入してもよい。さらに、ＡＢＣＤ１コード配列に関して導入される変異は、好ましくは、翻訳の遅延または減少をもたらし得る希少コドンの導入を回避する。

【0095】

例示的な態様において、ＡＢＣＤ１コード配列は、１つ以上のコドン最適化された領域を含む。コドン最適化されたコード領域は、多様な異なる方法により設計することができる。この最適化は、オンラインで入手可能な方法（例えば、GeneArt）、公開された方法、またはコドンを最適化するサービスを提供する会社、例えば、ATUM（Newark, CA）を用いて行うことができる。１つのコドン最適化の方法は、例えば、米国国際特許公開番号ＷＯ２０１５／０１２９２４において記載され、これは、その全体において本明細書において参考として援用される。また、例えば、米国特許公開番号２０１４／００３２１８６および米国特許公開番号２００６／０１３６１８４を参照。好適には、生成物についてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の長さ全体を修飾する。しかし、いくつかの態様においては、ＯＲＦのフラグメントのみを改変してもよい。これらの方法のうちの１つを用いることにより、任意の所与のポリペプチド配列に対して度数（frequency）を適用することができ、コドン最適化されたコード領域の核酸フラグメントであってポリペプチドをコードするものを生成することができる。

【0096】

多数のデノボおよび組み換えの選択肢が、コドンに対して実際の変更を行うために、またはコドン最適化されたコード領域を合成するために、利用可能である。かかる修飾または合成は、当業者に周知の標準的および慣用的な分子生物学的操作を用いて行うことができる。１つのアプローチにおいて、各々８０～９０ヌクレオチドの長さの、および所望される配列の長さにわたる、一連の相補的オリゴヌクレオチドペアを、標準的な方法により合成する。これらのオリゴヌクレオチドペアは、それらがアニーリングにより付着末端を含む８０～９０塩基対の二本鎖のフラグメントを形成するように合成され、例えば、ペアにおける各々のオリゴヌクレオチドは、ペアにおけるもう一方のオリゴヌクレオチドに対して相補的な領域を３、４、５、６、７、８、９、１０塩基またはそれより多くの塩基超えて伸長するように、合成される。オリゴヌクレオチドの各々のペアの一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドの別のペアの一本鎖末端とアニーリングするように設計される。オリゴヌクレオチドペアをアニーリングさせ、これらの二本鎖フラグメントのうちの約５～６を、次いで、付着性の一本鎖末端を介して一緒にアニーリングさせ、次いで、それらを一緒にライゲーションして、標準的な細菌のクローニングベクター、例えば、Invitrogen Corporation（Carlsbad, Calif）から入手可能なTOPO（登録商標）ベクター中にクローニングする。コンストラクトを、次いで、標準的な方法により配列決定する。８０～９０塩基対のフラグメントを一緒にライゲーションした５～６のフラグメント、すなわち、約５００塩基対のフラグメントからなる、これらのコンストラクトのうちのいくつかを、所望される配列全体が、一連のプラスミドコンストラクト中に表されるように調製する。これらのプラスミドのインサートを、次いで、適切な制限酵素により切断し、一緒にライゲーションして、最終コンストラクトを形成する。最終コンストラクトを、次いで、標準的な細菌のクローニングベクター中にクローニングし、配列決定する。かかる方法はまた、１つ以上の代替的オープンリーディングフレームが除去されているコード配列を構築するために用いてもよい。さらなる方法は、当業者にはすぐ明らかとなるであろう。加えて、遺伝子合成が、商業的に容易に利用可能である。

【0097】

「操作された」により、本明細書において記載されるＡＢＣＤ１タンパク質をコードする核酸配列が、組み立てられて、例えば、非ウイルス性送達系（例えば、ＲＮＡベースの系、ネイキッドＤＮＡなど）を作製するために、または、パッケージング宿主細胞中のウイルスベクターを作製するために、および／または対象中の宿主細胞への送達のために、その上で担持されるＡＢＣＤ１配列を宿主細胞に輸送する、任意の好適な遺伝子エレメント、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどの中に配置されることを意味する。一態様において、遺伝子エレメントは、プラスミドである。かかる操作されたコンストラクトを作製するために用いられる方法は、核酸操作の分野における当業者に公知であり、遺伝子工学、組み換え工学、および合成技術を含む。例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)を参照。

【0098】

本明細書において用いられる場合、用語「宿主細胞」とは、その中で生成プラスミドから組み換えＡＡＶが生成される、パッケージング細胞株を指し得る。代替において、用語「宿主細胞」とは、その中でコード配列の発現が所望される、任意の標的細胞を指し得る。したがって、「宿主細胞」とは、原核生物または真核生物の細胞であって、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコート（high velocity DNA-coated）ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合により、細胞中に導入された外来または異種ＤＮＡを含むものを指す。ある態様において、本明細書において、用語「宿主細胞」とは、ウイルスベクターまたは組み換えウイルスを作製してパッケージングするために使用される細胞を指す。他の態様において、本明細書において、用語「宿主細胞」とは、本明細書において記載される組成物のin vitro評価のための、多様な哺乳動物種のＣＮＳ細胞の培養物を指す。なお他の態様において、用語「宿主細胞」は、ＡＬＤまたはＡＭＮ疾患のためにin vivoで処置されている対象の神経系の細胞への参照を意図する。

【0099】

かかる宿主細胞は、上衣、脳室系の上皮の裏層を含む、ＣＮＳの上皮細胞を含む。他の宿主細胞として、ニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞、後根神経節およびミクログリアが挙げられる。

【0100】

本明細書において用いられる場合、用語「処置」または「処置すること」とは、ＡＬＤまたはＡＭＮの１つ以上の症状の寛解を目的として、対象に、本明細書において記載される１つ以上のＤＮＡコンストラクトまたは組成物を投与することを包含することを定義される。「処置」は、したがって、ＡＬＤまたはＡＭＮの発症または進行を軽減すること、疾患を予防すること、脳、脊髄および副腎皮質の血漿および組織における高レベルの極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の蓄積；副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）；罹患した後根神経節ニューロン（ＤＲＧ）に起因する末梢性ニューロパチー；アジソン病の発症；注意、思考、集中および他の大脳機能の「突然」の低下；大脳脱髄；その他を含む、疾患の症状の重篤度を低下させること、またはそれらの進行を遅らせることのうちの１つ以上を含んでもよい。

【0101】

用語「発現」は、本明細書において、その最も広い意味において用いられ、ＲＮＡの生成、またはＲＮＡおよびタンパク質の生成を含む。ＲＮＡに関して、用語「発現」または「翻訳」とは、特に、ペプチドまたはタンパク質の生成に関する。発現は、一過性であっても、安定であってもよい。

【0102】

用語「翻訳」は、本発明の文脈において、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の組み立てを制御してタンパク質またはペプチドを生じる、リボソームにおけるプロセスを指す。

【0103】

本明細書において用いられる場合、「疾患」、「障害」および「状態」は、対象における異常な状態を示すために、交換可能に用いられる。

【0104】

本明細書において用いられる場合、用語「約」または「約（～）」は、別段に特定されない限り、示される参照物からの１０％の可変性を意味する。

【0105】

用語「調節（regulation）」またはそのバリエーションは、本明細書において用いられる場合、生体経路の１つ以上の構成成分を阻害する能力を指す。

【0106】

「投与すること」により、方法において用いられる場合、組成物を、ＡＢＣＤ１遺伝子の欠損により特徴づけられる標的の選択された細胞に送達することを意味する。一態様において、方法は、髄腔内注射により組成物を送達することを含む。別の態様において、対象への脳室内（ＩＣＶ）注射が使用される。別の態様において、対象への腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）注射が使用される。なお別の方法において、血管内注射を使用してもよい。別の態様において、筋肉内注射が使用される。一般に、髄腔内投与が用いられる。投与のなお他の方法は、本開示を示された当業者により選択され得る。

【0107】

「投与すること」または「投与の経路」により、薬学的担体または賦形剤を伴う、またはこれを伴わない、本明細書において記載される組成物の対象への送達である。所望される場合、投与の経路は、組み合わせてもよい。いくつかの態様において、投与は、周期的に繰り返される。本明細書において記載される医薬組成物は、それを必要とする対象への、任意の好適な経路または異なる経路の組み合わせによる送達のために設計される。いくつかの態様において、脳への直接送達（任意に髄腔内、ＩＣＶまたはＩＴ－Ｌ注射を介して）、または全身経路、例えば、血管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口の投与の経路を介する送達が使用される。本明細書において記載される核酸分子、発現カセットおよび／またはベクターは、単一の組成物または複数の組成物中で送達することができる。任意に、２つ以上の異なるＡＡＶ、または複数のウイルスを送達してもよい［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４９３を参照］。別の態様において、複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶおよびアデノウィルス）を、単独で、またはタンパク質と組み合わせて含んでもよい。

【0108】

本明細書において用いられる場合、用語「髄腔内送達」または「髄腔内投与」とは、脊柱管中への、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、くも膜下腔中への注射を介した、薬物のための投与の経路を指す。髄腔内送達は、腰椎穿刺、脳室内（intraventricular）（脳室内（intracerebroventricular：ＩＣＶ）を含む）、後頭下／大槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰椎穿刺により、くも膜下腔全体にわたる拡散のために導入してもよい。別の例において、注射は、大槽中へのものであってよい。

【0109】

本明細書において用いられる場合、用語「大槽内送達」または「大槽内投与」とは、大槽樟脳髄質（cisterna magna cerebellomedularis）の脳脊髄液中へ直接的に、より具体的には、後頭下穿刺を介する、または大槽中への直接注射による、または恒久的に配置された管を介する、薬物のための投与の経路を指す。本明細書において記載される組成物を脳脊髄液中に送達するために有用であるデバイスは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１６１３３において記載され、これは、本明細書において参考として援用される。

【0110】

他の定義は、本開示全体を通して文脈において現れる。

【0111】

組成物および方法
本発明は、改善されたＡＡＶコンストラクト（ｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶゲノムベクターなど）ならびにそれを含む細胞および組成物を提供し、ここで、かかるＡＡＶコンストラクトは、ヒトＡＢＣＤ１タンパク質をコードする核酸配列を含み（ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトまたはＡＡＶ－ｈＡＢＣＤ１コンストラクト）、ここで、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、以下の利点のうちの１つ以上を有していてもよい：改善された安全性、改善されたパッケージング能力、増強されたＡＢＣＤ１発現レベル、改善された効力、改善された安定性、または低下した非自己抗原を発現する能力。

【0112】

本発明の組成物および方法は、ＡＢＣＤ１遺伝子における変異により引き起こされたＸ連鎖型副腎白質ジストロフィー（Ｘ－ＡＬＤ）のための処置を提供する。ＣＮＳへのターゲティングされた特異的なＡＢＣＤ１遺伝子の送達は、副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄ニューロパチーの症状に取り組むことが期待される。このことは、ＡＢＣＤ１をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することにより達成することができる。本明細書において記載されるのは、例示的なＡＡＶ－ｈＡＢＣＤ１ベクターであり、これは、時に、本明細書においてＡＡＶ－ＡＢＣＤ１として言及される。これらの用語の使用は、交換可能である。加えて、本明細書において記載されるような構成成分を利用する代替的な態様が企図される。

【0113】

本発明のある態様において、対象ＤＮＡコンストラクトを含む組成物、またはこれを含む組成物は、それを必要とする対象における、副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄ニューロパチーならびにそれらに関連する症状の処置および／または予防のために用いられ、ここにおいて、症状は、脳、脊髄および副腎皮質の血漿および組織における高レベルの極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の蓄積、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、および罹患した後根神経節ニューロンに起因する末梢性ニューロパチーを含む。

【0114】

本発明はまた、ヒトＡＢＣＤ１タンパク質（ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト）をコードする核酸配列を含む、かかる改善されたＡＡＶコンストラクトを作製する方法を提供し、このコンストラクトは、以下の利点：改善された安全性、改善されたパッケージング能力、増強されたＡＢＣＤ１発現レベル、改善された安定性、または、低下した非自己抗原を発現する能力のうちの１つ以上を有していてもよく、これは、それを必要とする対象において、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）および／または副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）の処置および／または予防のために使用することができる。

【0115】

本発明はまた、例えば、髄腔内、脳室内（ＩＣＶ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、血管内、筋肉内、または大槽内投与により、ヒトＡＢＣＤ１タンパク質（ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト）をコードする核酸配列を含む、かかる改善されたＡＡＶコンストラクトを送達する方法を提供し、このコンストラクトは、以下の利点のうちの１つ以上を有していてもよい：それを必要とする対象における、副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄ニューロパチーの処置および／または予防のための、改善された安全性、改善されたパッケージング能力、増強されたＡＢＣＤ１発現レベル、改善された安定性、または低下した非自己抗原を発現する能力。

【0116】

いくつかの態様において、本明細書において記載されるように、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を欠失しているであろう。

【0117】

他の態様において、本明細書において記載されるように、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、Ｘタンパク質の発現を排除するか、または不活化された、または非機能的なＸタンパク質、例えば切断型Ｘタンパク質の発現をもたらす、少なくとも１つの変異を含む、修飾されたウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むであろう。

【0118】

いくつかの態様において、本明細書において記載されるように、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を欠失しているであろう。

【0119】

他の態様において、本明細書において記載されるように、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、Ｘタンパク質の発現を排除するか、または不活化された、または非機能的なＸタンパク質、例えば切断型Ｘタンパク質の発現をもたらす、少なくとも１つの変異を含む、修飾されたウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むであろう。

【0120】

以下を提供することは、本発明の特定の目的である：ｒＡＡＶウイルスベクターを、ｒＡＡＶウイルスベクターゲノムをコードするポリヌクレオチドと共に包含すると理解される、新規の組み換えＡＡＶ ＤＮＡコンストラクトであって、治療的に十分な量のＡＬＤタンパク質をin vivoで発現し、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）などの潜在的に発癌性の導入遺伝子発現エンハンサーを欠失するか、またはＸタンパク質発現を低下させるかもしくはこれを除去する、またはＸタンパク質のバリアントであって不活性（非発癌性）であるものの発現をもたらすように修飾されたＷＰＲＥを含む、前記組み換えＡＡＶ ＤＮＡコンストラクト。

【0121】

以下を提供することは、本発明の特定の目的である：
ｒＡＡＶビリオンからのウイルスキャプシド中にパッケージングされていてもよい組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムを含む、単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、前記ｒＡＡＶベクターゲノムは、以下を含むか、またはこれらからなる：
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）；
（ｂ）発現カセット、ここで、発現カセットは、少なくとも以下を含む：
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、
（ｉｉ）ポリＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド、
（ｉｉｉ）１つ以上のターミネーター、および
（ｉｖ）前記ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナル；
ならびに
（ｃ）３’ＩＴＲ。
ｒＡＡＶベクターゲノムは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まなくともよく、あるいは、Ｘタンパク質が発現されないか、またはこれが不活性な形態において発現されることをもたらす、少なくとも１つの変異を含む、修飾されたＷＰＲＥ（ＷＰＲＥｘ－ｉｎａｃｔ）を含んでもよい。

【0122】

いくつかの場合において、本発明により提供される単離されたポリヌクレオチドにおいて、５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０（本明細書においてまたＡＡＶｒｈ．１０としても言及される）血清型のうちのいずれか１つ、またはこれらの組み合わせの５’および３’ＩＴＲから誘導されてもよい。

【0123】

いくつかの場合において、５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０の５’および３’ＩＴＲから誘導されてもよい。

【0124】

いくつかの場合において、単離されたポリヌクレオチドは、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含まない。

【0125】

いくつかの場合において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｘタンパク質が発現されないか、またはこれが不活性な形態において発現されることをもたらす、少なくとも１つの変異を含む、修飾されたＷＰＲＥ（ＷＰＲＥｘ－ｉｎａｃｔ）を含む。

【0126】

いくつかの場合において、本発明により提供される単離されたポリヌクレオチドにおいて、（ｉ）５’ＩＴＲは、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲから誘導される；および／または（ｉｉ）３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲから誘導される。例示的なＡＡＶ２の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列として、これらに限定されないが、それぞれ、配列番号６０１および６０２の参照５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列が挙げられ、これらは、例示的なＡＡＶ２において、アクセッション番号：ＮＣ＿００１４０１．２により提供されるゲノム参照配列を完成させる。いくつかの場合において、本発明により提供される単離されたポリヌクレオチドにおいて、（ｉ）５’ＩＴＲは、配列番号３０１、４０１、６０１、６１１、１０００１、１０１０１もしくは１０２０１の核酸配列を含んでもよく；および／または（ｉｉ）３’ＩＴＲは、配列番号３０２、４０２、６０２、６１２、１００１８、１０１１８もしくは１０２１８の核酸配列を含む。

【0127】

いくつかの場合において、本発明により提供される単離されたポリヌクレオチドにおいて、（ｉ）５’ＩＴＲは、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲの切断型形態であってよく；および／または（ｉｉ）３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２の３’ＩＴＲの切断型形態であってよい。例えば、（ｉ）５’ＩＴＲの切断型形態は、配列番号２、１０５０１、１１００１、１１１０１、１１２０１、１１３０１、１１５０１もしくは１１７０１の核酸配列を含んでもよく；および／または（ｉｉ）３’ＩＴＲの切断型形態は、配列番号２８、１０５１８、１１０１８、１１１１８、１１２１８、１１３１８、１１５１８もしくは１１７１８の核酸配列を含んでもよい。

【0128】

いくつかの場合において、ベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクターの標的細胞は、ニューロンまたはグリア細胞であってよい。

【0129】

いくつかの場合において、ベクターゲノム中に含まれるプロモーターは、以下から選択されてもよい：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスからのＨ５、Ｐ７．５およびＰＩ １プロモーター、伸長因子１－アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核細胞翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、ヒートショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、ヒートショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ＪｅＴプロモーター、β－アクチンプロモーター、任意に、ニワトリβ－アクチンプロモーター；組織特異的プロモーター、Ｂ２９プロモーター、ｒｕｎｔ転写因子（ＣＢＦａ２）プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＹＰ４５０ ３Ａ４プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ１プロモーター、エンドグリンプロモーター、線維芽細胞特異的タンパク質１プロモーター（ＦＳＰ１）プロモーター、フィブロネクチンプロモーター、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ１）プロモーター、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、インスリンプロモーター、インテグリンアルファ２ｂ（ＩＴＧＡ２Ｂ）プロモーター、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ－２）プロモーター、インターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）プロモーター、ケラチン５プロモーター（ケラチノサイト発現）、ミオグロビン（ＭＢ）プロモーター、筋分化１（ＭＹＯＤ１）プロモーター、ネフリンプロモーター、骨ガンマカルボキシグルタミン酸タンパク質２（ＯＧ－２）プロモーター、３－オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ２Ｂ（Ｏｘｃｔ２Ｂ）プロモーター、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ－Ｂ）プロモーター、シナプシンプロモーター、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）プロモーター、またはＭＮＤプロモーター。ＥＦ１プロモーターの例示的な配列は、例えば、アクセッション番号：Ｊ０４６１７により提供され得る。ＵＢＣプロモーターの例示的な配列は、例えば、アクセッション番号：ＮＧ＿０２７７２２．２により提供され得る。サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチンプロモーターの例示的な配列は、例えば、アクセッション番号：ＮＣ＿００６２７３／Ｘ００１８２により提供され得る。ＪｅＴプロモーターの例示的な配列は、例えば、Tornoee J, Kusk P, Johansen TE, Jensen PR.「Generation of a synthetic mammalian promoter library by modification of 配列spacing transcription factor binding sites」、Gene. 2002 Sep 4;297(1-2):21-32（doi: 10.1016/s0378-1119(02)00878-8; PMID: 12384282）により提供され得る。ＧＵＳＢプロモーターは、例えば、アクセッション番号：M65002により提供され得る。

【0130】

いくつかの場合において、ウイルスゲノム中に含まれるプロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーター（本明細書においてまたＣＢＡプロモーターとしても言及される）を含んでもよく、任意にここで、ニワトリβ－アクチンプロモーターは、配列番号１０、１０００７、１０１０７、１０２０７、１０５０７、１１００７、１１１０７、１１２０７、１１３０７、１１５０７もしくは１１７０７の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む。

【0131】

いくつかの場合において、ウイルスゲノム中に含まれるプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、アルファフェトタンパク質エンハンサー、ＴＴＲミニマルプロモーター／エンハンサー、ＬＳＰエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４エンハンサー、またはＡｐｏＥエンハンサーから選択されるエンハンサーに作動可能に連結されていてもよい。

【0132】

いくつかの場合において、ウイルスゲノム中に含まれるプロモーターは、エンハンサーに作動可能に連結されていてもよく、任意にここで、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーまたは骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーである。

【0133】

いくつかの場合において、ウイルスゲノム中に含まれるプロモーターは、ＣＭＶエンハンサーに作動可能に連結されており、任意にここで、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号７、１０００５、１０１０５、１０２０５、１０５０５、１１００５、１１１０５、１１２０５、１１３０５、１１５０５もしくは１１７０５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む。

【0134】

いくつかの場合において、ウイルスゲノム中に含まれるプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、β－アクチンエクソン、キメラ性イントロン、ウサギベータ－グロビンエクソンを、任意に５’末端から３’末端への方向において含む。

【0135】

ある場合において、（ｉ）ＣＭＶエンハンサーは、配列番号７、１０００５、１０１０５、１０２０５、１０５０５、１１００５、１１１０５、１１２０５、１１３０５、１１５０５もしくは１１７０５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含んでもよい；（ｉｉ）ニワトリβ－アクチンプロモーターは、配列番号１０、１０００７、１０１０７、１０２０７、１０５０７、１１００７、１１１０７、１１２０７、１１３０７、１１５０７もしくは１１７０７の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含んでもよい；（ｉｉｉ）β－アクチンエクソンは、配列番号１１、１０００８、１０１０８、１０２０８、１０５０８、１１００８、１１１０８、１１２０８、１１３０８、１１５０８もしくは１１７０８の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含んでもよい；（ｉｖ）キメラ性イントロンは、配列番号１２、１０００９、１０１０９、１０２０９、１０５０９、１１００９、１１１０９、１１２０９、１１３０９、１１５０９もしくは１１７０９の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含んでもよい；および／または、ウサギベータ－グロビンエクソンは、配列番号１００８５、１０１８５、１０２８５、１０５８５、１１０８５、１１１８５、１１２８５、１１３８５、１１５８５もしくは１１７８５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含んでもよい。

【0136】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターゲノムによりコードされるＡＢＣＤ１ポリペプチドは、配列番号１４、２０４、３０４、４０４、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５０１０、１００１２、１０１１２、１０２１２、１０５１２、１１０１２、１１１１２、１１２１２、１１３１２、１１５１２もしくは１１７１２の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0137】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターゲノム中に含まれるＡＢＣＤ１コード配列は、配列番号２０４の核酸配列と比較して減少した数の代替的オープンリーディングフレームを含んでもよく、または、任意の代替的オープンリーディングフレームを含まない。

【0138】

いくつかの場合において、ＡＢＣＤ１コード配列は、主に（５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％を超える）または全体が、ヒト優先コドンを含んでもよい。

【0139】

いくつかの場合において、ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４、２０４、３０４、４０４、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５０１０、１００１２、１０１１２、１０２１２、１０５１２、１１０１２、１１１１２、１１２１２、１１３１２、１１５１２もしくは１１７１２の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む。

【0140】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドのすぐ上流にＫｏｚａｋ配列をさらに含み、および任意にＫｏｚａｋ配列は、配列番号１０５１１、１１２１１もしくは１１３１１の核酸配列または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列：

【化7】

へのアプローチを表す任意の配列を含んでもよい。

【0141】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ＵＡＧ、ＵＡＡおよび／またはＵＧＡから個々に選択される１つ以上のターミネーターを含む。ある場合において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、配列番号１００７１、１０１７１、１０２７１、１０５７１、１１０７１、１１１７１、１１２７１、１１３７１、１１５７１もしくは１１７７１の核酸配列を含むターミネーターを含んでもよい。ある場合において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、配列番号１０５７２、１１２７２もしくは１１３７２の核酸配列を含む別のターミネーターをさらに含んでもよい。

【0142】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターゲノム中に含まれるポリＡシグナルは、ｂＧＨ、ｈＧＨ、ＳＶ４０、ＲＧＢ、ｍＲＧＢ、または合成ポリＡシグナルからなる少なくとも１つのポリＡシグナルを含んでもよい。いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターゲノム中に含まれるポリＡシグナルは、下流でＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される２つ以上のポリＡシグナルを含んでもよい。

【0143】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターゲノム中に含まれるポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡシグナルを含んでもよく、および任意にＳＶ４０ポリＡシグナルは、配列番号２７、１００１４、１０１１４、１０２１４、１０５１４、１１０１４、１１２１４もしくは１１７１４の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含んでもよい。

【0144】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターゲノム中に含まれるポリＡシグナルは、ｂＧＨポリＡシグナルを含んでもよく、および任意にｂＧＨポリＡシグナルは、配列番号１００１６、１０１１６、１０２１６、１１０１６、１１１１６、１１２１６、１１３１６、１１５１６もしくは１０１７１６の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含んでもよい。

【0145】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターゲノム中に含まれるポリＡシグナルは、配列番号２０６、３０６、４０５、１００３５、１０１３５、１０２３５、１０５３５、１１０３５、１１１３５、１１２３５、１１３３５、１１５３５もしくは１１７３５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含んでもよい。

【0146】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターゲノムにおいて、（ａ）５’ＩＴＲは、配列番号３０１、４０１、１０００１、１０１０１、１０２０１、２、１０５０１、１１００１、１１１０１、１１２０１、１１３０１、１１５０１もしくは１０１７０１の核酸配列を含んでもよい；（ｂ）、発現カセットにおいて、（ｉ）プロモーターは、配列番号１０、１０００７、１０１０７、１０２０７、１０５０７、１１００７、１１１０７、１１２０７、１１３０７、１１５０７もしくは１１７０７、３０３、４０３の核酸配列を含んでもよい、（ｉｉ）ＡＢＣＤ１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４、２０４、３０４、４０４、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５０１０、１００１２、１０１１２、１０２１２、１０５１２、１１０１２、１１１１２、１１２１２、１１３１２、１５１２もしくは１１７１２の核酸配列を含んでもよい、および（ｉｉｉ）ポリＡシグナルは、配列番号２７、１００１４、１０１１４、１０２１４、１０５１４、１１０１４、１１２１４、１１７１４、１００１６、１０１１６、１０２１６、１１０１６、１１１１６、１１２１６、１１３１６、１１５１６、１１７１６、３０６、４０５、１００３５、１０１３５、１０２３５、１１０３５、１１２３５もしくは１１７３５の核酸配列を含んでもよい；ならびに（ｃ）３’ＩＴＲは、配列番号３０２、４０２、６０２、６１２、２８、１００１８、１０１１８、１０２１８、１０５１８、１１０１８、１１１１８、１１２１８、１１３１８、１１５１８もしくは１１７１８の核酸配列を含んでもよい。

【0147】

ある場合において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、配列番号３００、４００、１００５０、１０１５０、１０２５０、１０５５０、１１０５０、１１１５０、１１２５０、１１３５０、１１５５０もしくは１１７５０の核酸配列、配列番号１００、もしくは配列番号１００６０、１０１６０、１０２６０、１０５６０、１１０６０、１１１６０、１１２６０、１１３６０、１１５６０もしくは１０１７６０の核酸配列のヌクレオチド１～３７１３、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0148】

ある場合において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、Ｘタンパク質の発現を排除するか、または不活化された、または非機能的なＸタンパク質（ＷＰＲＥ ｘ－ｉｎａｃｔ）の発現をもたらす少なくとも１つの変異を含む、修飾されたウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。例えば不活化された、または非機能的なＸタンパク質は、切断型Ｘタンパク質である。特定の例において、修飾されたＷＰＲＥは、配列番号３０５または１００７５の核酸配列を含む。

【0149】

ある場合において、本発明により提供される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３００、１００５０、または１００６０の核酸配列を含むか、またはこれからなるｒＡＡＶベクターゲノムを含んでもよい。

【0150】

ある場合において、本発明により提供される単離されたポリヌクレオチドは、特定の増殖条件下において、宿主細胞中で、プラスミド、好ましくは高コピープラスミド（５００～１０００コピー／細胞）（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ５７またはｐＵＣ１１８）であってよい。プラスミドは、任意に、抗生物質耐性遺伝子をコードしてもよく、これは、任意に、カナマイシン耐性遺伝子であってもよい。特定の例において、プラスミドは、ｐＵＣ５７またはｐＵＣ１１８骨格を含んでもよい。ある場合において、本発明により提供される単離されたポリヌクレオチドは、プラスミドｐＳＢＴ１０１、ｐＯＢ１００５、ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１１、ｐＯＢ１０１２、ｐＯＢ１０１３、ｐＯＢ１０１５またはｐＯＢ１０１７、またはＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ（Ｘｉｎａｃｔ）のゲノムをコードするプラスミドを含むか、これからなるか、またはこれから誘導される、プラスミドであってよい。

【0151】

ある場合において、本発明により提供される単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１００、１００００、１０１００、１０５００、１１０００、１１１００、１１２００、１１３００、１１５００もしくは１１７００の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはこれからなるプラスミドであってよい。

【0152】

（Ａ）上記のポリヌクレオチドのうちのいずれかによる単離されたポリヌクレオチドを含む組成物を提供することは、本発明の特定の目的であり、これは、任意に、以下のうちの１つ以上をさらに含む：（Ｂ）トランスフェクション試薬；（Ｃ）ＡＡＶキャプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；（Ｄ）ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；（Ｅ）Ｅ１領域、Ｅ２領域、Ｅ４領域およびＶＡ ＲＮＡ領域からなる群より選択されるアデノウィルスヘルパー遺伝子を含むポリヌクレオチド；および／または（Ｆ）薬学的に許容し得る担体または賦形剤。

【0153】

いくつかの場合において、トランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはPEIpro（登録商標）などのＰＥＩ誘導体である。いくつかの他の場合において、トランスフェクション試薬は、リポフェクタミン（商標）、FuGENE（登録商標）、またはTransIT（登録商標）であってもよい。いくつかの場合において、（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０、好ましくは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のｃａｐ遺伝子から誘導されてもよい；および／または（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０、好ましくは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のｒｅｐ遺伝子から誘導されてもよい。

【0154】

いくつかの態様において、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子とは、別個のプラスミドにより、パッケージング細胞に提供されてもよい。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、ｃａｐ遺伝子および／またはｒｅｐ遺伝子を発現するように操作される。ある場合において、ｒｅｐ遺伝子は、ｐ５および／またはｐ４０プロモーターにより転写され（すなわち、これにより転写が制御され）てもよく、ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターにより転写されてもよい。

【0155】

いくつかの態様において、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドにより提供されてもよい。ある態様において、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドは、ｐ５プロモーター、ｐ１９プロモーター、およびｐ４０プロモーターを含む。ある場合において、ｒｅｐ遺伝子は、ｐ５および／またはｐ４０プロモーターにより転写されてもよく、ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターにより転写されてもよい。

【0156】

いくつかの態様において、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０から全体的に誘導されてもよいが、一方、いくつかの態様においては、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドは、ＡＡＶ２からのエレメントおよびＡＡＶ９からのエレメントを含むＡＡＶ２／９などのハイブリッド血清型のものであってもよい。

【0157】

ある態様において、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドが、ＡＡＶ２／９血清型のものである場合、Ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２のものであってもよく、Ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９のものであってもよい。

【0158】

かかる態様において、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドは、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーター（これは、配列番号７１０の核酸配列を含んでもよい）、ＡＡＶ２ ｐ１９プロモーター（これは、配列番号７２０の核酸配列を含んでもよい）、およびＡＡＶ ｐ４０プロモーター（これは、配列番号７３０の核酸配列を含んでもよい）を含んでもよい。

【0159】

いくつかの態様において、キャプシド（ｃａｐ）遺伝子は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０の、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３キャプシドタンパク質をコードする、キャプシド遺伝子またはそのバリアントであってよい。

【0160】

いくつかの態様において、ｃａｐ遺伝子生成物は、ＡＡＶ ｐ４０プロモーターにより転写される。ある態様において、ＡＡＶ ｐ４０プロモーターは、配列番号７３０の核酸配列を含んでもよい。

【0161】

ある態様において、キャプシド遺伝子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０ｒｈ．１０のキャプシド遺伝子であっても、またはこれから誘導されてもよい。

【0162】

いくつかの態様において、キャプシド遺伝子（Ｃａｐ遺伝子）が、ＡＡＶ９から誘導される場合、ＡＡＶ９の３つのキャプシド遺伝子生成物ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が生成され得る。ある場合において、ＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、ｐ４０プロモーターにより転写され得る。ある場合において、ＡＡＶ９のＶＰ１は、配列番号７３１のアミノ酸配列を含んでもよい。ある場合において、ＡＡＶ９のＶＰ２は、配列番号７３２のアミノ酸配列を含んでもよい。ある場合において、ＡＡＶ９のＶＰ３は、配列番号７３３のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0163】

いくつかの態様において、キャプシド遺伝子（Ｃａｐ遺伝子）が、ＡＡＶ２のものであるか、またはこれから誘導される場合、ＡＡＶ２の３つのキャプシド遺伝子生成物ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が、生成され得る。ある場合において、ＡＡＶ２のＶＰ１は、配列番号８３１のアミノ酸配列を含んでもよい。ある場合において、ＡＡＶ２のＶＰ２は、配列番号８３２のアミノ酸配列を含んでもよい。ある場合において、ＡＡＶ２のＶＰ３は、配列番号８３３のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0164】

いくつかの態様において、キャプシド遺伝子（Ｃａｐ遺伝子）が、ＡＡＶｒｈ．１０のものから誘導される場合、ＡＡＶｒｈ．１０の３つのキャプシド遺伝子生成物ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が、生成され得る。ある場合において、ＡＡＶｒｈ．１０のＶＰ１は、配列番号９３１のアミノ酸配列を含んでもよい。ある場合において、ＡＡＶｒｈ．１０のＶＰ２は、配列番号９３２のアミノ酸配列を含んでもよい。ある場合において、ＡＡＶｒｈ．１０のＶＰ３は、配列番号９３３のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0165】

いくつかの場合において、例示的なＡＡＶｒｈ．１０キャプシド配列は、例えば、GeneBank＃ＡＹ２４３０１５（核酸配列）および／もしくはアクセッション番号ＡＡ０８８２０１．１（アミノ酸配列）により、ならびに／または、例えば、Gao G. et al., J Virol. 2004 Jun;78(12):6381-8により、提供され得る。

【0166】

いくつかの態様において、複製遺伝子は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０の、Ｒｅｐ ７８、Ｒｅｐ ６８、Ｒｅｐ ５２および／またはＲｅｐ ４０タンパク質をコードする複製遺伝子またはそのバリアントであってよい。いくつかの態様において、レプリコン遺伝子は、ｐ５プロモーターおよび／またはｐ１９プロモーターにより転写されてもよい。

【0167】

いくつかの態様において、複製遺伝子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０の複製遺伝子またはそのバリアントであってよい。

【0168】

ある態様において、２つの複製遺伝子生成物、ＲＥＰ７８およびＲＥＰ６８は、ｐ５プロモーターにより転写されてもよい。ある態様において、２つの複製遺伝子生成物、ＲＥＰ５２およびＲＥＰ４０は、ｐ１９プロモーターにより転写されてもよい。

【0169】

いくつかの態様において、複製遺伝子（ｒｅｐ遺伝子）が、ＡＡＶ２のものであるか、またはこれから誘導される場合、ＡＡＶ２の複製遺伝子生成物Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０が生成され得る。ある場合において、ＡＡＶ２のＲｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８は、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターにより転写されてもよく、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０は、ＡＡＶ２ ｐ１９プロモーターにより転写されてもよい。

【0170】

ある態様において、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターは、配列番号７１０の核酸配列を含んでもよく、および／またはＡＡＶ２ ｐ１９プロモーターは、配列番号７２０の核酸配列を含んでもよい。

【0171】

ある態様において、ＡＡＶ２の遺伝子生成物Ｒｅｐ７８は、配列番号７１１のアミノ酸配列を含んでもよい。ある場合において、ＡＡＶ２の遺伝子生成物Ｒｅｐ６８は、配列番号７１２のアミノ酸配列を含んでもよい。ある場合において、ＡＡＶ２の遺伝子生成物Ｒｅｐ５２は、配列番号７２１のアミノ酸配列を含んでもよい。ある場合において、ＡＡＶ２の遺伝子生成物Ｒｅｐ４０は、配列番号７２２のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0172】

特定の態様において、Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドが、ＡＡＶ２／９プラスミド、例えば本明細書において「ｐＡＡＶ２／９」として言及されるプラスミドである場合、プラスミドは、以下を含んでもよい：ＡＡＶ２ ｐ５プロモーター（配列番号７１０）（これからＡＡＶ２ ＲＥＰ７８（配列番号７１１）およびＡＡＶ２ ＲＥＰ６８（配列番号７１２）が生成され得る）；ＡＡＶ２ ｐ１９プロモーター（配列番号７２０）（これからＡＡＶ２ ＲＥＰ５２（配列番号７２１）およびＡＡＶ２ ＲＥＰ４０（配列番号７２２）が生成され得る）；ならびにＡＡＶ ｐ４０プロモーター（配列番号７３０）（これからＡＡＶ９ ＶＰ１（配列番号７３１）、ＡＡＶ９ ＶＰ２（配列番号７３２）およびＡＡＶ９ ＶＰ３（配列番号７３３）が生成され得る）。いくつかの特定の場合において、かかるｐＡＡＶ２／９プラスミドの完全なコンストラクト配列は、配列番号７００の核酸配列を有していてもよい。

【0173】

ある場合において、ｐＡＡＶ２／９ Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドにおいて、ＲＥＰ４０およびＲＥＰ６８の遺伝子は、ＣＡＰ ＶＰ１配列中に存在する第２のエクソンを共有してもよい。ある場合において、ＲＥＰ４０およびＲＥＰ６８小さな第２のエクソンによりコードされる最後の数個のアミノ酸（例えば、３個のアミノ酸）のバリエーションが存在してもよい。例えばＲＥＰ４０およびＲＥＰ６８が、それぞれ配列番号７２２および７１２のアミノ酸配列を含む場合、ＲＥＰ４０およびＲＥＰ６８の生成物はいずれも、アミノ酸配列ＬＡＲＧＱＰで終了する。これは、いずれもアミノ酸配列ＬＡＲＧＨＳＬで終了する天然のＡＡＶ２のＲＥＰ４０およびＲＥＰ６８配列とは異なる。

【0174】

いくつかの場合において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、配列番号７３１、７３２および／または７３３のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしていてもよい。

【0175】

いくつかの場合において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、配列番号８３１、８３２および／または８３３のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしていてもよい。

【0176】

いくつかの場合において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、配列番号９３１、９３２および／または９３３のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしていてもよい。

【0177】

いくつかの場合において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、配列番号７１１、７１２、７２１および／または７２２のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしていてもよい。

【0178】

いくつかの態様において、１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子、１つ以上の単純ヘルペスウイルスヘルパー遺伝子、１つ以上のパピローマウイルスヘルパー遺伝子、および／または１つ以上のワクシニアウイルスヘルパー遺伝子などの１つ以上のヘルパー遺伝子を含むポリヌクレオチドが、組成物中に含まれていてもよく、これは、本発明によるｒＡＡＶウイルスベクターを生成するために用いることができる。

【0179】

いくつかの態様において、１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子が含まれる場合、アデノウィルスヘルパー遺伝子は、アデノウィルス５（Ａｄ５）および／またはアデノウィルス２（Ａｄ２）から誘導されてもよい。いくつかの場合において、アデノウィルスヘルパー遺伝子は、野生型（ＷＴ）Ａｄ５から誘導されてもよく、ある場合においては、ＷＴ Ａｄ５は、配列番号２０００の核酸配列を含むゲノムを含んでもよい。いくつかの場合において、アデノウィルスヘルパー遺伝子は、野生型（ＷＴ）Ａｄ２から誘導されてもよく、ある場合においては、ＷＴ Ａｄ２は、配列番号３０００の核酸配列を含むゲノムを含んでもよい。

【0180】

いくつかの態様において、１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子が含まれる場合、アデノウィルスヘルパー遺伝子は、Ｅ１領域、Ｅ２領域、Ｅ４領域および／またはＶＡ ＲＮＡ領域を含んでもよい。いくつかの態様において、アデノウィルスヘルパー遺伝子は、ＶＡ ＲＮＡ領域、Ｅ２領域およびＥ４領域を含んでもよい。

【0181】

いくつかの態様において、１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子が、ＡＡＶヘルパーウイルスにより提供されてもよく、これは、ＡＡＶウイルスヘルパープラスミド（または本明細書においては単純に「ウイルスヘルパープラスミド」として言及される）により提供されてもよい。

【0182】

いくつかの態様において、１つ以上のＡｄ５ヘルパー遺伝子が、Ａｄ５ヘルパーウイルスにより提供されてもよく、これは、Ａｄ５ウイルスヘルパープラスミドにより提供されてもよい。かかるＡｄ５ウイルスヘルパープラスミドの非限定的な例として、本明細書においてｐＡＬＤ－Ｘ８０として言及されるプラスミドが挙げられる。

【0183】

いくつかの態様において、Ａｄ５ウイルスヘルパープラスミドは、Ａｄ５ ＶＡ ＲＮＡ領域、Ａｄ５ Ｅ２領域、および／またはＡｄ５ Ｅ４領域を含んでもよい。いくつかの場合において、Ａｄ５ ＶＡ ＲＮＡ領域は、配列番号２０１０の核酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ａｄ５ Ｅ２領域は、配列番号２０２０の核酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ａｄ５ Ｅ４領域は、配列番号２０３０の核酸配列を含んでもよい。例えば、例示的なプラスミドであるｐＡＬＤ－Ｘ８０は、これらの配列を含む。

【0184】

いくつかの態様において、Ａｄ５ ＶＡ ＲＮＡ領域は、Ａｄ５ ＶＡ－ＲＮＡ領域Ｉ（ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）およびＡｄ５ ＶＡ－ＲＮＡ領域ＩＩ（ＶＡ ＲＮＡ ＩＩ）を含んでもよい。いくつかの場合において、Ａｄ５ ＶＡ－ＲＮＡ領域Ｉ（ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）は、配列番号２０１１の核酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ａｄ５ ＶＡ－ＲＮＡ領域ＩＩ（ＶＡ ＲＮＡ ＩＩ）は、配列番号２０１２の核酸配列を含んでもよい。

【0185】

いくつかの態様において、Ａｄ５ Ｅ２領域は、Hexon（Ｃ末端フラグメント）；２３Ｋエンドプロテアーゼ；Ｅ２Ａ／ＤＢＰ；Hexonアセンブリー（１００Ｋ）；Hexonアセンブリー（３３Ｋ）；Hexonアセンブリー（２２Ｋ）；および／またはHexonに関連する前駆体をコードしていてもよい。いくつかの場合において、かかるHexon（Ｃ末端フラグメント）は、配列番号２０２１のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかる２３Ｋエンドプロテアーゼは、配列番号２０２２のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるＥ２Ａ／ＤＢＰは、配列番号２０２３のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるHexonアセンブリー（１００Ｋ）は、配列番号２０２４のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるHexonアセンブリー（３３Ｋ）は、配列番号２０２５のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるHexonアセンブリー（２２Ｋ）は、配列番号２０２６のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるHexonに関連する前駆体は、配列番号２０２７のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0186】

いくつかの態様において、Ａｄ５ Ｅ４領域は、Fiber；Ｅ４ ＯＲＦ１；Ｅ４ ＯＲＦ２；Ｅ４ ＯＲＦ３；Ｅ４ ＯＲＦ４；Ｅ４ ＯＲＦ６；および／またはＥ４ ＯＲＦ６／７をコードしていてもよい。いくつかの場合において、Fiberは、配列番号２０３１のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ｅ４ ＯＲＦ１は、配列番号２０３２のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ｅ４ ＯＲＦ２は、配列番号２０３３のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ｅ４ ＯＲＦ３は、配列番号２０３４のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ｅ４ ＯＲＦ４は、配列番号２０３５のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ｅ４ ＯＲＦ６は、配列番号２０３６のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ｅ４ ＯＲＦ６／７は、配列番号２０３７のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0187】

いくつかの特定の態様において、１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子は、ｐＡＬＤ－Ｘ８０プラスミドまたはＡｄ５ウイルスヘルパープラスミドにより提供されてもよい。

【0188】

いくつかの特定の態様において、Ａｄ５ウイルスヘルパープラスミドは、以下を含んでもよい：ＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）（配列番号２０１１）および／またはＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ ＩＩ）（配列番号２０１２）を含むＡｄ５領域ＶＡ－ＲＮＡ（配列番号２０１０）；Hexon（Ｃ末端フラグメント）（配列番号２０２１）、２３Ｋエンドプロテアーゼ（配列番号２０２２）、Ｅ２Ａ／ＤＢＰ（配列番号２０２３）、Hexonアセンブリー（１００Ｋ）（配列番号２０２４）、Hexonアセンブリー（３３Ｋ）（配列番号２０２５）、Hexonアセンブリー（２２Ｋ）（配列番号２０２６）、およびHexonに関連する前駆体（配列番号２０２７）をコードするＡｄ５領域Ｅ２（配列番号２０２０）；ならびにFiber（配列番号２０３１）、Ｅ４ ＯＲＦ１（配列番号２０３２）、Ｅ４ ＯＲＦ２（配列番号２０３３）、Ｅ４ ＯＲＦ３（配列番号２０３４）、Ｅ４ ＯＲＦ４（配列番号２０３５）、Ｅ４ ＯＲＦ６（配列番号２０３６）、および／またはＥ４ ＯＲＦ６／７（配列番号２０３７）をコードするＡｄ５領域Ｅ４（配列番号２０３０）。

【0189】

ｐＡＬＤ－Ｘ８０は、以下を含む：ＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）（配列番号２０１１）および／またはＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ ＩＩ）（配列番号２０１２）を含むＡｄ５領域ＶＡ－ＲＮＡ（配列番号２０１０）；Hexon（Ｃ末端フラグメント）（配列番号２０２１）、２３Ｋエンドプロテアーゼ（配列番号２０２２）、Ｅ２Ａ／ＤＢＰ（配列番号２０２３）、Hexonアセンブリー（１００Ｋ）（配列番号２０２４）、Hexonアセンブリー（３３Ｋ）（配列番号２０２５）、Hexonアセンブリー（２２Ｋ）（配列番号２０２６）、およびHexonに関連する前駆体（配列番号２０２７）をコードするＡｄ５領域Ｅ２（配列番号２０２０）；ならびにFiber（配列番号２０３１）、Ｅ４ ＯＲＦ１（配列番号２０３２）、Ｅ４ ＯＲＦ２（配列番号２０３３）、Ｅ４ ＯＲＦ３（配列番号２０３４）、Ｅ４ ＯＲＦ４（配列番号２０３５）、Ｅ４ ＯＲＦ６（配列番号２０３６）、および／またはＥ４ ＯＲＦ６／７（配列番号２０３７）をコードするＡｄ５領域Ｅ４（配列番号２０３０）。

【0190】

いくつかの態様において、１つ以上のＡｄ２ヘルパー遺伝子は、Ａｄ２ヘルパーウイルスにより提供されてもよく、これは、Ａｄ２ウイルスヘルパープラスミドにより転写されてもよい。かかるＡｄ２ウイルスヘルパープラスミドの非限定的な例として、本明細書においてｐＨＥＬＰ－ＫａｎＶ４として言及されるプラスミドを挙げることができる。

【0191】

いくつかの態様において、Ａｄ２ウイルスヘルパープラスミドは、Ａｄ２ＶＡ ＲＮＡ領域、Ａｄ２ Ｅ２領域および／またはＡｄ２ Ｅ４領域を含んでもよい。いくつかの場合において、Ａｄ２ ＶＡ ＲＮＡ領域は、配列番号３０１０の核酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ａｄ２ Ｅ２領域は、配列番号３０２０の核酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ａｄ２ Ｅ４領域は、配列番号３０３０の核酸配列を含んでもよい。例えば、例示的なプラスミドであるｐＨＥＬＰ－ＫａｎＶ４は、これらの配列を含む。

【0192】

いくつかの態様において、Ａｄ２ ＶＡ ＲＮＡ領域は、Ａｄ２ ＶＡ－ＲＮＡ領域Ｉ（ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）およびＡｄ２ ＶＡ－ＲＮＡ領域ＩＩ（ＶＡ ＲＮＡ ＩＩ）を含んでもよい。いくつかの場合において、Ａｄ２ ＶＡ－ＲＮＡ領域Ｉ（ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）は、配列番号３０１１の核酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、Ａｄ２ ＶＡ－ＲＮＡ領域ＩＩ（ＶＡ ＲＮＡ ＩＩ）は、配列番号３０１２の核酸配列を含んでもよい。

【0193】

いくつかの態様において、Ａｄ２ Ｅ２領域は、２３Ｋエンドプロテアーゼ（Ｃ末端フラグメント）；Ｅ２Ａ／ＤＢＰ；Hexonアセンブリー（１００Ｋ）；Hexonアセンブリー（３３Ｋ）；Hexonアセンブリー（２２Ｋ）；および／またはHexonに関連する前駆体をコードしていてもよい。いくつかの場合において、かかる２３Ｋエンドプロテアーゼ（Ｃ末端フラグメント）は、配列番号３０２２のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるＥ２Ａ／ＤＢＰは、配列番号３０２３のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるHexonアセンブリー（１００Ｋ）は、配列番号３０２４のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるHexonアセンブリー（３３Ｋ）は、配列番号３０２５のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるHexonアセンブリー（２２Ｋ）は、配列番号３０２６のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるHexonに関連する前駆体は、配列番号３０２７のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0194】

いくつかの態様において、Ａｄ２ Ｅ４領域は、Ｅ４ ＯＲＦ１；Ｅ４ ＯＲＦ２；Ｅ４ ＯＲＦ３；Ｅ４ ＯＲＦ４；Ｅ４ ＯＲＦ６；および／またはＥ４ ＯＲＦ６／７をコードしていてもよい。いくつかの場合において、いくつかの場合において、かかるＥ４ ＯＲＦ１は、配列番号３０３２のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるＥ４ ＯＲＦ２は、配列番号３０３３のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるＥ４ ＯＲＦ３は、配列番号３０３４のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるＥ４ ＯＲＦ４は、配列番号３０３５のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるＥ４ ＯＲＦ６は、配列番号３０３６のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、かかるＥ４ ＯＲＦ６／７は、配列番号３０３７のアミノ酸配列を含んでもよい。

【0195】

いくつかの特定の態様において、１つ以上のアデノウィルスヘルパー遺伝子は、ｐＨＥＬＰ＿ＫａｎＶ４プラスミド、およびＡｄ２ウイルスヘルパープラスミドにより転写されてもよい。

【0196】

いくつかの特定の態様において、Ａｄ２ウイルスヘルパープラスミドは、以下を含んでもよい：ＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）（配列番号３０１１）および／またはＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ ＩＩ）（配列番号３０１２）を含むＡｄ２領域ＶＡ－ＲＮＡ（配列番号３０１０）；２３Ｋエンドプロテアーゼ（Ｃ末端フラグメント）（配列番号３０２２）、Ｅ２Ａ／ＤＢＰ（配列番号３０２３）、Hexonアセンブリー（１００Ｋ）（配列番号３０２４）、Hexonアセンブリー（３３Ｋ）（配列番号３０２５）、Hexonアセンブリー（２２Ｋ）（配列番号３０２６）、およびHexonに関連する前駆体（配列番号３０２７）をコードするＡｄ２領域Ｅ２（配列番号３０２０）；ならびにＥ４ ＯＲＦ１（配列番号３０３２）、Ｅ４ ＯＲＦ２（配列番号３０３３）、Ｅ４ ＯＲＦ３（配列番号３０３４）、Ｅ４ ＯＲＦ４（配列番号３０３５）、Ｅ４ ＯＲＦ６（配列番号３０３６）、および／またはＥ４ ＯＲＦ６／７（配列番号３０３７）をコードするＡｄ２領域Ｅ４（配列番号３０３０）。

【0197】

ｐＨＥＬＰ＿ＫａｎＶ４は、以下を含む：ＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ Ｉ）（配列番号３０１１）および／またはＶＡ－ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ ＩＩ）（配列番号３０１２）を含むＡｄ２領域ＶＡ－ＲＮＡ（配列番号３０１０）；２３Ｋエンドプロテアーゼ（Ｃ末端フラグメント）（配列番号３０２２）、Ｅ２Ａ／ＤＢＰ（配列番号３０２３）、Hexonアセンブリー（１００Ｋ）（配列番号３０２４）、Hexonアセンブリー（３３Ｋ）（配列番号３０２５）、Hexonアセンブリー（２２Ｋ）（配列番号３０２６）、およびHexonに関連する前駆体（配列番号３０２７）をコードするＡｄ２領域Ｅ２（配列番号３０２０）；ならびにＥ４ ＯＲＦ１（配列番号３０３２）、Ｅ４ ＯＲＦ２（配列番号３０３３）、Ｅ４ ＯＲＦ３（配列番号３０３４）、Ｅ４ ＯＲＦ４（配列番号３０３５）、Ｅ４ ＯＲＦ６（配列番号３０３６）、および／またはＥ４ ＯＲＦ６／７（配列番号３０３７）をコードするＡｄ２領域Ｅ４（配列番号３０３０）。

【0198】

さらなる態様において、ヘルパーウイルス遺伝子のうちのいずれか、例えばアデノウィルスヘルパー遺伝子のうちのいずれかは、かかる遺伝子のうちのいずれかを発現するように操作されたパッケージング細胞により提供されてもよい。

【0199】

（Ｉ）ＡＡＶキャプシド；および（ＩＩ）上記のｒＡＡＶベクターゲノムのうちのいずれかによるｒＡＡＶベクターゲノムを含むか、またはこれらからなる、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供することは、本発明の特定の目的である。

【0200】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のキャプシド、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のキャプシド、またはそのバリアントであってよい。

【0201】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、配列番号７３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、またはこれからなってもよい。

【0202】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、配列番号７３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、またはこれからなってもよい。

【0203】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、配列番号７３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、またはこれからなってもよい。

【0204】

ある場合において、ｒＡＡＶベクター（すなわち、ｒＡＡＶウイルス粒子）は、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶ９ ＶＰ２キャプシドタンパク質、およびＡＡＶ９ ＶＰ３キャプシドタンパク質を含んでもよい。いくつかの特定の場合において、ｒＡＡＶベクターは、以下を含んでもよい：（ａ）配列番号７３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号７３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ９ ＶＰ２キャプシドタンパク質；および（ｃ）配列番号７３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＡＡＶ９ ＶＰ３キャプシドタンパク質。

【0205】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、配列番号８３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、またはこれからなってもよい。

【0206】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、配列番号８３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、またはこれからなってもよい。

【0207】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、配列番号８３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、またはこれからなってもよい。

【0208】

ある場合において、ｒＡＡＶベクター（すなわち、ｒＡＡＶウイルス粒子）は、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶ２ ＶＰ２キャプシドタンパク質、およびＡＡＶ２ ＶＰ３キャプシドタンパク質を含んでもよい。いくつかの特定の場合において、ｒＡＡＶベクターは、以下を含んでもよい：（ａ）配列番号８３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号８３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＡＡＶ２ ＶＰ２キャプシドタンパク質；および（ｃ）配列番号８３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＡＡＶ２ ＶＰ３キャプシドタンパク質。

【0209】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、配列番号９３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、またはこれからなってもよい。

【0210】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、配列番号９３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、またはこれからなってもよい。

【0211】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、配列番号９３３のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、またはこれからなってもよい。

【0212】

ある場合において、ｒＡＡＶベクター（すなわち、ｒＡＡＶウイルス粒子）は、ＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ１キャプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ２キャプシドタンパク質、およびＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ３キャプシドタンパク質を含んでもよい。いくつかの特定の場合において、ｒＡＡＶベクターは、以下を含んでもよい：（ａ）配列番号９３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ１キャプシドタンパク質；（ｂ）配列番号９３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ２キャプシドタンパク質；および（ｃ）配列番号９３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ３キャプシドタンパク質。

【0213】

（Ａ）本明細書において記載されるｒＡＡＶベクターのうちのいずれかの予防または治療有効量；および（Ｂ）薬学的に許容し得る担体を含む、in vivoでの投与のために好適な組成物を提供することもまた、本発明の特定の目的である。

【0214】

いくつかの場合において、組成物は、約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）～約１×１０^１５ＧＣのｒＡＡＶベクターの用量を含んでもよい。

【0215】

各々の組成物が上記の組成物による、いくつかの組成物を提供することもまた、本発明の特定の目的であり、これは、凝集体において、合計約１×１０^１３ＧＣ～約１×１０^１５ＧＣのｒＡＡＶベクターの用量を含んでもよい。

【0216】

いくつかの場合において、上記のような組成物（単数）または組成物（複数）のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶベクターの用量は、約１０ｍＬ～約１５０ｍＬの容積中に含まれていてもよい。

【0217】

いくつかの場合において、上記のような組成物（単数）または組成物（複数）のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶベクターの用量は、約１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約６０ｍＬ、約７０ｍＬ、約８０ｍＬ、約９０ｍＬ、約１００ｍＬ、約１１０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１３０ｍＬ、約１４０ｍＬ、または約１５０ｍＬの容積中に含まれていてもよい。

【0218】

いくつかの場合において、上記のような組成物（単数）もしくは組成物（複数）のうちのいずれかは、髄腔内、脳室内（ＩＣＶ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、血管内、筋肉内、または大槽内投与のために好適であってよい。

【0219】

いくつかの場合において、上記のような組成物（単数）もしくは組成物（複数）のうちのいずれかは、髄腔内投与のために好適であってよい。

【0220】

いくつかの場合において、上記のような組成物（単数）もしくは組成物（複数）のうちのいずれかは、ポンプによる髄腔内投与のために好適であってよい。それを必要とする対象において、ＡＬＤもしくはＡＭＮを処置および／または予防する、ならびに／またはＡＬＤおよび／もしくはＡＭＮに関連する症状を寛解させる方法を提供することは、本発明の別の特定の目的であり、これは、それを必要とする対象に、上記のような任意のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、上記のような任意のｒＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つ、および／または上記のような組成物のうちのいずれかのうちの少なくとも１つ以上の、予防または治療有効量を投与することを含む。

【0221】

いくつかの場合において、対象は、ヒトである。

【0222】

いくつかの場合において、方法は、対象において、脳、脊髄および副腎皮質の血漿および組織における高レベルの極長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の蓄積、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、または罹患した後根神経節ニューロンに起因する末梢性ニューロパチーなどの１つ以上の症状を緩和するか、軽減するか、またはこれを安定化させる。

【0223】

いくつかの場合において、単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、または組成物（単数）もしくは組成物（複数）は、髄腔内、脳室内（ＩＣＶ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、血管内、筋肉内、または大槽内投与により送達される。

【0224】

いくつかの場合において、送達は、髄腔内投与によるものである。

【0225】

いくつかの場合において、髄腔内投与は、ポンプにより媒介される。

【0226】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物が投与される場合、合計の投与されたｒＡＡＶベクターの用量は、約１×１０^１３ＧＣ～約１×１０^１５ＧＣであってもよい。

【0227】

いくつかの場合において、単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、または組成物（単数）もしくは組成物（複数）は、約１０ｍＬ～約１５０ｍＬの容積において投与されてもよい。

【0228】

いくつかの場合において、単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、または組成物（単数）もしくは組成物（複数）は、約１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約６０ｍＬ、約７０ｍＬ、約８０ｍＬ、約９０ｍＬ、約１００ｍＬ、約１１０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１３０ｍＬ、約１４０ｍＬ、または約１５０ｍＬ、好ましくは約１００ｍＬの容積において投与されてもよい。

【0229】

いくつかの場合において、単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、または組成物（単数）もしくは組成物（複数）は、単一用量または複数用量において投与されてもよい。

【0230】

いくつかの場合において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶｒｈ．１０キャプシドを含んでもよい。

【0231】

ウイルスベクターを作製する方法を提供することは、本発明の別の特定の目的である。

【0232】

いくつかの場合において、方法は、上記の単離されたポリヌクレオチドのうちのいずれかをパッケージング宿主細胞中に導入することを含んでもよい。任意に、ポリヌクレオチド中に含まれるベクターゲノムをパッケージングすることができるウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のキャプシドを含むｒＡＡＶベクターであってよい。

【0233】

いくつかの場合において、方法は、上記のようなｒＡＡＶベクターゲノムのうちのいずれかを含むパッケージング細胞を培養することを含んでもよい。任意に、ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のキャプシドを含むｒＡＡＶベクターであってよい。さらに任意に、パッケージング細胞は、ＡＡＶ ｃａｐおよび／またはＡＡＶ ｒｅｐをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。

【0234】

上記のようなｒＡＡＶベクターゲノムのうちのいずれかを含む細胞を提供することは、本発明の別の特定の目的である。かかる細胞は、本明細書において記載されるｒＡＡＶベクターのうちのいずれかを生成するために有用であり得る。任意に、細胞は、ＡＡＶ ｃａｐおよび／またはＡＡＶ ｒｅｐをコードするポリヌクレオチドを含む。あるいは、細胞が、ＡＡＶ ｃａｐおよび／またはＡＡＶ ｒｅｐをコードするポリヌクレオチドを含まない場合、ＡＡＶ ｃａｐおよび／またはＡＡＶ ｒｅｐをコードするポリヌクレオチドを、本明細書において記載されるｒＡＡＶベクターのうちのいずれかの生成の間に、細胞に導入してもよい。

【0235】

短縮型Ａ領域配列を含む、ＡＡＶ ５’ＩＴＲバリアントおよび／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲバリアントを提供することもまた、本発明の目的である。かかるＡＡＶ ５’ＩＴＲおよび／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲバリアントが、ＡＡＶゲノム中で目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む発現カセットに隣接する場合、かかるＡＡＶ ５’ＩＴＲおよび／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲバリアントは、ＧＯＩの発現を増強するために有用であり得る。

【0236】

いくつかの場合において、ＡＡＶ ５’ＩＴＲバリアントは、配列番号２、１０５０１、１１００１、１１１０１、１１２０１、１１３０１、１１５０１もしくは１１７０１の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0237】

いくつかの場合において、ＡＡＶの３’ＩＴＲバリアントは、配列番号２８、１０５１８、１１０１８、１１１１８、１１２１８、１１３１８、１１５１８もしくは１１７１８の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0238】

さらに、以下：
（ａ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの５’ＩＴＲバリアントのいずれか；
（ｂ）少なくとも以下を含む発現カセット：
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、
（ｉｉ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）前記ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナル；
ならびに
（ｃ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの３’ＩＴＲバリアントのいずれか；
を含むかまたはこれらからなるｒＡＡＶベクターゲノム
を含む、単離されたポリヌクレオチド
を提供することは、本発明の目的である。

【0239】

いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、任意にcｐＵＣ５７またはｐＵＣ１１８骨格を含む、プラスミドであってよい。

【0240】

さらに、以下を提供することは、本発明の目的である：
（Ａ）ｒＡＡＶベクターゲノムを含む単離されたポリヌクレオチド
を含む組成物であって、該ｒＡＡＶベクターゲノムは、以下：
（Ａ－ａ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの５’ＩＴＲバリアントのいずれか；
（Ａ－ｂ）少なくとも以下を含む発現カセット：
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、
（ｉｉ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）前記ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナル；
ならびに
（Ａ－ｃ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの３’ＩＴＲバリアントのいずれか；
を含むかまたはこれらからなる、
前記組成物。

【0241】

いくつかの場合において、組成物は、以下のうちのいずれか１つ以上をさらに含んでもよい：
（Ｂ）トランスフェクション試薬；（Ｃ）ＡＡＶキャプシド（ｃａｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；（Ｄ）ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子を含むポリヌクレオチド；（Ｅ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む細胞；（Ｆ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む細胞；および／または（Ｇ）薬学的に許容し得る担体または賦形剤。

【0242】

ある場合において、ポリヌクレオチド中に含まれるＡＡＶベクターゲノムにおいて、（ｉ）ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のｃａｐ遺伝子から誘導されてもよく；および／または（ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のｒｅｐ遺伝子から誘導されてもよい。

【0243】

以下を提供することもまた、本発明の目的である：
ｒＡＡＶベクターゲノムであって、以下：
（ａ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの５’ＩＴＲバリアントのいずれか；
（ｂ）少なくとも以下を含む発現カセット：
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、
（ｉｉ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）前記ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナル；
ならびに
（ｃ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの３’ＩＴＲバリアントのいずれか；
を含むかまたはこれらからなる前記ｒＡＡＶベクターゲノム
を含む単離されたポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む、細胞。

【0244】

いくつかの場合において、細胞は、ＡＡＶ ｃａｐおよび／またはＡＡＶ ｒｅｐをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。

【0245】

以下を提供することもまた、本発明の目的である：
以下：
（Ｉ）ＡＡＶキャプシド；および
（ＩＩ）以下を含むか、またはこれらからなるｒＡＡＶベクターゲノムによる、ｒＡＡＶベクターゲノム：
（ａ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの５’ＩＴＲバリアントのいずれか；
（ｂ）少なくとも以下を含む発現カセット：
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、
（ｉｉ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）前記ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナル；
ならびに
（ｃ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの３’ＩＴＲバリアントのいずれか；
を含むかまたはこれらからなる、ｒＡＡＶベクター。

【0246】

いくつかの場合において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のキャプシド、好ましくはＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のキャプシド、またはそのバリアントである。

【0247】

以下を提供することもまた、本発明の目的である：
以下：
（Ｉ）ＡＡＶキャプシド；および
（ＩＩ）以下を含むかまたはこれらからなるｒＡＡＶベクターゲノムによるｒＡＡＶベクターゲノム：
（ＩＩ－ａ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの５’ＩＴＲバリアントのいずれか；
（ＩＩ－ｂ）少なくとも以下を含む発現カセット：
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、
（ｉｉ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）前記ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナル；
ならびに
（ＩＩ－ｃ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの３’ＩＴＲバリアントのいずれか；
を含むかまたはこれらからなるｒＡＡＶベクターの予防または治療有効量を含む、in vivoでの投与のために好適な組成物（単数）または組成物（複数）。

【0248】

いくつかの場合において、組成物（単数）または組成物（複数）は、薬学的に許容し得る担体をさらに含んでもよい。

【0249】

以下を提供することもまた、本発明の目的である：
それを必要とする対象における遺伝子治療の方法であって、それを必要とする対象に、以下：
（Ａ）以下を含むかまたはこれらからなる少なくとも１つのｒＡＡＶベクター：
（Ｉ）ＡＡＶキャプシド、および
（ＩＩ）以下を含むか、またはこれらからなるｒＡＡＶベクターゲノムによるｒＡＡＶベクターゲノム：
（ＩＩ－ａ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの５’ＩＴＲバリアントのいずれか、
（ＩＩ－ｂ）少なくとも以下を含む発現カセット：
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、
（ｉｉ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）前記ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナル、ならびに
（ＩＩ－ｃ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの３’ＩＴＲバリアントのいずれか；
あるいは
（Ｂ）かかるｒＡＡＶベクターを含む、組成物（単数）または組成物（複数）
の予防または治療有効量を投与することを含む。

【0250】

以下を提供することもまた、本発明の目的である：
ウイルスベクターを作製する方法であって、パッケージング細胞中に、ｒＡＡＶベクターゲノムを含む単離されたポリヌクレオチドを導入することを含み、該ｒＡＡＶベクターゲノムは、以下を含むか、またはこれらからなる：
（ａ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの５’ＩＴＲバリアントのいずれか；
（ｂ）少なくとも以下を含む発現カセット：
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、
（ｉｉ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）前記ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナル；
ならびに
（ｃ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの３’ＩＴＲバリアントのいずれか。

【0251】

いくつかの場合において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のキャプシドを含む、ｒＡＡＶベクターである。

【0252】

以下を提供することは、さらに本発明の目的である：
ウイルスベクターを作製する方法であって、ｒＡＡＶベクターゲノムを含むパッケージング細胞を培養することを含み、該ｒＡＡＶベクターゲノムは、以下を含むか、またはこれらからなる：
（ａ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの５’ＩＴＲバリアントのいずれか；
（ｂ）少なくとも以下を含む発現カセット：
（ｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結する標的細胞において活性なプロモーター、
（ｉｉ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）前記ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドの下流の１つ以上のポリＡシグナル；
ならびに
（ｃ）上記のような短縮型Ａ領域配列を含むＡＡＶの３’ＩＴＲバリアントのいずれか。

【0253】

いくつかの場合において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のキャプシドを含む、ｒＡＡＶベクターである。

【0254】

ある場合において、パッケージング細胞は、ＡＡＶ ｃａｐおよび／またはＡＡＶ ｒｅｐをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0255】

いくつかの態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、配列番号２００において含まれるＡＢＣＤ１コード配列と比較してより少ない代替的オープンリーディングフレームを含むように修飾された、ＡＢＣＤ１コード配列を含むか、または、任意の代替的オープンリーディングフレームを含まないであろう。あるいは、または加えて、ＡＢＣＤ１コード配列は、好ましくは、ＡＢＣＤ１コード配列に関してサイレントである変異の導入により、内部のＫｏｚａｋまたはＫｏｚａｋ様配列を取り除くように修飾されていてもよい。あるいは、または加えて、ＡＢＣＤ１コード配列は、好ましくはサイレント変異の導入により、以下のうちの１つ以上を取り除くように修飾されるであろう：（ｉ）ＴＡＴＡボックス、（ｉｉ）ｃｈｉ部位、（ｉｉｉ）リボソームエントリー部位、（ｉｖ）ＡＲＥ配列エレメント、（ｖ）ＩＮＳ配列エレメント、（ｖｉ）ＣＲＳ配列エレメント、および／または（ｖｉｉ）潜在性のスプライシングのドナーおよびアクセプター部位。かかる修飾は、非自己抗原を発現する任意の潜在能力を回避し、および／またはＡＢＣＤ１の発現を改善することが期待される。

【0256】

いくつかの態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、「ＣＣＡＣＣ」もしくは「ＧＣＣＡＣＣ」などのＫｏｚａｋ配列、または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列

【化8】

へのアプローチを表す任意の配列を、ＡＢＣＤ１開始部位の上流に含むであろう。

【0257】

いくつかの態様において、ＡＢＣＤ１導入遺伝子カセットのサイズを減少させるために、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、ＡＢＣＤ１遺伝子の下流に、単一のポリＡ部位のみ（例えば、ＳＶ４０ポリＡ配列および／またはＢＧＨポリＡ配列、または合成ポリＡを含む他の好適なポリＡ配列）を含むであろう。

【0258】

いくつかの態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、ＡＢＣＤ１遺伝子の下流に、複数のポリＡ部位（例えば、ＳＶ４０ポリＡ配列およびＢＧＨポリＡ配列、または合成ポリＡを含む他の好適なポリＡ配列）を含んでもよい。

【0259】

いくつかの態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、短縮型または切断型ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含むであろう。

【0260】

いくつかの態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、ｐＵＣ５７またはｐＵＣ１１８骨格上に含まれるであろう。

【0261】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、主に（５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％を超える）または全体がヒト優先コドンを含む、ヒトＡＢＣＤ１コード配列を含むであろう。

【0262】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、配列番号２０４、配列番号３０４、配列番号４０４、配列番号５０１～５１０、配列番号１４、および配列番号１００１２、１０１１２、１０２１２、１０５１２、１１０１２、１１１１２、１１２１２、１１３１２、１１５１２および１１７１２のものから選択される、ヒトＡＢＣＤ１コード配列を含むであろう。

【0263】

いくつかの態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、ｐＳＢＴ１０１を含んでも、またはこれから誘導されてもよい。

【0264】

いくつかの態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ｐＯＢ１００５、ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１１、ｐＯＢ１０１２、ｐＯＢ１０１３、ｐＯＢ１０１５またはｐＯＢ１０１７を含んでも、またはこれから誘導されてもよい。

【0265】

いくつかの好ましい態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、ｐＳＢＴ１０１、ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１５またはｐＯＢ１０１７を含んでも、またはこれから誘導されてもよい。

【0266】

いくつかの好ましい態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、プラスミドｐＳＢＴ１０１、ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１５またはｐＯＢ１０１７においてコードされるベクターゲノムであってもよい。

【0267】

いくつかの好ましい態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムをコードするポリヌクレオチドは、ｐＳＢＴ１０１、ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１５またはｐＯＢ１０１７を含んでも、またはこれから誘導されてもよい。

【0268】

いくつかの好ましい態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、ｐＳＢＴ１０１、ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１５またはｐＯＢ１０１７から生成されてもよい。

【0269】

いくつかの好ましい態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、ＳＢＴ１０１、ＯＢ１０１０、ＯＢ１０１５またはＯＢ１０１７のベクターゲノムであってもよい。

【0270】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ（Ｘｉｎａｃｔ）のゲノムを含んでも、またはこれから誘導されてもよく、例えば、ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、配列番号１００５０もしくは１００６０の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0271】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１［ＷＰＲＥなし］のゲノムを含んでも、またはこれから誘導されてもよく、例えば、かかるベクターゲノムは、配列番号１０２５０もしくは１０２６０の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0272】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ｐＳＢＴ１０１を含んでも、またはこれから誘導されてもよく、例えば、ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、配列番号１０１５０もしくは１０１６０の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0273】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ｐＯＢ１００５を含んでも、またはこれから誘導されてもよく、例えば、ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、配列番号１０５５０もしくは１０５６０の核酸配列、またはｐＯＢ１００５（配列番号１００）を含むヌクレオチド１～３７１３を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0274】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ｐＯＢ１０１０を含んでも、またはこれから誘導されてもよく、例えば、ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、配列番号１１０５０もしくは１１０６０の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0275】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ｐＯＢ１０１１を含んでも、またはこれから誘導されてもよく、例えば、ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、配列番号１１１５０もしくは１１１６０の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0276】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ｐＯＢ１０１２を含んでも、またはこれから誘導されてもよく、例えば、ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、配列番号１１２５０もしくは１１２６０の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0277】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ｐＯＢ１０１３を含んでも、またはこれから誘導されてもよく、例えば、ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、配列番号１１３５０もしくは１１３６０の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0278】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ｐＯＢ１０１５を含んでも、またはこれから誘導されてもよく、例えば、ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、配列番号１１５５０もしくは１１５６０の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0279】

他の態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクト（ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、またはベクターゲノムをコードするポリヌクレオチド）は、ｐＯＢ１０１７を含んでも、またはこれから誘導されてもよく、例えば、ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ベクターゲノムは、配列番号１１７５０もしくは１１７６０の核酸配列を含んでも、またはこれからなってもよい。

【0280】

いくつかの態様において、ＡＢＣＤ１導入遺伝子カセットのサイズを減少させるために、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、ＡＢＣＤ１遺伝子の下流に、単一のポリＡ部位（例えば、ＳＶ４０ポリＡ配列および／またはＢＧＨポリＡ配列、または合成ポリＡを含む他の好適なポリＡ配列）のみを含むであろう。

【0281】

いくつかの態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、ＡＢＣＤ１遺伝子の下流に、複数のポリＡ部位（例えば、ＳＶ４０ポリＡ配列およびＢＧＨポリＡ配列、または合成ポリＡを含む他の好適なポリＡ配列）を含んでもよい。

【0282】

いくつかの態様において、かかる改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、短縮型または切断型ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含むであろう。

【0283】

特定の態様において、改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、（ｉ）任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のＩＴＲ配列からの、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含んでもよく、このＩＴＲ配列は、以下の配列に隣接していてもよい：（ｉｉ）ハイブリッドプロモーターなどの中枢神経系の細胞（ニューロンまたはグリア細胞など）において作動可能なプロモーター、これは、例えば、ＣＭＶ最初期エンハンサー（本明細書においてまたＣＭＶエンハンサーとしても言及される）を、ニワトリベータアクチンプロモーター、ベータアクチンエクソン、キメラ性イントロン、およびウサギベータ－グロビンエクソンの上流に含み、これは、（ｉｉｉ）の上流である；（ｉｉｉ）ヒトＡＢＣＤ１コード配列であって、このＡＢＣＤ１コード配列は、任意に、例えば、開始または停止コドンを取り除くように、ヒト優先コドンを含むように、および／または、その５’末端における「ＣＣＡＣＣ」などのＫＯＺＡＫ配列の付加により、修飾されていてもよく、配列番号２０４、配列番号３０４、配列番号４０４、配列番号５０１～５１０、配列番号１４、および配列番号１００１２、１０１１２、１０２１２、１０５１２、１１０１２、１１１１２、１１２１２、１１３１２、１１５１２および１１７１２のものから選択されるヒトＡＢＣＤ１コード配列を含んでもよい；（ｉｖ）任意に、修飾されたＷＰＲＥ配列であって、このＷＰＲＥは、存在する場合には、Ｘタンパク質発現を除去するように修飾されているか、または、それがＸタンパク質の不活性な形態をコードするように変異している；ならびに（ｖ）ＡＢＣＤ１コード配列および存在する場合には修飾されたＷＰＲＥ配列の下流の、少なくとも１つのポリＡ配列、例えばＳＶ４０ポリＡ配列および／またはＢＧＨポリＡ配列、または合成ポリＡを含む他の好適なポリＡ配列。

【0284】

特定の態様において、改善されたＡＡＶ－ＡＢＣＤ１コンストラクトは、ｐＯＢ１００５（配列番号１００もしくは１０５００）またはｐＯＢ１００５を含むヌクレオチド１～３７１３、ＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ Ｘｉｎａｃｔ（配列番号３００もしくは１００００）またはＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１（配列番号４００もしくは１０２００）、ｐＳＢＴ１０１（配列番号１０１００）、ｐＯＢ１０１０（配列番号１１０００）、ｐＯＢ１０１１（配列番号１１１００）、ｐＯＢ１０１２（配列番号１１２００）、ｐＯＢ１０１３（配列番号１１３００）、ｐＯＢ１０１５（配列番号１１５００）、またはｐＯＢ１０１７（配列番号１１７００）を含んでもよく、あるいは、前述のもののいずれかのバリアントであって、例えば、配列番号２０４、配列番号３０４、配列番号４０４、配列番号５０１～５１０、配列番号１４、および配列番号１００１２、１０１１２、１０２１２、１０５１２、１１０１２、１１１１２、１１２１２、１１３１２、１１５１２および１１７１２のものから選択されるヒトＡＢＣＤ１コード配列を含むように修飾されているものを含んでもよく、あるいは、ＡＢＣＤ１発現を調節するために用いられるプロモーターは、中枢神経系の細胞（ニューロンまたはグリア細胞など）において作動可能な別のプロモーター、例えば、上述のものから選択されるもので置換されていてもよく、あるいは、ＷＰＲＥは、除去されているか、またはＸタンパク質発現を除去するように変異しているかまたは不活性な（例えば短縮型もしくは別段に修飾された不活性なＸタンパク質）を発現するように修飾された、異なる変異したＷＰＲＥ（配列番号３０５または１００７５における修飾されたＷＰＲＥなど）が挿入されていてもよく、あるいは、ＡＢＣＤ１コード配列の前に、「ＣＣＡＣＣ」などのＫＯＺＡＫ配列、または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列

【化9】

へのアプローチを表す任意の配列の挿入により修飾されているか、あるいは、前述のコンストラクトのうちのいずれかにおいて含まれるポリＡシグナル配列の、別のポリＡ配列による置き換えにより、またはＡＡＶ２ ＩＴＲ配列の、他のＡＡＶなどから誘導されるＩＴＲ配列による置き換えにより修飾されているか、あるいは、前述のいずれかの組み合わせである。

【0285】

一態様において、コンストラクト中のヒトＡＢＣＤ１をコードする核酸配列は、それに共有結合により連結したタグポリペプチドをコードする核酸を、さらに含んでもよい。タグポリペプチドは、限定することなく、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタグポリペプチド、ｆｌａｇタグポリペプチド、およびマルトース結合タンパク質タグポリペプチドを含む、公知の「エピトープタグ」から選択してもよい。

【0286】

別の側面において、ヒトＡＢＣＤ１をコードする核酸配列を含む発現カセットが提供される。一態様において、配列は、上記のとおり、コドン最適化されているか、別段に最適化された配列である。

【0287】

別の態様において、ＡＡＶベクターにおける使用のための発現カセットが提供される。その態様において、ＡＡＶ発現カセットは、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）配列を含む。別の態様において、発現カセットは、５’ＩＴＲ配列および３’ＩＴＲ配列を含む。一態様において、５’および３’ＩＴＲは、ヒトＡＢＣＤ１および任意に修飾されたＷＰＲＥをコードする核酸配列に隣接し、これは、任意に宿主細胞においてヒトＡＢＣＤ１をコードする配列の発現を指揮するさらなる配列を伴う。したがって、本明細書において記載される場合、ＡＡＶ発現カセットとは、その５’末端において５’ＡＡＶ逆位末端反復配列配列（ＩＴＲ）に、およびその３’末端において３’ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する、上記のような発現カセットを記載することを意図する。したがって、このｒＡＡＶゲノムは、発現カセットをＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングするために必要とされる最少配列、すなわち、ＡＡＶ ５’および３’ＩＴＲを含む。ＡＡＶ ＩＴＲは、本明細書において記載されるような任意のＡＡＶのＩＴＲ配列から得ることができる。これらのＩＴＲは、結果として生じる組み換えＡＡＶにおいて使用されるキャプシドと同じＡＡＶ起源のものであっても、異なるＡＡＶ起源のものであってもよい（ＡＡＶシュードタイプを生成するために）。一態様において、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０からのＩＴＲ配列、またはその欠失型、短縮型または切断型バージョンが、便宜上、および規制当局の承認を促進するために用いられる。しかし、他のＡＡＶソースからのＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲのソースがＡＡＶ２からのものであり、ＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶソースからのものである場合、結果として生じるベクターは、シュードタイプ化されていると称される場合がある。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ヒトＡＢＣＤ１コード配列および好適な調節配列、およびＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。しかし、これらのエレメントの他の立体配置が好適な場合もある。各々のｒＡＡＶゲノムを、次いで、生成プラスミド中に導入することができる。例示的な短縮型５’ＩＴＲ配列として、これらに限定されないが、配列番号１０５０１、１１００１、１１１０１、１１２０１、１１３０１、１１５０１および１１７０１の核酸配列が挙げられる。例示的な短縮型３’ＩＴＲ配列として、これらに限定されないが、配列番号１０５１８、１１０１８、１１１１８、１１２１８、１１３１８、１１５１８および１１７１８の核酸配列が挙げられる。

【0288】

一側面において、本明細書において記載される発現カセットのうちのいずれかを含むベクターが提供される。本明細書において記載される場合、かかるベクターは、多様な起源のプラスミドであってよく、本明細書においてさらに記載されるように、組み換え複製欠損ウイルスのためのある態様において有用である。

【0289】

別の態様において、ベクターは、本明細書において記載される発現カセットを含むウイルスベクターである。一態様において、本明細書において記載されるような発現カセットを、薬物送達のため、またはウイルスベクターの生成のために用いられるプラスミドの上に操作してもよい。好適なウイルスベクターは、好ましくは複製欠損であり、脳細胞を標的とするものから選択される。ウイルスベクターは、遺伝子治療のために好適な任意のウイルスを含んでもよく、これは、これらに限定されないが、アデノウィルス；ヘルペスウイルスウイルス；レンチウイルス；レトロウイルス；パブロウイルスなどを含む。しかし、本明細書において、アデノ随伴ウイルスとは、具体化されたウイルスベクターである。ウイルスベクター、または非ウイルスベクターは、遺伝子導入および遺伝子治療適用における使用のために、生理学的に許容し得る担体を用いて処方することができる。

【0290】

別の態様において、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが提供される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド、およびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む。

【0291】

ベクターゲノムは、一態様において、（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトＡＢＣＤ１をコードするコード配列；および（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。

【0292】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルスファミリーのメンバーであり、４．７キロベース（ｋｂ）～５ｋｂの一本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムを有する、小さな無エンベロープの正二十面体ウイルスである。既知のＡＡＶ血清型として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、およびその他がある。ＩＴＲおよび他のＡＡＶの構成成分は、ＡＡＶから当業者に利用可能な技術を用いて、容易に単離または操作することができる。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、または公共のソースから、単離するか、操作するか、または得ることができる（例えば、American Type Culture Collection, Manassas, VA）。あるいは、ＡＡＶ配列は、公開された配列、例えば文献において、または例えばGenBank、PubMedなどのデータベースにおいて利用可能であるものへの参照により、合成または他の好適な手段を通して操作してもよい。ＡＡＶウイルスは、慣用的な分子生物学の技術により操作して、細胞特異的な核酸配列の送達のために、免疫原性を最小化するために、安定性および粒子の寿命を調整するために、効率的な分解のために、核への正確な送達などのために、これらの粒子を最適化することができるようにしてもよい。

【0293】

ＡＡＶのフラグメントは、多様なベクター系および宿主細胞において容易に利用することができる。望ましいＡＡＶフラグメントとしては、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３および高頻度可変性領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列がある。かかるフラグメントは、単独で用いても、他のＡＡＶ血清型の配列もしくはフラグメントと組み合わせて用いても、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルスの配列からのエレメントと組み合わせて用いてもよい。本明細書において用いられる場合、人工ＡＡＶ血清型として、限定することなく、天然には存在しないキャプシドタンパク質を有するＡＡＶが挙げられる。かかる人工キャプシドは、任意の好適な技術により、本発明の新規のＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質のフラグメント）を、別のＡＡＶ血清型（既知または新規）、同じＡＡＶ血清型の非隣接部分から、非ＡＡＶウイルスのソースから、または非ウイルス性のソースから得ることができる異種配列と組み合わせて用いて、作製することができる。人工ＡＡＶ血清型は、限定することなく、キメラＡＡＶキャプシド、組み換えＡＡＶキャプシド、または「ヒト化された」ＡＡＶキャプシドであってよい。一態様において、ベクターは、ＡＡＶ９のｃａｐおよび／またはｒｅｐ配列を含む。米国特許第７，９０６，１１１を参照；これは、本明細書において参考として援用される。

【0294】

一態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドを含んでもよい。本明細書において用いられる場合、「ＡＡＶ９キャプシド」は、約６０のウイルスタンパク質（ｖｐ）の数号体であるＤＮＡｓｅ耐性粒子により特徴づけられ、これは、典型的には、異なる長さのタンパク質をもたらす選択的スプライスバリアントとして発現される。また、Genbankアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４．１を参照；これは、本明細書において参考として援用される。また、ＵＳ７９０６１１１およびＷＯ２００５／０３３３２１を参照。本明細書において用いられる場合、「ＡＡＶ９バリアント」とは、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１およびＵＳ８，７３４，８０９において記載されるもの、または、それらと少なくとも約９０％、９５％、９５％、９８％または９９％の同一性を共有する配列を含む。

【0295】

例示的なＡＡＶ９キャプシドは、配列番号７３１のアミノ酸配列（ＡＡＶ９ ＶＰ１）、配列番号７３２（ＡＡＶ９ ＶＰ２）、または配列番号７３３（ＡＡＶ９ ＶＰ３）またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ ＶＰ１キャプシド、ＡＡＶ９ ＶＰ２キャプシド、およびＡＡＶ９ ＶＰ３キャプシドのうちの１つ以上を含んでもよい。

【0296】

一態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２キャプシドを含んでもよい。

【0297】

例示的なＡＡＶ２キャプシドは、配列番号８３１のアミノ酸配列（ＡＡＶ２ ＶＰ１）、配列番号８３２（ＡＡＶ２ ＶＰ２）、または配列番号８３３（ＡＡＶ２ ＶＰ３）またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ ＶＰ１キャプシド、ＡＡＶ２ ＶＰ２キャプシド、およびＡＡＶ２ ＶＰ３キャプシドのうちの１つ以上を含んでもよい。

【0298】

一態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ．１０キャプシドを含んでもよい。

【0299】

例示的なＡＡＶｒｈ．１０キャプシドは、配列番号９３１のアミノ酸配列（ＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ１）、配列番号９３２（ＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ２）、または配列番号９３３（ＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ３）またはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ１ キャプシド、ＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ２キャプシド、およびＡＡＶｒｈ．１０ ＶＰ３キャプシドのうちの１つ以上を含んでもよい。

【0300】

本明細書において用いられる場合、用語「クレード」とは、それがＡＡＶのグループと関連する場合、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、（少なくとも１０００回の複製の）少なくとも７５％のブートストラップ値、および０．０５以下のポアソン補正距離測定により、近隣結合（Neighbor-Joining）アルゴリズムを用いて決定された場合に、互いに系統学的に関連するＡＡＶのグループを指す。近隣結合アルゴリズムは、文献において記載されている。例えば、M. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics, Oxford University Press, New York (2000)を参照。このアルゴリズムを実行するために用いることができるコンピュータープログラムが利用可能である。例えば、MEGA v2.1プログラムは、改変Nei-Gojobori法を実行する。これらの技術およびコンピュータープログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１キャプシドタンパク質の配列を用いて、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書において同定されたクレードのうちの１つにおいて、別のクレードにおいて、含まれるか否か、またはこれらのクレードの外側にあるかを、容易に決定することができる。例えば、G Gao, et al, J Virol, 2004 Jun; 78(10): 6381-6388を参照；これは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦを同定し、新規のＡＡＶの核酸配列、GenBankアクセッション番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９を提供する。また、ＷＯ ２００５／０３３３２１を参照。ＡＡＶ９は、クレードＦ中にあることにより、さらに特徴づけられる。他のクレードＦのＡＡＶとして、ＡＡＶｈｕ３１およびＡＡＶｈｕ３２が挙げられる。

【0301】

本明細書においてＡＡＶに関して用いられる場合、バリアントという用語は、既知のＡＡＶ配列から誘導される任意のＡＡＶ配列を意味し、これは、アミノ酸または核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％またはそれより大きな配列同一性を共有するものを含む。別の態様において、ＡＡＶキャプシドは、任意の記載されたまたは既知のＡＡＶキャプシド配列からの約１０％までのバリエーションを含んでもよいバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶキャプシドは、本明細書において提供されるか、および／または当該分野において公知のＡＡＶキャプシド上で、約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性または約９７％～約９８％の同一性を共有する。一態様において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドと、少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶキャプシドのパーセント同一性を決定する場合、可変性タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のうちのいずれの上で比較を行ってもよい。一態様において、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９と、ｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３上で、少なくとも９５％の同一性を共有する。

【0302】

本明細書において用いられる場合、「人工ＡＡＶ」とは、限定することなく、天然には存在しないキャプシドタンパク質を有するＡＡＶを意味する。かかる人工キャプシドは、任意の好適な技術により、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質のフラグメント）を、異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非隣接部分から、非ＡＡＶウイルスのソースから、または非ウイルス性のソースから得ることができる異種配列と組み合わせて用いて、作製することができる。人工ＡＡＶは、限定することなく、シュードタイプ化されたＡＡＶ、キメラＡＡＶキャプシド、組み換えＡＡＶキャプシド、または「ヒト化された」ＡＡＶキャプシドであってよい。１つのＡＡＶのキャプシドが異種のキャプシドタンパク質で置き換えられているシュードタイプ化ベクターは、本発明において有用である。一態様において、ＡＡＶ２／９およびＡＡＶ２／ｒｈ．１０は、例示的なシュードタイプ化ベクターである。

【0303】

別の態様において、自己相補的ＡＡＶが用いられる。「自己相補的ＡＡＶ」とは、組み換えＡＡＶ核酸配列により担持されるコード領域が、分子内の二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている発現カセットを有する、プラスミドまたはベクターを指す。感染すると、細胞により媒介される第２鎖の合成を待つよりも、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成し、これは、すぐに複製および転写される準備ができている。例えば、D M McCartyら、「Self-complementary recombinant adeno- associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis」、Gene Therapy（２００１年８月）、第８巻、第１６号、１２４８～１２５４頁を参照。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；および同第７，４５６，６８３号において記載され、これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される。

【0304】

なお別の態様において、本明細書において記載されるもののいずれかを含む発現カセットは、組み換えＡＡＶゲノムを作製するために使用される。

【0305】

一態様において、本明細書において記載される発現カセットは、ウイルスベクターを作製するために、および／または宿主細胞への送達のために有用な、その上に担持されたヒトＡＢＣＤ１配列を導入する、好適な遺伝子エレメント（ベクター）、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどへと操作される。選択されたベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む、任意の好適な方法により、送達することができる。かかるコンストラクトを作製するために用いられる方法は、核酸操作における技術を有する当業者に公知であり、遺伝子工学、組み換え工学、および合成技術を含む。例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYを参照。

【0306】

発現カセットまたはｒＡＡＶゲノムまたは生成プラスミドを、ビリオン中にパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットとして同じコンストラクト中でシスにおいて必要とされる、唯一のＡＡＶ構成成分である。一態様において、複製（ｒｅｐ）および／またはキャプシド（ｃａｐ）のためのコード配列を、ＡＡＶゲノムから取り除き、ＡＡＶベクターを作製するために、パッケージング細胞株によりトランスにおいて供給する。

【0307】

対象への送達のために好適なＡＡＶウイルスベクターを作製および単離するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許７７９０４４９；米国特許７２８２１９９；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９；およびＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照。１つの系においては、生産者細胞株に、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子をコードするコンストラクトならびにｒｅｐおよびｃａｐをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトする。第２の系においては、ｒｅｐおよびｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲが隣接する導入遺伝子をコードするコンストラクトで一過性にトランスフェクトする。これらの系の各々において、ヘルパーアデノウィルスまたはヘルペスウイルスによる感染に応答して、ＡＡＶビリオンが生成され、これは、混入するウイルスからのｒＡＡＶの分離を要求する。

【0308】

本開示によるＡＡＶウイルスベクターを作製するための１つの例示的な方法は、以下のステップを含んでもよい：（ｉ）ＨＥＫ２９３細胞などの細胞を、（１）目的のｒＡＡＶゲノムベクタープラスミド（例えばｐＳＢＴ１０１、ｐＯＢ１００５、ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１１、ｐＯＢ１０１２、ｐＯＢ１０１３、ｐＯＢ１０１５もしくはｐＯＢ１０１７、またはＡＡＶ．ＡＢＣＤ１．ＷＰＲＥ－ＸｉｎａｃｔのＡＡＶゲノムをコードするプラスミド）、（２）ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードするプラスミド（「Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド」）（例えばｐＡＡＶ２／９）ならびに（３）１つ以上のウイルスヘルパー遺伝子をコードするプラスミド（「ウイルスヘルパープラスミド」）（例えばｐＡＬＤ－Ｘ８０またはｐＨＥＬＰ＿ＫａｎＶ４）でトランスフェクトすること；（ｉｉ）上清または細胞ライセートに対してカラム精製またはＣｓＣｌ勾配遠心分離などの精製を行うこと；ならびに（ｉｉｉ）遠心分離生成物を脱塩および濃縮すること。

【0309】

あるいは、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスによる感染を必要としない系が、開発されてきた。必要とされるヘルパー機能（すなわち、アデノウィルスＥｌ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）はまた、系によりトランスにおいて供給される。これらのより新しい系においては、ヘルパー機能は、要求されるヘルパー機能をコードするコンストラクトによる細胞の一過性トランスフェクションにより供給することができ、または、細胞を、その発現を転写または転写後のレベルにおいて制御することができるヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含むように、操作してもよい。

【0310】

さらに別の系においては、バキュロウイルスベースのベクターによる感染により、ＩＴＲおよびｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子が隣接した発現カセットを、昆虫細胞中に導入する。これらの生産系についての総説については、一般に、例えば、Zhang et al, 2009,「Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production」、Human Gene Therapy 20:922-929を参照；その内容は、その全体において、本明細書において参考として援用される。これらのおよび他のＡＡＶ生産系を作製して用いる方法はまた、以下の米国特許において記載され、これらの各々の内容は、その全体において、本明細書において参考として援用される：５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；および７，４３９，０６５。一般に、例えば、Grieger＆Samulski、２００５年、「Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications」、Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145；Buningら、２００８年、「Recent developments in adeno-associated virus vector technology」、J. Gene Med. 10:717-733；および下に引用される参考文献を参照これらの各々は、その全体において、本明細書において参考として援用される。

【0311】

本発明の任意の態様を構築するために用いられる方法は、核酸操作における技術を有する当業者に公知であり、遺伝子工学、組み換え工学および合成技術を含む。例えば、Green and Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)を参照。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作製する方法は周知であり、好適な方法の選択は、本発明の限定要因ではない。例えば、K. Fisher et al, (1993) J. Virol., 70:520-532および米国特許第５，４７８，７４５号を参照。

【0312】

「プラスミド」は、一般に、本明細書において、当業者になじみ深い標準的な命名の慣習に従って、小文字のｐが、文字および／または数により先行および／または追従されることにより命名される。本発明により用いることができる多くのプラスミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターは、周知であり、当業者にとって容易に入手可能である。さらに、当業者は、本発明における使用のために好適な他のプラスミドを、いくらでも容易に構築することができる。本発明における、かかるプラスミド、ならびに他のベクターの特性、構築および使用は、本開示から、当業者にとって容易に明らかであろう。

【0313】

一態様において、生成プラスミドは、本明細書において記載されるもの、または、ＷＯ２０１２／１５８７５７において記載されるものであり、これは、本明細書において参考として援用される。ｒＡＡＶベクターを生成することにおける使用のための多様なプラスミドが、当該分野において公知であり、本明細書において用いられる。生成プラスミドは、ＡＡＶ ｃａｐおよび／またはｒｅｐタンパク質を発現する宿主細胞中で培養される。宿主細胞において、各々のｒＡＡＶゲノムは、キャプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質中にパッケージングされて、感染性のウイルス粒子を形成する。

【0314】

一側面において、上記の発現カセットを含む生成プラスミドが提供される。一態様において、生成プラスミドは、図５、６、７、１０～１２において示すものである。これらのプラスミドは、例において例証される。かかるプラスミドは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列；選択されたプロモーター；ポリＡシグナル；および３’ＩＴＲを含む；加えて、それはまた、ニワトリベータ－アクチンイントロンなどのイントロン配列を含む。その例示的な模式図および関連する配列番号を、図５、６、７、および１０～１２において示す。いくつかの態様において、選択されたイントロン配列は、ｒＡＡＶベクターゲノムを、約３キロベース（ｋｂ）～約６ｋｂ、約４．７ｋｂ～約５ｋｂ、約３ｋｂ～約５．５ｋｂ、または約４．７ｋｂ～５．５ｋｂのサイズに保つ。ヒトＡＢＣＤ１をコードする配列を含む生成プラスミドの一例は、配列番号１００、または配列番号１００００、１０１００、１０２００、１０５００、１１０００、１１１００、１１２００、１１３００、１１５００および１１７００のうちのいずれかにおいて、見出すことができる。別の態様において、生成プラスミドは、ベクタープラスミド生成効率を最適化するために修飾される。かかる修飾は、他の中性の配列の付加、またはベクタープラスミドのスーパーコイルのレベルを調節するために、ラムダスタッファー（lambda stuffer）配列の包含を含む。かかる修飾は、本明細書において企図される。他の態様において、ターミネーターおよび他の配列は、プラスミド中に含まれる。

【0315】

ある態様において、ｒＡＡＶ発現カセット、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、ウイルス（ｒＡＡＶなど）、および／または生成プラスミドは、ＡＡＶ逆位末端反復配列、ヒトＡＢＣＤ１をコードするコドン最適化された核酸配列、および宿主細胞におけるコードされるタンパク質の発現を指揮する発現制御配列を含む。他の態様において、ｒＡＡＶ発現カセット、ウイルス、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、および／または生成プラスミドは、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ、転写後調節エレメント、およびその他のうちの１つ以上をさらに含む。一態様において、転写後調節エレメントは、Ｘタンパク質が発現されないかまたは不活性な形態において発現される、改変ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。

【0316】

発現カセット、ベクターおよびプラスミドは、他の構成成分を含み、これは、例えば本明細書において記載されるようなコドン最適化を含む当該分野において公知の技術を用いて、特定の種について最適化することができる。カセット、ベクター、プラスミドおよびウイルスまたは本明細書において記載される他の組成物の構成成分は、発現制御配列の一部として、プロモーター配列を含む。別の態様において、プロモーターは、細胞特異的である。用語「細胞特異的」とは、組み換えベクターのために選択された特定のプロモーターが、ニューロンまたはグリア細胞などの特定の細胞または組織の型における、ヒトＡＢＣＤ１コード配列の発現を指揮することができることを意味する。一態様において、プロモーターは、上衣、脳室系の上皮の裏層における、導入遺伝子の発現について特異的である。別の態様において、プロモーターは、ニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞、後根神経節、およびミクログリアから選択される脳細胞における発現について特異的である。一態様において、プロモーターは、クローニングを促進するために、１つ以上の制限酵素切断部位を付加するように修飾される。

【0317】

別の態様において、プロモーターは、偏在性の、または構成的プロモーターである。好適なプロモーターの例は、ハイブリッドプロモーターであり、これは、いくつかの場合において、ニワトリベータアクチンプロモーターを、ＣＭＶエンハンサー配列などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントと共に含む。かかるハイブリッドプロモーターは、例えば、図５、６、７、および１０～１２において開示されるコンストラクトにおいて含まれる。別の態様において、プロモーターは、ＣＢ７プロモーターである。他の好適なプロモーターとして、ヒトｂ－アクチンプロモーター、ヒト伸長因子－１プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０プロモーター、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。例えば、Damdindorjら（２０１４年８月）「A Comparative Analysis of Constitutive Promoters Located in Adeno-Associated Viral Vectors」、PLOS ONE 9(8): e106472を参照。さらに他の好適なプロモーターとして、ウイルスのプロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーターが挙げられる［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照］。あるいは、生理学的なキューに応答するプロモーターを、本明細書において記載される発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、ベクター、プラスミドおよびウイルスにおいて利用してもよい。一態様において、プロモーターは、ＡＡＶベクターのサイズの限界に起因して、１０００ｂｐ未満の小さなサイズのものである。別の態様において、プロモーターは、４００ｂｐ未満である。他のプロモーターは、当業者により選択され得る。

【0318】

さらなる態様において、プロモーターは、以下から選択される：ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ファージラムダ（ＰＬ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、テトラサイクリンにより制御されるトランスアクチベーター応答性プロモーター（ｔｅｔ）系、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＢＩＶ ＬＴＲまたはＨＩＶ ＬＴＲなどの長い末端反復（long terminal repeat：ＬＴＲ）プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルスのＵ３領域プロモーター、グランザイムＡプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、ＣＤ３４プロモーター、ＣＤ８プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、ＰＧＫプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、ＨＳＰ６５およびＨＳＰ７０プロモーターなどのヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｌａｃプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモーター、ＭＮＤプロモーター、またはＭＮＣプロモーター。
それらのプロモーター配列は、当業者に公知であるか、例えば学術文献において、またはデータベース、例えば、GenBank、PubMedなどにおいて、公共に利用可能である。

【0319】

別の態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、ラパマイシン／ラパログプロモーター、エクジソンプロモーター、エストロゲン応答性プロモーター、およびテトラサイクリン応答性プロモーター、またはヘテロ二量体リプレッサースイッチ（heterodimeric repressor switch）を含む既知のプロモーターから選択してもよい。Sochorら、「An Autogenously Regulated Expression System for Gene Therapeutic Ocular Applications」、Scientific Reports, 2015 Nov 24;5: 17105およびDaber R, Lewis M.,「A novel molecular switch」、J Mol Biol. 2009 Aug 28;39l(4):661-70, Epub 2009 Jun 21を参照；これらはいずれも、それらの全体において本明細書において参考として援用される。

【0320】

他の態様において、本明細書において記載される発現カセット、ベクター、プラスミドおよびウイルスは、他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列、効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；ＴＡＴＡ配列；細胞質のｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；イントロン；タンパク質の安定性を増強する配列；ならびに、所望される場合には、コードされる生成物の分泌を増強する配列を含む。発現カセットまたはベクターは、本明細書において記載されるエレメントを全く含まなくとも、そのうちのいずれかのうちの１つ以上を含んでもよい。

【0321】

いくつかの態様において、本明細書において開示されるようなｒＡＡＶウイルスゲノムをコードするｒＡＡＶウイルスゲノムおよびプラスミドは、コードされるＡＢＣＤ１遺伝子またはＡＢＣＤ１遺伝子バリアントの翻訳の終結を促進する、１つのターミネーターを含んでもよ。いくつかの場合において、かかるターミネーターは、本明細書において「ターミネーター１」として言及される場合がある。いくつかの態様において、本明細書において開示されるようなｒＡＡＶウイルスゲノムをコードするｒＡＡＶウイルスゲノムおよびプラスミドは、これもまたコードされるＡＢＣＤ１遺伝子またはＡＢＣＤ１遺伝子バリアントの翻訳の終結を促進する、別のターミネーターを含んでもよい。いくつかの場合において、かかるターミネーターは、として言及される場合がある。「ターミネーター２」として言及される場合があり、「ターミネーター１」と同じであっても、異なっていてもよい。いくつかの態様において、本明細書において開示されるようなｒＡＡＶウイルスゲノムをコードするｒＡＡＶウイルスゲノムおよびプラスミドは、２つより多くのターミネーターを含んでもよい。いくつかの態様において、ターミネーター１は、配列番号１００７１、１０１７１、１０２７１、１０５７１、１１０７１、１１１７１、１１２７１、１１３７１、１１５７１もしくは１１７７１の核酸配列によりコードされていてもよい。いくつかの態様において、ターミネーター２は、配列番号１０５７２、１１２７２もしくは１１３７２の核酸配列によりコードされていてもよい。

【0322】

好適なポリＡ（本明細書においてまた「ｐＡ」としても言及される）シグナルの例として、例えば、ウシ増殖ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト増殖ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギｂ－グロビン（ＲＧＢ）、または修飾されたＲＧＢ（ｍＲＧＢ）からの合成ポリＡが挙げられる。例示的なｂＧＨ ｐＡ配列は、例えば、アクセッション番号Ｍ５７７６４により提供される配列を含んでもよい。例示的なｈＧＨ ｐＡ配列は、例えば、アクセッション番号ＮＧ＿０１１６７６により提供される配列を含んでもよい。例示的なＳＶ４０ ｐＡ配列は、例えば、アクセッション番号ＮＣ＿００１６６９により提供される配列を含んでもよい。例示的なＲＢＧ ｐＡ配列は、例えば、アクセッション番号Ｖ００８８２により提供される配列を含んでもよい。例示的な態様において、ポリＡは、本明細書において記載されるＡＡＶコンストラクト、例えば図５、６、７、および１０～１２において開示されるものにおいて示されるような核酸配列を含む、ＳＶ４０またはＢＧＨポリＡ配列である。いくつかの態様において、ＳＶ４０ポリＡシグナルは、配列番号２７、１００１４、１０１１４、１０２１４、１０５１４、１１０１４、１１２１４もしくは１１７１４の核酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ｂＧＨポリＡシグナルは、配列番号１００１６、１０１１６、１０２１６、１１０１６、１１１１６、１１２１６、１１３１６、１１５１６もしくは１１７１４の核酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡシグナルの両方を、直列に用いてもよい。かかる場合において、ポリＡシグナルは、配列番号３０６、４０５、１００３５、１０１３５、１０２３５、１１０３５、１１２３５もしくは１１７３５の核酸配列を含んでもよい。

【0323】

好適なエンハンサーの例として、例えば、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、アルファフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲミニマルプロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／アルファｌ－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥ、その他が挙げられる。いくつかの態様において、ＣＭＶエンハンサーは、アクセッション番号：ＮＣ＿００６２７３により提供される参照ＣＭＶ配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号７、１０００５、１０１０５、１０２０５、１０５０５、１１００５、１１１０５、１１２０５、１１３０５、１１５０５もしくは１１７０５の核酸配列を含んでもよい。

【0324】

一態様において、「ＣＣＡＣＣ」などのＫｏｚａｋ配列、または最適なタンパク質翻訳開始のためのコンセンサス配列：

【化10】

へのアプローチを表す配列は、正確な開始コドンからの翻訳を増強するために、ヒトＡＢＣＤ１コード配列の上流に含まれる。別の態様において、ＣＢＡエクソン１およびイントロンは、発現カセット中に含まれる。一態様において、ヒトＡＢＣＤ１コード配列は、ハイブリッドプロモーターの制御下に置かれる。いくつかの場合において、ハイブリッドプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー、近位ニワトリベータアクチンプロモーター、およびイントロン１配列に隣接するＣＢＡエクソン１を含む。

【0325】

別の態様において、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトベータグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、アルファ－グロブリン、ベータ－グロブリン、コラーゲン、卵白アルブミン、ｐ５３、ウサギベータグロビン、またはそのフラグメントから選択される。例示的なＣＢＡイントロンは、例えば、アクセッション番号Ｘ００１８２により提供される配列を含んでもよい。例示的なウサギベータグロビンイントロンは、例えば、アクセッション番号Ｖ００８８２により提供される配列を含んでもよい。例示的なイントロンは、配列番号１２、１０００９、１０１０９、１０２０９、１０５０９、１１００９、１１１０９、１１２０９、１１３０９、１１５０９もしくは１１７０９の核酸配列を含んでもよい。

【0326】

一態様において、発現カセット、ベクター、プラスミドおよびウイルスは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータ－アクチンエクソン１およびイントロン、ヒトＡＢＣＤ１配列、ならびにＳＶ４０および／またはＢＧＨのポリＡを含む。さらなる態様において、発現カセットは、配列番号１００のｎｔ１～３７１３を含む。

【0327】

さらなる態様において、生成プラスミドは、配列番号１００、または配列番号１００００、１０１００、１０２００、１０５００、１１０００、１１１００、１１２００、１１３００、１１５００もしくは１１７００のうちのいずれか、またはその任意のバリアントであって、機能的に等価であるものの配列を有する。

【0328】

いくつかの好ましい態様において、生成プラスミドは、配列番号１００００、１０１００、１０２００、１０５００、１１０００、１１１００、１１２００、１１３００、１１５００もしくは１１７００の配列を有する。

【0329】

さらなる好ましい態様において、生成プラスミドは、配列番号１０１００、１１０００、１１５００もしくは１１７００の配列を有する。

【0330】

別の側面において、ＡＢＣＤ１遺伝子の欠損により越されたＡＬＤまたはＡＭＮ疾患を処置するための方法は、それを必要とする対象に、本明細書において記載されるようなヒトＡＢＣＤ１をコードするベクター（ｒＡＡＶなど）を送達することを含む。一態様において、ＡＬＤまたはＡＭＮ疾患を有する対象を本明細書において記載されるｒＡＡＶで処置する方法が提供される。

【0331】

また本明細書において提供されるのは、医薬組成物である。本明細書において記載される医薬組成物は、任意の好適な経路または異なる経路の組み合わせによる、それを必要とする対象への送達のために設計される。

【0332】

さらに他の側面において、これらの核酸配列、ベクター、発現カセットおよびｒＡＡＶウイルスベクターは、医薬組成物において有用であり、これはまた、薬学的に許容し得る担体、賦形剤、バッファー、希釈剤、界面活性剤、保存剤および／またはアジュバントなどを含む。かかる医薬組成物は、かかる組み換えにより操作されたＡＡＶまたは人工ＡＡＶによる送達を通して、ｒＡＡＶウイルスを安定化させ、送達の間のｒＡＡＶウイルスの損失を予防し、および／または宿主細胞においてヒトＡＢＣＤ１タンパク質を首尾よく発現させることを補助するために用いられる。

【0333】

核酸配列、ベクター、発現カセットおよびｒＡＡＶウイルスベクターを含むこれらの医薬組成物を調製するために、配列またはベクターもしくはウイルスベクターは、好ましくは、慣用的な方法により、混入について評価され、次いで、患者への投与のために好適な医薬組成物中に処方される。かかる処方物は、薬学的におよび／または生理学的に許容し得るビヒクルまたは担体、例えばｐＨを適切な生理学的レベルに維持するために緩衝化食塩水または他のバッファー、例えばＨＥＰＥＳ、および任意に、他の薬用の剤、医薬用の剤、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤、界面活性剤または賦形剤などの使用を含む。注射のために、担体は、典型的には、液体であろう。例示的な生理学的に許容し得る担体として、無菌のパイロジェンフリー水、および無菌のパイロジェンフリーのリン酸緩衝化食塩水が挙げられる。多様なかかる既知の担体は、本明細書において参考として援用される米国特許第７，６２９，３２２号において提供される。一態様において、担体は、等張性の塩化ナトリウム溶液である。別の態様において、担体は、平衡化塩溶液である。一態様において、担体は、ｔｗｅｅｎを含む。ウイルスを長期間保存する場合、それを、グリセロールまたはTween20の存在下において凍結してもよい。

【0334】

１つの例示的な特定の態様において、担体または賦形剤の組成物は、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ７．３）を、０．０００１％～０．０１％のPluronic F68（PF68）と共に含んでもよい。バッファーの食塩水構成成分の正確な組成は、１６０ｍＭ～１８０ｍＭのＮａＣｌの範囲であってよい。任意に、具体的に記載されるバッファーの代わりに、様々なｐＨバッファー（潜在的に、ＨＥＰＥＳ、炭酸水素ナトリウム、ＴＲＩＳ）を用いることができる。

【0335】

本明細書において用いられる場合、用語「投与量」とは、処置の経過において対象に送達される総投与量、単一の単位（または複数の単位もしくは分割投与量）の投与において送達される量を指し得る。薬学的なウイルス組成物は、投与量単位において、本明細書において記載されるようなヒトＡＢＣＤ１をコードするコドン最適化された核酸配列を担持する複製欠損ウイルスを、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣ／用量の範囲（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）の量で含むように、処方することができる。一態様において、組成物は、少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９または９×１０^９ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０または９×１０^１０ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１１、２×１０^ｖ、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１または９×１０^１１ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２または９×１０^１２ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３または９×１０^１３ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４または９×１０^１４ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５または９×１０^１５ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。一態様において、ヒトでの適用のために、用量は、１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣ／用量の範囲（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）であってよい。全ての投与量は、任意の既知の方法により測定することができ、これは、例えば、M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2): l 15-25. doi: 10. 1089/hgtb.20l3.131において記載されるようなｑＰＣＲまたはデジタルドロップレット（digital droplet）ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により測定されるものを含み、これは、本明細書において参考として援用される。

【0336】

一態様において、ＡＬＤまたはＡＭＮ患者への投与のために好適な水性懸濁液が提供される。懸濁液は、水性の懸濁液、および脳１グラムあたり約７．５×１０^９ＧＣのウイルス粒子～約１×１０^１２ＧＣのウイルス粒子の、ＡＬＤまたはＡＭＮ疾患のための治療剤として有用な本明細書において記載される組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む。

【0337】

また、本発明の医薬組成物の複数の「ブースター」投与量を投与することが望ましい場合もある。例えば、ＣＮＳ中の導入遺伝子の持続時間に依存して、第１の投与の後、６か月間の間隔で、または毎年、ブースター投与量を送達してもよい。ｒＡＡＶベクターの投与により、ＡＡＶを中和する抗体が生成されなかったという事実は、さらなるブースター投与を可能にすべきである。

【0338】

かかるブースター投与量およびその必要性は、例えばヒトＡＢＣＤ１活性および／または神経性の試験を用いて、主治医によりモニタリングすることができる。他の類似の試験を用いて、処置される対象の状態を経時的に決定もよい。適切な試験の選択は、主治医により行われてよい。なお代替的には、本発明の方法はまた、正常な対象において見いだされるものに近いＡＢＣＤ１活性レベルを可能にするために、単一または複数回の感染において、より大きな容積のウイルス含有溶液の注射を含んでもよい。

【0339】

これらの上の用量は、患者のサイズ、用いられるウイルス力価、投与の経路、および方法の所望される効果に依存して、約１００マイクロリットル～約１５０ｍＬの範囲（当該範囲内の全ての数を含む）の、多様な容積の担体、賦形剤またはバッファー処方物において投与することができる。一態様において、担体、賦形剤またはバッファーの容積は、少なくとも約５００μＬである。一態様において、容積は、約７５０μＬである。別の態様において、容積は、約１ｍＬである。別の態様において、容積は、約２ｍＬである。別の態様において、容積は、約３ｍＬである。別の態様において、容積は、約４ｍＬである。別の態様において、容積は、約５ｍＬである。別の態様において、容積は、約６ｍＬである。別の態様において、容積は、約７ｍＬである。別の態様において、容積は、約８ｍＬである。別の態様において、容積は、約９ｍＬである。別の態様において、容積は、約１０ｍＬである。別の態様において、容積は、約１１ｍＬである。別の態様において、容積は、約１２ｍＬである。別の態様において、容積は、約１３ｍＬである。別の態様において、容積は、約１４ｍＬである。別の態様において、容積は、約１５ｍＬである。別の態様において、容積は、約１６ｍＬである。別の態様において、容積は、約１７ｍＬである。別の態様において、容積は、約１８ｍＬである。別の態様において、容積は、約１９ｍＬである。別の態様において、容積は、約２０ｍＬである。別の態様において、容積は、約２１ｍＬである。別の態様において、容積は、約２２ｍＬである。別の態様において、容積は、約２３ｍＬである。別の態様において、容積は、約２４ｍＬである。別の態様において、容積は、約２５ｍＬ以上である。一態様において、最大注射容積は、総脳脊髄液容積の約１０％である。別の態様において、容積は、約５０ｍＬ～約１５０ｍＬである。別の態様において、容積は、約５０ｍＬである。別の態様において、容積は、約６０ｍＬである。別の態様において、容積は、約７０ｍＬである。別の態様において、容積は、約８０ｍＬである。別の態様において、容積は、約９０ｍＬである。別の態様において、容積は、約１００ｍＬである。別の態様において、容積は、約１１０ｍＬである。別の態様において、容積は、約１２０ｍＬである。別の態様において、容積は、約１３０ｍＬである。別の態様において、容積は、約１４０ｍＬである。別の態様において、容積は、約１５０ｍＬである。好ましい態様において、容積は、約１００ｍＬである。

【0340】

一態様において、ウイルスコンストラクトは、マウスなどの小さな動物対象について、約１００マイクロリットル～約１ｍＬの容積中で、少なくとも１×１０^９～約少なくとも１×１０^１３ＧＣの用量において、送達することができる。より大きな獣医学的対象については、上で記述されるよりおおきなヒト用の投与量および容積が有用である。多様な獣医学的動物への物質の投与のための良好な実施の考察については、例えば、Diehl et al, J. Applied Toxicology, 21: 15-23 (2001)を参照。この文書は、本明細書において参考として援用される。

【0341】

毒性などの望ましくない効果のリスクを減少させるために、ウイルスまたは他の送達ビヒクルの最低有効濃度が利用されることが、望ましい。これらの範囲におけるなお他の投与量は、処置されている対象、好ましくはヒトの身体的状態、対象の年齢、および障害が発達している程度を考慮して、主治医により選択されてよい。

【0342】

本明細書において記載されるさらに別の側面は、哺乳動物対象において、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）および／もしくは副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）を処置もしくは予防する、ならびに／またはそれに関連する症状を寛解させる方法である。一態様において、好ましくは生理学的に適合可能な担体、希釈座、賦形剤および／またはアジュバント中で懸濁された、ＡＢＣＤ１のネイティブな、修飾された、またはコドン最適化された配列を担持するｒＡＡＶを、治療有効量において、ヒト対象を含む、所望される対象に投与してもよい。この方法は、それを必要とする対象に、核酸配列、発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、プラスミド、ベクターもしくはｒＡＡＶベクター、またはこれらを含む組成物のうちのいずれかを投与することを含む。

【0343】

一態様において、組成物は、髄腔内で送達される。別の態様において、組成物は、ＩＣＶを介して送達される。別の態様において、組成物は、大槽内投与により送達される。なお別の態様において、組成物は、ＡＬＤまたはＡＭＮ疾患の処置のために好適な投与経路の組み合わせを用いて送達され、静脈内投与または他の慣用的な投与経路を含んでもよい。

【0344】

これらの方法における使用のために、各々の投与量の容積およびウイルス力価は、本明細書においてさらに記載されるように、個々に決定される。投与量、投与およびレジメンは、本明細書の教示を考慮して、主治医により決定されてよい。別の態様において、方法は、組成物を、２つ以上の投与量（例えば分割投与量）において投与することを含む。別の態様において、選択された発現カセット（例えば、ＡＢＣＤ１含有カセット）を含むｒＡＡＶの第２の投与は、より後の時点において行われる。かかる時点は、第１の投与の後、数週間、数カ月間または数年間であってよい。かかる第２の投与は、一態様において、第１の投与からのｒＡＡＶとは異なるキャプシドを有するｒＡＡＶにより行われる。別の態様において、第１および第２の投与からのｒＡＡＶは、同じキャプシドを有する。

【0345】

なお他の態様において、本明細書において記載される組成物を、単一の組成物または複数の組成物において送達してもよい。任意に、２つ以上の異なるＡＡＶまたは複数のウイルスを送達してもよく（例えば、ＷＯ ２０１１／１２６８０８およびＷＯ ２０１３／０４９４９３を参照）。別の態様において、複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶおよびアデノウィルス）を含んでもよい。

【0346】

本発明により、ヒトＡＢＣＤ１ベクターの「治療有効量」が、本明細書において記載されるように、所望される結果、すなわちＡＬＤまたはＡＭＮ疾患またはその１つ以上の症状の処置を達成するために、送達される。一態様において、処置のゴールは、疾患の進行を限定することである。このことは、先に記載されているような、症状の定量的および定性的な評価により評価することができる。

【0347】

別の態様において、方法は、さらなる試験、例えば、処置の効力を決定するためのアッセイおよび神経学的試験を行うことを含む。かかる試験は、ＵＢＤＲＳの一部として行われるものを含み、限定することなく、以下の評価を含む：発生の明瞭さ、舌の突出、視力、緊張（腕、脚、頸）、強度（腕、脚）、ハンドタッピング（hand tapping）、踵踏み鳴らし（heel stomping）、自発運動（無動症）、常同症、ジストニア、ミオクローヌス、振戦、舞踏病、測定異常、歩調、姿勢安定性、てんかん発作、行動および気分、ならびに全体的な健康状態。

【0348】

本明細書において記載される方法の一態様において、本明細書において記載されるような組成物のワンタイム（one-time）送達、例えば最適化されたヒトＡＢＣＤ１カセットのＡＡＶ送達が、対象においてＡＬＤまたはＡＭＮ疾患を処置することにおいて有用である。本明細書において記載される方法の別の態様において、本明細書において記載されるような組成物のワンタイム送達、例えば最適化されたヒトＡＢＣＤ１カセットのＡＡＶ送達は、ＡＢＤＣ１遺伝子において欠損を有する対象においてＡＬＤまたはＡＭＮ疾患を予防するために有用である。

【0349】

したがって、一態様において、組成物は、疾患の発症の前に投与される。別の態様において、組成物は、神経機能障害の開始の前に投与される。別の態様において、組成物は、神経機能障害の開始の後で投与される。一態様において、新生児期の処置は、出産の８時間以内、初めの１２時間、初めの２４時間、または初めの４８時間に、本明細書において記載されるようなＡＢＣＤ１コード配列、発現カセットまたはベクターがを投与されることとして定義される。別の態様において、特に霊長類(ヒトまたは非ヒト）について、新生児期の送達とは、約１２時間～約１週間、２週間、３週間または約１か月間の期間内、または約２４時間～約４８時間後である。別の態様において、組成物は、症状の発症の後で送達される。一態様において、患者の処置（例えば、第１の注射）は、人生の第１年目より前に開始される。別の態様において、処置は、最初の１年の後で、または最初の２～３歳の後で、５歳の後で、１１歳の後で、またはより後の年齢において開始される。一態様において、処置は、約４歳～約１２歳に開始される。一態様において、処置は、約４歳の時、またはその後で開始される。一態様において、処置は、約５歳の時、またはその後で開始される。一態様において、処置は、約６歳の時、またはその後で開始される。一態様において、処置は、約７歳の時、またはその後で開始される。一態様において、処置は、約８歳の時、またはその後で開始される。一態様において、処置は、約９歳の時、またはその後で開始される。一態様において、処置は、約１０歳の時、またはその後で開始される。一態様において、処置は、約１１歳の時、またはその後で開始される。一態様において、処置は、約１２歳の時、またはその後で開始される。しかし、処置は、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５または約４０歳の時に、またはその後で開始されてもよい。一態様において、子宮における処置は、本明細書において記載されるような組成物を、胎児において投与することとして定義される。例えば、David et al, Recombinant adeno-associated virus-mediated in utero gene transfer gives therapeutic transgene expression in the sheep, Hum Gene Ther. 2011 Apr;22(4):4l9-26. doi: 10. 1089/hum.2010.007. Epub 2011 Feb 2を参照；これは、本明細書において参考として援用される。

【0350】

別の態様において、組成物は、より後の日付において再投与される。任意に、１回より多くの再投与が許容される。かかる再投与は、同じ型のベクター、異なるウイルスベクターによるものであっても、または本明細書において記載されるような非ウイルス性送達を介するものであってもよい。

【0351】

本明細書において記載される処置のゴールとして、ＡＬＤまたはＡＭＮ疾患の進行を限定するかまたは停止させることが挙げられる。処置の望ましい結果として、限定することなく、ＵＢＤＲＳの評価スコアのいずれかの増加、ＡＢＣＤ１活性または発現のレベルの増大、対象におけるＶＬＣＦＡの量の減少またはＶＬＣＦＡの増大の安定化もしくは遅延、神経学的試験により決定される運動機能の増大（またはその障害の進行の軽減）、およびＭＲＩによる皮質容積の増大（またはまたはその障害の進行の軽減）が挙げられる。所望される結果として、筋力低下を軽減すること、筋力および筋緊張を増大させること、または呼吸器の健康を維持するかもしくはこれを増大させること、または振戦もしくは攣縮を軽減することが挙げられる。他の所望されるエンドポイントは、医師により決定され得る。

【0352】

さらに別の態様において、上記の方法のうちのいずれかを、別の、または第２の治療と組み合わせて行う。第２の治療は、任意の現在公知のもの、またはまだ知られていないもの、これらの変異または欠損を予防するか、停止させるか、または寛解させることを補助する治療、またはそれらに関連する効果のうちのいずれかであってよい。第２の治療は、上記の組成物の投与の前に投与されても、これと同時に投与されても、またはこれの後に投与されてもよい。一態様において、組み換えｒＡＡＶを作製する方法は、上記のようなＡＡＶ発現カセットを含むプラスミドを得ること、およびプラスミドを担持するパッケージング細胞を、十分なウイルスの配列の存在下において培養して、ＡＡＶウイルスゲノムの感染性ＡＡＶエンベロープまたはキャプシド中へのパッケージングを可能にすることを含む。ｒＡＡＶベクターの作製の具体的な方法は、上で記載され、発現カセットおよび本明細書において記載されるゲノム中のＡＢＣＤ１遺伝子を送達することができるｒＡＡＶベクターを作製することにおいて使用することができる。

【0353】

本発明のある態様において、対象は、ＡＬＤまたはＡＭＮ疾患を有し、本発明の構成成分、組成物および方法は、それを処置するように設計される。本明細書において用いられる場合、用語「対象」とは、本明細書において用いられる場合、ヒト、獣医学または農場の動物、飼育動物またはペット、および臨床研究のために通常用いられる動物を含む、哺乳動物を意味する。一態様において、これらの方法および組成物の対象は、ヒトである。なお他の好適な対象として、限定することなく、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類およびその他が挙げられる。本明細書において用いられる場合、用語「対象」は、「患者」と交換可能に用いられる。

【0354】

本明細書において用いられる場合、用語「処置」または「処置すること」とは、ＡＬＤまたはＡＭＮ疾患の１つ以上の症状の寛解を目的として、対象に、本明細書において記載される１つ以上の化合物または組成物を投与することを包含することを定義される。「処置」は、したがって、ＡＬＤまたはＡＭＮ疾患の発症または進行を軽減すること、疾患を予防すること、疾患の症状の重篤度を軽減すること、または神経機能障害の進行を含むそれらの進行を遅延させること、疾患の症状を取り除くこと、疾患の発症を遅延させること、または所与の対象において疾患の進行もしくは治療の効力をモニタリングすることのうちの１つ以上を含んでもよい。

【0355】

一側面において、機能的ヒトＡＢＣＤ１タンパク質をコードするＡＡＶベクターが提供される。「機能的ｈＡＢＣＤ１」により、疾患と関連しないネイティブなＡＢＣＤ１タンパク質、またはその天然のバリアントもしくは多型の生体活性レベルの、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはほぼ同じ、または１００％よりも多くを提供する、ＡＢＣＤ１タンパク質をコードする遺伝子が意味される。

【0356】

in vitroでのＡＢＣＤ１の発現および活性レベルを測定するための、多様なアッセイが存在する。本明細書において記載される方法はまた、ＡＬＤまたはＡＭＮ疾患またはその症状の処置のための任意の他の治療と組み合わせることができる。

【0357】

ある態様において、ＡＡＶ－ＡＢＣＤ１ウイルスベクターが提供される。多数の好適な精製方法を選択することができる。好適な精製方法の例は、例えば、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０およびその優先権文書である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願番号．６２／３２２，０７１、および２０１５年１２月１１日に出願された６２／２２６，３５７、表題「Scalable Purification Method for AAV9」において記載され、これは、本明細書において参考として援用される。

【0358】

ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量は、処方物中に含まれる用量の尺度として用いることができる。本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するために、当該分野において公知の任意の方法を用いることができる。ＡＡＶのＧＣ数タイトレーションを行うための１つの方法は、以下のとおりである：精製されたＡＡＶベクター試料を、初めにＤＮａｓｅで処置して、生成プロセスから混入している宿主ＤＮＡを除去する。ＤＮａｓｅ耐性粒子を、次いで熱処置に供して、キャプシドからゲノムを放出させる。放出されたゲノムを、次いで、ウイルスゲノムの特異的領域（例えばポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブのセットを用いて、リアルタイムＰＣＲにより定量する。ゲノムコピーを決定するための別の好適な方法は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、特に最適化ｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲである［Lock Martin, et al, Human Gene Therapy Methods. April 2014, 25(2): 115-125. doi: 10.1089/hgtb.2013.131；２０１３年１２月１３日に編集に先立ちオンラインで公開された］。あるいは、粒子定量またはフローサイトメトリーのためにViroCyt3100を用いることができる。別の方法において、ＡＢＣＤ１コード配列をコードする核酸配列を担持する組み換えアデノ随伴ウイルスの有効用量は、S.K. McLaughlin et al, 1988, J. Virol., 62: 1963において記載されるように測定され、これは、その全体において参考として援用される。

【0359】

複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者について、複製欠損ウイルスを、約１．０×１０９ＧＣ～約９×１０^１５ＧＣの範囲の量（体重７０ｋｇの平均的な対象を処置するために）（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１５ＧＣで含むように、投与量単位において処方することができる。一態様において、組成物は、少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９または９×１０^９ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０または９×１０^１０ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１または９×１０^１１ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２または９×１０^１２ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３または９×１０^１３ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４または９×１０^１４ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。別の態様において、組成物は、少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５または９×１０^１５ＧＣ／用量（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）を含むように処方される。ヒトでの適用のための一態様において、用量は、１×１０^１０～約１×１０^１５ＧＣ／用量の範囲（当該範囲内の全ての整数または分数の量を含む）であってよい。

【0360】

一態様において、ウイルスコンストラクトは、少なくとも約１×１０^９ＧＣ～約１×１０^１５ＧＣ、または約１×１０^１１ＧＣ～１×１０^１５ＧＣの用量において送達することができる。これらの用量および濃度の送達のための好適な容積は、当業者により決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容積を選択することができ、より高い容積が、成人のために選択される。典型的には、新生児については、好適な容積は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬであり、より大きな乳児については、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬを選択することができる。幼児については、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容積を選択することができる。小児については、約３０ｍＬまでの容積を選択することができる。１３歳未満（pre-teen）または１０代については、約５０ｍＬまでの容積を選択することができる。患者が髄腔内投与を受けてもよいなお他の態様において、約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容積が選択される。他の態様において、患者は、１０～１５０ｍＬ、５０ｍＬ～１５０ｍＬ、７５ｍＬ～１２５ｍＬ、または約１００ｍＬの髄腔内投与を受けてもよい。他の好適な容積および投与量を決定してもよい。投与量は、任意の副作用に対する治療上の利益のバランスをとるために調整され、かかる投与量は、組み換えベクターが使用される治療的適用に依存して変化し得る。

【0361】

上記の組み換えベクターは、公開される方法に従って宿主細胞に送達することができる。ある態様において、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、食塩水、界面活性剤および生理学的に適合可能な塩または塩の混合物を含む水溶液中に、好適に懸濁される。好適には、処方物は、生理学的に許容し得るｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲において調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるため、髄腔内送達のために、この範囲内のｐＨが所望される場合があるが、一方、静脈内送達のためには、６．８～約７．２のｐＨが所望される場合がある。しかし、より広い範囲およびこれらの部分範囲の内の他のｐＨが、他の送達の経路のために選択されてもよい。

【0362】

好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択することができる。一態様において、例えば、中性のｐＨを有し、８４００の平均分子量を有する、Pluronic（登録商標）F68 (BASF）、別名Poloxamer 188などの、１級ヒドロキシル基において末端を有する二官能性のブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、中心のポリオキシプロピレン(ポリプロピレンオキシド）の疎水性鎖およびこれを挟む２本のポリオキシエチレン(ポリエチレンオキシド）の親水性鎖からなる非イオン性の３ブロックコポリマー、SOLUTOL HS 15（マクロゴール－ｌ５ヒドロキシステアレート）、LABRASOL（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、TWEEN（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノールおよびポリエチレングリコールを選択してもよい。一態様において、処方物は、ポロキサマーを含む。これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）とその後に続く３つの数字により命名される：初めの２つの数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量を示し、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン内容物のパーセンテージを示す。一態様において、Poloxamer 188が選択される。

【0363】

界面活性剤は、懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％までの量において存在してもよい。

【0364】

一例において、処方物は、例えば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム－７Ｈ_２０）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム－２Ｈ_２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、およびこれらの混合物のうちの１つ以上を、水中に含む、緩衝化食塩水溶液を含んでもよい。好適には、髄腔内送達のために、浸透圧は、脳脊髄液に適合可能な範囲内である（例えば、約２７５～約２９０Ｏｓｍ／Ｌ）。任意に、髄腔内送達のために、懸濁剤として、または別の懸濁剤および他の任意の賦形剤と組み合わせて、市販の希釈剤を用いてもよい。例えば、Elliotts B（登録商標）溶液（Lukare Medical）を参照。他の態様において、処方物は、１つ以上の浸透増強剤を含んでもよい。好適な浸透増強剤の例として、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡが挙げられ得る。

【0365】

別の態様において、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む。好適な担体は、当業者により、導入（transfer）ウイルスが配向される適応症を考慮して、容易に選択され得る。例えば１つの好適な担体として、食塩水が挙げられ、これは、多様な緩衝化溶液により処方してもよい（例えば、リン酸緩衝化食塩水）。他の例示的な担体として、無菌の食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が挙げられる。バッファー／担体は、ｒＡＡＶが注入管に固着することを予防するが、vivoでのｒＡＡＶの結合活性を妨げない構成成分を含むべきである。

【0366】

任意に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、他の慣用的な薬学的な材料、例えば保存剤、または化学的安定化剤を含んでもよい。好適な例示的な保存剤として、クロロブタノール、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学的安定化剤として、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。

【0367】

本発明による組成物は、上で定義されるような薬学的に許容し得る担体を含んでもよい。好適には、本明細書において記載される組成物は、薬学的に好適な担体中に懸濁され、および／または注射、ポンプ、髄腔内カテーテルを介する対象への送達のために、または別のデバイスまたは経路による送達のために設計された、好適な賦形剤と混合された、１つ以上のＡＡＶの有効量を含む。一例において、組成物は、髄腔内送達のために処方される。一態様において、髄腔内送達は、脊柱管、例えば、くも膜下腔中への注射を包含する。一態様において、送達の経路は、脳室内注射（ＩＣＶ）である。別の態様において、送達の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）送達である。別の態様において、送達の経路は、大槽内投与である。

【0368】

本明細書において記載されるウイルスベクターは、機能的ＡＢＣＤ１を対象に供給するため、および／またはＡＬＤまたはＡＭＮ疾患を処置するために、ＡＢＣＤ１タンパク質を、それを必要とする対象（例えば、ヒト患者）に送達するための医薬を調製することにおいて、用いることができる。処置の経過は、任意に、同じウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９もしくはＡＡＶｒｈ．１０のベクター）または異なるウイルスベクター（例えば、異なるＡＡＶ２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０）の、繰り返しの投与を含んでもよい。ウイルスベクターおよび本明細書において記載される非ウイルス性送達系を用いる、なお他の組み合わせを選択してもよい。

【0369】

本明細書において記載されるＡＢＣＤ１ｃＤＮＡ配列は、当該分野において周知の技術を用いて、in vitroで、および合成により作製することができる。例えば、Xiong et al, PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences, Nature Protocols 1, 791 - 797 (2006)において記載されるように、長いＤＮＡ配列のＰＣＲベースの正確な合成（PCR-based accurate synthesis：ＰＡＳ）法を利用してもよい。二重非対称ＰＣＲ（dual asymmetrical PCR）法とオーバーラップ伸長ＰＣＲ（overlap extension PCR）法とを組み合わせる方法は、Young and Dong, Two-step total gene synthesis method, Nucleic Acids Res. 2004; 32(7): e59により記載される。また、Improved PCR-based gene synthesis method and its application to the Citrobacter freundii phytase gene codon modification. 2010 May;8l(2): 147-52. Epub 2010 Mar 10を参照；また、オリゴヌクレオチド合成および遺伝子合成についての以下の特許、Gene Seq. 2012 Apr;6(l): 10-21；ＵＳ８００８００５；およびＵＳ７９８５５６５を参照。これらの文書の各々は、本明細書において参考として援用される。加えて、ＰＣＲを介してＤＮＡを作製するためのキットおよびプロトコルは、商業的に利用可能である。これらは、限定することなく、Ｔａｑポリメラーゼ；OneTaq（登録商標）（New England Biolabs）；Q5（登録商標）高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）；およびGoTaq（登録商標）G2ポリメラーゼ（Promega）を含むポリメラーゼの使用を含む。ＤＮＡはまた、本明細書において記載されるｈＯＴＣ配列を含むプラスミドでトランスフェクトされた細胞から生成されてもよい。

【0370】

キットおよびプロトコルは、公知かつ商業的に利用可能であり、限定することなく、QIAGENプラスミドキット；Chargeswitch（登録商標）Pro Filterプラスミドキット（Invitrogen）；およぶGenElute（商標）プラスミドキット（Sigma Aldrich）を含む。本明細書において有用な他の技術として、熱サイクリングの必要性を除去する配列特異的等温増幅法が挙げられる。熱の代わりに、これらの方法は、典型的には、Bst ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（New England Biolabs）などの鎖置換（strand-displacing）ＤＮＡポリメラーゼを使用して、二本鎖ＤＮＡを分離する。ＤＮＡはまた、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼである逆転写酵素（ＲＴ）の使用を介する増幅を通して、ＲＮＡ分子から作製してもよい。ＲＴは、オリジナルのＲＮＡ鋳型に対して相補的な、ｃＤＮＡとして言及されるＤＮＡの鎖を重合する。このｃＤＮＡは、次いで、上で概略されるようにＰＣＲまたは等温法を通して、さらに増幅することができる。カスタムＤＮＡもまた、限定することなく、GenScript；GENEWIZ（登録商標）；GeneArt（登録商標）（Life Technologies）；およびIntegrated DNA Technologiesを含む企業から、商業的に作成することができる。

【0371】

用語「a」または「an」は、１つ以上を指すことに、留意すべきである。したがって、用語「a」(または「an」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書において交換可能に用いられる。

【0372】

語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、および「含むこと（comprising）」は、排他的であるよりもむしろ包括的に解釈されるべきである。語「からなる（consist）」、「からなること（consisting）」、およびそのバリアントは、包括的であるよりもむしろ排他的に解釈されるべきである。本明細書における多様な態様は、他の状況下において「含むこと（comprising）」の語法を用いて表される一方で、関連する態様はまた、「～からなること（consisting of）」または「～から本質的になること（consisting essentially of）」の語法を用いて解釈および記載されるべきであることを意図される

【0373】

本明細書において用いられる場合、「疾患」、「障害」および「状態」は、対象における異常な状態を示すために、交換可能に用いられる。

【0374】

本明細書において用いられる場合、別段に特定されない限り、用語「約（about）」または「約（～）」は、示される参照物からの１０％の変動性を意味する。

【0375】

用語「調節」またはそのバリエーションは、本明細書において用いられる場合、組成物が生体経路の１つ以上の構成成分を阻害する能力を指す。

【0376】

本明細書において別段に定義されない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は、当業者により、および本願において用いられる用語の多くについての一般的なガイドを当業者に供給する公開されたテキストへの参照により、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0377】

例
以下の例は、本発明を説明するために提供されるが、決して請求の範囲の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書において例において用いられるプラスミド配列は、図１０～１２において、および配列表において、配列番号により同定されるとおりである。

【0378】

材料および方法
以下の例は、別段に示されない限り、ＡＡＶ－ｈＡＢＣＤ１コンストラクトを用いて成される。これらのＡＡＶ－ｈＡＢＣＤ１コンストラクトは、例示的であることを意図され、本発明は、そのバリアントの構築および使用を包含する。

【0379】

例１：ＡＢＣＤ１ノックアウトマウスにおけるＡＡＶ９ベクターの髄腔内投与
この例において、脊髄およびＣＮＳにおけるＡＢＣＤ１発現レベルに対する様々なＡＡＶ９の効果、ならびに顕性の毒性を比較するために、短期のin vivo研究を行った。これらの実験の目的は、ＡＬＤまたはＡＭＮを処置するための好適な候補の同定であった。

【0380】

ＡＡＶ９キャプシドを含むＡＡＶベクターを、簡単に述べるとGong Y .et al., 2015 May; Mol Ther. 23(5):824-834およびGong Y. et al., 2019 May; Hum Gene Ther. 30(5):544-555において記載されるように、生成した。簡単に述べると、ヒト２９３Ｔ細胞を、初めに、ＡＢＣＤ１に対するｓｉＲＮＡのプールを用いて、DharmaFECT試薬を用いてトランスフェクトし、２４時間後に、細胞を目的のｒＡＡＶゲノムベクタープラスミド（ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ（オリジナル）、ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ Ｘ ｉｎａｃｔｉｖ．、またはＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１（ＷＰＲＥなし）のためのプラスミド）、Ｒｅｐ／ＣａｐプラスミドｐＡＡＶ２／９、およびＡｄヘルパープラスミドｐＦｄ６でトランスフェクトした。ｒＡＡＶベクターを、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を介して精製し、その後、脱塩および濃縮した。ｒＡＡＶ力価を、ｑＰＣＲにより決定した。ｓｉＲＮＡは、生成プロセスの間のＡＢＣＤ１の発現を低下させるために含められた。

【0381】

用いられたｐＡＡＶ２／９プラスミドは、以下を含む配列番号７００の全長コンストラクト配列を含んだ：ＡＡＶ２ ｐ５プロモーター（配列番号７１０）（これからＡＡＶ２ ＲＥＰ７８（配列番号７１１）およびＡＡＶ２ ＲＥＰ６８（配列番号７１２）が生成され得る）；ＡＡＶ２ ｐ１９プロモーター（配列番号７２０）（これからＡＡＶ２ ＲＥＰ５２（配列番号７２１）およびＡＡＶ２ ＲＥＰ４０（配列番号７２２）が生成され得る）；ならびにＡＡＶ２ ｐ４０プロモーター（配列番号７３０）（これからＡＡＶ９ ＶＰ１（配列番号７３１）、ＡＡＶ９ ＶＰ２（配列番号７３２）、およびＡＡＶ９ ＶＰ３（配列番号７３３））。

【0382】

これらの実験において、候補選択基準は、ＣＮＳにおいて、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むベクターと同等またはそれより強く、顕性の毒性の不在下において、ＶＬＣＦＡを減少させるベクターを同定すること、および、生体分布を最適化させる一方で、個々の細胞においてＷＴとほぼ同等のＡＢＣＤ１発現レベルを達成するコンストラクトを同定することを含んだ。

【0383】

その結果が図１において含まれるこの実験において、異なる群の、約３か月齢であった５個体のマウス（ＡＢＣＤ１ノックアウト（ＫＯ）マウスに、各々、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）ビヒクル中に含まれる１．２×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）の異なるＡＡＶベクター（図１０～１１を参照）、すなわち、「ＡＡＶ．ＡＢＣＤ１．ＷＰＲＥ」または「ＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ」（ＡＢＣＤ１およびＷＰＲＥのコード配列を含むＡＡＶベクター、図１０において表される）；「ＡＡＶ．ＡＢＣＤ１．ＷＰＲＥ－Ｘｉｎａｃｔ」または「ＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ－Ｘｉｎａｃｔ」（不活化されたＸタンパク質をコードする修飾されたＷＰＲＥを含むように修飾されたＡＡＶベクター、図１０および１１Ａにおいて表される）；ならびに「ＡＡＶ．ＡＢＣＤ１」または「ＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１」（オリジナルのＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ）をＷＰＲＥを取り除くように修飾したもの、図１０および１１Ｂにおいて表される）のボーラス注射を髄腔内投与するか、またはＰＢＳビヒクル担体のみを髄腔内投与した。投与の様式としてボーラス投与を選択したのは、それが、ポンプ注入よりも効率的であることが見出されたからである。また、５個体の野生型（ＷＴ）マウスの対照群を、処置しなかった。

【0384】

３週間後、異なる群のマウスを安楽死させ、脳、脊髄、後根神経節（ＤＲＧ）、心臓および肝臓を採取した（肝臓は、後の分析のために凍結した）。ＡＢＣＤ１発現レベル、ならびにベータアクチン発現レベル（正規化のため）を、採取された組織中でウェスタンブロット法により検出した。これらの結果は、図１において含まれる。それらから示され得るとおり、ＡＢＣＤ１発現は、全ての群において検出されたが、ＷＰＲＥを欠失しているＡＡＶ９ウイルスを投与された群において、より低かった（図１Ａ）。予測されたとおり、陰性対照のヌルマウスにおいて、ＡＢＣＤ１シグナルは検出されなかった。タンパク質発現の結果の定量は、オリジナルのＷＰＲＥ配列を含むベクター（「ＷＰＲＥ－オリジナル」）と修飾されたＸ－タンパク質配列を含むベクター（「Ｘ－不活化」）で処置されたマウスの間で、類似のレベルのＡＢＣＤ１タンパク質発現を示したが、一方で、ＷＰＲＥ配列を含まないベクター（「ＷＰＲＥなし」）からのタンパク質発現は、低下した。

【0385】

例２：様々なＡＡＶ９コンストラクトの髄腔内投与
第２のより長い期間のin vivo研究を行い、ここで、異なる群のＡＢＣＤ１ ＫＯマウス（各群ｎ＝５）に、図１０～１１において示される同じ例示的なＡＡＶ９コンストラクトを、異なる投与量、すなわち、１×１０^１１ｇｃ／マウスまたは３×１０^１１ｇｃ／マウスを髄腔内注射した。例１におけるもののように、ＡＡＶウイルスベクターを作製し、ウイルス力価を決定した。例１におけるもののように、約３か月齢であったＡＢＣＤ１ ＫＯマウスに、各々、ＡＡＶ９のボーラス、すなわち、１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）または３×１０^１１ＧＣの「ＡＡＶ９．ＡＢＣＤ１．ＷＰＲＥ」（ＡＢＣＤ１コード配列を含むオリジナルのＡＡＶ９ベクター、図１０において表される）；「ＡＡＶ９．ＡＢＣＤ１．ＷＰＲＥ－Ｘｉｎａｃｔ」（オリジナルのＡＡＶ９ベクターを不活化されたＸタンパク質をコードする修飾されたＷＰＲＥを含むように修飾したもの、図１０および１１Ａにおいて表される）；または「ＡＡＶ９．ＡＢＣＤ１」（オリジナルのＡＡＶ９ベクターをＷＰＲＥを取り除くように修飾したもの、図１０および１１Ｂにおいて表される）のボーラス注射を髄腔内投与するか、またはＰＢＳビヒクル担体のみを髄腔内投与した。先の実験におけるもののように、５個体の野生型（ＷＴ）マウスの対照群は、処置しなかった。

【0386】

これらのマウスを、注射の５週間後に安楽死させ、脊髄におけるＡＢＣＤ１レベルの検出のために、組織を再び回収した。これらの実験において、各々の群から２個体ずつのマウスにおいて、ウェスタンブロット技術を用いて、再びＡＢＣＤ１発現レベルを検出した。これらの結果は、図２において見出すことができる。

【0387】

図において、１×１０^１１ｇｃ／マウスおよび３×１０^１１ｇｃの用量を投与されたマウスについてのＡＢＣＤ１発現レベルは、別々のブロット上にある。図における２秒間および５秒間の暴露時間は、ＡＢＣＤ１のブロットを指す。ブロット上のベータアクチンレベルは、１０^１１ｇｃ／用量についての１０秒間の暴露および３×１０^１１ｇｃの投与量についての５秒間の暴露時間についてのものである。ＡＢＣＤ１発現は、ＡＢＣＤ１遺伝子を含むＡＡＶ９コンストラクトで処置された全ての群について検出されたが、ＷＰＲＥを欠失するＡＡＶ９コンストラクトを投与された群においては、より低かった。

【0388】

ＡＢＣＤ１発現の用量－応答もまた、評価した。図３において示されるとおり、１×１０^１１ｇｃ／マウスまたは３×１０１１ｇｃの用量の、ＷＰＲＥもしくはＸ－不活化されたＷＰＲＥを含むＡＡＶ９コンストラクトまたはＷＰＲＥを欠失するＡＡＶ９コンストラクトを投与されたマウスにおける、ＡＢＣＤ１ウェスタンブロットデータの用量－応答を比較した。ウェスタンブロットの結果は、ＡＢＣＤ１発現レベルが、３×１０１１ｇｃの用量のＷＰＲＥもしくはＸ－不活化されたＷＰＲＥを含むＡＡＶ９コンストラクトを投与されたマウスにおいて、１×１０１１ｇｃの用量のＷＰＲＥもしくはＸ－不活化されたＷＰＲＥを含むＡＡＶ９コンストラクトを投与されたものと比較して、より高いことを明らかにした。結果は、ＷＰＲＥを欠失するＡＡＶ９コンストラクトを投与されたマウスは、著しくより低下したＡＢＣＤ１発現レベルを有することを、さらに示した。

【0389】

例３：in vitroでのＶＬＣＦＡ低下効果に対するコンストラクトの差異の効果
例１および２において、ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ（Ｘｉｎａｃｔ）が、ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥにより誘導されるレベルと同等のＡＢＣＤ１タンパク質発現を誘導することが示されたことから、ＶＬＣＦＡ低下に対するＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ（Ｘｉｎａｃｔ）の効果を調べた。この実験において、ＡＢＣＤ１ ＫＯマウスから、混合型グリア培養物を生成した。ＡＡＶウイルスベクターＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ（オリジナル）およびＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ（Ｘｉｎａｃｔ）を、例１におけるもののように作製した。培養後第１２日において、混合グリア培養物からの細胞に、ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ベクターで、様々なＭＯＩ（１×１０^５、２．５×１０^５、５×１０^５および１×１０^６遺伝子コピー／細胞）において形質導入した。形質導入の４日後に、細胞を、ＶＬＣＦＡ分析のために採取した。ウェルのサブセットをまた、ウェスタンブロット分析のために用いて、細胞が首尾よく形質導入されていることを確認した。

【0390】

ＶＬＣＦＡ分析の結果を、図４Ａ（Ｃ２６：０レベル）および図４Ｂ（Ｃ２２：０に対するＣ２６：０の比）において示す。結果は、いずれのＡＡＶ９ベクターも、用量依存的な様式においてＶＬＣＦＡレベルを低下させること、およびＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ（Ｘｉｎａｃｔ）によるＶＬＣＦＡ低下は、ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１－ＷＰＲＥ（オリジナル）によるものと同等であることを示した。結果はまた、最も高い用量は、野生型ＶＬＣＦＡレベルと同等であることを示した。

【0391】

例４：ＡＡＶ－ｈＡＢＣＤ１ベクターの修飾
別の潜在的な候補ＡＡＶ－ｈＡＢＣＤ１コンストラクトを、ＷＰＲＥを用いることなくＡＢＣＤ１発現を増強する、および製造および臨床的使用のために所望される他の特性を改善する試みにおいて操作した。特に修飾されたＡＡＶ－ｈＡＢＣＤ１ベクターＳＢＴ１０１およびＯＢ１００５は、多数の修飾により、親ＡＡＶコンストラクトＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１［ＷＰＲＥなし］から誘導された。

【0392】

ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１［ＷＰＲＥなし］からＳＢＴ１０１を設計する上で、５’ＩＴＲの下流の配列を修飾した；ならびに、ｈＡＢＣＤ１ ５’ＵＴＲおよびｈＡＢＣＤ１ ３’ＵＴＲ配列を、それぞれｈＡＢＣＤ１ ｃＤＮＡ配列の上流および下流に付加した。

【0393】

ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１［ＷＰＲＥなし］からＯＢ１００５を設計する上で、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列を短縮化した；ＡＢＣＤ１コード配列を、非自己抗原を発現するその潜在能力を取り除くために、代替的オープンリーディングフレームを除去するように修飾した；ＡＢＣＤ１の翻訳を潜在的に改善するために、開始部位の上流にＫｏｚａｋ配列（ｃｃａｃｃ）を付加した；導入遺伝子カセットのサイズを減少させるために、第２のポリＡシグナル（ｂＧＨポリＡ）を除去した；ならびに、スケールアップの間のＩＴＲ安定性を改善するために、ＡＡＶ２ベクターを含む骨格を、ｐＵＣ５７からｐＵＣ１１８に変更した。

【0394】

ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１［ＷＰＲＥなし］からＯＢ１０１０を設計する上で、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列を短縮化した；ｈＡＢＣＤ１ ５’ＵＴＲおよびｈＡＢＣＤ１ ３’ＵＴＲ配列を、それぞれｈＡＢＣＤ１ ｃＤＮＡ配列の上流および下流に付加した；ならびに、スケールアップの間のＩＴＲ安定性を改善するために、ＡＡＶ２ベクターを含む骨格を、ｐＵＣ５７からｐＵＣ１１８に変更した。

【0395】

生じたＡＡＶベクターゲノムプラスミドｐＳＢＴ１０１、ｐＯＢ１００５およびｐＯＢ１０１０を、それぞれ、図５、図６および図７においてそれぞれ模式的に表す。これらのコンストラクトの模式図および配列の詳細もまた、図１２Ａ～Ｅにおいて提供される。

【0396】

例５：ＡＢＣＤ１発現の比較（ｐＳＴＢ１０１対ｐＯＢ１００５）
次いで、ＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクション実験において、ｐＳＢＴ１０１およびｐＯＢ１００５コンストラクトの性能を比較するために、実験を行った。これらの結果を、図８においてまとめる。ウェスタンブロットにより測定されたＡＢＣＤ１発現レベルを、図８Ａにおいて示す。図８Ｂにおいて、測定されたＡＢＣＤ１発現レベルを、棒グラフにおいて、バー２（ＷＰＲＥを含まないｐＳＢＴ１０１）およびバー３（ｐＯＢ１００５）において比較する。バー１は、トランスフェクトされていない対照である。全てのバーは、同じ数字のラベルを有するゲル上のレーンに対応する。相対的化学発光は、ＡＢＣＤ１値を表し、これは、やはりベータ－アクチンに対して正規化されている。

【0397】

これらの実験において、ＨＥＫ２９３細胞を、並行してプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションの３日後の発現を、細胞ライセート中でウェスタンブロッティングにより評価し、濃度測定を用いてウェスタンブロットを定量した。図における結果から示され得るとおり、修飾されたコンストラクトｐＯＢ１００５でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、ｐＳＢＴ１０１でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞よりも、明らかにより高いＡＢＣＤ１発現を示した。

【0398】

例６：接着細胞におけるパイロットスケールでのｐＳＢＴ１０１およびｐＯＢ１００５コンストラクトからのＡＡＶ中へのパッケージング能力の評価
ＨＥＫ２９３細胞において成された三重トランスフェクション実験において、ＷＰＲＥを欠失するｐＳＢＴ１０１の性能を、ｐＯＢ１００５と比較する、さらなる実験を行った。これらの実験において、ＨＥＫ２９３細胞を、ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド（ｐＡＡＶ２／９（配列番号７００））およびＡｄヘルパープラスミドと一緒に、ｐＳＢＴ１０１またはｐＯＢ１００５プラスミドで並行してトランスフェクトし、ｒＡＡＶベクターを、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を介して収集し、その後、脱塩および濃縮した。次いで、細胞ライセートおよび上清中で、ＤＮａｓｅ処置の後で、ｄｄＰＣＲおよび導入遺伝子カセットに対して特異的なプライマーを用いてベクターゲノムコピーの定量により、パッケージング能力を評価した。期待されたとおり、ｐＯＢ１００５は、これらの小規模な三重トランスフェクション試験において、明らかにより良好な生産性を示した（１プレップあたり５．６６×１０^９ベクターｇｃから、１プレップあたり１．４８×１０^１０ベクターｇｃへの、２．５倍を少し超える増加）。図９は、これらのパッケージング能力実験の結果を含む。ｐＳＢＴ１０１およびｐＯＢ１００５はいずれも、申し分ないパッケージング能力を示した。

【0399】

例７：短縮型ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するさらなるコンストラクトの構築
ＷＰＲＥを含まず、ＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１［ＷＰＲＥなし］において、ＷＰＲＥを含むオリジナルのコンストラクトと比較して低下したＡＢＣＤ１の発現および／または収量を回復させることができる候補コンストラクトをさらに探索する試みにおいて、ｐＯＢ１００５におけるもののような短縮型の５’ＩＴＲおよび短縮型の３’ＩＴＲのセットを含む多様なコンストラクトを設計した：ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１１、ｐＯＢ１０１２、ｐＯＢ１０１３、ｐＯＢ１０１５、およびｐＯＢ１０１７、これらの全てが、ｐＵＣ１１８骨格を利用する。ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１１、ｐＯＢ１０１２、ｐＯＢ１０１３、ｐＯＢ１０１５、およびｐＯＢ１０１７から作製されたＡＡＶベクターは、それぞれ、ＯＢ１０１０、ＯＢ１０１１、ＯＢ１０１２、ＯＢ１０１３、ＯＢ１０１５、およびＯＢ１０１７と命名され、代替的には、それぞれ、ｖ１、ｖ２、ｖ３、ｖ４、ｖ５、ｖ６、ｖ７およびｖ８として言及される。

【0400】

各々のコンストラクト中に含まれる（ＡＡＶ粒子中にパッケージングされるべき）ＡＡＶゲノムの模式図を、図１２Ａにおいて示す。ｐＯＢ１００５、ｐＯＢ１０１２およびｐＯＢ１０１３は、それぞれ、ＡＢＣＤ１の開始コドンの直前にＫｏｚａｋ配列を、およびＡＢＣＤ１をコードする配列中に、ｐＳＢＴ１０１において含まれる野生型ＡＢＣＤ１をコードする配列と比較して９個の変異を含む。ｐＯＢ１０１５およびｐＯＢ１０１７は、それぞれ、ＡＢＣＤ１をコードする配列中に、ｐＳＢＴ１０１において含まれる野生型ＡＢＣＤ１をコードする配列と比較して、３個の変異を含む。ｐＯＢ１０１１、ｐＯＢ１０１３およびｐＯＢ１０１５は、ＳＶ４０ポリＡシグナルを有さないが、なお一方で、ｂＧＨポリＡシグナルを含む。全長プラスミドに対して割り当てられた配列番号を、図１２Ｂにおいて示す。全ての全長プラスミド配列を、さらにセグメントへと分け、それらの全てを、図１２Ｂにおいて示すとおり命名し、配列番号を割り当てた。ＳＶ４０およびｂＧＨポリＡ配列の両方が存在する場合、ＳＶ４０ｐＡの開始からｂＧＨｐＡの終了までの配列を、「総ポリＡシグナル」と命名し、さらなる配列番号を割り当てた。個々のコンストラクトの模式図もまた、図１２Ｃ～１２Ｊにおける配列番号を参照して表す。図１２Ｂおよび１２Ｃ～１２Ｊにおいて参照される配列は、全て、配列表中に含まれる。

【0401】

例８：ＡＢＣＤ１タンパク質発現比較
ＡＡＶベクターは、例７において記載される新たなプラスミドコンストラクトを用いて生成した。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３細胞に、以下によりトランスフェクションした：（１）目的のｒＡＡＶゲノムベクタープラスミド（ｐＳＢＴ１０１、ｐＯＢ１００５、ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１１、ｐＯＢ１０１２、ｐＯＢ１０１３、ｐＯＢ１０１５またはｐＯＢ１０１７）、（２）ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質（ｐＡＡＶ２／９（配列番号７００））をコードするプラスミド、および（３）アデノウィルスヘルパープラスミド（ｐＡＬＤ－Ｘ８０）。ｒＡＡＶベクターを、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を介して収集し、その後、脱塩および濃縮した。ｒＡＡＶ力価を、ｄｄＰＣＲにより決定した。

【0402】

ＡＢＣＤ１タンパク質発現に対する異なるプラスミドコンストラクトの効果を評価した。簡単に述べると、ＡＢＣＤ１ノックアウトＬｅｃ２細胞を、異なるＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ベクター（ＡＡＶベクターＳＢＴ１０１、ＯＢ１００５、ＯＢ１０１０、ＯＢ１０１１、ＯＢ１０１２、ＯＢ１０１３、ＯＢ１０１５、およびＯＢ１０１７）または対照ベクター（ｐＯＢ１００８プラスミドを用いて作製されたＡＡＶ９－ＣＢＡ－ｅｍｐｔｙベクター「ＯＢ１００８」）を、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６および５×１０^６の遺伝子コピー／細胞のＭＯＩにおいて用いて、形質導入した。形質導入の３日後に、ＡＢＣＤ１タンパク質発現レベルは、インセル（in-cell）ウェスタンブロット（ＩＣＷＢ）により測定した。ＡＢＣＤ１タンパク質レベルを、ＭＯＩに対してプロットし、用量－発現曲線を、図１３Ａ～１３Ｄにおいて記載されるようにフィットさせた。各々のＡＡＶベクターについての概算された相対的な潜在能力（図１３Ａ～１３ＣにおいてはｐＯＢ１００８に対して相対的、および図１３ＤにおいてはｐＳＢＴ１０１に対して相対的）、標準誤差、９５％信頼区間、およびＥＣ５０値を計算した。。図１３Ｅは、例示的なウェスタンブロットウェルおよび相対的強度のデータを示す。

【0403】

図１３Ａ～１３Ｄにおいて示されるとおり、例７において記載される新たなコンストラクトの全て（ｖ１～ｖ８）は、首尾よく、対照コンストラクト（ｐＯＢ１００８）から生じるレベルよりも高いＡＢＣＤ１タンパク質発現をもたらす。さらに、ＯＢ１０１０、ＯＢ１０１５、およびＯＢ１０１７は、ｐＳＢＴ１０１（図１３Ａおよび１３Ｄ）と比較して、著しくより高いＡＢＣＤ１発現をもたらし、このことは、ｐＯＢ１０１０、ｐＯＢ１０１５、およびｐＯＢ１０１７が、ｐＳＢＴ１０１において低下したＡＢＣＤ１発現を回復させるというゴールを、ＷＰＲＥを用いることなく達成したことを意味する。このことは、ＷＰＲＥの代わりに別のエンハンサーを導入することなく発現が回復したことを考えると、特に驚異的かつ予想外である。

【0404】

例９：ＶＬＣＦＡ低下の比較
高いＡＢＣＤ１発現をもたらすＡＡＶベクター（ＯＢ１０１０、ＯＢ１０１５、およびＯＢ１０１７）が、ＶＬＣＦＡの低下を引き起こすか否かを試験するために、ＡＢＣＤ１ ＫＯ Ｌｅｃ２細胞を、例８において記載されるように生成されたＡＡＶベクターＯＢ１０１０、ＯＢ１０１５、およびＯＢ１０１７で、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６および５×１０^６遺伝子コピー／細胞のＭＯＩにおいて、形質導入し、ＶＬＣＦＡレベルを定量した。図１４において示されるとおり、ＯＢ１０１０、ＯＢ１０１５、およびＯＢ１０１７の全てが、低下したＣ２６：０／Ｃ２２：０比により示されるとおり、ＶＬＣＦＡを首尾よく低下させた。興味深いことに、ＶＬＣＦＡ低下の傾向は、ＡＢＣＤ１発現の傾向と一致し（図１３Ｄを参照）、すなわち、より高いＡＢＣＤ１発現は、より顕著なＶＬＣＦＡ低下をもたらした。

【0405】

例１０：ＶＬＣＦＡ低下における用量依存性
ＶＬＣＦＡ低下効果とＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１（ＯＢシリーズ）の用量またはＡＢＣＤ１発現レベルとの間の関係をより緊密に理解するために、一例としてｒＡＡＶベクターＯＢ１０１０を用いた。異なるベンダー（「ＳＴＣ」および「ＶＢＬ」）により生成された２つの異なるセットのＯＢ１０１０ベクターを、並行して試験した。２つのベンダーによるｒＡＡＶベクターは、本質的に、例８において記載されるように生成されたが、ＶＢＬがｒＡＡＶの精製のために超遠心を用いた一方で、ＳＴＣは、ＡＡＶ９アフィニティーに基づく精製を用いた。簡単に述べると、ＷＴまたはＡＢＣＤ１ ＫＯのマウスから混合グリア培養物を生成した。培養後第１２日において、ＡＢＣＤ１ ＫＯ混合グリア培養物からの細胞を、３つの異なる用量（低い、中程度および高い）のＯＢ１０１０ベクターで形質導入した。低い、中程度および高い用量とは、それぞれ、３．３×１０^４、１．０×１０^５および５×１０^５のウイルスゲノム／細胞であった。ＷＴの混合グリア細胞は、処置しなかった。形質導入の５日後に、ＶＬＣＦＡ分析およびウェスタンブロットによるＡＢＣＤ１タンパク質定量のために、細胞を収集した。

【0406】

図１５Ａにおいて示されるとおり、ベンダーにかかわらず、ＯＢ１０１０は、ベクター用量に依存的な様式において、Ｃ２６：０／Ｃ２２：０比およびＣ２６：０の量の両方を低下させた。図１５Ｂにおいて示されるとおり、Ｃ２６：０／Ｃ２２：０比またはＣ２４：０／Ｃ２２：０比を、ＡＢＣＤ１タンパク質発現レベルに対してプロットした場合、Ｃ２６：０／Ｃ２２：０比の低下およびＣ２４：０／Ｃ２２：０比の低下はいずれも、ＡＢＣＤ１タンパク質レベルの増大と相関した。

【0407】

同じ実験を、異なるベンダーにより生成されたｐＯＢ１０１０１１などのいくつかの他のＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ベクターを用いて行い、類似の用量依存的および／またはタンパク質レベル依存的ＶＬＣＦＡ低下を観察した。異なるベンダーからの全ての試験されたＡＡＶ－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ベクターからのデータを比較した、ＡＢＣＤ１発現と多様なＶＬＣＦＡパラメーターとの間の関係（絶対量および比）を、図１５Ｃにおいてまとめる。図１５Ｃにおける上の４つのグラフにおいて示されるとおり、増大したＡＢＣＤ１レベルは、より低いＶＬＣＦＡ（Ｃ２６：０およびＣ２４：０）およびより高い短鎖脂肪酸（Ｃ１６：０）と関連したが、一方で、Ｃ２２：０は、ＡＢＣＤ１発現によっては影響を受けないように見えた。図１５Ｃにおける下の２つのグラフにおいて示されるとおり、脂肪酸の比をＡＢＣＤ１タンパク質発現に対してプロットした場合、増大したＡＢＣＤ１レベルは、より低いＣ２６：０／Ｃ２２：０およびＣ２４：０／Ｃ２２：０比と関連した。

【0408】

例１１：ＳＢＴ１０１により誘発されるin vivoでの効果
ＡＡＶ９－ＣＢＡ－ＡＢＣＤ１ベクターが、in vivoでＡＢＣＤ１発現を回復させてＶＬＣＦＡを低下させることができるか否かを試験するために、ＡＢＣＤ１ ＫＯマウスに、多様な量の例８において記載されるように生成されたｒＡＡＶ ＳＢＴ１０１を髄腔内投与した。低い、中程度、高い投与用量は、ｄｄＰＣＲにより決定されるとおり、それぞれ、６．１×１０^８ベクターゲノムコピー（ｖｇ）、１．８×１０^９ｖｇ、および６．１×１０^９ｖｇであった。未処置のＷＴ対照もまた含まれた。投与の８週間後に、脊髄を回収した。ベクターおよび二倍体ゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を、ｄｄＰＣＲにより定量し、ＡＢＣＤ１タンパク質レベルは、JESS（Protein Simple（商標））を用いて、キャピラリー電気泳動（immuno-CE）とカップリングしたイムノアッセイにより定量した。

【0409】

結果を、図１６においてまとめる。左および中央のグラフにおいて示されるとおり、用量依存的なベクターゲノムレベルおよび用量依存的なＡＢＣＤ１タンパク質発現が確認された。ｍｔＤＮＡに関しては、ｍｔＤＮＡは、ミトコンドリアの数の代理であり、右のグラフにおいて示されるとおり、ｍｔＤＮＡは、ＡＢＣＤ１ノックアウトマウスにおいて、野生型マウスと比較して低下する。理論により拘束されることは望まないが、ＡＢＣＤ１ ＫＯにおいて低下したｍｔＤＮＡは、ペルオキシソームにおいて低下したＶＬＣＦＡのベータ酸化と関連付けられることが示唆され、したがって、ｍｔＤＮＡレベルの増大または回復は、ＶＬＣＦＡのベータ酸化の増大または回復の代替マーカーである。右のグラフにおいて示されるとおり、ｍｔＤＮＡレベルは、ベクターの用量に依存的な様式において回復し、特に、最も高い用量は、未処置と比較して顕著なｍｔＤＮＡの増大を提供し、ＡＢＣＤ１遺伝子ノックアウトにより失われたｍｔＤＮＡのほぼ半分を補充した。したがって、ＷＰＲＥを伴わずにＡＢＣＤ１をコードするＡＡＶベクターは、in vivoで、グリア細胞において、ベータ酸化のためのＶＬＣＦＡのペルオキシソーム中への輸送を回復するために十分に、ＡＢＣＤ１を首尾よく発現したことが結論付けられる。

【0410】

例１２：ｒＡＡＶベクターパッケージング能力比較
ｐＯＢ１０１０が効率的なｒＡＡＶベクターパッケージングを提供するか否かを試験するために、ｐＯＢ１０１０、ｐＳＢＴ１０１、およびｐＯＢ１００８プラスミドを比較した。

【0411】

ＨＥＫ２９３細胞に、以下によりトランスフェクションした：（１）目的のｒＡＡＶゲノムベクタープラスミド（ｐＳＢＴ１０１、ｐＯＢ１０１０、またはｐＯＢ１００８）、（２）ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド（ｐＡＡＶ２／９（配列番号７００）、および（３）アデノウィルスヘルパープラスミド（ｐＡＬＤ－Ｘ８０）。ｒＡＡＶベクターを、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を介して収集し、その後、脱塩および濃縮した。各々のＡＡＶベクターについて、同じ量（コピー数）のゲノムベクタープラスミドを用い、各々のＡＡＶベクターについて、同じ量（コピー数）のＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドおよびアデノウィルスヘルパープラスミドを用いた。得られたウイルスの力価を、ｈＡＢＣＤ１遺伝子に対する（またはｐＯＢ１００８の場合においてはＳＶ４０ポリＡに対する）ｄｄＰＣＲにより、およびＣＭＶエンハンサー遺伝子に対するｑＰＣＲにより比較した。これらの結果を、図１７においてまとめる。

【0412】

先行する手順において、多様な方法および材料が記載されてきた。しかし、以下の請求の範囲において記載されるような例示的な手順のより広い範囲から逸脱することなく、それらに対する多様な修飾および変更を行ってもよいこと、およびさらなる手順を実行してもよいことは、明らかであろう。

【0413】

均等物および範囲
請求の範囲において、「a」、「an」および「the」などの冠詞は、逆であることが示されるか、または文脈から別段に明らかでない限り、１つまたは１つより多くを意味し得る。グループの１つ以上のメンバーの間に「or」を含む請求項または記載は、逆であることが示されるか、または文脈から別段に明らかでない限り、グループのメンバーの１つ、１つより多く、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、または別段に関係する場合に、満たされるとみなされる。本発明は、グループの正確に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、または別段に関係する態様を含む。本発明は、グループのメンバーの１つより多く、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、または別段に関係する態様を含む。

【0414】

さらに、本発明は、列記される請求項のうちの１つ以上からの１つ以上の限定、要素、節および説明的用語が、別の請求項中に導入される、全てのバリエーション、組み合わせおよび順列を包含する。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基礎請求項に従属する任意の他の請求項において見出される１つ以上の限定を含むように修飾することができる。要素がリストとして、例えばマーカッシュ群形式において提示される場合、要素の各々のサブグループもまた開示され、任意の要素をグループから取り除くことができる。一般に、発明、または発明の側面が、特定の要素および／または特徴を含むものとして言及される場合、発明または発明の側面のある態様は、かかる要素および／または特徴からなるか、またはこれから本質的になることが、理解されるべきである。単純化を目的として、これらの態様は、本明細書において文言としては特には記載されていない。

【0415】

また、用語「含むこと（comprising）」および「含むこと（containing）」は、オープンエンドであることが意図され、さらなる要素またはステップの包含を許容することに留意する。範囲が示される場合、端点が含まれる。さらに、別段に示されるかまたは文脈および当業者の理解から別段に明らかでない限り、範囲として表される値は、発明の異なる態様における記述される範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈が明らかに別段に指示しない限り、当該範囲の下限の１０分の１まで、想定することができる。

【0416】

本願は、多様な発行された特許、公開された特許出願、学術文献の記事、および他の刊行物を指し、これらの全ては、本明細書において参考として援用される。援用される参考文献のうちのいずれかと本明細書との間に矛盾が存在する場合、本明細書が支配すべきである。加えて、本発明の任意の特定の態様であって、先行技術に該当するものは、請求項のうちの任意の１つ以上から、明示的に除外することができる。かかる態様は、当業者に公知であるものとみなされるので、それらは、除外が本明細書において明示的に記載されない場合であっても、除外することができる。本発明の任意の特定の態様は、先行技術の存在に関係するか否かにかかわらず、任意の請求項から、任意の理由のために、除外することができる。

【0417】

当業者は、本明細書において記載される特定の態様に対する多くの均等物を理解するか、慣用的な実験のみを用いて確認することができるであろう。本明細書において記載される本態様の範囲は、上の説明に限定されることを意図されず、むしろ、添付の請求の範囲において記載される。当業者は、以下の請求の範囲において定義されるような本発明の精神または範囲から逸脱することなく、この記載に対する多様な変更および修飾が行われてもよいことを、理解するであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図12F】

【図12G】

【図12H】

【図12I】

【図12J】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16】

【図17】

【配列表】

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【国際調査報告】