特表 2023-509493 ＰＴＥＮコピー数を判定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-08

(54)【発明の名称】ＰＴＥＮコピー数を判定する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6851 20180101AFI20230301BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230301BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6851 Z

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022541666

(86)(22)【出願日】2021-01-06

(85)【翻訳文提出日】2022-07-05

(86)【国際出願番号】 EP2021050136

(87)【国際公開番号】W WO2021140125

(87)【国際公開日】2021-07-15

(31)【優先権主張番号】62/957,913

(32)【優先日】2020-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】391008951

【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】ドハーティ，ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】ラブルス，ポール

(72)【発明者】

【氏名】ステントン，ダニエル

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ02

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ20

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS32

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

ＰＴＥＮコピー数を判定する方法が記載される。当該方法は、３つ以上のＰＴＥＮ遺伝子座及び２つ以上の参照遺伝子を、デジタルＰＣＲによって同時に増幅することを含み得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象由来のサンプルにおいてＰＴＥＮコピー数を判定する方法であって：
３つ以上のＰＴＥＮ遺伝子座及び２つ以上の参照遺伝子を、デジタルＰＣＲによって同時に増幅することと；
ＰＴＥＮ増幅の、参照遺伝子増幅に対する比率を算出することと；
前記サンプルについてのＰＴＥＮコピー数を、前記比率に基づいて判定することと
を含む方法。

【請求項2】

ＰＴＥＮ増幅の前記比率は：
増幅されたＰＴＥＮ遺伝子座の数で割った、全てのＰＴＥＮコピーの濃度対：
増幅された参照遺伝子の数で割った、全ての参照遺伝子コピーの濃度
の比率である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＰＴＥＮ増幅の前記比率は：
個々のＰＴＥＮ遺伝子座のコピーの濃度対：
個々の参照遺伝子のコピーの濃度
の比率である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

個々のＰＴＥＮ遺伝子座のコピーの濃度対：
個々の参照遺伝子のコピーの濃度
の比率を判定することをさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ＰＴＥＮコピー数は、前記比率の二倍である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記３つ以上のＰＴＥＮ遺伝子座は、イントロン２、イントロン３、及びイントロン６の少なくとも２つを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記３つ以上のＰＴＥＮ遺伝子座は、イントロン２、イントロン３、及びイントロン６を、そして場合によっては１つ以上の追加的なＰＴＥＮ遺伝子座を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

第１の参照遺伝子のコピーの濃度対：
第２の参照遺伝子のコピーの濃度
の比率を判定することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記サンプルの一部を、非腫瘍起源の対応するサンプルで希釈することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記サンプルは、フレッシュな凍結腫瘍組織を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記サンプルは、セルフリーＤＮＡを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍又は疑われる腫瘍組織を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記参照遺伝子は、Ｂ３ＧＮＴ２、ＥＲＣＣ３、ＯＲ５Ｔ１、ＲＵＦＹ２、及びＣＣ２Ｄ１Ｂの少なくとも１つを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２０２０年１月７日出願の米国仮特許出願第６２／９５７，９１３号明細書の優先権を主張し、この出願の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ）は、乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、脳癌、皮膚癌、甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、及び結腸癌、並びに黒色腫、神経膠芽腫、及びリンパ腫が挙げられる多種多様なヒト癌において変異しているか、又は欠失している瘍抑制因子である。実際に、ＰＴＥＮは、癌において最も一般的に変異している癌抑制遺伝子の１つである。ＰＴＥＮは、タンパク質及び脂質を修飾するホスファターゼである。ほとんどのホスファターゼとは異なり、ＰＴＥＮの主要な基質は、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化によって生成されるイノシトールリン脂質である。ＰＩ３Ｋによって生成されるイノシトールリン脂質は、Ａｋｔ、ｍＴＯＲに、そして最終的に、細胞生存及びタンパク質翻訳の下流活性化に至る。したがって、ＰＴＥＮは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の重要なネガティブ調節因子であり、腫瘍抑制において重要な役割を果たす。腫瘍発生の間に、ＰＴＥＮの変異及び欠失が生じ、酵素活性を不活化して、細胞増殖の増大及び細胞死の引下げに至る。癌におけるＰＴＥＮ変異の保有率は、ＰＴＥＮへの遺伝的変化の例を同定する重要性を明白に示している。

【0003】

ＰＴＥＮコピー数の低下は、ＰＴＥＮ発現及び／又は酵素活性の損失を反映し得る。ＰＴＥＮコピー数を判定するほとんどの方法が、一度に１つのみの遺伝子座を考慮するので、調査した遺伝子座以外の遺伝子座での欠失を正確に反映し得ない。したがって、ＰＴＥＮコピー数を判定する方法の向上が所望される。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

一態様において、対象由来のサンプルにおいてＰＴＥＮコピー数を判定する方法が：３つ以上のＰＴＥＮ遺伝子座及び２つ以上の参照遺伝子を、デジタルＰＣＲによって同時に増幅することと；ＰＴＥＮ増幅の、参照遺伝子増幅に対する比率を算出することと；サンプルについてのＰＴＥＮコピー数を、比率に基づいて判定することとを含む。

【0005】

ＰＴＥＮ増幅の比率は、以下の比率であり得る：増幅されたＰＴＥＮ遺伝子座の数で割った、全てのＰＴＥＮコピーの濃度対：増幅された参照遺伝子の数で割った、全ての参照遺伝子コピーの濃度。

【0006】

ＰＴＥＮ増幅の比率は、以下の比率であり得る：個々のＰＴＥＮ遺伝子座のコピーの濃度対：個々の参照遺伝子のコピーの濃度。一部の実施形態において、方法はさらに、以下の比率を判定することを含む：個々のＰＴＥＮ遺伝子座のコピーの濃度対：個々の参照遺伝子のコピーの濃度。

【0007】

ＰＴＥＮコピー数は、比率の二倍であり得る。

【0008】

３つ以上のＰＴＥＮ遺伝子座は、イントロン２、イントロン３、及びイントロン６の少なくとも２つを含み得る。３つ以上のＰＴＥＮ遺伝子座は、イントロン２、イントロン３、及びイントロン６を、そして場合によっては１つ以上の追加的なＰＴＥＮ遺伝子座を含み得る。

【0009】

一部の実施形態において、方法は、以下の比率を判定することをさらに含み得る：第１の参照遺伝子のコピーの濃度対：第２の参照遺伝子のコピーの濃度。

【0010】

一部の実施形態において、方法は、サンプルの一部を、非腫瘍起源の対応するサンプルで希釈することをさらに含み得る。

【0011】

サンプルとして、フレッシュな凍結腫瘍組織が挙げられ得る。サンプルとして、セルフリーＤＮＡが挙げられ得る。サンプルとして、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍又は疑われる腫瘍組織が挙げられ得る。

【0012】

参照遺伝子として、Ｂ３ＧＮＴ２、ＥＲＣＣ３、ＯＲ５Ｔ１、ＲＵＦＹ２、及びＣＣ２Ｄ１Ｂの少なくとも１つが挙げられ得る。

【0013】

他の特徴、目的、及び利点が、説明及び図面から、そして特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1A】１ｎｇの入力でのクラスター形成の例である。グラフの底部の各円は、固有の参照遺伝子座を含有する小滴を表しており、このアッセイにおいて、２つの標的参照遺伝子座がある。グラフの左側の３つの円の各々が、ＰＴＥＮ遺伝子座を含有する小滴を表す。円の外側の小滴が、複数の遺伝子座由来の標的を含有する。

【図1B】より高い入力（おおよそ５ｎｇ）でのクラスター形成の例である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本明細書中に記載されるのは、サンプル中の複数の、例えば２つ以上のＰＴＥＮ遺伝子座を同時に測定することによって、ＰＴＥＮコピー数を判定する方法である。複数のＰＴＥＮ遺伝子座を同時に測定することによって、本方法は、普通であれば気付かれ得ないＰＴＥＮ欠失の例を正確に同定して、ＰＴＥＮ欠失の範囲をより正確に定量化することができる。また、本方法は、フレッシュな凍結組織サンプル、セルフリーＤＮＡサンプル、及びホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルが挙げられる種々のサンプル源に適用可能である。

【0016】

血漿に由来する患者サンプルは、循環フリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）収量が非常に低い。多くの場合、ＤＮＡサンプル全体が、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリ反応に加えられなければならない。また、腫瘍に由来するＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、多くの場合、血漿サンプル内に通常見出されるｃｆＤＮＡと比較して、より小さな画分中に存在する。これらの交絡因子に起因して、血漿中の遺伝子欠失の検出は、非常に困難となる。ＮＧＳによって検出されるコピー数結果の精度を確実にするようなｄｄＰＣＲ等の技術による直交確認（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）があることが有益である。

【0017】

実施形態において、デジタルＰＣＲ（例えばｄｄＰＣＲ）が、単一の実験において複数のＰＴＥＮ遺伝子座を同時に増幅するのに用いられる。続いて、増幅された材料が定量化される。定量化はコピー数を示す。特に、増幅及び定量化は、遺伝子座単位で生じるので、コピー数は、各遺伝子座にて独立して測定される。ゆえに、１つのみの遺伝子座に影響を与える変化を、複数の遺伝子座に影響を与える変化から区別することができる。

【0018】

一部の実施形態において、ｄｄＰＣＲが、ＰＴＥＮ遺伝子座を増幅して定量化するのに用いられる。ｄｄＰＣＲは、複数の遺伝子座の同時増幅と共に、各遺伝子座の独立した検出を可能にする。さらに、同じサンプル由来の１つ以上の参照遺伝子もまた同時に増幅されて、ＰＴＥＮ遺伝子座と共に定量化される。知られており、且つ安定したコピー数を有する参照遺伝子が選択されて、ＰＴＥＮコピー数の変化についての比較が実現する。また、測定された参照遺伝子の相違は、ゲノム不安定性が高いサンプルを示し得る。

【0019】

一部の実施形態において、増幅された材料の定量化は、単位容量あたりの標的ＤＮＡのコピーの濃度として表される。続いて、ＰＴＥＮ遺伝子座のコピー及び参照遺伝子のコピーの測定濃度が比較されて、サンプル中のＰＴＥＮコピー数（ＣＮ）に達し得る。

【0020】

一部の実施形態において、全ＰＴＥＮ遺伝子座の総濃度が、参照遺伝子の総濃度と比較されて、ＰＴＥＮコピー数が判定される。例えば、３つのＰＴＥＮ遺伝子座及び２つの参照遺伝子が用いられる場合、
ＰＴＥＮ ＣＮ＝（（ＰＴＥＮ濃度（コピー／μＬ）／３）／（参照遺伝子濃度（コピー／μＬ）／２））＊２

【0021】

一部の実施形態において、各ＰＴＥＮ遺伝子座の濃度は、参照遺伝子の濃度と比較されて、ＰＴＥＮコピー数が判定される。一部の実施形態において、各ＰＴＥＮ遺伝子座の濃度は、参照遺伝子の各々の濃度と比較されて、ＰＴＥＮコピー数が判定される。この技術は、各遺伝子座でのコピー数の独立した測定を実現する。例えば、３つのＰＴＥＮ遺伝子座及び２つの参照遺伝子が用いられる場合、
ＰＴＥＮ（遺伝子座１）ＣＮ＝（（ＰＴＥＮ遺伝子座１濃度（コピー／μＬ））／（参照遺伝子１濃度（コピー／μＬ））＊２
ＰＴＥＮ（遺伝子座１）ＣＮ＝（（ＰＴＥＮ遺伝子座１濃度（コピー／μＬ））／（参照遺伝子２濃度（コピー／μＬ））＊２
ＰＴＥＮ（遺伝子座２）ＣＮ＝（（ＰＴＥＮ遺伝子座２濃度（コピー／μＬ））／（参照遺伝子１濃度（コピー／μＬ））＊２
ＰＴＥＮ（遺伝子座２）ＣＮ＝（（ＰＴＥＮ遺伝子座２濃度（コピー／μＬ））／（参照遺伝子２濃度（コピー／μＬ））＊２
ＰＴＥＮ（遺伝子座３）ＣＮ＝（（ＰＴＥＮ遺伝子座３濃度（コピー／μＬ））／（参照遺伝子１濃度（コピー／μＬ））＊２
ＰＴＥＮ（遺伝子座３）ＣＮ＝（（ＰＴＥＮ遺伝子座３濃度（コピー／μＬ））／（参照遺伝子２濃度（コピー／μＬ））＊２である。

【0022】

第１の参照遺伝子のコピーの濃度は、内部対照としての１つ以上の追加的な参照遺伝子のコピーの濃度と比較され得る（例えば、
（（参照遺伝子１濃度（コピー／μＬ））／（参照遺伝子２濃度（コピー／μＬ））＊２）。

【0023】

参照遺伝子において３０％以上の変異があるサンプルは、ゲノム不安定性を示し得る。そのような場合には、実験を、様々な参照遺伝子を用いて繰り返すことができる。

【0024】

一部の実施形態において、ＰＴＥＮ遺伝子座は、イントロン２、イントロン３、及びイントロン６を含み得る。ＰＴＥＮ遺伝子座は、イントロン２、イントロン３、及びイントロン６の２つ以上であり得る。参照遺伝子は、Ｂ３ＧＮＴ２、ＥＲＣＣ３、ＯＲ５Ｔ１、ＲＵＦＹ２、及びＣＣ２Ｄ１Ｂを含み得る。

【0025】

一部の実施形態において、サンプルは、腫瘍起源又は疑われる腫瘍起源のものである。腫瘍起源又は疑われる腫瘍起源のサンプルは、場合によっては、非腫瘍起源のマッチするサンプルと比較され得る。

【0026】

サンプルがＦＦＰＥ組織である一部の実施形態において、ＦＦＰＥ損傷の様々なレベル（軽度、中程度、重度）を反映する対照を用いて、試験されるサンプルが比較され得る。

【実施例】

【0027】

以下の例は実例であり、限定であることは意図されない。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に含まれる。

【0028】

方法
参照プローブ選択
癌患者に由来するサンプルにおけるゲノム不安定性についての潜在性により、分析を実行して、いくつかの安定した遺伝子を、様々な癌徴候の全体にわたって同定して、標準参照として利用した。ゲノム安定性を、ＮＧＳ試験に由来するコピー数推定値の二倍体（２つのコピーを示す）パーセントとして説明した。遺伝子を、二倍体スコアパーセントによってランク付けして、参照遺伝子に用いるための最良の候補を提供した。表１に示すように、いくつかの遺伝子を試験して、適した候補であることを見出した。

【0029】

【表1】

【0030】

ＰＴＥＮプローブ選択
ＰＴＥＮ遺伝子座の選択は、ｃＢｉｏデータベースで入手可能なコピー数データを分析することによって判定した。手短に言うと、ＰＴＥＮ損失を確認した患者由来のデータを、プローブ選択のために分析した。ＰＴＥＮ損失の保有率が高い領域を選択した。１つの領域が、全患者データの全体にわたって欠失することは見出されなかったので、３つの異なる遺伝子座の組合せを選択して、アッセイの臨床感度を最大にした。標的ＰＴＥＮ遺伝子座の染色体座標を、データセット由来のセグメントファイルの染色体座標と比較することによって、設計は、データセット内の報告されるサンプルの９９．３％（７３１／７３６）において、損失を潜在的に検出することを見出した。

【0031】

サンプル調製
試験サンプルを０．２ｎｇ／μＬに希釈して、反応への合計１ｎｇの入力とする。ポアソン統計を用いて、１ｎｇの入力により、大部分の小滴が１つの標的を含有する分布が与えられるはずである。各小滴が１つの標的のみを含有するように入力濃度を操作することで、クラスター分離を理論的に増強し、これにより分析はより有効となろう（図１Ａ及び図１Ｂ参照）。

【0032】

図１Ａは、１ｎｇ入力でのクラスター形成の例を示しており、二重格納小滴の数が最小である点が注目される。青色の各円は、固有のＰＴＥＮ遺伝子座を含有する小滴を表しており、このアッセイにおいて、３つの標的ＰＴＥＮ遺伝子座がある。緑色の各円は、固有の参照遺伝子座を含有する小滴を表しており、このアッセイにおいて、２つの標的参照遺伝子座がある。円の外側の小滴が、複数の遺伝子座由来の標的を含有する。図１Ｂは、より高い入力（おおよそ５ｎｇ）でのクラスター形成の例を示しており、二重格納小滴の数の増大が、クラスター描写を混乱させ得る点が注目される。

【0033】

マスター混合物の調製
表２に記載される成分を一緒に混合して、ボルテックスによって十分に混合する。最初の濃度は、フォワードプライマー及びリバースプライマーの双方について９μＭ、そして各プローブについて５μＭである。ＰＴＥＮ遺伝子座（ＦＡＭチャネル）又は参照遺伝子座（ＨＥＸチャネル）毎の入力容量の差異を用いて、シグナル振幅の差異を生じさせ、これがクラスター間で分離を生じさせる。反応の全容量は２２μＬであるが、２０μＬのみを小滴生成工程に用いる（残りの２μＬは、デッド容量と考える）。

【0034】

【表2】

【0035】

小滴生成
小滴生成を、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを用いて実行する。本工程の間、メーカーの推奨に従う。本工程の出力は、おおよそ２０，０００滴を含有する４０μＬ容量である。

【0036】

増幅
試験サンプルを小滴に分配した後に、反応の増幅を実行した。表３は、ＰＴＥＮコピー数アッセイに用いた熱サイクリングパラメータを概説する。

【0037】

【表3】

【0038】

小滴リーディング
個々の小滴を、ＢＩＯ－ＲＡＤ ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒを用いて調べた。これらのリード由来のデータを、結果の呼出しに用いた。

【0039】

実施例１
腫瘍サンプル（ＦＦＰＥ）を、３つのＰＴＥＮ遺伝子座及び２つの参照遺伝子（Ｂ３ＧＮＴ２及びＥＲＣＣ３）にて、ｄｄＰＣＲによってアッセイした。サンプルを、１００％の濃度にてアッセイして、非腫瘍材料による希釈を繰り返した。初期腫瘍細胞充実度（Ｉｎｉｔｉａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）は、７０％であった。表４は、結果を要約する：

【0040】

【表4】

【0041】

実施例２
ＥＲ^＋転移性乳癌患者由来の組織サンプル及び血漿サンプルを、フルベストラント及びカピバセルチブの第１相治験の間に収集した。一部の患者について、２つのサンプルを、様々な時点にて収集した（以下の表において「ベースライン」及び「それ以後」と指定した）。

【0042】

収集の時点にて、組織サンプルを、ＰＴＥＮ状況について、次世代配列決定（ＮＧＳ）によって分析した。血漿（ｃｔＤＮＡ）サンプルを、ＰＴＥＮ状況について、ｉＣＨＯＲ ＣＮＡにより実行したローパス全ゲノム配列決定（ＬＰ－ＷＧＳ）分析によって；そして別途、本明細書中に記載するｄｄＰＣＲによって分析した。結果を表５に要約する。

【0043】

【表5】

【0044】

表５は、ｃｔＤＮＡ ＬＰ－ＷＧＳによるＰＴＥＮ状況の判定が、数人の患者をＰＴＥＮ－コピーニュートラルとして誤って分類したことを示しており、これは、組織サンプルからＮＧＳによって得た結果と一致しない。これに対し、ｄｄＰＣＲ法は、組織サンプル結果と一律に一致した。腫瘍画分の推定は、ＬＰ－ＷＧＳデータのｉＣＨＯＲ ＣＮＡ分析に由来した。

【図1A】

【図1B】

【国際調査報告】