特表2023-509578ポリペプチドタグ及び体外タンパク質合成におけるその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-09
(54)【発明の名称】ポリペプチドタグ及び体外タンパク質合成におけるその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20230302BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230302BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230302BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230302BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08 ZNA
C12P21/02 C
C12N15/11 Z
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022532165
(86)(22)【出願日】2020-11-27
(85)【翻訳文提出日】2022-07-26
(86)【国際出願番号】 CN2020132391
(87)【国際公開番号】W WO2021104482
(87)【国際公開日】2021-06-03
(31)【優先権主張番号】201911206616.3
(32)【優先日】2019-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520037016
【氏名又は名称】康碼（上海）生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＫＡＮＧＭＡ－ＨＥＡＬＴＨＣＯＤＥ （ＳＨＡＮＧＨＡＩ） ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】ＢＵＩＬＤＩＮＧ １２， １１８ ＦＵＲＯＮＧＨＵＡ ＲＯＡＤ， ＰＵＤＯＮＧ ＮＥＷ ＡＲＥＡ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２０１３２１，ＰＥＯＰＬＥ’Ｓ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】クオ、ミン
(72)【発明者】
【氏名】ユイ、シュエ
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA21
4B064CB30
4B064CC24
4B064CD20
4B064CD30
4B064DA01
4H045AA10
4H045BA10
4H045BA16
4H045BA41
4H045EA20
(57)【要約】
ポリペプチドタグを提供し、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６であり、ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられる。第２方面は、ポリペプチド融合タンパク質を提供し、（１）第１方面のいずれかのポリペプチドタグと、（２）前記ポリペプチドタグに接続された標的タンパク質との、２つの構造を含む。無細胞タンパク質合成系及び体外タンパク質合成におけるその使用をさらに提供する。ポリペプチドタグと標的タンパク質を融合タンパク質に構築することにより、前記ポリペプチドタグを切除しない場合でも、標識された標的タンパク質の発現量を効果的に高めることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリペプチドタグであって、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６であり、ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられることを特徴とするポリペプチドタグ。
【請求項2】
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項3】
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項4】
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項5】
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項6】
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２Ｘａａ３はＳＥであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＫである、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項7】
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＰ又はＹＧＫである、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項8】
前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであり、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項9】
前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ５Ｘａａ６はＥＰ又はＧＫである、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項10】
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６のうちの少なくとも３つは存在しないものではなく、さらに好ましくは、Ｘａａ２Ｘａａ３及びＸａａ４は存在しないものではなく、あるいは、Ｘａａ３とＸａａ４Ｘａａ５は存在しないものではない、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項11】
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＰである、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項12】
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＧであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項13】
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項14】
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項15】
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項16】
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項17】
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３は存在しなく、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項18】
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項19】
（１）請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチドタグと、（２）前記ポリペプチドタグに接続された標的タンパク質との、２つの構造を含む、ことを特徴とするポリペプチド融合タンパク質。
【請求項20】
前記ポリペプチドタグのＣ末端は前記標的タンパク質のＮ末端に接続される、ことを特徴とする請求項１９に記載のポリペプチド融合タンパク質。
【請求項21】
前記標的タンパク質は、蛍光タンパク質、強化型蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼのうちの１つ又はその組み合わせである、ことを特徴とする請求項１９又は２０に記載のポリペプチド融合タンパク質。
【請求項22】
（１）細胞抽出物と、（２）請求項１９又は２０又は２１に記載のポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡとを含む、ことを特徴とする体外無細胞タンパク質合成系。
【請求項23】
前記細胞抽出物は、酵母細胞抽出物であり、好ましくは、クルイベロミセスラクティス細胞抽出物である、ことを特徴とする請求項２２に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
【請求項24】
アミノ酸混合物、ｄＮＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼのうちの１種又は複数をさらに含む、ことを特徴とする請求項２２又は２３に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
【請求項25】
ＤＮＡポリメラーゼ、エネルギー供給系、ポリエチレングリコール、水性溶媒のうちの１種又は複数をさらに含む、ことを特徴とする請求項２２又は２３又は２４に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
【請求項26】
体外タンパク質合成における、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチドタグのコード遺伝子、又は請求項１９～２１のいずれか一項に記載のポリペプチド融合タンパク質のコード遺伝子、又は請求項２２～２５のいずれか一項に記載の無細胞タンパク質合成系の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［発明の詳細な説明］
本願は、出願日が２０１９年１１月３０日である中国特許出願２０１９１１２０６６１６３の優先権を主張する。本願は、上記中国特許出願の全文を引用する。
本願は、出願日が２０１９年１１月３０日である中国特許出願２０１９１１２０６６１６３の優先権を主張する。本願は、上記中国特許出願の全文を引用する。
【0002】
本発明は生化学技術分野に属し、具体的には、ポリペプチドタグ及び体外タンパク質合成におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
タンパク質は、細胞における重要な分子であり、細胞の全ての機能の実行にほぼ関与する。異なるタンパク質の配列と構造により、その異なる機能が決定される（１）。細胞内において、タンパク質は、酵素類として様々な生化学反応を触媒することができ、シグナル分子として生体の様々な活動を協調することができ、生体形態を支持し、エネルギーを貯蔵し、分子を輸送し、且つ生体を運動させることができる（２）。生物医学分野において、タンパク質抗体は、標的薬物として、癌等の疾患を治療する重要な手段である（１、２）。
【0004】
ヒトが細胞内タンパク質合成に対する了解に加えて、タンパク質合成は細胞外で行うこともできる。タンパク質体外合成系とは、一般的に、細菌、真菌、植物細胞又は動物細胞の分解体系に、ｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレート、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸、ＡＴＰなどの組成分を添加して、外来タンパク質の迅速で高効率な翻訳を完了するシステムを意味する（３、４）。タンパク質の体外無細胞合成系は、従来の体内組換え発現系に比べ、複数の利点を有し、例えば、細胞への毒害作用を有するか又は非天然アミノ酸（例えばＤ－アミノ酸）を含有する特殊タンパク質を発現することができ、ＰＣＲ生成物を直接的にテンプレートとして複数のタンパク質を同時に平行に合成して、ハイスループット薬物スクリーニング及びプロテオーム学の研究（３、５）を展開することができる。
【0005】
文献報告によると、融合タンパク質技術は、現在、組換えタンパク質の生産過程を最適化する通常の方法の１つであり、融合タグによって標的タンパク質の発現の促進等の目的を達成することができる。例えば、研究者は、タンパク質融合タグによるポリシーが、標的タンパク質の発現の増加及び封入体の形成の抑制に有効であることを発見した（６）。なお、タンパク質融合に広く用いられるタグは、例えば、ＭＢＰ（マルトース結合性タンパク質）（７）、ＴｒｘＡ（チオレドキシン）（８）、ＮＵＳＡ（窒素利用物質Ａ）（９）、ＧＳＴ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）（１０）、及びＳＵＭＯ（小ユビキチン様修飾物質）（１１）をさらに含むがこれらに限定されない。ここで、大部分のタンパク質融合に用いられるタグは、２０～３００個のアミノ酸から構成されるポリペプチド鎖であり、その欠点は、鎖長が比較的に長く、分子が比較的に大きく、且つ、多くの場合、それが、標的タンパク質の構造及び機能を干渉してタンパク質合成の効率を低下させることを防止するように、発現完了後に標的タンパク質から除去させる必要がある。したがって、導入された融合タグが標的タンパク質に対する影響及び干渉を低減するために、当技術分野はタンパク質構造及び機能に影響を与えなく又は少なく与える、標的タンパク質の生産効率を向上させるポリペプチドタグを開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、タンパク質合成の従来技術に存在している問題を解決し、ポリペプチド鎖が短く、分子量が低くく、標的タンパク質の空間構造に影響しないポリペプチドタグを提供し、切除する必要がなく、プロセスフローを簡略化させ、生産効率を向上させ、コストを低減させることができ、また、前記ポリペプチドタグを切除しない場合でも、標識された標的タンパク質は、タンパク質発現量を効果的に向上させることができる。
【0007】
本発明の第１方面は、ポリペプチドタグを提供し、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６であり、
ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられる。好ましくは、クルイベロミセス・ラクティス源に基づく細胞内又は体外タンパク質発現に用いられる。
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６であり、
ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられる。好ましくは、クルイベロミセス・ラクティス源に基づく細胞内又は体外タンパク質発現に用いられる。
【0008】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであるか又は存在しない。
【0009】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ２はＳであるか又は存在しない。
【0010】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ３はＥであるか又は存在しない。
【0011】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ４はＹであるか又は存在しない。
【0012】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ５はＥ又はＧであるか又は存在しない。
【0013】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ６はＰ又はＫであるか又は存在しない。
【0014】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない。
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない。
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない。
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない。
【0015】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない。
前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない。
【0016】
好ましくは、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２Ｘａａ３はＳＥであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＫである。
【0017】
好ましくは、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＰ又はＹＧＫである。
【0018】
好ましくは、前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであり、Ｘａａ６は存在しない。
【0019】
好ましくは、前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ５Ｘａａ６はＥＰ又はＧＫである。
【0020】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６のうちの少なくとも３つは存在しないものではなく、さらに好ましくは、Ｘａａ２Ｘａａ３及びＸａａ４は存在しないものではなく、あるいは、Ｘａａ３とＸａａ４Ｘａａ５は存在しないものではない。
【0021】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＰである。
【0022】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＧであり、Ｘａａ６はＫである。
【0023】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0024】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６は存在しない。
【0025】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0026】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない。
【0027】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３は存在しなく、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0028】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない。
【0029】
本発明の第２方面は、本発明の第１方面により提供されるいずれかのポリペプチドタグで標的タンパク質を標識して形成された融合タンパク質であるポリペプチド融合タンパク質を提供する。前記ポリペプチド融合タンパク質は、（１）本発明の第１方面により提供されるいずれか一つのポリペプチドタグと、（２）前記ポリペプチドタグに接続された標的タンパク質との、２つの構造を含む。前記ポリペプチド融合タンパク質の構造は、標的タンパク質と、標的タンパク質を標識するためのポリペプチドタグと、を含み、両者の間には融合タンパク質が形成される。
【0030】
さらに、前記ポリペプチドタグのＣ末端は前記標的タンパク質のＮ末端に接続される。
【0031】
さらに、前記標的タンパク質は、蛍光タンパク質、強化型蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼのうちの１つ又はその組み合わせである。
【0032】
本発明の第３方面は、
（１）細胞抽出物と、
（２）本発明の第２方面により提供されるいずれか一つのポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡと、
を含む体外無細胞タンパク質合成系を提供する。
（１）細胞抽出物と、
（２）本発明の第２方面により提供されるいずれか一つのポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡと、
を含む体外無細胞タンパク質合成系を提供する。
【0033】
好ましくは、前記細胞抽出物は、酵母細胞抽出物であり、より好ましくは、クルイベロミセスラクティス細胞抽出物である。
【0034】
さらに、前記体外無細胞タンパク質合成系は、アミノ酸混合物、ｄＮＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼのうちの１種又は複数をさらに含む。
【0035】
またさらに、前記体外無細胞タンパク質合成系は、ＤＮＡポリメラーゼ、エネルギー供給系、ポリエチレングリコール、水性溶媒のうちの１種又は複数をさらに含む。
【0036】
本発明の第４方面は、体外タンパク質合成における、本発明の第１方面により提供されるいずれか一つのポリペプチドタグのコード遺伝子、又は本発明の第２方面により提供されるいずれか一つのポリペプチド融合タンパク質のコード遺伝子、又は本発明の第３方面により提供されるいずれか一つの無細胞タンパク質合成系の使用を提供する。合成されたタンパク質は外因性タンパク質である。好ましくは、体外タンパク質合成における、クルイベロミセスラクティス細胞抽出物に基づく使用である。
【0037】
本発明は、細胞内タンパク質の合成における前記ポリペプチドタグの使用、特に好ましくは、クルイベロミセスラクティス細胞内タンパク質の合成における使用をさらに開示する。
【0038】
本発明は、下記の積極的な進歩効果を取得した。本発明により提供されるポリペプチドタグにより、タグ分子量が大きい場合、切除しなければ、標的タンパク質の空間構造及び機能に影響を与えやすく、切除すれば、プロセス及びコストを増加させるなどの、従来技術における問題を克服した。本発明により提供されるポリペプチドタグは、そのポリペプチド鎖が短く、アミノ酸の長さが１１個未満であり、分子量が小さく、標的タンパク質の空間構造及び生体機能に影響を与えず、切除する必要がない。ポリペプチドタグと標的タンパク質を融合タンパク質に構築することにより、前記ポリペプチドタグを切除しない場合でも、標識された標的タンパク質の発現量を効果的に高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】本発明のポリペプチドタグのＤＮＡコード配列が標的タンパク質（ｅＧＦＰを例とする）のコード配列に接続されたキャリア構造概略図を示し、ここで、ｅＧＦＰは強化型緑色蛍光タンパク質のコード配列であり、標的タンパク質の代表例として、ｅＧＦＰのみに限定されるものではない。図において、ＡＵＧは、開始コドンであり、ＡＵＧとポリペプチドタグのコード配列との間の「－」は、接続ペプチドのコード配列である。
【図2】本発明の複数のＮ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰがそれぞれ異なる体外無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質発現効果の比較を示し、ここで、ＢＣ（Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端未融合ポリペプチドタグ配列のブランク対照であり、ＰＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端融合野生型ポリペプチドタグ配列の陽性対照であり、ＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）はコードタンパク質のＤＮＡテンプレートを加えない陰性対照である。ここで、図２に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４１０２であり、図３に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０８１９１であり、図４に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４２２４であり、いずれもクルイベロミセス・ラクティスの遺伝子の組み換えにより得られた異なる菌株であり、ＲＮＡポリメラーゼの内因性発現の組み換えを含む。
【図3】本発明の複数のＮ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰがそれぞれ異なる体外無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質発現効果の比較を示し、ここで、ＢＣ（Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端未融合ポリペプチドタグ配列のブランク対照であり、ＰＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端融合野生型ポリペプチドタグ配列の陽性対照であり、ＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）はコードタンパク質のＤＮＡテンプレートを加えない陰性対照である。ここで、図２に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４１０２であり、図３に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０８１９１であり、図４に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４２２４であり、いずれもクルイベロミセス・ラクティスの遺伝子の組み換えにより得られた異なる菌株であり、ＲＮＡポリメラーゼの内因性発現の組み換えを含む。
【図4】本発明の複数のＮ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰがそれぞれ異なる体外無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質発現効果の比較を示し、ここで、ＢＣ（Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端未融合ポリペプチドタグ配列のブランク対照であり、ＰＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端融合野生型ポリペプチドタグ配列の陽性対照であり、ＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）はコードタンパク質のＤＮＡテンプレートを加えない陰性対照である。ここで、図２に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４１０２であり、図３に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０８１９１であり、図４に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４２２４であり、いずれもクルイベロミセス・ラクティスの遺伝子の組み換えにより得られた異なる菌株であり、ＲＮＡポリメラーゼの内因性発現の組み換えを含む。
【発明を実施するための形態】
【0040】
名詞及び用語
本発明でいう「ポリペプチドタグ」は、複数のアミノ酸がペプチド結合により構成され、タンパク質の標識に用いられるものである。
本発明でいう「ポリペプチドタグ」は、複数のアミノ酸がペプチド結合により構成され、タンパク質の標識に用いられるものである。
【0041】
本発明でいう「ポリペプチド融合タンパク質」は、標的タンパク質のＮ末端またはＣ末端にポリペプチドタグが融合し発現して得られたタンパク質である。
【0042】
本発明でいう「シームレスクローニング」は、従来のＰＣＲ生成物のクローニングと異なり、唯一の差異は下記のようである。つまり、キャリア末端及びプライマー末端に１５～２０個の相同性塩基を有するべきであり、それにより得られたＰＣＲ生成物の両端にそれぞれ１５～２０個のキャリア配列と相同性の塩基が付けられ、塩基間の作用力により相補的にペアリングし、酵素接続を必要とせずに直接的に宿主菌の形質転換に用いられることができ、宿主菌に入った線形プラスミド又は環状プラスミドは宿主菌の自己酵素系により切り欠きを修復する。
【0043】
本発明でいう「ＮＴ ｔａｇ」は、ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端の複数のアミノ酸またはアミノ酸残基からなる小分子ペプチドであり、小分子ペプチドのアミノ酸の数をＮＴの後ろの数字で示し、例えば、ＮＴ１１（ウンデカペプチド）、ＮＴ８（オクタペプチド）、ＮＴ６（ヘキサペプチド）である。
【0044】
本発明でいう「ｅＧＦＰ」は、強化型緑色蛍光タンパク質である。
【0045】
本発明でいう「アミノ酸混合物」は、２０種類の天然アミノ酸又は他の非天然アミノ酸からなる混合物である。
【0046】
本発明でいう「Ｎ末端」は、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸鎖のアミノ末端である。
【0047】
本発明でいう「Ｃ末端」は、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸鎖のカルボキシル末端である。
【0048】
本発明でいう「エネルギー供給系」は、加水分解又は酵素分解作用により、ＡＴＰを放出して体外タンパク質の合成にエネルギーを提供する物質の組み合わせである。
【0049】
本発明でいう「ｄＮＴＰ」とは、アデノシントリヌクレオチド（ＡＴＰ）、チミントリヌクレオチド（ＴＴＰ）、グアノシントリヌクレオチド （ＧＴＰ）及びシチジントリヌクレオチド（ＣＴＰ）を含む混合物を指す。
【0050】
現在、具体的な実施形態、実施例及び図１～４を参照して本発明をさらに詳細に説明し、本発明の実施形態は、本発明の要旨がどのようにに実現されるかを具体的に説明するためのわずかな例を用いて説明したものであり、本発明を何ら限定するものではない。下記の実施例において、使用された実験試薬が説明されず、いずれも従来の市販由来のものである。
【0051】
ポリペプチドタグのスクリーニング
発明者は大量の実験設計及び実験検証により、タグとして、体外タンパク質の合成効率の向上に有利なポリペプチドをスクリーニングし、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６であり、
ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられるものである。
発明者は大量の実験設計及び実験検証により、タグとして、体外タンパク質の合成効率の向上に有利なポリペプチドをスクリーニングし、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６であり、
ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられるものである。
【0052】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであるか又は存在しない。
【0053】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ２はＳであるか又は存在しない。
【0054】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ３はＥであるか又は存在しない。
【0055】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ４はＹであるか又は存在しない。
【0056】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ５はＥ又はＧであるか又は存在しない。
【0057】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ６はＰ又はＫであるか又は存在しない。
【0058】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない。
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない。
【0059】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない。
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない。
【0060】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない。
前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない。
【0061】
好ましくは、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２Ｘａａ３はＳＥであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＫである。
【0062】
好ましくは、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＰ又はＹＧＫである。
【0063】
好ましくは、前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであり、Ｘａａ６は存在しない。
【0064】
好ましくは、前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ５Ｘａａ６はＥＰ又はＧＫである。
【0065】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６のうちの少なくとも３つは存在しないものではなく、さらに好ましくは、Ｘａａ２Ｘａａ３及びＸａａ４は存在しないものではなく、あるいは、Ｘａａ３とＸａａ４Ｘａａ５は存在しないものではない。
【0066】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＰである。
【0067】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＧであり、Ｘａａ６はＫである。
【0068】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0069】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６は存在しない。
【0070】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0071】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない。
【0072】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３は存在しなく、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0073】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない。
【0074】
ポリペプチド融合タンパク質のプラスミドの構築及び配列決定同定
一対のプライマーを用いて、スクリーニングされたポリペプチドタグのコード配列を、シームレスクローニング方法により、ｐＤ２Ｐプラスミドの標的タンパク質Ｎ末端のコード配列位置に融合した。このように発現された融合タンパク質において、ポリペプチドタグのＣ末端と標的タンパク質のＮ末端とはペプチド結合で接続された。例えば、ポリペプチドタグをコードする遺伝子配列が、ｐＤ２Ｐ－ｅＧＦＰプラスミド（ｅＧＦＰをコードする遺伝子配列が導入されたｐＤ２Ｐプラスミド）のｅＧＦＰのＮ末端遺伝子配列の位置に接続された。具体的には、一連のポリペプチド融合タンパク質をコードする遺伝子配列が含まれたプラスミドを構築し、例えば、番号がｐＤ２Ｐ－１．０７－００１のプラスミドを構築した。
一対のプライマーを用いて、スクリーニングされたポリペプチドタグのコード配列を、シームレスクローニング方法により、ｐＤ２Ｐプラスミドの標的タンパク質Ｎ末端のコード配列位置に融合した。このように発現された融合タンパク質において、ポリペプチドタグのＣ末端と標的タンパク質のＮ末端とはペプチド結合で接続された。例えば、ポリペプチドタグをコードする遺伝子配列が、ｐＤ２Ｐ－ｅＧＦＰプラスミド（ｅＧＦＰをコードする遺伝子配列が導入されたｐＤ２Ｐプラスミド）のｅＧＦＰのＮ末端遺伝子配列の位置に接続された。具体的には、一連のポリペプチド融合タンパク質をコードする遺伝子配列が含まれたプラスミドを構築し、例えば、番号がｐＤ２Ｐ－１．０７－００１のプラスミドを構築した。
【0075】
前記ｐＤ２Ｐプラスミドの基本的な構造は、中国特許出願文献ＣＮ２０１９１０４６０９８７．８の明細書図面を参照することができる。
【0076】
採用されたクローニング技術に基づいてプライマー対を設計し、それぞれ上記一連のポリペプチド融合タンパク質を含むプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、且つ増幅生成物５μＬを取って１％アガロース電気泳動同定を行い、ＤｐｎＩ ５μＬを増幅生成物１０μＬに加え、３７℃で６ｈインキュベートし、ＤｐｎＩ処理後の生成物を含む遠心チューブにＤＨ５αコンピテント細胞５０μＬを加え、軽く均一に混合し、氷上で３０ｍｉｎ放置した後、４２℃で４５ｓヒートショックし、直ちに、氷上に３ｍｉｎ放置し、遠心チューブにＬＢ液体培地７００μＬを加えた。遠心チューブを３７℃のクレードルに放置して１ｈ振動培養した後、培養液２００μＬを取って１００ｍｍｏｌ／Ｌのアンピシリンを含む固体ＬＢ培地に塗布し、３７℃で１４～１６ｈ培養した。その後、白色のコロニーを選択して配列決定を行い、遺伝子配列決定が正しいことを確認した後、プラスミドを抽出して－２０℃に保存した。
【0077】
体外無細胞タンパク質合成系
１つの実施形態として、体外無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出物と、ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡとを含む。
１つの実施形態として、体外無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出物と、ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡとを含む。
【0078】
１つの実施形態として、体外無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出物と、ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡと、アミノ酸混合物、ｄＮＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼのうちの１種又は複数と、を含む。
【0079】
１つの実施形態として、体外無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出物と、ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡと、アミノ酸混合物、ｄＮＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、エネルギー供給系、ポリエチレングリコール及び水性溶媒のうちの１種又は複数と、を含む。
【0080】
１つの実施形態として、体外無細胞タンパク質合成反応系は、下記のとおりである。最終濃度が９．７８ｍＭでｐＨが８．０であるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、酢酸カリウム８０ｍＭ、マグネシウムイオン５．６ｍＭ、ヌクレオシド三リン酸混合物１．５ｍＭ（ｄＮＴＰ、アデニンヌクレオシド三リン酸と、グアニンヌクレオシド三リン酸と、シトシンヌクレオシド三リン酸と、ウラシルヌクレオシド三リン酸と、を含み、各ヌクレオシド三リン酸の濃度はいずれも１．５ｍＭである）、アミノ酸混合物（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンの濃度は、それぞれ０．７ｍＭである）０．７ｍＭ、ジチオスレイトール１．７ｍＭ、ポリエチレングリコール、エネルギー供給系、リン酸三カリウム２４ｍＭ、５０体積％細胞抽出物、０．３３μｇ／μＬのＤＮＡテンプレートである。
【0081】
１つの実施形態として、前記マグネシウムイオン由来のマグネシウム塩は、グルタミン酸マグネシウム、酢酸マグネシウムのいずれかの１つ又はそれらの組み合わせから選択される。
【0082】
１つの実施形態として、アミノ酸混合物は、２０種類の天然アミノ酸と、他の非天然アミノ酸とを含む。
【0083】
１つの実施形態として、ポリエチレングリコールの分子量は、２００～１２０００Ｄａであり、好ましくは、４００、６００、８００、２０００、４０００、８０００Ｄａである。重量平均分子量で計算する。
【0084】
１つの実施形態として、前記エネルギー供給体系は、グルコース、マルトース、トレハロース、マルトデキストリン、でんぷんデキストリン、クレアチンリン酸及びリン酸キナーゼのいずれかの１つ又はそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、マルトデキストリン３２０ｍＭ、６％トレハロースである。
【0085】
１つの実施形態として、前記細胞抽出物は、真核細胞、酵母細胞、クルイベロミセス細胞から選択され、好ましくは、クルイベロミセス・ラクティス細胞である。より好ましくは、ゲノムにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが組み込まれたクルイベロミセス・ラクティス細胞であり、又はプラスミドにＴ７ＲＮＡポリメラーゼが導入されたクルイベロミセス・ラクティス細胞である。
【0086】
別の実施形態として、前記細胞抽出物は、人工的に育種された高収量タンパク質のクルイベロミセス・ラクティス細胞から選択される。具体的には、ゲノムにＤＮＡポリメラーゼが組み込まれて発見されたクルイベロミセス・ラクティス細胞であり、より好ましくは、ゲノムにｐｈｉ２９ポリメラーゼが組み込まれて発現されたクルイベロミセス・ラクティス細胞である。
【0087】
１つの実施形態として、前記ＤＮＡテンプレートは、ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡであり、ポリペプチド融合蛍光タンパク質、ポリペプチド融合ホタルルシフェラーゼを含み、好ましくは、ポリペプチド融合強化型蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするＤＮＡである。
【0088】
実施例１ ポリペプチドタグ配列の同定
１．１ ポリペプチドタグのアミノ酸配列の由来及び同定は、既に開示された文献で報告され、研究者は実験により、ドナリエラ炭酸脱水酵素（ｄｃａ）Ｎ末端ハーフドメイン内の最初の１１個のアミノ酸残基（ＮＴ１１のアミノ酸配列は配列番号１８を参照し、そのＤＮＡ配列は配列番号９を参照する）が外来タンパク質のＮ末端に接続されて融合発現を行うことは、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞においてＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）等のタンパク質翻訳レベルを向上させる（Ｔｈｉ Ｋｈｏａ Ｍｙ Ｎｇｕｙｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＮＴ１１， ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ２０１９；１０３（５）： ２２０５－２２１６．）。本実施例は、ＮＴ１１のアミノ酸配列に対して部分サイトの削除又はランダムな点突然変異を行うことにより、さらに実験によって外来タンパク質発現に顕著な向上効果を有するアミノ酸配列をスクリーニングした。
１．１ ポリペプチドタグのアミノ酸配列の由来及び同定は、既に開示された文献で報告され、研究者は実験により、ドナリエラ炭酸脱水酵素（ｄｃａ）Ｎ末端ハーフドメイン内の最初の１１個のアミノ酸残基（ＮＴ１１のアミノ酸配列は配列番号１８を参照し、そのＤＮＡ配列は配列番号９を参照する）が外来タンパク質のＮ末端に接続されて融合発現を行うことは、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞においてＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）等のタンパク質翻訳レベルを向上させる（Ｔｈｉ Ｋｈｏａ Ｍｙ Ｎｇｕｙｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＮＴ１１， ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ２０１９；１０３（５）： ２２０５－２２１６．）。本実施例は、ＮＴ１１のアミノ酸配列に対して部分サイトの削除又はランダムな点突然変異を行うことにより、さらに実験によって外来タンパク質発現に顕著な向上効果を有するアミノ酸配列をスクリーニングした。
【0089】
具体的には、ＮＴ１１（ＰＣ）のアミノ酸配列に対して段階的な削除又はランダムな点突然変異を行って、一連の異なるアミノ酸配列を取得し、且つコドン最適化によって対応するヌクレオチド配列を取得し、アミノ酸及びヌクレオチド配列に対して番号付けを行い、取得された部分配列は表１及び配列表の配列番号１～１８を参照する。
【0090】
【表1】
【0091】
好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＰであり、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１０である。
【0092】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＧであり、Ｘａａ６はＫであり、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１１である。
【0093】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫであり、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号３であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１２である。
【0094】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６は存在しなく、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号４であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１３である。
【0095】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫであり、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号５であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１４である。
【0096】
他の好ましい実施形態として、記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しなく、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号６であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１５である。
【0097】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３は存在しなく、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫであり、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号７であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１６である。
【0098】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しなく、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号８であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１７である。
【0099】
以上の８種類の新たに得られたポリペプチドタグは本発明により提供される一部の好ましい例に過ぎず、本発明の実施形態は上記好ましい例を含むがこれらに限定されない。
【0100】
実施例２ Ｎ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰのプラスミド構築
プラスミドの構築は、一対のプライマーを用い、シームレスクローニング方法を利用してポリペプチドタグのコード遺伝子をｐＤ２Ｐ－ｅＧＦＰプラスミドにおけるｅＧＦＰのＮ末端コード配列位置に接続され、その遺伝子構造は図１を参照する。ただし、９つのプラスミドの名称は、それぞれ、ｐＤ２Ｐ－１．０７－（００１～００８）及びＰＣである（表１参照）。前記９つのプラスミドの増幅プライマー配列は順に、配列番号１９～３６である。
プラスミドの構築は、一対のプライマーを用い、シームレスクローニング方法を利用してポリペプチドタグのコード遺伝子をｐＤ２Ｐ－ｅＧＦＰプラスミドにおけるｅＧＦＰのＮ末端コード配列位置に接続され、その遺伝子構造は図１を参照する。ただし、９つのプラスミドの名称は、それぞれ、ｐＤ２Ｐ－１．０７－（００１～００８）及びＰＣである（表１参照）。前記９つのプラスミドの増幅プライマー配列は順に、配列番号１９～３６である。
【0101】
具体的な構築プロセスは、下記のとおりである。
【0102】
クローニング技術に基づいて一対のプライマーを設計し（表２を参照し、ただし、尾部がＰＦであるのはフォワードプライマーに対応し、尾部がＰＲであるのはリバースプライマーに対応し、それぞれ上記９つのプラスミドｐＤ２Ｐ－１．０７－（００１～００８）とＰＣをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、増幅生成物５μＬを取って１％アガロース電気泳動同定を行い、ＤｐｎＩ５μＬを増幅生成物１０μＬに加え、３７℃で６ｈインキュベートし、ＤｐｎＩ処理後の生成物を含む遠心チューブにＤＨ５αコンピテント細胞５０μＬを加え、軽く均一に混合し、氷上で３０ｍｉｎ放置した後、４２℃で４５ｓヒートショックし、直ちに、氷上に３ｍｉｎ放置し、遠心チューブにＬＢ液体培地７００μＬを加えた。遠心チューブを３７℃のクレードルに放置して１ｈ振動培養した後、培養液２００μＬを取って１００ｍｍｏｌ／Ｌのアンピシリンを含む固体ＬＢ培地に塗布し、３７℃で１４～１６ｈ培養した。その後、白色のコロニーを選択して配列決定同定を行い、遺伝子配列決定が正しいことが確認された後、相応するコロニーのプラスミドを抽出して－２０℃に保存した。
【0103】
【表2】
【0104】
実施例３～５ 体外タンパク質合成における、ポリペプチドタグのコード遺伝子、Ｎ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰのコード遺伝子、及び系のＤＮＡテンプレートに上記コード遺伝子が含まれる体外無細胞タンパク質合成体系の応用
Ｓ１：ＤＮＡ増幅は、構築されたプラスミドをＤＮＡテンプレートとして増幅し、増幅体系は、下記のとおりである。最終濃度１～５ｍＭのランダムプライマー（ＮＮＮＮＮＮＮ、７つの塩基からランダムに構成されることを示す）、上記プラスミドテンプレート１．１４ｎｇ／μＬ、ｄＮＴＰ０．５～１ｍＭ、ＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬ、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬ、１×ｐｈｉ２９反応緩衝液（成分がＴｒｉｓ－ＨＣｌ ２００ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｍＭ、ＫＣｌ １０ｍＭであり、ｐＨが７．５である）。上記反応系を均一に混合した後、３０℃の環境に放置されて３ｈ反応させた。反応終了後、紫外分光光度計にてＤＮＡ濃度を測定した。
Ｓ１：ＤＮＡ増幅は、構築されたプラスミドをＤＮＡテンプレートとして増幅し、増幅体系は、下記のとおりである。最終濃度１～５ｍＭのランダムプライマー（ＮＮＮＮＮＮＮ、７つの塩基からランダムに構成されることを示す）、上記プラスミドテンプレート１．１４ｎｇ／μＬ、ｄＮＴＰ０．５～１ｍＭ、ＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬ、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬ、１×ｐｈｉ２９反応緩衝液（成分がＴｒｉｓ－ＨＣｌ ２００ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｍＭ、ＫＣｌ １０ｍＭであり、ｐＨが７．５である）。上記反応系を均一に混合した後、３０℃の環境に放置されて３ｈ反応させた。反応終了後、紫外分光光度計にてＤＮＡ濃度を測定した。
【0105】
実験群（処理方式）は、ＤＮＡテンプレートを加え、前記ＤＮＡテンプレートにはポリペプチドタグ融合強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【0106】
ＢＣ群（処理方式）は、ＢＣ（Ｂｌａｎｋ Ｃｏｎｔｒｏｌ）であって、すなわちブランク対照であり、ＤＮＡテンプレートを加え、前記ＤＮＡテンプレートには、ポリペプチドタグをコードするヌクレオチド配列が含まれなく、強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【0107】
ＰＣ群（処理方式）は、ＰＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｏｎｔｒｏｌ）であって、すなわち陽性対照であり、ＤＮＡテンプレートを加え、前記ＤＮＡテンプレートには野生型のポリペプチドタグをコードし強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰを融合するヌクレオチド配列が含まれる。
【0108】
ＮＣ群（処理方式）は、ＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）であって、すなわち陰性対照であり、外来ＤＮＡテンプレートが添加されない。
【0109】
Ｓ２：体外タンパク質合成系においてＮ末端融合ポリペプチドタグを発現するｅＧＦＰ
上記Ｓ１で増幅されたＤＮＡ断片を体外蛋白質合成系に添加した。体外無細胞タンパク質合成反応系は、下記のとおりである。最終濃度が９．７８ｍＭでｐＨが８．０のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、酢酸カリウム８０ｍＭ、マグネシウムイオン５．６ｍＭ、ヌクレオシド三リン酸混合物１．５ｍＭ（アデニンヌクレオシド三リン酸と、グアニンヌクレオシド三リン酸と、シトシンヌクレオシド三リン酸と、ウラシルヌクレオシド三リン酸と、を含み、各ヌクレオシド三リン酸の濃度はいずれも１．５ｍＭである）、アミノ酸混合物（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、 チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンの濃度は、それぞれ０．７ｍＭである）０．７ｍＭ、ジチオスレイトール１．７ｍＭ、２％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール８０００、マルトデキストリン３２０ｍＭ、６％トレハロース、リン酸三カリウム２４ｍＭ、５０体積％酵母細胞抽出物、０．３３μｇ／μＬのＤＮＡテンプレートである（上記ＤＮＡ増幅により得られたものである）。
上記Ｓ１で増幅されたＤＮＡ断片を体外蛋白質合成系に添加した。体外無細胞タンパク質合成反応系は、下記のとおりである。最終濃度が９．７８ｍＭでｐＨが８．０のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、酢酸カリウム８０ｍＭ、マグネシウムイオン５．６ｍＭ、ヌクレオシド三リン酸混合物１．５ｍＭ（アデニンヌクレオシド三リン酸と、グアニンヌクレオシド三リン酸と、シトシンヌクレオシド三リン酸と、ウラシルヌクレオシド三リン酸と、を含み、各ヌクレオシド三リン酸の濃度はいずれも１．５ｍＭである）、アミノ酸混合物（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、 チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンの濃度は、それぞれ０．７ｍＭである）０．７ｍＭ、ジチオスレイトール１．７ｍＭ、２％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール８０００、マルトデキストリン３２０ｍＭ、６％トレハロース、リン酸三カリウム２４ｍＭ、５０体積％酵母細胞抽出物、０．３３μｇ／μＬのＤＮＡテンプレートである（上記ＤＮＡ増幅により得られたものである）。
【0110】
３種類の異なる酵母細胞抽出物由来のものを採用し、それぞれ異なる体外タンパク質合成系を構築し、構築されたポリペプチド融合タンパク質が異なる系における効果を検証した。ここで、実施例３で使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４１０２であり、実施例４で使用された細胞抽出物はＹＹ１９０８１９１であり、実施例５で使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４２２４であり、いずれもクルイベロミセス・ラクティスＡＴＣＣ８５８５及びその遺伝子組み換えの異なる菌株であり、ＲＮＡポリメラーゼの内因性発現の組み換えを含み、中国特許出願文献ＣＮ２０１７１０７６８５５０．１の調製方法を参照する。
【0111】
上記反応系を３０℃の環境条件に放置し、約２０ｈ静置インキュベートした。反応終了後、直ちにＥｎｖｉｓｉｏｎ２１２０多機能マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に置いて、数値を読み取って、ｅＧＦＰの蛍光信号の強さを検出し、相対蛍光単位値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ、ＲＦＵ）を採用して活性単位とした。
【0112】
実験結果は、下記のとおりである。
【0113】
蛍光光度法の測定結果から分かるように、体外タンパク質合成系において、野生型ポリペプチドタグはタンパク質の発現を強化しなく、逆にタンパク質発現量の減少を引き起こし、図２～４を参照し、ＰＣ群のＲＦＵ値はいずれもＢＣ群より低いものであり、特に図４において抑制効果が非常に顕著である。これは野生型ポリペプチドタグの大腸菌細胞内における促進効果と逆である。
【0114】
発明者がスクリーニングしたポリペプチドタグを使用すれば、いずれもｅＧＦＰの体外発現に促進効果を有した。蛍光光度法の測定結果から分かるように、体外タンパク質合成系に発現された複数のＮ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰは、そのＲＦＵ値がいずれも向上され、本発明のポリペプチドタグによりｅＧＦＰの発現量が向上されたことが説明され、図２～４に示すことを参照する。
【0115】
実施例３について、その結果は図２を参照し、異なる実験群はいずれも空白対照群を超え、特にｐＤ２Ｐ－１．０７－００３（２０時間反応した後にＲＦＵ値が７３６１に達した）は、ポリペプチドタグ関連配列が導入されなかった空白対照（ＲＦＵ値が５１８９である）に比べ、ＲＦＵが４１．８６％向上された。
【0116】
実施例４から分かるように、異なる実験群はいずれも空白対照群を超え、図３を参照すれば、ここで、ｐＤ２Ｐ－１．０７－００３、ｐＤ２Ｐ－１．０７－００４、ｐＤ２Ｐ－１．０７－００６及びｐＤ２Ｐ－１．０７－００８を含む４つの実験群の効果が顕著であり、特にｐＤ２Ｐ－１．０７－００８は２０時間反応した後にＲＦＵ値が５５３２に達し、ポリペプチドタグ関連配列が導入されなかった空白対照（ＲＦＵ値が３３３４である）に比べ、ＲＦＵが６５．９３％向上された。
【0117】
実施例５において、異なる実験群はいずれも空白対照群を超え、図４を参照すれば、２０時間反応した後、実験群ｐＤ２Ｐ－１．０７－００２で測定されたＲＦＵ値は３５８０であり、ポリペプチドタグ関連配列が導入されなかった空白対照（ＲＦＵ値が２６５４である）に比べ、実験群のＲＦＵが３４．８９％向上された。
【0118】
上記実施例の実験結果により、本発明のポリペプチドタグ、特に標的タンパク質Ｎ末端に融合されたポリペプチドタグ配列を導入することにより、体外無細胞タンパク質合成系を用いて構築されたポリペプチド融合タンパク質を合成し、標的タンパク質の翻訳効率と生産量を向上させることができ、体外タンパク質合成系の利用可能性を大幅に向上させた。
【0119】
本発明に言及された全ての文献は、本出願において参考として引用され、各文献が単独で参考として引用されているようである。その他、理解すべきものとして、本発明の上記内容を読んだ後、当業者は本発明に対して様々な変更又は修正を行うことができ、これらの等価形式は本願の添付の特許請求の範囲に限定される範囲に属する。
【0120】
参考文献
１．Ｇａｒｃｉａ ＲＡ， Ｒｉｌｅｙ ＭＲ． Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，； １９８１． ２６３－２６４ ｐ．
２． Ｆｒｏｍｍ ＨＪ， Ｈａｒｇｒｏｖｅ Ｍ． Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１２；
３． Ｋａｔｚｅｎ Ｆ， Ｃｈａｎｇ Ｇ， Ｋｕｄｌｉｃｋｉ Ｗ． Ｔｈｅ ｐａｓｔ， ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５；２３（３）：１５０－６．
４． Ｇａｎ Ｒ， Ｊｅｗｅｔｔ ＭＣ． Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ． ２０１４；９（５）：６４１－５１．
５． Ｌｕ Ｙ． Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ａｎ ｏｐｅｎ ｗｏｒｌｄ． Ｓｙｎｔｈ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７；２（１）：２３－７．
６． Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｄ， Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ＤＫＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；１７（４）：３５３－３５８．
７．Ｋａｐｕｓｔ ＲＢ， Ｗａｕｇｈ ＤＳ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍａｌｔｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｕｎｃｏｍｍｏｎｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｔ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｗｈｉｃｈ ｉｔ ｉｓ ｆｕｓｅｄ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９９；８（８）：１６６８－１６７４．
８．Ｌｉａｎｇｆａｎ Ｚｈｏｕ， Ｚｈｉｈｕｉ Ｚｈａｏ，Ｂａｏｃｕｎ Ｌｉ，Ｙｕｆｅｎｇ Ｃａｉ，Ｓｈｕａｎｇｑｕａｎ Ｚｈａｎｇ．ＴｒｘＡ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ＣＭ４ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｊｏｉｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２００９；６４（２）：２２５－２３０．
９．Ｋｏｈｌ Ｔ， ｓｃｈｍｉｄｔ Ｃ， Ｗｉｅｍａｎｎ Ｓ， Ｐｏｕｓｔｋａ Ａ， Ｋｏｒｆ Ｕ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８； ６：４．
１０．Ｈｕ Ｊ， Ｑｉｎ Ｈ， Ｓｈａｒｍａ Ｍ， Ｃｒｏｓｓ ＴＡ， Ｇａｏ ＦＰ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７７８（４）：１０６０－１０６６．
１１．Ｄａ Ｓｏｌ Ｋｉｍ， Ｓｅｏｎ Ｗｏｏｎｇ Ｋｉｍ， Ｊａｅ Ｍｉｎ Ｓｏｎｇ， Ｓｏｏｎ Ｙｏｕｎｇ Ｋｉｍ＆Ｋｗａｎｇ－Ｃｈｕｌ Ｋｗｏｎ．Ａ ｎｅｗ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｂａｅｃｉｎ ｕｓｉｎｇ ＳＵＭＯ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１９；１９：１３．
１２． Ｔｈｉ Ｋｈｏａ Ｍｙ Ｎｇｕｙｅｎ， Ｍｉ Ｒａｎ Ｋｉ， Ｒｙｅｏ Ｇａｎｇ Ｓｏｎ， Ｓｅｕｎｇ Ｐｉｌ Ｐａｃｋ１．ｔｈｅ ＮＴ１１， ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２０１９；１０３（５）： ２２０５－２２１６．
１．Ｇａｒｃｉａ ＲＡ， Ｒｉｌｅｙ ＭＲ． Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，； １９８１． ２６３－２６４ ｐ．
２． Ｆｒｏｍｍ ＨＪ， Ｈａｒｇｒｏｖｅ Ｍ． Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１２；
３． Ｋａｔｚｅｎ Ｆ， Ｃｈａｎｇ Ｇ， Ｋｕｄｌｉｃｋｉ Ｗ． Ｔｈｅ ｐａｓｔ， ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５；２３（３）：１５０－６．
４． Ｇａｎ Ｒ， Ｊｅｗｅｔｔ ＭＣ． Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ． ２０１４；９（５）：６４１－５１．
５． Ｌｕ Ｙ． Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ａｎ ｏｐｅｎ ｗｏｒｌｄ． Ｓｙｎｔｈ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７；２（１）：２３－７．
６． Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｄ， Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ＤＫＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；１７（４）：３５３－３５８．
７．Ｋａｐｕｓｔ ＲＢ， Ｗａｕｇｈ ＤＳ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍａｌｔｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｕｎｃｏｍｍｏｎｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｔ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｗｈｉｃｈ ｉｔ ｉｓ ｆｕｓｅｄ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９９；８（８）：１６６８－１６７４．
８．Ｌｉａｎｇｆａｎ Ｚｈｏｕ， Ｚｈｉｈｕｉ Ｚｈａｏ，Ｂａｏｃｕｎ Ｌｉ，Ｙｕｆｅｎｇ Ｃａｉ，Ｓｈｕａｎｇｑｕａｎ Ｚｈａｎｇ．ＴｒｘＡ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ＣＭ４ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｊｏｉｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２００９；６４（２）：２２５－２３０．
９．Ｋｏｈｌ Ｔ， ｓｃｈｍｉｄｔ Ｃ， Ｗｉｅｍａｎｎ Ｓ， Ｐｏｕｓｔｋａ Ａ， Ｋｏｒｆ Ｕ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８； ６：４．
１０．Ｈｕ Ｊ， Ｑｉｎ Ｈ， Ｓｈａｒｍａ Ｍ， Ｃｒｏｓｓ ＴＡ， Ｇａｏ ＦＰ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７７８（４）：１０６０－１０６６．
１１．Ｄａ Ｓｏｌ Ｋｉｍ， Ｓｅｏｎ Ｗｏｏｎｇ Ｋｉｍ， Ｊａｅ Ｍｉｎ Ｓｏｎｇ， Ｓｏｏｎ Ｙｏｕｎｇ Ｋｉｍ＆Ｋｗａｎｇ－Ｃｈｕｌ Ｋｗｏｎ．Ａ ｎｅｗ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｂａｅｃｉｎ ｕｓｉｎｇ ＳＵＭＯ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１９；１９：１３．
１２． Ｔｈｉ Ｋｈｏａ Ｍｙ Ｎｇｕｙｅｎ， Ｍｉ Ｒａｎ Ｋｉ， Ｒｙｅｏ Ｇａｎｇ Ｓｏｎ， Ｓｅｕｎｇ Ｐｉｌ Ｐａｃｋ１．ｔｈｅ ＮＴ１１， ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２０１９；１０３（５）： ２２０５－２２１６．
【0121】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【表3-7】
【表3-8】
【表3-9】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2022-11-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［発明の詳細な説明］
本願は、出願日が２０１９年１１月３０日である中国特許出願２０１９１１２０６６１６３の優先権を主張する。本願は、上記中国特許出願の全文を引用する。
本願は、出願日が２０１９年１１月３０日である中国特許出願２０１９１１２０６６１６３の優先権を主張する。本願は、上記中国特許出願の全文を引用する。
【0002】
本発明は生化学技術分野に属し、具体的には、ポリペプチドタグ及び体外タンパク質合成におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
タンパク質は、細胞における重要な分子であり、細胞の全ての機能の実行にほぼ関与する。異なるタンパク質の配列と構造により、その異なる機能が決定される（１）。細胞内において、タンパク質は、酵素類として様々な生化学反応を触媒することができ、シグナル分子として生体の様々な活動を協調することができ、生体形態を支持し、エネルギーを貯蔵し、分子を輸送し、且つ生体を運動させることができる（２）。生物医学分野において、タンパク質抗体は、標的薬物として、癌等の疾患を治療する重要な手段である（１、２）。
【0004】
ヒトが細胞内タンパク質合成に対する了解に加えて、タンパク質合成は細胞外で行うこともできる。タンパク質体外合成系とは、一般的に、細菌、真菌、植物細胞又は動物細胞の分解体系に、ｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレート、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸、ＡＴＰなどの組成分を添加して、外来タンパク質の迅速で高効率な翻訳を完了するシステムを意味する（３、４）。タンパク質の体外無細胞合成系は、従来の体内組換え発現系に比べ、複数の利点を有し、例えば、細胞への毒害作用を有するか又は非天然アミノ酸（例えばＤ－アミノ酸）を含有する特殊タンパク質を発現することができ、ＰＣＲ生成物を直接的にテンプレートとして複数のタンパク質を同時に平行に合成して、ハイスループット薬物スクリーニング及びプロテオーム学の研究（３、５）を展開することができる。
【0005】
文献報告によると、融合タンパク質技術は、現在、組換えタンパク質の生産過程を最適化する通常の方法の１つであり、融合タグによって標的タンパク質の発現の促進等の目的を達成することができる。例えば、研究者は、タンパク質融合タグによるポリシーが、標的タンパク質の発現の増加及び封入体の形成の抑制に有効であることを発見した（６）。なお、タンパク質融合に広く用いられるタグは、例えば、ＭＢＰ（マルトース結合性タンパク質）（７）、ＴｒｘＡ（チオレドキシン）（８）、ＮＵＳＡ（窒素利用物質Ａ）（９）、ＧＳＴ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）（１０）、及びＳＵＭＯ（小ユビキチン様修飾物質）（１１）をさらに含むがこれらに限定されない。ここで、大部分のタンパク質融合に用いられるタグは、２０～３００個のアミノ酸から構成されるポリペプチド鎖であり、その欠点は、鎖長が比較的に長く、分子が比較的に大きく、且つ、多くの場合、それが、標的タンパク質の構造及び機能を干渉してタンパク質合成の効率を低下させることを防止するように、発現完了後に標的タンパク質から除去させる必要がある。したがって、導入された融合タグが標的タンパク質に対する影響及び干渉を低減するために、当技術分野はタンパク質構造及び機能に影響を与えなく又は少なく与える、標的タンパク質の生産効率を向上させるポリペプチドタグを開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、タンパク質合成の従来技術に存在している問題を解決し、ポリペプチド鎖が短く、分子量が低くく、標的タンパク質の空間構造に影響しないポリペプチドタグを提供
し、切除する必要がなく、プロセスフローを簡略化させ、生産効率を向上させ、コストを低減させることができ、また、前記ポリペプチドタグを切除しない場合でも、標識された標的タンパク質は、タンパク質発現量を効果的に向上させることができる。
し、切除する必要がなく、プロセスフローを簡略化させ、生産効率を向上させ、コストを低減させることができ、また、前記ポリペプチドタグを切除しない場合でも、標識された標的タンパク質は、タンパク質発現量を効果的に向上させることができる。
【0007】
本発明の第１方面は、ポリペプチドタグを提供し、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６（配列番号３７）であり、
ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられる。好ましくは、クルイベロミセス・ラクティス源に基づく細胞内又は体外タンパク質発現に用いられる。
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６（配列番号３７）であり、
ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられる。好ましくは、クルイベロミセス・ラクティス源に基づく細胞内又は体外タンパク質発現に用いられる。
【0008】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであるか又は存在しない。
【0009】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ２はＳであるか又は存在しない。
【0010】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ３はＥであるか又は存在しない。
【0011】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ４はＹであるか又は存在しない。
【0012】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ５はＥ又はＧであるか又は存在しない。
【0013】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ６はＰ又はＫであるか又は存在しない。
【0014】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない。
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない。
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない。
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない。
【0015】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない。
前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない。
【0016】
好ましくは、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２Ｘａａ３はＳＥであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＫである。
【0017】
好ましくは、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＰ又はＹＧＫである。
【0018】
好ましくは、前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであり、Ｘａａ６は存在しない。
【0019】
好ましくは、前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ５Ｘａａ６はＥＰ又はＧＫである。
【0020】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６のうちの少なくとも３つは存在しないものではなく、さらに好ましくは、Ｘａａ２Ｘａａ３及びＸａａ４は存在しないものではなく、あるいは、Ｘａａ３とＸａａ４Ｘａａ５は存在しないものではない。
【0021】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＰである。
【0022】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＧであり、Ｘａａ６はＫである。
【0023】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0024】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６は存在しない。
【0025】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0026】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない。
【0027】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３は存在しなく、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ
５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0028】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない。
【0029】
本発明の第２方面は、本発明の第１方面により提供されるいずれかのポリペプチドタグで標的タンパク質を標識して形成された融合タンパク質であるポリペプチド融合タンパク質を提供する。前記ポリペプチド融合タンパク質は、（１）本発明の第１方面により提供されるいずれか一つのポリペプチドタグと、（２）前記ポリペプチドタグに接続された標的タンパク質との、２つの構造を含む。前記ポリペプチド融合タンパク質の構造は、標的タンパク質と、標的タンパク質を標識するためのポリペプチドタグと、を含み、両者の間には融合タンパク質が形成される。
【0030】
さらに、前記ポリペプチドタグのＣ末端は前記標的タンパク質のＮ末端に接続される。
【0031】
さらに、前記標的タンパク質は、蛍光タンパク質、強化型蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼのうちの１つ又はその組み合わせである。
【0032】
本発明の第３方面は、
（１）細胞抽出物と、
（２）本発明の第２方面により提供されるいずれか一つのポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡと、
を含む体外無細胞タンパク質合成系を提供する。
（１）細胞抽出物と、
（２）本発明の第２方面により提供されるいずれか一つのポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡと、
を含む体外無細胞タンパク質合成系を提供する。
【0033】
好ましくは、前記細胞抽出物は、酵母細胞抽出物であり、より好ましくは、クルイベロミセスラクティス細胞抽出物である。
【0034】
さらに、前記体外無細胞タンパク質合成系は、アミノ酸混合物、ｄＮＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼのうちの１種又は複数をさらに含む。
【0035】
またさらに、前記体外無細胞タンパク質合成系は、ＤＮＡポリメラーゼ、エネルギー供給系、ポリエチレングリコール、水性溶媒のうちの１種又は複数をさらに含む。
【0036】
本発明の第４方面は、体外タンパク質合成における、本発明の第１方面により提供されるいずれか一つのポリペプチドタグのコード遺伝子、又は本発明の第２方面により提供されるいずれか一つのポリペプチド融合タンパク質のコード遺伝子、又は本発明の第３方面により提供されるいずれか一つの無細胞タンパク質合成系の使用を提供する。合成されたタンパク質は外因性タンパク質である。好ましくは、体外タンパク質合成における、クルイベロミセスラクティス細胞抽出物に基づく使用である。
【0037】
本発明は、細胞内タンパク質の合成における前記ポリペプチドタグの使用、特に好ましくは、クルイベロミセスラクティス細胞内タンパク質の合成における使用をさらに開示する。
【0038】
本発明は、下記の積極的な進歩効果を取得した。本発明により提供されるポリペプチドタグにより、タグ分子量が大きい場合、切除しなければ、標的タンパク質の空間構造及び機能に影響を与えやすく、切除すれば、プロセス及びコストを増加させるなどの、従来技術における問題を克服した。本発明により提供されるポリペプチドタグは、そのポリペプチド鎖が短く、アミノ酸の長さが１１個未満であり、分子量が小さく、標的タンパク質の
空間構造及び生体機能に影響を与えず、切除する必要がない。ポリペプチドタグと標的タンパク質を融合タンパク質に構築することにより、前記ポリペプチドタグを切除しない場合でも、標識された標的タンパク質の発現量を効果的に高めることができる。
空間構造及び生体機能に影響を与えず、切除する必要がない。ポリペプチドタグと標的タンパク質を融合タンパク質に構築することにより、前記ポリペプチドタグを切除しない場合でも、標識された標的タンパク質の発現量を効果的に高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】本発明のポリペプチドタグのＤＮＡコード配列が標的タンパク質（ｅＧＦＰを例とする）のコード配列に接続されたキャリア構造概略図を示し、ここで、ｅＧＦＰは強化型緑色蛍光タンパク質のコード配列であり、標的タンパク質の代表例として、ｅＧＦＰのみに限定されるものではない。図において、ＡＵＧは、開始コドンであり、ＡＵＧとポリペプチドタグのコード配列との間の「－」は、接続ペプチドのコード配列である。
【図2】本発明の複数のＮ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰがそれぞれ異なる体外無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質発現効果の比較を示し、ここで、ＢＣ（Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端未融合ポリペプチドタグ配列のブランク対照であり、ＰＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端融合野生型ポリペプチドタグ配列の陽性対照であり、ＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）はコードタンパク質のＤＮＡテンプレートを加えない陰性対照である。ここで、図２に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４１０２であり、図３に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０８１９１であり、図４に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４２２４であり、いずれもクルイベロミセス・ラクティスの遺伝子の組み換えにより得られた異なる菌株であり、ＲＮＡポリメラーゼの内因性発現の組み換えを含む。
【図3】本発明の複数のＮ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰがそれぞれ異なる体外無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質発現効果の比較を示し、ここで、ＢＣ（Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端未融合ポリペプチドタグ配列のブランク対照であり、ＰＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端融合野生型ポリペプチドタグ配列の陽性対照であり、ＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）はコードタンパク質のＤＮＡテンプレートを加えない陰性対照である。ここで、図２に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４１０２であり、図３に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０８１９１であり、図４に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４２２４であり、いずれもクルイベロミセス・ラクティスの遺伝子の組み換えにより得られた異なる菌株であり、ＲＮＡポリメラーゼの内因性発現の組み換えを含む。
【図4】本発明の複数のＮ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰがそれぞれ異なる体外無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質発現効果の比較を示し、ここで、ＢＣ（Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端未融合ポリペプチドタグ配列のブランク対照であり、ＰＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰのＮ末端融合野生型ポリペプチドタグ配列の陽性対照であり、ＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）はコードタンパク質のＤＮＡテンプレートを加えない陰性対照である。ここで、図２に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４１０２であり、図３に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０８１９１であり、図４に使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４２２４であり、いずれもクルイベロミセス・ラクティスの遺伝子の組み換えにより得られた異なる菌株であり、ＲＮＡポリメラーゼの内因性発現の組み換えを含む。
【発明を実施するための形態】
【0040】
名詞及び用語
本発明でいう「ポリペプチドタグ」は、複数のアミノ酸がペプチド結合により構成され、タンパク質の標識に用いられるものである。
本発明でいう「ポリペプチドタグ」は、複数のアミノ酸がペプチド結合により構成され、タンパク質の標識に用いられるものである。
【0041】
本発明でいう「ポリペプチド融合タンパク質」は、標的タンパク質のＮ末端またはＣ末
端にポリペプチドタグが融合し発現して得られたタンパク質である。
端にポリペプチドタグが融合し発現して得られたタンパク質である。
【0042】
本発明でいう「シームレスクローニング」は、従来のＰＣＲ生成物のクローニングと異なり、唯一の差異は下記のようである。つまり、キャリア末端及びプライマー末端に１５～２０個の相同性塩基を有するべきであり、それにより得られたＰＣＲ生成物の両端にそれぞれ１５～２０個のキャリア配列と相同性の塩基が付けられ、塩基間の作用力により相補的にペアリングし、酵素接続を必要とせずに直接的に宿主菌の形質転換に用いられることができ、宿主菌に入った線形プラスミド又は環状プラスミドは宿主菌の自己酵素系により切り欠きを修復する。
【0043】
本発明でいう「ＮＴ ｔａｇ」は、ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端の複数のアミノ酸またはアミノ酸残基からなる小分子ペプチドであり、小分子ペプチドのアミノ酸の数をＮＴの後ろの数字で示し、例えば、ＮＴ１１（ウンデカペプチド）、ＮＴ８（オクタペプチド）、ＮＴ６（ヘキサペプチド）である。
【0044】
本発明でいう「ｅＧＦＰ」は、強化型緑色蛍光タンパク質である。
【0045】
本発明でいう「アミノ酸混合物」は、２０種類の天然アミノ酸又は他の非天然アミノ酸からなる混合物である。
【0046】
本発明でいう「Ｎ末端」は、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸鎖のアミノ末端である。
【0047】
本発明でいう「Ｃ末端」は、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸鎖のカルボキシル末端である。
【0048】
本発明でいう「エネルギー供給系」は、加水分解又は酵素分解作用により、ＡＴＰを放出して体外タンパク質の合成にエネルギーを提供する物質の組み合わせである。
【0049】
本発明でいう「ｄＮＴＰ」とは、アデノシントリヌクレオチド（ＡＴＰ）、チミントリヌクレオチド（ＴＴＰ）、グアノシントリヌクレオチド （ＧＴＰ）及びシチジントリヌクレオチド（ＣＴＰ）を含む混合物を指す。
【0050】
現在、具体的な実施形態、実施例及び図１～４を参照して本発明をさらに詳細に説明し、本発明の実施形態は、本発明の要旨がどのようにに実現されるかを具体的に説明するためのわずかな例を用いて説明したものであり、本発明を何ら限定するものではない。下記の実施例において、使用された実験試薬が説明されず、いずれも従来の市販由来のものである。
【0051】
ポリペプチドタグのスクリーニング
発明者は大量の実験設計及び実験検証により、タグとして、体外タンパク質の合成効率の向上に有利なポリペプチドをスクリーニングし、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６（配列番号３７）であり、
ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられるものである。
発明者は大量の実験設計及び実験検証により、タグとして、体外タンパク質の合成効率の向上に有利なポリペプチドをスクリーニングし、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、
Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６（配列番号３７）であり、
ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられるものである。
【0052】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ１はＶであるか又は存在しない。
【0053】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ２はＳであるか又は存在しない。
【0054】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ３はＥであるか又は存在しない。
【0055】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ４はＹであるか又は存在しない。
【0056】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ５はＥ又はＧであるか又は存在しない。
【0057】
好ましくは、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列の一般式における前記Ｘａａ６はＰ又はＫであるか又は存在しない。
【0058】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない。
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない。
【0059】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない。
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない。
【0060】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない。
前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない。
【0061】
好ましくは、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２Ｘａａ３はＳＥであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＫである。
【0062】
好ましくは、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＰ又はＹＧＫである。
【0063】
好ましくは、前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであり、Ｘａａ６は存在しない。
【0064】
好ましくは、前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ５Ｘａａ６はＥＰ又はＧＫである。
【0065】
好ましくは、前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６のうちの少なくとも３つは存在しないものではなく、さらに好ましくは、Ｘａａ２Ｘａａ３及びＸａａ４は存在しないものではなく、あるいは、Ｘａａ３とＸａａ４Ｘａａ５は存在しないものではない。
【0066】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＰである。
【0067】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＧであり、Ｘａａ６はＫである。
【0068】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0069】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６は存在しない。
【0070】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0071】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない。
【0072】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３は存在しなく、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである。
【0073】
他の実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない。
【0074】
ポリペプチド融合タンパク質のプラスミドの構築及び配列決定同定
一対のプライマーを用いて、スクリーニングされたポリペプチドタグのコード配列を、シームレスクローニング方法により、ｐＤ２Ｐプラスミドの標的タンパク質Ｎ末端のコード配列位置に融合した。このように発現された融合タンパク質において、ポリペプチドタグのＣ末端と標的タンパク質のＮ末端とはペプチド結合で接続された。例えば、ポリペプチドタグをコードする遺伝子配列が、ｐＤ２Ｐ－ｅＧＦＰプラスミド（ｅＧＦＰをコードする遺伝子配列が導入されたｐＤ２Ｐプラスミド）のｅＧＦＰのＮ末端遺伝子配列の位置に接続された。具体的には、一連のポリペプチド融合タンパク質をコードする遺伝子配列が含まれたプラスミドを構築し、例えば、番号がｐＤ２Ｐ－１．０７－００１のプラスミドを構築した。
一対のプライマーを用いて、スクリーニングされたポリペプチドタグのコード配列を、シームレスクローニング方法により、ｐＤ２Ｐプラスミドの標的タンパク質Ｎ末端のコード配列位置に融合した。このように発現された融合タンパク質において、ポリペプチドタグのＣ末端と標的タンパク質のＮ末端とはペプチド結合で接続された。例えば、ポリペプチドタグをコードする遺伝子配列が、ｐＤ２Ｐ－ｅＧＦＰプラスミド（ｅＧＦＰをコードする遺伝子配列が導入されたｐＤ２Ｐプラスミド）のｅＧＦＰのＮ末端遺伝子配列の位置に接続された。具体的には、一連のポリペプチド融合タンパク質をコードする遺伝子配列が含まれたプラスミドを構築し、例えば、番号がｐＤ２Ｐ－１．０７－００１のプラスミドを構築した。
【0075】
前記ｐＤ２Ｐプラスミドの基本的な構造は、中国特許出願文献ＣＮ２０１９１０４６０９８７．８の明細書図面を参照することができる。
【0076】
採用されたクローニング技術に基づいてプライマー対を設計し、それぞれ上記一連のポ
リペプチド融合タンパク質を含むプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、且つ増幅生成物５μＬを取って１％アガロース電気泳動同定を行い、ＤｐｎＩ ５μＬを増幅生成物１０μＬに加え、３７℃で６ｈインキュベートし、ＤｐｎＩ処理後の生成物を含む遠心チューブにＤＨ５αコンピテント細胞５０μＬを加え、軽く均一に混合し、氷上で３０ｍｉｎ放置した後、４２℃で４５ｓヒートショックし、直ちに、氷上に３ｍｉｎ放置し、遠心チューブにＬＢ液体培地７００μＬを加えた。遠心チューブを３７℃のクレードルに放置して１ｈ振動培養した後、培養液２００μＬを取って１００ｍｍｏｌ／Ｌのアンピシリンを含む固体ＬＢ培地に塗布し、３７℃で１４～１６ｈ培養した。その後、白色のコロニーを選択して配列決定を行い、遺伝子配列決定が正しいことを確認した後、プラスミドを抽出して－２０℃に保存した。
リペプチド融合タンパク質を含むプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、且つ増幅生成物５μＬを取って１％アガロース電気泳動同定を行い、ＤｐｎＩ ５μＬを増幅生成物１０μＬに加え、３７℃で６ｈインキュベートし、ＤｐｎＩ処理後の生成物を含む遠心チューブにＤＨ５αコンピテント細胞５０μＬを加え、軽く均一に混合し、氷上で３０ｍｉｎ放置した後、４２℃で４５ｓヒートショックし、直ちに、氷上に３ｍｉｎ放置し、遠心チューブにＬＢ液体培地７００μＬを加えた。遠心チューブを３７℃のクレードルに放置して１ｈ振動培養した後、培養液２００μＬを取って１００ｍｍｏｌ／Ｌのアンピシリンを含む固体ＬＢ培地に塗布し、３７℃で１４～１６ｈ培養した。その後、白色のコロニーを選択して配列決定を行い、遺伝子配列決定が正しいことを確認した後、プラスミドを抽出して－２０℃に保存した。
【0077】
体外無細胞タンパク質合成系
１つの実施形態として、体外無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出物と、ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡとを含む。
１つの実施形態として、体外無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出物と、ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡとを含む。
【0078】
１つの実施形態として、体外無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出物と、ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡと、アミノ酸混合物、ｄＮＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼのうちの１種又は複数と、を含む。
【0079】
１つの実施形態として、体外無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出物と、ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡと、アミノ酸混合物、ｄＮＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、エネルギー供給系、ポリエチレングリコール及び水性溶媒のうちの１種又は複数と、を含む。
【0080】
１つの実施形態として、体外無細胞タンパク質合成反応系は、下記のとおりである。最終濃度が９．７８ｍＭでｐＨが８．０であるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、酢酸カリウム８０ｍＭ、マグネシウムイオン５．６ｍＭ、ヌクレオシド三リン酸混合物１．５ｍＭ（ｄＮＴＰ、アデニンヌクレオシド三リン酸と、グアニンヌクレオシド三リン酸と、シトシンヌクレオシド三リン酸と、ウラシルヌクレオシド三リン酸と、を含み、各ヌクレオシド三リン酸の濃度はいずれも１．５ｍＭである）、アミノ酸混合物（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンの濃度は、それぞれ０．７ｍＭである）０．７ｍＭ、ジチオスレイトール１．７ｍＭ、ポリエチレングリコール、エネルギー供給系、リン酸三カリウム２４ｍＭ、５０体積％細胞抽出物、０．３３μｇ／μＬのＤＮＡテンプレートである。
【0081】
１つの実施形態として、前記マグネシウムイオン由来のマグネシウム塩は、グルタミン酸マグネシウム、酢酸マグネシウムのいずれかの１つ又はそれらの組み合わせから選択される。
【0082】
１つの実施形態として、アミノ酸混合物は、２０種類の天然アミノ酸と、他の非天然アミノ酸とを含む。
【0083】
１つの実施形態として、ポリエチレングリコールの分子量は、２００～１２０００Ｄａであり、好ましくは、４００、６００、８００、２０００、４０００、８０００Ｄａである。重量平均分子量で計算する。
【0084】
１つの実施形態として、前記エネルギー供給体系は、グルコース、マルトース、トレハロース、マルトデキストリン、でんぷんデキストリン、クレアチンリン酸及びリン酸キナ
ーゼのいずれかの１つ又はそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、マルトデキストリン３２０ｍＭ、６％トレハロースである。
ーゼのいずれかの１つ又はそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、マルトデキストリン３２０ｍＭ、６％トレハロースである。
【0085】
１つの実施形態として、前記細胞抽出物は、真核細胞、酵母細胞、クルイベロミセス細胞から選択され、好ましくは、クルイベロミセス・ラクティス細胞である。より好ましくは、ゲノムにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが組み込まれたクルイベロミセス・ラクティス細胞であり、又はプラスミドにＴ７ＲＮＡポリメラーゼが導入されたクルイベロミセス・ラクティス細胞である。
【0086】
別の実施形態として、前記細胞抽出物は、人工的に育種された高収量タンパク質のクルイベロミセス・ラクティス細胞から選択される。具体的には、ゲノムにＤＮＡポリメラーゼが組み込まれて発見されたクルイベロミセス・ラクティス細胞であり、より好ましくは、ゲノムにｐｈｉ２９ポリメラーゼが組み込まれて発現されたクルイベロミセス・ラクティス細胞である。
【0087】
１つの実施形態として、前記ＤＮＡテンプレートは、ポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡであり、ポリペプチド融合蛍光タンパク質、ポリペプチド融合ホタルルシフェラーゼを含み、好ましくは、ポリペプチド融合強化型蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするＤＮＡである。
【0088】
実施例１ ポリペプチドタグ配列の同定
１．１ ポリペプチドタグのアミノ酸配列の由来及び同定は、既に開示された文献で報告され、研究者は実験により、ドナリエラ炭酸脱水酵素（ｄｃａ）Ｎ末端ハーフドメイン内の最初の１１個のアミノ酸残基（ＮＴ１１のアミノ酸配列は配列番号１８を参照し、そのＤＮＡ配列は配列番号９を参照する）が外来タンパク質のＮ末端に接続されて融合発現を行うことは、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞においてＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）等のタンパク質翻訳レベルを向上させる（Ｔｈｉ Ｋｈｏａ Ｍｙ Ｎｇｕｙｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＮＴ１１， ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ２０１９；１０３（５）： ２２０５－２２１６．）。本実施例は、ＮＴ１１のアミノ酸配列に対して部分サイトの削除又はランダムな点突然変異を行うことにより、さらに実験によって外来タンパク質発現に顕著な向上効果を有するアミノ酸配列をスクリーニングした。
１．１ ポリペプチドタグのアミノ酸配列の由来及び同定は、既に開示された文献で報告され、研究者は実験により、ドナリエラ炭酸脱水酵素（ｄｃａ）Ｎ末端ハーフドメイン内の最初の１１個のアミノ酸残基（ＮＴ１１のアミノ酸配列は配列番号１８を参照し、そのＤＮＡ配列は配列番号９を参照する）が外来タンパク質のＮ末端に接続されて融合発現を行うことは、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞においてＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）等のタンパク質翻訳レベルを向上させる（Ｔｈｉ Ｋｈｏａ Ｍｙ Ｎｇｕｙｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＮＴ１１， ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ２０１９；１０３（５）： ２２０５－２２１６．）。本実施例は、ＮＴ１１のアミノ酸配列に対して部分サイトの削除又はランダムな点突然変異を行うことにより、さらに実験によって外来タンパク質発現に顕著な向上効果を有するアミノ酸配列をスクリーニングした。
【0089】
具体的には、ＮＴ１１（ＰＣ）のアミノ酸配列に対して段階的な削除又はランダムな点突然変異を行って、一連の異なるアミノ酸配列を取得し、且つコドン最適化によって対応するヌクレオチド配列を取得し、アミノ酸及びヌクレオチド配列に対して番号付けを行い、取得された部分配列は表１及び配列表の配列番号１～１８を参照する。
【0090】
【表1】
【0091】
好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＰであり、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１０である。
【0092】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＧであり、Ｘａａ６はＫであり、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１１である。
【0093】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫであり、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号３であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１２である。
【0094】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６は存在しなく、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号４であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１３である。
【0095】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫであり、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号５であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１４である。
【0096】
他の好ましい実施形態として、記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しなく、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号６であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１５である。
【0097】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３は存在しなく、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫであり、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号７であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１６である。
【0098】
他の好ましい実施形態として、前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しなく、ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号８であり、アミノ酸配列は、例えば、配列番号１７である。
【0099】
以上の８種類の新たに得られたポリペプチドタグは本発明により提供される一部の好ましい例に過ぎず、本発明の実施形態は上記好ましい例を含むがこれらに限定されない。
【0100】
実施例２ Ｎ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰのプラスミド構築
プラスミドの構築は、一対のプライマーを用い、シームレスクローニング方法を利用してポリペプチドタグのコード遺伝子をｐＤ２Ｐ－ｅＧＦＰプラスミドにおけるｅＧＦＰのＮ末端コード配列位置に接続され、その遺伝子構造は図１を参照する。ただし、９つのプラスミドの名称は、それぞれ、ｐＤ２Ｐ－１．０７－（００１～００８）及びＰＣである（表１参照）。前記９つのプラスミドの増幅プライマー配列は順に、配列番号１９～３６である。
プラスミドの構築は、一対のプライマーを用い、シームレスクローニング方法を利用してポリペプチドタグのコード遺伝子をｐＤ２Ｐ－ｅＧＦＰプラスミドにおけるｅＧＦＰのＮ末端コード配列位置に接続され、その遺伝子構造は図１を参照する。ただし、９つのプラスミドの名称は、それぞれ、ｐＤ２Ｐ－１．０７－（００１～００８）及びＰＣである（表１参照）。前記９つのプラスミドの増幅プライマー配列は順に、配列番号１９～３６である。
【0101】
具体的な構築プロセスは、下記のとおりである。
【0102】
クローニング技術に基づいて一対のプライマーを設計し（表２を参照し、ただし、尾部がＰＦであるのはフォワードプライマーに対応し、尾部がＰＲであるのはリバースプライマーに対応し、それぞれ上記９つのプラスミドｐＤ２Ｐ－１．０７－（００１～００８）とＰＣをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、増幅生成物５μＬを取って１％アガロース電気泳動同定を行い、ＤｐｎＩ５μＬを増幅生成物１０μＬに加え、３７℃で６ｈインキュベートし、ＤｐｎＩ処理後の生成物を含む遠心チューブにＤＨ５αコンピテント細胞５０μＬを加え、軽く均一に混合し、氷上で３０ｍｉｎ放置した後、４２℃で４５ｓヒートショックし、直ちに、氷上に３ｍｉｎ放置し、遠心チューブにＬＢ液体培地７００μＬを加えた。遠心チューブを３７℃のクレードルに放置して１ｈ振動培養した後、培養液２００μＬを取って１００ｍｍｏｌ／Ｌのアンピシリンを含む固体ＬＢ培地に塗布し、３７℃で１４～１６ｈ培養した。その後、白色のコロニーを選択して配列決定同定を行い、遺伝子配列決定が正しいことが確認された後、相応するコロニーのプラスミドを抽出して－２０℃に保存した。
【0103】
【表2】
【0104】
実施例３～５ 体外タンパク質合成における、ポリペプチドタグのコード遺伝子、Ｎ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰのコード遺伝子、及び系のＤＮＡテンプレートに上記コード遺伝子が含まれる体外無細胞タンパク質合成体系の応用
Ｓ１：ＤＮＡ増幅は、構築されたプラスミドをＤＮＡテンプレートとして増幅し、増幅体系は、下記のとおりである。最終濃度１～５ｍＭのランダムプライマー（ＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号３８）、７つの塩基からランダムに構成されることを示す）、上記プラスミドテンプレート１．１４ｎｇ／μＬ、ｄＮＴＰ０．５～１ｍＭ、ＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬ、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬ、１×ｐｈｉ２９反応緩衝液（成分がＴｒｉｓ－ＨＣｌ ２００ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｍＭ、ＫＣｌ １０ｍＭであり、ｐＨが７．５である）。上記反応系を均一に混合した後、３０℃の環境に放置されて３ｈ反応させた。反応終了後、紫外分光光度計にてＤＮＡ濃度を測定した。
Ｓ１：ＤＮＡ増幅は、構築されたプラスミドをＤＮＡテンプレートとして増幅し、増幅体系は、下記のとおりである。最終濃度１～５ｍＭのランダムプライマー（ＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号３８）、７つの塩基からランダムに構成されることを示す）、上記プラスミドテンプレート１．１４ｎｇ／μＬ、ｄＮＴＰ０．５～１ｍＭ、ＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬ、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ０．０５～０．１ｍｇ／ｍＬ、１×ｐｈｉ２９反応緩衝液（成分がＴｒｉｓ－ＨＣｌ ２００ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｍＭ、ＫＣｌ １０ｍＭであり、ｐＨが７．５である）。上記反応系を均一に混合した後、３０℃の環境に放置されて３ｈ反応させた。反応終了後、紫外分光光度計にてＤＮＡ濃度を測定した。
【0105】
実験群（処理方式）は、ＤＮＡテンプレートを加え、前記ＤＮＡテンプレートにはポリペプチドタグ融合強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【0106】
ＢＣ群（処理方式）は、ＢＣ（Ｂｌａｎｋ Ｃｏｎｔｒｏｌ）であって、すなわちブランク対照であり、ＤＮＡテンプレートを加え、前記ＤＮＡテンプレートには、ポリペプチドタグをコードするヌクレオチド配列が含まれなく、強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【0107】
ＰＣ群（処理方式）は、ＰＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｏｎｔｒｏｌ）であって、すなわち陽性対照であり、ＤＮＡテンプレートを加え、前記ＤＮＡテンプレートには野生型のポリペプチドタグをコードし強化型緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰを融合するヌクレオチド配列が含まれる。
【0108】
ＮＣ群（処理方式）は、ＮＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）であって、すなわち陰性対照であり、外来ＤＮＡテンプレートが添加されない。
【0109】
Ｓ２：体外タンパク質合成系においてＮ末端融合ポリペプチドタグを発現するｅＧＦＰ
上記Ｓ１で増幅されたＤＮＡ断片を体外蛋白質合成系に添加した。体外無細胞タンパク質合成反応系は、下記のとおりである。最終濃度が９．７８ｍＭでｐＨが８．０のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、酢酸カリウム８０ｍＭ、マグネシウムイオン５．６ｍＭ、ヌクレオシド三リン酸混合物１．５ｍＭ（アデニンヌクレオシド三リン酸と、グアニンヌクレオシド三リン酸と、シトシンヌクレオシド三リン酸と、ウラシルヌクレオシド三リン酸と、を含み、各ヌクレオシド三リン酸の濃度はいずれも１．５ｍＭである）、アミノ酸混合物（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、 チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンの濃度は、それぞれ０．７ｍＭである）０．７ｍＭ、ジチオスレイトール１．７ｍＭ、２％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール８０００、マルトデキストリン３２０ｍＭ、６％トレハロース、リン酸三カリウム２４ｍＭ、５０体積％酵母細胞抽出物、０．３３μｇ／μＬのＤＮＡテンプレートである（上記ＤＮＡ増幅により得られたものである）。
上記Ｓ１で増幅されたＤＮＡ断片を体外蛋白質合成系に添加した。体外無細胞タンパク質合成反応系は、下記のとおりである。最終濃度が９．７８ｍＭでｐＨが８．０のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、酢酸カリウム８０ｍＭ、マグネシウムイオン５．６ｍＭ、ヌクレオシド三リン酸混合物１．５ｍＭ（アデニンヌクレオシド三リン酸と、グアニンヌクレオシド三リン酸と、シトシンヌクレオシド三リン酸と、ウラシルヌクレオシド三リン酸と、を含み、各ヌクレオシド三リン酸の濃度はいずれも１．５ｍＭである）、アミノ酸混合物（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、 チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンの濃度は、それぞれ０．７ｍＭである）０．７ｍＭ、ジチオスレイトール１．７ｍＭ、２％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール８０００、マルトデキストリン３２０ｍＭ、６％トレハロース、リン酸三カリウム２４ｍＭ、５０体積％酵母細胞抽出物、０．３３μｇ／μＬのＤＮＡテンプレートである（上記ＤＮＡ増幅により得られたものである）。
【0110】
３種類の異なる酵母細胞抽出物由来のものを採用し、それぞれ異なる体外タンパク質合成系を構築し、構築されたポリペプチド融合タンパク質が異なる系における効果を検証した。ここで、実施例３で使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４１０２であり、実施例４で使用された細胞抽出物はＹＹ１９０８１９１であり、実施例５で使用された細胞抽出物はＹＹ１９０４２２４であり、いずれもクルイベロミセス・ラクティスＡＴＣＣ８５８５及びその遺伝子組み換えの異なる菌株であり、ＲＮＡポリメラーゼの内因性発現の組み換えを含み、中国特許出願文献ＣＮ２０１７１０７６８５５０．１の調製方法を参照する。
【0111】
上記反応系を３０℃の環境条件に放置し、約２０ｈ静置インキュベートした。反応終了後、直ちにＥｎｖｉｓｉｏｎ２１２０多機能マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に置いて、数値を読み取って、ｅＧＦＰの蛍光信号の強さを検出し、相対蛍光単位値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ、ＲＦＵ）を採用して活性単位とした。
【0112】
実験結果は、下記のとおりである。
【0113】
蛍光光度法の測定結果から分かるように、体外タンパク質合成系において、野生型ポリペプチドタグはタンパク質の発現を強化しなく、逆にタンパク質発現量の減少を引き起こし、図２～４を参照し、ＰＣ群のＲＦＵ値はいずれもＢＣ群より低いものであり、特に図４において抑制効果が非常に顕著である。これは野生型ポリペプチドタグの大腸菌細胞内における促進効果と逆である。
【0114】
発明者がスクリーニングしたポリペプチドタグを使用すれば、いずれもｅＧＦＰの体外発現に促進効果を有した。蛍光光度法の測定結果から分かるように、体外タンパク質合成系に発現された複数のＮ末端融合ポリペプチドタグのｅＧＦＰは、そのＲＦＵ値がいずれも向上され、本発明のポリペプチドタグによりｅＧＦＰの発現量が向上されたことが説明され、図２～４に示すことを参照する。
【0115】
実施例３について、その結果は図２を参照し、異なる実験群はいずれも空白対照群を超え、特にｐＤ２Ｐ－１．０７－００３（２０時間反応した後にＲＦＵ値が７３６１に達した）は、ポリペプチドタグ関連配列が導入されなかった空白対照（ＲＦＵ値が５１８９である）に比べ、ＲＦＵが４１．８６％向上された。
【0116】
実施例４から分かるように、異なる実験群はいずれも空白対照群を超え、図３を参照すれば、ここで、ｐＤ２Ｐ－１．０７－００３、ｐＤ２Ｐ－１．０７－００４、ｐＤ２Ｐ－１．０７－００６及びｐＤ２Ｐ－１．０７－００８を含む４つの実験群の効果が顕著であり、特にｐＤ２Ｐ－１．０７－００８は２０時間反応した後にＲＦＵ値が５５３２に達し、ポリペプチドタグ関連配列が導入されなかった空白対照（ＲＦＵ値が３３３４である）に比べ、ＲＦＵが６５．９３％向上された。
【0117】
実施例５において、異なる実験群はいずれも空白対照群を超え、図４を参照すれば、２０時間反応した後、実験群ｐＤ２Ｐ－１．０７－００２で測定されたＲＦＵ値は３５８０であり、ポリペプチドタグ関連配列が導入されなかった空白対照（ＲＦＵ値が２６５４である）に比べ、実験群のＲＦＵが３４．８９％向上された。
【0118】
上記実施例の実験結果により、本発明のポリペプチドタグ、特に標的タンパク質Ｎ末端に融合されたポリペプチドタグ配列を導入することにより、体外無細胞タンパク質合成系を用いて構築されたポリペプチド融合タンパク質を合成し、標的タンパク質の翻訳効率と生産量を向上させることができ、体外タンパク質合成系の利用可能性を大幅に向上させた。
【0119】
本発明に言及された全ての文献は、本出願において参考として引用され、各文献が単独で参考として引用されているようである。その他、理解すべきものとして、本発明の上記内容を読んだ後、当業者は本発明に対して様々な変更又は修正を行うことができ、これらの等価形式は本願の添付の特許請求の範囲に限定される範囲に属する。
本発明は以下の態様を含む。
＜１＞
ポリペプチドタグであって、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６であり、
ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられることを特徴とするポリペプチドタグ。
＜２＞
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜３＞
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜４＞
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜５＞
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜６＞
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２Ｘａａ３はＳＥであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜７＞
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＰ又はＹＧＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜８＞
前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであり、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜９＞
前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ５Ｘａａ６はＥＰ又はＧＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１０＞
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６のうちの少なくとも３つは存在しないものではなく、さらに好ましくは、Ｘａａ２Ｘａａ３及びＸａａ４は存在しないものではなく、あるいは、Ｘａａ３とＸａａ４Ｘａａ５は存在しないものではない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１１＞
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＰである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１２＞
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＧであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１３＞
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１４＞
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１５＞
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１６＞
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１７＞
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３は存在しなく、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１８＞
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１９＞
（１）＜１＞～＜１８＞のいずれか一項に記載のポリペプチドタグと、（２）前記ポリペプチドタグに接続された標的タンパク質との、２つの構造を含む、ことを特徴とするポリペプチド融合タンパク質。
＜２０＞
前記ポリペプチドタグのＣ末端は前記標的タンパク質のＮ末端に接続される、ことを特徴とする＜１９＞に記載のポリペプチド融合タンパク質。
＜２１＞
前記標的タンパク質は、蛍光タンパク質、強化型蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼのうちの１つ又はその組み合わせである、ことを特徴とする＜１９＞又は＜２０＞に記載のポリペプチド融合タンパク質。
＜２２＞
（１）細胞抽出物と、
（２）＜１９＞又は＜２０＞又は＜２１＞に記載のポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡとを含む、ことを特徴とする体外無細胞タンパク質合成系。
＜２３＞
前記細胞抽出物は、酵母細胞抽出物であり、好ましくは、クルイベロミセスラクティス細胞抽出物である、ことを特徴とする＜２２＞に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
＜２４＞
アミノ酸混合物、ｄＮＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼのうちの１種又は複数をさらに含む、ことを特徴とする＜２２＞又は＜２３＞に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
＜２５＞
ＤＮＡポリメラーゼ、エネルギー供給系、ポリエチレングリコール、水性溶媒のうちの１種又は複数をさらに含む、ことを特徴とする＜２２＞又は＜２３＞又は＜２４＞に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
＜２６＞
体外タンパク質合成における、＜１＞～＜１８＞のいずれか一項に記載のポリペプチドタグのコード遺伝子、又は＜１９＞～＜２１＞のいずれか一項に記載のポリペプチド融合タンパク質のコード遺伝子、又は＜２２＞～＜２５＞のいずれか一項に記載の無細胞タンパク質合成系の使用。
本発明は以下の態様を含む。
＜１＞
ポリペプチドタグであって、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６であり、
ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在しなく、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられることを特徴とするポリペプチドタグ。
＜２＞
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜３＞
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜４＞
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜５＞
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１が存在しなく、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しなく、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜６＞
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２Ｘａａ３はＳＥであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜７＞
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであるか又は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＰ又はＹＧＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜８＞
前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、さらに好ましくは、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであり、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜９＞
前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、さらに好ましくは、Ｘａａ５Ｘａａ６はＥＰ又はＧＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１０＞
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６のうちの少なくとも３つは存在しないものではなく、さらに好ましくは、Ｘａａ２Ｘａａ３及びＸａａ４は存在しないものではなく、あるいは、Ｘａａ３とＸａａ４Ｘａａ５は存在しないものではない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１１＞
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＰである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１２＞
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＧであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１３＞
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１４＞
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１５＞
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１６＞
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１７＞
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３は存在しなく、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫである、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１８＞
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない、ことを特徴とする＜１＞に記載のポリペプチドタグ。
＜１９＞
（１）＜１＞～＜１８＞のいずれか一項に記載のポリペプチドタグと、（２）前記ポリペプチドタグに接続された標的タンパク質との、２つの構造を含む、ことを特徴とするポリペプチド融合タンパク質。
＜２０＞
前記ポリペプチドタグのＣ末端は前記標的タンパク質のＮ末端に接続される、ことを特徴とする＜１９＞に記載のポリペプチド融合タンパク質。
＜２１＞
前記標的タンパク質は、蛍光タンパク質、強化型蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼのうちの１つ又はその組み合わせである、ことを特徴とする＜１９＞又は＜２０＞に記載のポリペプチド融合タンパク質。
＜２２＞
（１）細胞抽出物と、
（２）＜１９＞又は＜２０＞又は＜２１＞に記載のポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡとを含む、ことを特徴とする体外無細胞タンパク質合成系。
＜２３＞
前記細胞抽出物は、酵母細胞抽出物であり、好ましくは、クルイベロミセスラクティス細胞抽出物である、ことを特徴とする＜２２＞に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
＜２４＞
アミノ酸混合物、ｄＮＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼのうちの１種又は複数をさらに含む、ことを特徴とする＜２２＞又は＜２３＞に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
＜２５＞
ＤＮＡポリメラーゼ、エネルギー供給系、ポリエチレングリコール、水性溶媒のうちの１種又は複数をさらに含む、ことを特徴とする＜２２＞又は＜２３＞又は＜２４＞に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
＜２６＞
体外タンパク質合成における、＜１＞～＜１８＞のいずれか一項に記載のポリペプチドタグのコード遺伝子、又は＜１９＞～＜２１＞のいずれか一項に記載のポリペプチド融合タンパク質のコード遺伝子、又は＜２２＞～＜２５＞のいずれか一項に記載の無細胞タンパク質合成系の使用。
【0120】
参考文献
１．Ｇａｒｃｉａ ＲＡ， Ｒｉｌｅｙ ＭＲ． Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，； １９８１． ２６３－２６４ ｐ．
２． Ｆｒｏｍｍ ＨＪ， Ｈａｒｇｒｏｖｅ Ｍ． Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１２；
３． Ｋａｔｚｅｎ Ｆ， Ｃｈａｎｇ Ｇ， Ｋｕｄｌｉｃｋｉ Ｗ． Ｔｈｅ ｐａｓｔ， ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５；２３（３）：１５０－６．
４． Ｇａｎ Ｒ， Ｊｅｗｅｔｔ ＭＣ． Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ． ２０１４；９（５）：６４１－５１．
５． Ｌｕ Ｙ． Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ａｎ ｏｐｅｎ ｗｏｒｌｄ． Ｓｙｎｔｈ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７；２（１）：２３－７．
６． Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｄ， Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ＤＫＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ
ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；１７（４）：３５３－３５８．
７．Ｋａｐｕｓｔ ＲＢ， Ｗａｕｇｈ ＤＳ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍａｌｔｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｕｎｃｏｍｍｏｎｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｔ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｗｈｉｃｈ ｉｔ ｉｓ ｆｕｓｅｄ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９９；８（８）：１６６８－１６７４．
８．Ｌｉａｎｇｆａｎ Ｚｈｏｕ， Ｚｈｉｈｕｉ Ｚｈａｏ，Ｂａｏｃｕｎ Ｌｉ，Ｙｕｆｅｎｇ Ｃａｉ，Ｓｈｕａｎｇｑｕａｎ Ｚｈａｎｇ．ＴｒｘＡ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ＣＭ４ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｊｏｉｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２００９；６４（２）：２２５－２３０．
９．Ｋｏｈｌ Ｔ， ｓｃｈｍｉｄｔ Ｃ， Ｗｉｅｍａｎｎ Ｓ， Ｐｏｕｓｔｋａ
Ａ， Ｋｏｒｆ Ｕ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８；
６：４．
１０．Ｈｕ Ｊ， Ｑｉｎ Ｈ， Ｓｈａｒｍａ Ｍ， Ｃｒｏｓｓ ＴＡ， Ｇａｏ
ＦＰ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７７８（４）：１０６０－１０６６．
１１．Ｄａ Ｓｏｌ Ｋｉｍ， Ｓｅｏｎ Ｗｏｏｎｇ Ｋｉｍ， Ｊａｅ Ｍｉｎ Ｓｏｎｇ， Ｓｏｏｎ Ｙｏｕｎｇ Ｋｉｍ＆Ｋｗａｎｇ－Ｃｈｕｌ Ｋｗｏｎ．Ａ ｎｅｗ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｂａｅｃｉｎ ｕｓｉｎｇ ＳＵＭＯ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１９；１９：１３．
１２． Ｔｈｉ Ｋｈｏａ Ｍｙ Ｎｇｕｙｅｎ， Ｍｉ Ｒａｎ Ｋｉ， Ｒｙｅｏ
Ｇａｎｇ Ｓｏｎ， Ｓｅｕｎｇ Ｐｉｌ Ｐａｃｋ１．ｔｈｅ ＮＴ１１， ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２０１９；１０３（５）： ２２０５－２２１６．
１．Ｇａｒｃｉａ ＲＡ， Ｒｉｌｅｙ ＭＲ． Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，； １９８１． ２６３－２６４ ｐ．
２． Ｆｒｏｍｍ ＨＪ， Ｈａｒｇｒｏｖｅ Ｍ． Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１２；
３． Ｋａｔｚｅｎ Ｆ， Ｃｈａｎｇ Ｇ， Ｋｕｄｌｉｃｋｉ Ｗ． Ｔｈｅ ｐａｓｔ， ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５；２３（３）：１５０－６．
４． Ｇａｎ Ｒ， Ｊｅｗｅｔｔ ＭＣ． Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｒｏｍ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ． ２０１４；９（５）：６４１－５１．
５． Ｌｕ Ｙ． Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ａｎ ｏｐｅｎ ｗｏｒｌｄ． Ｓｙｎｔｈ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１７；２（１）：２３－７．
６． Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｄ， Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ＤＫＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ
ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；１７（４）：３５３－３５８．
７．Ｋａｐｕｓｔ ＲＢ， Ｗａｕｇｈ ＤＳ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｍａｌｔｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｕｎｃｏｍｍｏｎｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｔ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｗｈｉｃｈ ｉｔ ｉｓ ｆｕｓｅｄ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９９；８（８）：１６６８－１６７４．
８．Ｌｉａｎｇｆａｎ Ｚｈｏｕ， Ｚｈｉｈｕｉ Ｚｈａｏ，Ｂａｏｃｕｎ Ｌｉ，Ｙｕｆｅｎｇ Ｃａｉ，Ｓｈｕａｎｇｑｕａｎ Ｚｈａｎｇ．ＴｒｘＡ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ＣＭ４ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｊｏｉｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２００９；６４（２）：２２５－２３０．
９．Ｋｏｈｌ Ｔ， ｓｃｈｍｉｄｔ Ｃ， Ｗｉｅｍａｎｎ Ｓ， Ｐｏｕｓｔｋａ
Ａ， Ｋｏｒｆ Ｕ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００８；
６：４．
１０．Ｈｕ Ｊ， Ｑｉｎ Ｈ， Ｓｈａｒｍａ Ｍ， Ｃｒｏｓｓ ＴＡ， Ｇａｏ
ＦＰ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００８；１７７８（４）：１０６０－１０６６．
１１．Ｄａ Ｓｏｌ Ｋｉｍ， Ｓｅｏｎ Ｗｏｏｎｇ Ｋｉｍ， Ｊａｅ Ｍｉｎ Ｓｏｎｇ， Ｓｏｏｎ Ｙｏｕｎｇ Ｋｉｍ＆Ｋｗａｎｇ－Ｃｈｕｌ Ｋｗｏｎ．Ａ ｎｅｗ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｂａｅｃｉｎ ｕｓｉｎｇ ＳＵＭＯ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１９；１９：１３．
１２． Ｔｈｉ Ｋｈｏａ Ｍｙ Ｎｇｕｙｅｎ， Ｍｉ Ｒａｎ Ｋｉ， Ｒｙｅｏ
Ｇａｎｇ Ｓｏｎ， Ｓｅｕｎｇ Ｐｉｌ Ｐａｃｋ１．ｔｈｅ ＮＴ１１， ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２０１９；１０３（５）： ２２０５－２２１６．
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリペプチドタグであって、前記ポリペプチドタグのアミノ酸配列は、Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３ＰＨＤＹＮＸａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６（配列番号３７）であり、ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立してアミノ酸であるか又は存在せず、前記ポリペプチドタグは、標的タンパク質を標識するために用いられることを特徴とするポリペプチドタグ。
【請求項2】
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在しせず、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しないか；又は、
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ６がＰであるか又は存在しないか；又は、
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１がＶであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ５がＧであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ６がＫであるか又は存在しないか；又は、
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６は、それぞれ独立して、
前記Ｘａａ１が存在せず、
前記Ｘａａ２がＳであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ３がＥであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ４がＹであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ５がＥ又はＧであるか又は存在せず、
前記Ｘａａ６がＰ又はＫであるか又は存在しないか；又は、
前記Ｘａａ１は存在せず、Ｘａａ２Ｘａａ３はＳＥであるか又は存在しなか；又は、
前記Ｘａａ１は存在せず、Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであるか又は存在しないか；又は、
前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであるか；又は、
前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、Ｘａａ４は存在しないか；又は、
前記Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５、Ｘａａ６のうちの少なくとも３つは存在しないものではないか；又は、
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＰであるか；又は、
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＧであり、Ｘａａ６はＫであるか；又は、
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫであるか；又は、
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６は存在しないか；又は、
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫであるか；又は、
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しないか；又は、
前記Ｘａａ１は存在しなく、Ｘａａ２は存在しなく、Ｘａａ３は存在しなく、Ｘａａ４はＹであり、Ｘａａ５はＥであり、Ｘａａ６はＫであるか；又は、
前記Ｘａａ１はＶであり、Ｘａａ２はＳであり、Ｘａａ３はＥであり、Ｘａａ４は存在しなく、Ｘａａ５は存在しなく、Ｘａａ６は存在しない、
ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドタグ。
【請求項3】
前記Ｘａａ１は存在せず、前記Ｘａａ２Ｘａａ３はＳＥであるか又は存在せず、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＫであるか；又は、
前記Ｘａａ１は存在せず、前記Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ若しくはＹＧであるか又は存在せず、Ｘａａ４Ｘａａ５Ｘａａ６はＹＥＰ又はＹＧＫであるか；又は、
前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、前記Ｘａａ４Ｘａａ５はＹＥ又はＹＧであり、前記Ｘａａ６は存在しないか；又は、
前記Ｘａａ１Ｘａａ２Ｘａａ３はＶＳＥであり、前記Ｘａａ４は存在せず、前記Ｘａａ５Ｘａａ６はＥＰ又はＧＫであるか；又は、
前記Ｘａａ１、前記Ｘａａ２、前記Ｘａａ３、前記Ｘａａ４、前記Ｘａａ５、及び前記Ｘａａ６のうちの少なくとも３つは存在しないか、前記Ｘａａ２Ｘａａ３及び前記Ｘａａ４は存在しないか、又は、前記Ｘａａ３及び前記Ｘａａ４Ｘａａ５は存在しない、
ことを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチドタグ。
【請求項4】
（１）請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリペプチドタグと、（２）前記ポリペプチドタグに接続された標的タンパク質との、２つの構造を含む、ことを特徴とするポリペプチド融合タンパク質。
【請求項5】
前記ポリペプチドタグのＣ末端は前記標的タンパク質のＮ末端に接続される、ことを特徴とする請求項４に記載のポリペプチド融合タンパク質。
【請求項6】
前記標的タンパク質は、蛍光タンパク質、強化型蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼのうちの１つ又はその組み合わせである、ことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のポリペプチド融合タンパク質。
【請求項7】
（１）細胞抽出物と、（２）請求項４～請求項６のいずれか一項に記載のポリペプチド融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡとを含む、ことを特徴とする体外無細胞タンパク質合成系。
【請求項8】
前記細胞抽出物は、酵母細胞抽出物であり、好ましくは、クルイベロミセスラクティス細胞抽出物である、ことを特徴とする請求項７に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
【請求項9】
アミノ酸混合物、ｄＮＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼのうちの１種又は複数をさらに含む、ことを特徴とする請求項７に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
【請求項10】
ＤＮＡポリメラーゼ、エネルギー供給系、ポリエチレングリコール、水性溶媒のうちの１種又は複数をさらに含む、ことを特徴とする請求項７～請求項９のいずれか一項に記載の体外無細胞タンパク質合成系。
【請求項11】
体外タンパク質合成における、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリペプチドタグのコード遺伝子、又は請求項４～請求項６のいずれか一項に記載のポリペプチド融合タンパク質のコード遺伝子、又は請求項７～請求項１０のいずれか一項に記載の無細胞タンパク質合成系の使用。
【国際調査報告】