▶ ナンジンジンスールイ サイエンス アンド テクノロジー バイオロジー コーポレイションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-09
(54)【発明の名称】遺伝子変異ライブラリーを構築する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230302BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20230302BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230302BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230302BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20230302BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230302BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230302BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C40B40/06
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6876 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022539638
(86)(22)【出願日】2020-12-28
(85)【翻訳文提出日】2022-06-27
(86)【国際出願番号】 CN2020140247
(87)【国際公開番号】W WO2021136194
(87)【国際公開日】2021-07-08
(31)【優先権主張番号】201911389782.1
(32)【優先日】2019-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519241381
【氏名又は名称】ナンジン、ジェンスクリプト、バイオテック、カンパニー、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＪＩＮＧ ＧＥＮＳＣＲＩＰＴ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ダイ，シャオフイ
(72)【発明者】
【氏名】リー，イーファン
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ジョンシェン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR14
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX02
4B065AA26X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA46
(57)【要約】
遺伝子変異ライブラリーを構築するための方法であって、該方法によって得られた遺伝子変異ライブラリーにも関連する、方法、遺伝子変異ライブラリーを構築するための方法のためのキット、並びにタンパク質中のアミノ酸変異とタンパク質の特性、調節及び／又は機能との間の関係を該方法によって構築された遺伝子変異ライブラリーを用いて分析するための方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子変異ライブラリーを構築するための方法であって、（１）１つ以上の変異部位で変異体ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列のプールを合成するステップと；
（２）前記変異体ヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチド配列の前記合成されたプール中の前記オリゴヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅を実施するステップと；
（３）鋳型としてメチル化部位及び変異されるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミドを使用し、且つプライマーとしてステップ（２）において得られた前記増幅されたオリゴヌクレオチド配列の前記プール中の前記オリゴヌクレオチドを使用することにより、ＰＣＲ増幅を実施するステップと；
（４）前記メチル化部位を認識し、且つ切断するエンドヌクレアーゼを使用し、ステップ（３）の前記増幅系において存在している前記鋳型プラスミドを切断するステップと；
（５）変異されるべき前記遺伝子又はその前記一部の両末端に対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーの各々をステップ（４）において得られた前記系に添加し、且つＰＣＲ増幅を実施し、前記変異体ヌクレオチドを有する複数の遺伝子又はそれらの一部を含む前記遺伝子変異ライブラリーを得るステップと、
を含む方法。
【請求項2】
精製は、ステップ（１）～（５）中に実施されない、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（６）ステップ（５）の増幅産物を回収及び精製し、最終産物を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
（７）ステップ（６）において得られた前記最終産物を配列決定し、配列を検証し、且つ／又は遺伝子変異分布を検出するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記配列決定は、サンガー配列決定及び／又はハイスループット配列決定である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ステップ（１）において合成された前記オリゴヌクレオチド配列の前記プール中の前記オリゴヌクレオチド配列の長さは、６０～１７０ｂｐ、好ましくは８０～９０ｂｐである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ステップ（１）において合成された前記オリゴヌクレオチド配列の前記プールは、１～１０の変異部位に変異体ヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記変異部位は、隣接するか又は非隣接であるかのいずれかである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記変異体ヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、変異されるべき前記遺伝子によってコードされる前記アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の差異を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記少なくとも１つのアミノ酸の差異は、置換、付加又は欠失から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記少なくとも１つのアミノ酸の差異は、置換である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記置換は、前記元のアミノ酸を前記元のアミノ酸と異なる特性を有するアミノ酸と置換することである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記特性は、酸性度及びアルカリ度、極性、荷電特性及び側鎖基から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
１つ以上の変異部位で前記変異体ヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチド配列の両末端に対応する２つのプライマーの各々は、ステップ（２）における前記ＰＣＲ増幅において使用される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ステップ（２）における前記ＰＣＲ増幅のサイクルの数は、１０～２５サイクル、好ましくは１２～２２サイクル、１４～２０サイクル、１５～１８サイクル又は１５～１６サイクル、及び最も好ましくは１６サイクルである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ステップ（２）における前記ＰＣＲ増幅において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、高フィデリティＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ステップ（３）における前記プライマー対前記鋳型のモル比は、１５：１～５０：１、好ましくは１６：１～４０：１、１７：１～３０：１、１８：１～２５：１、又は１９：１～２２：１、より好ましくは１９：１～２１：１、及び最も好ましくは２０：１である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
ステップ（３）における前記ＰＣＲ増幅のサイクルの数は、１０～２０サイクル、好ましくは１２～１８サイクル、１４～１６サイクル、及び最も好ましくは１５サイクルである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ステップ（３）における前記ＰＣＲ増幅において使用される前記ＤＮＡポリメラーゼは、高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは高フィデリティＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記プラスミドは、前記プラスミドをメチル化する細菌、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０株から抽出される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ステップ（４）における前記エンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩ、ＭｓｐＪＩ又はＦｓｐＥＩである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法を用いて構築される遺伝子変異ライブラリー。
【請求項23】
請求項１～２１のいずれか一項に記載の遺伝子変異ライブラリーを構築するための方法のためのキットであって、１つ以上の変異部位で変異体ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列のプール、メチル化部位及び変異されるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミド、並びに前記メチル化部位を認識及び切断するエンドヌクレアーゼを含むキット。
【請求項24】
ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項25】
タンパク質中のアミノ酸変異と前記タンパク質の特性、調節及び／又は機能との間の関係を分析するための方法であって、
（１）請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異ライブラリーを構築するステップと；
（２）前記遺伝子変異ライブラリーにおける変異遺伝子によってコードされる前記タンパク質の特性、調節及び／又は機能を、非変異タンパク質の特性、調節及び／又は機能と比較するステップと；
（３）前記変異位置の前記アミノ酸と前記タンパク質の特性、調節及び／又は機能との間の関係を分析するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属する。具体的には、本発明は、遺伝子変異ライブラリーの構築の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子変異ライブラリーは大量のＤＮＡバリアント配列の組み合わせであり、遺伝子合成、遺伝子変異及び指向性進化試験の組み合わせの産物である。遺伝子変異ライブラリーは、ハイスループット薬物標的スクリーニング、タンパク質エンジニアリングによる指向性進化、高い親和性及び特異性を有するバリアント抗体をスクリーニングするための多様性抗体ライブラリーの合成などの研究分野においてますます使用されている。遺伝子変異ライブラリーの構築は、分子指向性進化を使用して自然選択プロセスをシミュレートし、それにより元のタンパク質のアミノ酸配列を変化させ、特異的機能を有する変異タンパク質を得ることを含む。
【0003】
分子指向性進化は、現代の分子生物学法を使用して大量の変異相同遺伝子を含むライブラリーを作出して自然進化機序を人工的にシミュレートし、高感度指向性スクリーニング方針を使用して天然に存在しないか、又はある特性の有意な変化を有する変異タンパク質又は他の生体分子を作出することを含む。分子指向性進化はタンパク質の分子改変において広く使用されており、タンパク質特性を改善するか、又は配列を調節する最も効率的な方法であるとみなされる。
【0004】
遺伝子変異ライブラリーを使用してタンパク質中の特異的部位又はＤＮＡ中の調節領域を変更することができ、それを使用して構造と機能との間の関係を試験することができる。異なる設計目的によれば、試験配列の多様性をインビトロ合成ライブラリーにおいてより正確に、且つ意図的に制御することができる。さらに、核酸又はタンパク質変異体を得ることの効率は合成ＤＮＡライブラリーにより有意に改善することができ、それは下流研究に有用である。
【0005】
遺伝子変異ライブラリーは、アラニンスキャニングライブラリー、縮重変異ライブラリー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ）、トリマーライブラリー（ｔｒｉｍｅｒ ｌｉｂｒａｒｙ）、部位特異的飽和変異ライブラリー、ランダム変異ライブラリーなどを含む。
【0006】
インビトロ分子最適化を有意に有効に使用して改善された又は新規の変異タンパク質を生成し、調節配列を同定し、構造及び機能に重要な残基を探索することができる。インビトロ分子最適化の方法を使用する合成ライブラリーの構築は、タンパク質の特性、調節及び機能を体系的に研究するための極めて有効な手法である。
【0007】
ハイスループット半導体精密プライマープールを使用して変異ライブラリーの構築に理論的に要求される全てのプライマーを合成することにより、異なる下流発現系によれば、コドン最適化を実施することができ、それぞれの変異位置における異なる変異分布率を、予期されない終止コドンの導入という問題を根本的に排除するように設定することができる。ライブラリーは、後続のスクリーニングのための時間及び労力を節約するために、要求される変異体のみを含有する。
【0008】
しかしながら、現在の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法は複雑なステップを有し、時間消費及び労働集約型である。既存の方法は、チップにより合成された変異領域をＰ
ＣＲによりさらに増幅し、次いで変異させるべき遺伝子を鋳型として使用することにより変異領域の前後の２つの非変異領域を増幅し、次いでアセンブリＰＣＲにより３つの断片を１つの断片にアセンブルし、最後に、アセンブリ産物を鋳型として使用し、遺伝子についてのヘッド及びテールプライマーを使用することによりアセンブルされた全長断片を増幅することを含む。さらに、それぞれのステップ後に精製を実施しなければならない。
ＣＲによりさらに増幅し、次いで変異させるべき遺伝子を鋳型として使用することにより変異領域の前後の２つの非変異領域を増幅し、次いでアセンブリＰＣＲにより３つの断片を１つの断片にアセンブルし、最後に、アセンブリ産物を鋳型として使用し、遺伝子についてのヘッド及びテールプライマーを使用することによりアセンブルされた全長断片を増幅することを含む。さらに、それぞれのステップ後に精製を実施しなければならない。
【0009】
本発明は、比較的簡易なステップを介して遺伝子変異ライブラリーの構築を完了させ得、遺伝子変異ライブラリーの構築のためのコストを大幅に節約する、遺伝子変異ライブラリーを構築する方法を記載する。
【0010】
さらに、現在の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法により生成される遺伝子変異ライブラリーは、変異分布が予測に合致しない課題も有する。
【0011】
本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法は、得られる遺伝子変異ライブラリー中の種々の変異を含む配列の比が、反応条件を簡易に最適化することにより要求される比により類似し得ることも実現し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
遺伝子変異ライブラリーは、タンパク質エンジニアリング及び抗体薬物エンジニアリングに極めて重要である。遺伝子変異ライブラリーの後続の構築及びスクリーニングのための多くの時間及び労力を、ハイスループット半導体精密プライマープールを使用する合成により節約することができる。しかしながら、現在の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法は、複雑なステップを有する。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、比較的簡易なステップを介して遺伝子変異ライブラリーの構築を完了させ得、遺伝子変異ライブラリーの複雑な構築ステップの課題を解決し、同時に遺伝子変異ライブラリーを構築するためのコストを節約する、新たな遺伝子変異ライブラリーを構築する方法を提供する。
【0014】
第１の態様において、本発明は、遺伝子変異ライブラリーを構築する方法であって、
（１）１つ以上の変異部位における変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列のプールを合成すること；
（２）変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列の合成プール中のオリゴヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅を実施すること；
（３）メチル化部位及び変異させるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミドを鋳型として使用し、ステップ（２）において得られた増幅オリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することによりＰＣＲ増幅を実施すること；
（４）メチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼを使用してステップ（３）の増幅系中に存在する鋳型プラスミドを切断させること；並びに
（５）変異させるべき遺伝子又はその一部の両末端にそれぞれ対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーをステップ（４）において得られた系に添加し、ＰＣＲ増幅を実施して変異ヌクレオチドを含有する複数の遺伝子又はその一部を含む遺伝子変異ライブラリーを得ること
を含む方法を提供する。
（１）１つ以上の変異部位における変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列のプールを合成すること；
（２）変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列の合成プール中のオリゴヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅を実施すること；
（３）メチル化部位及び変異させるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミドを鋳型として使用し、ステップ（２）において得られた増幅オリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することによりＰＣＲ増幅を実施すること；
（４）メチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼを使用してステップ（３）の増幅系中に存在する鋳型プラスミドを切断させること；並びに
（５）変異させるべき遺伝子又はその一部の両末端にそれぞれ対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーをステップ（４）において得られた系に添加し、ＰＣＲ増幅を実施して変異ヌクレオチドを含有する複数の遺伝子又はその一部を含む遺伝子変異ライブラリーを得ること
を含む方法を提供する。
【0015】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（１）～ステップ（５）の間に精製ステップを実施しない。
【0016】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法は、（６）ステップ（５）の増幅産物を回収し、精製して最終産物を得ることをさらに含む。一部の実施形態において、ステップ（６）は、ステップ（５）の増幅産物に対してアガロースゲル電気泳動を実施し、次いでゲル切断を実施し、好ましくは、回収及び精製のためのＤＮＡゲル回収キットを使用して増幅産物を回収し、精製することを含む。
【0017】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法は、（６）ステップ（５）の増幅産物を回収し、精製して最終産物を得ること；並びに（７）ステップ（６）において得られた最終産物を配列決定して配列を検証し、及び／又は遺伝子変異分布を検出することをさらに含む。一部の実施形態において、配列決定は、サンガー配列決定及び／又はハイスループット配列決定である。
【0018】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（１）において、プール合成されたオリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチド配列の長さは、６０～１７０ｂｐ、例えば、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０又は１７０ｂｐ、好ましくは、８０～９０ｂｐ、例えば、８０又は９０である。
【0019】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（１）において、ステップ（１）において合成されたオリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチドは、１から１０個の変異部位における変異ヌクレオチドを含み、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の変異部位における変異ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（１）において、ステップ（１）において合成されたオリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチドは、２から１０個の変異部位における変異ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、２から１０個の変異部位は、隣接しているか又は隣接していない。
【0020】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法において、変異ヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、変異させるべき遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸差異を有する。一部の実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸差異は、置換、付加又は欠失から選択される。好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸差異は、置換である。一部の実施形態において、置換は、元のアミノ酸を、元のアミノ酸と異なる特性を有するアミノ酸で置換することである。好ましくは、置換は、元のアミノ酸を、元のアミノ酸と異なる特性を有するアミノ酸で置換することであり、特性は、酸度及びアルカリ度、極性、荷電特性及び側鎖基から選択される。アミノ酸の酸度及びアルカリ度によれば、アミノ酸は、酸性アミノ酸（リジン、アルギニン及びヒスチジン）及び塩基性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）に分類される。側鎖の極性によれば、アミノ酸は非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニン）及び極性アミノ酸に分類され、極性アミノ酸は、極性非荷電アミノ酸（グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸及びグルタミン）、極性正荷電アミノ酸（リジン、アルギニン及びヒスチジン）、及び極性負荷電アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）に分類される。側鎖基の構造によれば、アミノ酸は、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、システイン、及びグルタミン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン及びチロシン）、複素環アミノ酸（ヒスチジン及びトリプトファン）、及び複素環イミノ酸（プロリン）に分類される。
【0021】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（１）において、合成オリゴヌクレオチド配列のプール中の異なる変異オリゴヌクレオチドの変異ヌクレオチドは、変異させるべき遺伝子の対応部位のコドンによりコードされるアミノ酸と異なるアミノ酸の変異コドンをコードし得、例えば、変異させるべき遺伝子中の変異させるべき部位がアラニンである場合、合成オリゴヌクレオチド配列のプール中の異なる配列のこの部位におけるヌクレオチドコドンは、異なる一般アミノ酸をコードするコドン、例えば、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジンをコードするコドンであり得る。別の例として、変異遺伝子ライブラリー中の異なる配列中の特異的変異ヌクレオチドコドンは、変異させるべき部位における元のコドンによりコードされるアミノ酸と異なる特性を有するアミノ酸をコードし得る。例えば、変異させるべき遺伝子中の変異させるべき部位が非極性アミノ酸アラニンをコードするコドンである場合、オリゴヌクレオチド配列のプール中の異なるオリゴヌクレオチド配列中の対応する変異部位は、極性アミノ酸をコードするコドン、例えば、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン又はトレオニンをコードするコドンであり得る。
【0022】
本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（２）の目的は、チップにより合成されたオリゴヌクレオチドのコピー数をさらに増加させることである。
【0023】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（２）において、１つ以上の変異部位における変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列の両末端にそれぞれ対応する２つのプライマーをＰＣＲ増幅において使用する。
【0024】
本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（２）において、ＰＣＲ増幅のサイクルの数を最小化して変異部位におけるコドンにコードされるアミノ酸の分布への影響を回避する。変異部位におけるコドンによりコードされるアミノ酸の頻度差異は、ＰＣＲサイクルの数の増加に伴って指数関数的に増幅される。好ましくは、ＰＣＲ増幅のサイクルの数は、１０～３０サイクルであり、１０から２８サイクル、１０から２６サイクル、１０から２８サイクル、１０から２５サイクル、１０から２２サイクル、１０から２０サイクル、１０から１８サイクル、１０から１６サイクル、１２から３０サイクル、１２から２８サイクル、１２から２６サイクル、１２から２４サイクル、１２から２２サイクル、１２から２０サイクル、１２から１８サイクル、１２から１６サイクル、１２から１４サイクル、１４から３０サイクル、１４から２８サイクル、１４から２６サイクル、１４から２４サイクル、１４から２２サイクル、１４から２０サイクル、１４から１８サイクル、１４から１６サイクル、１６から３０サイクル、１６から２８サイクル、１６から２６サイクル、１６から２４サイクル、１６から２２サイクル、１６から２０サイクル、及び１６から１８サイクル、より好ましくは、１０から２０サイクル、いっそうより好ましくは、１２から２２サイクル、１４から１６サイクル、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０サイクル、最も好ましくは、１６サイクルであり得る。
【0025】
本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（２）において、ＤＮＡポリメラーゼは、任意のＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、増幅エラーを低減させるための高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ、より好ましくは、高フィデリティＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼであり得る。ＤＮＡポリメラーゼは、高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ及びＱ５（登録商標）高フィデリティＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
【0026】
本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（３）において、メチル化部位及び変異させるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミドを鋳型として使用し、ステップ（２）において得られた増幅オリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することによりＰＣＲ増幅を実施する。このステップの目的は、変異部位における変異ヌクレオチドを含む遺伝子又はその一部の配列を得ることである。反応系中で他のプライマーは存在せず、フォワード増幅のためのプライマーは対応するフォワードプライマーを欠き、バックワード増幅のためのプライマーは対応するリバースプライマーを欠く。プラスミドは、変異が必要とされる全長遺伝子又は変異されないその一部の配列を含有する。ステップ（２）において得られる増幅オリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡである。ＰＣＲの変性段階において、二本鎖ＤＮＡは２本の一本鎖ＤＮＡに解離される。一本鎖ＤＮＡは、それぞれのＰＣＲ反応のためのプライマーとしてそれぞれ使用する。それぞれのＰＣＲ反応において、フォワード線形増幅及びバックワード線形増幅は、変異させるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミドを鋳型として使用することによりそれぞれ実施する。線形増幅は、ＤＮＡ分子の線形増幅である。最終的に得られるＤＮＡ分子の数は指数関数的増幅のものよりもかなり少なく、要求されるプライマーの数も指数関数的増幅よりもかなり少ない。したがって、ステップ（３）の線形増幅において、系中のプライマーの数及び鋳型の数を厳密に制御し、ＰＣＲ反応のサイクルの数を可能な限り最小化することが必要である。
【0027】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（３）において、系中のプライマー（すなわち、ステップ（２）において得られる増幅オリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチド）の量及び鋳型（すなわち、メチル化部位及び変異させるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミド）の量を厳密に制御することが必要である。本発明者らは、プライマーと鋳型とのモル比が２０：１である場合、増幅効果が最良であることを見出した。一部の実施形態において、プライマーと鋳型とのモル比は、１５：１から１００：１、好ましくは、１５：１から９０：１、１５：１から８０：１、１５：１から７０：１、１５：１から６０：１、１５：１から５０：１、１５：１から４０：１、１５：１から３０：１、１５：１から２８：１、１５：１から２６：１、１５：１から２４：１、１５：１から２２：１、１５：１から２０：１、及び１６：１から１００：１；好ましくは、１６：１から９０：１、１６：１から８０：１、１６：１から７０：１、１６：１から６０：１、１６：１から５０：１、１６：１から４０：１、１６：１から３０：１、１６：１から２８：１、１６：１から２６：１、１６：１から２４：１、１６：１から２２：１、及び１６：１から２０：１；好ましくは、１７：１から９０：１、１７：１から８０：１、１７：１から７０：１、１７：１から６０：１、１７：１から５０：１、１７：１から４０：１、１７：１から３０：１、１７：１から２８：１、１７：１から２６：１、１７：１から２４：１、１７：１から２２：１、及び１７：１から２０：１；好ましくは、１８：１から９０：１、１８：１から８０：１、１８：１から７０：１、１８：１から６０：１、１８：１から５０：１、１８：１から４０：１、１８：１から３０：１、１８：１から２８：１、１８：１から２６：１、１８：１から２４：１、１８：１から２２：１、及び１８：１から２０：１；好ましくは、１９：１から９０：１、１９：１から８０：１、１９：１から７０：１、１９：１から６０：１、１９：１から５０：１、１９：１から４０：１、１９：１から３０：１、１９：１から２８：１、１９：１から２６：１、１９：１から２４：１、１９：１から２２：１、及び１９：１から２０：１；好ましくは、２０：１から９０：１、２０：１から８０：１、２０：１から７０：１、２０：１から６０：１、２０：１から５０：１、２０：１から４０：１、２０：１から３０：１、２０：１から２８：１、２０：１から２６：１、２０：１から２４：１、及び２０：１から２２：１、最も好ましくは、２０：１である。
【0028】
本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（３）において、ＰＣＲ増幅のサイクルの数を最小化して変異部位におけるヌクレオチドによりコードされるアミノ
酸の分布への影響を回避する。変異部位によりコードされるアミノ酸の頻度差異は、ＰＣＲサイクルの数の増加に伴って指数関数的に増幅される。好ましくは、ＰＣＲ増幅のサイクルの数は、１０～３０サイクルであり、１０から２８サイクル、１０から２６サイクル、１０から２８サイクル、１０から２５サイクル、１０から２２サイクル、１０から２０サイクル、１０から１８サイクル、１０から１６サイクル、１２から３０サイクル、１２から２８サイクル、１２から２６サイクル、１２から２４サイクル、１２から２２サイクル、１２から２０サイクル、１２から１８サイクル、１２から１６サイクル、１２から１４サイクル、１４から３０サイクル、１４から２８サイクル、１４から２６サイクル、１４から２４サイクル、１４から２２サイクル、１４から２０サイクル、１４から１８サイクル、１４から１６サイクル、１６から３０サイクル、１６から２８サイクル、１６から２６サイクル、１６から２４サイクル、１６から２２サイクル、１６から２０サイクル、及び１６から１８サイクル、より好ましくは、１０から２０サイクル、いっそうより好ましくは、１２から２２サイクル、１４から１６サイクル、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０サイクル、最も好ましくは、１５サイクルであり得る。
酸の分布への影響を回避する。変異部位によりコードされるアミノ酸の頻度差異は、ＰＣＲサイクルの数の増加に伴って指数関数的に増幅される。好ましくは、ＰＣＲ増幅のサイクルの数は、１０～３０サイクルであり、１０から２８サイクル、１０から２６サイクル、１０から２８サイクル、１０から２５サイクル、１０から２２サイクル、１０から２０サイクル、１０から１８サイクル、１０から１６サイクル、１２から３０サイクル、１２から２８サイクル、１２から２６サイクル、１２から２４サイクル、１２から２２サイクル、１２から２０サイクル、１２から１８サイクル、１２から１６サイクル、１２から１４サイクル、１４から３０サイクル、１４から２８サイクル、１４から２６サイクル、１４から２４サイクル、１４から２２サイクル、１４から２０サイクル、１４から１８サイクル、１４から１６サイクル、１６から３０サイクル、１６から２８サイクル、１６から２６サイクル、１６から２４サイクル、１６から２２サイクル、１６から２０サイクル、及び１６から１８サイクル、より好ましくは、１０から２０サイクル、いっそうより好ましくは、１２から２２サイクル、１４から１６サイクル、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０サイクル、最も好ましくは、１５サイクルであり得る。
【0029】
本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（３）において、増幅すべき遺伝子又はその一部の長さによれば、ステップ（２）において得られた増幅オリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチドの２つのストランドをプライマーとして使用する２つのＰＣＲ反応は、ＰＣＲ反応の伸長時間を制御することにより遺伝子又はその一部のヘッド及びテール末端にそれぞれ及び得る。
【0030】
本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（４）において、メチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼを使用してステップ（３）の増幅系中に存在する鋳型プラスミドを切断させ、この目的は、次のステップのための鋳型としての変異を含有しないプラスミドを増幅して変異を含有しない最終遺伝子産物を得ることを回避することである。細菌から抽出されたプラスミドは全てメチル化部位を有し、ステップ（３）におけるＰＣＲ増幅により得られる産物はメチル化部位を含有せず、したがって、メチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼはプラスミドを小断片に選択的に切断させ得、したがって次のＰＣＲ反応のための鋳型として使用することができない。
【0031】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法において、プラスミドは、細菌から抽出される。一部の実施形態において、プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から抽出される。一部の実施形態において、プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０から抽出される。細菌は、一般に、細菌のＤＮＡをメチル化するためのメチラーゼを有する。例えば、Ｄａｍメチラーゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０中に存在する。Ｄａｍメチラーゼは、ＧＡＴＣモチーフ中のアデニンを認識し、メチル化する。
【0032】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（４）において、メチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼは、当技術分野において周知である。例えば、メチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩ、ＭｓｐＪＩ、ＦｓｐＥＩなどである。好ましくは、メチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩである。制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩは、メチル化ＧｍＡＴＣのアデニンを有効に認識し、切断し得るが、非メチル化ＧＡＴＣ配列を切断し得ない。Ｄａｍ＋細菌から抽出されたプラスミドは全てＧｍＡＴＣを含有し、それはＤｐｎＩの基質として作用し得る。好ましくは、ＤｐｎＩにより消化され得るプラスミドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０株から抽出される。
【0033】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法において、
メチル化部位を有するプラスミドは、ｐＭＢ１、ｐＢＲ３２２、ｐｃＤＮＡ３．１又はｐＵＣ５７である。一部の実施形態において、メチル化部位を有するプラスミドはｐＭＢ１である。
メチル化部位を有するプラスミドは、ｐＭＢ１、ｐＢＲ３２２、ｐｃＤＮＡ３．１又はｐＵＣ５７である。一部の実施形態において、メチル化部位を有するプラスミドはｐＭＢ１である。
【0034】
一部の実施形態において、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（５）において、変異させるべき遺伝子又はその一部の両末端にそれぞれ対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーをステップ（４）において得られた系に添加し、ＰＣＲ増幅を実施して変異ヌクレオチドを含有する複数の遺伝子又はその一部を含む遺伝子変異ライブラリーを得る。ＰＣＲ反応の鋳型は、相補的塩基対合により異なる方向で一緒に結合しているステップ（３）において得られた２つのＰＣＲ増幅産物である。
【0035】
本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（５）において、ＰＣＲ増幅のサイクルの数を最小化して変異部位におけるコドンによりコードされるアミノ酸の分布への影響を回避する。変異部位におけるアミノ酸の頻度差異は、ＰＣＲサイクルの数の増加に伴って指数関数的に増幅される。好ましくは、ＰＣＲ増幅のサイクルの数は、１０～３０サイクルであり、１０から２８サイクル、１０から２６サイクル、１０から２８サイクル、１０から２５サイクル、１０から２２サイクル、１０から２０サイクル、１０から１８サイクル、１０から１６サイクル、１２から３０サイクル、１２から２８サイクル、１２から２６サイクル、１２から２４サイクル、１２から２２サイクル、１２から２０サイクル、１２から１８サイクル、１２から１６サイクル、１２から１４サイクル、１４から３０サイクル、１４から２８サイクル、１４から２６サイクル、１４から２４サイクル、１４から２２サイクル、１４から２０サイクル、１４から１８サイクル、１４から１６サイクル、１６から３０サイクル、１６から２８サイクル、１６から２６サイクル、１６から２４サイクル、１６から２２サイクル、１６から２０サイクル、及び１６から１８サイクル、より好ましくは、１０から２０サイクル、いっそうより好ましくは、１２から２２サイクル、１４から１６サイクル、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０サイクル、最も好ましくは、１６サイクルであり得る。
【0036】
本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のステップ（５）において、好ましくは、このステップは、増幅産物をアガロースゲル電気泳動、回収及び／又は精製に供して最終産物を得ることをさらに含む。
【0037】
さらに、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法は、ステップ（６）：ステップ（５）において得られた最終産物を配列決定して配列が正確か否かを検証することも含む。好ましくは、配列決定は、サンガー配列決定である。このステップは、最終産物の平滑末端ライゲーションを実施して線形化Ｐｕｃ５７－ＥＶをライゲートし、Ｍ１３Ｆプライマーを使用することにより最終産物を配列決定することを含む。好ましくは、配列決定は、ハイスループット配列決定又は次世代配列決定技術（短鎖についてはＮＧＳ）であり、それを使用して配列が正確か否かを確認し、配列決定を使用してそれぞれの変異部位における種々のヌクレオチド変異の比率をそれぞれ検出して比率が所望の比率にマッチすることを確認することもできる。
【0038】
第２の態様において、本発明は、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法により構築された遺伝子変異ライブラリーを提供する。
【0039】
第３の態様において、本発明は、上記の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のためのキットであって、１つ以上の変異部位における変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列のプール、メチル化部位及び変異させるべきヌクレオチドを含む遺伝子又はその一部を含むプラスミド、並びにメチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼを
含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、ＤＮＡポリメラーゼも含む。
含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、ＤＮＡポリメラーゼも含む。
【0040】
第４の態様において、本発明は、タンパク質中のアミノ酸変異と、タンパク質の特性、調節及び／又は機能との間の関係を分析する方法であって、以下のステップ：
（１）本発明の方法を使用してタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異ライブラリーを構築するステップ；
（２）遺伝子変異ライブラリー中の変異遺伝子によりコードされるタンパク質の特性、調節及び／又は機能を、非変異タンパク質の特性、調節及び／又は機能と比較するステップ；並びに
（３）変異位置におけるアミノ酸と、タンパク質の特性、調節及び／又は機能との間の関係を分析するステップ
を含む方法を提供する。
（１）本発明の方法を使用してタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異ライブラリーを構築するステップ；
（２）遺伝子変異ライブラリー中の変異遺伝子によりコードされるタンパク質の特性、調節及び／又は機能を、非変異タンパク質の特性、調節及び／又は機能と比較するステップ；並びに
（３）変異位置におけるアミノ酸と、タンパク質の特性、調節及び／又は機能との間の関係を分析するステップ
を含む方法を提供する。
【0041】
具体的には、本発明は以下の項に関する：
１．遺伝子変異ライブラリーを構築する方法であって、
（１）１つ以上の変異部位における変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列のプールを合成すること；
（２）変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列の合成プール中のオリゴヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅を実施すること；
（３）メチル化部位及び変異させるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミドを鋳型として使用し、ステップ（２）において得られた増幅オリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することによりＰＣＲ増幅を実施すること；
（４）メチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼを使用してステップ（３）の増幅系中に存在する鋳型プラスミドを切断させること；並びに
（５）変異させるべきヌクレオチドを有する遺伝子又はその一部の両末端にそれぞれ対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーをステップ（４）において得られた系に添加し、ＰＣＲ増幅を実施して変異を含有する複数の遺伝子又はその一部を含む遺伝子変異ライブラリーを得ること
を含む方法。
２．ステップ（１）～ステップ（５）の間に精製を実施しない、項１に記載の方法。
３．（６）ステップ（５）の増幅産物を回収し、精製して最終産物を得ること
をさらに含む、項１に記載の方法。
４．（７）ステップ（６）において得られた最終産物を配列決定して配列を検証し、及び／又は遺伝子変異分布を検出すること
をさらに含む、項３に記載の方法。
５．配列決定は、サンガー配列決定及び／又はハイスループット配列決定である、項４に記載の方法。
６．ステップ（１）において合成されたオリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチド配列の長さは、６０～１７０ｂｐ、好ましくは、８０～９０ｂｐである、項１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．ステップ（１）において合成されたオリゴヌクレオチド配列のプールは、１から１０個の変異部位における変異ヌクレオチドを含む、項１～６のいずれか１つに記載の方法。８．変異部位は、隣接しているか又は隣接していない、項１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．変異ヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、変異させるべき遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸差異を有する、項１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．少なくとも１つのアミノ酸差異は、置換、付加又は欠失から選択される、項９に記載の方法。
１１．少なくとも１つのアミノ酸差異は、置換である、項１０に記載の方法。
１２．置換は、元のアミノ酸を、元のアミノ酸と異なる特性を有するアミノ酸で置換することである、項１１に記載の方法。
１３．特性は、酸度及びアルカリ度、極性、荷電特性及び側鎖基から選択される、項１２に記載の方法。
１４．１つ以上の変異部位における変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列の両末端にそれぞれ対応する２つのプライマーをステップ（２）におけるＰＣＲ増幅において使用する、項１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．ステップ（２）におけるＰＣＲ増幅のサイクルの数は、１０～２５サイクル、好ましくは、１２～２２サイクル、１４～２０サイクル、１５～１８サイクル又は１５～１６サイクル、最も好ましくは、１６サイクルである、項１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．ステップ（２）におけるＰＣＲ増幅において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、高フィデリティＤＮＡポリメラーゼである、項１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．ステップ（３）におけるプライマーと鋳型とのモル比は、１５：１から５０：１、好ましくは、１６：１から４０：１、１７：１から３０：１、１８：１から２５：１、又は１９：１から２２：１、より好ましくは、１９：１から２１：１、最も好ましくは、２０：１である、項１～１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．ステップ（３）におけるＰＣＲ増幅のサイクルの数は、１０～２０サイクル、好ましくは、１２～１８サイクル、１４～１６サイクル、最も好ましくは、１５サイクルである、項１～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．ステップ（３）におけるＰＣＲ増幅において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、高フィデリティＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼである、項１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．プラスミドは、プラスミドをメチル化する細菌から、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から、より好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０株から抽出される、項１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．ステップ（４）におけるエンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩ、ＭｓｐＪＩ又はＦｓｐＥＩである、項１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．項１～２１のいずれか１つに記載の方法を使用して構築された遺伝子変異ライブラリー。
２３．項１～２１のいずれか１つに記載の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のためのキットであって、１つ以上の変異部位における変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列のプール、メチル化部位及び変異させるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミド、並びにメチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼを含むキット。
２４．ＤＮＡポリメラーゼを含む、項２３に記載のキット。
２５．タンパク質中のアミノ酸変異と、タンパク質の特性、調節及び／又は機能との間の関係を分析する方法であって、以下のステップ：
（１）項１～２１のいずれか１つに記載の方法を使用してタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異ライブラリーを構築するステップ；
（２）遺伝子変異ライブラリー中の変異遺伝子によりコードされるタンパク質の特性、調節及び／又は機能を、非変異タンパク質の特性、調節及び／又は機能と比較するステップ；並びに
（３）変異位置におけるアミノ酸と、タンパク質の特性、調節及び／又は機能との間の関係を分析するステップ
を含む方法。
１．遺伝子変異ライブラリーを構築する方法であって、
（１）１つ以上の変異部位における変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列のプールを合成すること；
（２）変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列の合成プール中のオリゴヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅を実施すること；
（３）メチル化部位及び変異させるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミドを鋳型として使用し、ステップ（２）において得られた増幅オリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することによりＰＣＲ増幅を実施すること；
（４）メチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼを使用してステップ（３）の増幅系中に存在する鋳型プラスミドを切断させること；並びに
（５）変異させるべきヌクレオチドを有する遺伝子又はその一部の両末端にそれぞれ対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーをステップ（４）において得られた系に添加し、ＰＣＲ増幅を実施して変異を含有する複数の遺伝子又はその一部を含む遺伝子変異ライブラリーを得ること
を含む方法。
２．ステップ（１）～ステップ（５）の間に精製を実施しない、項１に記載の方法。
３．（６）ステップ（５）の増幅産物を回収し、精製して最終産物を得ること
をさらに含む、項１に記載の方法。
４．（７）ステップ（６）において得られた最終産物を配列決定して配列を検証し、及び／又は遺伝子変異分布を検出すること
をさらに含む、項３に記載の方法。
５．配列決定は、サンガー配列決定及び／又はハイスループット配列決定である、項４に記載の方法。
６．ステップ（１）において合成されたオリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチド配列の長さは、６０～１７０ｂｐ、好ましくは、８０～９０ｂｐである、項１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．ステップ（１）において合成されたオリゴヌクレオチド配列のプールは、１から１０個の変異部位における変異ヌクレオチドを含む、項１～６のいずれか１つに記載の方法。８．変異部位は、隣接しているか又は隣接していない、項１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．変異ヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、変異させるべき遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸差異を有する、項１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．少なくとも１つのアミノ酸差異は、置換、付加又は欠失から選択される、項９に記載の方法。
１１．少なくとも１つのアミノ酸差異は、置換である、項１０に記載の方法。
１２．置換は、元のアミノ酸を、元のアミノ酸と異なる特性を有するアミノ酸で置換することである、項１１に記載の方法。
１３．特性は、酸度及びアルカリ度、極性、荷電特性及び側鎖基から選択される、項１２に記載の方法。
１４．１つ以上の変異部位における変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列の両末端にそれぞれ対応する２つのプライマーをステップ（２）におけるＰＣＲ増幅において使用する、項１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．ステップ（２）におけるＰＣＲ増幅のサイクルの数は、１０～２５サイクル、好ましくは、１２～２２サイクル、１４～２０サイクル、１５～１８サイクル又は１５～１６サイクル、最も好ましくは、１６サイクルである、項１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．ステップ（２）におけるＰＣＲ増幅において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、高フィデリティＤＮＡポリメラーゼである、項１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．ステップ（３）におけるプライマーと鋳型とのモル比は、１５：１から５０：１、好ましくは、１６：１から４０：１、１７：１から３０：１、１８：１から２５：１、又は１９：１から２２：１、より好ましくは、１９：１から２１：１、最も好ましくは、２０：１である、項１～１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．ステップ（３）におけるＰＣＲ増幅のサイクルの数は、１０～２０サイクル、好ましくは、１２～１８サイクル、１４～１６サイクル、最も好ましくは、１５サイクルである、項１～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．ステップ（３）におけるＰＣＲ増幅において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、高フィデリティＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼである、項１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．プラスミドは、プラスミドをメチル化する細菌から、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から、より好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０株から抽出される、項１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．ステップ（４）におけるエンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩ、ＭｓｐＪＩ又はＦｓｐＥＩである、項１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．項１～２１のいずれか１つに記載の方法を使用して構築された遺伝子変異ライブラリー。
２３．項１～２１のいずれか１つに記載の遺伝子変異ライブラリーを構築する方法のためのキットであって、１つ以上の変異部位における変異ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列のプール、メチル化部位及び変異させるべき遺伝子又はその一部を含むプラスミド、並びにメチル化部位を認識し、切断させるエンドヌクレアーゼを含むキット。
２４．ＤＮＡポリメラーゼを含む、項２３に記載のキット。
２５．タンパク質中のアミノ酸変異と、タンパク質の特性、調節及び／又は機能との間の関係を分析する方法であって、以下のステップ：
（１）項１～２１のいずれか１つに記載の方法を使用してタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異ライブラリーを構築するステップ；
（２）遺伝子変異ライブラリー中の変異遺伝子によりコードされるタンパク質の特性、調節及び／又は機能を、非変異タンパク質の特性、調節及び／又は機能と比較するステップ；並びに
（３）変異位置におけるアミノ酸と、タンパク質の特性、調節及び／又は機能との間の関係を分析するステップ
を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築するための方法の系統図である。
【図2】変異体ヌクレオチドを含む合成されたオリゴヌクレオチド配列のプール中のオリゴヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅を実施することにより得られた産物の電気泳動図である。右レーンは、ＤＬ３０００マーカーであり、左レーンは、プライマーとしてＣｈｉｐ－Ｆ及びＣｈｉｐ－Ｒを使用し、また鋳型として変異体ヌクレオチドを含む合成されたオリゴヌクレオチド配列のプールを使用した増幅産物である。
【図3】実施例５において得られた最終産物の電気泳動図である。左レーンは、ＤＬ３０００マーカーであり、右レーンは、プライマーとしてＣｈｉｐ－Ｆ及びＣｈｉｐ－Ｒを使用し、また鋳型として相補的領域によって一緒に連結された一本鎖ＤＮＡを使用して増幅を実施することによって得られた産物のアガロースゲル電気泳動、回収及び精製によって得られた最終産物である。一本鎖ＤＮＡは、プライマーとして実施例３における合成されたオリゴヌクレオチドの２本の鎖を使用して増幅を各々実施することによって得られたセンス及びアンチセンスＰＣＲ増幅産物である。
【図4A】最終産物のサンガー配列決定の結果である。標的変異部位、即ち３５位のアミノ酸のコドン位置、即ち１０３～１０５位のヌクレオチドで、変異が生じた。
【図4B】最終産物のサンガー配列決定の結果である。標的変異部位、即ち３５位のアミノ酸のコドン位置、即ち１０３～１０５位のヌクレオチドで、変異が生じた。
【図4C】最終産物のサンガー配列決定の結果である。標的変異部位、即ち３５位のアミノ酸のコドン位置、即ち１０３～１０５位のヌクレオチドで、変異が生じた。
【図5】プライマーとして合成されたオリゴヌクレオチドを使用し、また１：２５４の鋳型対プライマーのモル比、及び２５のＰＣＲ反応のサイクル数を使用する線形増幅のステップにおける最終産物の電気泳動図である。左レーンは、ＤＬ３０００マーカーであり、右レーンは、プライマーとしてＣｈｉｐ－Ｆ及びＣｈｉｐ－Ｒを使用し、鋳型として相補的領域によって一緒に連結された一本鎖ＤＮＡを使用して増幅を実施することによって得られた最終産物である。一本鎖ＤＮＡは、プライマーとして実施例７における合成されたオリゴヌクレオチドの２本の鎖を使用して増幅を各々実施することによって得られたセンス及びアンチセンスＰＣＲ増幅産物である。
【図6】プライマーとして合成されたオリゴヌクレオチドを用いる線形増幅のステップにおける、鋳型対プライマーのモル比が１：２５４であり、ＰＣＲ反応のサイクル数が１５であるときの状況を試験する。左レーンは、ＤＬ３０００マーカーであり、右レーンは、プライマーとしてＣｈｉｐ－Ｆ及びＣｈｉｐ－Ｒを使用し、また鋳型として相補的領域によって一緒に連結された一本鎖ＤＮＡを使用して増幅を実施することによって得られた最終産物である。一本鎖ＤＮＡは、プライマーとして実施例７における合成されたオリゴヌクレオチドの２本の鎖を使用して増幅を各々実施することによって得られたセンス及びアンチセンスＰＣＲ増幅産物である。
【発明を実施するための形態】
【0043】
本説明及び添付の特許請求の範囲において使用される通り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」に対する参照は、任意選択的には、かかる分子の２つ以上の組み合わせなどを含む。
【0044】
本明細書で用いられるとき、用語「約」は、当業者によって容易に認知される対応する数値の通常の誤差範囲を指す。「約」が付く特定の値又はパラメータに対する本明細書での参照は、その値又はパラメータ自身を含む実施形態を含み（そして記載する）。
【0045】
本明細書に記載の本発明の態様及び実施形態が、「含む」、「～からなる」、及び「～から本質的になる」を含む態様及び実施形態を含むことが理解される。
【0046】
用語「オリゴヌクレオチド」は、短鎖ヌクレオチドに対する一般用語を指す。これに関連して、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を介して２～３００ヌクレオチドを重合することにより作製され得る。
【0047】
用語「オリゴヌクレオチド配列のプール」は、種々の異なるオリゴヌクレオチド配列からなる混合物を指す。
【0048】
用語「遺伝子変異ライブラリー」は、種々の異なるＤＮＡバリアント配列からなる混合物を指す。遺伝子変異ライブラリーは、遺伝子合成、遺伝子変異及び指向性進化研究の組み合わせの産物である。遺伝子変異ライブラリーは、例えば、ハイスループット薬物標的スクリーニング、タンパク質工学による指向性進化、高い親和性及び特異性を有するバリアント抗体をスクリーニングするための多様な抗体ライブラリーの合成などの研究分野においてますます使用されている。
【0049】
用語「ＰＣＲ増幅」は、特定のＤＮＡ断片を増幅するための分子生物学的技法であるポリメラーゼ連鎖反応を指す。それはインビトロでの特殊なＤＮＡ複製とみなすことができる。ＰＣＲの最大の特徴は、それが微量のＤＮＡを大幅に増加させ得ることである。具体的には、ＰＣＲ技術の基本的原理は、ＤＮＡの天然の複製プロセスに類似し、その特異性は、標的配列の両末端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーに依存する。ＰＣＲは、３つの基本的な反応ステップ：変性、アニーリング及び伸長からなり、（１）鋳型ＤＮＡの変性：鋳型ＤＮＡを特定期間にわたり９０℃超に加熱し、次に二本鎖鋳型ＤＮＡ又はＰＣＲ増幅によって形成された二本鎖ＤＮＡを解離させ、一本鎖にすることで、一本鎖がプライマーと結合され、次の反応ラウンドに備えられること；（２）鋳型ＤＮＡ及びプライマーのアニーリング（復元）：鋳型ＤＮＡが加熱により一本鎖に変性されてから、温度をより低温に下げることで、プライマーは一本鎖鋳型ＤＮＡの相補的配列と対合及び結合されること；（３）プライマーの伸長：反応原料としてｄＮＴＰを使用し、鋳型として標的配列を使用し、且つ相補的塩基対合及び半保存的複製の原理に従い、約７０℃のＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなど）の作用下で、ＤＮＡ鋳型－プライマーコンジュゲートからの鋳型ＤＮＡ鎖に相補的な新しい半保存的複製鎖を合成すること、を含む。さらなる「半保存的複製鎖」は、変性－アニーリング－伸長の３つのプロセスのサイクルを反復することにより得ることができる。
【0050】
本願の遺伝子変異ライブラリーを構築するための方法のステップ（５）では、変異されるべき遺伝子又はその一部の両末端に対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーの各々が、ステップ（４）で得られた系に添加され、変異体ヌクレオチドを有する複数の遺伝子又はそれらの一部を含む遺伝子変異ライブラリーを得るため、ＰＣＲ増幅が実施される。このステップでは、融合ＰＣＲが実施され、（１）鋳型ＤＮＡの変性：鋳型ＤＮＡを特定期間にわたり９０℃超に加熱し、鋳型ＤＮＡを元の一本鎖状態で保持することであり、ここで鋳型ＤＮＡは、鋳型としてステップ（３）における変異されるべき遺伝子を有するプラスミドを使用し、またプライマーとしてステップ（２）において増幅されたオリゴヌクレオチドのプール中のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅を実施することによって得られた産物であり、ステップ（１）において合成されたオリゴヌクレオチドのプール中のオリゴヌクレオチド配列に対応する位置で相補的である；（２）アニーリング：鋳型ＤＮＡをアニーリングすることで、一本鎖鋳型ＤＮＡの相補的配列が対合及び結合される；（３）伸長：ＤＮＡポリメラーゼを使用し、３’末端からＤＮＡ鎖を伸長させ、鋳型として相補鎖を使用することにより完全二本鎖ＤＮＡを形成すること、を含む。次に、それに続くＰＣＲ反応は、通常のＰＣＲと同じであり、変異体ヌクレオチドを有する複数の遺伝子又はそれらの一部を含む遺伝子変異ライブラリーは、鋳型として形成された完全二本鎖ＤＮＡを使用し、またプライマーとして変異されるべき遺伝子又はその一部の２つの末端に対応する添加されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用する変性／アニーリング／伸長の３ステップ増幅により得られる。
【0051】
用語「ＰＣＲプライマー」は、ポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング（復元）段階中に
一本鎖鋳型ＤＮＡの相補的配列と対合及び結合され、且つ伸長段階中にＤＮＡポリメラーゼの作用下で反応系におけるヌクレオチドと共有結合を介して連結される、特定のヌクレオチド配列を有する合成高分子を指す。
一本鎖鋳型ＤＮＡの相補的配列と対合及び結合され、且つ伸長段階中にＤＮＡポリメラーゼの作用下で反応系におけるヌクレオチドと共有結合を介して連結される、特定のヌクレオチド配列を有する合成高分子を指す。
【0052】
通常、プライマー対における一方のプライマーは、標的領域の一方の末端で一方のＤＮＡ鋳型鎖に相補的であり、且つプライマー対における他方のプライマーは、標的領域の他方の末端で他方のＤＮＡ鋳型鎖に相補的である。プライマーの機能は、ヌクレオチド重合の開始点として働くことであり、核酸ポリメラーゼは各々、２つのプライマーの３’末端から新しい核酸鎖を合成し始め得る。合成された二本鎖ＤＮＡは、次のサイクルのＤＮＡ変性段階中に再溶融され、増幅におけるこのサイクルの鋳型として使用可能である。理論的には、この増幅方法は、ｍ＊２ｎ（ｍは最初に添加された鋳型鎖の数であり、ｎはサイクルの数である）二本鎖ＤＮＡを生成する。したがって、このプライマー対を用いるＰＣＲ増幅は、指数関数的増幅とも称される。
【0053】
本明細書中のプライマー対は、２つの相補的オリゴヌクレオチドでもあり得、２つのオリゴヌクレオチドは、変性段階中に溶融され、アニーリング段階中にそれらの対応する鋳型に各々相補的であり、各々が前方及び後方に伸長及び増幅される。増幅後に得られた二本鎖ＤＮＡは、系に最初に添加された鋳型鎖とプライマーから開始された伸長によって得られた産物鎖との複合体である。この場合、産物鎖は次の増幅反応における鋳型として使用され得ない。系に最初に添加された鋳型鎖のみが各ＰＣＲサイクルにおける鋳型として使用可能である。したがって、理論的には、この増幅方法の各々は、ｎサイクル後、各方向にｍ＊ｎ（ｍは最初に添加された鋳型鎖の数であり、ｎはサイクルの数である）一本鎖ＤＮＡを生成する。したがって、かかるプライマー対を用いるＰＣＲ増幅は、線形増幅である。
【0054】
用語「ＤＮＡポリメラーゼ」は、複製のための鋳型としてＤＮＡを用いて、５’末端から３’末端へＤＮＡを複製する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼの主な活性は、鋳型、プライマー、ｄＮＴＰなどの存在下でＤＮＡの合成を触媒することである。
【0055】
用語「高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ」は、目的のＤＮＡの忠実な複製を確保するための低い取り込みエラー率（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）及び校正活性を有するＤＮＡポリメラーゼを指す。
【0056】
用語「変異されるべき遺伝子」は、本明細書中で、遺伝子変異ライブラリーを構築するために特異的に変異される必要がある遺伝子を指し、変異されるべき遺伝子の配列は、変異体ヌクレオチドを有しない元の配列である。
【0057】
用語「プラスミド」は、細菌などの生物中の染色体ＤＮＡ（又は核様体）以外のＤＮＡ分子を指す。プラスミドは、細胞質内に存在し、自律的に複製する能力を有することで、それが娘細胞内に存在し、一定のコピー数を維持し、そして全ての運ばれた遺伝子情報を発現することを可能にする。一般に、細菌から抽出されたプラスミドは、メチル化部位を有する。
【0058】
用語「ＤＮＡメチル化」は、ＤＮＡ配列を変更することなく遺伝的挙動を改変し得る、ＤＮＡの化学修飾の形態である。広義には、ＤＮＡメチル化は、ＤＮＡ配列上の特定塩基が、共有結合を介して、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）の触媒作用下で、且つメチルドナーとしてＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を用いてメチル基を得る化学修飾プロセスを指す。このＤＮＡメチル化修飾は、例えばシトシンのＣ－５位、アデニンのＮ－６位及びグアニンのＮ－７位などの位置で生じ得る。ＤＮＡメチル化は、安定な修飾状態として、重要なエピジェネティック機構であるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ
の作用下のＤＮＡ複製プロセスとともに、新しい娘ＤＮＡに遺伝され得る。
の作用下のＤＮＡ複製プロセスとともに、新しい娘ＤＮＡに遺伝され得る。
【0059】
実験室内の一般的なＫ１２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えばＴＯＰ１０は、異なるＤＮＡ配列を認識する３種のメチラーゼ：ＤＮＡのＧＡＴＣモチーフのＡにメチルを付加するＤａｍメチラーゼ；ＤＮＡのＣＣＷＧＧモチーフの２番目のＣにメチルを付加するＤｃｍメチラーゼ；及びＤＮＡのＡＡＣＮＮＮＮＮＮＧＴＧＣモチーフ又はＧＣＡＣＮＮＮＮＮＮＧＴＴモチーフのＡにメチルを付加するＥｃｏＫＩメチラーゼを含む。
【0060】
用語「制限エンドヌクレアーゼ」は、特定のデオキシヌクレオチド配列を認識し、それに付着し、各鎖内の特定位置で２つのデオキシリボヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断し得る酵素のクラスを指し、「エンドヌクレアーゼ」と称される。
【0061】
用語「制限部位」は、ＤＮＡ鎖上の特定の配列を指し、ここで制限エンドヌクレアーゼは、該配列を特異的に認識し、ＤＮＡ配列をここで２つの断片に特定の様式で切断し得る。
【0062】
用語「メチル化部位を認識し、切断するエンドヌクレアーゼ」は、メチル化デオキシヌクレオチドを含む特定のデオキシヌクレオチド配列を認識し、それに付着し、各鎖内の特定位置で２つのデオキシリボヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断し得る酵素のクラスを指す。例えば、メチル化部位を認識し、切断するエンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩ酵素、ＦｓｐＥＩ酵素及びＭｓｐＪＩであり得る。
【0063】
ＤｐｎＩ酵素は、Ｄａｍメチラーゼを有する細菌から抽出されたプラスミド内のメチル化モチーフＧｍＡＴＣを認識し、切断する。しかし、非メチル化ＰＣＲ産物は、ＰＣＲシステムがメチラーゼを全く有しないことから切断されない。特に、モチーフ「ＧｍＡＴＣ」内の「ｍＡ」は、メチル化アデニンヌクレオチドを表す。
【0064】
ＦｓｐＥＩ酵素は、修飾シトシンＣ、即ち
のＣｍＣ部位を認識し、３’末端Ｎ１２／Ｎ１６で二本鎖ＤＮＡ切断を生成する修飾依存性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＦｓｐＥＩ酵素は、Ｄｃｍメチラーゼを有する細菌から抽出されたプラスミド内のメチル化モチーフＣｍＣＷＧＧを認識し、切断する。しかし、非メチル化ＰＣＲ産物は、ＰＣＲシステムがメチラーゼを全く有しないことから切断されない。特に、モチーフ「ＣｍＣ」及び「ＣｍＣＷＧＧ」内の「ｍＣ」は、メチル化シトシンヌクレオチドを表す。
【化1】
のＣｍＣ部位を認識し、３’末端Ｎ１２／Ｎ１６で二本鎖ＤＮＡ切断を生成する修飾依存性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＦｓｐＥＩ酵素は、Ｄｃｍメチラーゼを有する細菌から抽出されたプラスミド内のメチル化モチーフＣｍＣＷＧＧを認識し、切断する。しかし、非メチル化ＰＣＲ産物は、ＰＣＲシステムがメチラーゼを全く有しないことから切断されない。特に、モチーフ「ＣｍＣ」及び「ＣｍＣＷＧＧ」内の「ｍＣ」は、メチル化シトシンヌクレオチドを表す。
【0065】
ＭｓｐＪＩ酵素は、修飾シトシン、即ち
（式中、Ｒ＝Ａ又はＧであり；及びＹ＝Ｃ又はＴである）のｍＣＮＮＲ部位を認識し、３’末端Ｎ９／Ｎ１３で二本鎖ＤＮＡ切断を生成する修飾依存性エンドヌクレアーゼである。特に、モチーフ「ｍＣＮＮＲ」内の「ｍＣ」は、メチル化シトシンヌクレオチドを表す。
【化2】
（式中、Ｒ＝Ａ又はＧであり；及びＹ＝Ｃ又はＴである）のｍＣＮＮＲ部位を認識し、３’末端Ｎ９／Ｎ１３で二本鎖ＤＮＡ切断を生成する修飾依存性エンドヌクレアーゼである。特に、モチーフ「ｍＣＮＮＲ」内の「ｍＣ」は、メチル化シトシンヌクレオチドを表す。
【0066】
サンガー配列決定は、固定点で開始し、ヌクレオチドの特定塩基で無作為に終了し、各
塩基を蛍光標識し、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧで終了する異なる長さの一連の４つのヌクレオシド群を生成し、次に尿素変性ＰＡＧＥゲル上での電気泳動により検出し、可視ＤＮＡ塩基配列を得ることを含む方法である。
塩基を蛍光標識し、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧで終了する異なる長さの一連の４つのヌクレオシド群を生成し、次に尿素変性ＰＡＧＥゲル上での電気泳動により検出し、可視ＤＮＡ塩基配列を得ることを含む方法である。
【0067】
ハイスループット配列決定は、「次世代」配列決定技術（ＮＧＳと略される）としても知られ、従来のサンガー配列決定方法と比較される。ＮＧＳは、数十万～数百万のＤＮＡ分子を並行して一般により短いリードで配列決定する能力によって特徴づけられる。現在、ハイスループット配列決定用の主なプラットフォームは、Ｒｏｃｈｅ ４５４シークエンサー（Ｒｏｃｈ ＧＳ ＦＬＸシークエンサー）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｏｌｅｘａゲノムアナライザー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ）及びＡＢＩ ＳＯＬｉＤシークエンサーによって代表される。それらの一般的特徴は、（１）目的のＤＮＡが小さい断片に切断される；（２）単一の小さい断片ＤＮＡ分子が固相の表面に結合する；（３）単一分子が独立して増幅される；（４）１塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、及びＧ）のみが一度に複製され、シグナルが検出される；及び（５）高解像度画像処理システムである。
【0068】
用語「配列決定深度」は、ゲノムのサイズに対する配列決定によって得られた塩基（ｂｐ）の総数の比を指し、配列決定の量を評価するための指標の１つである。配列決定深度とゲノムカバレッジとの間に正の相関があり、配列決定によって得られる誤り率又は偽陽性の結果は、配列決定深度の増加に伴って減少することになる。これに関連して、配列決定深度は、遺伝子変異ライブラリーのハイスループット配列決定によって得られた配列決定結果において使用される。これに関連して、配列決定深度は、具体的にはハイスループット配列決定結果における各遺伝子変異体の配列決定深度を指す。
【0069】
用語「平均配列決定深度」は、本明細書中で遺伝子変異ライブラリーの配列決定結果における各遺伝子変異体の平均配列決定深度を指す。
【0070】
用語「１０％にランク付けされた配列決定深度」は、１０％にランク付けされた遺伝子変異体に対応する配列決定深度を指し、遺伝子変異ライブラリーの配列決定結果において得られた全ての遺伝子変異体が、それらの対応する配列決定深度に従い、小から大にランク付けされる。
【0071】
用語「９０％にランク付けされた配列決定深度」は、９０％にランク付けされた遺伝子変異体に対応する配列決定深度を指し、遺伝子変異ライブラリーの配列決定結果において得られた全ての遺伝子変異体が、それらの対応する配列決定深度に従い、小から大にランク付けされる。
【0072】
用語「偏り度合い」は、９０％にランク付けされた配列決定深度／１０％にランク付けされた配列決定深度を指し、遺伝子変異ライブラリーのハイスループット配列決定によって得られた全ての遺伝子変異体の配列決定深度が均一であるか否かを特徴づけるために使用され、特定の変異部位での異なる変異を含む異なる変異体配列のコピー数が遺伝子変異ライブラリーにおいて均一であるか否かを示す。１は、最適な偏り度合いであり、遺伝子変異ライブラリーにおいて、特定の変異部位での異なる変異を含む異なる変異配列のコピー数が同じであることを意味する。偏り度合いが１に近づくと、特定の変異部位での異なる変異を含む異なる変異体配列のコピー数は接近する。
【0073】
用語「遺伝子変異分布」は、本明細書中で、最終的に得られた遺伝子変異ライブラリー内の全ての配列における特定位置での変異の全体分布を指す。
【0074】
【表1】
【実施例】
【0075】
特定の実施例
実施例１．オリゴヌクレオチドの合成
ライブラリーの構築が必要とされる場合のアミノ酸配列は以下の通りであった：
（全部で４０７アミノ酸であり、３５番目アミノ酸は変異が必要であるアミノ酸であり、即ちアラニン（Ａｌａ）は、別の１９の一般アミノ酸、即ち、グリシン（Ｇｌｙ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｒｙ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）への変異が必要とされる）。
実施例１．オリゴヌクレオチドの合成
ライブラリーの構築が必要とされる場合のアミノ酸配列は以下の通りであった：
【化3】
（全部で４０７アミノ酸であり、３５番目アミノ酸は変異が必要であるアミノ酸であり、即ちアラニン（Ａｌａ）は、別の１９の一般アミノ酸、即ち、グリシン（Ｇｌｙ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｒｙ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）への変異が必要とされる）。
【0076】
変異が必要である全長遺伝子のヌクレオチド配列は、次の通りである（全部で１２２４ｂｐ）。
【化4】
【0077】
変異体ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列のプールを合成するためのチップを使用するため、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔに依頼した。各オリゴヌクレオチドは、３５位で他の１９の一般アミノ酸の１つの変異体アミノ酸を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列であった。各オリゴヌクレオチドは８０ｂｐ長である。特に、各アミノ酸変異の比は１／１９である。配列は次の通りである：
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＧＧＣｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号３）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＧＴＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号４）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＣＴＧｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号５）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＴＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号６）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＴＧｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号７）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＴＴＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号８）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＴＧＧｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号９）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＣＣＧｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１０）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＴＣＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１１）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＣＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１２）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＴＧＣｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１３）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＴＡＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１４）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＡＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１５）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＣＡＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１６）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＧＡＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１７）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＧＡＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１８）
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＡＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１９）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＧＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号２０）；及び
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＣＡＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号２１）。
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＧＧＣｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号３）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＧＴＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号４）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＣＴＧｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号５）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＴＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号６）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＴＧｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号７）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＴＴＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号８）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＴＧＧｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号９）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＣＣＧｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１０）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＴＣＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１１）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＣＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１２）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＴＧＣｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１３）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＴＡＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１４）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＡＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１５）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＣＡＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１６）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＧＡＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１７）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＧＡＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１８）
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＡＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号１９）；
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＡＧＡｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号２０）；及び
ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔｃｇｇｇｇｃｔｇａｃａｃｃｃｔｇｇｇｔｃａｔａｔｃＣＡＴｇａａｇｃｔｔｇｔｇｃｃａａａｇｇｃｇａａｇｃｔｇ（配列番号２１）。
【0078】
実施例２．チップにより合成されたオリゴヌクレオチドの増幅
増幅プライマーを設計し、ここでフォワードプライマーをＣｈｉｐ－Ｆと称し、リバースプライマーをＣｈｉｐ－Ｒと称した。プライマー配列は次の通りであり：Ｃｈｉｐ－Ｆ：ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃ（配列番号２２）、リバースプライマー配列は次の通りである：Ｃｈｉｐ－Ｒ：ｃａｇｃｔｔｃｇｃｃｔｔｔｇｇｃａｃａａｇｃｔｔｃ（配列番号２３）。ＰＣＲ反応系を調製し（表１を参照）、鋳型は、チップにより合成されたオリゴヌクレオチド配列のプールであり、プライマーは、上記のＣｈｉｐ－Ｆ／Ｃｈｉｐ－Ｒであり、そして反応系は、キットＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入）からのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び５×ＨＦ緩衝液も含み、水を
添加し、全体積を５０μｌにした。チップにより合成されたオリゴヌクレオチドに対し、表２に示すＰＣＲ反応手順に従い、ＰＣＲ増幅を実施した。増幅結果を図２に示す。
増幅プライマーを設計し、ここでフォワードプライマーをＣｈｉｐ－Ｆと称し、リバースプライマーをＣｈｉｐ－Ｒと称した。プライマー配列は次の通りであり：Ｃｈｉｐ－Ｆ：ａｇａａｇａｔｇｃａｇａａｃｇｃｔｔｔｇｇｔｇａｃ（配列番号２２）、リバースプライマー配列は次の通りである：Ｃｈｉｐ－Ｒ：ｃａｇｃｔｔｃｇｃｃｔｔｔｇｇｃａｃａａｇｃｔｔｃ（配列番号２３）。ＰＣＲ反応系を調製し（表１を参照）、鋳型は、チップにより合成されたオリゴヌクレオチド配列のプールであり、プライマーは、上記のＣｈｉｐ－Ｆ／Ｃｈｉｐ－Ｒであり、そして反応系は、キットＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入）からのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び５×ＨＦ緩衝液も含み、水を
添加し、全体積を５０μｌにした。チップにより合成されたオリゴヌクレオチドに対し、表２に示すＰＣＲ反応手順に従い、ＰＣＲ増幅を実施した。増幅結果を図２に示す。
【0079】
【表2】
【0080】
ＰＣＲ反応手順を表２に示す。
【0081】
【表3】
【0082】
実施例３ プライマーとしてチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチドを用いる線形増幅
鋳型として、変異されるべき全長遺伝子及びメチル化部位を含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０から抽出されたプラスミドＰＭＢ１を使用し、且つプライマーとして、実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＰＣＲ増幅を実施した。実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡであり、両鎖は各々、前方末端及び後方末端の方へ増幅するためのプライマーとして使用可能であり、両方の増幅は線形増幅であった。線形増幅に必要とされるプライマーの数は、指数関数的増幅における場合よりもはるかに少なかった。したがって、線形増幅の間、系における鋳型（即ち、プラスミド）に対するプライマー（即ち、実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチド）の比を厳密に制御することが必要である。プラスミド鋳型と実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチド（二本鎖）のモル比は１：２０であり、ＰＣＲ反応のサイクル数は１５であった。ＰＣＲ反応系を表３に示す。
鋳型として、変異されるべき全長遺伝子及びメチル化部位を含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０から抽出されたプラスミドＰＭＢ１を使用し、且つプライマーとして、実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＰＣＲ増幅を実施した。実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡであり、両鎖は各々、前方末端及び後方末端の方へ増幅するためのプライマーとして使用可能であり、両方の増幅は線形増幅であった。線形増幅に必要とされるプライマーの数は、指数関数的増幅における場合よりもはるかに少なかった。したがって、線形増幅の間、系における鋳型（即ち、プラスミド）に対するプライマー（即ち、実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチド）の比を厳密に制御することが必要である。プラスミド鋳型と実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチド（二本鎖）のモル比は１：２０であり、ＰＣＲ反応のサイクル数は１５であった。ＰＣＲ反応系を表３に示す。
【0083】
【表4】
【0084】
ＰＣＲ反応手順を表４に示す。
【0085】
【表5】
【0086】
実施例４．ＤｐｎＩによる増幅系におけるプラスミド鋳型の消化
それに続く増幅系がＰＭＢ１プラスミド鋳型を有する場合、次の増幅反応において変異を全く有しない元の全長遺伝子が作製されることになり、それ故、反応系におけるプラスミドは除去される必要があった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０株は、プラスミドにおけるＧＡＴＣのアデニンメチル化を触媒し、ＧｍＡＴＣを形成することが可能であるＤａｍメチラーゼを有する。したがって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αから抽出されたプラスミドＰＭＢ１は、メチル化修飾を有する。ＤｐｎＩは、メチル化部位ＧｍＡＴＣを認識し、切断することが可能である。増幅系におけるプラスミド鋳型は、ＤｐｎＩを加えることにより小さい断片に消化されたが、次のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用できない。酵素消化系の調製は、１０μｌのＰＣＲ反応産物、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒ０１７６Ｌ）及び１０×Ｃｕｔｓａｍｒｔを添加し、且つ水を添加し、全体積を５０μｌにすることを含んだ。反応は、ＤｐｎＩ酵素に最適な温度である３７℃で２時間実施した。
それに続く増幅系がＰＭＢ１プラスミド鋳型を有する場合、次の増幅反応において変異を全く有しない元の全長遺伝子が作製されることになり、それ故、反応系におけるプラスミドは除去される必要があった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０株は、プラスミドにおけるＧＡＴＣのアデニンメチル化を触媒し、ＧｍＡＴＣを形成することが可能であるＤａｍメチラーゼを有する。したがって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αから抽出されたプラスミドＰＭＢ１は、メチル化修飾を有する。ＤｐｎＩは、メチル化部位ＧｍＡＴＣを認識し、切断することが可能である。増幅系におけるプラスミド鋳型は、ＤｐｎＩを加えることにより小さい断片に消化されたが、次のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用できない。酵素消化系の調製は、１０μｌのＰＣＲ反応産物、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｒ０１７６Ｌ）及び１０×Ｃｕｔｓａｍｒｔを添加し、且つ水を添加し、全体積を５０μｌにすることを含んだ。反応は、ＤｐｎＩ酵素に最適な温度である３７℃で２時間実施した。
【0087】
酵素消化系を表５に示す。
【0088】
【表6】
【0089】
実施例５．最終産物を得るためのＰＣＲ増幅
遺伝子のヘッド及びテールプライマーを設計した。フォワードプライマーを遺伝子の頭部に設定し、Ｇｅｎｅ－Ｆと名付け、リバースプライマーを遺伝子の尾部に設定し、Ｇｅｎｅ－Ｒと名付けた。プライマー配列は、次の通りである：Ｇｅｎｅ－Ｆ：ａｔｇａａａｃｇｔｇｃａｔｔｔａｔｔａｔｇｇ（配列番号２４）、及びＧｅｎｅ－Ｒ：ｔｔａｇａａｃａｔｇｇｃｔｔｔｇｃｃａｔａｔ（配列番号２５）。ＰＣＲ反応系の調製は、鋳型として実施例４で得られたエンドヌクレアーゼＤｐｎＩで消化された生成系を使用し、プライマーＧｅｎｅ－Ｆ／Ｇｅｎｅ－Ｒ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び５×ＨＦ緩衝液を反応系に添加し、且つ水を添加し、全体積を５０μｌにし、遺伝子の全長配列を増幅することを含んだ。実施例３におけるプライマーとしてチップにより合成されたオリゴヌクレオチドの２本の鎖を各々用いることによって得られた（変異部位で相補的ヌクレオシドを有する、２本の一本鎖ＤＮＡであった）センス及びアンチセンスＰＣＲ増幅産物は、相補的領域により一緒に連結され、ＰＣＲ増幅反応における鋳型として使用され得る。ＰＣＲが完了後、産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。最終産物のサイズに対応するバンドは、ゲルを切断し、ａｘｙｇｅｎ ＤＮＡゲル回収キット（ＡＸＹＧＥＮから購入、物品番号：ＡＰ－ＧＸ－２５０）を使用することにより回収及び精製し、図３に示す通り、最終産物を得た。
遺伝子のヘッド及びテールプライマーを設計した。フォワードプライマーを遺伝子の頭部に設定し、Ｇｅｎｅ－Ｆと名付け、リバースプライマーを遺伝子の尾部に設定し、Ｇｅｎｅ－Ｒと名付けた。プライマー配列は、次の通りである：Ｇｅｎｅ－Ｆ：ａｔｇａａａｃｇｔｇｃａｔｔｔａｔｔａｔｇｇ（配列番号２４）、及びＧｅｎｅ－Ｒ：ｔｔａｇａａｃａｔｇｇｃｔｔｔｇｃｃａｔａｔ（配列番号２５）。ＰＣＲ反応系の調製は、鋳型として実施例４で得られたエンドヌクレアーゼＤｐｎＩで消化された生成系を使用し、プライマーＧｅｎｅ－Ｆ／Ｇｅｎｅ－Ｒ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び５×ＨＦ緩衝液を反応系に添加し、且つ水を添加し、全体積を５０μｌにし、遺伝子の全長配列を増幅することを含んだ。実施例３におけるプライマーとしてチップにより合成されたオリゴヌクレオチドの２本の鎖を各々用いることによって得られた（変異部位で相補的ヌクレオシドを有する、２本の一本鎖ＤＮＡであった）センス及びアンチセンスＰＣＲ増幅産物は、相補的領域により一緒に連結され、ＰＣＲ増幅反応における鋳型として使用され得る。ＰＣＲが完了後、産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。最終産物のサイズに対応するバンドは、ゲルを切断し、ａｘｙｇｅｎ ＤＮＡゲル回収キット（ＡＸＹＧＥＮから購入、物品番号：ＡＰ－ＧＸ－２５０）を使用することにより回収及び精製し、図３に示す通り、最終産物を得た。
【0090】
ＰＣＲ増幅の反応系を表６に示す。
【0091】
【表7】
【0092】
ＰＣＲ増幅反応の反応手順を表７に示す。
【0093】
【表8】
【0094】
実施例６．最終産物の同定
実施例５において回収及び精製されたＤＮＡをサンガー配列決定にかけ、配列決定結果を図４Ａ～４Ｃに示す。図４Ａは、標的変異部位で、即ち３５位のアミノ酸のコドン位置で（即ち、１０３～１０５位のヌクレオチドで）、変異が生じたことを示す。
実施例５において回収及び精製されたＤＮＡをサンガー配列決定にかけ、配列決定結果を図４Ａ～４Ｃに示す。図４Ａは、標的変異部位で、即ち３５位のアミノ酸のコドン位置で（即ち、１０３～１０５位のヌクレオチドで）、変異が生じたことを示す。
【0095】
実施例５において回収及び精製されたＤＮＡをハイスループット配列決定にかけ、変異部位での変異体ヌクレオチド配列及び得られたＤＮＡ配列における各変異体ヌクレオチド配列の頻度を分析した。ハイスループット配列決定結果を表８に示す。
【0096】
【表9】
【0097】
実施例７．プライマーとしてチップにより合成されたオリゴヌクレオチドを使用する線形増幅ステップにおける鋳型対プライマーの異なる比の比較
プライマーとしてチップにより合成されたオリゴヌクレオチドを使用する線形増幅ステップにおける鋳型対プライマーの異なる比を試験した。鋳型として変異されるべき全長遺伝子及びメチル化部位を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０から抽出されたプラスミドＰＭＢ１を使用し、且つプライマーとして実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＰＣＲ増幅を実施した。鋳型プラスミドと実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチド（二本鎖）のモル比は１：２５４であり、ＰＣＲ反応のサイクル数は２５であった。ＰＣＲ反応系を表８に示し、反応手順を表９に示す。次に、実施例４～６と同じステップを反復し、最
終的に得られた全長遺伝子の電気泳動結果を図５に示し、ここではバンドは浅く、強いスメアを示す。
プライマーとしてチップにより合成されたオリゴヌクレオチドを使用する線形増幅ステップにおける鋳型対プライマーの異なる比を試験した。鋳型として変異されるべき全長遺伝子及びメチル化部位を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０から抽出されたプラスミドＰＭＢ１を使用し、且つプライマーとして実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＰＣＲ増幅を実施した。鋳型プラスミドと実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチド（二本鎖）のモル比は１：２５４であり、ＰＣＲ反応のサイクル数は２５であった。ＰＣＲ反応系を表８に示し、反応手順を表９に示す。次に、実施例４～６と同じステップを反復し、最
終的に得られた全長遺伝子の電気泳動結果を図５に示し、ここではバンドは浅く、強いスメアを示す。
【0098】
【表10】
【0099】
ＰＣＲ反応手順を表９に示す。
【0100】
【表11】
【0101】
反応のサイクル数を最適化した。鋳型として変異されるべき全長遺伝子及びメチル化部位を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０から抽出されたプラスミドＰＭＢ１を使用し、且つプライマーとして実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＰＣＲ増幅を実施した。鋳型プラスミドと実施例２におけるチップにより合成された増幅されたオリゴヌクレオチド（二本鎖）のモル比は１：２５４であり、ＰＣＲ反応のサイクル数は１５に減少した。ＰＣＲ反応系を表８に示し、反応手順を表１０に示す。最終的に得られた全長遺伝子の電気泳動結果を図６に示し、ここではバンドは浅く、わずかなスメアを示す。
【0102】
【表12】
【0103】
実施例８：本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築するための方法と先行技術における遺伝子変異ライブラリーを構築するための方法との間の比較
先行技術における遺伝子変異ライブラリーを構築するための従来の方法は次の通りである：１．チップにより合成された変異体領域をＰＣＲにより増幅し、次にカラム精製を実施する、２．鋳型として変異されるべき遺伝子を使用し、変異体領域の前及び後の非変異体領域を増幅し（ここで変異体領域の前の領域及び変異体領域の後の領域は、別々に増幅される必要があり、また各々がＰＣＲ反応にかけられる）、次にアガロースゲル電気泳動を実施し、そしてゲルを切断することによりＤＮＡ断片を回収し、精製する；３．アセンブリＰＣＲにより、３つの断片を１つの断片にアセンブルする、及び４．鋳型として構築された産物を使用することにより全長断片を増幅し（精製を伴わない）、遺伝子におけるヘッド及びテールプライマーを添加し、次にアガロースゲル電気泳動を実施し、そしてゲルを切断することによりＤＮＡ断片を回収し、精製する。
先行技術における遺伝子変異ライブラリーを構築するための従来の方法は次の通りである：１．チップにより合成された変異体領域をＰＣＲにより増幅し、次にカラム精製を実施する、２．鋳型として変異されるべき遺伝子を使用し、変異体領域の前及び後の非変異体領域を増幅し（ここで変異体領域の前の領域及び変異体領域の後の領域は、別々に増幅される必要があり、また各々がＰＣＲ反応にかけられる）、次にアガロースゲル電気泳動を実施し、そしてゲルを切断することによりＤＮＡ断片を回収し、精製する；３．アセンブリＰＣＲにより、３つの断片を１つの断片にアセンブルする、及び４．鋳型として構築された産物を使用することにより全長断片を増幅し（精製を伴わない）、遺伝子におけるヘッド及びテールプライマーを添加し、次にアガロースゲル電気泳動を実施し、そしてゲルを切断することによりＤＮＡ断片を回収し、精製する。
【0104】
先行技術における遺伝子変異ライブラリーを構築するための上の従来の方法は全体で約６．５時間かかる一方で、本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築するための方法は約５．５時間かかる。本発明の遺伝子変異ライブラリーを構築するための方法がより少ないステップを有し、時間を節約することは理解することができる。
【0105】
さらに、それが実行可能であり、本発明の要点に明らかには違反しないことを前提として、本説明における技術的解決法の構成要素として記載された任意の技術的特徴又は技術的特徴の組み合わせは、他の技術的解決法にも適用可能であり；さらに、それが実行可能であり、本発明の要点に明らかには違反しないことを前提として、異なる技術的解決法の構成要素として記載された技術的特徴は、いかなる方法であっても組み合わせることで、他の技術的解決法を得ることも可能であることは注目されるべきである。本発明は、上記の場合における組み合わせることにより得られる技術的解決法も含み、これらの技術的解決法は、本発明において記載されていることに相当する。
【0106】
本発明は、具体的な実施形態及び実施例によって説明されたが、当業者であれば、これらが本発明の範囲を限定することが意図されないことを理解する必要がある。本発明の範囲は、特許請求の範囲により決定されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】