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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-09
(54)【発明の名称】耐糖能異常障害を決定する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20230302BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230302BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20230302BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20230302BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N33/53 D
C12N15/115 Z
C12Q1/686 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022540737
(86)(22)【出願日】2021-01-08
(85)【翻訳文提出日】2022-06-30
(86)【国際出願番号】 US2021012612
(87)【国際公開番号】W WO2021142200
(87)【国際公開日】2021-07-15
(31)【優先権主張番号】62/959,660
(32)【優先日】2020-01-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｌｉｎｕｘ
２．ＴＷＥＥＮ
３．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】505373306
【氏名又は名称】ソマロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハガー ヨランダ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045DA36
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QX02
(57)【要約】
対象が耐糖能異常障害、具体的には、前糖尿病または糖尿病に罹患しているか否かを決定するための方法、組成物、及びキットを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象での耐糖能異常障害の有無、または対象が耐糖能異常障害を有している尤度を決定する方法であって、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成すること、及び、前記対象から得た試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含み、また、Ｎは、少なくとも３であり、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する、前記方法。
【請求項2】
対象での前糖尿病の有無、または対象が前糖尿病もしくは糖尿病を発症する尤度を決定する方法であって、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成すること、及び、前記対象から得た試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含み、また、Ｎは、少なくとも３であり、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する、前記方法。
【請求項3】
試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のレベルを検出する方法であって、対象から前記試料を得ること、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成すること、及び前記対象から得た前記試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含み、Ｎは、少なくとも３であり、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する、前記方法。
【請求項4】
Ｎが３～４１、またはＮが４～４１、またはＮが５～４１、またはＮが６～４１、またはＮが７～４１、またはＮが８～４１、またはＮが９～４１、またはＮが１０～４１、またはＮが１１～４１、またはＮが１２～４１、またはＮが１３～４１、またはＮが１４～４１、またはＮが１５～４１、またはＮが１６～４１である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
Ｎが３、またはＮが４、またはＮが５、またはＮが６、またはＮが７、またはＮが８、またはＮが９、またはＮが１０、またはＮが１１、またはＮが１２、またはＮが１３、またはＮが１４、またはＮが１５、またはＮが１６、またはＮが１７、またはＮが１８、またはＮが１９、またはＮが２０、またはＮが２１、またはＮが２２、またはＮが２３、またはＮが２４、またはＮが２５、またはＮが２６、またはＮが２７、またはＮが２８、またはＮが２９、またはＮが３０、またはＮが３１、またはＮが３２、またはＮが３３、またはＮが３４、またはＮが３５、またはＮが３６、またはＮが３７、またはＮが３８、またはＮが３９、またはＮが４０、またはＮが４１である先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質のそれぞれを、表１から選択する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、及びＫＩＮから選択する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の１つまたは２つが、ＩＮＨＢＣ及び／またはＳＨＢＧである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
Ｎ個の前記タンパク質バイオマーカーの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個を、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個を、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＨＴＲＡ１、ＣＨＡＤ、ＣＰＭ、ＤＬＫ１、ＨＥＲＣ１、ＩＬ２０ＲＢ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＧＰＸ２、及びＦＧＦＲ４から選択する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＩＮＨＢＣ及びＡＣＹ１である、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＳＨＢＧ及びＡＣＹ１である、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の３つが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＡＣＹ１である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＩＮＨＢＣ及びＣＯＬ１Ａ１である、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＳＨＢＧ及びＣＯＬ１Ａ１である、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の３つが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＯＬ１Ａ１である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＩＮＨＢＣ及びＲＴＮ４Ｒである、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＳＨＢＧ及びＲＴＮ４Ｒである、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の３つが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＲＴＮ４Ｒである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＩＮＨＢＣ及びＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体である、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＳＨＢＧ及びＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体である、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の３つが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＩＮＨＢＣ及びＣＢＸ７である、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＳＨＢＧ及びＣＢＸ７である、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の３つが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＢＸ７である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＩＮＨＢＣ及びＫＩＮである、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の２つが、ＳＨＢＧ及びＫＩＮである、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質の３つが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＫＩＮである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
Ｎは、少なくとも５である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも５つが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、及びＲＴＮ４Ｒである先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
Ｎは、少なくとも１６である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質の少なくとも１６個が、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＨＴＲＡ１である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記試料が、血液試料、血漿試料、または血清試料である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記対象が、普通の食事を続ける、かつ、前記試料を得る前にグルコース溶液を前記対象に投与しない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
それぞれのバイオマーカーのコントロールレベルよりも高レベルにあるＳＨＢＧ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＣＨＡＤ、ＩＬ２０ＲＢ、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＣＡＬＢ１、ＦＧＦＲ４、ＯＳＴＭ１、ＩＴＩＨ１、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する少なくとも１つのバイオマーカーのレベルは、前記対象が、耐糖能異常障害を有する、または有する可能性が高い、前糖尿病を発症している、または発症する可能性が高い、及び／または糖尿病を発症する可能性が高いことを示す、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
それぞれのバイオマーカーのコントロールレベルよりも低レベルにあるＩＮＨＢＣ、ＡＣＹ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＢＸ７、ＴＦＦ３、ＨＴＲＡ１、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＣＰＭ、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＤＬＫ１、ＨＥＲＣ１、ＳＴＣ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＧＰＸ２、ＣＣＬ２３、ＲＮＡＳＥ１０、及びＺＮＦ１３４から選択する少なくとも１つのバイオマーカーのレベルは、前記対象が、耐糖能異常障害を有する、または有する可能性が高い、前糖尿病を発症している、または発症する可能性が高い、及び／または糖尿病を発症する可能性が高いことを示す、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記対象が、糖尿病を発症するリスクがある、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記対象が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高いかを決定することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記対象が、耐糖能異常障害を有する可能性が高い、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記対象が、耐糖能異常障害を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
前記対象が、前糖尿病を発症する可能性が高いか、または前糖尿病であるかを決定することを含む、請求項２～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記対象が、前糖尿病を発症する可能性が高い、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記対象が、前糖尿病である、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記対象が、糖尿病を発症する可能性が高い、請求項２５、２６、２８、及び２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記糖尿病が、２型糖尿病である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記対象を治療することを含む、請求項２１～２３、２５、２６、及び２８～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記治療が、インスリン、メトホルミン、減量プログラムの実施、食事制限の実施、カロリー制限の実施、及び／または運動プログラムの実施を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
１つ以上の前記試料のバイオマーカータンパク質を、一組のバイオマーカー捕捉試薬と接触させることを含み、また、一組の前記バイオマーカー捕捉試薬のそれぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、検出した異なるバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、抗体またはアプタマーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、アプタマーである、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
少なくとも１つのアプタマーが、低速オフレートを示すアプタマーである、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
低速オフレートを示す少なくとも１つのアプタマーでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または、少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受けている、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
低速オフレートを示すそれぞれのアプタマーが、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）で、それらの標的タンパク質に結合する、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記対象が、耐糖能異常障害を有する、または、有する可能性が高い、前糖尿病である、または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高い場合、前記対象に対して、体重の減量、血糖コントロール、及び／または薬物治療を含むレジメンを勧める、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記決定を、分類モデルまたはエラスティックネットロジスティック回帰モデルを使用して、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質レベルのレベルを解析することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
医療保険料、または、生命保険料を決定する目的で、前記対象が、耐糖能異常障害を有する、もしくは、有する可能性が高い、前糖尿病である、または前糖尿病もしくは糖尿病を発症する可能性が高いか否かを決定することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記方法が、医療保険料または生命保険料を決定することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記方法が、前記方法から得た情報を使用して、医療資源の利用を予測及び／または管理することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
Ｎ個のバイオマーカータンパク質捕捉試薬を含むキットであって、Ｎが、少なくとも３である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の少なくとも１つが、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択するバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、前記キット。
【請求項46】
Ｎが３～４１、またはＮが４～４１、またはＮが５～４１、またはＮが６～４１、またはＮが７～４１、またはＮが８～４１、またはＮが９～４１、またはＮが１０～４１、またはＮが１１～４１、またはＮが１２～４１、またはＮが１３～４１、またはＮが１４～４１、またはＮが１５～４１、またはＮが１６～４１である、請求項４５に記載のキット。
【請求項47】
Ｎが３、またはＮが４、またはＮが５、またはＮが６、またはＮが７、またはＮが８、またはＮが９、またはＮが１０、またはＮが１１、またはＮが１２、またはＮが１３、またはＮが１４、またはＮが１５、またはＮが１６、またはＮが１７、またはＮが１８、またはＮが１９、またはＮが２０、またはＮが２１、またはＮが２２、またはＮが２３、またはＮが２４、またはＮが２５、またはＮが２６、またはＮが２７、またはＮが２８、またはＮが２９、またはＮが３０、またはＮが３１、またはＮが３２、またはＮが３３、またはＮが３４、またはＮが３５、またはＮが３６、またはＮが３７、またはＮが３８、またはＮが３９、またはＮが４０、またはＮが４１である、請求項４５または４６に記載のキット。
【請求項48】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬のそれぞれが、異なるバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～４７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項49】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬のそれぞれが、表１から選択するバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～４８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項50】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の少なくとも１つが、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、及びＫＩＮから選択するバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～４９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項51】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の１つまたは２つが、ＩＮＨＢＣ及び／またはＳＨＢＧに対して特異的に結合する、請求項４５～５０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項52】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の少なくとも２つ、または少なくとも３つのそれぞれが、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択するタンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～５１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項53】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の少なくとも１つが、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＨＴＲＡ１、ＣＨＡＤ、ＣＰＭ、ＤＬＫ１、ＨＥＲＣ１、ＩＬ２０ＲＢ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＧＰＸ２、及びＦＧＦＲ４から選択するタンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項54】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣもしくはＡＣＹ１に対して特異的に結合する、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＳＨＢＧもしくはＡＣＹ１に対して特異的に結合する、または、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の３つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＡＣＹ１から選択したバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～５３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項55】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣもしくはＣＯＬ１Ａ１に対して特異的に結合する、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＳＨＢＧもしくはＣＯＬ１Ａ１に対して特異的に結合する、または、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の内の３つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＯＬ１Ａ１から選択したバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～５４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項56】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣもしくはＲＴＮ４Ｒに対して特異的に結合する、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＳＨＢＧもしくはＲＴＮ４Ｒに対して特異的に結合する、または、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の３つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＲＴＮ４Ｒから選択したバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～５５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項57】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣもしくはＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体に対して特異的に結合する、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＳＨＢＧもしくはＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体に対して特異的に結合する、または、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の３つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体から選択したバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～５６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項58】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣもしくはＣＢＸ７に対して特異的に結合する、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＳＨＢＧもしくはＣＢＸ７に対して特異的に結合する、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の３つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＢＸ７から選択したバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～５７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項59】
Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣもしくはＫＩＮに対して特異的に結合する、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の２つのそれぞれが、ＳＨＢＧもしくはＫＩＮに対して特異的に結合する、またはＮ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の３つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＫＩＮから選択したバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項60】
Ｎは、少なくとも５である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の５つのそれぞれが、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、及びＲＴＮ４Ｒから選択するバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～５９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項61】
Ｎは、少なくとも１６である、かつ、Ｎ個の前記バイオマーカータンパク質捕捉試薬の１６個のそれぞれが、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＨＴＲＡ１から選択するバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する、請求項４５～６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項62】
Ｎ個の前記バイオマーカー捕捉試薬のそれぞれが、抗体またはアプタマーである、請求項４５～６１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項63】
それぞれのバイオマーカー捕捉試薬が、アプタマーである、請求項６２に記載のキット。
【請求項64】
少なくとも１つのアプタマーが、低速オフレートを示すアプタマーである、請求項６３に記載のキット。
【請求項65】
低速オフレートを示す少なくとも１つのアプタマーでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受けている、請求項６４に記載のキット。
【請求項66】
低速オフレートを示すそれぞれのアプタマーが、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）で、それらの標的タンパク質に結合する、請求項６４または請求項６５に記載のキット。
【請求項67】
対象から得た試料でのＮ個の前記バイオマーカータンパク質の検出において使用する請求項４５～６６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項68】
前記対象が、耐糖能異常障害を有するか、もしくは、有する可能性が高いか、または、前糖尿病であるか、または前糖尿病もしくは糖尿病を発症する可能性が高いか否かの決定において使用する請求項６７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年１月１０日に出願した米国仮出願第６２／９５９，６６０号の優先権の利益を主張するものであり、この出願を、あらゆる目的で、その全内容を、参照により、本明細書に記載した一部を構成するものとして援用する。
本出願は、２０２０年１月１０日に出願した米国仮出願第６２／９５９，６６０号の優先権の利益を主張するものであり、この出願を、あらゆる目的で、その全内容を、参照により、本明細書に記載した一部を構成するものとして援用する。
【0002】
発明の分野
本出願は、一般的に、バイオマーカーの検出、及び耐糖能の特徴決定に関連しており、例えば、前糖尿病または糖尿病の兆候である耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い対象を特定する。様々な実施形態では、本発明は、耐糖能異常障害の特徴決定を行うための１つ以上のバイオマーカー、方法、機器、試薬、システム、及びキットに関する。
本出願は、一般的に、バイオマーカーの検出、及び耐糖能の特徴決定に関連しており、例えば、前糖尿病または糖尿病の兆候である耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い対象を特定する。様々な実施形態では、本発明は、耐糖能異常障害の特徴決定を行うための１つ以上のバイオマーカー、方法、機器、試薬、システム、及びキットに関する。
【背景技術】
【0003】
背景
耐糖能を決定する現在の方法では、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の参加者に対して、２時間の血漿ブドウ糖レベルを測定する。一般的なＯＧＴＴは、一晩の絶食の後に、７５グラムの経口ブドウ糖溶液を摂取して、ベースライン（「空腹時血漿ブドウ糖」）、及び摂取後２時間（「２時間－ＯＧＴＴブドウ糖値」）において血漿ブドウ糖測定を行う。現在のところ、２型糖尿病の臨床的診断には、空腹時血漿グルコース、及び２時間ＯＧＴＴ血漿グルコースの両方が、ＨｂＡ１ｃ値をも含めて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎで採用されている。２型糖尿病の予防は、主として、耐糖能異常障害を有する方々に基づいて評価をしており、２時間のＯＧＴＴ血漿グルコースレベルを≧７．８ｍｍｏｌ／Ｌで定義している。例えば、Ｋｎｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００２；３４６：３９３－４０３及びＴｕｏｍｉｌｅｈｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００１；３４４：１３４３－１３５０を参照されたい。絶食またはブドウ糖の投与を必要とせず、耐糖能異常障害に対するＯＧＴＴ血漿ブドウ糖閾値を示すプロテオミクスモデルの開発が待望されている。
耐糖能を決定する現在の方法では、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の参加者に対して、２時間の血漿ブドウ糖レベルを測定する。一般的なＯＧＴＴは、一晩の絶食の後に、７５グラムの経口ブドウ糖溶液を摂取して、ベースライン（「空腹時血漿ブドウ糖」）、及び摂取後２時間（「２時間－ＯＧＴＴブドウ糖値」）において血漿ブドウ糖測定を行う。現在のところ、２型糖尿病の臨床的診断には、空腹時血漿グルコース、及び２時間ＯＧＴＴ血漿グルコースの両方が、ＨｂＡ１ｃ値をも含めて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎで採用されている。２型糖尿病の予防は、主として、耐糖能異常障害を有する方々に基づいて評価をしており、２時間のＯＧＴＴ血漿グルコースレベルを≧７．８ｍｍｏｌ／Ｌで定義している。例えば、Ｋｎｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００２；３４６：３９３－４０３及びＴｕｏｍｉｌｅｈｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００１；３４４：１３４３－１３５０を参照されたい。絶食またはブドウ糖の投与を必要とせず、耐糖能異常障害に対するＯＧＴＴ血漿ブドウ糖閾値を示すプロテオミクスモデルの開発が待望されている。
【発明の概要】
【0004】
概要
一部の実施形態では、対象が耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高いか否かを決定する方法を提供する。一部の実施形態では、前糖尿病である対象、または前糖尿病を発症する可能性が高い対象を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、糖尿病を発症する可能性が高い対象を同定する方法を提供する。
一部の実施形態では、対象が耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高いか否かを決定する方法を提供する。一部の実施形態では、前糖尿病である対象、または前糖尿病を発症する可能性が高い対象を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、糖尿病を発症する可能性が高い対象を同定する方法を提供する。
【0005】
一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、対象が前糖尿病または糖尿病の兆候である耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高いか否かを決定する方法であり、この方法は、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、及び、対象から得た試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含み、また、Ｎは、少なくとも３つである、そして、Ｎ個の当該バイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する。一部の実施形態では、Ｎは３～４１、Ｎは４～４１、Ｎは５～４１、またはＮは６～４１、またはＮは７～４１、またはＮは８～４１、またはＮは９～４１、またはＮは１０～４１、またはＮは１１～４１、またはＮは１２～４１、またはＮは１３～４１、またはＮは１４～４１、またはＮは１５～４１、またはＮは１６～４１、またはＮは少なくとも４である、またはＮは少なくとも５である、またはＮは少なくとも６である、またはＮは少なくとも７である、またはＮは少なくとも８である、またはＮは少なくとも９である、またはＮは少なくとも１０である、またはＮは少なくとも１１である、またはＮは少なくとも１２である、または、Ｎは少なくとも１３である、または、Ｎは少なくとも１４である、または、Ｎは少なくとも１５である、またはＮは少なくとも１６である。一部の実施形態では、Ｎは３である、またはＮは４である、またはＮは５である、またはＮは６である、またはＮは７である、またはＮは８である、またはＮは９である、またはＮは１０である、またはＮは１１である、またはＮは１２である、またはＮは１３である、またはＮは１４である、またはＮは１５である、またはＮは１６である、またはＮは１７である、またはＮは１８である、またはＮは１９である、またはＮは２０である、またはＮは２１である、またはＮは２２である、またはＮは２３である、またはＮは２４である、またはＮは２５である、またはＮは２６である、またはＮは２７である、またはＮは２８である、またはＮは２９である、またはＮは３０である、またはＮは３１である、またはＮは３２である、またはＮは３３である、またはＮは３４である、またはＮは３５である、またはＮは３６である、またはＮは３７である、またはＮは３８である、またはＮは３９である、またはＮは４０である、またはＮは４１である。一部の実施形態では、対象は、耐糖能異常障害を有する。一部の実施形態では、対象は、耐糖能異常障害を有する可能性が高い。一部の実施形態では、対象は、前糖尿病を発症する可能性が高い。一部の実施形態では、対象は、前糖尿病である。一部の実施形態では、対象は、糖尿病を発症する可能性が高い。一部の実施形態では、対象は、耐糖能異常障害と糖尿病とを併発している。一部の実施形態では、糖尿病を発症する可能性が高い対象は、糖尿病の発症を抑制するために、予防措置を講じる、または予防的治療を受ける。
【0006】
一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカーのそれぞれを、表１から選択する。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、及びＫＩＮから選択する。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の１つまたは２つは、ＩＮＨＢＣ及び／またはＳＨＢＧである。一部の実施形態では、Ｎ個のタンパク質バイオマーカーの少なくとも２つ、または少なくとも３つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＨＴＲＡ１、ＣＨＡＤ、ＣＰＭ、ＤＬＫ１、ＨＥＲＣ１、ＩＬ２０ＲＢ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＧＰＸ２、及びＦＧＦＲ４から選択する。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＡＣＹ１である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＡＣＹ１である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＡＣＹ１である。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＣＯＬ１Ａ１である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＣＯＬ１Ａ１である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＯＬ１Ａ１である。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＲＴＮ４Ｒである、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＲＴＮ４Ｒである、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＲＴＮ４Ｒである。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体である。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＣＢＸ７である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＣＢＸ７である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＢＸ７である。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＫＩＮである、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＫＩＮである、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＫＩＮである。一部の実施形態では、Ｎは少なくとも５つであり、かつ、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の５つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、及びＲＴＮ４Ｒである。一部の実施形態では、Ｎは少なくとも１６である、かつ、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の１６個は、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＨＴＲＡ１である。
【0007】
本明細書に記載したいずれの実施形態でも、対象は、耐糖能異常障害を発症するリスクを持ち得る。本明細書に記載したいずれの実施形態でも、対象は、前糖尿病を発症するリスクを持ち得る。本明細書に記載したいずれの実施形態でも、対象は、糖尿病を発症するリスクを持ち得る。一部の実施形態では、この方法は、対象が、前糖尿病または糖尿病の兆候である耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高いか否かを決定することを含む。一部の実施形態では、この方法は、対象が、前糖尿病であるか否か、または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いか否かを決定することを含む。一部の実施形態では、糖尿病は、２型糖尿病である。一部の実施形態では、この方法は、対象を治療することを含む。一部の実施形態では、治療は、対象に対して、インスリン及び／またはメトホルミンを投与することを含む。一部の実施形態では、治療は、対象のための減量プログラムの実施、食事制限の実施、カロリー制限の実施、及び／または運動プログラムの実施を含む。
【0008】
本明細書に記載したいずれの実施形態のいずれでも、Ｎ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれは、互いに相違する。一部の実施形態では、この方法は、対象から得た試料のバイオマーカーを、一組のバイオマーカー捕捉試薬と接触させることを含み、そして、一組のバイオマーカー捕捉試薬のそれぞれのバイオマーカー捕捉試薬は、検出する異なるバイオマーカーに対して特異的に結合する。一部の実施形態では、それぞれのバイオマーカー捕捉試薬は、抗体またはアプタマーである。一部の実施形態では、それぞれのバイオマーカー捕捉試薬は、アプタマーである。一部の実施形態では、少なくとも１つのアプタマーは、低速オフレートを示すアプタマーである。一部の実施形態では、少なくとも１つの低速オフレートを示すアプタマーでは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受けている。一部の実施形態では、低速オフレートを示すそれぞれのアプタマーは、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）で、バイオマーカータンパク質に結合する。
【0009】
本明細書に記載したいずれの実施形態でも、試料を、血液試料とし得る。本明細書に記載したいずれの実施形態でも、試料は、血清試料または血漿試料から選択し得る。本明細書に記載したいずれの実施形態でも、試料は、血漿試料である。一部の実施形態では、対象は、試料を提供する前に普通の食事をする、また、この普通の食事では、空腹時が通常よりも長くならないようにする。
【0010】
一部の実施形態では、それぞれのバイオマーカーのコントロールレベルよりも高レベルであるＳＨＢＧ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＣＨＡＤ、ＩＬ２０ＲＢ、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＣＡＬＢ１、ＦＧＦＲ４、ＯＳＴＭ１、ＩＴＩＨ１、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する少なくとも１つのバイオマーカーのレベルは、対象が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い、前糖尿病である、及び／または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いことを示す。
【0011】
一部の実施形態では、それぞれのバイオマーカーのコントロールレベルよりも低レベルであるＩＮＨＢＣ、ＡＣＹ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＢＸ７、ＴＦＦ３、ＨＴＲＡ１、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＣＰＭ、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＤＬＫ１、ＨＥＲＣ１、ＳＴＣ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＧＰＸ２、ＣＣＬ２３、ＲＮＡＳＥ１０、及びＺＮＦ１３４から選択する少なくとも１つのバイオマーカーのレベルは、対象が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い、前糖尿病である、及び／または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いことを示す。
【0012】
一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、医療保険料または生命保険料を決定することを目的とする。一部の実施形態では、この方法は、医療保険料または生命保険料を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、この方法で得られる情報を使用して、医療資源の利用を予測及び／または管理することをさらに含む。
【0013】
一部の実施形態では、キットを提供する。一部の実施形態では、キットは、Ｎ個のバイオマーカータンパク質捕捉試薬を含み、また、Ｎは少なくとも３つである、かつ、Ｎ個のバイオマーカータンパク質捕捉試薬の少なくとも１つが、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択するバイオマーカータンパク質に対して特異的に結合する。一部の実施形態ではで、Ｎは３～４１である、またはＮは４～４１である、またはＮは５～４１である、またはＮは６～４１である、またはＮは７～４１である、またはＮは８～４１である、またはＮは９～４１である、またはＮは１０～４１である、またはＮは１１～４１である、またはＮは１２～４１である、またはＮは１３～４１である、またはＮは１４～４１である、またはＮは１５～４１である、またはＮは１６～４１である、またはＮは少なくとも４である、またはＮは少なくとも５である、またはＮは少なくとも６である、またはＮは少なくとも７である、またはＮは少なくとも８である、またはＮは少なくとも９である、またはＮは少なくとも１０である、またはＮは少なくとも１１である、またはＮは少なくとも１２である、またはＮは少なくとも１３である、またはＮは少なくとも１４である、またはＮは少なくとも１５である、またはＮは少なくとも１６である。一部の実施形態では、Ｎは３である、またはＮは４である、またはＮは５である、またはＮは６である、またはＮは７である、またはＮは８である、またはＮは９である、またはＮは１０である、またはＮは１１である、またはＮは１２である、またはＮは１３である、またはＮは１４である、またはＮは１５である、またはＮは１６である、またはＮは１７である、またはＮは１８である、またはＮは１９である、またはＮは２０である、またはＮは２１である、またはＮは２２である、またはＮは２３である、またはＮは２４である、またはＮは２５である、またはＮは２６である、またはＮは２７である、またはＮは２８である、またはＮは２９である、またはＮは３０である、またはＮは３１である、またはＮは３２である、またはＮは３３である、またはＮは３４である、またはＮは３５である、またはＮは３６である、またはＮは３７である、またはＮは３８である、またはＮは３９である、またはＮは４０である、またはＮは４１である。一部の実施形態では、キットは、試料に含まれるＮ個のバイオマーカータンパク質のレベルを検出するために使用する、また、この試料は、対象由来のものである。一部の実施形態では、キットは、対象が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い、前糖尿病であるか否か、及び／または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いか否かを決定するために使用する。
【0014】
一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカーのそれぞれを、表１から選択する。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、及びＫＩＮから選択する。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の１つまたは２つは、ＩＮＨＢＣ及び／またはＳＨＢＧである。一部の実施形態では、Ｎ個のタンパク質バイオマーカーの少なくとも２つまたは少なくとも３つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＨＴＲＡ１、ＣＨＡＤ、ＣＰＭ、ＤＬＫ１、ＨＥＲＣ１、ＩＬ２０ＲＢ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＧＰＸ２、及びＦＧＦＲ４から選択する。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＡＣＹ１である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＡＣＹ１である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つはＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＡＣＹ１である。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＣＯＬ１Ａ１である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＣＯＬ１Ａ１である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＯＬ１Ａ１である。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＲＴＮ４Ｒである、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＲＴＮ４Ｒである、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＲＴＮ４Ｒである。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体である。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＣＢＸ７である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＣＢＸ７である、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＣＢＸ７である。一部の実施形態では、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＩＮＨＢＣ及びＫＩＮである、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の２つは、ＳＨＢＧ及びＫＩＮである、またはＮ個のバイオマーカータンパク質の内の３つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、及びＫＩＮである。一部の実施形態では、Ｎは、少なくとも５である、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の５つは、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、及びＲＴＮ４Ｒである。一部の実施形態では、Ｎは、少なくとも１６である、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の内の１６個は、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＨＴＲＡ１である。
【0015】
一部の実施形態では、それぞれのバイオマーカー捕捉試薬は、抗体またはアプタマーである。一部の実施形態では、それぞれのバイオマーカー捕捉試薬は、アプタマーである。一部の実施形態では、少なくとも１つのアプタマーは、低速オフレートを示すアプタマーである。
【0016】
一部の実施形態では、それぞれの低速オフレートを示すアプタマーは、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）で、バイオマーカータンパク質に結合する。
【0017】
本明細書に記載したいずれの実施形態でも、試料を、血液試料とし得る。本明細書に記載したいずれの実施形態でも、試料を、血清試料及び血漿試料から選択し得る。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。
【0018】
本明細書に記載したいずれの実施形態でも、Ｎ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれは、その他のＮ個のバイオマーカータンパク質とは相違する。本明細書に記載したいずれの実施形態でも、少なくとも１つの低速オフレートを示すアプタマーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のヌクレオチドが修飾を受けている。一部の実施形態では、修飾は、疎水性修飾である。一部の実施形態では、修飾は、疎水性塩基修飾である。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、図２に示す改変から選択し得る。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】Ａは、実施例４に記載したように、一度に１つのバイオマーカータンパク質をモデルに加えるモデルの結果を示す。Ｂは、実施例４に記載したように、一度に１つのバイオマーカータンパク質をモデルから減らすモデルの結果を示す。Ｃは、実施例４に記載したように、表１から無作為に選択したＮ個のバイオマーカーを含むモデルの結果を示す。
【図2】アプタマーで使用することができる特定の核酸塩基修飾を示す。
【図3】コンピューターで実施する様々な方法での使用のための本明細書に記載した例示的なコンピューターシステムを示しているが、これらに限定されない。
【図4】従来のＯＧＴＴ（ｘ軸）で決定したレベルを使用して、実施例２（ｙ軸）に記載した方法で決定した耐糖能状態を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
詳細な説明
本発明を、代表的な特定の実施形態と併せて説明をするが、本発明は、特許請求の範囲によって定義されており、それらの実施形態に限定するものでない、ことを理解されたい。
本発明を、代表的な特定の実施形態と併せて説明をするが、本発明は、特許請求の範囲によって定義されており、それらの実施形態に限定するものでない、ことを理解されたい。
【0021】
当業者であれば、本明細書に記載したものと類似または同等の数多くの方法及び材料が、本発明を実施するにあたって使用し得ることを認識する。本発明は、本明細書に記載した方法及び材料に限定することは、決してない。
【0022】
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が、一般的に理解する意味を有する。本明細書に記載したものと類似または同等のあらゆる方法、装置、及び材料を、本発明の実施に使用することができるが、特定の方法、装置、及び材料を、本明細書に記載している。
【0023】
本明細書で引用するすべての刊行物、公開特許公報、及び特許出願は、それぞれの個別の刊行物、公開特許公報、または特許出願を、参照により、あたかも具体的かつ個別に示したものと同然に、参照により、それらの内容を本明細書で援用する。
【0024】
本明細書に添付した許請求の範囲を含めて、本出願で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確にその他の事項を指していない限り、複数形を含む、また、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」及び「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」と互換可能に使用し得る。したがって、「アプタマー」とは、アプタマーの混合物を含み、「プローブ」とは、プローブの混合物などを含む。
【0025】
本明細書で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び、それらのあらゆる変形は、プロセス、方法、プロダクト－バイ－プロセス、または、要素を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、または含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）組成物などを排他的に含むことは意図していない、そして、要素の一覧は、その一覧に明示されていないその他の要素を含み得る。
【0026】
本出願は、対象が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高いか否か、または前糖尿病及び／または糖尿病を発症しているか、または発症する可能性が高いか否かを決定するためのバイオマーカー、方法、機器、試薬、システム、及びキットを含む。一部の実施形態では、耐糖能異常障害の対象が、前糖尿病または糖尿病を発症しているか、または発症する可能性が高いか否かを決定するためのバイオマーカー、方法、機器、試薬、システム、及びキットを提供する。
【0027】
本明細書で使用する用語「ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体」は、ＣＲＬＦ１及び／またはＣＬＣＦ１、及び／またはＣＲＬＦ１とＣＬＣＦ１の複合体のことを指すために使用する。したがって、方法が、バイオマーカー「ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体」を検出することを含むのであれば、その方法は、ＣＲＬＦ１、ＣＬＣＦ１、ＣＲＬＦ１とＣＬＣＦ１の両方、及び／またはＣＲＬＦ１とＣＬＣＦ１との複合体を検出することを含み得る。ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体に対して特異的に結合するバイオマーカー捕捉試薬は、ＣＲＬＦ１、及び／またはＣＬＣＦ１、及び／またはＣＲＬＦ１とＣＬＣＦ１の両方、及び／またはＣＲＬＦ１とＣＬＣＦ１との複合体に結合し得る。
【0028】
一部の実施形態では、単独で、または様々な組み合わせで、対象が耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い、または前糖尿病及び／または糖尿病を発症しているか、または発症する可能性が高いか否かを決定する。後述するように、例示的な実施形態として、表１に提供するバイオマーカーがある。
【0029】
バイオマーカーは、多重化アプタマーをベースとしたアッセイを使用して同定した。表１に、耐糖能を有する個体から得た試料と、耐糖能異常障害を有する個体から得た試料を識別する上で役立つバイオマーカーを示す。
【0030】
用語「感受性」及び「特異性」は、生物学的試料で検出した１つ以上のバイオマーカーレベルに基づいて、疾患を有する個体、または疾患を持たない個体を正しく見分ける能力に関して本明細書で使用する。一部の実施形態では、用語「感受性」及び「特異性」は、生物学的試料で検出した１つ以上のバイオマーカーレベルに基づいて、耐糖能異常障害を有する個体、または正常な耐糖能を有する個体を正しく見分ける能力に関して本明細書で使用し得る。そのような実施形態では、「感受性」は、耐糖能異常障害を有する個体を正しく見分けるバイオマーカー（複数可）の性能を示す。「特異性」は、耐糖能異常障害を持たない個体を正しく見分けるバイオマーカー（複数可）の性能を示す。例えば、バイオマーカーのパネルに対して、８５％の特異性と９０％の感受性を試験するために使用した、一連のコントロール試料（健康な個体または耐糖能異常障害を持っていないことが明らかな対象からの試料など）、及び試験試料（耐糖能異常障害を有する個体の試料など）は、コントロール試料の８５％が、パネルではコントロール試料として正しく分類されており、かつ、試験試料の９０％が、パネルでは試験試料として正しく分類されている。
【0031】
一部の実施形態では、用語「感受性」及び「特異性」は、試料で検出した１つ以上のバイオマーカーレベルに基づいて、一般的には、前糖尿病の兆候であり、かつ、一部の事例では、糖尿病を示し得る個体については、耐糖能異常障害を有する個体として正しく見分ける能力として本明細書で使用し得る。「感受性」は、一般的には、前糖尿病の兆候であり、かつ、一部の事例では、糖尿病を示し得る個体については、耐糖能異常障害を有する個体を正しく見分けるバイオマーカー（複数可）の性能を示す。「特異性」は、一般的には、前糖尿病の兆候であり、かつ、一部の事例では、糖尿病を示し得る個体については、耐糖能異常障害を持たない個体を正しく見分けるバイオマーカー（複数可）の性能を示す。例えば、正常耐糖能を有する個体から得た試料のセットを試験するために使用するバイオマーカーのパネルに関して８５％の特異性と９０％の感受性であれば、８５％の個体を正しくも見分ける。同様に、耐糖能異常障害を有する個体から得た試料のセットでは、個体の９０％が正しく分類される。
【0032】
一部の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーのパネルの全体的な性能を、曲線下面積（ＡＵＣ）値で表す。このＡＵＣ値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線から導き出す。このＲＯＣ曲線は、試験の偽陽性率（１－特異度）に対する試験の真正陽性率（感受性）のプロットである。用語「曲線下面積」または「ＡＵＣ」は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積のことを指しており、これらは、両方ともに、当該技術分野で周知である。ＡＵＣの測定は、完全なデータ範囲にわたって分類器の精度を比較する上で役立つ。ＡＵＣが大きい分類器は、関心を寄せた２つのグループの間（例えば、正常な個体と糖尿病の個体、または耐糖能異常障害のある個体と糖尿病であり得る個体）で未知数を正しく分類する能力を高める。ＲＯＣ曲線は、２つの母集団を区別する際に、特定の機能（例えば、本明細書で説明するバイオマーカーのいずれか、及び／またはさらなる生物医学情報のあらゆる特徴）のパフォーマンスをプロットする上で役立つ。一般的には、母集団全体の機能データを、単一の機能の値に基づいて昇順で並べ替える。次に、その機能に関するそれぞれの数値に関して、データの真陽性率と偽陽性率を計算する。真陽性率は、その機能の数値を超える事例の数を計数して、事例の総数で割って決定する。偽陽性率は、その機能の数値を超えるコントロールの数を計数して、コントロールの総数で割って決定する。この定義は、コントロールと比較して機能が改善している状況のことを指しているが、この定義は、コントロールと比較して機能が改善していない状況にも使える（そのような状況では、その機能の数値を下回る試料を計数する）。ＲＯＣ曲線は、単一の機能、及びその他の単一の出力に対して生成することができる、例えば、２つ以上の機能の組み合わせを数学的に（例えば、加算、減算、乗算などで）組み合わせて、単一の合計値を提供することができ、この単一の合計値は、ＲＯＣ曲線にプロットすることができる。加えて、複数の機能のあらゆる組み合わせ、すなわち、単一の出力値を導出する組み合わせを、ＲＯＣ曲線にプロットすることができる。
【0033】
本明細書で使用する対象に関する「肥満」とは、ＢＭＩが３０以上の対象のことを指す。
【0034】
「生物学的試料」及び「試料」は、本明細書では互換可能に使用しており、個体から得た、またはその他の方法で得たあらゆる材料、体液、組織、または細胞のことを指す。このものとして、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、血漿、及び血清など）、喀痰、涙液、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、尿、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、腺液、リンパ液、気管支吸引物、滑液関節吸引物、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液がある。これには、上記したすべての実験的に分離した画分も含む。例えば、血液試料は、血清、血漿、または、赤血球や白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））などの特定の種類の血液細胞を含む画分に分画することができる。一部の実施形態では、試料は、組織及び液体試料の組み合わせなど、個体由来の試料の組み合わせとし得る。また、用語「生物学的試料」は、例えば、糞便試料、組織試料、または組織生検など、均質化した固体材料を含む材料も含む。用語「生物学的試料」は、組織培養または細胞培養に由来する材料も含む。生物学的試料を得るためのあらゆる適切な方法を使用することができる；例示的な方法として、例えば、瀉血、綿棒拭い（例えば、口腔内綿棒拭い）、及び細針吸引生検方法がある。細針吸引の影響を受けやすい例示的な組織として、リンパ節、肺、甲状腺、乳房、膵臓、及び肝臓がある。試料は、例えば、顕微解剖（例えば、レーザーキャプチャーマイクロ解剖（ＬＣＭ）、またはレーザーマイクロ解剖（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、塗抹標本（例えば、ＰＡＰ塗抹標本）、または管洗浄で回収することもできる。個体から得た、または個体に由来する「生物学的試料」として、個体から得た後にあらゆる適切な方法で処理をした試料がある。
【0035】
本明細書で使用する「普通の食事」とは、個体の毎日の食生活のことを意味する。個体の普通の食事は、その他の個体の普通の食事と同じである、似ている、または異なり得る。普通の食事療法は、普段より長く絶食する、普段より多めに、または少なめに食べる、または医学的検査に向けて行われる食事療法の変更など、食事療法の変更は控える。
【0036】
さらに、一部の実施形態では、生物学的試料は、数多くの個体から生物学的試料を採取する、それらをプールする、または、それぞれの個体の生物学的試料のアリコートをプールすることによって誘導し得る。プールしたこれらの試料は、単一の個体に由来する試料に関して本明細書で記載したようにして処理し得る、そして、例えば、プールした試料に予後不良が確立すれば、次に、それぞれの生物学的試料を改めて試験をして、いずれの個体（複数可）が、耐糖能異常障害を有する、及び／または前糖尿病または糖尿病である、またはそれらを発症する可能性が高い、ことを決定することができる。
【0037】
「標的」、「標的分子」、及び「分析物」とは、本明細書では互換可能に使用しており、試料に存在し得る関心を寄せたあらゆる分子のことを指す。「関心を寄せた分子」とは、特定の分子の小さなあらゆる変化を含んでおり、例えば、タンパク質の事例では、アミノ酸配列のわずかな変化、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはその他のあらゆる操作または修飾、例えば、分子の同一性を実質的に変化させない標識成分とのコンジュケーションがある。「標的分子」、「標的」、または「分析物」とは、分子または多分子構造の１つのタイプまたは種のコピーのセットのことを指す。「標的分子」、「標的」、及び「分析物」とは、分子または多分子構造の２つ以上のタイプまたは種のことを指す。例示的な標的分子として、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ、抗体模倣対、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、成長因子、細胞、組織、及び上記したいずれかのあらゆるフラグメントまたは部分がある。一部の実施形態では、標的分子は、タンパク質であり、この事例では、標的分子は「標的タンパク質」と称し得る。
【0038】
本明細書で使用する「捕捉剤」または「捕捉試薬」とは、バイオマーカータンパク質に対して特異的に結合することができる分子のことを指す。「バイオマーカータンパク質捕捉試薬」とは、バイオマーカータンパク質に対して特異的に結合することができる分子のことを指す。捕捉試薬の例として、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、その他の抗体模倣体、及びその他のタンパク質スキャホールド、自己抗体、キメラ、小分子、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、合成受容体、及び、上記した捕捉試薬のいずれかの修飾体またはフラグメントがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、捕捉試薬は、アプタマー、及び抗体から選択する。
【0039】
用語「抗体」は、あらゆる種の完全長抗体、及びそのような抗体のフラグメント、及び誘導体、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、Ｆｖフラグメント、及び一本鎖Ｆｖフラグメントのことを指す。また、用語「抗体」は、合成抗体のことも指しており、例えば、ファージディスプレイ由来の抗体、及びフラグメント、アフィボディ、及びナノボディがある。
【0040】
本明細書で使用する「マーカー」及び「バイオマーカー」は互換可能に使用しており、個体での正常または異常なプロセスの徴候、または、個体での疾患またはその他の病態を示す標的分子のことを指す。より具体的には、「マーカー」または「バイオマーカー」は、正常または異常に関係なく、また異常であるならば、慢性または急性に関係なく、特定の生理学的状態またはプロセスの存在に関連する解剖学的、生理学的、生化学的、または分子的パラメーターである。バイオマーカーは、実験室アッセイ、及び医療イメージングを含めた様々な方法によって検出可能かつ測定可能である。一部の実施形態では、バイオマーカーは、標的タンパク質である。
【0041】
本明細書で使用する「バイオマーカーレベル」及び「レベル」は、生物学的試料でのバイオマーカーを検出するあらゆる分析方法を使用して得た測定値のことを指しており、このものは、当該生物学的試料でのバイオマーカーに応じて、存在、不存在、絶対量または濃度、相対量または濃度、力価、レベル、発現レベル、測定したレベルの比率などを示す。「レベル」の正確な内容は、バイオマーカーを検出するために採用した特定の分析方法の特定のデザインと要素が関係している。
【0042】
標的分子の「コントロールレベル」とは、疾患または病態が認められない個体、または疾患または病態を有する疑いのない個体から得た同じ試料タイプでの標的分子のレベルのことを指す。標的分子の「コントロールレベル」は、本発明の方法を行う度に決定する必要はなく、特定の試料のレベルが、通常のレベルより高い、または低いことを決定するためのリファレンスまたは閾値として使用する従前に決定したレベルとし得る。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法でのコントロールレベルは、正常耐糖能を有する１名以上の対象で認められたレベルである。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法でのコントロールレベルは、耐糖能異常障害を有するが、糖尿病ではない、１名以上の対象で認められたレベルである。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法でのコントロールレベルは、複数の正常な対象、または耐糖能異常障害を有するが、糖尿病ではない対象で認められた平均または平均レベルであり、任意に統計的変動を加減している。
【0043】
本明細書で使用する「個体」及び「対象」は、試験対象または患者のことを指すために互換可能に使用する。個体は、哺乳動物または非哺乳動物とし得る。様々な実施形態では、個体は、哺乳動物である。哺乳動物の個体は、ヒトまたは非ヒトとし得る。様々な実施形態では、個体は、ヒトである。健康または正常な個体は、関心を寄せた疾患または病態（耐糖能異常障害など）が、従来の診断方法では検出できない個体のことである。
【0044】
「診断する（Ｄｉａｇｎｏｓｅ）」、「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」、「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」、及びこれらの変形は、個体に関連する１つ以上の徴候、症状、データ、またはその他の情報に基づいて、その個体の健康状態または病態を検出、定量、または認識することを指す。個体の健康状態は、健康／正常（すなわち、疾患または病態が存在しないことの診断）、または病気／異常（すなわち、疾患または病態の存在の診断または特徴の評価）として診断することができる。「診断する（Ｄｉａｇｎｏｓｅ）」、「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」、「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」などの用語は、特定の疾患または病態に関して、疾患の初期検出、疾患の特徴決定または分類、疾患の進行、寛解、または再発の検出、及び個体に対して治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または治療（ｔｈｅｒａｐｙ）を行った後の疾患応答の検出を含む。用語「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｅ）」、「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」、「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）などは、特定の疾患または病態に関して、疾患の当初の検出；疾患の特徴決定または分類；疾患の進行、寛解、または再発の検出；及び、個体に治療または療法を行った後の疾患反応の検出を含む。耐糖能異常障害の診断は、耐糖能異常障害がある個体と、正常耐糖能を有する個体とを識別することを含む。前糖尿病または糖尿病の診断は、耐糖能異常障害を有しているが、おそらく糖尿病ではない個体と、正常耐糖能を有する個体とを識別することを含む。
【0045】
「予後（Ｐｒｏｇｎｏｓｅ）」、「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｎｇ）」、「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」、及びこれらの変形は、疾患または病態を有する個体での疾患または病態の将来の経過の予測（例えば、患者の生存予測）のことを指しており、そして、そのような用語は、個体に治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）または治療（ｔｈｅｒａｐｙ）を施した後の疾患反応の予測能のことを指す。
【0046】
「評価する（Ｅｖａｌｕａｔｅ）」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価（ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）」、及びこれらの変形は、「診断」及び「予後」の両方を含み、また、疾患を有していない個体での疾患または病態の将来の経過についての判断または予測、ならびに、疾患が治癒したことが明白な個体において、疾患または病態が生じる尤度に関する判断及び予測を含む。また、用語「評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ）」は、治療法に対する個体の応答を評価すること、例えば、個体が治療剤に対して好ましい応答を示し得るか、または治療剤に対して応答し得ない（または、例えば、毒性またはその他の望ましくない副作用を被る）かについて予測すること、個体に投与するための治療剤を選択すること、または、個体に対して行っている治療法に対する個体の応答をモニタリングまたは判定することも含む。したがって、耐糖能を「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」ことは、例えば：個体における耐糖能の将来の経過を予測すること；耐糖能異常障害が、前糖尿病または糖尿病にまで進行するか否かを予測すること；前糖尿病または糖尿病の特定の段階が、前糖尿病または糖尿病のさらに高い段階にまで進行するか否かを予測する、などのいずれかを含み得る。
【0047】
本明細書で使用するバイオマーカーレベルに関する「検出する」または「決定する」には、バイオマーカーレベルに対応するシグナルを検知及び記録するために使用する機器と、そのシグナルを生成するために必要な材料の両方の使用がある。様々な実施形態では、レベルは、蛍光、化学発光、表面プラズモン共鳴、表面音響波、質量分析、赤外線分光法、ラマン分光法、原子間力顕微鏡法、走査型トンネル顕微鏡法、電気化学検出法、核磁気共鳴検出、量子ドットなどのあらゆる適切な方法を使用して検出する。
【0048】
本明細書で使用する「耐糖能異常障害を有する対象」は、耐糖能異常障害と診断した対象のことを指す。一部の実施形態では、耐糖能異常障害は、定期検査、メタボリックシンドローム、及び肥満のモニタリング、または薬物が起こし得る副作用をモニタリングしている間に出現しやすい。
【0049】
本明細書で使用する「前糖尿病である対象」または「糖尿病である対象」は、前糖尿病または糖尿病との診断を受けた対象のことを指す。一部の実施形態では、前糖尿病または糖尿病であると診断することは、耐糖能異常障害に関して上記した方法を含む。
【0050】
本明細書で使用する病態を「発症するリスクのある対象」とは、病態の１つ以上のリスク因子または併存疾患を有する対象のことを指す。一部の実施形態では、病態は、糖尿病である。糖尿病の発症に関連するリスク因子として、４５歳以上、男性、体重が大きい、または約２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩ、糖尿病の家族歴、３時間未満／週の運動、人種（例えば、アフリカ系アメリカ人、ヒスパニック／ラテン系アメリカ人、アメリカ先住民、またはアラスカ先住民）、妊娠糖尿病、及び／または多嚢胞性症候群の病歴があるが、これらに限定されない。
【0051】
本明細書で使用する「可能性が高い」とは、０．５０超の確率のことを意味する。
【0052】
本明細書では、「固体支持体」は、分子が、共有結合または非共有結合のいずれかを介して直接的または間接的に付着し得る表面を有するあらゆる基板のことを指す。「固体支持体」は、様々な物理的形式、例えば、膜；チップ（例えば、タンパク質チップ）；スライド（例えば、スライドガラス、またはカバーガラス）；カラム；例えば、ビーズなどの中空、中実、半中実、細孔または空洞を含む粒子；ゲル；光ファイバー材料を含むファイバー；マトリックス；及び、試料レセプタクルを持つことができる。試料レセプタクルの例として、試料ウェル、チューブ、キャピラリー、バイアル、及び試料を保持することができるその他のあらゆる容器、溝、または、窪みがある。試料レセプタクルは、マイクロタイタープレート、スライド、マイクロフルイディクス機器などのマルチ試料プラットフォームに収容することができる。支持体は、天然または合成の材料、有機または無機の材料で構成することができる。捕捉試薬が付着する固体支持体の組成は、一般的には、付着の方法（例えば、共有結合）に依存する。その他のレセプタクルの例として、微小液滴、及びマイクロ流体制御、またはバルク油／水性エマルジョンがあり、その内部で、アッセイ及び関連する操作をし得る。適切な固体支持体として、例えば、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカをベースとした材料、機能性ガラス、変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、膜、ナイロン、天然繊維（例えば、絹、羊毛、及び綿など）、ポリマーなどがある。固体支持体を構成する材料として、捕捉試薬の付着に使用する、例えば、カルボキシ、アミノ、またはヒドロキシル基などの反応性基を含むことができる。高分子固体支持体として、例えば、ポリスチレン、ポリエチレングリコールテトラフタレート、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンフルオリド、ポリカーボネート、及びポリメチルペンテンがある。使用可能な適切な固体支持体粒子として、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）タイプのコード化粒子、磁性粒子、及びガラス粒子などのコード化粒子がある。
【0053】
バイオマーカーの例示的使用
様々な例示的な実施形態では、対象が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い、前糖尿病である、及び／または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いか否かを決定する方法を提供する。様々な実施形態では、対象が、耐糖能異常障害を有するか、及び／または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いか否かを決定する方法を提供しており、当該対象から試料を得る、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、そして、当該試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含み、また、Ｎは、少なくとも３であり、かつ、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する。
様々な例示的な実施形態では、対象が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い、前糖尿病である、及び／または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いか否かを決定する方法を提供する。様々な実施形態では、対象が、耐糖能異常障害を有するか、及び／または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いか否かを決定する方法を提供しており、当該対象から試料を得る、Ｎ個のバイオマーカータンパク質を有するバイオマーカーパネルを形成する、そして、当該試料でのＮ個のバイオマーカータンパク質のそれぞれのレベルを検出することを含み、また、Ｎは、少なくとも３であり、かつ、Ｎ個のバイオマーカータンパク質の少なくとも１つを、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１：ＣＬＣＦ１複合体、ＣＢＸ７、ＫＩＮ、ＳＥＲＰＩＮＡ１１、ＰＥＬＩ２、ＴＦＦ３、ＦＡＢＰ１２、ＧＡＤ１、ＳＶＥＰ１、ＳＯＣＳ７、Ｆ９、ＳＴＣ１、ＭＹＯＣ、ＷＦＤＣ１１、ＣＡＬＢ１、ＣＣＬ１６、ＳＭＣＯ２、ＣＣＬ２３、ＯＳＴＭ１、ＲＮＡＳＥ１０、ＩＴＩＨ１、ＺＮＦ１３４、ＣＦＡＰ４５、及びＳＦＴＰＤから選択する。
【0054】
様々な実施形態では、Ｎ個のバイオマーカーのそれぞれを、表１から選択する。
【表1-1】
【表1-2】
【0055】
一部の実施形態では、バイオマーカーは、正常耐糖能を有する個体と比較して、耐糖能異常障害を有する個体では異なるレベルで存在する。
【0056】
個体でのバイオマーカーの差次的レベルの検出を使用すると、例えば、個体が、耐糖能異常障害を有するか、または、有する可能性が高い、または耐糖能異常障害を有する個体が、前糖尿病であるか、または前糖尿病を発症する可能性が高いか否かの決定を可能にする。一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーのいずれかを使用して、耐糖能異常障害の発症について個体をモニタリングする、または前糖尿病または糖尿病の発症について耐糖能異常障害のある個体をモニタリングすることができる。
【0057】
本明細書に記載したバイオマーカーのいずれかを使用して、対象が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高いか否かを決定する方法の例として、耐糖能異常障害の診断を受けていない個体での本明細書で説明をした１つ以上のバイオマーカーのレベルでは耐性は認められるが、１つ以上の耐糖能異常障害のリスク因子または併存疾患がある場合には、別の試験を使用して、個体が耐糖能異常障害を発症したことを早期の段階で示し得る。耐糖能異常障害を早期に発見することで、医学的介入がより効果的になり得る。このような医学的介入として、体重減少、及び血糖コントロールがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、インスリンまたはメトホルミンなどの治療薬を使用し得る。
【0058】
同様に、本明細書に記載したバイオマーカーを使用して、耐糖能異常障害を有する対象が、前糖尿病または糖尿病の発症の有無を決定することができる方法のさらなる例として、耐糖能異常障害を有する個体での本明細書に記載したバイオマーカーの１つ以上のレベルが、個体が前糖尿病または糖尿病を発症していることを示し得る。前糖尿病または糖尿病を早期に発見することで、医学的介入がより効果的になり得る。このような医学的介入として、体重の減量、及び血糖コントロールがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、インスリンまたはメトホルミンなどの治療薬を使用し得る。
【0059】
加えて、一部の実施形態では、個体での１つ以上のバイオマーカーの経時的な差次的発現レベルは、特定の治療レジメンに対する個体の応答を示し得る。一部の実施形態では、フォローアップモニタリングリングの間での１つ以上のバイオマーカーの発現の変化は、特定の治療が効果的であることを示す、または治療レジメンを何らかの方法で変更する、例えば、さらに積極的に血糖をコントロールする、もっと積極的に減量に取り組むべきである、ことを示唆し得る。一部の実施形態では、個体における１つ以上のバイオマーカーの経時的な一定の発現レベルは、個体の耐糖能異常障害が悪化していない、または前糖尿病または糖尿病を発症していない、ことを示し得る。
【0060】
スタンドアロンの診断試験としてバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーレベルを、疾患の感受性のリスクの高まりを示す一塩基多型（ＳＮＰ）、または、その他の遺伝領域、または変動性と組み合わせて決定することもできる。
【0061】
スタンドアロンの診断試験としてバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーレベルを、その他の耐糖能異常障害スクリーニング法と組み合わせて行うこともできる。一部の事例では、本明細書に記載したバイオマーカーを使用する方法は、耐糖能異常障害、または前糖尿病、または糖尿病に対して、さらに積極的な治療、さらに頻繁な追跡スクリーニングなどを実施するにあたって、医学的及び経済的妥当性を高め得る。耐糖能異常障害を発症するリスクはあるが、耐糖能異常障害と診断されていない個体に関して、診断試験が、疾患を発症する可能性が高いことを示している場合でも、バイオマーカーを使用して治療も開始し得る。
【0062】
その他の耐糖能異常障害診断法と組み合わせてバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーに関する情報は、その他のタイプのデータ、特に、耐糖能異常障害の個体のリスクを示すデータと組み合わせて評価することもできる。これらの様々なデータは、コンピューター、またはその他の装置／機器で具体化することができるコンピュータープログラム／ソフトウェアなどの自動化した方法で評価することができる。
【0063】
バイオマーカーとバイオマーカーレベルの検出及び決定
本明細書に記載したバイオマーカーのバイオマーカーレベルは、公知の様々な分析方法のいずれかを使用して検出することができる。ある実施形態では、バイオマーカーレベルは、捕捉試薬を使用して検出する。様々な実施形態では、捕捉試薬を、溶液でのバイオマーカーに触れさせる、または捕捉試薬が固体支持体に固定化している間にバイオマーカーに触れさせることができる。その他の実施形態では、捕捉試薬は、固体支持体の二次的特徴を受けて反応する性質を含む。これらの実施形態では、捕捉試薬は、溶液でのバイオマーカーに触れさせる、次いで、捕捉試薬の特徴を受けて、固体支持体の二次的特徴と組み合わせて使用して、固体支持体にバイオマーカーを固定化することができる。捕捉試薬は、実施する分析の種類に基づいて選択する。捕捉試薬として、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、その他の抗体模倣体、及びその他のタンパク質スキャホールド、自己抗体、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、抗体、ナノボディ、インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、合成受容体、及びこれらの修飾物とフラグメントがあるが、これらに限定しない。
本明細書に記載したバイオマーカーのバイオマーカーレベルは、公知の様々な分析方法のいずれかを使用して検出することができる。ある実施形態では、バイオマーカーレベルは、捕捉試薬を使用して検出する。様々な実施形態では、捕捉試薬を、溶液でのバイオマーカーに触れさせる、または捕捉試薬が固体支持体に固定化している間にバイオマーカーに触れさせることができる。その他の実施形態では、捕捉試薬は、固体支持体の二次的特徴を受けて反応する性質を含む。これらの実施形態では、捕捉試薬は、溶液でのバイオマーカーに触れさせる、次いで、捕捉試薬の特徴を受けて、固体支持体の二次的特徴と組み合わせて使用して、固体支持体にバイオマーカーを固定化することができる。捕捉試薬は、実施する分析の種類に基づいて選択する。捕捉試薬として、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、その他の抗体模倣体、及びその他のタンパク質スキャホールド、自己抗体、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、抗体、ナノボディ、インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、合成受容体、及びこれらの修飾物とフラグメントがあるが、これらに限定しない。
【0064】
一部の実施形態では、バイオマーカーレベルは、バイオマーカー／捕捉試薬複合体を使用して検出する。
【0065】
一部の実施形態では、バイオマーカーレベルは、バイオマーカー／捕捉試薬複合体に由来しており、そして、例えば、バイオマーカー／捕捉試薬の相互作用の結果として間接的に検出されるが、バイオマーカー／捕捉試薬複合体の形成に依存している。
【0066】
一部の実施形態では、バイオマーカーレベルは、生物学的試料でのバイオマーカーから直接に検出する。
【0067】
一部の実施形態では、バイオマーカーは、生物学的試料での２つ以上のバイオマーカーの同時検出を可能にする多重化フォーマットを使用して検出する。多重化フォーマットの一部の実施形態では、捕捉試薬は、直接的または間接的に、共有結合または非共有結合で、固体支持体での別個の位置に固定化する。一部の実施形態では、多重化フォーマットは、個別の固体支持体を使用しており、それぞれの固体支持体は、例えば、量子ドットなど、その固体支持体に関連する固有の捕捉試薬を有する。一部の実施形態では、個々の機器は、生物学的試料において検出する複数のバイオマーカーのそれぞれの検出のために使用する。個々の機器は、生物学的試料のそれぞれのバイオマーカーを同時に処理するように構成することができる。例えば、マイクロタイタープレートを使用して、プレート内のそれぞれのウェルで、生物学的試料で検出する複数のバイオマーカーの内の１つ以上を分析することができる。
【0068】
上記した実施形態の１つ以上では、蛍光タグを使用して、バイオマーカー／捕捉試薬複合体の成分を標識して、バイオマーカーレベルを検出することができる。様々な実施形態では、蛍光標識は、公知の技術を使用して、本明細書に記載したバイオマーカーのいずれかに特異的な捕捉試薬にコンジュゲートすることができる、次いで、蛍光標識を使用して、対応するバイオマーカーレベルを検出することができる。適切な蛍光標識として、希土類キレート、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ－３、Ｑｄｏｔ ６０５、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリトリン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、及びその他のかような化合物がある。
【0069】
一部の実施形態では、蛍光標識は、蛍光色素分子である。一部の実施形態では、蛍光色素分子は、少なくとも１つの置換したインドリウム環系を含み、インドリウム環の３つの炭素にある置換基は、化学的に反応性を示す基または共役物質を含む。一部の実施形態では、色素分子は、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７００などのＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子を含む。一部の実施形態では、色素分子は、例えば、２つの異なるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ分子など、第１のタイプ及び第２のタイプの色素分子を含む。一部の実施形態では、色素分子は、第１のタイプ及び第２のタイプの色素分子を含み、そして、２つの色素分子は、異なる発光スペクトルを有する。
【0070】
蛍光は、様々なアッセイ形式と互換可能である様々な機器で測定することができる。例えば、分光蛍光光度計は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、プリントアレイ、キュベットなどを分析するようにデザインしている。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ｂｙ Ｊ．Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．，２００４を参照されたい。Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＆ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ： Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ＆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｐｈｉｌｉｐ Ｅ．Ｓｔａｎｌｅｙ ａｎｄ Ｌａｒｒｙ Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｊａｎｕａｒｙ ２００２を参照されたい。
【0071】
１つ以上の実施形態では、化学発光タグを任意に使用して、バイオマーカー／捕捉複合体の成分を標識して、バイオマーカーレベルを検出することができる。適切な化学発光材料として、塩化オキサリル、ローダミン６Ｇ、Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３
２＋、ＴＭＡＥ（テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン）、Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ（１，２，３－トリヒドロキシベンゼン）、Ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ、ペルオキシシュウ酸塩、シュウ酸アリール、アクリジニウムエステル、ジオキセタンなどがある。
【0072】
一部の実施形態では、検出方法は、バイオマーカーレベルに対応する検出可能なシグナルを生成する酵素／基質の組み合わせを含む。一般的に、この酵素は、分光光度法、蛍光、化学発光などの様々な手法を使用して測定できる発色基質の化学的変化を触媒する。適切な酵素として、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、尿素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどがある。
【0073】
一部の実施形態では、検出方法は、測定可能なシグナルを生成する蛍光、化学発光、放射性核種の組み合わせ、または酵素／基質の組み合わせとすることができる。一部の実施形態では、マルチモーダルシグナリングは、バイオマーカーアッセイフォーマットにおいて、独特で有利な特性を有する。
【0074】
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーのバイオマーカーレベルは、後述するような、シングルプレックスアプタマーアッセイ、マルチプレックスアプタマーアッセイ、シングルプレックスまたはマルチプレックス免疫アッセイ、ｍＲＮＡ発現プロファイリング、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、質量分光分析、組織学的／細胞学的方法などのあらゆる分析方法を使用して検出することができる。
【0075】
アプタマーをベースとしたアッセイを使用したバイオマーカーレベルの決定
生物学的試料及びその他の試料での生理学的に重要な分子の検出及び定量に関するアッセイは、科学研究及びヘルスケア分野での重要なツールである。そのようなアッセイの１種は、固体支持体に固定化した１つ以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を含む。アプタマーはそれぞれ、非常に特異的な方法で、かつ、非常に高い親和性で標的分子に結合することができる。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」を参照されたい；また、例えば、それぞれの発明の名称が、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」である米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、及び米国特許第６，５０３，７１５号を参照されたい。マイクロアレイが試料と接触すると、アプタマーは、試料に存在するそれぞれの標的分子に結合する、それによって、バイオマーカーに対応するバイオマーカーレベルの決定が可能となる。
生物学的試料及びその他の試料での生理学的に重要な分子の検出及び定量に関するアッセイは、科学研究及びヘルスケア分野での重要なツールである。そのようなアッセイの１種は、固体支持体に固定化した１つ以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を含む。アプタマーはそれぞれ、非常に特異的な方法で、かつ、非常に高い親和性で標的分子に結合することができる。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」を参照されたい；また、例えば、それぞれの発明の名称が、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」である米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、及び米国特許第６，５０３，７１５号を参照されたい。マイクロアレイが試料と接触すると、アプタマーは、試料に存在するそれぞれの標的分子に結合する、それによって、バイオマーカーに対応するバイオマーカーレベルの決定が可能となる。
【0076】
本明細書で使用する「アプタマー」は、標的分子に対して特異的な結合親和性を有する核酸のことを指す。親和性の相互作用は、程度の問題であると認識されているが、このことに関して、その標的に対するアプタマーの「特異的結合親和性」とは、そのアプタマーが、一般的には、試験試料でのその他の成分に結合するよりも遙かに高レベルの親和性で、その標的に対して結合することを意味する。「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つのタイプまたは１種のコピーのセットである。アプタマーは、あらゆる個数の化学的に修飾したヌクレオチドを含んだ、あらゆる適切な個数のヌクレオチドを含むことができる。「アプタマー」は、そのような分子の複数のセットのことを指す。異なるアプタマーは、同数または異なる個数のヌクレオチドを持つことができる。アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたは化学的に修飾した核酸とすることができる、また、一本鎖、二本鎖、または二本鎖領域を含むことができる、そして、さらに高次の構造を含むことができる。また、アプタマーが、光反応性または化学反応性官能基を含んだアプタマーであれば、対応する標的に共有結合する光アプタマーとすることができる。本明細書に開示したアプタマー方法のいずれでも、同じ標的分子に対して特異的に結合する２つ以上のアプタマーの使用を含むことができる。後述するように、アプタマーは、タグを含み得る。アプタマーがタグを含んでいると、アプタマーのすべてのコピーに、同じタグを付ける必要がない。さらに、異なるアプタマーが、それぞれタグを含んでいると、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのいずれかを持つことができる。
【0077】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸプロセスを含むあらゆる公知の方法を使用して識別することができる。同定が行われると、アプタマーは、化学的合成法、及び酵素的合成法を含むあらゆる公知の方法に従って調製または合成することができる。
【0078】
用語「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸプロセス」は、本明細書では互換可能に使用しており、一般的には、（１）所望の方法で標的分子と相互作用するアプタマーの選択、例えば、タンパク質に対する高度の親和性での結合と、（２）選択したそれらの核酸の増幅との組み合わせのことを指す。このＳＥＬＥＸプロセスは、特定の標的またはバイオマーカーに対して高度の親和性を有するアプタマーを同定するために使用することができる。
【0079】
ＳＥＬＥＸは、一般的には、核酸の候補混合物を調製すること、当該候補混合物と所望の標的分子とを結合させて親和性複合体を形成すること、当該親和性複合体を非結合候補核酸から分離すること、当該核酸を当該親和性複合体から分離及び単離すること、当該核酸を精製すること、及び、特異的アプタマー配列を同定すること、を含む。このプロセスは、選択したアプタマーの親和性をさらに改良するために複数回行い得る。このプロセスは、プロセスでの１回以上の時点において、増幅ステップを含み得る。例えば、発明の名称が「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」である米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。ＳＥＬＥＸプロセスは、その標的と非共有結合するアプタマーに加えて、その標的と共有結合するアプタマーを生成するために使用することができる。例えば、発明の名称が「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ－ＳＥＬＥＸ」である米国特許第５，７０５，３３７号を参照されたい。
【0080】
ＳＥＬＥＸプロセスは、改善した特性、例えば、改善したインビボ安定性、または、改善した送達特性などをアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する親和性の大きなアプタマーを同定するために使用することができる。このような修飾の例として、リボース位置、及び／またはリン酸位置、及び／または塩基位置での化学的置換がある。ＳＥＬＥＸプロセスで同定する修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、発明の名称が「Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」である米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、そこでは、ピリミジンの５’位、及び、２’位で化学的に修飾したヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載がされている。前出の米国特許第５，５８０，７３７号は、２’－アミノ（２’－ＮＨ２）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、及び／または、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）で修飾した１つ以上のヌクレオチドを含有する優れた特異性を有するアプタマーについて記載している。広範な物理的及び化学的特質を有する核酸ライブラリー、ならびに、ＳＥＬＥＸ、及び、ｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸでのそれらの使用について記載している、発明の名称が「ＳＥＬＥＸ ａｎｄ ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」である米国特許出願公開第２００９／００９８５４９号も参照されたい。
【0081】
また、ＳＥＬＥＸは、所望の低速特性を有するアプタマーを同定するために使用することができる。発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ－Ｒａｔｅｓ」であり、標的分子に結合することができるアプタマーを生成する改善したＳＥＬＥＸ方法を記載している米国特許出願公開第２００９／０００４６６７号を参照されたい。解離速度がさらに低速である、それぞれの標的分子由来のアプタマー及び光アプタマーを製造するための方法を説明している。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させ、核酸－標的複合体の形成を可能ならしめ、そして、低速オフレートの核酸－標的複合体に富んだプロセスを行う、そこでは、高速解離速度の核酸－標的複合体は解離してしまい、再形成することはなく、一方で、低速解離速度を示す複合体はそのまま残存する。加えて、この方法は、候補核酸混合物の生産において修飾ヌクレオチドを使用して、改善したオフレート性能を有するアプタマーを生成することを含む。例示的な修飾ヌクレオチドとして、例えば、図２に示す修飾ピリミジンがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、アプタマーは、塩基修飾などの修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アプタマーは、標的タンパク質との疎水性接触を可能にする、疎水性塩基修飾などの疎水性修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。そのような疎水性接触は、一部の実施形態では、アプタマーよりも大きな親和性、及び／または低速のオフレートを示す結合に寄与する。疎水性修飾を有する例示的なヌクレオチドを図２に示すが、これらに限定されない。一部の実施形態では、アプタマーは、疎水性修飾を有する少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでおり、当該疎水性修飾は、その他のものと同じものとし得る、または、違うものとし得る。一部の実施形態では、アプタマーでの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個の疎水性修飾を、図２に示す疎水性修飾から独立して選択する。
【0082】
一部の実施形態では、低速オフレートを示すアプタマー（疎水性修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むアプタマーを含む）は、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフレート（ｔ１／２）を有する。
【0083】
一部の実施形態では、このアッセイは、アプタマーが、それらの標的分子と共有結合する、または、「光架橋する」ことを可能にする光反応性官能基を含むアプタマーを使用する。例えば、発明の名称が、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」である米国特許第６，５４４，７７６号を参照されたい。これらの光反応性アプタマーは、光アプタマーとも称する。例えば、発明の名称がいずれも「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ」である米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、及び、米国特許第６，２９１，１８４号を参照されたい；また、例えば、発明の名称が「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」である米国特許第６，４５８，５３９号も参照されたい。マイクロアレイを試料と接触させ、光アプタマーが、それらの標的分子と結合する機会を得た後に、光アプタマーを光活性化し、そして、固体支持体を洗浄してあらゆる非特異的結合分子を除去する。光アプタマーに結合する標的分子は、光アプタマーでの光活性化官能基（複数可）が作り出す共有結合であるため、通常は除去されないので、徹底した洗浄条件を使用し得る。このアッセイは、このようにして、試験試料でのバイオマーカーに対応するバイオマーカーレベルの検出を可能にする。
【0084】
一部のアッセイ形式では、アプタマーを、試料と接触させる前に、固体支持体に固定化する。しかしながら、特定の状況下では、試料と接触させる前のアプタマーの固定は、最適なアッセイを提供し得ない。例えば、アプタマーを予め固定化すると、固体支持体表面でのアプタマーと標的分子との混合が非効率的になりかねず、おそらくは、このことが、反応時間の長期化を招き、それ故に、アプタマーと、それらの標的分子との効率的な結合を可能にするためのインキュベーション時間を長くする。さらに、光アプタマーを、アッセイにおいて、かつ、固体支持体として利用する材料に応じて使用する場合、固体支持体は、光アプタマーと、それらの標的分子との間に共有結合を形成するために使用する光を散乱させる、または、吸収する傾向を示し得る。さらに、使用する方法に応じて、標的分子を、それらのアプタマーに結合させて検出することは、固体支持体の表面が、使用するあらゆる標識薬剤にも曝露されて、これらの影響を受ける場合もあり得るので、対象を不正確なものにしかねない。最後に、固体支持体でのアプタマーの固定化は、一般的には、試料に対してアプタマーを曝露する前に、アプタマー調製ステップ（すなわち、固定化）を含んでおり、そして、この調製ステップは、アプタマーの活性または機能性に影響を及ぼし得る。
【0085】
アプタマーが、溶液において、その標的を捕捉し、次いで、アプタマー－標的混合物の特定の成分を検出前に除去することが可能になるようにデザインした分離ステップを用いるアプタマーアッセイも記載されている（発明の名称が、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｔｅｓｔ Ｓａｍｐｌｅｓ」である米国特許出願公開第２００９／００４２２０６号を参照されたい）。ここに記載されているアプタマーアッセイ方法は、核酸（すなわち、アプタマー）を検出及び定量することで、試験試料での非核酸標的（例えば、タンパク質標的）の検出及び定量を可能にする。ここに記載されている方法は、非核酸標的を検出及び定量する核酸代用物（すなわち、アプタマー）を作り出し、それにより、増幅を含む多種多様な核酸技術を、タンパク質標的など、より広範囲な所望の標的に適用することを可能にする。
【0086】
アプタマーは、アプタマーバイオマーカー複合体（または、光アプタマーバイオマーカー共有結合複合体）由来のアッセイ成分の分離を容易にし、そして、検出及び／または定量のためのアプタマーの単離を許容するように構築することができる。ある実施形態では、このような構築物は、アプタマー配列に切断可能な要素、または放出可能な要素を含むことができる。その他の実施形態では、さらなる機能性をアプタマーに導入することができる、例えば、標識または検出可能成分、スペーサー成分、または特異的結合タグ、または固定化要素を導入することができる。例えば、アプタマーは、切断可能部分を介して、アプタマーに接続したタグ、標識、その標識を分離するスペーサー成分、及び切断可能部分を含むことができる。ある実施形態では、切断可能要素は、光切断可能リンカーである。光切断可能リンカーは、ビオチン部分、及びスペーサー部分に結合可能であり、アミンの誘導体化のためのＮＨＳ基を含むことが可能であり、ビオチン基をアプタマーに導入するために使用することができる、それにより、その後にアッセイ法でアプタマーの放出が可能になる。
【0087】
均質アッセイは、溶液に含まれるすべてのアッセイ成分を使用して実施するが、シグナルの検出前に試料及び試薬の分離を必要としない。これらの方法は、迅速かつ容易に使用できる。これらの方法は、その特定の標的と反応する分子捕捉試薬または結合試薬に基づいてシグナルを生成する。本明細書に記載した方法の一部の実施形態では、分子捕捉試薬は、アプタマーまたは抗体などを含んでおり、当該特定の標的は、表１に示すバイオマーカーとし得る。
【0088】
一部の実施形態では、シグナル生成のための方法は、フルオロフォア標識捕捉試薬と、その特異的バイオマーカー標的との相互作用による異方性シグナル変化を利用する。標識した捕捉物質がその標的と反応すると、分子量の増加によって、複合体に結合しているフルオロフォアの回転運動が生じて、異方性値の変化が非常に遅くなる。異方性変化をモニタリングすることで、結合事象を使用して、溶液でのバイオマーカーを定量的に測定することができる。その他の方法として、蛍光偏光アッセイ、分子ビーコン法、時間分解蛍光消光、化学発光、蛍光共鳴エネルギー移動などがある。
【0089】
生物学的試料でのバイオマーカーレベルを検出するために使用し得る例示的な溶液をベースとしたアプタマーアッセイは：（ａ）生物学的試料を、第１のタグを含み、かつ、バイオマーカーに対して特異的親和性を有するアプタマーに接触させる、また、バイオマーカーが試料に存在する場合、アプタマー親和性複合体を形成する；（ｂ）混合物を、第１の捕捉要素を含む第１の固体支持体に曝露し、そして、第１のタグを、第１の捕捉要素と関連付ける；（ｃ）第１の固体支持体に関連しない混合物の成分を除去する；（ｄ）アプタマー親和性複合体のバイオマーカー成分に、第２のタグを結合させる；（ｅ）第１の固体支持体からアプタマー親和性複合体を放出させる；（ｆ）放出したアプタマー親和性複合体を、第２の捕捉要素を含む第２の固体支持体に曝露する、そして、第２のタグを、第２の捕捉要素と会合させる；（ｇ）複合体を形成していないアプタマーを、アプタマー親和性複合体から分配して、複合体を形成していないアプタマーを混合物から除去する；（ｈ）固体支持体からアプタマーを溶出させる；及び、（ｉ）アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出して、分析物を検出すること、を含む。
【0090】
アプタマーを使用して生物学的試料でのバイオマーカーを検出する例示的な方法を、実施例３に記載しているが、これに限定されない。Ｋｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（１０）：ｅ２６３３２に記載されている。
【0091】
イムノアッセイを使用するバイオマーカーレベルの定量
イムノアッセイ法は、対応する標的または分析物、例えば、バイオマーカータンパク質に対する抗体の反応に基づいており、そして、特定のアッセイ形式に応じて試料に含まれる分析物を検出することができる。特異的なエピトープ認識を備えているが故に、免疫反応性に基づいたアッセイ法の特異性及び感受性を改善するために、モノクローナル抗体、及びそのフラグメントを使用することが多い。ポリクローナル抗体も、モノクローナル抗体と比較して標的に対する親和性が高いので、様々なイムノアッセイで首尾よく使用されている。イムノアッセイは、広範囲の生物学的試料マトリックスと共に使用するようにデザインされている。イムノアッセイ形式は、定性的、半定量的、及び定量的な結果が得られるようにデザインされている。
イムノアッセイ法は、対応する標的または分析物、例えば、バイオマーカータンパク質に対する抗体の反応に基づいており、そして、特定のアッセイ形式に応じて試料に含まれる分析物を検出することができる。特異的なエピトープ認識を備えているが故に、免疫反応性に基づいたアッセイ法の特異性及び感受性を改善するために、モノクローナル抗体、及びそのフラグメントを使用することが多い。ポリクローナル抗体も、モノクローナル抗体と比較して標的に対する親和性が高いので、様々なイムノアッセイで首尾よく使用されている。イムノアッセイは、広範囲の生物学的試料マトリックスと共に使用するようにデザインされている。イムノアッセイ形式は、定性的、半定量的、及び定量的な結果が得られるようにデザインされている。
【0092】
定量的な結果は、公知の濃度の検出すべき特定の分析物で作り出した標準曲線を使用して得る。未知の試料からの応答またはシグナルを標準曲線にプロットし、そして、未知の試料での標的に対応する量またはレベルを確立させる。
【0093】
数多くのイムノアッセイ形式がデザインされている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物の検出において定量的にし得る。この方法は、分析物または抗体のいずれかに対する標識の結合に依存しており、そして、標識成分は、直接的または間接的に酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は、分析物の直接的、間接的、競合的、またはサンドイッチ検出のためにフォーマット作成することができる。その他の方法は、例えば、放射性同位体（Ｉ１２５）または蛍光などの標識に依存している。さらなる技術として、例えば、凝集、比濁法、濁度法、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイなどがある（ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ（Ｂｒｉａｎ Ｌａｗ編、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｔｄ．発行、２００５年版）を参照されたい）。
【0094】
例示的なアッセイ形式として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、蛍光、化学発光、及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）イムノアッセイがある。バイオマーカーを検出するための手順の例として、バイオマーカー免疫沈降、それに続いて、サイズ及びペプチドレベルの識別を可能にする定量的方法（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面電気クロマトグラフィーなど）がある。
【0095】
検出可能な標識またはシグナル生成材料を検出及び／または定量する方法は、標識の性質に依存している。適切な酵素が触媒した反応の産物（検出可能な標識が酵素である場合；上記を参照されたい）は、限定を意図するものではないが、蛍光性、発光性、または放射性のものとし得る、または、このような産物は、可視光または紫外光を吸収することができる。このような検出可能な標識を検出する上で好適な検出器の例として、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、照度計、及び濃度計があるが、これらに限定されない。
【0096】
検出のための方法はいずれも、反応に向けたあらゆる好適な調製、処理、及び分析を可能にするあらゆる形式で実施することができる。この形式として、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルまたは３８６ウェル）や、あらゆる好適なアレイまたはマイクロアレイを用いる形式もある。様々な作用物質の原液は、手動またはロボットで作り出すことができる、そして、それに続くピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料読み出し、データ収集、及び分析のすべてを、検出可能な標識を検出できる市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、及び検出計測器を使用して、ロボットが行い得る。
【0097】
遺伝子発現プロファイリングを使用するバイオマーカーレベルの決定
生物学的試料でのｍＲＮＡの測定は、一部の実施形態では、当該生物学的試料での対応するタンパク質のレベルの検出のための代替物として使用し得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルは、適切なＲＮＡを検出することで検出し得る。
生物学的試料でのｍＲＮＡの測定は、一部の実施形態では、当該生物学的試料での対応するタンパク質のレベルの検出のための代替物として使用し得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルは、適切なＲＮＡを検出することで検出し得る。
【0098】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲと、それに続くｑＰＣＲ）で測定する。ＲＴ－ＰＣＲ法を使用して、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作り出す。このｃＤＮＡを、ｑＰＣＲアッセイに使用すると、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を生成し得る。標準曲線と比較することで、ｑＰＣＲは、絶対的測定値、例えば、ｍＲＮＡのコピー数／細胞などを示し得る。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、及びキャピラリー電気泳動と組み合わせたＲＴ－ＰＣＲは、すべて、試料に含まれるｍＲＮＡの発現レベルを測定するために使用する。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｓｈｉｍｋｅｔｓ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照されたい。
【0099】
インビボ分子イメージング技術を使用するバイオマーカーの検出
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーは、分子イメージング試験で使用することができる。例えば、造影剤を、捕獲試薬にカップリングしたものを使用してインビボでバイオマーカーを検出することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーは、分子イメージング試験で使用することができる。例えば、造影剤を、捕獲試薬にカップリングしたものを使用してインビボでバイオマーカーを検出することができる。
【0100】
インビボでのイメージング技術は、個体の体内の特定の疾患の病態を決定する非侵襲的方法を提供する。例えば、身体の全部分、または全身をも三次元画像として見ることができ、これにより、体内の形態及び構造に関する有用な情報を提供し得る。このような技術は、本明細書に記載したバイオマーカーの検出と組み合わせて、インビボでのバイオマーカーに関する情報を提供し得る。
【0101】
インビボでの分子イメージング技術は、様々な技術進歩を受けて発展しつつある。これらの進歩として、体内で強力なシグナルを発生させることができる放射標識、及び／または蛍光標識などの新しい造影剤または標識の開発；及び、身体の外部からこれらのシグナルを十分な感度ならびに精度で検出して分析を行って、有用な情報を提供することができる強力で新規のイメージング技術の開発がある。造影剤は、適切なイメージングシステムで可視化することができる、それにより、体内の造影剤が存在する部分（複数可）の画像を得ることができる。造影剤は、例えば、アプタマーまたは抗体などの捕獲試薬、及び／またはペプチドもしくはタンパク質、またはオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子発現の検出のためのもの）、またはこれらのいずれかと１つ以上の巨大分子及び／またはその他の粒子型とを含む複合体と結合または連結し得る。
【0102】
また、造影剤は、イメージングにおいて有用な放射性原子を特徴とするものとし得る。適切な放射性原子として、シンチグラフ検査のためのテクネチウム－９９ｍまたはヨウ素－１２３がある。その他の容易に検出可能な部分として、例えば、磁気共鳴像（ＭＲＩ）用のスピン標識があり、例えば、ヨウ素－１２３の他に、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄がある。このような標識は、当該技術分野において周知であり、当業者であれば容易に選択することができる。
【0103】
標準的なイメージング技術として、磁気共鳴撮像、コンピューター断層撮影スキャン、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などがあるが、これらに限定されない。インビボでの診断イメージングについては、所定の造影剤、例えば、所定の放射性核種と、それを使用して標的化する具体的なバイオマーカー（タンパク質、ｍＲＮＡなど）との選択に際して利用可能な検出機器のタイプが重要な要素となる。一般的に選択されている放射性核種は、所定のタイプの機器で検出できるある種の減衰を示す。また、インビボでの診断のために放射性核種を選択する場合、その半減期は、標的組織の取り込み時間が最長であるが、宿主に対する有害な放射線を最小化する上で十分な程度の短さにすべきである。
【0104】
例示的なイメージング技術として、個体に対して放射性核種を合成的または局所的に照射するイメージング技術であるＰＥＴ及びＳＰＥＣＴがあるが、これらに限定されない。その後の放射性トレーサーの取り込みを経時的に測定して、標的組織及びバイオマーカーに関する情報を得るために使用する。使用する特定の同位体からの高エネルギー（ガンマ線）放射と、それを検出するために使用する機器の感度及び精巧さが故に、身体の外部から放射活性の二次元分布を推定し得る。
【0105】
ＰＥＴにおいて一般的に使用されている陽電子放出核種として、例えば、炭素－１１、窒素－１３、酸素－１５、及びフッ素－１８がある。ＳＰＥＣＴでは、電子捕獲、及び／またはガンマ放射によって減衰する同位体を使用しており、例えば、ヨウ素－１２３、及びテクネチウム－９９ｍがある。アミノ酸を、テクネチウム－９９ｍで標識する例示的な方法では、キレート前駆体の存在下で過テクネチウム酸イオンを還元し、次いで、不安定なテクネチウム－９９ｍ前駆体複合体を形成し、続いて、このものを二官能性修飾下走化性ペプチドの金属結合基と反応させて、テクネチウム－９９ｍ－走化性ペプチドコンジュケートを形成する。
【0106】
このようなインビボでのイメージング診断方法では、抗体が、頻繁に使用されている。インビボでの診断用抗体の調製及び使用は、当該技術分野において周知である。同様に、アプタマーは、このようなインビボイメージング診断法に使用し得る。例えば、本明細書に記載した特定のバイオマーカーを同定するために使用したアプタマーを、適切に標識し、個体に注射し、そして、インビボでバイオマーカーを検出し得る。使用する標識は、上記したようにして使用するイメージング様式に従って選択する。アプタマー特異的造影剤は、その他の造影剤と比べて、組織透過性、組織分布、速度論、除去、効力、及び選択性に関して、特有かつ有利な特性を有する。
【0107】
また、そのような技術は、任意に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するイメージングで遺伝子発現を検出するために、例えば、標識したオリゴヌクレオチドも使用し得る。これらの方法は、例えば、標識として蛍光分子または放射性核種を使用するインサイチュハイブリダイゼーションで利用する。遺伝子発現の検出のためのその他の方法として、例えば、レポーター遺伝子活性の検出がある。
【0108】
別の一般的なタイプのイメージング技術として、光学イメージングがあり、このものは、対象の身体内の蛍光シグナルを、対象の外部にある光学装置が検出する。これらのシグナルは、実際の蛍光、及び／または生物発光に起因し得る。光学検出装置の感度を改善することで、インビボでの診断アッセイのための光学イメージングの有用性を改善し得る。
【0109】
その他の技術の総論については、Ｎ．Ｂｌｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、６、４６５－４６９、２００９を参照されたい。
【0110】
組織学／細胞学的方法を使用するバイオマーカーの決定
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーは、組織学的または細胞学的方法を使用して、様々な組織試料において検出し得る。例えば、気管支内生検、及び経気管支生検、穿刺吸引生検、切断針、及びコア生検を組織学に使用することができる。気管支洗浄、及び擦過、胸膜吸引、及び喀痰は、細胞診に使用することができる。本明細書で同定したいずれのバイオマーカーも、疾患の兆候として、標本を染色するために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカーは、組織学的または細胞学的方法を使用して、様々な組織試料において検出し得る。例えば、気管支内生検、及び経気管支生検、穿刺吸引生検、切断針、及びコア生検を組織学に使用することができる。気管支洗浄、及び擦過、胸膜吸引、及び喀痰は、細胞診に使用することができる。本明細書で同定したいずれのバイオマーカーも、疾患の兆候として、標本を染色するために使用することができる。
【0111】
一部の実施形態では、対応するバイオマーカー（複数可）に特異的な１つ以上の捕捉試薬を、試料の細胞学的評価に使用する、そして：細胞試料の回収、細胞試料の固定、脱水、清浄、顕微鏡スライドでの細胞試料の固定化、細胞試料の透過処理、分析物の回収処理、染色、脱色、洗浄、ブロッキング、及び緩衝剤での１つ以上の捕捉試薬との反応の１つ以上を含み得る。別の実施形態では、細胞試料は、細胞ブロックから生成する。
【0112】
一部の実施形態では、対応するバイオマーカーに特異的な１つ以上の捕捉試薬を、組織試料の組織学的評価に使用する、そして：組織標本の回収、組織試料の固定、脱水、清浄、組織試料の顕微鏡スライドへの固定化、組織試料の透過処理、分析物の回収、染色、脱色、洗浄、ブロッキング、再水和、及び緩衝剤での捕捉試薬（複数可）との反応の１つ以上を含み得る。別の実施形態では、固定化及び脱水を、凍結と置き換える。
【0113】
別の実施形態では、対応するバイオマーカー（複数可）に特異的な１つ以上のアプタマー（複数可）は、組織学的または細胞学的試料と反応して、核酸増幅法において核酸標的として機能することができる。適切な核酸増幅法として、例えば、ＰＣＲ、ｑ－ベータレプリカーゼ、ローリングサークル増幅、鎖置換、ヘリカーゼ依存的増幅、ループ媒介等温増幅、リガーゼ連鎖反応、そして、制限及び環状化支援ローリングサークル増幅がある。
【0114】
ある実施形態では、組織学的または細胞学的評価で使用するための対応するバイオマーカーに特異的な１つ以上の捕捉試薬を：ブロッキング物質、競合物質、界面活性剤、安定剤、担体核酸、ポリアニオン性材料などのいずれかを含むことができる緩衝剤において混合する。
【0115】
「細胞診プロトコール」は、一般的には、試料の回収、試料の固定、試料の固定化、及び染色を含む。「細胞調製」は、調製した細胞の染色のための１つ以上のアプタマーの使用を含んでいる、試料回収後の幾つかの処理ステップを含むことができる。
【0116】
質量分析法を使用するバイオマーカーレベルの決定
様々な構成の質量分析計を使用して、バイオマーカーレベルを検出することができる。幾つかのタイプの質量分析計が利用可能であり、または様々な構成で製造することができる。一般的に、質量分析計は：試料注入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空系、及び計測器制御系、及びデータ系という主要な構成要素を備えている。一般的に、試料注入口、イオン源、及び質量分析器での差異は、計測器のタイプと、その能力を表している。例えば、注入口は、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源や、マトリックス支援レーザー脱離で使用するような、直接プローブまたはステージとすることができる。一般的なイオン源は、例えば、エレクトロスプレー、例えば、ナノスプレーやマイクロスプレーなど、またはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析器として、四重極質量フィルター、イオントラップ質量分析器、及び飛行時間型質量分析器がある。さらなる質量分析法は、当該技術分野で周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７ Ｒ－７１６Ｒ（１９９８）；Ｋｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい）。
様々な構成の質量分析計を使用して、バイオマーカーレベルを検出することができる。幾つかのタイプの質量分析計が利用可能であり、または様々な構成で製造することができる。一般的に、質量分析計は：試料注入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空系、及び計測器制御系、及びデータ系という主要な構成要素を備えている。一般的に、試料注入口、イオン源、及び質量分析器での差異は、計測器のタイプと、その能力を表している。例えば、注入口は、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源や、マトリックス支援レーザー脱離で使用するような、直接プローブまたはステージとすることができる。一般的なイオン源は、例えば、エレクトロスプレー、例えば、ナノスプレーやマイクロスプレーなど、またはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析器として、四重極質量フィルター、イオントラップ質量分析器、及び飛行時間型質量分析器がある。さらなる質量分析法は、当該技術分野で周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７ Ｒ－７１６Ｒ（１９９８）；Ｋｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい）。
【0117】
タンパク質バイオマーカー、及びバイオマーカーレベルは：エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）、シリコンでの脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ）、ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦと称するタンデム飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ－ＭＳ）、ＡＰＣＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ－（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ－ＭＳ）、ＡＰＰＩ－ＭＳ／ＭＳ及びＡＰＰＩ－（ＭＳ）Ｎ、四重極質量分析、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、定量的質量分析、及びイオントラップ質量分析のいずれかで、検出及び測定することができる。
【0118】
試料調製戦略は、タンパク質バイオマーカーの質量分析による特徴決定と、バイオマーカーレベルの定量の前に、試料を標識及び濃縮するために使用する。標識方法として、相対的及び絶対的定量のための等圧性タグ（ｉＴＲＡＱ）、及び細胞培養物でのアミノ酸を含む安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）があるが、これらに限定されない。質量分析の前に候補バイオマーカータンパク質のための試料を選択的に濃縮するために使用する捕捉試薬として、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替的抗体スキャホールド（例えば、ダイアボディなど）インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、そして、これらの修飾物及びフラグメントがあるが、これらに限定されない。
【0119】
上記したアッセイは、本明細書に記載した方法において有用なバイオマーカーレベルの検出を可能にしており、当該方法は、個体由来の生物学的試料において、表１に記載したバイオマーカーの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または少なくとも９つを検出することを含む。本明細書に記載した方法のいずれかに従って、バイオマーカーレベルを、個別に検出及び分類することができる、あるいは、例えば、マルチプレックスアッセイ形式など、それらを集合的に検出及び分類することができる。
【0120】
バイオマーカーの分類、及び疾患スコアの計算
一部の実施形態では、所定の診断試験に関するバイオマーカーの「シグネチャー」は、一連のバイオマーカーを含んでおり、それぞれのバイオマーカーは、関心を寄せた集団において特徴的なレベルを有する。特徴的なレベルとは、一部の実施形態では、特定のグループ内での個体に関するバイオマーカーの平均または平均値のことを指し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載した診断方法を用いて、個体由来の未知の試料を、２つのグループの内の一方、すなわち、耐糖能異常障害または正常耐糖能の内の一方に割り当てることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載した診断方法を使用して、個体から未知の試料を３つのグループ：正常耐糖能、前糖尿病または糖尿病でない耐糖能異常障害、及び前糖尿病または糖尿病の内の１つに割り当てることができる。
一部の実施形態では、所定の診断試験に関するバイオマーカーの「シグネチャー」は、一連のバイオマーカーを含んでおり、それぞれのバイオマーカーは、関心を寄せた集団において特徴的なレベルを有する。特徴的なレベルとは、一部の実施形態では、特定のグループ内での個体に関するバイオマーカーの平均または平均値のことを指し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載した診断方法を用いて、個体由来の未知の試料を、２つのグループの内の一方、すなわち、耐糖能異常障害または正常耐糖能の内の一方に割り当てることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載した診断方法を使用して、個体から未知の試料を３つのグループ：正常耐糖能、前糖尿病または糖尿病でない耐糖能異常障害、及び前糖尿病または糖尿病の内の１つに割り当てることができる。
【0121】
試料を２つ以上のグループの内の１つに割り当てることは、分類として知られており、また、この割り当てを達成するための手法は、分類器または分類方法として知られている。分類方法は、スコア付け法とも称し得る。バイオマーカーレベルのセットから診断分類器を構築するために使用することができる数多くの分類方法がある。一部の事例では、分類方法は、監視型ラーニング技術を使用して行われており、そこでは、区別しようとする２つ（または、多変量状態の場合では、それより多く）の別個のグループの個体から得た試料を使用してデータセットを回収する。それぞれの試料が属するクラス（グループまたは集団）が、それぞれの試料について予め分かっているので、分類方法をトレーニングして、望ましい分類応答を得ることができる。監視型ラーニング技術を使用しなくとも、診断分類器を作り出すことは可能である。
【0122】
診断分類器を開発するための一般的な手法として、決定木；バギング＋ブースティング＋フォレスト；推論ルールに基づく学習；パルザン窓（Ｐａｒｚｅｎ Ｗｉｎｄｏｗｓ）；線形モデル；記号論理学；ニューラルネットワーク法；非監視型クラスタリング；Ｋ平均法；階層上昇／下降；半管理学習法；プロトタイプ法；最近傍法；カーネル密度推定；サポーティブベクターマシーン；隠れマルコフ（Ｍａｒｋｏｖ）モデル；ボルツマン（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ）学習があり、そして、分類器は、単純に組み合わせ得る、あるいは特定の目的関数を最小化する方法で組み合わせ得る。総論に関して、例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｒ．Ｏ．Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１を参照されたい。また、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ－Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００９も参照されたい。
【0123】
管理学習技術を使用して分類器を作るために、トレーニングデータと称する試料のセットを入手する。診断テストに関連して、トレーニングデータは、後から、未知試料が割り当てられる別個のグループ（クラス）に由来する試料を含むことになる。例えば、コントロール集団の個体から回収した試料と、特定の疾患を有する集団の個体から回収した試料とで、未知試料（また、より具体的には、試料を得た個体）を、疾患の有無のいずれかで分類することができる分類器を開発するためのトレーニングデータを構成することができる。トレーニングデータに由来する分類器の開発は、分類器のトレーニングとして知られている。分類器のトレーニングに関する具体的な詳細は、管理学習技術の性質に依存している。単純ベイズ分類器は、このような管理学習技術の一例である（例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｒ．Ｏ．Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１を参照されたい；また、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ－Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ．、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００９も参照されたい）。単純ベイズ分類器のトレーニングは、例えば、米国特許公開第２０１２／０１０１００２号、及び同第２０１２／００７７６９５号に記載されている。
【0124】
一般的には、トレーニングセットの試料よりも数多くの潜在的なバイオマーカーレベルがあるので、過剰適合を回避する配慮が必要である。過剰適合は、統計モデルが、基礎となる関係の代わりに、ランダムエラーまたはノイズを表現する場合に発生する。過剰適合は、様々な方法で回避することができ、そのような方法として、例えば、分類器開発に使用するバイオマーカーの数を制限すること、バイオマーカーの応答が互いに独立していると仮定すること、使用する基本とする統計モデルの複雑度を制限すること、そして、基本とする統計モデルが確実にデータに一致させる、ことがある。
【0125】
バイオマーカーのセットを使用する診断試験の開発の具体的な例として、単純ベイズ分類器の利用、すなわち、バイオマーカーの厳密な独立した処理を行うベイズの定理に基づいた単純な確率的分類器の利用がある。それぞれのバイオマーカーは、それぞれのクラスでのＲＦＵ測定値または対数ＲＦＵ（相対蛍光単位）測定値に関するクラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）で説明される。１つのクラスでのバイオマーカーのセットに関する結合ｐｄｆは、それぞれのバイオマーカーに関する個々のクラス依存性ｐｄｆの積であると推定される。このことに関連して、単純ベイズ分類器をトレーニングすることは、クラス依存性ｐｄｆを特性化するために、パラメーターを割り当てること（「パラメーター化」）に等しい。クラス依存性ｐｄｆのために、あらゆる基本モデルを使用し得るが、このモデルは、一般的には、トレーニングセットで認められたデータと一致する必要がある。
【0126】
単純ベイズ分類器の性能は、分類器を構築及びトレーニングするために使用するバイオマーカーの個数及び品質に依存している。単一のバイオマーカーは、ＫＳ－距離（コルモボロフ－スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ）に従う。良好なＫＳ距離（例えば、＞０．３）を有するバイオマーカーを続けて加えると、続けて加えたバイオマーカーが第１のバイオマーカーから独立している場合には、一般的には、分類性能を高める。分類器スコアとして感受性に加えて特異性を使用して、高いスコアを付ける数多くの分類器を、グリーディアルゴリズムの変動を利用して作り出すことができる。（グリーディアルゴリズムとは、大域的最適解を見出すという目的で、それぞれの段階において局所的に最適な選択を行って、問題解決を図るメタヒューリスティック手法に従うあらゆるアルゴリズムのことである）。
【0127】
分類器性能を説明する別の方法は、受信者動作特性（ＲＯＣ）、または単純にＲＯＣ曲線、もしくはＲＯＣプロットによる。ＲＯＣとは、２項分類器系の識別閾値の変化に応じた、その２項分類器系に関する、感受性、または真陽性率の偽陽性率に対する（１－特異性、または１－真陽性率）グラフィカルプロットである。また、このＲＯＣは、陽性の内の真陽性の割合（ＴＰＲ＝真陽性率）を、陰性の内の偽陽性の割合（ＦＰＲ＝偽陽性率）に対してプロットして同等に表すことができる。このことは、基準の変化が、２つの動作特性（ＴＰＲ ＆ ＦＰＲ）の比較であるので、相対的動作特性曲線としても知られている。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断精度の集約尺度として一般的に使用されている。これは、０．０～１．０の値になり得る。ＡＵＣは、重要な統計的性質：すなわち、分類器のＡＵＣが、分類器が無作為に選択した正事例を、無作為に選択した負事例よりも上にランク付けする確率と同等である（Ｆａｗｃｅｔｔ Ｔ、２００６．Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ＲＯＣ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２７：８６１－８７４）。このものは、ウィルコクソン順位検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ｒａｎｋｓ）に相当する（Ｈａｎｌｅｙ，Ｊ．Ａ．、ＭｃＮｅｉｌ，Ｂ．Ｊ、１９８２．Ｔｈｅ ｍｅａｎｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ａ ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ） ｃｕｒｖｅ．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １４３、２９－３６．）。
【0128】
例示的な実施形態は、表１に記載したあらゆる個数のバイオマーカーの様々な組み合わせを使用して、耐糖能異常障害を有する個体を同定する診断試験を作り出す。表１に記載したバイオマーカーを様々な方法で組み合わせて、分類器を作り出すことができる。一部の実施形態では、バイオマーカーのパネルは、選択した特定の診断性能基準に応じて、異なるセットのバイオマーカーから構成する。例えば、バイオマーカーの特定の組み合わせは、その他の組み合わせよりも感受性が高い（または、より特異的な）試験を構成し得る。
【0129】
一部の実施形態では、パネルが特定のバイオマーカーのセットを含むように定義されており、また、分類器をトレーニングデータのセットから構築すると、診断試験パラメーターが完了する。一部の実施形態では、生物学的試料に対して１つ以上のアッセイを行って、分類用の関連する定量的バイオマーカーレベルを決める。測定したバイオマーカーレベルを、分類を決める分類方法の入力値として、また、クラス割り当ての信頼性を反映する試料の任意のスコアとして使用する。
【0130】
一部の実施形態では、試料を、任意に希釈して、多重化アプタマーアッセイを行って、データを、次のように評価する。まず、アッセイから得たデータを、任意に、正規化及び標準化する、そして、得られた結果のバイオマーカーレベルを、ベイズ分類スキームの入力値として使用する。次に、測定した個別のバイオマーカーごとに対数尤度比を計算し、合計して最終的な分類スコア、別名、診断スコアを生成する。結果の割り当てと、全体的な分類スコアを報告することができる。一部の実施形態では、それぞれのバイオマーカーレベルについて計算した個々の対数尤度リスク因子も報告することができる。
【0131】
キット
例えば、本明細書に開示した方法を実行するための使用において、適切なキットを利用して、本明細書に記載したバイオマーカーのあらゆる組み合わせを検出することができる。さらに、いずれのキットも、本明細書に記載したような１つ以上の検出可能な標識、例えば、蛍光部分などを含むことができる。
例えば、本明細書に開示した方法を実行するための使用において、適切なキットを利用して、本明細書に記載したバイオマーカーのあらゆる組み合わせを検出することができる。さらに、いずれのキットも、本明細書に記載したような１つ以上の検出可能な標識、例えば、蛍光部分などを含むことができる。
【0132】
一部の実施形態では、キットは、（ａ）生体試料での１つ以上のバイオマーカーを検出するための１つ以上の捕獲試薬（例えば、少なくとも１つのアプタマーまたは抗体）、及び、任意に、（ｂ）生体試料を提供した個体が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い、または、前糖尿病である、または、前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いか否かを予測するための１つ以上のソフトウェアまたはコンピュータープログラム製品とを含む。あるいは、１つ以上のコンピュータープログラム製品よりもむしろ、上記した工程を、ヒトが手動で行うための１つ以上の説明書を提供し得る。
【0133】
一部の実施形態では、キットは、固体支持体、捕獲試薬、及び少なくとも１つのシグナルを生成する材料を含む。また、キットは、機器と試薬の使用、試料の取り扱い、及びデータ解析に関する説明書を含むことができる。さらに、キットは、生体試料の分析結果を解析して報告するためのコンピューターシステムまたはソフトウェアと共に使用し得る。
【0134】
さらに、キットは、生体試料を処理するための１つ以上の試薬（例えば、可溶化緩衝剤、洗浄剤、洗浄液、または緩衝剤）を含むことができる。本明細書に記載したいずれのキットも、例えば、緩衝剤、ブロッキング剤、質量分析用マトリックス材料、抗体捕獲剤、陽性コントロール試料、陰性コントロール試料、プロトコール、ガイダンス、及びリファレンスデータなどのソフトウェアならびに情報を含むことができる。
【0135】
一部の実施形態では、キットを、耐糖能異常障害を分析するために提供する、そして、キットは、本明細書に記載したバイオマーカーに特異的な１つ以上のアプタマーのためのＰＣＲプライマーを含む。一部の実施形態では、キットは、バイオマーカーの使用に関する説明書と、バイマーカーと、耐糖能異常障害、及び／または前糖尿病または糖尿病の予後との相関についての説明書をさらに含み得る。一部の実施形態では、キットは、試料ＤＮＡを増幅または単離するために、本明細書に記載した１つ以上のバイオマーカーの補体を含むＤＮＡアレイ、試薬、及び／または酵素を含み得る。キットは、リアルタイムＰＣＲのための試薬、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、及び／またはプライマー、及び酵素を含み得る。
【0136】
例えば、キットは、（ａ）試料での１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定するための少なくとも１つの捕獲試薬を含む試薬、及び、任意に、（ｂ）試料に関して定量したそれぞれのバイオマーカーの量を、１つ以上の所定のカットオフと比較する工程を行うための１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムとを含むことができる。一部の実施形態では、アルゴリズムまたはコンピュータープログラムは、当該比較に基づいて定量したそれぞれのバイオマーカーに関するスコアを割り当てる、一部の実施形態では、バイオマーカーごとに割り当てられたスコアを足し合わせて総スコアを得る。さらに、一部の実施形態では、アルゴリズムまたはコンピュータープログラムは、総スコアと所定のスコアとを比較して、この比較を利用して、個体での耐糖能異常障害の有無を決定する。あるいは、１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムよりはむしろ、上記した工程を、ヒトが手動で行うための１つ以上の説明書を提供することができる。
【0137】
コンピューターによる方法、及びソフトウェア
バイオマーカーまたはバイオマーカーパネルを選択したら、個体が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い、または、前糖尿病である、または、前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いか否かを決定する方法は：１）当該個体から生体試料を回収する、または得る；２）分析方法を行って、生体試料においてパネルでのバイオマーカーを検出して測定する；及び、３）バイオマーカーレベルの結果を報告する、ことを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーレベルの結果を、例えば、下された診断（「耐糖能異常障害」、または「前糖尿病」）として、または「陽性」及び「陰性」と定義される陽性／陰性として簡略して報告する。一部の実施形態では、個体での耐糖能異常障害の有無を決定する方法は：１）生体試料を回収する、または得る；２）分析方法を行って、生体試料のパネルでのバイオマーカーを検出して測定する；３）あらゆるデータの正規化または標準化を行う；４）それぞれのバイオマーカーレベルを決定する；及び、５）これらの結果を報告することを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーレベルは、何らかの方法で組み合わせる、そして、組み合わせたバイオマーカーレベルに関する単一の値を報告する。この手法において、一部の実施形態では、スコアは、すべてのバイオマーカーの計算の合計から決定する単一の数値であり、この数値を、病態の有無の指標として予め設定した閾値と比較し得る。あるいは、診断スコアは、それぞれが、バイオマーカー値を示す一連のバーであり、そして、応答パターンは、病態の有無の決定について予め設定したパターンと比較し得る。
バイオマーカーまたはバイオマーカーパネルを選択したら、個体が、耐糖能異常障害を有するか、または有する可能性が高い、または、前糖尿病である、または、前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いか否かを決定する方法は：１）当該個体から生体試料を回収する、または得る；２）分析方法を行って、生体試料においてパネルでのバイオマーカーを検出して測定する；及び、３）バイオマーカーレベルの結果を報告する、ことを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーレベルの結果を、例えば、下された診断（「耐糖能異常障害」、または「前糖尿病」）として、または「陽性」及び「陰性」と定義される陽性／陰性として簡略して報告する。一部の実施形態では、個体での耐糖能異常障害の有無を決定する方法は：１）生体試料を回収する、または得る；２）分析方法を行って、生体試料のパネルでのバイオマーカーを検出して測定する；３）あらゆるデータの正規化または標準化を行う；４）それぞれのバイオマーカーレベルを決定する；及び、５）これらの結果を報告することを含み得る。一部の実施形態では、バイオマーカーレベルは、何らかの方法で組み合わせる、そして、組み合わせたバイオマーカーレベルに関する単一の値を報告する。この手法において、一部の実施形態では、スコアは、すべてのバイオマーカーの計算の合計から決定する単一の数値であり、この数値を、病態の有無の指標として予め設定した閾値と比較し得る。あるいは、診断スコアは、それぞれが、バイオマーカー値を示す一連のバーであり、そして、応答パターンは、病態の有無の決定について予め設定したパターンと比較し得る。
【0138】
本明細書に記載した方法の少なくとも一部の実施態様は、コンピューターを使用して実施することができる。図３に、コンピューターシステム１００の例を示す。図３を参照すると、システム１００は、プロセッサ１０１、入力装置１０２、出力装置１０３、記憶装置１０４、コンピューターで読取り可能な記憶媒体リーダー１０５ａ、通信システム１０６、加速処理装置（例えば、ＤＳＰ、または特殊用途のプロセッサ）１０７、及び記憶装置１０９を含む、バス１０８を介して電気的に接続したハードウェア要素から構成されている。コンピューターで読取り可能な記憶媒体リーダー１０５ａは、コンピューターで読取り可能な記憶媒体１０５ｂにさらに接続しており、この組み合わせは、コンピューターで読取り可能な情報を、一時的な格納、及び／または長期間の格納、遠隔利用、ローカル接続、固定、及び／または取り外しが可能な記憶装置と記憶媒体、メモリなどを総合的に示しており、この組み合わせは、記憶装置１０４、記憶装置１０９、及び／または、そのようなその他のあらゆるアクセス可能なシステム１００リソースを含む。また、システム１００は、オペレーティングシステム１９２、及びその他のコード１９３、例えば、プログラム、データなどを含むソフトウェア要素（作業メモリ１９１内に配置したものとして示す）も含む。
【0139】
図３を参照すると、システム１００は、広範な適応性と構成可能性とを備えている。したがって、例えば、単一のアーキテクチャーを利用して１つ以上のサーバーを実施することが可能であり、このようなサーバーは、現在のところ、所望のプロトコール、プロトコール変更、拡張などにしたがって再構成することもできる。しかしながら、当業者であれば、ある特定のアプリケーション要求に従って実施形態を利用できることは自明の事項である。例えば、１つ以上のシステム要素が、システム１００の構成要素（例えば、通信システム１０６）の下位要素として実施し得る。また、カスタマイズしたハードウェアを利用することもできる、及び／またはハードウェア、ソフトウェア、またはその両方において特定の要素を実施し得る。さらに、ネットワーク入力／出力装置（図示せず）などのその他の演算装置に接続し得るが、その他の演算装置への有線、無線、モデム、及び／またはその他の接続（複数可）も利用し得る、ことを理解されたい。
【0140】
ある態様では、システムは、耐糖能異常障害、及び／または前糖尿病に特徴的なバイオマーカーの特徴を含むデータベースを含むことができる。このバイオマーカーデータ（または、バイオマーカー情報）を、コンピューターに入力して、コンピューターに実装した方法の一部として使用することができる。バイオマーカーデータは、本明細書に記載したようなデータを含むことができる。
【0141】
ある態様では、システムは、入力データを１つ以上のプロセッサに提供するための１つ以上の装置をさらに含む。
【0142】
システムは、ランク付けしたデータ要素のデータセットを格納する記憶装置をさらに含む。
【0143】
別の態様では、入力データを提供するための装置は、例えば、質量分析計または遺伝子チップリーダーなどのデータ要素の特徴を検出するための検出器を含む。
【0144】
システムは、データベース管理システムをさらに含み得る。ユーザーの要求または質問は、質問を処理するトレーニングセットのデータベースから関連情報を抽出するデータベース管理システムが理解する適切な言語でフォーマットし得る。
【0145】
システムは、ネットワークサーバーと１つ以上のクライエントとを接続するネットワークに接続可能とし得る。ネットワークは、当該技術分野で公知のように、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）またはワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）とし得る。好ましくは、サーバーは、コンピュータープログラム製品（例えば、ソフトウェア）を作動させてユーザーの要求を処理するためのデータベースのデータにアクセスする上で必要なハードウェアを含む。
【0146】
システムは、データベース管理システムからの命令を実行するオペレーティングシステム（例えば、ＵＮＩＸ（登録商標）またはＬｉｎｕｘ）を含み得る。ある態様では、オペレーティングシステムは、インターネットなどのグローバル通信ネットワークで作動する、そして、そのようなネットワークに接続するために、グローバル通信ネットワークサーバーを利用することができる。
【0147】
システムは、当該技術分野で公知のグラフィカルユーザーインターフェースで日常的に認められるボタン、プルダウンメニュー、スクロールバー、テキスト入力用フィールドなどのインターフェース要素を含むグラフィカルディスプレイインターフェースを含む１つ以上の装置を含み得る。ユーザーインターフェイスで入力される要求事項は、システム内のアプリケーションプログラムに送信して、１つ以上のシステムデータベースにおいて関連情報を検索するようにフォーマットすることができる。ユーザーが入力した要求または質問は、あらゆる適切なデータベース言語で構築することができる。
【0148】
グラフィカルユーザーインターフェースは、オペレーティングシステムの一部としてグラフィカルユーザーインターフェースコードで作製し得る、そして、データを入力したり、及び／または入力したデータを表示したりするために利用することができる。処理したデータの結果は、インターフェースで表示する、システムと接続した印刷機で印刷する、記憶装置デバイスに保存する、及び／またはネットワークに送信し得る、あるいはコンピューターで読取り可能な媒体の形態で提供することができる。
【0149】
システムは、システムにデータ要素に関するデータ（例えば、発現値）を提供する入力装置と接続することができる。ある態様では、この入力装置は、例えば、質量分析装置、遺伝子チップ、またはアレイリーダーなどの遺伝子発現プロファイリングシステムを含むことができる。
【0150】
様々な実施態様に従ってバイオマーカー情報を解析する方法及び装置は、あらゆる適切な方式で、例えば、コンピューターシステムで作動するコンピュータープログラムを使用して実施することができる。リモートアクセス可能なアプリケーションサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピューター、またはワークステーションなどのプロセッサ、及びランダムアクセス記憶装置を含む従来のコンピューターシステムを利用し得る。さらなるコンピューターシステム要素は、例えば、大規模記憶システム、及びユーザーインターフェイス、例えば、従来型のモニター、キーボード、及びトラッキング装置などの記憶装置デバイスまたは情報保存システムを含み得る。コンピューターシステムは、スタンドアロンシステムとし得る、またはサーバーと１つ以上のデータベースとを含むコンピューターのネットワークの一部とし得る。
【0151】
バイオマーカー解析システムは、データ収集、処理、解析、報告、及び／または診断などのデータ解析を完了するための機能及び操作を提供することができる。例えば、ある実施態様では、コンピューターシステムは、バイオマーカーに関する情報を受け取る、保存する、検索する、解析する、及び報告することができるコンピュータープログラムを実行することができる。コンピュータープログラムは、様々な機能または操作を実行する複数のモジュールを含み得る、例えば、生データを処理して補充データを生成するための処理モジュール、及び生データと補足データを解析して、疾患の病態及び／または診断をもたらす解析モジュールなどがある。耐糖能異常障害、前糖尿病、及び／または糖尿病の可能性を特定することは、疾患に関連する個体の病態に関するさらなる生物医学情報を含むあらゆるその他の情報を生成または回収すること、さらなる検査が望ましいか否かを決定すること、または、その他の方法で個体の健康状態を評価することを含み得る。
【0152】
本明細書に記載した一部の実施形態は、コンピュータープログラム製品の形態で実施することができる。コンピュータープログラム製品は、アプリケーションプログラムを生成する媒体内にあり、コンピューターで読取り可能なプログラムコードを有しているコンピューターで読取り可能な媒体を含み、データベースを備えたコンピューターを作動させ得る。
【0153】
本明細書で使用する「コンピュータープログラム製品」とは、あらゆるタイプの物理的媒体（例えば、文書、電子、磁気、光学、またはその他の様式）を含んでおり、また、コンピューターまたはその他の自動データ処理システムで使用することができる自然言語またはプログラミング言語ステートメントの形態で組織化した一連の指示のことを指している。このようなプログラミング言語ステートメントを、コンピューターまたはデータ処理システムで実行すると、コンピューターまたはデータ処理システムが、ステートメントの特定の内容に従って作動する。コンピュータープログラム製品として：ソース及びオブジェクトコードでのプログラム、及び／またはコンピューターで読取り可能な媒体に埋め込まれたテストライブラリーまたはデータライブラリーがあるが、これらに限定されない。さらに、コンピューターシステムまたはデータ処理装置を予め選択した方式で作動可能にしているコンピュータープログラム製品を、数多くの形態で提供することができる、例えば、オリジナルソースコード、アセンブリコード、オブジェクトコード、機械言語、上記コードの暗号化または圧縮したバージョン、そして、ありとあらゆる等価物があるが、これらに限定されない。
【0154】
ある態様では、個体が、耐糖能異常障害を有するか、及び／または個体が前糖尿病を発症しているか、または発症する可能性が高いか否か、及び／または糖尿病を発症する可能性が高いか否かを示すコンピュータープログラム製品を提供する。このコンピュータープログラム製品は、演算装置またはシステムのプロセッサが実行可能なプログラムコードを具体化するコンピューターで読取り可能な媒体を含んでおり、このプログラムコードは：個体由来の生体試料に起因するデータを検索するコードを含んでおり、このデータは、本明細書に記載した１つ以上のバイオマーカーに対応するバイオマーカーレベルと、これらのバイオマーカーレベルに応じて個体の耐糖能異常障害を示す分類方法を実行するコードを含む。
【0155】
様々な実施態様を、方法または機器に関して説明をしてきたが、これらの実施形態は、コンピューターと接続したコード、例えば、コンピューターに内蔵した、またはコンピューターに接続可能なコードを介して実施することができる、ことを理解されたい。例えば、ソフトウェア及びデータベースを利用して、上記した本方法の数多くのことが実施可能である。したがって、ハードウェアが達成する実施態様に加えて、これらの実施態様は、コンピューターで読取り可能なプログラムコードを具体化させるコンピューターが使用可能な媒体で構成されている製造品を使用して、本明細書の説明で開示した機能が達成できる、ことも留意されたい。それ故に、それらのプログラムコード手段においても、これらの実施態様が、本特許によって同様に保護されたものとみなすことが望ましい。さらに、これら実施形態は、実質的にあらゆる種類のコンピューターで読取り可能な記憶装置に保存したコードとして具体化することができ、当該記憶装置として、ＲＡＭ、ＲＯＭ、磁気媒体、光学媒体、または磁気光学媒体があるが、これらに限定されない。なおもさらに一般的には、このような実施形態は、ソフトウェア、またはハードウェア、あるいはそれらのあらゆる組み合わせにおいて実施することができ、例えば、汎用プロセッサで作動するソフトウェア、マイクロコード、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）、または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などで実施可能であるが、これらに限定されない。
【0156】
搬送波で具体化するコンピューターシグナル、及び伝送媒体を介して伝播するシグナル（例えば、電気、及び光学）で、実施形態が達成し得ることも想定される。したがって、上記した様々な種類の情報を、データ構造などの構造でフォーマットして、伝送媒体を介して電気シグナルとして伝送する、またはコンピューターで読取り可能な媒体に保存することができる。
【0157】
治療の方法
一部の実施形態では、対象が耐糖能異常障害を有する、または有する可能性が高い、または前糖尿病である、または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いという決定に続いて、当該対象は、疾患の悪化を遅延または予防するための治療レジメンを受ける。耐糖能異常障害、前糖尿病、及び／または糖尿病の例示的治療レジメンとして、体重の減量と、血糖コントロールがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、対象は、インスリンまたはメトホルミンなどの治療薬を服用する。
一部の実施形態では、対象が耐糖能異常障害を有する、または有する可能性が高い、または前糖尿病である、または前糖尿病または糖尿病を発症する可能性が高いという決定に続いて、当該対象は、疾患の悪化を遅延または予防するための治療レジメンを受ける。耐糖能異常障害、前糖尿病、及び／または糖尿病の例示的治療レジメンとして、体重の減量と、血糖コントロールがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、対象は、インスリンまたはメトホルミンなどの治療薬を服用する。
【0158】
一部の実施形態では、耐糖能異常障害をモニタリングする方法を提供する。一部の実施形態では、対象での耐糖能異常障害の有無を決定する本発明の方法は、時間０で行う。一部の実施形態では、この方法は、対象の耐糖能異常障害の進行をモニタリングするために、時間１、そして、任意に時間２、及び、任意に時間３などで改めて行う。一部の実施形態では、個体の疾患の現在の状態に応じて、及び／または疾患が疑われる、または、進行すると考えられる際に予測される速度に応じて、異なる時点で、異なるバイオマーカーを使用する。
【0159】
その他の方法
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカー及び方法は、医療保険料及び／または生命保険料を決定するために使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法の結果は、医療保険料及び／または生命保険料を決定するために使用する。一部のこのような事例では、医療保険または生命保険を提供する組織は、医療保険または生命保険の申請に応じる、そうでなければ、対象の耐糖能異常障害または前糖尿病、または前糖尿病または糖尿病状態を発症し得る尤度に関する情報を得る、または、その情報を使用して、当該対象に関する適切な医療保険料または生命保険料を決定する。一部の実施形態では、この審査は、医療保険または生命保険を提供する組織が要求し、そして、その審査経費は当該組織が負担する。
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカー及び方法は、医療保険料及び／または生命保険料を決定するために使用する。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法の結果は、医療保険料及び／または生命保険料を決定するために使用する。一部のこのような事例では、医療保険または生命保険を提供する組織は、医療保険または生命保険の申請に応じる、そうでなければ、対象の耐糖能異常障害または前糖尿病、または前糖尿病または糖尿病状態を発症し得る尤度に関する情報を得る、または、その情報を使用して、当該対象に関する適切な医療保険料または生命保険料を決定する。一部の実施形態では、この審査は、医療保険または生命保険を提供する組織が要求し、そして、その審査経費は当該組織が負担する。
【0160】
一部の実施形態では、本明細書に記載したバイオマーカー及び方法は、医療資源の利用を予測、及び／または管理するために使用する。一部のそのような実施形態では、本方法は、そのような予測目的のために行われることはないが、本方法から得た情報を、そのような医療資源の利用の予測及び／または管理のために使用する。例えば、検査施設または病院は、特定の施設、または特定の地理的領域での医療資源の利用を予測及び／または管理するために、数多くの対象に関する情報を、本方法で回収し得る。
【実施例】
【0161】
以下の実施例は、例示目的で提供しており、添付した特許請求の範囲が定義している本出願の範囲の限定を意図するものではない。以下の実施例で説明する所定の分子生物学技術は、標準的な実験マニュアル、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２００１）に記載されているようにして行う。
【0162】
実施例１．バイオマーカー同定のための多重化アプタマーアッセイ及び統計的手法
多重化アプタマーアッセイを使用して、試験試料とコントロール試料を分析し、耐糖能異常障害を予測するバイオマーカーを特定した。この実験で使用した多重分析では、少量の試料（約６５μｌの血清または血漿）から得た血液に含まれる約５，０００個のタンパク質を検出するアプタマーを使用しており、検出限界は低く（１ｐＭの中央値）、約７ ｌｏｇのダイナミックレンジ、そして、変動係数は、中央値で５％であった。多重化アプタマーアッセイは、一般的には、例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ａｐｔａｍｅｒ－Ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（１２）： ｅ１５００４；及び、米国公開：２０１２／０１０１００２及び２０１２／００７７６９５に記載されている。
多重化アプタマーアッセイを使用して、試験試料とコントロール試料を分析し、耐糖能異常障害を予測するバイオマーカーを特定した。この実験で使用した多重分析では、少量の試料（約６５μｌの血清または血漿）から得た血液に含まれる約５，０００個のタンパク質を検出するアプタマーを使用しており、検出限界は低く（１ｐＭの中央値）、約７ ｌｏｇのダイナミックレンジ、そして、変動係数は、中央値で５％であった。多重化アプタマーアッセイは、一般的には、例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ａｐｔａｍｅｒ－Ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（１２）： ｅ１５００４；及び、米国公開：２０１２／０１０１００２及び２０１２／００７７６９５に記載されている。
【0163】
耐糖能障害の分類器
安定性によって選択した４１個のバイオマーカーのパネルを表１に示している、そして、ランダムフォレストアルゴリズムに供してモデルを作成した。本明細書に記載したバイオマーカーに対して利用するモデルは分類モデルであり、具体的には、エラスティックネットロジスティック回帰モデルである。
安定性によって選択した４１個のバイオマーカーのパネルを表１に示している、そして、ランダムフォレストアルゴリズムに供してモデルを作成した。本明細書に記載したバイオマーカーに対して利用するモデルは分類モデルであり、具体的には、エラスティックネットロジスティック回帰モデルである。
【0164】
それぞれのバイオマーカーのベータ＿ハット（Ｂｅｔａ＿ｈａｔ）値を、以下の表２に示す。ベータ＿ハット値は、試験試料でのバイオマーカーレベルとの相対的変化を示しており、コントロール試料と比較して得られたものであり、このものは、試験試料が、耐糖能異常障害のある対象から得たことを示す。
【表2-1】
【表2-2】
【0165】
発達コホート及びモデル開発
発達コホートは、英国での１２，０００名超の男性と女性の参加者（２９～６４歳）を対象とした［ＥＧＣ１］集団をベースとした研究である。この研究の目的は、一般的な集団での糖尿病、肥満、及び関連する健康状態を招く遺伝的及びライフスタイルのリスク因子を同定することであった。臨床的に糖尿病の診断を受けた参加者、臨床的に精神病の診断を受けた参加者、末期疾患の参加者、妊婦、または自力歩行不可能な参加者を、この研究から除外した。このコホートでは、本明細書に記載した多重アッセイを使用して、参加者から得た試料の測定を行っており、当該試料は、４つの研究登録サイトで得たフェーズ１（ベースライン）及びフェーズ２（ベースラインから約６年のフォローアップ訪問）試料である。
発達コホートは、英国での１２，０００名超の男性と女性の参加者（２９～６４歳）を対象とした［ＥＧＣ１］集団をベースとした研究である。この研究の目的は、一般的な集団での糖尿病、肥満、及び関連する健康状態を招く遺伝的及びライフスタイルのリスク因子を同定することであった。臨床的に糖尿病の診断を受けた参加者、臨床的に精神病の診断を受けた参加者、末期疾患の参加者、妊婦、または自力歩行不可能な参加者を、この研究から除外した。このコホートでは、本明細書に記載した多重アッセイを使用して、参加者から得た試料の測定を行っており、当該試料は、４つの研究登録サイトで得たフェーズ１（ベースライン）及びフェーズ２（ベースラインから約６年のフォローアップ訪問）試料である。
【0166】
試料処理プロトコールは、２つの測定の間で変更した。この変更により、フェーズ１は、サイトごとの処理時間の分布が、フェーズ２よりも広くなった。フェーズ１（ベースライン）訪問では、研究参加者の試験（ＯＧＴＴ、ＤＥＸＡ、トレッドミルなど）を効率的に実施することを優先しており、試料を回収した後の血液試料処理の時間範囲が数時間になった。フェーズ２の訪問では、スタッフを増員して、すべての試料を、回収時に迅速に処理をした。したがって、２番目の時点（フェーズ２）では、最初の時点（フェーズ１）よりも、調査サイト全体で均一な試料処理を行えている。プロトコールの変更を説明し、そして、時系列データ全体でモデルのロバスト性を高めるために、モデルの開発、検証、及び妥当性確認に使用するデータセットには、フェーズ１及びフェーズ２の測定値を含めた。これらのデータは、７，１１６個のフェーズ１試料（フェーズ１だけに参加した参加者由来のもの）と、５，００３個のフェーズ２試料（フェーズ１及び２に参加した参加者由来のもの）を含んでいた。有効な２ｈ－ＯＧＴＴ血漿グルコース測定値を使用して、それぞれの参加者からの１つの測定値だけを使用して、試料間の独立性の仮定を維持した。
【0167】
このデータセットでは、表３に示すように、標準的なＯＧＴＴで測定した耐糖能異常障害を有する個体の有病率は６．５％であった。この研究期間での英国全体での耐糖能異常障害または前糖尿病の推定値は１０．５％であった（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｉａｂｅｔｅｓ．ｃｏ．ｕｋ／ｐｒｅ－ｄｉａｂｅｔｅｓ．ｈｔｍｌを参照されたい）。米国では、現在の推定値は高く、１８歳以上の成人の有病率は３３．９％と予測している（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｄｄｋ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｅａｌｔｈ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｈｅａｌｔｈ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／ｄｉａｂｅｔｅｓ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓを参照されたい）。米国などの有病率の高い母集団では、この試験結果のＰＰＶ（正の予測値）は、改善する可能性が高く、ＮＰＶ（負の予測値）は、有病率の低い母集団の試験パフォーマンスと比較して、わずかに低下し得る。米国の有病率人口には、現在の標的市場である自己負担の高級専門医療に関する許容可能な過小予測のリスクがわずかにある。
【0168】
コホートデータセットは、それぞれ、７０％／１５％／１５％を、トレーニング、検証、及び妥当性確認のデータセットに分けた。標準ＯＧＴＴで測定したトレーニング、及び検証データセットの人口統計を、表３に示す。
【表3】
【0169】
機械学習技術を使用して予測モデルを開発する場合には、複数のデータセットを使用して、最高の予測機能を備えたモデルを同定すべきである。この目的のために、データを分割する次の戦略を使用した。このデータを、３つのセットに分割した：トレーニングセット（相互検証を通じて上位モデルを識別するために使用した）、検証セット（上位モデルのパラメーターを調整できる第２のトレーニングセット）、及び検証試験セット（最終モデルの評価にだけ使用する、モデルの開発には使用しないホールドアウトセット）。このデータを３つの方法で分割することが最も理想的であり、そして、試料の規模を大きくする必要があるので、一般的には使用されておらず、また、モデル開発に必要であるとは見なされていない。この手法は、特徴選択とパラメーター推定を実行する際の過剰適合の問題を軽減する。
【0170】
コホートは、２つの時点で本明細書に記載した多重アッセイを使用した試料測定を行っており、また、その２つの時点の間に試料処理プロトコールを変更するので、モデルの開発、検証、及び妥当性確認に使用するデータセットは、両方の時点での測定を含んでいた。この分析のために選択したコホートは、フェーズ１での試料だけを有する個体に由来する７，１１６個の試料と、両方の時点でのデータを有する５，００３名の個体から得たフェーズ２データだけの試料を加えた。
【0171】
データの品質を確保するために、データを分析する前に、４つの前処理ステップを行った。
１．ＡＮＭＬによる正規化：最大尤度（ＡＮＭＬ）を使用して適応正規化を行って、希釈特異的試料、及びアッセイバイアス、例えば、ピペッティングエラー、試薬濃度、アッセイのタイミング、及びその他のシステムの変動原因の変化などを補正した。試料の測定値が、リファレンス分布（コントロール試料セット）から得た確率を最大化して倍率を計算した。リファレンス分布と比較して｜２｜のＺスコアを超えた分析物を除外して、試料処理のアーティファクト、またはその他の大きなプロテオミクスの変化のバイアスを軽減した。
２．データ品質管理（ＱＣ）：このステップでは、試料の処理と、正規化の問題を確認した。まず、試料データを正規化して、処理を行っている間のハイブリダイゼーション変動を解消した。これに続いて、キャリブレーター試料全体の中央値を正規化して、分析を行っている間のその他のアッセイバイアスを解消した。次に、プレートごとに、全体的なスケーリングを行って、実行を行っている間の全体的な強度の差異を解消した。次に、キャリブレーションを行って、その間のアッセイの差異を解消した。最後に、リファレンスに対する中央値の正規化を、ＱＣ、緩衝剤、及び個々の試料で行った。
３．事前分析：このステップでは、臨床変数と正規化倍率との関係を調べて、２つの間に最小限の相関関係があることを確認した。
１．ＡＮＭＬによる正規化：最大尤度（ＡＮＭＬ）を使用して適応正規化を行って、希釈特異的試料、及びアッセイバイアス、例えば、ピペッティングエラー、試薬濃度、アッセイのタイミング、及びその他のシステムの変動原因の変化などを補正した。試料の測定値が、リファレンス分布（コントロール試料セット）から得た確率を最大化して倍率を計算した。リファレンス分布と比較して｜２｜のＺスコアを超えた分析物を除外して、試料処理のアーティファクト、またはその他の大きなプロテオミクスの変化のバイアスを軽減した。
２．データ品質管理（ＱＣ）：このステップでは、試料の処理と、正規化の問題を確認した。まず、試料データを正規化して、処理を行っている間のハイブリダイゼーション変動を解消した。これに続いて、キャリブレーター試料全体の中央値を正規化して、分析を行っている間のその他のアッセイバイアスを解消した。次に、プレートごとに、全体的なスケーリングを行って、実行を行っている間の全体的な強度の差異を解消した。次に、キャリブレーションを行って、その間のアッセイの差異を解消した。最後に、リファレンスに対する中央値の正規化を、ＱＣ、緩衝剤、及び個々の試料で行った。
３．事前分析：このステップでは、臨床変数と正規化倍率との関係を調べて、２つの間に最小限の相関関係があることを確認した。
【0172】
４．欠測データ：モデル開発の前に、対象または試料の除去を必要とする欠測データポイントは無かった。モデルは、二分法のものを開発した：患者の耐糖能は、正常である（＜７．８ｍｍｏｌ／ＬのＯＧＴＴブドウ糖測定値に対応する）、または耐糖能異常障害である（≧７．８ｍｍｏｌ／ＬのＯＧＴＴブドウ糖測定値に対応する）。利用したモデリングＢＩ内で応答変数を計算した。
【0173】
データ品質管理と事前分析の後に、モデル開発を、次の２つのステップで完了した。
１．概念実証（ＰＯＣ）：終点での関心を寄せたシグナルの証拠の有無を理解するためにデザインした、単変量の機械学習分析。
２．改良：ＰＯＣで作成したモデルを確認及び拡張するモデラー主導の分析。データとモデルに関するその他のさらなる懸念事項に対処する。
１．概念実証（ＰＯＣ）：終点での関心を寄せたシグナルの証拠の有無を理解するためにデザインした、単変量の機械学習分析。
２．改良：ＰＯＣで作成したモデルを確認及び拡張するモデラー主導の分析。データとモデルに関するその他のさらなる懸念事項に対処する。
【0174】
ＰＯＣステップでは、トレーニングデータだけを使用した。ロジスティック回帰係数のｔ検定、ＫＳ検定、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、及びＷａｌｄ検定を使用した単変量分析を行って、分析対象とＯＧＴＴ状態との間での統計的に有意な関連の有無を判断した。それぞれの単変量試験について、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順（Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，ｅｔ．ａｌ）と、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正したｐ値を使用して計算した偽発見率（ＦＤＲ）で複数の試験を補正した。最小指標を満たすか否かを評価するために、予備的なエラスティックネットロジスティック回帰モデルも作成した。このモデルは、１０分割交差検定を、５回繰り返して開発した。クラスの不均衡（トレーニングデータの６．５％だけに「グルコース障害」と標識付けした）が故に、交差検定内での低解像度処理を採用した。初期モデルのパフォーマンス基準を満足すると、試験をモデル改良に移す上で十分な証拠が得られる。
【0175】
改良して開発したモデルは、コホートのトレーニングと検証のデータセットを使用した。初期モデルでは、終点のクラスの不均衡に対応するために、交差検定内での低解像度処理を使用して、トレーニングデータの１０分割交差検定を５回繰り返して計算した。モデルの精度を使用して上位モデルを選択した、すなわち、精度＝（真陽性＋真陰性）／ｎである。感度と特異性のバランスを表す（ＡＵＣとは異なり、感度や特異性が低いモデルでも、それらが非常に高くなることがある。）ので、この測定基準を使用した。分析ツールとして改良の間に精度を使用したが、モデルの受け入れ基準は、ＡＵＣ、感度、及び特異性の組み合わせのままであった。次に、これらの上位モデルは、検証データと様々なモデル改善ツールを使用してさらに改良した。
【0176】
モデル構築に使用した主な手法として、モデルのパフォーマンスが改善しなくなるまで特徴要素を繰り返してフィルタリングするエラスティックネットペナルティモデルを反復ラウンドに供した。
【0177】
反復エラスティックネットの特徴縮小モデリングのアルゴリズムは、次の通りである。
１．ランクに基づいて、機能をフィルタリングするエラスティックネットモデルを構築する。
２．ステップ１で作成した最上位モデルから、推定値がゼロと等しくないすべての特徴を保持する。
３．ステップ２で保持したすべての機能を含む新しいエラスティックモデルを作成する。
４．ステップ２及び３を、少なくとも１０回繰り返す、そして、精度が上がらなくなるまで継続する。
１．ランクに基づいて、機能をフィルタリングするエラスティックネットモデルを構築する。
２．ステップ１で作成した最上位モデルから、推定値がゼロと等しくないすべての特徴を保持する。
３．ステップ２で保持したすべての機能を含む新しいエラスティックモデルを作成する。
４．ステップ２及び３を、少なくとも１０回繰り返す、そして、精度が上がらなくなるまで継続する。
【0178】
このプロセスを、複数回実行する：単変量ランク（上位１００、２００、または５００の特徴要素を含む）によるプロセス；絶食状態と統計的に有意に関連する（ＦＤＲ＜＝０．０１）特徴要素の除去；干渉試験の失敗に関連する特徴要素の削除；及び、モデルの強化に使用する外部データセットの変動性に基づいた特徴要素の削除、などの様々な方法で特徴要素をフィルタリングした。
【0179】
この最終モデルは、様々な合成データセットを調査して最小値と最大値に関するデータの補完の影響を確認する、そして、モデル予測に対する試料処理の効果を評価することで、ロバスト性についても評価した。
【0180】
次に、フェーズ１とフェーズ２の両方で最良のモデルの予測パフォーマンスを調査して、２つの時点の間に有意差が認められなかったことを確認した。加えて、残ったモデルを、年齢、性別、または訪問との相関について調査した。
【0181】
データＱＣは、２１９個の試料が、行チェックに失敗したことを示しており、このことは、ハイブリダイゼーションの少なくとも１つ、または３つの中央値スケール係数が、０．４～２．５の範囲外にあることを意味しており、改めて実行しても試料の修正に至らない試料の特定の技術的な問題（例えば、詰まり）を示している。加えて、中央値シグナルからの測定値の少なくとも５％にはＭＡＤが６を超える１８個の試料と、正規化スケール係数が大きな２つの試料があった。これら２３９個の試料（１．４％）は、以降の分析から除外した。最後に、標的確認特異性試験に合格した分析物だけを分析に使用した。
【0182】
ＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡプロットも、２つの主成分間の非線形関係の可能性を示したが、これらは、回収時点（フェーズ１対フェーズ２）では有意な差異が認められなかったので、大きな懸念事項にはならなかった。試料回収プロトコールを、フェーズ１とフェーズ２との間で変更したので、２つの時点の比較は重要であり、したがって、プロトコールの変更が、アッセイシグナルの変動の最大の原因ではない、ことが確認できたことが重要であった。
【0183】
事前分析では、第１または第２の時点で、終点と正規化スケール係数との間に強い関係がある、との根拠は示されなかった。
【0184】
ＰＯＣの結果は、様々なＦＤＲレベルの数多くの重要な分析物を示した。これらの数値とパーセンテージを、単変量ｔ検定に関して、表４に示す。
【表4】
【0185】
最高のパフォーマンスを発揮するモデルは、ＡＵＣが０．８５６、そして、感度／特異性が０．７８／０．７７であるエラスティックネットロジスティック回帰モデルであり、ＡＵＣ、感度は、実現可能性基準を上回っており、また。特異性は、≧０．７０であった。
【0186】
このタイプのモデルは、ＰＯＣステージで最も成功を示しており、また、ソフトウェアへのモデル転送プロセスに要する負担を軽減するための改良に向けて、エラスティックネットロジスティック回帰モデルを使用した。トレーニング及び検証データに関するモデルのパフォーマンスを、表５に示す。９５％のブートストラップ間隔を、表５の括弧内に示している。
【表5】
【0187】
範囲外の数値に関するデータ補完の効果を、２段階で調査した。
１．トレーニングデータを使用して、それぞれの分析物の最小及び最大許容ＲＦＵ値を、次のようにして計算した：
ａ．トレーニングデータを使用して、（トレーニングデータと同じ試料サイズの）ブートストラップデータセットを作成する。
ｂ．データをｋ倍に分割する、すなわち、ｋ＝ｍａｘ｛１０、試料サイズ／１０｝である。ｃ．それぞれのフォールド内、及びそれぞれのアプタマーに関して、データセットの最小値と最大値を計算して、それらを保存する。
ｄ．ステップＡ～Ｃを１００回繰り返す。
ｅ．ｋ＊１００の繰り返し全体で、それぞれのアプタマーに関して、標準偏差を計算する。
ｆ．アプタマー特異的最小／最大ＲＦＵ値は、最小／最大トレーニングデータＲＦＵ値－／＋２ＳＤである（ＳＤは、ステップＥからのものである）。
２．次のステップは、ステップ１で計算した最小値と最大値、及び検証データを使用して行った。
ａ．検証データセット内のｎ＊ｐ個の観測値（ｎは、検証データの試料サイズ、ｐは、モデル内のアプタマーの数）の内、範囲外にあるＲＦＵ値の１．５％を無作為に収集する。（１．５％は、従前のアッセイ性能と、ＲＦＵ測定に関する経験的観察に基づいている。）これらの行及び列特異的数値にはタグ付けしている。
ｂ．検証データのタグ付けした数値を、１（Ｆ）からの最大値と最小値と置換する。このデータセットを使用して、最終モデルの予測精度（セクション５．４での式において示す）を計算する。
ｃ．検証データのタグ付けした数値を、０に置換する（この作業は、モデル由来のアプタマーの除去に類似している）。このデータセットを使用して、最終モデルの予測精度を（ステップＢと同じ方法を使用して）計算する。
ｄ．ステップＡ～Ｅを、１００回繰り返す。予測精度の兆候をまとめる。最高の予測精度測定基準を提供するデータの補完方法は、生産に向けて推奨される方法である。
１．トレーニングデータを使用して、それぞれの分析物の最小及び最大許容ＲＦＵ値を、次のようにして計算した：
ａ．トレーニングデータを使用して、（トレーニングデータと同じ試料サイズの）ブートストラップデータセットを作成する。
ｂ．データをｋ倍に分割する、すなわち、ｋ＝ｍａｘ｛１０、試料サイズ／１０｝である。ｃ．それぞれのフォールド内、及びそれぞれのアプタマーに関して、データセットの最小値と最大値を計算して、それらを保存する。
ｄ．ステップＡ～Ｃを１００回繰り返す。
ｅ．ｋ＊１００の繰り返し全体で、それぞれのアプタマーに関して、標準偏差を計算する。
ｆ．アプタマー特異的最小／最大ＲＦＵ値は、最小／最大トレーニングデータＲＦＵ値－／＋２ＳＤである（ＳＤは、ステップＥからのものである）。
２．次のステップは、ステップ１で計算した最小値と最大値、及び検証データを使用して行った。
ａ．検証データセット内のｎ＊ｐ個の観測値（ｎは、検証データの試料サイズ、ｐは、モデル内のアプタマーの数）の内、範囲外にあるＲＦＵ値の１．５％を無作為に収集する。（１．５％は、従前のアッセイ性能と、ＲＦＵ測定に関する経験的観察に基づいている。）これらの行及び列特異的数値にはタグ付けしている。
ｂ．検証データのタグ付けした数値を、１（Ｆ）からの最大値と最小値と置換する。このデータセットを使用して、最終モデルの予測精度（セクション５．４での式において示す）を計算する。
ｃ．検証データのタグ付けした数値を、０に置換する（この作業は、モデル由来のアプタマーの除去に類似している）。このデータセットを使用して、最終モデルの予測精度を（ステップＢと同じ方法を使用して）計算する。
ｄ．ステップＡ～Ｅを、１００回繰り返す。予測精度の兆候をまとめる。最高の予測精度測定基準を提供するデータの補完方法は、生産に向けて推奨される方法である。
【0188】
結果として得られる予測測定基準は同じであり（表６を参照されたい）、また、このプロセスが、最も一般的に使用されているので、範囲外のアプタマーは、Ｗｉｎｓｏｒｉｚｅｄとすべきである。
【表6】
【0189】
実施例２：モデルの検証
１５％ホールドアウト検証（試験）セットで評価した最終モデル。このデータは、試験リポジトリの別のフォルダに保存しており、そして、検証データの人口統計表を作成する目的においてのみ調査した（表７を参照されたい）。
１５％ホールドアウト検証（試験）セットで評価した最終モデル。このデータは、試験リポジトリの別のフォルダに保存しており、そして、検証データの人口統計表を作成する目的においてのみ調査した（表７を参照されたい）。
【0190】
モデル予測は、個体が耐糖能を損なう確率を示す可能性である。カットオフ閾値は、０．５であり、カットオフよりも高い確率を持つ個体は「耐糖能異常障害」として分類する。「１」に近い値は、耐糖能異常障害の可能性が最も高い対象を示す。
【0191】
検証フェーズでは、予測確率と、それに関連する分類器を、検証データに基づいて計算した。ＡＵＣ、感度、及び特異性は、それぞれ、０．７０以上である必要があり、実際には、０．７０以上であった（表８を参照されたい）。
【0192】
検証データセットは、合計１，７６１名の患者を含むコホートデータセットの最後の１５％から構成されていた。このデータセットの人口統計（表７）は、トレーニング及び検証セット（表３）と定性的に同じであった。
【表7】
【0193】
ＡＵＣは、最後の４１個のバイオマーカーパネルモデルを使用して、最後の１５％ホールドアウトコホート検証データセットを分類して計算した。このデータは、ＰＯＣでも、改良版でも使用しなかった。最終モデルは、ＡＵＣ、感度、及び特異性が、０．７０を超えており、検証に合格した。検証データセットの予測測定基準の結果を、以下の表８に示す。９５％のブートストラップ間隔を、表８の括弧内に示している。
【表8】
【0194】
図４は、検証データセットの標準的な経口ブドウ糖負荷試験（正常、障害、及び糖尿病の可能性）の数値に基づいた診断によって層別化した、４１個のバイオマーカーパネルモデルで予測した耐糖能異常障害の確率のボックスプロットを示す。３つのグループ間の離間は、かなり大きく、ロバストなモデルを示している。
【0195】
このモデルは、ＡＵＣ／感度／特異性≧０．７／０．７／０．７の検証基準を満たしていた（これは、一部が、２時間のＯＧＴＴ血漿グルコースレベルの１０年間の糖尿病予測値に基づいている）。最終モデルのＡＵＣは、０．７６４であり、ホールドアウト検証セットの感度／特異性は、０．７９４／０．７３４である。この報告の結論は、試験が臨床的許容基準を満たしており、生産に移行できるということである。
【0196】
実施例３：アプタマーを使用する例示的なバイオマーカー検出
試料に含まれる１つ以上のバイオマーカーを検出する例示的な方法は、例えば、Ｋｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ６（１０）：ｅ２６３３２に記載されており、以下に記載する。３つの異なる定量方法：マイクロアレイをベースとしたハイブリダイゼーション、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズをベースとした方法、及びｑＰＣＲが記載されている。
試料に含まれる１つ以上のバイオマーカーを検出する例示的な方法は、例えば、Ｋｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ６（１０）：ｅ２６３３２に記載されており、以下に記載する。３つの異なる定量方法：マイクロアレイをベースとしたハイブリダイゼーション、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズをベースとした方法、及びｑＰＣＲが記載されている。
【0197】
試薬
ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＭｇＣｌ２、及びＴｗｅｅｎ－２０は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し得る。公称分子量８０００のデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤｘＳＯ４）は、例えば、ＡＩＣから購入し得る、そして、１回の交換で、少なくとも２０時間、脱イオン水に対して透析する。ＫＯＤ ＥＸ ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＶＷＲから購入し得る。塩化テトラメチルアンモニウム、及びＣＡＰＳＯは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し得る、そして、ストレプトアビジン－フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）は、例えば、Ｍｏｓｓ Ｉｎｃから購入し得る。４－（２－アミノエチル）－ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）は、例えば、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し得る。ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレートは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ ＨＢＣ、透明、９６ウェル、製品番号１５５００または１５５０１）から購入し得る。ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＯ４－Ｂｉｏｔｉｎ、製品番号２１３２９）から購入して、無水ＤＭＳＯに溶解し、そして、使い捨てのアリコートで凍結保存することができる。ＩＬ－８、ＭＩＰ－４、リポカリン－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＭＰ－７、及びＭＭＰ－９は、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し得る。レジスチン及びＭＣＰ－１は、例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入し得る、また、ｔＰＡは、例えば、ＶＷＲから購入し得る。
ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＭｇＣｌ２、及びＴｗｅｅｎ－２０は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し得る。公称分子量８０００のデキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤｘＳＯ４）は、例えば、ＡＩＣから購入し得る、そして、１回の交換で、少なくとも２０時間、脱イオン水に対して透析する。ＫＯＤ ＥＸ ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＶＷＲから購入し得る。塩化テトラメチルアンモニウム、及びＣＡＰＳＯは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し得る、そして、ストレプトアビジン－フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）は、例えば、Ｍｏｓｓ Ｉｎｃから購入し得る。４－（２－アミノエチル）－ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）は、例えば、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し得る。ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレートは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ ＨＢＣ、透明、９６ウェル、製品番号１５５００または１５５０１）から購入し得る。ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＯ４－Ｂｉｏｔｉｎ、製品番号２１３２９）から購入して、無水ＤＭＳＯに溶解し、そして、使い捨てのアリコートで凍結保存することができる。ＩＬ－８、ＭＩＰ－４、リポカリン－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＭＰ－７、及びＭＭＰ－９は、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し得る。レジスチン及びＭＣＰ－１は、例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入し得る、また、ｔＰＡは、例えば、ＶＷＲから購入し得る。
【0198】
核酸
従来のオリゴデオキシヌクレオチド（アミン及びビオチンで置換したものを含む）は、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入し得る。Ｚ－Ｂｌｏｃｋとは、配列５’－（ＡＣ－ＢｎＢｎ）７－ＡＣ－３’の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドであり、式中、Ｂｎは、ベンジル置換デオキシウリジン残基を示す。Ｚブロックは、従来のホスホルアミダイト化学を使用して合成し得る。アプタマー捕捉試薬も、従来のホスホルアミダイト化学で合成し得る、そして、例えば、ｔｉｍｂｅｒｌｉｎｅ ＴＬ－６００またはＴＬ－１５０ヒーターと、重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）／ＡＣＮの勾配を使用するＷａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２７６７システム（または、Ｗａｔｅｒｓ ６００シリーズ半自動システム）で、８０℃で作動する、２１．５×７５ｍｍ ＰＲＰ－３カラムで精製して、生成物を溶出する。検出を２６０ｎｍで行い、最良のフラクションをプールする前に、メインピーク全体についてフラクションを回収する。
従来のオリゴデオキシヌクレオチド（アミン及びビオチンで置換したものを含む）は、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入し得る。Ｚ－Ｂｌｏｃｋとは、配列５’－（ＡＣ－ＢｎＢｎ）７－ＡＣ－３’の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドであり、式中、Ｂｎは、ベンジル置換デオキシウリジン残基を示す。Ｚブロックは、従来のホスホルアミダイト化学を使用して合成し得る。アプタマー捕捉試薬も、従来のホスホルアミダイト化学で合成し得る、そして、例えば、ｔｉｍｂｅｒｌｉｎｅ ＴＬ－６００またはＴＬ－１５０ヒーターと、重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）／ＡＣＮの勾配を使用するＷａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２７６７システム（または、Ｗａｔｅｒｓ ６００シリーズ半自動システム）で、８０℃で作動する、２１．５×７５ｍｍ ＰＲＰ－３カラムで精製して、生成物を溶出する。検出を２６０ｎｍで行い、最良のフラクションをプールする前に、メインピーク全体についてフラクションを回収する。
【0199】
緩衝剤
緩衝剤ＳＢ１８は、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及びＮａＯＨでｐＨを７．５に調整した０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０からなる。緩衝剤ＳＢ１７は、ＳＢ１８に、１ｍＭ 三ナトリウムＥＤＴＡを加えたものである。緩衝剤ＰＢ１は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ 三ナトリウムＥＤＴＡ、及びＮａＯＨでｐＨを７．５に調整した０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０からなる。ＣＡＰＳＯ溶出緩衝剤は、１００ｍＭ ＣＡＰＳＯ ｐＨ１０．０と、１Ｍ ＮａＣｌとからなる。中和緩衝剤は、５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＨＣｌ、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０を含む。Ａｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーション緩衝剤は、キット（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐハイブリダイゼーションキット）の一部として提供する当社の製剤である。Ａｇｉｌｅｎｔ洗浄緩衝剤１は、当社の製剤である（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ洗浄緩衝剤１、Ａｇｉｌｅｎｔ）。Ａｇｉｌｅｎｔ洗浄緩衝剤２は、当社の製剤である（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ洗浄緩衝剤２、Ａｇｉｌｅｎｔ）。ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液は、４．５Ｍ 塩化テトラメチルアンモニウム、６ｍＭ ＥＤＴＡ三ナトリウム、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、及び０．１５％（ｖ／ｖ）サルコシルからなる。ＫＯＤ緩衝剤（１０倍濃縮）は、１２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ ＫＣｌ、６０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、及び１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡからなる。
緩衝剤ＳＢ１８は、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及びＮａＯＨでｐＨを７．５に調整した０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０からなる。緩衝剤ＳＢ１７は、ＳＢ１８に、１ｍＭ 三ナトリウムＥＤＴＡを加えたものである。緩衝剤ＰＢ１は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ 三ナトリウムＥＤＴＡ、及びＮａＯＨでｐＨを７．５に調整した０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０からなる。ＣＡＰＳＯ溶出緩衝剤は、１００ｍＭ ＣＡＰＳＯ ｐＨ１０．０と、１Ｍ ＮａＣｌとからなる。中和緩衝剤は、５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＨＣｌ、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０を含む。Ａｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーション緩衝剤は、キット（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐハイブリダイゼーションキット）の一部として提供する当社の製剤である。Ａｇｉｌｅｎｔ洗浄緩衝剤１は、当社の製剤である（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ洗浄緩衝剤１、Ａｇｉｌｅｎｔ）。Ａｇｉｌｅｎｔ洗浄緩衝剤２は、当社の製剤である（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ洗浄緩衝剤２、Ａｇｉｌｅｎｔ）。ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液は、４．５Ｍ 塩化テトラメチルアンモニウム、６ｍＭ ＥＤＴＡ三ナトリウム、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、及び０．１５％（ｖ／ｖ）サルコシルからなる。ＫＯＤ緩衝剤（１０倍濃縮）は、１２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ ＫＣｌ、６０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、及び１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡからなる。
【0200】
試料調製
血清（１００μＬのアリコートを－８０℃で保存したもの）を、２５℃の水浴で、１０分間かけて解凍し、試料を希釈する前に、氷上で保存する。試料は、８秒間、穏やかにボルテックスして混合する。６％血清試料溶液を、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ三ナトリウム、０．８ｍＭ ＡＥＢＳＦ、及び２μＭ Ｚ－Ｂｌｏｃｋを加えた０．９４×ＳＢ１７に希釈して調製する。６％血清原液の一部を、ＳＢ１７で１０倍に希釈して、０．６％血清原液を調製する。一部の実施形態では、６％及び０．６％の原液を、それぞれ、存在量の多い分析物と、存在量の少ない分析物を検出するために使用する。
血清（１００μＬのアリコートを－８０℃で保存したもの）を、２５℃の水浴で、１０分間かけて解凍し、試料を希釈する前に、氷上で保存する。試料は、８秒間、穏やかにボルテックスして混合する。６％血清試料溶液を、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ三ナトリウム、０．８ｍＭ ＡＥＢＳＦ、及び２μＭ Ｚ－Ｂｌｏｃｋを加えた０．９４×ＳＢ１７に希釈して調製する。６％血清原液の一部を、ＳＢ１７で１０倍に希釈して、０．６％血清原液を調製する。一部の実施形態では、６％及び０．６％の原液を、それぞれ、存在量の多い分析物と、存在量の少ない分析物を検出するために使用する。
【0201】
捕捉試薬（アプタマー）とストレプトアビジンプレートの調製
アプタマーは、関連する分析物（または、バイオマーカー）の相対的な存在量に応じて、２つの混合物に分ける。原液濃度は、それぞれのアプタマーについて４ｎＭであり、それぞれのアプタマーの最終濃度は０．５ｎＭである。アプタマー原体混合物を、ＳＢ１７緩衝剤で４倍に希釈し、９５℃で５分間加熱し、そして、使用前に、１５分間で３７℃にまで冷却する。この変性－再生サイクルは、アプタマーのコンフォーマー分布を正常化して、様々な履歴にもかかわらず、再現性のあるアプタマー活性を確保することを目的としている。ストレプトアビジンプレートは、使用前に、１５０μＬの緩衝剤ＰＢ１で２回洗浄する。
アプタマーは、関連する分析物（または、バイオマーカー）の相対的な存在量に応じて、２つの混合物に分ける。原液濃度は、それぞれのアプタマーについて４ｎＭであり、それぞれのアプタマーの最終濃度は０．５ｎＭである。アプタマー原体混合物を、ＳＢ１７緩衝剤で４倍に希釈し、９５℃で５分間加熱し、そして、使用前に、１５分間で３７℃にまで冷却する。この変性－再生サイクルは、アプタマーのコンフォーマー分布を正常化して、様々な履歴にもかかわらず、再現性のあるアプタマー活性を確保することを目的としている。ストレプトアビジンプレートは、使用前に、１５０μＬの緩衝剤ＰＢ１で２回洗浄する。
【0202】
インキュベーション及びプレート捕捉
熱冷却した２×アプタマーミックス（５５μＬ）を、等量の６％または０．６％血清希釈液と合わせて、３％及び０．３％血清を含むインキュベーションミックスを作る。これらのプレートを、Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｍａｔ（Ａｘｙｍａｔ Ｓｉｌｉｃｏｎｅシーリングマット、ＶＷＲ）で密封し、３７℃で、１．５時間インキュベーションした。次に、インキュベーションミックスを、洗浄した９６ウェルストレプトアビジンプレートのウェルに移し、さらに、３７℃に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで、８００ｒｐｍで、震盪しながら、２時間、インキュベーションする。
熱冷却した２×アプタマーミックス（５５μＬ）を、等量の６％または０．６％血清希釈液と合わせて、３％及び０．３％血清を含むインキュベーションミックスを作る。これらのプレートを、Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｍａｔ（Ａｘｙｍａｔ Ｓｉｌｉｃｏｎｅシーリングマット、ＶＷＲ）で密封し、３７℃で、１．５時間インキュベーションした。次に、インキュベーションミックスを、洗浄した９６ウェルストレプトアビジンプレートのウェルに移し、さらに、３７℃に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで、８００ｒｐｍで、震盪しながら、２時間、インキュベーションする。
【0203】
マニュアルアッセイ
特記しない限り、液体を流して除去し、続いて、層状のペーパータオルで、２回軽くたたく。洗浄量は１５０μＬであり、すべての震盪インキュベーションを、２５℃、８００ｒｐｍに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで行う。インキュベーションミックスを、ピペッティングして除去し、そして、プレートを、１ｍＭ デキストラン硫酸、及び５００μＭ ビオチンを加えた緩衝剤ＰＢ１で、１分間、２回洗浄し、次に、緩衝剤ＰＢ１で、１５秒間、４回洗浄する。新たに調製した１ｍＭ ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンを含む緩衝剤ＰＢ１（１５０μＬ／ウェル）溶液を加え、そして、プレートを震盪しながら５分間インキュベーションする。ＮＨＳ－ビオチン溶液を除去し、そして、プレートを、２０ｍＭ グリシンを加えた緩衝剤ＰＢ１で３回、そして、緩衝剤ＰＢ１で３回洗浄する。次に、１ｍＭ ＤｘＳＯ４を加えた８５μＬの緩衝剤ＰＢ１を、それぞれのウェルに加え、そして、プレートを、ＢｌａｃｋＲａｙ ＵＶランプ（公称波長３６５ｎｍ）の下で、５ｃｍの距離で、２０分間、震盪しながら照射する。改めて洗浄したストレプトアビジンコーティングプレート、または公知の洗浄を終えたストレプトアビジンプレートの未使用ウェルに試料を移し、希釈度の高い試料と希釈度の低い試料の混合物を、単一のウェルに合わせる。試料を、室温で、１０分間震盪しながらインキュベーションする。未吸着の物質を除去し、そして、プレートを、３０％グリセロールを加えた緩衝剤ＰＢ１で、それぞれ、１５秒間、８回洗浄する。次に、プレートを、緩衝剤ＰＢ１で１回洗浄する。アプタマーを、１００μＬ ＣＡＰＳＯ溶出緩衝剤を使用して、室温で、５分間溶出する。９０μＬの溶出液を、９６ウェルＨｙｂＡｉｄプレートに移し、そして、１０μＬの中和緩衝剤を加える。
特記しない限り、液体を流して除去し、続いて、層状のペーパータオルで、２回軽くたたく。洗浄量は１５０μＬであり、すべての震盪インキュベーションを、２５℃、８００ｒｐｍに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで行う。インキュベーションミックスを、ピペッティングして除去し、そして、プレートを、１ｍＭ デキストラン硫酸、及び５００μＭ ビオチンを加えた緩衝剤ＰＢ１で、１分間、２回洗浄し、次に、緩衝剤ＰＢ１で、１５秒間、４回洗浄する。新たに調製した１ｍＭ ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンを含む緩衝剤ＰＢ１（１５０μＬ／ウェル）溶液を加え、そして、プレートを震盪しながら５分間インキュベーションする。ＮＨＳ－ビオチン溶液を除去し、そして、プレートを、２０ｍＭ グリシンを加えた緩衝剤ＰＢ１で３回、そして、緩衝剤ＰＢ１で３回洗浄する。次に、１ｍＭ ＤｘＳＯ４を加えた８５μＬの緩衝剤ＰＢ１を、それぞれのウェルに加え、そして、プレートを、ＢｌａｃｋＲａｙ ＵＶランプ（公称波長３６５ｎｍ）の下で、５ｃｍの距離で、２０分間、震盪しながら照射する。改めて洗浄したストレプトアビジンコーティングプレート、または公知の洗浄を終えたストレプトアビジンプレートの未使用ウェルに試料を移し、希釈度の高い試料と希釈度の低い試料の混合物を、単一のウェルに合わせる。試料を、室温で、１０分間震盪しながらインキュベーションする。未吸着の物質を除去し、そして、プレートを、３０％グリセロールを加えた緩衝剤ＰＢ１で、それぞれ、１５秒間、８回洗浄する。次に、プレートを、緩衝剤ＰＢ１で１回洗浄する。アプタマーを、１００μＬ ＣＡＰＳＯ溶出緩衝剤を使用して、室温で、５分間溶出する。９０μＬの溶出液を、９６ウェルＨｙｂＡｉｄプレートに移し、そして、１０μＬの中和緩衝剤を加える。
【0204】
半自動アッセイ
吸着したインキュベーションミックスを含むストレプトアビジンプレートを、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機のデッキに置く。ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機は：未吸着物質を吸引して除去する、そして、ウェルを、１ｍＭ デキストラン硫酸、及び５００μＭ ビオチンを加えた３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で、４回洗浄するステップを行うようにプログラムしている。次に、ウェルを、３００μＬの緩衝液ＰＢ１で、３回洗浄する。新たに調製した（１００ｍＭ 原液を含むＤＭＳＯ）１５０μＬの溶液、すなわち、１ｍＭ ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンを含む緩衝剤ＰＢ１を加える。プレートを震盪しながら、５分間、インキュベーションする。液体を吸引し、そして、ウェルを、１０ｍＭ グリシンを加えた３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で８回洗浄する。１ｍＭ デキストラン硫酸を加えた１００μＬの緩衝剤ＰＢ１を加える。これらの自動化したステップの後に、プレートを、プレート洗浄機から取り外し、そして、ＵＶ光源（ＢｌａｃｋＲａｙ、公称波長３６５ｎｍ）の下に取り付けたサーモシェーカーに対して、５ｃｍの距離をあけて、２０分間置く。サーモシェーカーは、８００ｒｐｍ、２５℃に設定している。２０分間の照射後に、改めて洗浄をしたストレプトアビジンプレート（または、洗浄を終えた公知のプレートの未使用ウェル）に試料を手動で移す。この時点で、十分量（３％血清＋３％アプタマーミックス）と、少量の反応ミックス（０．３％血清＋０．３％アプタマーミックス）が、１つのウェルで合わさる。この「Ｃａｔｃｈ－２」プレートを、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機のデッキに配置する。このプレート洗浄機は：これらのプレートを、震盪しながら、１０分間インキュベートするステップを行うようにプログラムしている。液体を吸引し、そして、ウェルを、３０％グリセロールを加えた３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で２１回洗浄する。ウェルを、３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で５回洗浄し、そして、最後の洗浄液を吸引する。１００μＬのＣＡＰＳＯ溶出緩衝剤を加え、そして、アプタマーを、震盪しながら、５分間溶出する。これらの自動化ステップに続いて、プレートを、プレート洗浄機のデッキから取り外し、試料の９０μＬアリコートを、１０μＬ中和緩衝剤を含むＨｙｂＡｉｄ ９６ウェルプレートのウェルに手動で移す。
吸着したインキュベーションミックスを含むストレプトアビジンプレートを、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機のデッキに置く。ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機は：未吸着物質を吸引して除去する、そして、ウェルを、１ｍＭ デキストラン硫酸、及び５００μＭ ビオチンを加えた３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で、４回洗浄するステップを行うようにプログラムしている。次に、ウェルを、３００μＬの緩衝液ＰＢ１で、３回洗浄する。新たに調製した（１００ｍＭ 原液を含むＤＭＳＯ）１５０μＬの溶液、すなわち、１ｍＭ ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンを含む緩衝剤ＰＢ１を加える。プレートを震盪しながら、５分間、インキュベーションする。液体を吸引し、そして、ウェルを、１０ｍＭ グリシンを加えた３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で８回洗浄する。１ｍＭ デキストラン硫酸を加えた１００μＬの緩衝剤ＰＢ１を加える。これらの自動化したステップの後に、プレートを、プレート洗浄機から取り外し、そして、ＵＶ光源（ＢｌａｃｋＲａｙ、公称波長３６５ｎｍ）の下に取り付けたサーモシェーカーに対して、５ｃｍの距離をあけて、２０分間置く。サーモシェーカーは、８００ｒｐｍ、２５℃に設定している。２０分間の照射後に、改めて洗浄をしたストレプトアビジンプレート（または、洗浄を終えた公知のプレートの未使用ウェル）に試料を手動で移す。この時点で、十分量（３％血清＋３％アプタマーミックス）と、少量の反応ミックス（０．３％血清＋０．３％アプタマーミックス）が、１つのウェルで合わさる。この「Ｃａｔｃｈ－２」プレートを、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０６プレート洗浄機のデッキに配置する。このプレート洗浄機は：これらのプレートを、震盪しながら、１０分間インキュベートするステップを行うようにプログラムしている。液体を吸引し、そして、ウェルを、３０％グリセロールを加えた３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で２１回洗浄する。ウェルを、３００μＬの緩衝剤ＰＢ１で５回洗浄し、そして、最後の洗浄液を吸引する。１００μＬのＣＡＰＳＯ溶出緩衝剤を加え、そして、アプタマーを、震盪しながら、５分間溶出する。これらの自動化ステップに続いて、プレートを、プレート洗浄機のデッキから取り外し、試料の９０μＬアリコートを、１０μＬ中和緩衝剤を含むＨｙｂＡｉｄ ９６ウェルプレートのウェルに手動で移す。
【0205】
カスタムＡｇｉｌｅｎｔ８×１５ｋマイクロアレイに対するハイブリダイゼーション
中和した溶出液の２４μＬを、新たな９６ウェルプレートに移し、そして、１０Ｃｙ３アプタマーから構成されるハイブリダイゼーションコントロールのセットを含む、６μＬの１０×Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐハイブリダイゼーションキット、大容量、Ａｇｉｌｅｎｔ ５１８８－５３８０）を、それぞれのウェルに加える。３０μＬの２×Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ緩衝剤を、それぞれの試料に加えて混合する。得られたハイブリダイゼーション溶液の４０μＬを、ハイブリダイゼーションガスケットスライド（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｇａｓｋｅｔ Ｓｌｉｄｅ、８個のマイクロアレイ／スライドフォーマット、Ａｇｉｌｅｎｔ）のそれぞれの「ウェル」に対して、手動で、ピペットで移す。２０×ｄＴリンカーを備えたそれぞれのアプタマーの４０個のヌクレオチドランダム領域に相補的なアレイに対して１０個のプローブを備えているカスタムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスライドを、メーカーのプロトコールに従って、ガスケットスライドに配置する。このアセンブリ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｋｉｔ－ＳｕｒｅＨｙｂ対応可能、Ａｇｉｌｅｎｔ）を固定して、２０ｒｐｍで、回転させながら、６０℃で、１９時間、インキュベーションする。
中和した溶出液の２４μＬを、新たな９６ウェルプレートに移し、そして、１０Ｃｙ３アプタマーから構成されるハイブリダイゼーションコントロールのセットを含む、６μＬの１０×Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐハイブリダイゼーションキット、大容量、Ａｇｉｌｅｎｔ ５１８８－５３８０）を、それぞれのウェルに加える。３０μＬの２×Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ緩衝剤を、それぞれの試料に加えて混合する。得られたハイブリダイゼーション溶液の４０μＬを、ハイブリダイゼーションガスケットスライド（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｇａｓｋｅｔ Ｓｌｉｄｅ、８個のマイクロアレイ／スライドフォーマット、Ａｇｉｌｅｎｔ）のそれぞれの「ウェル」に対して、手動で、ピペットで移す。２０×ｄＴリンカーを備えたそれぞれのアプタマーの４０個のヌクレオチドランダム領域に相補的なアレイに対して１０個のプローブを備えているカスタムＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスライドを、メーカーのプロトコールに従って、ガスケットスライドに配置する。このアセンブリ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｋｉｔ－ＳｕｒｅＨｙｂ対応可能、Ａｇｉｌｅｎｔ）を固定して、２０ｒｐｍで、回転させながら、６０℃で、１９時間、インキュベーションする。
【0206】
ハイブリダイゼーション後の洗浄
約４００ｍＬのＡｇｉｌｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １を、２つの別々のガラス染色ディシュのそれぞれに入れる。スライド（一度に２つ以下）を、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １に沈めた状態で分解及び分離させ、次いで、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １を含む第２の染色ディシュのスライドラックに移す。スライドを、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １で、さらに５分間撹拌しながらインキュベーションする。スライドを、３７℃で、事前に平衡化したＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２に移し、そして、撹拌しながら、５分間インキュベーションする。スライドを、アセトニトリルを含む第４の染色ディシュに移し、そして、撹拌しながら５分間インキュベーションする。
約４００ｍＬのＡｇｉｌｅｎｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １を、２つの別々のガラス染色ディシュのそれぞれに入れる。スライド（一度に２つ以下）を、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １に沈めた状態で分解及び分離させ、次いで、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １を含む第２の染色ディシュのスライドラックに移す。スライドを、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １で、さらに５分間撹拌しながらインキュベーションする。スライドを、３７℃で、事前に平衡化したＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２に移し、そして、撹拌しながら、５分間インキュベーションする。スライドを、アセトニトリルを含む第４の染色ディシュに移し、そして、撹拌しながら５分間インキュベーションする。
【0207】
マイクロアレイイメージング
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５ＣＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを、１００％ＰＭＴに設定して、５μｍの分解能で、Ｃｙ３チャネルを使用し、そして、０．０５でＸＲＤオプションを有効にして、マイクロアレイスライドを画像化する。得られるＴＩＦＦ画像は、ＧＥ１＿１０５＿Ｄｅｃ０８プロトコールを使用したＡｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェアバージョン１０．５．１．１を使用して処理する。
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５ＣＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを、１００％ＰＭＴに設定して、５μｍの分解能で、Ｃｙ３チャネルを使用し、そして、０．０５でＸＲＤオプションを有効にして、マイクロアレイスライドを画像化する。得られるＴＩＦＦ画像は、ＧＥ１＿１０５＿Ｄｅｃ０８プロトコールを使用したＡｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェアバージョン１０．５．１．１を使用して処理する。
【0208】
Ｌｕｍｉｎｅｘプローブのデザイン
ビーズに固定化したプローブは、標的アプタマーの４０個のヌクレオチドランダム領域の３’末端に相補的な４０ヌクレオチドを有する。このアプタマー相補領域は、５’アミノ末端を有するヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）リンカーを介して、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓに結合する。ビオチン化検出デオキシオリゴヌクレオチドは、標的アプタマーの５’プライマー領域に相補的な１７－２１デオキシヌクレオチドを含む。ビオチン部分を、検出オリゴの３’末端に加える。
ビーズに固定化したプローブは、標的アプタマーの４０個のヌクレオチドランダム領域の３’末端に相補的な４０ヌクレオチドを有する。このアプタマー相補領域は、５’アミノ末端を有するヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）リンカーを介して、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓに結合する。ビオチン化検出デオキシオリゴヌクレオチドは、標的アプタマーの５’プライマー領域に相補的な１７－２１デオキシヌクレオチドを含む。ビオチン部分を、検出オリゴの３’末端に加える。
【0209】
Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓに対するプローブの結合
プローブは、基本的にメーカーの指示に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｉｃｒｏｐｌｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓに結合するが、次の変更：アミノ末端オリゴヌクレオチドの量は、０．０８ｎｍｏｌ／２．５×１０６ミクロスフェアである、そして、２回目のＥＤＣ添加は、１０ｍｇ／ｍＬで５μＬを添加する、ことが加えられている。カップリング反応は、２５℃、６００ｒｐｍに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＳｈａｋｅｒで行う。
プローブは、基本的にメーカーの指示に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍｉｃｒｏｐｌｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓに結合するが、次の変更：アミノ末端オリゴヌクレオチドの量は、０．０８ｎｍｏｌ／２．５×１０６ミクロスフェアである、そして、２回目のＥＤＣ添加は、１０ｍｇ／ｍＬで５μＬを添加する、ことが加えられている。カップリング反応は、２５℃、６００ｒｐｍに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＳｈａｋｅｒで行う。
【0210】
ミクロスフェアハイブリダイゼーション
ミクロスフェア原液（約４００００ミクロスフェア／μＬ）を、ボルテックスし、そして、Ｈｅａｌｔｈ Ｓｏｎｉｃｓ超音波洗浄機（Ｍｏｄｅｌ：Ｔ１．９Ｃ）で、６０秒間、超音波処理して、ミクロスフェアを懸濁する。懸濁したミクロスフェアを、１．５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で、反応の度に、２０００個のミクロスフェアに希釈をし、そして、ボルテックスと超音波処理して混合する。ビーズ混合物の反応の度に、３３μＬを、９６ウェルＨｙｂＡｉｄプレートに移す。１５ｎＭ ビオチン化検出オリゴヌクレオチドストックを含む１×ＴＥ緩衝剤の７μＬを、それぞれの反応に加えて、混合する。中和したアッセイ試料の１０μＬを加え、そして、プレートを、シリコンキャップマットシールで密封する。まず、プレートを、９６℃で、５分間、インキュベーションする、そして、従来のハイブリダイゼーションオーブンで、５０℃で、一晩、撹拌せずに、インキュベーションする。フィルタープレート（Ｄｕｒａポア、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ部品番号ＭＳＢＶＮ１２５０、１．２μｍ孔径）を、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えた７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で事前に湿らせておく。ハイブリダイゼーション反応で得た試料全量を、フィルタープレートに移す。ハイブリダイゼーションプレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で濯ぎ、そして、残余の物質を残らずフィルタープレートに移す。試料を、ゆっくりと真空下で濾過し、１５０μＬの緩衝剤を、約８秒間、脱気する。フィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で１回洗浄し、そして、フィルタープレート内のミクロスフェアを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液に再懸濁する。フィルタープレートを光から保護し、そして、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒで、１０００ｒｐｍで、５分間、インキュベーションする。次に、フィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で、１回洗浄する。７５μＬの１０μｇ／ｍＬストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ－１００、ＭＯＳＳ、Ｉｎｃ．）を含む１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液を、それぞれの反応に加え、そして、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒで、２５℃、１０００ｒｐｍで、６０分間インキュベーションする。このフィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で２回洗浄し、そして、フィルタープレート内のミクロスフェアを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液に再懸濁する。次に、フィルタープレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒで、光から保護しながら、５分間、１０００ｒｐｍで、インキュベーションする。次に、フィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で１回洗浄する。ミクロスフェアを、０．５％ＢＳＡを加えた７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液に再懸濁し、そして、ＸＰｏｎｅｎｔ ３．０ソフトウェアで作動するＬｕｍｉｎｅｘ １００機器で分析する。ＰＭＴキャリブレーションが大きく、かつ、７５００～１８０００のダブレット除去設定の下で、少なくとも１００個／ビーズタイプのミクロスフェアを計数する。
ミクロスフェア原液（約４００００ミクロスフェア／μＬ）を、ボルテックスし、そして、Ｈｅａｌｔｈ Ｓｏｎｉｃｓ超音波洗浄機（Ｍｏｄｅｌ：Ｔ１．９Ｃ）で、６０秒間、超音波処理して、ミクロスフェアを懸濁する。懸濁したミクロスフェアを、１．５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で、反応の度に、２０００個のミクロスフェアに希釈をし、そして、ボルテックスと超音波処理して混合する。ビーズ混合物の反応の度に、３３μＬを、９６ウェルＨｙｂＡｉｄプレートに移す。１５ｎＭ ビオチン化検出オリゴヌクレオチドストックを含む１×ＴＥ緩衝剤の７μＬを、それぞれの反応に加えて、混合する。中和したアッセイ試料の１０μＬを加え、そして、プレートを、シリコンキャップマットシールで密封する。まず、プレートを、９６℃で、５分間、インキュベーションする、そして、従来のハイブリダイゼーションオーブンで、５０℃で、一晩、撹拌せずに、インキュベーションする。フィルタープレート（Ｄｕｒａポア、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ部品番号ＭＳＢＶＮ１２５０、１．２μｍ孔径）を、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えた７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で事前に湿らせておく。ハイブリダイゼーション反応で得た試料全量を、フィルタープレートに移す。ハイブリダイゼーションプレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で濯ぎ、そして、残余の物質を残らずフィルタープレートに移す。試料を、ゆっくりと真空下で濾過し、１５０μＬの緩衝剤を、約８秒間、脱気する。フィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で１回洗浄し、そして、フィルタープレート内のミクロスフェアを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液に再懸濁する。フィルタープレートを光から保護し、そして、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒで、１０００ｒｐｍで、５分間、インキュベーションする。次に、フィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で、１回洗浄する。７５μＬの１０μｇ／ｍＬストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ－１００、ＭＯＳＳ、Ｉｎｃ．）を含む１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液を、それぞれの反応に加え、そして、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒで、２５℃、１０００ｒｐｍで、６０分間インキュベーションする。このフィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で２回洗浄し、そして、フィルタープレート内のミクロスフェアを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液に再懸濁する。次に、フィルタープレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍａｌｍｉｘｅｒ Ｒで、光から保護しながら、５分間、１０００ｒｐｍで、インキュベーションする。次に、フィルタープレートを、０．５％ＢＳＡを含む７５μＬの１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液で１回洗浄する。ミクロスフェアを、０．５％ＢＳＡを加えた７５μＬ １×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液に再懸濁し、そして、ＸＰｏｎｅｎｔ ３．０ソフトウェアで作動するＬｕｍｉｎｅｘ １００機器で分析する。ＰＭＴキャリブレーションが大きく、かつ、７５００～１８０００のダブレット除去設定の下で、少なくとも１００個／ビーズタイプのミクロスフェアを計数する。
【0211】
ＱＰＣＲ読み出し
ｑＰＣＲの標準曲線を、１０倍希釈、及びテンプレートを持たないコントロールを使用して、１０８～１０２コピーの範囲で、水中で作成する。中和したアッセイ試料を、ｄｉＨ２Ｏで、４０倍に希釈する。ｑＰＣＲマスターミックスを、２×最終濃度で調製する（２×ＫＯＤ緩衝剤、４００μＭ ｄＮＴＰミックス、４００ｎＭフォワード及びリバースプライマーミックス、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、及び０．５Ｕ ＫＯＤＥＸ）。１０μＬの２×ｑＰＣＲマスターミックスを、１０μＬの希釈アッセイ試料に加える。ｑＰＣＲを、ＢｉｏＲａｄ ＭｙＩＱ ｉＣｙｃｌｅｒで、９６℃で、２分間行った後に、９６℃で、５秒間、７２℃で、３０秒間のサイクルを、４０回行う。
ｑＰＣＲの標準曲線を、１０倍希釈、及びテンプレートを持たないコントロールを使用して、１０８～１０２コピーの範囲で、水中で作成する。中和したアッセイ試料を、ｄｉＨ２Ｏで、４０倍に希釈する。ｑＰＣＲマスターミックスを、２×最終濃度で調製する（２×ＫＯＤ緩衝剤、４００μＭ ｄＮＴＰミックス、４００ｎＭフォワード及びリバースプライマーミックス、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、及び０．５Ｕ ＫＯＤＥＸ）。１０μＬの２×ｑＰＣＲマスターミックスを、１０μＬの希釈アッセイ試料に加える。ｑＰＣＲを、ＢｉｏＲａｄ ＭｙＩＱ ｉＣｙｃｌｅｒで、９６℃で、２分間行った後に、９６℃で、５秒間、７２℃で、３０秒間のサイクルを、４０回行う。
【0212】
実施例４．バイオマーカーパネルモデルの分析
表１及び２に記載した４１個のバイオマーカーの様々な組み合わせを含むモデルを分析して、様々なバイオマーカーの組み合わせを含むパネルのＡＵＣ、感受性、及び特異性を決定した。以下の表９は、パネルのバイオマーカータンパク質を、表９に示した順序で、１つずつ加えた場合、または１つずつ減らした場合のモデルでの結果を示す。したがって、表９の最初の行は、パネルがＩＮＨＢＣだけを含む場合（「１つずつ加えた」結果）、またはＩＮＨＢＣ以外の記載をした４１個のバイオマーカーすべてを含む場合（「１つずつ減らした」結果）のモデルの結果を示す。表９の結果は、パネルが少なくとも最初の５つのバイオマーカータンパク質、具体的には、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、及びＲＴＮ４Ｒを含んでいると、それに続く各バイオマーカータンパク質を加えても、ＡＵＣの改善は有意に大きくないことを示す。感受性と特異性の値は、残りのバイオマーカータンパク質を加えることで改善が継続した。表９の結果は、パネルが少なくとも最初の１０個のバイオマーカータンパク質、具体的には、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１、ＣＢＸ７、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ、及びＫＩＮを欠失していると、ＡＵＣ、感受性、及び特異性が有意に低下することも示している。表９に示す結果は、グラフ形式で図１Ａ及び１Ｂにも示している。
表１及び２に記載した４１個のバイオマーカーの様々な組み合わせを含むモデルを分析して、様々なバイオマーカーの組み合わせを含むパネルのＡＵＣ、感受性、及び特異性を決定した。以下の表９は、パネルのバイオマーカータンパク質を、表９に示した順序で、１つずつ加えた場合、または１つずつ減らした場合のモデルでの結果を示す。したがって、表９の最初の行は、パネルがＩＮＨＢＣだけを含む場合（「１つずつ加えた」結果）、またはＩＮＨＢＣ以外の記載をした４１個のバイオマーカーすべてを含む場合（「１つずつ減らした」結果）のモデルの結果を示す。表９の結果は、パネルが少なくとも最初の５つのバイオマーカータンパク質、具体的には、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、及びＲＴＮ４Ｒを含んでいると、それに続く各バイオマーカータンパク質を加えても、ＡＵＣの改善は有意に大きくないことを示す。感受性と特異性の値は、残りのバイオマーカータンパク質を加えることで改善が継続した。表９の結果は、パネルが少なくとも最初の１０個のバイオマーカータンパク質、具体的には、ＩＮＨＢＣ、ＳＨＢＧ、ＡＣＹ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＲＴＮ４Ｒ、ＣＲＬＦ１、ＣＢＸ７、ＦＡＭ２０Ｂ、ＣＯＬ１５Ａ、及びＫＩＮを欠失していると、ＡＵＣ、感受性、及び特異性が有意に低下することも示している。表９に示す結果は、グラフ形式で図１Ａ及び１Ｂにも示している。
【表9-1】
【表9-2】
【0213】
モデルのＡＵＣ、感受性、及び特異性の分析も行っており、そのパネルは、表１及び２のＮ個の上記バイオマーカーから構成されており、バイオマーカーを無作為の順序で１つずつ加えた。その結果を、図１Ｃに示す。それらの結果は、表１及び２から選択したバイオマーカーの追加の有無に関係なく、パネルにバイオマーカーを加えると、モデルのパフォーマンスが改善することを示している。さらに、１０個のランダムバイオマーカータンパク質は、一般的に、０．７のＡＵＣを示す。
【0214】
上記した実施形態及び実施例は、例示を意図するものでしかない。特定の実施形態、実施例、または特定の実施形態または実施例の要素は、特許請求の範囲のいずれかの重要な、必要とする、または必須の要素または特徴事項として解釈すべきではない。添付した特許請求の範囲が定義する本出願の範囲から逸脱せずに、開示した実施形態に対して様々な変更、修正、置換、及びその他の変形を行うことができる。図面及び実施例を含む明細書は、限定を意図するものではなく、例示的な方法であるとみなすべきであり、そのようなすべての修正及び置換を、出願の範囲に含めることを意図している。方法またはプロセスの請求項のいずれかに記載したステップは、実行可能なあらゆる順序で行うことができ、実施形態、実施例、または請求項のいずれかに示した順序に限定されない。さらに、上記した方法のいずれかにおいて、１つ以上の具体的に記載したバイオマーカーは、個々のバイオマーカー、またはあらゆるパネルに由来するバイオマーカーとして、具体的に除外することができる。
【符号の説明】
【0215】
１００・・・コンピューターシステム
１０１・・・プロセッサ
１０２・・・入力装置
１０３・・・出力装置
１０４、１０９・・・記憶装置
１０５ａ、１０５ｂ・・・記憶媒体リーダー
１０６・・・通信システム
１０７・・・加速処理装置
１０８・・・バス
１９１・・・作業メモリ
１９２・・・オペレーティングシステム
１９３・・・コード
１０１・・・プロセッサ
１０２・・・入力装置
１０３・・・出力装置
１０４、１０９・・・記憶装置
１０５ａ、１０５ｂ・・・記憶媒体リーダー
１０６・・・通信システム
１０７・・・加速処理装置
１０８・・・バス
１９１・・・作業メモリ
１９２・・・オペレーティングシステム
１９３・・・コード
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】