(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-10
(54)【発明の名称】キットおよびデバイス
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20230303BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230303BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230303BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z ZNA
C12M1/00 A
C12M1/34 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022538921
(86)(22)【出願日】2020-12-23
(85)【翻訳文提出日】2022-08-09
(86)【国際出願番号】 GB2020053362
(87)【国際公開番号】W WO2021130495
(87)【国際公開日】2021-07-01
(31)【優先権主張番号】1919186.5
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1919187.3
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521027629
【氏名又は名称】バイオフィデリティ・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】フレイリング，キャメロン・アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】ストラレク－ヤヌツキーヴィッチ，マグダレーナ
(72)【発明者】
【氏名】バームフォース，バーナビー・ウィリアム
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B029BB01
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4B063QR08
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4B063QR55
4B063QR62
4B063QS26
4B063QX02
(57)【要約】
改善されたポリヌクレオチド検出のために使用可能なキットおよびデバイスを本明細書に提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記オリゴヌクレオチドＡ０；（ｂ）リガーゼ；
（ｃ）Ａ０の端から３’－５’方向で第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能な加ピロリン酸分解酵素；
（ｄ）加ピロリン酸分解反応を駆動するイオン供給源であって、任意選択でイオンがピロリン酸イオンである、前記イオン供給源；および
（ｅ）適切な緩衝剤
を含むキット。
【請求項2】
陽性および陰性対照をさらに含む、請求項１に請求されるキット。
【請求項3】
Ａ０の５’端が５’－３’エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性にされており、そしてキットが５’－３’エキソヌクレアーゼをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項4】
デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼおよび試料中に存在するターゲットポリヌクレオチド配列の最初の増幅のための緩衝剤をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項5】
ｄＵＴＰを取り込む高忠実度ポリメラーゼ、ｄＵＴＰおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含む、請求項４に請求されるキット。
【請求項6】
プロテイナーゼをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項7】
連結プローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項8】
スプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項9】
連結プローブオリゴヌクレオチドＣおよびスプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項10】
連結プローブオリゴヌクレオチドＣが、該オリゴヌクレオチドを３’－５’エキソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含み、そしてキットが３’－５’エキソヌクレアーゼをさらに含む、請求項７または９に請求されるキット。
【請求項11】
Ｄが、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含む、請求項８、９または１０に請求されるキット。
【請求項12】
Ｄが、３’修飾により、またはＤの３’端およびＡ１またはＣの対応する領域の間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対して伸長を経ることが不可能である、請求項１１に請求されるキット。
【請求項13】
Ａ０の一部に実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド、増幅酵素、ｄＮＴＰ、および１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項14】
各々異なるターゲット配列に対して選択的であり、そして各々同定領域を含む、複数のＡ０をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項15】
－Ａ１上の隣接配列に相補的である２つまたはそれより多い連結連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが一方のＬＣＲプローブの５’リン酸へのアニーリングに成功すると、もう一方のＬＣＲプローブの３’ＯＨにすぐ隣接する、前記プローブオリゴヌクレオチド；および－１つまたはそれより多いリガーゼ
をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項16】
増幅酵素が加ピロリン酸分解酵素と同じである、請求項１３に請求されるキット。
【請求項17】
－連結プローブオリゴヌクレオチドＣ；－スプリントオリゴヌクレオチドＤ
をさらに含み；
ここで、Ｃは５’リン酸を有し、Ａ１およびＥが共に連結されてＡ２を形成可能であるように、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’端がＣの５’に相補的であり、そしてＤの５’端がＡ１の３’端に相補的である
請求項１～１２のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項18】
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１がＡ２に相補的であり、そしてＡ２にアニーリングした際、ＨＯ１のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ１；および－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２が開いたＨＯ１に相補的であり、そしてＨＯ１にアニーリングした際、ＨＯ２のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ２
をさらに含む、請求項１７に請求されるキット。
【請求項19】
複数のＨＯ１およびＨＯ２をさらに含む、請求項１８に請求されるキット。
【請求項20】
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＡ；－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＢ；ならびに
－フルオロフォア・消光剤対を含む基質
をさらに含み；
ここで、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームは、Ａ２の存在下で、オリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒性の多構成要素核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成するように、Ａ２の隣接領域に相補的である
請求項１～１２のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項21】
部分的に二本鎖である核酸構築物をさらに含み、ここで：－一方の鎖は少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の領域に相補的であり、そしてこの鎖は「基質」鎖と称されてもよく；そして
－他方の鎖は、少なくとも１つの消光剤を含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の存在下で、部分的に二本鎖鎖形成した核酸構築物が、実質的により大きな二本鎖部分を有するように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の領域に相補的である
請求項１～１２のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項22】
少なくとも１つのＲＮＡ塩基を除去するための酵素をさらに含む、請求項２１に請求されるキット。
【請求項23】
－連結部位を含むＡ２の領域に相補的なオリゴヌクレオチドであって、その蛍光が互いに対するあるいは１つまたはそれより多い蛍光消光剤に対する近接のいずれかによって消光されるように配置された１つまたは複数のフルオロフォアを含む、前記オリゴヌクレオチド；－二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素
をさらに含み；
ここで、Ａ２の存在下で、フルオロフォアが互いからまたは対応する消光剤から分離され、そして蛍光シグナル、そしてしたがってＡ２の存在が検出可能であるように、標識オリゴヌクレオチドが消化される
請求項１～１２のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項24】
ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項25】
ピロホスファターゼをさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項26】
ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを形成するための酵素をさらに含む、請求項１～２５のいずれか一項に請求されるキット。
【請求項27】
第一の領域および第二の領域の間の流体経路を含むデバイスであって、第一の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、１つまたはそれより多いウェルが：ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記オリゴヌクレオチドＡ０；
Ａ０の端から３’－５’方向で第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能な加ピロリン酸分解酵素；加ピロリン酸分解反応を順方向に駆動するイオン供給源であって、任意選択でイオンがピロリン酸イオンである、前記イオン供給源；および
Ａ１を連結してオリゴヌクレオチドＡ２を生成可能な１つまたはそれより多いリガーゼ
を含み；
第二の領域が１つまたはそれより多いウェルを含む、
前記デバイス。
【請求項28】
Ａ０の５’端が５’－３’エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性であり、そして第一の領域のウェルが５’－３’エキソヌクレアーゼをさらに含む、請求項２７のデバイス。
【請求項29】
流体経路によって第一の領域に連結されている、１つまたはそれより多いウェルを含む第三の領域をさらに含み、そして第三の領域の１つまたはそれより多いウェルが：ｄＮＴＰ；
少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；および
増幅酵素
を含む、請求項２７または２８のいずれか一項のデバイス。
【請求項30】
第三の領域のｄＮＴＰが、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰであり；増幅酵素が、ｄＵＴＰを取り込む高忠実度ポリメラーゼであり；そして
第三の領域の１つまたはそれより多いウェルが、ウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼをさらに含む、
請求項２９のデバイス。
【請求項31】
第一および第三の領域の間に位置し、１つまたはそれより多いウェルを含む第四の領域をさらに含み、１つまたはそれより多いウェルがプロテイナーゼを含む、請求項２９または請求項３０のデバイス。
【請求項32】
第一または第二の領域の１つまたはそれより多いウェルが、リガーゼ、および連結プローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含む、請求項２７～３１のいずれか一項のデバイス。
【請求項33】
第一または第二の領域の１つまたはそれより多いウェルが、リガーゼ、およびＡ０の領域に相補的であるスプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含む、請求項２７～３１のいずれか一項のデバイス。
【請求項34】
第一または第二の領域の１つまたはそれより多いウェルが、リガーゼ、スプリントオリゴヌクレオチドＤおよび連結プローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含む、請求項２７～３１のいずれか一項のデバイス。
【請求項35】
連結プローブオリゴヌクレオチドＣが、該オリゴヌクレオチドを３’－５’エキソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含む、請求項３２または請求項３４のデバイス。
【請求項36】
Ｄが、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含む、請求項３３、３４、または３５のいずれか一項のデバイス。
【請求項37】
第一の領域の１つまたはそれより多いウェルが、各々異なるターゲット配列に対して選択的である、少なくとも１つまたはそれより多い異なるＡ０を含む、請求項２７～３６のいずれか一項のデバイス。
【請求項38】
第二の領域のウェルが：ｄＮＴＰ；
緩衝剤；
増幅酵素；
１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブ；および
Ａ１またはその一部、あるいはＡ１の多数コピーまたはその一部の多数コピーに由来するシグナルを検出するための手段
を含む、請求項３７のデバイス。
【請求項39】
第二の領域のウェルが：－Ａ１上の隣接配列に相補的である２つまたはそれより多い連結連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが一方のＬＣＲプローブの５’リン酸へのアニーリングに成功すると、もう一方のＬＣＲプローブの３’ＯＨにすぐ隣接する、前記プローブオリゴヌクレオチド；および
－１つまたはそれより多いリガーゼ
をさらに含む、請求項２７～３６のいずれか一項のデバイス。
【請求項40】
第二の領域のウェルが：－連結プローブオリゴヌクレオチドＣ；
－スプリントオリゴヌクレオチドＤ
をさらに含み；
ここで、Ｃは５’リン酸を有し、Ａ１およびＣが共に連結されてオリゴヌクレオチドＡ２を形成可能であるように、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’端がＣの５’に相補的であり、そしてＤの５’端がＡ１の３’端に相補的である
請求項２７～３６のいずれか一項のデバイス。
【請求項41】
第二の領域のウェルが：－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１がＡ２に相補的であり、そしてＡ２にアニーリングした際、ＨＯ１のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ１；および
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２が開いたＨＯ１に相補的であり、そしてＨＯ１にアニーリングした際、ＨＯ２のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ２
をさらに含む、請求項４０のデバイス。
【請求項42】
第二の領域のウェルが：－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＡ；
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＢ；ならびに
－フルオロフォア・消光剤対を含む基質
をさらに含み；
ここで、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームは、Ａ２の存在下で、オリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒性の多構成要素核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成するように、Ａ２の隣接領域に相補的である
請求項２７～３６のいずれか一項のデバイス。
【請求項43】
第二の領域のウェルが、部分的に二本鎖である核酸構築物をさらに含み、ここで：－一方の鎖は少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の領域に相補的であり、そしてこの鎖は「基質」鎖と称されてもよく；
－他方の鎖は、少なくとも１つの消光剤を含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の存在下で、部分的に鎖形成した核酸構築物が、実質的により二本鎖を形成するように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の領域に相補的であり；そして
第二の領域のウェルは、少なくとも１つのＲＮＡ塩基を除去するための酵素をさらに含む
請求項２７～３６のいずれか一項のデバイス。
【請求項44】
第二の領域の１つまたはそれより多いウェルが：連結部位を含むＡ２の領域に相補的なオリゴヌクレオチドであって、その蛍光が互いに対するあるいは１つまたはそれより多い蛍光消光剤に対する近接のいずれかによって消光されるように配置された１つまたは複数のフルオロフォアを含む、前記オリゴヌクレオチド；
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素
をさらに含み；
ここで、Ａ２の存在下で、フルオロフォアが互いからまたは対応する消光剤から分離され、そして蛍光シグナル、そしてしたがってＡ２の存在が検出可能であるように、標識オリゴヌクレオチドが消化される
請求項２７～３６のいずれか一項のデバイス。
【請求項45】
１つまたはそれより多い領域の１つまたはそれより多いウェルが、ピロホスファターゼをさらに含む、請求項２７～４４のいずれか一項のデバイス。
【請求項46】
１つまたはそれより多い領域の１つまたはそれより多いウェルが、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含む、請求項２７～４５のいずれか一項に請求されるようなデバイス。
【請求項47】
第一の領域の１つまたはそれより多いウェルが、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを形成するための酵素をさらに含む、請求項２７～４６のいずれか一項に請求されるようなデバイス。
【請求項48】
第一および第二の領域が組み合わされている、請求項２７～４７のいずれか一項に請求されるようなデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌、感染性疾患および移植臓器拒絶の同定に用いられるものを含めて、複数の診断マーカーの存在に関して試験する際の使用に適した、キットおよびデバイスに関する。これらはまた、確実に、そして低コストで、マーカーパネルを同定しなければならないコンパニオン診断試験にも有用である。
【発明の概要】
【0002】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、確実に検出され、そして／または定量化されうるレベルまで、実験室試料および診断試料に存在するＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するための、周知であり、そして強力な技術である。しかし、低レベルのこうした分子を含有する分析物試料を調べる目的のために適用した場合、いくつかの限界に悩まされる。第一に、この技術は、単一ターゲット分子と同程度に少ない分子を検出可能であるが、試料中に存在する他の核酸配列の望ましくない増幅のため、偽陽性結果を生じる傾向がある。このため、反応を開始するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーの選択が重要となり；これは次に、必要なレベルの特異性を持つプライマーを設計することを比較的複雑にする。その結果、現在、市場で入手可能であるＰＣＲに基づく多くの試験は、限定された特異性を有する。
【0003】
第二の欠点は、ＰＣＲに基づく方法の多重化が、実際のところ、プライマー－プライマー相互作用の回避のために、最大、数十のターゲット配列（しばしば１０以下）に限定され、比較的狭い操作ウィンドウの必要性を生じることである。
【0004】
別の問題は、ＰＣＲ反応は、指数関数方式でサイクリングするため、ターゲットの定量化が困難なことであり；反応効率の小さな変動が、生成される検出可能な物質の量に多大な影響を有する。したがって、適切な対照および較正が整っていても、定量化は、典型的には、ほぼ１／３からほぼ３倍の正確さに限定される。
【0005】
最後に、ＰＣＲ増幅法による研究のためにターゲティングされる領域中の突然変異は、望ましくない副作用を有しうる。例えば、ターゲット生物が、試験プライマーによってターゲティングされる遺伝子領域中の突然変異を経て、複数の偽陰性が生じたため、ＦＤＡに認可された試験が撤回されなければならなかった例があった。逆に、特定の一塩基多型（ＳＮＰ）を増幅のためにターゲティングした場合、野生型変異体が存在すると、ＰＣＲ法は、しばしば、偽陽性を生じるであろう。これを回避するには、非常に注意深いプライマー設計が必要であり、そしてさらに多重化の有効性が限定される。癌試験／スクリーニングまたはコンパニオン診断において一般的な要件であるような、ＳＮＰパネルに関する検索の際には、これは特に関連する。
【0006】
ＵＳ２００６／１１０７６５Ａ１（Ｗａｎｇら）は、典型的には非効率的であり、そしてそれほど特異的な反応ではない、ミスマッチ部位での酵素的切断を解説する。さらに、試料中の類似の配列に対する、Ｗａｎｇらに開示されるようなプローブのオフターゲットハイブリダイゼーションは、ミスマッチ部位での切断の使用のため、偽陽性結果を生じる。同じ位または近傍の位の２つの異なる遺伝子変異体は、すべて、同じプローブの切断および増幅を生じるため、こうした変異体の間を区別することもまた不可能である。Ｗａｎｇらの解説は、したがって、低感度および低特異性の反応スキームを生じるであろう。対照的に、本発明によって開示するような方法の技術的効果は、ミスマッチによって有効にブロックされうる、ｄｓＤＮＡに対する高い特異性を持つ、迅速で効率的な方法を提供する。さらに、本発明の方法は、ターゲティングされる遺伝子変異体に非常に特異的であり、同じ位または近傍の位での異なる変異体間の区別を可能にする。
【0007】
ＵＳ２００９／２３９２８３ Ａ１（Ｌｉｕら）は、加ピロリン酸分解（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ）によって除去される伸長不能３’端の使用を解説し、これは３’ブロッキング修飾を除去可能なカスタムポリメラーゼの遺伝子操作を必要とする。対照的に、本発明は、存在するポリメラーゼに生得的な天然加ピロリン酸分解活性を利用し、そして３’ブロッキング修飾を使用しない。Ｌｉｕらに開示されるような方法はまた、続く増幅を可能にするため、プローブの一部からの末端塩基のみの除去に頼り、そして３’ブロッキング修飾の使用によって、この態様に限定される。対照的に、本発明で開示する方法は、反応を引き起こすためにプローブからの複数の塩基の進行性除去が必要である態様を可能にし、末端塩基の望ましくない除去を生じうる、バックグラウンドＤＮＡまたは他のプローブのいずれかに対する一過性のオフターゲットアニーリングに対して、反応を実質的によりロバストにする。
【0008】
発明のサマリー
本発明者らは、現在、これらの制限の多くを克服するため、本発明者らの以前の特許（ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５２０１７を参照されたい）に使用した加ピロリン酸分解法を用いて本発明者らの経験の上に構築された、新規方法で使用するためのキットおよびデバイスを開発している。開発を行うにあたり、一本鎖オリゴヌクレオチド基質、あるいはブロッキング基またはヌクレオチドミスマッチを含む二本鎖基質では効率的に進行しない反応である、加ピロリン酸分解の二本鎖特異性を利用している。したがって、本発明にしたがって：
（ａ）ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記オリゴヌクレオチドＡ０；
（ｂ）リガーゼ；
（ｃ）Ａ０の端から３’－５’方向で第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能な加ピロリン酸分解酵素；
（ｄ）Ａ０の一部に実質的に相補的である、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；
（ｅ）増幅酵素；
（ｆ）適切な緩衝剤
を含むキットを提供する。
本発明者らは、現在、これらの制限の多くを克服するため、本発明者らの以前の特許（ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５２０１７を参照されたい）に使用した加ピロリン酸分解法を用いて本発明者らの経験の上に構築された、新規方法で使用するためのキットおよびデバイスを開発している。開発を行うにあたり、一本鎖オリゴヌクレオチド基質、あるいはブロッキング基またはヌクレオチドミスマッチを含む二本鎖基質では効率的に進行しない反応である、加ピロリン酸分解の二本鎖特異性を利用している。したがって、本発明にしたがって：
（ａ）ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記オリゴヌクレオチドＡ０；
（ｂ）リガーゼ；
（ｃ）Ａ０の端から３’－５’方向で第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能な加ピロリン酸分解酵素；
（ｄ）Ａ０の一部に実質的に相補的である、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；
（ｅ）増幅酵素；
（ｆ）適切な緩衝剤
を含むキットを提供する。
【0009】
および：
第一の領域、第二の領域および第三の領域の間の流体経路
を少なくとも含むデバイスであって、
第一の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ｄＮＴＰ；
少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；
試料中に存在するＤＮＡの最初の増幅のための増幅酵素
を含み、そして
第二の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記オリゴヌクレオチドＡ０；
Ａ０の端から３’－５’方向で第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能な加ピロリン酸分解酵素；
ピロリン酸イオンの少なくとも１つの供給源；
リガーゼ
を含み、そして
第三の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ｄＮＴＰ；
緩衝剤；
増幅酵素；
Ａ１またはその一部、あるいはＡ１の多数コピーまたはその一部の多数コピーに由来するシグナルを検出するための手段
を含み；そして
第二の領域のウェルまたは第三の領域のウェルが、Ａ０の一部に実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む
前記デバイス。
第一の領域、第二の領域および第三の領域の間の流体経路
を少なくとも含むデバイスであって、
第一の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ｄＮＴＰ；
少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；
試料中に存在するＤＮＡの最初の増幅のための増幅酵素
を含み、そして
第二の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記オリゴヌクレオチドＡ０；
Ａ０の端から３’－５’方向で第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能な加ピロリン酸分解酵素；
ピロリン酸イオンの少なくとも１つの供給源；
リガーゼ
を含み、そして
第三の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ｄＮＴＰ；
緩衝剤；
増幅酵素；
Ａ１またはその一部、あるいはＡ１の多数コピーまたはその一部の多数コピーに由来するシグナルを検出するための手段
を含み；そして
第二の領域のウェルまたは第三の領域のウェルが、Ａ０の一部に実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む
前記デバイス。
【0010】
本発明の方法を適用してもよい分析物は、探しているターゲットポリヌクレオチド配列（単数または複数）を含む核酸、例えば天然存在または合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。１つの態様において、分析物は、典型的には、該分析物および他の生物学的物質を含有する水溶液中に存在し、そして１つの態様において、分析物は、試験の目的のための関心対象ではない他のバックグラウンド核酸分子と共に存在するであろう。いくつかの態様において、分析物は、これらの他の核酸構成要素に比較して、少量で存在するであろう。好ましくは、例えば、分析物が細胞性物質を含有する生物学的標本に由来する場合、方法の工程（ｂ）を実行する前に、これらの他の核酸および外来性の生物学的物質のある程度またはすべては、試料調製技術、例えば濾過、遠心分離、クロマトグラフィまたは電気泳動を用いて、除去されているであろう。適切には、分析物は、哺乳動物被験体（特にヒト患者）から採取された生物学的試料、例えば血液、血漿、痰、尿、皮膚または生検に由来する。１つの態様において、存在するいずれの細胞も破壊することによって分析物を放出させるため、生物学的試料は、溶解に供されるであろう。他の態様において、分析物は、試料自体の中で、すでに遊離した形で；例えば血液または血漿中に循環している細胞不含ＤＮＡとして存在してもよい。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】単純化されたポリヌクレオチド配列検出法に関するプロトコル。
【図2】前増幅工程中に５’－３’エキソヌクレアーゼ消化工程が起こる場合、およびこの消化工程がプロトコルの加ピロリン酸分解／連結工程に移動した場合（プロトコル３～５におけるようなもの）に検出される蛍光のレベル（特定のターゲット分析物配列の存在に相当する）を比較するグラフ。この例では、５’－３’エキソヌクレアーゼはラムダである。
【図3】本発明者らは、ある範囲の異なるＰＰＬ酵素を用いて、本発明のプロトコル３の方法を試験した。図３（Ａ）は、Ｍａｋｏ、ＫｌｅｎｏｗおよびＢｓｕを用いた１％ＭＡＦ Ｔ７９０Ｍの検出を示す。図３（Ｂ）は、異なるＰｐｉ濃度範囲で、Ｂｓｔ ＬＦを用いた０．５％ＭＡＦ Ｔ７９０Ｍの検出を示す。４つの酵素はすべて、広範な最適化を伴わなくても非常によく働いた。
【図4】４つの異なる加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）酵素：Ｍａｋｏ、Ｋｌｅｎｏｗ、ＢｓｕおよびＢｓｔ ＬＦを用い、本発明のプロトコル４の方法を用いた、１％ＭＡＦ、Ｔ７９０Ｍの検出に関する結果。
【図5】プロトコル１およびプロトコル４にしたがって検出される、０．５％、０．１０％および０．０５％ＭＡＦエクソン１９ ｄｅｌ＿６２２３の検出される蛍光（特定のターゲット分析物配列の存在に相当する）のレベルを示すグラフ。
【図6】本発明者らは、プロトコル４にしたがって、０．１０％、０．５０％および１％ＭＡＦでのＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍを検出した。
【図7】ＲＣＡ工程においてエキソヌクレアーゼの存在を伴うおよび伴わない、１％ＭＡＦでのＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍの検出を示す。
【図8】本発明者らは、０．５％ＭＡＦ ＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍに関して検出されるシグナルの強度に対して、ＰＰＬ：ＲＣＡ混合比がどのような影響を有するかを調べ、その結果を図８に示す。見て取れるように、１：２のＰＰＬ：ＲＣＡ混合比は最低のシグナル強度を生じるが、最も早い時点でシグナルを生じる。これに続いて時間的に近いのが１：４ ＰＰＬ：ＲＣＡ混合物であり、これはより高いシグナル強度を有する。最大のシグナル強度は、反応の最も遅い時点で、１：８ ＰＰＬ：ＲＣＡ混合物に関して見られる。
【図10】本発明者らは、プロトコル４にしたがって、ＲＣＡに関する、２つの異なる酵素、ＢＳＴ Ｌ．ＦおよびＢＳＴ ２．０ＷＳの使用を調べた。
【図11】本発明者らは、異なるＰＰＬ：ＲＣＡ反応混合比で、ＲＣＡ反応に対する異なるＰＰＬ酵素の効果を調べた。この結果は、図１１（Ａ）１：４ ＰＰＬ：ＲＣＡおよび図１１（Ｂ）１：８ ＰＰＬ：ＲＣＡで見られうる。すべてのＰＰＬ酵素は、ＢＳＴ Ｌ．Ｆ．以外は、１：４ ＰＰＬ：ＲＣＡ比でＲＣＡ反応に影響を及ぼす。１：８ ＰＰＬ：ＲＣＡ比では、ＢＳＴ Ｌ．ＦおよびＫｌｅｎｏｗ以外のすべての酵素がＲＣＡ反応に影響を及ぼす。
【図12】オリゴヌクレオチド３および４が両方存在する場合、反応中で蛍光シグナルがより迅速に現れることを示し、オリゴヌクレオチド３の加ピロリン酸分解および連結が第一の反応混合物で生じていることを示す、実施例１１に関する蛍光測定結果。
【図13】同じ反応における１％アレル割合でのＴ７９０ＭおよびＣ７９７Ｓ＿２３８９突然変異の検出。
【図14】０．５％アレル割合での１つのウェル中で同時の３つの突然変異：Ｇ７１９Ｘ＿６２３９、Ｇ７１９Ｘ＿６２５２、Ｇ７１９Ｘ＿６２５３の検出。
【図15】分析物ターゲット配列に対して、Ａ２を形成するＡ１の環状化の模式図。Ａ０はＡ０の３’端から３’－５’方向にターゲットに対して進行性に消化されて、部分的に消化された鎖Ａ１を形成し、これを工程（Ａ）および（Ｂ）に示す。この進行性消化は、Ａ０／Ａ１の５’端に相補的なターゲット領域を明らかにし、そして次いで、Ａ１の５’端がこの領域にハイブリダイズする。これを工程（Ｃ）に示す。次いで、Ａ１は共に連結されて、環状化Ａ２を形成する。工程（Ｄ）。
【図16】Ａ１を形成するＡ０の加ピロリン酸分解が起こり、その後、ターゲット配列に対して、Ａ２を形成するＡ１の環状化が続く態様からの結果を示す、実施例１４に関する蛍光測定結果。
【図17】一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０は、ターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ０の３’端がターゲットポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成する。本発明のこの単純化された態様において、ターゲットにアニーリングしていないＡ０が、どのように方法のさらなる工程に関与しないかを例示するため、存在するＡ０の２つの分子および１つのターゲットポリヌクレオチド配列がある。この例示的例において、Ａ０の３’端はターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングする一方、Ａ０の５’端はアニーリングしない。Ａ０の５’端は、５’化学ブロッキング基、共通プライミング配列およびバーコード領域を含む。部分的に二本鎖である第一の中間産物は、加ピロリン酸分解酵素の存在下で、Ａ０の３’端から３’－５’方向で、加ピロリン酸分解を経て、部分的に消化された鎖Ａ１、分析物、およびターゲットにアニーリングしなかった未消化Ａ０分子を生じる。
【図18】Ａ１は、一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングし、そしてＡ１鎖は、Ｂに対して５’－３’方向に伸長されてオリゴヌクレオチドＡ２を生成する。この例示的例において、トリガーオリゴヌクレオチドＢは５’化学ブロックを有する。いずれの未消化Ａ０もトリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングするが、Ｂに対して５’－３’方向に伸長されて、方法の後半部分のターゲットである配列を生成することは不可能である。この例では、Ａ２は少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングされて、そしてＡ２またはＡ２の領域の多数コピーが生成される。
【図19】Ａ１はスプリントオリゴヌクレオチドＤにアニーリングし、そして次いでその３’および５’端での連結によって環状化される。ここで環状化されたＡ２は少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングされて、そしてＡ２またはＡ２の領域の多数コピーが生成される。この例示的例において、スプリントオリゴヌクレオチドＤは、３’修飾（この例では化学物質）により、またはＤの３’端およびＡ２の対応する領域の間のヌクレオチドミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対して伸長することが不可能である。
【図20】スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’領域は、Ａ１の３’領域にアニーリングする一方、スプリントオリゴヌクレオチドＤの５’領域は、連結プローブＣの５’領域にアニーリングする。したがって、Ａ１、Ｃ、および任意選択で５’－３’方向でのＡ１の伸長によって形成されてＣの５’端と出会う中間領域で構成される、第二の中間産物Ａ２が形成される。この例示的例において、連結プローブＣは、３’化学ブロッキング基を有し、したがって、３’－５’エキソヌクレアーゼを用いて、いずれの非連結Ａ１も消化することも可能である。Ａ２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そして多数コピーのＡ２またはＡ２の領域を生成する。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の１つの側面において、試料中に存在する所定の核酸分析物におけるターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法であって：
（ａ）
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；および
ｉｉｉ．リガーゼ
を含む第一の反応混合物に、１つまたはそれより多い核酸分析物を導入し、
ここで、Ａ０は３’端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を生成し、そしてＡ１は連結を経てＡ２を形成する；
（ｂ）先の工程の産物由来のシグナルを検出する、ここで、産物はＡ２またはその一部、あるいはＡ２の多数コピーまたはその一部の多数コピーであり、そしてそこから分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在を推測する
工程を含む、前記方法を提供する。
（ａ）
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；および
ｉｉｉ．リガーゼ
を含む第一の反応混合物に、１つまたはそれより多い核酸分析物を導入し、
ここで、Ａ０は３’端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を生成し、そしてＡ１は連結を経てＡ２を形成する；
（ｂ）先の工程の産物由来のシグナルを検出する、ここで、産物はＡ２またはその一部、あるいはＡ２の多数コピーまたはその一部の多数コピーであり、そしてそこから分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在を推測する
工程を含む、前記方法を提供する。
【0013】
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、ピロリン酸イオンの供給源をさらに含む。
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、Ａ０の一部に実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、Ａ０の一部に実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。
【0014】
いくつかの態様において、ｄＮＴＰは任意選択である。
いくつかの態様において、第一の反応混合物は増幅酵素をさらに含む。
いくつかの態様において、工程（ａ）の産物を、工程（ｂ）の前に第二の反応混合物に導入し、前記の第二の反応混合物は、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびｄＮＴＰを含む。
いくつかの態様において、第一の反応混合物は増幅酵素をさらに含む。
いくつかの態様において、工程（ａ）の産物を、工程（ｂ）の前に第二の反応混合物に導入し、前記の第二の反応混合物は、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびｄＮＴＰを含む。
【0015】
いくつかの態様において、第二の反応混合物は増幅酵素をさらに含む。
いくつかの態様において、１つまたはそれより多い核酸分析物を、第一および第二の反応混合物に同時に導入してもよい。
いくつかの態様において、１つまたはそれより多い核酸分析物を、第一および第二の反応混合物に同時に導入してもよい。
【0016】
いくつかの態様において、１つまたはそれより多い核酸分析物を、第一および第二の反応混合物に連続して導入してもよい。
いくつかの態様において、ｄＮＴＰはホットスタートｄＮＴＰである。
いくつかの態様において、ｄＮＴＰはホットスタートｄＮＴＰである。
【0017】
ホットスタートｄＮＴＰは、３’末端で熱不安定性保護基で修飾されているｄＮＴＰである。この修飾が存在することで、熱活性化工程を用いてヌクレオチド保護基が除去されるまで、ＤＮＡポリメラーゼヌクレオチド取り込みが遮断される。
【0018】
いくつかの態様において、工程（ａ）中、分析物は一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０にアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ０の３’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成する。
【0019】
いくつかの態様において、工程（ａ）中、第一の中間産物は、Ａ０の３’端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解されて、部分的に消化された鎖Ａ１および分析物を生成する。
【0020】
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、連結プローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含み、そして部分的に消化された鎖Ａ１が３’端でＣの５’端に連結されて、オリゴヌクレオチドＡ２を生成する。
【0021】
いくつかの態様において、部分的に消化された鎖Ａ１は、その３’および５’端の連結を通じて環状化される。
いくつかの態様において、Ａ１の連結は：
工程（ａ）中；または
工程（ｂ）中；または
工程（ａ）および（ｂ）の間
に起こる。
いくつかの態様において、Ａ１の連結は：
工程（ａ）中；または
工程（ｂ）中；または
工程（ａ）および（ｂ）の間
に起こる。
【0022】
１つの態様において、Ａ１は分析物ターゲット配列に対して環状化される。この態様において、Ａ１を形成する、Ａ０の３’端から３’－５’方向へのＡ０の進行性消化によって明らかになるターゲット領域は、Ａ０／Ａ１の５’端に相補的である。この態様において、リガーゼを用いて、Ａ１の３’および５’端を連結して、環状化オリゴヌクレオチドＡ２を形成してもよい。これは例えば、図１５に示される。１つの態様において、Ａ０／Ａ１の５’端は、長さ５～５０ヌクレオチドの領域に渡って、ターゲットに相補的である。１つの態様において、これは長さ５～２５ヌクレオチドである。１つの態様において、これは長さ５～２０ヌクレオチドである。１つの態様において、これは長さ５～１５ヌクレオチドである。１つの態様において、これは長さ５～１２ヌクレオチドである。１つの態様において、これは長さ５～１０ヌクレオチドである。
【0023】
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、５’－３’エキソヌクレアーゼをさらに含み、そしてＡ０の５’端は５’－３’エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性を与えられている。
【0024】
いくつかの態様において、所定の核酸分析物の増幅後および第一の反応混合物（工程（ａ））の添加前に、試料をプロテイナーゼでさらに処理する。
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含む。
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含む。
【0025】
いくつかの態様において、工程（ｂ）の前または工程（ｂ）中、先の工程の産物をピロホスファターゼで処理する。
いくつかの態様において、工程（ｂ）の前または工程（ｂ）中、先の工程の産物をエキソヌクレアーゼで処理する。
いくつかの態様において、工程（ｂ）の前または工程（ｂ）中、先の工程の産物をエキソヌクレアーゼで処理する。
【0026】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドＣは、３’－５’エキソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾をさらに含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドＣは、５’－３’エキソヌクレアーゼ消化から保護する５’修飾をさらに含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドＣは、５’－３’エキソヌクレアーゼ消化から保護する５’修飾をさらに含む。
【0027】
いくつかの態様において、第一または第二の反応混合物は、スプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含む。
いくつかの態様において、Ｄは、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含む。
いくつかの態様において、Ｄは、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含む。
【0028】
いくつかの態様において、Ｄは、３’修飾により、またはＤの３’端およびＡ１の対応する領域の間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対して伸長を経ることが不可能である。
【0029】
いくつかの態様において、Ａ０の加ピロリン酸分解を実行して、部分的に消化された鎖Ａ１を形成する酵素はまた、Ａ２を増幅する。
いくつかの態様において、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、検出を達成する。
いくつかの態様において、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、検出を達成する。
【0030】
いくつかの態様において、Ａ２のアンプリコン生成から生じる、経時的なシグナル増加を用いて、分析物中のターゲット配列の濃度を推測する。
いくつかの態様において、各々異なるターゲット配列に対して選択的であり、そして各々同定領域を含む、複数のプローブＡ０であって、そしてＡ２由来のアンプリコンには、この同定領域が含まれ、そしてしたがって、分析物中に存在するターゲット配列が、同定領域（単数または複数）の検出を通じて推測されることでさらに特徴づけられる、前記Ａ０を使用する。
いくつかの態様において、各々異なるターゲット配列に対して選択的であり、そして各々同定領域を含む、複数のプローブＡ０であって、そしてＡ２由来のアンプリコンには、この同定領域が含まれ、そしてしたがって、分析物中に存在するターゲット配列が、同定領域（単数または複数）の検出を通じて推測されることでさらに特徴づけられる、前記Ａ０を使用する。
【0031】
いくつかの態様において、同定領域（単数または複数）の検出は、分子プローブを用いて、または配列決定を通じて行われる。
いくつかの態様において、方法の最終工程は：
ｉ．１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、工程（ｂ）の産物を標識し；
ｉｉ．産物の蛍光シグナルを測定し；
ｉｉｉ．産物を一組の変性条件に曝露し；そして
変性条件への曝露中、産物の蛍光シグナルにおける変化を監視することによって、分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列を同定する
工程をさらに含む。
いくつかの態様において、方法の最終工程は：
ｉ．１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、工程（ｂ）の産物を標識し；
ｉｉ．産物の蛍光シグナルを測定し；
ｉｉｉ．産物を一組の変性条件に曝露し；そして
変性条件への曝露中、産物の蛍光シグナルにおける変化を監視することによって、分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列を同定する
工程をさらに含む。
【0032】
いくつかの態様において、１つまたはそれより多い核酸分析物は、複数の反応体積に分けられ、各体積は、異なるターゲット配列を検出するために導入される、１つまたはそれより多いプローブオリゴヌクレオチドＡ０を有する。
【0033】
いくつかの態様において、異なるプローブＡ０は、共通のプライミング部位を含み、単一のプライマーまたは単一の組のプライマーをＡ２の領域の増幅に用いることを可能にする。
【0034】
いくつかの態様において、試料中に存在する所定の核酸分析物中のターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法であって：
（ａ）試料中に存在する所定の核酸分析物を増幅し；
（ｂ）
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；および
ｉｉｉ．リガーゼ
を含む第一の反応混合物に、工程（ａ）の産物を導入し、
ここで、Ａ０は３’端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を生成し、そしてＡ１は連結を経てＡ２を形成する；
（ｃ）先の工程の産物由来のシグナルを検出する、ここで、産物はＡ２またはその一部、あるいはＡ２の多数コピーまたはその一部の多数コピーであり、そしてそこから分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在を推測する
工程を含む、前記方法を提供する。
（ａ）試料中に存在する所定の核酸分析物を増幅し；
（ｂ）
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；および
ｉｉｉ．リガーゼ
を含む第一の反応混合物に、工程（ａ）の産物を導入し、
ここで、Ａ０は３’端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ１を生成し、そしてＡ１は連結を経てＡ２を形成する；
（ｃ）先の工程の産物由来のシグナルを検出する、ここで、産物はＡ２またはその一部、あるいはＡ２の多数コピーまたはその一部の多数コピーであり、そしてそこから分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在を推測する
工程を含む、前記方法を提供する。
【0035】
本発明にしたがって、所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法を提供する。本発明の多様な方法を適用してもよい分析物を、分析物を増幅するように設計された一連の予備的工程によって、上述の生物学的試料から調製してもよく、そして典型的には有意に過剰に存在するバックグラウンドゲノムＤＮＡから分析物を分離してもよい。この方法は、一般的に、一本鎖ターゲット分析物の産生に適用可能であり、そしてしたがって、本発明の第一の側面の方法と共に組み込まれているかまたは第一の側面の方法の部分をさらに含む場合以外の状況で有用である。したがって、（１）分析物（単数または複数）および任意選択でバックグラウンドゲノムＤＮＡを含む生物学的試料を、増幅サイクルに供することによって、分析物（単数または複数）のアンプリコンを産生する工程によって特徴づけられる、ターゲットポリヌクレオチド領域を含む核酸の少なくとも１つの一本鎖分析物を調製するための方法を提供する。
【0036】
いくつかの好ましい態様において、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸および少なくとも１つの対応するプライマー対の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、増幅を行い、ここで、プライマーの１つには、５’－３’エキソヌクレアーゼブロッキング基が含まれ、そして（２）任意選択で、工程（１）の産物を、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼで消化する。１つの態様において、方法は、（３）工程（２）の産物をプロテイナーゼと反応させて、ポリメラーゼを破壊し、そしてその後、（４）工程（３）の産物を、５０℃を超える温度に加熱することによって、プロテイナーゼを脱活性化する工程をさらに含んでもよい。
【0037】
いくつかの好ましい態様において、工程（１）～（４）を、本発明の第一の側面の方法の工程（ａ）の前に行って、生物学的試料由来のターゲット配列を検出する統合法を生じる。別の態様において、生物学的試料は、工程（１）を実行する前に、細胞溶解を経ている。
【0038】
工程（１）のいくつかの態様において、ヌクレオシド三リン酸は、天然存在ＤＮＡに特徴的な４つのデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物である。好ましい態様において、デオキシヌクレオシド三リン酸の混合物は、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の代わりに、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を含み、そして酵素ｄＵＴＰ－ＤＮＡグリコラーゼ（ＵＤＧ）の存在下で工程（１）をさらに行って、先のアッセイ由来のいずれの混入アンプリコンも除去する。さらに別の態様において、高忠実度ポリメラーゼ、例えば商標名Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）またはＱ５の下で販売されるものの１つを工程（１）で用いる。さらに別の態様において、ポリメラーゼは、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉウラシル＋ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
【0039】
高忠実度ＤＮＡポリメラーゼは、いくつかの安全装置を有して、ＤＮＡをコピーする間の誤りの作製および増幅の両方に対して保護する。こうした酵素は、重合中、正しくないヌクレオシド三リン酸に対して、正しいヌクレオシド三リン酸に有意な結合優先性を有する。正しくないヌクレオチドがポリメラーゼ活性部位に結合すると、活性部位複合体の最適以下の構造のため、取り込みが遅くなる。この遅延時間は、ポリメラーゼ進行前に正しくないヌクレオチドが解離する機会を増加させ、それによって正しいヌクレオシド三リン酸でプロセスが再び始まることを可能にする。正しくないヌクレオチドが挿入された場合、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼが追加の防御線となる。誤って対形成した塩基によって引き起こされる攪乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）が検出され、そしてポリメラーゼは成長中のＤＮＡ鎖の３’端を、プルーフリーディング３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン内に移動させる。ここで、正しくないヌクレオチドが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性によって除去され、この際、鎖は再びポリメラーゼドメインに戻され、ここで重合が続きうる。
【0040】
いくつかの態様において、ヌクレオシド三リン酸は、合成または修飾デオキシヌクレオシド三リン酸の混合物である。
いくつかの態様において、ヌクレオシド三リン酸は、４つのデオキシヌクレオシド三リン酸および合成または修飾デオキシヌクレオチド三リン酸の混合物である。
いくつかの態様において、ヌクレオシド三リン酸は、４つのデオキシヌクレオシド三リン酸および合成または修飾デオキシヌクレオチド三リン酸の混合物である。
【0041】
いくつかの態様において、限定された量のプライマーおよび過剰な増幅サイクルを用いて、工程（１）を行う。これによって、分析物の最初の量に関わらず、固定された量のアンプリコンが産生されることを意味する。したがって、続く工程前の分析物定量化に関する必要性が回避される。工程（２）の必要性を取り除く利点を有する、工程（１）の別の態様において、プライマー対であって、２つのプライマーの一方が他方より過剰に存在し、１つのプライマーが完全に利用されたら、一本鎖アンプリコンの生成を生じる、前記プライマー対の存在下で、増幅を行う。
【0042】
工程（２）のいくつかの好ましい態様において、ホスホロチオエート連結、反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）塩基、ＤＮＡスペーサーおよび当該技術分野に一般的に知られる他のオリゴヌクレオチド修飾より選択される、エキソヌクレアーゼブロッキング基で、５’プライマーをブロッキングする。別の態様において、対のもう一方のプライマーは、５’端にリン酸基を有する。
【0043】
いくつかの態様において、工程（３）において、使用するプロテイナーゼはプロテイナーゼＫであり、そして８０～１００℃の温度で、最大３０分間加熱することによって、工程（４）を実行する。１つの態様において、工程（３）において、使用するプロテイナーゼはプロテイナーゼＫであり、５５℃の温度に５分間加熱することによって、工程（３）を実行し、そして９５℃の温度に１０分間加熱することによって、工程（４）を実行する。別の態様において、工程（２）の後の何らかの時点で、反応媒体をホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼで処理して、存在しうるいずれの残渣ヌクレオシド三リン酸も除去する。
【0044】
いくつかの態様において、分析物中のターゲットポリヌクレオチド配列は、癌性腫瘍細胞のＤＮＡまたはＲＮＡ内の遺伝子または染色体領域であり、そして１つまたはそれより多い突然変異；例えば１つまたはそれより多い一塩基多型（ＳＮＰ）の形の突然変異の存在によって特徴づけられるであろう。したがって、本発明は、疾患の再発の監視および／または治療の際に有用であろう。治療後に疾患から解放されたと宣言されている患者を長期間監視し、疾患の再発を検出してもよい。これは、非侵襲性に行われる必要があり、そして血液試料からのターゲット配列の高感度検出を必要とする。同様に、いくつかの癌に関しては、治療後、患者において残存する残渣癌細胞がある。患者血液中に存在するこれらの細胞（または細胞不含ＤＮＡ）のレベルを、本発明を用いて監視すると、疾患の再発または現在の療法の失敗、そして代替療法へのスイッチの必要性の検出が可能になる。
【0045】
いくつかの態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列の検出は、疾患治療中の患者試料の反復試験を可能にし、療法に対する耐性の発展を早期に検出することを可能にするであろう。例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、例えばゲフィチニブ、エルロチニブは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の第一選択の治療として一般的に用いられる。治療中、腫瘍は、しばしば、治療に対する耐性を与える、ＥＧＦＲ遺伝子中の突然変異（例えばＴ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ）を発展させるであろう。これらの突然変異の早期検出は、患者の代替療法への転換を可能にする。
【0046】
いくつかの態様において、分析物中のターゲットポリヌクレオチド配列は、胎児起源のＤＮＡまたはＲＮＡ内の遺伝子または染色体領域にあり、そして１つまたはそれより多い突然変異；例えば１つまたはそれより多い一塩基多型（ＳＮＰ）の形の突然変異の存在によって特徴づけられるであろう。したがって、本発明は、他の利用可能な試験技術よりも、妊娠のより初期の段階で、非常に低いアレル割合の突然変異を検出するために使用可能である。
【0047】
別の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、得られる遺伝情報以外は健康である個体に由来する遺伝子またはゲノム領域であってもよく、価値あるコンパニオン診断情報を生成することを補助し、ヒト集団内の１つまたはそれより多い定義される群に渡って医学的または療法的結論を引き出すことを可能にしうる。
【0048】
さらに別の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、感染性疾患、または特定の療法での治療に対する感染性疾患の耐性に特徴的であってもよく；例えば細菌またはウイルスの遺伝子または染色体領域に特徴的なポリヌクレオチド配列、あるいは療法に対する耐性を与えるその中の突然変異である。
【0049】
いくつかの態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、ドナーＤＮＡに特徴的であってもよい。移植された臓器が患者によって拒絶される場合、この臓器由来のＤＮＡは、患者の血流内に脱落する。このＤＮＡを早期検出すれば、拒絶の早期検出が可能になるであろう。これは、ドナー特異的マーカーのカスタムパネルを用いて、またはあるものはドナー中に存在し、そしてあるものはレシピエントに存在する、集団に一般的であることが知られる変異体のパネルを用いることによって、達成可能である。したがって、長期に渡る臓器レシピエントのルーチンの監視が、請求する方法によって可能である。
【0050】
さらに別の態様において、プローブ（以下を参照されたい）の異なる組み合わせを用いる多様なバージョンの方法を平行して使用して、複数のターゲット配列；例えば、癌の供給源、癌の指標または感染の複数の供給源に関して、分析物を同時にスクリーニングすることが可能になる。このアプローチでは、方法の平行適用によって得られる増幅された産物を、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または配列特異的分子プローブ、例えば分子ビーコン、ヘアピンプローブ等で構成される検出パネルと接触させる。したがって、本発明の別の側面において、ターゲットポリヌクレオチド配列に関して選択的である１つまたはそれより多い化学的および生物学的プローブと、あるいは増幅されたプローブ領域を同定するための配列決定の使用と組み合わせた、少なくとも１つのプローブおよび任意選択で１つの連結オリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【0051】
いくつかの態様において、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０は、プライミング領域および検出しようとするターゲットポリヌクレオチド配列に相補的である３’端を含む。この手段によって、少なくとも部分的に二本鎖である第一の中間産物を生成する。１つの態様において、過剰なＡ０の存在下で、そして分析物および任意の他の核酸分子を含有する水性媒体中で、この工程を行う。
【0052】
工程（ａ）中、第一の中間産物の二本鎖領域は、そのＡ０鎖の３’端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解される。その結果、Ａ０鎖は次第に消化されて、部分的に消化された鎖を生成し；以後これをＡ１と称する。プローブオリゴヌクレオチドが誤って非ターゲット配列にハイブリダイズした場合、加ピロリン酸分解反応が、いずれのミスマッチでも停止し、方法の続く工程が進行することを防ぐ。別の態様において、Ａ１が、分析物またはその中のターゲット領域と安定な二重鎖を形成するために十分な相補性を欠くようになるまで、この消化を続ける。この時点で、多様な鎖は次いで、融解によって分離し、それによって、一本鎖型のＡ１を生じる。典型的な加ピロリン酸分解条件下では、この分離は、分析物およびＡ０の間に、６～２０の間の相補性ヌクレオチドが存在する場合に起こる。
【0053】
別の態様において、Ａ１が、加ピロリン酸分解酵素が結合するために、または加ピロリン酸分解反応が続くために、分析物またはその中のターゲット領域と、十分な相補性を欠くまで、消化は続く。これは典型的には、分析物およびプローブの間に、６～２０の間の相補性ヌクレオチドがある場合に起こる。いくつかの態様において、これは、６～４０の間の相補性ヌクレオチドが残っている際に起こる。
【0054】
Ａ１の５’および３’端に相補性を有するスプリントオリゴヌクレオチドＤを使用する（以下を参照されたい）、別の態様において、消化は、Ａ１およびターゲットの間の相補性の長さが、オリゴＤがＡ１から分析物分子を置換することがエネルギー的に好ましい時点まで減少するまで続く。これは、典型的には、Ａ１および分析物分子の間の相補性領域が、オリゴＤおよびＡ１の３’端の間の相補性領域と類似であるかまたはそれより短い際に起こるが、Ａ１の５’端にすでにハイブリダイズしていてもよい、オリゴＤの分子内ハイブリダイゼーションの好ましさ（ｆａｖｏｕｒａｂｉｌｉｔｙ）のため、Ａ１および分析物分子の間の相補性がこれより長い場合もまた、起こりうる。
【0055】
Ａ１の連結がスプリントとして分析物分子を用いて行われる（図１６を参照されたい）、別の態様において、Ａ１の３’および５’端が隣接し、そしてニックによってのみ分離されるように、Ａ１の５’端が分析物分子にハイブリダイズ可能であるまで消化は続き、この時点で、これらはリガーゼによって共に連結され、そして消化はもはや進行不能である。
【0056】
適切には、加ピロリン酸分解は、加ピロリン酸分解活性を示す少なくとも１つのポリメラーゼおよびピロリン酸イオンの供給源の存在下、２０～９０℃の範囲の温度で、反応媒体中で行われる。ポリヌクレオチド消化に適用されるような加ピロリン酸分解反応に関するさらなる情報は、例えばＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４４（１９６９） ｐｐ．３０１９－３０２８または本発明者らの以前の特許出願に見出されうる。
【0057】
いくつかの態様において、加ピロリン酸分解工程は、過剰なポリピロリン酸の供給源の存在によって駆動され、適切な供給源には、３またはそれより多いリン原子を含有する化合物が含まれる。
【0058】
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、過剰なポリピロリン酸の供給源を含む。
いくつかの態様において、加ピロリン酸分解工程は、過剰な修飾ピロリン酸の供給源の存在によって駆動される。適切な修飾ピロリン酸には、架橋酸素の代わりに置換された他の原子または基を持つもの、あるいは他の酸素上に置換基または修飾基を含むピロリン酸（またはポリピロリン酸）が含まれる。当業者は、本発明の使用に適した修飾ピロリン酸の多くのこうした例があることを理解するであろうし、その限定されない選択は：
いくつかの態様において、加ピロリン酸分解工程は、過剰な修飾ピロリン酸の供給源の存在によって駆動される。適切な修飾ピロリン酸には、架橋酸素の代わりに置換された他の原子または基を持つもの、あるいは他の酸素上に置換基または修飾基を含むピロリン酸（またはポリピロリン酸）が含まれる。当業者は、本発明の使用に適した修飾ピロリン酸の多くのこうした例があることを理解するであろうし、その限定されない選択は：
【0059】
【化1】
【0060】
である。
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、過剰な修飾ポリピロリン酸の供給源を含む。
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、過剰な修飾ポリピロリン酸の供給源を含む。
【0061】
いくつかの好ましい態様において、ピロリン酸イオンの供給源は、ＰＮＰ、ＰＣＰまたはトリポリリン酸（ＰＰＰｉ）である。
さらに、限定されるわけではないが、加ピロリン酸分解工程（ｂ）で用いるためのピロリン酸イオンの供給源の例は、ＷＯ２０１４／１６５２１０およびＷＯ００／４９１８０に見られうる。
さらに、限定されるわけではないが、加ピロリン酸分解工程（ｂ）で用いるためのピロリン酸イオンの供給源の例は、ＷＯ２０１４／１６５２１０およびＷＯ００／４９１８０に見られうる。
【0062】
いくつかの態様において、過剰な修飾ピロリン酸の供給源は、Ｙ－Ｈとして示されることも可能であり、式中、Ｙは一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｂ）－（Ｚ－Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ－Ｘ））ｎ－に対応し、式中、ｎは１～４の整数であり；各Ｚ－は、－Ｏ－、－ＮＨ－または－ＣＨ２－より独立に選択され；各Ｂは独立にＯまたはＳのいずれかであり；Ｘ基は、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、アルキル、アルケニル、または複素環基より独立に選択され、但し、ＺおよびＢの両方が－Ｏ－に対応し、そしてｎが１である場合、少なくとも１つのＸ基はＨでない。
【0063】
いくつかの態様において、Ｙは、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｂ）－（Ｚ－Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ－Ｘ））ｎ－に対応し、式中、ｎは１、２、３または４である。別の態様において、Ｙ基は、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｈ）－に対応し、式中、Ｘ基の１つは－Ｈである。さらに別の好ましい態様において、Ｙは、一般式（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｘ）－－に対応し、式中、Ｘ基の少なくとも１つは、メチル、エチル、アリルまたはジメチルアリルより選択される。
【0064】
別の態様において、Ｙは、一般式（Ｈ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｈ）－、式中、Ｚは、－ＮＨ－または－ＣＨ２－である、あるいは（Ｘ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｘ）－－、式中、Ｘ基はすべて、－Ｎａまたは－Ｋのいずれかであり、そしてＺは－ＮＨ－または－ＣＨ２－のいずれかである、のいずれかに対応する。
【0065】
他の態様において、Ｙは、一般式（Ｈ－Ｏ）２Ｐ（＝Ｂ）－Ｏ－Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ－Ｈ）－に対応し、式中、各Ｂ基は、独立に、ＯまたはＳのいずれかであり、少なくとも１つはＳである。
【0066】
Ｙの好ましい態様の特定の例には、式（Ｘ１－Ｏ）（ＨＯ）Ｐ（＝Ｏ）－Ｚ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－Ｘ２）のものが含まれ、式中、ＺはＯ、ＮＨまたはＣＨ２であり、そして（ａ）Ｘ１はγ，γ－ジメチルアリルであり、そしてＸ２は－Ｈであるか；または（ｂ）Ｘ１およびＸ２はどちらもメチルであるか；または（ｃ）Ｘ１およびＸ２はどちらもエチルであるか；または（ｄ）Ｘ１はメチルであり、そしてＸ２はエチルであるかまたはその逆である。
【0067】
いくつかの態様において、検出のために分子プローブを用いようとする場合、プローブオリゴヌクレオチドＡ０は、ターゲット配列に相補的な領域の５’側にオリゴヌクレオチド同定領域を含むように設定され、そして使用される分子プローブは、この同定領域にアニーリングするよう設計される。１つの態様において、Ａ０の３’領域のみが、ターゲットにアニーリング可能であり；すなわち他の領域はいずれも、加ピロリン酸分解工程を行う温度で、安定な二重鎖が存在するために十分な、分析物との相補性を欠く。ここで、そして全体に、用語「十分な相補性」によって、所定の領域が分析物上の所定の領域と相補性を有する限りにおいて、相補性領域は長さ１０ヌクレオチドより長いことを意味する。
【0068】
本発明の方法のさらなる側面において、任意の先の態様の加ピロリン酸分解工程を、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼを用いたエキソヌクレアーゼ消化工程で置き換える、代替態様を提供する。当業者は、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼには、とりわけ、３’－５’方向に読むもの、例えばエキソＩＩＩ、および５’－３’方向に読むもの、例えばラムダエキソが含まれることを理解するであろう。
【0069】
エキソヌクレアーゼ消化工程が二本鎖特異的５’－３’エキソヌクレアーゼを利用する、本発明のいくつかの態様において、ターゲット分析物に相補的であるのはＡ０の５’端であり、そして共通プライミング配列およびブロッキング基は、ターゲットに相補的な領域の３’側に位置する。検出のために分子プローブを用いようとする、さらなる態様において、プローブオリゴヌクレオチドＡ０は、ターゲット配列に相補的な領域の３’側に、オリゴヌクレオチド同定領域を含むように設定され、そして使用する分子プローブは、この同定領域にアニーリングするように設計される。
【0070】
エキソヌクレアーゼ消化工程が二本鎖特異的５’－３’エキソヌクレアーゼを利用する、本発明の態様において、存在するいずれの他の核酸分子も消化する一方、Ａ０および部分的に消化された鎖Ａ１を含むいずれの物質も損なわれない（ｉｎｔａｃｔ）ままに残す目的のため、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを、任意選択で反応混合物に添加してもよい。適切には、エキソヌクレオリシスに対するこの耐性は、本出願の別の箇所に記載するように達成される。
【0071】
本発明の１つの好ましい態様において、Ａ０の５’端またはプライミング領域の５’側の内部部位は、エキソヌクレオリシスに耐性を与えられる。この手段によって、そして加ピロリン酸分解工程の後でまたはそれと同時に、存在するいずれの他の核酸分子も消化する一方、Ａ０および部分的に消化された鎖Ａ１を含むいずれの物質も損なわれないままに残す目的のため、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを、任意選択で、反応媒体に添加してもよい。適切には、エキソヌクレオリシスに対するこの耐性は、必要なポイントで、オリゴヌクレオチドＡ０内に１つまたはそれより多いブロッキング基を導入することによって達成される。１つの態様において、これらのブロッキング基は、ホスホロチオエート連結および当該技術分野に一般的に用いられる他の主鎖修飾、Ｃ３スペーサー、リン酸基、修飾塩基等より選択されてもよい。
【0072】
いくつかの態様において、同定領域は、ユニークな配列を有し、そして増幅された構成要素Ａ２に適用される配列特異的分子プローブを用いて、間接的に同定されるか、またはこれらの構成要素の配列決定によって直接同定されるように適応されている、バーコード領域を含むかまたはこうしたバーコード領域内に包埋されているであろう。使用してもよい分子プローブの例には、限定されるわけではないが、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブ等が含まれる。
【0073】
すべての態様において、複数の、典型的には数百万のコピーが作製されるように、Ａ２鎖またはその望ましい領域が増幅を経るようにされる。これは、Ａ２および続いてそれに由来する任意のアンプリコンの領域を、例えば順方向／逆方向またはセンス／アンチセンス対の形で提供され、これらの上の相補領域にアニーリング可能である、一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングすることによって、達成される。プライミングされた鎖は次いで、増幅のための起点になる。増幅法には、限定されるわけではないが、熱サイクリングおよび等温法、例えばポリメラーゼ連鎖反応、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅およびローリングサークル増幅が含まれ；これらのうち最後のものは、Ａ２が環状化されている場合に適用可能である。これらの手段のいずれによっても、Ａ２の領域の多くのアンプリコンコピーおよびいくつかの場合、その配列相補体が迅速に生成されうる。これらの増幅法のいずれかを実行するための正確な方法論は、一般の当業者に周知であり、そして使用する正確な条件および温度管理体制は、一般文献で容易に入手可能であり、そちらを参照されたい。特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の場合、方法論は、一般的に、ポリメラーゼおよび多様な単一ヌクレオシド三リン酸の供給源を用いて、相補鎖が産生されるまで、５’－３’方向にＡ２鎖に対してプライマーオリゴヌクレオチドを伸長し；産生された二本鎖産物を脱ハイブリダイズし、Ａ２鎖および相補鎖を再生し；Ａ２鎖およびそのアンプリコンのいずれも再プライミングして、そしてその後、これらの伸長／脱ハイブリダイズ／再プライミング工程を複数回反復して、信頼可能に検出されうるレベルまで、Ａ２アンプリコンの濃度を増大させる工程を含む。
【0074】
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、連結プローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含み、そして部分的に消化された鎖Ａ１が、３’端でＣの５’端に連結される一方、別の態様において、Ａ１は、その３’および５’端の連結を通じて環状化され；
各場合でオリゴヌクレオチドＡ２を形成する。
各場合でオリゴヌクレオチドＡ２を形成する。
【0075】
１つの態様において、Ａ１の連結は：
工程（ａ）中；または
工程（ｂ）中；または
工程（ａ）および（ｂ）の間
に起こる。
工程（ａ）中；または
工程（ｂ）中；または
工程（ａ）および（ｂ）の間
に起こる。
【0076】
１つの態様において、Ａ１は、連結前に、任意選択で５’－３’方向に伸長される。
いくつかの態様において、この任意選択の伸長および連結は、ターゲットオリゴヌクレオチドに対して行われる一方、別の態様において、これらは、伸長および／または連結前に、Ａ１がアニーリングするさらなるスプリントオリゴヌクレオチドＤの添加を通じて行われる。１つの態様において、Ｄは、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含む。別の態様において、Ｄは、３’端修飾のため、またはＤの３’端およびＡ１の対応する領域の間のヌクレオチドミスマッチを通じて、Ａ１に対して伸長不能である。
いくつかの態様において、この任意選択の伸長および連結は、ターゲットオリゴヌクレオチドに対して行われる一方、別の態様において、これらは、伸長および／または連結前に、Ａ１がアニーリングするさらなるスプリントオリゴヌクレオチドＤの添加を通じて行われる。１つの態様において、Ｄは、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含む。別の態様において、Ｄは、３’端修飾のため、またはＤの３’端およびＡ１の対応する領域の間のヌクレオチドミスマッチを通じて、Ａ１に対して伸長不能である。
【0077】
いくつかの態様において、連結プローブＣは、スプリントオリゴヌクレオチドＤの５’端領域の少なくとも一部に、またはターゲットオリゴヌクレオチドに相補的な５’領域を有する。こうした手段によって、第二の中間産物が形成され、ここで、Ａ２鎖は、Ａ１、Ｃおよび任意選択で、Ｃの５’端と出会うように５’－３’方向でＡ１の伸長によって形成される中間領域で構成される。こうした態様において、工程（ｃ）で使用されるプライマー（以下を参照されたい）は、少なくとも、Ａ１のＣへの連結が起こる部位を含むＡ２の領域を増幅するように選択される。この態様において、本発明者らは、３’－５’エキソヌクレアーゼを用いて、増幅前に、いずれの連結されていないＡ１も消化可能であるように、Ｃ上に３’ブロッキング基を含めることが好適であることを見出している。連結前のＡ１の伸長に使用可能な適切なポリメラーゼには、限定されるわけではないが、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ、ＭａｋｏおよびＳｔｏｆｆｅｌ断片が含まれる。
【0078】
いくつかの態様において、第一の反応混合物は、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含み、加ピロリン酸分解反応によって産生されたヌクレオシド三リン酸を加水分解することによって除去し、それにより、加ピロリン酸分解反応を続けることが可能であり、そして順方向重合反応によって打ち負かされないことを確実にする。
【0079】
いくつかの態様において、工程（ｂ）の前または工程（ｂ）中、先の工程の産物をピロホスファターゼで処理して、ピロリン酸イオンを加水分解し、さらなる加ピロリン酸反応が起こることを防止し、そして順方向重合反応を支持する。
【0080】
いくつかの態様において、工程（ｂ）の前または工程（ｂ）中、先の工程の産物をエキソヌクレアーゼで処理する。
いくつかの態様において、Ａ０の加ピロリン酸分解を行って、部分的に消化された鎖Ａ１を形成する酵素はまた、Ａ２を増幅する。当業者は、多くのこうした酵素が存在することを認識するであろう。
いくつかの態様において、Ａ０の加ピロリン酸分解を行って、部分的に消化された鎖Ａ１を形成する酵素はまた、Ａ２を増幅する。当業者は、多くのこうした酵素が存在することを認識するであろう。
【0081】
アンプリコンを検出し、そして得られる情報を用いて、元来の分析物にポリヌクレオチドターゲット配列が存在するかまたは存在しないか、および／またはそれに関連する特性を推測する。例えば、この手段によって、癌性腫瘍細胞に特徴的であるターゲット配列を、探している特定のＳＮＰを参照して検出してもよい。別の態様において、ウイルスまたは細菌のゲノム（その新規突然変異を含む）に特徴的であるターゲット配列を検出してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド結合色素、配列特異的分子プローブ、例えば蛍光標識分子ビーコンまたはヘアピンプローブを含めて、アンプリコンまたは同定領域を検出する多くの方法を使用してもよい。あるいは、当該技術分野に使用されるかまたは報告される直接配列決定法の１つを用いて、Ａ２アンプリコンの直接配列決定を行ってもよい。オリゴヌクレオチド結合色素、蛍光標識ビーコンまたはプローブを使用する場合、刺激性電磁放射の供給源（レーザー、ＬＥＤ、ランプ等）、および放出された蛍光を検出し、そしてそこから、特に設計されたアルゴリズムを用いて、マイクロプロセッサまたはコンピュータによって分析可能であるデータストリームを含むシグナルを生成するように配置された光検出装置を含む配置を用いて、アンプリコンを検出することが好適である。
【0082】
いくつかの態様において、検出は、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて達成される。こうした態様において、Ａ２のアンプリコン生成から生じる、経時的なシグナルの増加を用いて、分析物中のターゲット配列の濃度を推測する。１つの態様において、方法の最終工程は：
ｉ．１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、工程（ｂ）の産物を標識し；
ｉｉ．産物の蛍光シグナルを測定し；
ｉｉｉ．一組の変性条件に産物を曝露し；そして
変性条件への曝露中、産物の蛍光シグナルの変化を監視することによって、分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列を同定する
工程をさらに含む。
ｉ．１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、工程（ｂ）の産物を標識し；
ｉｉ．産物の蛍光シグナルを測定し；
ｉｉｉ．一組の変性条件に産物を曝露し；そして
変性条件への曝露中、産物の蛍光シグナルの変化を監視することによって、分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列を同定する
工程をさらに含む。
【0083】
いくつかの態様において、複数のプローブＡ０であって、各々、異なるターゲット配列に対して選択的であり、そして各々、同定領域を含み、そしてＡ２のアンプリコンにこの同定領域が含まれることでさらに特徴づけられ、そしてしたがって分析物中に存在するターゲット配列が、同定領域（単数または複数）の検出を通じて推測される、前記プローブＡ０を使用する。こうした態様において、同定領域（単数または複数）の検出は、分子プローブを用いて、または配列決定を通じて行われる。
【0084】
いくつかの態様において、１つまたはそれより多い核酸分析物は、複数の反応体積に分けられ、各体積は、異なるターゲット配列を検出するために導入される、１つまたはそれより多いプローブオリゴヌクレオチドＡ０を有する。
【0085】
異なるプローブＡ０を用いるいくつかの態様において、異なるプローブＡ０は、１つまたはそれより多い共通のプライミング部位を含み、単一のプライマーまたは単一のプライマーセットを増幅に用いることを可能にする。
【0086】
本発明の別の側面において、本発明の任意の先の態様の工程によって特徴づけられる所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を同定する方法であって、Ａ２またはＡ２の領域の多数コピーが、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて標識されている、前記方法を提供する。これらの多数コピーの蛍光シグナルを測定し、そして多数コピーを一組の変性条件に曝露する。ターゲットポリヌクレオチド配列は、変性条件への曝露中、多数コピーの蛍光シグナルの変化を監視することによって同定される。
【0087】
いくつかの態様において、温度を変化させる、例えば二本鎖が解離し始める点まで温度を増加させることによって、変性条件を提供してもよい。さらにまたはあるいは、また、条件が酸性であるかまたはアルカリ性であるようにｐＨを変化させることによって、あるいは添加剤または剤、例えば強酸または強塩基、濃縮無機塩または有機溶媒、例えばアルコールを添加することによって、変性条件を提供してもよい。
【0088】
本発明の別の側面において、哺乳動物被験体、特にヒト患者を、感染性疾患、癌の存在に関して、あるいはコンパニオン診断情報を生成する目的のために、スクリーニングするための、上記の方法の使用を提供する。
【0089】
本発明のさらなる側面において、上述のような方法で使用するための対照プローブを提供する。本発明の態様には、単数または複数の特異的ターゲット配列の存在が、蛍光シグナルの生成によって解明されるものが含まれる。こうした態様において、試料中に存在する非ターゲットＤＮＡから生成される、あるレベルのシグナルが必然的に存在しうる。所定の試料に関して、このバックグラウンドシグナルは、「真」のシグナルよりも後に開始するが、この開始は、試料間で多様でありうる。低濃度の単数または複数のターゲット配列の存在の正確な検出は、したがって、その非存在下で、どのシグナルが予期されるかの知識に頼る。企図される試料に関しては参照が入手可能であるが、患者由来の真の「ブラインド」試料に関しては当てはまらない。対照プローブ（Ｅ０）を利用して、各アッセイプローブに関する予期されるバックグラウンドシグナルプロファイルを決定する。対照プローブは、試料中に存在しないと予期される配列をターゲットとし、そして次いで、このプローブから生成されるシグナルを用いて、ターゲット配列の非存在下での試料からのシグナル生成の予期される速度を推測してもよい。
【0090】
したがって：
ａ．ターゲット配列に少なくとも部分的にミスマッチしている３’端領域を有する第二の一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＥ０を用いて、試料の別個のアリコットを用いるかまたは同じアリコット中でそして第二の検出チャネルを用いるかのいずれかで、方法の工程を、続いてまたは同時にのいずれかで反復し；
ｂ．試料中のいずれのターゲット分析物も非存在下で、Ａ０から生成されると予期されるバックグラウンドシグナルを推測し；そして
ｃ．（ａ）で推測される、予期されるバックグラウンドシグナルとターゲット分析物の存在下で観察される実際のシグナルの比較を通じて、分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在を推測する
工程によって特徴づけられる先に記載する方法いずれかにしたがって、所定の核酸分析物中のターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法を提供する。
ａ．ターゲット配列に少なくとも部分的にミスマッチしている３’端領域を有する第二の一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＥ０を用いて、試料の別個のアリコットを用いるかまたは同じアリコット中でそして第二の検出チャネルを用いるかのいずれかで、方法の工程を、続いてまたは同時にのいずれかで反復し；
ｂ．試料中のいずれのターゲット分析物も非存在下で、Ａ０から生成されると予期されるバックグラウンドシグナルを推測し；そして
ｃ．（ａ）で推測される、予期されるバックグラウンドシグナルとターゲット分析物の存在下で観察される実際のシグナルの比較を通じて、分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在を推測する
工程によって特徴づけられる先に記載する方法いずれかにしたがって、所定の核酸分析物中のターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法を提供する。
【0091】
いくつかの態様において、対照プローブ（Ｅ０）およびＡ０を試料の別個の部分に添加する一方、別の態様において、Ｅ０およびＡ０を試料の同じ部分に添加し、そして異なる検出チャネル（例えば異なる有色色素）を用いて、それぞれのシグナルを測定する。次いで、Ｅ０によって生成されたシグナルを利用して、試料中のポリヌクレオチドターゲット配列の非存在下で、Ａ０によって生成されると予期されるバックグラウンドシグナルを推測し、そしてこれに関して修正してもよい。例えば、バックグラウンドシグナルの修正は、Ａ０から観察されるものから、Ｅ０から観察されるシグナルを減算することを伴うか、または多様な条件下で、Ａ０およびＥ０によって生成される相対シグナルの較正曲線を用いた、Ａ０から観察されるシグナルの較正を通じてもよい。
【0092】
いくつかの態様において、単一のＥ０を用いて、産生されうるアッセイプローブすべてを較正してもよい。
いくつかの態様において、別個のＥ０を用いて、最初の増幅工程で生成された試料ＤＮＡの各アンプリコンを較正してもよい。各アンプリコンは、関心対象の複数の突然変異／ターゲット配列を含有してもよいが、単一アンプリコンに対してアッセイプローブのすべてを較正するために、単一のＥ０で十分であろう。
いくつかの態様において、別個のＥ０を用いて、最初の増幅工程で生成された試料ＤＮＡの各アンプリコンを較正してもよい。各アンプリコンは、関心対象の複数の突然変異／ターゲット配列を含有してもよいが、単一アンプリコンに対してアッセイプローブのすべてを較正するために、単一のＥ０で十分であろう。
【0093】
さらなる態様において、各ターゲット配列に関して、別個のＥ０を用いてもよい。例えば、Ｃ＞Ｔ突然変異をターゲティングする場合、患者に生じていることが知られていない同じ部位のＣ＞Ｇ突然変異をターゲティングするＥ０を設計してもよい。多様な条件下で、Ｅ０によって生成されるシグナルプロファイルを較正反応において評価して、そしてこれらのデータを用いて、変異体が存在しない場合のＣ＞Ｔ変異体をターゲティングするアッセイプローブから予期されるシグナルを推測してもよい。
【0094】
本発明の方法のいくつかの態様は、図１７～２０に見られうる。
図１７において、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０は、ターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ０の３’端がターゲットポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成する。本発明のこの単純化された態様において、ターゲットにアニーリングしなかったＡ０が、方法のさらなる工程に、どのように関与しないかを例示するため、存在するＡ０の２つの分子および１つのターゲットポリヌクレオチド配列がある。この例示的例において、Ａ０の３’端はターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングする一方、Ａ０の５’端はアニーリングしない。Ａ０の５’端は５’化学ブロッキング基、共通プライミング配列およびバーコード領域を含む。
図１７において、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０は、ターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ０の３’端がターゲットポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成する。本発明のこの単純化された態様において、ターゲットにアニーリングしなかったＡ０が、方法のさらなる工程に、どのように関与しないかを例示するため、存在するＡ０の２つの分子および１つのターゲットポリヌクレオチド配列がある。この例示的例において、Ａ０の３’端はターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングする一方、Ａ０の５’端はアニーリングしない。Ａ０の５’端は５’化学ブロッキング基、共通プライミング配列およびバーコード領域を含む。
【0095】
部分的に二本鎖である第一の中間産物は、加ピロリン酸分解酵素の存在下で、Ａ０の３’端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解を経て、部分的に消化された鎖Ａ１、分析物およびターゲットにアニーリングしなかった未消化Ａ０分子を生成する。
【0096】
図１８において、Ａ１を一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングさせて、そしてＡ１鎖をＢに対して５’－３’方向に伸長してオリゴヌクレオチドＡ２を生成する。この例示的例において、トリガーオリゴヌクレオチドＢは５’化学ブロックを有する。未消化Ａ０のいずれかがトリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングするが、Ｂに対して５’－３’方向に伸長して、方法のより後の部分に関するターゲットである配列を生成することは不可能である。この例では、Ａ２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングして、そして多数コピーのＡ２またはＡ２の領域を生成する。
【0097】
図１９において、Ａ１をスプリントオリゴヌクレオチドＤにアニーリングさせて、そして次いで、その３’および５’端の連結によって環状化する。ここで環状化されているＡ２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングして、そして多数コピーのＡ２またはＡ２の領域を生成する。この例示的例において、スプリントオリゴヌクレオチドＤは、３’修飾（この例においては化学物質）のため、またはＤの３’端およびＡ２の対応する領域の間のヌクレオチドミスマッチを通じて、Ａ１に対して伸長することは不可能である。
【0098】
図２０において、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’領域は、Ａ１の３’領域にアニーリングする一方、スプリントオリゴヌクレオチドＤの５’領域は連結プローブＣの５’領域にアニーリングする。したがって、Ａ１、Ｃ、および任意選択でＣの５’端と出会うように５’－３’方向でＡ１の伸長によって形成される中間領域で構成される、第二の中間産物Ａ２が形成される。この例示的例において、３’－５’エキソヌクレアーゼを用いて、いずれの連結されていないＡ１も消化可能であるように、連結プローブＣは、３’化学ブロッキング基を有する。
【0099】
Ａ２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングして、そして多数コピーのＡ２またはＡ２の領域を生成する。
ブロッキングオリゴヌクレオチドの導入によって、本発明の方法の特異性を改善してもよい。例えば、野生型ＤＮＡの少なくとも一部にハイブリダイズするようにブロッキングオリゴヌクレオチドを導入して、ターゲットポリヌクレオチド配列に対してのみ、Ａ０のアニーリングを促進し、そして野生型へのアニーリングは促進しないようにしてもよい。あるいはまたはさらに、ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の特異性を改善して、存在するいずれの野生型配列の増幅も防止してもよい。用いられる一般的な技術は、ＰＣＲプライマー間でアニーリングし、そしてＰＣＲポリメラーゼによって置換されるかまたは消化されることが不可能である、オリゴヌクレオチドを設計することである。オリゴヌクレオチドは、非ターゲット（通常、健康な）配列にアニーリングするように設計される一方、ターゲット（突然変異体）配列にはミスマッチ（しばしば一塩基で）である。このミスマッチは、２つの配列に対して異なる融解温度を生じ、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ伸長温度では、非ターゲット配列にアニーリングしたままである一方、ターゲット配列からは解離するように設計される。
ブロッキングオリゴヌクレオチドの導入によって、本発明の方法の特異性を改善してもよい。例えば、野生型ＤＮＡの少なくとも一部にハイブリダイズするようにブロッキングオリゴヌクレオチドを導入して、ターゲットポリヌクレオチド配列に対してのみ、Ａ０のアニーリングを促進し、そして野生型へのアニーリングは促進しないようにしてもよい。あるいはまたはさらに、ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の特異性を改善して、存在するいずれの野生型配列の増幅も防止してもよい。用いられる一般的な技術は、ＰＣＲプライマー間でアニーリングし、そしてＰＣＲポリメラーゼによって置換されるかまたは消化されることが不可能である、オリゴヌクレオチドを設計することである。オリゴヌクレオチドは、非ターゲット（通常、健康な）配列にアニーリングするように設計される一方、ターゲット（突然変異体）配列にはミスマッチ（しばしば一塩基で）である。このミスマッチは、２つの配列に対して異なる融解温度を生じ、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ伸長温度では、非ターゲット配列にアニーリングしたままである一方、ターゲット配列からは解離するように設計される。
【0100】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、しばしば、ＰＣＲポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による消化を防止するか、またはターゲットおよび非ターゲット配列の間の融解温度差異を増進させるような修飾を有してもよい。
【0101】
ロックト核酸（ＬＮＡ）または他の融解温度改変修飾のブロッキングオリゴヌクレオチド内への取り込みは、ターゲットおよび非ターゲット配列に対するオリゴヌクレオチドの融解温度の差異を有意に増加させうる。
【0102】
したがって、ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いる本発明の態様を提供する。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、消化されずまた置換されないことを確実にするために、加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）反応に耐性でなければならない。これは、いくつかの異なる方法で、例えば３’端のミスマッチを通じるか、あるいはホスホロチオエート結合またはスペーサーなどの修飾を通じるかのいずれかで、達成可能である。
【0103】
ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いる、本発明のこうした態様または側面において、所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法は、分析物ターゲット配列を一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０にアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ０の３’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する第一の中間産物を生成するのと同じ工程の前にまたはこうした工程中に、非ターゲットポリヌクレオチド配列の少なくともサブセットに、一本鎖ブロッキングオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって特徴づけられる。
【0104】
いくつかの態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’端でのミスマッチを通じて加ピロリン酸分解反応に耐性であるように作製される。別の態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’ブロッキング基の存在を通じて耐性であるように作製される。別の態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、スペーサーまたは他の内部修飾の存在を通じて耐性であるように作製される。さらなる態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドには、融解温度を増加させる修飾または修飾ヌクレオチド塩基の両方が含まれ、そして加ピロリン酸分解に耐性を与えられる。
【0105】
本明細書において「ホスファターゼ酵素」への言及は、本発明の方法によって産生されるヌクレオシド三リン酸を加水分解によって除去する能力を持つ任意の酵素またはその機能性断片を指す。これには、リン酸モノエステルをリン酸イオンおよびアルコールに切断する能力を持つ任意の酵素またはその機能性断片が含まれる。
【0106】
本明細書において、「ピロホスファターゼ酵素」への言及は、ピロリン酸の１つのイオンの２つのリン酸イオンへの変換を触媒する能力を持つ任意の酵素またはその機能性断片を指す。
【0107】
これにはまた、無機ピロホスファターゼおよび無機ジホスファターゼも含まれる。限定されない例は、熱安定性無機ピロホスフェート（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＴＩＰＰ）である。
【0108】
いくつかの態様において、ピロホスファターゼの使用が任意選択である、任意の先に記載する態様の修飾型を提供する。
本発明のいくつかの態様において、試料中に存在する所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法で使用するためのキットであって：
（ａ）ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
（ｂ）リガーゼ；
（ｃ）第一の中間産物をＡ０の端から３’－５’方向に消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能な、加ピロリン酸分解酵素；
（ｄ）Ａ０の一部に実質的に相補的である、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；
（ｅ）増幅酵素；および
（ｆ）適切な緩衝剤
を含む、前記キットを提供する。
本発明のいくつかの態様において、試料中に存在する所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法で使用するためのキットであって：
（ａ）ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
（ｂ）リガーゼ；
（ｃ）第一の中間産物をＡ０の端から３’－５’方向に消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能な、加ピロリン酸分解酵素；
（ｄ）Ａ０の一部に実質的に相補的である、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；
（ｅ）増幅酵素；および
（ｆ）適切な緩衝剤
を含む、前記キットを提供する。
【0109】
１つの態様において、Ａ０の３’端は、ターゲットポリヌクレオチド配列に完全に相補的である。
１つの態様において、リガーゼは、一本鎖連結活性を実質的に欠く。
１つの態様において、リガーゼは、一本鎖連結活性を実質的に欠く。
【0110】
いくつかの態様において、キットは、ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
（ａ）リガーゼ；
（ｂ）Ａ０の端から３’－５’方向で第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能である、加ピロリン酸分解酵素；
（ｃ）適切な緩衝剤
を含む。
（ａ）リガーゼ；
（ｂ）Ａ０の端から３’－５’方向で第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能である、加ピロリン酸分解酵素；
（ｃ）適切な緩衝剤
を含む。
【0111】
いくつかの態様において、キットは別に：
－Ａ１上の隣接配列に相補的である２つまたはそれより多い連結連鎖反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが一方のＬＣＲプローブの５’リン酸へのアニーリングに成功すると、もう一方のＬＣＲプローブの３’ＯＨにすぐ隣接する、前記プローブオリゴヌクレオチド；および
－１つまたはそれより多いリガーゼ
をさらに含む。
－Ａ１上の隣接配列に相補的である２つまたはそれより多い連結連鎖反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが一方のＬＣＲプローブの５’リン酸へのアニーリングに成功すると、もう一方のＬＣＲプローブの３’ＯＨにすぐ隣接する、前記プローブオリゴヌクレオチド；および
－１つまたはそれより多いリガーゼ
をさらに含む。
【0112】
いくつかの態様において、Ａ２の存在下で、２つのＬＣＲプローブはＡ２へのアニーリングに成功し、そして共に連結されて１つのオリゴヌクレオチド分子を形成し、これが続いて第二ラウンドの共有連結の新規ターゲットとして働き、関心対象のターゲット、この場合はＡ２の幾何的増幅を導く。連結された産物またはアンプリコンは、Ａ２に相補的であり、そして増幅の次のサイクルにおいてターゲットとして機能する。したがって、特異的ターゲットＤＮＡ配列の指数関数的増幅は、過剰なＬＣＲプローブの存在下での変性、ハイブリダイゼーション、および連結の反復サイクルを通じて達成される。このことから、Ａ２の存在、そしてしたがってターゲットポリヌクレオチド配列の存在が推測される。
【0113】
いくつかの態様において、Ａ２の存在下で、２つのＰＣＲプローブはＡ２へのアニーリングに成功し、そして共に連結されて１つのオリゴヌクレオチド分子を形成し、これが次いで第二ラウンドの共有連結の新規ターゲットとして働き、関心対象のターゲット、この場合はＡ２の幾何的増幅を導き、これが次いで検出される。
【0114】
いくつかの態様において、キットは別に：
－連結プローブオリゴヌクレオチドＣ；
－スプリントオリゴヌクレオチドＤ
をさらに含んでもよく；
ここで、Ｃは５’リン酸を有し、Ａ１およびＣが共に連結されてＡ２を形成可能であるように、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’端はＣの５’に相補的であり、そしてＤの５’端はＡ１の３’端に相補的である。
－連結プローブオリゴヌクレオチドＣ；
－スプリントオリゴヌクレオチドＤ
をさらに含んでもよく；
ここで、Ｃは５’リン酸を有し、Ａ１およびＣが共に連結されてＡ２を形成可能であるように、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’端はＣの５’に相補的であり、そしてＤの５’端はＡ１の３’端に相補的である。
【0115】
いくつかの態様において、キットは：
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１がＡ２に相補的であり、そしてＡ２にアニーリングした際、ＨＯ１のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ１；および
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２が開いたＨＯ１に相補的であり、そしてＨＯ１にアニーリングした際、ＨＯ２のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ２
をさらに含んでもよい。
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１がＡ２に相補的であり、そしてＡ２にアニーリングした際、ＨＯ１のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ１；および
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２が開いたＨＯ１に相補的であり、そしてＨＯ１にアニーリングした際、ＨＯ２のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ２
をさらに含んでもよい。
【0116】
いくつかの態様において、キットは、複数のＨＯ１およびＨＯ２をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、別に、基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＡ；
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＢ；ならびに
－フルオロフォア－消光剤対を含む基質
をさらに含んでもよく；
ここで、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームは、Ａ２の存在下で、オリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒性の多構成要素核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成するように、Ａ２の隣接領域に相補的である。
いくつかの態様において、キットは、別に、基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＡ；
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＢ；ならびに
－フルオロフォア－消光剤対を含む基質
をさらに含んでもよく；
ここで、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームは、Ａ２の存在下で、オリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒性の多構成要素核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成するように、Ａ２の隣接領域に相補的である。
【0117】
いくつかの態様において、キットは別に、部分的に二本鎖である核酸構築物をさらに含んでもよく、ここで：
－一方の鎖は少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の領域に相補的であり、そしてこの鎖は「基質」鎖と称されてもよく；
－他方の鎖は、少なくとも１つの消光剤を含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の存在下で、部分的に二本鎖形成した核酸構築物が、実質的により二本鎖を形成するように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の領域に相補的である。
－一方の鎖は少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の領域に相補的であり、そしてこの鎖は「基質」鎖と称されてもよく；
－他方の鎖は、少なくとも１つの消光剤を含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の存在下で、部分的に二本鎖形成した核酸構築物が、実質的により二本鎖を形成するように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の領域に相補的である。
【0118】
言い換えると、部分的に二本鎖である核酸構築物は、Ａ２の存在下で、よりサイズが大きい二本鎖部分を有する。
いくつかの態様において、キットは、少なくとも１つのＲＮＡ塩基を除去するための酵素をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、少なくとも１つのＲＮＡ塩基を除去するための酵素をさらに含んでもよい。
【0119】
いくつかの態様において、酵素は、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり、そしてＲＮＡ塩基はウラシルである。
いくつかの態様において、キットは、別に：
－連結部位を含むＡ２の領域に相補的なオリゴヌクレオチドであって、その蛍光が互いに対するあるいは１つまたはそれより多い蛍光消光剤に対する近接のいずれかによって消光されるように配置された１つまたは複数のフルオロフォアを含む、前記オリゴヌクレオチド；
－二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素
をさらに含んでもよく；
ここで、Ａ２の存在下で、フルオロフォアが互いからまたは対応する消光剤から分離され、そして蛍光シグナル、そしてしたがってＡ２の存在が検出可能であるように、標識オリゴヌクレオチドが消化される。
いくつかの態様において、キットは、別に：
－連結部位を含むＡ２の領域に相補的なオリゴヌクレオチドであって、その蛍光が互いに対するあるいは１つまたはそれより多い蛍光消光剤に対する近接のいずれかによって消光されるように配置された１つまたは複数のフルオロフォアを含む、前記オリゴヌクレオチド；
－二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素
をさらに含んでもよく；
ここで、Ａ２の存在下で、フルオロフォアが互いからまたは対応する消光剤から分離され、そして蛍光シグナル、そしてしたがってＡ２の存在が検出可能であるように、標識オリゴヌクレオチドが消化される。
【0120】
いくつかの態様において、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素はエキソヌクレアーゼである。
いくつかの態様において、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は、プルーフリーディング活性を持つポリメラーゼである。
いくつかの態様において、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は、プルーフリーディング活性を持つポリメラーゼである。
【0121】
いくつかの態様において、キットのフルオロフォアは、フルオレセインファミリー、カルボキシローダミンファミリー、シアニンファミリー、ローダミンファミリーの色素、ポリハロフルオレセインファミリー色素、ヘキサクロロフルオレセインファミリー色素、クマリンファミリー色素、オキサジンファミリー色素、チアジンファミリー色素、スクアラインファミリー色素、およびキレートランタニドファミリー色素より選択されてもよい。
【0122】
いくつかの態様において、キットのフルオロフォアは、任意の商業的に入手可能な色素から選択されてもよい。
いくつかの態様において、キットの消光剤は、商標名Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭ、ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ． Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、およびＩｏｗａ ＢｌａｃｋＴＭの下で入手可能なものより選択されてもよい。
いくつかの態様において、キットの消光剤は、商標名Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭ、ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ． Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、およびＩｏｗａ ＢｌａｃｋＴＭの下で入手可能なものより選択されてもよい。
【0123】
いくつかの態様において、キットの消光剤は、任意の商業的に入手可能な消光剤より選択されてもよい。
いくつかの態様において、キットは、１つまたはそれより多い部分的に二本鎖であるＤＮＡ構築物をさらに含んでもよく、各構築物は、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤を含有する。いくつかの態様において、構築物が部分的に二本鎖である場合、１つまたはそれより多いフルオロフォアの十分な消光が起こるように、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤は十分に近接して位置する。
いくつかの態様において、キットは、１つまたはそれより多い部分的に二本鎖であるＤＮＡ構築物をさらに含んでもよく、各構築物は、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤を含有する。いくつかの態様において、構築物が部分的に二本鎖である場合、１つまたはそれより多いフルオロフォアの十分な消光が起こるように、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤は十分に近接して位置する。
【0124】
いくつかの態様において、構築物は、それ自体に折り重なる（ｌｏｏｐｅｄ ｂａｃｋ ｏｎ ｉｔｓｅｌｆ）自己相補領域を持つＤＮＡ一本鎖である。
いくつかの態様において、構築物はプライマー対の一方のプライマーを含む。
いくつかの態様において、構築物はプライマー対の一方のプライマーを含む。
【0125】
いくつかの態様において、キットは、プライマー対のもう一方のプライマーをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、構築物の一本鎖セクションの一部がＡ２にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長される。いくつかの態様において、プライマー対のもう一方のプライマーが、次いで、伸長された構築物にハイブリダイズする。このプライマーは次いで、構築物に対して伸長されて、自己相補領域を置換する。したがって、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い色素は、蛍光シグナルが検出されるために十分に分離され、Ａ２の存在を示す。
いくつかの態様において、構築物の一本鎖セクションの一部がＡ２にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長される。いくつかの態様において、プライマー対のもう一方のプライマーが、次いで、伸長された構築物にハイブリダイズする。このプライマーは次いで、構築物に対して伸長されて、自己相補領域を置換する。したがって、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い色素は、蛍光シグナルが検出されるために十分に分離され、Ａ２の存在を示す。
【0126】
こうした態様において、構築物はＳｕｎｒｉｓｅプライマーとして知られてもよい。
いくつかの態様において、構築物は２つの別個のＤＮＡ鎖を含む。
いくつかの態様において、構築物の一本鎖セクションの一部がＡ２にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長される。いくつかの態様において、プライマー対のもう一方のプライマーが、次いで、伸長された構築物にハイブリダイズする。このプライマーは次いで、構築物に対して、二本鎖セクションの方向に伸長され、ＤＮＡ鎖の短い方を置換し、そしてしたがって１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い色素は、蛍光シグナルが検出されるために十分に分離され、Ａ２の存在を示す。
いくつかの態様において、構築物は２つの別個のＤＮＡ鎖を含む。
いくつかの態様において、構築物の一本鎖セクションの一部がＡ２にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長される。いくつかの態様において、プライマー対のもう一方のプライマーが、次いで、伸長された構築物にハイブリダイズする。このプライマーは次いで、構築物に対して、二本鎖セクションの方向に伸長され、ＤＮＡ鎖の短い方を置換し、そしてしたがって１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い色素は、蛍光シグナルが検出されるために十分に分離され、Ａ２の存在を示す。
【0127】
こうした態様において、構築物は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｚｉｐｐｅｒとして知られてもよい。
当業者は、ＳｕｎｒｉｓｅプライマーおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｚｉｐｐｅｒの両方に関して、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤対が、それぞれの構築物各々内の多様な位に位置することが可能であることを認識するであろう。重要な特徴は、各対が互いに十分に近接して位置し、Ａ２の非存在下で、すなわち伸長および鎖置換が起こらない場合、蛍光シグナルが放出されないことである。
当業者は、ＳｕｎｒｉｓｅプライマーおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｚｉｐｐｅｒの両方に関して、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤対が、それぞれの構築物各々内の多様な位に位置することが可能であることを認識するであろう。重要な特徴は、各対が互いに十分に近接して位置し、Ａ２の非存在下で、すなわち伸長および鎖置換が起こらない場合、蛍光シグナルが放出されないことである。
【0128】
１つの態様において、キットはピロリン酸イオンの供給源をさらに含む。
ピロリン酸イオンの適切な供給源（単数または複数）は先に記載する通りである。
いくつかの態様において、キットは、適切な陽性および陰性対照をさらに含む。
ピロリン酸イオンの適切な供給源（単数または複数）は先に記載する通りである。
いくつかの態様において、キットは、適切な陽性および陰性対照をさらに含む。
【0129】
いくつかの態様において、キットは、先に記載する通りである１つまたはそれより多い対照プローブ（Ｅ０）をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、先に記載する通りである１つまたはそれより多いブロッキングオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、先に記載する通りである１つまたはそれより多いブロッキングオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。
【0130】
いくつかの態様において、キットは、１つまたはそれより多い対照プローブ（Ｅ０）および１つまたはそれより多いブロッキングオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、Ａ０の５’端は、５’－３’エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性を与えられてもよく、そしてキットは５’－３’エキソヌクレアーゼをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、Ａ０の５’端は、５’－３’エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性を与えられてもよく、そしてキットは５’－３’エキソヌクレアーゼをさらに含んでもよい。
【0131】
いくつかの態様において、キットは、連結プローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、スプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、スプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含んでもよい。
【0132】
いくつかの態様において、キットはＣおよびＤの両方を含んでもよい。
連結プローブＣは、該プローブを３’－５’エキソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含んでもよい。
連結プローブＣは、該プローブを３’－５’エキソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含んでもよい。
【0133】
Ｄは、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含んでもよい。
いくつかの態様において、Ｄは、３’修飾により、あるいはＤの３’端およびＡ１またはＣの対応する領域の間のミスマッチを通じて、Ａ１に対して伸長を経ることが不可能であってもよい。
いくつかの態様において、Ｄは、３’修飾により、あるいはＤの３’端およびＡ１またはＣの対応する領域の間のミスマッチを通じて、Ａ１に対して伸長を経ることが不可能であってもよい。
【0134】
いくつかの態様において、キットは、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、および試料中に存在するターゲットポリヌクレオチド配列の最初の増幅に適した緩衝液をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、ｄＵＴＰを取り込む高忠実度ポリメラーゼ、ｄＵＴＰおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、ｄＵＴＰを取り込む高忠実度ポリメラーゼ、ｄＵＴＰおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含んでもよい。
【0135】
いくつかの態様において、キットは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、ピロホスファターゼをさらに含んでもよい。ピロホスファターゼはホットスタートであってもよい。
いくつかの態様において、キットは、ピロホスファターゼをさらに含んでもよい。ピロホスファターゼはホットスタートであってもよい。
【0136】
いくつかの態様において、キットはプロテイナーゼをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含んでもよい。
【0137】
いくつかの態様において、キットは、各々異なるターゲット配列に対して選択的であり、そして各々同定領域を含む、複数のＡ０をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットはＲＮＡテンプレートからＤＮＡを形成するための酵素をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットはＲＮＡテンプレートからＤＮＡを形成するための酵素をさらに含んでもよい。
【0138】
いくつかの態様において、酵素は逆転写酵素である。
いくつかの態様において、キットの１つまたはそれより多い酵素はホットスタートであってもよい。
いくつかの態様において、キットの１つまたはそれより多い酵素はホットスタートであってもよい。
【0139】
いくつかの態様において、キットの１つまたはそれより多い酵素は熱安定性であってもよい。
いくつかの態様において、キットは、適切な洗浄および緩衝試薬をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、適切な洗浄および緩衝試薬をさらに含んでもよい。
【0140】
いくつかの態様において、（ｅ）の増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じである。
いくつかの態様において、増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じである。
いくつかの態様において、増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じである。
【0141】
キットは、本明細書に記載するような処理にしたがって、ポリヌクレオチドの一部を単離し、そして／または精製するための精製デバイスおよび試薬をさらに含んでもよい。適切な試薬は当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ゲル濾過カラムおよび洗浄緩衝液が含まれる。
【0142】
いくつかの態様において：
（ａ）ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
（ｂ）リガーゼ；
（ｃ）Ａ０の端から３’－５’方向に第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能である、加ピロリン酸分解酵素；
（ｄ）適切な緩衝剤
を含むキットを提供する。
（ａ）ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
（ｂ）リガーゼ；
（ｃ）Ａ０の端から３’－５’方向に第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能である、加ピロリン酸分解酵素；
（ｄ）適切な緩衝剤
を含むキットを提供する。
【0143】
いくつかの態様において、キットは、ピロリン酸イオンの供給源をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、適切な陽性および陰性対照を含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、適切な陽性および陰性対照を含んでもよい。
【0144】
キットのいくつかの態様において、Ａ０の５’端は５’－３’エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性にされており、そしてキットは５’－３’エキソヌクレアーゼをさらに含んでもよい。
【0145】
いくつかの態様において、キットは、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼおよび試料中に存在するターゲットポリヌクレオチド配列の最初の増幅に適した緩衝剤をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、ｄＵＴＰを取り込む高忠実度ポリメラーゼ、ｄＵＴＰおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、ｄＵＴＰを取り込む高忠実度ポリメラーゼ、ｄＵＴＰおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含んでもよい。
【0146】
いくつかの態様において、キットはプロテイナーゼをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは連結プローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは連結プローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含んでもよい。
【0147】
いくつかの態様において、キットはスプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、連結プローブオリゴヌクレオチドＣおよびスプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、連結プローブオリゴヌクレオチドＣおよびスプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含んでもよい。
【0148】
キットのいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドＣは、該オリゴヌクレオチドを３’－５’エキソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含む。
キットのいくつかの態様において、Ｄは、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含む。
キットのいくつかの態様において、Ｄは、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含む。
【0149】
キットのいくつかの態様において、Ｄは、３’修飾により、またはＤの３’端およびＡ１またはＣの対応する領域の間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対して伸長を経ることが不可能である。
【0150】
いくつかの態様において、キットは、Ａ０の一部に実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド、増幅酵素およびｄＮＴＰをさらに含む。
いくつかの態様において、キットは、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含む。
いくつかの態様において、キットは、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含む。
【0151】
いくつかの態様において、キットは、各々異なるターゲット配列に対して選択的であり、そして各々同定領域を含む、複数のＡ０をさらに含む。
いくつかの態様において、キットは：
－Ａ１上の隣接配列に相補的である２つまたはそれより多い連結連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが一方のＬＣＲプローブの５’リン酸へのアニーリングに成功すると、もう一方のＬＣＲプローブの３’ＯＨにすぐ隣接する、前記プローブオリゴヌクレオチド；および
－１つまたはそれより多いリガーゼ
をさらに含む。
いくつかの態様において、キットは：
－Ａ１上の隣接配列に相補的である２つまたはそれより多い連結連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが一方のＬＣＲプローブの５’リン酸へのアニーリングに成功すると、もう一方のＬＣＲプローブの３’ＯＨにすぐ隣接する、前記プローブオリゴヌクレオチド；および
－１つまたはそれより多いリガーゼ
をさらに含む。
【0152】
いくつかの態様において、キットは、１つまたはそれより多いポリメラーゼをさらに含む。
キットのいくつかの態様において、１つまたはそれより多いポリメラーゼは、加ピロリン酸分解酵素と同じである。
キットのいくつかの態様において、１つまたはそれより多いポリメラーゼは、加ピロリン酸分解酵素と同じである。
【0153】
いくつかの態様において、キットは：
－連結プローブオリゴヌクレオチドＣ；
－スプリントオリゴヌクレオチドＤ
をさらに含み；
ここで、Ｅは５’リン酸を有し、Ａ１およびＥが共に連結されてＡ２を形成可能であるように、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’端はＥの５’に相補的であり、そしてＤの５’端はＡ１の３’端に相補的である。
－連結プローブオリゴヌクレオチドＣ；
－スプリントオリゴヌクレオチドＤ
をさらに含み；
ここで、Ｅは５’リン酸を有し、Ａ１およびＥが共に連結されてＡ２を形成可能であるように、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’端はＥの５’に相補的であり、そしてＤの５’端はＡ１の３’端に相補的である。
【0154】
いくつかの態様において、キットは：
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１がＡ２に相補的であり、そしてＡ２にアニーリングした際、ＨＯ１のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ１；および
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２が開いたＨＯ１に相補的であり、そしてＨＯ１にアニーリングした際、ＨＯ２のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ２
をさらに含む。
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１がＡ２に相補的であり、そしてＡ２にアニーリングした際、ＨＯ１のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ１；および
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２が開いたＨＯ１に相補的であり、そしてＨＯ１にアニーリングした際、ＨＯ２のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ２
をさらに含む。
【0155】
いくつかの態様において、キットは複数のＨＯ１およびＨＯ２をさらに含む。
いくつかの態様において、キットは：
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＡ；
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＢ；ならびに
－フルオロフォア・消光剤対を含む基質
をさらに含み；
ここで、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームは、Ａ２の存在下で、オリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒性の多構成要素核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成するように、Ａ２の隣接領域に相補的である。
いくつかの態様において、キットは：
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＡ；
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＢ；ならびに
－フルオロフォア・消光剤対を含む基質
をさらに含み；
ここで、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームは、Ａ２の存在下で、オリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒性の多構成要素核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成するように、Ａ２の隣接領域に相補的である。
【0156】
いくつかの態様において、キットは部分的に二本鎖である核酸構築物をさらに含み、ここで：
－一方の鎖は少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の領域に相補的であり、そしてこの鎖は「基質」鎖と称されてもよく；そして
－他方の鎖は、少なくとも１つの消光剤を含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の存在下で、部分的に鎖形成した核酸構築物が、実質的により二本鎖を形成するように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の領域に相補的である。
－一方の鎖は少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の領域に相補的であり、そしてこの鎖は「基質」鎖と称されてもよく；そして
－他方の鎖は、少なくとも１つの消光剤を含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の存在下で、部分的に鎖形成した核酸構築物が、実質的により二本鎖を形成するように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の領域に相補的である。
【0157】
いくつかの態様において、キットは、少なくとも１つのＲＮＡ塩基を除去するための酵素をさらに含む。
キットのいくつかの態様において、酵素はウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり、そしてＲＮＡ塩基はウラシルである。
キットのいくつかの態様において、酵素はウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり、そしてＲＮＡ塩基はウラシルである。
【0158】
いくつかの態様において、キットは：
－連結部位を含むＡ２の領域に相補的なオリゴヌクレオチドであって、その蛍光が互いに対するあるいは１つまたはそれより多い蛍光消光剤に対する近接のいずれかによって消光されるように配置された１つまたは複数のフルオロフォアを含む、前記オリゴヌクレオチド；
－二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素
をさらに含み、
ここで、Ａ２の存在下で、フルオロフォアが互いからまたは対応する消光剤から分離され、そして蛍光シグナル、そしてしたがってＡ２の存在が検出可能であるように、標識オリゴヌクレオチドが消化される。
－連結部位を含むＡ２の領域に相補的なオリゴヌクレオチドであって、その蛍光が互いに対するあるいは１つまたはそれより多い蛍光消光剤に対する近接のいずれかによって消光されるように配置された１つまたは複数のフルオロフォアを含む、前記オリゴヌクレオチド；
－二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素
をさらに含み、
ここで、Ａ２の存在下で、フルオロフォアが互いからまたは対応する消光剤から分離され、そして蛍光シグナル、そしてしたがってＡ２の存在が検出可能であるように、標識オリゴヌクレオチドが消化される。
【0159】
キットのいくつかの態様において、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素はエキソヌクレアーゼである。
キットのいくつかの態様において、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は、プルーフリーディング活性を持つポリメラーゼである。
キットのいくつかの態様において、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は、プルーフリーディング活性を持つポリメラーゼである。
【0160】
キットのいくつかの態様において、フルオロフォアは、フルオレセインファミリー、カルボキシローダミンファミリー、シアニンファミリー、ローダミンファミリーの色素、ポリハロフルオレセインファミリー色素、ヘキサクロロフルオレセインファミリー色素、クマリンファミリー色素、オキサジンファミリー色素、チアジンファミリー色素、スクアラインファミリー色素、およびキレートランタニドファミリー色素より選択される。
【0161】
キットのいくつかの態様において、消光剤は、商標名Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭ、ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ． Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、およびＩｏｗａ ＢｌａｃｋＴＭの下で入手可能なものより選択される。
【0162】
いくつかの態様において、キットは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含む。
いくつかの態様において、キットは、ピロホスファターゼをさらに含む。
いくつかの態様において、キットは、ピロホスファターゼをさらに含む。
【0163】
いくつかの態様において、キットは、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを形成するための酵素をさらに含む。
キットのいくつかの態様において、酵素は逆転写酵素である。
キットのいくつかの態様において、酵素は逆転写酵素である。
【0164】
キットのいくつかの態様において、１つまたはそれより多い酵素はホットスタートである。
キットのいくつかの態様において、１つまたはそれより多い酵素は熱安定性である。
キットのいくつかの態様において、１つまたはそれより多い酵素は熱安定性である。
【0165】
いくつかの態様において、キットは、適切な洗浄および緩衝試薬をさらに含んでもよい。
本発明の１つの態様において：
第一の領域、第二の領域および第三の領域の間の流体経路
を少なくとも含むデバイスであって：
第一の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ｄＮＴＰ；
少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；
試料中に存在するＤＮＡの最初の増幅のための増幅酵素
を含み；そして
第二の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
Ａ０の端から３’－５’方向に第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能である、加ピロリン酸分解酵素
を含み；そして
第三の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ｄＮＴＰ；
緩衝剤；
増幅酵素；
Ａ２またはその一部、あるいはＡ２の多数コピーまたはその一部の多数コピー由来のシグナルを検出するための手段
を含み；そして
第二の領域のウェルまたは第三の領域のウェルが、Ａ０の一部に実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む、
前記デバイスを提供する。
本発明の１つの態様において：
第一の領域、第二の領域および第三の領域の間の流体経路
を少なくとも含むデバイスであって：
第一の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ｄＮＴＰ；
少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；
試料中に存在するＤＮＡの最初の増幅のための増幅酵素
を含み；そして
第二の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記プローブオリゴヌクレオチドＡ０；
Ａ０の端から３’－５’方向に第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能である、加ピロリン酸分解酵素
を含み；そして
第三の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、各ウェルが：
ｄＮＴＰ；
緩衝剤；
増幅酵素；
Ａ２またはその一部、あるいはＡ２の多数コピーまたはその一部の多数コピー由来のシグナルを検出するための手段
を含み；そして
第二の領域のウェルまたは第三の領域のウェルが、Ａ０の一部に実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む、
前記デバイスを提供する。
【0166】
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、第三の領域の１つまたはそれより多いウェル内に位置する。
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、デバイスの第三の領域内に位置する。
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、デバイスの第三の領域内に位置する。
【0167】
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、デバイスの隣接領域内に位置する。
いくつかの態様において、第一の領域の各ウェルのｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰであってもよく、そして各ウェルは、ｄＵＴＰを取り込む高忠実度ポリメラーゼおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、第一の領域の各ウェルのｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰであってもよく、そして各ウェルは、ｄＵＴＰを取り込む高忠実度ポリメラーゼおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含んでもよい。
【0168】
いくつかの態様において、第三の領域の各ウェルのｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰであってもよく、そして各ウェルは、ｄＵＴＰを取り込む高忠実度ポリメラーゼおよびウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）をさらに含んでもよい。
【0169】
いくつかの態様において、第二の領域の各ウェルは、ピロリン酸イオンの供給源をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、Ａ０の５’端は、５’－３’エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性を与えられてもよく、そして第二の領域のウェルは、５’－３’エキソヌクレアーゼをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、Ａ０の５’端は、５’－３’エキソヌクレアーゼ消化に対する耐性を与えられてもよく、そして第二の領域のウェルは、５’－３’エキソヌクレアーゼをさらに含んでもよい。
【0170】
いくつかの態様において、第二または第三の領域の各ウェルは、リガーゼおよび連結プローブオリゴヌクレオチドＣまたはスプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含んでもよい。
【0171】
連結プローブＣは、該プローブを３’－５’エキソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含んでもよい。
スプリントオリゴヌクレオチドＤは、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含んでもよい。
スプリントオリゴヌクレオチドＤは、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含んでもよい。
【0172】
Ｄは、３’修飾により、またはＤの３’端およびＡ１またはＣの対応する領域の間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対して伸長を経ることが不可能であってもよい。
いくつかの態様において、ｄＮＴＰはホットスタートであってもよく、そして第二の領域の各ウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、ｄＮＴＰはホットスタートであってもよく、そして第二の領域の各ウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含んでもよい。
【0173】
いくつかの態様において、第二の領域の各ウェルは、ピロホスファターゼをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、ピロホスファターゼはホットスタートであってもよい。
いくつかの態様において、ピロホスファターゼはホットスタートであってもよい。
【0174】
いくつかの態様において、第三の領域の各ウェルは、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、第二の領域の各ウェルは、同定領域を含むターゲット配列に関して選択的である、少なくとも１つまたはそれより多い異なるＡ０を含んでもよい。
いくつかの態様において、第二の領域の各ウェルは、同定領域を含むターゲット配列に関して選択的である、少なくとも１つまたはそれより多い異なるＡ０を含んでもよい。
【0175】
いくつかの態様において、第二の領域における増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じであってもよい。
いくつかの態様において、１つまたはそれより多いウェルを含む第四の領域があってもよく、ここで各ウェルはプロテイナーゼを含んでもよく、そして前記の第四の領域は、第一および第二の領域の間に位置していてもよい。
いくつかの態様において、１つまたはそれより多いウェルを含む第四の領域があってもよく、ここで各ウェルはプロテイナーゼを含んでもよく、そして前記の第四の領域は、第一および第二の領域の間に位置していてもよい。
【0176】
いくつかの態様において、デバイスの第二および第三の領域は、第二の領域のウェルが：
ｄＮＴＰ；
緩衝剤；
増幅酵素；および
Ａ１またはその一部、あるいはＡ１の多数コピーまたはその一部の多数コピー由来のシグナルを検出するための手段
をさらに含むように組み合わされていてもよい。
ｄＮＴＰ；
緩衝剤；
増幅酵素；および
Ａ１またはその一部、あるいはＡ１の多数コピーまたはその一部の多数コピー由来のシグナルを検出するための手段
をさらに含むように組み合わされていてもよい。
【0177】
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、第二の領域の１つまたはそれより多いウェル内に位置する。
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、デバイスの第二の領域内に位置する。
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、デバイスの第二の領域内に位置する。
【0178】
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、デバイスの隣接領域内に位置する。
いくつかの態様において：
第一の領域および第二の領域の間の流体経路を含むデバイスであって、第一の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、１つまたはそれより多いウェルが：
ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記オリゴヌクレオチドＡ０；
Ａ０の端から３’－５’方向で第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能な加ピロリン酸分解酵素；および
Ａ１を連結してオリゴヌクレオチドＡ２を生成可能な１つまたはそれより多いリガーゼ
を含み、
第二の領域が１つまたはそれより多いウェルを含む、
前記デバイスを提供する。
いくつかの態様において：
第一の領域および第二の領域の間の流体経路を含むデバイスであって、第一の領域が１つまたはそれより多いウェルを含み、１つまたはそれより多いウェルが：
ターゲットポリヌクレオチド配列と第一の中間産物を形成可能な一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ０であって、前記中間産物が少なくとも部分的に二本鎖である、前記オリゴヌクレオチドＡ０；
Ａ０の端から３’－５’方向で第一の中間産物を消化して、部分的に消化された鎖Ａ１を生成可能な加ピロリン酸分解酵素；および
Ａ１を連結してオリゴヌクレオチドＡ２を生成可能な１つまたはそれより多いリガーゼ
を含み、
第二の領域が１つまたはそれより多いウェルを含む、
前記デバイスを提供する。
【0179】
いくつかの態様において、第一の領域の１つまたはそれより多いウェルは、加ピロリン酸分解反応を順方向に駆動するため、イオンの供給源をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、イオンはピロリン酸イオンである。
いくつかの態様において、イオンはピロリン酸イオンである。
【0180】
いくつかの態様において、Ａ０の５’端は５’－３’エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性であり、そして第一の領域のウェルは５’－３’エキソヌクレアーゼをさらに含む。
いくつかの態様において、デバイスは、流体経路によって第一の領域に連結されている、１つまたはそれより多いウェルを含む第三の領域をさらに含んでもよく、そして第三の領域の１つまたはそれより多いウェルは：
ｄＮＴＰ；
一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；および
増幅酵素
を含む。
いくつかの態様において、デバイスは、流体経路によって第一の領域に連結されている、１つまたはそれより多いウェルを含む第三の領域をさらに含んでもよく、そして第三の領域の１つまたはそれより多いウェルは：
ｄＮＴＰ；
一本鎖プライマーオリゴヌクレオチド；および
増幅酵素
を含む。
【0181】
いくつかの態様において、第三の領域のｄＮＴＰは、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰであってもよく；増幅酵素は、ｄＵＴＰを取り込む高忠実度ポリメラーゼであってもよく；そして第三の領域の１つまたはそれより多いウェルは、ウラシル－ＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼをさらに含んでもよい。
【0182】
いくつかの態様において、デバイスは、第一および第三の領域の間に位置し、１つまたはそれより多いウェルを含む第四の領域をさらに含んでもよく、１つまたはそれより多いウェルはプロテイナーゼを含んでもよい。
【0183】
いくつかの態様において、第一または第二の領域の１つまたはそれより多いウェルは、リガーゼ、およびＡ０の領域に相補的である連結プローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含んでもよい。
【0184】
いくつかの態様において、第一または第二の領域の１つまたはそれより多いウェルは、リガーゼ、およびＡ０の領域に相補的であるスプリントオリゴヌクレオチドＤをさらに含んでもよい。
【0185】
いくつかの態様において、第一または第二の領域の１つまたはそれより多いウェルは、リガーゼ、スプリントオリゴヌクレオチドＤおよび連結プローブオリゴヌクレオチドＣをさらに含んでもよい。
【0186】
いくつかの態様において、連結プローブオリゴヌクレオチドＣは、該オリゴヌクレオチドを３’－５’エキソヌクレアーゼ消化から保護する３’または内部修飾を含んでもよい。
【0187】
いくつかの態様において、Ｄは、Ａ１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ１の５’端のいずれかに相補的な領域を含んでもよい。
【0188】
いくつかの態様において、Ｄは、３’修飾により、またはＤの３’端およびＡ１またはＣの対応する領域の間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ１に対して伸長を経ることが不可能であってもよい。
【0189】
いくつかの態様において、第一の領域の１つまたはそれより多いウェルは、各々異なるターゲット配列に対して選択的であり、そして各々同定領域を含む、少なくとも１つまたはそれより多い異なるＡ０を含んでもよい。
【0190】
いくつかの態様において、第二の領域のウェルは：
ｄＮＴＰ；
緩衝剤；
増幅酵素；
Ａ１またはその一部、あるいはＡ１の多数コピーまたはその一部の多数コピーに由来するシグナルを検出するための手段
を含んでもよい。
ｄＮＴＰ；
緩衝剤；
増幅酵素；
Ａ１またはその一部、あるいはＡ１の多数コピーまたはその一部の多数コピーに由来するシグナルを検出するための手段
を含んでもよい。
【0191】
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、第二の領域の１つまたはそれより多いウェル内に位置する。
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、デバイスの第二の領域内に位置する。
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、デバイスの第二の領域内に位置する。
【0192】
いくつかの態様において、シグナルを検出するための手段は、デバイスの隣接領域内に位置する。
いくつかの態様において、第二の領域の１つまたはそれより多いウェルは、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、第二の領域の１つまたはそれより多いウェルは、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブをさらに含んでもよい。
【0193】
いくつかの態様において、デバイスの増幅酵素および加ピロリン酸分解酵素は同じである。
いくつかの態様において、第二の領域のウェルは：
－Ａ１上の隣接配列に相補的である２つまたはそれより多い連結連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが一方のＬＣＲプローブの５’リン酸へのアニーリングに成功すると、もう一方のＬＣＲプローブの３’ＯＨにすぐ隣接する、前記プローブオリゴヌクレオチド；および
－１つまたはそれより多いリガーゼ
をさらに含む。
いくつかの態様において、第二の領域のウェルは：
－Ａ１上の隣接配列に相補的である２つまたはそれより多い連結連鎖反応（ＬＣＲ）プローブオリゴヌクレオチドであって、プローブが一方のＬＣＲプローブの５’リン酸へのアニーリングに成功すると、もう一方のＬＣＲプローブの３’ＯＨにすぐ隣接する、前記プローブオリゴヌクレオチド；および
－１つまたはそれより多いリガーゼ
をさらに含む。
【0194】
いくつかの態様において、第二の領域のウェルは：
－連結プローブオリゴヌクレオチドＣ；
－スプリントオリゴヌクレオチドＤ
をさらに含んでもよく；
ここで、Ｃは５’リン酸を有し、Ａ１およびＣが共に連結されてオリゴヌクレオチドＡ２を形成可能であるように、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’端はＣの５’に相補的であり、そしてＤの５’端はＡ１の３’端に相補的である。
－連結プローブオリゴヌクレオチドＣ；
－スプリントオリゴヌクレオチドＤ
をさらに含んでもよく；
ここで、Ｃは５’リン酸を有し、Ａ１およびＣが共に連結されてオリゴヌクレオチドＡ２を形成可能であるように、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’端はＣの５’に相補的であり、そしてＤの５’端はＡ１の３’端に相補的である。
【0195】
いくつかの態様において、第二の領域のウェルは：
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１がＡ２に相補的であり、そしてＡ２にアニーリングした際、ＨＯ１のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ１；および
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２が開いたＨＯ１に相補的であり、そしてＨＯ１にアニーリングした際、ＨＯ２のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ２
をさらに含んでもよい。
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド１（ＨＯ１）であって、ＨＯ１がＡ２に相補的であり、そしてＡ２にアニーリングした際、ＨＯ１のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ１；および
－フルオロフォア－消光剤対を含むヘアピンオリゴヌクレオチド２（ＨＯ２）であって、ＨＯ２が開いたＨＯ１に相補的であり、そしてＨＯ１にアニーリングした際、ＨＯ２のヘアピン構造が開いて、そしてフルオロフォア－消光剤対が分離する、前記ＨＯ２
をさらに含んでもよい。
【0196】
いくつかの態様において、第二の領域のウェルは、複数のＨＯ１およびＨＯ２をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、第二の領域のウェルは：
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＡ；
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＢ；ならびに
－フルオロフォア・消光剤対を含む基質
をさらに含んでもよく；
ここで、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームは、Ａ２の存在下で、オリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒性の多構成要素核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成するように、Ａ２の隣接領域に相補的である。
いくつかの態様において、第二の領域のウェルは：
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＡ；
－基質アーム、部分的触媒コアおよびセンサーアームを含むオリゴヌクレオチドＢ；ならびに
－フルオロフォア・消光剤対を含む基質
をさらに含んでもよく；
ここで、オリゴヌクレオチドＡおよびＢのセンサーアームは、Ａ２の存在下で、オリゴヌクレオチドＡおよびＢが組み合わされて触媒性の多構成要素核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成するように、Ａ２の隣接領域に相補的である。
【0197】
いくつかの態様において、第二の領域のウェルは、部分的に二本鎖である核酸構築物をさらに含んでもよく、ここで：
－一方の鎖は少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の領域に相補的であり、そしてこの鎖は「基質」鎖と称されてもよく；
－他方の鎖は、少なくとも１つの消光剤を含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の存在下で、部分的に鎖形成した核酸構築物が、実質的により二本鎖を形成するように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の領域に相補的である。
－一方の鎖は少なくとも１つのＲＮＡ塩基、少なくとも１つのフルオロフォアを含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の領域に相補的であり、そしてこの鎖は「基質」鎖と称されてもよく；
－他方の鎖は、少なくとも１つの消光剤を含み、そしてこの鎖の１つの領域は、Ａ２の存在下で、部分的に鎖形成した核酸構築物が、実質的により二本鎖を形成するように、基質鎖が相補的である領域に隣接するＡ２の領域に相補的である。
【0198】
いくつかの態様において、第二の領域のウェルは、少なくとも１つのＲＮＡ塩基を除去するための酵素をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、酵素は、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり、そしてＲＮＡ塩基はウラシルである。
いくつかの態様において、酵素は、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり、そしてＲＮＡ塩基はウラシルである。
【0199】
いくつかの態様において、第二の領域の１つまたはそれより多いウェルは：
連結部位を含むＡ２の領域に相補的なオリゴヌクレオチドであって、その蛍光が互いに対するあるいは１つまたはそれより多い蛍光消光剤に対する近接のいずれかによって消光されるように配置された１つまたは複数のフルオロフォアを含む、前記オリゴヌクレオチド；
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素
をさらに含んでもよく；
ここで、Ａ２の存在下で、フルオロフォアが互いからまたは対応する消光剤から分離され、そして蛍光シグナル、そしてしたがってＡ２の存在が検出可能であるように、標識オリゴヌクレオチドが消化される。
連結部位を含むＡ２の領域に相補的なオリゴヌクレオチドであって、その蛍光が互いに対するあるいは１つまたはそれより多い蛍光消光剤に対する近接のいずれかによって消光されるように配置された１つまたは複数のフルオロフォアを含む、前記オリゴヌクレオチド；
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素
をさらに含んでもよく；
ここで、Ａ２の存在下で、フルオロフォアが互いからまたは対応する消光剤から分離され、そして蛍光シグナル、そしてしたがってＡ２の存在が検出可能であるように、標識オリゴヌクレオチドが消化される。
【0200】
いくつかの態様において、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素はエキソヌクレアーゼである。
いくつかの態様において、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は、プルーフリーディング活性を持つポリメラーゼである。
いくつかの態様において、二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素は、プルーフリーディング活性を持つポリメラーゼである。
【0201】
いくつかの態様において、フルオロフォアは、フルオレセインファミリー、カルボキシローダミンファミリー、シアニンファミリー、ローダミンファミリーの色素、ポリハロフルオレセインファミリー色素、ヘキサクロロフルオレセインファミリー色素、クマリンファミリー色素、オキサジンファミリー色素、チアジンファミリー色素、スクアラインファミリー色素、およびキレートランタニドファミリー色素より選択される。
【0202】
いくつかの態様において、デバイスのフルオロフォアは、任意の商業的に入手可能な色素から選択されてもよい。
いくつかの態様において、デバイスの消光剤は、商標名Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭ、ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、Ｉｏｗａ ＢｌａｃｋＴＭ、ＺＥＮおよび／またはＴＡＯの下で入手可能なものより選択されてもよい。
いくつかの態様において、デバイスの消光剤は、商標名Ｂｌａｃｋ ＨｏｌｅＴＭ、ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ Ｄａｒｋ、Ｑｘ１Ｊ、Ｉｏｗａ ＢｌａｃｋＴＭ、ＺＥＮおよび／またはＴＡＯの下で入手可能なものより選択されてもよい。
【0203】
いくつかの態様において、デバイスの消光剤は、任意の商業的に入手可能な消光剤より選択されてもよい。
いくつかの態様において、第二の領域の１つまたはそれより多いウェルは、１つまたはそれより多い部分的に二本鎖であるＤＮＡ構築物をさらに含んでもよく、各構築物は、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤を含有する。いくつかの態様において、構築物が部分的に二本鎖である場合、１つまたはそれより多いフルオロフォアの十分な消光が起こるように、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤は十分に近接して位置する。
いくつかの態様において、第二の領域の１つまたはそれより多いウェルは、１つまたはそれより多い部分的に二本鎖であるＤＮＡ構築物をさらに含んでもよく、各構築物は、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤を含有する。いくつかの態様において、構築物が部分的に二本鎖である場合、１つまたはそれより多いフルオロフォアの十分な消光が起こるように、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤は十分に近接して位置する。
【0204】
いくつかの態様において、構築物は、それ自体に折り重なる自己相補領域を持つＤＮＡ一本鎖である。
いくつかの態様において、構築物はプライマー対の一方のプライマーを含む。
いくつかの態様において、構築物はプライマー対の一方のプライマーを含む。
【0205】
いくつかの態様において、第二の領域の１つまたはそれより多いウェルは、プライマー対のもう一方のプライマーをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、構築物の一本鎖セクションの一部がＡ２にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長される。いくつかの態様において、プライマー対のもう一方のプライマーが、次いで、伸長された構築物にハイブリダイズしてＡ２をディスプレイする。このプライマーは次いで、構築物に対して伸長されて、自己相補領域を置換する。したがって、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い色素は、蛍光シグナルが検出されるために十分に分離され、Ａ２の存在を示す。
いくつかの態様において、構築物の一本鎖セクションの一部がＡ２にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長される。いくつかの態様において、プライマー対のもう一方のプライマーが、次いで、伸長された構築物にハイブリダイズしてＡ２をディスプレイする。このプライマーは次いで、構築物に対して伸長されて、自己相補領域を置換する。したがって、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い色素は、蛍光シグナルが検出されるために十分に分離され、Ａ２の存在を示す。
【0206】
こうした態様において、構築物はＳｕｎｒｉｓｅプライマーとして知られてもよい。
いくつかの態様において、構築物は２つの別個のＤＮＡ鎖を含む。
いくつかの態様において、構築物の一本鎖セクションの一部がＡ２にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長される。いくつかの態様において、プライマー対のもう一方のプライマーが、次いで、伸長された構築物にハイブリダイズしてＡ２をディスプレイする。このプライマーは次いで、構築物に対して、二本鎖セクションの方向に伸長され、ＤＮＡ鎖の短い方を置換し、そしてしたがって１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い色素は、蛍光シグナルが検出されるために十分に分離され、Ａ２の存在を示す。
いくつかの態様において、構築物は２つの別個のＤＮＡ鎖を含む。
いくつかの態様において、構築物の一本鎖セクションの一部がＡ２にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼによってＡ２に対して伸長される。いくつかの態様において、プライマー対のもう一方のプライマーが、次いで、伸長された構築物にハイブリダイズしてＡ２をディスプレイする。このプライマーは次いで、構築物に対して、二本鎖セクションの方向に伸長され、ＤＮＡ鎖の短い方を置換し、そしてしたがって１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い色素は、蛍光シグナルが検出されるために十分に分離され、Ａ２の存在を示す。
【0207】
こうした態様において、構築物は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｚｉｐｐｅｒとして知られてもよい。
当業者は、ＳｕｎｒｉｓｅプライマーおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｚｉｐｐｅｒの両方に関して、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤対が、それぞれの構築物各々内の多様な位に位置することが可能であることを認識するであろう。重要な特徴は、各対が互いに十分に近接して位置し、Ａ２の非存在下で、すなわち伸長および鎖置換が起こらない場合、蛍光シグナルが放出されないことである。
当業者は、ＳｕｎｒｉｓｅプライマーおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｚｉｐｐｅｒの両方に関して、１つまたはそれより多いフルオロフォアおよび１つまたはそれより多い消光剤対が、それぞれの構築物各々内の多様な位に位置することが可能であることを認識するであろう。重要な特徴は、各対が互いに十分に近接して位置し、Ａ２の非存在下で、すなわち伸長および鎖置換が起こらない場合、蛍光シグナルが放出されないことである。
【0208】
いくつかの態様において、１つまたはそれより多い領域の１つまたはそれより多いウェルは、ピロホスファターゼをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域の１つまたはそれより多いウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域の１つまたはそれより多いウェルは、ホスファターゼまたはホスホヒドロラーゼをさらに含んでもよい。
【0209】
いくつかの態様において、デバイスの第一の領域の１つまたはそれより多いウェルは、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡを形成するための酵素をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、酵素は逆転写酵素である。
いくつかの態様において、酵素は逆転写酵素である。
【0210】
いくつかの態様において、デバイスに存在する１つまたはそれより多い酵素はホットスタートである。
いくつかの態様において、デバイスに存在する１つまたはそれより多い酵素は熱安定性である。
いくつかの態様において、デバイスに存在する１つまたはそれより多い酵素は熱安定性である。
【0211】
いくつかの態様において、デバイスの第一および第二の領域は組み合わされている。
いくつかの態様において、領域の１つまたはそれより多いウェルの間／およびまたはデバイスの１つまたはそれより多い領域の間には、１つまたはそれより多い流体経路が位置する。
いくつかの態様において、領域の１つまたはそれより多いウェルの間／およびまたはデバイスの１つまたはそれより多い領域の間には、１つまたはそれより多い流体経路が位置する。
【0212】
いくつかの態様において、第一の領域は、流体界面を通じて、試料コンテナに流体的に連結されていてもよい。
いくつかの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域に、加熱および／または冷却素子が存在してもよい。
いくつかの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域に、加熱および／または冷却素子が存在してもよい。
【0213】
いくつかの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域に加熱および／または冷却を適用してもよい。
いくつかの態様において、デバイスの各領域は、少なくとも１００または２００のウェルを独立に含んでもよい。
いくつかの態様において、デバイスの各領域は、少なくとも１００または２００のウェルを独立に含んでもよい。
【0214】
いくつかの態様において、デバイスの各領域は、約１００～３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００の間またはそれより多いウェルを独立に含んでもよい。ウェルは、任意の形状であってもよく、そしてその位置は、支持体上に任意の形式またはパターンで配置されてもよい。
【0215】
いくつかの態様において、ウェル支持体は、金属（例えば限定されない例として、金、白金、またはニッケル合金）、セラミック、ガラス、または他のＰＣＲ適合性ポリマー材料、あるいは複合材料から構築されてもよい。ウェル支持体には複数のウェルが含まれる。
【0216】
いくつかの態様において、ウェルは、ウェル支持体中に、ブラインドホールまたはスルーホールとして形成されてもよい。ウェルは、ウェル支持体内に、例えばレーザードリル（例えばエキシマーまたは固相レーザー）、超音波エンボス加工、ホットエンボス加工リソグラフィ、ニッケルモールドの電鋳（ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｍｉｎｇ）、射出成形、および射出圧縮成形によって生成されてもよい。
【0217】
いくつかの態様において、個々のウェル体積は、０．１～１５００ｎｌの範囲であってもよい。１つの態様において、０．５～５０ｎＬである。各ウェルは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００ｎＬの体積を有してもよい。
【0218】
いくつかの態様において、ウェル寸法は、任意の形状、例えば円状、楕円形、正方形、長方形、卵型、六角形、八角形、円錐、および当業者に周知の他の形状を有してもよい。
いくつかの態様において、ウェル形状は、軸に沿って多様な横断面面積を有してもよい。例えば、正方形の穴が、第一のサイズから、第一のサイズの部分である第二のサイズに徐々に小さくなってもよい。
いくつかの態様において、ウェル形状は、軸に沿って多様な横断面面積を有してもよい。例えば、正方形の穴が、第一のサイズから、第一のサイズの部分である第二のサイズに徐々に小さくなってもよい。
【0219】
いくつかの態様において、ウェル寸法は、およそ等しい直径および深さの正方形であってもよい。
いくつかの態様において、ウェルを定義する壁は非平行であってもよい。
いくつかの態様において、ウェルを定義する壁は非平行であってもよい。
【0220】
いくつかの態様において、ウェルを定義する壁は、点に収束してもよい。ウェル寸法は、ウェル支持体の総体積容量から得られうる。
いくつかの態様において、ウェルの深さは２５μｍ～１０００μｍの範囲であってもよい。
いくつかの態様において、ウェルの深さは２５μｍ～１０００μｍの範囲であってもよい。
【0221】
いくつかの態様において、ウェルは、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００μｍの深さを有してもよい。
【0222】
いくつかの態様において、ウェル直径は、約２５μｍ～約５００μｍの範囲であってもよい。
いくつかの態様において、ウェルは、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５または５００μｍの幅を有してもよい。
いくつかの態様において、ウェルは、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５または５００μｍの幅を有してもよい。
【0223】
いくつかの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域の一部は、流体の接着を促進するかまたは防止するように修飾されていてもよい。ウェルを定義する表面を、親水性物質でコーティングし（または親水性であるように修飾し）、そしてしたがって流体の保持を促進してもよい。
【0224】
いくつかの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域の一部を、疎水性物質でコーティングし（または疎水性であるように修飾し）、そしてしたがって流体の保持を防止してもよい。当業者は、流体が好ましくはウェル内に保持されるが、上部表面には保持されないように、過剰な流体の排出を促進するため、他の表面の処理を行ってもよいことを理解するであろう。
【0225】
いくつかの態様において、ウェル支持体のウェルは、整列された行および列の単純な幾何的パターン、あるいは対角線状にまたは六角形に配置されたパターンを有するようにパターン形成されてもよい。１つの態様において、ウェル支持体のウェルは、カオスパターンまたはアイソジオメトリック設計パターンなどの複雑な幾何パターンを有するようにパターン形成されてもよい。
【0226】
いくつかの態様において、ウェルは、幾何的に互いに分離されてもよく、そして／または試薬の交差混入を防止するのを補助するため、大きな深さ対幅比を特徴としてもよい。
いくつかの態様において、デバイスは、プロセス流体、例えば油または他の化学物質溶液を、デバイスの領域の１つまたはそれより多くに提供するために使用可能な、１つまたはそれより多い補助領域を含んでもよい。こうした補助領域は、１つまたはそれより多い膜、バルブ、および／または圧切断可能基質（すなわち、補助領域内、または流体経路の隣接部分内で、流体からあらかじめ決定された量の圧に供された際、破壊される物質）、例えば金属ホイルまたは薄いフィルムを通じて、デバイスの領域の１つまたはそれより多くに流体的に連結されていてもよい。
いくつかの態様において、デバイスは、プロセス流体、例えば油または他の化学物質溶液を、デバイスの領域の１つまたはそれより多くに提供するために使用可能な、１つまたはそれより多い補助領域を含んでもよい。こうした補助領域は、１つまたはそれより多い膜、バルブ、および／または圧切断可能基質（すなわち、補助領域内、または流体経路の隣接部分内で、流体からあらかじめ決定された量の圧に供された際、破壊される物質）、例えば金属ホイルまたは薄いフィルムを通じて、デバイスの領域の１つまたはそれより多くに流体的に連結されていてもよい。
【0227】
いくつかの態様において、デバイスの流体経路には、拡張トーチュラス（ｔｏｒｔｕｒｏｕｓ）部分が含まれてもよい。流体経路の入口通路およびデバイスの領域の１つまたはそれより多くの間のトーチュラスパスは、流体プロセスの制御および取り扱いのため、役立ってもよい。トーチュラスパスは、流体経路を通じた油の流動に干渉しうるガス泡の形成の減少を補助してもよい。
【0228】
いくつかの態様において、デバイスは、デバイスの１つまたはそれより多い領域のウェルから気体が排出されることを可能にする一方、流体が通過することを許さない、気体浸透性膜をさらに含んでもよい。気体浸透性膜は、気体浸透性接着剤によって、デバイスのウェル支持体に接着されてもよい。１つの態様において、膜はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から構築されてもよく、そして２０～１０００μｍの範囲の厚さを有する。いくつかの態様において、膜は、１００～２００μｍの範囲の厚さを有しうる。
【0229】
いくつかの態様において、ウェル支持体のすべてまたは一部は、金属からウェルへの熱移動を可能にするため、伝導性金属部分（例えば金）を含有してもよい。１つの態様において、ウェルの内部表面を金属でコーティングして、熱移動を可能にしてもよい。
【0230】
いくつかの態様において、適切な試薬がデバイスの１つまたはそれより多い領域のウェルを満たした後、絶縁油または熱伝導性液体をデバイスに適用して、クロストークを防止してもよい。
【0231】
いくつかの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域のウェルを、円錐のように、より大きい直径からより小さい直径に先細になるように成形してもよい。傾斜した壁を有する円錐状ウェルは、試薬のための非接触沈着法（例えばインクジェット）の使用を可能にする。円錐形状はまた、乾燥を補助し、そして気体浸透性膜が存在する場合、泡および漏洩を防止することが見出されてきている。
【0232】
いくつかの態様において、デバイスの流体経路に沿って、試料流体を（例えば圧によって）前進させることによって、デバイスの１つまたはそれより多い領域のウェルを満たしてもよい。流体がデバイスの１つまたはそれより多い領域のウェル上を通過するにつれ、各ウェルには流体が満たされ、これはまず、表面張力を通じてウェル内に保持される。以前記載されるように、デバイスのウェル支持体の部分は、試料流体が通過するにつれて、ウェルの完全でそして均一な充填を促進するため、望ましいように、親水性／疎水性物質でコーティングされてもよい。
【0233】
いくつかの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域のウェルは、充填後、油で「キャップ」されてもよい。これは次いで、ウェル支持体が熱サイクリングに供された場合、蒸発を減少させることを補助しうる。１つの態様において、油キャッピング後、水溶液をデバイスの１つまたはそれより多い領域に満たし、熱伝導性を改善してもよい。
【0234】
いくつかの態様において、定常水溶液を、デバイスの１つまたはそれより多い領域内で加圧して、流体およびいずれの泡の移動も停止してもよい。
いくつかの態様において、油、例えばミネラルオイルを、デバイスの１つまたはそれより多い領域のウェルの単離のために用いて、そして熱伝導性を提供してもよい。しかし、任意の熱伝導液、例えばフッ素化液体（例えば３Ｍ ＦＣ－４０）を用いてもよい。本開示において、油への言及は、当業者が適用可能と認識するであろうようなこうした代替物を含むと理解されるべきである。
いくつかの態様において、油、例えばミネラルオイルを、デバイスの１つまたはそれより多い領域のウェルの単離のために用いて、そして熱伝導性を提供してもよい。しかし、任意の熱伝導液、例えばフッ素化液体（例えば３Ｍ ＦＣ－４０）を用いてもよい。本開示において、油への言及は、当業者が適用可能と認識するであろうようなこうした代替物を含むと理解されるべきである。
【0235】
いくつかの態様において、デバイスは、１つまたはそれより多いセンサーアセンブリをさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、１つまたはそれより多いセンサーアセンブリは、光ファイバー面板（ＦＯＦＰ）にカップリングされた電荷結合素子（ＣＣＤ）／相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）検出装置を含んでもよい。フィルターはＦＯＰＦの最上部上に層状に配置されてもよく、そしてウェル支持体に対してまたはこれに隣接して配置されてもよい。１つの態様において、フィルターは、ＦＯＰＦが最上部に配置されたＣＣＤの最上部に直接層状に配置され（結合し）てもよい。
いくつかの態様において、１つまたはそれより多いセンサーアセンブリは、光ファイバー面板（ＦＯＦＰ）にカップリングされた電荷結合素子（ＣＣＤ）／相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）検出装置を含んでもよい。フィルターはＦＯＰＦの最上部上に層状に配置されてもよく、そしてウェル支持体に対してまたはこれに隣接して配置されてもよい。１つの態様において、フィルターは、ＦＯＰＦが最上部に配置されたＣＣＤの最上部に直接層状に配置され（結合し）てもよい。
【0236】
いくつかの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域が最大１００％の湿度を有するか、または少なくとも熱サイクリング中の蒸発を防止するために十分な湿度を有するように、水和液、例えば蒸留水を、第一の領域または補助領域の１つ内で加熱してもよい。
【0237】
いくつかの態様において、デバイスの充填が完了した後、ＰＣＲのための熱サイクリングを実行するため、デバイスと熱的に接触している外部デバイスによって、ウェル支持体を加熱してもよい。
【0238】
いくつかの態様において、加熱の非接触法、例えばＲＦＩＤ、キュリー点、誘導性またはマイクロ波加熱を使用してもよい。加熱のこれらのおよび他の非接触法は当業者には周知であろう。熱サイクリング中、先に記載するセンサー配置を通じて、化学反応に関してデバイスを監視してもよい。
【0239】
いくつかの態様において、デバイスの領域の１つまたはそれより多くのウェルの１つまたはそれより多くに沈着される試薬は、あらかじめ決定された配置で沈着される。
いくつかの態様において：
試料流体をデバイスの流体経路に提供し、ここでデバイスは、少なくとも、第一の領域、第二の領域および第三の領域の間の流体経路を含み、第一、第二および第三の領域は、独立に１つまたはそれより多いウェルを含む；
第二の領域の１つまたはそれより多いウェルが、増幅された流体でコーティングされるように、第一の領域からの増幅された流体で第二の領域を満たし；
１つまたはそれより多いウェルが、増幅された流体の少なくともある程度で湿ったままであるように、第二の領域から増幅された流体を排出し；
第三の領域の１つまたはそれより多いウェルがこの流体でコーティングされるように、第二の流域から排出された流体で第三の領域を満たし；そして
１つまたはそれより多いウェルが、この流体の少なくともある程度で湿ったままであるように、第三のチャンバーから流体を排出する
工程を含む、方法を提供する。
いくつかの態様において：
試料流体をデバイスの流体経路に提供し、ここでデバイスは、少なくとも、第一の領域、第二の領域および第三の領域の間の流体経路を含み、第一、第二および第三の領域は、独立に１つまたはそれより多いウェルを含む；
第二の領域の１つまたはそれより多いウェルが、増幅された流体でコーティングされるように、第一の領域からの増幅された流体で第二の領域を満たし；
１つまたはそれより多いウェルが、増幅された流体の少なくともある程度で湿ったままであるように、第二の領域から増幅された流体を排出し；
第三の領域の１つまたはそれより多いウェルがこの流体でコーティングされるように、第二の流域から排出された流体で第三の領域を満たし；そして
１つまたはそれより多いウェルが、この流体の少なくともある程度で湿ったままであるように、第三のチャンバーから流体を排出する
工程を含む、方法を提供する。
【0240】
方法のいくつかの態様において、流体経路にはバルブがなくてもよい。
方法のいくつかの態様において、排出された第二の領域に、疎水性物質を満たしてもよい。
方法のいくつかの態様において、排出された第二の領域に、疎水性物質を満たしてもよい。
【0241】
方法のいくつかの態様において、排出された第三の領域に、疎水性物質を満たしてもよい。
方法のいくつかの態様において、疎水性物質は、第二および第三の領域と流体連絡がある油チャンバーから供給されてもよい。
方法のいくつかの態様において、疎水性物質は、第二および第三の領域と流体連絡がある油チャンバーから供給されてもよい。
【0242】
方法のいくつかの態様において、試料流体は、曲がりくねった方式で、流体経路に沿って送られてもよい。
いくつかの態様において、方法は、第一、第二または第三の領域の１つまたはそれより多くに、加熱および冷却サイクルを適用する工程をさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、方法は、第一、第二または第三の領域の１つまたはそれより多くに、加熱および冷却サイクルを適用する工程をさらに含んでもよい。
【0243】
本発明の多様なさらなる側面および態様は、本開示の観点で、当業者には明らかであろう。
本明細書で用いる際、「および／または」は、他方を伴うまたは伴わない、２つの明記する特徴または構成要素の各々の特定の開示として解釈されるものとする。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、本明細書に各々が個々に示されるのと同じように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特定の開示として解釈されるものとする。
本明細書で用いる際、「および／または」は、他方を伴うまたは伴わない、２つの明記する特徴または構成要素の各々の特定の開示として解釈されるものとする。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、本明細書に各々が個々に示されるのと同じように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特定の開示として解釈されるものとする。
【0244】
別に示さない限り、上に示す特徴の説明および定義は、本発明のいずれの特定の側面または態様にも限定されず、そして記載されるすべての側面および態様に等しく適用される。
【0245】
当業者には、本発明はいくつかの態様に言及して例として記載されてきているが、本発明は開示する態様に限定されず、そして付随する請求項に定義するような本発明の範囲から逸脱することなく、別の態様を構築可能であることがさらに認識されるであろう。
【実施例】
【0246】
実施例１－単純化プロトコル
この目的および以下のセクションのため、本発明の態様を例示し、そしてそれぞれ、プロトコル１～５として言及する。
この目的および以下のセクションのため、本発明の態様を例示し、そしてそれぞれ、プロトコル１～５として言及する。
【0247】
図１は、異なるプロトコルの概観を提供する。
以下の表は、各プロトコルを実行するために掛かる時間の概観を示す：
以下の表は、各プロトコルを実行するために掛かる時間の概観を示す：
【0248】
【表1】
【0249】
１つの態様において、ＴＩＰＰは、本発明のプロトコル、方法、キットおよびまたはデバイスのいずれの１つにも存在しない。
１つの態様において、５’－３’エキソヌクレアーゼは、本発明のプロトコル、方法、キットおよびまたはデバイスのいずれの１つにも存在しない。
１つの態様において、５’－３’エキソヌクレアーゼは、本発明のプロトコル、方法、キットおよびまたはデバイスのいずれの１つにも存在しない。
【0250】
以下の表は、各プロトコルで用いてもよい酵素の概観を示す：
【0251】
【表2】
【0252】
１つの態様において、ピロホスファターゼの存在は任意選択である。
１つの態様において、５’－３’エキソヌクレアーゼの存在は任意選択である。
１つの態様において、ＵＤＧの存在は任意選択である。
１つの態様において、５’－３’エキソヌクレアーゼの存在は任意選択である。
１つの態様において、ＵＤＧの存在は任意選択である。
【0253】
【表3】
【0254】
見て取れるように、本発明者らは、必要な酵素の総数を減らし、したがって方法のコストおよび複雑さを減らした。驚くべきことに、本発明者らは、５’－３’エキソヌクレアーゼ添加を、プロトコルの前増幅工程から加ピロリン酸分解／連結工程に移動させると（プロトコル３～５におけるように）、図２に示すように、より高い蛍光シグナル（特定のターゲット分析物配列の検出に相当する）が生じることを発見した。
【0255】
実施例２：加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）酵素
本発明者らは、ある範囲の異なるＰＰＬ酵素を用いて、本発明のプロトコル３の方法を試験し、その結果は図３で見られうる。図３（Ａ）は、Ｍａｋｏ、ＫｌｅｎｏｗおよびＢｓｕを用いた１％ＭＡＦ Ｔ７９０Ｍの検出を示す。図３（Ｂ）は、ある範囲の異なるＰＰｉ濃度でＢｓｔ ＬＦを用いた０．５％ＭＡＦ Ｔ７９０Ｍの検出を示す。
本発明者らは、ある範囲の異なるＰＰＬ酵素を用い、本発明のプロトコル４の方法を試験し、その結果は図４で見られうる。
本発明者らは、ある範囲の異なるＰＰＬ酵素を用いて、本発明のプロトコル３の方法を試験し、その結果は図３で見られうる。図３（Ａ）は、Ｍａｋｏ、ＫｌｅｎｏｗおよびＢｓｕを用いた１％ＭＡＦ Ｔ７９０Ｍの検出を示す。図３（Ｂ）は、ある範囲の異なるＰＰｉ濃度でＢｓｔ ＬＦを用いた０．５％ＭＡＦ Ｔ７９０Ｍの検出を示す。
本発明者らは、ある範囲の異なるＰＰＬ酵素を用い、本発明のプロトコル４の方法を試験し、その結果は図４で見られうる。
【0256】
実施例３：プロトコル１対プロトコル４
本発明者らは、プロトコル１およびプロトコル４の両方を用いて、０．５％、０．１０％および０．０５％ＭＡＦでエクソン１９ ｄｅｌ＿６２２３を検出し、その結果は図５で見られうる。見て取れるように、蛍光ピークは、プロトコル４を用いた際により大きい。
本発明者らは、プロトコル１およびプロトコル４の両方を用いて、０．５％、０．１０％および０．０５％ＭＡＦでエクソン１９ ｄｅｌ＿６２２３を検出し、その結果は図５で見られうる。見て取れるように、蛍光ピークは、プロトコル４を用いた際により大きい。
【0257】
実施例４：プロトコル４－感度
本発明者らは、プロトコル４にしたがい、図６に示すように、０．１０％、０．５０％および１％ＭＡＦでＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍ突然変異を検出した。
本発明者らは、プロトコル４にしたがい、図６に示すように、０．１０％、０．５０％および１％ＭＡＦでＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍ突然変異を検出した。
【0258】
実施例５：プロトコル４－ＲＣＡ中にエキソヌクレアーゼ消化工程は必要か？
本発明者らは、ＲＣＡ中のエキソヌクレアーゼ消化工程は必須ではないことを示した。しかし、検出可能なシグナルは、エキソヌクレアーゼ消化工程を省略すると、ＲＣＡ中でより遅く検出される。図７は、ＲＣＡ工程中、エキソヌクレアーゼの存在を伴うおよび伴わない、１％ＭＡＦでのＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍの検出を示す。
本発明者らは、ＲＣＡ中のエキソヌクレアーゼ消化工程は必須ではないことを示した。しかし、検出可能なシグナルは、エキソヌクレアーゼ消化工程を省略すると、ＲＣＡ中でより遅く検出される。図７は、ＲＣＡ工程中、エキソヌクレアーゼの存在を伴うおよび伴わない、１％ＭＡＦでのＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍの検出を示す。
【0259】
実施例６：プロトコル４－ＰＰＬ：ＲＣＡ混合比
本発明者らは、０．５％ＭＡＦ ＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍに関して検出されるシグナル強度に対して、ＰＰＬ：ＲＣＡ混合比がどのような影響を有するかを調べ、その結果を図８に示す。見て取れるように、１：２ ＰＰＬ：ＲＣＡ混合比は、最低のシグナル強度を生じるが、これは、最も早い時点である。最大のシグナル強度は、反応の最も遅い時点で、１：８ ＰＰＬ：ＲＣＡ混合物に関して見られる。
本発明者らは、０．５％ＭＡＦ ＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍに関して検出されるシグナル強度に対して、ＰＰＬ：ＲＣＡ混合比がどのような影響を有するかを調べ、その結果を図８に示す。見て取れるように、１：２ ＰＰＬ：ＲＣＡ混合比は、最低のシグナル強度を生じるが、これは、最も早い時点である。最大のシグナル強度は、反応の最も遅い時点で、１：８ ＰＰＬ：ＲＣＡ混合物に関して見られる。
【0260】
実施例７：プロトコル４－色素選択
本発明者らは、ＲＣＡ中に用いる色素を最適化可能であるかどうかを調べた。図９は、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ（５０℃および６０℃）およびＳｙｔｏ８２（５０℃および６０℃）を用い、プロトコル４にしたがって行った比較実験の結果を示す。Ｓｙｔｏ８２色素は、ＲＣＡが５０℃のより低い温度で実行可能であることを許容する一方、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩはより高い６０℃の温度を必要とする。反応混合物へのプロテイナーゼＫの添加を省くプロトコル５に関しては、より低いＲＣＡ温度が必要である。ターゲットポリヌクレオチド領域を含む核酸の少なくとも１つの一本鎖分析物を調製するために用いる増幅酵素が働くためには、本発明の方法を用いた検出のため、５０℃より高い温度が必要である。ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩの使用は、６０℃の反応温度を必要とし、そしてしたがって、ＲＣＡ前の増幅酵素を不活性化するため、方法のどこかの時点でプロテイナーゼＫを添加しなければならない。
本発明者らは、ＲＣＡ中に用いる色素を最適化可能であるかどうかを調べた。図９は、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ（５０℃および６０℃）およびＳｙｔｏ８２（５０℃および６０℃）を用い、プロトコル４にしたがって行った比較実験の結果を示す。Ｓｙｔｏ８２色素は、ＲＣＡが５０℃のより低い温度で実行可能であることを許容する一方、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩはより高い６０℃の温度を必要とする。反応混合物へのプロテイナーゼＫの添加を省くプロトコル５に関しては、より低いＲＣＡ温度が必要である。ターゲットポリヌクレオチド領域を含む核酸の少なくとも１つの一本鎖分析物を調製するために用いる増幅酵素が働くためには、本発明の方法を用いた検出のため、５０℃より高い温度が必要である。ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩの使用は、６０℃の反応温度を必要とし、そしてしたがって、ＲＣＡ前の増幅酵素を不活性化するため、方法のどこかの時点でプロテイナーゼＫを添加しなければならない。
【0261】
より低いＲＣＡ温度は、ｑＰＣＲの代わりにプレート読み取り装置中で本発明の方法を実行することを可能にしうる。
Ｓｙｔｏ８２を利用する反応は、図９で見られうるようにより迅速であり、そして蛍光総量はＳｙｔｏ８２に関してはより低いが、これはより高い濃度のＳｙｔｏ８２色素を用いることによって軽減されうる。
Ｓｙｔｏ８２を利用する反応は、図９で見られうるようにより迅速であり、そして蛍光総量はＳｙｔｏ８２に関してはより低いが、これはより高い濃度のＳｙｔｏ８２色素を用いることによって軽減されうる。
【0262】
実施例８：プロトコル４－ＢＳＴ Ｌ．Ｆ．対ＢＳＴ ２．０ＷＳ
本発明者らは、０．５％ＭＡＦ ＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍ突然変異を検出するため、プロトコル４にしたがい、ＲＣＡに関して、２つの異なる酵素、ＢＳＴ Ｌ．ＦおよびＢＳＴ ２．０ＷＳの使用を調べた。この結果を図１０に示し、ここから、ＢＳＴ ２．０ＷＳで反応が最速であることが見て取れる。ＢＳＴ ２．０ ＷＳは、ｄＵＴＰを取り込むように設計され、これは反応速度を補助する。ＢＳＴ Ｌ．Ｆ．およびＢＳＴ ２．０ＷＳの間で達成される総シグナル強度では無視できる程度の相違しかない。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）によって提供される説明によれば、ＢＳＴ ２．０ＷＳはより安定であるはずであり、そして４５℃より高い温度でのみ活性であるはずである。
本発明者らは、０．５％ＭＡＦ ＥＧＦＲエクソン２０ Ｔ７９０Ｍ突然変異を検出するため、プロトコル４にしたがい、ＲＣＡに関して、２つの異なる酵素、ＢＳＴ Ｌ．ＦおよびＢＳＴ ２．０ＷＳの使用を調べた。この結果を図１０に示し、ここから、ＢＳＴ ２．０ＷＳで反応が最速であることが見て取れる。ＢＳＴ ２．０ ＷＳは、ｄＵＴＰを取り込むように設計され、これは反応速度を補助する。ＢＳＴ Ｌ．Ｆ．およびＢＳＴ ２．０ＷＳの間で達成される総シグナル強度では無視できる程度の相違しかない。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）によって提供される説明によれば、ＢＳＴ ２．０ＷＳはより安定であるはずであり、そして４５℃より高い温度でのみ活性であるはずである。
【0263】
実施例９：シグナル検出に対するＰＰＬ酵素の影響
本発明者らは、異なるＰＰＬ：ＲＣＡ反応混合比でのＲＣＡ反応に対する異なるＰＰＬ酵素の影響を調べた。その結果は図１１（Ａ）１：４ ＰＰＬ：ＲＣＡおよび図１１（Ｂ）１：８ ＰＰＬ：ＲＣＡで見られうる。ＢＳＴを除き、すべてのＰＰＬ酵素は、１：４ ＰＰＬ：ＲＣＡ比でＲＣＡ反応に影響を及ぼす。１：８ ＰＰＬ：ＲＣＡ比では、ＢＳＴおよびＫｌｅｎｏｗはＲＣＡ反応に影響を及ぼさない。
本発明者らは、異なるＰＰＬ：ＲＣＡ反応混合比でのＲＣＡ反応に対する異なるＰＰＬ酵素の影響を調べた。その結果は図１１（Ａ）１：４ ＰＰＬ：ＲＣＡおよび図１１（Ｂ）１：８ ＰＰＬ：ＲＣＡで見られうる。ＢＳＴを除き、すべてのＰＰＬ酵素は、１：４ ＰＰＬ：ＲＣＡ比でＲＣＡ反応に影響を及ぼす。１：８ ＰＰＬ：ＲＣＡ比では、ＢＳＴおよびＫｌｅｎｏｗはＲＣＡ反応に影響を及ぼさない。
【0264】
実施例１０：一塩基ミスマッチに対する加ピロリン酸分解、連結特異性
以下のヌクレオチド配列を有する、一本鎖の第一のオリゴヌクレオチド（配列番号１）を調製した：
以下のヌクレオチド配列を有する、一本鎖の第一のオリゴヌクレオチド（配列番号１）を調製した：
【0265】
【化2】
【0266】
以下のヌクレオチド配列を有する、一本鎖連結オリゴヌクレオチド２（配列番号２）を調製した：
【0267】
【化3】
【0268】
式中、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、ＤＮＡの関連する特徴的な核酸塩基を所持するヌクレオチドを示し、
／５Ｐｈｏｓ／は５’端リン酸を示し、
＊はホスホロチオエート結合を示す。
／５Ｐｈｏｓ／は５’端リン酸を示し、
＊はホスホロチオエート結合を示す。
【0269】
５’から３’方向に、以下のヌクレオチド配列を有する一組の一本鎖オリゴヌクレオチド３～４（配列番号３～４）もまた調製した：
【0270】
【化4】
【0271】
式中、オリゴヌクレオチド３には、オリゴヌクレオチド１の３’端の１７塩基に相補的な１７塩基領域が含まれ、そしてオリゴヌクレオチド４には、３位での一塩基ミスマッチを含む同じ領域が含まれる。配列番号３および４は、それぞれ、Ｃ７９７Ｓ突然変異を含む／含まない、ヒトＥＧＦＲ遺伝子の一部である。
【0272】
次いで、以下の配合から得られるものに対応する組成を有する、第一の反応混合物を調製した：
０．５μＬ ２０ｘ緩衝剤ｐＨ７．０
０．２５μＬ ５ｘ緩衝剤ｐＨ８．０
０．２５μＬ ５ｘＨＦ緩衝剤
０．２μＬオリゴヌクレオチド１、１０００ｎＭ
０．３μＬオリゴヌクレオチド２、１０００ｎＭ
１μＬオリゴヌクレオチド２（５００ｎＭ）またはオリゴ２および３の混合物（それぞれ５００および０．５ｎＭ）
０．３Ｕ Ｋｌｅｎｏｗ断片エキソ－（ＮＥＢ）
０．０１μＬ無機ピロリン酸、１０ｍＭ
０．０１３２Ｕアピラーゼ（例えばＮＥＢ）
１Ｕ大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（例えばＮＥＢ）
１０μＬまでの水
ここで、２０ｘ緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
２００μＬ酢酸Ｔｒｉｓ、１Ｍ、ｐＨ７．０
３４２．５μＬ水性酢酸マグネシウム、１Ｍ
１２０μＬ水性酢酸カリウム、５Ｍ
５０μＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００界面活性剤（１０％）
１ｍＬまでの水
ここで、５ｘ緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
５０μＬ酢酸Ｔｒｉｚｍａ、１Ｍ、ｐＨ８．０
２５μＬ水性酢酸マグネシウム、１Ｍ
２５μＬ水性酢酸カリウム、５Ｍ
５０μＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００界面活性剤（１０％）
１ｍＬまでの水
次いで、混合物を４５℃で１５分間インキュベーションすることによって、オリゴヌクレオチド１の加ピロリン酸分解、その後の連結を通じた環状化を行い、そして生じた産物混合物を増幅反応（実施例１１）で用いた。
０．５μＬ ２０ｘ緩衝剤ｐＨ７．０
０．２５μＬ ５ｘ緩衝剤ｐＨ８．０
０．２５μＬ ５ｘＨＦ緩衝剤
０．２μＬオリゴヌクレオチド１、１０００ｎＭ
０．３μＬオリゴヌクレオチド２、１０００ｎＭ
１μＬオリゴヌクレオチド２（５００ｎＭ）またはオリゴ２および３の混合物（それぞれ５００および０．５ｎＭ）
０．３Ｕ Ｋｌｅｎｏｗ断片エキソ－（ＮＥＢ）
０．０１μＬ無機ピロリン酸、１０ｍＭ
０．０１３２Ｕアピラーゼ（例えばＮＥＢ）
１Ｕ大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（例えばＮＥＢ）
１０μＬまでの水
ここで、２０ｘ緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
２００μＬ酢酸Ｔｒｉｓ、１Ｍ、ｐＨ７．０
３４２．５μＬ水性酢酸マグネシウム、１Ｍ
１２０μＬ水性酢酸カリウム、５Ｍ
５０μＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００界面活性剤（１０％）
１ｍＬまでの水
ここで、５ｘ緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
５０μＬ酢酸Ｔｒｉｚｍａ、１Ｍ、ｐＨ８．０
２５μＬ水性酢酸マグネシウム、１Ｍ
２５μＬ水性酢酸カリウム、５Ｍ
５０μＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００界面活性剤（１０％）
１ｍＬまでの水
次いで、混合物を４５℃で１５分間インキュベーションすることによって、オリゴヌクレオチド１の加ピロリン酸分解、その後の連結を通じた環状化を行い、そして生じた産物混合物を増幅反応（実施例１１）で用いた。
【0273】
実施例１１：環状化プローブの増幅
以下のヌクレオチド配列を有する、一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー１（配列番号５）および２（配列番号６）の対を調製した：
以下のヌクレオチド配列を有する、一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー１（配列番号５）および２（配列番号６）の対を調製した：
【0274】
【化5】
【0275】
式中、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、ＤＮＡの関連する特徴的な核酸塩基を所持するヌクレオチドを示す。
次いで、以下の配合から得られるものに対応する組成を有する、第二の反応混合物を調製した：
３μＬ １０ｘＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤
３．２Ｕ ＢＳＴ ２．０ＷＳ
０．３２μＬオリゴヌクレオチド１、１０μＭ
０．３２μＬオリゴヌクレオチド２、１０μＭ
１．１２５μＬ Ｓｙｔｏ８２、３０μＭ
０．１６５Ｕ無機ピロホスファターゼ
１．２μＬ ｄＮＴＰ混合物、１０ｍＭ
１．２５μＬの実施例１０の反応混合物
１１．２５μＬまでの水
ここで、１０ｘＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
２００μＬ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝８．８、１Ｍ
１００μＬ ＮＨ４）２ＳＯ４、１Ｍ
１００μＬ ｍＭ ＫＣｌ、１Ｍ
２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１Ｍ
１０μＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、１０％
１ｍＬまでの水
次いで、反応混合物を５０℃で４０分間インキュベーションし、そして次いで、生じた反応産物をリアルタイム蛍光によって分析した。その結果を図１２に示す。
次いで、以下の配合から得られるものに対応する組成を有する、第二の反応混合物を調製した：
３μＬ １０ｘＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤
３．２Ｕ ＢＳＴ ２．０ＷＳ
０．３２μＬオリゴヌクレオチド１、１０μＭ
０．３２μＬオリゴヌクレオチド２、１０μＭ
１．１２５μＬ Ｓｙｔｏ８２、３０μＭ
０．１６５Ｕ無機ピロホスファターゼ
１．２μＬ ｄＮＴＰ混合物、１０ｍＭ
１．２５μＬの実施例１０の反応混合物
１１．２５μＬまでの水
ここで、１０ｘＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
２００μＬ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝８．８、１Ｍ
１００μＬ ＮＨ４）２ＳＯ４、１Ｍ
１００μＬ ｍＭ ＫＣｌ、１Ｍ
２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１Ｍ
１０μＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、１０％
１ｍＬまでの水
次いで、反応混合物を５０℃で４０分間インキュベーションし、そして次いで、生じた反応産物をリアルタイム蛍光によって分析した。その結果を図１２に示す。
【0276】
この分析から、オリゴヌクレオチド３および４の両方が存在する場合、蛍光シグナルは反応中により迅速に現れ、オリゴヌクレオチド３の加ピロリン酸分解および連結が第一の反応混合物中で起こっていたことを示す。
【0277】
実施例１２：Ｓｕｎｒｉｓｅプライマーを用いた多色検出
１．ターゲットオリゴ希釈
ＷＴオリゴ希釈は以下の成分で構成される：
０．５ｘＡ７緩衝剤
０．５ｘＰｈｕｓｉｏｎ Ｕ緩衝剤
２００ｎＭ ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号７）
総体積：５μＬ
Ｔ７９０ＭおよびＣ７９７Ｓ １％ＡＦ突然変異体オリゴ混合物：
０．５ｘＡ７緩衝剤
０．５ｘＰｈｕｓｉｏｎ Ｕ緩衝剤
１００ｎＭ ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号７）
２ｎＭ Ｔ７９０Ｍオリゴヌクレオチド（配列番号８）
２ｎＭ Ｃ７９７Ｓ＿２３８９オリゴ（配列番号９）
総体積：５μＬ
１．ターゲットオリゴ希釈
ＷＴオリゴ希釈は以下の成分で構成される：
０．５ｘＡ７緩衝剤
０．５ｘＰｈｕｓｉｏｎ Ｕ緩衝剤
２００ｎＭ ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号７）
総体積：５μＬ
Ｔ７９０ＭおよびＣ７９７Ｓ １％ＡＦ突然変異体オリゴ混合物：
０．５ｘＡ７緩衝剤
０．５ｘＰｈｕｓｉｏｎ Ｕ緩衝剤
１００ｎＭ ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号７）
２ｎＭ Ｔ７９０Ｍオリゴヌクレオチド（配列番号８）
２ｎＭ Ｃ７９７Ｓ＿２３８９オリゴ（配列番号９）
総体積：５μＬ
【0278】
【化6】
【0279】
１ｘＡ７組成
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム２５ｍＭ
酢酸マグネシウム５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
ＰｈｕｓｉｏｎＵ緩衝剤
ＰｈｕｓｉｏｎＵ緩衝剤組成は公的に入手不能である。
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム２５ｍＭ
酢酸マグネシウム５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
ＰｈｕｓｉｏｎＵ緩衝剤
ＰｈｕｓｉｏｎＵ緩衝剤組成は公的に入手不能である。
【0280】
２．ＰＰＬ
以下に対応する混合物を調製した：
１ＸＢＦＦ１
３７．５Ｕ／ｍＬ Ｍａｋｏ ＤＮＡポリメラーゼ（３’→５’エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼ
１．２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
０．６ｍＭ ＰＰｉ
２０ｎＭ Ｔ７９０Ｍプローブ
２０ｎＭ Ｃ７９７Ｓ＿２３８９プローブ
３０ｎＭ Ｔ７９０Ｍスプリントオリゴヌクレオチド
３０ｎＭ Ｃ７９７Ｓ＿２３８９スプリントオリゴヌクレオチド
５μＬのポイント１のＷＴまたは１％ＡＦ突然変異体希釈
総体積１０μＬ
次いで、この混合物を４１℃で３０分間インキュベーションした。
以下に対応する混合物を調製した：
１ＸＢＦＦ１
３７．５Ｕ／ｍＬ Ｍａｋｏ ＤＮＡポリメラーゼ（３’→５’エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼ
１．２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
０．６ｍＭ ＰＰｉ
２０ｎＭ Ｔ７９０Ｍプローブ
２０ｎＭ Ｃ７９７Ｓ＿２３８９プローブ
３０ｎＭ Ｔ７９０Ｍスプリントオリゴヌクレオチド
３０ｎＭ Ｃ７９７Ｓ＿２３８９スプリントオリゴヌクレオチド
５μＬのポイント１のＷＴまたは１％ＡＦ突然変異体希釈
総体積１０μＬ
次いで、この混合物を４１℃で３０分間インキュベーションした。
【0281】
１ｘＢＦＦ１組成
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム３０ｍＭ
酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム３０ｍＭ
酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
【0282】
【化7】
【0283】
式中、＊はホスホロチオエート結合を示す。
【0284】
３．ＴＩＰＰ
以下に対応する混合物を調製した：
１ｘＡ７
６６．６Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
１０μＬのポイント２由来の混合物
総体積２０μＬ
次いで、この混合物を２５℃で５分間、９５℃で５分間インキュベーションした。
以下に対応する混合物を調製した：
１ｘＡ７
６６．６Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
１０μＬのポイント２由来の混合物
総体積２０μＬ
次いで、この混合物を２５℃で５分間、９５℃で５分間インキュベーションした。
【0285】
４．連結
以下に対応する混合物を調製した：
１ｘＡ７
１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼ
２０μＬのポイント３由来の混合物
１０ｎＭ Ｔ７９０Ｍスプリントオリゴヌクレオチド
１０ｎＭ Ｃ７９７Ｓ＿２３８９スプリントオリゴヌクレオチド
総体積３０μＬ
次いで、この混合物を３７℃で１０分間、９５℃で１０分間インキュベーションした。
以下に対応する混合物を調製した：
１ｘＡ７
１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼ
２０μＬのポイント３由来の混合物
１０ｎＭ Ｔ７９０Ｍスプリントオリゴヌクレオチド
１０ｎＭ Ｃ７９７Ｓ＿２３８９スプリントオリゴヌクレオチド
総体積３０μＬ
次いで、この混合物を３７℃で１０分間、９５℃で１０分間インキュベーションした。
【0286】
【化8】
【0287】
５．エキソヌクレアーゼ処理
以下に対応する混合物を調製した：
１ｘＡ７
１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼ
３０μＬのポイント４由来の混合物
６２５Ｕ／ｍＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩ
６２．５Ｕ／ｍＬ Ｔ５エキソヌクレアーゼ
総体積４０μＬ
次いで、この混合物を３０℃で５分間、９５℃で５分間インキュベーションした。
以下に対応する混合物を調製した：
１ｘＡ７
１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼ
３０μＬのポイント４由来の混合物
６２５Ｕ／ｍＬのエキソヌクレアーゼＩＩＩ
６２．５Ｕ／ｍＬ Ｔ５エキソヌクレアーゼ
総体積４０μＬ
次いで、この混合物を３０℃で５分間、９５℃で５分間インキュベーションした。
【0288】
６．ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
１ｘＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤（５３．２ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２６．６ｍＭ ＫＣｌ、５．３２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２６６％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８）
０．２μＭプライマー混合物１
０．４μＭ逆方向プライマー
５３３．３Ｕ／ｍＬ ＢＳＴ Ｌ．Ｆ．
０．４ｍＭ ｄＮＴＰ
１０μＬのポイント５由来の反応混合物
総体積１５μＬ
以下に対応する混合物を調製した：
１ｘＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤（５３．２ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２６．６ｍＭ ＫＣｌ、５．３２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２６６％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８）
０．２μＭプライマー混合物１
０．４μＭ逆方向プライマー
５３３．３Ｕ／ｍＬ ＢＳＴ Ｌ．Ｆ．
０．４ｍＭ ｄＮＴＰ
１０μＬのポイント５由来の反応混合物
総体積１５μＬ
【0289】
【化9】
【0290】
次いで、混合物を６０℃で９０分間インキュベーションした。蛍光測定を１分ごとに行った。Ｂｉｏ－ｒａｄ装置によって提供される自動閾値に基づいて、Ｃｑを得た。この結果は図１３に見られうる。
【0291】
実施例１３：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｚｉｐｐｅｒを用いた多色検出
１．ターゲットオリゴ希釈
ＷＴオリゴ希釈は以下の成分で構成される：
０．５ｘＡ７緩衝剤
０．５ｘＱ５Ｕ緩衝剤
１００ｎＭ ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号１７）
総体積：１．２５μＬ
Ｇ７１９Ｘ＿６２３９、Ｇ７１９Ｘ＿６２５２、Ｇ７１９Ｘ＿６２５３ ０．５％ＡＦ突然変異体オリゴヌクレオチド混合物：
０．５ｘＡ７緩衝剤
０．５ｘＱ５Ｕ緩衝剤
１００ｎＭ ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号１７）
０．５ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２３９オリゴヌクレオチド（配列番号１８）
０．５ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２５２オリゴヌクレオチド（配列番号１９）
０．５ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２５３オリゴヌクレオチド（配列番号２０）
総体積：１．２５μＬ
１．ターゲットオリゴ希釈
ＷＴオリゴ希釈は以下の成分で構成される：
０．５ｘＡ７緩衝剤
０．５ｘＱ５Ｕ緩衝剤
１００ｎＭ ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号１７）
総体積：１．２５μＬ
Ｇ７１９Ｘ＿６２３９、Ｇ７１９Ｘ＿６２５２、Ｇ７１９Ｘ＿６２５３ ０．５％ＡＦ突然変異体オリゴヌクレオチド混合物：
０．５ｘＡ７緩衝剤
０．５ｘＱ５Ｕ緩衝剤
１００ｎＭ ＷＴオリゴヌクレオチド（配列番号１７）
０．５ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２３９オリゴヌクレオチド（配列番号１８）
０．５ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２５２オリゴヌクレオチド（配列番号１９）
０．５ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２５３オリゴヌクレオチド（配列番号２０）
総体積：１．２５μＬ
【0292】
【化10】
【0293】
１ｘＡ７組成
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム２５ｍＭ
酢酸マグネシウム５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
Ｑ５Ｕ緩衝剤
Ｑ５Ｕ緩衝剤組成は公的に入手不能である。
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム２５ｍＭ
酢酸マグネシウム５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
Ｑ５Ｕ緩衝剤
Ｑ５Ｕ緩衝剤組成は公的に入手不能である。
【0294】
２．加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）および連結
以下に対応する混合物を調製した：
１ＸＢＦＦ１
１０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼ
１．２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬラムダエキソ
０．２５ｍＭ ＰＰｉ
６．６ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２３９プローブオリゴヌクレオチド（配列番号２１）
６．６ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２５２プローブオリゴヌクレオチド（配列番号２２）
６．６ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２５３プローブオリゴヌクレオチド（配列番号２３）
３０ｎＭ スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号２４）
以下に対応する混合物を調製した：
１ＸＢＦＦ１
１０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼ
１．２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬラムダエキソ
０．２５ｍＭ ＰＰｉ
６．６ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２３９プローブオリゴヌクレオチド（配列番号２１）
６．６ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２５２プローブオリゴヌクレオチド（配列番号２２）
６．６ｎＭ Ｇ７１９Ｘ＿６２５３プローブオリゴヌクレオチド（配列番号２３）
３０ｎＭ スプリントオリゴヌクレオチド（配列番号２４）
【0295】
１．２５μＬのポイント２由来の混合物
総体積１０μＬ
次いで、この混合物を４５℃で１５分間インキュベーションした。
総体積１０μＬ
次いで、この混合物を４５℃で１５分間インキュベーションした。
【0296】
１ｘＢＦＦ１組成
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム３０ｍＭ
酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム３０ｍＭ
酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
【0297】
【化11】
【0298】
式中、＊はホスホロチオエート結合を示す。
【0299】
３．検出－ＲＣＡ
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６ｘＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤（５３．２ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２６．６ｍＭ ＫＣｌ、５．３２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２６６％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８）
０．２８μＭ色素プライマー混合物１
０．５６μＭ消光剤プライマー１
０．２８μＭ消光剤プライマー２
０．８４μＭ逆方向プライマー
５６８．８Ｕ／ｍＬ ＢＳＴ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
１．０６ｍＭ ｄＮＴＰ
１．２５μＬのポイント２由来の反応混合物
総体積１１．２５μＬ
色素プライマー混合物１は以下からなった
以下に対応する混合物を調製した：
２．６６ｘＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤（５３．２ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２６．６ｍＭ ＫＣｌ、５．３２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２６６％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８）
０．２８μＭ色素プライマー混合物１
０．５６μＭ消光剤プライマー１
０．２８μＭ消光剤プライマー２
０．８４μＭ逆方向プライマー
５６８．８Ｕ／ｍＬ ＢＳＴ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
１．０６ｍＭ ｄＮＴＰ
１．２５μＬのポイント２由来の反応混合物
総体積１１．２５μＬ
色素プライマー混合物１は以下からなった
【0300】
【化12】
【0301】
次いで、混合物を５８℃で１５０分間インキュベーションした。蛍光測定を１分ごとに行った。この結果は図１４に見られうる。
【0302】
実施例１４：ターゲットに対する加ピロリン酸分解および連結
１．オリゴヌクレオチド希釈調製物
オリゴヌクレオチドの希釈を０．５ｘＡ７および０．５ｘＱ５緩衝液中で調製した：
ＷＴオリゴヌクレオチド２００ｎＭ
＋／－突然変異体オリゴヌクレオチド５００ｐＭ
総体積１．２５μＬ
１．オリゴヌクレオチド希釈調製物
オリゴヌクレオチドの希釈を０．５ｘＡ７および０．５ｘＱ５緩衝液中で調製した：
ＷＴオリゴヌクレオチド２００ｎＭ
＋／－突然変異体オリゴヌクレオチド５００ｐＭ
総体積１．２５μＬ
【0303】
【化13】
【0304】
２．加ピロリン酸分解および連結
以下からなるＰＰＬ混合物を調製した：
１ｘＢＦＦ１
１０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼ
１．２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬラムダエキソ
０．２５ｍＭ ＰＰｉ
２０ｎＭプローブＡ０
１．２５μＬのポイント１由来のオリゴ
総体積１０μＬ
以下からなるＰＰＬ混合物を調製した：
１ｘＢＦＦ１
１０Ｕ／ｍＬ Ｋｌｅｎｏｗ（エキソ－）
１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼ
１．２Ｕ／ｍＬアピラーゼ
１００Ｕ／ｍＬラムダエキソ
０．２５ｍＭ ＰＰｉ
２０ｎＭプローブＡ０
１．２５μＬのポイント１由来のオリゴ
総体積１０μＬ
【0305】
【化14】
【0306】
式中、＊はホスホロチオエート結合である。
【0307】
１ｘＢＦＦ１組成
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム３０ｍＭ
酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
１ｘＡ７組成
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム２５ｍＭ
酢酸マグネシウム５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
Ｑ５緩衝剤
Ｑ５緩衝剤組成は公的に入手不能である。
生じた混合物を４５℃で１５分間インキュベーションした。
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝７．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム３０ｍＭ
酢酸マグネシウム１７．１２５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
１ｘＡ７組成
酢酸Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８．０ １０ｍＭ
酢酸カリウム２５ｍＭ
酢酸マグネシウム５ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ０．０１％
Ｑ５緩衝剤
Ｑ５緩衝剤組成は公的に入手不能である。
生じた混合物を４５℃で１５分間インキュベーションした。
【0308】
３．検出－ＲＣＡ
以下からなるＲＣＡ混合物を調製した：
２．６６ｘＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤（５３．２ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２６．６ｍＭ ＫＣｌ、５．３２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２６６％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８）
０．２８μＭプライマー混合物
２８４．４Ｕ／ｍＬ ＢＳＴ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
１．０６ｍＭ ｄＮＴＰ
Ｓｙｔｏ８２色素３μＭ
１．２５μＬのポイント２由来の反応
総体積１１．２５μＬ
プライマー混合物：
以下からなるＲＣＡ混合物を調製した：
２．６６ｘＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝剤（５３．２ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２６．６ｍＭ ＫＣｌ、５．３２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２６６％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８）
０．２８μＭプライマー混合物
２８４．４Ｕ／ｍＬ ＢＳＴ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ
１４．６７Ｕ／ｍＬ ＴＩＰＰ
１．０６ｍＭ ｄＮＴＰ
Ｓｙｔｏ８２色素３μＭ
１．２５μＬのポイント２由来の反応
総体積１１．２５μＬ
プライマー混合物：
【0309】
【化15】
【0310】
生じた混合物を５０℃で７０分間インキュベーションした。
蛍光読み取りを１分ごとに行った。結果は図１６に見られうる。
蛍光読み取りを１分ごとに行った。結果は図１６に見られうる。
【0311】
実施例１５：本発明のさらに選択される適用および態様
ＫＲＡＳ検出
ＫＲＡＳ遺伝子は細胞増殖を制御し、突然変異すると、この陰性シグナル伝達が破壊されて、そして細胞は増殖し続けることが可能になり、しばしば癌に発展する。単一アミノ酸置換、そして特に一塩基置換が、多様な癌：肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の管癌および結腸直腸癌に関連付けられる活性化突然変異の原因である。ＫＲＡＳ突然変異は、例えば肺癌における予後バイオマーカーとして用いられてきている。
ＫＲＡＳ検出
ＫＲＡＳ遺伝子は細胞増殖を制御し、突然変異すると、この陰性シグナル伝達が破壊されて、そして細胞は増殖し続けることが可能になり、しばしば癌に発展する。単一アミノ酸置換、そして特に一塩基置換が、多様な癌：肺腺癌、粘液腺腫、膵臓の管癌および結腸直腸癌に関連付けられる活性化突然変異の原因である。ＫＲＡＳ突然変異は、例えば肺癌における予後バイオマーカーとして用いられてきている。
【0312】
ＫＲＡＳにおけるドライバー突然変異は、ヒト癌の最大２０％と関連し、そしてこの突然変異およびその関連疾患（単数または複数）に対する開発中のターゲティング療法があり、いくつかのこうした療法の限定されないリストが以下の表に見られうる：
【0313】
【表4】
【0314】
ＫＲＡＳ突然変異の存在は、ＥＧＦＲ阻害剤、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）およびセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）に対する非常に劣った反応を反映することが見出されてきている。ＫＲＡＳをコードする遺伝子中の活性化突然変異は、結腸直腸癌の３０％～５０％で起こり、そして研究によって、その腫瘍がＫＲＡＳ遺伝子のこの突然変異型を発現する患者はパニツムマブおよびセツキシマブに反応しないことが示されている。野生型ＫＲＡＳ遺伝子の存在は、患者がこれらの薬剤に反応することを保証はしないが、研究によって、セツキシマブは、野生型ＫＲＡＳ腫瘍を持つ転移性結腸直腸癌患者において、有意な有効性を有することが示されてきている。ＫＲＡＳ突然変異（野生型ＥＧＦＲ）に関して陽性である肺癌患者は、ＥＧＦＲアンタゴニスト、エルロチニブまたはゲフィチニブに関して、ＫＲＡＳ突然変異を持たない患者では６０％の反応率であるのに比較して、５％またはそれ未満と概算される反応率を有する。
【0315】
結腸直腸癌におけるセツキシマブ療法（抗ＥＧＦＲ療法）に対する獲得耐性の頻繁なドライバーである、ＫＲＡＳ突然変異（活性化または過剰発現）の出現を早期に検出すると、耐性を遅延させるかまたは逆転させる治療の修飾（例えばマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤の早期開始）が可能になり、そしてしたがって本発明の方法が、患者のＫＲＡＳ状態の迅速でそして安価な検出を可能にすることが好適である。
【0316】
突然変異の限定されないリストは：Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ａ５９Ｔ／Ｅ／Ｇ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ／Ｌ、Ｋ１１７ＮおよびＡ１４６Ｐ／Ｔ／Ｖである。
【0317】
突然変異のさらなる限定されないリストを以下の表に示す：
【0318】
【表5】
【0319】
ＢＲＡＦ検出
ＢＲＡＦは、細胞内部に、細胞増殖の指示に関与するシグナルを送る際に関与するＢ－Ｒａｆと称されるタンパク質をコードするヒト遺伝子である。ＢＲＡＦは、いくつかのヒト癌において、突然変異していることが示されてきている。Ｂ－Ｒａｆは、増殖シグナル伝達プロテインキナーゼのＲａｆキナーゼファミリーメンバーであり、そしてとりわけ、細胞分裂に影響を及ぼす、ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫシグナル伝達経路の制御に役割を果たす。
ＢＲＡＦは、細胞内部に、細胞増殖の指示に関与するシグナルを送る際に関与するＢ－Ｒａｆと称されるタンパク質をコードするヒト遺伝子である。ＢＲＡＦは、いくつかのヒト癌において、突然変異していることが示されてきている。Ｂ－Ｒａｆは、増殖シグナル伝達プロテインキナーゼのＲａｆキナーゼファミリーメンバーであり、そしてとりわけ、細胞分裂に影響を及ぼす、ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫシグナル伝達経路の制御に役割を果たす。
【0320】
特定の他の遺伝性ＢＲＡＦ突然変異は出生異常を引き起こす。
ヒト癌に関連する、ＢＲＡＦ遺伝子の３０より多い突然変異が同定されてきている。症例の９０％において、ヌクレオチド１７９９でチミンがアデニンで置換される。これは、ヒト癌で見られる活性化セグメントにおけるコドン６００でのバリン（Ｖ）のグルタミン酸（Ｅ）での置換（ここで、Ｖ６００Ｅと称される）を導く。この突然変異は広く：
－結腸直腸癌
－黒色腫
－乳頭状甲状腺癌
－非小細胞肺癌
－エナメル上皮腫
で観察される。
ヒト癌に関連する、ＢＲＡＦ遺伝子の３０より多い突然変異が同定されてきている。症例の９０％において、ヌクレオチド１７９９でチミンがアデニンで置換される。これは、ヒト癌で見られる活性化セグメントにおけるコドン６００でのバリン（Ｖ）のグルタミン酸（Ｅ）での置換（ここで、Ｖ６００Ｅと称される）を導く。この突然変異は広く：
－結腸直腸癌
－黒色腫
－乳頭状甲状腺癌
－非小細胞肺癌
－エナメル上皮腫
で観察される。
【0321】
見出されている他の突然変異の限定されないリストは：Ｒ４６１Ｉ、Ｉ４６２Ｓ、Ｇ４６３Ｅ、Ｇ４６３Ｖ、Ｇ４６５Ａ、Ｇ４６５Ｅ、Ｇ４６５Ｖ、Ｇ４６８Ａ、Ｇ４６８Ｅ、Ｎ５８０Ｓ、Ｅ５８５Ｋ、Ｄ５９３Ｖ、Ｆ５９４Ｌ、Ｇ５９５Ｒ、Ｌ５９６Ｖ、Ｔ５９８Ｉ、Ｖ５９９Ｄ、Ｖ５９９Ｅ、Ｖ５９９Ｋ、Ｖ５９９Ｒ、Ｖ６００ＫおよびＡ７２７Ｖである。
【0322】
ＢＲＡＦ突然変異によって駆動される癌を治療する薬剤が開発されてきており；ベムラフェニブおよびダブラフェニブは、後期黒色腫の治療に関してＦＤＡによって認可されている。以前の最適な化学療法剤ダカルバジンに関する７～１２％と比較して、転移性黒色腫に関して、ベムラフェニブでの治療に対する反応率は５３％であった。
【0323】
ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２検出
ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）はまた、ＣＤ３４０（表面抗原分類３４０）、癌原遺伝子Ｎｅｕ、Ｅｒｂｂ２（齧歯類）またはＥＲＢＢ２（ヒト）としても知られ、ＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。この癌遺伝子の増幅または過剰発現は、乳癌の侵襲型の進行に重要な役割を果たす。ＥＲＢＢ２遺伝子の過剰発現はまた、卵巣、胃、肺腺癌、および子宮癌の侵襲型および唾液管癌の３０％でも起こることが知られる。過剰発現の非存在下で受容体のリガンド独立発火（ｆｉｒｉｎｇ）を引き起こす構造改変もまた同定されてきている。
ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）はまた、ＣＤ３４０（表面抗原分類３４０）、癌原遺伝子Ｎｅｕ、Ｅｒｂｂ２（齧歯類）またはＥＲＢＢ２（ヒト）としても知られ、ＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。この癌遺伝子の増幅または過剰発現は、乳癌の侵襲型の進行に重要な役割を果たす。ＥＲＢＢ２遺伝子の過剰発現はまた、卵巣、胃、肺腺癌、および子宮癌の侵襲型および唾液管癌の３０％でも起こることが知られる。過剰発現の非存在下で受容体のリガンド独立発火（ｆｉｒｉｎｇ）を引き起こす構造改変もまた同定されてきている。
【0324】
この突然変異およびその関連疾患（単数または複数）に対して認可され、そして開発中である多くのターゲティング療法があり、こうした療法のいくつかの限定されないリストが以下の表に見られうる：
【0325】
【表6】
【0326】
ＨＥＲ２試験は、予後を評価し、治療に対する反応を監視し、そしてターゲティング療法（トラスツズマブなど）に関する適切性を決定するため、乳癌患者においてルーチンに行われる。トラスツズマブは高価であり、そして重大な副作用（心臓毒性）と関連するため、ＨＥＲ２＋患者のみがこの薬剤を投与されるように選択されることが重要であり、そしてしたがって、本発明の方法が患者のＨＥＲ２状態の迅速でそして安価な検出を可能にすることは好適である。
【0327】
１つの態様において、本発明の方法を用いて、ＥＲＲＢ２エクソン２０挿入突然変異の存在または非存在を検出する。
ＥＲＢＢ２突然変異のさらなる限定されないリストを、以下の表に示す：
ＥＲＢＢ２突然変異のさらなる限定されないリストを、以下の表に示す：
【0328】
【表7】
【0329】
ＥＭＬ４－ＡＬＫ検出
ＥＭＬ４－ＡＬＫは、棘皮動物微小管会合タンパク質様４（ＥＭＬ４）遺伝子および未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子の異常な遺伝子融合である。この遺伝子融合は、タンパク質ＥＭＬ４－ＡＬＫの産生を導き、これは、癌細胞の悪性のふるまいを促進し、そして維持するようである。ＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性肺癌は、その細胞がこの突然変異を含有する、原発性悪性肺腫瘍である。
ＥＭＬ４－ＡＬＫは、棘皮動物微小管会合タンパク質様４（ＥＭＬ４）遺伝子および未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子の異常な遺伝子融合である。この遺伝子融合は、タンパク質ＥＭＬ４－ＡＬＫの産生を導き、これは、癌細胞の悪性のふるまいを促進し、そして維持するようである。ＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性肺癌は、その細胞がこの突然変異を含有する、原発性悪性肺腫瘍である。
【0330】
この突然変異およびその関連疾患（単数または複数）に対して認可され、そして開発中である多くのターゲティング療法があり、こうした療法のいくつかの限定されないリストが以下の表に見られうる：
【0331】
【表8】
【0332】
ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子融合は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のおよそ５％に関与し、ＮＳＣＬＣは、米国において年間約９，０００の新規症例があり、そして世界では約４５，０００例がある。
【0333】
ＥＭＬ４－ＡＬＫの多くの変異体があり、すべての変異体は、ＥＭＬ４ Ｎ末端部分および形質転換活性に必要なＡＬＫエクソン２０のキナーゼドメインに、必須のコイルドコイルドメインを有する。ＥＭＬ４のエクソン１３とＡＬＫのエクソン２０（変異体１：Ｖ１）（この検出は図２０に見られうる）、ＥＭＬ４のエクソン２０とＡＬＫのエクソン２０（Ｖ２）、そしてＥＭＬ４のエクソン６とＡＬＫのエクソン２０（Ｖ３）の融合は、より一般的な変異体のいくつかである。これらの異なる変異体の臨床的な重要性は、最近、ようやく明らかになりつつある。
【0334】
Ｖ３は、非チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）治療、例えば化学療法および放射線療法後、より短い無増悪生存（ＰＦＳ）を有する可能性が高い患者の選択に適したマーカーとして出現した。Ｖ３は、ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１およびＶ２に比較して、第一および第二世代の治療ラインを投与された患者のより短いＰＦＳ、ならびに全体の生存（ＯＳ）の悪化と関連するというさらなる証拠がある。
【0335】
Ｖ３陽性患者が、耐性突然変異の発展を通じて、第一および第二の治療ラインに対する耐性を発展させ、そしておそらく、野生型Ｖ３のＩＣ５０がより高いことから、腫瘍細胞抑制が不完全なことによって、これが促進されることもまた見出されてきている。好ましくないＶ３の検出を用いて、より積極的な監視および治療戦略を必要とする患者を選択してもよい。Ｖ３を有する患者への第三世代ロルラニチブの投与は、Ｖ１を有するものよりも長いＰＦＳを与えうるようであり、そしてしたがって、本発明の方法が、患者がどの変異体を有しうるかの迅速でそして安価な検出を可能にすることは好適である。
【0336】
本発明の方法は、限定されるわけではないが、例えば：Ｇ１２０２Ｒ、Ｇ１２６９Ａ、Ｅ１２１０Ｋ、Ｄ１２０３、Ｓ１２０６Ｃ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｆ１１７４Ｃ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｉ１１７１Ｎ／Ｓ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｔ１１５１ＫおよびＣ１１５６Ｙなどの耐性突然変異の検出をさらに可能にする。
【0337】
例えばＧ１２０２Ｒは、溶媒先端（ｓｏｌｖｅｎｔ－ｆｒｏｎｔ）の突然変異であり、薬剤結合への干渉を引き起こし、そして第一および第二世代のＡＬＫ阻害剤に対する高レベルの耐性を与える。したがって、本発明の方法が、この突然変異を所持する可能性があり、そして第一または第二よりも、第三世代治療に対する治療開始から利益を得る可能性がある患者の同定を可能にすることが好適である。
【0338】
ＥＭＬ４－ＡＬＫ突然変異のさらなる限定されない例を以下の表に示す：
【0339】
【表9】
【0340】
ＥＧＦＲ検出
癌遺伝子としての上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の同定によって、肺癌に関するゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ブリガチニブおよびイコチニブ、ならびに結腸癌に関するセツキシマブなどのターゲティング療法の開発が導かれた。しかし、多くの人々は、これらの療法に対して耐性を発展させる。耐性の２つの主な供給源は、Ｔ７９０Ｍ突然変異およびＭＥＴ癌遺伝子である。
癌遺伝子としての上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の同定によって、肺癌に関するゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ブリガチニブおよびイコチニブ、ならびに結腸癌に関するセツキシマブなどのターゲティング療法の開発が導かれた。しかし、多くの人々は、これらの療法に対して耐性を発展させる。耐性の２つの主な供給源は、Ｔ７９０Ｍ突然変異およびＭＥＴ癌遺伝子である。
【0341】
ＥＧＦＲ突然変異はＥＧＦＲエクソン１８～２１で起こり、そしてエクソン１８、１９および２１の突然変異は、ＥＧＦＲ－ＴＫＩ（チロシンキナーゼ阻害剤）での治療の適切性を示す。エクソン２０の突然変異（いくつかの突然変異を除く）は、腫瘍がＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性であり、そしてＥＧＦＲ－ＴＫＩでの治療に適していないことを示す。
【0342】
２つの最も一般的なＥＧＦＲ突然変異は、エクソン１９の短いインフレーム欠失、およびコドン８５８でのロイシンのアルギニンによる置換（Ｌ８５８Ｒ）を生じるヌクレオチド２５７３でのエクソン２１の点突然変異（ＣＴＧからＣＧＧ）である。これらの２つの突然変異はあわせて、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のすべてのＥＧＦＲ突然変異の～９０％を占める。ＮＳＣＬＣ患者におけるこれらの突然変異のスクリーニングを用いて、どの患者がＴＫＩに反応するかを予測してもよい。
【0343】
したがって、本発明の方法が、これらの突然変異を所持し、そしてＴＫＩに関する治療開始から利益を得る可能性がある患者の同定を可能にすることが好適である。当業者は、本発明の方法が、ある範囲のＥＧＦＲ突然変異の同定を可能にすることを認識するであろうし、こうした突然変異の非包括的なリストは：Ｇ７１９Ｘ、Ｅｘ１９Ｄｅｌ、Ｓ７６８Ｉ、Ｅｘ２０ＩｎｓおよびＬ８６１Ｑである。
【0344】
突然変異のさらなる限定されないリストを以下の表に示す：
【0345】
【表10-1】
【0346】
【表10-2】
【0347】
ＲＯＳ１
ＲＯＳ１は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）タンパク質に構造的類似性を持つ受容体チロシンキナーゼ（遺伝子ＲＯＳ１によってコードされる）であり；ｃ－ｒｏｓ癌遺伝子によってコードされる。
ＲＯＳ１は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）タンパク質に構造的類似性を持つ受容体チロシンキナーゼ（遺伝子ＲＯＳ１によってコードされる）であり；ｃ－ｒｏｓ癌遺伝子によってコードされる。
【0348】
ＲＯＳ１突然変異の限定されないリストを以下の表に示す：
【0349】
【表11】
【0350】
ＲＥＴ癌原遺伝子
ＲＥＴ癌原遺伝子は、細胞外シグナル伝達分子のグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーの受容体チロシンキナーゼをコードする。
ＲＥＴ癌原遺伝子は、細胞外シグナル伝達分子のグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーの受容体チロシンキナーゼをコードする。
【0351】
ＲＥＴ突然変異の限定されないリストを以下の表に示す：
【0352】
【表12】
【0353】
ＭＥＴエクソン１４
ＭＥＴエクソン１４スキッピングは、ＮＳＣＬＣのおよそ５％の頻度で起こり、そして扁平癌および腺癌組織学の両方で見られる。
ＭＥＴエクソン１４スキッピングは、ＮＳＣＬＣのおよそ５％の頻度で起こり、そして扁平癌および腺癌組織学の両方で見られる。
【0354】
ＭＥＴ突然変異の限定されないリストを以下の表に示す：
【0355】
【表13】
【0356】
ＮＴＲＫ癌原遺伝子
ＮＴＲＫ遺伝子融合は、ＴＲＫ融合タンパク質と称される異常なタンパク質を導き、これは癌細胞の増殖を引き起こしうる。ＮＴＲＫ遺伝子融合は、脳、頭頚部、甲状腺、軟組織、肺、および結腸の癌を含む、いくつかのタイプの癌に見られうる。神経栄養チロシン受容体キナーゼ遺伝子融合とも称される。
ＮＴＲＫ遺伝子融合は、ＴＲＫ融合タンパク質と称される異常なタンパク質を導き、これは癌細胞の増殖を引き起こしうる。ＮＴＲＫ遺伝子融合は、脳、頭頚部、甲状腺、軟組織、肺、および結腸の癌を含む、いくつかのタイプの癌に見られうる。神経栄養チロシン受容体キナーゼ遺伝子融合とも称される。
【0357】
ＮＴＲＫ突然変異の限定されないリストを以下の表に示す：
【0358】
【表14】
【0359】
パネル
本発明の１つの態様において、各Ａ０がターゲット突然変異に相補的である複数のプローブ分子（Ａ０）を含むパネルを提供する。先にまたは以下に記載するかまたは知られている、任意の突然変異から、突然変異を選択してもよい。したがって、当業者は、本発明の範囲内には、先にまたは以下に記載するかまたは知られている、任意の癌原遺伝子または癌遺伝子のいずれかに対する１つまたはそれより多い突然変異の検出において有用でありうるパネルが含まれることを認識するであろう。
本発明の１つの態様において、各Ａ０がターゲット突然変異に相補的である複数のプローブ分子（Ａ０）を含むパネルを提供する。先にまたは以下に記載するかまたは知られている、任意の突然変異から、突然変異を選択してもよい。したがって、当業者は、本発明の範囲内には、先にまたは以下に記載するかまたは知られている、任意の癌原遺伝子または癌遺伝子のいずれかに対する１つまたはそれより多い突然変異の検出において有用でありうるパネルが含まれることを認識するであろう。
【0360】
１つの態様において、パネルは、５～５００の個々のプローブ分子を含み、各々は、特定のターゲット突然変異に相補的である。１つの態様において、パネルは、５～４００の個々のプローブ分子を含み、各々は、特定のターゲット突然変異に相補的である。１つの態様において、パネルは、５～３００の個々のプローブ分子を含み、各々は、特定のターゲット突然変異に相補的である。１つの態様において、パネルは、５～２００の個々のプローブ分子を含み、各々は、特定のターゲット突然変異に相補的である。１つの態様において、パネルは、５～１００の個々のプローブ分子を含み、各々は、特定のターゲット突然変異に相補的である。１つの態様において、パネルは、５～５０の個々のプローブ分子を含み、各々は、特定のターゲット突然変異に相補的である。
【0361】
１つの態様において、同じ突然変異に特異的な複数のプローブ分子があってもよい。１つの態様において、パネルの各突然変異に特異的な唯一のプローブ分子のみがあってもよい。
【0362】
１つの態様において、複数のプローブ分子を含むパネルであって、１つまたはそれより多いプローブがＥＧＦＲ突然変異に相補的であり、１つまたはそれより多いプローブがＫＲＡＳ突然変異に相補的であり、１つまたはそれより多いプローブがＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２突然変異に相補的であり、１つまたはそれより多いプローブがＥＭＬ４－ＡＬＫ突然変異に相補的であり、１つまたはそれより多いプローブがＲＯＳ１突然変異に相補的であり、１つまたはそれより多いプローブがＲＥＴ突然変異に相補的であり、そして１つまたはそれより多いプローブがＭＥＴ突然変異に相補的である、前記パネルを提供する。
【0363】
１つの態様において、複数のプローブ分子を含むパネルであって、１つまたはそれより多いプローブがＥＧＦＲ突然変異に相補的であってもよく、１つまたはそれより多いプローブがＫＲＡＳ突然変異に相補的であってもよく、１つまたはそれより多いプローブがＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２突然変異に相補的であってもよく、１つまたはそれより多いプローブがＥＭＬ４－ＡＬＫ突然変異に相補的であってもよく、１つまたはそれより多いプローブがＲＯＳ１突然変異に相補的であってもよく、１つまたはそれより多いプローブがＲＥＴ突然変異に相補的であってもよく、そして１つまたはそれより多いプローブがＭＥＴ突然変異に相補的であってもよい、前記パネルを提供する。
【0364】
１つの態様において、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２、ＥＭＬ４－ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＭＥＴ突然変異の１つまたはそれより多くに対して選択的であるプローブのパネルを提供する。
【0365】
１つの態様において、ＥＧＦＲ突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
１つの態様において、ＫＲＡＳ突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
１つの態様において、ＫＲＡＳ突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
【0366】
１つの態様において、ＢＲＡＦ突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
１つの態様において、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
１つの態様において、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
【0367】
１つの態様において、ＥＭＬ４－ＡＬＫ突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
１つの態様において、ＲＯＳ１突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
１つの態様において、ＲＯＳ１突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
【0368】
１つの態様において、ＲＥＴ突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
１つの態様において、ＮＴＲＫ突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
１つの態様において、ＮＴＲＫ突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
【0369】
１つの態様において、ＲＯＳ１突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
１つの態様において、ＭＥＴエクソン１４突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
１つの態様において、ＭＥＴエクソン１４突然変異に対して選択的であるプローブ分子のパネルを提供する。
【0370】
１つの態様において、１つまたはそれより多いコード配列（ＣＤＳ）に対して選択的である複数のプローブ分子を含むパネルを提供する。
１つの態様において、先に記載するパネルの１つまたはそれより多くを用いて、１つまたはそれより多い突然変異を検出する方法を提供する。
１つの態様において、先に記載するパネルの１つまたはそれより多くを用いて、１つまたはそれより多い突然変異を検出する方法を提供する。
【0371】
１つの態様において、先に記載するパネルの１つまたはそれより多くを用いて、１つまたはそれより多い突然変異の存在または非存在を検出する方法を提供する。
１つの態様において、先にまたは以下に記載する通りであってもよいパネルを、先にまたは以下に記載する通りであってもよい１つまたはそれより多い試薬と組み合わせて含む、キットを提供する。
１つの態様において、先にまたは以下に記載する通りであってもよいパネルを、先にまたは以下に記載する通りであってもよい１つまたはそれより多い試薬と組み合わせて含む、キットを提供する。
【0372】
当業者は、Ａ０を開示するキットの態様には、その範囲内に、複数のＡ０を含むパネルがある態様が含まれることを認識するであろう。
１つの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域が１つまたはそれより多いパネルを含み、これらが先にまたは続いて記載される通りであってもよい、前記デバイスを提供する。
１つの態様において、デバイスの１つまたはそれより多い領域が１つまたはそれより多いパネルを含み、これらが先にまたは続いて記載される通りであってもよい、前記デバイスを提供する。
【0373】
コンパニオン診断
本発明の方法を用いて、試料における特定の遺伝子マーカーを検出してもよく、これは適切な療法の選択のガイドを補助するために使用されうる。これらのマーカーは腫瘍特異的突然変異であってもよいし、または野生型ゲノム配列であってもよく、そして組織、血液または任意の他の患者試料タイプを用いて検出されてもよい。
本発明の方法を用いて、試料における特定の遺伝子マーカーを検出してもよく、これは適切な療法の選択のガイドを補助するために使用されうる。これらのマーカーは腫瘍特異的突然変異であってもよいし、または野生型ゲノム配列であってもよく、そして組織、血液または任意の他の患者試料タイプを用いて検出されてもよい。
【0374】
耐性監視
疾患の治療中の患者試料の反復試験によって、療法に対して発展する耐性の早期検出が可能になりうる。この適用の例は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えばゲフィチニブ、エルロチニブ）が第一の治療として一般的に用いられる、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるものである。治療中、腫瘍はしばしば、ＥＧＦＲ遺伝子中に突然変異（例えばＴ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ）を発展させる可能性があり、これが薬剤に対する耐性を与える。これらの突然変異の早期検出は、代替療法（例えばＴａｇｒｉｓｓｏ）への患者の転換を可能にしうる。
疾患の治療中の患者試料の反復試験によって、療法に対して発展する耐性の早期検出が可能になりうる。この適用の例は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えばゲフィチニブ、エルロチニブ）が第一の治療として一般的に用いられる、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるものである。治療中、腫瘍はしばしば、ＥＧＦＲ遺伝子中に突然変異（例えばＴ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ）を発展させる可能性があり、これが薬剤に対する耐性を与える。これらの突然変異の早期検出は、代替療法（例えばＴａｇｒｉｓｓｏ）への患者の転換を可能にしうる。
【0375】
典型的には、耐性開始に関して監視される患者は、反復組織生検を行うには病状が悪すぎる可能性もある。反復組織生検はまた、費用が高く、侵襲性であり、そして関連するリスクを持つ可能性もある。血液から試験することが好ましいが、妥当な採血試料においては、関心対象の突然変異は非常に低コピー数でしか存在しない可能性もある。したがって、監視は、定期的に実行可能であるように、実行が単純でそして費用効率的である、本発明の方法を用いた、血液試料からの高感度試験を必要とする。
【0376】
再発監視
この適用例において、治療後に疾患がないと宣言されている患者を、長期に渡って監視して、疾患の再発を検出してもよい。これは、非侵襲性に行われる必要があり、そして血液試料からのターゲット配列の高感度検出を必要とする。本発明の方法を用いることによって、定期的に実行可能である、単純でそして低コストの方法を提供する。ターゲティングされる配列は、関心対象の疾患に一般的であることが知られる遺伝子突然変異であってもよいし、または寛解前の腫瘍組織における変異体の検出に基づいて、特定の患者に関して設計されるターゲットのカスタムパネルであってもよい。
この適用例において、治療後に疾患がないと宣言されている患者を、長期に渡って監視して、疾患の再発を検出してもよい。これは、非侵襲性に行われる必要があり、そして血液試料からのターゲット配列の高感度検出を必要とする。本発明の方法を用いることによって、定期的に実行可能である、単純でそして低コストの方法を提供する。ターゲティングされる配列は、関心対象の疾患に一般的であることが知られる遺伝子突然変異であってもよいし、または寛解前の腫瘍組織における変異体の検出に基づいて、特定の患者に関して設計されるターゲットのカスタムパネルであってもよい。
【0377】
最小残渣疾患（ＭＲＤ）監視
治療後、患者に残る残渣癌細胞があるいくつかの癌に関しては、これが癌および白血病の再発の主な原因である。ＭＲＤ監視および試験は、いくつかの重要な役割：治療が癌を根絶させたかまたは痕跡が残っているかを決定すること、異なる治療の有効性を比較すること、患者寛解状態を監視すること、ならびに白血病の再発を検出すること、およびこれらの必要性を最適に満たすであろう治療を選択することを有する。
治療後、患者に残る残渣癌細胞があるいくつかの癌に関しては、これが癌および白血病の再発の主な原因である。ＭＲＤ監視および試験は、いくつかの重要な役割：治療が癌を根絶させたかまたは痕跡が残っているかを決定すること、異なる治療の有効性を比較すること、患者寛解状態を監視すること、ならびに白血病の再発を検出すること、およびこれらの必要性を最適に満たすであろう治療を選択することを有する。
【0378】
スクリーニング
疾患の早期検出のための集団スクリーニングは、特に癌診断において、かねてからの目的である。困難な点は二重である：あまりにも多い偽陰性を伴わずに、疾患の確実な検出を可能にするマーカーパネルの同定、ならびに十分な感度および十分に低いコストの方法の開発である。本発明の方法を用いて、ＰＣＲに基づく試験よりもより大きな突然変異パネルに取り組むが、配列決定に基づく診断法よりもはるかに単純なワークフローおよびより低いコストであることが可能である。
疾患の早期検出のための集団スクリーニングは、特に癌診断において、かねてからの目的である。困難な点は二重である：あまりにも多い偽陰性を伴わずに、疾患の確実な検出を可能にするマーカーパネルの同定、ならびに十分な感度および十分に低いコストの方法の開発である。本発明の方法を用いて、ＰＣＲに基づく試験よりもより大きな突然変異パネルに取り組むが、配列決定に基づく診断法よりもはるかに単純なワークフローおよびより低いコストであることが可能である。
【0379】
臓器移植拒絶
移植された臓器がレシピエントによって拒絶される場合、この臓器からのＤＮＡがレシピエントの血流内に脱落する。このＤＮＡの早期検出によって、拒絶の早期検出が可能になる。ドナー特異的マーカーのカスタムパネルを用いて、または集団において一般的であることが知られる変異体のパネルを用いることによって、これを達成してもよく、こうした変異体のうちいくつかは、ドナーに存在し、そしていくつかは、レシピエントに存在する。長期に渡る、臓器レシピエントのルーチンの監視は、本明細書に開示する本発明の低コストおよび単純なワークフローによって可能になりうる。
移植された臓器がレシピエントによって拒絶される場合、この臓器からのＤＮＡがレシピエントの血流内に脱落する。このＤＮＡの早期検出によって、拒絶の早期検出が可能になる。ドナー特異的マーカーのカスタムパネルを用いて、または集団において一般的であることが知られる変異体のパネルを用いることによって、これを達成してもよく、こうした変異体のうちいくつかは、ドナーに存在し、そしていくつかは、レシピエントに存在する。長期に渡る、臓器レシピエントのルーチンの監視は、本明細書に開示する本発明の低コストおよび単純なワークフローによって可能になりうる。
【0380】
非侵襲性出生前試験（ＮＩＰＴ）
胎児ＤＮＡが母体血液中に存在することは長い間知られており、そしてＮＩＰＴ市場は現在、配列決定を用いて突然変異を同定し、そして特定の染色体のコピー数をカウントして、胎児異常の検出を可能にする企業によってかなり飽和している。本明細書に開示するような本発明の方法は、非常に低いアレル割合の突然変異を検出する能力を有し、胎児ＤＮＡのより早期の検出を潜在的に可能にする。所定の集団における共通の突然変異の同定は、母体または胎児ＤＮＡのいずれに存在してもよい突然変異をターゲティングするか、あるいは妊娠のより早期段階での異常の検出を可能にするアッセイを開発することを可能にするであろう。
胎児ＤＮＡが母体血液中に存在することは長い間知られており、そしてＮＩＰＴ市場は現在、配列決定を用いて突然変異を同定し、そして特定の染色体のコピー数をカウントして、胎児異常の検出を可能にする企業によってかなり飽和している。本明細書に開示するような本発明の方法は、非常に低いアレル割合の突然変異を検出する能力を有し、胎児ＤＮＡのより早期の検出を潜在的に可能にする。所定の集団における共通の突然変異の同定は、母体または胎児ＤＮＡのいずれに存在してもよい突然変異をターゲティングするか、あるいは妊娠のより早期段階での異常の検出を可能にするアッセイを開発することを可能にするであろう。
【0381】
本発明の多様なさらなる側面および態様は、本開示を考慮して、当業者に明らかであろう。
「および／または」は、本明細書において、他方を伴うまたは伴わない、２つの明記する特徴または構成要素の各々の特異的開示として解釈されるものとする。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、各々が本明細書に個々に示されるのと同様に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特異的開示として解釈されるものとする。
「および／または」は、本明細書において、他方を伴うまたは伴わない、２つの明記する特徴または構成要素の各々の特異的開示として解釈されるものとする。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、各々が本明細書に個々に示されるのと同様に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特異的開示として解釈されるものとする。
【0382】
背景が別に示さない限り、上に示す特徴の説明および定義は、本発明の任意の特定の側面または態様に限定されず、そして記載されるすべての側面および態様に等しく適用される。
【0383】
当業者は、本発明が例として、いくつかの態様に言及して記載されてきているが、開示する態様に限定されず、そして付随する請求項に定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく、代替態様が構築可能であることをさらに認識するであろう。
【0384】
当業者は、「部分的に消化された鎖Ａ１」への言及が、ターゲット分析物配列にハイブリダイズした際、相補性の欠如のために鎖が解離するまで、３’－５’方向のＡ０の進行性消化によって形成される一本鎖オリゴヌクレオチドを指しうることを理解するであろう。
【0385】
当業者は、「部分的に二本鎖である」核酸への言及が、１つまたはそれより多い部分が二本鎖であり、そして１つまたはそれより多い部分が一本鎖である核酸を指しうることを理解するであろう。
【0386】
当業者は、「実質的に二本鎖である」核酸への言及が、１つまたはそれより多い部分が二本鎖であり、そして１つまたはそれより多い、より小さい部分が一本鎖である核酸を指しうることを理解するであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】