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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-10
(54)【発明の名称】新規なマスクされたサイトカインおよびその使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20230303BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230303BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230303BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230303BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230303BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230303BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230303BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230303BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230303BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230303BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230303BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230303BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230303BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20230303BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20230303BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230303BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230303BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230303BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230303BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230303BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230303BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230303BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20230303BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230303BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20230303BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20230303BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230303BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230303BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20230303BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20230303BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20230303BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P43/00 123
A61P35/00
A61P37/06
A61P37/04
A61P31/00
A61P31/18
A61P31/20
A61P31/14
A61P37/02
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P17/06
A61P3/10
A61P21/00
A61K38/19
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K38/20
A61K38/21
A61K39/395 M
A61K39/395 B
A61K39/395 J
C12N15/12 ZNA
C12N15/13
C07K14/47
C07K16/28
C07K16/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022542224
(86)(22)【出願日】2021-01-11
(85)【翻訳文提出日】2022-09-06
(86)【国際出願番号】 US2021013007
(87)【国際公開番号】W WO2021142471
(87)【国際公開日】2021-07-15
(31)【優先権主張番号】62/959,973
(32)【優先日】2020-01-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/027,138
(32)【優先日】2020-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/029,473
(32)【優先日】2020-05-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/126,393
(32)【優先日】2020-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520347328
【氏名又は名称】アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡｓｋＧｅｎｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】ルゥ，ユエフォン
(72)【発明者】
【氏名】ユィ，チュンシャオ
(72)【発明者】
【氏名】ルゥ，ジエン－フォン
(72)【発明者】
【氏名】リウ，リーチン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC03
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC09
4C076CC18
4C076CC21
4C076CC27
4C076CC31
4C076CC35
4C076CC42
4C076EE59
4C076FF67
4C076GG50
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA06
4C084AA07
4C084BA41
4C084BA42
4C084BA44
4C084CA53
4C084DA01
4C084DA12
4C084DA13
4C084DA14
4C084DA16
4C084DA17
4C084DA18
4C084DA22
4C084DA24
4C084DA25
4C084NA05
4C084NA06
4C084NA11
4C084NA13
4C084NA15
4C084ZA891
4C084ZA941
4C084ZA961
4C084ZB051
4C084ZB081
4C084ZB091
4C084ZB151
4C084ZB261
4C084ZB311
4C084ZB331
4C084ZC551
4C085AA25
4C085BB01
4C085BB11
4C085BB12
4C085BB31
4C085CC05
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C085GG08
4C085GG10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
サイトカインプロドラッグおよびその製造方法ならびに免疫系の刺激または処置する癌、自己免疫性疾患または感染性疾患における使用方法がここに提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サイトカイン部分、マスキング部分および担体部分を含むプロドラッグであって、ここで、ａ)マスキング部分がサイトカイン部分に結合し、サイトカインの生物学的活性を阻害し；
ｂ)担体部分が抗原結合部分を含み、ここで、抗原結合部分は標的細胞の表面に発現される抗原に結合し；そして
ｃ)マスキング部分が担体部分に開裂不可能ペプチドリンカーを介してまたはペプチドリンカーを伴わず直接的にまたは間接的に連結される、
プロドラッグ。
【請求項2】
プロドラッグが、細胞表面に抗原およびサイトカイン部分の受容体両者を発現する細胞により活性化される、所望により、ここで、プロドラッグの生物学的活性が、細胞を含まない部位と比較して、細胞を含む疾患部位で少なくとも２倍、５倍または１０倍増加される、請求項１のプロドラッグ。
【請求項3】
サイトカイン部分の受容体が、２以上のサブユニットを含む、請求項１または２のプロドラッグ。
【請求項4】
抗原が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ２５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４４、ＮＫＰ３０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＢＣＭＡおよびシグナル制御タンパク質アルファ(ＳＩＲＰアルファ)から選択される、請求項１～３の何れかのプロドラッグ。
【請求項5】
サイトカイン部分がＩＬ－２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－９アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２１アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１αアゴニストポリペプチド、ＩＬ－１βアゴニストポリペプチド、ＩＬ－４アゴニストポリペプチド、ＩＬ－５アゴニストポリペプチド、ＩＬ－６アゴニストポリペプチド、ＩＬ－８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１０アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３１アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３６アゴニストポリペプチド、インターフェロン－アルファアゴニストポリペプチド、インターフェロンガンマアゴニストポリペプチド、４－１ＢＢリガンド、ＯＸ－４０リガンドまたはＣＤ－４０リガンドを含む、請求項１～４の何れかのプロドラッグ。
【請求項6】
マスキング部分がサイトカインの受容体のＥＣＤまたはサイトカインに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、請求項１～５の何れかのプロドラッグ。
【請求項7】
請求項１～６の何れかのプロドラッグであって、ｉ)サイトカイン部分がＩＬ－７アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－７受容体αの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)(ＩＬ－７Ｒα ＥＣＤ)またはその機能的アナログを含む、
ii)サイトカイン部分がＩＬ－２１アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－２１受容体αのＥＣＤ(ＩＬ－２１Ｒα ＥＣＤ)またはその機能的アナログを含む、
iii)サイトカイン部分がＩＬ－２アゴニストポリペプチドまたはＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－２受容体βのＥＣＤ(ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤ)またはその機能的アナログを含む、
iv)サイトカイン部分がＩＬ－２１アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－２１に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体を含む、
ｖ)サイトカイン部分がＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－２に対するｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体を含む、
vi)サイトカイン部分がＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－１５に対するｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体を含むまたは
vii)サイトカイン部分がＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－１５受容体αのスシドメイン(ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン)を含む、
プロドラッグ。
【請求項8】
サイトカイン部分が配列番号６または６２またはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含む、請求項５～７の何れかのプロドラッグ。
【請求項9】
サイトカイン部分が配列番号７またはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含む、請求項５～７の何れかのプロドラッグ。
【請求項10】
サイトカイン部分がＩＬ－２またはＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログを含む、所望により、ここで、ＩＬ－２－Ｒβ ＥＣＤが配列番号１１またはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５～９の何れかのプロドラッグ。
【請求項11】
サイトカイン部分がＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－２に対するｓｃＦｖを含み、所望によりＩＬ－２サイトカイン部分とＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγの１以上の間の相互作用を阻害または妨害し、所望により、ここで、ｓｃＦｖが抗体４Ｅ１２Ｂ２Ｄ１０、抗ＩＬ－２ ｓｃＦｖ１または抗ＩＬ－２ ｓｃＦｖ２のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３または重鎖および軽鎖可変ドメインまたは
配列番号２２、配列番号２３または配列番号６０および６１またはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列
を含む、請求項５～９の何れかのプロドラッグ。
【請求項12】
サイトカイン部分がＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－１５に対するｓｃＦｖを含み、所望によりＩＬ－１５サイトカイン部分とＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγの１以上の間の相互作用を阻害または妨害し、所望により、ここで、ｓｃＦｖが抗体１４６Ｂ７、抗ＩＬ－１５ ｓｃＦｖ１または抗ＩＬ－１５ ｓｃＦｖ２のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３または重鎖および軽鎖可変ドメインまたは
配列番号１８、配列番号１９または配列番号８３および８４またはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列
を含む、請求項５～９の何れかのプロドラッグ。
【請求項13】
サイトカイン部分が配列番号１～５の何れかまたはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－２１アゴニストポリペプチドを含む、請求項５～７の何れかのプロドラッグ。
【請求項14】
サイトカイン部分がＩＬ－２１アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がＩＬ－２１Ｒα ＥＣＤまたはその機能的アナログまたはＩＬ－２１Ｒγ ＥＣＤまたはその機能的アナログを含み、所望により、ここで、マスキング部分が配列番号１２、１３または配列番号６３～７３の何れかまたはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５～７または１３の何れかのプロドラッグ。
【請求項15】
サイトカイン部分がＩＬ－２１アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分がヒトＩＬ－２１に対するｓｃＦｖを含み、所望によりＩＬ－２１サイトカイン部分とＩＬ－２１Ｒαおよび／またはＩＬ－２１Ｒγの間の相互作用を阻害または妨害し、所望により、ここで、ｓｃＦｖが抗ＩＬ－２１ ｓｃＦｖ１または抗ＩＬ－２１ ｓｃＦｖ２のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３または重鎖および軽鎖可変ドメインまたは
配列番号２０または２１またはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列
を含む、請求項５～７または１３の何れかのプロドラッグ。
【請求項16】
マスキング部分がＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１から選択されるサイトカインに対するｓｃＦｖを含み、所望によりサイトカインとＩＬ－２Ｒγの間の相互作用を阻害または妨害するまたは
ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１から選択されるサイトカインの受容体αまたはγのＥＣＤを含む、
請求項１～１５の何れかのプロドラッグ。
【請求項17】
プロドラッグが、抗ＰＤ－１抗体部分、ここで、抗体部分が配列番号４４を含む２個の軽鎖およびそれぞれ配列番号２４および２５、
配列番号２４および２６または７４,
配列番号３５および３６、
配列番号３７および３６、
配列番号３７および３８または７５、
配列番号３９および４１または７４または
配列番号４２および４３または７４
を含む２個の重鎖
を含む、請求項１～１６の何れかのプロドラッグ。
【請求項18】
プロドラッグが、抗ＣＴＬＡ４抗体部分、ここで、抗体部分が配列番号５０を含む２個の軽鎖およびそれぞれ配列番号５１および５４、
配列番号５１および５５、
配列番号５１および５６、
配列番号５２および５４、
配列番号５３および５８、
配列番号５３および５９または
配列番号５２および５７
を含む２個の重鎖
を含む、請求項１～１７の何れかのプロドラッグ。
【請求項19】
請求項１～１８の何れかのプロドラッグおよび薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
【請求項20】
請求項１～１８の何れかのプロドラッグをコードする、１以上のポリヌクレオチド。
【請求項21】
請求項２０の１以上のポリヌクレオチドを含む、１以上の発現ベクター。
【請求項22】
請求項２１のベクターを含む、宿主細胞であって、所望により、哺乳動物細胞である、宿主細胞。
【請求項23】
請求項１～１８の何れかのプロドラッグを製造する方法であって、ａ)哺乳動物細胞である請求項２２の宿主細胞を、プロドラッグの発現を可能とする条件下で培養し；そして
ｂ)プロドラッグを細胞培養物から単離する
ことを含む、方法。
【請求項24】
処置を必要とする患者における癌、自己免疫性疾患もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系を刺激する方法であって、患者に治療有効量の請求項１～１８の何れかのプロドラッグまたは請求項１９の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項25】
処置を必要とする患者における、癌、自己免疫性疾患もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激に使用するための、請求項１～１８の何れかのプロドラッグまたは請求項１９の医薬組成物。
【請求項26】
処置を必要とする患者における、癌、自己免疫性疾患もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激のための医薬の製造のための、請求項１～１８の何れかのプロドラッグの使用。
【請求項27】
患者がＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＰＶ感染、
ループス、Ｉ型糖尿病、乾癬、皮膚筋炎、ＧｖＨＤまたは関節リウマチから選択される自己免疫性疾患または
乳癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌または胃癌からなる群から選択される癌
を有する、請求項２４の方法、請求項２５の使用のためのプロドラッグまたは医薬組成物または請求項２６の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月１１日出願の米国仮出願６２／９５９,９７３；２０２０年５月１９日出願の米国仮出願６３／０２７,１３８；２０２０年５月２３日出願の米国仮出願６３／０２９,４７３；および２０２０年１２月１６日出願の米国仮出願６３／１２６,３９３も基づく優先権を主張する。前記優先権主張出願の開示を、引用により全体として本明細書に包含させる。
本出願は、２０２０年１月１１日出願の米国仮出願６２／９５９,９７３；２０２０年５月１９日出願の米国仮出願６３／０２７,１３８；２０２０年５月２３日出願の米国仮出願６３／０２９,４７３；および２０２０年１２月１６日出願の米国仮出願６３／１２６,３９３も基づく優先権を主張する。前記優先権主張出願の開示を、引用により全体として本明細書に包含させる。
【0002】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提供しており、引用により全体として本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは２０２１年１月１１日に作成し、025471_WO008_SL.txtなる名称であり、２４０,３２２バイトサイズである。
本出願は、ASCII形式で電子的に提供しており、引用により全体として本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは２０２１年１月１１日に作成し、025471_WO008_SL.txtなる名称であり、２４０,３２２バイトサイズである。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
インターロイキン(ＩＬ)－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１は、免疫細胞の増殖、分化および生存に重要な役割を演ずる。これらサイトカインの受容体は、ＣＤ１３２としても知られる共通のγ鎖(γＣ)を共有する。故に、これらサイトカインは、共通γＣファミリーサイトカインとも称される。
インターロイキン(ＩＬ)－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１は、免疫細胞の増殖、分化および生存に重要な役割を演ずる。これらサイトカインの受容体は、ＣＤ１３２としても知られる共通のγ鎖(γＣ)を共有する。故に、これらサイトカインは、共通γＣファミリーサイトカインとも称される。
【0004】
ＩＬ－２は、リンパ球発生、生存および恒常性に中心的役割を演ずる。１３３アミノ酸を有し、その機能に必須の四次構造を形成する４個の逆平行、両親媒性アルファらせんからなる(Smith, Science (1988) 240:1169-76; Bazan, Science (1992) 257:410-13)。ＩＬ－２は、３個までの個別のサブユニットからなるＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒ)への結合により、その活性を発揮する。α(ＣＤ２５またはＴａｃ抗原)、β(ＣＤ１２２)およびγＣサブユニットの結合は、ＩＬ－２に対する三量体性、高親和性受容体をもたらす(ＫＤ 約０.０１nM)。βおよびγサブユニットからなる二量体ＩＬ－２受容体は、中間親和性ＩＬ－２Ｒと称される(ＫＤ 約１nM)。αサブユニット単独は、単量体低親和性ＩＬ－２受容体を形成する(ＫＤ 約１０nM)。例えば、Kim et al., Cytokine Growth Factor Rev. (2006) 17:349-66参照。二量体中間親和性ＩＬ－２受容体は、三量体高親和性受容体より約１００倍低い親和性でＩＬ－２に結合するが、二量体および三量体ＩＬ－２受容体は、ＩＬ－２結合によりシグナルを伝達できる(Minami et al., Annu Rev Immunol. (1993) 11:245-68)。
【0005】
ＩＬ－１５は、ＩＬ－２と構造が類似するサイトカインである。ＩＬ－１５は、ウイルス感染後単核食細胞および他の免疫細胞により分泌される。ＩＬ－１５は、ナチュラルキラー(ＮＫ)および免疫系の他の細胞の増殖を誘導し、ウイルス感染細胞および癌細胞の殺滅に関与する。ＩＬ－２と同様、ＩＬ－１５は、中間親和性受容体であるＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒ)β／γ複合体に、約１nMのＫＤで結合する(Giri et al., EMBO J. (1994) 13:2822-30)。ＩＬ－１５は、遥かに高い親和性でＩＬ－１５受容体(ＩＬ－１５Ｒ)αに結合する(ＫＤ 約０.０５nM)。ＩＬ－１５ＲαはＩＬ－２Ｒβ／γ複合体と結合して、ＩＬ－１５特異的、機能的高親和性(αβγ)受容体を形成できる((Minami et al., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11:245-67; Giri et al., J Leukoc Biol. (1995) 5745:763-6; and Lehours et al., Eur Cytokine Netw. (2000) 11:207-15)。
【0006】
ＩＬ－２１は、活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞、Ｔ濾胞性ヘルパー細胞およびナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞により産生される(Spolski and Leonard, Ann Rev Immunol. (2008) 26:57008)。ＩＬ－２１は、種々のクラスのリンパ系細胞の増殖、分化および細胞毒性に多面的効果を発揮することが示されている。もっと最近では、ＩＬ－２１は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の、炎症状態および自己免疫性疾患の進展と関連するＴ細胞のサブセットであるＴ－ヘルパー１７(ＴＨ１７)細胞への分化に重要な役割を演ずることが示されている(Korn et al., Nature (2007) 448(7152):484-87; Nurieva et al., Nature (2007) 448(7152):480-83)。ＩＬ－２１の受容体複合体は、専用鎖ＩＬ－２１Ｒαおよび共通鎖γＣ(またはＲγ)からなる。ヒトＩＬ－２１は、ＩＬ－２１Ｒαに極めて高い親和性で結合し(ＫＤ 約７０pM; Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. (2003) 300(2):291-6)、一方ＩＬ－２１Ｒγへの結合は比較的低親和性である(ＫＤ 約１６０μM)。
【0007】
上記サイトカイン、そのムテインおよび融合タンパク質は、治療剤としての可能性について探索されており、組み換えＩＬ－２は、癌治療について承認された初めてのサイトカインである。しかしながら、これらのサイトカイン薬物および薬物候補は、相当な副作用を有する。さらに、それらのインビボ半減期は、抗体－サイトカイン融合分子として存在するときでさえ、おそらく免疫細胞上のサイトカインの受容体により形成される「ＰＫ沈降」のため、しばしば短い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
故に、より腫瘍部位選択的であり、ＰＫおよび有効性が改善され、同時に引き起こされる副作用が少ない、サイトカインベースの癌治療を開発する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
発明の概要
本発明は、サイトカイン部分、マスキング部分および担体部分を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がサイトカイン部分に結合し、サイトカインの生物学的活性を阻害し；担体部分が標的細胞表面に発現される抗原に結合する抗原結合部分を含み；およびマスキング部分が開裂可能ペプチドリンカーを伴わず担体部分に連結される(例えば、開裂不可能ペプチドリンカーを介して担体部分に間接的に連結；またはペプチドリンカーを伴わず直接連結)を提供する。
本発明は、サイトカイン部分、マスキング部分および担体部分を含むプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がサイトカイン部分に結合し、サイトカインの生物学的活性を阻害し；担体部分が標的細胞表面に発現される抗原に結合する抗原結合部分を含み；およびマスキング部分が開裂可能ペプチドリンカーを伴わず担体部分に連結される(例えば、開裂不可能ペプチドリンカーを介して担体部分に間接的に連結；またはペプチドリンカーを伴わず直接連結)を提供する。
【0010】
ある実施態様において、プロドラッグは、細胞表面に抗原およびサイトカイン部分の受容体両者を発現する細胞により活性化される。ある実施態様において、プロドラッグの生物学的活性は、細胞を含まない部位と比較して、細胞を含む疾患部位で少なくとも２倍、５倍または１０倍増加される。具体的実施態様において、サイトカイン部分の受容体は、２以上のサブユニットを含む。
【0011】
ある実施態様において、抗原は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ２５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４４、ＮＫＰ３０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＢＣＭＡおよびシグナル制御タンパク質アルファ(ＳＩＲＰアルファ、命名ＣＤ１７２ａ)から選択される。
【0012】
ある実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－９アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２１アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１αアゴニストポリペプチド、ＩＬ－１βアゴニストポリペプチド、ＩＬ－４アゴニストポリペプチド、ＩＬ－５アゴニストポリペプチド、ＩＬ－６アゴニストポリペプチド、ＩＬ－８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１０アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３１アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３６アゴニストポリペプチド、インターフェロン－アルファアゴニストポリペプチド、インターフェロンガンマアゴニストポリペプチド、４－１ＢＢリガンド、ＯＸ－４０リガンドまたはＣＤ－４０リガンドを含む。
【0013】
ある実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－２アゴニストポリペプチドまたはＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分はＩＬ－２受容体βのＥＣＤ(ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤ)またはその機能的フラグメントを含む。さらなる実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－２１アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分はＩＬ－２１に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体を含む。他の実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分はＩＬ－２に対するｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体を含む。さらなる実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分はＩＬ－１５に対するｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体を含む。他の実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分はＩＬ－１５受容体αのスシドメイン(ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン)を含む。
【0014】
ある実施態様において、サイトカイン部分は配列番号１またはそれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－２１アゴニストポリペプチドを含む。他の実施態様において、サイトカイン部分は配列番号６または６２またはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含む。他の実施態様において、サイトカイン部分は配列番号７またはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含む。
【0015】
ある実施態様において、マスキング部分はサイトカインの受容体の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含む。具体的実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－７アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分はＩＬ－７受容体αのＥＣＤ(ＩＬ－７Ｒα ＥＣＤ)またはその機能的アナログを含む。具体的実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－２１アゴニストポリペプチドであり、マスキング部分はＩＬ－２１受容体αのＥＣＤ(ＩＬ－２１Ｒα ＥＣＤ)またはその機能的アナログを含む。具体的実施態様において、マスキング部分は配列番号１２、１３および６３～７３またはそれと少なくとも９０％(例えば、少なくとも９５％)同一のものから選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ－２１Ｒα ＥＣＤまたはその機能的アナログを含む。ある実施態様において、マスキング部分は配列番号１１またはそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤまたはその機能的アナログを含む。
【0016】
ある実施態様において、マスキング部分はサイトカイン部分に結合し、サイトカイン部分とその受容体の間の相互作用を阻害または妨害するｓｃＦｖを含む。具体的実施態様において、マスキング部分は、ヒトＩＬ－２１と結合し、配列番号２０または２１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。具体的実施態様において、マスキング部分は、ＩＬ－２と結合し、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの相互作用、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβの相互作用および／またはＩＬ－２とＩＬ－２Ｒγの相互作用を阻害または妨害するｓｃＦｖを含み、所望により、ここで、ｓｃＦｖは抗体４Ｅ１２Ｂ２Ｄ１０の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む。ある実施態様において、ｓｃＦｖは抗体４Ｅ１２Ｂ２Ｄ１０の重鎖および軽鎖を含む。具体的実施態様において、４Ｅ１２Ｂ２Ｄ１０の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６０および６１を含む。ある実施態様において、マスキング部分は、ＩＬ－２と結合し、配列番号２２または２３または配列番号２２または２３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。具体的実施態様において、マスキング部分はＩＬ－１５に結合し、ＩＬ－１５とＩＬ－２Ｒβの相互作用および／またはＩＬ－１５とＩＬ－２Ｒγの相互作用を阻害または妨害するｓｃＦｖを含み、所望により、ここで、ｓｃＦｖは抗ＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７、１４６Ｈ５または４０４Ｅ４の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含みまたは所望により、ここで、ｓｃＦｖは抗ＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７、１４６Ｈ５または４０４Ｅ４の重鎖および軽鎖を含みまたは所望により、ここで、ｓｃＦｖは配列番号１８または１９を含む。ある実施態様において、ｓｃＦｖまたはＦａｂ ＩＬ－１５アンタゴニストは１４６Ｂ７、１４６Ｈ５および４０４Ｅ４から選択される抗ＩＬ－１５抗体の重鎖ＣＤＲ１～３；および１４６Ｂ７、１４６Ｈ５および４０４Ｅ４から選択される抗ＩＬ－１５抗体の軽鎖ＣＤＲ１～３を含み、その全てＷＯ２００３／０１７９３５Ａ２に記載される。
【0017】
具体的実施態様において、マスキング部分は、ＩＬ－２１に結合し、ＩＬ－２１とＩＬ－２１Ｒαの間の相互作用および／またはＩＬ－２１とＩＬ－２Ｒγの間の相互作用を阻害または妨害するｓｃＦｖを含む。具体的実施態様において、マスキング部分は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインに結合し、サイトカインとＩＬ－２Ｒγの間の相互作用を阻害または妨害するｓｃＦｖを含む。
【0018】
ある実施態様において、プロドラッグは、対応する野生型サイトカインより少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍または少なくとも２００倍長い、非ヒト霊長類またはヒトにおける半減期を有する。
【0019】
具体的実施態様において、プロドラッグは、配列番号４４のアミノ酸配列を有する２個の軽鎖およびアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２４および２５；配列番号３５および３６；配列番号３７および３６；配列番号３７および３８；配列番号３９および４１；または配列番号４２および４３を含む２個の重鎖ポリペプチド鎖を含む。
【0020】
具体的実施態様において、プロドラッグは、配列番号５０のアミノ酸配列を有する２個の軽鎖およびアミノ酸配列がそれぞれ配列番号５１および５４；配列番号５１および５５；配列番号５１および５６；配列番号５２および５４；配列番号５３および５８；配列番号５３および５９；または配列番号５２および５７を含む２個の重鎖ポリペプチド鎖を含む。
【0021】
ある実施態様において、本発明は、本発明のプロドラッグおよび薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物を提供する。
【0022】
ある態様において、本発明は、本プロドラッグをコードする１以上のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび発現ベクターを含む宿主細胞(例えば、ＣＨＯ、ＮＳ０細胞および２９３Ｔ細胞などの哺乳動物宿主細胞)を提供する。本発明はまた本プロドラッグを製造する方法であって、プロドラッグの発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養し、プロドラッグを単離(精製も)することを含む、方法も提供する。
【0023】
ＦｃベースのＩＬ－２１プロドラッグ分子はＩＬ－２１受容体を発現するＭｉｎｏ細胞などの細胞と結合できず(図２)、サイトカイン部分がマスクされたことが確認された。担体としてＰＤ－１抗体を有するマスクされた分子が、ＰＤ－１を発現しないＮＫ９２細胞に最小活性を有することも示された(図３)。ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２１プロドラッグ分子が、活性化前のＭｉｎｏ細胞に意義ある活性を有することは発明者らにとって驚きであった(図４Ａおよび４Ｂ)。同様のことがＩＬ－２プロドラッグ(図６Ａおよび６Ｂ)およびＩＬ－１５プロドラッグ(図５Ａ～Ｃ)で観察された。何らかの理論に拘束されることを意図しないが、抗原およびサイトカイン受容体両者が同じ細胞に発現されているときの、ＰＤ－１抗体の抗原へのおよびサイトカイン部分のサイトカイン受容体へのそれぞれのシス結合が、マスキング部分のマスキング効果の取り消しに至ると仮設だてられる。したがって、ターゲティング部分を有するプロドラッグが、担体部分により標的とされる抗原を発現する細胞への、抗原を有しないものを超える有意な選択性を提供することが提唱される。驚くべきことに、マスキング部分のプロテアーゼ切断または除去の必要なく、プロドラッグを構築することができる。
【0024】
本発明は、マスキング部分のプロテアーゼ切断または除去の必要なく、疾患部位で選択的に活性化され得るプロドラッグを提供する。ある態様において、本発明は、サイトカイン部分(サイトカインアゴニストポリペプチド)、マスキング部分および担体部分を含む新規サイトカインプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がサイトカインアゴニストポリペプチドに結合し、サイトカインの意図される生物学的活性を阻害し；担体部分が抗原結合部分を含み；マスキング部分が担体部分に開裂不可能ペプチドリンカーを介してまたはペプチドリンカーを伴わず直接的にまたは間接的に連結され；そして、ここで、プロドラッグの活性が、担体部分により標的とされる抗原およびサイトカインの受容体両者を発現する細胞の刺激について、サイトカインの受容体を発現するが、担体部分により標的とされる抗原を発現しない細胞を刺激する活性より高い、プロドラッグを提供する。
【0025】
ある態様において、本発明は、サイトカイン部分(サイトカインアゴニストポリペプチド)、マスキング部分および担体部分を含む新規サイトカインプロドラッグであって、ここで、マスキング部分がサイトカインアゴニストポリペプチドに結合し、サイトカインの意図される生物学的活性を阻害し；担体部分が抗原結合部分を含み；マスキング部分が担体部分に開裂不可能ペプチドリンカーを介してまたはペプチドリンカーを伴わず直接的にまたは間接的に連結され；そして、ここで、プロドラッグが担体部分により標的とされる抗原およびサイトカインの受容体両者を発現する細胞が存在する疾患部位で活性化されるまたはプロドラッグの生物学的活性が担体部分により標的とされる抗原およびサイトカインの受容体両者を発現する細胞が存在する疾患部位で少なくとも２倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍増加する、プロドラッグを提供する。
【0026】
ある実施態様において、プロドラッグは、如何なる開裂可能ペプチドリンカーも含まない。
【0027】
ある実施態様において、担体部分が抗原結合部分を含み、ここで、抗原は免疫細胞に発現される。ある実施態様において、担体部分が抗原結合部分を含み、ここで、抗原は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ２５、ＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂから選択される。
【0028】
ある実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－９アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドおよびＩＬ－２１アゴニストポリペプチドから選択されるサイトカインを含む。ある実施態様において、サイトカインは、ＩＬ－１αアゴニストポリペプチド、ＩＬ－１βアゴニストポリペプチド、ＩＬ－４アゴニストポリペプチド、ＩＬ－５アゴニストポリペプチド、ＩＬ－６アゴニストポリペプチド、ＩＬ－８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１０アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３１アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３６アゴニストポリペプチド、インターフェロン－アルファアゴニストポリペプチド、インターフェロンガンマ、４－１ＢＢリガンド、ＯＸ－４０リガンド、ＣＤ－４０リガンドから選択される。
【0029】
ある実施態様において、マスキング部分はサイトカインの受容体の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)である。ある実施態様において、マスキング部分はサイトカインに対する抗体または抗体の結合フラグメントを含む。
【0030】
ある実施態様において、サイトカインはＩＬ－２１アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分はＩＬ－２１受容体αの細胞外ドメイン(ＩＬ－２１Ｒα ＥＣＤ)またはその機能的アナログである。ある実施態様において、サイトカインはＩＬ－２アゴニストポリペプチドまたはＩＬ－１５アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分はＩＬ－２受容体βの細胞外ドメイン(ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤ)である。ある実施態様において、サイトカインはＩＬ－２１アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分はＩＬ－２１に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体である。
【0031】
ある実施態様において、サイトカインはＩＬ－２アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分はＩＬ－２に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体である。
【0032】
ある実施態様において、サイトカインはＩＬ－１５アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分はＩＬ－１５に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体である。ある実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、ここで、キメラ分子はさらにＩＬ－１５受容体αのスシドメイン(ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン)を含む。
【0033】
ある実施態様において、ＩＬ－２１アゴニストポリペプチドは、配列番号１のまたは配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－２１Ｒα－ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、それは配列番号１２、６３～７２および７３から選択されるまたは配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、マスキング部分はヒトＩＬ－２１に結合するｓｃＦｖであり；そして、ここで、ｓｃＦｖは配列番号２０または２１のアミノ酸配列を含む。
【0034】
ある実施態様において、ＩＬ－２アゴニストポリペプチドは、配列番号６または６１のまたは配列番号６または６１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤまたはその機能的アナログを含み；、ここで、ＩＬ－２－Ｒβ－ＥＣＤは配列番号１１のまたは配列番号１１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖはＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの相互作用を妨害する。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖはＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβの相互作用を妨害する。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖはＩＬ－２とＩＬ－２Ｒγの相互作用を妨害する。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖは、ハイブリドーマ４Ｅ１２Ｂ２Ｄ１０と同じ重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖは配列番号２２、２３のまたは配列番号２２、２３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0035】
ある実施態様において、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドは、配列番号７のまたは配列番号７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグはスシドメインをさらに含み、それは配列番号８のまたは配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤまたはその機能的アナログを含み；、ここで、ＩＬ－２－Ｒβ－ＥＣＤは配列番号１１のまたは配列番号１１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－１５に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖはＩＬ－１５とＩＬ－２Ｒβの相互作用を妨害する。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－１５に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖはＩＬ－１５とＩＬ－２Ｒγの相互作用を妨害する。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－１５に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖは、ＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７、１４６Ｈ５または４０４Ｅ４と同じ重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－１５に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖは配列番号１８または１９のアミノ酸配列を含む。
【0036】
ある実施態様において、ヒトＩＬ－２１アゴニストポリペプチドは、Ｄ１８、Ｑ１９、Ｅ１０９およびＫ１１７から選択される位置の１か所(配列番号１によるナンバリング)に変異を含む。具体的実施態様において、ヒトＩＬ－２１アゴニストポリペプチドは、配列番号１、２、３、４および５から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0037】
本プロドラッグのある実施態様において、サイトカイン部分およびマスキング部分は、配列番号２７～３４から選択されるものなどの開裂不可能ペプチドリンカーを介して担体部分に融合される。
【0038】
本プロドラッグのある実施態様において、担体部分は変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(「ＬＡＬＡ」)を含むＩｇＧ１抗体(ＥＵナンバリング)または変異２２８Ｐ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ(ＰＡＡ)を含むＩｇＧ４抗体である。Tam et al., Antibodies (2017) 6(12):1-34により記載されているような、Ｆｃ機能性を低減させる他の変異も、Ｆｃドメインまたは抗体のＦｃが担体部分として使用されるとき、導入され得る。
【0039】
具体的実施態様において、担体部分はノブ・イントゥ・ホール変異を含む抗体であり、ここで、サイトカイン部分およびマスキング部分は抗体の異なる重鎖に融合される。ある実施態様において、ノブ・イントゥ・ホール変異は、Ｆｃドメインのポリペプチド鎖または抗体の重鎖にＴ３６６Ｙ「ノブ」変異およびＦｃドメインの他方のポリペプチドまたは抗体の他方の重鎖にＹ４０７Ｔ「ホール」変異を含む(ＥＵナンバリング)。ある実施態様において、ノブ・イントゥ・ホール変異は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異を含む(ＥＵナンバリング)。
【0040】
ある実施態様において、担体部分は、グアニル酸シクラーゼＣ(ＧＣＣ)、炭水化物抗原１９－９(ＣＡ１９－９)、糖タンパク質Ａ３３(ｇｐＡ３３)、ムチン１(ＭＵＣ１)、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、インシュリン様増殖因子１受容体(ＩＧＦ１－Ｒ)、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２(ＨＥＲ２)、ヒト上皮細胞増殖因子受容体３(ＨＥＲ３)、デルタ様タンパク質３(ＤＬＬ３)、デルタ様タンパク質４(ＤＬＬ４)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、グリピカン－３(ＧＰＣ３)、ｃ－ＭＥＴ、血管内皮細胞増殖因子受容体１(ＶＥＧＦＲ１)、血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)、ネクチン－４、Ｌｉｖ－1、糖タンパク質ＮＭＢ(ＧＰＮＭＢ)、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)、Ｔｒｏｐ－２、炭酸脱水酵素IX(ＣＡ９)、エンドセリンＢ受容体(ＥＴＢＲ)、前立腺の６回膜貫通上皮抗原１(ＳＴＥＡＰ１)、葉酸受容体アルファ(ＦＲ－α)、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質６(ＳＬＩＴＲＫ６)、炭酸脱水酵素VI(ＣＡ６)、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３(ＥＮＰＰ３)、メソテリン、栄養芽細胞糖タンパク質(ＴＰＢＧ)、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ３５２、ＣＤ４７、シグナル制御タンパク質アルファ(ＳＩＲＰα)、ＰＤ１、クローディン１８.２、クローディン６、５Ｔ４、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(ＦＡＰアルファ)、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)および上皮細胞接着分子(ＥＰＣＡＭ)から選択される１以上の抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。具体的実施態様において、担体部分はＦＡＰアルファまたは５Ｔ４に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである。
【0041】
他の態様において、本発明は、本プロドラッグまたは融合分子をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび発現ベクターを含む宿主細胞(例えば、ＣＨＯ、ＮＳ０細胞および２９３Ｔ細胞などの哺乳動物宿主細胞)を提供する。本発明はまた本プロドラッグまたは融合分子を製造する方法であって、哺乳動物宿主細胞を、プロドラッグまたは融合分子の発現を可能とする条件下で培養し、プロドラッグまたは融合分子を単離することを含む、方法も提供する。
【0042】
本発明はまた、処置を必要とする患者(例えば、ヒト患者)における癌もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系を刺激する方法であって、患者に治療有効量の本発明のサイトカインプロドラッグまたは医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。患者は、例えば、ウイルス感染(例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＰＶ感染)または乳癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌および胃癌からなる群から選択される癌を有し得る。またここに提供されるのは、本方法における癌もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激に使用するためのサイトカインプロドラッグ；本方法における癌もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激のための医薬の製造のための、サイトカインプロドラッグの使用；および本サイトカインプロドラッグを１投与単位以上含む、製品(例えば、キット)である。
【0043】
またここに提供されるのは、本方法における癌もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激に使用するためのプロドラッグ；本方法における癌もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激のための医薬の製造のためのプロドラッグの使用；および本プロドラッグを１投与単位以上含む、製品(例えば、キット)である。
【0044】
本発明の他の特性、目的および利点は、次の詳細な記載から明らかとなる。しかしながら、詳細な記載は本発明の実施態様および態様を示すが、単なる説明として提供され、限定ではないことは理解されるべきである。本発明の範囲内の種々の変更および修飾が、詳細な記載から当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【図1】図１Ａ～Ｅは、担体が抗体であるヘテロ二量体サイトカインプロドラッグを示す。図１Ａは、担体が２個の軽鎖および２個の重鎖を有する典型的抗体である、プロドラッグを説明する。図１Ｂは、担体として二特異的抗体を有するプロドラッグを記載し、ここで、各抗原結合部分はＦａｂドメインを含む一つの抗原結合部分およびｓｃＦｖを含む第二の抗原結合部分を有する単量体または単一ドメイン抗体である。図１Ｃは、担体として二特異的抗体を有するプロドラッグを示し、ここで、各抗原結合部分は二量体である。図１Ｄは、ポリペプチド鎖の一方でＦａｂドメインおよびポリペプチド鎖の他方でサイトカインペプチドに融合した二量体Ｆｃドメインを有するプロドラッグを示す。サイトカインは、Ｎ末端を介してマスキング部分に融合される。図１Ｅ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｓ ポリペプチド鎖の一方でＦａｂドメインおよびポリペプチド鎖の他方でサイトカインペプチドに融合した二量体Ｆｃドメインを有するプロドラッグ。マスキング部分は、Ｎ末端を介してサイトカインペプチドに融合される。
【0046】
【0047】
【図3】図３は、プロテアーゼＭＭＰ２および対照分子による活性化前後のＩＬ－２１プロドラッグのＮＫ－９２細胞ベースの生物学的活性アッセイの結果を示す。ＰＷ０４－３８ αＰＤ１－ＩＬ２１－ａ＊およびＰＷ０９－１６ αＰＤ１－ＩＬ２１－ａ＊マスキング部分としてＩＬ－２１Ｒ α－ＥＣＤを有する抗ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２１である同じ分子の２バッチである；ＰＷ０５－６８ αＰＤ１－ＩＬ２１－ｓｃＦｖはマスキング部分としてｓｃＦｖを有するＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２１プロドラッグである。第一の対照分子ＰＷ０４－６７ αＰＤ１－ＩＬ２１ｎｏ マスクは、マスクがなく、野生型ＩＬ－２１を有する抗ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２１融合分子である。他の対照分子、ＰＷ０９－０２ αＰＤ１－ＩＬ２１ムテインＲ９ＥＲ７６Ａは、マスクがなく、Ｒ９ＥおよびＲ７６Ａアミノ酸置換を有するＩＬ－２１ムテインを有する抗ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２１融合分子である(配列番号１によるナンバリング)。ＰＷ０４－３８ αＰＤ１－ＩＬ２１－ａ＊活性化およびＰＷ０９－１６ αＰＤ１－ＩＬ２１－ａ＊活性化は、いずれもマスクがプロテアーゼにより開裂されている、抗ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２１野生型融合分子である。
【0048】
【0049】
【図5】図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、抗ＰＤ－１抗体(ＰＤ－１)、ｓｃＦｖでマスクされたＦｃ－ＩＬ－１５融合分子(２１５β)、ｓｃＦｖでマスクされた抗ＰＤ１－抗体－ＩＬ－１５融合分子(２１５γ)、マスクがないＦｃ－ＩＬ－１５融合分子(２１５β ｒｅｆ)およびマスクがないＰＤ１－抗体－ＩＬ－１５融合分子(ＰＤ１／ＩＬ１５ムテイン(Ｍ２))で処理後のＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋ Ｔ細胞のＫｉ６７活性化の結果を示す。図５Ａは、ＰＤ－１発現がないＣＤ４＋ Ｔ細胞のＫｉ６７活性化の結果を示す。図５Ｂは、ＰＤ－１発現があるＣＤ４＋ Ｔ細胞のＫｉ６７活性化の結果を示す。図５Ｃは、ＰＤ－１発現がないおよびあるＣＤ４＋ Ｔ細胞での試験品のＥＣ５０値を示す。ＰＤ－１発現がないおよびあるＣＤ４＋ Ｔ細胞間でのＥＣ５０値の変化倍率も示す。
【0050】
【0051】
【図7】図７は、「シス結合」を介するプロドラッグ活性化の新規機構を示す。標的細胞(右)は、担体部分により標的とされる抗原およびサイトカイン部分の受容体両者を発現する。プロドラッグの細胞表面の抗原への結合は、プロドラッグを細胞のサイトカイン受容体に近づけ、サイトカイン受容体がマスキング部分と効率的に競合し、置き換わり、結合したサイトカイン受容体による細胞シグナル伝達に至ることを可能とする。マスクを外し、プロドラッグを活性化するためにマスキング部分のプロテアーゼ切断は必要ではない。サイトカイン受容体を発現するが、抗原は発現しない細胞で(左)、プロドラッグのサイトカイン部分は、マスクされ、不活性なままである。
【発明を実施するための形態】
【0052】
発明の詳細な記載
ここでおよび添付する特許請求の範囲で使用される単数表現は、文脈が明確に異なる指示をしない限り、複数表現を含む。
ここでおよび添付する特許請求の範囲で使用される単数表現は、文脈が明確に異なる指示をしない限り、複数表現を含む。
【0053】
ここでの「約」を付した数値またはパラメータは、その数値またはパラメータ自体を含む(および記載する)。例えば、「約Ｘ」なる記載は、「Ｘ」を含む。さらに、何らかの一連の数値の前の「約」の使用は、その一連の数値各々の「約」を含む。例えば、「約Ｘ、ＹまたはＺ」なる記載は、「約Ｘ、約Ｙまたは約Ｚ」を意味する。
【0054】
用語「抗原結合部分」は、抗体(例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体、二重特異的または二特異的抗体、抗イディオタイプ抗体または二機能性ハイブリッド抗体)またはその抗原結合フラグメント(例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体(ｄＡｂ)または二重特異性抗体、一本鎖抗体およびイムノアドヘシンなどのＦｃ含有ポリペプチド)を含むが、これらに限定されない抗原に結合するポリペプチドまたは一組の相互作用ポリペプチドをいう。ある実施態様において、抗体は、あらゆる重鎖アイソタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ)またはサブタイプ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４)であり得る。ある実施態様において、抗体は、あらゆる軽鎖アイソタイプ(例えば、カッパまたはラムダ)であり得る。抗体は、ヒト、非ヒト(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたは他の非ヒト動物由来)、キメラ(例えば、非ヒト可変領域およびヒト定常領域を有する)またはヒト化(例えば、非ヒトＣＤＲおよびヒトフレームワークおよび定常領域を有する)であり得る。ある実施態様において、抗体は、誘導体化抗体である。
【0055】
ここで使用する、２分子間の相互作用下における用語「に対する」、「に結合する」または「に特異的に結合する」は、当分野における一般的方法(例えば、表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡなど)により測定して、結合が１０００nMを超えない(例えば、１００nM、１０nMまたは１nMを超えない；例えば１nM、１～１０nM、１０～１００nMまたは１００～１０００nM未満)ＫＤを有することを意図する。
【0056】
用語「サイトカインアゴニストポリペプチド」は、野生型サイトカインまたはそのアナログをいう。野生型サイトカインのアナログは、野生型サイトカインと同じ生物学的特異性(例えば、同じ受容体に結合し、同じ標的細胞を活性化)を有するが、アナログの活性レベルは野生型サイトカインのものと異なり得る。アナログは、例えば、野生型サイトカインのムテイン(すなわち、変異ポリペプチド)であってよく、野生型サイトカインに対して少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の変異を含み得る。
【0057】
用語「サイトカインアンタゴニスト」、「マスキング部分」または「サイトカインマスク」は、サイトカインに結合し、それによりアンタゴニストまたはマスクに結合されている間、サイトカインが標的細胞表面のその受容体に結合するおよび／または生物学的機能を発揮するのを阻害する、部分(例えば、ポリペプチド)をいう。サイトカインアンタゴニストまたはマスクの例は、サイトカインと接触するサイトカインの細胞外ドメイン由来のポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【0058】
用語「有効量」または「治療有効量」は、特定した障害、状態または疾患の処置に十分である化合物または組成物の量をいう(例えば、その症状の１以上の好転、緩和、低減および／または遅延)。癌などの疾患に関して、有効量は、癌進展または進行の遅延(例えば、腫瘍増殖速度の減少および／または腫瘍血管形成、転移または末梢臓器への癌細胞浸潤の遅延または阻止)、類上皮細胞数減少、癌退縮誘導(例えば、腫瘍の縮小または根絶)および／または予防または発癌もしくは再発の遅延のために十分な量であり得る。有効量は、１用量以上で投与され得る。
【0059】
用語「機能的アナログ」は、対照分子と同じ生物学的特異性(例えば、同じリガンドに結合)および／または活性(例えば、標的細胞活性化または阻害)を有する分子をいう。
【0060】
２個のポリペプチド配列に関連する用語「融合」または「融合体」は、主鎖ペプチド結合を介する２個のポリペプチド配列の連結をいう。２個のポリペプチドは、直接または１以上のアミノ酸長であるペプチドリンカーを介して融合され得る。融合ポリペプチドは、２個の融合パートナーの各コード配列を、その間のペプチドリンカーをコードする配列を伴いまたは伴わずに、当該コード配列から、組み換え技術により産生され得る。ある実施態様において、融合は化学的結合(conjugation)を含む。
【0061】
用語「薬学的に許容される添加物」は、組成物中の成分ついて使用されるとき、該添加物がヒト対象を含む対象の処置のために、対象に過度の有害な副作用を伴わず、かつ活性医薬成分(ＡＰＩ)の生物学的活性に影響することなく、投与するのに適するものを意味する。
【0062】
用語「プロドラッグ」は、インビトロまたは循環中は不活性または低活性であり、他方その活性が疾患部位で増加する、治療分子をいう。
【0063】
用語「対象」は哺乳動物を言い、ヒト、ペット(例えば、イヌまたはネコ)、家畜(例えば、ウシまたはウマ)、齧歯類または霊長類を含むが、これらに限定されない。
【0064】
ここで使用する、「処置」または「処置する」は、有益なまたは所望の臨床的結果を得るためのアプローチである。有益なまたは所望の臨床的結果は、次の、疾患に由来する１以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患状態の好転、疾患の安定(例えば、疾患悪化または進行の予防または遅延)、疾患拡散(例えば、転移)の予防または遅延、疾患再発の予防または遅延、疾患の部分的または完全寛解の提供、疾患の処置に必要な１以上の他の医薬の用量の減少、患者のクオリティ・オブ・ライフの改善および／または生存期間の延長の１以上を含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、処置のこれら態様の何れか１以上を意図する。
【0065】
ここに記載する種々の実施態様の性質の１個、一部または全てを組み合わせて、本発明の他の実施態様を形成し得ることは理解される。ここで使用するセクションの見出しは、記載事項の整理のみを目的するものあり、その見出しのもとに記載される主題を限定すると解釈してはならない。
【0066】
Ｉ. サイトカインプロドラッグ
本発明は、疾患部位でより活性となるサイトカインプロドラッグを提供する。プロドラッグは、サイトカインアゴニストポリペプチド(サイトカイン部分)、担体部分およびマスキング部分を含む。サイトカイン部分は、ペプチドリンカー(例えば、開裂不可能ペプチドリンカー)を伴いまたは伴わずに担体部分に連結され、マスキング部分によりマスク(結合)される。マスキング部分は、ペプチドリンカー(例えば、開裂不可能ペプチドリンカー)を伴いまたは伴わずにサイトカイン部分または担体部分に連結され得る。あるいは、サイトカイン部分は、ペプチドリンカー(例えば、開裂不可能ペプチドリンカー)を伴いまたは伴わずに、マスキング部分に連結され、これは、次に、ペプチドリンカー(例えば、開裂不可能ペプチドリンカー)を伴いまたは伴わずに、担体部分に連結される。
本発明は、疾患部位でより活性となるサイトカインプロドラッグを提供する。プロドラッグは、サイトカインアゴニストポリペプチド(サイトカイン部分)、担体部分およびマスキング部分を含む。サイトカイン部分は、ペプチドリンカー(例えば、開裂不可能ペプチドリンカー)を伴いまたは伴わずに担体部分に連結され、マスキング部分によりマスク(結合)される。マスキング部分は、ペプチドリンカー(例えば、開裂不可能ペプチドリンカー)を伴いまたは伴わずにサイトカイン部分または担体部分に連結され得る。あるいは、サイトカイン部分は、ペプチドリンカー(例えば、開裂不可能ペプチドリンカー)を伴いまたは伴わずに、マスキング部分に連結され、これは、次に、ペプチドリンカー(例えば、開裂不可能ペプチドリンカー)を伴いまたは伴わずに、担体部分に連結される。
【0067】
担体部分は標的細胞(例えば、腫瘍細胞または免疫細胞)の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。ある実施態様において、担体は抗体を含む。例えば、図１Ａ参照。ある実施態様において、担体部分は、図１Ｂおよび１Ｃに説明するとおり、２個の異なる抗原に結合する二特異的抗体を含む。
【0068】
マスキング部分は、例えば、サイトカイン受容体の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含んでよく、ここで、ＥＣＤは、サイトカイン部分(例えば、図１Ｄおよび１Ｅ参照)および／または開裂不可能リンカーを介して担体部分(例えば、図１Ａ～Ｃおよび１Ｅ参照)に連結される。マスクは、サイトカイン部分に結合し、生物学的機能を阻害する。これらプロドラッグは、細胞表面に発現するサイトカイン受容体および抗原の「シス結合」を介して標的細胞に結合し、マスキング部分の切断および除去なく、プロドラッグの活性を増加させ得る。プロドラッグのサイトカイン部分は、担体により標的とされる抗原およびサイトカインの受容体両者が同じ細胞で発現されるところである、標的部位(例えば、腫瘍部位または周囲環境)で活性を増加させ得る。このようなプロドラッグの例を図１Ａ～Ｅに示し、「シス結合」作用機構を図７に示す。
【0069】
Ａ. プロドラッグのサイトカイン部分
ある実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含む。ある実施態様において、ＩＬ－２アゴニストポリペプチドは、変異Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２ＡまたはＦ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇを有するＩＬ－２ムテインである(ナンバリングは配列番号６による)。ある実施態様において、本発明のＩＬ－２ムテインは、Ｔ３、Ｄ２０、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｌ７２、Ａ７３、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｃ１２５およびＱ１２６に変異を含み得る(ナンバリングは配列番号６による)。ある実施態様において、新規ＩＬ－２ムテインは、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５およびＡ７３に変異を含む(ナンバリングは配列番号６による)。
ある実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含む。ある実施態様において、ＩＬ－２アゴニストポリペプチドは、変異Ｒ３８Ｓ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｅ６２ＡまたはＦ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇを有するＩＬ－２ムテインである(ナンバリングは配列番号６による)。ある実施態様において、本発明のＩＬ－２ムテインは、Ｔ３、Ｄ２０、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｌ７２、Ａ７３、Ｎ８８、Ｎ９０、Ｃ１２５およびＱ１２６に変異を含み得る(ナンバリングは配列番号６による)。ある実施態様において、新規ＩＬ－２ムテインは、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５およびＡ７３に変異を含む(ナンバリングは配列番号６による)。
【0070】
ある実施態様において、プロドラッグのサイトカイン部分は、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含む。ある実施態様において、ヒトＩＬ－１５ポリペプチドは、Ｎ１Ａ、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ａ、Ｎ４Ｄ、Ｉ６Ｔ、Ｓ７Ａ、Ｄ８Ａ、Ｄ８Ｔ、Ｄ８Ｅ、Ｄ８Ｎ、Ｋ１０Ａ、Ｋ１０Ｄ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｄ、Ｅ４６、Ｖ４９、Ｌ４５、Ｓ５１、Ｌ５２、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｔ６２Ｌ、Ｔ６２Ａ、Ｅ６４Ａ、Ｅ６４Ｌ、Ｅ６４Ｋ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｌ、Ｎ６５Ｄ、Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｉ６７Ｅ、Ｉ６８Ｓ、Ｉ６８Ｅ、Ｌ６９Ｓ、Ｌ６９Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｄ、Ｖ６３Ｅ、Ｖ６３Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｌ６６Ｄ、Ｉ６７Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１１２Ａ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８ＥおよびＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄから選択される１以上の変異を含む(ナンバリングは配列番号７による)。ある実施態様において、ＩＬ－１５プロドラッグはさらにスシドメインを含む。ある実施態様において、スシドメインは配列番号８のまたは配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0071】
ある実施態様において、サイトカイン部分はＩＬ－２１アゴニストポリペプチドを含む。ある実施態様において、ＩＬ－２１アゴニストポリペプチドは、野生型ヒトＩＬ－２１(例えば、配列番号１)などの野生型ＩＬ－２１ポリペプチドまたはヒトＩＬ－２１由来のＩＬ－２１ムテイン、例えば、配列番号２～５から選択されるアミノ酸配列のものであり得る。ＩＬ－２１ムテインは、野生型ＩＬ－２１と比較して、ＩＬ－２１ＲαまたはＩＬ－２１ＲαＲγに対する親和性が有意に減少されていてよい。ある実施態様において、ＩＬ－２１ムテインは、野生型ＩＬ－２１と比較して、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、３００倍、５００倍、１,０００倍または１０,０００倍低い、高親和性ＩＬ－２Ｒαに対する結合親和性を有する。特に断らない限り、ここに記載するＩＬ－２１およびＩＬ－２１ムテインの全残基番号は、配列番号１のナンバリングによる。
【0072】
Ｂ. プロドラッグのマスキング部分
本プロドラッグのマスキング部分は、プロドラッグのサイトカイン部分に結合し、サイトカイン部分をマスキングし、その生物学的機能を阻害するペプチドまたは抗体または抗体フラグメントを含む。ある実施態様において、マスキング部分は、開裂不可能ペプチドリンカーを介して、プロドラッグの残りに作動的に連結される。
本プロドラッグのマスキング部分は、プロドラッグのサイトカイン部分に結合し、サイトカイン部分をマスキングし、その生物学的機能を阻害するペプチドまたは抗体または抗体フラグメントを含む。ある実施態様において、マスキング部分は、開裂不可能ペプチドリンカーを介して、プロドラッグの残りに作動的に連結される。
【0073】
例として、プロドラッグはＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分は、ＩＬ－２に結合し、ＩＬ－２のその同族受容体への結合を妨害するペプチドまたは抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む。ある実施態様において、マスキング部分はマスクされている間ＩＬ－２部分の生物学的活性を低減する。ある実施態様において、ＩＬ－２アンタゴニストは、ヒトＩＬ－２ＲβまたはヒトＩＬ－２Ｒγ(例えば、配列番号１１または１３)由来のものなどのＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒγ細胞外ドメインまたはその機能的アナログを含む。ある実施態様において、ＩＬ－２マスキング部分はペプチドライブラリースクリーニングを介して同定されたペプチドを含む。ある実施態様において、ＩＬ－２マスキング部分はＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインのＩＬ－２受容体への結合を遮断する抗体またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－２に対する抗体のｓｃＦｖを含む。ある実施態様において、マスキング部分は配列番号２２または２３のまたは配列番号２２または２３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0074】
他の例として、プロドラッグはＩＬ－２１アゴニストポリペプチドを含み、マスキング部分は、ＩＬ－２１に結合し、ＩＬ－２１のその同族受容体への結合を妨害するペプチドまたは抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む。ある実施態様において、マスキング部分はマスクされている間ＩＬ－２１部分の生物学的活性を低減する。ある実施態様において、ＩＬ－２１アンタゴニストは、ヒトＩＬ－２１ＲαまたはヒトＩＬ－２１Ｒγ(例えば、配列番号１２または１３)由来のものなどのＩＬ－２１ＲαまたはＩＬ－２１Ｒγ細胞外ドメインまたはその機能的アナログを含む。ある実施態様において、ＩＬ－２１マスキング部分はペプチドライブラリースクリーニングを介して同定されたペプチドを含む。ある実施態様において、ＩＬ－２１マスキング部分はＩＬ－２１またはＩＬ－２１ムテインのＩＬ－２１受容体への結合を遮断する抗体またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－２１に対する抗体のｓｃＦｖを含む。ある実施態様において、マスキング部分は配列番号２０または２１のまたは配列番号２０または２１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0075】
他の例として、プロドラッグは、ＩＬ－７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－９アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１αアゴニストポリペプチド、ＩＬ－１βアゴニストポリペプチド、ＩＬ－４アゴニストポリペプチド、ＩＬ－５アゴニストポリペプチド、ＩＬ－６アゴニストポリペプチド、ＩＬ－８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１０アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３１アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３６アゴニストポリペプチド、インターフェロン－アルファアゴニストポリペプチド、インターフェロンガンマアゴニストポリペプチド、４－１ＢＢリガンド、ＯＸ－４０リガンドおよびＣＤ－４０リガンドから選択されるサイトカインを含むが、これらに限定されないここに開示するあらゆるサイトカインのマスキング部分を含む。
【0076】
Ｃ. プロドラッグの担体部分
本プロドラッグの担体部分は、抗原結合ドメインおよび所望により他のドメインを含む。担体部分はサイトカインアゴニストポリペプチドの血清半減期などのＰＫプロファイルを改善し、サイトカインアゴニストポリペプチドを腫瘍部位などの体内の標的部位にも向ける。
本プロドラッグの担体部分は、抗原結合ドメインおよび所望により他のドメインを含む。担体部分はサイトカインアゴニストポリペプチドの血清半減期などのＰＫプロファイルを改善し、サイトカインアゴニストポリペプチドを腫瘍部位などの体内の標的部位にも向ける。
【0077】
１. 担体部分の抗原結合ドメイン
担体部分は抗原結合ドメインを含み、抗体またはその抗原結合フラグメントまたはイムノアドヘシンであり得る。ある実施態様において、抗原結合担体部分は、２個の重鎖および２個の軽鎖を有する完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、ナノボディまたは一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある実施態様において、抗原結合部分は二特異的抗原結合部分であり、２個の異なる抗原または同じ抗原の２個の異なるエピトープに結合できる。抗原結合部分は、サイトカインアゴニストポリペプチドに相加的および相乗的となり得る治療有効性を提供する。
担体部分は抗原結合ドメインを含み、抗体またはその抗原結合フラグメントまたはイムノアドヘシンであり得る。ある実施態様において、抗原結合担体部分は、２個の重鎖および２個の軽鎖を有する完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、ナノボディまたは一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある実施態様において、抗原結合部分は二特異的抗原結合部分であり、２個の異なる抗原または同じ抗原の２個の異なるエピトープに結合できる。抗原結合部分は、サイトカインアゴニストポリペプチドに相加的および相乗的となり得る治療有効性を提供する。
【0078】
サイトカインアゴニストポリペプチドおよびそのマスクは、抗原結合部分の軽鎖および／または重鎖のＮ末端またはＣ末端に融合し得る。例として、ＩＬ－２１アゴニストポリペプチドおよびそのマスクは、抗体重鎖もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗体軽鎖もしくはその抗原結合フラグメントに融合され得る。ある実施態様において、ＩＬ－２１アゴニストポリペプチドの一端は抗体の重鎖の一方または両方のＣ末端に融合され、ＩＬ－２１マスクは、開裂不可能ペプチドリンカーを介してＩＬ－２１アゴニストポリペプチドの他端に融合される。ある実施態様において、ＩＬ－２１アゴニストポリペプチドは抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合され、ＩＬ－２１マスクは開裂不可能ペプチドリンカーを介して抗体の他方の重鎖のＣ末端に融合され、ここで、２個の重鎖は、２個の異なる重鎖の特異的ペアリングを可能とする変異を含む。
【0079】
ヘテロ二量体を形成する戦略は周知である(例えば、Spies et al., Mol Imm. (2015) 67(2)(A):95-106参照)。例えば、プロドラッグの２個の重鎖ポリペプチドは、「ノブ・イントゥ・ホール」変異を介して安定なヘテロ二量体を形成し得る。「ノブ・イントゥ・ホール」変異は、抗体重鎖のヘテロ二量体の形成を促進するためになされ、二特異的抗体の製造に一般的に使用される(、例えば、米国特許８,６４２,７４５参照)。例えば、抗体のＦｃドメインは「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異を含み得る。ＣＨ３ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋も、例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ変異を導入することにより、用い得る(例えば、Merchant et al., Nature Biotech (1998) 16:677-81参照)。他の実施態様において、抗体部分は、２個のＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異および他方のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異を含み得る。ある実施態様において、抗体部分は、２個のＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異および他方のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ(またはＥ３５６Ｃ)、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異、そしてＣＨ３ドメインの一方にさらなるＹ３４９Ｃ変異および他方のＣＨ３ドメインにさらなるＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ変異を含み得て、鎖間ジスルフィド架橋を形成する(ナンバリングは常にKabatのEU indexによる；Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載のものなどの他のノブ・イントゥ・ホール技術を、これとは別にまたはこれに加えて使用できる。故に、抗体部分のノブ・イントゥ・ホール変異の他の例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ／Ｋ３７０Ｅ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ変異を有することである(ＥＵナンバリング)。
【0080】
ある実施態様において、プロドラッグの抗原結合部分は、ＦｃドメインにＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(「ＬＡＬＡ」)変異を含む抗体である。ＬＡＬＡ変異は、補体結合および固定ならびにＦｃγ依存的ＡＤＣＣを排除する(例えば、Hezareh et al. J. Virol. (2001) 75 (24):12161-8参照)。さらなる実施態様において、ノブ・イントゥ・ホール変異に加えてＬＡＬＡ変異が抗体部分に存在する。
【0081】
ある実施態様において、抗原結合部分はＦｃドメインにＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ(「ＹＴＥ」)変異を含む抗体である。ＹＴＥ変異は、血清半減期、組織分布およびＩｇＧ１活性の同時調節を可能とする(Dall’Acqua et al., J Biol Chem. (2006) 281:23514-24;およびRobbie et al., Antimicrob Agents Chemother. (2013) 57(12):6147-53参照)。さらなる実施態様において、ノブ・イントゥ・ホール変異に加えてＹＴＥ変異が抗体に存在する。具体的実施態様において、抗体は、ＹＴＥ、ＬＡＬＡおよびノブ・イントゥ・ホール変異またはこれらの何れかの組み合わせを含む。
【0082】
具体的実施態様において、抗原結合部分は免疫細胞などの標的細胞の表面の抗原に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。免疫細胞は当分野で周知である。免疫細胞の非限定的例は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージを含む。抗原結合部分は、免疫細胞を活性化し、その抗癌活性を増強する能力を有し得る。抗体はＡＤＣＣ活性を有しても有していなくてもよい。抗原結合部分は、さらに細胞毒性薬物にコンジュゲートもし得る。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４またはＴＧＦ－ベータに結合し得る。他の実施態様において、抗原結合部分は、腫瘍細胞などの標的細胞の表面の抗原に結合し得る。例えば、抗原結合部分は、ＦＡＰアルファ、５Ｔ４、Ｔｒｏｐ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＨＥＲ－２、ＥＧＦＲ、クローディン１８.２、ＤＬＬ－３、ＧＣＰ３または癌胎児性抗原(ＣＥＡ)に結合し得る。
【0083】
ある実施態様において、抗原結合部分は、グアニル酸シクラーゼＣ(ＧＣＣ)、炭水化物抗原１９－９(ＣＡ１９－９)、糖タンパク質Ａ３３(ｇｐＡ３３)、ムチン１(ＭＵＣ１)、インシュリン様増殖因子１受容体(ＩＧＦ１－Ｒ)、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２(ＨＥＲ２)、ヒト上皮細胞増殖因子受容体３(ＨＥＲ３)、デルタ様タンパク質３(ＤＬＬ３)、デルタ様タンパク質４(ＤＬＬ４)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、グリピカン－３(ＧＰＣ３)、ｃ－ＭＥＴ、血管内皮細胞増殖因子受容体１(ＶＥＧＦＲ１)、血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)、ネクチン－４、Ｌｉｖ－1、糖タンパク質ＮＭＢ(ＧＰＮＭＢ)、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)、Ｔｒｏｐ－２、炭酸脱水酵素IX(ＣＡ９)、エンドセリンＢ受容体(ＥＴＢＲ)、前立腺の６回膜貫通上皮抗原１(ＳＴＥＡＰ１)、葉酸受容体アルファ(ＦＲ－α)、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質６(ＳＬＩＴＲＫ６)、炭酸脱水酵素VI(ＣＡ６)、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３(ＥＮＰＰ３)、メソテリン、栄養芽細胞糖タンパク質(ＴＰＢＧ)、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ３５２、ＣＤ４７、シグナル制御タンパク質アルファ(ＳＩＲＰα)、クローディン１８.２、クローディン６、ＢＣＭＡまたはＥＰＣＡＭに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＤＬＬ３の上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)様ドメインに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＤＬＬ３のデルタ／Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｌａｇ２(ＤＳＬ)様ドメインに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＧＰＣ３の３７４番目のアミノ酸の後ろに位置するエピトープに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＧＰＣ３のヘパリン硫酸グリカンに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分はクローディン１８.２に結合し、クローディン１８.１に結合しない。ある実施態様において、抗原結合部分は、クローディン１８.２より少なくとも１０倍弱い結合親和性でクローディン１８.１に結合する。
【0084】
抗原結合部分の例は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化バージョン)、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化バージョン)、抗ｄＰＮＡＧ抗体Ｆ５９８およびその抗原結合フラグメントに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブまたはパニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化バージョン)、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化バージョン)、抗ｄＰＮＡＧ抗体Ｆ５９８またはそのフラグメントと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある実施態様において、抗原結合部分はトラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化バージョン)、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化バージョン)、抗ｄＰＮＡＧ抗体Ｆ５９８またはそのフラグメントの抗体重鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する抗体重鎖を含む。ある実施態様において、抗原結合部分はトラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化バージョン)、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化バージョン)、抗ｄＰＮＡＧ抗体Ｆ５９８またはそのフラグメントの抗体軽鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する抗体軽鎖を有する。抗原結合部分は、ＩＬ－２アゴニストポリペプチドに融合される。ある実施態様において、抗原結合部分はトラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６または抗ｄＰＮＡＧ抗体Ｆ５９８の６個の相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。
【0085】
いくつかのＣＤＲ標記が当分野で知られ、ここに包含される。当業者は、重鎖または軽鎖可変領域の配列に基づき、ＣＤＲを容易に決定できる。「Kabat」ＣＤＲ標記は、配列変動性に基づき、最も一般に使用される(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「Chothia」ＣＤＲ標記は、構造ループを参照する(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. (1987) 196:901-917)。「ＡｂＭ」ＣＤＲ標記は、Kabat CDRとChothia構造ループの間の妥協点を表し、Oxford Molecular’s AbMは抗体モデリングソフトウェアで使用される。「Contact」ＣＤＲ標記は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。これらＣＤＲの各々からの残基を下表１に、一般的抗体ナンバリングスキームを引用して記載する。ここで特に断らない限り、抗体のＣＤＲアミノ酸番号は、Kabat、Chothia、ＡｂＭまたはContactスキームを引用してなされたときを含み、Kabat et al., supraに記載のKabatナンバリングスキームを引用する。このナンバリングシステムを使用して、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク領域(ＦＲ)またはＣＤＲの短縮または挿入に対応する、少ないまたは多いアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一アミノ酸挿入(Kabatによる残基５２ａ) および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えば、Kabatによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど)を含み得る。ある抗体について残基のKabatナンバリングは、「標準」Kabat番号付けされた配列を有する抗体と、配列の相同性の領域を整列することにより決定され得る。
【表1】
【0086】
ある実施態様において、ＣＤＲは、「拡張ＣＤＲ」であり、異なるスキームに従い開始または終了する領域を包含する。例えば、拡張ＣＤＲは次のとおりであり得る：Ｌ２４－Ｌ３６、Ｌ２６－Ｌ３４またはＬ２６－Ｌ３６(ＶＬ－ＣＤＲ１)；Ｌ４６－Ｌ５２、Ｌ４６－Ｌ５６またはＬ５０－Ｌ５５(ＶＬ－ＣＤＲ２)；Ｌ９１－Ｌ９７(ＶＬ－ＣＤＲ３)； Ｈ４７－Ｈ５５、Ｈ４７－Ｈ６５、Ｈ５０－Ｈ５５、Ｈ５３－Ｈ５８またはＨ５３－Ｈ６５(ＶＨ－ＣＤＲ２)；および／またはＨ９３－Ｈ１０２(ＶＨ－ＣＤＲ３)。
【0087】
ある実施態様において、抗原結合部分はＰＤＬ１に結合し、配列番号４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖またはそのフラグメントおよび配列番号４６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは配列番号４５からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号４６からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0088】
ある実施態様において、抗原結合部分はＰＤ－１に結合し、配列番号４４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖またはそのフラグメントおよび配列番号４７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは配列番号４４からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号４７からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0089】
ある実施態様において、抗原結合部分はＰＤ－１に結合し、配列番号４８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖またはそのフラグメントおよび配列番号４９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗原結合ドメインは配列番号４８からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および配列番号４９からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0090】
ある実施態様において、抗原結合部分は１個、２個または３個の抗原結合ドメインを含む。例えば、抗原結合部分は二特異的であり、ＣＤ３、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、５Ｔ４、ＦＡＰアルファ、Ｔｒｏｐ－２、ＧＰＣ３、ＶＥＧＦＲ２、クローディン１８.２およびＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される２個の異なる抗原に結合する。ある実施態様において、二特異的抗原結合部分は、ＨＥＲ２の２個の異なるエピトープに結合する。他の実施態様において、抗原結合部分は二特異的であり、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４７、ＣＤ３、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３およびＴＩＧＩＴから選択される２個の異なる抗原に結合する。
【0091】
２. 担体部分の他のドメイン
担体部分は、抗原結合性ではない他のドメインも含み得る。例えば、抗体Ｆｃドメイン(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ)、ポリマー(例えば、ＰＥＧ)、アルブミン(例えば、ヒトアルブミン)またはそのフラグメントまたはナノ粒子が使用され得る。
担体部分は、抗原結合性ではない他のドメインも含み得る。例えば、抗体Ｆｃドメイン(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ)、ポリマー(例えば、ＰＥＧ)、アルブミン(例えば、ヒトアルブミン)またはそのフラグメントまたはナノ粒子が使用され得る。
【0092】
例として、サイトカインアゴニストポリペプチド(例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－５またはここに開示するあらゆるサイトカイン)およびそのアンタゴニストを抗体Ｆｃドメインに融合して、Ｆｃ融合タンパク質を形成し得る。ある実施態様において、サイトカインアゴニストポリペプチドは、Ｆｃドメインポリペプチド鎖の一方のＣ末端またはＮ末端に融合(直接またはペプチドリンカーを介して)され、サイトカインマスクは開裂可能ペプチドリンカーを介して他方のＦｃドメインポリペプチド鎖の対応するＣ末端またはＮ末端に融合され、ここで、２個のＦｃドメインポリペプチド鎖は、２個の異なるＦｃ鎖の特異的ペアリングを可能とする変異を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは上記ホール・イントゥ・ホール変異を含む。さらなる実施態様において、Ｆｃドメインは上記ＹＴＥおよび／またはＬＡＬＡ変異も含み得る。
【0093】
プロドラッグの担体部分は、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)またはそのフラグメントを含み得る。ある実施態様において、担体部分は、約１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１２０以上、１４０以上、１６０以上、１８０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上または５５０以上のアミノ酸長であるアルブミンフラグメント(例えば、ヒト血清アルブミンフラグメント)を含む。ある実施態様において、アルブミンフラグメントは、約１０アミノ酸～約５８４アミノ酸長(例えば約１０～約２０、約２０および約４０、約４０および約８０、約８０および約１６０、約１６０および約２５０、約２５０および約３５０、約３５０および約４５０または約４５０および約５５０アミノ酸長)である。ある実施態様において、アルブミンフラグメントは、Ｓｕｄｌｏｗ ＩドメインまたはそのフラグメントまたはＳｕｄｌｏｗ IIドメインまたはそのフラグメントを含む。
【0094】
Ｄ. プロドラッグのリンカー要素
サイトカインアゴニストポリペプチドは、ペプチドリンカーを伴いまたは伴わずに担体部分と融合され得る。ペプチドリンカーは、開裂不可能である。ある実施態様において、ペプチドリンカーは配列番号２７～３４から選択される。具体的実施態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号３０)を含む。
サイトカインアゴニストポリペプチドは、ペプチドリンカーを伴いまたは伴わずに担体部分と融合され得る。ペプチドリンカーは、開裂不可能である。ある実施態様において、ペプチドリンカーは配列番号２７～３４から選択される。具体的実施態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号３０)を含む。
【0095】
マスキング部分を、開裂不可能リンカーを介してまたはペプチドリンカーを用いずにサイトカイン部分または担体に融合し得る。
【0096】
II. 医薬組成物
本発明のプロドラッグおよびムテイン(すなわち、活性医薬成分またはＡＰＩ)を含む医薬組成物は、所望の純度を有するＡＰＩと、１以上の任意の薬学的に許容される添加物(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition., Osol, A. Ed. (1980)参照)の混合により凍結乾燥製剤または水溶液に調製され得る。薬学的に許容される添加物(または担体)は、一般に用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、例えば、リン酸、クエン酸、スクシネート、ヒスチジン、酢酸または他の無機または有機酸またはその塩を含む、緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール)；低分子量(約１０残基未満の)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン；スクロース、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えばナトリウム；金属錯体(例えばＺｎ－タンパク質錯体)；および／または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含むが、これらに限定されない。
本発明のプロドラッグおよびムテイン(すなわち、活性医薬成分またはＡＰＩ)を含む医薬組成物は、所望の純度を有するＡＰＩと、１以上の任意の薬学的に許容される添加物(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition., Osol, A. Ed. (1980)参照)の混合により凍結乾燥製剤または水溶液に調製され得る。薬学的に許容される添加物(または担体)は、一般に用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、例えば、リン酸、クエン酸、スクシネート、ヒスチジン、酢酸または他の無機または有機酸またはその塩を含む、緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール)；低分子量(約１０残基未満の)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン；スクロース、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えばナトリウム；金属錯体(例えばＺｎ－タンパク質錯体)；および／または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含むが、これらに限定されない。
【0097】
緩衝液は、特に、安定性がｐＨ依存的であるとき、治療有効性を最適化する範囲にｐＨを制御するために使用される。緩衝液は、好ましくは約５０mM～約２５０mMの範囲の濃度で存在する。本発明で使用するための適当な緩衝剤は、有機および無機両方の酸およびその塩、例えばクエン酸、リン酸、琥珀酸、酒石酸、フマル酸、グルコン酸、シュウ酸、乳酸および酢酸を含む。さらに、緩衝液は、ヒスチジンおよびＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩を含み得る。
【0098】
防腐剤は、微生物の成長を遅らせるために使用し、概して０.２％～１.０％(ｗ／ｖ)の範囲で存在する。本発明で使用するための適当な防腐剤は、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムハライド(例えば、クロライド、ブロマイド、アイオダイド)、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノールおよびｍ－クレゾールを含む。
【0099】
等張化剤は、「安定化剤」として知られることもあり、組成物の液体の張性を調節または維持するために使用される。タンパク質および抗体などの大型、荷電生体分子と使用されるとき、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより分子間および分子内相互作用の可能性を低減できるため、しばしば「安定化剤」と称される。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０.１％～２５重量％またはそれ以上、好ましくは１％～５重量％のある量で存在し得る。好ましい等張化剤は、多価糖アルコール、好ましくは三価またはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールを含む。
【0100】
非イオン性界面活性剤または界面活性剤(「湿潤剤」としても知られる)は、治療剤の可溶化を助け、治療タンパク質を撹拌誘導凝集に対して保護するために存在し、また製剤が活性治療タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく剪断表面ストレスにさらされることを可能とする。非イオン性界面活性剤は、約０.０５mg／ml～約１.０mg／ml、好ましくは約０.０７mg／ml～約０.２mg／mlの範囲で存在する。
【0101】
適当な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート(２０、４０、６０、６５、８０など)、ポロキサマー(１８４、１８８など)、プルロニック(登録商標)ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ(登録商標)、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(ＴＷＥＥＮ(登録商標)－２０、ＴＷＥＥＮ(登録商標)－８０など)、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアラート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む。使用できるアニオン性界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホスクシネートおよびジオクチルナトリウムスルホネートを含む。カチオン性界面活性剤は、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含む。
【0102】
医薬担体、添加物または希釈剤の選択は、意図する投与経路および標準的手法を考慮して選択され得る。医薬組成物は、さらに何らかの適当な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤または可溶化剤を含み得る。
【0103】
異なる送達系に依存して、異なる組成物／製剤要件が存在し得る。例として、本発明において有用な医薬組成物は、ミニポンプを使用してまたは粘膜経路により、例えば、経鼻スプレーまたは吸入用エアロゾルとしてまたは摂取可能溶液としてまたは組成物が、例えば、静脈内、筋肉内または皮下経路による送達のための注射用形態で製剤化される非経腸で投与するために製剤化され得る。
【0104】
ある実施態様において、本発明の医薬組成物は凍結乾燥タンパク質製剤である。他の実施態様において、医薬組成物は水性液体製剤であり得る。
【0105】
III. 処置方法
サイトカインプロドラッグおよび融合分子を、抗原結合ドメインにより結合される抗原に依存して、疾患の処置に使用できる。ある実施態様において、サイトカインプロドラッグまたは融合分子は、癌の処置に使用される。ある実施態様において、サイトカインプロドラッグまたは融合分子は、感染の処置に使用される。
サイトカインプロドラッグおよび融合分子を、抗原結合ドメインにより結合される抗原に依存して、疾患の処置に使用できる。ある実施態様において、サイトカインプロドラッグまたは融合分子は、癌の処置に使用される。ある実施態様において、サイトカインプロドラッグまたは融合分子は、感染の処置に使用される。
【0106】
ある実施態様において、対象における疾患(例えば癌、寄生虫感染、ウイルス感染または細菌感染)を処置する方法は、対照に有効量のサイトカインプロドラッグまたは融合分子を投与することを含む。
【0107】
ある実施態様において、癌は固形癌である。ある実施態様において、癌は血液癌または固形腫瘍である。処置し得る癌の例は、白血病、リンパ腫、腎臓癌、膀胱癌、尿路癌、頸部癌、脳癌、頭頸部癌、皮膚癌、子宮癌、精巣癌、食道癌、肝臓癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮細胞癌、前立腺癌、膵臓癌、非小細胞肺癌などの肺癌、胆管癌、乳癌および卵巣癌を含むが、これらに限定されない。
【0108】
ある実施態様において、サイトカインプロドラッグまたは融合分子は、ウイルス感染の処置に使用される。ある実施態様において、ウイルス感染を引き起こすウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)またはヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)である。ある実施態様において、抗原結合部分はウイルス抗原に結合する。
【0109】
ある実施態様において、サイトカインプロドラッグまたは融合分子は、敗血症などの細菌感染の処置に使用される。ある実施態様において、細菌感染を引き起こす細菌は、薬物耐性細菌である。ある実施態様において、抗原結合部分は細菌抗原に結合する。
【0110】
一般に、本医薬組成物の投与量および投与経路は、対象の体格および状態により、標準的手法に従い決定される。ある実施態様において、医薬組成物を、経口、経皮、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、創傷部位への直接適用、手術部位への適用、腹腔内、坐薬、皮下、皮内、経真皮、噴霧化、胸膜内、脳室内、関節内、眼内、頭蓋内または髄腔内を含む、あらゆる経路を介して対象に投与する。ある実施態様において、組成物を、対象に静脈内投与する。
【0111】
ある実施態様において、医薬組成物の投与量は、単回投与または反復投与である。ある実施態様において、用量を、対象に１日１回、１日２回、１日３回または１日４回またはそれ以上投与する。ある実施態様において、週に約１回以上(例えば約２回、３回、４回、５回、６回または７回以上)を投与する。ある実施態様において、医薬組成物を毎週、２週毎、３週毎、４週毎、３週中２週毎週または４週中３週毎週投与する。ある実施態様において、複数用量を数日、数週、数カ月または数年にわたり投与する。ある実施態様において、処置のコースは、約１回以上(例えば約２回、３回、４回、５回、７回、１０回、１５回または２０回以上)である。
【0112】
ここで他に定義しない限り、本発明と関連して使用する、科学的および技術的用語は、当業者に共通して理解される意味を有する。例示的方法および材料を下に記載するが、ここに記載するものに類似するまたは等価な方法および材料も、本発明の実施または試験に使用され得る。矛盾があれば、定義を含む本明細書の記載が優先する。一般に、個々に記載する、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品化学および薬化学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用する命名法および技術は、当分野で周知であり、一般に使用される。酵素反応および精製技術は、当分野で一般に実施されるとおりまたはここに記載するとおり、製造業者の仕様に従い実施する。さらに、文脈から他の解釈が必要ではない限り、単数表現は複数を含み、複数表現は単数を含む。本明細書および実施態様を通して、用語「有する」および「含む」または「有し」、「有して」、「含み」または「含んで」などの変形は、記載する整数または整数の群を含むが、いかなる整数または整数の群も除外しないことを含意すると解釈されるべきである。ここに記載する本発明の態様およびバリエーションは、「からなる」および／または「本質的にからなる」態様およびバリエーションを含むことは理解されるべきである。ここに記載する全ての刊行物および他の参考文献は、引用により全体として本明細書に包含させる。いくつかの文献がここに引用されているが、この引用は、これらの文献が当技術分野における一般的な知識の一部を形成していることを認めるものではない。
【0113】
IV. 例示的実施態様
さらに、本発明の特定の実施態様を以下に記載する。これらの実施態様は本開示に記載される組成物および方法を説明することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
１. サイトカイン部分、マスキング部分および担体部分を含むプロドラッグであって、ここで、
ａ)マスキング部分はサイトカイン部分に結合し、サイトカインの意図される生物学的活性を阻害し；
ｂ)担体部分が細胞の表面に発現される抗原に結合する抗原結合部分を含み；そして
ｃ)マスキング部分が担体部分に開裂不可能ペプチドリンカーを介してまたはペプチドリンカーを伴わず直接的にまたは間接的に連結され；
ここで、プロドラッグの活性が、担体部分により標的とされる抗原およびサイトカインの受容体両者を発現する細胞の刺激について、サイトカインの受容体を発現するが、担体部分により標的とされる抗原を発現しない細胞を刺激する活性より高い、
プロドラッグ。
２. サイトカイン部分、マスキング部分および担体部分を含むプロドラッグであって、ここで、
ａ)マスキング部分はサイトカイン部分に結合し、サイトカインの意図される生物学的活性を阻害し；
ｂ)担体部分が細胞の表面に発現される抗原に結合する抗原結合部分を含み；そして
ｃ)マスキング部分が担体部分に開裂不可能ペプチドリンカーを介してまたはペプチドリンカーを伴わず直接的にまたは間接的に連結され；
ここで、プロドラッグが担体部分により標的とされる抗原およびサイトカインの受容体両者を発現する細胞が存在する疾患部位で活性化されるまたはプロドラッグの生物学的活性が担体部分により標的とされる抗原およびサイトカインの受容体両者を発現する細胞が存在する疾患部位で少なくとも２倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍増加する、
プロドラッグ。
３. サイトカイン部分の受容体が２以上のサブユニットを含む、実施態様１または２のプロドラッグ。
４. 担体が抗原結合部分を含み、ここで、抗原が免疫細胞に発現される、実施態様１または２のプロドラッグ。
５. 担体部分が抗原結合部分を含み、ここで、抗原が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ２５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４４、ＮＫＰ３０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＢＣＭＡから選択される、実施態様１または２のプロドラッグ。
６. サイトカイン部分がＩＬ－２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－９アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドおよびＩＬ－２１アゴニストポリペプチドから選択されるサイトカインを含む、実施態様１～５の何れかのプロドラッグ。
７. サイトカインが、ＩＬ－１αアゴニストポリペプチド、ＩＬ－１βアゴニストポリペプチド、ＩＬ－４アゴニストポリペプチド、ＩＬ－５アゴニストポリペプチド、ＩＬ－６アゴニストポリペプチド、ＩＬ－８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１０アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３１アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３６アゴニストポリペプチド、インターフェロン－アルファアゴニストポリペプチド、インターフェロンガンマアゴニストポリペプチド、４－１ＢＢリガンド、ＯＸ－４０リガンドおよびＣＤ－４０リガンドから選択される、実施態様１～５の何れかのプロドラッグ。
８. マスキング部分がサイトカインの受容体の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)である、実施態様１～７の何れかのプロドラッグ。
９. サイトカインがＩＬ－７アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－７受容体αの細胞外ドメイン(ＩＬ－７Ｒα ＥＣＤ)またはその機能的アナログである、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１０. サイトカインがＩＬ－２１アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－２１受容体αの細胞外ドメイン(ＩＬ－２１Ｒα ＥＣＤ)またはその機能的アナログである、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１１. サイトカインがＩＬ－２アゴニストポリペプチドまたはＩＬ－１５アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－２受容体βの細胞外ドメイン(ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤ)である、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１２. サイトカインがＩＬ－２１アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－２１に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体である、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１３. サイトカインがＩＬ－２アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－２に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体である、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１４. サイトカインがＩＬ－１５アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体である、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１５. サイトカイン部分がＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、ここで、融合分子がさらにＩＬ－１５受容体αのスシドメイン(ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン)を含む、実施態様１～６、１１および１４の何れかのプロドラッグ。
１６. ＩＬ－２１アゴニストポリペプチドが、配列番号１のまたは配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１０または１２の何れかのプロドラッグ。
１７. マスキング部分がＩＬ－２１Ｒα－ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、それが配列番号１２、６３～７２および７３から選択されるまたは配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１０または１６のプロドラッグ。
１８. マスキング部分がヒトＩＬ－２１に結合するｓｃＦｖであり；そして、ここで、ｓｃＦｖが配列番号２０または２１のアミノ酸配列を含む、実施態様１２または１６のプロドラッグ。
１９. ＩＬ－２アゴニストポリペプチドが、配列番号６または６１のまたは配列番号６または６１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１１または１３のプロドラッグ。
２０. ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドが、配列番号７のまたは配列番号７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１１または１４のプロドラッグ。
２１. マスキング部分がＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤまたはその機能的アナログを含み；、ここで、ＩＬ－２－Ｒβ－ＥＣＤが配列番号１１のまたは配列番号１１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１１、１９または２０のプロドラッグ。
２２. マスキング部分がＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖがＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの相互作用、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβの相互作用および／またはＩＬ－２とＩＬ－２Ｒγの相互作用を阻害または妨害する、実施態様６、１３または１９の何れかのプロドラッグ。
２３. マスキング部分がＩＬ－１５に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖがＩＬ－１５とＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２とＩＬ－２Ｒγの相互作用を阻害または妨害する、実施態様６、１４、１５または２０の何れかのプロドラッグ。
２４. マスキング部分がＩＬ－２１に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖがＩＬ－２１とＩＬ－２１Ｒαおよび／またはＩＬ－２１とＩＬ－２Ｒγの相互作用を阻害または妨害する、実施態様６、１２または１６の何れかのプロドラッグ。
２５. マスキング部分がＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインに結合するｓｃＦｖであり；ここで、ｓｃＦｖがサイトカインとＩＬ－２Ｒγの間の相互作用を阻害または妨害し；そして、ここで、プロドラッグが、対応する野生型サイトカインより少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍または少なくとも２００倍長い、非ヒト霊長類またはヒトにおける半減期を有する、実施態様６のプロドラッグ。
２６. 担体部分、サイトカイン部分およびマスキング部分を含むプロドラッグであって、ここで：
ａ)サイトカイン部分がＩＬ－２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－９アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドまたはＩＬ－２１アゴニストポリペプチドから選択され；
ｂ)マスキング部分がサイトカイン部分に結合するｓｃＦｖであり；
ｃ)ｓｃＦｖがサイトカインとＩＬ－２Ｒγの間の相互作用を阻害または妨害し；そして
ｄ)ここで、プロドラッグが野生型サイトカインより少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍または少なくとも２００倍長い非ヒト霊長類またはヒトにおける半減期を有する、プロドラッグ。
２７. ｓｃＦｖがサイトカインに１～１０nMのＫＤで結合する、実施態様２２～２５の何れかのプロドラッグ。
２８. ｓｃＦｖがサイトカインに１０～１００nMのＫＤで結合する、実施態様２２～２５の何れかのプロドラッグ。
２９. ｓｃＦｖがサイトカインに１００～１０００nMのＫＤで結合する、実施態様２２～２５の何れかのプロドラッグ。
３０. マスキング部分がＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖが、ハイブリドーマ４Ｅ１２Ｂ２Ｄ１０と同じ重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む、実施態様１３または１９のプロドラッグ。
３１. マスキング部分がＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖが配列番号２２または２３のまたは配列番号２２または２３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１３または１９のプロドラッグ。
３２. マスキング部分がＩＬ－１５に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖが、ＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７、１４６Ｈ５または４０４Ｅ４と同じ重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む、実施態様１４または２０のプロドラッグ。
３３. マスキング部分がＩＬ－１５に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖが配列番号１８または１９のアミノ酸配列を含む、実施態様１４または２０のプロドラッグ。
３４. プロドラッグが開裂可能ペプチドリンカーを含まない、実施態様１～３２の何れかのプロドラッグ。
３５. プロドラッグが、配列番号４４のアミノ酸配列を有する２個の軽鎖およびアミノ酸配列がそれぞれ
配列番号３５および３６、
配列番号３７および３６、
配列番号３７および３８、
配列番号３９および４１または
配列番号４２および４３
を含む２個の重鎖ポリペプチド鎖を含む、
実施態様１のプロドラッグ。
３６. プロドラッグが、配列番号５０のアミノ酸配列を有する２個の軽鎖およびアミノ酸配列がそれぞれ
配列番号５１および５４、
配列番号５１および５５、
配列番号５１および５６、
配列番号５２および５４、
配列番号５３および５８、
配列番号５３および５９または
配列番号５２および５７
を含む２個の重鎖ポリペプチド鎖を含む、
実施態様１のプロドラッグ。
３７. 実施態様１－３６の何れかのプロドラッグ薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
３８. 実施態様１～３６の何れかのプロドラッグをコードする、１以上のポリヌクレオチド。
３９. 実施態様３８の１以上のポリヌクレオチドを含む、１以上の発現ベクター。
４０. 実施態様３９のベクターを含む、宿主細胞。
４１. 実施態様１～３６の何れかのプロドラッグを製造する方法であって、
哺乳動物細胞である実施態様４６の宿主細胞を、プロドラッグの発現を可能とする条件下で培養し、そして
プロドラッグを単離する
ことを含む、方法。
４２. 処置を必要とする患者における癌、自己免疫性疾患もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系の刺激する方法であって、患者に治療有効量の実施態様３７の医薬組成物を投与することを含む、方法。
４３. 処置を必要とする患者における、癌、自己免疫性疾患もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激に使用するための、実施態様１～３６の何れかのプロドラッグ。
４４. 処置を必要とする患者における、癌、自己免疫性疾患もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激のための医薬の製造のための、実施態様１～３６の何れかのプロドラッグの使用。
４５. 患者がＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＰＶ感染；ループス、Ｉ型糖尿病、乾癬、皮膚筋炎、ＧｖＨＤまたは関節リウマチから選択される自己免疫性疾患；または乳癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌および胃癌からなる群から選択される癌を有する、実施態様４１の方法、請求項４２の使用のためのプロドラッグまたは請求項４３の使用のための融合分子または請求項４４の使用。
４６. 担体部分、サイトカイン部分およびマスキング部分を含むプロドラッグであって、ここで：
ａ)サイトカイン部分がＩＬ－２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－９アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドまたはＩＬ－２１アゴニストポリペプチドから選択され；
ｂ)マスキング部分がサイトカイン部分に結合するｓｃＦｖであり；
ｃ)ｓｃＦｖがサイトカインとＩＬ－２Ｒγの間の相互作用を阻害または妨害し；そして
ｄ)ここで、プロドラッグが、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍または少なくとも２００倍、野生型サイトカインより大きい非ヒト霊長類またはヒトにおける曲線下面積(ＡＵＣ)を有する、プロドラッグ。
さらに、本発明の特定の実施態様を以下に記載する。これらの実施態様は本開示に記載される組成物および方法を説明することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
１. サイトカイン部分、マスキング部分および担体部分を含むプロドラッグであって、ここで、
ａ)マスキング部分はサイトカイン部分に結合し、サイトカインの意図される生物学的活性を阻害し；
ｂ)担体部分が細胞の表面に発現される抗原に結合する抗原結合部分を含み；そして
ｃ)マスキング部分が担体部分に開裂不可能ペプチドリンカーを介してまたはペプチドリンカーを伴わず直接的にまたは間接的に連結され；
ここで、プロドラッグの活性が、担体部分により標的とされる抗原およびサイトカインの受容体両者を発現する細胞の刺激について、サイトカインの受容体を発現するが、担体部分により標的とされる抗原を発現しない細胞を刺激する活性より高い、
プロドラッグ。
２. サイトカイン部分、マスキング部分および担体部分を含むプロドラッグであって、ここで、
ａ)マスキング部分はサイトカイン部分に結合し、サイトカインの意図される生物学的活性を阻害し；
ｂ)担体部分が細胞の表面に発現される抗原に結合する抗原結合部分を含み；そして
ｃ)マスキング部分が担体部分に開裂不可能ペプチドリンカーを介してまたはペプチドリンカーを伴わず直接的にまたは間接的に連結され；
ここで、プロドラッグが担体部分により標的とされる抗原およびサイトカインの受容体両者を発現する細胞が存在する疾患部位で活性化されるまたはプロドラッグの生物学的活性が担体部分により標的とされる抗原およびサイトカインの受容体両者を発現する細胞が存在する疾患部位で少なくとも２倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍増加する、
プロドラッグ。
３. サイトカイン部分の受容体が２以上のサブユニットを含む、実施態様１または２のプロドラッグ。
４. 担体が抗原結合部分を含み、ここで、抗原が免疫細胞に発現される、実施態様１または２のプロドラッグ。
５. 担体部分が抗原結合部分を含み、ここで、抗原が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ２５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ４４、ＮＫＰ３０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＢＣＭＡから選択される、実施態様１または２のプロドラッグ。
６. サイトカイン部分がＩＬ－２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－９アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドおよびＩＬ－２１アゴニストポリペプチドから選択されるサイトカインを含む、実施態様１～５の何れかのプロドラッグ。
７. サイトカインが、ＩＬ－１αアゴニストポリペプチド、ＩＬ－１βアゴニストポリペプチド、ＩＬ－４アゴニストポリペプチド、ＩＬ－５アゴニストポリペプチド、ＩＬ－６アゴニストポリペプチド、ＩＬ－８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１０アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１８アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－２３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３１アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３３アゴニストポリペプチド、ＩＬ－３６アゴニストポリペプチド、インターフェロン－アルファアゴニストポリペプチド、インターフェロンガンマアゴニストポリペプチド、４－１ＢＢリガンド、ＯＸ－４０リガンドおよびＣＤ－４０リガンドから選択される、実施態様１～５の何れかのプロドラッグ。
８. マスキング部分がサイトカインの受容体の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)である、実施態様１～７の何れかのプロドラッグ。
９. サイトカインがＩＬ－７アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－７受容体αの細胞外ドメイン(ＩＬ－７Ｒα ＥＣＤ)またはその機能的アナログである、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１０. サイトカインがＩＬ－２１アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－２１受容体αの細胞外ドメイン(ＩＬ－２１Ｒα ＥＣＤ)またはその機能的アナログである、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１１. サイトカインがＩＬ－２アゴニストポリペプチドまたはＩＬ－１５アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－２受容体βの細胞外ドメイン(ＩＬ－２Ｒβ ＥＣＤ)である、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１２. サイトカインがＩＬ－２１アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－２１に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体である、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１３. サイトカインがＩＬ－２アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－２に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体である、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１４. サイトカインがＩＬ－１５アゴニストポリペプチドであり；そして、ここで、マスキング部分がＩＬ－１５に対する一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または単一ドメイン抗体である、実施態様１～６の何れかのプロドラッグ。
１５. サイトカイン部分がＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含み、ここで、融合分子がさらにＩＬ－１５受容体αのスシドメイン(ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン)を含む、実施態様１～６、１１および１４の何れかのプロドラッグ。
１６. ＩＬ－２１アゴニストポリペプチドが、配列番号１のまたは配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１０または１２の何れかのプロドラッグ。
１７. マスキング部分がＩＬ－２１Ｒα－ＥＣＤまたはその機能的アナログであり、それが配列番号１２、６３～７２および７３から選択されるまたは配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１０または１６のプロドラッグ。
１８. マスキング部分がヒトＩＬ－２１に結合するｓｃＦｖであり；そして、ここで、ｓｃＦｖが配列番号２０または２１のアミノ酸配列を含む、実施態様１２または１６のプロドラッグ。
１９. ＩＬ－２アゴニストポリペプチドが、配列番号６または６１のまたは配列番号６または６１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１１または１３のプロドラッグ。
２０. ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドが、配列番号７のまたは配列番号７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１１または１４のプロドラッグ。
２１. マスキング部分がＩＬ－２Ｒβ－ＥＣＤまたはその機能的アナログを含み；、ここで、ＩＬ－２－Ｒβ－ＥＣＤが配列番号１１のまたは配列番号１１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１１、１９または２０のプロドラッグ。
２２. マスキング部分がＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖがＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの相互作用、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβの相互作用および／またはＩＬ－２とＩＬ－２Ｒγの相互作用を阻害または妨害する、実施態様６、１３または１９の何れかのプロドラッグ。
２３. マスキング部分がＩＬ－１５に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖがＩＬ－１５とＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２とＩＬ－２Ｒγの相互作用を阻害または妨害する、実施態様６、１４、１５または２０の何れかのプロドラッグ。
２４. マスキング部分がＩＬ－２１に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖがＩＬ－２１とＩＬ－２１Ｒαおよび／またはＩＬ－２１とＩＬ－２Ｒγの相互作用を阻害または妨害する、実施態様６、１２または１６の何れかのプロドラッグ。
２５. マスキング部分がＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインに結合するｓｃＦｖであり；ここで、ｓｃＦｖがサイトカインとＩＬ－２Ｒγの間の相互作用を阻害または妨害し；そして、ここで、プロドラッグが、対応する野生型サイトカインより少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍または少なくとも２００倍長い、非ヒト霊長類またはヒトにおける半減期を有する、実施態様６のプロドラッグ。
２６. 担体部分、サイトカイン部分およびマスキング部分を含むプロドラッグであって、ここで：
ａ)サイトカイン部分がＩＬ－２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－９アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドまたはＩＬ－２１アゴニストポリペプチドから選択され；
ｂ)マスキング部分がサイトカイン部分に結合するｓｃＦｖであり；
ｃ)ｓｃＦｖがサイトカインとＩＬ－２Ｒγの間の相互作用を阻害または妨害し；そして
ｄ)ここで、プロドラッグが野生型サイトカインより少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍または少なくとも２００倍長い非ヒト霊長類またはヒトにおける半減期を有する、プロドラッグ。
２７. ｓｃＦｖがサイトカインに１～１０nMのＫＤで結合する、実施態様２２～２５の何れかのプロドラッグ。
２８. ｓｃＦｖがサイトカインに１０～１００nMのＫＤで結合する、実施態様２２～２５の何れかのプロドラッグ。
２９. ｓｃＦｖがサイトカインに１００～１０００nMのＫＤで結合する、実施態様２２～２５の何れかのプロドラッグ。
３０. マスキング部分がＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖが、ハイブリドーマ４Ｅ１２Ｂ２Ｄ１０と同じ重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む、実施態様１３または１９のプロドラッグ。
３１. マスキング部分がＩＬ－２に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖが配列番号２２または２３のまたは配列番号２２または２３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１３または１９のプロドラッグ。
３２. マスキング部分がＩＬ－１５に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖが、ＩＬ－１５抗体１４６Ｂ７、１４６Ｈ５または４０４Ｅ４と同じ重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む、実施態様１４または２０のプロドラッグ。
３３. マスキング部分がＩＬ－１５に結合するｓｃＦｖであり、ここで、ｓｃＦｖが配列番号１８または１９のアミノ酸配列を含む、実施態様１４または２０のプロドラッグ。
３４. プロドラッグが開裂可能ペプチドリンカーを含まない、実施態様１～３２の何れかのプロドラッグ。
３５. プロドラッグが、配列番号４４のアミノ酸配列を有する２個の軽鎖およびアミノ酸配列がそれぞれ
配列番号３５および３６、
配列番号３７および３６、
配列番号３７および３８、
配列番号３９および４１または
配列番号４２および４３
を含む２個の重鎖ポリペプチド鎖を含む、
実施態様１のプロドラッグ。
３６. プロドラッグが、配列番号５０のアミノ酸配列を有する２個の軽鎖およびアミノ酸配列がそれぞれ
配列番号５１および５４、
配列番号５１および５５、
配列番号５１および５６、
配列番号５２および５４、
配列番号５３および５８、
配列番号５３および５９または
配列番号５２および５７
を含む２個の重鎖ポリペプチド鎖を含む、
実施態様１のプロドラッグ。
３７. 実施態様１－３６の何れかのプロドラッグ薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
３８. 実施態様１～３６の何れかのプロドラッグをコードする、１以上のポリヌクレオチド。
３９. 実施態様３８の１以上のポリヌクレオチドを含む、１以上の発現ベクター。
４０. 実施態様３９のベクターを含む、宿主細胞。
４１. 実施態様１～３６の何れかのプロドラッグを製造する方法であって、
哺乳動物細胞である実施態様４６の宿主細胞を、プロドラッグの発現を可能とする条件下で培養し、そして
プロドラッグを単離する
ことを含む、方法。
４２. 処置を必要とする患者における癌、自己免疫性疾患もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系の刺激する方法であって、患者に治療有効量の実施態様３７の医薬組成物を投与することを含む、方法。
４３. 処置を必要とする患者における、癌、自己免疫性疾患もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激に使用するための、実施態様１～３６の何れかのプロドラッグ。
４４. 処置を必要とする患者における、癌、自己免疫性疾患もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激のための医薬の製造のための、実施態様１～３６の何れかのプロドラッグの使用。
４５. 患者がＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＰＶ感染；ループス、Ｉ型糖尿病、乾癬、皮膚筋炎、ＧｖＨＤまたは関節リウマチから選択される自己免疫性疾患；または乳癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌および胃癌からなる群から選択される癌を有する、実施態様４１の方法、請求項４２の使用のためのプロドラッグまたは請求項４３の使用のための融合分子または請求項４４の使用。
４６. 担体部分、サイトカイン部分およびマスキング部分を含むプロドラッグであって、ここで：
ａ)サイトカイン部分がＩＬ－２アゴニストポリペプチド、ＩＬ－７アゴニストポリペプチド、ＩＬ－９アゴニストポリペプチド、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドまたはＩＬ－２１アゴニストポリペプチドから選択され；
ｂ)マスキング部分がサイトカイン部分に結合するｓｃＦｖであり；
ｃ)ｓｃＦｖがサイトカインとＩＬ－２Ｒγの間の相互作用を阻害または妨害し；そして
ｄ)ここで、プロドラッグが、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍または少なくとも２００倍、野生型サイトカインより大きい非ヒト霊長類またはヒトにおける曲線下面積(ＡＵＣ)を有する、プロドラッグ。
【0114】
本発明がよりよく理解され得るために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、説明のみを目的とするものであり、いかなる方法でも本発明の範囲を限定すると解釈されてはならない。
【実施例】
【0115】
実施例１および２に記載する実験のための材料および方法は次のとおりである。
【0116】
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析
ＳＥＣ－ＨＰＬＣを、Tosoh Bioscienceに発注したTSKgel G3000SWXLカラム(７.８mm ＩＤ×３０cm、５μm粒子径)を有するAgilent 1100シリーズのＨＰＬＣ系で実施した。１００μlまでのサンプルを負荷した。カラムを、２００mM Ｋ３ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌを含む緩衝液、ｐＨ６.５で流した。流速は０.５ml／分であった。カラムを室温で流した。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣを、Tosoh Bioscienceに発注したTSKgel G3000SWXLカラム(７.８mm ＩＤ×３０cm、５μm粒子径)を有するAgilent 1100シリーズのＨＰＬＣ系で実施した。１００μlまでのサンプルを負荷した。カラムを、２００mM Ｋ３ＰＯ４、２５０mM ＫＣｌを含む緩衝液、ｐＨ６.５で流した。流速は０.５ml／分であった。カラムを室温で流した。
【0117】
タンパク分解処理
プロテアーゼ、ヒトＭＭＰ２、ヒトＭＭＰ９、マウスＭＭＰ２およびマウスＭＭＰ９をR&D systemsから購入した。プロテアーゼ消化を、２mM ＣａＣｌ２および１０μM ＺｎＣｌ２を含むＨＢＳ緩衝液(２０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ２、ｐＨ７.４)中、１０μg～５０μgのプロドラッグと１μgのヒトＭＭＰ２、ヒトＭＭＰ９、マウスＭＭＰ２またはマウスＭＭＰ９を、３７℃で１２時間インキュベートすることにより実施した。
プロテアーゼ、ヒトＭＭＰ２、ヒトＭＭＰ９、マウスＭＭＰ２およびマウスＭＭＰ９をR&D systemsから購入した。プロテアーゼ消化を、２mM ＣａＣｌ２および１０μM ＺｎＣｌ２を含むＨＢＳ緩衝液(２０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ２、ｐＨ７.４)中、１０μg～５０μgのプロドラッグと１μgのヒトＭＭＰ２、ヒトＭＭＰ９、マウスＭＭＰ２またはマウスＭＭＰ９を、３７℃で１２時間インキュベートすることにより実施した。
【0118】
細胞ベースの活性アッセイ
プロテアーゼ消化前のプロドラッグおよび対照サンプルを、細胞ベースの活性アッセイにより試験した。簡潔には、ＮＫ９２細胞を、Ｌ－グルタミン、１０％ウシ胎児血清、１０％非必須アミノ酸、１０％ピルビン酸ナトリウムおよび５５μM ベータ－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で増殖させた。ＮＫ９２細胞は非接着性であり、１００ng／mlのＩＬ－２で培地中１×１０５～１×１０６細胞／mlに維持した。一般に、細胞は週２回分裂した。バイオアッセイについて、細胞を、継代後４８時間以降に使用するのが最良であった。ＩＬ－２１機能的活性を、ＮＫ９２細胞を５×１０４細胞／ウェルで、一定量のＩＬ－２存在下、連続希釈サンプルと２日間培養することにより、決定した。次いで、上清をＥＬＩＳＡによりインターフェロン－γについてアッセイした。
プロテアーゼ消化前のプロドラッグおよび対照サンプルを、細胞ベースの活性アッセイにより試験した。簡潔には、ＮＫ９２細胞を、Ｌ－グルタミン、１０％ウシ胎児血清、１０％非必須アミノ酸、１０％ピルビン酸ナトリウムおよび５５μM ベータ－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で増殖させた。ＮＫ９２細胞は非接着性であり、１００ng／mlのＩＬ－２で培地中１×１０５～１×１０６細胞／mlに維持した。一般に、細胞は週２回分裂した。バイオアッセイについて、細胞を、継代後４８時間以降に使用するのが最良であった。ＩＬ－２１機能的活性を、ＮＫ９２細胞を５×１０４細胞／ウェルで、一定量のＩＬ－２存在下、連続希釈サンプルと２日間培養することにより、決定した。次いで、上清をＥＬＩＳＡによりインターフェロン－γについてアッセイした。
【0119】
Ｍｉｎｏ ＩＬ－２１生存能アッセイ
Ｍｉｎｏ細胞生存能アッセイを、次のプロトコールに従い実施する：
ａ)９６ウェル組織培養プレート中、５０μLアッセイ培地(ＲＰＭＩ １６４０、１０％ウシ胎児血清、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、５５μM ｂ－メルカプトエタノール)で試験品の連続希釈を実施する。
ｂ)５０μLアッセイ培地に２０,０００ Ｍｉｎｏ細胞／ウェルを加える。
ｃ)３日間または５日間培養する。
ｄ)１００μL／ウェル Cell Titer Glo(Promega)を加える。Cell Titer-Gloは、ＡＴＰの定量的評価の提供により、細胞生存能の指標を提供する。
ｅ)ルミネセンスを測定する。
Ｍｉｎｏ細胞生存能アッセイを、次のプロトコールに従い実施する：
ａ)９６ウェル組織培養プレート中、５０μLアッセイ培地(ＲＰＭＩ １６４０、１０％ウシ胎児血清、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、５５μM ｂ－メルカプトエタノール)で試験品の連続希釈を実施する。
ｂ)５０μLアッセイ培地に２０,０００ Ｍｉｎｏ細胞／ウェルを加える。
ｃ)３日間または５日間培養する。
ｄ)１００μL／ウェル Cell Titer Glo(Promega)を加える。Cell Titer-Gloは、ＡＴＰの定量的評価の提供により、細胞生存能の指標を提供する。
ｅ)ルミネセンスを測定する。
【0120】
ＰＢＭＣ初代細胞でのＫｉ６７活性化アッセイ
ヒトＰＢＭＣを、１００ng／mLの抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ３で２日間刺激し、続いて３回洗浄し、次いで３日間、習慣的な細胞培養培地で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで休息させた。この刺激／休息後、ＰＢＭＣを、２００Ｋ細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、示すとおり種々の濃度の試験品で５日間処理し、その後ＰＤ－１＋ＣＤ４＋およびＰＤ－１－ＣＤ４＋細胞集団におけるＫｉ６７について細胞染色およびフローサイトメトリー分析に付した(細胞染色に使用した全Ａｂは、ＢＤから購入した)。
ヒトＰＢＭＣを、１００ng／mLの抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ３で２日間刺激し、続いて３回洗浄し、次いで３日間、習慣的な細胞培養培地で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで休息させた。この刺激／休息後、ＰＢＭＣを、２００Ｋ細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、示すとおり種々の濃度の試験品で５日間処理し、その後ＰＤ－１＋ＣＤ４＋およびＰＤ－１－ＣＤ４＋細胞集団におけるＫｉ６７について細胞染色およびフローサイトメトリー分析に付した(細胞染色に使用した全Ａｂは、ＢＤから購入した)。
【0121】
実施例１：抗ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２１プロドラッグ融合分子の構築
抗ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２１プロドラッグを、第一の重鎖ポリペプチド鎖(配列番号４２に示すアミノ酸配列を有する)、第二の重鎖ポリペプチド鎖(配列番号７６に示すアミノ酸配列を有する)および２個の同一軽鎖(配列番号４４に示すアミノ酸配列を有する)を用いて構築した。。分子を一過性に発現させ、精製した(lot# PW04-38)。
抗ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２１プロドラッグを、第一の重鎖ポリペプチド鎖(配列番号４２に示すアミノ酸配列を有する)、第二の重鎖ポリペプチド鎖(配列番号７６に示すアミノ酸配列を有する)および２個の同一軽鎖(配列番号４４に示すアミノ酸配列を有する)を用いて構築した。。分子を一過性に発現させ、精製した(lot# PW04-38)。
【0122】
マスキング部分としてのｓｃＦｖを有する第二のＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２１プロドラッグも発現させ、精製した(Lot #PW05-68)。
【0123】
さらに、対照として、マスクがない抗ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２１融合分子も発現させ、精製した(Lot #PW05-67)。
【0124】
さらに、第二の対照、マスクがない抗ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２１ムテイン(Ｒ９ＥＲ７６Ａ)融合分子も発現させ、精製した(Lot #PW09-02)。
【0125】
実施例２：抗ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２１プロドラッグ融合分子の生物学的活性
プロドラッグ分子および数個の対照分子のＭｉｎｏ細胞への結合をＦＡＣＳにより試験した。図２の結果は、ＰＤ－１抗体およびＦｃ－ＩＬ－２１融合分子両者がＭｉｎｏ細胞に結合できたことを示し、Ｍｉｎｏ細胞がＰＤ－１およびＩＬ－２１に対する受容体両者を発現することを示す。結果は、ＦｃベースのＩＬ－２１プロドラッグ分子の両者が細胞に結合しないことを示し、ＩＬ－２１サイトカイン部分が対応するマスキング部分によりマスクされていることを示す。しかしながら、ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２１プロドラッグ分子および融合分子は、Ｍｉｎｏ細胞に結合できた。
プロドラッグ分子および数個の対照分子のＭｉｎｏ細胞への結合をＦＡＣＳにより試験した。図２の結果は、ＰＤ－１抗体およびＦｃ－ＩＬ－２１融合分子両者がＭｉｎｏ細胞に結合できたことを示し、Ｍｉｎｏ細胞がＰＤ－１およびＩＬ－２１に対する受容体両者を発現することを示す。結果は、ＦｃベースのＩＬ－２１プロドラッグ分子の両者が細胞に結合しないことを示し、ＩＬ－２１サイトカイン部分が対応するマスキング部分によりマスクされていることを示す。しかしながら、ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２１プロドラッグ分子および融合分子は、Ｍｉｎｏ細胞に結合できた。
【0126】
分子の細胞ベースの活性を、ＮＫ９２細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞株を使用して評価した。結果を図３に示す。データは、活性化しなければ、マスキング部分としてＩＬ－２１α ＥＣＤを有するプロドラッグ分子(Lot# PW04-38)は最小の活性を有し、一方マスキング部分としてｓｃＦｖを有するプロドラッグ(Lot# PW05-68)は、マスキング部分がないもの(PW04-67)より約１０００倍低い活性を有することを示した。データは、プロドラッグのバイオアッセイ活性は、プロテアーゼＭＭＰ２処理により有意に増強されたことを示す。
【0127】
融合分子の殺腫瘍活性を試験するために、Ｍｉｎｏ細胞を使用した。Ｍｉｎｏ細胞は、ＰＤ－１およびＩＬ－２１の受容体両者を発現する、マントル細胞リンパ腫細胞株である(Harington et al., Leuk Lymphoma (2019) 60(10):2498-2507およびGelebart et al., Leukemia (2009) 23:1836-1846)。Ｍｉｎｏ生存能アッセイ結果を図４Ａおよび４Ｂに示す。驚くべきことに、抗ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２１プロドラッグ(Lots# PW04-38およびPW05-68)は、活性化前に相当の活性を有し、一方、対照分子(ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２１Ｒ９Ｅ／Ｒ７６Ａ融合分子、Lot# PW09-02)は活性がないか僅かであった。結果は、抗ＰＤ－１ ＩＬ－２１融合分子が「シス結合」、すなわち、ＰＤ－１およびＩＬ－２１受容体両者への結合を介して活性化されたことを示す。ＰＤ－１抗体の細胞表面上のＰＤ－１抗原へのおよびサイトカインの同じ細胞表面上のその受容体へのシス結合は、マスキング部分のマスキング効果を壊さなかった。それ故に、開裂可能ペプチドリンカーを有しないプロドラッグが、局所免疫細胞が担体により標的とされる抗原およびサイトカイン部分(例えば、ＩＬ－２１)に結合する受容体両者を発現し得るため、腫瘍などの疾患部位で「活性化」され得ることが予測される。
【0128】
実施例３：抗ＰＤ－１抗体－ＩＬ－１５プロドラッグ融合分子の構築
ＩＬ－１５部分が、(ｉ)ｓｃＦｖ ２１５βでマスクされた、(ii)ｓｃＦｖ ２１５γでマスクされた、(iii)マスクを有しない(２１５β Ｒｅｆ)または(iv)変異を有するがマスクを有しない(ＰＤ１／ＩＬ１５ムテイン(Ｍ２))一連の抗ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－１５プロドラッグを構築した。これらプロドラッグにおける抗ＰＤ－１抗体は、配列番号４４のアミノ酸配列を有する２個の同一軽鎖および配列番号４７のアミノ酸配列を有する２個の同一重鎖を含む。
ＩＬ－１５部分が、(ｉ)ｓｃＦｖ ２１５βでマスクされた、(ii)ｓｃＦｖ ２１５γでマスクされた、(iii)マスクを有しない(２１５β Ｒｅｆ)または(iv)変異を有するがマスクを有しない(ＰＤ１／ＩＬ１５ムテイン(Ｍ２))一連の抗ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－１５プロドラッグを構築した。これらプロドラッグにおける抗ＰＤ－１抗体は、配列番号４４のアミノ酸配列を有する２個の同一軽鎖および配列番号４７のアミノ酸配列を有する２個の同一重鎖を含む。
【0129】
Ｆｃベースのプロドラッグ２１５βは、アミノ酸配列番号１６および１７を含む、ヘテロ二量体である。
【0130】
抗ＰＤ－１抗体ベースのプロドラッグ２１５γは、２個の同一軽鎖(配列番号４４)、配列番号３７のアミノ酸配列を有する第一の重鎖融合ポリペプチド鎖および配列番号７７のアミノ酸配列を有する第二の重鎖融合ポリペプチド鎖を含む。
【0131】
２１５β Ｒｅｆは、ＩＬ－１５ムテイン(Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ)－Ｆｃ融合分子である。
【0132】
ＰＤ１／ＩＬ１５ムテイン(Ｍ２)は、ＩＬ－１５ムテインを有する抗ＰＤ－１－抗体融合であり、ここで、ＩＬ－１５アゴニストは、変異Ｅ４６Ｇ、Ｖ４９Ｒ、Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０ＮおよびＮ１Ｇを含む。
【0133】
サンプル全てをＣＨＯ細胞で発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、続いてさらなるクロマトグラフィー工程を使用して、精製した。
【0134】
実施例４：抗ＰＤ－１抗体－ＩＬ－１５プロドラッグ融合分子の生物学的活性
ＩＬ－１５プロドラッグを、ヒトドナーから得たＰＢＭＣ細胞におけるＫｉ６７発現を刺激する能力について、試験した。図５Ａ～５Ｃは、処理後のＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋ Ｔ細胞のＫｉ６７活性化の結果を示す。図５Ａは、ＰＤ－１発現がないＣＤ４＋ Ｔ細胞のＫｉ６７活性化の結果を示す。図５Ｂは、ＰＤ－１発現があるＣＤ４＋ Ｔ細胞のＫｉ６７活性化の結果を示す。図５Ｃは、ＰＤ－１発現がないおよびあるＣＤ４＋ Ｔ細胞での試験品のＥＣ５０値を示す。またＰＤ－１発現がないおよびあるＣＤ４＋ Ｔ細胞間のＥＣ５０値の変化倍率も示す。驚くべきことに、データは、２１５γがＰＤ－１を発現するＣＤ４＋細胞が、ＰＤ－１発現がないものより有意に高いＫｉ６７活性を有することを示し、プロドラッグ２１５γが抗原ＰＤ－１およびサイトカインＩＬ－１５の受容体両者を発現する細胞に作用したとき、プロテアーゼの切断なしで活性化できたことを示す。
ＩＬ－１５プロドラッグを、ヒトドナーから得たＰＢＭＣ細胞におけるＫｉ６７発現を刺激する能力について、試験した。図５Ａ～５Ｃは、処理後のＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋ Ｔ細胞のＫｉ６７活性化の結果を示す。図５Ａは、ＰＤ－１発現がないＣＤ４＋ Ｔ細胞のＫｉ６７活性化の結果を示す。図５Ｂは、ＰＤ－１発現があるＣＤ４＋ Ｔ細胞のＫｉ６７活性化の結果を示す。図５Ｃは、ＰＤ－１発現がないおよびあるＣＤ４＋ Ｔ細胞での試験品のＥＣ５０値を示す。またＰＤ－１発現がないおよびあるＣＤ４＋ Ｔ細胞間のＥＣ５０値の変化倍率も示す。驚くべきことに、データは、２１５γがＰＤ－１を発現するＣＤ４＋細胞が、ＰＤ－１発現がないものより有意に高いＫｉ６７活性を有することを示し、プロドラッグ２１５γが抗原ＰＤ－１およびサイトカインＩＬ－１５の受容体両者を発現する細胞に作用したとき、プロテアーゼの切断なしで活性化できたことを示す。
【0135】
実施例５：抗ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２プロドラッグ融合分子
抗ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２プロドラッグを同様に構築した。プロドラッグ、ＰＤ－１／ＩＬ－２ｖ＊は、２個の同一軽鎖(配列番号４４)および２個の重鎖融合ポリペプチド(それぞれ配列番号２４および２５)を含んだ。ＩＬ－２部分はＩＬ－２ムテインであり、プロドラッグにおけるマスクはＩＬ－２受容体β細胞外ドメインである。ＩＬ－２プロドラッグを、ヒトドナーから得たＰＢＭＣ細胞におけるＫｉ６７発現を刺激する能力について、評価した。
抗ＰＤ－１抗体ベースのＩＬ－２プロドラッグを同様に構築した。プロドラッグ、ＰＤ－１／ＩＬ－２ｖ＊は、２個の同一軽鎖(配列番号４４)および２個の重鎖融合ポリペプチド(それぞれ配列番号２４および２５)を含んだ。ＩＬ－２部分はＩＬ－２ムテインであり、プロドラッグにおけるマスクはＩＬ－２受容体β細胞外ドメインである。ＩＬ－２プロドラッグを、ヒトドナーから得たＰＢＭＣ細胞におけるＫｉ６７発現を刺激する能力について、評価した。
【0136】
図６Ａおよび６Ｂは、抗ＰＤ－１抗体(ＰＤ－１)、陰性対照またはＰＤ－１／ＩＬ－２ｖ＊で処理後のＰＢＭＣからのＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＫｉ６７活性化の結果を示す。陰性対照は、ヒトクローディン１８.２に対するＩｇＧ１抗体であった。サンプル全てをＣＨＯ細胞で発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、続いてさらなるクロマトグラフィー工程を使用して、精製した。図６Ａは、ＰＤ－１発現がないＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＫｉ６７活性化の結果を示す。図６Ｂは、ＰＤ－１発現があるＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＫｉ６７活性化の結果を示す。驚くべきことに、データは、プロドラッグＰＤ－１／ＩＬ２Ｖ＊がＰＤ－１を発現するＣＤ４＋細胞で、ＰＤ－１発現がないものより有意に高いＫｉ６７誘導活性を有することを示した。これらの結果は、ＰＤ－１／ＩＬ－２ｖ＊が、抗原ＰＤ－１およびサイトカインＩＬ－２の受容体両者を発現する細胞に作用したとき、プロテアーゼ切断なして活性化できたことを示す。
【0137】
まとめると、上記データは、サイトカインプロドラッグが、サイトカインの受容体および担体部分により標的化される抗原両者を発現する細胞が存在する部位で、活性化できたことを示す。抗原結合部分を有する担体を有するプロドラッグが、プロテアーゼ切断せずに活性化できたことは驚きであった。理論に拘束されることを意図しないが、担体部分の抗原結合ドメインがプロドラッグ分子を抗原を発現する細胞の表面に向け、これにより、細胞のサイトカイン受容体表面がプロドラッグのマスク部分と効率的に競合することが可能となると予測する。この過程は、図７に示すとおり、マスキング部分の細胞表面のサイトカイン受容体への置換を介する、プロドラッグの無プロテアーゼ切断活性化を可能とする。
【0138】
疲弊Ｔｅｆｆ細胞などの細胞は、抗原(例えば、ＰＤ－１)およびサイトカインの受容体(例えば、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγ)両者を発現する。疲弊Ｔｅｆｆ細胞は、一般に腫瘍微小環境に局在するが、正常組織にも存在する。抗原およびサイトカイン受容体を発現する細胞のこの差示的分布は、プロドラッグの疾患部位特異的活性化を可能とする。このような標的特異性は、サイトカイン治療の安全性の増強ももたらす。
【0139】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】