特表 2023-509973 上皮カドヘリン特異性抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-10

(54)【発明の名称】上皮カドヘリン特異性抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230303BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230303BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230303BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230303BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230303BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20230303BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20230303BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230303BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230303BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230303BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230303BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230303BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230303BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230303BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230303BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230303BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230303BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20230303BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C12N5/10

C12N5/0783

C12N15/63 Z

A01K67/027

C12Q1/04

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K39/395 T

A61K39/395 E

A61K47/68

A61K35/17 A

A61K35/76

A61K35/12

A61K31/7088

A61K48/00

A61K45/00

G01N33/574 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022542247

(86)(22)【出願日】2021-01-08

(85)【翻訳文提出日】2022-09-07

(86)【国際出願番号】 NL2021050009

(87)【国際公開番号】W WO2021141492

(87)【国際公開日】2021-07-15

(31)【優先権主張番号】20151325.6

(32)【優先日】2020-01-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521361969

【氏名又は名称】クリング・バイオセラピューティックス・べー・フェー

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ティム・ボーモン

(72)【発明者】

【氏名】サブリナ・ジュリア・ルイーザ・メラト

(72)【発明者】

【氏名】マルク・イェロン・クワッケンボス

(72)【発明者】

【氏名】マルティン・ケッデ

(72)【発明者】

【氏名】ヘルゲン・スピツ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QR72

4B063QR77

4B065AA91X

4B065AA93X

4B065AA94X

4C076AA95

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF68

4C084AA13

4C084AA19

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB36

4C085BB41

4C085CC01

4C085DD23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB64

4C087BC83

4C087CA05

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZC75

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA42

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA22

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、上皮カドヘリン特異性抗体、ならびに癌などの疾患の診断および処置におけるその使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｅ－カドヘリンの１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基を特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基が、図１Ａに示されるような前記Ｅ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する、抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項2】

前記抗体または抗原結合フラグメントの前記Ｅ－カドヘリンへの結合が、図１Ａに示されるような前記Ｅ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４７２位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４６３位でのグルタミン酸残基、４６５位でのセリン残基、４６９位でのセリン残基、および／または４７７位でのバリン残基の存在に依存している、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項3】

前記抗体または抗原結合フラグメントの前記Ｅ－カドヘリンへの前記結合が、図１Ａに示されるような前記Ｅ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および／または４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および／または４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基の存在に依存している、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項4】

前記抗体または抗原結合フラグメントが、Ｏ－マンノシル化完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好にＯ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンを結合することを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項5】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体または抗原結合フラグメントが：
ａ．アミノ酸配列ＧＦＸ_１ＦＳＸ_２ＡＷを含む重鎖可変領域ＣＤＲ１（Ｘ_１はＴまたはＩであり、Ｘ_２はＮまたはＹである）；
または前記ＧＦＸ_１ＦＳＸ_２ＡＷ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ．アミノ酸配列ＩＫＳＫＩＤＧ Ｘ_１Ｔ Ｘ_２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２（Ｘ_１はＧまたはＥであり、Ｘ_２はＴまたはＩである）；
または前記ＩＫＳＫＩＤＧ Ｘ_１Ｔ Ｘ_２配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ．アミノ酸配列ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲを含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（Ｘ_１はＡまたはＴであり、Ｘ_２はＤまたはＮである）；
または前記ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ．アミノ酸配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
または前記ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ．アミノ酸配列ＷＡＸ_１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２（Ｘ_１はＳまたはＣである）；
または前記ＷＡＸ_１配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ．アミノ酸配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
または前記ＱＱＹＳＮＴＰＱＴ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
の１つまたは複数、および場合によってはそれぞれを含む、抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項6】

ａ．配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｂ．配列ＧＦＩＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｃ．配列ＧＦＩＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｄ．配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｅ．配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｆ．配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＣを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｇ．配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｈ．配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＴＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｉ．配列ＧＦＴＦＳＹＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｊ．配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＩを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｋ．配列ＧＦＴＦＳＹＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｌ．配列ＧＦＩＦＳＹＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３；または
ｍ．配列ＧＦＩＦＳＹＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項7】

- 配列番号１～１７からなる群より選択されるＶＨ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域；および／または
- 配列番号１８～２２からなる群より選択されるＶＬ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項8】

- 配列番号１に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号１に示されるようなＶＨ配列および配列番号２２に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号３に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号４に示されるようなＶＨ配列および配列番号１９に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号５に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号６に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号６に示されるようなＶＨ配列および配列番号２０に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号７に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号８に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号９に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号１０に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号１０に示されるようなＶＨ配列および配列番号２１に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号１１に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号１２に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号１３に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号１４に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号１５に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号１６に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号１７に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項9】

ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項10】

前記抗体が、ＩｇＧアイソタイプ、好ましくはＩｇＧ１である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項11】

脱フコシル化されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項12】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン、好ましくはＯ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンへの結合について、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項13】

前記抗体または抗原結合フラグメントが、以下の特徴：
- Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンの細胞外（ＥＣ）３ドメインに結合する；
- Ｏ－マンノシル化完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好にＯ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンを結合する；
- Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を同時発現する腫瘍細胞を結合する
の１つまたは複数、好ましくはそれぞれを有している、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項14】

別の化合物、好ましくは免疫調節化合物、Ｔ細胞結合化合物、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）結合化合物、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）結合化合物、ガンマ－デルタＴ細胞結合化合物、ＣＤ３特異性結合化合物、ＴＧＦβ特異性結合化合物、サイトカイン、二次抗体またはその抗原結合部分、検出可能な標識、薬物、化学療法剤、細胞毒性剤、毒性部分、ホルモン、酵素、および放射性化合物からなる群より選択される化合物と結合している、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項15】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる、二重特異性または多重特異性結合化合物、好ましくは二重特異性または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントであって：
- 請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント；および
- 免疫調節化合物
を含む、二重特異性または多重特異性結合化合物。

【請求項16】

請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントおよび治療用化合物を含む、抗体薬物複合体。

【請求項17】

請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントが、ＣＤ３特異性結合化合物またはＴＧＦβ特異性結合化合物に結合している、請求項１４に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、または請求項１５に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項１６に記載の抗体薬物複合体。

【請求項18】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントであって：
- 請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
- Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）またはガンマ－デルタＴ細胞に特異的である、好ましくはＣＤ３に特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項19】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントであって：
- 請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
- ＴＧＦβに特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項20】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞であって、前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞。

【請求項21】

請求項５または６に列挙された重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２０に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞。

【請求項22】

請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする、または請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体の少なくとも前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をコードする、または請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体の少なくとも前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をコードする、または請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメントの少なくとも前記重鎖可変領域および／もしくは前記軽鎖可変領域をコードする、単離、合成または組換え核酸。

【請求項23】

配列番号２３～３９からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、および／または配列番号４０～４４からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２２に記載の核酸。

【請求項24】

非ヒト宿主細胞における発現のために最適化されたコドンである、請求項２２から２３のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項25】

請求項２２から２４のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項26】

前記ベクターが、Ｔ細胞活性化ドメインをコードする核酸配列および抗原認識ドメインをコードする核酸配列を含むＣＡＲ Ｔ細胞ベクターであり、前記抗原認識ドメインが、請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体の少なくとも前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、好ましくは請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体の少なくとも前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２５に記載のベクター。

【請求項27】

- 配列番号２３に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２３に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４４に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２４に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
- 配列番号２５に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２６に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４１に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２７に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２８に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２８に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４２に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２９に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号３０に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号３１に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３２に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３２に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４３に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３３に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３４に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３５に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３６に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３７に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３８に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３９に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
を含む、請求項２５または２６に記載のベクター。

【請求項28】

請求項１から２７のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体、ＣＡＲ Ｔ細胞、核酸またはベクターを含む、単離または組換え宿主細胞、または非ヒト動物。

【請求項29】

哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項２８に記載の細胞。

【請求項30】

請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体、ＣＡＲ Ｔ細胞、核酸分子、ベクターまたは宿主細胞を含む、組成物。

【請求項31】

前記組成物が、医薬適合性のある担体、希釈剤または賦形剤も含む医薬組成物である、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害の処置または予防のための別の治療剤をさらに含む、請求項３０または３１に記載の組成物。

【請求項33】

請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体、ＣＡＲ Ｔ細胞、核酸分子、ベクターまたは宿主細胞ならびにＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害の処置または予防のための別の治療剤を含む、キットオブパーツ。

【請求項34】

請求項１から２１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントまたは抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞を産生するための方法であって、前記方法が、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の核酸またはベクターを含む細胞を培養すること、ならびに前記細胞が前記核酸またはベクターを翻訳することを可能にすること、それによって、請求項１から２１のいずれか一項に記載の前記抗体または抗原結合フラグメントまたは抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞を産生することを含み、前記方法が、好ましくは前記抗体または抗原結合フラグメントまたは抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞を前記細胞から、および／または培養培地から取り出すことをさらに含む、方法。

【請求項35】

医薬品または予防薬または診断薬としての使用のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞。

【請求項36】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害を処置または予防するための方法における使用のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞。

【請求項37】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害の診断における使用のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞。

【請求項38】

前記障害が、上皮癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、食道胃接合部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、食道胃接合部癌、膀胱癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、尿路癌、前立腺癌、脳腫瘍、甲状腺癌、喉頭癌、カルチノイド癌、肝癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌（ovary cancer）、子宮頸癌、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮内膜癌、上皮内癌、明細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、腎癌、腎細胞癌、腎移行上皮癌、卵管癌および腹膜癌からなる群より選択される、好ましくは結腸直腸癌、結腸癌、結腸癌サブタイプＣＭＳ１、結腸癌サブタイプＣＭＳ２、結腸癌サブタイプＣＭＳ３、結腸癌サブタイプＣＭＳ４、喉頭癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、肺癌、胃癌（stomach cancer）、尿路癌、前立腺癌および卵巣癌（ovary cancer）からなる群より選択される、請求項３２に記載の組成物、請求項３３に記載のキットオブパーツ、または請求項３６もしくは３７に記載の使用のための抗体もしくは抗原結合フラグメントもしくは二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体もしくはＣＡＲ Ｔ細胞もしくは核酸もしくはベクターもしくは宿主細胞。

【請求項39】

前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞が、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害の処置および／または予防に有用である別の治療剤と組み合わせられる、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の使用のための抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞。

【請求項40】

試料がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む、細胞、好ましくは腫瘍細胞を含むかどうかを決定するための、請求項１から２１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞の使用。

【請求項41】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞が試料中に存在するかどうかを決定するための方法であって：
- 前記試料を請求項１から２１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞と接触させること、および
- 前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞が、存在する場合にＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞に結合することを可能にすること、および
- 細胞が、前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞に結合されているかいないかを決定し、それによって、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞が前記試料中に存在するかしないかを決定すること
を含む、方法。

【請求項42】

ヒトまたは非ヒト個体が、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに陽性である癌に罹患しているかどうかを決定するための方法であって：
- 前記個体の腫瘍細胞を請求項１から２１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞と接触させること、
- 前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞が、存在する場合にＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む腫瘍細胞に結合することを可能にすること、および
- 腫瘍細胞が前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞に結合されているかいないかを決定し、それによって、前記個体がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を含む癌に罹患しているかいないかを決定すること
を含む、方法。

【請求項43】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連する障害を処置または予防するための方法であって、請求項１から３３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞または組成物またはキットオブパーツの治療的有効量を、場合によっては、さらなる治療剤または治療手順に関連して、それを必要とする個体に投与することを含む、方法。

【請求項44】

医薬品の製造のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞の使用。

【請求項45】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連する障害を処置または予防するため医薬品の製造のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体または抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞の使用。

【請求項46】

前記障害が、上皮癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、食道胃接合部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、食道胃接合部癌、膀胱癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、尿路癌、前立腺癌、脳腫瘍、甲状腺癌、喉頭癌、カルチノイド癌、肝癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌（ovary cancer）、子宮頸癌、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮内膜癌、上皮内癌、明細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、腎癌、腎細胞癌、腎移行上皮癌、卵管癌および腹膜癌からなる群より選択される、好ましくは結腸直腸癌、結腸癌、結腸癌サブタイプＣＭＳ１、結腸癌サブタイプＣＭＳ２、結腸癌サブタイプＣＭＳ３、結腸癌サブタイプＣＭＳ４、喉頭癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、肺癌、胃癌（stomach cancer）、尿路癌、前立腺癌および卵巣癌（ovary cancer）からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法または請求項４４もしくは４５に記載の使用。

【請求項47】

請求項３４に記載の方法により得られる場合の抗体または抗原結合フラグメントまたは抗体薬物複合体またはＣＡＲ Ｔ細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物学、医学および免疫学の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

膜貫通タンパク質上皮カドヘリン（Ｅ－カドヘリン：とりわけＣＤ３２４、カドヘリン－１、ＣＡＭ１２０／８０およびウボモルリンとも呼ばれる）は、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーである。Ｅ－カドヘリンは、当技術分野において、分子量が約１２０ｋＤａであるカルシウム依存性細胞間接着糖タンパク質として既知であり、５つの細胞外カドヘリン（ＥＣ）リピート（ＥＣ１～ＥＣ５）、膜貫通領域および高度に保存された細胞質テールで構成される。Ｅ－カドヘリンは、上皮細胞を互いにしっかりと保持する細胞間接着タンパク質の重要な種類である。Ｅ－カドヘリンダウンレギュレーションは、組織内部の細胞接着の強度を低下させ、結果として細胞の運動性および上皮間葉転換（ＥＭＴ）の増加となる可能性がある。Ｅ－カドヘリン機能または発現の喪失は、癌の進行および転移に関係している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本発明は、上皮カドヘリン特異性抗体、ならびに癌などの疾患の診断および処置におけるその使用に関する。

【課題を解決するための手段】

【0004】

第１の態様において、本発明は、本明細書において指定された構造的および機能的特徴を含むＥ－カドヘリン特異性抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。

【0005】

種々の実施形態において、本発明は、Ｅ－カドヘリンの１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基を特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前記１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する。好ましい実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントの前記Ｅ－カドヘリンへの結合は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４７２位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４６３位でのグルタミン酸残基、４６５位でのセリン残基、４６９位でのセリン残基、および／または４７７位でのバリン残基の存在により、特に、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および／または４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および／または４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基の存在に対して影響される。いくらかの実施形態において、４６５位および／または４６９位での前記セリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。好ましい実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、Ｏ－マンノシル化完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好にＯ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンを結合する。好ましい実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、Ｏ－マンノシル化完全長Ｅ－カドヘリンよりも、少なくとも２倍良好に、より好ましくは少なくとも３倍良好に、より好ましくは少なくとも４倍良好に、より好ましくは少なくとも５倍良好にＯ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンを結合する。

【0006】

種々の実施形態において、本発明は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは：
ａ．アミノ酸配列ＧＦＸ_１ＦＳＸ_２ＡＷを含む重鎖可変領域ＣＤＲ１（Ｘ_１はＴまたはＩであり、Ｘ_２はＮまたはＹである）；
または前記ＧＦＸ_１ＦＳＸ_２ＡＷ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ．アミノ酸配列ＩＫＳＫＩＤＧ Ｘ_１Ｔ Ｘ_２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２（Ｘ_１はＧまたはＥであり、Ｘ_２はＴまたはＩである）；
または前記ＩＫＳＫＩＤＧ Ｘ_１Ｔ Ｘ_２配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ．アミノ酸配列ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲを含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（Ｘ_１はＡまたはＴであり、Ｘ_２はＤまたはＮである）；
または前記ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ．アミノ酸配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
または前記ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ．アミノ酸配列ＷＡＸ_１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２（Ｘ_１はＳまたはＣである）；
または前記ＷＡＸ_１配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ．アミノ酸配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
または前記ＱＱＹＳＮＴＰＱＴ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
の１つまたは複数、および場合によってはそれぞれを含む。

【0007】

ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるように、配列番号１～１７からなる群より選択されるＶＨ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域；および／または配列番号１８～２２からなる群より選択されるＶＬ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変動は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。

【0008】

種々の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、完全長抗体である。

【0009】

種々の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0010】

種々の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＡアイソタイプである。種々の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＭアイソタイプである。種々の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＤアイソタイプである。ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＤである。

【0011】

種々の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧアイソタイプである。ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１である。ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、好ましくはヒトＩｇＧ１である。

【0012】

種々の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、脱フコシル化されている。

【0013】

ある特定の実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン、好ましくはＯ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンに結合するために、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体と競合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0014】

ある特定の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、以下の特徴：
- Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンの細胞外３（ＥＣ３）ドメインに結合する；
- Ｏ－マンノシル化完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好に、好ましくは少なくとも２倍良好に、より好ましくは少なくとも３倍良好に、より好ましくは少なくとも４倍良好に、より好ましくは少なくとも５倍良好に、Ｏ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンを結合する；および
- Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を同時発現する腫瘍細胞を結合する
の１つまたは複数、好ましくはそれぞれを有している。

【0015】

いくらかの実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、以下の特徴：
- 結腸癌サブタイプＣＭＳ１、ＣＭＳ２、ＣＭＳ３およびＣＭＳ４を結合する；
- 健康な胸腺髄質上皮細胞または樹状細胞またはランゲルハンス細胞よりも良好に結腸癌細胞株ＳＷ９４８を結合する
の少なくとも１つをさらに含む。

【0016】

ある特定の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、別の化合物に結合される。ある特定の実施形態において、前記他の化合物は、治療用化合物である。ある特定の実施形態において、前記他の化合物は、免疫調節化合物、Ｔ細胞結合化合物、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）結合化合物、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）結合化合物、ガンマ－デルタＴ細胞結合化合物、ＣＤ３特異性結合化合物、ＴＧＦβ特異性結合化合物、サイトカイン、二次抗体またはその抗原結合部分、検出可能な標識、薬物、化学療法剤、細胞毒性薬、毒性部分、ホルモン、酵素および放射性化合物からなる群より選択される化合物である。いくらかの実施形態において、前記免疫調節化合物は、本発明による抗体のＦｃテールではない。いくらかの実施形態において、前記免疫調節化合物は、非天然系免疫調節化合物である。

【0017】

直接的または間接的に治療用化合物に結合されている本発明による抗体または抗原結合フラグメントはまた、本明細書では本発明による抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）とも呼ばれる。

【0018】

本発明はまた：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメント；および
- 免疫調節化合物
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性または多重特異性結合化合物、好ましくは二重特異性または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0019】

いくらかの実施形態において、前記免疫調節化合物は、本発明による抗体のＦｃテールではない。いくらかの実施形態において、前記免疫調節化合物は、非天然系免疫調節化合物である。

【0020】

本発明はまた：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメント；および
- Ｔ細胞結合化合物またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）結合化合物またはナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）結合化合物またはガンマ－デルタＴ細胞結合化合物
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性または多重特異性結合化合物、好ましくは二重特異性または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0021】

本発明はまた：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメント；および
- ＣＤ３特異性結合化合物
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性または多重特異性結合化合物、好ましくは二重特異性または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0022】

本発明はまた：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメント；および
- ＫＬＲＧ１特異性結合化合物
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性または多重特異性結合化合物、好ましくは二重特異性または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0023】

本発明はまた：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメント；および
- ＣＤ１０３特異性結合化合物
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性または多重特異性結合化合物、好ましくは二重特異性または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0024】

本発明はまた：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメント；および
- ＴＧＦβ特異性結合化合物
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性または多重特異性結合化合物、好ましくは二重特異性または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0025】

また：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
- 好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞に特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。

【0026】

また：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
・ＣＤ３に特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。

【0027】

また：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
- ＫＬＲＧ１またはＣＤ１０３に特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。

【0028】

また：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
- ＴＧＦβに特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。

【0029】

ある特定の実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を提供し、ＣＡＲ Ｔ細胞は、本発明による抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。前記ＣＡＲ Ｔ細胞はまた、本発明による抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むことが好ましい。好ましくは、前記ＣＤＲ１～３配列は、単鎖フォーマットにおける前記ＣＡＲ Ｔ細胞の表面に存在する。

【0030】

本発明はまた、本明細書において指定された構造的および機能的特徴を含む核酸も提供する。種々の実施形態において、本発明は、本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントをコードする、または本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントの少なくとも重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域をコードする単離、合成または組換え核酸を提供する。

【0031】

ある特定の実施形態において、本発明は、表１に示されるように、配列番号２３～３９からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、および／または配列番号４０～４４からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む核酸を提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記配列変動は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。

【0032】

ある特定の実施形態において、本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。

【0033】

ある特定の実施形態において、本発明による核酸は、ｃＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、またはＤＮＡ／ＲＮＡヘリックスを含む。

【0034】

ある特定の実施形態において、本発明による核酸は、非ヒト宿主細胞における発現に最適化されたコドンである。

【0035】

ある特定の実施形態において、本発明による核酸は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞における発現に最適化されたコドンである。

【0036】

本発明は、本発明による核酸を含むベクターをさらに提供する。いくらかの実施形態において、前記ベクターは、抗原認識ドメインおよびＴ細胞活性化ドメインをコードする核酸配列を含むＣＡＲ Ｔ細胞ベクターである。いくらかの実施形態において、前記ＣＡＲ Ｔ細胞ベクターは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列をさらに含む。

【0037】

本発明は、本発明による抗体、抗原結合フラグメント、核酸、ベクター、ＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞を含む単離または組換え宿主細胞、または非ヒト動物をさらに提供する。ある特定の実施形態において、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞である。

【0038】

本発明はまた、本発明による抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、ＡＤＣ、ＣＡＲ Ｔ細胞または宿主細胞を含む組成物も提供する。種々の実施形態において、前記組成物は、医薬適合性のある担体、希釈剤または賦形剤も含む医薬組成物である。

【0039】

本発明はまた、本発明による抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、ＡＤＣ、ＣＡＲ Ｔ細胞または宿主細胞を含むキットオブパーツも提供する。

【0040】

ある特定の実施形態において、本発明による組成物またはキットオブパーツは、少なくとも１つの他の治療剤をさらに含む。

【0041】

本発明はまた、本発明による抗体または抗原結合フラグメントを産生するための方法も提供し、その方法は、本発明による核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養して前記宿主細胞が前記核酸またはベクターを翻訳することを可能にし、それによって本発明による前記抗体または抗原結合フラグメントを産生することを含む。前記方法は、好ましくは、前記抗体または抗原結合フラグメントを前記宿主細胞から、および／または培養培地から回収することをさらに含む。いくらかの実施形態において、前記宿主細胞には、前記抗体の重鎖をコードする核酸配列および前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列を両方とも含むベクターが提供される。いくらかの実施形態において、前記宿主細胞には、少なくとも２つの異なるベクターが提供され、１つのベクターは、前記抗体の重鎖をコードする核酸配列を含み、第２のベクターは、前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列を含む。

【0042】

また、本発明による方法により得られる場合、抗体または抗原結合フラグメントも提供される。

【0043】

本発明はまた、医薬品または予防薬または診断薬としての使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞も提供する。

【0044】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞も提供される。いくらかの好ましい実施形態において、前記障害は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌である。いくらかの実施形態において、前記癌はまた、ＴＧＦβを発現する腫瘍細胞も含む。

【0045】

種々の実施形態は、本発明による使用のための抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供し、それによって、前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞は、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害の処置および／または予防に有用な別の治療剤と併用される。

【0046】

本発明はまた、医薬品の製造のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞の使用も提供する。

【0047】

また、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する細胞に関連している障害を処置または予防するための医薬品の製造のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞の使用も提供される。特定の実施形態において、前記細胞は腫瘍細胞である。特定の実施形態において、前記Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼは、ＴＭＴＣ３である。また、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌を処置または予防するための医薬品の調製のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞の使用も提供される。特定の実施形態において、前記Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌は、上皮癌である。いくらかの実施形態において、前記Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌は、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、食道胃接合部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、食道胃接合部癌、膀胱癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、尿路癌、前立腺癌、脳腫瘍、甲状腺癌、喉頭癌、カルチノイド癌、肝癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌（ovary cancer）、子宮頸癌、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮内膜癌、上皮内癌、明細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、腎癌、腎細胞癌、腎移行上皮癌、卵管癌および腹膜癌からなる群より選択される。

【0048】

いくらかの実施形態において、前記Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌は、結腸直腸癌、結腸癌、結腸癌サブタイプＣＭＳ１、結腸癌サブタイプＣＭＳ２、結腸癌サブタイプＣＭＳ３、結腸癌サブタイプＣＭＳ４、喉頭癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、肺癌、胃癌（stomach cancer）、尿路癌、前立腺癌および卵巣癌（ovary cancer）からなる群より選択される。

【0049】

本発明はまた、治療的有効量の本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメント、および／または本発明による二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体もしくはＡＤＣもしくはＣＡＲ Ｔ細胞、および／または本発明による核酸、および／または本発明によるベクターもしくは細胞、および／または本発明による組成物もしくはキットオブパーツを、それを必要とする個体に投与することを含む、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害を処置および／または予防するための方法も提供する。治療的有効量の本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメント、および／または本発明による二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体もしくはＡＤＣもしくはＣＡＲ Ｔ細胞、および／または本発明による核酸、および／または本発明によるベクターもしくは細胞、および／または本発明による組成物もしくはキットオブパーツを、それを必要とする個体に投与することを含む、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌を少なくとも一部処置および／または予防するための方法が、さらに提供される。前記組成物は、本発明による医薬組成物であることが好ましい。

【0050】

本発明はまた、試料がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む、細胞、好ましくは腫瘍細胞を含むかどうかを決定するための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞の使用も提供する。

【0051】

また、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む、細胞、好ましくは腫瘍細胞が試料中に存在するかどうかを決定するため方法も提供され、その方法は：
- 前記試料を本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞と接触させること、ならびに
- 前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞が、存在する場合にＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有腫瘍細胞に結合することを可能にすること、ならびに
- 細胞が前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞に結合されているかいないかを決定し、それによって、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有腫瘍細胞が前記試料中に存在するかしないかを決定すること
を含む。

【0052】

また、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞が、試料中に存在するかどうかを決定するための方法も提供され、その方法は：
- 前記試料を本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞と接触させること、ならびに
- 前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞が、存在する場合にＥ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に結合することを可能にすること、ならびに
- 細胞が前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞に結合されているかいないかを決定し、それによって、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞が前記試料中に存在するかしないかを決定すること
を含む。

【0053】

本発明はまた、ヒトまたは非ヒト個体がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに陽性である癌に罹患しているかどうかを決定するための方法も提供し、その方法は：
- 前記個体の腫瘍細胞を本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞と接触させること、
- 前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞が、存在する場合にＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有腫瘍細胞を結合することを可能にすること、ならびに
- 腫瘍細胞が前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞に結合されているかいないかを決定し、それによって、前記個体がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに陽性である癌に罹患しているかいないかを決定すること
を含む。

【0054】

いくらかの実施形態において、前記方法は、エクスビボ方法である。他の実施形態において、前記方法は、インビボで実行される。

【図面の簡単な説明】

【0055】

【図1A】（Ａ）本文全体で使用されている番号付けを含む、完全長Ｅ－カドヘリンアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＩＩ７）が示されている。

【図1B】（Ｂ）Ｅ－カドヘリンの異なるドメインが示される。Ｂｅｒｘ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９５から採用。赤はＡＴ１６３６の予測された結合エピトープ。

【図1C】（Ｃ）さらに実施例においてｐ７０と示されている、膜貫通（イタリック）および細胞間ドメインを含む短縮７０ｋＤａタンパク質が示されている。

【図2】（Ａ）ＡＴ１００２およびＡＴ１６３６抗体の免疫沈降試料を分析するＳＤＳ－ＰＡＧＥ。矢印は、ＡＴ１６３６により免疫沈降させ、質量分析により分析したタンパク質「バンド」を示し、ＪＫＴ＝Ｊｕｒｋａｔ陰性対照Ｔ細胞株、ＤＬＤ１は、結腸癌細胞株であり、Ｍ＝分子量マーカー、ＩＰ＝免疫沈降およびＡＴ１００２は、陰性対照抗体である。（Ｂ）ＥＰ７００Ｙウサギ抗体（アブカム）およびＣテール細胞内指向性抗体（ＢＤバイオサイエンス）による完全長Ｅ－カドヘリンの免疫沈降ならびにＤＬＤ１細胞からのＡＴ１６３６によるｐ７０タンパク質の免疫沈降を示すウェスタンブロット。ＥＰ７００Ｙ；細胞外膜近位ＥＣ５ドメインを結合する；Ｃテールイントラ、Ｅ－カドヘリン（ＢＤバイオサイエンス）のＣ末端細胞内ドメインに特異的で、検出のために使用されたマウス抗Ｅ－カドヘリン、ならびにＡＴ１６３６は、ｐ７０Ｅ－カドヘリン型に優先的に曝露されているエピトープと反応する。

【図3】完全長および短縮ｐ７０Ｅ－カドヘリンを表すグラフィックの概要。黒色のロリポップは、報告されたＯ－マンノースグリコシル化部位（Ｌａｒｓｅｎ ＰＮＡＳ（２０１７）およびＶｅｓｔｅｒ－Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ＰＮＡＳ（２０１３））を示し、白色および暗灰色のロリポップは、予測されたＯ－マンノースグリコシル化部位を説明し、明灰色のロリポップは、ＡＴ１６３６免疫沈降ｐ７０Ｅ－カドヘリンの質量分析によりマンノシル化されている可能性があることにより我々が同定した部位を説明する。太字で示されたアミノ酸残基は、アラニンスキャニングにより決定されたようにＡＴ１６３６結合にとって重要である。大文字の残基４７２および４７４は、Ｏ－マンノシル化されていることが既知であり、４７０は、Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１７およびＶｅｓｔｅｒ－Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１３により記載されるようにマンノシル化されることが予測されている。完全長Ｅ－カドヘリン（上）において、ＳＣ１０．１７（抗ＣＤ３２４モノクローナル抗体およびその使用、米国特許第９５３４０５８号）およびＥＰ７００Ｙの抗体結合領域ならびにβ－カテニン結合領域が示される。

【図4】異なる阻害剤で前処理されているＤＬＤ１細胞へのＡＴ１６３６の結合のフローサイトメトリ分析。Ｍａｎｎ（マンノシルトランスフェラーゼ阻害剤：４－オキソ－２－チオキソ－３－チアゾリジニル酢酸（シグマ））またはＣＭＫ（フーリン含有コンベルターゼ阻害剤：デカノイル－ＲＶＫＲ－ＣＭＫ（Ｔｏｃｒｉｓ））阻害剤で４８時間前処理したＤＬＤ１細胞に対しての５μｇ／ｍｌでのＡＴ１６３６および対照抗体ＡＴ１００２およびＥＰ７００Ｙのヒストグラム（実線、オープンヒストグラム）が示されている。塗りつぶされたヒストグラムは、非処理細胞への結合を示す。

【図5】（Ａ）Ｅ－カドヘリンクローン親クローン、７Ｇ０２の平均結合と比較してＥ－カドヘリン組換えタンパク質への増加した結合を有するサブクローン（赤ボックス）の選択および単離。細胞を組換えＥ－カドヘリンタンパク質およびＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－Ａｌｅｘａ６４７および抗マウスＦｃ－ＰＥ抗体で染色した。ゲート細胞の単一細胞クローニングを細胞ソーター（ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ、ＢＤ）で実行した。（Ｂ）親７Ｇ０２クローンと比較したＥ－カドヘリン抗原結合の増加したサブクローンの選択。ＡＴ１６３６ＧＦＰ低親細胞をＧＦＰ高サブクローン細胞と混合した。細胞のこの混合物をＥ－カドヘリン結合およびＢＣＲ発現について染色した。親７Ｇ細胞（オレンジ色）と比較したサブクローン（青色）のＢＣＲ発現に関連する抗原結合の強度が示されている。

【図6A】（Ａ）フローサイトメトリにより検出されるようなヒトＣＲＣ細胞株ＤＬＤ１、胸部上皮細胞株ＭＣＦ１０ａおよびマウスＣＲＣ細胞株ＣＭＴ９３へのＡＴ１６３６およびＡＴ１６３６高親和性変異型の結合曲線が示されている（ヤギ抗ヒト二次抗体（インビトロジェン）に共役したＡｌｅｘａ６４７染料の中央蛍光強度（ＭＦＩ）が示されている）。ＥＰ７００ＹおよびＳＣ１０．１７抗体は、マウスＥ－カドヘリンと交差反応しない。

【図6B】（Ｂ）皮膚上皮細胞株Ａ４３１、肺Ａ５４６およびマウスＣＭＴ９３細胞株に対してフローサイトメトリにより検出されるようなＡＴ１６３６およびＡＴ１６３６－ＹＮおよび－ＩＹＮ変異型の対照抗体ＡＴ１００２に対する結合比が示されている。

【図7A】（Ａ）可溶性ｐ７０Ｅ－カドヘリンへのＡＴ１６３６、ＡＴ１６３６－ＮＹおよび－ＩＹＮ変異型のＳＰＲ結合。５．０μｇ／ｍｌの抗体を、２．０μｇ／ｍｌのｐ７０Ｅ－カドヘリンで固定化されたスポットに注入した。対照として、ＥＣ５ドメインに特異的であるＥＰ７００Ｙウサギ抗ヒトＥ－カドヘリンを使用した。結合は、ＩＢＩＳマルチプレックスＳＰＲイメージングを使用して検出される．

【図7B】（Ｂ）組換えの、固定化された完全長Ｅ－カドヘリン（左パネル）、ｐ７０Ｅ－カドヘリン（中央パネル）および（この残基のマンノシル化を阻止する）Ｍ４７０Ａ置換を含むＥ－カドヘリンＤ３ドメイン（右パネル）へのＡＴ１６３６およびＡＴ１６３６－ＩＹＮ変異型の結合を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイ。ＳＣ１０．１７抗体は、完全長（ＥＣ１ドメイン）には結合するが、ｐ７０およびＤ３ドメインには結合しない対照抗体として使用される。ＡＴ１００２は、インフルエンザに特異的な陰性ヒト対照抗体である。

【図7C】（Ｃ）組換えの、固定化された完全長Ｅ－カドヘリン（左パネル）、ｐ７０Ｅ－カドヘリン（中央パネル）および（この残基のマンノシル化を阻止する）Ｍ４７０Ａ置換を含むＥ－カドヘリンＤ３ドメイン（右パネル）に結合するために幅広い濃度範囲のＡＴ１６３６およびその変異型を使用するＥＬＩＳＡアッセイ。ＡＴ１００２は、インフルエンザに特異的な陰性ヒト対照抗体である。

【図8A】（Ａ）ＡＴ１６３６免疫沈降および高レベルのマンノピラノシドを使用するＡＴ１６３６免疫沈降物からのｐ７０の特異的溶出の後の投入物およびフロースルー（ＦＴ）を示すウェスタンブロット。

【図8B】（Ｂ）ＨＥＫ細胞に由来する完全長Ｅ－カドヘリン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）へのＡＴ１６３６結合（左パネル）および大腸菌由来Ｅ－カドヘリン（Ｌｓｂｉｏ）へのＡＴ１６３６の結合の欠如（左パネル）を示すＥＬＩＳＡ。大腸菌産生Ｅ－カドヘリンは、ＥＰ７００Ｙ抗体により認識される。

【図9】Ｅ－カドヘリン ｐ７０短縮ＥＣ３ドメイン（Ｄ３）のアラニン置換は、ＡＴ１６３６の結合に必須であるいくらかのアミノ酸を明らかにする。組換え小規模Ｄ３－ＦＬＡＧマウスＦｃ融合タンパク質へのＡＴ１６３６の結合は、抗マウスＦｃ捕捉時にＥＬＩＳＡにより研究された。すべてのタンパク質は、培養上清において類似の量で発現し、Ｄ３野生型結合は、１と設定され、すべて、抗ＦＬＡＧ検出に正規化される。

【図10】示されている計算解析は、いくらかの腫瘍特異的細胞株におけるＴＭＴＣ３およびＥ－カドヘリンの複合ｍＲＮＡ発現である；円の中央には、組織の種類ごとに含まれる腫瘍細胞株の数がある。明灰色で、腫瘍細胞株の割合がＥ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３発現の両方について高く（≧７倍）、したがって、ＡＴ１６３６により認識されると予測される。７のカットオフ値は、表３を参照して、そのような細胞株がＡＴ１６３６抗体により結合される可能性があることを示したフローサイトメトリ分析に基づいて選択された。通常はＴＭＴＣ３およびＥ－カドヘリンの両方について陰性である組織は、造血組織またはリンパ組織、骨および軟部組織である。（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ，Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｉｎａ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）から得られたデータ）。

【図11】ＡＴ１６３６の結合が完全長Ｅ－カドヘリンを含むコンストラクトを用いて形質導入されたＳＫ－ＭＥＬ－５細胞に対して増加していることを示唆するフローサイトメトリ分析。ＳＫ－ＭＥＬ－５が、通常はＥ－カドヘリンに対して陰性であるが、ＴＭＴＣ３を発現する。ＡＴ１６３６（実線）は、ＳＫ－ＭＥＬ－５（左）には結合しないが、Ｅ－カドヘリンが過剰発現する場合に結合する（中央）。また、ＥＰ７００Ｙ（右）は、ここで、ＳＫ－ＭＥＬ－５が結合されている。明灰色曲線は、アイソタイプの対照のバックグラウンド染色である。

【図12】ｓｈＲＮＡ誘導ＴＭＴＣ３ノックダウンは、フローサイトメトリにより決定されるように、結果として低減されたＡＴ１６３６結合となる。対照のスクランブルｓｈＲＮＡベクターのほかに、ＴＭＴＣ３標的化ｓｈＲＮＡプローブが開発され、試験された。ＴＭＴＣ３発現は、ｑＰＣＲにより決定されるように強力に低下される（左）。ＴＭＴＣ３ノックダウンは、結果として、ＡＴ１６３６結合において＞３倍の低下となった（右パネル、実線）。

【図13A】（Ａ）抗ＣＤ３ ＵＣＨＴ１に融合したＡＴ１６３６またはＡＴ１６３６－ＩＹＮからなる一価Ｔ細胞誘導体（ｍＴＣＥ）の構造のグラフィック表現。

【図13B】（Ｂ）化合物を２Ｄ細胞培養モデルにおいて試験し、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ陽性ＣＲＣ細胞株ＤＬＤ１、ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６を５０００ｃ／ｗ（９６ｗ）でＯ／Ｎ培養した後、エフェクタ細胞として刺激されていない総ＰＢＭＣとともに２日間インキュベートした。細胞毒性は、４８時間にわたって発現したルシフェラーゼの測定により確立された。

【図13C】（Ｃ）ＡＴ１６３６、ＡＴ１６３６－ＩＹＮまたはＡＴ１００２およびＵＣＨＴ１抗体に由来するＣＤ３εｓｃＦｖの両方について一価であるノブインホール（ＫｉＨ）二重特異性フォーマットの構造のグラフィック表現。

【図13D】（Ｄ）化合物を２Ｄ細胞培養モデルにおいて試験し、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ陽性ＣＲＣ細胞株ＤＬＤ１およびＨＴ２９およびメラノーマ細胞株Ａ３７５を５０００ｃ／ｗ（９６ｗ）でＯ／Ｎ培養した後、ＫｉＨ二重特異性一価ＡＴ１６３６、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１００２をＵＣＨＴ１ ｓｃＦｖ ＣＤ３εとインキュベートし、続いて、エフェクタ細胞として刺激されていない総ＰＢＭＣとともに２日間培養した。細胞毒性は、４８時間のインキュベーション時間の終わりでのルシフェラーゼ活性の測定により評価された。

【図14】通常、Ｅ－カドヘリンを発現する細胞株（ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６、およびＨＴ２９）および通常、Ｅ－カドヘリンに対して陰性である細胞（ＳＫ－ＭＥＬ－５）におけるｐ７０Ｅ－カドヘリンおよび完全長Ｅ－カドヘリンの安定した過剰発現。左の列は空のベクターが形質導入された細胞を示す。ｐ７０Ｅ－カドヘリンの過剰発現で、すべての細胞は、脱接着形態学的表現型（ＥＭＴ表現型を示唆）を示す。

【図15】ＴＧＦβの非存在下で培養された細胞と比較してＴＧＦβとともに長期間培養されたＤＬＤ１細胞に結合するＡＴ１６３６のフローサイトメトリ分析。

【図16A】ＴＧＦβおよびＡＴ１６３６－ＩＹＮの添加後に低下した細胞増殖および細胞数。（Ａ）ＴＧＦβおよびＡＴ１６３６およびＡＴ１６３６－ＩＹＮ変異型の非存在下または存在下でのＡ４３１細胞培養物。一番上の行のパネルは、組織培養処理済みプラスチック上で５日間培養されたＡ４３１細胞を示し、一番下の行のパネルは、１０×倍率を使用してフィブロネクチンコートプラスチック上で培養された細胞Ａ４３１細胞を示す。左パネルは培養培地中、中央のパネルはＴＧＦβの存在下で、右はＴＧＦβおよびＡＴ１６３６－ＩＹＮとともに培養された細胞を示す。ＴＧＦβおよびＡＴ１６３６－ＩＹＮの存在下で培養されたウェルにおいて、減少した（生存可能な）細胞および接着性がより低い細胞が観察された。プラスチックまたはフィブロネクチンコートプレートで培養された細胞間で差異は観察されず、ＡＴ１６３６－ｗｔまたはＡＴ１００２対照抗体について、影響は観察されなかった（示さず）。

【図16B】（Ｂ）ＴＧＦβ（左パネル）およびＴＧＦβおよびＡＴ１６３６－ＩＹＮ（右パネル）の存在下での培養７日後にフィブロネクチンコートウェルで培養されたＡ４３１細胞の２０×倍率を使用する詳細な代表的な概要。右パネルでは、より丸く、乾燥した単一細胞および接着性がより低い細胞が観察される。

【図17】ｐＨ感受性Ｚｅｎｏｎ ｐＨｒｏｄｏ ｉＦＬ染料を使用して蛍光顕微鏡（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）で検出されたＤＬＤ１細胞におけるＡＴ１６３６およびその変異型の内在化の時系列分析。陰性対照ＡＴ１００２を除くすべての抗体は、内在化される。

【図18】ＡＴ１６３６およびその変異型およびＣＤ１０３特異性抗体（ＭＣＡ７０８）とインキュベートした後の完全長およびｐ７０Ｅ－カドヘリンタンパク質が結合したプレート上でインキュベートされたＣＦＳＥ標識ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の細胞表面被覆率が示されている。

【発明を実施するための形態】

【0056】

Ｅ－カドヘリン
Ｅ－カドヘリンはヒトに存在し、ＣＤ３２４とも呼ばれるＣＤＨ１遺伝子によりコードされている。現在既知であるヒトＥ－カドヘリンのアミノ酸配列を図１Ａに示す。Ｅ－カドヘリンは、上皮細胞の接着結合に局在化する１２０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である。Ｅ－カドヘリンは、いくらかのサブタイプ：Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）、Ｎ－カドヘリン（ＣＤＨ２）、およびＰ－カドヘリン（ＣＤＨ３）などのタイプＩの古典的カドヘリン；ＶＥ－カドヘリン（ＣＤＨ５）およびＯＢ－カドヘリン（ＣＤＨ１１）などのタイプＩＩの古典的カドヘリン；デスモソームカドヘリン；７回膜貫通型カドヘリン；ＦＡＴおよびｄａｃｈｓｏｕｓ（ＤＣＨＳ）グループのカドヘリン；ならびにプロトカドヘリン（ＰＣＤＨ）に分類することができるカドヘリンの大きなファミリーのメンバーである。Ｅ－カドヘリンは、３つの成分：（１）同型のカドヘリン－カドヘリン相互作用を担っている細胞外カドヘリンドメイン（ＥＣ）（２）１回膜貫通型ドメインまたは７回膜貫通型ならびに（３）細胞表面、関連する細胞質カテニンタンパク質および細胞骨格の間のコネクタとして作用する細胞質ドメインを有する膜貫通タンパク質である。カドヘリンは、生物の成長（胚発生）、創傷治癒および腫瘍浸潤および転移に関与する。

【0057】

カルシウム依存性接着分子であることに加えて、Ｅ－カドヘリンはまた、上皮接合部形成の重要な調節因子である。カテニンとのその連携は、細胞－細胞接着および外側膜と頂端膜との間の上皮細胞／上皮シートの極性化を必要とする。チロシンリン酸化は、これらの複合体を崩壊させることができ、細胞接着特性における変化をもたらす。Ｅ－カドヘリン発現は、高侵襲性で不十分な分化の癌腫において頻繁にダウンレギュレートされる。これらの細胞におけるＥ－カドヘリンの増加した発現は、侵襲性を低下させる。したがって、Ｅ－カドヘリンの発現または機能の喪失は、腫瘍形成の進行における重要なステップであるように思われる。さらに、カドヘリンは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、可逆的なプロセスを通じた細胞の浸潤および遊走において重要な役割を果たす。ＥＭＴは、多くの外部シグナル（炎症、ストレス、低酸素、免疫応答など）により調整することができる非常に多様なプロセスである。特に、ＥＭＴ誘導転写因子（Ｓｎａｉｌ、Ｅ４７、ＴｗｉｓｔおよびＺｅｂファミリー）の強力な調節が、ＥＭＴに基づいており、例えばＴＧＦβ、Ｗｎｔ、インテグリンおよび増殖因子の細胞への結合により、結果としてＥ－カドヘリン、ＺＯ－１、デスモプラキンのダウンレギュレーション、ならびにビメンチン、フィブロネクチン、Ｎ－カドヘリンなどアップレギュレーションとなることが、一般に受け入れられている。細胞は、より「幹細胞性」のような表現型に似ているプロセスを通過する。さらに最近では、既知のＥＭＴマーカーのダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションなしで細胞がＥＭＴを「示す」こともできることが観察されたため、このモデルは変更されている。これは、部分的ＥＭＴ、ハイブリッドＥＭＴ／ＭＥＴおよび準ＥＭＴと名付けられており、新規モデルのほとんどは、細胞がタンパク質発現を調節することができる（例えばタンパク質内在化、高／低タンパク質の代謝回転）か、細胞が一緒に（クラスター）、活性／侵襲性の異なるモードを有するシステムを提案する。Ｅ－カドヘリンは、それらのプロセスで支配的な役割を果たしており、この点で、Ｅ－カドヘリンＯ－マンノシル化は、腫瘍細胞が周囲のマトリックスと相互作用する間、接着および形態学的変化を調節するための追加のツールであると考えられている。

【0058】

抗Ｅ－カドヘリン抗体およびその抗原結合フラグメント
本発明は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを特異的に結合することができる抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。いくらかの実施形態において、抗体は単離される。他の実施形態において、抗体は、合成または組換えである。興味深いことに、本発明は、転移を有するステージＩＶ結腸癌に罹患しているが、化学療法後何年もの間、完全に寛解しているヒト個体に由来するヒト抗体のＶＨおよびＶＬ配列に基づいているＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。対照的に、多くの現在既知の治療用抗体は、典型的には、マウス、ラット、ラクダ、ウサギまたはヤギなどの非ヒト動物を免疫化し、その後、場合によってはヒト化プロセスを行うことにより得られる。そのようなヒト化抗体は、非ヒト配列に対するレシピエントの免疫応答に起因する有害な副作用のリスクを依然として伴う。加えて、多くの従来技術の治療用抗体またはそのフラグメントは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖が無作為に対になっている人工ファージディスプレイライブラリに由来する。対照的に、本発明は、完全寛解状態にあるヒト患者においてインビボで進化している抗体の配列に基づいて、自然に対になっている重鎖および軽鎖を有する抗体および抗原結合フラグメントを提供する。

【0059】

Ｅ－カドヘリンが、多くの上皮組織において幅広く発現しているので、本発明以前は、特にＥ－カドヘリンがＥＭＴを促進するために腫瘍細胞において頻繁にダウンレギュレートされる事実に鑑み、当技術分野において治療用途のための選択の抗原としてＥ－カドヘリンは考慮されていなかった。しかし、本発明は、腫瘍細胞において頻繁にアップレギュレートされている、約７０ｋＤａの分子量を有するＥ－カドヘリンの短縮型を特異的に結合することができる、抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。

【0060】

本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、タンパク質性分子ならびに任意のその抗原結合フラグメントを包含する。前記タンパク質性分子は、好ましくは免疫グロブリンタンパク質であり、それらがタンパク質の免疫グロブリンクラスに属していることを意味する。いくらかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗原上のエピトープを結合する１つまたは複数のドメインを含み、そのようなドメインは、好ましくは抗体の可変ドメインに由来するか、それと配列相同性を共有する。

【0061】

相補性決定領域（ＣＤＲ）は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインに存在する超可変領域である。完全長抗体の場合、重鎖のＣＤＲ１～３および接続した軽鎖のＣＤＲ１～３は一緒に抗原結合部位を形成する。

【0062】

天然の抗体のフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域は、２つの重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインで構成される。

【0063】

典型的には、抗体の抗原結合フラグメントは、必ずしも同じ程度である必要はないが、前記抗体と同じ抗原を結合することができる。いくらかの実施形態において、抗原結合フラグメントは、少なくとも抗体の重鎖ＣＤＲ３領域を含む。いくらかの実施形態において、抗原結合フラグメントは、少なくとも抗体の重鎖ＣＤＲ３領域および軽鎖ＣＤＲ３領域を含む。いくらかの実施形態において、前記重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、互いに対になっている。

【0064】

種々の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む。種々の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくともＶＨドメインを含む。種々の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む。種々の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくともＶＬドメインを含む。種々の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくともＶＨおよびＶＬドメインを含む。

【0065】

本発明による抗体または抗原結合フラグメントの非限定例は、完全長抗体、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）（２つの異なるＩｇＧ１を含む二重特異性抗体）、単一ドメイン抗体またはナノボディ（単一ＶＨまたはＶＬドメインを含む）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ；典型的に短いリンカーペプチドにより接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む）、Ｆｖフラグメント（ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む、典型的にはリンカーがない）、ｕｎｉｂｏｄｙ（商標）、Ｆｄフラグメント（ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む）、ｄｉａｂｏｄｙ（２つのＶＨドメインおよび２つのＶＬドメインを含み、ＶＨはそのような短いリンカーによりＶＬと結合しており、互いに対になることができないが別の鎖のＶＬおよびＶＨと対になり、それによって２つの抗原結合部位を作成する）、Ｆａｂフラグメント（重鎖定常ドメインＣＨ１、軽鎖定常ドメインＣＬならびに重鎖可変ドメインＶＨおよび軽鎖可変ドメインＶＬを含む）ならびにＦ（ａｂ’）_２フラグメント（ジスルフィド架橋により結合した２つのＦａｂフラグメントを含む）である。

【0066】

種々の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくらかの実施形態において、前記ＶＨは、前記ＶＬと対になっている。

【0067】

治療的使用のための抗体は、可能な限り処置される被験者の自然抗体に近いもの（例えば、ヒト被験者についてはヒト抗体）が好ましい。種々の実施形態において、本発明の抗体は、完全長抗体、好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭまたはＩｇＡ完全長抗体である。本明細書で使用されるように、ＩｇＧ完全長抗体は、２つのガンマクラスの重鎖および２つの軽鎖を含む二価の分子である。当業者に周知であるように、抗体の重鎖は、免疫グロブリン分子を構成する２つのタイプの鎖のうち大きいほうである。天然重鎖は、典型的には、定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む定常ドメインＣＨ、ならびに抗原結合に関与する可変ドメイン（ＶＨ）を含む。抗体の軽鎖は、免疫グロブリンを構成する２つのタイプの鎖のうち小さい方である。天然軽鎖は、典型的には、定常ドメイン（ＣＬ）および可変ドメイン（ＶＬ）を含む。軽鎖可変ドメインは、常にではなく頻繁に、抗原結合に関与する重鎖の可変ドメインと一緒になっている。

【0068】

完全長ＩｇＤ抗体は、デルタクラスの２つの重鎖および２つの軽鎖を含む二価の分子である。

【0069】

ＩｇＭの場合における完全長抗体は、免疫グロブリンの各モノマーが重鎖および軽鎖で形成される２つの抗原結合部位を有する５個または６個の結合した免疫グロブリンを含む十価または十二価の分子である。

【0070】

ＩｇＡの場合における完全長抗体は、単量体または二量体であり得る。

【0071】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントである。ヒトアミノ酸配列の存在は、マウスまたはヒト化抗体とは反対に、ヒト患者における治療的使用中の有害な副作用の機会を少なくし、非ヒトＣＤＲまたは可変領域または定常領域の配列は、ヒトレシピエントにおける抗マウス免疫応答のリスクに関与する。

【0072】

種々の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧアイソタイプ、好ましくはＩｇＧ１である。これは、例えばＩｇＧ１抗体が典型的にヒト個体へのインビボ投与時に好ましい半減期を有しているので、ヒトにおける医療用途に有益である。さらに、ＩｇＧ１のＦｃテールは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）のようなエフェクタ機能を可能にする。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧ１である。

【0073】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ２アイソタイプである。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ３アイソタイプである。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプである。

【0074】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＭアイソタイプである。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＡアイソタイプである。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＩｇＤアイソタイプである。

【0075】

種々の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つまたは複数の突然変異を含む。そのような突然変異は、例えば、アミノ酸置換、挿入または欠失を含む。本明細書で使用されるように、得られる抗体の結合特徴を本質的に変更せずに１個または数個、好ましくは最大２０個のアミノ酸残基が欠失している完全長抗体は、依然として完全長抗体とみなされる。

【0076】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、修飾されたＦｃテールを有する。いくらかの実施形態において、前記Ｆｃテールは、１つまたは複数のアミノ酸置換（複数を含む）および／またはグリコシル化の変更により修飾されている。いくらかの実施形態において、前記Ｆｃテールは、ＡＤＣＣ活性を低下させるために修飾されている。いくらかの実施形態において、前記Ｆｃテールは、ＡＤＣＣ活性を強化するために修飾されている。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、脱フコシル化されており、それによって、ＡＤＣＣ活性が強化される。

【0077】

用語「結合することができる」、「特異的に」、「特異的に結合することができる」、「特異的結合が可能である」および「結合する」は、本明細書において交換可能に使用され、抗体、またはその抗原結合フラグメントと、その標的（その抗原とも呼ばれる）との間の相互作用を指す。これは、前記抗体または抗原結合フラグメントが他の抗原またはアミノ酸配列よりも優先的に前記抗原に結合することを意味する。したがって、抗体または抗原結合フラグメントが、他の抗原またはアミノ酸配列に非特異的に結合する可能性があるが、前記抗体または抗原結合フラグメントのその抗原に対する結合親和性は、前記抗体または抗原結合フラグメントの他の抗原またはアミノ酸配列に対する非特異的結合親和性よりも有意に高い。

【0078】

典型的に、いくらかの方法において修飾されている本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、少なくとも５０％のその結合活性（親抗体と比較した場合）を保持している。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、親抗体と比較して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のその結合活性を保持している。

【0079】

いくらかの実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、実質的にその生物学的活性を変更しない保存的または非保存的アミノ酸置換を含む（得られる変異型は、本明細書においてそれぞれ「保存的変異型」または「機能保存変異型」と呼ばれる）。いくらかの実施形態において、そのような保存的変異型または機能保存変異型は、親抗体と比較して少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％のその結合活性を保持している。

【0080】

本明細書で使用されるように、保存的置換は、それによってアミノ酸残基が一般的に類似の特性（サイズ、疎水性など）を有する別の残基で置換されている置換であり、そのため、抗体の全体的な機能性は、本質的に影響されない。典型的には、表２に示される、同じクラス内でのアミノ酸残基の置換は、保存的アミノ酸置換とみなされる。

【0081】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに結合することができる本発明による抗体または抗原結合フラグメントはまた、前記抗体または抗原結合フラグメントにより結合されるＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンエピトープが前記他の化合物にも期せずして存在する場合、別の化合物にも特異的である可能性がある。そのような場合において、本明細書でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに特異的であると呼ばれている抗体または抗原結合フラグメントはまた、同じ種類のＯ－マンノシルエピトープを含むそのような他の化合物にも特異的である。そのような他のＯ－マンノシル化エピトープは、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンをインビボで産生するＯ－マンノシルトランスフェラーゼ以外の別のＯ－マンノシルトランスフェラーゼによりインビボで産生される可能性がある。したがって、用語「結合すること」または「特異的な」は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの別のタンパク質または同じ種類のＯ－マンノシル化エピトープを含むタンパク質（複数を含む）への結合を排除しない。

【0082】

「結合親和性」は、抗体または抗原結合フラグメントの単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で使用されるように、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体および抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。親和性は、一般に、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）により表すことができ、ｋ_ａのｋ_ｄに対する比率として算出されるものであり、例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５－８８１を参照されたい。親和性は、例えば、ＢｉａＣｏｒｅ（ＧＥヘルスケア）、Ｏｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）またはＩＢＩＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＢＶ（ヘンゲロー、オランダ）のＩＢＩＳ－ｉＳＰＲインスツルメントなどの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイまたはＫｉｎｅｘａなどの液相アッセイなどの当技術分野で既知の一般的な方法により測定することができる。

【0083】

本明細書で使用されるように、用語「核酸」および「核酸分子」は、交換可能に使用される。いくらかの実施形態において、本発明による核酸または核酸分子は、ヌクレオチドの鎖、より好ましくはＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む。いくらかの実施形態において、本発明による核酸または核酸分子は、例えばＤＮＡ／ＲＮＡヘリックス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および／またはロック核酸（ＬＮＡ）などの、天然ヌクレオチドと同じ機能を示す非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド構築ブロックを含む。

【0084】

アミノ酸または核酸配列の同一性の割合、または用語「％配列同一性」は、本明細書において、２つの配列を整列させて必要に応じてギャップを導入し、最大パーセント同一性に達した後の参照配列における残基と同一である、候補アミノ酸または核酸配列における残基の割合として定義される。整列のための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野において周知であり、例えば「Ａｌｉｇｎ２」である。

【0085】

本明細書で使用されるように、単数形の用語「ａ」は、用語「１つまたは複数」を包含する。

【0086】

代表的なＥ－カドヘリン特異性抗体
本発明は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに特異的であり、特定の構造的および機能的特徴を有する抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびに疾患の処置または予防のためのそれらの治療的使用を提供する。そのような疾患の非限定例は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有癌である。

【0087】

本明細書で使用されるように、用語「Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン」は、マンノースがスレオニンまたはセリンの酸素原子と結合していることを意味するＯ－結合マンノースを有する少なくとも１つの前記スレオニンまたはセリン残基を含むＥ－カドヘリンタンパク質を指す。いくらかの実施形態において、前記Ｅ－カドヘリンタンパク質は、少なくとも１つの単一Ｏ－マンノシル化スレオニンまたはセリン残基を含む。用語「単一Ｏ－マンノシル化スレオニン残基」は、別の糖部分のＯ－結合マンノースへの結合がない前記Ｏ－結合マンノースを含むスレオニン残基を指す。用語「単一Ｏ－マンノシル化セリン残基は、別の糖部分のＯ－結合マンノースへの結合がない前記Ｏ－結合マンノースを含むセリン残基を指す。

【0088】

種々の実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに特異的である本発明による抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントの前記Ｅ－カドヘリンへの結合は、図１Ａに示されるように、Ｅ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４７２位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４６３位でのグルタミン酸残基、４６５位でのセリン残基、４６９位でのセリン残基、および／または４７７位でのバリン残基の存在に依存している。

【0089】

いくらかの実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに特異的である抗体、およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントの前記Ｅ－カドヘリンへの結合は、図１Ａに示されるように、Ｅ－カドヘリンアミノ酸領域４６７～４７２内の１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基の存在に依存している。いくらかの実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および／または４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および／または４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および／または４７２位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基の存在に依存している。いくらかの実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基の存在に依存している。いくらかの実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基の存在に依存している。いくらかの実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４７２位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基の存在に依存している。いくらかの実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントの前記Ｅ－カドヘリンへの結合は、図１Ａに示されるように、Ｅ－カドヘリン配列の４６３位でのグルタミン酸残基、および／または４６５位でのセリン残基、および／または４６９位でのセリン残基、および／または４７７位でのバリン残基の存在にさらに依存している。いくらかの実施形態において、４６５位および／または４６９位での前記セリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。

【0090】

本明細書で使用されるように、抗体または抗原結合フラグメントの結合は、前記アミノ酸残基のアラニン残基による置き換えが、前記抗体または抗原結合フラグメントのその抗原への結合を少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％低減する場合、ある特定のアミノ酸残基に「依存している」。

【0091】

いくらかの実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに特異的であり、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、および／または４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、および／または４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、および／または４７２位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、および／または４６３位でのグルタミン酸残基、および／または４６５位でのセリン残基、および／または４６９位でのセリン残基、および／または４７７位でのバリン残基に特異的に結合する本発明による抗体または抗原結合フラグメントを提供する。いくらかの実施形態において、４６５位および／または４６９位での前記セリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。

【0092】

本発明のいくらかの実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに特異的であり、Ｅ－カドヘリンのＯ－マンノシル化スレオニン残基の１つまたは複数に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する。

【0093】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基、および４７２位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基からなる群より選択される１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４７２位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。

【0094】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。

【0095】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。

【0096】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列の４６７位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４６８位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基および４７２位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。

【0097】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のＴ４６８およびＴ４７０を含むＥ－カドヘリンの領域を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、スレオニン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。

【0098】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のＴ４６７、Ｔ４６８およびＴ４７０を含むＥ－カドヘリンの領域を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、３つのスレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。

【0099】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のＴ４６７、Ｔ４６８、Ｔ４７０およびＴ４７２を含むＥ－カドヘリンの領域を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の３つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、４つのスレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。

【0100】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のＴ４６８、Ｓ４６９およびＴ４７０を含むＥ－カドヘリンの領域を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、スレオニン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記セリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。

【0101】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のＴ４６７、Ｔ４６８、Ｓ４６９およびＴ４７０を含むＥ－カドヘリンの領域を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記セリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。

【0102】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のＳ４６５、Ｔ４６７、Ｔ４６８、Ｓ４６９およびＴ４７０を含むＥ－カドヘリンの領域を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、少なくとも１つのセリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、セリン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。

【0103】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のＳ４６５、Ｔ４６７、Ｔ４６８、Ｓ４６９、Ｔ４７０およびＴ４７２を含むＥ－カドヘリンの領域を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも３つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、少なくとも１つのセリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、セリン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。

【0104】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のＥ４６３、Ｓ４６５、Ｔ４６７、Ｔ４６８、Ｓ４６９、Ｔ４７０およびＴ４７２を含むＥ－カドヘリンの領域を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも３つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、少なくとも１つのセリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、セリン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。

【0105】

いくらかの実施形態は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のＥ４６３、Ｓ４６５、Ｔ４６７、Ｔ４６８、Ｓ４６９、Ｔ４７０、Ｔ４７２およびＶ４７７を含むＥ－カドヘリンの領域を特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも３つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、少なくとも１つのセリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、セリン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。

【0106】

いくらかの実施形態は、配列ＴＳＴを含むＥ－カドヘリンのエピトープを特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、スレオニン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記セリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。

【0107】

いくらかの実施形態は、配列ＴＴＳＴを含むＥ－カドヘリンのエピトープを特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記セリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。

【0108】

いくらかの実施形態は、配列ＳＴＴＳＴを含むＥ－カドヘリンのエピトープを特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、少なくとも１つのセリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、セリン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。

【0109】

いくらかの実施形態は、配列ＳＴＴＳＴＴを含むＥ－カドヘリンのエピトープを特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも３つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、少なくとも１つのセリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、セリン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。

【0110】

いくらかの実施形態は、配列ＥＳＴＴＳＴＴを含むＥ－カドヘリンのエピトープを特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも３つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、少なくとも１つのセリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、セリン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。

【0111】

いくらかの実施形態は、配列ＥＳＴＴＳＴＴＶを含むＥ－カドヘリンのエピトープを特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供し、前記スレオニン残基の少なくとも１つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも２つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基の少なくとも３つは、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、前記スレオニン残基はすべて、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、少なくとも１つのセリン残基は、Ｏ－マンノシル化されている。いくらかの実施形態において、セリン残基は両方とも、Ｏ－マンノシル化されている。

【0112】

Ｅ－カドヘリンは、ＣＤＨ１遺伝子の産物として当技術分野において既知であり、ヒトにおいては、約１２０ｋＤａの分子量を有する。しかし、本発明は、Ｏ－マンノシル化短縮Ｅカドヘリン型も自然界に存在するという驚くべき洞察を提供する。約７０ｋＤａの分子量を有するこの短縮型は、完全長Ｅ－カドヘリンの細胞外ドメインＥＣ１およびＥＣ２を欠く。細胞外ドメイン５，４および細胞外ドメインＥＣ３の一部は、短縮７０ｋＤａ型に依然として存在している。本発明者らは、この短縮７０ｋＤａ型のＥ－カドヘリンが多くの種類の上皮細胞の表面に存在し、頻繁に腫瘍細胞上でアップレギュレートされるという洞察を提供している。理論に縛られることなく、とりわけ、短縮７０ｋＤａ型が実施例において示されるように上皮間葉転換（ＥＭＴ）を刺激し、それによって、腫瘍細胞の遊走および転移を増加させるので、７０ｋＤａ型のＥ－カドヘリンのアップレギュレーションが腫瘍増殖に寄与すると考えられている。さらに、短縮７０ｋＤａ型のＥ－カドヘリンが、１２０ｋＤａの完全長型のＥ－カドヘリンと比較して免疫細胞を結合する能力が低いので、７０ｋＤａ型のＥ－カドヘリンのアップレギュレーションが腫瘍の免疫逃避メカニズムに貢献すると考えられている。本発明によれば、Ｏ－マンノシル化７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型の過剰発現は、ＣＤ３またはＫＬＲＧ１またはＣＤ１０３を介する免疫細胞認識からの逃避を促進することができ、Ｅ－カドヘリンの完全なダウンレギュレーションなしでＥＭＴを促進する。したがって、腫瘍細胞上での７０ｋＤａ短縮型のアップレギュレーションは、これらの腫瘍細胞と免疫細胞との間の相互作用を減少させることができ、それによって、免疫応答から腫瘍が回避するのを支援する可能性がある。

【0113】

いくらかの実施形態において、本発明は、約１２０ｋＤａの周知のＯ－マンノシル化完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好に、上述したＯ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンを結合する、抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。好ましい実施形態は、Ｏ－マンノシル化完全長Ｅ－カドヘリンよりも少なくとも２倍良好に、より好ましくは少なくとも３倍良好に、より好ましくは少なくとも４倍良好に、より好ましくは少なくとも５倍良好にＯ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンを結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。この特徴は、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型が、腫瘍細胞上で有意にアップレギュレートされる場合に、健康な組織結合により引き起こされる腫瘍特異性の向上および有害な副作用の低下を可能にする。本明細書で使用されるように、用語「完全長Ｅ－カドヘリン」は、例えば図１Ａに示されるように、ヒトにおいて約１２０ｋＤａの分子量を有する既知のＣＤＨ１遺伝子産物を指す。用語「短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン」または「７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型」は、６０ｋＤａから８０ｋＤａ、典型的には約７０ｋＤａの分子量を有し、また上皮細胞の表面上で自然に発生する、より小さいＥ－カドヘリン型を指す。図１Ｃに示されるように、６０ｋＤａから８０ｋＤａの分子量を有するこの自然発生した短縮Ｅ－カドヘリン型は、完全長Ｅ－カドヘリンの細胞外ドメインＥＣ１およびＥＣ２を欠く。細胞外ドメイン５，４および細胞外ドメインＥＣ３の一部は、この短縮７０ｋＤａ型に依然として存在している。用語「Ｏ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン」は、図１Ａに示されるように少なくとも１つのＯ－マンノシル化スレオニンまたはセリン残基、好ましくは少なくとも４６７位および／または４６８位および／または４７０位でのＯ－マンノシル化スレオニン残基を含む上述した短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンタンパク質を指す。

【0114】

ある特定の実施形態において、本発明の抗Ｅ－カドヘリン抗体または抗原結合フラグメントは：
- アミノ酸配列ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲを含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（Ｘ_１はＡまたはＴであり、Ｘ_２はＤまたはＮである）；および
- アミノ酸配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

【0115】

ある特定の実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは：
ａ．アミノ酸配列ＧＦＸ_１ＦＳＸ_２ＡＷを含む重鎖可変領域ＣＤＲ１（Ｘ_１はＴまたはＩであり、Ｘ_２はＮまたはＹである）；
ｂ．アミノ酸配列ＩＫＳＫＩＤＧ Ｘ_１Ｔ Ｘ_２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２（Ｘ_１はＧまたはＥであり、Ｘ_２はＴまたはＩである）；
ｃ．アミノ酸配列ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲを含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（Ｘ_１はＡまたはＴであり、Ｘ_２はＤまたはＮである）；
ｄ．アミノ酸配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ．アミノ酸配列ＷＡＸ_１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２（Ｘ_１はＳまたはＣである）；
ｆ．アミノ酸配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
または前記ＱＱＹＳＮＴＰＱＴ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
の１つまたは複数、および場合によってはそれぞれを含む。

【0116】

場合によっては、保存的アミノ酸置換は、上述したＣＤＲ配列の少なくとも１つに適用される。いくらかの実施形態において、前記保存的置換は、表２に示されるようなアミノ酸クラスの１つまたは複数のアミノ酸残基の、同じアミノ酸クラスの別のアミノ酸残基による置換を含む。保存的アミノ酸置換の非限定例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの疎水性残基の、別の疎水性残基による置換、およびアルギニンのリジンによる置換、グルタミン酸のアスパラギン酸による置換、またはグルタミンのアスパラギンによる置換などの１つの極性残基の別の極性残基による置換を含む。好ましくは、保存的アミノ酸置換の後、親抗体の好ましいＥ－カドヘリン結合特徴は、維持されるかさらには改善される。好ましくは、そのような変異型のＣＤＲ配列は、親配列とは３つ以下、好ましくは２つ以下、好ましくは１つ以下のアミノ酸が異なる。

【0117】

そのため、いくらかの実施形態は：
- アミノ酸配列ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲを含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（Ｘ_１はＡまたはＴであり、Ｘ_２はＤまたはＮである）；または前記ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；ならびに
- アミノ酸配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３または前記ＱＱＹＳＮＴＰＱＴ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、本発明の抗Ｅ－カドヘリン抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0118】

また、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、前記抗体または抗原結合フラグメントは：
ａ．アミノ酸配列ＧＦＸ_１ＦＳＸ_２ＡＷを含む重鎖可変領域ＣＤＲ１（Ｘ_１はＴまたはＩであり、Ｘ_２はＮまたはＹである）；
または前記ＧＦＸ_１ＦＳＸ_２ＡＷ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ．アミノ酸配列ＩＫＳＫＩＤＧＸ_１ＴＸ_２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２（Ｘ_１はＧまたはＥであり、Ｘ_２はＴまたはＩである）；
または前記ＩＫＳＫＩＤＧＸ_１ＴＸ_２配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ．アミノ酸配列ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲを含む重鎖可変領域ＣＤＲ３（Ｘ_１はＡまたはＴであり、Ｘ_２はＤまたはＮである）；
または前記ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ．アミノ酸配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
または前記ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ．アミノ酸配列ＷＡＸ_１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２（Ｘ_１はＳまたはＣである）；
または前記ＷＡＸ_１配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ．アミノ酸配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
または前記ＱＱＹＳＮＴＰＱＴ配列とは１つ、２つまたは３つの保存的置換により異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
の１つまたは複数、および場合によってはそれぞれを含む。

【0119】

表１は、本発明による好ましい抗体の配列を提供する。これらの好ましい抗体は、本明細書では、抗体ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮと呼ばれる。これらの抗体は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン、特に、本明細書の上記で記載されたような新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型を結合する。これらの好ましい抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列は、ａ）からｆ）で上述したようにＣＤＲ配列ＧＦＸ_１ＦＳＸ_２ＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＸ_１ＴＸ_２、ＴＰＧＶＧＸ_１ＮＸ_２ＰＹＹＦＤＲ、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＸ_１およびＱＱＹＳＮＴＰＱＴによる。

【0120】

本明細書で使用されるように、用語「ＡＴ１６３６」、「Ｅ－Ｃ０６」、「Ｄ－Ｈ０４」、「Ｄ－Ａ０２」、「Ｄ－Ｅ０９」、「Ｅ－Ａ０４」、「Ｅ－Ｂ０９」、「Ｃ－Ａ０５」、「Ｃ－Ａ０３」、「Ｃ－Ｂ０２」、「Ｃ－Ｄ０４－Ａ」、「Ｃ－Ｄ０４－Ｂ」、「Ｆ－Ｃ０８」、「Ｄ－Ｇ０３」、「Ｄ－Ｆ１０」、「Ｃ－Ｅ０８」、「Ｄ－Ｂ０６」、「Ｄ－Ｇ０５」、「Ｄ－Ｈ０８」、「Ｃ－Ｈ０１」、「Ｄ－Ｃ１２」、「Ｄ－Ｃ１１」、「Ｅ－Ｃ１０」、「ＡＴ１６３６－Ｉ」、「ＡＴ１６３６－Ｙ」、「ＡＴ１６３６－Ｅ」、「ＡＴ１６３６－Ｎ」、「ＡＴ１６３６－ＹＮ」、「ＡＴ１６３６－ＩＹＮ」および「ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮ」は、図１に示されるようなこれらの抗体の少なくとも重鎖および軽鎖ＣＤＲ１～３領域、好ましくは重鎖および軽鎖可変領域を有するすべての抗体および抗原結合フラグメントを包含する。

【0121】

表１に示される抗体に基づいて、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合し、表１に示される抗体の少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを産生することが可能である。そのため、表１に示されるような抗体の少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。前記ＣＤＲ配列は、表１に示されるような抗体のＣＤＲ３配列が好ましい。いくらかの実施形態において、表１に示されるような抗体の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体または抗原結合フラグメントが提供される。したがって、いくらかの実施形態は、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0122】

いくらかの実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合し、表１に示される１つまたは複数の抗体の重鎖ＣＤＲ１～３配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0123】

いくらかの実施形態において、表１に示された同じ抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む抗体または抗原結合フラグメントが提供される。したがって、この実施形態によれば、抗体ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮまたはＡＴ１６３６－ＩＹＥＮの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、１つの抗体または抗原結合フラグメントに一緒に存在する。そのような抗体または抗原結合フラグメントは、複数の異なる重鎖と機能的に対となることができ、それによって前記重鎖の抗原特異性が維持される軽鎖として本明細書で定義されている一般的な軽鎖をさらに含む。このアプローチは、重鎖が多くの場合親和性および特異性の主な推進力であるという周知の事実に基づく。一般的な軽鎖の所与の重鎖とのペアリングは、典型的に、好ましい構造を提供するが、そのような一般的な軽鎖は、抗原特異性に有意には寄与しない。

【0124】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示される同じ抗体の３つすべての重鎖ＣＤＲおよび３つすべての軽鎖ＣＤＲを含む。そのため、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む抗体または抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0125】

抗体ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮの重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）配列も、表１に示される。これらのＶＨおよび／またはＶＬ配列に基づいて、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合し、表１に示される抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを産生することがさらに可能である。典型的には、８０％から９９％のＶＨおよびＶＬ配列の変形は許容されるが、特に、ＣＤＲ領域が未変更のままである場合に抗原結合性を維持する。そのため、表１に示されるようなＶＨまたはＶＬ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨまたはＶＬ配列を含む抗体および抗原結合フラグメントもまた、本明細書で提供される。

【0126】

そのため、表１に示される抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）、またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供される。また、表１に示される抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む抗体、またはその抗原結合フラグメントも提供される。いくらかの実施形態は、表１に示される抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む抗体、またはその抗原結合フラグメントが提供される。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、表１に示される抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体の重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。好ましくは、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0127】

例えば、いくらかの実施形態において、表１に示されるＶＨまたはＶＬ配列の１つまたは複数のフレームワーク残基は、免疫原性を低下させるため、および／または得られる抗体または抗原結合フラグメントの結合有効性または安定性を高めるために修飾される。フレームワーク配列は、例えば、好ましくは得られる抗体－またはその抗原結合フラグメント－の特徴を試験した後で、そのようなフレームワーク配列をコードする核酸分子を突然変異することにより最適化される。このように、改善された結合化合物を得ることが可能である。

【0128】

いくらかの実施形態において、１つまたは複数のフレームワーク残基は、免疫原性を低下させるために、抗体ＡＴ１６３６が由来する生殖系列の配列に突然変異して戻される。所与の抗体のフレームワーク領域を、抗体が由来する生殖系列の配列と比較するための方法は、当技術分野において周知である。

【0129】

いくらかの実施形態において、表１に示されるＶＨまたはＶＬ配列の１つまたは複数のフレームワーク残基は、１つまたは複数のＴ細胞エピトープを除去するために修飾され、それによって、得られる抗体または抗原結合フラグメントの潜在的な免疫原性を低下させる。これは、脱免疫化と呼ばれる。所与の抗体または抗原結合フラグメントのフレームワーク領域を脱免疫化する方法もまた、例えば、Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ，２００５に記載されているように、当技術分野において周知である。

【0130】

いくらかの実施形態において、表１に示されるようなＶＨまたはＶＬ配列のフレームワーク残基の最大１０のアミノ酸残基は、表１に示されるような前記ＶＨまたはＶＬ配列と比較して修飾されている。いくらかの実施形態において、表１に示されるようなＶＨまたはＶＬ配列のフレームワーク残基の最大８つのアミノ酸残基は修飾されている。いくらかの実施形態において、表１に示されるようなＶＨまたはＶＬ配列のフレームワーク残基の最大５つのアミノ酸残基は修飾されている。いくらかの実施形態において、表１に示されるようなＶＨまたはＶＬ配列のフレームワーク残基の最大３つまたは２つのアミノ酸残基は修飾されている。いくらかの実施形態において、表１に示されるようなＶＨおよびＶＬ配列のフレームワーク残基の１つのアミノ酸残基は修飾されている。

【0131】

いくらかの実施形態は：
- 配列番号１～１７からなる群より選択されるＶＨ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域；および／または
- 配列番号１８～２２からなる群より選択されるＶＬ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる、本発明による抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0132】

本発明による好ましい抗体は、抗体ＡＴ１６３６である。この抗体は、腫瘍細胞上に発現されたＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン、特に本明細書の上記で記載されたような新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型を結合することができるので好ましい。ＡＴ１６３６の特定の利点は、約１２０ｋＤａの完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好にこの短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型を結合するという事実である。ＡＴ１６３６のこの特徴は、典型的に、Ｏ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンが、腫瘍細胞上でアップレギュレートされる場合に、腫瘍特異性の向上を可能にする。ＡＴ１６３６が短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型を優先するというさらなる利点は、完全長Ｅ－カドヘリンが広く発現されることである。したがって、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型の優先がない場合、広く発現した完全長Ｅ－カドヘリンは、シンクとして機能する可能性がある、および／または望ましくない効果をもたらす可能性がある。さらに、完全長Ｅ－カドヘリンの発現レベルは非常に高く、そのため、多くの場合、健康な上皮細胞と腫瘍上皮細胞との間を区別することができないが、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型の優先は、より高い腫瘍特異性を可能にする。加えて、Ｅ－カドヘリンは、重要なバリア機能を有し、そのため、Ｅ－カドヘリンの健康な機能による有意な干渉を回避することが好ましい。

【0133】

さらに、ＡＴ１６３６は、転移を有するステージＩＶ結腸癌に罹患しているが、化学療法後何年もの間、完全に寛解しているヒト個体に由来し、治療効果を示唆する。興味深いことに、ＡＴ１６３６は、ＩｇＧ３アイソタイプである。ヒトアミノ酸配列の存在は、ヒト患者における治療的使用中の有害な副作用の機会を少なくする。

【0134】

加えて、ＡＴ１６３６は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現結腸癌サブタイプＣＭＳ１、ＣＭＳ２、ＣＭＳ３およびＣＭＳ４を結合するその能力により選択された。ＡＴ１６３６は、腫瘍細胞、特に上皮腫瘍細胞、より具体的には、実施例において示されるように、例えばＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現結腸癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、肺癌細胞および食道癌細胞などのＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現癌細胞に結合する。そのため、抗体ＡＴ１６３６は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現癌細胞、特に新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型を発現する癌細胞などのＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する細胞の存在に関連している障害の処置および／または診断に特に適している。

【0135】

表１に示される抗体Ｅ－Ｃ１０、Ｄ－Ｃ１２およびＤ－Ｃ１１は、ＡＴ１６３６と同じ重鎖および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を有し、そのため、同じ結合特異性を有する。これらの抗体はまた、とりわけ、細胞上に発現されたＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン、特に本明細書に記載されるような新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型、より具体的には、図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基を結合することができるので、本発明による好ましい抗体であり、そのため、そのようなＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現細胞、特に癌細胞の存在に関連している障害の処置および／または診断に非常に適している。ヒトアミノ酸配列の存在は、ヒト患者における治療的使用中の有害な副作用の機会を少なくする。

【0136】

表１に示されるような抗体ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ１０、Ｄ－Ｃ１２およびＤ－Ｃ１１の重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＴＦＳＮＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲである。これらの抗体ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ１０、Ｄ－Ｃ１２およびＤ－Ｃ１１の軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0137】

抗体ＡＴ１６３６のＶＨ配列は、配列番号１として表１に示されている。抗体ＡＴ１６３６のＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体ＡＴ１６３６の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0138】

抗体Ｅ－Ｃ１０のＶＨ配列は、配列番号１として表１に示されている。抗体Ｅ－Ｃ１０のＶＬ配列は、配列番号２２として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１に示されるようなＶＨ配列および配列番号２２に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１に示されるようなＶＨ配列および配列番号２２に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｅ－Ｃ１０の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0139】

抗体Ｄ－Ｃ１２のＶＨ配列は、配列番号１３として表１に示されている。抗体Ｄ－Ｃ１２のＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１３に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１３に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｄ－Ｃ１２の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0140】

抗体Ｄ－Ｃ１１のＶＨ配列は、配列番号１４として表１に示されている。抗体Ｄ－Ｃ１１のＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１４に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１４に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｄ－Ｃ１１の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0141】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体ＡＴ１６３６またはＥ－Ｃ１０またはＤ－Ｃ１２またはＤ－Ｃ１１と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0142】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体ＡＴ１６３６またはＥ－Ｃ１０またはＤ－Ｃ１２またはＤ－Ｃ１１と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0143】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体ＡＴ１６３６またはＥ－Ｃ１０またはＤ－Ｃ１２またはＤ－Ｃ１１と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0144】

表１に示される、抗体Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－ＥおよびＡＴ１６３６－Ｎはまた、本発明による好ましい抗体である。これらの抗体はまた、細胞上に発現されたＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン、特に新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型、より具体的には、図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基を結合することができ、そのため、そのようなＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現細胞、特に癌細胞の存在に関連している障害の処置および／または診断に非常に適している。これらの抗体におけるヒトアミノ酸配列の存在は、ヒト患者における治療的使用中の有害な副作用の機会を少なくする。

【0145】

表１に示される、抗体Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９およびＡＴ１６３６－Ｉの重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＩＦＳＮＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲである。これらの抗体Ｅ－Ｃ０６、Ｄ-Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９およびＡＴ１６３６－Ｉの軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＩＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0146】

抗体Ｅ－Ｃ０６およびＤ－Ｈ０４のＶＨ配列は、配列番号２として表１に示されている。抗体Ｅ－Ｃ０６およびＤ－Ｈ０４のＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号２に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号２に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｅ－Ｃ０６またはＤ－Ｈ０４の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0147】

抗体Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９およびＡＴ１６３６－ＩのＶＨ配列は、配列番号３として表１に示されている。抗体Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９およびＡＴ１６３６－ＩのＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号３に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号３に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９またはＡＴ１６３６－Ｉの重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0148】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体Ｅ－Ｃ０６またはＤ－Ｈ０４またはＤ－Ａ０２またはＤ－Ｅ０９またはＥ－Ａ０４またはＥ－Ｂ０９またはＡＴ１６３６－Ｉと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0149】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体Ｅ－Ｃ０６またはＤ－Ｈ０４またはＤ－Ａ０２またはＤ－Ｅ０９またはＥ－Ａ０４またはＥ－Ｂ０９またはＡＴ１６３６－Ｉと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0150】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体Ｅ－Ｃ０６またはＤ－Ｈ０４またはＤ－Ａ０２またはＤ－Ｅ０９またはＥ－Ａ０４またはＥ－Ｂ０９またはＡＴ１６３６－Ｉと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0151】

表１に示される、抗体Ｃ－Ａ０５の重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＩＦＳＮＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲである。この抗体Ｃ－Ａ０５の軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＩＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0152】

抗体Ｃ－Ａ０５のＶＨ配列は、配列番号４として表１に示されている。抗体Ｃ－Ａ０５のＶＬ配列は、配列番号１９として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号４に示されるようなＶＨ配列および配列番号１９に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号４に示されるようなＶＨ配列および配列番号１９に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｃ－Ａ０５の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0153】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体Ｃ－Ａ０５と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0154】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ａ０５と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0155】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ａ０５と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0156】

表１に示される、抗体Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２およびＡＴ１６３６－Ｅの重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＴＦＳＮＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲである。これらの抗体Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２およびＡＴ１６３６－Ｅの軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0157】

抗体Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２およびＡＴ１６３６－ＥのＶＨ配列は、配列番号５として表１に示されている。抗体Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２およびＡＴ１６３６－ＥのＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号５に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号５に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｃ－Ａ０３またはＣ－Ｂ０２またはＡＴ１６３６-Ｅの重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0158】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体Ｃ－Ａ０３またはＣ－Ｂ０２またはＡＴ１６３６－Ｅと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0159】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ａ０３またはＣ－Ｂ０２またはＡＴ１６３６－Ｅと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0160】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ａ０３またはＣ－Ｂ０２またはＡＴ１６３６－Ｅと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0161】

表１に示される、抗体Ｃ－Ｄ０４－Ａの重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＴＦＳＮＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲである。この抗体Ｃ－Ｄ０４－Ａの軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0162】

抗体Ｃ－Ｄ０４－ＡのＶＨ配列は、配列番号６として表１に示されている。抗体Ｃ－Ｄ０４－ＡのＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号６に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号６に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｃ－Ｄ０４－Ａの重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0163】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体Ｃ－Ｄ０４－Ａと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0164】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ｄ０４－Ａと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0165】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ｄ０４－Ａと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0166】

表１に示される、抗体Ｃ－Ｄ０４－Ｂの重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＴＦＳＮＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲである。この抗体Ｃ－Ｄ０４－Ｂの軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＣおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＣを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0167】

抗体Ｃ－Ｄ０４－ＢのＶＨ配列は、配列番号６として表１に示されている。抗体Ｃ－Ｄ０４－ＢのＶＬ配列は、配列番号２０として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号６に示されるようなＶＨ配列および配列番号２０に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号６に示されるようなＶＨ配列および配列番号２０に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｃ－Ｄ０４－Ｂの重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0168】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体Ｃ－Ｄ０４－Ｂと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0169】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ｄ０４－Ｂと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0170】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ｄ０４－Ｂと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0171】

表１に示される、抗体Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３およびＡＴ１６３６－Ｎの重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＴＦＳＮＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲである。これらの抗体Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３およびＡＴ１６３６－Ｎの軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0172】

抗体Ｆ－Ｃ０８のＶＨ配列は、配列番号７として表１に示されている。抗体Ｆ－Ｃ０８のＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号７に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号７に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｆ－Ｃ０８の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0173】

抗体Ｄ－Ｇ０３およびＡＴ１６３６－ＮのＶＨ配列は、配列番号８として表１に示されている。抗体Ｄ－Ｇ０３およびＡＴ１６３６－ＮのＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号８に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号８に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｄ－Ｇ０３またはＡＴ１６３６－Ｎの重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0174】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体Ｆ－Ｃ０８またはＤ－Ｇ０３またはＡＴ１６３６－Ｎと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0175】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体Ｆ－Ｃ０８またはＤ－Ｇ０３またはＡＴ１６３６－Ｎと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0176】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体Ｆ－Ｃ０８またはＤ－Ｇ０３またはＡＴ１６３６-Ｎと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0177】

表１に示される、抗体Ｄ－Ｆ１０の重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＴＦＳＮＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴおよびＴＰＧＶＧＴＮＮＰＹＹＦＤＲである。この抗体Ｃ－Ａ０５の軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＴＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0178】

抗体Ｄ－Ｆ１０のＶＨ配列は、配列番号９として表１に示されている。抗体Ｄ－Ｆ１０のＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号９に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号９に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｄ－Ｆ１０の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0179】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体Ｄ－Ｆ１０と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0180】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体Ｄ－Ｆ１０と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0181】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体Ｄ－Ｆ１０と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0182】

表１に示される、抗体Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、ＡＴ１６３６－ＹおよびＤ－Ｈ０８の重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＴＦＳＹＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲである。これらの抗体Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５およびＤ－Ｈ０８の軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＴＦＳＹＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0183】

抗体Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６およびＡＴ１６３６－ＹのＶＨ配列は、配列番号１０として表１に示されている。抗体Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６およびＡＴ１６３６－ＹのＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１０に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１０に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｃ－Ｅ０８またはＤ－Ｂ０６またはＡＴ１６３６－Ｙの重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0184】

抗体Ｄ－Ｇ０５のＶＨ配列は、配列番号１０として表１に示されている。抗体Ｄ－Ｇ０５のＶＬ配列は、配列番号２１として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１０に示されるようなＶＨ配列および配列番号２１に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１０に示されるようなＶＨ配列および配列番号２１に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｄ－Ｇ０５の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0185】

抗体Ｄ－Ｈ０８のＶＨ配列は、配列番号１１として表１に示されている。抗体Ｄ－Ｈ０８のＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１１に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１１に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｄ－Ｈ０８の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0186】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体Ｃ－Ｅ０８またはＤ－Ｂ０６またはＤ－Ｇ０５またはＤ－Ｈ０８またはＡＴ１６３６－Ｙと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0187】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ｅ０８またはＤ－Ｂ０６またはＤ－Ｇ０５またはＤ－Ｈ０８またはＡＴ１６３６－Ｙと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0188】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ｅ０８またはＤ－Ｂ０６またはＤ－Ｇ０５またはＤ－Ｈ０８またはＡＴ１６３６－Ｙと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0189】

表１に示される、抗体Ｃ－Ｈ０１の重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＴＦＳＮＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＩおよびＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲである。この抗体Ｃ－Ｈ０１の軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＴＦＳＮＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＩを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＤＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0190】

抗体Ｃ－Ｈ０１のＶＨ配列は、配列番号１２として表１に示されている。抗体Ｃ－Ｈ０１のＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１２に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１２に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体Ｃ－Ｈ０１の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0191】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体Ｃ－Ｈ０１と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0192】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ｈ０１と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0193】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体Ｃ－Ｈ０１と競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0194】

本発明による別の好ましい抗体は、抗体ＡＴ１６３６－ＹＮである。この抗体は、腫瘍細胞上に発現されたＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン、特に新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型を結合することができるので好ましい。ＡＴ１６３６－ＹＮの特定の利点は、約１２０ｋＤａの完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好にこの短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型を結合するという事実である。本明細書の上記で記載されたように、この特徴は、典型的に、Ｏ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンが、腫瘍細胞上でアップレギュレートされる場合に、腫瘍特異性の向上を可能にする。ＡＴ１６３６－ＹＮが短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型を優先するというさらなる利点は、完全長Ｅ－カドヘリンが広く発現されることである。したがって、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型の優先がない場合、広く発現した完全長Ｅ－カドヘリンは、シンクとして機能する可能性がある、および／または望ましくない効果をもたらす可能性がある。さらに、完全長Ｅ－カドヘリンの発現レベルは非常に高く、そのため、多くの場合、健康な上皮細胞と腫瘍上皮細胞との間を区別することができないが、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型の優先は、より高い腫瘍特異性を可能にする。加えて、Ｅ－カドヘリンは、重要なバリア機能を有し、そのため、Ｅ－カドヘリンの健康な機能による有意な干渉を回避することが好ましい。

【0195】

加えて、ＡＴ１６３６－ＹＮは、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現結腸癌サブタイプＣＭＳ１、ＣＭＳ２、ＣＭＳ３およびＣＭＳ４を結合することができる。ＡＴ１６３６－ＹＮは、腫瘍細胞、特に上皮腫瘍細胞、より具体的には、例えばＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現結腸癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、肺癌細胞および食道癌細胞などのＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現癌細胞に結合する。そのため、抗体ＡＴ１６３６－ＹＮは、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現癌細胞、特に新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型を発現する癌細胞などのＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する細胞の存在に関連している障害の処置および／または診断に特に適している。ヒトアミノ酸配列の存在は、ヒト患者における治療的使用中の有害な副作用の機会を少なくする。

【0196】

さらに、抗体ＡＴ１６３６－ＹＮは、抗体ＡＴ１６３６よりも良好に類表皮癌細胞株Ａ４３１、肺癌細胞株Ａ５４９およびマウス腫瘍細胞株ＣＭＴ９３を結合する（図６Ｂを参照されたい）。

【0197】

表１に示される、抗体ＡＴ１６３６－ＹＮの重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＴＦＳＹＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲである。この抗体ＡＴ１６３６－ＹＮの軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＴＦＳＹＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0198】

抗体ＡＴ１６３６－ＹＮのＶＨ配列は、配列番号１５として表１に示されている。抗体ＡＴ１６３６－ＹＮのＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１５に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１５に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体ＡＴ１６３６－ＹＮの重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0199】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体ＡＴ１６３６－ＹＮと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0200】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体ＡＴ１６３６－ＹＮと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0201】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体ＡＴ１６３６－ＹＮと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0202】

本発明による別の好ましい抗体は、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮである。この抗体は、腫瘍細胞上に発現されたＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン、特に新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型を結合することができるので好ましい。ＡＴ１６３６－ＩＹＮの特定の利点は、約１２０ｋＤａの完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好にこの短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型を結合するという事実である。本明細書の上記で記載されたように、この特徴は、典型的に、Ｏ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンが、腫瘍細胞上でアップレギュレートされる場合に、腫瘍特異性の向上を可能にする。ＡＴ１６３６－ＩＹＮが短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型を優先するというさらなる利点は、完全長Ｅ－カドヘリンが広く発現されることである。したがって、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型の優先がない場合、広く発現した完全長Ｅ－カドヘリンは、シンクとして機能する可能性がある、および／または望ましくない効果をもたらす可能性がある。さらに、完全長Ｅ－カドヘリンの発現レベルは非常に高く、そのため、多くの場合、健康な上皮細胞と腫瘍上皮細胞との間を区別することができないが、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型の優先は、より高い腫瘍特異性を可能にする。加えて、Ｅ－カドヘリンは、重要なバリア機能を有し、そのため、Ｅ－カドヘリンの健康な機能による有意な干渉を回避することが好ましい。

【0203】

加えて、ＡＴ１６３６－ＩＹＮは、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現結腸癌サブタイプＣＭＳ１、ＣＭＳ２、ＣＭＳ３およびＣＭＳ４を結合することができる。ＡＴ１６３６－ＩＹＮは、腫瘍細胞、特に上皮腫瘍細胞、より具体的には、例えばＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現結腸癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、肺癌細胞および食道癌細胞などのＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現癌細胞に結合する。そのため、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮは、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現癌細胞、特に新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型を発現する癌細胞などのＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する細胞の存在に関連している障害の処置および／または診断に特に適している。ヒトアミノ酸配列の存在は、ヒト患者における治療的使用中の有害な副作用の機会を少なくする。

【0204】

さらに、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮは、抗体ＡＴ１６３６よりも良好に、結腸細胞株ＤＬＤ１、乳房上皮細胞株ＭＣＦ１０ａ、類表皮癌細胞株Ａ４３１、肺癌細胞株Ａ５４９およびマウス腫瘍細胞株ＣＭＴ９３を結合する（図６Ａおよび図６Ｂを参照されたい）。

【0205】

表１に示される、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮの重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＩＦＳＹＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲである。この抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮの軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＩＦＳＹＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＧＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0206】

抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮのＶＨ配列は、配列番号１６として表１に示されている。抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮのＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１６に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１６に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮの重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0207】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0208】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0209】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＮと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0210】

本発明による別の好ましい抗体は、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮである。この抗体は、腫瘍細胞上に発現されたＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン、特に新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型を結合することができるので好ましい。ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮの特定の利点は、約１２０ｋＤａの完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好にこの短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型を結合するという事実である。本明細書の上記で記載されたように、この特徴は、典型的に、Ｏ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンが、腫瘍細胞上でアップレギュレートされる場合に、腫瘍特異性の向上を可能にする。ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮが短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型を優先するというさらなる利点は、完全長Ｅ－カドヘリンが広く発現されることである。したがって、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型の優先がない場合、広く発現した完全長Ｅ－カドヘリンは、シンクとして機能する可能性がある、および／または望ましくない効果をもたらす可能性がある。さらに、完全長Ｅ－カドヘリンの発現レベルは非常に高く、そのため、多くの場合、健康な上皮細胞と腫瘍上皮細胞との間を区別することができないが、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型の優先は、より高い腫瘍特異性を可能にする。加えて、Ｅ－カドヘリンは、重要なバリア機能を有し、そのため、Ｅ－カドヘリンの健康な機能による有意な干渉を回避することが好ましい。

【0211】

加えて、ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮは、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現結腸癌サブタイプＣＭＳ１、ＣＭＳ２、ＣＭＳ３およびＣＭＳ４を結合することができる。ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮは、腫瘍細胞、特に上皮腫瘍細胞、より具体的には、例えばＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現結腸癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、肺癌細胞および食道癌細胞などのＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現癌細胞に結合する。そのため、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮは、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現癌細胞、特に新規に発見された約７０ｋＤａの短縮Ｅ－カドヘリン型を発現する癌細胞などのＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する細胞の存在に関連している障害の処置および／または診断に特に適している。ヒトアミノ酸配列の存在は、ヒト患者における治療的使用中の有害な副作用の機会を少なくする。

【0212】

さらに、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮは、抗体ＡＴ１６３６よりも良好に、結腸細胞株ＤＬＤ１、乳房上皮細胞株ＭＣＦ１０ａおよびマウス腫瘍細胞株ＣＭＴ９３を結合する（図６Ａを参照されたい）。

【0213】

表１に示される、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮの重鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＧＦＩＦＳＹＡＷ、ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴおよびＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲである。この抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮの軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣ、ＷＡＳおよびＱＱＹＳＮＴＰＱＴである。そのため、いくらかの実施形態は、配列ＧＦＩＦＳＹＡＷを含む重鎖ＣＤＲ１および配列ＩＫＳＫＩＤＧＥＴＴを含む重鎖ＣＤＲ２および配列ＴＰＧＶＧＡＮＮＰＹＹＦＤＲを含む重鎖ＣＤＲ３および配列ＱＳＶＬＣＲＳＮＮＫＮＣを含む軽鎖ＣＤＲ１および配列ＷＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ２および配列ＱＱＹＳＮＴＰＱＴを含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0214】

抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮのＶＨ配列は、配列番号１７として表１に示されている。抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮのＶＬ配列は、配列番号１８として表１に示されている。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１７に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。そのため、いくらかの実施形態は、配列番号１７に示されるようなＶＨ配列および配列番号１８に示されるようなＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮの重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。

【0215】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンへの結合について、好ましくは図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニン残基への結合について、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0216】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞、好ましくはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞への結合について、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。前記細胞は、好ましくは、それらの表面上でＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する。

【0217】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞への結合について、抗体ＡＴ１６３６－ＩＹＥＮと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントがさらに提供される。

【0218】

いくらかの実施形態において、上述した抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、列挙された重鎖および軽鎖ＣＤＲ１～３配列からなる。

【0219】

いくらかの実施形態において、抗体ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮまたはＡＴ１６３６－ＩＹＥＮの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１～３配列は、異なる抗体のフレームワーク配列に合体されている。前記フレームワーク配列は、ヒトフレームワーク配列が好ましい。ヒトフレームワーク領域の配列は、公開ＤＮＡデータベースから利用可能である。いくらかの好ましい実施形態において、ヒト生殖系列の配列は、本発明による抗体および抗原結合フラグメントにおけるフレームワーク領域のために使用される。これらの生殖系列の配列が、典型的に、免疫原性応答を引き起こす可能性がある体細胞高頻度突然変異がないので、ヒト生殖系列の配列の使用は、前記抗体の免疫原性のリスクを最小化する。

【0220】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントである。ヒトアミノ酸配列の存在は、非ヒト抗体と比較して、ヒト患者における治療的使用中の有害な副作用の機会を少なくする。

【0221】

いくらかの実施形態は、完全長抗体である本発明による抗体を提供する。完全長抗体は、それらの好ましい半減期のために有利である。本発明の抗体は、好ましくはＩｇＧアイソタイプである。特に、ＩｇＧ１は、ヒトにおける長い循環半減期に基づいて好まれる。さらにＩｇＧ１抗体は、商業的に容易に産生され、それらのＦｃテールは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）のようなエフェクタ機能を可能にする。ヒトにおける免疫原性を防止するために、本発明による抗体がヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントであることが好ましい。

【0222】

本明細書の上記で記載されたように、抗体ＡＴ１６３６は、ＩｇＧ３アイソタイプである。ＩｇＧ３アイソタイプの抗体が、凝集する傾向を有するため商業的に開発するのが困難であるので、いくらかの実施形態は、抗体ＡＴ１６３６の重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含むＩｇＧ１アイソタイプの抗体を提供する。いくらかの実施形態は、抗体ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体の重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含むＩｇＧ１抗体を提供する。

【0223】

いくらかの実施形態は、抗体ＡＴ１６３６、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むＩｇＧ１抗体を提供する。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列変化は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。

【0224】

本発明による完全長ＩｇＧ抗体は、所望の特徴を提供する突然変異が存在する抗体を包含する。そのような突然変異は、任意の抗体領域の実質的な部分の欠失であってはならない。しかし、本明細書の上記で記載されたように、得られる抗体の結合特徴を本質的に変更せずに、１つまたはいくらかのアミノ酸残基が欠失されている抗体は、用語「完全長抗体」に包含される。例えば、ＩｇＧ抗体は、定常領域における１～２０のアミノ酸残基の挿入、欠失またはそれらの組み合わせを有する可能性がある。例えば、本明細書の以下で記載されたように、グリコシル化を低減することができ、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を変更することができる。

【0225】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、以下の特徴：
- Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンの細胞外（ＥＣ）３ドメインに結合する；
- Ｏ－マンノシル化完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好に、好ましくは少なくとも２倍良好に、より好ましくは少なくとも３倍良好に、より好ましくは少なくとも４倍良好に、より好ましくは少なくとも５倍良好に、Ｏ－マンノシル化短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンを結合する；
- Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を同時発現する腫瘍細胞を結合する
の１つまたは複数、好ましくはそれぞれを有している。

【0226】

いくらかの実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、以下の特徴：
- 結腸癌サブタイプＣＭＳ１、ＣＭＳ２、ＣＭＳ３およびＣＭＳ４を結合する；
- 健康な胸腺髄質上皮細胞または樹状細胞またはランゲルハンス細胞よりも良好に結腸癌細胞株ＳＷ９４８を結合する
の少なくとも１つをさらに含む。

【0227】

いくらかの好ましい実施形態は、上に列記された各特徴を有する本発明による抗体および抗原結合フラグメントを提供する。そのような抗体および抗原結合フラグメントは、異なる癌のタイプおよび異なる結腸癌のサブタイプを結合するそれらの能力に鑑み、幅広い抗腫瘍適応性を有する。さらに、本明細書の上記で詳しく説明したように、完全長Ｅ－カドヘリンと比較して、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリンを優先することに鑑み、そのような抗体および抗原結合フラグメントは、短縮７０ｋＤａ Ｅ－カドヘリン型が、腫瘍細胞上で有意にアップレギュレートされる場合に腫瘍特異性を向上させるのに適している。

【0228】

実施例において示されるように、Ｅ－カドヘリンの１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニンおよび／またはセリン残基を特異的に結合する抗体が提供され、前記１つまたは複数のＯ－マンノシル化スレオニンおよび／またはセリン残基は、図１Ａに示されるようにＥ－カドヘリン配列のアミノ酸４６７～４７２位内に存在する。ここで、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンの同じエピトープについて競合しているさらなる抗体を得るか生成することが可能になることが知られている。これは、例えば、非ヒト動物を、図１Ａに示されるようなＥ－カドヘリン配列の上述したアミノ酸残基４６７～４７２を含むＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンペプチド、またはそのようなペプチドを含む免疫原性化合物、またはそのようなペプチドをコードする核酸分子で免疫化することにより行うことができ、好ましくは１つまたは複数のブースター投与が続く。代わりに、非ヒト動物は、細胞表面にＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現させるためにＴＭＴＣ３およびＥ－カドヘリンを発現する細胞で免疫化することができる。また、非ヒト動物は、いわゆるＤＮＡ免疫化技術により、例えばＴＭＴＣ３およびＥ－カドヘリンを両方とも発現する、例えばｃＤＮＡのような核酸で免疫化することもできる。

【0229】

続いて、前記エピトープまたはペプチドに特異的である抗体および／またはＢ細胞は、前記非ヒト動物から回収することができる。いくらかの実施形態において、ヒトの治療に最適化するために、得られた抗体をヒト化させる。いくらかの実施形態において、前記ペプチドまたはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンまたはその７０ｋＤａ短縮型への結合のために、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６-Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、またはその抗原結合フラグメントとの競合について、得られた抗体またはＢ細胞を試験する。

【0230】

適切な投与手順およびアジュバント、そのような免疫化動物からの抗体および／または免疫細胞の獲得および精製のための手順、競合実験ならびに非ヒト抗体のヒト化手順を含む、動物免疫化プロトコルは、当技術分野において周知である。例えばＨａｎｌｙ ｅｔ ａｌ，１９９５を参照する。

【0231】

代わりに、またはさらに、前記ペプチドまたはＴＭＣＴ３－Ｅ－カドヘリン同時発現細胞を使用して、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン特異性免疫グロブリン、典型的にはＦａｂフラグメントを同定および／または単離するために、ファージディスプレイライブラリをスクリーニングする。得られた抗体、Ｂ細胞またはＦａｂフラグメントは、前記ペプチドまたはＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンまたはその７０ｋＤａ短縮型への結合のために、典型的に、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４-Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる抗体からなる群より選択される抗体、またはその抗原結合フラグメントと競合する。いくらかの実施形態において、競合アッセイが実行される。

【0232】

また、本発明による抗体または抗原結合フラグメントの少なくとも１つのＣＤＲ配列をコードする核酸分子およびベクターもここで提供される。したがって、いくらかの実施形態は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントの少なくとも１つのＣＤＲ配列をコードする、単離、合成もしくは組換え核酸、またはベクターを提供する。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントの少なくとも重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列がコードされる。そのため、本発明による抗体または抗原結合フラグメントの少なくとも重鎖ＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ３配列をコードする、単離、合成もしくは組換え核酸、またはベクターがさらに提供される。好ましくは、本発明による抗体または抗原結合フラグメントの少なくとも重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列がコードされる。そのため、本発明による抗体または抗原結合フラグメントの少なくとも重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列をコードする、単離、合成もしくは組換え核酸、またはベクターがさらに提供される。好ましくは、前記ＣＤＲ配列は、表１に示されるような抗体のＣＤＲ配列である。

【0233】

特定の実施形態は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントの少なくとも重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする単離、合成または組換え核酸を提供する。いくらかの実施形態において、前記核酸は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方をコードする。そのような核酸は、産生細胞における本発明の抗体または抗原結合フラグメントの産生に特に適している。いくらかの実施において、前記核酸は、ある特定の産生細胞、例えば大腸菌、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）またはＴ２９３細胞などに最適化されたコドンである核酸配列を含み、これらの産生細胞において本発明の抗体または抗原結合フラグメントの効率的な産生を可能にする。抗体産生が、任意の組換え抗体産生システムにより行うことができ；上述した４つの産生細胞システムが、現在までに利用可能である多くのシステムのほんの数例であることに注意する必要がある。本明細書で使用されるように、用語「コドン」は、特定のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドの３つの組を意味する。用語「最適化されたコドン」は、元の、好ましくはヒトの核酸配列からの１つまたは複数のコドンが、ある特定の産生細胞により好まれる１つまたは複数のコドンにより置き換えられていることを意味する。これらの置き換えコドンは、置き換えられている元のコドンと同じアミノ酸残基をコードすることが好ましい。代わりに、１つまたは複数の置き換えコドンは、異なるアミノ酸残基をコードする。これは、必要ではないが、好ましくは、結果として保存的アミノ酸置換となる。定常領域およびフレームワーク領域において、１つまたは複数のアミノ酸置換は、一般に許容される。ＣＤＲ領域において、置き換えられている元のコドンと同じアミノ酸残基をコードするコドンを使用することが好ましく、そのため、得られる産物は、元の抗体と同じＣＤＲアミノ酸配列を有する。

【0234】

本発明による好ましい抗体のＶＨおよびＶＬアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表１に列記されている。多くのアミノ酸残基が、１つより多い異なる核酸コドンによりコードされているので、異なるコドンは、上記で説明したように、例えばある特定の産生細胞に対するコドンの使用を最適化するために、ある特定のアミノ酸残基のために使用することができる。さらに、結果として異なるアミノ酸残基となるいくらかの核酸配列の変形もまた、典型的には、特にＣＤＲをコードする配列の外側で許容される。そのため、特定の実施形態は、表１に示される抗体の少なくとも重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする単離、合成または組換え核酸を提供する。いくらかの実施形態は、配列番号１～１７からなる群より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、単離、合成または組換え核酸を提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨ領域の前記配列の変形は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。いくらかの実施形態は、配列番号１８～２２からなる群より選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、単離、合成または組換え核酸を提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＬ領域の前記配列の変形は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。いくらかの実施形態は、配列番号１～１７からなる群より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１８～２２からなる群より選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、単離、合成または組換え核酸を提供する。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列の変形は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。

【0235】

いくらかの実施形態は、表１に示されるようなＶＨまたはＶＬ配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する単離、合成または組換え核酸を提供する。本発明による好ましい抗体のＶＨ核酸配列は、配列番号２３～３９として表１に列記されている。本発明による好ましい抗体のＶＬ核酸配列は、配列番号４０～４４として表１に列記されている。そのため、配列番号２３～３９からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、および／または配列番号４０～４４からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む核酸がさらに提供される。好ましくは、本発明による核酸分子は、表１に示されるような同じ抗体の可変重鎖コード配列および可変軽鎖コード配列を含む。そのため、また、配列番号２３～３９からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、および配列番号４０～４４からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む核酸も提供される。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列の変形は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。

【0236】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸分子が提供される。抗体ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体をコードする核酸分子が、さらに提供される。いくらかの実施形態において、前記核酸は、非ヒト宿主細胞における発現のために最適化されたコドンである。

【0237】

本発明による核酸分子を含むベクターが、さらに提供される。本明細書で使用されるように、「本発明による核酸分子を含むベクター」はまた、「本発明によるベクター」とも呼ばれる。

【0238】

本発明による１つまたは複数の核酸分子（複数を含む）を含むベクターを構築するための方法は、当技術分野において周知である。適切なベクターおよび産生プラットフォームの非限定例は、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター、細菌または酵母プラスミド、ＳＶ４０ベクター、バキュロウイルスベクター、ファージＤＮＡベクター、ｐＵＣベクター、ｐＢＲ３２２のようなプラスミドベクター、例えばｐＣｏｎプラスベクターのようなロンザにより製造されたベクター、例えばＴｕｒｂｏＣｅｌｌ（商標）発現プラットフォームのようなレンチュラー・バイオファーマにより製造された産生システム、および例えばＡｐｏｌｌｏ（商標）哺乳動物発現プラットフォームのようなＦｕｊｉｆｉｌｍ Ｄｉｏｓｙｎｔｈの発現プラットフォームである。

【0239】

いくらかの実施形態において、本発明によるベクターは、表１に示されるような抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸配列を含む。これらの抗体のＶＨ核酸配列は、配列番号２３～３９として表１に列記されており、これらの抗体のＶＬ核酸配列は、配列番号４０～４４として表１に列記されている。そのため、配列番号２３～３９からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および／または配列番号４０～４４からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むベクターが、さらに提供される。好ましくは、本発明によるベクターは、表１に示されるような抗体の可変重鎖コード配列および可変軽鎖コード配列を含む。そのため、また、配列番号２３～３９からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、および配列番号４０～４４からなる群より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むベクターも提供される。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列の変形は、前記抗体のＣＤＲ領域の外側に位置している。

【0240】

いくらかの実施形態は：
- 配列番号２３に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２３に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４４に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２４に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
- 配列番号２５に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２６に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４１に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２７に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２８に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２８に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４２に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号２９に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号３０に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
- 配列番号３１に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３２に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３２に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４３に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３３に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３４に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３５に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３６に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３７に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３８に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；または
配列番号３９に示されるようなＶＨコード核酸配列および配列番号４０に示されるようなＶＬコード核酸配列、もしくはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列
を含むベクターを提供する。

【0241】

好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列の変形は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。

【0242】

いくらかの実施形態において、本発明によるベクターは、抗原認識ドメインおよびＴ細胞活性化ドメインをコードする核酸配列を含むＣＡＲ Ｔ細胞ベクターである。いくらかの実施形態において、前記抗原認識ドメインは、本発明による抗体の少なくとも重鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。いくらかの実施形態において、前記抗原認識ドメインは、本発明による抗体の少なくとも軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。いくらかの実施形態において、前記抗原認識ドメインは、本発明による抗体の重鎖ＣＤＲ１～３配列および軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む。いくらかの実施形態において、前記抗原認識ドメインは、本発明による抗体のＶＨ配列、またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくらかの実施形態において、前記抗原認識ドメインは、本発明による抗体のＶＬ配列、またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくらかの実施形態において、前記抗原認識ドメインは、本発明による抗体のＶＨおよびＶＬ配列、またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。好ましくは、前記配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％である。好ましくは、前記ＶＨおよび／またはＶＬ領域の前記配列の変形は、ＣＤＲ領域の外側に位置している。

【0243】

いくらかの実施形態において、前記抗原認識ドメインは、単鎖フォーマット内にある。いくらかの実施形態において、前記ＣＡＲ Ｔ細胞ベクターは、膜貫通ドメインをコードする核酸配列をさらに含む。

【0244】

本発明によるベクターは、例えば、本発明の抗体または抗原結合フラグメントまたはＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ産生に有用である。これは、例えば、そのような核酸分子またはベクターを細胞に導入することにより行われ、そのため、細胞の核酸翻訳機構は、コードされた抗体または抗原結合フラグメントまたはＣＡＲ Ｔ細胞を産生する。いくらかの実施形態において、少なくとも１つの本発明による核酸分子またはベクターは、いわゆる産生細胞、例えば、そのいくらかが商業的な抗体産生に適合している、大腸菌、ＣＨＯ、ＮＳＯまたはＴ２９３細胞などで発現される。本明細書の上記で記載されたように、そのような場合、本明細書で提供されるような元のヒト配列が産生細胞に最適化されたコドンである、核酸分子を使用することが好ましい。前記産生細胞の増殖は、結果として本発明による抗体または抗原結合フラグメントを産生することができる産生細胞株となる。好ましくは、前記産生細胞株は、ヒトにおける使用のための抗体を産生するのに適している。したがって、前記産生細胞株は、好ましくは病原性微生物などの病原体を含まない。いくらかの実施形態において、ヒト配列からなる抗体は、そのような産生細胞株により生成される。

【0245】

いくらかの実施形態において、本発明によるＣＡＲ Ｔ細胞ベクターは、ＣＡＲ Ｔ細胞を産生するためにＴ細胞に導入される。

【0246】

そのため、本発明による少なくとも１つの抗体、または抗原結合フラグメント、または核酸分子、またはベクターを含む、単離または組換え宿主細胞が、さらに提供される。そのような細胞は、好ましくは大規模抗体産生が可能である抗体産生細胞である。いくらかの実施形態において、前記細胞は、哺乳動物細胞、Ｔ細胞、細菌細胞、植物細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、例えばｐＣｏｎプラスベクター産生システムのようなロンザにより製造された産生システム、例えばＴｕｒｂｏＣｅｌｌ（商標）発現プラットフォームのようなレンチュラー・バイオファーマにより製造された産生システム、または例えばＡｐｏｌｌｏ（商標）哺乳動物発現プラットフォームのようなＦｕｊｉｆｉｌｍ Ｄｉｏｓｙｎｔｈの発現プラットフォームである。

【0247】

本発明による抗体または抗原結合フラグメントを産生するための方法がさらに提供され、その方法は、本発明による核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養し、前記宿主細胞が前記核酸またはベクターを翻訳することを可能にし、それによって、本発明による前記抗体または抗原結合フラグメントを産生することを含む。本発明による前記方法は、前記宿主細胞からおよび／または培養培地から前記抗体または抗原結合フラグメントを回収するステップをさらに含むことが好ましい。いくらかの実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、表１に示されるような抗体、好ましくは、ＡＴ１６３６、ＡＴ１６３６-Ｉ、ＡＴ１６３６-Ｙ、ＡＴ１６３６-Ｅ、ＡＴ１６３６-Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントである。いくらかの好ましい実施形態において、前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントである。

【0248】

本発明による方法により得られる場合の抗体または抗原結合フラグメントもまた、本明細書で提供される。本発明にしたがって得られた結合化合物は、例えば、場合によっては、追加の精製、単離または加工ステップの後に、ヒトの治療または診断における使用に適している。

【0249】

いくらかの実施形態において、本発明による少なくとも１つの核酸分子またはベクターは、例えばインビボ抗体産生のために、非ヒト動物に導入される。そのため、本発明による抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子またはベクターを含む単離または組換え非ヒト動物が、さらに提供される。遺伝子導入非ヒト動物を生産するための方法は、当技術分野において既知である。

【0250】

追加の抗体修飾
定常領域の１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾されている本発明による抗体が、さらに提供される。いくらかの実施形態において、Ｆｃ領域における１つまたは複数のアミノ酸は、グリコシル化を低下させるために修飾されている。Ｎ－グリコシル化は、抗体の翻訳後修飾として一般的に認められており、コンセンサス配列Ｎ－Ｘ－ＳまたはＮ－Ｘ－Ｔ（Ｎはアスパラギンを表し、Ｘはアミノ酸残基を表し、Ｓはセリンを表し、Ｔはスレオニンを表す）を含むグリコシル化モチーフで生じることが知られている。Ｆｃグリコシル化は、抗体のＦｃ部分の構造的特徴に影響し、それによって、エフェクタ機能および薬物動態に影響する。Ｆｃグリコシル化が結果として半減期を短縮するおよび／または免疫原性を向上させることになる可能性があるので、グリコシル化は、治療用抗体に望ましくない可能性がある。いくらかの実施形態において、Ｆｃグリコシル化領域における１つまたは複数のアミノ酸は、グリコシル化を少なくするか、回避するために、元の親抗体と比較して修飾されている。例えば、上述したグリコシル化モチーフのＮ、ＳおよびＴ残基の少なくとも１つは変更されている。いくらかの実施形態において、ＣＨ２領域の４７位でのアスパラギン残基（Ｎ４７）は変更されている。いくらかの実施形態において、ＣＨ２領域の９５位でのスレオニン（Ｔ９５）は変更されている。

【0251】

代わりに、またはさらに、本発明による抗体の可変フレームワーク領域における１つまたは複数のグリコシル化部位は、グリコシル化を少なくするか、回避するために変更されている。

【0252】

抗体の定常ドメインは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のような種々の抗体の特徴の一端を担う。Ｆｃ領域は、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞および好中球などの免疫エフェクタ細胞上で異なる受容体に結合することにより抗体機能を媒介する。ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）およびＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）などのこれらの受容体のいくらかは、免疫エフェクタ細胞を活性化して抗原に対する応答を構築する。ＣＤ３２Ｂなどの他の受容体は、免疫細胞の活性化を阻害する。いくらかの実施形態において、本発明による抗体は、ＡＤＣＣ活性を強化するように設計されている。抗体のＡＤＣＣ活性を強化するための１つの技術は、脱フコシル化されている。そのため、脱フコシル化されている本発明による抗体または抗原結合フラグメントが、さらに提供される。

【0253】

脱フコシル化抗体を得るための当技術分野において既知である任意の手段を適用することができる。脱フコシル化抗体は、例えばＬｅｃ１３ ＣＨＯ突然変異体（Ｐａｔｎａｉｋ＆Ｓｔａｎｌｅｙ，２００６）などの、例えばフコシル化の能力が低下している産生細胞株の使用により得られる。ＣＨＯなどの細胞株におけるアルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子をノックアウトすること（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）技術）（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ，２００４）も可能である。

【0254】

代わりに、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ）を過剰発現し、結果として非フコシル化抗体（ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）技術）となる抗体産生細胞株を使用することができる。

【0255】

代わりに、またはさらに、例えば、すべて低親和性活性化ＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃ結合を改善、および／または低親和性阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの結合を低下しようとしている、糖鎖工学（協和発酵／Ｂｉｏｗａ、ＧｌｙｃＡｒｔ（ロシュ）およびＥｕｒｅｋａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）ならびに突然変異誘発（Ｘｅｎｃｏｒおよびマクロジェニックス）を含む、複数の他の戦略を使用して、ＡＤＣＣ強化を達成することができる。化学酵素的修飾はまた、Ｆｃ結合Ｎ－グリカンの修飾のために使用されている。

【0256】

フコースを除いて、他の糖部分も、ＡＤＣＣ活性の一端を担っていることが既知である。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＡＤＣＣを強化するために超ガラクトシル化されている。

【0257】

いくらかの実施形態において、本発明の抗体のＦｃドメイン内のＦｃγＲ結合部位の少なくとも１つのアミノ酸は、Ｆｃ／ＦｃＲ相互作用を操作するために修飾されている。いくらかの実施形態において、アミノ酸突然変異Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３ＡおよびＫ３３４Ａは、本発明の抗体のＦｃドメインに導入される。これらの突然変異は、ＡＤＣＣ活性を強化すると報告されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ，２００１）。いくらかの実施形態において、本発明の抗体のＡＤＣＣ活性は、場合によってはアミノ酸突然変異Ａ３３０Ｌと組み合わせて、アミノ酸突然変異Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを導入することにより強化される（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ，２００６）。いくらかの実施形態において、本発明の抗体のＡＤＣＣ活性は、アミノ酸突然変異Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌを導入することにより強化される（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ，２００７）。そのため、群：
- Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ；
- Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ；
- Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ；および
- Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｐ３９６Ｌ
から選択されるアミノ酸突然変異を含む、本発明による抗体または抗原結合フラグメントが、さらに提供される。

【0258】

ＡＤＣＣを誘発する際の抗体の有効性を決定するためのいくらかのインビトロ法が存在する。これらの中には、クロム－５１［Ｃｒ５１］放出アッセイ、ユーロピウム［Ｅｕ］放出アッセイおよび硫黄－３５［Ｓ３５］放出アッセイがある。通常、ある特定の表面曝露抗原を発現する標識化標的細胞株は、その抗原に特異的な抗体とインキュベートされる。洗浄後、Ｆｃ受容体ＣＤ１６を発現するエフェクタ細胞は、典型的に、抗体標識化標的細胞と同時インキュベートされる。続いて、標的細胞溶解物は、細胞内標識の放出により、例えば、シンチレーションカウンタまたは分光光度法により、典型的に測定される。代わりに、ルシフェラーゼベースの細胞毒性アッセイを使用することができ、ホタルルシフェラーゼを発現する標的細胞を、例えば二重特異性または多重特異性抗体などの抗体とインキュベートする。洗浄後、エフェクタ細胞を加え、同時インキュベートする。続いて、標的細胞死滅は、残りの標的細胞を溶解し、分光測色法によりルシフェリン発光を測定することにより、典型的に測定される。

【0259】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体は、ＣＤＣ活性を強化するように設計されている。ＣＤＣを強化するための１つの方法は、アミノ酸突然変異Ｋ３２６Ｗおよび／またはＥ３３３ＳのＦｃドメインへの導入である（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，２００１）。いくらかの実施形態において、アミノ酸突然変異Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８ＦおよびＳ３２４Ｔは、ＣＤＣ活性を強化するために、本発明の抗体のＦｃドメインに導入される。これらの突然変異はＡＤＣＣ活性を小さくすると報告されているので、アミノ酸置換Ｇ２３６ＡおよびＩ３３２Ｅはまた、ＡＤＣＣ活性を修復するために導入されることが好ましい（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ，２０１０）。

【0260】

いくらかの実施形態において、アミノ酸突然変異Ｅ３４５Ｒは、ＣＤＣ活性を強化するために、本発明の抗体のＦｃドメインに導入される。いくらかの実施形態において、アミノ酸突然変異Ｅ３４５Ｋおよび／またはＥ４３０Ｇは、ＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性を強化するために、本発明の抗体のＦｃドメインに導入される（Ｄｅ Ｊｏｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１６）。

【0261】

そのため、群：
- Ｋ３２６Ｗ；
- Ｅ３３３Ｓ；
- Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ｓ；
- Ｅ３４５Ｒ；
- Ｅ３４５Ｋ；
- Ｅ４３０Ｇ；
- Ｅ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｇ；
- Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ；および
- Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｇ２３６Ａ、Ｉ３３２Ｅ
から選択される１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む、本発明による抗体または抗原結合フラグメントが、さらに提供される。

【0262】

ＡＤＣＣおよびＣＤＣのような免疫エフェクタ機能が多くの治療用途において有益である一方で、他の用途では、それらを小さくするために有益である。そのような用途は、例えば、作用機序が特にＦａｂアームまたはＦｃ領域に融合した他の部分にある、治療的アプローチを含む。そのような場合において、Ｆｃ／ＦｃＲおよび／またはＦｃ／Ｃ１ｑ相互作用の低下は、免疫エフェクタ機能により引き起こされる組織損傷を低減するために有益である可能性がある。そのため、免疫エフェクタ機能の低下は、本発明による抗体の使用が、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを必要としない場合に好ましい可能性がある。本発明による抗体のエフェクタ機能は、例えば、ＩｇＧ１と比較してエフェクタ機能が低下しているＩｇＧ２またはＩｇＧ４フォーマットの使用により小さくされる。いくらかの実施形態において、本発明による抗体のエフェクタ機能は、Ｆｃ領域へのＬ２３５Ｅ突然変異の導入により、またはアミノ酸２３４～２３７位内の１つまたは複数の他の突然変異の導入により小さくされる。いくらかの実施形態において、本発明のＩｇＧ１抗体には、エフェクタ機能を小さくするためにアミノ酸置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ突然変異）が提供される（Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９２）。いくらかの実施形態において、本発明のＩｇＧ１抗体には、エフェクタ機能を小さくするためにアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ突然変異）が提供される。いくらかの実施形態において、本発明のＩｇＧ４抗体には、アミノ酸置換Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ（ＳＰＬＥ突然変異）が提供される。アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇの導入はまた、エフェクタ機能を小さくするのに有益である。

【0263】

そのため、群：
- Ｌ２３５Ｅ；
- Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；
- Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ；
- Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ；および
- Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ
から選択される１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む、本発明による抗体または抗原結合フラグメントが、さらに提供される。

【0264】

二重特異性または多重特異性結合化合物
本発明の別の態様は、別の化合物に結合している本発明による抗体または抗原結合フラグメントを提供する。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、いわゆる「抗体薬物複合体」（ＡＤＣ）を形成するために、例えば、薬物、化学療法剤、毒性部分、細胞毒性剤または放射性化合物などの別の治療的部分に結合している。

【0265】

いくらかの実施形態は、ＡＤＣを提供し、ＡＤＣは、本発明による抗体または抗原結合フラグメントおよび細胞増殖抑制剤または細胞毒性薬の単位を含む。薬物単位は、例えばＤＮＡ鎖（例えば、デュオカルマイシン、カリケアミシン、ピロロベンゾジアゼピン［ＰＢＤ］、およびＳＮ－３８［イリノテカンの活性代謝物］）または微小管（例えばマイタンシンおよびアウリスタチン）を破壊するか、トポイソメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ阻害を用いて、細胞死をもたらす（Ｃｈａｕ ｅｔ ａｌ，２０１９）可能性がある。いくらかの実施形態において、前記ＡＤＣは、細胞増殖抑制剤または細胞毒性薬の単位と抗体単位との間に化学リンカー単位を含む（Ｔｓｕｃｈｉｋａｍａ，２０１８）。いくらかの実施形態において、リンカーは、細胞内条件下で開裂し、リンカーの開裂は、細胞内環境下で薬物単位を抗体または抗原結合フラグメントから放出する。いくらかの実施形態において、リンカー単位は開裂可能ではなく、薬物は、例えば抗体分解により放出される。いくらかの実施形態において、リンカーは、細胞内環境下（例えばリソソーム内またはエンドソーム内または小窩内）に存在する開裂剤により開裂される。開裂可能なリンカーの非限定例は、ジスルフィド交換を通じて開裂可能であるジスルフィド含有リンカー、酸性ｐＨで開裂可能である酸に不安定なリンカー、および加水分解酵素、エステラーゼ、ペプチダーゼおよびグルクロニダーゼにより開裂可能であるリンカーを含む。

【0266】

いくらかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、細胞毒性リボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、阻害性ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＡＮ分子）または免疫賦活性核酸（例えば、免疫賦活性ＣｐＧモチーフ含有ＤＮＡ分子）である可能性がある核酸に共役する。いくらかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、アウリスタチンまたはその機能的ペプチド類縁体もしくは誘導体の代わりに、アプタマーまたはリボザイムに共役する。

【0267】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体薬物複合体は、診断目的および治療目的の両方に有用である、１つまたは複数の放射性標識アミノ酸を含む。放射性標識アミノ酸および関連するペプチド誘導体を調製するための方法は、当技術分野において既知である（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．１９９６、米国特許第４，６８１，５８１号、米国特許第４，７３５，２１０号、米国特許第５，１０１，８２７号、米国特許第５，１０２，９９０号（ＵＳ ＲＥ３５，５０Ｇ）、米国特許第５，６４８，４７１号および米国特許第５，６９７，９０２号を参照されたい）。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、放射性同位体または放射性同位体含有キレートに共役する。

【0268】

本明細書に開示された抗体およびその抗原結合フラグメントはまた、^９９Ｔｃ、^９０Ｙ、^１１１Ｉｎ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^１３１Ｉ、^１１Ｃ、^１５０、^１３Ｎ、^１８Ｆ、^３５Ｓ、^５１Ｃｒ、５１Ｔｏ、２２６Ｒａ、６ｏＣｏ、５９Ｆｅ、５１Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２ｎＣｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、および４ｏＫ、１５１Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^５２Ｔｒ、および^５６Ｆｅなどの標識と共役している可能性がある。

【0269】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントに結合している部分は、免疫調節化合物である。そのような免疫調節化合物の好ましい例は、Ｔ細胞結合化合物、ＮＫ細胞結合化合物、ＮＫＴ細胞結合化合物、またはガンマ－デルタＴ細胞結合化合物である。いくらかの好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞結合化合物は、ＣＤ３特異性結合化合物、ＫＬＲＧ１特異性結合化合物またはＣＤ１０３特異性結合化合物である。本発明による抗体または抗原結合フラグメントに結合された場合、そのようなＴ細胞結合化合物は、Ｔ細胞を、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する癌細胞などの細胞に向け、それによって、前記（癌）細胞に対して細胞毒性Ｔ細胞応答を誘導または強化する。

【0270】

同様に、ＮＫ細胞結合化合物、ＮＫＴ細胞結合化合物、またはガンマ－デルタＴ細胞結合化合物は、それぞれＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞に向けて、それらを、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する細胞に引き付け、細胞毒性または他の免疫媒介活性を誘導するのに適している。

【0271】

いくらかの好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞結合化合物は、ＣＤ３特異性結合化合物である。いくらかの好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞結合化合物は、ＫＬＲＧ１特異性結合化合物である。いくらかの好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞結合化合物は、ＣＤ１０３特異性結合化合物である。

【0272】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ＴＧＦβ特異性結合化合物に結合する。これは、本発明による抗体または抗原結合フラグメントを細胞、好ましくは、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンおよびＴＧＦβを含む腫瘍細胞などの疾患特異性細胞に向けるのに特に有用である。実施例において示されるように、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、前記腫瘍がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンおよびＴＧＦβを両方とも発現する場合、特に充分に、腫瘍細胞の増殖を阻害する、および／または腫瘍細胞死を増加させることができる。

【0273】

腫瘍学における二重特異性抗体および抗体コンストラクトの概要は、Ｓｕｕｒｓ ｅｔ ａｌ，２０１９に与えられている。

【0274】

そのため、いくらかの実施形態は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントおよび免疫調節分子を含む、二重特異性または多重特異性結合化合物を提供する。

【0275】

いくらかの実施形態は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントならびにＴ細胞結合化合物、ＮＫ細胞結合化合物、ＮＫＴ細胞結合化合物およびガンマ－デルタＴ細胞結合化合物からなる群より選択される化合物を含む、二重特異性または多重特異性結合化合物を提供する。

【0276】

いくらかの実施形態は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントおよびＣＤ３特異性結合化合物を含む、二重特異性または多重特異性結合化合物を提供する。

【0277】

いくらかの実施形態は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントおよびＣＤ１０３特異性結合化合物を含む、二重特異性または多重特異性結合化合物を提供する。

【0278】

いくらかの実施形態は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントおよびＫＬＲＧ１特異性結合化合物を含む、二重特異性または多重特異性結合化合物を提供する。

【0279】

いくらかの実施形態は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントおよびＴＧＦβ特異性結合化合物を含む、二重特異性または多重特異性結合化合物を提供する。

【0280】

いくらかの実施形態は、別の腫瘍結合化合物に結合している、本発明による抗体または抗原結合フラグメントを提供する。そのような二重特異性または多重特異性化合物は、特に、２つまたはそれ以上の結合した結合化合物が腫瘍細胞上の異なるエピトープに特異的である場合、例えば、腫瘍細胞の結合の増加またはより特異的な結合を可能にする。したがって、そのような二重特異性または多重特異性化合物は、治療用途または診断用途に非常に適している。

【0281】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、標識に結合している。これは、そのような標識結合化合物を使用して、例えばＥ－カドヘリン陽性癌細胞などのＥ－カドヘリン含有細胞の検出を可能にする。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、ホルモンまたは酵素に結合している。これは、そのようなホルモンまたは酵素の、Ｅ－カドヘリン含有（癌）細胞への標的化を可能にする。他の実施形態は、二次抗体またはその抗原結合フラグメントに結合している、本発明による抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0282】

したがって、いくらかの実施形態は、別の化合物、好ましくは免疫調節化合物、Ｔ細胞結合化合物、ＮＫ細胞結合化合物、ＮＫＴ細胞結合化合物およびガンマ－デルタＴ細胞結合化合物、ＣＤ３特異性結合化合物、ＴＧＦβ特異性結合化合物、サイトカイン、二次抗体またはその抗原結合フラグメント、検出可能な標識、薬物、化学療法剤、細胞毒性剤、毒性部分、ホルモン、酵素、および放射性化合物からなる群より選択される化合物に結合している、本発明による抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

【0283】

いくらかの実施形態において、前記二次抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに特異的である。そのため、本発明による抗体または抗原結合フラグメントおよびＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンにも特異的である二次抗体またはその抗原結合フラグメントを含む二重特異性または多重特異性結合化合物が提供される。得られる結合化合物は、Ｅ－カドヘリンに対して単一特異性であり、各Ｆａｂアームは、典型的にそれ自体のＥ－カドヘリンエピトープと結合する。いくらかの実施形態において、Ｆａｂフラグメントにより認識されるエピトープは互いに異なっている。他の実施形態において、エピトープは同じである。Ｆａｂアームは、異なる親和性でエピトープを結合する可能性がある。代わりに、Ｆａｂアームは、本質的に同じ親和性でそれらのエピトープを結合し、ＦａｂアームのＫ_Ｄが、３０％以下、好ましくは２０％以下または１０％以下で互いに異なっていることを意味する。

【0284】

いくらかの実施形態において、前記二次抗体またはその抗原結合フラグメントもまた、本発明による抗体または抗原結合フラグメントである。そのため、本発明による少なくとも２つの抗体または抗原結合フラグメントを含む二重特異性または多重特異性結合化合物が提供される。いくらかの実施形態において、本発明による前記少なくとも２つの抗体または抗原結合フラグメントは、互いに結合している。いくらかの実施形態において、前記二重特異性または多重特異性結合化合物は、少なくとも２つのＡＴ１６３６抗体またはその抗原結合部分を含む。いくらかの実施形態において、前記二重特異性または多重特異性結合化合物は、少なくとも２つのＡＴ１６３６－Ｉ抗体またはその抗原結合部分を含む。いくらかの実施形態において、前記二重特異性または多重特異性結合化合物は、少なくとも２つのＡＴ１６３６－Ｅ抗体またはその抗原結合部分を含む。いくらかの実施形態において、前記二重特異性または多重特異性結合化合物は、少なくとも２つのＡＴ１６３６－Ｎ抗体またはその抗原結合部分を含む。いくらかの実施形態において、前記二重特異性または多重特異性結合化合物は、少なくとも２つのＡＴ１６３６－Ｙ抗体またはその抗原結合部分を含む。いくらかの実施形態において、前記二重特異性または多重特異性結合化合物は、少なくとも２つのＡＴ１６３６－ＹＮ抗体またはその抗原結合部分を含む。いくらかの実施形態において、前記二重特異性または多重特異性結合化合物は、少なくとも２つのＡＴ１６３６－ＩＹＮ抗体またはその抗原結合部分を含む。いくらかの実施形態において、前記二重特異性または多重特異性結合化合物は、少なくとも２つのＡＴ１６３６－ＩＹＥＮ抗体またはその抗原結合部分を含む。

【0285】

いくらかの実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる結合化合物を提供し、前記化合物は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントおよび治療薬または放射性化合物または毒性部分を含む。

【0286】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、二重特異性または多重特異性化合物を産生するために、例えば現在既知である抗Ｅ－カドヘリン抗体またはその抗原結合フラグメントなどの別のＥ－カドヘリン特異性結合化合物に結合している。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントの重鎖は、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを産生するために、別のＥ－カドヘリン特異性抗体の重鎖と対になっている。本発明による二重特異性または多重特異性化合物は、例えば、Ｅ－カドヘリン含有細胞への結合の増加を可能にする。したがって、そのような二重特異性または多重特異性化合物は、治療用途または診断用途に非常に適している。また、本発明による二重特異性または多重特異性化合物をアッセイで使用することもでき、異なるＥ－カドヘリン含有細胞は、同じ二重特異性または多重特異性結合化合物に結合している。

【0287】

いくらかの実施形態は、本発明による抗体の１つのＦａｂフラグメントおよび別の抗体の１つのＦａｂフラグメントを含む、二重特異性抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。いくらかの実施形態において、そのような二重特異性抗体は、本発明による抗体の１つのＦａｂフラグメントおよび好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞に特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント、例えば、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１またはＣＤ１０３に特異的であるＦａｂフラグメントなどを含む。

【0288】

そのため、いくらかの実施形態は：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
- 好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞に特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0289】

また：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
- ＣＤ３に特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。

【0290】

また：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
- ＫＬＲＧ１に特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。

【0291】

また：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
- ＣＤ１０３に特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。

【0292】

また：
- 本発明による抗体または抗原結合フラグメントの１つのＦａｂフラグメント；および
- ＴＧＦβに特異的である別の抗体の１つのＦａｂフラグメント
を含む、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができる二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。

【0293】

本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、例えば酸に不安定なヒドラゾンリンカーなどのリンカーを介して、またはシトルリン－バリンのようなペプチドリンカーを介して、またはチオエーテル結合を介して、または国際公開第２０１０／０８７９９４号に詳細に説明されているソルターゼ触媒アミド基転移により、例えば薬物または免疫調節化合物または標識などの別の部分に結合する可能性がある。

【0294】

ソルターゼ触媒アミド基転移は、抗体の重鎖に対する、好ましくは重鎖のＣ末端部に対する、および前記抗体に結合している部分に対するソルターゼ認識部位（ＬＰＥＴＧＧ）の設計に関与する。抗体およびその部分はさらに、典型的にＧＧＧＧＳ配列およびＨＩＳタグなどの精製目的のためのタグを含む。続いて、ソルターゼ媒介アミド基転移が実行され、続いてクリックケミストリー結合が実行される。ソルターゼ触媒アミド基転移において、「クリックケミストリー結合」は、典型的に、例えばアルキン含有試薬と、例えば抗体の重鎖上のソルターゼモチーフおよび抗体に結合されている部分（タンパク質、ペプチドまたは抗体など）上のソルターゼモチーフへのグリシンの添加を通じてソルターゼにより添加されるアジド含有試薬との化学的カップリングに関与する。そのため、一実施形態において、本発明は、ソルターゼ認識部位（ＬＰＥＴＧＧ）が抗体の重鎖に対して、好ましくは重鎖のＣ末端部に対して設計される、本発明による抗体を提供し、抗体は、ＧＧＧＧＳ配列およびＨＩＳタグなどの精製タグをさらに含むことが好ましい。

【0295】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、チオエーテル結合を介して別の部分に結合している。そのような場合において、１つまたは複数のシステインは、好ましくは、本発明による抗体または抗原結合フラグメントに組み込まれる。システインは、チオール基を含み、そのため、１つもしくは複数のシステインの、本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントへの組み込み、または１つもしくは複数のアミノ酸の、１つもしくは複数のシステインによる置き換えは、前記抗体または抗原結合フラグメントの、別の部分への結合を可能にする。前記１つまたは複数のシステインは、好ましくは、前記抗体または抗原結合フラグメントの折り畳みに有意に影響せず、抗原結合またはエフェクタ機能を有意に変更しない位置で導入される。そのため、本発明はまた、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体の重鎖配列を含む、本発明による抗体または抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体の少なくとも１つのアミノ酸（システイン以外）は、システインにより置き換えられている。

【0296】

本発明は、本発明による抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞をさらに提供する。いくらかの実施形態において、前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、本発明による抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をさらに含む。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体としても既知である）は、新規の特定の標的を結合する細胞の能力を与えることができる、設計された受容体タンパク質である。ＣＡＲは、抗原結合機能および細胞活性化機能の両方を、１つの受容体に組み合わせる。ＣＡＲは、典型的に、活性化シグナルを伝達する、抗原結合ドメインと、直接または間接的に結合した１つまたは複数の細胞内ドメインとを含むモジュラーデザインを有している。共刺激ドメインの数に応じて、ＣＡＲは、第１（ＣＤ３ｚのみ）、第２（１つの共刺激ドメイン＋ＣＤ３ｚ）、または第３世代ＣＡＲ（１つより多い共刺激ドメイン＋ＣＤ３ｚ）に分類することができる。ＣＡＲ遺伝子のＴ細胞への導入は、追加の抗原特異性でＴ細胞を成功裏にリダイレクトし、完全なＴ細胞活性化を促進するために必要なシグナルを提供する。代わりに、ＣＡＲ遺伝子はまた、ＮＫ、ＮＫＴまたはガンマ－デルタ－Ｔ細胞などの他の免疫細胞に導入することもできる（Ｒａｆｉｑ ｅｔ ａｌ．２０１９）。ＣＡＲの抗原結合特徴は、好ましくは、細胞外ｓｃＦｖにより定義される。ｓｃＦｖのフォーマットは、一般に、方向ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカーＶＨのいずれかであるフレキシブルなペプチド配列により連結した、２つの可変ドメインである。当技術分野において既知である他のフォーマットは、タンデムＣＡＲ、ループタンデムＣＡＲおよび一般的なアダプタ分子に結合するＣＡＲを含む。（Ｇｕｅｄａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１９）。

【0297】

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、典型的に、活性化ドメインおよび１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。当技術分野において、ＣＡＲの大部分は、ＣＤ３ζ由来免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフを介してＣＡＲ Ｔ細胞を活性化する。最も広く研究されている共刺激ドメインは、遺伝子（４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０およびＣＤ２７を含む）のＣＤ２８ファミリー（ＣＤ２８およびＩＣＯＳを含む）または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーからの共刺激分子に由来する。代替のドメインは、ＭＹＤ８８またはキラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２（ＫＩＲ２ＤＳ２；ＤＡＰ１２としても既知である、ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質の同時発現と組み合わせる）に由来するものを含む。代わりに、ＣＡＲ－Ｔ細胞に使用される結合ドメインは、５つの他のＴＣＲサブユニットのいずれかの細胞外Ｎ末端に融合することができ、結果として、各ＴＣＲ融合コンストラクト（ＴＲｕＣｓ）のＴＣＲ複合体への組込みとなる（Ｂａｕｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ，２０１９）。

【0298】

ＣＡＲを発現するように細胞を遺伝子組換えするための当技術分野において使用されている戦略は、ガンマレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターなどのウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子工学ツールを含む。他の方法は、例えば、トランスポゾンシステム様ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）およびｐｉｇｇｙＢａｃ、ｍＲＮＡ、非統合レンチウイルス、エンドヌクレアーゼ酵素（Ｇｕｅｄａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１９）およびインサイチュ細胞プログラミングのためのＤＮＡナノキャリーを含む。

【0299】

本発明によるＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン、好ましくはその７０ｋＤＡ短縮形を結合し、そのため、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性癌細胞に対する免疫療法における使用に非常に適している。そのため、いくらかの実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを結合することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を提供し、ＣＡＲ Ｔ細胞は、本発明による抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。いくらかの実施形態において、前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、表１に示されるような抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。いくらかの実施形態において、前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、表１に示されるような抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をさらに含む。いくらかの実施形態において、前記ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。

【0300】

いくらかの実施形態は、本発明による二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＣＡＲ Ｔ細胞を含む、単離または組換え宿主細胞、または非ヒト動物を提供する。

【0301】

抗Ｅ－カドヘリン抗体の治療的使用
本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する細胞に対する使用に適している。さらに、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞を用いる処置が必要なヒト被験者を含む被験者を処置するための方法が提供される。また、医薬品および／または予防薬としての使用のための、本発明による核酸分子もしくはベクター、または本発明による核酸を含む細胞も提供される。本発明による１つまたは複数の核酸分子（を含むベクター）が投与される場合、核酸分子（複数を含む）は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントにインサイチュで翻訳される。得られる本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、続いて、例えばＥ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性腫瘍のようなＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現細胞に関連する障害を妨害または予防する。同様に、それを必要とする患者への本発明による細胞の導入は、結果として本発明による治療的または予防的抗Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン抗体または抗原結合フラグメントのインビボ生成となる。

【0302】

いくらかの実施形態は、医薬品または予防薬としての使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。いくらかの実施形態において、前記医薬品または予防薬は、Ｅ－カドヘリンを発現する細胞に関連している障害に対している。特定の実施形態において、前記細胞はまた、Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼを発現し、Ｅ－カドヘリンのＯ－マンノシル化およびＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに特異的である抗体およびその抗原結合フラグメントによるその結合を可能にする。そのため、いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0303】

特定の実施形態において、前記Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼは、ＴＭＴＣ３であり、そのＥ－カドヘリンＯ－マンノシル化活性について周知である。そのため、Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞が、さらに提供される。

【0304】

いくらかの実施形態において、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する腫瘍細胞に関連している前記障害は、上皮癌である。いくらかの実施形態において、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する腫瘍細胞に関連している前記障害は、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、食道胃接合部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、食道胃接合部癌、膀胱癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、尿路癌、前立腺癌、脳腫瘍、甲状腺癌、喉頭癌、カルチノイド癌、肝癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌（ovary cancer）、子宮頸癌、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮内膜癌、上皮内癌、明細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、腎癌、腎細胞癌、腎移行上皮癌、卵管癌および腹膜癌からなる群より選択される。いくらかの実施形態において、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する腫瘍細胞に関連している前記障害は、結腸直腸癌、結腸癌、結腸癌サブタイプＣＭＳ１、結腸癌サブタイプＣＭＳ２、結腸癌サブタイプＣＭＳ３、結腸癌サブタイプＣＭＳ４、喉頭癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、肺癌、胃癌（stomach cancer）、尿路癌、前立腺癌および卵巣癌（ovary cancer）からなる群より選択される。

【0305】

本明細書で使用されるように、Ｅ－カドヘリンを発現する腫瘍細胞はまた、「Ｅ－カドヘリン発現腫瘍細胞」または「Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞」とも呼ばれる。Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３を両方とも発現する腫瘍細胞はまた、本明細書では「Ｅ－カドヘリン発現およびＴＭＴＣ３発現腫瘍細胞」または「Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３発現腫瘍細胞」または「Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性腫瘍細胞」または「Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３陽性腫瘍細胞」とも呼ばれる。Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３を発現する腫瘍細胞を含む癌は、本明細書では「Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌」と呼ばれる。

【0306】

「被験者」は、ヒトまたは動物個体であり得る。いくらかの実施形態において、被験者は、例えばヒト、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、サル、類人猿、またはゴリラなどの哺乳動物個体である。特定の実施形態において、前記被験者は、ヒト個体である。

【0307】

本明細書で使用されるように、用語「Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する細胞に関連している障害」は、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する疾患に特異的な細胞の存在を含む任意の疾患を意味する。いくらかの実施形態において、そのような細胞は、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する腫瘍細胞の場合に頻繁にあるように、疾患の原因となる要因である。いくらかの実施形態において、そのような細胞の存在は、例えば炎症および／または疼痛などの有害な症状を引き起こす。

【0308】

用語「Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する細胞に関連している障害を処置または予防すること」は、前記障害の発症または進行を妨害すること、および／または前記障害に起因する症状を緩和することを指す可能性がある。例えば、用語「Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する腫瘍細胞に関連している障害を処置または予防すること」は、前記腫瘍細胞の増殖を防止、妨害および／もしくは減速させること、ならびに／または患者における前記腫瘍細胞の存在に起因する症状を緩和することを含む可能性がある。

【0309】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌を処置または予防するための方法における使用のための、抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。本発明によるＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン特異性抗体および抗原結合フラグメントの利点は、Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３を両方とも発現するが、ＴＭＴＣ３を発現しないＥ－カドヘリン陽性細胞にはかなり低い程度で結合する、（腫瘍）細胞に対するそれらの特異性である。これは、有害な副作用の低減を可能にし、そのためより高い投与量が許容される可能性がある。

【0310】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性上皮癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0311】

いくらかの実施形態は、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、食道胃接合部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、食道胃接合部癌、膀胱癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、尿路癌、前立腺癌、脳腫瘍、甲状腺癌、喉頭癌、カルチノイド癌、肝癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌（ovary cancer）、子宮頸癌、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮内膜癌、上皮内癌、明細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、腎癌、腎細胞癌、腎移行上皮癌、卵管癌および腹膜癌からなる群より選択される、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0312】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性結腸直腸癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0313】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性結腸癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0314】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性結腸癌サブタイプＣＭＳ１を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0315】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性結腸癌サブタイプＣＭＳ２を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0316】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性結腸癌サブタイプＣＭＳ３を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0317】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性結腸癌サブタイプＣＭＳ４を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0318】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性咽頭癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0319】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性頭頸部癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0320】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性乳癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0321】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性膵臓癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0322】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性食道癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0323】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性膀胱癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0324】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性肺癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0325】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性胃癌（stomach cancer）を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0326】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性尿路癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0327】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性前立腺癌または卵巣癌（ovary cancer）を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。

【0328】

いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、好ましくはＴＧＦβ１を発現する腫瘍細胞も含む、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌に対して使用される。本明細書で使用されるように、Ｅ－カドヘリン発現腫瘍細胞およびＴＭＴＣ３発現腫瘍細胞およびＴＧＦβ発現腫瘍細胞を含む癌は、「Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性およびＴＧＦβ陽性癌」と呼ばれる。実施例において示されるように、本発明による抗体または機能的フラグメントは、ＴＧＦβが存在する場合、腫瘍細胞に特によく結合する。本発明による抗体または抗原結合フラグメントのＴＧＦβとの組み合わせは、腫瘍細胞増殖を阻害する、および／または腫瘍細胞死を増加させるのに特に適している。そのため、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性およびＴＧＦβ陽性癌を治療または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞が、さらに提供される。ＴＧＦβの存在下での改善された腫瘍細胞増殖阻害の利点は、より少ない投与量を使用する可能性である。

【0329】

列挙された方法のいずれかにおける使用のための好ましい抗体は、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、ならびに同じ結合特異性を有するその抗原結合フラグメントである。

【0330】

いくらかの実施形態は、医薬品の製造のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。

【0331】

いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する細胞に関連している障害を処置または予防するための医薬品の製造のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。特定の実施形態において、前記細胞は腫瘍細胞である。特定の実施形態において、前記Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼは、ＴＭＴＣ３である。いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌を処置または予防するための医薬品の調製のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。いくらかの実施形態において、前記Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌は、上皮癌である。いくらかの実施形態において、前記Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌は、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、食道胃接合部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、食道胃接合部癌、膀胱癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、尿路癌、前立腺癌、脳腫瘍、甲状腺癌、喉頭癌、カルチノイド癌、肝癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌（ovary cancer）、子宮頸癌、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮内膜癌、上皮内癌、明細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、腎癌、腎細胞癌、腎移行上皮癌、卵管癌および腹膜癌からなる群より選択される。いくらかの実施形態において、前記Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌は、結腸直腸癌、結腸癌、結腸癌サブタイプＣＭＳ１、結腸癌サブタイプＣＭＳ２、結腸癌サブタイプＣＭＳ３、結腸癌サブタイプＣＭＳ４、喉頭癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、肺癌、胃癌（stomach cancer）、尿路癌、前立腺癌および卵巣癌（ovary cancer）からなる群より選択される。

【0332】

さらなる実施形態は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物を提供するいくらかの実施形態は、本発明による二重特異性抗体、多重特異性抗体、ＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞を含む組成物を提供する。本発明による核酸分子を含む組成物、ならびに本発明によるベクターまたは細胞を含む組成物も提供される。いくらかの実施形態において、前記抗体は、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ-Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体である。いくらかの実施形態において、本発明による組成物は、本発明による抗体、および別のＥ－カドヘリン特異性抗体を含む。前記他のＥ－カドヘリン特異性抗体は、好ましくは、本発明による抗体と比較して、異なるＥ－カドヘリンエピトープを結合する。異なるＥ－カドヘリン特異性抗体のそのような組み合わせは、Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３陽性腫瘍細胞などのＥ－カドヘリン陽性細胞を結合および／または妨害するのに特に適している。

【0333】

いくらかの実施形態において、本発明による組成物は、医薬組成物である。そのような医薬組成物はまた、医薬適合性のある担体、希釈剤および／または賦形剤を含むことが好ましい。適切な担体の非限定例は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（例えば、ＢＳＡまたはＲＳＡ）および卵白アルブミンを含む。いくらかの特定の実施形態において、前記適切な担体は、例えば生理食塩水のような溶液を含む。本発明による医薬組成物は、好ましくはヒトの使用に適している。

【0334】

本発明は、本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメント、および／または本発明による二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体もしくはＡＤＣもしくはＣＡＲ Ｔ細胞、および／または本発明による核酸、および／または本発明によるベクターもしくは細胞、および／または本発明による組成物もしくはキットオブパーツの治療的有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する細胞、好ましくは限定されないが腫瘍細胞に関連している障害を処置および／または予防するための方法を、さらに提供する。治療的有効量の本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメント、および／または本発明による二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞、および／または本発明による核酸、および／または本発明によるベクターもしくは細胞、および／または本発明による組成物もしくはキットオブパーツを、それを必要とする個体に投与することを含む、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌を少なくとも一部処置および／または予防するための方法が、さらに提供される。前記組成物は、好ましくは本発明による医薬組成物である。本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは核酸分子またはベクターまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または医薬組成物は、好ましくは１つまたは複数の注射を介して投与される。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは核酸分子またはベクターまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または医薬組成物は、静脈投与される。代わりに、当技術分野において既知である他の投与経路が使用される。本発明による結合化合物の投与の用量の非限定例は、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇから１０ｍｇである。

【0335】

いくらかの実施形態は、別の治療剤、好ましくは、抗癌治療剤および／または免疫調節化合物と組み合わせられる、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。例えば、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３などのＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害の処置および／または予防において有用である別の薬剤と組み合わせられる。そのため、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞が提供され、それによって、本発明による前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞は、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している前記障害の処置および／または予防に有用である別の治療剤と組み合わせられる。

【0336】

Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌を処置または予防するための方法における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞が、さらに提供され、それによって、本発明による前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞は、前記癌の処置および／または予防のための別の治療剤と組み合わせられる。

【0337】

いくらかの実施形態において、前記他の治療剤は、化学療法剤である。

【0338】

いくらかの実施形態において、前記他の治療剤は、細胞増殖抑制剤または細胞毒性薬である。

【0339】

いくらかの実施形態において、前記他の治療剤は、治療用核酸である。いくらかの実施形態において、前記核酸は、細胞毒性リボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、阻害性ＲＮＡ分子（例えばｓｉＲＡＮ分子）または免疫賦活性核酸（例えば免疫賦活性ＣｐＧモチーフ含有ＤＮＡ分子）である。いくらかの実施形態において、前記核酸は、アプタマーまたはリボザイムである。

【0340】

いくらかの実施形態において、前記他の治療剤は、放射性標識アミノ酸を含む。

【0341】

いくらかの実施形態において、前記他の治療剤は、放射性同位体または放射性同位体含有キレートを含む。

【0342】

Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する腫瘍細胞に関連している前記障害は、好ましくはＥ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌である。いくらかの実施形態において、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する腫瘍細胞に関連している前記障害は、上皮癌である。いくらかの実施形態において、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する腫瘍細胞に関連している前記障害は、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、食道胃接合部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、食道胃接合部癌、膀胱癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、尿路癌、前立腺癌、脳腫瘍、甲状腺癌、喉頭癌、カルチノイド癌、肝癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌（ovary cancer）、子宮頸癌、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮内膜癌、上皮内癌、明細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、腎癌、腎細胞癌、腎移行上皮癌、卵管癌および腹膜癌からなる群より選択される癌である。いくらかの特定の実施形態において、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼを発現する腫瘍細胞に関連している前記障害は、結腸直腸癌、結腸癌、結腸癌サブタイプＣＭＳ１、結腸癌サブタイプＣＭＳ２、結腸癌サブタイプＣＭＳ３、結腸癌サブタイプＣＭＳ４、喉頭癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、肺癌、胃癌（stomach cancer）、尿路癌、前立腺癌および卵巣癌（ovary cancer）からなる群より選択される癌である。

【0343】

本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞および別の治療剤の組み合わせを含む組成物およびキットオブパーツもまた、本明細書で提供される。いくらかの実施形態は、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害の処置または予防のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸分子またはベクターまたは宿主細胞、および別の治療剤を含むキットオブパーツまたは組成物を提供する。いくらかの実施形態において、前記組成物は医薬組成物である。前記障害は、好ましくはＥ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌である。

【0344】

いくらかの実施形態において、前記組成物は医薬組成物である。前記障害は、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌が好ましい。

【0345】

本発明によるキットオブパーツは、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＴ Ｔ細胞または核酸分子またはベクターまたは宿主細胞を含む組成物および他の治療剤を含む組成物が充填された１つまたは複数の容器を含む可能性がある。前記キットオブパーツまたは前記１つもしくは複数の容器は、場合によっては１つまたは複数の医薬適合性のある担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む。そのようなキットオブパーツまたは容器（複数を含む）に関連して、使用説明書などの種々の資料、または医薬品の製造、使用もしくは販売を規制する政府機関により規定された形式での通知が含まれる可能性があり、通知は製造、使用または販売の代理店による承認を反映している。いくらかの実施形態において、本発明によるキットオブパーツは、使用説明書を含む。

【0346】

いくらかの実施形態は、ヒトまたは非ヒト個体におけるＥ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連する障害を処置または予防するための方法を提供し、その方法は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞または組成物またはキットオブパーツの治療的有効量を、さらなる治療剤または治療手順と組み合わせて、前記個体に投与することを含む。前記さらなる治療剤は、本明細書で上述したような薬剤であることが好ましい。

【0347】

Ｅ－カドヘリン特異性抗体のさらなる用途
本発明による抗体、抗原結合フラグメント、ＡＤＣおよびＣＡＲ Ｔ細胞はまた、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現細胞の検出に特に有用である。例えば、個体、好ましくはヒトが、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現細胞に関連する障害に罹患している疑いがある場合、前記個体からの試料をＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現細胞（本明細書ではＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性細胞とも呼ばれる）の存在について、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞を使用して試験することができる。いくらかの実施形態において、前記試料を、そのような細胞が前記試料中に存在する場合、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性細胞を特異的に結合する、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞と混合する。本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞に結合される、例えばＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞などのＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性細胞は、試料から単離することができる、および／または当技術分野において既知である任意の方法、例えば限定されないが、磁気ビーズ、ストレプトアビジンコートビーズを使用する単離、またはカラムに固定化された二次抗体の使用を通じた単離を使用して検出することができる。代わりに、またはさらに、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞は、それを検出することができるように標識される。そのような抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞は、例えば希土類キレート、フルオレセインまたはその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅ ｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム（acridimium）塩標識、オキサラートエステル標識、エクオリン標識、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識、または安定フリーラジカルなどのフルオロフォアを使用して、例えば蛍光標識、酵素標識または放射性標識されている。いくらかの実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞は、前記抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞に対して向けられている標識二次抗体を使用して検出される。

【0348】

本明細書で提供されるように、スクリーニングアッセイは、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウェスタンブロットアッセイおよび免疫組織化学染色アッセイなどの当技術分野において既知である方法を使用して実行することができる。

【0349】

標識された本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞は、例えば血液試料または組織試料などの個体の細胞含有試料と例えばインキュベートされ、その後、未結合の結合化合物が洗い流される。続いて、前記標識された本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞が、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性細胞に結合されるかどうかが決定される。いくらかの実施形態において、未標識の本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞を、細胞含有試料と接触させる。インキュベーション後、１つまたは複数の洗浄ステップは、好ましくは非結合の結合化合物を除去するために実行される。続いて、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞が、例えば本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞に対して特異的に向けられており、例えば蛍光化合物などのマーカー、または例えば西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼと結合している検出抗体を使用して、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性細胞に結合している。さらなる洗浄ステップの後、検出抗体が、例えば発光を測定することによりまたは西洋わさびペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼの基質を添加することにより結合されているかどうかが決定されることが好ましい。これらの検出技術は、当技術分野において周知である。

【0350】

本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞が患者の試料の成分に結合するようにみえる場合、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性細胞の存在について示唆している。このように、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞のような疾患特異的細胞を検出することができる。さらに、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞のような疾患特異的Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性細胞の存在は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞を用いる処置が、有益な効果を有していることを示唆する。そのため、いくらかの実施形態は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する細胞を試料が含むかどうかを決定するための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞の使用を提供する。いくらかの実施形態において、本発明による前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する腫瘍細胞を試料が含むかどうかを決定するために使用される。

【0351】

また、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞が試料中に存在するかどうかを決定するための方法も提供され、その方法は：
- 前記試料を本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞と接触させること、および
- 前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞が、存在する場合にＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞に結合することを可能にすること、および
- 細胞が、前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞に結合されているかいないかを決定し、それによって、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞が前記試料中に存在するかしないかを決定すること
を含む。

【0352】

抗体ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮ、ならびにそれらの抗原結合フラグメントは、例えばＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞のようなＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現細胞を検出するのに特に適している。そのため、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞を試料が含むかどうかを決定するための、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントの使用がさらに提供される。いくらかの実施形態は、例えばＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現上皮癌細胞、または腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、食道胃接合部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、食道胃接合部癌、膀胱癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、尿路癌、前立腺癌、脳腫瘍、甲状腺癌、喉頭癌、カルチノイド癌、肝癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌（ovary cancer）、子宮頸癌、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮内膜癌、上皮内癌、明細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、腎癌、腎細胞癌、腎移行上皮癌、卵管癌および腹膜癌からなる群より選択される、好ましくは結腸直腸癌細胞、結腸癌細胞、結腸癌サブタイプＣＭＳ１細胞、結腸癌サブタイプＣＭＳ２細胞、結腸癌サブタイプＣＭＳ３細胞、結腸癌サブタイプＣＭＳ４細胞、咽頭癌細胞、頭頸部癌、乳癌細胞、膵臓癌細胞、食道癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、胃癌（stomach cancer）細胞、尿路癌細胞、前立腺癌細胞および卵巣癌（ovary cancer）細胞からなる群より選択される癌の細胞のようなＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む腫瘍細胞を試料が含むかどうかを決定するための、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントの使用を提供する。

【0353】

また、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞が試料中に存在するかどうかを決定するための方法も提供され、その方法は：
- 前記試料を、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントと接触させること、ならびに
- 前記抗体または抗原結合フラグメントが、存在する場合にＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞に結合することを可能にすること、ならびに
- 細胞が、前記抗体または抗原結合フラグメントに結合されているかいないかを決定し、それによって、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞が前記試料中に存在するかしないかを決定すること
を含む。

【0354】

いくらかの実施形態は、本発明による方法を提供し、前記試料は、血液試料または骨髄試料または生検を含む。いくらかの実施形態において、前記生検は、腸からであり、好ましくは、消化器癌、結腸直腸癌、結腸癌、食道癌または胃癌（stomach cancer）について試験される。いくらかの実施形態において、前記生検は、膵臓組織または肺組織または乳房組織または咽頭組織または扁平上皮組織または肝臓組織または卵巣組織または前立腺組織または尿路組織または膀胱組織または脳組織からである。いくらかの実施形態において、前記試料は血液試料であり、例えば、多発性骨髄腫の存在および／または上述した固形腫瘍のいずれかの転移について試験するのに有用である。

【0355】

本発明による方法の試験結果は、試料のタイピングに有用である。例えば、個体の試料が悪性のＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性細胞を含むようにみえる場合、試料は、疾患関連細胞を含んでいるとタイピングされる。そのようなタイピングは、その後、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン発現細胞に関連する障害の診断に使用することができる。そのため、いくらかの実施形態は、診断薬として使用するための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞を提供する。Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む細胞、好ましくは腫瘍細胞に関連している障害の診断における使用のための、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞または核酸またはベクターまたは宿主細胞が、さらに提供される。前記障害は、好ましくは上皮癌であり、好ましくは、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、食道胃接合部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、食道胃接合部癌、膀胱癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、尿路癌、前立腺癌、脳腫瘍、甲状腺癌、喉頭癌、カルチノイド癌、肝癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌（ovary cancer）、子宮頸癌、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮内膜癌、上皮内癌、明細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、腎癌、腎細胞癌、腎移行上皮癌、卵管癌および腹膜癌からなる群より選択される、より好ましくは、結腸直腸癌、結腸癌、結腸癌サブタイプＣＭＳ１、結腸癌サブタイプＣＭＳ２、結腸癌サブタイプＣＭＳ３、結腸癌サブタイプＣＭＳ４、喉頭癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、肺癌、胃癌（stomach cancer）、尿路癌、前立腺癌および卵巣癌（ovary cancer）からなる群より選択される。

【0356】

いくらかの好ましい実施形態において、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、上述した検出および診断に使用される。そのため、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン含有細胞に関連する障害の診断における使用のための、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントも提供される。いくらかの実施形態は、上皮癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、食道胃接合部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、食道胃接合部癌、膀胱癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、尿路癌、前立腺癌、脳腫瘍、甲状腺癌、喉頭癌、カルチノイド癌、肝癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巣癌（ovary cancer）、子宮頸癌、卵巣癌（ovarian cancer）、子宮内膜癌、上皮内癌、明細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、腎癌、腎細胞癌、腎移行上皮癌、卵管癌および腹膜癌からなる群より選択される、より好ましくは、結腸直腸癌、結腸癌、結腸癌サブタイプＣＭＳ１、結腸癌サブタイプＣＭＳ２、結腸癌サブタイプＣＭＳ３、結腸癌サブタイプＣＭＳ４、喉頭癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、肺癌、胃癌（stomach cancer）、尿路癌、前立腺癌および卵巣癌（ovary cancer）からなる群より選択される、Ｅ－カドヘリン陽性およびＴＭＴＣ３陽性癌細胞の診断における使用のための、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを提供する。

【0357】

また、ヒトまたは非ヒト個体がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む癌に罹患しているかどうかを決定するための方法も提供され、その方法は：
- 前記個体の細胞を本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞と接触させること、
- 前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞が、存在する場合にＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む腫瘍細胞を結合することを可能にすること、ならびに
- 腫瘍細胞が前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞に結合されているかいないかを決定し、それによって、前記個体がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む癌に罹患しているかいないかを決定すること
を含む。いくらかの実施形態において、前記方法はエクスビボ方法である。他の実施形態において、前記方法はインビボ画像検査法である。

【0358】

適切な画像検査技術は、ＳＰＥＣＴイメージング（単一光子放射断層撮影）およびＰＥＴイメージング（陽電子放射断層撮影）を含む。適切な標識は、例えばＳＰＥＣＴイメージングと組み合わせた、例えばヨウ素－１２３（^１２３１）およびテクネチウム－９９ｍ（９ｍ^９Ｔｃ）、または例えばＰＥＴイメージングと組み合わせた^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５０または^１８Ｆ、またはインジウム１１１（例えば、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６７：３８５－４４０を参照されたい）を含む。

【0359】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性癌の非限定例は、上記に列記されている。好ましくは、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントは、前記方法に使用される。そのため、いくらかの実施形態は、ヒトまたは非ヒト個体が、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを発現する癌に罹患しているかどうかを決定するための方法を提供し、その方法は：
- 前記個体の細胞を、ＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントと接触させること、
- 前記抗体または抗原結合フラグメントが、存在する場合にＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む腫瘍細胞を結合することを可能にすること、ならびに
- 腫瘍細胞が前記抗体または抗原結合フラグメントに結合されているかいないかを決定し、それによって、前記個体がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む癌に罹患しているかいないかを決定すること
を含む。

【0360】

いくらかの実施形態において、個体がＥ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する癌に罹患しているかどうかが決定される。本明細書の上記で説明したように、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンを含む癌の存在は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞を用いる処置が、有益な効果を有していることを示唆する。そのため：
- 前記個体からの試料を本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞と接触させること、ならびに
- 前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞が、存在する場合にＥ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する腫瘍細胞を結合することを可能にすること、ならびに
- 腫瘍細胞が前記抗体または抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体または多重特異性抗体またはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞に結合されているかいないかを決定し、それによって、前記個体がＥ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する癌に罹患しているかいないかを決定すること
を含む、個体がＥ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現する癌に罹患しているかどうかを決定するための方法も提供される。好ましくは、前記個体はヒトである。

【0361】

本発明の別の態様は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞を用いる癌患者の処置が、癌患者の平均個体群と比較して処置の前向きな結果の改善された可能性を有するかどうかを決定するための方法を提供し、その方法は、前記癌患者の試料が、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリン陽性腫瘍細胞を含むかどうかを決定することを含む。これが事実である場合、例えばＡＴ１６３６、Ｅ－Ｃ０６、Ｄ－Ｈ０４、Ｄ－Ａ０２、Ｄ－Ｅ０９、Ｅ－Ａ０４、Ｅ－Ｂ０９、Ｃ－Ａ０５、Ｃ－Ａ０３、Ｃ－Ｂ０２、Ｃ－Ｄ０４－Ａ、Ｃ－Ｄ０４－Ｂ、Ｆ－Ｃ０８、Ｄ－Ｇ０３、Ｄ－Ｆ１０、Ｃ－Ｅ０８、Ｄ－Ｂ０６、Ｄ－Ｇ０５、Ｄ－Ｈ０８、Ｃ－Ｈ０１、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１１、Ｅ－Ｃ１０、ＡＴ１６３６－Ｉ、ＡＴ１６３６－Ｙ、ＡＴ１６３６－Ｅ、ＡＴ１６３６－Ｎ、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６－ＩＹＮおよびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮからなる群より選択される抗体のような本発明による抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントが、そのような癌に対抗するのに特に適している。そのため、個体の癌細胞がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンをそれらの表面に含むことが既知である場合、処置が成功する可能性が高くなる。そのため、個体の疾患特異的細胞、好ましくは腫瘍細胞がＯ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンをそれらの表面で含むかどうかを決定することを含むスクリーニング方法がさらに提供される。いくらかの態様において、前記疾患特異的細胞がＥ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３を発現するかどうかが決定される。いくらかの態様において、前記疾患特異的細胞がＴＧＦβを発現するかどうかがさらに決定される。癌細胞のような疾患特異的細胞が、Ｅ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、好ましくはＴＭＴＣ３、およびＴＧＦβを発現する場合、本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞を用いる処置が成功する可能性は、さらに高くなる。

【0362】

Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンの存在が、典型的にＥ－カドヘリンおよび例えばＴＭＴＣ３などのＯ－マンノシルトランスフェラーゼの発現の結果であるので、いくらかの実施形態は、個体の疾患特異的細胞、好ましくは腫瘍細胞がＥ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、特にＴＭＴＣ３を発現するかどうかを決定することを含むスクリーニング方法を提供する。いくらかの実施形態は、個体の疾患特異的細胞、好ましくは腫瘍細胞がＥ－カドヘリンおよびＯ－マンノシルトランスフェラーゼ、特にＴＭＴＣ３、およびＴＧＦβを発現するかどうかを決定することを含むスクリーニング方法を提供する。

【0363】

いくらかの実施形態において、本発明によるそのような方法は：
- 個体からの疾患特異的細胞含有試料を、Ｏ－マンノシル化Ｅ－カドヘリンに特異的である結合化合物、好ましくは抗体または抗原結合フラグメントと接触させるステップ；
- 前記結合化合物が前記試料の疾患特異的細胞を結合することを可能にするステップ、および
- 前記結合化合物が前記試料の疾患特異的細胞に結合されているかいないかを決定するステップ
を含み、前記結合化合物の、前記試料の疾患特異的細胞への結合が、前記患者が本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはＡＤＣまたはＣＡＲ Ｔ細胞を用いる処置の前向きな結果の優位な可能性を有すことを示唆する。

【0364】

いくらかの実施形態において、前記疾患特異的細胞は腫瘍細胞である。

【0365】

いくらかの実施形態において、前記疾患特異的細胞がまた、ＴＧＦβを発現するかどうかがさらに決定される。

【0366】

本出願が同じ実施形態の一部として、または別個の実施形態の一部として、特徴を記載する可能性がある一方で、本発明の範囲はまた、本明細書に記載の特徴のすべてまたはいくらかの任意の組み合わせを含む実施形態を含む。

【実施例】

【0367】

本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではないが、単に本発明を明確にするのに役立つ。

【0368】

【表1】

【0369】

【表2】

【0370】

【表3】

【0371】

【表4】

【0372】

【表5】

【0373】

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US 4,681,581

US 4,735,210

US 5,101,827

US 5,102,990 (US RE35,50G)

US 5,648,471

US 5,697,902

US9534058 (B2)

WO 2010/087994

WO 2013/081463

WO 2015/093949

【0374】

実施例
実施例１ ＡＴ１６３６抗体発見
患者および健康なヒトの材料
研究プロトコルは、アカデミックメディカルセンターの医療倫理委員会、アムステルダム、オランダにより承認された。すべての参加者は、インフォームドコンセントに署名した。全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール勾配遠心分離後に新鮮な血液から単離し、使用するまで凍結した。

【0375】

結腸癌特異性クローンＡＴ１６３６の生成
国際公開第２０１５／０９３９４９号およびＫｗａｋｋｅｎｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ（２０１０）により記載された手順にしたがって、ナイーブおよびメモリーＩｇＧ Ｂ細胞を、ＭＳＨ６遺伝子における病原性遺伝子変異体の保因者であり、ステージＩＶの結腸直腸癌（ＣＲＣ）および肝転移と診断されており、アバスチン、カペシタビンおよびオキサリプラチンを用いる処置に成功している、リンチ症候群に罹患している患者から単離した。Ｂ細胞を、最後の処置から９年後にこの患者から得られた末梢血から単離した。ナイーブおよびメモリーＩｇＧ Ｂ細胞を、Ｂｃｌ６およびＢｃｌ－ｘＬ遺伝子ならびにレポータ遺伝子ＧＦＰのレトロウイルス形質導入により不死化された。次に、不死化したＢ細胞を、１ウェルあたり５個、１０個または２０個の細胞の濃度で播種し（この後、ミクロ培養と名付ける）、ＩＬ－２１およびＣＤ４０Ｌで増殖させた。その後、増殖させたＢ細胞ミクロ培養の上清を、結腸細胞株：ＣＯＬＯ－２０５、ＣＡＣＯ－２およびＤＬＤ１細胞（ＡＴＣＣ）のミクスに結合する特異性抗体についてスクリーニングした。二次抗体として抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、フローサイトメトリ（ＢＤ）により結合した抗体を検出した。

【0376】

インフルエンザのＨＡ抗原（国際公開第２０１３／０８１４６３号に記載）を特異的に結合する無関係な対照抗体（ＡＴ１００２）を、実験の陰性対照として含めた。

【0377】

上清が結腸細胞株への特異的な結合を示したミクロ培養を選択し、１個の細胞／ウェルの濃度で播種し、クローン培養を得た。増殖後、クローン培養の上清を、結腸細胞株に特異的に結合する抗体の存在に対して、上述したようにフローサイトメトリを使用して試験した。７Ｇ０２と名付けられた、得られた結腸特異的Ｂ細胞クローンの１つは、３つの結腸細胞株の２つに結合したＩｇＧ３抗体を産生した。

【0378】

結腸癌特異性抗体ＡＴ１６３６のクローニング
７Ｇ０２により産生された抗体を同定するため、メーカーの説明書にしたがってＴｒｉＰｕｒｅ／クロロホルム法（ロシュ）を使用して、総ｍＲＮＡを単離した。次に、ｃＤＮＡを、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、インビトロジェン）およびランダムヘキサマー（プロメガ）により生成した。ＣＨ１（重鎖）およびＣｋａｐｐａ（軽鎖）特異的プライマを組み合わせたリーダー特異的プライマを適用するメーカーの手順にしたがって、ＰＣＲ（ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ロシュ）により、重鎖および軽鎖のＩｇＧ可変ドメインを増幅させた。アンプリコンは、増幅に使用したような同族プライマを使用する、サンガージデオキシ蛍光シーケンシング（ＢＤＴ、インビトロジェン）に使用された。逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ誘導突然変異を除外するために、少なくとも５つのクローンを配列決定した。

【0379】

次に、７Ｇ０２の完全重鎖および軽鎖領域をコードする合成コドン最適化ＤＮＡフラグメント（ＧｅｎｅＡｒｔ）を、Ｄｏｕｂｌｅ Ｇｅｎｅ ｐＸＣベースの発現ベクター（ロンザ）にサブクローニングした。コンストラクトは、ＤＮＡの配列決定により、完全性についてチェックされた。ここから、７Ｇ０２のヒトＩｇＧ１／カッパ組換え抗体は、ＡＴ１６３６と指定されている。

【0380】

続いて、ｐＸＣ二重遺伝子ベクターを、ＣＨＯ－ＧＳ細胞に安定的にトランスフェクトして、安定プールを生成した（ＧＳ Ｘｃｅｅｄプラットフォーム、ロンザ）。安定プールを拡大し、７日間の振盪フラスコ、流加回分細胞培養ＩｇＧ産生に使用した。組換えＡＴ１６３６抗体を含む細胞除去上清を回収し、ＡＫＴＡ精製システム（ゼネラルエレクトリックライフサイエンス）を使用するプロテインＡクロマトグラフィを使用して精製した。０．１Ｍクエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．５の緩衝液を使用して抗体を溶出し、続いて、１Ｍトリス－ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和し、その後サイズ排除クロマトグラフィによりＴＢＳ－ＴＳ中で再緩衝化した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＯＤ２８０、サーモフィッシャー）を使用して濃度を確立した。サイズ排除クロマトグラフィを使用して、精製された抗体の単量体含量は、＞９０％と確認された。精製されたタンパク質の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確立した。

【0381】

ＡＴ１６３６のフローサイトメトリ結合特性
フローサイトメトリを使用して、細胞株のパネルおよび初代細胞材料への結合について、組換えＡＴ１６３６抗体を試験した。要するに、細胞を抗体溶液と３０～６０分間、４℃でインキュベートし、その後、１５０μｌのＰＢＳ １％ＢＳＡで２回洗浄した。抗体結合を、抗ヒトＩｇＧ－ＲＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７共役ポリクローナルＢＣＲ抗体（インビトロジェン）で検出し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩまたはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー）で分析した。ＡＴ１６３６は、Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＣＴ３を同時発現する（癌細胞株百科事典（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ）にしたがって）、上皮細胞株への結合を示す（表３を参照されたい）。

【0382】

実施例２ ＡＴ１６３６の標的同定
免疫沈降
ＡＴ１６３６抗体の標的を同定するため、結腸癌細胞株ＤＬＤ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２１）およびＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ（陰性対照）の細胞を使用して、標的の免疫沈降（ＩＰ）を実行した。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（ロシュ）を添加した溶解緩衝液（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４（シグマ）、０．５％ＤＯＣ；０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス－ＨＣＬ ｐＨ７．４、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を使用して、細胞を溶解した。溶解後、不溶性画分を遠心分離により除去した。その後、溶解物を、プロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（インビトロジェン）に結合した無関係な抗体（ＲＳＶ抗体パリビズマブ）およびストレプトアビジンビーズ（インビトロジェン）を用いて予めきれいにし、非特異性結合タンパク質を除去した。その後、予めきれいにした溶解物を、５０μｇの、プロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ結合ＡＴ１６３６抗体または陰性対照としてのビーズ結合インフルエンザ特異性抗体ＡＴ１００２と３時間４℃でインキュベートした。抗体－インキュベートビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、１×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオ・ラッド）＋０．１Ｍ ＤＴＴを用いて、結合したタンパク質をビーズから溶出させた。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離した。ＩＰ試料の８５％を分取ＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動させ、免疫沈降したタンパク質を、Ｉｍｐｅｒｉａｌタンパク質染色（Ｐｉｅｒｃｅ）で視覚化した。ＤＬＤ１対Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（陰性対照として）からのＡＴ１６３６およびＡＴ１００２（陰性対照）免疫沈降物との間で特異の免疫沈降タンパク質：７０ｋＤａおよび８５ｋＤａを切除した（図２ａを参照されたい）。バンドを質量分析に供した。タンパク質は、ジチオスレイトールによる還元、ヨードアセトアミドによるアルキル化、およびＰｒｏｔｅｉｎｅｅｒ ＤＰ消化ロボット（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ブレーメン、ドイツ）を使用するゲル内トリプシン消化に供された。トリプシンペプチドを、Ｅａｓｙ ｎＬＣ １０００勾配ＨＰＬＣシステム（サーモ、ブレーメン、ドイツ）、およびＬＵＭＯＳ質量分析計（サーモ）からなるシステムを有するオンラインＣ１８ナノＨＰＬＣ ＭＳ／ＭＳにより分析した。その後、ヒトＵｎｉｐｒｏｔデータベースに対して、Ｍａｓｃｏｔアルゴリズム（Ｍａｓｃｏｔ ｖ２．２．０４、マトリックスサイエンス）を使用して質量分析データをサーチすることによりタンパク質を同定した。１０ｐｐｍのＭＳ許容値および０．０２ＤａのＭＳ／ＭＳ許容値を使用した。トリプシンが選択の酵素として指定され、最大２つの開裂部位の欠落を可能にした。カルバミドメチルシステインを固定修飾として、メチオニンの酸化およびＮ末端アセチル化を可変修飾として選択した。データベースサーチからの結果を分析し、足場（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｓｏｆｔｗａｒｅ．ｃｏｍ）を使用して視覚化した。Ｅ－カドヘリンは、Ｏ－マンノシル化されていることが認められた。Ｏ－マンノシル化の同定のため、ヘキソースによるセリンおよびスレオニンの修飾を可変修飾として選択した。非トリプシンＮ末端を同定するために、セミトリプシンを酵素特異性として使用した。

【0383】

質量分析により、ＡＴ１６３６による免疫沈降されているタンパク質は、切除された７０ｋＤａバンドにおいてＥ－カドヘリンの２４％のシーケンスカバレッジで短縮７０ｋＤａ型のＥ－カドヘリン（ＣＤＨ１、本明細書ではｐ７０と呼ばれる短縮型）であるが、ベータカテニンは、８５ｋＤａバンドに認められる（７６％のタンパク質カバレッジ）ことが明らかにされた。Ｅ－カドヘリンの最も外側のＣ末端ドメインに対応するペプチドは検出されず、短縮タンパク質が示唆された（図３における完全長および短縮Ｅ－カドヘリンの漫画を参照）。さらにＮ末端アセチル化実験により、Ｎ末端残基がグルタミン酸４６３であることが明らかになった（Ｕｎｉｐｏｒｔ Ｐ１２８３０エントリによる番号付け）。

【0384】

ウェスタンブロット
ＡＴ１６３６のｐ７０Ｅ－カドヘリンの特異的結合は、ウェスタンブロットにより確認された。ＡＴ１６３６反応性を、市販のＥＰ７００Ｙ（アブカム、ウサギ抗体）およびＥ－カドヘリンの細胞質ドメインに特異的なマウス抗体（クローン３６／Ｅ、ＢＤバイオサイエンス）と比較した。ＥＰ７００Ｙは、ヒトＥ－カドヘリンのＥＣ５ドメインへの結合が示されており、したがって、細胞内Ｃテール抗体にも当てはまる、完全長およびｐ７０Ｅ－カドヘリンの両方を結合する。Ｅ－カドヘリン抗体免疫沈降を、同量の溶解物（１０ｍｇ）および抗体（２．５μｇ）を用いて、ＤＬＤ１細胞から実行した。投入物（４０μｇ）およびＩＰ試料（すべて）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動させ、免疫ブロット法ためにＰＶＤＦ膜（バイオ・ラッド）に移した。Ｅ－カドヘリンの細胞内ドメインおよびＥＰ７００Ｙ抗体を結合する抗体を使用すると、完全長（１２０ｋＤａ）Ｅ－カドヘリンおよび７０ｋＤａタンパク質が免疫沈降されたが、一方で、ＡＴ１６３６では主に７０ｋＤａタンパク質が免疫沈降された（図２ｂ）。したがって、ＡＴ１６３６は、完全長Ｅ－カドヘリンよりもｐ７０の濃縮により示されるように完全長Ｅ－カドヘリンよりもｐ７０を優先的に結合する。シグナルの濃度測定的定量で、我々は、ＥＰ７００Ｙ ＩＰと比較して、ＡＴ１６３６ＩＰでは完全長よりもｐ７０の７倍濃縮を認めた。

【0385】

図３において、図は、ｐ７０において認められている短縮を要約しており、完全長Ｅ－カドヘリンのＥＣ１、ＥＣ２およびＥＣ３ドメインの大部分を除去し、Ｄ３ドメインの短いペプチドに加えてドメインＥＣ４およびＥＣ５を残している。また、いくらかの抗体の結合領域およびβ－カテニン相互作用ドメインも示す。

【0386】

ＡＴ１６３６標的のタンパク質分解性開裂
ｐ７０を生成するためにＥ－カドヘリンがタンパク質分解的に開裂されるかどうかを調べるため、我々は、ＤＬＤ１細胞（デカノイル－ＲＶＫＲ－ＣＭＫ（Ｔｏｃｒｉｓ））に添加されたフーリン／コンベルターゼ阻害剤を用いてフーリンおよび関連するコンベルターゼを阻害した。示された濃度の阻害剤の非存在下または存在下で細胞を４８時間培養し、１回リフレッシュさせた。細胞を回収し、示された抗体（図４）を用いるフローサイトメトリに供した。ＤＬＤ１細胞のＣＭＫとのインキュベーションは低下したが、ＤＬＤ１細胞へのＡＴ１６３６の結合を完全に無効にせず（図４）、ｐ７０開裂がフーリンおよび他の関連するコンベルターゼにより一部媒介されていることを示唆した。

【0387】

ＥＣ３ドメイン内でのＥ－カドヘリンの独特な開裂に加えて、Ｅ－カドヘリンをＯ－マンノシル化することができることが知られている（Ｉ．Ｓ．Ｂ．Ｌａｒｓｅｎ，ＰＮＡＳ（２０１７）、Ｍ．Ｂ．Ｖｅｓｔｅｒ－Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ＰＮＡＳ（２０１３）、Ｍ．Ｌｏｍｍｅｌ，ＰＮＡＳ（２０１３）およびＳ．Ｃａｒｖａｌｈｏ Ｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１６））。ＡＴ１６３６の開裂部位および可能な結合ドメインに隣接しているものは、少なくとも２つのＯ－マンノシル化スレオニン（Ｔｈｒ残基４７２および４７４）であり、おそらく１つは４７０位である。ＡＴ１６３６結合についてｐ７０のＯ－マンノシル化の依存性を研究するため、ＣＭＫ実験と類似の実験を、マンノシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｍａｎｎ、オキソ－２－チオキソ－３－チアゾリジニル酢酸、シグマ）を用いて実行した。図４の２つの右の列に示されているのは、Ｍａｎｎで処置されたＤＬＤ１細胞へのＡＴ１６３６結合の低下であり、ＡＴ１６３６結合領域内でのｐ７０Ｏ－マンノシル化が結合に必要とされていることを示唆する。

【0388】

実施例３ 高親和性ＡＴ１６３６変異型の生成
組換え可溶性ｐ７０Ｅ－カドヘリンタンパク質の産生
完全長Ｅ－カドヘリンｃＤＮＡと、ＥＣ５およびＥＣ４ドメインならびに細胞内および膜貫通（ＴＭ）ドメインの両方を除く４６３位でのＮ末端までのＥＣ３の一部に対応するｐ７０Ｅ－カドヘリンｃＤＮＡ（図１）とを、ＧｅｎｅＡｒｔから得、続いて、ソルターゼおよびＨＩＳタグを備えたマウスＦテール上のＦＬＡＧタグを含む、ｐＣＭＶ３、ｐｃＤＮＡ３およびｐＸＣ１９ベクターにクローン化されたか、Ｃタグのみを含むタンパク質が生産された。ベクターを一時的にＥｘｐｉ２９３またはＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、組み換え蛋白質をＣタグ親和性マトリックスまたはプロテインＡセファロースで精製した。溶出されたタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィによりＴＢＳ－ＴＳ中で再緩衝化した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＯＤ２８０、サーモフィッシャー）を使用して濃度を確立した。サイズ排除クロマトグラフィを使用して、精製された抗体の単量体含量は、＞９０％と確認された。精製されたタンパク質の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確立した。

【0389】

ＧＦＰ高発現７Ｇ０２ Ｂ細胞の生成
Ｂｃｌ６およびＢｃｌ－ｘＬの遺伝子の次に、７Ｇ０２ Ｂ細胞に形質導入するために使用されたレトロウイルスはまた、Ｂ細胞の形質導入の成功のためのレポータとしてＧＦＰの遺伝子も含んでいた。Ｂｃｌ６、Ｂｃｌ－ｘＬおよびＧＦＰ遺伝子を含むレトロウイルスを使用して、７Ｇ０２ Ｂ細胞を２回目のレトロウイルス形質導入に供した。これは、結果として、元の７Ｇ０２ Ｂ細胞よりもＧＦＰ発現が高い７Ｇ０２ Ｂ細胞となった。高ＧＦＰ発現７Ｇ０２ Ｂ細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンス）を使用する細胞ソーティングに供し、高レベルのＧＦＰを安定して発現する７Ｇ０２ Ｂ細胞の均一な集団を生成した。７Ｇ０２－ＧＦＰ－高細胞の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインの配列を、メーカーのプロトコルにしたがって、ＴｒｉＰｕｒｅ／クロロホルム（ロシュ／メルク）を使用して、全ＲＮＡを単離することにより決定した。次に、逆転写酵素（インビトロジェン）を使用して、ｃＤＮＡを生成した。抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードするｃＤＮＡを、ＶＨおよびＶＬプライマを使用するＰＣＲにより増幅させ、ＤＮＡ配列決定に供した。７Ｇ０２－ＧＦＰ－高Ｂ細胞の抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインの配列は、７Ｇ０２－ＧＦＰ－低Ｂ細胞のものと同一であった。

【0390】

増加した標的結合を有する７Ｇ０２ Ｂ細胞クローンの単離
可溶性Ｅ－カドヘリンタンパク質を使用して、Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓら（Ｍ．Ｊ．Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３））により記載されたようなＡＩＭＰｒｏｖｅ法により、元の７Ｇ０２ Ｂ細胞クローンと比較して増加した抗原結合を有するサブクローンを選択した。要するに、７Ｇ０２ Ｂ細胞ＧＦＰ－高－クローンを拡大し、増殖した細胞を組換え可溶性Ｅ－カドヘリンマウスＦｃ融合タンパク質とインキュベートした（上記を参照されたい）。続いて、細胞を洗浄し、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の重鎖および軽鎖を特異的に結合するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７共役ポリクローナル抗体（インビトロジェン）と同時インキュベートして、ＢＣＲ発現レベルを評価し、Ｒ－フィコエリスリン標識ポリクローナル抗マウスＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて結合したＥ－カドヘリンタンパク質を視覚化した。細胞をフローサイトメトリにより分析し、平均７Ｇ０２ Ｂ細胞集団と比較してＢＣＲ発現に関してより高い組換えＥ－カドヘリンタンパク質結合を示した細胞は、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンス）を使用して単一細胞に分類された（図５ａ）。選択されたクローンを２週間から３週間培養して増殖を可能にし、その後、親７Ｇ０２－ＧＦＰ－低クローンと比較して増加した抗原結合について抗原競合アッセイ（以下を参照されたい）で試験された。

【0391】

抗原競合アッセイ
７Ｇ０２ Ｂ細胞（７Ｇ０２、ＧＦＰ低）を回収し、９６ウェル丸底フラスコマイクロウェルプレートに、１ウェルあたり１０，０００個の細胞で播種した。続いて、１０～５０μＬの分類されたサブクローン（ＧＦＰ高）をこれらのウェルに加えた。全細胞を２回洗浄し、Ｅ－カドヘリン－マウスＦｃタンパク質と１～３時間氷上でインキュベートした。続いて、細胞を２回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７共役ポリクローナルＢＣＲ抗体およびＲ－フィコエリスリン標識ポリクローナル抗マウスＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と約１時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤバイオサイエンス）を使用して、フローサイトメトリにより結合した抗体を検出した。親７Ｇ０２－ＧＦＰ－低細胞に結合する組換えＥ－カドヘリンタンパク質の量をサブクローン（ＧＦＰ高）に結合した組換えＥ－タンパク質の量と比較する。親クローン（ＧＦＰ－低）と比較して組換えＥ－のサブクローン（ＧＦＰ－高）への結合が、ＢＣＲ発現レベルに関して高いことは、より高い結合能を有するＢＣＲを示唆する。図５ｂでプロットされているのは、ＢＣＲ発現に関して親７Ｇ０２－ＧＦＰ－低Ｂ細胞と比較してＥ－カドヘリンタンパク質への向上した結合を示す７Ｇ０２－ＧＦＰ－高サブクローンの例である。

【0392】

ＡＴ１６３６の選択されたサブクローン抗体のクローニングおよび配列分析
サブクローンのパネルを、親７Ｇ０２クローと比較して強化された組換えＥ－カドヘリン抗原結合に基づいて選択した。メーカーの説明書にしたがってＴｒｉＰｕｒｅ／クロロホルム法（ロシュ）を使用して、これらのサブクローンの総ＲＮＡを単離した。次に、ｃＤＮＡを、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、インビトロジェン）およびランダムヘキサマー（プロメガ）により生成した。ＣＨ１（重鎖）およびＣｋａｐｐａ（軽鎖）特異的プライマを組み合わせたリーダー特異的プライマを適用するメーカーの手順にしたがって、ＰＣＲ（ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ロシュ）により、重鎖および軽鎖のＩｇＧ可変ドメインを増幅させた。アンプリコンは、増幅に使用したような同族プライマを使用する、サンガージデオキシ蛍光シーケンシング（ＢＤＴ、インビトロジェン）に使用された。表１は、Ｂ細胞サブクローンの表面上のＢＣＲの量に関して増加した抗原結合を示したサブクローンのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示している。この配列データに基づいて、組換え抗体ＡＴ１６３６－Ｉ（ＶＨ配列番号３、ＶＬ配列番号１８）、ＡＴ１６３６－Ｙ（ＶＨ配列番号１０、ＶＬ配列番号１８）、ＡＴ１６３６－Ｅ（ＶＨ配列番号５、ＶＬ配列番号１８）、ＡＴ１６３６－Ｎ（ＶＨ配列番号８、ＶＬ配列番号１８）、ＡＴ１６３６－ＹＮ（ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１８）、ＡＴ１６３６－ＩＹＮ（ＶＨ配列番号１６、ＶＬ配列番号１８）およびＡＴ１６３６－ＩＹＥＮ（ＶＨ配列番号１７、ＶＬ配列番号１８）は、組換え生産された。

【0393】

７Ｇ０２サブクローン配列に基づいて組換え抗体を生産するため、重鎖および軽鎖可変領域を、ヒトＩｇＧ１およびカッパ定常領域とインフレームでＤｏｕｂｌｅ Ｇｅｎｅ ｐＸＣベース発現ベクター（ロンザ）にクローン化した。ＤＮＡシーケンシングにより完全性についてコンストラクトを調べ、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（ＧＳ Ｘｃｅｅｄプラットフォーム、ロンザ）にトランスフェクトした。細胞を増殖させて、振盪フラスコ、流加回分細胞培養ＩｇＧ産生のために７日間使用した。組換えＡＴ１６３６抗体を含む細胞除去上清を回収し、ＡＫＴＡ精製システム（ゼネラルエレクトリックライフサイエンス）を使用するプロテインＡクロマトグラフィを使用して精製した。０．１Ｍクエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．５の緩衝液を使用して抗体を溶出し、続いて、１Ｍトリス－ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和し、その後サイズ排除クロマトグラフィによりＴＢＳ－ＴＳ中で再緩衝化した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＯＤ２８０、サーモフィッシャー）を使用して濃度を確立した。サイズ排除クロマトグラフィを使用して、精製された抗体の単量体含量は、＞９０％と確認された。精製されたタンパク質の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確立した。

【0394】

次に、結腸ＤＬＤ１、マウスＣＭＴ９３、乳房ＭＣＦ１０ａ、皮膚Ａ４３１および肺Ａ５４７を含む異なる細胞株に結合するフローサイトメトリについて組換え抗体を比較した（図６ａおよび図６ｂ）。これらの実験から、我々は、３つの突然変異（ＶＨ配列番号１６、ＶＬ配列番号１８）を組み合わせるＡＴ１６３６－ＩＹＮ抗体がＡＴ１６３６および他のＡＴ１６３６変異型と比較してさらに効率的にこれらの細胞を結合すると結論付けることができた。

【0395】

実施例４ ＡＴ１６３６高親和性変異型の分析
ＳＰＲを使用するＡＴ１６３６高親和性変異型の結合
組換えｐ７０Ｅ－カドヘリンへの結合について、ＡＴ１６３６組換え抗体およびＡＴ１６３６－ＹＮ（本明細書では－ＮＹとも呼ばれる；ＶＨ配列番号１５およびＶＬ配列番号１８）およびＡＴ１６３６－ＩＹＮ（本明細書では－ＩＹＮとも呼ばれる；ＶＨ配列番号１６およびＶＬ配列番号１８）変異型を試験し、ＩＢＩＳ Ｍｘ９６（ＩＢＩＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＣＦＭスポッタ（ワサッチマイクロ流体工学社）を使用して抗体ＥＰ７００Ｙ Ｅ－カドヘリン抗体と比較した。スプリントソフトウェア（バージョン１１．０．２４、ＩＢＩＳ）を使用して、結果を分析した。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェア（バイオロジックソフトウェア）を使用して、結合曲線をフィッティングさせた。

【0396】

ＳｅｎｓＥｙｅ Ｇ－ＳＴＲＥＰチップ（Ｓｓｅｎｓ ＢＶ、エンスヘデ、オランダ）を、ヒトｐ７０Ｅ－カドヘリン－マウスＦｃ－ビオチンの濃度系列（０．２～２．０μｇ／ｍｌ）でコートした（実施例３を参照されたい）。２μｌ／分（会合＋解離の間）、８μ／分（再生ステップ）の流速下、両方とも２５℃の温度で結合を評価した。続いて、抗ウサギＩｇＧ（ヤギ抗ウサギＨ＋Ｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ）、および抗マウスＩｇＧ（ヤギ抗マウスＨ＋Ｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ）、ＥＰ７００Ｙ（アブカム）、ＡＴ１６３６および変異型－ＩＹＮおよび－ＮＹを、０．５～２０μｇ／ｍｌの濃度系列で、二連で注入した。ＩＢＩＳマルチプレックスＳＰＲイメージングにより、結合を確立する。

【0397】

図７ａに示されるように、ＡＴ１６３６ならびにその変異型－ＹＮおよび－ＩＹＮの可溶性ｐ７０Ｅ－カドヘリンへの結合を示した。ＡＴ１６３６ＮＹは、ＡＴ１６３６と比較して大幅に改善された結合を示し、ＡＴ１６３６ＩＹＮと比較してほぼ等しい結合を示す。ＡＴ１６３６抗体の中で、特にオンレートが増加しても、オフレートは、変化しないままであった。

【0398】

ＥＬＩＳＡによるＡＴ１６３６変異型の定常状態結合
ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃｙ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用する組換えＥ－カドヘリンｍＦｃタンパク質を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に捕捉した。ＴＢＳ／５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキングした後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、捕捉してＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、ＡＴ１６３６およびＡＴ１６３６親和性変異型を（４度で）加え、これらの抗体の結合をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した後にヤギヒトＩｇＧ Ｈ＋Ｌ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用して検出した。結合した抗体を、ＴＭＢ基質（シグマ）を使用して視覚化し、反応をＨ_２ＳＯ_４（メルク）で停止し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（パーキンエルマー）を使用してＯＤ４５０測定により定量した。図７ｂ（２つの左パネル）に示されるように、ＡＴ１６３６抗体と比較してＡＴ１６３６－ＹＮおよび－ＩＹＮ抗体変異型の類似の増加した結合は、ＥＬＩＳＡにより、完全長Ｅ－カドヘリンおよびｐ７０に対して観察された。再度、ＡＴ１６３６ＩＹＮ変異型は、－ＹＮおよびＡＴ１６３６抗体よりもより強力な結合を示す。ここで、ＳＣ１０．１７、ヒト化ＥＣ１ドメイン特異性Ｅ－カドヘリン抗体は、完全長Ｅ－カドヘリンを結合するが、ｐ７０短縮変異型を結合しない。注目すべきことに、試験した抗体ＡＴ１６３６変異型のすべておよびＡＴ１６３６野生型は、完全長Ｅ－カドヘリンよりも良好にＥ－カドヘリンの短縮７０ｋＤａ型を結合する。

【0399】

別のＥＬＩＳＡにおいて、我々は、ＡＴ１６３６およびその変異型の、残基Ｔｈｒ４７０のアラニン置換を含むＤ３－マウスＦｃタンパク質への結合を試験した。ＡＴ１６３６結合が、実施例２、図４におけるオキソ－２－チオキソ－３－チアゾリジニル酢酸を使用するマンノシルトランスフェラーゼ阻害により示される、Ｏ－マンノシル化ｐ７０に依存しているので、我々は、Ｏ－マンノシル化を無効にする置換を行った。残基４７０は、ＡＴ１６３６エピトープの中心に位置し、おそらくマンノシル化されている。確かに、我々は、ＡＴ１６３６が、このＴｈｒ４７０Ａｌａ Ｄ３変異型への結合をほとんど完全に喪失したことを示すことが可能である（図７ｂ、右パネル）。ＡＴ１６３６変異型は、ＡＴ１６３６－ｗｔと比較してｐ７０へのそれらの向上した結合能力にも関わらず、依然として、それらの結合エピトープ内で適切なＯ－マンノシル化に依存していた。

【0400】

完全長Ｅ－カドヘリンを超えるｐ７０の結合優先性を評価するため、我々は、完全長Ｅ－カドヘリン、ｐ７０および、ＡＴ１６３６結合が強力に低減される変異型である残基Ｔｈｒ４７０のアラニン置換を含むＤ３マウスＦｃタンパク質への結合について、幅広い濃度範囲のＡＴ１６３６およびその変異型を試験した（図７ｂに示される）。

【0401】

図７ｃおよび表４に示されるように、ＡＴ１６３６野生型と比較した結合の増加は、－ＩＹＮおよび－ＹＮ変異型で最も顕著である。重要なことに、それらは、それぞれ完全長Ｅ－カドヘリン（ＹＮについては５６．５倍、ＩＹＮについては６７．１倍）および（ＹＮについては２８．４倍、ＩＹＮについては６４．３倍）と比較してＥ－カドヘリンのｐ７０型への好ましい結合を保持する。

【0402】

実施例５ エピトープマッピング
ＡＴ１６３６へのｐ７０Ｅ－カドヘリン結合は、マンノース依存性である
溶解緩衝液（プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（ロシュ）を添加した０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４（シグマ）、０．５％ＤＣＯ；０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス－ＨＣＬ ｐＨ７．４、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を使用して、４℃で３時間、ＤＬＤ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２１）を溶解した。溶解後、不溶性画分を遠心分離により除去した。次に、溶解物を、プロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（インビトロジェン）およびストレプトアビジンビーズ（インビトロジェン）に捕捉された無関係な抗体（ＲＳＶ抗体パリビズマブ）を用いて予めきれいにし、非特異性結合タンパク質を除去した。その後、予めきれいにした溶解物を、プロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（インビトロジェン）に捕捉されたＡＴ１６３６抗体と４℃で３時間インキュベートし、溶解緩衝液で３回洗浄し、４５０ｍＭメチルα－マンノピラノシド（シグマ）を用いて、結合したタンパク質をビーズから溶出させた。１×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液（バイオ・ラッド）＋０．１Ｍ ＤＴＴ中で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、続いて、ＰＶＤＦ膜上でのウェスタンブロッティングにより、溶出物を分析した。ＴＢＳＴ／５％ＢＳＡを用いる膜のブロッキング後、膜をウサギ抗Ｅ－カドヘリン（ＥＰ７００Ｙ、アブカム）とインキュベートし、Ｅ－カドヘリンタンパク質を検出した。図８ａに示されるように、ｐ７０Ｅ－カドヘリンを高マンノース添加によりＡＴ１６３６から溶出させ、１つまたは複数のマンノース基が、ＡＴ１６３６の結合エピトープの本質的な部分を形成することを示唆した。ＡＴ１６３６のＥ－カドヘリンへの結合のマンノース依存性は、ＥＬＩＳＡにより確認された。組換えＥ－カドヘリンタンパク質を、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃｙ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用して９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に捕捉した。ＨＥＫ細胞由来の完全長Ｅ－カドヘリン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）および大腸菌（ＬＳｂｉｏ）由来の完全長Ｅ－カドヘリンを捕捉した。捕捉してＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した後、ＡＴ１６３６およびＥＰ７００Ｙ（アブカム）および陰性対照としてのＡＴ１００２を用量－濃度で添加した。これらの抗体の結合は、ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎでの２回の洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ｙ）－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）または抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｄａｋｏ）を使用して検出された。結合した抗体を、ＴＭＢ基質（シグマ）を使用して視覚化し、反応をＨ２ＳＯ４（メルク）で停止し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（パーキンエルマー）を使用してＯＤ４５０測定により定量した。ＥＰ７００Ｙ、Ｅ－カドヘリンのＥＣ５ドメインに対するウサギ抗体は、両方のＥ－カドヘリン組換えタンパク質を結合するが、ＡＴ１６３６は、大腸菌由来Ｅ－カドヘリン（翻訳後修飾を保持しない）を結合せず、ＨＥＫ産生組換えＥ－カドヘリンを結合する（図８Ｂを参照されたい）。

【0403】

いくらかのＳｅｒ／Ｔｈｒ残基は、マンノシル化されていると報告されている；Ｅ－カドヘリンのＥＣ２ドメイン内で５つ、ＥＣ３内で４つ、ＥＣ４内で４つ、ＥＣ５内で１つ（Ｌａｒｓｅｎ，ＰＮＡＳ（２０１７）、Ｖｅｓｔｅｒ－Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ＰＮＡＳ（２０１３）およびＬｏｍｍｅｌ，ＰＮＡＳ（２０１５））。図３において、Ｅ－カドヘリン上の推定Ｏ－マンノシル化部位は、黒色で示される。ＡＴ１６３６の質量分析において、免疫沈降したｐ７０Ｅ－カドヘリンタンパク質Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基は、１つがＯ－マンノシル化されていることが認められた。

【0404】

ＡＴ１６３６のアラニン突然変異ＥＣ３Ｅ－カドヘリンドメインへの結合
短縮Ｅ－カドヘリンｐ７０ドメイン内のＡＴ１６３６抗体の正確な結合エピトープを決定するため、複数のアラニン突然変異を短縮組換え細胞外ドメイン３（Ｄ３）内で生成した。最初に、アミノ酸残基ＥＶＳＬＴＴＳＴＡＴＶＴＶＤＶＬＤＶＮＥＡＰＩＦからなる短縮細胞外ドメインＤ３のみのドメインを生成した（図３）。加えて、各残基の単一アラニン突然変異が設計された。Ｄ３およびそのアラニン突然変異体をコードするｃＤＮＡを、ＦＬＡＧタグおよびソルターゼおよびＨＩＳタグを備えたマウスＦｃテールに融合したｐｃＤＮＡ３ベクターにクローン化した。ベクターを一時的にＥｘｐｉ２９３またはＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、組換えタンパク質を含む上清を７日後に回収した。組換えＤ３タンパク質またはそのアラニン突然変異体を、抗マウスＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（５ｕｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ）コート３８４ウェルｓｐｅｃｔｒａ ｐｌａｔｅ ＨＢ（パーキンエルマー）上のマウスＦｃドメインを介して捕捉した。インキュベーションおよびＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎでの２回の洗浄後、ＡＴ１６３６－ＹＮまたは対照Ａｂ ＡＴ１００２を加え、これらの抗体の結合は、二次ヤギヒトＩｇＧ Ｆｃ（ｙ）－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用してＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した後、検出された。結合した抗体を、ＴＭＢ基質を使用して視覚化し、反応をＨ_２ＳＯ_４で停止した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（パーキンエルマー）上でのＯＤ４５０測定により、結合した抗体の定量化を確立した。

【0405】

アラニン置換は、結果として、野生型Ｅ－カドヘリン：Ｅ４６３Ａ、Ｓ４６５Ａ、Ｔ４６７Ａ、Ｓ４６９Ａ、Ｔ４７２ＡおよびＶ４７７Ａと比較してＡＴ１６３６－ＹＮの結合の部分的破棄となった。Ｔ４６８ＡおよびＴ４７０Ａ／Ｇ／Ｎ／Ｄの置換は、ＡＴ１６３６－ＹＮ結合を完全に破棄した。残基４７０の重要性も、実施例４、図７ｂ、右パネルに示しており、ＡＴ１６３６およびその変異型は、４７０位でアラニン突然変異を有するＤ３タンパク質変異型への結合を可能にしなかった。全体として、特に４つの中心スレオニン（より少ない程度に４６７、４６８、４７０、および４７２）は、ＡＴ１６３６のＥ－カドヘリンおよびｐ７０Ｅ－カドヘリンへの結合を支配しているようである（図９を参照されたい）。

【0406】

実施例６ ＡＴ１６３６の結合は、ＴＭＴＣ３およびＥ－カドヘリン同時発現に対応する
Ｌａｒｓｅｎおよび協力者は、Ｅ－カドヘリンマンノシル化がテトラトリコペプチドリピート（ＴＰＲ）リピート含有タンパク質（ＴＭＴＣ１～４）の存在に依存していることを報告した（Ｍ．Ｒａｃａｐｅ Ｍ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１１）、Ｂａｒｔｅｌｓ ＭＦ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１６）、Ｊ．Ｃ．Ｓｕｎｒｙｄ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２０１４）およびＩ．Ｓ．Ｂ．Ｌａｒｓｅｎ，ＰＮＡＳ（２０１７））。Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ）からの癌細胞株百科事典ｍＲＮＡデータベースから回収された＞１１００個の細胞株において完全長Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３のｍＲＮＡ発現を使用すると、Ｅ－カドヘリンおよびＴＭＴＣ３の同時発現の間の強力な相関を確立し、一方で、他のＴＭＴＣ１、２および４はいずれも、そのような相関を確立することができなかった。加えて、Ｅ－カドヘリン、ＴＭＴＣ３およびＡＴ１６３６の結合の間の相関を確立することができた（表３）。ＴＭＴＣ３およびＥ－カドヘリンのためのｍＲＮＡ発現について７のカットオフを使用すると、ＴＭＴＣ３およびＥ－カドヘリンの≧７のｍＲＮＡ発現を示すすべての細胞株は、ＡＴ１６３６結合に陽性であると予測された。ＡＴ１６３６結合に陽性であると予測されている異なる腫瘍のタイプに由来する細胞株の割合を図１０に示す。いくらかの固形腫瘍は、両方の遺伝子を高レベルで発現し、上部（気道）消化管、食道、乳房、結腸、前立腺、膵臓、胃、尿路、卵巣および肺からの腫瘍を含む腫瘍細胞株の大部分が、ＡＴ１６３６またはＡＴ１６３６高親和性変異型を結合することが示唆される。

【0407】

ＴＭＴＣ３発現Ｅ－カドヘリン陰性細胞株における完全長Ｅ－カドヘリンの発現
Ｅ－カドヘリン完全コード配列を、Ｇｅｎｅａｒｔから得、ＩＲＥＳ－ＧＦＰを含むｐＨＥＦレンチウイルスベクターにサブクローニングした。ＶＳＶ－Ｇエンベロープを用いてレンチウイルス粒子を産生し、ＳＫ－ＭＥＬ－５標的細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－７０）にウイルスで形質導入し、少なくとも１週間の増殖後、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を使用してＧＦＰ発現について分類した。ヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ６４７（インビトロジェン）およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ）抗体を検出試薬として使用して、陰性対照抗体としてのＡＴ１００２、ＡＴ１６３６およびＥＰ７００Ｙ Ｅ－カドヘリン抗体とともに単離細胞をフローサイトメトリに供した（図１１）。ＴＭＴＣ３を発現しているが、通常はＥ－カドヘリン陰性である細胞ＳＫ－ＭＥＬ－５細胞における完全長Ｅ－カドヘリンの過剰発現は、結果としてＡＴ１６３６抗体の結合となる。

【0408】

ＡＴ１６３６結合は、ＴＭＴＣ３に依存している
ＴＭＴＣ３ ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿１８１７８３．４）を標的化するためにいくらかのｓｈＲＮＡを設計した。最終的に、選択されたｓｈＴＭＴＣ３は、最後のコーディングエクソン（１４）：２２＿ｍｅｒ：ＡＧＧＡＧＡＣＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡを標的とする。選択されたｓｈＲＮＡをｐＴＲＩＰＺベクター（サーモサイエンティフィック）にサブクローニングし、ＶＳＶ－Ｇエンベロープを有するレンチウイルス粒子をメーカーの説明書にしたがって生成した。ＤＬＤ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２１）に形質導入し、１μｇ／ｍｌ Ｄｏｘｙｃｙｌｉｎ（シグマ）の添加によりｓｈＲＮＡの発現を誘導した。４日間から７日間の培養後、ＡＴ１６３６およびＡＴ１００２抗体の結合について、結合した抗体を検出するように、ヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ６４７（インビトロジェン）抗体を使用して、細胞をフローサイトメトリ分析に供した。並行して、Ｔｒｉｐｕｒｅ単離試薬（ロシュ）を使用してＲＮＡを単離し、Ｏｉｌｇｏ－ｄＴプライマを有するＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン）を用いてｃＤＮＡを生成した。ＩＣｙｃｌｅｒ（バイオ・ラッド）上でＩＱ Ｓｙｂｒｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオ・ラッド）を用いて定量ＰＣＲを実行し、ＴＭＴＣ３ ｑＰＣＲフォワードプライマ５’－ＧＧＴＧＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴ－３’およびリバースプライマ５’－ＧＧＡＣＧＧＴＡＡＧＡＣＴＴＧＴＧＧＣＴ－３’を使用してＴＭＴＣ３ ｍＲＮＡを検出し、ＧＡＰＤＨ対照を使用してｍＲＮＡ転写を定量した。

【0409】

図１２に示されるように、ＴＭＴＣ３のｓｈＲＮＡノックダウンに続き、ＤＬＤ１細胞へのＡＴ１６３６結合は強く低下する。

【0410】

実施例７ ｐ７０Ｅ－カドヘリンを標的とするＴ細胞エンゲージャーは腫瘍細胞株に対する細胞毒性を誘導する
Ｔ細胞誘導抗体の生成
Ｔ細胞誘導抗体（ＴＣＥ）は、ｐ７０については二価、ＣＤ３ε結合については一価のＴＣＥフォーマット（ｍＴＣＥ）で生成された（図１３ａ；Ｓ．Ａｔｗｅｌｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）およびＡ．Ｍ．Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８））。１つの重鎖Ｃ末端にのみ単一抗ＣＤ３フラグメントを備えることができる抗体を得るため、一方における「ノブ」突然変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（配列ＩＤ）および他方の重鎖Ｆｃ領域における「ホール」突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（配列ＩＤ）をコードするＡＴ１６３６およびＡＴ１６３６－ＩＹＮの配列を使用した。加えて、「ノブ」突然変異を含む重鎖配列において、Ｃ末端リジン残基は、Ｃ末端ＳＴタグ（アミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ）で置き換えられた。抗体は、ａ）軽鎖、ｂ）「ノブ」突然変異ＳＴタグ含有重鎖およびｃ）「ホール」突然変異重鎖をコードする３つの異なるベクターを用いるＣＨＯ細胞の一時的トランスフェクションで発現された。ｍＴＣＥを生成し、Ｌ．Ｂａｒｔｅｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１９）およびＬ．Ｂａｒｔｅｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１９）に記載された方法にしたがって精製した。培養の７日後、組換え抗体を回収し、ＡＫＴＡ精製システム（ゼネラルエレクトリックライフサイエンス）を使用するプロテインＡクロマトグラフィを使用して細胞上清から精製した。０．１Ｍクエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．５の緩衝液を使用して抗体を溶出し、続いて１Ｍトリス－ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和し、その後サイズ排除クロマトグラフィによりＴＢＳ－ＴＳ中で再緩衝化した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＯＤ２８０、サーモフィッシャー）を使用して濃度を確立した。サイズ排除クロマトグラフィを使用して、精製された抗体の単量体含量は、＞９０％と確認された。精製されたタンパク質の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確立した。

【0411】

次に、ＳＴタグ修飾重鎖Ｃ末端は、ソルターゼ触媒ペプチド転移を使用してメチルテトラジンクリックハンドルを備え、完全長抗体に類似であるが相補的クリックハンドルトランスシクロオクテンを有するソルターゼ触媒ペプチド転移により修飾されている抗体ＵＣＨＴ１に基づく抗ＣＤ３単鎖可変フラグメントに共役させた。

【0412】

抗体ＡＴ１００２に基づく対照ｍＴＣＥ（グループ２インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質に特異的）を、同様に調製した。

【0413】

ｍＴＣＥ製剤内に潜在的に残っているエンドトキシンを、Ｐｉｅｒｃｅ高容量エンドトキシン除去スピンカラム（サーモフィッシャー）を使用して除去し、最終のエンドトキシンレベルをＥｎｄｏＺｙｍｅアッセイキット（Ｈｙｇｌｏｓ）で確認した。

【0414】

別の実験において、我々は、Ｅ－カドヘリンおよびＣＤ３εの両方に対して一価であるＴ細胞エンゲージャーを生成した。ＡＴ１６３６変異型は、ＡＴ１６３６、ＡＴ１６３６－ＩＹＮまたはＡＴ１００２の１つの重鎖および軽鎖ならびにＦｃテールに融合した単鎖抗ＣＤ３εフラグメントからなるノブ－イン－ホール（ＫｉＨ）二重特異性フォーマットに再フォーマットされた（図１３ｃ）。抗体は、ａ）ＡＴ１６３６、ＡＴ１６３６－ＩＹＮまたはＡＴ１００２の軽鎖、ｂ）ＡＴ１６３６、ＡＴ１６３６－ＩＹＮまたはＡＴ１００２の突然変異Ｓ３５４Ｃ、およびＴ３６６Ｗを保持する「ノブ」突然変異重鎖ならびにｃ）ＶＨ－ＣＨ１領域がＵＣＨＴ１単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）により置き換えられている、「ホール」突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを保持する重鎖をコードする３つの異なるベクターを用いるＣＨＯ細胞の一時的トランスフェクションで発現された。他の抗体のように（上述した）、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＧＥヘルスケア）を使用して、ＫｉＨ二重特異性抗体を精製した。

【0415】

腫瘍細胞の細胞毒性を誘導したＡＴ１６３６および－ＩＹＮのＣＤ３Ｔ細胞エンゲージャー
ルシフェラーゼベースの細胞毒性アッセイにおいて、ＡＴ１６３６およびＡＴ１６３６－ＩＹＮのｍＴＣＥ変異型を評価した。最初にＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９（すべてＣＲＣ細胞株）に、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクター、続いてｐＨＩＶまたはｐＨＣＭＶプロモータ（Ａｄｄｇｅｎｅ）により制御されたＺｓＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質で形質導入した。ＦＡＣＳ ＡＲＩＡシステム（ＢＤ）を使用して緑色蛍光細胞を分類した。トランスフェクトおよび単離された細胞を平底組織培養プレートで一晩、種々の濃度のｍＴＣＥおよびエフェクタ細胞としての末梢血単核細胞とともに、約１０：１のエフェクタの標的細胞に対する比率で、プレインキュベートした。４０～４４時間のアッセイインキュベーション後、ＯＮＥ－Ｇｌｏ、ルシフェリン含有溶解溶液（プロメガ）を使用して細胞を溶解した。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（パーキンエルマー）を使用して発光を獲得した。

【0416】

Ｔ細胞エンゲージメントアッセイにおいて、ＡＴ１６３６－ＩＹＮ ｍＴＣＥは、ＤＬＤ１、ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６標的細胞に対して、それぞれ１３９ｐＭ、４７６ｐＭ、および９２６ｐＭのＥＣ_５０値で細胞毒性を誘導した（図１３ｂ）。最大標的細胞溶解は、６９％から９１％の範囲であった。ＡＴ１６３６ ｍＴＣＥは、より高濃度で標的細胞溶解を誘導し、陰性対照ＡＴ１００２ ｍＴＣＥとのインキュベーション後には、溶解は観察されなかった。

【0417】

ＡＴ１６３６－ＩＹＮ ＫｉＨは、ＤＬＤ１、ＨＴ２９およびＡ３７５標的細胞に対して、それぞれ１６０ｐＭ、２５００ｐＭ、および４７０ｐＭのＥＣ_５０値で細胞毒性を誘導した（図１３ｄ）。最大標的細胞溶解は、３４％から９６％の範囲であった。ＡＴ１６３６およびＡＴ１００２ＫｉＨのみが、より高濃度で標的細胞溶解を誘導した。

【0418】

実施例８．脱接着分子としてのｐ７０Ｅ－カドヘリン機能の過剰発現
Ｅ－カドヘリン完全長オープンリーディングフレームおよびｐ７０Ｅ－カドヘリンコード配列を、Ｇｅｎｅａｒｔから得、ＩＲＥＳ－ＧＦＰを含むｐＨＥＦレンチウイルスベクターにサブクローニングした。ＶＳＶ－Ｇエンベロープを用いてレンチウイルス粒子を産生し、標的細胞にウイルスで形質導入した。形質導入細胞をＧＦＰ発現について選択し、等量で播種した。４８時間後、ｐ７０Ｅ－カドヘリンタンパク質を過剰発現する細胞は、図１４に示されるように、変型した丸い細胞の形態を示し、細胞－細胞相互作用の強度が小さく、単一細胞がより多いことおよび上皮間葉転換（ＥＭＴ）を示唆した（Ｖ．Ｐａｄｍａｎａｂａｎ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１９）およびＮ．Ｍ．Ａｉｅｌｌｏ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ（２０１８））。

【0419】

実施例９．上皮細胞株でのＡＴ１６３６の結合は、ＴＧＦβの存在下で増加する
ＴＧＦβは、その上皮間葉転換を促進するための周知の因子である。ＴＧＦβ（Ｐｒｏｓｐｅｃ、レホボト、イスラエル）（Ｖ．Ｐａｄｍａｎａｂａｎ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１９）、Ｄ．Ｖ．Ｆ．Ｔａｕｒｉｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１８）およびＮ．Ｍ．Ａｉｅｌｌｏ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ（２０１８））を１０ｎｇ／ｍｌから４０ｎｇ／ｍｌで、ヒトＣＲＣ細胞株ＤＬＤ１、マウス結腸ＣＭＴ９３、ヒト皮膚Ａ４３１およびヒト乳房ＭＣＦ７、細胞株に、６日間から７日間添加した。ＴＧＦβを１日おきに添加し、４日目に培養培地を新しくした。２４ウェルプレート中、組織培養処理済みプラスチックまたはフィブロネクチンがコートされたウェルのいずれかに、低細胞密度で細胞を培養した。加えて、該当する場合、ＡＴ１６３６またはＡＴ１６３６－ＩＹＮを、ＴＧＦβの存在下または非存在下で（１０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの濃度で）添加した。細胞形態および細胞密度をＯｐｅｒｅｔｔａ（パーキンエルマー）により監視し、ＡＴ１６３６またはＡＴ１６３６－ＩＹＮの細胞株への結合を、フローサイトメトリにより監視した（ウェルあたりのＭＦＩ）。

【0420】

図１５において、ＴＧＦβの存在下または非存在下で培養した細胞株間のＡＴ１６３６－ＩＹＮの結合比を示す。ＴＧＦβの存在下での延長培養では、ＡＴ１６３６－ＩＹＮのＡ４３１およびＣＭＴ９３への結合を３～４倍増加させるが、ＭＣＦ７については、フローサイトメトリにより決定されるように、より小さい誘導が認められた。ＴＧＦβの存在下でのＡＴ１６３６のＨＴ２９細胞への結合における小さい変化が観察された。

【0421】

上述したようなＴＧＦβおよびＡＴ１６３６－ＩＹＮ抗体での５～７日間の同時培養中、細胞増殖およびウェル表面に付着した細胞数の減少がＡ４３１細胞について観察された（図１６ａ（１０×倍）および図１６ｂ（２０×倍）を参照されたい）。この効果は、細胞がプラスチック上またはフィブロネクチンコートウェル上のいずれかで直接培養された設定で観察された。

【0422】

実施例１０．ＡＴ１６３６および高親和性変異型の内在化
８，０００個のＤＬＤ１細胞を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μｌで播種し、Ｏ／Ｎで培養した。ＡＴ１６３６、ＡＴ１６３６高親和性変異型、ＡＴ１００２およびＳＣ１０．１７抗体を、メーカーの説明書にしたがって、ヤギ抗ヒトＦｃ Ｆａｂ標識Ｚｅｎｏｎ ｐＨｒｏｄｏ ｉＦＬ色素（インビトロジェン）と１５分間のインキュベーション中に共役させた。次に、抗体をＤＬＤ１細胞に添加し、ｐＨｒｏｄｏ共役抗体の内在化を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏ）中、最大６０時間、１時間毎の検出により経時的に監視した。

【0423】

図１７において、酸性環境誘導ｐＨｒｏｄｏ色素蛍光が示されており、ＡＴ１６３６およびＡＴ１６３６高親和性変異型が、ＤＬＤ１細胞内に内在化することを示唆する。ＡＴ１６３６－ＩＹＮ抗体は、ＡＴ１６３６－ＹＮ、ＡＴ１６３６またはＳＣ１０．１７抗体と比較して、内在化するのに最も効果的である。対照的に、陰性対照としてのＡＴ１００２は内在化しない。

【0424】

実施例１１．ＣＤ８＋Ｔ細胞上での完全長およびｐ７０Ｅ－カドヘリンのＣＤ１０３との相互作用
フィコール勾配遠心分離を使用してリチウム－ヘパリンチューブに回収された血液から新鮮なＰＢＭＣを得、メーカーの説明書にしたがってＭａｇｎｉＳｏｒｔ（商標）ヒトＣＤ８Ｔ細胞濃縮キット（サーモフィッシャー）を使用してＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。続いて、ＣＤ８＋細胞を、ＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中、１０μｇ／ｍｌ ＰＨＡ、６０００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβの存在下、１ｍｌあたり１×１０^６個のＰＢＭＣの細胞密度で培養した。約１０日後、ＣＤ８細胞上でのＣＤ１０３発現を、フローサイトメトリにより決定した（Ｂｅｒ ＡＣＴ ８クローン、ＢＤ、ＦＩＴＣ標識）。

【0425】

ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ１０３の、Ｅ－カドヘリンタンパク質が結合したプレートとの相互反応を分析するため、完全長およびｐ７０Ｅ－カドヘリンを、１ｍＭ Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＤＰＢＳ中、Ｏ／Ｎでコートし、ＣＤ１０３発現ＣＤ８＋Ｔ細胞を、５μＭ Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ－ＣＦＳＥ（サーモフィッシャー）を用いてＲＴで５分間標識した。次に、１ｍＭ Ｍｎ２＋を有する培養培地中に１×１０^５／ｍｌの濃度で細胞を再懸濁し、３０分間、１０μｇ／ｍｌのＡＴ１００２陰性対照抗体、抗ＣＤ１０３抗体およびＡＴ１６３６およびその－ＩＹＮ変異型と３０分間プレインキュベートした。５０，０００個の細胞（１００μｌ）を３７℃で３０分間、Ｅ－カドヘリンタンパク質を含む各ウェルに添加した後、プレートを元に戻すことによりウェルを空にし、ＤＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で分析する前に、ＤＰＢＳ中の３．７％ホルマリンで固定した。

【0426】

図１８に、ＣＦＳＥ標識ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞によるウェルカバレッジを示す。細胞をＣＤ１０３特異性抗体ＭＣＡ７０８とプレインキュベートした場合、細胞は完全長Ｅ－カドヘリンに接着しなかった。細胞をＡＴ１６３６および－ＩＹＮ変異型とプレインキュベートした場合、細胞は依然として付着している可能性があり、ＡＴ１６３６が細胞上でＣＤ１０３タンパク質と相互作用しないことが示唆された。加えて、我々は、ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がｐ７０Ｅ－カドヘリンタンパク質に付着しなかったことを観察した。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【配列表】

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【国際調査報告】