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特表2023-510100サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（ＬＶ－ＲＳＮ－１）の改変型の異種産生を行う遺伝的組換え微生物、このサーファクタントタンパク質の改変型、このサーファクタントタンパク質をコードする合成遺伝子、これらの合成遺伝子を含有する発現カセット、及びこれらの合成遺伝子を含有する発現ベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-13
(54)【発明の名称】サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（ＬＶ－ＲＳＮ－１）の改変型の異種産生を行う遺伝的組換え微生物、このサーファクタントタンパク質の改変型、このサーファクタントタンパク質をコードする合成遺伝子、これらの合成遺伝子を含有する発現カセット、及びこれらの合成遺伝子を含有する発現ベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230306BHJP
C07K 14/46 20060101ALI20230306BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230306BHJP
C12N 15/78 20060101ALI20230306BHJP
C12N 15/81 20060101ALI20230306BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230306BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230306BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230306BHJP
C09K 23/30 20220101ALI20230306BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20230306BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C07K14/46
C12N15/63 Z
C12N15/78 Z
C12N15/81 Z
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
C09K23/30
C12P21/02 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022536900
(86)(22)【出願日】2020-12-14
(85)【翻訳文提出日】2022-08-12
(86)【国際出願番号】 BR2020050541
(87)【国際公開番号】W WO2021119782
(87)【国際公開日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】BR1020190268670
(32)【優先日】2019-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】BR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591005349
【氏名又は名称】ペトロレオ ブラジレイロ ソシエダ アノニマ － ペトロブラス
(74)【代理人】
【識別番号】100145713
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 竜太
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100120684
【弁理士】
【氏名又は名称】宮城 三次
(72)【発明者】
【氏名】マシエル メロ ヴァニア マリア
(72)【発明者】
【氏名】デ アブレウ ワルドウ ヴィニシウス
(72)【発明者】
【氏名】ノゲイラ モイセス ダヌザ
(72)【発明者】
【氏名】カヴァルカンテ ヒッサ デニス
(72)【発明者】
【氏名】デ ソウサ マイラ パウラ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA16
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD50
4B065CA56
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA50
4H045EA35
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ノースイースタンペッパーフロッグ（ラプトダクチルス・バスツス）からの巣泡のタンパク質抽出物の分析から配列が推定されたサーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）の予測アイソフォームの改変型の、微生物における異種産生に関する。より具体的には、本発明は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１の予測アイソフォームの改変型からなる２種のサーファクタントタンパク質、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１の予測アイソフォームのこれらの改変型の１つをそれぞれコードする２種の合成遺伝子、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１の予測アイソフォームの改変型の１つをコードする合成遺伝子の１つをそれぞれ含む２種の発現カセット、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１の予測アイソフォームの改変型をコードする合成遺伝子の１つをそれぞれ含む２種の発現ベクター、並びにこれらの合成遺伝子の１つでそれぞれ形質転換されて、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１の予測アイソフォームの改変型の１つを異種的に産生する２種の遺伝子導入微生物、細菌及び酵母に関する。Ｌｖ－Ｒｓｎ－１は、とりわけ界面活性、乳化特性及び分散特性を有し、その異種産生により、カエルの巣泡からＬｖ－Ｒｓｎ－１を抽出する必要なしに、様々な用途及び工業製品におけるその使用が可能になる。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）のアイソフォームの予測配列をコードし、配列番号２からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項2】
サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）のアイソフォームの予測配列をコードし、細菌における発現のために最適化されたコドン頻度を有し、配列番号３からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項3】
サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）のアイソフォームの予測配列をコードし、酵母における発現のために最適化されたコドン頻度を有し、配列番号７からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項4】
サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）のアイソフォームの改変型であり、配列番号６からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項5】
サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）のアイソフォームの改変型であり、配列番号１０からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項6】
細菌における発現を導くプロモータに作動可能に連結された請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項7】
真菌における、好ましくは酵母における発現を導くプロモータに作動可能に連結された請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項8】
請求項６に記載の発現カセットを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項9】
請求項７に記載の発現カセットを含むことを特徴とする発現及び形質転換ベクター。
【請求項10】
タンパク質を産生する細菌であって、前記タンパク質のコード配列が請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む細菌であることを特徴とする遺伝子改変微生物。
【請求項11】
タンパク質を産生する酵母であって、前記タンパク質のコード配列が請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む細菌であることを特徴とする遺伝子改変微生物。
【請求項12】
遺伝子改変生物の製造方法であって、請求項１０に記載の細菌を与え、ａ）細菌株を請求項６に記載の発現カセットで形質転換する工程と、
ｂ）形質転換された細菌を選択する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項13】
遺伝子改変生物の製造方法であって、請求項１１に記載の酵母を与え、ａ）酵母株を請求項７に記載の発現カセットで形質転換する工程と、
ｂ）形質転換された酵母を選択する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項14】
請求項４に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする産物。
【請求項15】
請求項５に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする産物。
【請求項16】
請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物から得られる生物系サーファクタントタンパク質を用いる高度な油回収方法及び貯留槽流体力学の改善であって、前記遺伝子改変生物は、生物系サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１を合成することができることを特徴とする高度な油回収方法及び貯留槽流体力学の改善。
【請求項17】
請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物から得られる生物系サーファクタントタンパク質を用いる、油のバイオレメディエーション方法であって、前記遺伝子改変生物は、生物系サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１を合成することができることを特徴とする方法。
【請求項18】
請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物から得られる生物系サーファクタントタンパク質を用いる、石油ガス産業におけるタンク洗浄方法であって、前記遺伝子改変生物は、生物系サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１を合成することができることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本特許出願は、サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－ｒａｎａｓｐｕｍｉｎａ－１又はＬｖ－ｒａｎａｓｐｕｍｉｎ－１、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）の予測アイソフォームの改変型の、微生物における異種産生に関する。このサーファクタントタンパク質は、ノースイースタンペッパーフロッグ（ｒａ－ｐｉｍｅｎｔａ－ｄｏ－Ｎｏｒｄｅｓｔｅ、Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ Ｐｅｐｐｅｒ Ｆｒｏｇ）（ラプトダクチルス・バスツス（Ｌｅｐｔｏｄａｃｔｙｌｕｓ ｖａｓｔｕｓ））の泡巣において単離及び発見されたものであり、このサーファクタントタンパク質は、抽出によって得ることができず、様々な用途におけるその使用を妨げている。より具体的には、本特許出願は、それぞれがＬｖ－Ｒｓｎ－１アイソフォームの予測アミノ酸配列の改変型をコードする２種の合成遺伝子の発明、これらの合成遺伝子の１つをそれぞれ含む２種の発現カセットの発明、発現カセットに挿入されたこれらの合成遺伝子の１つをそれぞれ含む２種の発現ベクターの発明、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１の改変型の１つを異種的に産生する２つの遺伝子改変（組換え）微生物（細菌及び酵母）の発明、並びにＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の改変型からなる２種のタンパク質の発明に関する。Ｌｖ－Ｒｓｎ－１は、とりわけ、界面活性、乳化及び分散特性を有し、その異種産生により、様々な用途及び製品におけるその使用が可能になる。
【背景技術】
【0002】
界面活性剤は、両親媒性分子のクラスを構成する。つまり、それらの分子構造は、極性部分（親水性及び疎油性）及び非極性部分（疎水性及び親油性）を同時に提示し、このため、これらの分子は、系の表面及び界面上に蓄積し、それらの表面及び界面の自由エネルギーを低下させる特性を有する。この文脈では、「表面」は、通常、液体／固体又は液体／気体の間の境界を指し、「界面」は、通常、２つの非混和性液体の間の境界を指す。
【0003】
界面活性剤は、とりわけ、農業、食品、織物、医薬品、化粧品、家庭用衛生、石油及びガスの産業においていくつかの用途を有する。これらの用途は、これらの表面活性分子の異なる活性を探求する。主なものは、乳化、脱乳化、可溶化及び洗浄力（液体－液体相互作用に関連する活性）、濡れ性及び分散性の変化（固液相互作用に関連する活性）、並びに発泡性（液体－気体相互作用に関連する活性）である。
【0004】
石油ガス産業において、界面活性剤は、例えば、（１）炭化水素を動員し、炭化水素を生分解性生物に生物学的に利用可能にするために使用される場合の汚染領域のバイオレメディエーション（生物学的環境修復）、（２）油膜を分散させるために使用される場合の流出油の浄化、（３）貯蔵タンクの内部からの油性残留物の除去、（４）殺生物剤及び防汚剤として使用される場合の有害微生物の防除；（５）濾過膜の中に含浸した鉱物堆積物及びバイオフィルムを除去するために使用される場合の濾過膜の浄化、並びに（６）リザーバ内の残留油を動員し、回収率を増加させるために使用される場合の先進的な油回収、等の目的のために使用することができる。
【0005】
いわゆる化学系界面活性剤は、生命体の代謝によって合成されるものである生物系界面活性剤とは対照的に、化石前駆体（石油化学物質）又は植物（油脂化学物質）から人工的に合成されるものである。化学系界面活性剤は、現在、界面活性剤市場を支配しているが、近年、生物系界面活性剤の使用は、以下の特性により、ますます魅力的な代替物と考えられてきた：（１）より高い界面活性；（２）最大の界面活性度に達するのに必要とされる最低濃度が低いこと（すなわち、低い臨界ミセル濃度、すなわちＣＭＣを有する）；（３）低い生態毒性；（４）より大きい生分解性；（５）より広いｐＨ、塩分、及び温度の範囲にわたる増加した界面活性安定性；（６）より穏やかな製造条件；並びに（７）再生可能な原材料から製造することができること。
【0006】
世界的な界面活性剤市場は、２０１６年に３０６億米ドルと推定されたが、２０２１年までに３９８億米ドルまで増加すると予測され、２０１６年と２０２１年との間の年平均成長率（ＣＡＧＲ）は５．４％である。この分野内で、生物系界面活性剤は、２０１７年に４２億米ドルを占め、予測は、２０２２年までに５５億米ドルまで増加し、２０１７年と２０２２年との間のＣＡＧＲは５．６％になるというものである。
【0007】
化学系界面活性剤に関して報告されたすべての興味深い特性及び多数の利点にもかかわらず、生物系界面活性剤の工業生産は、依然として高い製造コストという課題を抱えており、これは、現在、界面活性剤についての様々な応用分野における生物系界面活性剤のより広範な使用に対する最大の障害である。この高い製造コストは主に以下の理由による：（１）原料の高いコスト、（２）製造プロセスの低い収率、及び（３）生物系界面活性剤の精製に関連するコスト。
【0008】
生物系界面活性剤の工業生産は、２つの異なるアプローチによって行うことができる。第１のアプローチは、生物系界面活性剤が発見された種を生産プラットフォームとして使用することである。これは、２種類の生物系界面活性剤によって支配されている生物系界面活性剤産業における現在の最も多く採用されているアプローチであり、この２種類の生物系界面活性剤は、両方とも糖脂質のクラスのものである：（１）シュードモナス・エルジノーサ（緑膿菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）種の細菌によって産生されるラムノリピド（ラムノ脂質、ＲＬ）及び（２）スターメレラ（カンジダ）・ボンビコーラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ（Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）種の酵母によって産生されるソホロリピド（ソホロ脂質、ＳＬ）。少量では、糖脂質クラスの生物系界面活性剤の２つの他のタイプも商業的に生産されている：（１）シュードザイマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属の酵母によって産生されるマンノシルエリスリトール脂質（ＭＥＬ）、及び（２）ウスティラゴ・メイディス（トウモロコシ黒穂病菌、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）及びシュードザイマ・フロキュローサ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）種の酵母によって産生されるセロビオース脂質（ＣＬ）。最後に、両方ともバチルス・スブチリス（枯草菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種の細菌によって産生されるリポペプチド（とりわけフェンジシン（ｆｅｎｇｉｃｉｎａ）、イツリン（ｉｔｕｒｉｎａ）、リケニシン（ｌｉｑｕｅｎｉｓｉｎａ）、マイコスブチリン（ｍｉｃｏｓｕｂｔｉｌｉｎａ）及びサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎａ））の混合物又は単離されたサーファクチンの商業的生産も存在する。
【0009】
しかしながら、生物系界面活性剤が発見されたのと同じ種の生物を使用することは常に可能であるとは限らず、この場合、採用されてもよい第２のアプローチは、目的の生物系界面活性剤を異種的に産生するようないくつかの微生物の遺伝子形質転換（遺伝子組換え）である。バイオ製品一般の異種産生のためのプラットフォームとして工業的に最も使用される微生物株は、大規模な工業的培養及び遺伝子形質転換技術がすでによく習得されているものであり、主なものは以下の通りである：バチルス・スブチリス、コリネバクテリウム（ミクロコッカス）・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ） ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及び大腸菌（エシェリキア・コリ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種の細菌、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ））、サッカロマイセス・セレビシエ（出芽酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）種の酵母、並びにアスペルギルス・オリゼ（ニホンコウジカビ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（クロコウジカビ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｅ）及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）種の糸状菌。
【0010】
しかしながら、これらの種における生物系界面活性剤の異種産生は、困難を呈する。現在工業規模で生産されている最も科学的に知られた生物系界面活性剤は、脂肪酸から構成される非極性部分と、それぞれ炭水化物及びペプチドから構成される極性部分とを有する糖脂質及びリポペプチドのクラスに属する。これらの生物系界面活性剤の生合成は、いくつかの遺伝子が関与する複雑な代謝経路に依存し、この生合成の複雑さのアイデアを有するために、関与する遺伝子を４つの主要な組にグループ分けすることができる：（１）ペプチド又は炭水化物からなる親水性部分の生合成に関与する遺伝子；（２）脂肪酸からなる疎水性部分の生合成に関与する遺伝子；（３）親水性部分を疎水性部分に共有結合させることに関与する遺伝子；及び（４）他の３つのグループに属する遺伝子の発現調節に関与する遺伝子。
【0011】
それを考慮すると、生物工学的な生産プロセスにおいて伝統的に使用される種における糖脂質及びリポペプチドタイプの生物系界面活性剤の異種産生に関連する遺伝子工学及び代謝工学の課題がさらに大きくなる可能性がある。これは、これらの種における異種産生が、多数の遺伝子の挿入、並びに挿入された遺伝子の発現の正確な調節及びこれらの代謝経路への前駆体の適切な供給を必要とするからである。これらの困難は、上述の種の使用を困難にするので、生物系界面活性剤の工業生産は、現在、これらの生物系界面活性剤を天然に産生する種に限定される。
【0012】
生物系界面活性剤を天然に合成する微生物によって産生されなければならないという制限に加えて、これらの生物系界面活性剤は、それらが異なるアイソフォーム（又は同族体）の混合物として産生され、これらのアイソフォームが、その疎水性部分及び親水性部分の両方の組成における変動に起因して、それらの特性における差異を示すというさらなる困難も抱える。例えば、ラムノリピドは、その極性部分に１つ又は２つのＬ－ラムノース型糖、及びその非極性部分に８～１６の偶数個の炭素を含有する１つ又は２つのβ－ヒドロキシル化脂肪酸を有する可能性がある。各アイソフォームの割合に関する生物系界面活性剤の混合物の組成は、同じ微生物株を用いて同じ培養条件下で産生されたバッチ間でさえ、かなり変動する。また、異なるアイソフォームの特性に変動があるため、生成される混合物中に存在する異なるアイソフォームの割合は、最終生成物の特性に影響を及ぼし、その標準化を困難にする。
【0013】
しかしながら、別のクラスの生物系界面活性剤、いわゆるサーファクタントタンパク質が存在し、そのメンバーは、いくつかの遺伝子を挿入する必要性を回避すること、及び単一のアイソフォームを産生することをより容易にすることの両方という二重の利点を有する。サーファクタントタンパク質は、単一の遺伝子によってコードされるアミノ酸のポリマーであり、この遺伝子は、遺伝子コードに従って、ＤＮＡ配列をｍＲＮＡに転写し、ｍＲＮＡをリボソーム上でタンパク質に翻訳する古典的経路によって発現される。このようにして、単一の遺伝子を宿主微生物に挿入し（これは、遺伝子形質転換の作業を容易にする）、従って、単一のアイソフォームの異種産生を行う（これは、最終産物の標準化を容易にする）ことができる。
【0014】
サーファクタントタンパク質の公知の天然供給源の中で、近年探索されているものはカエルの巣由来の泡であり、これは環境中でのその持続性に顕著である。この供給源から単離された最初のサーファクタントタンパク質は、トゥンガラガエル（ｒａ－ｔｕｎｇａｒａ）（フィサラエムス（＝エンジストモプス）・プスツロサス（Ｐｈｙｓａｌａｅｍｕｓ（＝Ｅｎｇｙｓｔｏｍｏｐｓ） ｐｕｓｔｕｌｏｓｕｓ））によって産生されたものであった。このカエル由来の巣の泡から単離された６つのタンパク質（これらはラナスプミンと名付けられ、１～６の番号が付与された）のうち、Ｅｐ－ラナスプミン－２（Ｅｐ－Ｒｓｎ－２）は、９７個のアミノ酸から構成され、１１．０ｋＤａの分子量を有する（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＰ４８８３１）、界面活性剤活性を示した唯一のタンパク質であった。Ｅｐ－Ｒｓｎ－２は、１０μｇ／ｍＬの濃度で水／空気表面張力を７２ｎＭ／ｍから５０ｎＭ／ｍに低下させることができた。
【0015】
第２の種類のサーファクタントタンパク質は、本発明の出願人らによって、ノースイースタンペッパーフロッグ（ラプトダクチルス・バスツス）の巣泡から単離された。このタンパク質は、クロマトグラフィー技術によって泡流体から単離され、得られた２つの画分のうちの１つにおいて、密で明確なバンドが約２０ｋＤａの分子量で検出され、これは０．１ｍｇ／ｍＬで乳化活性（５７％の乳化指数）を示した。このタンパク質はＬｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）と命名された。
【0016】
泡流体から単離されたＬｖ－Ｒｓｎ－１タンパク質は、そのアミノ酸配列が変性ゲル電気泳動による各バンドの分子量２３．５ｋＤａの情報と、このバンドの酵素消化により得られた３６個のペプチド断片の質量分析による配列決定と、Ｘ線結晶学により得られた電子密度マップとの交叉から推測され、その結果、２１７個のアミノ酸の予測配列が得られた。このＬｖ－Ｒｓｎ－１タンパク質の結晶についての２つの予測された三次元構造は、受入コード４Ｋ８２及び４Ｋ８３の下でＲＣＳＢ ＰＤＢ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／）に提出された。
【0017】
三次元構造がすでに公開されているＥｐ－Ｒｓｎ－２及びＬｖ－Ｒｓｎ－１の２つのアイソフォームを比較すると、両者は、わずか３８％のアミノ酸配列類似性しか示さず、それらの三次元構造は全く異なる。Ｌｖ－Ｒｓｎ－１は１３束のαヘリックスとクランプを構成する２つの逆平行βシートを有するのに対して、Ｅｐ－Ｒｓｎ－２は４つの逆平行βシートで構成され、αヘリックスがその面の１つを垂直に取り囲んでいる。それゆえ、両方ともカエルの巣泡に由来するのでラナスプミンと命名されているが、それらは２つの明確に異なるタンパク質である。
【0018】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、及びペプチド断片の配列決定によって、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１を含有するＬ．バスツス（Ｌ．ｖａｓｔｕｓ）巣泡の画分を分析したときに得られた結果は、異なるサイズ及び組成のアミノ酸配列を有する他のアイソフォームの発生を示唆する。しかしながら、Ｌ．バスツスのゲノムも、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１のいずれのアイソフォームをコードするいかなる遺伝子も、今日まで配列決定されておらず、そのため、これらの他のアイソフォームの配列はまだ不明である。
【0019】
Ｌｖ－Ｒｓｎ－１は、様々な用途に対して優れた可能性を有するサーファクタントタンパク質の１種であり、その工業生産を可能にすることは、その商業化及び様々な目的のための応用を達成するために克服される必要がある障害である。しかしながら、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１が、多細胞性で、感覚があり、環境立法により保護される動物生物由来の生物系界面活性剤であることを考慮すると、産生生物自体を使用するアプローチは、技術的経済的理由及び倫理的法律的問題の両方のために実行不可能である。同様の理由から、ノースイースタンペッパーフロッグの巣からの泡からの抽出によってＬｖ－Ｒｓｎ－１を得ることも実行不可能である。検証が可能な範囲では、あらゆる種のカエルの巣の泡からのサーファクタントタンパク質の異種産生に言及する特許はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0020】
本開示に鑑みて、本発明は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の改変型を異種様式で産生する能力を有する２種の遺伝子改変微生物（細菌及び酵母）からなる。この２種の遺伝子改変微生物に加えて、本発明は、以下の他の発明も企図する：（１）サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）の予測アイソフォームの改変型からなる２種のタンパク質、（２）配列が細菌及び酵母における発現のためにそれぞれ最適化されており、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの２つの改変型の１つをコードする２種の合成遺伝子、（３）Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型の１つをコードする合成遺伝子の１つをそれぞれ含む２つの細菌発現カセット及び酵母発現カセット、並びに（４）Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの２つの改変型の１つをコードする合成遺伝子の１つを含む、細菌及び酵母それぞれにおける発現のための２種の発現ベクター。
【課題を解決するための手段】
【0021】
本発明は、ノースイースタンペッパーフロッグ（ラプトダクチルス・バスツス）によって産生されるタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）の界面活性剤活性の特定に基づいており、このタンパク質はいくつかの工業的応用の可能性を有する。従って、本発明は、いずれも天然には存在しない、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質のアイソフォームの１つの予測配列の改変型からなる２種のタンパク質を企図する。
【0022】
本発明の別の要素は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質のアイソフォームの予測配列の改変型の１つをそれぞれコードする２種の合成遺伝子に関し、その配列は、遺伝子改変された細菌微生物及び真核微生物における発現をそれぞれ標的とするコドンの使用頻度について最適化されたものである。
【0023】
本発明の別の要素は、２種の発現カセットであって、各々が、それぞれ遺伝子改変された細菌及び酵母における複製及び発現のための発現ベクターへの挿入を目的とする、活性プロモータに作動可能に連結されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測配列の改変型をコードする合成遺伝子の１つを含有する２種の発現カセットに関する。
【0024】
本発明の別の要素は、２種の発現ベクターであって、各々が、それぞれ遺伝子改変された細菌及び酵母における複製及び発現を標的とする、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質のアイソフォームの予測配列の改変型をコードする合成遺伝子の１つを含む２種の発現ベクターに関する。
【0025】
本発明の別の要素は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質のアイソフォームの予測配列のバージョンをコードする合成遺伝子を有する発現カセットを含むそれぞれの発現ベクターでそれぞれ形質転換され、この遺伝子の発現及びこのサーファクタントタンパク質の異種産生を標的とする２種の遺伝子改変微生物、細菌及び酵母に関する。
【0026】
本発明の他の対象、詳細及び利点は、以下の図面、配列、説明及び実施例から明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】図１は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの１つの改変型をコードする遺伝子（配列番号３）を含む細菌ｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１（配列番号５）における発現のためのベクターマップを示す。マップ上には、以下のものが表されている：Ｔ７プロモータ配列（Ｔ７プロモータ）；ｌａｃＯオペレータ配列（ｌａｃオペレータ）；ＮｄｅＩエンドヌクレアーゼのための２つの制限酵素部位（ＮｄｅＩ）及びエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩのための１つの制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ）；ポリヒスチジンタグコード配列（６ｘＨｉｓ）；ＴＥＶプロテアーゼによる切断部位についてのコード配列（ＴＥＶ部位）；大腸菌における発現のために最適化されたコドン頻度を有するＬｖ－ラナスプミン－１タンパク質のコード配列（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）；ＸｈｏＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位；Ｔ７転写終結配列（Ｔ７ターミネータ）；アンピシリン耐性についてのマーカー遺伝子のためのプロモータ（ＡｍｐＲプロモータ）及びコード化（ＡｍｐＲ）配列；プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点配列（ｏｒｉ）；可動化の基礎（ｂａｓｉｓ ｏｆ ｍｏｂｉｌｉｔｙ）エレメント（ｂｏｍ）；プライマーのリプレッサー（ｒｏｐ）タンパク質のコード配列；並びにｌａｃＩ調節タンパク質遺伝子のプロモータ（ｌａｃＩプロモータ）及びコード（ｌａｃＩ）配列。
【図2】図２は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの１つの改変型の遺伝子（配列番号７）を含む酵母ｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１（配列番号９）における発現のためのベクターマップを示す。マップ上には、以下のものが表されている：ＡＯＸ１プロモータ配列（ＡＯＸ１プロモータ）；エンドヌクレアーゼＳａｃＩのための制限酵素部位（ＳａｃＩ）；α分泌因子のコード配列（α分泌因子シグナル）；ＰｓｔＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位（ＰｓｔＩ）；Ｋ．ファフィ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）における発現のために最適化されたコドン頻度を有するＬｖ－ラナスプミン－１タンパク質コード配列（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）；ＴＥＶプロテアーゼによる切断部位についてのコード配列（ＴＥＶ部位）；ＮｏｔＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位（ＮｏｔＩ）；ｃ－Ｍｙｃタグコード配列（Ｍｙｃ）；ポリヒスチジンタグコード配列（６ｘＨｉｓ）；転写終結配列ＡＯＸ１（ＡＯＸ１ターミネータ）；ＴＥＦ１プロモータ配列（ＴＥＦ１プロモータ）；ＥＭ７プロモータ配列（ＥＭ７プロモータ）；ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）耐性についてのマーカー遺伝子のためのコード配列（ＢｌｅｏＲ）；ＣＹＣ１転写終結配列（ＣＹＣ１ターミネータ）；及びｐＵＣプラスミド複製起点配列（ｏｒｉ）。
【図3】図３は、遺伝子改変細菌によって産生された封入体の再可溶化及びニッケルカラムによる精製後のＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの１つの改変型の存在を評価するために実施された、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル中のタンパク質の電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）の写真を示す。「洗浄後」試料は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００洗浄剤及び尿素を含有する緩衝液を含む不溶性画分を指す。試料「洗浄」は、保持されていないピークの洗浄を指し、「ＭＭ」は、分子量マーカーを指す。矢印は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質に対応するバンドを示す。
【図5】図５は、異なる濃度（単位：ｐｐｍ）で大腸菌細菌において発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの１つの改変型によって促進された水／空気表面張力（単位：ｍＮ／ｍ）に対する界面活性剤効果のグラフを示す。
【図6】図６は、細菌中で発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの１つの改変型１．０ｍｇ／Ｌによる海水中の油分散アッセイの写真を示す（１．０ｍｇ／Ｌのウシ血清アルブミンタンパク質 － ＢＳＡを参照として使用した）。
【図7】図７は、細菌中で発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの１つの改変型５０ｍｇ／Ｌによる、シクロヘキサンペンタン酸を含浸させたカルサイト（方解石）粉末の濡れ性反転アッセイの写真を示す。陰性対照として海水が使用され、陽性対照として２５ｍｇ／ＬのＡｒｑｕａｄ Ｃ－５０カチオン性界面活性剤が使用された。
【図8】図８は、０．５％（ｖ／ｖ）のメタノールの添加の２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間後の５リットルバイオリアクター中での遺伝子改変Ｋ．ファフィの培養のバット上清中及び泡中のＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの１つの改変型の存在を評価するためのトリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）の写真を示す。ＭＭ＝分子マーカー、Ｃ＋＝大腸菌によって産生されたＬｖ－Ｒｓｎ－１タンパク質のバージョン、赤色矢印は、Ｋ．ファフィによって産生されたＬｖ－Ｒｓｎ－１タンパク質アイソフォームの１つの改変型に対応するバンドを指す。
【図9】図９は、Ｋ．ファフィにおいて産生されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの１つの改変型の異なる濃度を用いた水／ケロシン乳化アッセイの写真を示す。陰性対照は、ｐＨ６．０のＢＭＭＨ培地からなる。
【0028】
生物学的配列表の簡単な説明
配列番号１は、ノースイースタンペッパーフロッグ（ラプトダクチルス・バスツス）の巣泡に存在するＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質アイソフォームの１つの予測アミノ酸配列である。
配列番号２は、配列番号１の逆翻訳から生じるヌクレオチド配列である。
配列番号３は、参照種として大腸菌を使用して、細菌における発現のために最適化されたコドン使用頻度を有した後の配列番号２から得られるヌクレオチド配列である。
配列番号４は、エンドヌクレアーゼのための制限酵素部位、ポリヒスチジンタグについてのコード配列、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位コード配列を付加した配列番号３を含むヌクレオチド配列である。
配列番号５は、配列番号３を含む発現カセットを含む、ｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１と命名された、細菌における発現のためのベクターのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、配列番号４によってコードされるＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型のアミノ酸配列である。
配列番号７は、参照種としてコマガタエラ・ファフィ（ピキア・パストリス）を使用して、酵母における発現のために最適化されたコドン使用頻度を有した後の配列番号２から得られるヌクレオチド配列である。
配列番号８は、分泌因子αコード配列、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位コード配列、Ｍｙｃタグコード配列及びポリヒスチジンタグのコード配列を付加した配列番号７を含むヌクレオチド配列である。
配列番号９は、配列番号７を含む発現カセットを含む、ｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１と命名された、酵母における発現のためのベクターのヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、配列番号８によってコードされるＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型のアミノ酸配列である。
配列番号１は、ノースイースタンペッパーフロッグ（ラプトダクチルス・バスツス）の巣泡に存在するＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質アイソフォームの１つの予測アミノ酸配列である。
配列番号２は、配列番号１の逆翻訳から生じるヌクレオチド配列である。
配列番号３は、参照種として大腸菌を使用して、細菌における発現のために最適化されたコドン使用頻度を有した後の配列番号２から得られるヌクレオチド配列である。
配列番号４は、エンドヌクレアーゼのための制限酵素部位、ポリヒスチジンタグについてのコード配列、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位コード配列を付加した配列番号３を含むヌクレオチド配列である。
配列番号５は、配列番号３を含む発現カセットを含む、ｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１と命名された、細菌における発現のためのベクターのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、配列番号４によってコードされるＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型のアミノ酸配列である。
配列番号７は、参照種としてコマガタエラ・ファフィ（ピキア・パストリス）を使用して、酵母における発現のために最適化されたコドン使用頻度を有した後の配列番号２から得られるヌクレオチド配列である。
配列番号８は、分泌因子αコード配列、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位コード配列、Ｍｙｃタグコード配列及びポリヒスチジンタグのコード配列を付加した配列番号７を含むヌクレオチド配列である。
配列番号９は、配列番号７を含む発現カセットを含む、ｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１と命名された、酵母における発現のためのベクターのヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、配列番号８によってコードされるＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明は、サーファクタントタンパク質Ｌｖ－ラナスプミン－１（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１）の予測アイソフォームの１つの改変型を異種的に産生する２種の遺伝子改変微生物であって、一方は細菌であり、他方は酵母であるものの構築に関する。加えて、本発明は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１の２つの改変型、これらのＬｖ－Ｒｓｎ－１の改変型をそれぞれコードする２種の合成遺伝子、これらのＬｖ－Ｒｓｎ－１の改変型をコードする合成遺伝子をそれぞれ含む２種の発現カセット、これらのＬｖ－Ｒｓｎ－１の改変型をコードするこれらの合成遺伝子の１つをそれぞれ含有する２種の発現ベクターに関する。
【0030】
本発明で用いるアミノ酸配列（配列番号１）は、ラプトダクチルス・バスツスの巣の泡沫のタンパク質抽出物をポリアクリルアミドのゲル電気泳動及びペプチド断片の配列決定による分析に基づいて予測されたＬｖ－Ｒｓｎ－１タンパク質のアイソフォームの配列に相当する。Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質のこのアイソフォームの２１６アミノ酸及び２３．３ｋＤａの分子量の予測配列は、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を得るために、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ（配列操作スイート）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｒｅｖ＿ｔｒａｎｓ．ｈｔｍｌ）のＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（逆翻訳）ツールを使用して逆翻訳に供された。
【0031】
次いで、このようにして得られたヌクレオチド配列は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（インテグレーテッド・ディーエヌエー・テクノロジーズ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）からのＣｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（コドン最適化ツール）を用いて、細菌における発現については参照種として大腸菌を使用して（配列番号３）、そして酵母における発現については参照種としてコマガタエラ・ファフィ（ピキア・パストリス）を使用して（配列番号７）コドン使用頻度に関して最適化された。
【0032】
細菌における発現のために最適化されたヌクレオチド配列（配列番号３）を使用して、エンドヌクレアーゼのための部位（発現ベクターへのヌクレオチドの挿入を容易にする）及びさらなるアミノ酸配列をコードする配列（発現タンパク質の精製を容易にする）からなる配列番号３の下流及び上流に付加されたヌクレオチドを有する遺伝子が設計された。
【0033】
この遺伝子が人工的に合成され、この合成遺伝子と細菌における発現のためのベクターの両方が２つのエンドヌクレアーゼで消化された（遺伝子が発現カセット中のプロモータに対して正しい向きで挿入されるようにする）後、ＤＮＡリガーゼで連結された。このようにして得られた発現ベクターは、細菌において活性なプロモータに作動可能に連結された合成遺伝子を有する発現カセットを含み、この発現カセットは、このベクターから除去されることが可能で、そしてエンドヌクレアーゼによる消化及びＤＮＡリガーゼによる結合によって、細菌における発現のための他のベクター中に挿入されることができる。
【0034】
細菌株が、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型をコードする合成遺伝子を含む発現ベクターで遺伝子形質転換された。遺伝子改変された細菌は、その複製及びＬｖ－Ｒｓｎ－１のこのバージョンの発現のために適切な培養培地中で培養された。
【0035】
酵母については、酵母における発現のために最適化されたヌクレオチド配列（配列番号７）を使用して、エンドヌクレアーゼのための部位（発現ベクターへのヌクレオチドの挿入を容易にする）及びさらなるアミノ酸配列をコードする配列（発現タンパク質の精製を容易にする）からなる配列番号３の下流及び上流に付加されたヌクレオチドを有する遺伝子が設計された。
【0036】
この遺伝子が人工的に合成され、この合成遺伝子と酵母における発現のためのベクターの両方が２つのエンドヌクレアーゼで消化された（遺伝子が発現カセット中のプロモータに対して正しい向きで挿入されるようにする）後、ＤＮＡリガーゼで連結された。このようにして得られた発現ベクターは、細菌において活性なプロモータに作動可能に連結された合成遺伝子を有する発現カセットを含み、この発現カセットは、このベクターから除去されることが可能で、そしてエンドヌクレアーゼによる消化及びＤＮＡリガーゼによる結合によって、酵母における発現のための他のベクター中に挿入されることができる。
【0037】
酵母株が、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型をコードする合成遺伝子を含む発現ベクターで遺伝子形質転換された。遺伝子改変酵母は、その複製及びＬｖ－Ｒｓｎ－１のこのバージョンの発現のために適切な培養培地中で培養された。
【実施例】
【0038】
本発明は、以下の実施例によってよりよく理解されてもよい。本発明は、言及された実施例に限定されず、記載されるすべての応用例において、又は任意の他の等価な変形形態において使用することができるということに留意されたい。
【0039】
実施例１：細菌におけるＬｖ－Ｒｓｎ－１の産生のためのベクターの取得
Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質のアイソフォームのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、細菌における発現のために最適化されたヌクレオチド配列（配列番号３）にヌクレオチドが付加されて、その結果、５’から３’への向きに読んだ場合、以下の組成を有する合成遺伝子（配列番号４）が得られた：（１）３’末端にチミンを付加したＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位配列（５’－ＧＡＡＴＴＣＴ－３’）；（２）ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧＳ）をコードする配列（５’－ＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴＡＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣ－３’）；（３）ＮｄｅＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位配列（５’－ＣＡＴＡＴＧ－３’）；（４）開始コドン（５’－ＡＴＧ－３’）；（５）細菌における発現のために最適化されたコドン頻度を有するＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームのためのアミノ酸配列をコードする配列（配列番号３）；（６）終止コドン（５’－ＴＡＡ－３’）；及び（７）ＸｈｏＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位配列（５’－ＣＴＣＧＡＧ－３’）。
Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質のアイソフォームのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、細菌における発現のために最適化されたヌクレオチド配列（配列番号３）にヌクレオチドが付加されて、その結果、５’から３’への向きに読んだ場合、以下の組成を有する合成遺伝子（配列番号４）が得られた：（１）３’末端にチミンを付加したＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位配列（５’－ＧＡＡＴＴＣＴ－３’）；（２）ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧＳ）をコードする配列（５’－ＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴＡＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣ－３’）；（３）ＮｄｅＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位配列（５’－ＣＡＴＡＴＧ－３’）；（４）開始コドン（５’－ＡＴＧ－３’）；（５）細菌における発現のために最適化されたコドン頻度を有するＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームのためのアミノ酸配列をコードする配列（配列番号３）；（６）終止コドン（５’－ＴＡＡ－３’）；及び（７）ＸｈｏＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位配列（５’－ＣＴＣＧＡＧ－３’）。
【0040】
この合成遺伝子（配列番号４）及び細菌発現における発現のためのベクターを共にＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩエンドヌクレアーゼで消化した後、ＤＮＡリガーゼで連結した。ｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１と命名された発現ベクターの最終配列（配列番号５）を図２に示す。
【0041】
発現ベクターｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１（配列番号５）中に存在する遺伝子によってコードされるＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型は、２３６個のアミノ酸及び２５．８ｋＤａの分子量を有し（配列番号６）、そのＮ末端部分に２０個のアミノ酸の配列を加えたことによって予測アイソフォームとは異なり、このアミノ酸の配列は、ポリヒスチジン尾部（ＨＨＨＨＨＨ）及びＴＥＶプロテアーゼによる切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧ）を含有する。Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質のアイソフォームのこの改変型がＴＥＶプロテアーゼによって消化される場合、それは、そのＮ末端部分における５つのアミノ酸（ＧＳＨＭＭ）の存在によって予測アイソフォームとは異なる。
【0042】
実施例２：遺伝子改変細菌の取得
大腸菌細菌株をｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１ベクター（配列番号５）でエレクトロポレーションにより遺伝子形質転換した。使用した菌株は大腸菌Ｋ－１２株由来の菌株であり、この由来の菌株は以下の通りであった：（１）ロイシンアミノ酸に対して栄養要求性であり、カナマイシン抗生物質に対して感受性である、（２）この菌株は、グルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）及びチオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）遺伝子に突然変異を有する、並びに（３）この菌株は、テトラサイクリン抗生物質耐性のための遺伝子を有する。
大腸菌細菌株をｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１ベクター（配列番号５）でエレクトロポレーションにより遺伝子形質転換した。使用した菌株は大腸菌Ｋ－１２株由来の菌株であり、この由来の菌株は以下の通りであった：（１）ロイシンアミノ酸に対して栄養要求性であり、カナマイシン抗生物質に対して感受性である、（２）この菌株は、グルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）及びチオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）遺伝子に突然変異を有する、並びに（３）この菌株は、テトラサイクリン抗生物質耐性のための遺伝子を有する。
【0043】
大腸菌細胞を１０％（ｍ／ｖ）グリセロール溶液で３回洗浄してエレクトロコンピテントにした後、１．０μＬのこの溶液にｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１ベクター（５０ηｇ／μＬ）を加えた。細胞混合物をベクターと共に氷上で１分間維持した後、この混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移し、２．５ｋＶのショックに供した。エレクトロポレーション後、９６０μＬのＳＯＣ培地（２０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ グルコース）を加え、混合物を１５０ｒｐｍ、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション時間後、培養物５０μＬをＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ 寒天）を含むペトリ皿に接種した。
【0044】
その後、得られたコロニーを、１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（この鎖の細胞のみを選択し、汚染細菌の増殖を防ぐため）及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（形質転換細胞のみを選択し、非形質転換細胞の増殖を防ぐため）を補充したＬＢ培地中で培養した。
【0045】
得られたコロニーの発現ベクターｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１による遺伝子形質転換を、これらのコロニーからＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル１％（ｍ／ｖ）で電気泳動することにより評価して、予想される６９２ｂｐ断片の存在を確認した。発現ベクターｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１による大腸菌の遺伝子形質転換は、いくつかのコロニー、並びに世代にわたるｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１の複製及び安定な遺伝について確認した。
【0046】
実施例３：遺伝子改変細菌によるＬｖ－Ｒｓｎ－１の産生
ｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１ベクターで形質転換した大腸菌細胞を、ｌａｃＩタンパク質と相互作用してそれをｌａｃＯオペレータから脱離させ、その結果、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質のアイソフォームの改変型をコードする遺伝子の発現を誘導するアロラクトースの構造類似体であるイソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を補充したＬＢ培地中で培養した。
ｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１ベクターで形質転換した大腸菌細胞を、ｌａｃＩタンパク質と相互作用してそれをｌａｃＯオペレータから脱離させ、その結果、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質のアイソフォームの改変型をコードする遺伝子の発現を誘導するアロラクトースの構造類似体であるイソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を補充したＬＢ培地中で培養した。
【0047】
単離したコロニーを、２種の抗生物質（１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）を補充した１０ｍＬのＬＢブロスに移し、次いで２５０ｒｐｍ及び３７℃で１６時間インキュベートすることによって、遺伝子形質転換細胞の接種前駆体（ｐｒｅ－ｉｎｏｃｕｌｏ、又はｐｒｅ－ｉｎｏｃｕｌｕｍ）を得た。次いで、１ｍＬの体積の培養物を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した１００ｍＬのＬＢ培地を含有するフラスコに移し、３７℃及び２５０ｒｐｍで、増殖の対数期（６００ｎｍにおける光学密度は０．５～０．７である）に達するまでインキュベートした。フラスコを室温で１５分間静置した。次いで、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの最終濃度まで添加し、培養物を２００ｒｐｍ及び３７℃で３時間インキュベートした。この期間の後、培養物を７，８００ｇ、４℃で１３分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿物を０．１Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、７，８００ｇ、４℃で１時間遠心分離した。
【0048】
発現がＩＰＴＧによって誘導されるＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型を精製するために、細胞を５ｍＬの再懸濁緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、氷浴中で５分間及び４０％の振幅の３サイクルにわたって超音波処理した。超音波処理後、細胞を、１５，０００ｇ、４℃で４５分間遠心分離して、可溶性（上清）画分と不溶性（沈殿物）画分を分離した。
【0049】
不溶性画分（封入体を含有する沈殿物）からのＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型の精製を、再可溶化及び再生プロトコルを使用して行った。これについて、不溶性画分を洗浄緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、２Ｍ 尿素及び２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に再懸濁し、２２，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。この調製物を１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００洗浄剤及び尿素を含有する緩衝液での２回の洗浄が、封入体からＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型のほとんどを抽出するのに充分であるかどうかを確認した。
【0050】
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び尿素での洗浄の上清からのＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型の精製を、超純水に対する透析、続いて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０及び１００ｍＭ ＮａＣｌで予め平衡化したシリカ樹脂を含有するニッケルカラムでの適用によって行った。Ｌｖ－Ｒｓｎ－１の溶出は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、及び２５０ｍＭ イミダゾールに相当する溶出緩衝液を用いて行った。
【0051】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型が実際に大腸菌において発現されることを示した。図３は、封入体の再可溶化及びニッケルカラム精製プロセス（Ｌｖ－Ｒｓｎ－１の改変型に存在するポリヒスチジン尾部との相互作用による）後のタンパク質抽出物の電気泳動の結果を示す。「洗浄後」は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００洗浄剤及び尿素を含有する緩衝液を用いた不溶性画分を指し、「洗浄」は、保持されないピークの洗浄を指し、「ＭＭ」は分子タグを指す。矢印は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１に対応するバンドを示す。
【0052】
ｐＰＢＵＦＣＢａｃ－ＬｖＲｓｎ１ベクター（配列番号５）で遺伝的に形質転換した細菌の培養により、このベクターが数世代の細胞にわたって安定的に遺伝し、これがベクターを複製し、ＩＰＴＧの存在下で、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型をコードする遺伝子を発現し始め、このタンパク質が封入体中に濃縮されたことが実証された。
【0053】
上記の開示から、当該発明が、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型の、細菌における異種産生を技術的に可能にし、現在の技術水準に対する解決手段を提示することが明らかである。それは、ノースイースタンペッパーフロッグ（ラプトダクチルス・バスツス）の巣から泡を収集及び抽出する必要なく、かつこの収集及び抽出から生じるすべてのコスト及び環境影響を伴わずに、動物起源のこのサーファクタントタンパク質の産生を可能にするからである。
【0054】
実施例４：細菌によって産生されたＬｖ－Ｒｓｎ－１の活性
遺伝的に形質転換した大腸菌細胞において発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型を精製し、その乳化、水／空気表面張力低下活性、油分散、及び濡れ性の反転を評価するために、様々なアッセイに供した。
遺伝的に形質転換した大腸菌細胞において発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型を精製し、その乳化、水／空気表面張力低下活性、油分散、及び濡れ性の反転を評価するために、様々なアッセイに供した。
【0055】
０．０１～１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度における大腸菌において発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型の水／ケロシン混合物に対する乳化効果を図４に示す。
【0056】
大腸菌において発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型による水／空気表面張力の低下。０．１５ｍｇ／ｍＬの濃度のＬｖ－Ｒｓｎ－１は、図５に示すように、水の表面張力を７２ｍＮ／ｍから３９ｍＮ／ｍに低下させる。
【0057】
１．０ｍｇ／Ｌの濃度における大腸菌中で発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型による、海水中に流出した油層の分散を図６に示す。同じ図６は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１の添加前の油層、及び参照として使用したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質の同じく１ｍｇ／Ｌの濃度での分散活性の不存在も示す。
【0058】
５０ｍｇ／Ｌの濃度における大腸菌中で発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型による、シクロヘキサンペンタン酸を含浸させたカルサイト粉末（ＣａＣＯ３）の濡れ性の反転を図７に示す。濡れ性の反転は、陰性対照（海水）と比較して、試験管の底部におけるより多量のカルサイト粉末の存在によって測定する。
【0059】
上記の開示から、大腸菌において発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型が、界面活性剤、乳化剤、分散剤及び濡れ性反転剤として作用し、これらの活性に関連する様々な目的に適用することができるということは明らかである。
【0060】
実施例５：酵母におけるＬｖ－Ｒｓｎ－１の産生のためのベクターの取得
酵母における発現のために最適化されたヌクレオチド配列（配列番号７）にヌクレオチドが付加されて、その結果、５’から３’への向きに読んだ場合、以下の組成を有する合成遺伝子（配列番号８）が得られた：（１）ＰｓｔＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位（５’－ＣＴＧＣＡＧ－３’）；（２）Ｌｖ－Ｒｓｎ－１コード配列をα分泌因子と同じ翻訳フレームに配置するための２つのヌクレオチド（５’－ＧＮ－３’）；（３）酵母発現のために最適化されたコドン頻度を有するＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質をコードする配列（配列番号７）；（４）ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧ）をコードする配列（５’－ＧＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＧＧＧＡ－３’）；及び（５）ＮｏｔＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位（５’－ＧＣＧＧＣＣＣＣ－３’）。
酵母における発現のために最適化されたヌクレオチド配列（配列番号７）にヌクレオチドが付加されて、その結果、５’から３’への向きに読んだ場合、以下の組成を有する合成遺伝子（配列番号８）が得られた：（１）ＰｓｔＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位（５’－ＣＴＧＣＡＧ－３’）；（２）Ｌｖ－Ｒｓｎ－１コード配列をα分泌因子と同じ翻訳フレームに配置するための２つのヌクレオチド（５’－ＧＮ－３’）；（３）酵母発現のために最適化されたコドン頻度を有するＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質をコードする配列（配列番号７）；（４）ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧ）をコードする配列（５’－ＧＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＧＧＧＡ－３’）；及び（５）ＮｏｔＩエンドヌクレアーゼのための制限酵素部位（５’－ＧＣＧＧＣＣＣＣ－３’）。
【0061】
この合成遺伝子（配列番号７９）及び細菌における発現のためのベクターを共にＰｓｔＩ及びＮｏｔＩエンドヌクレアーゼで消化した後、ＤＮＡリガーゼで連結した。ｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１と命名された発現ベクターの最終配列（配列番号９）を図３に示す。
【0062】
発現ベクターｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１（配列番号９）中に存在する遺伝子によってコードされるＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型は、３４１個のアミノ酸及び３６．７ｋＤａの分子量を有し（配列番号１０）、そのＮ末端部分における分泌因子αプラス２個のアミノ酸、並びにＣ末端部分におけるＴＥＶプロテアーゼによる切断部位、プラス６アミノ酸、ｃ－Ｍｙｃタグ、プラス５アミノ酸、及びポリヒスチジン尾部を加えたことによって予測アイソフォームとは異なる。Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームのこの改変型がＴＥＶプロテアーゼによって消化される場合、それは、そのＮ末端部分の９１個のアミノ酸及びそのＣ末端部分の６個のアミノ酸の存在によって予測アイソフォームとは異なる。
【0063】
実施例６：遺伝子改変酵母の取得
コマガタエラ・ファフィ種の酵母株を、エレクトロポレーションによってベクターｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１（配列番号９）で遺伝的に形質転換した。使用した株は、コマガタエラ・ファフィＧＳ１１５／ＡＴＣＣ ２０８６４株であり、この株は、ヒスチジンアミノ酸（ＨＩＳ４－）に対して栄養要求性であり、ＡＯＸ１及びＡＯＸ２に対する活性遺伝子（Ｍｕｔ＋）を有するので、栄養素としてメタノールを使用することができる。
コマガタエラ・ファフィ種の酵母株を、エレクトロポレーションによってベクターｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１（配列番号９）で遺伝的に形質転換した。使用した株は、コマガタエラ・ファフィＧＳ１１５／ＡＴＣＣ ２０８６４株であり、この株は、ヒスチジンアミノ酸（ＨＩＳ４－）に対して栄養要求性であり、ＡＯＸ１及びＡＯＸ２に対する活性遺伝子（Ｍｕｔ＋）を有するので、栄養素としてメタノールを使用することができる。
【0064】
単離したコロニーを５．０ｍＬのＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのペプトン、及び２０ｇ／Ｌのグルコース）に接種し、それらを２５０ｒｐｍ、３０℃で１６時間インキュベートすることによってＫ．ファフィ細胞を調製した。次いで、２５０μＬの培養物を２．０Ｌ容器中の５００ｍＬのＹＰＤブロスに移し、６００ｎｍで１．３～１．６の光学密度が得られるまで、２５０ｒｐｍ、３０℃で約１６時間インキュベートした。次いで、培養物を１，５００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を含む沈殿物を氷冷超純水５００ｍｌに穏やかに再懸濁した。次いで、細胞を再度遠心分離し、沈殿物を２５０ｍｌの氷冷超純水に再懸濁した。細胞を遠心分離し、ペレットを２０ｍｌの氷冷１．０Ｍ Ｄ－ソルビトールに再懸濁した。最後に、細胞を遠心分離し、１．０ｍｌの氷冷１．０Ｍ Ｄ－ソルビトールに再懸濁し、これによりエレクトロコンピテント細胞を得て、これを遺伝子形質転換に使用した。
【0065】
遺伝子形質転換のための調製では、ベクターｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１（配列番号９）をＳａｃＩエンドヌクレアーゼで線状化した後、この線状化したベクターを酢酸カリウム沈殿プロトコルを用いて精製した。この目的のために、３．０Ｍ酢酸カリウムｐＨ５．５を０．３Ｍの最終濃度まで添加し、続いて２体積量の１００％エタノールを添加し、－２０℃で３０分間インキュベートした。次いで、この混合物を１２，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、再度遠心分離した。プラスミドを３７℃で１０分間乾燥した後、それを超純水に再懸濁し、分光光度法によって定量し、－２０℃で冷凍庫に保存した。
【0066】
遺伝子形質転換のために、エレクトロコンピテントのＫ．ファフィ細胞を含有する９０μＬ容量の溶液を、６００μＬマイクロチューブ中で線状化した５～１０μｇのｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１ベクターＤＮＡ（配列番号９）と混合し、最終容量を、氷上で予め冷却した０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。細胞及び線状化ベクターを含むキュベットを氷上で５分間インキュベートし、次いでエレクトロポレーター中で２．５ｋＶのパルスに供した。直ちに１．０ｍＬの氷冷１．０Ｍ Ｄ－ソルビトールをキュベットに加え、次いで内容物を１５ｍＬチューブに移した。このチューブを撹拌せずに３０℃で２時間インキュベートした。次いで、１００μｇ／ｍＬのゼオシン抗生物質を補充したＹＤＰＳ寒天培地（１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、２０ｇ／Ｌ ペプトン、２０ｇ／Ｌ グルコース、１８２．２ｇ／ＬのＤ－ソルビトール及び１５ｇ／Ｌの寒天）を含有するプレート上に、２００μＬの体積の上記チューブ内容物を接種した。このプレートをオーブン中３０℃で３～１０日間、コロニーが出現するまでインキュベートした。形質転換したクローンをＹＰＤ培地中で培養し、２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを補充した後、－８０℃で保存した。形質転換したクローンを、ｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１ベクター（配列番号９）の複数のコピーを含有する形質転換体を選択するために、ＹＰＤ寒天培地中の漸増濃度のゼオシン（５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ及び２０００μｇ／ｍＬ）に順次供した。
【0067】
遺伝子形質転換の成功を確認するために、２，０００μｇ／ｍＬのゼオシンに耐性のある細胞のコロニーから、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）プロトコルを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出の最後に、得られたＤＮＡを、２０μｇ／μＬのリボヌクレアーゼを補充した５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０に溶出した。試料を定量し、分光光度計における２３０ｎｍ、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度測定によって評価し、その後、－２０℃で冷凍庫に保存した。形質転換クローンにおけるＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の改変型をコードする遺伝子の存在の検出を、プライマーＡＯＸ１－ｆｗｄ（５’－ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣ－３’）及びＡＯＸ１－ｒｅｖ（５’－ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣ－３’）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して行った。ＰＣＲ反応は、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、３．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー、及び１．０単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有する２５μＬの最終容量で行った。反応は、最初の変性工程（９４℃で５分）、続いて９４℃で１分、５２℃で１分及び７２℃で１．５分の３０サイクルのためにプログラムされたサーモサイクラー中で実施した。最後のサイクルの後、７２℃で１０分の最終伸長を行った。ＰＣＲ産物を１．０％（ｍ／ｖ）アガロースゲル電気泳動で可視化した。このゲルは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎで染色され、参照として１ｋｂマーカーを有していた。発現ベクターｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１（配列番号９）によるＫ．ファフィの遺伝子形質転換、並びに世代にわたるこの形質転換の安定した遺伝を確認した。
【0068】
実施例７：酵母によるＬｖ－Ｒｓｎ－１産生の確認
ｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１ベクター（配列番号９）で形質転換したＫ．ファフィ細胞を、１００μｇ／ｍＬの抗生物質ゼオシンを補充したＹＰＤ寒天培地（１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、２０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース、及び１５ｇ／Ｌの寒天）を含有するプレート上で３０℃で培養した。この接種前駆体のために、純粋なコロニーを、２００ｍＬのＢＭＧＨ培地（１３．４ｇ／Ｌの、硫酸アンモニウムを含みアミノ酸を含まない酵母エキス、１０ｍＬ／Ｌのグリセロール、１００ｍＬ／Ｌのリン酸緩衝液１．０Ｍ ｐＨ６．０、２．０ｍＬ／Ｌの０．０２％ビオチン、１０ｍＬ／Ｌの０．４％ヒスチジン、及び１００μｇ／Ｌのゼオシン）中で、約２．０の６００ｎｍにおける光学密度を達成するまで、２５０ｒｐｍ、２９℃で１６時間培養した。次いで、培養物を３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物をＢＭＭＨ培地（１３．４ｇ／Ｌの、硫酸アンモニウムを含みアミノ酸を含まない酵母エキス、１００ｍＬ／Ｌの１．０Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０、２．０ｍＬ／Ｌの０．０２％ビオチン、１０ｍＬ／Ｌの０．４％ヒスチジン、及び０．５％ｖ／ｖメタノール）で２回洗浄して、接種前駆体に用いたＢＭＧＨ培地中に存在するグリセロールを除去した。
ｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１ベクター（配列番号９）で形質転換したＫ．ファフィ細胞を、１００μｇ／ｍＬの抗生物質ゼオシンを補充したＹＰＤ寒天培地（１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、２０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース、及び１５ｇ／Ｌの寒天）を含有するプレート上で３０℃で培養した。この接種前駆体のために、純粋なコロニーを、２００ｍＬのＢＭＧＨ培地（１３．４ｇ／Ｌの、硫酸アンモニウムを含みアミノ酸を含まない酵母エキス、１０ｍＬ／Ｌのグリセロール、１００ｍＬ／Ｌのリン酸緩衝液１．０Ｍ ｐＨ６．０、２．０ｍＬ／Ｌの０．０２％ビオチン、１０ｍＬ／Ｌの０．４％ヒスチジン、及び１００μｇ／Ｌのゼオシン）中で、約２．０の６００ｎｍにおける光学密度を達成するまで、２５０ｒｐｍ、２９℃で１６時間培養した。次いで、培養物を３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物をＢＭＭＨ培地（１３．４ｇ／Ｌの、硫酸アンモニウムを含みアミノ酸を含まない酵母エキス、１００ｍＬ／Ｌの１．０Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０、２．０ｍＬ／Ｌの０．０２％ビオチン、１０ｍＬ／Ｌの０．４％ヒスチジン、及び０．５％ｖ／ｖメタノール）で２回洗浄して、接種前駆体に用いたＢＭＧＨ培地中に存在するグリセロールを除去した。
【0069】
この工程の後、細胞を再懸濁し、６００ｎｍにおける光学密度１．０まで、５０ｍＬのＢＭＭＨを含有する５００ｍＬフラスコに接種した。培養物を２５０ｒｐｍで撹拌しながら２９℃で９６時間インキュベートし、６００ｎｍにおける光学密度を２４時間毎にモニターし、その時、培養物に０．５％（ｖ／ｖ）メタノールを補充した。９６時間の終わりに、培養物を３，０００ｇで５分間遠心分離した。
【0070】
Ｋ．ファフィによるＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型の発現をトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってモニターした。電気泳動ゲルに加える前に、上清からの試料をアセトンで沈殿させ、沈殿物からの試料（０．３ｍｇ）を０．３ｍＬの試料緩衝液（１０ｍＬの最終容量について、２ｍＬのＳＤＳ、１．２ｍＬのグリセロール、０．２ｍＬのβ－メルカプトエタノール、１．０ｍｇのクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）Ｇ－２５０、及び０．５ｍＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８）と混合し、１００℃で１０分間インキュベートした。得られた結果は、Ｌｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型がＫ．ファフィによって発現され、この特徴が世代にわたって維持されることを示した。
【0071】
続いて、ｐＰＢＵＦＣＹｅａ－ＬｖＲｓｎ１ベクターで形質転換した同じＫ．ファフィ細胞を、５．０Ｌの容量のバイオリアクター中で培養した。接種前駆体のために、純粋なコロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充した２００ｍＬのＢＭＧＨ培地を含有する６つの２．０Ｌフラスコ中で、約２．０の６００ｎｍにおける光学密度に達するまで、２５０ｒｐｍ、２９℃で１６時間培養した。これらの培養物をプールし、最終体積を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物をＢＭＭＨ発現培地で２回洗浄して、残留するグリセロールを除去した。その後、細胞を１００ｍｌのＢＭＭＨ培地に再懸濁し、この体積をバイオリアクターに移し、約１．５の６００ｎｍにおける光学密度を得た。
【0072】
培養は、１００μｇ／ｍＬのゼオシンを補充した３．０ＬのＢＭＭＨ発現培地の最大容量を用いて２９℃、５００ｒｐｍ及び１ｖｖｍの通気でバッチで行った。最初の６００ｎｍにおける光学密度を記録し、培養物に０．５％（ｖ／ｖ）メタノールを与えた。この手順を９６時間まで２４時間毎に繰り返した。２４時間毎に、Ｍａｒｉｏｔｔｅ（マリオット）フラスコに溢れた泡の体積を収集した。このＭａｒｉｏｔｔｅフラスコは、バイオリアクターに接続して、バットから溢れた泡を収集するようにしていた。この液化泡沫を９，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。泡タンパク質濃度を定量し、タンパク質プロファイルをトリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ １５％によって分析した。得られた結果は、図８に見られるように、５．０Ｌのバイオリアクター中でＫ．ファフィによって産生されたＬｖ－Ｒｓｎ－１の改変型が泡沫中に濃縮されたことを示した。
【0073】
実施例８：酵母によって産生されたＬｖ－Ｒｓｎ－１の活性
５．０Ｌバイオリアクター中で培養した遺伝的に形質転換したＫ．ファフィ細胞中で発現したＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測されたアイソフォームの改変型を精製し、その乳化活性、水／空気表面張力の低下、及び濡れ性の反転を評価するために様々なアッセイに供した。
５．０Ｌバイオリアクター中で培養した遺伝的に形質転換したＫ．ファフィ細胞中で発現したＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測されたアイソフォームの改変型を精製し、その乳化活性、水／空気表面張力の低下、及び濡れ性の反転を評価するために様々なアッセイに供した。
【0074】
０．０３～０．２４ｍｇ／ｍＬの濃度におけるＫ．ファフィにおいて発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型の水／ケロシン混合物に対する乳化効果を図９に示す。
【0075】
Ｋ．ファフィにおいて発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型による水／空気表面張力の低下。０．２４ｍｇ／ｍＬの濃度のＬｖ－Ｒｓｎ－１は、図１０に示すように、水の表面張力を７２ｍＮ／ｍから３５ｍＮ／ｍに低下させる。
【0076】
５０ｍｇ／Ｌの濃度におけるＫ．ファフィ中で発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型による、シクロヘキサンペンタン酸を含浸させたカルサイト粉末（ＣａＣＯ３）の濡れ性の反転を図１１に示す。濡れ性の反転は、陰性対照（海水）と比較して、試験管の底部におけるより多量のカルサイト粉末の存在によって測定する。陽性対照として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を２，５００ｍｇ／Ｌの濃度で使用した。
【0077】
上記の開示から、Ｋ．ファフィにおいて発現されたＬｖ－Ｒｓｎ－１サーファクタントタンパク質の予測アイソフォームの改変型が、界面活性剤、乳化剤、分散剤及び濡れ性反転剤として作用し、これらの活性に関連する様々な目的に適用することができるということは明らかである。
【0078】
当業者は、本出願の保護の範囲に焦点を当てた多数の変形形態が許容され、そのことが本発明が上述の特定の構成及び実施形態に限定されないという事実を強化するということを理解するであろう。
【0079】
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【表21】
【表22】
【表23】
【表24】
【表25】
【表26】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】