特表 2023-510121 抗Ｍｕｃ１組成物及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-13

(54)【発明の名称】抗Ｍｕｃ１組成物及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230306BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20230306BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230306BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230306BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20230306BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230306BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230306BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230306BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230306BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230306BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20230306BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20230306BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/30 ZNA

C07K16/46

C07K14/705

C07K19/00

C12N15/62 Z

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N5/078

C12N5/0783

A61K39/395 N

A61K47/68

A61K35/17 Z

A61P35/00

A61P35/04

A61K39/00 H

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022537751

(86)(22)【出願日】2020-12-18

(85)【翻訳文提出日】2022-08-17

(86)【国際出願番号】 US2020066121

(87)【国際公開番号】W WO2021127505

(87)【国際公開日】2021-06-24

(31)【優先権主張番号】62/951,257

(32)【優先日】2019-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519331338

【氏名又は名称】ポセイダ セラピューティクス，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】エリック エム．オスタータグ

(72)【発明者】

【氏名】デボン シェドロック

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB36

4C085BB41

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

ＭＵＣ１に対する抗体、ＭＵＣ１－ＣＡＲ組成物、及びＭＵＣ１タンパク質を標的とするためのこれらの抗体及び組成物の使用方法が開示され、ここで、ＭＵＣ１タンパク質を発現する細胞は、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞によって標的化され、死滅され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列：

【化1】

［配列番号１のＸ１はＶ又はＩであり、
配列番号１のＸ２はＲ又はＫであり、
配列番号１のＸ３はＡ又はＲであり、
配列番号１のＸ４はＧ又はＡであり、
配列番号１のＸ５はＶ又はＡであり、
配列番号１のＸ６はＴ又はＳであり、及び
配列番号１のＸ７はＤ又はＡである］
を含む重鎖可変領域；ならびに
アミノ酸配列：

【化2】

［配列番号２のＸ１はＴ又はＳであり、
配列番号２のＸ２はＬ又はＶであり、及び
配列番号２のＸ３はＴ又はＤである］
含む軽鎖可変領域
を含む抗体。

【請求項2】

抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ＶＨ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ又はＦａｂ断片である、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

抗体がヒト化される、請求項１に記載の抗体。

【請求項4】

抗体がＩｇＧである、請求項１に記載の抗体。

【請求項5】

抗体がヒトＭＵＣ１－Ｃに結合する、請求項１に記載の抗体。

【請求項6】

重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項7】

軽鎖可変領域が、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項8】

アミノ酸配列：

【化3】

［配列番号１のＸ１はＶ又はＩであり、
配列番号１のＸ２はＲ又はＫであり、
配列番号１のＸ３はＡ又はＲであり、
配列番号１のＸ４はＧ又はＡであり、
配列番号１のＸ５はＶ又はＡであり、
配列番号１のＸ６はＴ又はＳであり、及び
配列番号１のＸ７はＤ又はＡである］
を含む重鎖可変領域；ならびに
アミノ酸配列：

【化4】

［配列番号２のＸ１はＴ又はＳであり、
配列番号２のＸ２はＬ又はＶであり、及び
配列番号２のＸ３はＴ又はＤである］
を含む軽鎖可変領域
を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）。

【請求項9】

重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のｓｃＦｖ。

【請求項10】

軽鎖可変領域が、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のｓｃＦｖ。

【請求項11】

ｓｃＦｖが、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間にリンカーを含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ。

【請求項12】

リンカーが配列番号５９のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のｓｃＦｖ。

【請求項13】

ｓｃＦｖが、配列番号１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０又は１４１のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のｓｃＦｖ。

【請求項14】

ＳｃＦｖが配列番号１２５のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のＳｃＦｖ。

【請求項15】

請求項１に記載の抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項16】

請求項８に記載のｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項17】

（ａ）抗原認識領域が少なくとも１つの抗ＭＵＣ１一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、抗原認識領域を含むエクトドメインエクトドメイン；
（ｂ）膜貫通ドメイン、及び
（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメイン
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
ここで、ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：

【化5】

［配列番号１のＸ１はＶ又はＩであり、
配列番号１のＸ２はＲ又はＫであり、
配列番号１のＸ３はＡ又はＲであり、
配列番号１のＸ４はＧ又はＡであり、
配列番号１のＸ５はＶ又はＡであり、
配列番号１のＸ６はＴ又はＳであり、及び
配列番号１のＸ７はＤ又はＡである］
を含む重鎖可変領域；ならびに
アミノ酸配列：

【化6】

［配列番号２のＸ１はＴ又はＳであり
配列番号２のＸ２はＬ又はＶであり、及び
配列番号２のＸ３はＴ又はＤである］
を含む軽鎖可変領域
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

【請求項18】

重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項19】

軽鎖可変領域が、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項20】

重鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項21】

重鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項22】

重鎖可変領域が配列番号５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項23】

重鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項24】

重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項25】

重鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項26】

重鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項27】

重鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項28】

重鎖可変領域が配列番号５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項29】

重鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項30】

重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項31】

重鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項32】

重鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項33】

重鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項34】

重鎖可変領域が配列番号５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項35】

重鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項36】

重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項37】

重鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項38】

ｓｃＦｖが、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間にリンカーを含む、請求項１７～３７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。

【請求項39】

リンカーが配列番号５９のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のＣＡＲ。

【請求項40】

ｓｃＦｖが、配列番号１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０又は１４１のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項41】

ｓｃＦｖが配列番号１２５のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項42】

エクトドメインがシグナルペプチドをさらに含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項43】

シグナルペプチドが配列番号５７のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のＣＡＲ。

【請求項44】

ＣＡＲが、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジ領域をさらに含む、請求項１７～４３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。

【請求項45】

ヒンジ領域が配列番号６１のアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載のＣＡＲ。

【請求項46】

膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインをコードする配列を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項47】

ＣＤ８膜貫通ドメインが配列番号６３のアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載のＣＡＲ。

【請求項48】

少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＣＤ３ζ共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項49】

少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＣＤ３ζ共刺激ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、４－１ＢＢ共刺激ドメインが、膜貫通ドメインとＣＤ３ζ共刺激ドメインの間に位置する、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項50】

４－１ＢＢ共刺激ドメインが配列番号６５のアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載のＣＡＲ。

【請求項51】

ＣＤ３ζ共刺激ドメインが配列番号６７のアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載のＣＡＲ。

【請求項52】

ｓｃＦｖが、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間にリンカーを含み、
エクトドメインが、シグナルペプチドを含み、
ＣＡＲがさらに、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジ領域を含み、
膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む配列を含み、
少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＣＤ３ζ共刺激ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、４－１ＢＢ共刺激ドメインが、膜貫通ドメインとＣＤ３ζ共刺激ドメインの間に位置する、請求項１７に記載のＣＡＲ。

【請求項53】

ｓｃＦｖが配列番号１２５のアミノ酸配列を含み、
シグナルペプチドが配列番号５７を含み、
ヒンジ領域が配列番号６１を含み、
ＣＤ８膜貫通ドメインが配列番号６３を含み、
４－１ＢＢ共刺激ドメインが配列番号６５を含み；及び
ＣＤ３ζ共刺激ドメインが配列番号６７を含む、請求項５２に記載のＣＡＲ。

【請求項54】

ＣＡＲが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、又は配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載のＣＡＲ。

【請求項55】

ＣＡＲが配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載のＣＡＲ。

【請求項56】

ＣＡＲのアミノ酸配列が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、又は配列番号１６７の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項５２に記載のＣＡＲ。

【請求項57】

ＣＡＲのアミノ酸配列が、配列番号１６７の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、請求項５６に記載のＣＡＲ。

【請求項58】

請求項１に記載の抗体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項59】

請求項８に記載のｓｃＦｖをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項60】

請求項１７に記載のＣＡＲ又は請求項５２に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項61】

請求項１７に記載のＣＡＲ又は請求項５２に記載のＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾン。

【請求項62】

核酸配列が、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＡＲを含む、請求項６１に記載のトランスポゾン。

【請求項63】

前記トランスポゾンが、誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする核酸、キメラ刺激受容体をコードする核酸、選択遺伝子をコードする核酸、治療剤をコードする核酸、又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項６１に記載のトランスポゾン。

【請求項64】

選択遺伝子がＤＨＦＲ耐性遺伝子を含む、請求項６３に記載のトランスポゾン。

【請求項65】

トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである、請求項６１に記載のトランスポゾン。

【請求項66】

トランスポゾンが配列番号１７２の核酸配列を含む、請求項６１に記載のトランスポゾン。

【請求項67】

請求項６０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項68】

請求項６１に記載のトランスポゾンを含むベクター。

【請求項69】

請求項１に記載の抗体を含む細胞。

【請求項70】

請求項８に記載のｓｃＦｖを含む細胞。

【請求項71】

請求項１７に記載のＣＡＲを含む細胞。

【請求項72】

請求項６１に記載のトランスポゾンを含む細胞。

【請求項73】

複数の細胞集団が、請求項１７に記載のＣＡＲを発現するように修飾される細胞集団。

【請求項74】

複数の修飾された細胞が複数の修飾された免疫細胞である、請求項７３に記載の細胞集団。

【請求項75】

複数の修飾された細胞が複数の修飾されたＴ細胞である、請求項７３に記載の細胞集団。

【請求項76】

複数の細胞集団が、請求項１７に記載のＣＡＲを発現する、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の細胞を含む、請求項７３に記載の細胞集団。

【請求項77】

ＣＡＲが配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載の細胞集団。

【請求項78】

少なくとも５０％の複数の修飾されたＴ細胞が、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、ＣＤ４５ＲＯを含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現しない、請求項７５に記載の細胞集団。

【請求項79】

請求項１に記載の抗体を含む組成物。

【請求項80】

細胞傷害性物質にコンジュゲートされた請求項１に記載の抗体を含む組成物。

【請求項81】

請求項８に記載のｓｃＦｖを含む組成物。

【請求項82】

請求項１７に記載のＣＡＲを含む組成物。

【請求項83】

請求項７１に記載の細胞を含む組成物。

【請求項84】

請求項７３に記載の細胞集団を含む組成物。

【請求項85】

請求項７９～８４のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項86】

それを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、請求項７９～８４のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む方法。

【請求項87】

請求項８５に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法。

【請求項88】

がんがＭＵＣ１陽性がんである、請求項８６に記載の方法。

【請求項89】

がんがＭＵＣ１－Ｃ陽性がんである、請求項８６に記載の方法。

【請求項90】

がんが、原発性腫瘍、転移性がん、多剤耐性がん、進行性腫瘍又は再発性がんである、請求項８６に記載の方法。

【請求項91】

がんが固形腫瘍である、請求項８６に記載の方法。

【請求項92】

がんが、肺がん、脳がん、頭頸部がん、乳がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん又は食道がんである、請求項８６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１９年１２月２０日に出願された米国仮出願大６２／９５１，２５７号の優先権及び利益を主張し、本出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本開示は、分子生物学に向けられ、より具体的には、高い親和性及び結合活性を有する標的タンパク質に特異的に結合する抗体及びキメラ抗原受容体に向けられる。

【0003】

参照による配列表の組み込み
２０２０年１２月１５日に作成され、サイズが４１２ＫＢである「ＰＯＴＨ－０４０ ００１ＷＯ ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ ＳＴ２５」というファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

高い親和性及び結合活性を有する特定の標的タンパク質を認識し、それに結合することができる物質の発見は、バイオ医薬品産業の焦点であった。入手可能な選択肢よりも小さく、より溶解性が高く、より安定である、より効果的な薬剤が依然として必要である。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む単離された抗体を提供する。

【0006】

【化1】

【0007】

ここで、配列番号１のＸ１は、Ｖ又はＩであり、配列番号１のＸ２は、Ｒ又はＫであり、配列番号１のＸ３は、Ａ又はＲであり、配列番号１のＸ４は、Ｇ又はＡであり、配列番号１のＸ５は、Ｖ又はＡであり、配列番号１のＸ６は、Ｔ又はＳであり、配列番号１のＸ７は、Ｄ又はＡであり；軽鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を含む。

【0008】

【化2】

【0009】

ここで、配列番号２のＸ１は、Ｔ又はＳであり、配列番号２のＸ２は、Ｌ又はＶであり、配列番号２のＸ３は、Ｔ又はＤである。

【0010】

単離された抗体をヒト化することができる。単離された抗体は、ＩｇＧであり得る。単離された抗体は、ヒトＭＵＣ１－Ｃに結合することができ、単離された抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ＶＨ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ又はＦａｂ断片であり得る。好ましくは、単離された抗体はｓｃＦｖである。

【0011】

重鎖可変領域は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８のアミノ酸配列を含む。軽鎖可変領域は、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

【0012】

ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間のリンカーを含むことができる。一態様では、リンカーは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。

【0013】

ｓｃＦｖは、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０又は配列番号１４１を含むことができる。一態様において、ｓｃＦｖは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。

【0014】

本開示はまた、本明細書中に開示された抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。好ましくは、ＣＡＲは、本明細書に開示されるｓｃＦｖを含む。ＣＡＲは、（ａ）抗原認識領域を含むエクトドメインであって、抗原認識領域が、少なくとも１つの抗ＭＵＣ１単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；（ｂ）膜貫通ドメイン；及び（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含み、ｓｃＦｖが以下のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、エクトドメインを含むことができる。

【0015】

【化3】

【0016】

ここで、配列番号１のＸ１は、Ｖ又はＩであり、配列番号１のＸ２は、Ｒ又はＫであり、配列番号１のＸ３は、Ａ又はＲであり、配列番号１のＸ４は、Ｇ又はＡであり、配列番号１のＸ５は、Ｖ又はＡであり、配列番号１のＸ６は、Ｔ又はＳであり、配列番号１のＸ７は、Ｄ又はＡであり；及び、以下のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域である。

【0017】

【化4】

【0018】

ここで、配列番号２のＸ１はＴ又はＳであり、配列番号２のＸ２はＬ又はＶであり、配列番号２のＸ３はＴ又はＤである。

【0019】

ＣＡＲの重鎖可変領域は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの軽鎖可変領域は、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。

【0020】

ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号５のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号６のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号５のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号６のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号５のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号６のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。ＣＡＲの重鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を含むことができ、ＣＡＲの軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。

【0021】

ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間のリンカーを含むことができる。好ましくは、リンカーは配列番号５９のアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖは、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０又は配列番号１４１を含むことができる。ある態様において、ｓｃＦｖは、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。エクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含むことができる。好ましくは、シグナルペプチドは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。ＣＡＲは、抗原認識領域と膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域をさらに含むことができる。ヒンジ領域は、配列番号６１のアミノ酸配列を含むことが好ましい。膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインをコードする配列を含むことができる。好ましくは、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＣＤ３ζ共刺激ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、又はそれらの組み合わせを含むことができる。一態様では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＣＤ３ζ共刺激ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζ共刺激ドメインとの間に位置する。好ましくは、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＣＤ３ζ共刺激ドメインは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。

【0022】

本開示はまた、（ａ）抗原認識領域が少なくとも１つの抗ＭＵＣ１単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、抗原認識領域を含むエクトドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；及び（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含み、ｓｃＦｖが以下のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0023】

【化5】

【0024】

ここで、配列番号１のＸ１は、Ｖ又はＩであり、配列番号１のＸ２は、Ｒ又はＫであり、配列番号１のＸ３は、Ａ又はＲであり、配列番号１のＸ４は、Ｇ又はＡであり、配列番号１のＸ５は、Ｖ又はＡであり、配列番号１のＸ６は、Ｔ又はＳであり、配列番号１のＸ７は、Ｄ又はＡであり；及び、以下のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域である。

【0025】

【化6】

【0026】

ここで、配列番号２のＸ１はＴ又はＳであり、配列番号２のＸ２はＬ又はＶであり、配列番号２のＸ３はＴ又はＤであり、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間のリンカーを含み、エクトドメインは、シグナルペプチドを含み、ＣＡＲは、抗原認識領域と膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域をさらに含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む配列を含み、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＣＤ３ζ共刺激ドメインと４－１ＢＢ共刺激ドメインとを含み、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζ共刺激ドメインとの間に位置する。

【0027】

いくつかの態様において、ｓｃＦｖは配列番号１２５のアミノ酸配列を含み、シグナルペプチドは配列番号５７を含み、ヒンジ領域は配列番号６１を含み、ＣＤ８膜貫通ドメインは配列番号６３を含み、４－１ＢＢ共刺激ドメインは配列番号６５を含み、ＣＤ３ζ共刺激ドメインは配列番号６７を含む。

【0028】

いくつかの態様において、ＣＡＲは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、又は配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７又は配列番号１６７の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの態様において、ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号１６７の核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。

【0029】

本開示はまた、本明細書中に開示された抗体をコードする核酸配列；本明細書中に開示されたｓｃＦｖをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド；及び／又は本明細書中に開示されたＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供する。

【0030】

本開示はまた、本明細書中に開示されたＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを提供する。いくつかの態様において、核酸配列は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＡＲを含む。トランスポゾンは、誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする核酸、キメラ刺激受容体をコードする核酸、選択遺伝子をコードする核酸、治療剤をコードする核酸、又はそれらの組み合わせをさらに含むことができる。選択遺伝子は、ＤＨＦＲ耐性遺伝子を含むことができる。好ましくは、トランスポゾンはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。いくつかの態様において、トランスポゾンは、配列番号１７２の核酸配列を含む。本開示はまた、本明細書中に開示されたポリヌクレオチドのいずれか、又は本明細書中に開示されたトランスポゾンのいずれかを含むプラスミド又はベクターを提供する。

【0031】

本開示はまた、抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ又は本明細書中に開示されているトランスポゾンのいずれかを含む細胞を提供する。本開示はまた、複数の集団が、本明細書に開示されているように、抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ又はトランスポゾンのいずれかを発現するように修飾された細胞集団を提供する。一態様では、複数の修飾された細胞は、複数の修飾された免疫細胞である。一態様では、複数の修飾された細胞は、複数の修飾されたＴ細胞である。ある態様では、複数の細胞集団は、ＣＡＲを発現する細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を含む。一態様では、ＣＡＲは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。ある態様において、少なくとも５０％の複数の修飾されたＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、ＣＤ４５ＲＯを含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現しない。

【0032】

本開示はまた、抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ、トランスポゾン、細胞又は本明細書中に開示される細胞集団のいずれかを含む組成物を提供する。一態様では、組成物は医薬組成物であり、さらに薬学的に許容される担体を含む。

【0033】

本開示はまた、本明細書に開示されているように、抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ、トランスポゾン、細胞、細胞集団、組成物又は医薬組成物のいずれかの治療有効量を投与することによって、それを必要とする対象における増殖障害を治療する方法を提供する。一態様では、増殖障害はがんである。ある態様では、がんはＭＵＣ１陽性がんであり得る。一態様では、がんはＭＵＣ１－Ｃ陽性がんである。がんは、原発性腫瘍、転移性がん、多剤耐性がん、進行性腫瘍又は再発性がんであり得る。がんは固形腫瘍である可能性がある。がんは、肺がん、脳がん、頭頸部がん、乳がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、又は食道がんであり得る。

【0034】

特許又は出願ファイルは、色彩を付して作成された少なくとも１の図面を含む。この特許又は特許出願公開の写し及び色彩図面は、請求及び必要な手数料の納付があったときは、特許庁により提供される。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1A】図１Ａ～１Ｂは、ＭＵＣ１ヘテロ二量体の構造を示す一対の概略図である。図１Ａは、ＳＥＡドメイン（ウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ及びアグリンドメイン）で自己タンパク質分解を受け、安定な非共有ヘテロ二量体を形成する２つのサブユニットを生成するＭＵＣ１を示す。ＭＵＣ１－ＮとＭＵＣ１－Ｃの命名法は、切断後のサブユニットの位置を指定し、それらをギリシャ語の形質で下位分類された遺伝的アイソフォームと区別するために用いられる。

【図1B】図１ＢはＭＵＣ１－Ｃサブユニットの詳細を示す。ＭＵＣ１－Ｃ ５８アミノ酸の細胞外ドメインは、Ｎ^３６ＬＴ部位である３６位のアスパラギン上でグリコシル化される。ＭＵＣ１－Ｃ（ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ）のＣ末端の細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す（配列番号７７）。ＭＵＣ１－Ｃ ７２アミノ酸の細胞質ドメインは、複数のエフェクターと相互作用し、発がん性の形質転換を誘導するのに十分である。図１Ａ－１ＢはＫｕｆｅ ＤＷ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、３２（９）：１０７３から複製される。

【図2A】図２Ａは、完全長ＭＵＣ１（ＰＤＢ：２ＡＣＭ）又はＭＵＣ１－Ｃドメインの予測構造のいずれかのリボン構造を示す一対の概略図である。

【図2B】図２Ｂは、異なる細胞型におけるＭＵＣ１発現を示す一連のグラフである。

【図3】図３は、異なるがん細胞株におけるＭｕｃ１発現を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。

【図4】図４は、ヒト化ＭＵＣ１－Ｃキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の例示的構築を示す概略図である。重鎖（４＋２変異体（Ｈ１Ｂ及びＨ２Ｂ））及び軽鎖（３）配列を異なる軽鎖組み合わせで集合させ、１４の新規候補ヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲを構築した。以下のヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ構造を用いた：シグナルペプチド（ＣＤ８α）－軽鎖－リンカー－重鎖－ヒンジ（ＣＤ８α）－膜貫通型（ＣＤ８α）－細胞内シグナル伝達（４－１ＢＢ）－細胞内シグナル伝達（ＣＤ３ζ）。

【図5A】図５Ａは、本開示のヒト化抗ＭＵＣ－１Ｃ抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。

【図5B】５Ｂは、本開示のヒト化抗ＭＵＣ－１Ｃ抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。

【図6】図６は、ＭＵＣ－１Ｃ ＣＡＲを含む開示のｐｉｇｇｙＢａｃナノトランスポゾンの概略図である。ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲを三シストロン性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンにサブクローン化した。トランスポゾンは、ＥＦ１αプロモーター－ｉＣ９安全スイッチ－Ｔ２Ａ－ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ（Ｌ１－リンカー－Ｈ１Ｂ ｓｃＦｖ）－Ｔ２Ａ－ＤＨＦＲ選択遺伝子構築物を含む。

【図7】図７は、候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲがＴ細胞の表面上に発現されることを示す一連のフローサイトメトリーグラフである。全ての候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲは、ｐｉｇｇｙＢａｃ産生ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面に発現され、検出された。

【図8】図８は、候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＭＵＣ１＋標的細胞の特異的死滅を示すグラフである。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の死滅は、ライングラフの各ＣＡＲについて示されている。すべてのＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＭＵＣ１＋ ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の特異的死滅を発現した。模擬Ｔ細胞は標的細胞（青色系）を特異的に死滅させなかった。

【図9】図９は、候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＭＵＣ１＋標的細胞の特異的死滅を示すグラフである。各細胞株の死滅は、棒グラフの各ＣＡＲについて示され、誤差バーは、三連で実行された試料の標準偏差を表す。すべてのＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＭＵＣ１＋遺伝子操作されたＲａｊｉ細胞株の特異的死滅を発現したが、ＭＵＣ１－Ｒａｊｉ細胞に対しては発現しなかった。模擬トランスポゾンＴ細胞は、Ｒａｊｉ標的細胞株も遺伝子操作したＲａｊｉ標的細胞株も死滅さなかった。

【図10】図１０は、マウス異種移植モデルを用いた「ストレス」用量での候補ヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞の前臨床評価のための試験デザインの概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0036】

明示的に除外されるか又は別途制限されない限り、本明細書に引用された全ての文献は、参照により、全ての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。文献の引用は、それが本明細書において開示され若しくは請求された発明に関して先行技術であること、又はそれが単独で、又は他の引例若しくは引例との何らかの組み合わせで、そのような発明を教示し、示唆し、又は開示していることを認めるものではない。さらに、本文書中の用語の意味又は定義が、引用により援用された文書中の同じ用語の意味又は定義と矛盾する限りにおいて、本文書中のその用語に割り当てられた意味又は定義が支配するものとする。

【0037】

発明の詳細な説明
本開示は、特異的標的タンパク質、ムチン１、細胞表面結合（ＭＵＣ１）タンパク質を認識し、高親和性及び高親和性で結合するために、これらの組成物を使用するための組成物及び方法を提供する。

【0038】

ＭＵＣ１
ＭＵＣ１は、主に上皮細胞によって発現される広範なＯ－グリコシル化ムチンタンパク質である。分泌され、膜に結合したＭＵＣ１は、毒素、微生物、及び外部環境との界面で起こるその他のストレスによって誘発される損傷から上皮細胞の頂端境界を保護する物理的障壁を形成する。ほとんどのヒト癌腫で認められるように、ＭＵＣ１の異常な過剰発現は、足場非依存性増殖及び腫瘍形成性を付与する。ＭＵＣ１の過剰発現は、酸化ストレス及び遺伝毒性抗がん剤によって誘導されるアポトーシスに対する耐性を付与する。

【0039】

ヒトＭＵＣ１はヘテロ二量体糖タンパク質であり、単一のポリペプチドとして翻訳され、小胞体でＮ末端及びＣ末端サブユニット（ＭＵＣ１－Ｎ及びＭＵＣ１－Ｃ）に切断される。この切断は、自己触媒過程によって媒介され得る。＞２５０ｋＤａのＭＵＣ１ Ｎ末端（ＭＵＣ１ Ｎ－ｔｅｒ又はＭＵＣ１－Ｎ）サブユニットは、高度に保存されたバリエーションでは不完全であり、Ｏ－結合型グリカンによって修飾される２０個のアミノ酸のタンデム反復を可変数含む。ＭＵＣ１－Ｎは、約２３ｋＤａのＣ末端サブユニット（ＭＵＣ１ Ｃ－ｔｅｒ又はＭＵＣ１－Ｃ）との二量体化により細胞表面に結合され、これは５８アミノ酸の細胞外領域、２８アミノ酸の膜貫通ドメイン及び７２アミノ酸の細胞質ドメインを含む（図１Ｂ）。ＭＵＣ１－Ｃは、（配列番号７６）のアミノ酸配列を含む。

【0040】

【化7】

【0041】

本開示の組成物は、下線を引いたＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤの５８アミノ酸部分に結合することができる。太字の配列はＣＤを示し、イタリック体の部分はオリゴマー阻害ペプチドである。正常上皮ががんに転換すると、ＭＵＣ１は細胞質及び細胞膜全体に異常に過剰発現する。細胞膜に結合したＭＵＣ１は、クラスリンを介したエンドサイトーシスによりエンドソームを標的とする。さらに、ＭＵＣ１－Ｃは核とミトコンドリアを標的とするが、ＭＵＣ１－Ｎは標的としない。

【0042】

本開示の組成物は、「エピトープ」ＭＵＣ１－Ｃ／細胞外ドメイン（ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ）の１つ以上のアミノ酸に選択的に結合することができる。エピトープは、直鎖状でもコンホメーション状でもよい。本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、開示された組成物が特異的に結合する１つ以上のアミノ酸を指すことを意味する。本開示のエピトープの１つ以上のアミノ酸は、線形、非線形、連続的、又は不連続的な様式で配列され得る。本開示のエピトープは、「コンホメーション」であってもよく、これは、タンパク質骨格が、適切に折り畳まれたペプチド、タンパク質、又はタンパク質複合体のコンホメーションで提示される場合に、より高い親和性又はより高い選択性で、エピトープの１つ以上のアミノ酸に結合することを意味する。ある態様において、立体配座エピトープに結合する組成物は、線状エピトープに結合しないことができる。

【0043】

本開示の組成物は、ＳＶＶＶＱＬＴＬＡＦＲＥＧＴＩＮＶＨＤＶＥＴＱＦＮＱＹＫＴＥＡＡＳＲＹＮＬＴＩＳＤＶＳＶＳＤＶＰＦＰＦＳＡＱＳＧＡＧ（配列番号７７）のアミノ酸配列によって定義されるＭＵＣ１－Ｃ／細胞外ドメイン（ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ）の１つ以上のアミノ酸に選択的に結合することができる（図１Ｂ参照）。あるいは又はさらに、組成物は、変異型ＭＵＣ１－Ｃ／細胞外ドメイン（ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ）の１つ以上のアミノ酸に選択的に結合する。本開示の変異型ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤペプチドは、配列番号７６又は配列番号７７に従って番号付けされたＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ－Ｌ６Ａ、ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ－Ｌ８Ａ、ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ－Ｌ６、８Ａ、ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ－Ｑ２３Ｖ、ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ－Ｑ２６Ｖ、ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ－Ｎ３６Ａを含むが、これらに限定されない。

【0044】

本開示の組成物は、ＭＵＣ１－Ｃ／細胞外ドメイン（ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤ）：ＳＶＶＶＱＬＴＬＡＦＲＥＧＴＩＮＶＨＤＶＥＴ（「ペプチド１」、配列番号７８）、ＶＥＴＱＦＮＱＹＫＴＥＡＡＳＲＹＮＬＴＩＳＤ（「ペプチド２」、配列番号７９）、又はＴＩＳＤＶＳＶＳＤＶＰＦＰＦＳＡＱＳＧＡＧ（「ペプチド３」、配列番号８０）に由来する以下のペプチドの１つ以上のアミノ酸に選択的に結合することができる。

【0045】

本開示の組成物は、ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＤ中のアルファ３（α３）ヘリックス又はアルファ４（α４）ヘリックスに選択的に結合することができる。いくつかの実施態様において、ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＣＤは、次のアミノ酸配列を含む。

【0046】

【化8】

【0047】

α３ヘリックスは太字、α４ヘリックスは太字、イタリック体。ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＤ α３ヘリックスは、以下のアミノ酸配列を含むことができ、必須であり、又はそれらからなることができる。

【0048】

【化9】

【0049】

ＭＵＣ１－Ｃ／ＥＤ α４ヘリックスは、以下のアミノ酸配列を含むことができ、必須であり、又はそれらからなることができる。

【0050】

【化10】

【0051】

本開示の組成物のエピトープは、配列番号８１又は配列番号８２のアミノ酸配列を含むことができ、配列番号８１又は配列番号８２のアミノ酸配列から構成され、又はそれらから構成される。エピトープは、線状又は立体配座であり得る。いくつかの態様において、エピトープは不連続であり、場合により、配列番号８１又は配列番号８２のアミノ酸配列の２つ以上の不連続なアミノ酸から本質的に構成され、又はそれから構成される。

【0052】

開示の構成
本開示は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）のアミノ酸配列から本質的になるか又はそれからなる重鎖可変領域を含む抗体を提供する。

【0053】

【化11】

【0054】

ここで、配列番号１のＸ１はＶ又はＩであり、配列番号１のＸ２はＲ又はＫであり、配列番号１のＸ３はＡ又はＲであり、配列番号１のＸ４はＧ又は配列番号１のＸ５がＶ又はＡであり、配列番号１のＸ６がＴ又はＳであり、配列番号１のＸ７がＤ又はＡである；軽鎖可変領域は、以下の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0055】

【化12】

【0056】

ここで、配列番号２のＸ１はＴ又はＳであり、配列番号２のＸ２はＬ又はＶであり、配列番号２のＸ３はＴ又はＤである。

【0057】

好ましくは、重可変鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、Ｘ２はＲ又はＫであり、Ｘ３はＡ又はＲであり、Ｘ４はＧ又はＡであり、Ｘ５はＶ又はＡである。好ましくは、軽可変鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ここでＸ１はＴ又はＳであり、Ｘ２はＬ又はＶであり、Ｘ３はＴ又はＤである。

【0058】

いくつかの態様において、抗体は、配列番号１６０からなる、又は配列番号１６０からなる、ヒトＭＵＣ１ポリペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１５９４１－１）に結合する。１つの態様において、抗体は、配列番号７６を含む、本質的に構成される、又は配列番号７６からなるヒトＭＵＣ１－Ｃポリペプチドに結合する。別の態様では、抗体は、配列番号１６１からなる、本質的に構成される、又は配列番号１６１からなる、ヒトＭＵＣ１－Ｎポリペプチド（アルファ鎖、成熟鎖としても知られるＭＵＣ１受容体のサブユニット）に結合する。

【0059】

いくつかの態様において、抗体は、本質的に配列番号７７からなる、又は配列番号７７からなる、ヒトＭＵＣ１－Ｃ細胞外ドメイン（ＥＤ）に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ヒト全長ＭＵＣ１ポリペプチド（配列番号１６０）よりも高い親和性でＭＵＣ１－Ｃ ＥＤ（配列番号７７）に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ＭＵＣ１－Ｎポリペプチド（配列番号１６１）よりも高い親和性でヒトＭＵＣ１－Ｃ ＥＤ（配列番号７７）に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ＭＵＣ１－Ｃ ＥＤ（配列番号７７）に結合し、ヒト全長ＭＵＣ１ポリペプチド（配列番号１６０）に結合しない。いくつかの態様において、抗体は、ヒトＭＵＣ１－Ｃ ＥＤ（配列番号７７）に結合し、ＭＵＣ１－Ｎポリペプチド（配列番号１６１）に結合しない。

【0060】

いくつかの実施形態において、ヒト可変重鎖フレームワークアクセプターは、配列番号１６２のＩＧＨＶ１－６９ ０８のポリペプチドを含む、本質的に含む、又はそれらからなる。いくつかの態様において、ヒト可変軽鎖フレームワークアクセプターは、配列番号１６３のＩＧＫＶ６－２１ ０２のポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。

【0061】

重鎖可変領域は、配列番号６９を含む相補的決定領域１（ＣＤＲＨ１）を含む。重鎖可変領域は、配列番号７０又は配列番号７５を含むＣＤＲＨ２を含む。重鎖可変領域は、配列番号７１を含むＣＤＲＨ３を含む。

【0062】

軽鎖可変領域は、配列番号７２を含む相補的決定領域１（ＣＤＲＬ１）を含む。軽鎖可変領域は、配列番号７３を含むＣＤＲＬ２を含む。軽鎖可変領域は、配列番号７４を含むＣＤＲＬ３を含む。

【0063】

重鎖可変領域は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。好ましい態様では、重鎖可変領域は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらからなる。

【0064】

重鎖可変領域は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３又は配列番号１６４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む、本質的にそれらからなる、又はそれらからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好ましい態様において、重鎖可変領域は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３又は配列番号１６４の核酸配列から本質的に構成されるか又はそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされる。

【0065】

軽鎖可変領域は、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含み、本質的にそれらからなるか、又はそれらのアミノ酸配列からなる。好ましい態様において、軽鎖可変領域は、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列を含み、本質的にそれらからなり、又はそれらからなる。

【0066】

軽鎖可変領域は、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６又は配列番号１６５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列から本質的に又はそれからなるポリヌクレオチドによりコードされる。好ましい態様において、軽鎖可変領域は、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６又は配列番号１６５の核酸配列から本質的に構成されるか又はそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされる。

【0067】

抗体の重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号５のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号６のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号９のアミノ酸配列を含むことができる。

【0068】

抗体の重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号５のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号６のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含むことができる。

【0069】

抗体の重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号５のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号６のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。抗体の重鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を含むことができ、抗体の軽鎖可変領域は配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。

【0070】

いくつかの態様において、抗体は、ヒト又はヒト化配列を含む。いくつかの態様において、ＣＤＲは、ヒト化配列を含む。いくつかの態様において、可変領域は、ヒト化配列を含む。ある態様において、フレームワーク領域は、ヒト化配列を含む。フレームワーク領域は、免疫原性を低下させるため、又は抗体の産生を改善するために、１つ以上の配列変異をさらに含むことができる。いくつかの態様において、抗体はＩｇＧである。

【0071】

抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ＶＨ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗原結合断片（Ｆａｂ）又はＦａｂ断片であり得る。好ましい態様において、抗体はｓｃＦｖである。

【0072】

本開示は、ｓｃＦｖ組成物及びこれらの組成物を用いて、高い親和性及び結合活性を有する特定の標的タンパク質（例えば、ＭＵＣ１）を認識し、それに結合するための方法を提供する。ｓｃＦｖ組成物は、抗ＭＵＣ１抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むことができる。

【0073】

ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカーポリペプチドを含むことができる。ある態様において、リンカーポリペプチドは、配列番号５９のアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。リンカーポリペプチドは、本質的に配列番号６０の核酸配列からなる、又はそれからなるポリヌクレオチドによりコード化することができる。

【0074】

ｓｃＦｖは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８又は配列番号２９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。好ましい態様では、ｓｃＦｖは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８又は配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0075】

ｓｃＦｖは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７又は配列番号１６６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。好ましい態様では、ｓｃＦｖは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７又は配列番号１６６のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0076】

本開示はまた、抗原認識領域を含むエクトドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、ここで、抗原認識領域は、本開示の少なくとも１つの抗ＭＵＣ１単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；膜貫通ドメイン；及び少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含む。ＣＡＲは、抗原認識ドメインと膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域をさらに含むことができる。抗原認識領域は、少なくとも２つの抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖを含むことができる。抗原認識領域は、少なくとも３つの抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖを含むことができる。一態様では、本開示のＣＡＲは、２つの異なる抗原に特異的に結合する少なくとも２つのｓｃＦｖを含む二特異的ＣＡＲである。

【0077】

エクトドメインは、シグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含むことができる。好ましい態様において、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８アルファ（ＣＤ８α）シグナルペプチド（ＳＰ）又はその一部を含み、本質的にそれらからなり、又はそれらからなる。ヒトＣＤ８α ＳＰは、配列番号５７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）と同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれらからなり、又はそれらからなる。好ましくは、ヒトＣＤ８α ＳＰは、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。

【0078】

ヒトＣＤ８α ＳＰは、配列番号５８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列から本質的になるか又はそれからなるポリヌクレオチドによりコードされる。好ましくは、ヒトＣＤ８α ＳＰは、配列番号５８のアミノ酸配列から本質的に構成されるか、又はそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされる。

【0079】

ヒンジドメイン又はヒンジ領域は、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、ＣＤ４配列、又はそれらの組み合わせを含むことができる。好ましい態様では、ヒンジは、ヒトＣＤ８α（ＣＤ８α）ヒンジ又はその一部を含み、本質的に含むか、又はそれからなることができる。ヒトＣＤ８ａヒンジは、配列番号６１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含み、本質的に含むか、又はそれからなる。好ましくは、ヒトＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。

【0080】

ヒトＣＤ８αヒンジは、配列番号６２又は配列番号１６８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列から本質的に又はそれからなるポリヌクレオチドによりコードされる。好ましくは、ヒトＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号６２又は配列番号１６８の核酸配列から本質的に構成されるか又はそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされる。

【0081】

膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はＧＭ－ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる。好ましくは、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α（ＣＤ８α）膜貫通ドメイン、又はその一部を含み、本質的に含み、又はそれから構成され得る。ＣＤ８ａ膜貫通ドメインは、配列番号６３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含み、それからなり、又はそれから本質的になる。好ましくは、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。

【0082】

ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号６４又は配列番号１６９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む、それから本質的になる、又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好ましくは、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号６４又は配列番号１６９の核酸配列から本質的に構成されるか、又はそれから構成されるポリヌクレオチドによりコードされる。

【0083】

少なくとも１つの共刺激ドメインは、本質的に、ヒト４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ－４０細胞内ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含み得るか、又はそれらから構成され得る。好ましくは、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＣＤ３ζ、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む。

【0084】

４－１ＢＢ細胞内ドメインは、配列番号６５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。好ましくは、４－１ＢＢ細胞内ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列からなるか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0085】

４－１ＢＢ細胞内ドメインは、配列番号６６又は配列番号１７０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好ましくは、４－１ＢＢ細胞内ドメインは、配列番号６６又は配列番号１７０の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる。

【0086】

ＣＤ３ζ細胞内ドメインは、配列番号６７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。好ましくは、ＣＤ３ζ細胞内ドメインは、配列番号６７のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0087】

ＣＤ３ζ細胞内ドメインは、配列番号６８又は配列番号１７１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる。好ましくは、ＣＤ３ζ細胞内ドメインは、配列番号６８又は配列番号１７１の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれを含むポリヌクレオチドによりコードされる。

【0088】

本開示の組成物（例えば、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖを含むＣＡＲ）は、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１１Ｍ以下、１０^－１２Ｍ以下、１０^－１３Ｍ以下、１０^－１４Ｍ以下、及び１０^－１５Ｍ以下のＫ_Ｄから選択される少なくとも１つの親和性でヒトＭＵＣ１に結合し得る。Ｋ_Ｄは、表面プラズモン共鳴を含むがこれに限定されない任意の手段によって決定され得る。

【0089】

抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ又は抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖを含むＣＡＲを含む組成物は、本明細書に詳細に記載されるように、細胞送達組成物（例えば、トランスポゾン又はベクター）に組み込むことができ、任意に、細胞に組み込むことができる。

【0090】

本開示の組成物の接触及び／又は取り込みによって修飾された細胞（例えば、免疫細胞及び細胞傷害性免疫細胞）は、ＭＵＣ１発現細胞を特異的に標的とすることができる。本開示の方法の好ましい態様は、ＭＵＣ１－Ｃ（ＭＵＣ１－Ｃ＋）を発現する細胞の破壊を媒介する細胞傷害性細胞型をリダイレクトするためにＭＵＣ１－Ｃ ｓｃＦｖ結合剤を使用する。例えば、がんなどの増殖障害を治療するために、本開示の抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ又は抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する修飾された細胞は、インビボでの持続性及び抗腫瘍効果の改善を実証する。いくつかの態様において、本開示の抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ又は抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する修飾された細胞は、マウス抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ又はマウス抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する細胞と比較して、改良された効力及び低下した免疫原性を示す。いくつかの態様において、本開示の抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ又は抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する修飾された細胞は、配列番号１７６の重い可変領域及び配列番号１７７の軽い可変領域を含むｓｃＦｖ又はｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する細胞と比較して、改良された効力及び低下した免疫原性を示す。いくつかの態様において、本開示の抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ又は抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する修飾された細胞は、配列番号１７８の重い可変領域及び配列番号１７９の軽い可変領域を含むｓｃＦｖを発現する細胞、又はｓｃＦｖを含むＣＡＲと比較して、改良された効力及び低下した免疫原性を示す。いくつかの態様において、本開示の抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ又は抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する修飾された細胞は、配列番号１８０の重い可変領域及び配列番号１８１の軽い可変領域を含むｓｃＦｖを発現する細胞、又はそれを含むＣＡＲと比較して、改良された効力及び低下した免疫原性を示す。

【0091】

「Ｌ１Ｈ１」ｓｃＦｖは、配列番号５４の核酸配列によりコードされる配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ１」を含み、配列番号４８の核酸配列によりコードされる配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ１」を含む。「Ｌ１Ｈ１」ｓｃＦｖは、配列番号１４２の核酸配列によりコードされる配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。「Ｌ１Ｈ１」ＣＡＲは、配列番号３０の核酸配列によりコードされる配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

【0092】

「Ｌ１Ｈ１Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号５４又は配列番号１６５の核酸配列によりコードされる配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ１」を含み、配列番号４９又は配列番号１６４の核酸配列によりコードされる配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ１Ｂ」を含む。「Ｌ１Ｈ１Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号１４３又は配列番号１６６の核酸配列によりコードされる配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。「Ｌ１Ｈ１Ｂ」ＣＡＲは、配列番号３１又は配列番号１６７の核酸配列によりコードされる配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

【0093】

「Ｌ１Ｈ２」ｓｃＦｖは、配列番号５４の核酸配列によりコードされる配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ１」を含み、配列番号５０の核酸配列によりコードされる配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ２」を含む。「Ｌ１Ｈ２」ｓｃＦｖは、配列番号１４４の核酸配列によりコードされる配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。「Ｌ１Ｈ２」ＣＡＲは、配列番号３２の核酸配列によりコードされる配列番号１４のアミノ酸配列を含む。

【0094】

「Ｌ１Ｈ２Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号５４の核酸配列によりコードされる配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ１」を含み、配列番号５１の核酸配列によりコードされる配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ２Ｂ」を含む。「Ｌ１Ｈ２Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号１４５の核酸配列によりコードされる配列番号１２７のアミノ酸配列を含む。「Ｌ１Ｈ２Ｂ」ＣＡＲは、配列番号３３の核酸配列によりコードされる配列番号１５のアミノ酸配列を含む。

【0095】

「Ｌ１Ｈ３」ｓｃＦｖは、配列番号５４の核酸配列によりコードされる配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ１」を含み、配列番号５２の核酸配列によりコードされる配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ３」を含む。「Ｌ１Ｈ３」ｓｃＦｖは、配列番号１４６の核酸配列によりコードされる配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。「Ｌ１Ｈ３」ＣＡＲは、配列番号３４の核酸配列によりコードされる配列番号１６のアミノ酸配列を含む。

【0096】

「Ｌ１Ｈ４」ｓｃＦｖは、配列番号５４の核酸配列によりコードされる配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ１」を含み、配列番号５３の核酸配列によりコードされる配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ４」を含む。「Ｌ１Ｈ４」ｓｃＦｖは、配列番号１４７の核酸配列によりコードされる配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。「Ｌ１Ｈ４」ＣＡＲは、配列番号３５の核酸配列によりコードされる配列番号１７のアミノ酸配列を含む。

【0097】

「Ｌ２Ｈ１」ｓｃＦｖは、配列番号５５の核酸配列によりコードされる配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ２」を含み、配列番号４８の核酸配列によりコードされる配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ１」を含む。「Ｌ２Ｈ１」ｓｃＦｖは、配列番号１４８の核酸配列によりコードされる配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。「Ｌ２Ｈ１」ＣＡＲは、配列番号３６の核酸配列によりコードされる配列番号１８のアミノ酸配列を含む。

【0098】

「Ｌ２Ｈ１Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号５５の核酸配列によりコードされる配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ２」を含み、配列番号４９の核酸配列によりコードされる配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ１Ｂ」を含む。「Ｌ２Ｈ１Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号１４９の核酸配列によりコードされる配列番号１３１のアミノ酸配列を含む。「Ｌ２Ｈ１Ｂ」ＣＡＲは、配列番号３７の核酸配列によりコードされる配列番号１９のアミノ酸配列を含む。

【0099】

「Ｌ２Ｈ２」ｓｃＦｖは、配列番号５５の核酸配列によりコードされる配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ２」を含み、配列番号５０の核酸配列によりコードされる配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ２」を含む。「Ｌ２Ｈ２」ｓｃＦｖは、配列番号１５０の核酸配列によりコードされる配列番号１３２のアミノ酸配列を含む。「Ｌ２Ｈ２」ＣＡＲは、配列番号３８の核酸配列によりコードされる配列番号２０のアミノ酸配列を含む。

【0100】

「Ｌ２Ｈ２Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号５５の核酸配列によりコードされる配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ２」を含み、配列番号５１の核酸配列によりコードされる配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ２Ｂ」を含む。「Ｌ２Ｈ２Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号１５１の核酸配列によりコードされる配列番号１３３のアミノ酸配列を含む。「Ｌ２Ｈ２Ｂ」ＣＡＲは、配列番号３９の核酸配列によりコードされる配列番号２１のアミノ酸配列を含む。

【0101】

「Ｌ２Ｈ３」ｓｃＦｖは、配列番号５５の核酸配列によりコードされる配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ２」を含み、配列番号５２の核酸配列によりコードされる配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ３」を含む。「Ｌ２Ｈ３」ｓｃＦｖは、配列番号１５２の核酸配列によりコードされる配列番号１３４のアミノ酸配列を含む。「Ｌ２Ｈ３」ＣＡＲは、配列番号４０の核酸配列によりコードされる配列番号２２のアミノ酸配列を含む。

【0102】

「Ｌ２Ｈ４」ｓｃＦｖは、配列番号５５の核酸配列によりコードされる配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ２」を含み、配列番号５３の核酸配列によりコードされる配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ４」を含む。「Ｌ２Ｈ４」ｓｃＦｖは、配列番号１５３の核酸配列によりコードされる配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。「Ｌ２Ｈ４」ＣＡＲは、配列番号４１の核酸配列によりコードされる配列番号２３のアミノ酸配列を含む。

【0103】

「Ｌ３Ｈ１」ｓｃＦｖは、配列番号５６の核酸配列によりコードされる配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ３」を含み、配列番号４８の核酸配列によりコードされる配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ１」を含む。「Ｌ３Ｈ１」ｓｃＦｖは、配列番号１５４の核酸配列によりコードされる配列番号１３６のアミノ酸配列を含む。「Ｌ３Ｈ１」ＣＡＲは、配列番号４２の核酸配列によりコードされる配列番号２４のアミノ酸配列を含む。

【0104】

「Ｌ３Ｈ１Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号５６の核酸配列によりコードされる配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ３」を含み、配列番号４９の核酸配列によりコードされる配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ１Ｂ」を含む。「Ｌ３Ｈ１Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号１５５の核酸配列によりコードされる配列番号１３７のアミノ酸配列を含む。「Ｌ３Ｈ１Ｂ」ＣＡＲは、配列番号４３の核酸配列によりコードされる配列番号２５のアミノ酸配列を含む。

【0105】

「Ｌ３Ｈ２」ｓｃＦｖは、配列番号５６の核酸配列によりコードされる配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ３」を含み、配列番号５０の核酸配列によりコードされる配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ２」を含む。「Ｌ３Ｈ２」ｓｃＦｖは、配列番号１５６の核酸配列によりコードされる配列番号１３８のアミノ酸配列を含む。「Ｌ３Ｈ２」ＣＡＲは、配列番号４４の核酸配列によりコードされる配列番号２６のアミノ酸配列を含む。

【0106】

「Ｌ３Ｈ２Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号５６の核酸配列によりコードされる配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ３」を含み、配列番号５１の核酸配列によりコードされる配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ２Ｂ」を含む。「Ｌ３Ｈ２Ｂ」ｓｃＦｖは、配列番号１５７の核酸配列によりコードされる配列番号１３９のアミノ酸配列を含む。「Ｌ３Ｈ２Ｂ」ＣＡＲは、配列番号４５の核酸配列によりコードされる配列番号２７のアミノ酸配列を含む。

【0107】

「Ｌ３Ｈ３」ｓｃＦｖは、配列番号５６の核酸配列によりコードされる配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ３」を含み、配列番号５２の核酸配列によりコードされる配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ３」を含む。「Ｌ３Ｈ３」ｓｃＦｖは、配列番号１５８の核酸配列によりコードされる配列番号１４０のアミノ酸配列を含む。「Ｌ３Ｈ３」ＣＡＲは、配列番号４６の核酸配列によりコードされる配列番号２８のアミノ酸配列を含む。

【0108】

「Ｌ３Ｈ４」ｓｃＦｖは、配列番号５６の核酸配列によりコードされる配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域「Ｌ３」を含み、配列番号５３の核酸配列によりコードされる配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域「Ｈ４」を含む。「Ｌ３Ｈ４」ｓｃＦｖは、配列番号１５９の核酸配列によりコードされる配列番号１４１のアミノ酸配列を含む。「Ｌ３Ｈ４」ＣＡＲは、配列番号４７の核酸配列によりコードされる配列番号２９のアミノ酸配列を含む。

【0109】

表１Ａ及び表１Ｂは、本開示の例示的なＭＵＣ－１Ｃ ＣＡＲ成分及び配列を示す。

【0110】

【表1-1】

【0111】

【表1-2】

【0112】

【表1-3】

【0113】

【表1-4】

【0114】

【表1-5】

【0115】

【表1-6】

【0116】

【表1-7】

【0117】

【表1-8】

【0118】

【表2-1】

【0119】

【表2-2】

【0120】

本開示の細胞及び修飾された細胞
開示の細胞及び修飾された細胞は、哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、細胞及び修飾された細胞はヒト細胞である。開示の細胞及び修飾された細胞は、免疫細胞であり得る。本開示の免疫細胞は、リンパ系前駆細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、幹記憶Ｔ細胞（ＴＳＣＭ細胞）、中央記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ）、幹細胞様Ｔ細胞を、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、骨髄前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、血小板、赤血球、赤血球（ＲＢＣ）、巨核球又は破骨細胞含み得る。

【0121】

免疫前駆細胞は、１つ以上のタイプの免疫細胞に分化することができる任意の細胞を含むことができる。免疫前駆細胞は、自己再生し、免疫細胞に成長することができる多能性幹細胞を含むことができる。免疫前駆細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はその子孫を含むことができる。免疫前駆細胞は、免疫細胞に成長し得る前駆細胞を含み得る。免疫前駆細胞は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含むことができる。

【0122】

造血幹細胞（ＨＳＣ）は多能性自己再生細胞である。リンパ系及び骨髄系から分化したすべての血液細胞は、ＨＳＣから生じる。ＨＳＣは、成人骨髄、末梢血、動員末梢血、腹膜透析排出物及び臍帯血中に見出され得る。

【0123】

ＨＳＣは、単離され得るか、又は初代幹細胞又は培養幹細胞から誘導され得る。ＨＳＣは、胚性幹細胞、多能性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から単離又は誘導され得る。

【0124】

免疫前駆細胞は、ＨＳＣ又はＨＳＣ子孫細胞を含むことができる。ＨＳＣ子孫細胞の非限定的な例としては、多能性幹細胞、リンパ系前駆細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球細胞、Ｂリンパ球細胞、骨髄系前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球及びマクロファージが挙げられる。

【0125】

開示された方法によって産生されたＨＳＣは、成体幹細胞から単離又は由来し、かつ単一の系統にコミットされている間に、胚性幹細胞の特徴を共有する「原始的な」幹細胞の特徴を保持することができる。例えば、開示された方法によって生成された「原始的な」ＨＳＣは、分裂後の「幹性」を保持し、分化しない。従って、養子細胞治療として、開示された方法によって産生された「原始的」ＨＳＣは、それらの数を補充するだけでなく、インビボで拡大する。開示された方法によって産生された「原始的な」ＨＳＣは、単回投与として投与された場合に、治療的に有効であり得る。

【0126】

原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋であり得る。原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋及びＣＤ３８－であり得る。原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－及びＣＤ９０＋であり得る。原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋及びＣＤ４５ＲＡ－であり得る。原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－、及びＣＤ４９ｆ＋であり得る。原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－、及びＣＤ４９ｆ＋であり得る。

【0127】

原始的なＨＳＣ、ＨＳＣ、及び／又はＨＳＣの子孫細胞は、外因性配列（例えば、キメラ抗原受容体又は治療用タンパク質）を発現するために開示された方法に従って修飾することができる。修飾された原始的ＨＳＣ、修飾されたＨＳＣ、及び／又は修飾されたＨＳＣの子孫細胞は、修飾されたＴ細胞、修飾されたナチュラルキラー細胞、及び／又は修飾されたＢ細胞を含むが、これらに限定されない修飾された免疫細胞を産生するために前方分化され得る。

【0128】

修飾された免疫又は免疫前駆細胞は、ＮＫ細胞であり得る。ＮＫ細胞は、リンパ系前駆細胞から分化する細胞傷害性リンパ球であり得る。修飾されたＮＫ細胞は、修飾された造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）又は修飾されたＨＳＣから誘導され得る。いくつかの態様において、非活性化ＮＫ細胞は、ＣＤ３除去白血球アフェレーシス（ＣＤ１４／ＣＤ１９／ＣＤ５６＋細胞を含む）に由来する。

【0129】

修飾された免疫又は免疫前駆細胞は、Ｂ細胞であり得る。Ｂ細胞は、細胞表面にＢ細胞受容体を発現するリンパ球の一種である。Ｂ細胞受容体は特異抗原に結合する。修飾されたＢ細胞は、修飾された造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）又は修飾されたＨＳＣから誘導され得る。

【0130】

本開示の修飾されたＴ細胞は、修飾された造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）又は修飾されたＨＳＣから誘導され得る。従来の生物学的製剤及び化学療法剤とは異なり、開示された修飾Ｔ細胞は、抗原認識時に迅速に再現する能力を有し、それによって、再治療の必要性を潜在的に回避する。これを達成するために、いくつかの実施形態において、修飾された－Ｔ細胞は、初期応答を駆動するだけでなく、生存可能な記憶Ｔ細胞の安定した集団として患者に存続し、潜在的な再発を防止する。あるいは、いくつかの態様において、それが望ましくない場合、修飾されたＴ細胞は、患者において存続しない。

【0131】

抗原非依存性（強直性）シグナル伝達を介してＴ細胞の消耗を引き起こさない抗原受容体分子の開発、ならびに早期記憶Ｔ細胞、特に幹細胞記憶（Ｔ_ＳＣＭ）又は幹細胞様Ｔ細胞を含む修飾Ｔ細胞産物の開発に集中的な努力がなされている。本開示の幹細胞様修飾Ｔ細胞は、中枢記憶（Ｔ_ＣＭ）Ｔ細胞又はＴ_ＣＭ細胞、エフェクター記憶（Ｔ_ＥＭ）及びエフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）のようなＴＯＢ細胞を誘導するための最大の自己再生能力及び多能性能力を示し、それにより良好な腫瘍根絶及び長期修飾Ｔ細胞生着を産生する。分化の線形経路は、これらの細胞の生成に関与している可能性がある：ナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）＞Ｔ_ＳＣＭ＞Ｔ_ＣＭ＞Ｔ_ＥＭ＞Ｔ_Ｅ＞Ｔ_ＴＥ、それによってＴ_Ｎは直接Ｔ_ＳＣＭを生じる親前駆細胞であり、次に、直接Ｔ_ＣＭ等を生じる。本開示のＴ細胞の組成物は、最も豊富なＴ_ＳＣＭ細胞（例えば、Ｔ_ＳＣＭ＞Ｔ_ＣＭ＞Ｔ_ＥＭ＞ＴＯ_Ｅ＞Ｔ_ＴＥ）を有する各親Ｔ細胞サブセットの１つ以上を含むことができる。

【0132】

免疫細胞前駆体は、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）、Ｔ_ＳＣＭ、Ｔ_ＣＭ、Ｔ_ＥＭ、Ｔ_Ｅ、又はＴ_ＴＥに分化することができ、又はそれに分化することができる。免疫細胞前駆体は、本開示の原始ＨＳＣ、ＨＳＣ、又はＨＳＣ子孫細胞であり得る。免疫細胞は、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）、Ｔ_ＳＣＭ、Ｔ_ＣＭ、Ｔ_ＥＭ、Ｔ_Ｅ、又はＴ_ＴＥであり得る。

【0133】

本開示の方法は、修飾されたＴ細胞の集団を修飾及び／又は産生することができ、ここで、集団中の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意のパーセンテージが、初期記憶Ｔ細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。修飾された早期記憶Ｔ細胞の集団は、複数の修飾された幹細胞様Ｔ細胞を含む。修飾された初期記憶Ｔ細胞の集団は、複数の修飾されたＴ_ＳＣＭ細胞を含む。修飾された初期記憶Ｔ細胞の集団は、複数の修飾されたＴ_ＣＭ細胞を含む。

【0134】

本開示の方法は、修飾されたＴ細胞の集団を修飾及び／又は産生することができ、ここで、集団中の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意のパーセンテージが、幹細胞様Ｔ細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。修飾された幹細胞様Ｔ細胞の集団は、複数の修飾されたＴ_ＳＣＭ細胞を含む。修飾された幹細胞様Ｔ細胞の集団は、複数の修飾されたＴ_ＣＭ細胞を含む。

【0135】

いくつかの態様では集団における複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％、又はその間の任意のパーセンテージが、幹記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）又はＴ_ＳＣＭ様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し；１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを含む。細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５及びＩＬ－２Ｒβのうちの１つ以上を含むことができる。細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌのうちの１つ以上を含むことができる。

【0136】

いくつかの態様では集団における複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が、中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）又はＴ_ＣＭ様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し；１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌを含む。細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌのうちの１つ以上を含むことができる。

【0137】

本開示の方法は、修飾されたＴ細胞の集団を修飾及び／又は産生することができ、ここで、集団中の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意のパーセンテージが、ナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）の１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌのうちの１つ以上を含むことができる。

【0138】

本開示の方法は、修飾されたＴ細胞の集団を修飾及び／又は産生することができ、ここで、集団中の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意のパーセンテージが、エフェクターＴ細胞（修飾Ｔ_ＥＦＦ）の１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、及びＩＬ－２Ｒβの１つ以上を含むことができる。

【0139】

本開示の方法は、修飾されたＴ細胞の集団を修飾及び／又は産生することができ、ここで、集団中の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はその間の任意のパーセンテージが、幹細胞様Ｔ細胞、幹記憶Ｔ細胞の（Ｔ_ＳＣＭ）又は中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）の１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。

【0140】

集団の複数の修飾細胞は、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列（例えば、ＣＡＲ）を含み、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％の集団の複数の細胞が、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列を含み、集団の複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は又はその間の任意のパーセンテージが、幹細胞様Ｔ細胞、幹記憶Ｔ細胞の（Ｔ_ＳＣＭ）又は中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）の１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの態様において、ＣＡＲは、配列番号３１又は配列番号１６７の核酸配列によりコードされる配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

【0141】

集団の複数の修飾細胞は、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列（例えば、ＣＡＲ）を含み、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％の集団の複数の細胞が、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列を含み、修飾細胞の集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％がＣＤ３４を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するか、又は修飾細胞の集団の少なくとも約７０％～約９９％、約７５％～約９５％、又は約８５％～約９５％が、ＣＤ３４を含む１つ以上の細胞表面マーカー（例えば、細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋を含む）を発現する。

【0142】

集団の複数の修飾細胞は、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列（例えば、ＣＡＲ）を含み、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％の集団の複数の細胞が、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列を含み、修飾細胞の集団の少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％がＣＤ３４を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するが、ＣＤ３８を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現しないか、又は修飾細胞の集団の少なくとも約４５％～約９０％、約５０％～約８０％、又は約６５％～約７５％がＣＤ３４を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するが、ＣＤ３８を含む１つ以上の細胞表面マーカー（例えば、細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋及びＣＤ３８－を含む）を発現しない。

【0143】

集団の複数の修飾細胞は、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列（例えば、ＣＡＲ）を含み、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％の集団の複数の細胞が、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列を含み、修飾細胞の集団の少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％が、ＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するが、ＣＤ３８を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現しないか、又は修飾細胞の集団の少なくとも約０．２％～約４０％、約０．２％～約３０％、約０．２％～約２％、又は０．５％～約１．５％が、ＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するが、ＣＤ３８を含む１つ以上の細胞表面マーカー（例えば、細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－及びＣＤ９０＋を含む）を発現しない。

【0144】

集団の複数の修飾細胞は、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列（例えば、ＣＡＲ）を含み、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％の集団の複数の細胞が、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列を含み、修飾細胞の集団の少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％が、ＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するが、ＣＤ３８及びＣＤ４５ＲＡを含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現しないか、又は修飾細胞の集団の少なくとも約０．２％～約４０％、約０．２％～約３０％、約０．２％～約２％、又は０．５％～約１．５％がＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するが、ＣＤ３８及びＣＤ４５ＲＡを含む１つ以上の細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋及びＣＤ４５ＲＡ－を含む）を発現しない。

【0145】

集団の複数の修飾細胞は、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列（例えば、ＣＡＲ）を含み、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％の集団の複数の細胞が、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列を含み、修飾細胞の集団の少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％が、ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４９ｆを含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するが、ＣＤ３８及びＣＤ４５ＲＡを含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現しないか、又は修飾細胞の集団の少なくとも約０．０２％～約３０％、約０．０２％～約２％、約０．０４％～約２％又は約０．０４％～約１％がＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４９ｆを含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するが、ＣＤ３８及びＣＤ４５ＲＡを含む１つ以上の細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－及びＣＤ４９＋を含む）を発現しない。

【0146】

集団の複数の修飾細胞は、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列（例えば、ＣＡＲ）を含み、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％の集団の複数の細胞が、導入遺伝子又は導入遺伝子をコードする配列を含み、修飾細胞の集団の少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％又は１００％が、ＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するが、ＣＤ４５ＲＡを含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現しないか、又は修飾細胞の集団の少なくとも約０．２％～約５％、約０．２％～約３％又は約０．４％～約３％がＣＤ３４及びＣＤ９０を含む１つ以上の細胞表面マーカーを発現するが、ＣＤ４５ＲＡを含む１つ以上の細胞表面マーカー表現型ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋及びＣＤ４５ＲＡ－を含む）を発現しない。

【0147】

免疫細胞又は免疫前駆細胞（例えば、開示された修飾されたＴ細胞）を産生及び／又は拡大する組成物及び方法、ならびに免疫細胞又は免疫前駆細胞（例えば、開示された修飾されたＴ細胞）の細胞生存率及び／又は幹様表現型を維持又は増強するための緩衝液は、本明細書の他の箇所に開示されており、米国特許第１０，３２９，５４３号及びＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６にさらに詳細に開示されている。

【0148】

開示の細胞及び修飾された細胞は、体細胞であり得る。開示の細胞及び修飾された細胞は、分化細胞であり得る。開示の細胞及び修飾された細胞は、自家細胞又は同種細胞であり得る。同種細胞は、対象への投与後の生着に対する有害反応を防止するように操作される。同種細胞は、任意の種類の細胞であり得る。同種細胞は、幹細胞であってもよく、幹細胞由来であってもよい。同種細胞は、分化した体細胞であり得る。

【0149】

キメラ抗原受容体の発現方法
本開示は、細胞の表面上にＣＡＲを発現する方法を提供する。本方法は、（ａ）細胞集団を得ること；（ｂ）細胞集団を、細胞集団中の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切ってＣＡＲを伝達するのに十分な条件下で、ＣＡＲ又はＣＡＲをコードする配列を含む組成物に接触させ、それによって修飾された細胞集団を生成すること；（ｃ）ＣＡＲをコードする配列の統合に適した条件下で修飾された細胞集団を培養すること；及び（ｄ）細胞表面上でＣＡＲを発現する修飾された細胞集団から少なくとも１つの細胞を拡大及び／又は選択することを含む。

【0150】

いくつかの態様において、細胞集団は、白血球及び／又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋白血球を含むことができる。細胞集団は、最適化された比率でＣＤ４＋及びＣＤ８＋白血球を含むことができる。ＣＤ４＋対ＣＤ８＋白血球の最適化された比率は、インビボでは自然には生じない。細胞集団は、腫瘍細胞を含むことができる。

【0151】

いくつかの態様において、細胞集団中の少なくとも１つの細胞の細胞膜を横切ってＣＡＲ又はＣＡＲ、トランスポゾン、又はベクターをコードする配列を伝達するのに十分な条件は、特定の電圧における１つ以上の電気パルス、緩衝液、及び１つ以上の補助因子の印加のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲをコードする配列の統合に適した条件は、緩衝液及び１つ以上の補助因子のうちの少なくとも１つを含む。

【0152】

緩衝液は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓｓ、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。１つ以上の補助因子は、（ａ）組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン又はそれらの任意の組合せ；（ｂ）塩、鉱物、代謝物又はそれらの任意の組合せ；（ｃ）細胞培地；（ｄ）細胞ＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達の阻害剤、１つ以上のアポトーシス経路又はそれらの組合せ；及び（ｅ）１つ以上の核酸を修飾又は安定化する試薬を含み得る。組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はそれらの任意の組み合わせは、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１アルファ／ＩＬ－１Ｆ１、ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１Ｆ２、ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－３５ ｐ３５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７／ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８／ＩＬ－１Ｆ４、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－３２、ＩＬ－３２ベータ、ＩＬ－３２ガンマ、ＩＬ－３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ－ベータ１）、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ Ｌ、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。塩、ミネラル、代謝産物、又はそれらの任意の組み合わせは、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調整剤、アール塩、２－メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＰＬＵＳサプリメント、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ_２、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮＡＨ_２ＰＯ_４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ_３）_２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１８１、ポロキサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、Ｃｒｏｗｎ－５、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞培地は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、Ｘ－ＶＩＶＯ １５、ＣｅｌｌＧｒｏ ＤＣ培地、ＣＴＳ ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ Ｔ細胞拡大ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ細胞増殖培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ Ｔ細胞増殖培地又はその任意の組み合わせを含むことができる。細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、１つ以上のアポトーシス経路又はそれらの組み合わせの阻害剤は、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ－７、ＮＦ－κＢ、１型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ－３、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、ＲＩＧ－１、ＩＰＳ－１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、Ｃａｓｐａｓｅ１、Ｐｒｏ－ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）（例えば、ＴＷＳ１１９）の阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせを含む。このような阻害剤の例としては、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ－ＹＶＡＤ－ＣＭＫ、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫ、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。１つ以上の核酸を修飾又は安定化する試薬は、ｐＨ修飾剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を伴う又は伴わない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素又はそれらの任意の組合せを含む。

【0153】

拡大及び選択ステップは、同時又は連続的に行うことができる。この拡大は、選択の前に行うことができます。この拡大は、選択後に起こり得、任意に、さらなる（すなわち、第２の）選択が、拡大後に起こり得る。同時展開と選択が同時に可能である。拡大及び／又は選択ステップは、１０～１４日間（端点を含む）進行することができる。

【0154】

この拡大は、修飾された細胞集団の少なくとも１つの細胞を抗原と接触させて、ＣＡＲを介して少なくとも１つの細胞を刺激し、それによって拡大された細胞集団を生成することを含むことができる。抗原は、基質の表面上に提示することができる。基質は、限定されるものではないが、表面、ウェル、ビーズ又は複数、及びマトリックスを含む任意の形態を有することができる。基質は、常磁性又は磁性成分をさらに含むことができる。抗原は、基質の表面上に提示することができ、ここで、基質は、磁性ビーズであり、ここで、磁性ビーズを、修飾され拡大された細胞集団から除去又は分離するために使用することができる。抗原は、細胞又は人工抗原提示細胞の表面上に提示することができる。人工抗原提示細胞は、限定されるものではないが、腫瘍細胞及び幹細胞を含むことができる。

【0155】

トランスポゾン又はベクターが選択遺伝子を含むいくつかの態様において、選択工程は、選択遺伝子が抵抗性を付与する化合物と、修飾された細胞集団の少なくとも１つの細胞を接触させる工程を含み、それによって、選択遺伝子を発現する細胞を選択の生存として同定し、選択遺伝子を発現しない細胞を選択工程に耐えられないものとして同定する。

【0156】

本開示は、本明細書に記載される方法の修飾、拡大及び選択された細胞集団を含む組成物を提供する。

【0157】

細胞の表面上にＣＡＲを発現する方法のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／０４９８１６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されている。

【0158】

本開示は、細胞が（ａ）誘導性プロモーターをコードする配列及び導入遺伝子をコードする配列を含む誘導性導入遺伝子構築物、及び（ｂ）構成的プロモーターをコードする配列及びＣＡＲなどの外因性受容体をコードする配列を含む受容体構築物を含む組成物を含む、細胞又は細胞集団を提供し、ここで、（ａ）の構築物及び（ｂ）の構築物が細胞のゲノム配列に組み込まれると、外因性受容体が発現され、外因性受容体は、リガンド又は抗原に結合すると、誘導性導入遺伝子（ａ）の発現を調節する誘導性プロモーターを直接的又は間接的に標的とする細胞内シグナルを伝達して、遺伝子発現を修飾する。

【0159】

組成物は、遺伝子発現を減少させることによって遺伝子発現を修飾することができる。組成物は、遺伝子発現を一時的に修飾することによって遺伝子発現を修飾することができる（例えば、リガンドの外因性受容体への結合期間）。組成物は、遺伝子発現を急性的に修飾することができる（例えば、リガンドは、外因性受容体に可逆的に結合する）。組成物は、遺伝子発現を慢性的に修飾することができる（例えば、リガンドは、外因性受容体に不可逆的に結合する）。

【0160】

外因性受容体は、細胞のゲノム配列に関して内因性受容体を含み得る。受容体の例としては、細胞内受容体、細胞表面受容体、膜貫通受容体、リガンド依存性イオンチャネル、及びＧ－タンパク質共役受容体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0161】

外因性受容体は、非天然に存在する受容体を含むことができる。非天然型受容体は、合成、修飾、組換え、突然変異又はキメラ受容体であり得る。非天然に存在する受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）から単離又は誘導された１つ以上の配列を含むことができる。非天然に存在する受容体は、足場タンパク質から単離された、又は誘導された１つ以上の配列を含むことができる。非天然型受容体が膜貫通ドメインを含まないものを含むいくつかの態様において、非天然型受容体は、非天然型受容体との接触後に細胞内シグナルを伝達する第２の膜貫通型、膜結合型及び／又は細胞内受容体と相互作用する。非天然受容体は、膜貫通ドメインを含むことができる。非天然型受容体は、細胞内シグナルを伝達する細胞内受容体と相互作用することができる。非天然型受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。非天然に存在する受容体は、キメラリガンド受容体（ＣＬＲ）であり得る。ＣＬＲは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。

【0162】

誘導性プロモーターをコードする配列は、ＮＦκＢプロモーターをコードする配列、インターフェロンプロモーターをコードする配列、又はインターロイキン－２プロモーターをコードする配列を含む。いくつかの態様において、ＩＦＮプロモーターは、ＩＦＮγプロモーターである。誘導性プロモーターは、サイトカイン又はケモカインのプロモーターから単離又は誘導することができる。サイトカイン又はケモカインは、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、コロニー刺激因子２（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、ＬＴα、パーフォリン、グランザイムＣ（Ｇｚｍｃ）、グランザイムＢ（Ｇｚｍｂ）、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド４（Ｃｃｌ４）、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド３（Ｃｃｌ３）、Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（Ｘｃｌ１）、又はＬＩＦインターロイキン６ファミリーサイトカイン（Ｌｉｆ）を含むことができる。

【0163】

誘導性プロモーターは、細胞分化、活性化、消耗及び機能に関与する表面タンパク質を含む遺伝子のプロモーターから単離又は誘導することができる。いくつかの態様では、遺伝子は、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＧＩＴＲ、ＭＨＣＩＩ、ＣＯＸ－２、ＦＡＳＬ又は４－１ＢＢを含む。

【0164】

誘導性プロモーターは、ＣＤの代謝及び分化に関与する遺伝子のプロモーターから単離又は誘導することができる。誘導性プロモーターは、Ｎｒ４ａ１、Ｎｒ４ａ３、Ｔｎｆｒｓｆ９（４－１ＢＢ）、Ｓｅｍａ７ａ、Ｚｆｐ３６ｌ２、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｄｕｓｐ５、Ｄｕｓｐ６及びＮｅｔｏ２のプロモーターから単離又は誘導することができる。

【0165】

いくつかの態様において、誘導性導入遺伝子構築物は、抑制性チェックポイントシグナル、転写因子、サイトカイン又はサイトカイン受容体、ケモカイン又はケモカイン受容体、細胞死又はアポトーシス受容体／リガンド、代謝感知分子、がん治療に対する感受性を付与するタンパク質、及びがん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の下流のシグナル伝達成分の発現を含むか又は発現を駆動する。その非限定的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されている。

【0166】

本開示は、本開示のＣＡＲを含む組成物又は複数の修飾されたＴ細胞を産生するために同じものをコードする配列からなる、本開示のＣＡＲを含む組成物を複数の初代ヒトＴ細胞に導入することからなる、又はそれからなる修飾されたＴ細胞集団を産生する方法を提供する。本開示は、本方法によって産生された修飾されたＴ細胞の集団を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が、本開示のＣＡＲを発現する。

【0167】

武装化細胞
開示の修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）は、その治療可能性を高めるためにさらに修飾され得る。あるいは又は加えて、修飾された細胞をさらに修飾して、それらを免疫学的及び／又は代謝的チェックポイントに対する感受性を低下させることができる。このタイプの「被覆」細胞の修飾は、修飾に続いて、ここでは「被覆」細胞（例えば、被覆Ｔ細胞）と呼ばれ得る。装着細胞は、腫瘍免疫抑制微小環境内で、例えば、細胞に送達される特定のチェックポイントシグナルを自然に遮断及び／又は希釈することによって生成され得る（例えば、チェックポイント阻害）。

【0168】

本開示の武装化細胞は、任意の細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血前駆細胞、末梢血由来Ｔ細胞（Ｇ－ＣＳＦ動員末梢血由来のＴ細胞を含む）、又は臍帯血由来のＴ細胞から誘導することができる。武装化細胞（例えば、武装化Ｔ細胞）は、キメラリガンド受容体（タンパク質足場、抗体、Ｓｃａｎ Ｆｖ、又は抗体模倣体を含むＣＬＲ）／キメラ抗原受容体（タンパク質足場、抗体、Ｓｃａｎ Ｆｖ、又は抗体模倣体を含むＣＡＲ）、ＣＡＲＴｙｒｉｎ（Ｃｅｎｔｙｒｉｎを含むＣＡＲ）、及び／又はＶＣＡＲ（ラクダＶＨＨ又は単一ドメインＶＨを含むＣＡＲ）のうちの１つ以上を含み得る。武装化細胞（例えば、武装化Ｔ細胞）は、本明細書に開示されているように、誘導可能なアポトーシス促進性ポリペプチドを含むことができる。武装化細胞（例えば、武装化Ｔ細胞）は、外因性配列を含み得る。外因性配列は、治療用タンパク質をコードする配列を含むことができる。例示的な治療タンパク質は、核タンパク質、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞表面結合タンパク質、又は分泌タンパク質であり得る。武装化細胞によって発現される例示的な治療タンパク質（例えば、武装化Ｔ細胞）は、武装化細胞の活性を修飾し得るか、又は第２の細胞の活性を修飾し得る。武装化細胞（例えば、武装化Ｔ細胞）は、選択遺伝子又は選択マーカーを含み得る。武装化細胞（例えば、武装化Ｔ細胞）は、合成遺伝子発現カセット（本明細書では誘導性導入遺伝子構築物とも呼ばれる）を含むことができる。

【0169】

開示の修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、抑制性チェックポイントシグナルの受容体をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）をサイレンシングし、又は発現を減少させて、武装化細胞（例えば、武装化ＣＡＲ Ｔ細胞）を生成することができる。抑制性チェックポイントシグナルの受容体は、細胞表面又は細胞の細胞質内で発現される。抑制性チェックポイントシグナルの受容体をコードする遺伝子のサイレンシング又は発現の減少は、被覆細胞の表面又は細胞質内の抑制性チェックポイント受容体のタンパク質発現の喪失をもたらす。このように、抑制性チェックポイント受容体をコードする１つ以上の遺伝子のサイレンシングされた又は減少された発現を有する武装化細胞は、チェックポイントシグナルに対して抵抗性、非受容性又は非感受性である。抑制性チェックポイントシグナルに対する武装化細胞の抵抗性又は感受性の低下は、これらの抑制性チェックポイントシグナルの存在下で武装化細胞の治療可能性を高める。抑制性チェックポイントシグナル（及び免疫抑制を誘導するタンパク質）の非限定的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。抑制され得る抑制性チェックポイントシグナルの好ましい例としては、ＰＤ－１及びＴＧＦβＲＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。

【0170】

開示の修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、チェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子（例えば、武装化ＣＡＲ Ｔ細胞）をサイレンシングし、又は発現を減少させて、武装化細胞（例えば、武装化ＣＡＲ Ｔ細胞）を生成することができる。修飾された細胞の活性は、チェックポイントシグナル伝達経路に関与する任意の細胞内シグナル伝達タンパク質を標的とすることによって増強され得、それによって、チェックポイント阻害又は１つ以上のチェックポイント経路への干渉を達成し得る。チェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内シグナル伝達タンパク質の非限定的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。

【0171】

開示の修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）は、武装化細胞（例えば、武装化ＣＡＲ Ｔ細胞）を産生する治療の効力を妨げる転写因子をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）の不活性化又は発現の減少のためにさらに修飾され得る。修飾された細胞の活性は、治療の効力を妨げる転写因子の発現をサイレンシング又は減少させる（又は機能を抑制する）ことによって増強又は調節され得る。発現を抑制するか、発現を減少させるか、又はその機能を抑制するように修飾され得る転写因子の非限定的な例には、限定されるものではないが、例示的な転写因子が、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。

【0172】

開示の修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、細胞死又は細胞アポトーシス受容体をコードする１つ以上の遺伝子の発現を抑制又は減少させて、武装化細胞（例えば、武装化ＣＡＲ Ｔ細胞）を生成することができる。死受容体とその内因性リガンドとの相互作用は、アポトーシスの開始をもたらす。細胞死及び／又は細胞アポトーシス受容体及び／又はリガンドの発現、活性、又は相互作用の破壊は、修飾された細胞を死シグナルに対する受容性を低下させ、その結果、被覆細胞を腫瘍環境においてより効果的にする。細胞死及び／又は細胞アポトーシス受容体及びリガンドの非限定的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。修飾され得る細胞死受容体の好ましい例は、Ｆａｓ（ＣＤ９５）である。

【0173】

開示の修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、代謝感知タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）の発現を抑制又は減少させて、武装化細胞（例えば、武装化ＣＡＲ Ｔ細胞）を生成することができる。修飾された細胞による免疫抑制性腫瘍微小環境（低レベルの酸素、ｐＨ、グルコース及び他の分子によって特徴づけられる）の代謝感知の破壊は、Ｔ細胞機能の延長された保持をもたらし、その結果、細胞当たりにより多くの腫瘍細胞が死滅される。代謝感知遺伝子及びタンパク質の非限定的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。好ましい例として、ＨＩＦ１ａ及びＶＨＬは、低酸素環境下でＴ細胞機能において役割を果たす。武装化Ｔ細胞は、ＨＩＦ１ａ又はＶＨＬをコードする１つ又は複数の遺伝子の発現を抑制又は低下させていてもよい。

【0174】

開示の修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）は、さらに修飾されて、モノクローナル抗体を含むがん治療に対する感受性を付与するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子（例えば、被覆ＣＡＲ Ｔ細胞）をサイレンシングし、又は発現を減少させて、被覆細胞（例えば、被覆ＣＡＲ Ｔ細胞）を産生することができる。したがって、武装化細胞は、がん治療（例えば、化学療法、モノクローナル抗体療法、又は他の抗腫瘍治療）の存在下で機能し、優れた機能又は有効性を示すことができる。がん治療に対する感受性を付与することに関与するタンパク質の非限定的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。

【0175】

開示された修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、増殖優位因子をコードする１つ以上の遺伝子（複数可）の発現を抑制又は減少させて、武装化細胞（例えば、武装化ＣＡＲ Ｔ細胞）を生成することができる。がん遺伝子の発現をサイレンシングしたり、発現を減少させたりすると、細胞の増殖に有利に働くことができる。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞製造プロセス中にＴＥＴ２遺伝子の発現をサイレンシング又は減少させる（例えば、発現を破壊する）ことは、この拡大能力を欠く非武装化ＣＡＲ Ｔ細胞と比較した場合、腫瘍の拡大及びその後の根絶のための有意な能力を有する武装化ＣＡＲ Ｔ細胞の生成をもたらす。この戦略は、対象からの有害反応又は武装化ＣＡＲ Ｔ－細胞の制御されない増殖の場合に武装化ＣＡＲ Ｔ－細胞の標的破壊を可能にする安全スイッチ（例えば、本明細書中に記載されるｉＣ９安全スイッチ）に連結され得る。増殖優位因子の非限定的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。

【0176】

開示の修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、修飾された／キメラチェックポイント受容体を発現させて、本開示の武装化Ｔ細胞を生成することができる。

【0177】

修飾／キメラチェックポイント受容体は、ヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体を含むことができる。ヌル受容体、デコイ受容体又はドミナントネガティブ受容体は、修飾／キメラ受容体／タンパク質であり得る。ヌル受容体、デコイ受容体又はドミナントネガティブ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインの発現のために切断され得る。別法として、又はさらに、ヌル受容体、デコイ受容体又はドミナントネガティブ受容体は、決定的であるか、又は効果的なシグナル伝達に必要とされる１つ以上のアミノ酸位置において、細胞内シグナル伝達ドメイン内で突然変異され得る。ヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体の切断又は突然変異は、受容体のチェックポイントシグナルを細胞又は細胞内に伝達又は伝達する能力の喪失をもたらすことがある。

【0178】

例えば、腫瘍細胞の表面上に発現されるＰＤ－Ｌ１受容体からの免疫抑制チェックポイントシグナルの希釈又は遮断は、武装化細胞（例えば、武装化ＣＡＲ Ｔ細胞）の表面上に修飾／キメラＰＤ－１ヌル受容体を発現することによって達成することができ、これは、武装化細胞の表面上に発現される内因性（非修飾）ＰＤ－１受容体とも効果的に競合し、武装化細胞の内因性ＰＤ－１受容体を介して免疫抑制チェックポイントシグナルの形質導入を減少又は阻害する。この非限定的な例において、腫瘍細胞上に発現されるＰＤ－Ｌ１への結合についての２つの異なる受容体間の競合は、有効なチェックポイントシグナル伝達のレベルを減少又は減少させ、それによって、ＰＤ－１ヌル受容体を発現する武装化細胞の治療可能性を増強する。

【0179】

修飾／キメラチェックポイント受容体は、膜貫通受容体、膜結合型若しくは膜結合型受容体／タンパク質、又は細胞内受容体／タンパク質であるヌル受容体、デコイ受容体、又はドミナントネガティブ受容体を含み得る。例示的なヌル、デコイ、又はドミナントネガティブな細胞内受容体／タンパク質には、抑制性チェックポイントシグナルの下流のシグナル伝達成分、転写因子、サイトカイン又はサイトカイン受容体、ケモカイン又はケモカイン受容体、細胞死又はアポトーシス受容体／リガンド、代謝感知分子、癌治療に対する感受性を付与するタンパク質、及び癌遺伝子又は癌抑制遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン及びケモカイン受容体の非限定的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。

【0180】

修飾／キメラチェックポイント受容体は、スイッチ受容体を含むことができる。例示的スイッチ受容体は、修飾された／キメラ受容体／タンパク質を含み、ここで、天然型又は野生型細胞内シグナル伝達ドメインは、タンパク質に対して非天然であるか、及び／又は野生型ドメインではない、異なる細胞内シグナル伝達ドメインと切り替えられるか、又は置き換えられる。例えば、抑制性シグナル伝達ドメインを刺激性シグナル伝達ドメインに置き換えると、免疫抑制性シグナルを免疫刺激性シグナルに切り替えることになる。あるいは、阻害性シグナル伝達ドメインを異なる阻害性ドメインに置き換えることによって、阻害性シグナル伝達のレベルを低下又は増強することができる。スイッチ受容体の発現又は過剰発現は、免疫抑制性腫瘍微小環境内で発現される同族チェックポイント受容体に結合するための内因性野生型チェックポイント受容体（スイッチ受容体ではない）との競合を介して、同族チェックポイントシグナルの希釈及び／又は遮断をもたらすことができる。武装化細胞（例えば、武装化ＣＡＲ Ｔ細胞）は、１つ以上のスイッチ受容体の発現を導き、結果的に武装化細胞の活性を変化させるスイッチ受容体をコードする配列を含み得る。武装化細胞（例えば、武装化ＣＡＲ Ｔ細胞）は、チェックポイント受容体、転写因子、サイトカイン受容体、死受容体、代謝感知分子、がん治療、がん遺伝子、及び／又は腫瘍抑制タンパク質又は遺伝子の下流で細胞内に発現されるタンパク質を標的とするスイッチ受容体を発現することができる。

【0181】

例示的スイッチ受容体は、限定されるものではないが、抑制性チェックポイントシグナルの下流のシグナル伝達成分、転写因子、サイトカイン又はサイトカイン受容体、ケモカイン又はケモカイン受容体、細胞死又はアポトーシス受容体／リガンド、代謝感知分子、がん治療に対する感受性を付与するタンパク質、及びがん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子を含むタンパク質を含み得るか、又はそれらから誘導され得る。

【0182】

開示の修飾された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）をさらに修飾して、条件的遺伝子発現を媒介するＣＬＲ／ＣＡＲを発現させて、武装化Ｔ細胞を生成することができる。ＣＬＲ／ＣＡＲと被覆Ｔ細胞の核内の条件遺伝子発現系との組み合わせは、ＣＬＲ又は同族抗原とＣＡＲとの同族リガンドの結合時に条件的に活性化される合成遺伝子発現系を構成する。このシステムは、例えば、腫瘍環境において、又は腫瘍環境内において、リガンド又は抗原結合部位での合成遺伝子発現を減少又は制限することによって、「被覆」を助け、又は修飾されたＴ細胞の治療可能性を増強することができる。

【0183】

遺伝子編集組成及び方法
導入遺伝子を細胞に導入することによって修飾された細胞が生成される。導入工程は、核酸配列、導入遺伝子、及び／又は非転移送達システムを介したゲノム編集構築物の送達を含み得る。

【0184】

核酸配列、トランスジーン及び／又はゲノム編集構築物をエクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで細胞に導入することは、局所送達、吸着、吸収、エレクトロポレーション、スピンフェクション、共培養、トランスフェクション、機械的送達、音波送達、振動送達、マグネトフェクション、又はナノ粒子媒介送達による。核酸配列、導入遺伝子及び／又はゲノムエディティング構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで細胞に導入することは、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、遺伝子トランスフェクション、及びデンドリマー媒介トランスフェクションを含むことができる。核酸配列、導入遺伝子、及び／又はゲノム編集構築物を、機械的トランスフェクションにより、エクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで細胞に導入することは、細胞スクイージング、細胞衝撃、又は遺伝子銃技術を含むことができる。核酸配列、導入遺伝子及び／又はゲノムエディティング構築物を、ナノ粒子媒介トランスフェクションにより、エクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで細胞に導入することは、リポソーム送達、ミセルによる送達、及びポリメロソームによる送達を含むことができる。

【0185】

核酸配列、導入遺伝子及び／又はゲノムエディティング構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで細胞に導入することは、非ウイルスベクターを含むことができる。非ウイルスベクターは、核酸を含むことができる。非ウイルスベクターは、プラスミドＤＮＡ、直鎖二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、直鎖一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ（商標）ＤＮＡ、ナノプラスミド、ミニサークルＤＮＡ、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、ＤＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、及び二本鎖ｍＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むことができる。非ウイルスベクターは、本明細書に記載されるようなトランスポゾンを含むことができる。

【0186】

核酸配列、導入遺伝子及び／又はゲノムエディティング構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで細胞に導入することは、ウイルスベクターを含むことができる。ウイルスベクターは、非組込み非染色体ベクターであり得る。非組込み非染色体ベクターの非限定的な例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、及びヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスベクターは組込み染色体ベクターであり得る。染色体ベクターを組み込む非限定的な例としては、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルス、及びγ－レトロウイルスが挙げられる。

【0187】

核酸配列、導入遺伝子及び／又はゲノムエディティング構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで細胞に導入することは、ベクターの組み合わせを含むことができる。ベクターの組合せの非限定的な例には、ウイルスベクター及び非ウイルスベクター、複数の非ウイルスベクター、又は複数のウイルスベクターが含まれる。ベクターの組み合わせの非限定的な例としては、ＤＮＡ由来ベクターとＲＮＡ由来ベクターとの組み合わせ、ＲＮＡと逆転写酵素との組み合わせ、トランスポゾンとトランスポゼースとの組み合わせ、非ウイルスベクターとエンドヌクレアーゼとの組み合わせ、及びウイルスベクターとエンドヌクレアーゼとの組み合わせが挙げられる。

【0188】

ゲノム修飾は、核酸配列を安定に統合するため、核酸配列を一時的に統合するため、核酸配列の部位特異的統合を生成するため、又は核酸配列の部位特異的統合を生成するため、又は核酸配列の偏った統合を生成するために、エクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで、細胞に核酸配列、導入遺伝子及び／又はゲノム編集構築物を導入することを含むことができる。核酸配列は導入遺伝子であり得る。

【0189】

ゲノム修飾は、核酸配列、導入遺伝子及び／又はゲノム編集構築物を、核酸配列を安定に統合するために、エクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュで細胞に導入することを含むことができる安定な染色体組込みは、ランダム組込み、部位特異的組込み、又は偏った組込みであり得る。部位特異的統合は、支援されないか、又は支援され得る。補助部位特異的組込みは、部位特異的ヌクレアーゼと同時に送達される。部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム組込み部位の上流及び下流領域に対するパーセンテージ相同性を含む５’及び３’ヌクレオチド配列延長を有する導入遺伝子を含む。相同なヌクレオチド伸長を有する導入遺伝子は、相同組換え、微小相同性媒介末端連結、又は非相同末端連結によるゲノム統合を可能にする。部位特異的統合は、安全な港湾サイトで起こり得る。ゲノムセーフハーバー部位は、新たに挿入された遺伝子エレメントが確実に機能し（例えば、治療的に有効な発現レベルで発現される）、宿主ゲノムに有害な変化を引き起こさず、宿主生物にリスクを引き起こすような方法で、新しい遺伝物質の組込みに適応することができる。潜在的ゲノムセーフハーバーの非限定的な例としては、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン配列、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、染色体１９上のＡＡＶウイルスの組込みの天然に存在する部位、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子の部位、及びマウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログの部位が挙げられる。

【0190】

部位特異的導入遺伝子組込みは、標的遺伝子の発現を破壊する部位で起こりうる。標的遺伝子発現の破壊は、イントロン、エキソン、プロモーター、遺伝因子、エンハンサー、サプレッサー、開始コドン、終止コドン、及び応答エレメントにおける部位特異的組込みによって起こり得る。部位特異的組込みによって標的化される標的遺伝子の非限定的な例には、ＴＲＡＣ、ＴＲＡＢ、ＰＤＩ、任意の免疫抑制遺伝子、及び同種拒絶に関与する遺伝子が含まれる。

【0191】

部位特異的導入遺伝子の組込みは、標的遺伝子の発現を増強する部位で起こり得る。標的遺伝子発現の増強は、イントロン、エキソン、プロモーター、遺伝的要素、エンハンサー、サプレッサー、開始コドン、停止コドン、及び応答エレメントにおける部位特異的組込みによって起こり得る。

【0192】

酵素は、導入遺伝子の送達又は組込みを容易にするために、宿主ゲノム中に鎖切断を作製するために使用され得る。酵素は一本鎖切断や二本鎖切断を起こすことができる。切断誘導酵素の非限定的な例としては、トランスポゼース、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ（商標）、及びＣＰＦ１が挙げられる。切断を誘発する酵素は、ＤＮＡにコードされた細胞、ｍＲＮＡにコードされた細胞、タンパク質として、又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との核タンパク質複合体として送達することができる。

【0193】

部位特異的導入遺伝子組込みは、ベクター媒介組込み部位バイアスによって制御することができる。ベクター媒介性組込み部位バイアスは、選択されたレンチウイルスベクター又は選択されたガンマ－レトロウイルスベクターによって制御することができる。

【0194】

部位特異的導入遺伝子組込み部位は、非安定な染色体挿入であり得る。組込まれた導入遺伝子は、サイレンシングされ、除去され、切り出され、又はさらに修飾され得る。ゲノム修飾は、導入遺伝子の非安定な組込みであり得る。非安定な組込みは、一過性の非染色体組込み、半安定な非染色体組込み、半持続性の非染色体挿入、又は非安定な染色体挿入であり得る。一過性の非染色体挿入は、エピ染色体性であっても、細胞質性であってもよい。一態様において、導入遺伝子の一過性の非染色体挿入は、染色体に組み込まれず、修飾された遺伝物質は、細胞分裂中に複製されない。

【0195】

ゲノム修飾は、導入遺伝子の半安定性又は持続性の非染色体組込みであり得る。ＤＮＡベクターは、分裂細胞の核内での自律的複製を可能にする非ウイルスベクターのエピソーム保持のために核マトリックスタンパク質に結合する足場／マトリックス付着領域（Ｓ－ＭＡＲ）モジュールをコードする。

【0196】

ゲノム修飾は、導入遺伝子の非安定な染色体組込みであり得る。組込まれた導入遺伝子は、サイレンシングされ、除去され、切り出され、又はさらに修飾され得る。

【0197】

導入遺伝子挿入によるゲノムへの修飾は、相同組換え（ＨＲ）、ミクロホモロジー媒介末端連結（ＭＭＥＪ）、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）、トランスポゼース酵素媒介修飾、インテグラーゼ酵素媒介修飾、エンドヌクレアーゼ酵素媒介修飾、又は組換え酵素媒介修飾による宿主細胞指向死二本鎖切断修復（相同指向性修復）を介して起こり得る。導入遺伝子挿入によるゲノムへの修飾は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ（商標）、及びｃｐｆ１を介して起こりうる。

【0198】

新規又は既存のヌクレオチド／核酸の挿入を含む遺伝子編集システムでは、挿入ツール（例えば、ＤＮＡ鋳型ベクター、転移因子（トランスポゾン又はレトロトランスポゾン））は、切断酵素（例えば、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ又はトランスポゼース）に加えて細胞に送達されなければならない。組換え酵素のためのそのような挿入ツールの例は、ＤＮＡベクターを含み得る。他の遺伝子編集システムでは、挿入ベクターとともにインテグラーゼ、トランスポゾン／レトロトランスポゾンとともにトランスポゼースの送達が必要である。切断酵素として用いることができる組換え酵素の例は、ＣＲＥリコンビナーゼである。挿入ツールに使用され得るインテグラーゼの非限定的な例には、ＡＡＶ、γレトロウイルス、及びレンチウイルスを含む多数のウイルスのいずれかから採取されたウイルスベースの酵素が含まれる。挿入入ツールに使用され得るトランスポゾン／レトロトランスポゾンの例は、本明細書中でより詳細に記載される。

【0199】

エクスビボ、インビボ、インビトロ又はインサイチュのゲノム修飾を有する細胞は、生殖系細胞又は体細胞であり得る。修飾された細胞は、ヒト、非ヒト、哺乳動物、ラット、マウス、又はイヌの細胞であり得る。修飾された細胞は、分化、未分化、又は不死化され得る。修飾された未分化細胞は、幹細胞であり得る。修飾された未分化細胞は、誘導された多能性幹細胞であり得る。修飾された細胞は免疫細胞であり得る。修飾された細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、巨核球、又は破骨細胞であり得る。修飾された細胞は、細胞が休止状態、活性化状態、休止状態、間期、前期、中期、後期、又は終期にある間に修飾することができる。修飾された細胞は、新鮮であり、凍結保存され、バルクであり、サブ集団に仕分けられ、全血から、白血球除去から、又は不死化細胞系から選別され得る。白血球アフェレーシス製品又は血液から細胞を単離するための詳細な説明は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されている。

【0200】

本開示は、遺伝子編集組成物及び／又は遺伝子編集組成物を含む細胞を提供する。遺伝子編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列、及びヌクレアーゼタンパク質又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含むことができる。ヌクレアーゼタンパク質をコードする配列又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はそれらの組み合わせを含むことができる。ヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びエンドヌクレアーゼの１つ又は複数を含むことができる。

【0201】

ヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質及びエンドヌクレアーゼを含むことができる。エンドヌクレアーゼは、Ｃｌｏ０５１ヌクレアーゼ又はそのヌクレアーゼドメインを含むことができる。遺伝子編集組成物は、融合タンパク質を含むことができる。融合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質及びＣｌｏ０５１ヌクレアーゼ又はＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインを含むことができる。遺伝子編集組成物は、ガイド配列をさらに含むことができる。ガイド配列は、ＲＮＡ配列を含む。

【0202】

本開示は、作用的にエフェクターに連結された小さなＣａｓ９（Ｃａｓ９）を含む組成物を提供する。本開示は、本質的にＤＮＡ局在化成分及びエフェクター分子からなるか又はそれからなる融合タンパク質を提供し、ここで、エフェクターは小型のＣａｓ９（Ｃａｓ９）を含む。本開示の小さなＣａｓ９構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含むことができる。活性触媒部位を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９は、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。

【0203】

本開示は、エフェクターに作動可能に連結された不活化された小さなＣａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む組成物を提供する。本開示は、本質的にＤＮＡ局在化成分及びエフェクター分子からなるか又はそれからなる融合タンパク質を提供し、ここで、エフェクターは、小型の不活化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む。本開示の小さな不活化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含み得る。ＳａｄＡ Ｃａｓ９は、触媒部位を不活性化するためのＤ１０Ａ及びＮ５８０Ａ突然変異を含む配列番号８４のアミノ酸配列を含む。

【0204】

本開示は、エフェクターに作動可能に連結された不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む組成物を提供する。本開示は、本質的にＤＮＡ局在化成分及びエフェクター分子からなるか又はそれからなる融合タンパク質を提供し、ここで、エフェクターは不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。本開示の不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含み得る。

【0205】

ｄＣａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離又は由来することができる。ｄＣａｓ９は、触媒部位を不活性化するアミノ酸位置１０及び８４０に置換したｄＣａｓ９を含むことができる。いくつかの態様において、これらの置換は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａである。ｄＣａｓ９は、配列番号８５又は配列番号８６のアミノ酸配列を含むことができる。

【0206】

例示的なＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、配列番号８７のアミノ酸配列を含み、本質的に構成され、又は配列番号８７のアミノ酸配列からなる。

【0207】

例示的なｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１（Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ）融合タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含むか、本質的に含むか、又は配列番号８８のアミノ酸配列からなることができる。例示的なｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１融合タンパク質は、配列番号８９の核酸配列を含む、本質的に構成される、又はそれからなるポリヌクレオチドによりコード化され得る。ｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１融合タンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。

【0208】

例示的なｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１（Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ）融合タンパク質は、配列番号９０のアミノ酸配列を含み、本質的に含むか、又はそれからなることができる。例示的なｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１融合タンパク質は、配列番号９１の核酸配列を含む、本質的に構成される、又はそれからなるポリヌクレオチドによりコード化され得る。ｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１融合タンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。

【0209】

遺伝子編集組成物を含む細胞は、遺伝子編集組成物を安定に又は一時的に発現することができる。好ましくは、遺伝子編集組成物は一時的に発現される。ガイドＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ配列内の標的配列に相補的な配列を含むことができる。ゲノムＤＮＡ配列内の標的配列は、ゲノムＤＮＡ配列の安全なハーバー部位内の標的配列であり得る。

【0210】

Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲを含む遺伝子編集組成物、及び遺伝子編集のためにこれらの組成物を使用する方法は、米国特許公開第２０１７／０１０７５４１号、同第２０１７／０１１４１４９号、同第２０１８／０１８７１８５号、及び米国特許第１０，４１５，０２４号に詳細に記載されている。

【0211】

遺伝子編集ツールは、１つ以上のポリ（ヒスチジン）ベースのミセルを用いて細胞に送達することもできる。ポリ（ヒスチジン）（例えば、ポリ（Ｌ－ヒスチジン））は、不飽和窒素上に電子孤立対を提供するイミダゾール環によるｐＨ感受性ポリマーである。すなわち、ポリ（ヒスチジン）は、プロトン化－脱プロトン化を介して両性特性を有する。特に、特定のｐＨにおいて、ポリ（ヒスチジン）含有トリブロック共重合体は、表面上に正に荷電したポリ（ヒスチジン）単位を有するミセルに集合することができ、それによって、負に荷電した遺伝子編集分子との錯体形成を可能にする。これらのナノ粒子を用いて、ｐＨ依存的にタンパク質及び／又は核酸を結合及び放出させることは、所望の遺伝子修飾を実施するための効率的かつ選択的メカニズムを提供し得る。特に、このミセルベースの送達システムは、荷電材料、ならびに大きなペイロード容量、及びナノ粒子ペイロードの標的放出に関して実質的な柔軟性を提供する。一例では、二本鎖ＤＮＡの部位特異的切断は、ポリ（ヒスチジン）ベースのミセルを使用するヌクレアーゼの送達によって可能となる。特定の理論に拘束されることを望まないが、種々のトリブロック共重合体によって形成されるミセルにおいて、疎水性ブロックは凝集してコアを形成し、親水性ブロック及びポリブロックを末端に残して１つ以上の周囲層を形成すると考えられる。

【0212】

一態様では、本開示は、親水性ブロック、疎水性ブロック、及び荷電ブロックからなるトリブロック共重合体を提供する。いくつかの態様において、親水性ブロックは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）であり得、荷電ブロックは、ポリ（Ｌ－ヒスチジン）であり得る。使用できる例示的なトリブロック共重合体は、ＰＥＯ－ｂ－ＰＬＡ－ｂ－ＰＨＩＳであり、各ブロック中の可変数の繰り返し単位が設計によって変化する。

【0213】

トリブロックコポリマーを作製するための中間体として使用できるジブロックコポリマーは、親水性生体適合性ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）を有することができ、これは、ＰＥＧと化学的に同義であり、様々な疎水性脂肪族ポリ（無水物）、ポリ（核酸）、ポリ（エステル）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ペプチド）、ポリ（ホスファゼン）及びポリ（サッカライド）、例えば、限定されないが、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）に結合される。１００％ＰＥＧ化表面から成る高分子ミセルは、改良されたインビトロ化学的安定性、増加されたインビボバイオアベイラビリティ、及び延長された血中循環半減期を有する。

【0214】

ポリマー小胞、ポリマーソーム及びポリ（ヒスチジン）ベースのミセル（トリブロックコポリマーを含むものを含む）、及びその製造方法は、米国特許第７，２１７，４２７号；同第７，８６８，５１２号；同第６，８３５，３９４号；同第８，８０８，７４８号；同第１０，４５６，４５２号；米国出願公開第２０１４／０３６３４９６号；同第２０１７／００００７４３号；及び同第２０１９／０２５５１９１号；並びにＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１２６５８９号にさらに詳細に記載されている。

【0215】

トランスポゾン及びベクター組成物
本開示は、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）又はＣＡＲ（例えば、ｓｃＦｖを含む）を細胞又は細胞集団に送達するための組成物及び方法を提供する。細胞又は細胞集団への本開示の組成物の送達のための組成物の非限定的な例は、トランスポゾン又はベクターを含む。したがって、本開示は、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）又はＣＡＲ（例えば、ｓｃＦｖを含む）を含むトランスポゾン、又は抗体（例えば、ｓｃＦｖ）又はＣＡＲ（例えば、ｓｃＦｖを含む）を含むベクターを提供する。

【0216】

本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン、又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。あるいは又はさらに、１つのトランスポゾン又は１つのベクターは、本開示のＣＡＲを含み得、第２のトランスポゾン又は第２のベクターは、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする配列を含み得る。誘導性アポトーシス誘発性ポリペプチドは、本明細書においてより詳細に記載される。

【0217】

本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン、又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）をコードする配列をさらに含むことができる。あるいは、又はさらに、１つのトランスポゾン又は１つのベクターは、本開示のＣＡＲを含むことができ、第２のトランスポゾン又は第２のベクターは、本開示のＣＳＲをコードする配列を含むことができる。キメラ刺激受容体は、本明細書中でより詳細に記載される。

【0218】

本開示のＣＡＲ又は本開示のＣＡＲを含むベクターを含むトランスポゾンは、組換えＨＬＡ－Ｅポリペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。あるいは、又はさらに、１つのトランスポゾン又は１つのベクターは、本開示のＣＡＲを含み得、第２のトランスポゾン又は第２のベクターは、組換えＨＬＡ－Ｅポリペプチドをコードする配列を含み得る。組換えＨＬＡ－Ｅポリペプチドは、本明細書中により詳細に記載される。

【0219】

本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン、又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、選択遺伝子をさらに含むことができる。選択遺伝子は、細胞生存及び生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子は、選択的細胞培養条件下でチャレンジすると、細胞生存及び生存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択的細胞培養条件は、細胞生存又は生存に有害な化合物を含み得、ここで、遺伝子産物は、化合物に対して抵抗性を付与する。選択遺伝子の非限定的な例には、ｎｅｏ（ネオマイシンに対する耐性を付与する）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼをコードする）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）－メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードする）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ１をコードする）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣをコードする）、ＧＣＳ（グルコシルセラミドシンターゼをコードする）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２をコードする）、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0220】

好ましい態様において、選択遺伝子は、ＤＨＦＲミューテイン酵素をコードする。ＤＨＦＲミューテイン酵素は、配列番号９２のアミノ酸配列を含み、本質的に構成され、又は配列番号９２のアミノ酸配列からなる。ＤＨＦＲミューテイン酵素は、配列番号９３又は配列番号１７４の核酸配列からなる、又はそれからなるポリヌクレオチドによりコードされる。ＤＨＦＲミューテイン酵素のアミノ酸配列は、８０、１１３、又は１５３位の１つ以上の位置における突然変異をさらに含むことができる。ＤＨＦＲミューテイン酵素のアミノ酸配列は、８０位でのフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）の置換、１１３位でのロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）の置換、及び１５３位でのＶａｌｉｎｅ（Ｖ）又はアスパラギン酸（Ｄ）の置換の１つ以上を含み得る。

【0221】

本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン、又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、少なくとも１つの自己切断ペプチドをさらに含むことができる。例えば、自己切断ペプチドは、ＣＡＲ（例えば、ｓｃＦｖを含む）と誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドとの間に位置することができ；又は自己切断ペプチドは、ＣＡＲ（例えば、ｓｃＦｖを含む）と選択遺伝子によりコードされるタンパク質との間に位置することができる。

【0222】

本開示のＣＡＲを含むトランスポゾン、又は本開示のＣＡＲを含むベクターは、さらに、少なくとも２つの自己切断ペプチドを含むことができる。例えば、第１の自己切断ペプチドはＣＡＲの上流又は直上流に位置し、第２の自己切断ペプチドはＣＡＲの下流又は直下流に位置する；又は、第１の自己切断ペプチド及び第２の自己切断ペプチドはＣＡＲに隣接する。例えば、第１の自己切断ペプチドは、誘導性アポトーシス誘発性ポリペプチドの上流又は直上流に位置し、第２の自己切断ペプチドは、誘導性アポトーシス誘発性ポリペプチドの下流又は直下流に位置する；又は、第１の自己切断ペプチド及び第２の自己切断ペプチドは、誘導性アポトーシス誘発性ポリペプチドに隣接する。例えば、第１の自己切断ペプチドは、選択遺伝子によってコードされるタンパク質の上流又は直上流に位置し、第２の自己切断ペプチドは、選択遺伝子によってコードされるタンパク質の下流又は直下流に位置する；又は、第１の自己切断ペプチド及び第２の自己切断ペプチドは、選択遺伝子によってコードされるタンパク質に隣接する。

【0223】

自己切断ペプチドの非限定的な例としては、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、又はＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドが挙げられる。Ｔ２Ａペプチドは、配列番号９４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。ＧＳＧ－Ｔ２Ａは、配列番号９５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。ＧＳＧ－Ｔ２Ａポリペプチドは、配列番号９６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによりコードされる。Ｅ２Ａペプチドは、配列番号９７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチドは、配列番号９８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。Ｆ２Ａペプチドは、配列番号９９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチドは、配列番号１００と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。Ｐ２Ａペプチドは、配列番号１０１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。ＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドは、配列番号１０２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0224】

いくつかの態様において、本開示のトランスポゾンは、配列番号１３のＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号９５のＴ２Ａペプチドをコードする核酸に隣接する。いくつかの態様において、トランスポゾンは、配列番号９２のＤＨＦＲ酵素をコードする核酸をさらに含む。いくつかの態様において、トランスポゾンは、配列番号１７２のｉｃ９安全スイッチペプチドをコードする核酸をさらに含む。

【0225】

いくつかの態様において、本開示のトランスポゾンは、配列番号１７５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0226】

転位系
本開示は、本明細書中に開示されたタンパク質骨格を含むトランスポゾンを提供するか、又は本開示は、本明細書中に開示された抗体（例えば、ｓｃＦｖ）又はＣＡＲ（例えば、ｓｃＦｖを含む）を含むトランスポゾンを提供する。好ましい態様において、トランスポゾンは、本明細書に開示されているｓｃＦｖ又はＣＡＲをコードするヌクレオチド配列（例えば、ｓｃＦｖを含む）と、２つのシス調節インシュレーターエレメントとが隣接するプラスミドＤＮＡトランスポゾンである。本開示はまた、トランスポゾンを含む組成物を提供する。好ましい態様において、トランスポゾンを含む組成物は、トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドをさらに含む。トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列であり得る。好ましくは、トランスポゼースをコードする配列はｍＲＮＡ配列である。

【0227】

本開示のトランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポゾンであり得る。トランスポゾンがＰＢトランスポゾンである場合のいくつかの態様において、トランスポゼースは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポゼース、ｐｉｇｇｙＢａｃ様（ＰＢＬ）トランスポゼース又はスーパーｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポゼースである。ＳＰＢトランスポゼースをコードする配列はｍＲＮＡ配列である。

【0228】

ＰＢトランスポゾン及びＰＢ、ＰＢＬ及びＳＰＢトランスポゼースの非限定的な例は、米国特許第６，２１８，１８２号；米国特許第６，９６２，８１０号；米国特許第８，３９９，６４３号及びＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０９９２９６に詳細に記載されている。

【0229】

ＰＢ、ＰＢＬ、ＳＰＢトランスポゼースはトランスポゾンの末端にあるトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、染色体部位内の５’－ＴＴＡＴ－３’配列（ＴＴＡＴ標的配列）又は染色体部位内の５’－ＴＴＡＡ－３’配列（ＴＴＡＡ標的配列）のＩＴＲ間の内容物を挿入する。ＰＢ又はＰＢＬトランスポゾンの標的配列は、５’－ＣＴＡＡ－３’、５’－ＴＴＡＧ－３’、５’－ＡＴＡＡ－３’、５’－ＴＣＡＡ－３’、５’ＡＧＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＧＡ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＡＣ－３’、５’－ＡＣＴＡ－３’、５’－ＡＧＧＧ－３’、５’－ＣＴＡＧ－３’、５’－ＴＧＡＡ－３’、５’－ＡＧＧＴ－３’、５’－ＡＴＣＡ－３’、５’－ＣＴＣＣ－３’、５’－ＴＡＡＡ－３’、５’－ＴＣＴＣ－３’、５’ＴＧＡＡ－３’、５’－ＡＡＡＴ－３’、５’－ＡＡＴＣ－３’、５’－ＡＣＡＡ－３’、５’－ＡＣＡＴ－３’、５’－ＡＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＴＧ－３’、５’－ＡＴＡＧ－３’、５’－ＣＡＡＡ－３’、５’－ＣＡＣＡ－３’、５’－ＣＡＴＡ－３’、５’－ＣＣＡＧ－３’、５’－ＣＣＣＡ－３’、５’－ＣＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣＣ－３’、５’－ＴＡＡＧ－３’、５’－ＴＣＴＡ－３’、５’－ＴＧＡＧ－３’、５’－ＴＧＴＴ－３’、５’－ＴＴＣＡ－３’５’－ＴＴＣＴ－３’及び５’－ＴＴＴＴ－３’を含むか又はそれからなることができる。ＰＢ又はＰＢＬトランスポゾンシステムは、ＩＴＲ間に含まれ得る関心遺伝子のペイロード制限を持たない。

【0230】

１つ以上のＰＢ、ＰＢＬ及びＳＰＢトランスポゼースの例示的なアミノ酸配列は、米国特許第６，２１８，１８５号；米国特許第６，９６２，８１０号；及び米国特許番号８，３９９，６４３号に開示されている。好ましい態様において、ＰＢトランスポゼースは、配列番号１０３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。

【0231】

ＰＢ又はＰＢＬトランスポゼースは、配列番号１０３の配列の位置３０、１６５、２８２、又は５３８のそれぞれにおいて、２つ以上、３つ以上、又はそれ以上でアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれらからなることができる。トランスポゼースは、配列番号１０３の配列のアミノ酸配列を含む又はそれからなるＳＰＢトランスポゼースであり得、ここで、３０位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）に対するバリン（Ｖ）の置換であり得、１６５位におけるアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）に対するセリン（Ｓ）の置換であり得、２８２位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）のメチオニン（Ｍ）に対する置換であり得、５３８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）に対するリジン（Ｋ）の置換であり得る。好ましい態様において、ＳＰＢトランスポゼースは、配列番号１０４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。

【0232】

トランスポゼースが位置３０、１６５、２８２及び／又は５３８に上記の突然変異を含む特定の態様では、ＰＢ、ＰＢＬ及びＳＰＢトランスポゼースは、配列番号１０３又は配列番号１０４の配列の位置３、４６、８２、１０３、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２５８、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８６、５０３、５５２、５７０及び５９１のうちの１つ以上にアミノ酸置換をさらに含むことができ、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６により詳細に記載されている。

【0233】

ＰＢ、ＰＢＬ又はＳＰＢトランスポゼースは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に詳細に記載されているように、昆虫、脊椎動物、甲殻類又は脊索動物から単離又は誘導することができる。好ましい態様において、ＰＢ、ＰＢＬ又はＳＰＢトランスポゼースは、昆虫Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ８７３７５）又はＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＤ１１１３５）から単離又は誘導される。

【0234】

高活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポゼースは、それが由来する天然の変異体よりも活性が高いトランスポゼースである。好ましい態様において、高活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポゼースは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ又はＸｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓから単離又は誘導される。過剰活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポゼースの例は、米国特許第６，２１８，１８５号；米国特許第６，９６２，８１０号；米国特許第８，３９９，６４３号及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。高活性アミノ酸置換のリストは、米国特許第１０，０４１，０７７号に開示されている。

【0235】

いくつかの態様では、ＰＢ又はＰＢＬトランスポゼースは組込みが欠損している。組込み欠損型ＰＢ又はＰＢＬトランスポゼースは、対応するトランスポゾンを切り出すことができるが、切り出されたトランスポゾンを対応する野生型トランスポゼースよりも低い頻度で組み込むトランスポゼースである。組込み欠損ＰＢ又はＰＢＬトランスポゼースの例は、米国特許第６，２１８，１８５号；米国特許第６，９６２，８１０号；米国特許第８，３９９，６４３号及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。組込み欠損アミノ酸置換のリストは、米国特許第１０，０４１，０７７号に開示されている。

【0236】

いくつかの態様において、ＰＢ又はＰＢＬトランスポゼースは、核局在化シグナルに融合される。核局在化シグナルに融合したＰＢ又はＰＢＬトランスポゼースの例は、米国特許第６，２１８，１８５号；米国特許第６，９６２，８１０号；米国特許第８，３９９，６４３号及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。

【0237】

本開示のトランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンであり得る。トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである場合、トランスポゼースはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゼース（例えば、米国特許第９，２２８，１８０号）又は過活動Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポゼースである。好ましい態様において、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゼースは、配列番号１０５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。好ましい態様において、過活動Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポゼースは、配列番号１０６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含み又はそれらからなる。

【0238】

本開示のトランスポゾンは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンであり得る。例示的なＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンは、配列番号１０７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含むか、又はそれらからなるＨｅｌｉｂａｔ１を含む。ある態様では、トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンである場合、トランスポゼースはＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゼースである（例えば、ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示される）。好ましい態様において、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゼースは、配列番号１０８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。

【0239】

本開示のトランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポゾンであり得る。逆方向反復、サブターミナル配列及びＴｏｌ２トランスポゼースを含む例示的なＴｏｌ２トランスポゾンは、配列番号１０９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含むか又はそれからなる。ある態様において、トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンである場合、トランスポゼースはＴｏｌ２トランスポゼースである（例えば、ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示される）。好ましい態様において、Ｔｏｌ２トランスポゼースは、配列番号１１０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。

【0240】

本開示のトランスポゾンは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンであり得る。ある態様において、トランスポゾンがＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンである場合、トランスポゼースは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゼース又は高活性ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゼースである（例えば、ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示される）。ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゼースは、天然に存在するアミノ酸配列又は非天然に存在するアミノ酸配列を含み得るか、又はそれらから構成され得る。好ましい態様において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゼースは、配列番号１１１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸配列又は非天然に存在する核酸配列を含み得るか、又はそれらから構成され得る。好ましい態様において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゼースは、配列番号１１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含むか又はそれからなるポリヌクレオチドによりコードされる。

【0241】

いくつかの態様において、突然変異体ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゼースは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に詳細に記載されているように、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゼースと比較した場合、１つ以上の配列変異を含む。

【0242】

トランスポゾンはナノトランスポゾンである。ナノトランスポゾンは、（ａ）第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列、第２の逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列、及びＩＴＲ間配列を含む、トランスポゾンインサートをコードする配列；（ｂ）骨格をコードする配列であって、骨格をコードする配列は、端点を含めて１～４５０ヌクレオチドを有する複製起点をコードする配列、及び端点を含めて１～２００ヌクレオチドを有する選択マーカーをコードする配列を含む骨格をコードする配列、ならびに（ｃ）ＩＴＲ間配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの態様において、（ｃ）のＩＴＲ間配列は（ｂ）の配列を含む。いくつかの態様において、（ａ）のＩＴＲ間配列は（ｂ）の配列を含む。

【0243】

骨格をコードする配列は、端点を含めて１～６００ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの態様では、骨格をコードする配列は、１～５０ヌクレオチド、５０～１００ヌクレオチド、１００～１５０ヌクレオチド、１５０～２００ヌクレオチド、２００～２５０ヌクレオチド、２５０～３００ヌクレオチド、３００～３５０ヌクレオチド、３５０～４００ヌクレオチド、４００～４５０ヌクレオチド、４５０～５００ヌクレオチド、５００～５５０ヌクレオチド、５５０～６００ヌクレオチドからなり、それぞれの範囲は端点を含む。

【0244】

ＩＴＲ間配列は、端点を含む１～１０００ヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、１～５０ヌクレオチド、５０～１００ヌクレオチド、１００～１５０ヌクレオチド、１５０～２００ヌクレオチド、２００～２５０ヌクレオチド、２５０～３００ヌクレオチド、３００～３５０ヌクレオチド、３５０～４００ヌクレオチド、４００～４５０ヌクレオチド、４５０～５００ヌクレオチド、５００～５５０ヌクレオチド、５５０～６００ヌクレオチド、６００～６５０ヌクレオチド、６５０～７００ヌクレオチド、７００～７５０ヌクレオチド、７５０～８００ヌクレオチド、８００～８５０ヌクレオチド、８５０～９００ヌクレオチド、９００～９５０ヌクレオチド、又は９５０～１０００ヌクレオチドからなり、各範囲は端点を含む。

【0245】

ナノトランスポゾンは、短いナノトランスポゾン（ＳＮＴ）であり得、ここで、ＩＴＲ間配列は、端点を含む１～２００ヌクレオチドを含む。ＩＴＲ間配列は、１～１０ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、３０～４０ヌクレオチド、４０～５０ヌクレオチド、５０～６０ヌクレオチド、６０～７０ヌクレオチド、７０～８０ヌクレオチド、８０～９０ヌクレオチド、又は９０～１００ヌクレオチドからなり、各囲は端点を含む。

【0246】

端点を含む１～２００ヌクレオチドを有する選択マーカーは、スクロース選択マーカーをコードする配列を含むことができる。スクロース選択マーカーをコードする配列は、ＲＮＡ－ＯＵＴ配列をコードする配列を含むことができる。ＲＮＡ－ＯＵＴ配列をコードする配列は、１３７塩基対（ｂｐ）を含み得るか、又はそれから構成され得る。端点を含む１～２００ヌクレオチドを有する選択マーカーは、蛍光マーカーをコードする配列を含むことができる。端点を含む１～２００ヌクレオチドを有する選択マーカーは、細胞表面マーカーをコードする配列を含むことができる。

【0247】

端点を含む１～４５０ヌクレオチドを有する複製起点をコードする配列は、ミニ複製起点をコードする配列を含むことができる。いくつかの態様において、端点を含む１～４５０ヌクレオチドを有する複製起点をコードする配列は、Ｒ６Ｋ複製起点をコードする配列を含む。Ｒ６Ｋ複製起点は、Ｒ６Ｋガンマ複製起点を含むことができる。Ｒ６Ｋ複製起点は、Ｒ６Ｋミニ複製起点を含むことができる。Ｒ６Ｋ複製起点は、Ｒ６Ｋガンマミニ複製起点を含むことができる。Ｒ６Ｋガンマミニ複製起点は、２８１塩基対（ｂｐ）を含み得るか、又はそれから構成され得る。

【0248】

ナノトランスポゾンのいくつかの態様において、骨格をコードする配列は、組換え部位、切り出し部位、連結部位、又はそれらの組み合わせを含まない。いくつかの態様において、ナノトランスポゾンも骨格をコードする配列も組換え部位、切り出し部位、連結部位又はそれらの組み合わせの産物を含まない。いくつかの態様において、ナノトランスポゾンも骨格をコードする配列も組換え部位、切り出し部位、連結部位又はそれらの組み合わせに由来しない。

【0249】

ナノトランスポゾンのいくつかの態様において、組換え部位は、組換え事象から生じる配列を含む。ある態様において、組換え部位は、組換え事象の産物である配列を含む。いくつかの態様において、組換え事象は、組換え酵素（例えば、リコンビナーゼ部位）の活性を含む。

【0250】

ナノトランスポゾンのいくつかの態様において、骨格をコードする配列は、外来ＤＮＡをコードする配列をさらに含まない。

【0251】

ナノトランスポゾンのいくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、組換え部位、切り出し部位、連結部位、又はそれらの組み合わせを含まない。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、組換え事象、切り出し事象、連結事象、又はそれらの組み合わせの生成物を含まない。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、組換え事象、切り出し事象、連結事象、又はそれらの組み合わせに由来しない。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、外来ＤＮＡをコードする配列を含む。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、インスレーターをコードする少なくとも１つの配列、及び哺乳動物細胞において外因性配列を発現することができるプロモーターをコードする配列を含む。哺乳動物細胞はヒト細胞であり得る。いくつかの態様において、ＩＴＲ間配列は、インスレーターをコードする第一の配列、哺乳動物細胞において外因性配列を発現することができるプロモーターをコードする配列、及びインスレーターをコードする第二の配列を含む。いくつかの態様において、ＩＴＲ内配列は、インスレーターをコードする第一の配列、哺乳動物細胞において外因性配列を発現することができるプロモーターをコードする配列、ポリアデノシン（ポリＡ）配列、及びインスレーターをコードする第二の配列を含む。いくつかの態様において、ＩＴＲ内配列は、インスレーターをコードする第一の配列、哺乳動物細胞において外因性配列を発現することができるプロモーターをコードする配列、少なくとも１つの外因性配列、ポリアデノシン（ポリＡ）配列、及びインスレーターをコードする第二の配列を含む。

【0252】

ナノトランスポゾンは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６７７５８に詳細に記載されている。

【0253】

ベクターシステム
本開示のベクターは、ウイルスベクター又は組換えベクターであり得る。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又はそれらの任意の組合せから単離又は誘導される配列を含むことができる。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離又は由来する配列を含み得る。ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含み得る。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスは、本開示のｓｃＦｖ又はＣＡＲをコードする配列の隣にシスに位置する２つ以上の逆末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスには、すべての血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９）が含まれるが、これらに限定されない。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスは、限定されるものではないが、１つの血清型のゲノム及び別の血清型（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ－ＤＪ及びＡＡＶ－ＤＪ８）のカプシドを含む自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）及びＡＡＶハイブリッドを含む。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスは、ｒＡＡＶ－ＬＫ０３を含むが、これらに限定されない。

【0254】

本開示のベクターは、ナノ粒子であり得る。ナノ粒子ベクターの非限定的な例には、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせ）、アミノ酸（Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、合成アミノ酸、修飾アミノ酸、又はポリマー（例えば、ポリマーソーム）、ミセル、脂質（例えば、リポソーム）、有機分子（例えば、炭素原子、シート、繊維、チューブ）、無機分子（例えば、リン酸カルシウム又は金）、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ナノ粒子ベクターは、受動的又は能動的に細胞膜を横切って輸送され得る。

【0255】

本明細書に開示される細胞送達組成物（例えば、トランスポゾン、ベクター）は、治療用タンパク質又は治療剤をコードする核酸を含み得る。治療用タンパク質の例としては、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されているものが挙げられる。

【0256】

誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド
本明細書に開示される誘導性アポトーシス誘導性ポリペプチドは、本開示の誘導性アポトーシス誘導性ポリペプチドは、免疫原性がはるかに低いため、既存の誘導性ポリペプチドよりも優れている。誘導性プロアポトーシスポリペプチドは、組換えポリペプチドであり、従って、天然に存在しない。さらに、組換えされて、宿主ヒト免疫系が「非自己」として認識することができた非ヒト配列を含まない誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを生成し、その結果、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを受け取る対象、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞、又は誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む組成物を含む細胞において免疫応答を誘導し得る。

【0257】

本開示は、リガンド結合領域、リンカー、及びアポトーシス促進ペプチドを含む誘導可能なアポトーシス促進性ポリペプチドを提供し、ここで、誘導可能なアポトーシス促進性ポリペプチドは、ヒト以外の配列を含まない。特定の態様において、非ヒト配列は、制限部位を含む。ある態様において、リガンド結合領域は、多量体リガンド結合領域であり得る。特定の態様において、アポトーシス促進ペプチドはカスパーゼポリペプチドである。カスパーゼポリペプチドの非制限的な例としては、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、及びカスパーゼ１４が含まれる。好ましくは、カスパーゼポリペプチドはカスパーゼ９ポリペプチドである。カスパーゼ９ポリペプチドは、切断されたカスパーゼ９ポリペプチドであり得る。誘導性アポトーシス誘発性ポリペプチドは、天然に存在しないことができる。カスパーゼがカスパーゼ９又は切断されたカスパーゼ９である場合、誘導可能なアポトーシス促進性ポリペプチドは、「ｉＣ９安全スイッチ」とも呼ばれ得る。

【0258】

誘導性カスパーゼポリペプチドは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）カスパーゼポリペプチドを含み得、ここで、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、ヒト以外の配列を含まない。ある態様において、誘導性カスパーゼポリペプチドは、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、及び（ｃ）切断されたカスパーゼ９ポリペプチドを含み、ここで、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、ヒト以外の配列を含まない。

【0259】

リガンド結合領域は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むことができる。ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、配列の３６位での修飾を含むことができる。この修飾は、３６位（Ｆ３６Ｖ）でのフェニルアラニン（Ｆ）に対するバリン（Ｖ）の置換であり得る。ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、配列番号１１３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる。ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、配列番号１１４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む又はそれからなるポリヌクレオチドによりコード化することができる。

【0260】

リンカー領域は、配列番号１１５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができ、又はリンカーは、配列番号１１６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む又はそれからなるポリヌクレオチドによりコード化することができる。いくつかの態様において、リンカーをコードする核酸配列は、制限部位を含まない。

【0261】

切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列の８７位にアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列を含み得る。あるいは又はさらに、切断されたカスパーゼ９ポリペプチドは、配列２８２位でアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列を含み得る。切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列番号１１７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができ、又は切断型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列番号１１８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む又はそれからなるポリヌクレオチドによりコード化することができる。

【0262】

ポリペプチドが切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含む場合の特定の態様において、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、配列番号１１９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができ、又は誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、配列番号１２０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む又はそれからなるポリヌクレオチドによりコード化することができる。

【0263】

ポリペプチドが切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含む場合の特定の態様において、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、配列番号１７２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができ、又は誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、配列番号１７３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一である核酸配列を含む又はそれからなるポリヌクレオチドによりコード化することができる。

【0264】

誘導性アポトーシス誘発性ポリペプチドは、その細胞において誘導性アポトーシス誘発性ポリペプチドの発現を開始及び／又は調節することができる当該技術分野で公知の任意のプロモーターの転写調節下で、細胞内で発現され得る。

【0265】

誘導性プロアポトーシスポリペプチドの活性化は、例えば、誘導剤によって媒介される化学的に誘導された二量化（ＣＩＤ）を介して、条件的に制御されたタンパク質又はポリペプチドを生成することによって達成することができる。アポトーシス促進性ポリペプチドは、誘導可能であるだけでなく、不安定な二量化剤の分解又は単量体競合阻害剤の投与のために、これらのポリペプチドの誘導も可逆的である。

【0266】

特定の態様では、リガンド結合領域が、３６位のフェニルアラニン（Ｆ）をバリン（Ｖ）に置換したＦＫＢＰ１２ポリペプチド（Ｆ３６Ｖ）を含む場合、誘導剤は、ＡＰ１９０３、合成薬物（ＣＡＳインデックス名：２－ピペリジンカルボン酸、１－［（２Ｓ）－１－オキソ－２－（３，４，５－トリメトキシフェニル）ブチル］－、１，２－エタンジイルビス［イミノ（２－オキソ－２，１－エタンジイル）オキシ－３，１－フェニレン［（１Ｒ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ－［１（Ｒ^＊），２Ｒ^＊［Ｓ^＊［Ｓ^＊［１（Ｒ^＊），２Ｒ^＊］］］］］－（９Ｃｌ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４－６３－７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０；分子量：１４１１．６５））；ＡＰ２０１８７（ＣＡＳ登録番号：１９５５１４－８０－８及び分子式：Ｃ８２Ｈ１０７Ｎ５Ｏ２０）又はＡＰ２０１８７類似体、例えばＡＰ１５１０を含むことができる。本明細書中で使用されるように、誘導剤ＡＰ２０１８７、ＡＰ１９０３及びＡＰ１５１０は、互換的に使用することができる。

【0267】

誘導性アポトーシス誘発ペプチド及びこれらのペプチドを誘導する方法は、米国特許公開ＷＯ２０１９／０２２５６６７及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１８／０６８０２２に詳細に記載されている。

【0268】

キメラ刺激受容体と組換えＨＬＡ－Ｅポリペプチド
任意の患者に投与するために「普遍的に」安全である養子細胞組成物は、同種反応性の有意な減少又は除去を必要とする。この目的のために、開示の細胞（例えば、同種異系細胞）を修飾して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はクラスの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の発現又は機能を中断することができる。ＴＣＲは移植片対宿主（ＧｖＨ）反応を媒介するが、ＭＨＣは宿主対移植片（ＨｖＧ）反応を媒介する。好ましい態様において、ＴＣＲの任意の発現及び／又は機能は、対象に死を引き起こし得るＴ細胞媒介ＧｖＨを防止するために除去される。従って、好ましい態様において、本開示は、純粋なＴＣＲ陰性同種Ｔ細胞組成物（例えば、組成物の各細胞は、検出不能又は存在しないような低レベルで発現する）を提供する。

【0269】

ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ、具体的には、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）の発現及び／又は機能は、ＨｖＧを防止し、結果的に対象における細胞の生着を改善するために減少又は排除される。改良された生着は、細胞のより長い持続性をもたらし、従って、対象に対するより大きな治療ウインドウをもたらす。具体的には、ＭＨＣ－Ｉ、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の構造要素の発現及び／又は機能は、減少又は排除される。

【0270】

上記の戦略は、さらなる挑戦を誘発する。Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ノックアウト（ＫＯ）は、ＴＣＲ複合体の一部であるＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ｚ又はＣＤ３ζ）の発現の喪失をもたらす。ＴＣＲ－ＫＯ Ｔ－細胞におけるＣＤ３ζの喪失は、アゴニスト抗ＣＤ３ ｍＡｂを含むが、これらに限定されない標準的な刺激／活性化試薬を用いて、これらの細胞を最適に活性化及び拡大する能力を劇的に低下させる。ＴＣＲ複合体のいずれかの成分の発現又は機能が中断されると、複合体のすべての成分が失われ、ＴＣＲ－アルファ（ＴＣＲα）、ＴＣＲ－ベータ（ＴＣＲβ）、ＣＤ３－ガンマ（ＣＤ３γ）、ＣＤ３－イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ３－デルタ（ＣＤ３δ）、及びＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）が含まれる。Ｔ細胞の活性化と増殖には、ＣＤ３εとＣＤ３ζが必要である。アゴニスト抗ＣＤ３ ｍＡｂは、典型的には、ＣＤ３ε及びおそらく複合体内の別のタンパク質を認識し、次に、それは、ＣＤ３ζにシグナルを送る。ＣＤ３ζは、Ｔ細胞の活性化と増殖を最適にするための（二次共刺激シグナルとともに）一次刺激となる。正常な条件下では、完全なＴ細胞活性化は、免疫応答を促進する１つ以上の補助刺激受容体（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２、４－１ＢＢＬ）によって媒介される第２のシグナルとＴＣＲの結合に依存する。しかし、ＴＣＲが存在しない場合、アゴニスト抗ＣＤ３ ｍＡｂを含む標準的な活性化／刺激試薬を用いて刺激すると、Ｔ細胞増殖が著しく低下する。実際、Ｔ細胞増殖は、アゴニスト抗ＣＤ３ ｍＡｂを含む標準的な活性化／刺激試薬を用いて刺激すると、正常な拡大レベルのわずか２０～４０％にまで低下する。

【0271】

従って、本開示は、（ａ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が単離されるか、第１のタンパク質から誘導されるエクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが単離されるか、又は第２のタンパク質から誘導される、エンドドメインとを含む、非天然に存在するキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供し、ここで、第１のタンパク質及び第２のタンパク質は同一ではない。

【0272】

活性化成分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ共受容体の成分、ＴＣＲ共刺激タンパク質の成分、ＴＣＲ阻害タンパク質の成分、サイトカイン受容体、及び活性化成分のアゴニストが結合するケモカイン受容体の１つ以上の一部を含み得る。活性化成分は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部を含むことができる。

【0273】

シグナル伝達ドメインは、ヒトシグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ補助受容体の成分、ＴＣＲ補助刺激タンパク質の成分、ＴＣＲ抑制タンパク質の成分、サイトカイン受容体、及びケモカイン受容体の１つ以上を含み得る。シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３タンパク質又はその一部を含むことができる。ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３ζタンパク質又はその一部を含むことができる。

【0274】

エンドドメインは、さらに、細胞質ドメインを含み得る。細胞質ドメインは、単離され得るか、又は第三のタンパク質から誘導され得る。最初のタンパク質と３番目のタンパク質は同じである。エクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含むことができる。シグナルペプチドは、４番目のタンパク質から誘導することができる。最初のタンパク質と４番目のタンパク質は同じである。膜貫通ドメインは、単離され得るか、又は５番目のタンパク質から誘導され得る。最初のタンパク質と５番目のタンパク質は同一である。

【0275】

いくつかの態様において、活性化成分は、天然に存在する分子に結合しない。いくつかの態様において、活性化成分は、天然に存在する分子に結合するが、ＣＳＲは、活性化成分の天然に存在する分子への結合時にシグナルを変換しない。いくつかの態様において、活性化成分は、非天然分子に結合する。いくつかの態様において、活性化成分は、天然に存在する分子に結合しないが、非天然に存在する分子に結合する。ＣＳＲは、活性化成分の非天然分子への結合時にシグナルを選択的に変換することができる。

【0276】

好ましい態様において、本開示は、（ａ）シグナルペプチド及び活性化成分を含むエクトドメインであって、シグナルペプチド又はその一部を含み、活性化成分がＣＤ２細胞外ドメイン又はアゴニストが結合するその一部を含むエクトドメイン；（ｂ）膜貫通ドメインがＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部を含む膜貫通ドメイン；及び（ｃ）細胞質ドメイン及び少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインであって、細胞質ドメインがＣＤ２細胞質ドメイン又はその一部を含み、かつ少なくとも１つのシグナル伝達ドメインがＣＤ２細胞質ドメイン又はその一部を含み、かつ少なくとも１つのシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζタンパク質又はその一部を含む、非天然キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。いくつかの態様において、非天然ＣＳＲは、配列番号１２１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、非天然ＣＳＲは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。

【0277】

本開示はまた、エクトドメインが修飾を含む、非天然のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。修飾は、活性化成分又は第１のタンパク質の野生型配列と比較した場合、活性化成分又は第１のタンパク質のアミノ酸配列の突然変異又は切断を含むことができる。活性化成分のアミノ酸配列の突然変異又は切断は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメイン又はその一部の突然変異又は切断を含むことができる。ＣＤ２細胞外ドメインの突然変異又は切断は、天然に存在するＣＤ５８との結合を減少又は排除することができる。いくつかの態様において、突然変異又は切断を含むＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１２２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、突然変異又は切断を含むＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む。

【0278】

好ましい態様では、本開示は、（ａ）シグナルペプチド及び活性化成分を含むエクトドメインであって、シグナルペプチド又はその一部を含み、活性化成分がＣＤ２細胞外ドメイン又はアゴニストが結合するその一部を含み、かつＣＤ２細胞外ドメイン又はアゴニストが結合するその一部を含むエクトドメイン；（ｂ）膜貫通ドメインがＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部を含み、膜貫通ドメインがＣＤ２膜貫通ドメイン又はその一部を含む膜貫通ドメイン；及び（ｃ）細胞質ドメイン及び少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含み、細胞質ドメインがＣＤ２細胞質ドメイン又はその一部を含み、かつ少なくとも１つのシグナル伝達ドメインがＣＤ２細胞質ドメイン又はその一部を含み、かつ少なくとも１つのシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζタンパク質又はその一部を含む、非天然キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。いくつかの態様において、非天然ＣＳＲは、配列番号１２３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、非天然ＣＳＲは、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む。

【0279】

本開示は、本明細書中に開示されたいずれかのＣＳＲをコードする核酸配列を提供する。本開示は、本明細書中に開示されたいずれかのＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾン又はベクターを提供する。

【0280】

本開示は、本明細書中に開示された任意のＣＳＲを含む細胞を提供する。本開示は、本明細書中に開示されたいずれかのＣＳＲをコードする核酸配列を含む細胞を提供する。本開示は、本明細書中に開示されたいずれかのＣＳＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む細胞を提供する。本開示は、本明細書中に開示されたいずれかのＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む細胞を提供する。

【0281】

本明細書に開示される修飾された細胞は、同種細胞又は自家細胞であり得る。いくつかの好ましい態様において、修飾された細胞は、同種細胞である。いくつかの態様において、修飾された細胞は、自己Ｔ細胞又は修飾された自己ＣＡＲ Ｔ細胞である。いくつかの好ましい態様において、修飾された細胞は、同種Ｔ細胞又は修飾された同種ＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0282】

本開示は、本明細書において開示される任意のＣＳＲを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書中に開示されたいずれかのＣＳＲをコードする核酸配列を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書中に開示されたいずれかのＣＳＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書中に開示されたいずれかのＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書中に開示された修飾された細胞、又は本明細書中に開示された複数の修飾された細胞を含む組成物を含む組成物を提供する。

【0283】

本開示は、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の修飾であって、該修飾はＴＣＲの発現レベル又は活性レベルを低下又は排除する、修飾されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ならびに（ｂ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、該活性化成分が第１のタンパク質から単離又は由来するもの、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインであって、該少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが第２のタンパク質から単離又は由来するものを含むキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を含み、該第１のタンパク質及び該第２のタンパク質は同一ではない、修飾されたＴリンパ球（Ｔ細胞）を提供する。

【0284】

修飾されたＴ細胞は、誘導性のアポトーシス促進性ポリペプチドをさらに含むことができる。修飾されたＴ細胞は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の修飾をさらに含むことができ、この修飾は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）の発現レベル又は活性レベルを低下させるか又は除去する。

【0285】

修飾されたＴ細胞は、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）ポリペプチドを含む非天然ポリペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然ポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然ポリペプチドは、Ｂ２Ｍポリペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然ポリペプチドは、リンカーをさらに含み得、ここで、リンカーは、Ｂ２ＭポリペプチドとＨＬＡ－Ｅポリペプチドとの間に位置する。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含む非天然ポリペプチドは、ペプチド及びＢ２Ｍポリペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ－Ｅを含む非天然ポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドとペプチドとの間に位置する第一のリンカー、及びＢ２ＭポリペプチドとＨＬＡ－Ｅをコードするペプチドとの間に位置する第二のリンカーをさらに含むことができる。

【0286】

修飾されたＴ細胞は、さらに、非天然抗原受容体、治療用ポリペプチドをコードする配列、又はそれらの組み合わせを含むことができる。非天然抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことができる。

【0287】

ＣＳＲは修飾されたＴ細胞内で一時的に発現することができる。このＣＳＲは修飾されたＴ細胞内で安定に発現することができる。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含むポリペプチドは、修飾されたＴ細胞において一時的に発現され得る。ＨＬＡ－Ｅポリペプチドを含むポリペプチドは、修飾されたＴ細胞において安定に発現され得る。誘導性プロアポトーシスポリペプチドは、修飾されたＴ細胞において一時的に発現され得る。誘導性プロアポトーシスポリペプチドは、修飾されたＴ細胞において安定に発現され得る。非天然抗原受容体又は治療用タンパク質をコードする配列は、修飾されたＴ細胞中で一時的に発現され得る。非天然抗原受容体又は治療用タンパク質をコードする配列は、修飾されたＴ細胞中で安定に発現され得る。

【0288】

本明細書に詳細に記載されるように、ｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１を含むＲＮＡ誘導融合タンパク質を含むが、これらに限定されない遺伝子編集組成物を用いて、内因性Ｔ細胞受容体の発現を標的化し、減少させ、又は排除することができる。好ましい態様において、遺伝子編集組成物は、内因性Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子、遺伝子の一部、又は遺伝子の調節エレメント（例えば、プロモーター）を標的とし、削除する。ＴＣＲ－アルファ（ＴＣＲ－α）を標的化及び欠失させ、ＴＣＲ－ベータ（ＴＣＲ－β）を標的化及び欠失させ、ベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）を標的化及び欠失させるためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）鋳型の生成のためのプライマー（Ｔ７プロモーター、ゲノム標的配列、及びｇＲＮＡ足場を含む）の非限定的な例は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されている。

【0289】

限定されるものではないが、ｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１を含むＲＮＡ誘導融合タンパク質を含む遺伝子編集組成物を用いて、内因性ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、又はＭＨＣアクチベーターの発現を標的化し、減少させ、又は排除することができる。好ましい態様において、遺伝子編集組成物は、内因性ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、又はＭＨＣアクチベーターの１つ以上の成分をコードする遺伝子、遺伝子の一部、又は遺伝子の調節エレメント（例えば、プロモーター）を標的にし、欠失させる。ＭＨＣアクチベーターを標的とし、欠失させるためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の非限定的な例は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されている。

【0290】

非天然のキメラ刺激受容体、ＴＣＲ－アルファ（ＴＣＲ－α）、ＴＣＲ－ベータ（ＴＣＲ－β）、及び／又はベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）をコードする内因性配列の遺伝子修飾、及びＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）ポリペプチドを含む非天然ポリペプチドの詳細な説明は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されている。

【0291】

製剤、用法・用量及び投与方法
本開示は、本明細書に記載される組成物の投与のための製剤、投与量及び方法を提供する。

【0292】

開示された組成物及び医薬組成物は、限定されないが、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバントなどの任意の適切な助剤の少なくとも１つをさらに含むことができる。薬学的に許容される助剤が好ましい。このような無菌溶液の非限定的な例、及びその調製方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）１９９０、及び“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”、第２５版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ（Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．）１９９８に記載されている。薬学的に許容される担体は、当該技術分野において周知であるか、又は本明細書に記載されるようなタンパク質足場、断片又はバリアント組成物の投与モード、溶解度及び／又は安定性に適したルーチン的に選択することができる。

【0293】

使用に適した薬学的賦形剤及び添加剤の非限定的な例には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、糖、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖；誘導体化された糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖など；及び多糖類又は糖ポリマー）であり、これらは、単独又は組み合わせで存在することができ、単独又は組み合わせで、重量又は体積比で１～９９．９９％を構成する。タンパク質賦形剤の非限定的な例としては、ヒト血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどの血清アルブミンが挙げられる。緩衝能力でも機能する代表的なアミノ酸／タンパク質成分には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが含まれる。１つの好ましいアミノ酸はグリシンである。

【0294】

使用に適した炭水化物賦形剤の非限定的な例には、単糖、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど；二糖、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン；アルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどが挙げられる。好ましくは、炭水化物賦形剤はマンニトール、トレハロース、及び／又はラフィノースである。

【0295】

組成物はまた、緩衝液又はｐＨ調整剤を含むことができ、典型的には、緩衝液は、有機酸又は塩基から調製された塩である。代表的な緩衝液には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩などの有機酸塩；トリス、トロメタミン塩酸塩、又はリン酸緩衝液が含まれる。好ましい緩衝液は、クエン酸塩のような有機酸塩である。

【0296】

さらに、開示された組成物は、高分子賦形剤／添加剤、例えば、ポリビニルピロリドン、フィコール（高分子糖）、デキストレート（例えば、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、香味剤、抗菌剤、甘味料、酸化防止剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ ２０」及び「ＴＷＥＥＮ ８０」などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含むことができる。

【0297】

本明細書中に開示された組成物又は医薬組成物の治療上有効な量を投与するために、多くの公知及び開発されたモードを使用することができる。投与様式の非限定的な例としては、ボーラス、口腔内、注入、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内、細胞内、小脳内、脳室内、結腸内、頸部内、胃内、肝内、病巣内、筋肉内、心筋内、鼻腔内、眼内、骨内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸腔内、子宮内、腫瘍内、静脈内、膀胱内、経口、非経口、直腸、舌下、皮下、経皮又は膣手段が挙げられる。

【0298】

本開示の組成物は、非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与）又は他の任意の投与で使用するためには、特に溶液又は懸濁液の形態で調製することができ；膣又は直腸への投与で使用するためには特に半固体の形態（非限定的な例としてクリーム、座薬など）で調製することができ；口腔又は舌下に投与するためには、非限定的な例として錠剤又はカプセルの形態で調製することができ；鼻腔内投与するためには、非限定的な例として粉末、点鼻薬、エアロゾールのいずれか、又はいくつかの薬剤の形態で調製することができ；経皮投与するためには、非限定的な例としてゲル、軟膏、ローション、懸濁液、パッチ送達システムのいずれかの形態で調製することができ、パッチ送達システムでは、皮膚構造を変えるか、経皮パッチ内の薬の濃度を大きくするための化学的エンハンサー（ジメチルスルホキシドなど）（『Ｄｒｕｇ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ』、Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．編の中のＪｕｎｇｉｎｇｅｒ他、５９～９０ページ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．社、ニューヨーク１９９４年；その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）を用いるか、タンパク質とペプチドを含む製剤を皮膚に適用することを可能にする酸化剤（ＷＯ９８／５３８４７）を用いるか、一過性の輸送経路を作り出すため（電気穿孔など）、又は皮膚を通過する帯電した薬の移動度を大きくするため電場を印加する（イオン導入など）か超音波を適用する（超音波導入など）（アメリカ合衆国特許第４，３０９，９８９号と第４，７６７，４０２号）（上記の刊行物と特許は、全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。

【0299】

非経口投与のために、本明細書に開示される任意の組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、粒子、粉末、又は凍結乾燥粉末として、関連して製剤化することができ、又は別々に、薬学的に許容される非経口ベヒクルを提供することができる。非経口投与のための製剤は、一般的な賦形剤として、殺菌した水又は生理食塩水、ポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコールなど）、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含むことができる。注射用の水性又は油性の懸濁液は、公知の方法に従って適切な乳化剤又は湿潤剤と懸濁剤を用いることによって調製できる。注射用の薬剤として、非毒性で非経口投与可能な希釈剤（水溶液、溶媒中の殺菌注射溶液又は懸濁液など）が可能である。使用可能なビヒクル又は溶媒として、水、リンゲル溶液、等張生理食塩水などが許容される。通常の溶媒又は懸濁溶媒として、殺菌不揮発性油を使用できる。これらの目的のため、任意の種類の不揮発性油と脂肪酸を使用することができ、その中には天然又は合成又は半合成の脂肪油又は脂肪酸、天然又は合成又は半合成のモノグリセリド、又はジグリセリド、又はトリグリセリドが含まれる。非経口投与は当該技術分野で知られており、その非限定的な例に含まれるのは、通常の注射手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記載されているガス圧針なし注射装置、米国特許第５，８３９，４４６号に記載されているレーザー穿孔装置である（全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。

【0300】

経口投与のための製剤は、腸壁の透過性を人為的に増加させるためのアジュバント（例えば、レゾルシノール及びポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン界面活性剤）の同時投与、ならびに酵素分解を阻害するための酵素阻害剤（例えば、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＦ）及びトラシロール）の同時投与に依存する。タンパク質及びタンパク質足場を含む親水性物質の送達のための製剤、ならびに口腔、口腔、口腔、粘膜、鼻腔、肺、膣経膜、又は直腸投与のための少なくとも２つの界面活性剤の組み合わせが、米国特許第６，３０９，６６３号に記載されている。経口投与用の固形剤形の有効成分化合物は、スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成ポリマー、及びグリセリドを含む少なくとも１つの添加剤と混合することができる。これらの剤形はまた、他のタイプの添加剤、例えば、不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、パラベン、ソルビン酸、アスコルビン酸、α－トコフェロールなどの保存剤、システインなどの酸化防止剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、着香剤、着香剤などを含むことができる。

【0301】

錠剤及び丸剤は、さらに腸溶コーティング製剤に加工することができる。経口投与用の液体製剤には、医学的使用が許容される乳濁液、シロップ、エリキシル、懸濁液及び溶液製剤が含まれる。これらの製剤は、当該技術分野で通常使用される不活性希釈剤、例えば水を含有することができる。リポソームはまた、インシュリン及びヘパリンのためのドラッグデリバリーシステムとして記載されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。より最近では、混合アミノ酸（プロテイノイド）の人工ポリマーのミクロスフェアが、医薬を送達するために使用されている（米国特許第４，９２５，６７３）。さらに、米国特許第５，８７９，６８１号及び米国特許第５，８７１，７５３号に記載され、経口的に生物学的活性剤を送達するために使用される担体化合物は、当該技術分野で公知である。

【0302】

肺投与のためには、好ましくは、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、肺又は副鼻腔の下気道に到達するのに有効な粒子サイズで送達される。組成物又は医薬組成物は、吸入による治療剤の投与のために当該技術分野で公知の種々の吸入装置又は鼻装置のいずれかによって送達することができる。患者の副鼻腔又は肺胞にエアロゾール化製剤を沈着させることができるこれらの装置は、計量投与吸入器、ネブライザー（例えば、ジェットネブライザー、超音波ネブライザー）、乾燥粉末発生器、スプレーヤーなどを含む。全てのこのようなデバイスは、エアロゾール中に本明細書中に記載される組成物又は医薬組成物の分配のための投与に適した製剤を使用することができる。このようなエーロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）又は固体粒子のいずれかで構成することができる。さらに、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物を含むスプレーは、圧力下でノズルを通して少なくとも１つのタンパク質足場の懸濁液又は溶液を強制的に生成することによって製造することができる。定量噴霧吸入器、噴射剤、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物、及び任意の賦形剤又は他の添加剤は、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスターに含まれる。計量弁の作動により、好ましくは約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～約３μｍのサイズ範囲の粒子を含むエアロゾールとして混合物を放出する。肺投与、製剤及び関連装置のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開第２０１９／０４９８１６に開示されている。

【0303】

粘膜表面を介して吸収するために、組成物は、複数のサブミクロン粒子、粘膜接着性高分子、生物活性ペプチド、及びエマルジョン粒子の粘膜接着を達成することによって粘膜表面を介して吸収を促進する水性連続相を含むエマルジョンを含む（米国特許第５，５１４，６７０号）。本開示のエマルジョンの適用に適した粘液表面には、角膜、結膜、口腔、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸及び直腸投与経路が含まれ得る。膣又は直腸投与のための製剤、例えば坐薬は、賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコール、バセリン、カカオバターなどを含有することができる。鼻腔内投与のための製剤は固体であり、賦形剤として、例えばラクトースを含有することができ、又は点鼻薬の水溶液又は油溶液であってもよい。口腔内投与のためには、賦形剤には、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、プレゲリネチン化デンプンなどが含まれる（米国特許第５，８４９，６９５号）。粘膜投与及び製剤のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／０４９８１６に開示されている。

【0304】

経皮投与のために、本明細書に開示される組成物又は医薬組成物は、リポソーム又はポリマーナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、又はマイクロスフェア（特に断らない限り、集合的にマイクロ粒子と称する）のような送達装置中に封入される。ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びそれらの共重合体などのポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、及びポリホスファゼンなどの合成ポリマー、ならびにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン、及び他のタンパク質、アルギネート及び他の多糖類、ならびにそれらの組み合わせなどの天然ポリマーでできた微粒子を含む、多くの適切なデバイスが知られている（米国特許第５，８１４，５９９号）。経皮投与、製剤及び適切なデバイスのより詳細な説明は、ＰＣＴ公開２０１９／０４９８１６に開示されている。

【0305】

開示された化合物を、長期間、例えば、単回投与から１週間から１年間、対象に送達することが望ましい。種々の徐放性剤形、デポ剤形又はインプラント剤形を用いることができる。例えば、剤形は、体液への溶解度が低い化合物の薬学的に許容される非毒性の塩、例えば、（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ又はジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの多塩基酸との酸付加塩；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオンとの塩、又は例えばＮ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン又はエチレンジアミンから形成される有機カチオンとの塩；又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組合せ、例えば、タンニン酸亜鉛塩を含有することができる。さらに、開示された化合物、又は好ましくは、今説明したもののような比較的不溶性の塩は、注射に適したゲル、例えばゴマ油を含むモノステアリン酸アルミニウムゲルに製剤化することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩などである。注射用の別のタイプの徐放性デポ製剤は、例えば米国特許第３，７７３，９１９号に記載されているようなポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーのような、ゆっくり分解する非毒性の非抗原性ポリマー中にカプセル化するために分散された化合物又は塩を含有するであろう。化合物又は好ましくは比較的不溶性の塩、例えば上述のものもまた、特に動物での使用のために、コレステロールマトリックスシラスティックペレットに製剤化することができる。追加の徐放性製剤、デポ製剤又はインプラント製剤、例えばガス又は液体リポソームは、文献（米国特許第５，７７０，２２２号、及び「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、１９７８）に公知である。

【0306】

適切な投与量は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓら、編集、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（２０００）；ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，Ｃａｌｉｆ．（２０００）；Ｎｕｒｓｉｎｇ ２００１ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ，２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ Ｃｏｒｐ．，Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ，Ｐａ．，２００１；Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｇｕｉｄｅ ２００１，ｅｄ．，Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓｔａｎｇ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ－Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ，Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。好ましい用量は、約０．１～９９及び／又は１００～５００ｍｇ／ｋｇ／投与、又はその任意の範囲、値若しくは分数を任意に含み得るか、又は単回若しくは複数回投与当たり約０．１～５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、又はその任意の範囲、値若しくは割合を達成する。本明細書に開示される組成物又は医薬組成物の好ましい投与量範囲は、被験者の約１ｍｇ／ｋｇ、最大約３、約６又は約１２ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0307】

あるいは、投与される投与量は、既知の因子、例えば、特定の薬剤の薬力学的特性、その投与のモード及び経路；レシピエントの年齢、健康、及び体重；症状の性質及び程度、同時治療の種類、治療の頻度、及び所望の効果に依存して変化し得る。通常、活性成分の投与量は、体重１ｋｇ当たり約０．１～１００ミリグラムであり得る。所望の結果を得るためには、通常、投与当たり０．１～５０、好ましくは０．１～１０ミリグラム／ｋｇ、又は持続放出形態で効果的である。

【0308】

非限定的な例として、ヒト又は動物の治療は、本明細書に開示される組成物又は薬学的組成物の１回又は定期的な投与量として、１～４０日において、１日あたり少なくとも１日約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ又はその任意の範囲、値又は割合として提供され得る。又は代替的又は追加的に、１～５２週の少なくとも１回、又は代替的又は追加的に１～２０年の少なくとも１回、又はそれらの任意の組み合わせで、単一、注入又は反復投与で提供され得る。

【0309】

内服に適した投与形態は、一般に、単位又は容器当たり約０．００１ミリグラム～約５００ミリグラムの活性成分を含有する。これらの医薬組成物において、活性成分は、通常、組成物の全重量に基づいて約０．５～９９．９９９重量％の量で存在するであろう。

【0310】

有効量は、単回（例えば、ボーラス）、複数回又は連続投与当たり約０．００１～約５００ｍｇ／ｋｇの量を含み得るか、又は、本明細書に記載されているか、又は関連技術において公知の方法を用いて行われ、決定されるように、単回、複数回又は連続投与当たり０．０１～５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、又はその中の任意の有効範囲又は値を達成することができる。

【0311】

本明細書に開示されているように、対象に投与される組成物が修飾された細胞である態様において、細胞は、約１×１０^３及び１×１０^１５細胞；約１×１０^４及び１×１０^１２細胞；約１×１０^５及び１×１０^１０細胞；約１×１０^６及び１×１０^９細胞；約１×１０^６及び１×１０^６細胞；約１×１０^６及び１×１０^７細胞；又は約１×１０^６及び２５×１０^６細胞の間で投与することができる。一態様では、細胞は、約５×１０^６～２５×１０^６細胞の間で投与される。

【0312】

開示された組成物及び医薬組成物の医薬上許容される賦形剤、製剤、投与量及び投与方法のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開２０１９／０４９８１６に開示されている。

【0313】

開示の組成物の使用方法
本開示は、当該技術分野で知られているように、又は本明細書に記載されているように、開示された組成物及び薬学的組成物を使用して、例えば、細胞、組織、臓器、動物、又は対象に治療有効量の組成物又は薬学的組成物を投与又は接触させることを含む、細胞、組織、臓器、動物、又は対象における疾患又は障害を治療するための、開示された組成物又は医薬組成物の使用を提供する。１つの態様において、対象は哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。用語「対象」及び「患者」は、本明細書において互換的に使用される。

【0314】

本開示は、細胞、組織、臓器、動物又は対象における少なくとも１つの悪性疾患又は障害を調節又は治療するための方法を提供する好ましくは、悪性疾患はがんである。悪性疾患又は障害の非限定的な例には、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、悪性組織球症、腫瘍随伴症候群／悪性高カルシウム血症、固形腫瘍、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭部がん、頸部がん、遺伝性非ポリポーシスがん、ホジキンリンパ腫、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞がん、精巣がん、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、癌関連骨痛などが含まれる。

【0315】

好ましい態様において、悪性疾患又は障害の治療は、養子細胞療法を含む。例えば、１つの態様において、本開示は、それを必要とする対象への投与のために選択及び／又は拡大された抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含む少なくとも１つの開示された抗体（例えば、ｓｃＦｖ）及び／又はＣＡＲを発現する修飾された細胞を提供する。修飾された細胞は、室温及び体温を含む任意の温度で貯蔵するために処方することができる。修飾された細胞は、凍結保存及びその後の解凍のために処方することができる。修飾された細胞は、無菌パッケージングから対象に直接投与するために、薬学的に許容される担体中に処方することができる。修飾された細胞は、最小レベルの細胞機能及びＣＡＲ発現を確実にするために、細胞生存率及び／又はＣＡＲ発現レベルのインジケーターを用いて、薬学的に許容される担体中に処方することができる。修飾された細胞は、さらなる拡大を阻害し、及び／又は細胞死を防止するために、１つ以上の試薬とともに、所定の密度で、薬学的に許容される担体中に処方することができる。

【0316】

任意のものは、本明細書中に開示される任意の組成物又は医薬組成物の有効量を、そのような調節、治療又は治療を必要とする細胞、組織、臓器、動物又は対象に投与することを含むことができる。このような方法は、任意に、そのような疾患又は障害を治療するための同時投与又は併用療法をさらに含むことができ、ここに、本明細書に開示される任意の組成物又は医薬組成物の投与は、少なくとも１つの化学療法剤（例えば、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品）を同時投与する前に及び／又は後に投与することをさらに含む。

【0317】

いくつかの態様において、対象は、投与後に移植片対宿主（ＧｖＨ）及び／又は宿主対移植片（ＨｖＧ）を発現しない。１つの態様において、投与は全身性である。全身投与は、当該技術分野で公知であり、本明細書に詳細に記載される任意の手段であり得る。好ましくは、全身投与は、静脈内注射又は静脈内注入によって行われる。一態様では、投与は局所的である。局所投与は、当該技術分野で公知であり、本明細書に詳細に記載される任意の手段であり得る。好ましくは、局所投与は、腫瘍内注射若しくは点滴、髄腔内注射若しくは点滴、脳室内注射若しくは点滴、眼内注射若しくは点滴、又は骨内注射若しくは点滴による。

【0318】

いくつかの態様において、治療上有効な用量は、単回用量である。いくつかの態様において、単回用量は、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又は同時に製造されるその間の任意の数の用量のうちの１つである。組成物が自家細胞又は同種細胞であるいくつかの態様において、投与量は、細胞が疾患又は障害を治療するのに十分な時間移植及び／又は持続するのに十分な量である。

【0319】

１つの例において、本開示は、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）又は抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを、抗体又はＣＡＲが腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法を提供する。組成物が修飾された細胞又は細胞集団を含む態様において、細胞又は細胞集団は、自家性又は同種性であり得る。

【0320】

本明細書に記載される治療方法のいくつかの態様において、治療は、修飾され得るか、又は終了され得る。具体的には、治療に使用される組成物が誘導性アポトーシス誘導性ポリペプチドを含む態様において、細胞を誘導剤と接触させることによって、アポトーシスを細胞内で選択的に誘導することができる。治療は、例えば、回復の徴候、又は疾患の重症度／進行の低下の徴候、疾患の寛解／停止の徴候、及び／又は有害事象の発生に応答して、修正又は終了され得る。いくつかの態様において、本方法は、細胞療法の修飾を阻害するために誘導剤の阻害剤を投与する工程を含み、それによって、細胞療法の機能及び／又は効力を回復させる工程（例えば、疾患の徴候又は症状が再び現れるか、又は重症度が増加し、及び／又は有害事象が消失した場合）を含む。

【0321】

抗体／ｓｃＦｖ産生、スクリーニング及び精製
本開示の少なくとも１つの抗体（例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ＶＨ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗原結合断片（Ｆａｂ）又はＦａｂ断片）は、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、又は不死化細胞のクローン集団によって、当技術分野でよく知られているように、必要に応じて産生することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９８７－２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４－２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９９７－２００１）を参照されたい。

【0322】

ｓｃＦｖからのアミノ酸は、免疫原性を低減させるか、又は結合、親和性、オンレート、オフレート、アビディティ、特異性、半減期、安定性、溶解性又は当該技術分野で知られている他の適切な特性を低減、増強若しくは修飾するために変更、付加及び／又は欠失され得る。。

【0323】

所望により、ｓｃＦｖは、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性の保持で操作することができる。この目的を達成するために、足場タンパク質は、親配列及び操作された配列の三次元モデルを使用して、親配列及び種々の概念的に操作された生成物の分析プロセスによって、任意に調製され得る。三次元モデルは一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補配列の可能性のある三次元立体配座構造を例示し、表示し、可能性のある免疫原性を測定するコンピュータプログラム（例えば、Ｘｅｎｃｏｒ社のＩｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒプログラム、カリフォルニア州モンロビア）が利用可能である。これらのディスプレイを検査することにより、候補配列の機能における残基の可能性のある役割、すなわち候補ｓｃＦｖがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析を分析することができる。このようにして、残基は、標的抗原に対する親和性のような所望の特徴が達成されるように、親配列及び参照配列から選択及び組み合わせることができる。あるいは、又は上記の手順に加えて、他の適切な工学的方法を使用することもできる。

【0324】

類似のタンパク質又は断片に特異的に結合するｓｃＦｖのスクリーニングは、ヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡディスプレイ）又はペプチドディスプレイライブラリー、例えばインビトロディスプレイを用いて都合よく達成することができる。この方法は、所望の機能又は構造を有する個々のメンバーのためのペプチドの大きなコレクションのスクリーニングを含む。表示されるヌクレオチド又はペプチド配列は、３～５０００個又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の長さ、しばしば５～１００個のアミノ酸の長さ、しばしば約８～２５個のアミノ酸の長さであり得る。ペプチドライブラリーを生成するための直接化学合成方法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ方法が記載されている。１つのタイプは、バクテリオファージ又は細胞の表面上にペプチド配列を表示することである。各バクテリオファージ又は細胞は、特定の表示されたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような方法は、ＰＣＴ特許公開ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９１／１８９８０、ＷＯ９１／１９８１８、及びＷＯ９３／０８２７８に記載されている。

【0325】

ペプチドのライブラリーを生成するための他のシステムは、インビトロ化学合成及び組換え方法の両方の側面を有する。ＰＣＴ特許公開ＷＯ９２／０５２５８、ＷＯ９２／１４８４３、及びＷＯ９６／１９２５６を参照されたい。さらに米国特許第５，６５８，７５４号、及び同第５，６４３，７６８号を参照されたい。ペプチドディスプレイライブラリー、ベクター、及びスクリーニングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国ケンブリッジシャー）のようなサプライヤーから市販されている。例えば、Ｅｎｚｏｎに譲渡された米国特許第４，７０４，６９２号、同第４，９３９，６６６号、同第４，９４６，７７８号、同第５，２６０，２０３号、同第５，４５５，０３０号、同第５，５１８，８８９号、同第５，５３４，６２１号、同第５，６５６，７３０号、同第５，７６３，７３３号、同第５，７６７，２６０号、同第５８５６４５６号；Ｄｙａｘに譲渡された米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６９８号、同第５，８３７，５００号；Ａｆｆｙｍａｘに譲渡された米国特許第５，４２７，９０８号、同第５，５８０，７１７号；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡された米国特許第５，８８５，７９３号；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された米国特許第５，７５０，３７３号；Ｘｏｍａに譲渡された米国特許第５，６１８，９２０号、同第５，５９５，８９８号、同第５，５７６，１９５号、同第５，６９８，４３５号、同第５，６９３，４９３号、同第５，６９８，４１７号、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，前掲；Ａｕｓｕｂｅｌ，前掲；又はＳａｍｂｒｏｏｋ前掲を参照されたい。

【0326】

本開示のｓｃＦｖは、広範囲の親和性（ＫＤ）でヒト又は他の哺乳動物タンパク質と結合することができる。好ましい態様では、本開示の少なくとも１つのｓｃＦｖは、所望により、当業者によって実施されるよう、表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって決定した場合、高親和性で、例えば、約１０^－７Ｍ以下のＫＤで、例えば、限定されないが、０．１～９．９（又はその中の任意の範囲又は値）×１０^－８、１０^－９、１０^－１０、１０^－１１、１０^－１２、１０^－１３、１０^－１４、１０^－１５又はその中の任意の範囲又は値で標的タンパク質に結合することができる。

【0327】

抗原に対するｓｃＦｖの親和性又は結合活性は、任意の適切な方法を用いて実験的に決定することができる（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編集，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；及びそこに記載される方法を参照されたい）。特定のｓｃＦｖ－抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定された場合に変化し得る。従って、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、好ましくは、タンパク質足場及び抗原の標準溶液、ならびに本明細書に記載される緩衝液のような標準化緩衝液を用いて行う。

【0328】

どのタンパク質、抗体、及び他のアンタゴニストが、本開示のｓｃＦｖと標的タンパク質への結合に関して競合するか、及び／又はエピトープ領域を共有するかを決定するために、本開示のｓｃＦｖを用いて競合アッセイを実施することができる。これらのアッセイは、当業者に容易に知られているように、タンパク質上の限られた数の結合部位に対するアンタゴニスト又はリガンド間の競合を評価する。タンパク質及び／又は抗体は、競合の前又は後に固定化又は不溶化され、標的タンパク質に結合した試料は、例えば、デカンティング（タンパク質／抗体が事前に不溶化された場合）又は遠心分離（競合反応後にタンパク質／抗体が沈降した場合）によって、非結合試料から分離される。また、競合結合は、機能が標的タンパク質へのｓｃＦｖの結合又は結合の欠如によって変化するかどうか、例えば、ｓｃＦｖ分子が、例えば、標識の酵素活性を阻害又は増強するかどうかによって決定され得る。当該技術分野で周知のように、ＥＬＩＳＡ及び他の機能的アッセイを使用することができる。

【0329】

核酸分子
ｓｃＦｖをコードする開示の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ又は他の任意の形態のようなＲＮＡの形態であってもよく、又はＤＮＡの形態であってもよく、これには、クローニング又は合成的に生産されたｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖又は一本鎖、又はそれらの任意の組合せであり得る。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１本の鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよく、又はアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。

【0330】

本開示の単離された核酸分子は、場合により、１つ以上のイントロン、例えば、少なくとも１つのｓｃＦｖの少なくとも１つの特定部分とともに、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子；標的タンパク質に結合するタンパク質骨格又はループ領域のコード配列を含む核酸分子；及び上述のものとは実質的に異なるヌクレオチド配列を含むが、遺伝コードの縮重のために、本明細書に記載され、及び／又は当該技術分野で公知のように、依然としてタンパク質骨格をコードする核酸分子を含むことができる。もちろん、遺伝暗号は当該技術分野で周知である。従って、本開示の特異的ｓｃＦｖをコードするそのような縮重核酸変異体を生成することは、当業者にとって日常的であろう。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照され、そのような核酸変異体は、本開示に含まれる。

【0331】

本明細書に示されるように、ｓｃＦｖをコードする核酸を含む本開示の核酸分子には、限定されないが、ｓｃＦｖ断片のアミノ酸配列を単独でコードするもの；タンパク質足場全体又はその一部のコード配列；ｓｃＦｖ、断片又は部分のコード配列、ならびに少なくとも１つのイントロンなどの前述の追加のコード配列を伴う又は伴わない、少なくとも１つのシグナルリーダー又は融合ペプチドのコード配列などの追加の配列、さらに、転写、スプライシング及びポリアデニル化シグナルを含むｍＲＮＡプロセシングで役割（例えば、リボソーム結合とｍＲＮＡの安定性）を果たす転写された非翻訳配列などの非コード５’及び３’配列を含むがこれらに限定されない追加の非コード配列；追加の機能を提供するものなどの追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列が含まれ得る。このようにして、タンパク質足場をコードする配列は、タンパク質足場断片又は部分を含む融合タンパク質足場の精製を容易にするペプチドをコードする配列などのマーカー配列に融合され得る。

【0332】

本明細書に記載のポリヌクレオチドへ選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本開示は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示されたポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸を提供する。従って、ポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び／又は定量するために使用することができる。例えば、本開示のポリヌクレオチドを用いて、寄託ライブラリー中の部分的又は全長クローンを同定、単離、又は増幅することができる。ポリヌクレオチドは、ヒト又は哺乳動物核酸ライブラリーから単離されたゲノム又はｃＤＮＡ配列であってもよく、又はヒト又は哺乳動物核酸ライブラリーからのｃＤＮＡに相補的であってもよい。

【0333】

好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％の全長配列、好ましくは少なくとも８５％又は９０％の全長配列、より好ましくは少なくとも９５％の全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリーは、希少配列の表現を増加させるために正規化することができる。低又は中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、相補的配列に対して減少した配列同一性を有する配列とともに典型的に使用されるが、それだけではない。中等度及び高度のストリンジェンシー条件を、より大きな同一性の配列のために任意に使用することができる。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オルソロガス配列又はパラロガス配列を同定するために使用することができる。

【0334】

任意に、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質骨格の少なくとも一部をコードするであろう。ポリヌクレオチドは、本開示のタンパク質足場をコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションのために用いることができる核酸配列を包含する。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ；上記のＣｏｌｌｉｇａｎを参照されたい。

【0335】

核酸の構築
本開示の単離された核酸は、（ａ）組換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、及び／又は（ｄ）それらの組み合わせを用いて、当該技術分野で周知であるように製造することができる。

【0336】

核酸は、都合よく、本開示のポリヌクレオチドに加えてヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離を助けることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、本開示の翻訳されたポリヌクレオチドの単離を助けることができる。例えば、ヘキサ－ヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。コード配列を除いた本開示の核酸は、任意に、本開示のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプター、又はリンカーである。

【0337】

さらなる配列を、そのようなクローニング及び／又は発現配列に加えて、クローニング及び／又は発現におけるそれらの機能を最適化し、ポリヌクレオチドの単離を助け、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改良することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当該技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出；又はＳａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照されたい）。

【0338】

核酸構築のための組換え法
本開示の単離された核酸組成物、例えばＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの任意の組合せは、当業者に公知の任意の数のクローニング方法を用いて生物学的供給源から得ることができる。いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチドに厳密な条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の配列を同定する。ＲＮＡの単離、及びｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーの構築は、当業者に周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出；又はＳａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照されたい）。

【0339】

核酸のスクリーニング及び単離方法
ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーは、本開示のポリヌクレオチドの配列に基づいてプローブを用いてスクリーニングすることができる。プローブを用いてゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて、同じ生物又は異なる生物において相同遺伝子を単離することができる。当業者であれば、種々の程度のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーをアッセイに用いることができ、ハイブリダイゼーション又は洗浄媒体のいずれかをストリンジェントにすることができることを理解するであろう。ハイブリダイゼーションの条件がより厳しくなるにつれて、二本鎖形成が起こるためには、プローブと標的との間に、より高い程度の相補性がなければならない。ストリンジェンシーの程度は、１つ以上の温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドのような部分変性溶媒の存在によって制御することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、０％～５０％の範囲内のホルムアミドの濃度の操作を通して、反応体溶液の極性を変化させることによって都合よく変化させる。検出可能な結合に必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒体及び／又は洗浄媒体のストリンジェンシーに従って変化する。相補性の程度は、最適には１００％、又は７０～１００％、又はその中の任意の範囲又は値である。しかしながら、プローブ及びプライマーにおけるわずかな配列変異は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄媒体のストリンジェンシーを減少させることによって補償することができることを理解すべきである。

【0340】

ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に提示された教示及びガイダンスに基づいて、過度の実験を行うことなく開示に従って使用することができる。

【0341】

ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の公知の方法には、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連増幅プロセス（例えば、Ｍｕｌｌｉｓらによる米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８；Ｔａｂｏｒらによる米国特許第４，７９５，６９９号及び同第４，９２１，７９４号；Ｉｎｎｉｓによる米国特許第５，１４２，０３３号；Ｗｉｌｓｏｎらによる米国特許第５，１２２，４６４号；Ｉｎｎｉｓによる米国特許第５，０９１，３１０号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎらによる米国特許第５，０６６，５８４号；Ｇｅｌｆａｎｄらによる米国特許第４，８８９，８１８号；Ｓｉｌｖｅｒらによる米国特許第４，９９４，３７０号；Ｂｉｓｗａｓによる米国特許第４，７６６，０６７号；Ｒｉｎｇｏｌｄによる米国特許第４，６５６，１３４号を参照されたい）、及び二本鎖ＤＮＡ合成の鋳型として標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ媒介増幅（Ｍａｌｅｋらによる米国特許第５，１３０，２３８号、商標名ＮＡＳＢＡ）が含まれ、参考文献の全内容は参照により本明細書に援用される（Ａｕｓｕｂｅｌ，前掲；又はＳａｍｂｒｏｏｋ前掲を参照されたい）。

【0342】

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから直接開示のポリヌクレオチド及び関連遺伝子の配列を増幅することができる。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅方法は、例えば、発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするため、試料中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を作製するため、核酸配列決定のため、又は他の目的のために有用であり得る。インビトロ増幅法により当業者を指揮するのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、前掲、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前掲、Ａｕｓｕｂｅｌ、前掲、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７年）；Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に見られる。ゲノムＰＣＲ増幅のための市販のキットは、当該技術分野で公知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ－ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照されたい。さらに、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（ベーリンガーマンハイム）を使用して、長いＰＣＲ産物の収率を改善することができる。

【0343】

核酸の合成法
本開示の単離された核酸は、公知の方法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前述参照）による直接化学合成によって調製することもできる。化学合成は、一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、又は鋳型として一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼとの重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成が約１００又はそれ以上の塩基の配列に限定され得るが、より短い配列の連結によってより長い配列を得ることができることを認識するであろう。

【0344】

組換え発現カセット
本開示はさらに、本開示の核酸を含む組換え発現カセットを提供する。本開示の核酸配列、例えば、本開示のタンパク質足場をコードするｃＤＮＡ又はゲノム配列を使用して、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入することができる組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、典型的には、意図された宿主細胞におけるポリヌクレオチドの転写を指令する転写開始調節配列に機能し得るように連結された本開示のポリヌクレオチドを含む。異種性及び非異種性（すなわち、内因性）プロモーターの両方を用いて、本開示の核酸の発現を指示することができる。

【0345】

いくつかの態様において、プロモーター、エンハンサー、又は他のエレメントとして機能する単離された核酸を、開示のポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置（上流、下流又はイントロン）に導入して、開示のポリヌクレオチドの発現を上方又は下方制御することができる。例えば、内因性プロモーターは、突然変異、欠失及び／又は置換によってインビボ又はインビトロで修飾することができる。

【0346】

発現ベクター及び宿主細胞
本開示はまた、本開示の単離された核酸分子、組換えベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、及び組換え技術による少なくとも１つのタンパク質骨格の産生を含むベクターに関する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照されたい。

【0347】

ポリヌクレオチドは、場合により、宿主中で増殖するための選択マーカーを含むベクターに結合させることができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中、又は荷電脂質との複合体中に導入される。ベクターがウイルスである場合には、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングし、次に宿主細胞に形質導入することができる。

【0348】

ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに機能的に連結されていなければならない。発現構築物は、転写開始部位、終結部位、及び転写領域において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含むであろう。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、開始時に開始する翻訳及び翻訳されるｍＲＮＡの末端に適切に位置する終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含み、哺乳動物又は真核細胞の発現に好ましいＵＡＡ及びＵＡＧを含む。

【0349】

発現ベクターは、好ましくは、しかし任意に少なくとも１つの選択マーカーを含むであろう。このようなマーカーには、例えば、限定されないが、アンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに耐性を付与する）、ミコフェノール酸、又はグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号）、ブラストサイジン（ｂｓｄ遺伝子）、真核細胞培養の耐性遺伝子、及びアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、又は大腸菌及び他の細菌又は原核生物で培養するためのテトラサイクリン耐性遺伝子（上記の特許は、参照により完全に本明細書に組み込まれる）が挙げられる。上記宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は、当該技術分野で公知である。適切なベクターは、当業者には容易に明らかであろう。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、感染又は他の公知の方法によって行うことができる。このような方法は、当該技術分野、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前掲、１－４及び１６－１８章；Ａｕｓｕｂｅｌ、前掲、１、９、１３、１５、１６章に記載されている。

【0350】

発現ベクターは、好ましくは、しかし必要に応じて、本開示の組成物及び方法によって修飾された細胞の単離のための少なくとも１つの選択可能な細胞表面マーカーを含むであろう。本開示の選択可能な細胞表面マーカーは、細胞又は細胞のサブセットを別の定義された細胞のサブセットから区別する表面タンパク質、糖タンパク質、又はタンパク質のグループを含む。好ましくは、選択可能な細胞表面マーカーは、本開示の組成物又は方法によって修飾されたそれらの細胞を、本開示の組成物又は方法によって修飾されないそれらの細胞から区別する。このような細胞表面マーカーには、例えば、限定されないが、ＣＤ１９、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、又はそれらの任意の組み合わせの短縮形又は完全長形態などの「指定のクラスター」又は「分類決定因子」タンパク質（しばしば「ＣＤ」と略される）が含まれる。細胞表面マーカーはさらに、自殺遺伝子マーカーＲＱＲ８（Ｐｈｉｌｉｐ Ｂら、Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ａｕｇ ２１；１２４（８）：１２７７－８７）を含む。

【0351】

発現ベクターは、好ましくは、しかし必要に応じて、本開示の組成物及び方法によって修飾された細胞の単離のための少なくとも１つの選択可能な薬物耐性マーカーを含むであろう。本開示の選択可能な薬剤耐性マーカーは、野生型又は突然変異体Ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＭＤＲ１、ＡＬＤＨ１、ＮＫＸ２．２、又はそれらの任意の組合せを含み得る。

【0352】

開示の少なくとも１つのタンパク質骨格は、融合タンパク質のような修飾された形態で発現され得、分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能領域も含むことができる。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、宿主細胞中、精製中、又はその後の取扱い及び貯蔵中の安定性及び持続性を改善するために、タンパク質足場のＮ末端に加えることができる。また、ペプチド部分は、精製を容易にするために、開示のタンパク質骨格に加えることができる。このような領域は、タンパク質骨格又はその少なくとも１つの断片の最終調製の前に除去することができる。このような方法は、多くの標準的な実験室マニュアル、例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ，前掲，Ｃｈａｐｔｅｒｓ １７．２９－１７．４２及び１８．１－１８．７４；Ａｕｓｕｂｅｌ，前掲，Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６，１７及び１８に記載されている。

【0353】

当業者は、本開示のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系に精通している。あるいは、本開示の核酸は、本開示のタンパク質足場をコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞においてオン（操作によって）にすることによって、宿主細胞中で発現され得る。このような方法は、例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、及び同第５，７３３，７６１号に記載されているように、当該技術分野で周知である。

【0354】

タンパク質足場、その特定の部分又は変異体の製造に有用な細胞培養物の例は、当該技術分野で公知の細菌、酵母、及び哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、しばしば、細胞の単層の形態であるが、哺乳動物細胞懸濁液又はバイオリアクターも使用することができる。無傷のグリコシル化タンパク質を発現することができる多くの適切な宿主細胞株が当技術分野で開発されており、ＣＯＳ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ－７（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）及びＢＳＣ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６）細胞株、Ｃｏｓ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などであり、これらは、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である。好ましい宿主細胞は、骨髄腫及びリンパ腫細胞のようなリンパ系由来の細胞を含む。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ－１５８０）及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ－１８５１）である。好ましい態様において、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３又はＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞である。

【0355】

これらの細胞の発現ベクターは、限定されるものではないが、以下の発現制御配列、例えば、複製起点；プロモーター（例えば、後期又は初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒトプロモーター；エンハンサー、及び／又はプロセッシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原ポリＡ付加部位）、及び転写ターミネーター配列のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照されたい。本開示の核酸又はタンパク質の生産に有用な他の細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ及びＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）又は他の公知又は商業的供給源から公知及び／又は入手可能である。

【0356】

真核生物宿主細胞を用いる場合、ポリアデニル化又は転写ターミネーター配列は、典型的には、ベクターに組み込まれる。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。転写産物の正確なスプライシングのための配列も含めることができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０（Ｓｐｒａｇｕｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３－７８１（１９８３））由来のＶＰ１イントロンである。さらに、宿主細胞における複製を制御する遺伝子配列を、当該技術分野で公知のように、ベクターに組み込むことができる。

【0357】

ｓｃＦｖ精製
ｓｃＦｖは、タンパク質Ａ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない、周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に用いることができる。例えば、各々が全体として参照により本明細書に援用されるＣｏｌｌｉｇａｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７－２００１）、例えば、１、４、６、８、９、１０章を参照されたい。

【0358】

本開示のｓｃＦｖには、精製された生成物、化学合成方法の生成物、及び、例えば、大腸菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む、原核生物又は真核生物宿主からの組換え技術により製造された生成物が含まれる。組換え生産手順で使用される宿主に依存して、開示のタンパク質骨格はグリコシル化され得るか又は非グリコシル化され得る。このような方法は、多数の標準的な実験室マニュアルに記載され、例えば、全体として本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ，前掲，Ｓｅｃｔｉｏｎｓ １７．３７－１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ，前掲，Ｃｈａｐｔｅｒｓ １０，１２，１３，１６，１８及び２０、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，前掲，Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２－１４を参照されたい。

【0359】

アミノ酸コード
本開示のタンパク質骨格を構成するアミノ酸は、しばしば省略される。アミノ酸の指定は、当該技術分野においてよく理解されているように、その一文字コード、その三文字コード、名前、又は３つのヌクレオチドコドンによってアミノ酸を指定することによって示すことができる（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照されたい）。本開示のタンパク質骨格は、本明細書中に明記されるように、自然発生的又は突然変異及び／又はヒト操作からの１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むことができる。機能に必須である本開示のタンパク質骨格中のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニン走査突然変異誘発のような当該技術分野で公知の方法によって同定することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，前掲，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ８，１５；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５（１９８９）を参照されたい）。後者の方法は、分子中のすべての残基に単一のアラニン突然変異を導入する。次に、得られた突然変異体分子を、限定されるものではないが、少なくとも１つの中和活性などの生物学的活性について試験する。タンパク質骨格結合に重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴又は光親和性標識のような構造分析によって同定することもできる（Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９－９０４（１９９２）及びｄｅ Ｖｏｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６－３１２（１９９２））。

【0360】

当業者が理解するように、本開示は、本開示の少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質骨格を含む。生物学的に活性なタンパク質足場は、天然（非合成）、内因性又は関連する既知のタンパク質足場の比活性の少なくとも２０％、３０％、又は４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、又は７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、９０％、又は９５％～９９％以上の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性の測定値をアッセイ及び定量する方法は、当業者に周知である。

【0361】

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるように、有機部分の共有結合付着によって修飾されるタンパク質足場及び断片に関する。このような修飾は、改善された薬物動態特性（例えば、インビボ血清半減期の増加）を有するタンパク質足場断片を生成することができる。有機部分は、直鎖状又は分枝鎖状の親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。特に、親水性ポリマー基は、約８００～約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー又はポリビニルピロリドンであり得、脂肪酸又は脂肪酸エステル基は、約８～約４０個の炭素原子を含むことができる。

【0362】

本開示の修飾されたタンパク質足場及び断片は、抗体に直接的又は間接的に共有結合された１つ以上の有機部分を含むことができる。本開示のタンパク質骨格又は断片に結合される各有機部分は、独立して親水性ポリマー基、脂肪酸基又は脂肪酸エステル基であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「脂肪酸」は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」という用語は、本明細書中で使用される場合、オクタンよりも水に溶解性が高い有機ポリマーを指す。例えば、ポリリジンはオクタンよりも水に溶けやすい。したがって、ポリリジンの共有結合により修飾されたタンパク質足場は、本開示に包含される。本開示のタンパク質足場を修飾するのに適した親水性ポリマーは、直鎖状又は分枝状であり得、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、及びポリビニルピロリドンが含まれる。好ましくは、本開示のタンパク質骨格を修飾する親水性ポリマーは、別個の分子実体として約８００～約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、下付き文字がダルトンにおけるポリマーの平均分子量であるＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００を使用することができる。親水性ポリマー基は、１～約６個のアルキル、脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、適切な方法を用いることによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーを脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボキシレートにカップリングさせることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（例えば、Ｎ，Ｎ－カルボニルジイミダゾールで活性化）をポリマー上のヒドロキシル基にカップリングさせることができる。

【0363】

本開示のタンパク質足場を修飾するのに適した脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和であってもよく、又は１つ以上の不飽和ユニットを含んでもよい。本開示のタンパク質足場を修飾するのに適した脂肪酸には、例えば、ｎ－ドデカノエート（Ｃ１２、ラウレート）、ｎ－テトラデカノエート（Ｃ１４、ミリステート）、ｎ－オクタデカノエート（Ｃ１８、ステアレート）、ｎ－エイコサノエート（Ｃ２０、アラキデート）、ｎ－ドコサノエート（Ｃ２２、ベヘネート）、ｎ－トリアコンタノエート（Ｃ３０）、ｎ－テトラコンタノエート（Ｃ４０）、ｃｉｓ－Δ９－オクタデカノエート（Ｃ１８、オレエート）、全ｃｉｓ－Δ５，８，１１，１４－エイコサテトラエノエート（Ｃ２０、アラキドン酸）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが含まれる。適切な脂肪酸エステルには、直鎖又は分枝鎖状の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルが含まれる。低級アルキル基は、１～約１２個、好ましくは１～約６個の炭素原子を含むことができる。

【0364】

修飾されたタンパク質足場及び断片は、１種以上の修飾剤との反応などの適切な方法を用いて調製することができる。本明細書において用語として使用される「修飾剤」とは、活性化基を含む好適な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」とは、適切な条件下で第２の化学基と反応し、それによって修飾剤と第２の化学基との間に共有結合を形成することができる化学部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性化基には、求電子基、例えば、トシレート、メシレート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などが含まれる。チオールと反応し得る活性化基としては、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５－チオール－２－ニトロ安息香酸チオールなどが挙げられる。アルデヒド官能基はアミナーヒドラジド含有分子にカップリングされ得、アジド基は三価リン酸基と反応してホスホラミデート又はホスホリミド結合を形成し得る。活性化基を分子に導入するための適切な方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）参照）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接結合することができ、又はリンカー部分、例えば、１つ以上の炭素原子が酸素、窒素又は硫黄のようなヘテロ原子で置換され得る二価Ｃ１～Ｃ１２基を介して結合することができる。適切なリンカー部分としては、例えば、テトラエチレングリコール、－（ＣＨ_２）_３－、－ＮＨ－（ＣＨ_２）_６－ＮＨ－、－（ＣＨ_２）_２－ＮＨ－及び－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ－ＮＨ－が含まれる。リンカー部分を含む修飾剤は、例えば、モノ－Ｂｏｃ－アルキルジアミン（例えば、モノ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン、モノ－Ｂｏｃ－ジアミノヘキサン）を、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で脂肪酸と反応させて、遊離アミンと脂肪酸カルボン酸との間にアミド結合を形成することによって製造することができる。Ｂｏｃ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理することによって生成物から除去することができ、これにより、第一級アミンを、に記載のように、別のカルボキシレートとカップリングさせることができ、又は無水マレイン酸と反応させ、得られた生成物を環化して、脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成させることができる（例えば、全技術が参照により本明細書に援用されるＴｈｏｍｐｓｏｎら、ＷＯ９２／１６２２１を参照されたい）。

【0365】

本開示の修飾されたタンパク質足場は、タンパク質足場又は断片を修飾剤と反応させることによって製造することができる。例えば、有機部分は、アミン反応性修飾剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを用いることによって、非部位特異的な様式でタンパク質骨格に結合することができる。本開示のタンパク質足場の特定の部位に結合された有機部分を含む修飾されたタンパク質足場及び断片は、適切な方法、例えば、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３：１４７－１５３（１９９２）；Ｗｅｒｌｅｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：４１１－４１７（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３－２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９－６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６－４６３（１９９７））、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）に記載される方法を用いて調製することができる。

【0366】

定義
開示全体を通じて使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明白に他のことを指示しない限り、複数の基準を含む。従って、例えば、「方法」への言及は、複数のそのような方法を含み、「用量」への言及は、当業者に公知の１つ以上の用量及びその等価物への言及を含む。

【0367】

用語「約」又は「ほぼ」は、当業者によって決定される特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、例えば、測定システムの限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、１つ以上の標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、又は最大１０％、又は最大５％、又は最大１％の範囲を意味し得る。別法として、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が出願及びクレームに記載されている場合、別段の記載がない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内の「約」意味の用語が仮定されるべきである。

【0368】

本開示は、単離又は実質的に精製されたポリヌクレオチド又はタンパク質組成物を提供する。「単離された」若しくは「精製された」ポリヌクレオチド若しくはタンパク質、又はそれらの生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境において見出されるように、ポリヌクレオチド若しくはタンパク質に通常付随又は相互作用する成分を実質的に又は本質的に含まない。従って、単離された又は精製されたポリヌクレオチド又はタンパク質は、組換え技術によって生産される場合には他の細胞材料又は培地を実質的に含まず、化学的に合成される場合には化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡ中のポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドの５’及び３’末端に位置する配列）に天然に隣接する配列（最適にはタンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、種々の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ中のポリヌクレオチドに天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量）未満の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む。開示のタンパク質又はその生物学的に活性な部分が組換え的に産生される場合、最適な培養培地は、化学的前駆体又は目的の非タンパク質化学物質の約３０％、２０％、１０％、５％又は１％（乾燥重量）未満を表す。

【0369】

本開示は、開示されたＤＮＡ配列及びこれらのＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の断片及びバリアントを提供する。開示全体を通じて使用される場合、用語「断片」は、ＤＮＡ配列の一部又はアミノ酸配列の一部、ひいてはそれによってコードされるタンパク質を指す。コード配列を含むＤＮＡ配列の断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持し、従って本明細書に記載されているように、ＤＮＡ認識又は標的ＤＮＡ配列への結合活性を保持するタンパク質断片をコードすることができる。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なＤＮＡ配列の断片は、一般に、生物学的活性を保持するか、又はプロモーター活性を保持しないタンパク質をコードしない。従って、ＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、及び本開示の全長ポリヌクレオチドまでの範囲であり得る。

【0370】

本開示の核酸又はタンパク質は、最終目的地ベクターに組み立てることができる標的ベクター中のモノマー単位及び／又は反復単位を前もって組み立てることを含むモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示のポリペプチドは、本開示の反復モノマーを含んでもよく、標的ベクター中の反復単位を前もって組み立てることによりモジュラーアプローチにより構築することができ、その後最終目的地ベクター中に組み立てることができる。本開示は、本方法により製造されたポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示は、このモジュラーアプローチを生成したポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主生物及び細胞を提供する。

【0371】

用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、特に、単一モノクローナル抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）及びポリエピトープ特異性を有する抗体組成物を包含する。本明細書において定義される本明細書中の抗体の天然又は合成類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、相同体及びオルソログ（本明細書において総称して「類似体」と称する）を使用することも本明細書の範囲内である。従って、本明細書の一態様によれば、その最も広い意味における用語「本明細書の抗体」は、そのような類似体も包含する。一般に、このような類似体では、本明細書に定義される本明細書の抗体と比較して、１つ以上のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は添加されていてもよい。

【0372】

本明細書で使用される「抗体断片」、及びそのすべての文法的変形は、抗原結合部位又は無傷の抗体の可変領域を含む無傷の抗体の一部として定義され、その部分は、無傷の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体のアイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を含まない。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；連続アミノ酸残基（本明細書では「一本鎖抗体断片」又は「一本鎖ポリペプチド」と称する）の１つの連続した配列からなる一次構造を有する任意の抗体断片（限定するわけではないが、（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子（２）１つの軽鎖可変ドメインを含む単鎖ポリペプチド、又は軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含み、結合した重鎖部分を含まない断片；及び（３）１つの重鎖可変領域のみを含む単鎖ポリペプチド、又は結合した軽鎖部分を伴わない重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含むそれらの断片；ならびに抗体断片から形成される多特異的又は多価構造を含む）が挙げられる。１つ以上の重鎖を含む抗体断片において、重鎖は、インタクト抗体の非Ｆｃ領域に見出される任意の定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプにおけるＣＨＩ）を含み得る、及び／又はインタクト抗体に見出される任意のヒンジ領域配列を含み得る、及び／又はヒンジ領域配列又は重鎖の定常ドメイン配列に融合又は位置するロイシンジッパー配列を含み得る。用語はさらに、一般に単一のモノマー可変抗体ドメイン（例えば、ラクダ由来）を有する抗体断片を指す単一ドメイン抗体（「ｓｄＡＢ」）を含む。このような抗体断片タイプは、当業者によって容易に理解されるであろう。

【0373】

「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の配列特異的で非共有結合的な相互作用をいう。結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基の接触）。ただし、相互作用全体が配列特異的であることを条件とする。

【0374】

用語「含む」は、組成物及び方法が、列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図する。組成物及び方法を定義するために使用される場合、「本質的にからなる」とは、意図された目的のために使用される場合、組合せにとって本質的に重要な他の要素を排除することを意味するものとする。従って、本明細書に定義される元素から本質的に構成される組成物は、微量の汚染物質又は不活性担体を排除しないであろう。「からなる」とは、他の成分の微量元素を超えるもの及び実質的な方法工程を排除することをいう。これらの移行用語の各々によって定義される側面は、本開示の範囲内である。

【0375】

用語「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、エピトープに特有の空間的立体配座を有する３つのアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも４個、５個、６個、又は７個のそのようなアミノ酸からなり、より一般的には、少なくとも８個、９個、又は１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的立体配座を決定する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶解析及び二次元核磁気共鳴を含む。

【0376】

本明細書中で使用される「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0377】

「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することをいう。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡ、又は任意の他のタイプのＲＮＡ）又はｍＲＮＡの翻訳によって生成されるタンパク質の直接転写産物であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、並びに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、及びグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。

【0378】

遺伝子発現の「調節」又は「制御」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0379】

用語「操作可能に連結された」又はその同等物（例えば、「操作可能的に連結された」）は、２つ以上の分子が、１つ若しくは両方の分子又はそれらの組み合わせに起因する機能に影響を与えるように相互作用することができるように、互いに対して配置されることを意味する。

【0380】

非共有結合的に連結された成分、及び非共有結合的に連結された成分を製造及び使用する方法が開示されている。種々の構成要素は、本明細書に記載されるように、種々の異なる形態をとることができる。例えば、非共有結合（すなわち、機能的に連結された）タンパク質を使用して、当該技術分野における１つ以上の問題を回避する一時的な相互作用を可能にすることができる。タンパク質のような非共有結合成分が会合及び解離する能力は、所望の活性のためにそのような会合が必要とされる場合にのみ、又は主にそのような会合が必要とされる状況下でのみ、機能的会合を可能にする。結合は、所望の効果を可能にするのに十分な持続時間であってもよい。

【0381】

生物のゲノム中の特定の遺伝子座にタンパク質を導く方法が開示されている。本方法は、ＤＮＡ局在化成分を提供し、エフェクター分子を提供する工程を含んでもよく、ここで、ＤＮＡ局在化成分及びエフェクター分子は、非共有結合を介して作動可能に連結することができる。

【0382】

用語「ｓｃＦｖ」は、一本鎖可変断片を指す。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドと結合した免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーペプチドは、約５～４０個のアミノ酸、又は約１０～３０個のアミノ酸、又は長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０個のアミノ酸であり得る。一本鎖可変断片は、完全な抗体分子に見出される定常Ｆｃ領域、従って、抗体を精製するために使用される共通の結合部位（例えば、プロテインＧ）を欠いている。該用語はさらに、体内であるｓｃＦｖ、細胞の細胞質内で安定であり、細胞内タンパク質に結合し得る抗体を含む。

【0383】

用語「単一ドメイン抗体」は、特異的抗原に選択的に結合することができる単一のモノマー可変抗体ドメインを有する抗体断片を意味する。単一ドメイン抗体は、一般に、長さ約１１０アミノ酸のペプチド鎖であり、重鎖抗体の１つの可変ドメイン（ＶＨ）又は共通ＩｇＧを含み、これらは、一般に、抗体全体として抗原に対して類似の親和性を有するが、界面活性剤及び高濃度の尿素に対してより耐熱性で安定である。実施例は、ラクダ又は魚の抗体に由来するものである。あるいは、単一ドメイン抗体は、４つの鎖を有する共通のマウス又はヒトＩｇＧから作製することができる。

【0384】

本明細書中で使用される用語「特異的に結合する」及び「特異的結合」は、異なる抗原の均一な混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する抗体、抗体断片又はナノボディの能力を指す。いくつかの態様において、特異的結合相互作用は、試料中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを区別するであろう。ある態様では、約１００倍以上（例えば、約１０００倍以上又は１０，０００倍以上）である。「特異性」とは、免疫グロブリン又はナノボディなどの免疫グロブリン断片が、異なる抗原標的に対して選択的に１つの抗原標的に結合する能力を指し、必ずしも高い親和性を意味しない。

【0385】

「標的部位」又は「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合、結合分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。

【0386】

用語「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを指す。一本鎖の描写も相補鎖の配列を規定する。従って、核酸はまた、示された一本鎖の相補鎖を包含し得る。本開示の核酸は、同じ構造を保持するか、又は同じタンパク質をコードする実質的に同一の核酸及びその相補物も含む。

【0387】

本開示のプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得る一本鎖核酸を含み得る。従って、本開示の核酸は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを指すことができる。

【0388】

本開示の核酸は一本鎖又は二本鎖であり得る。本開示の核酸は、分子の大部分が一本鎖であっても、二本鎖配列を含み得る。本開示の核酸は、分子の大部分が二本鎖であっても、一本鎖配列を含み得る。本開示の核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらのハイブリッドが含まれ得る。本開示の核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせを含み得る。本開示の核酸は、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る。本開示の核酸は、非天然アミノ酸修飾を含むように合成することができる。本開示の核酸は、化学合成方法又は組換え方法によって得ることができる。

【0389】

本開示の核酸、その全配列、又はその任意の部分は、天然に存在しないものであってもよい。本開示の核酸は、天然に存在しない１つ以上の突然変異、置換、欠失、又は挿入を含み、全核酸配列を非天然に存在させることができる。本開示の核酸は、１つ以上の重複、逆転又は反復配列を含み得、その結果として生じる配列は天然に存在せず、全核酸配列を非天然に存在させる。本開示の核酸は、天然に存在しない修飾ヌクレオチド、人工ヌクレオチド、又は合成ヌクレオチドを含み、全核酸配列を非天然に存在させることができる。

【0390】

遺伝暗号の重複性を考慮すると、複数のヌクレオチド配列は、任意の特定のタンパク質をコードし得る。そのようなヌクレオチド配列はすべて、本明細書において意図される。

【0391】

本開示全体を通じて使用される場合、用語「機能的に連結された」は、それが空間的に連結されているプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指す。プロモーターは、制御下にある遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に位置することができる。プロモーターと遺伝子との距離は、プロモーターが由来する遺伝子の中で、そのプロモーターとそれが制御する遺伝子との距離とほぼ同じである。プロモーターと遺伝子との距離の変化は、プロモーターの機能を失うことなく対応できる。

【0392】

本開示全体を通じて使用される場合、用語「プロモーター」は、細胞中の核酸の発現を付与、活性化又は増強することができる合成又は天然由来の分子を指す。プロモーターは、発現をさらに増強し、及び／又は同じものの空間的発現及び／又は時間的発現を変化させるために、１つ以上の特異的転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、転写開始部位から数千塩基対ほど離れた位置に位置する遠位のエンハンサー又はリプレッサーエレメントを含むことができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫及び動物を含む供給源から誘導することができる。プロモーターは、細胞、発現が起こる組織若しくは器官、又は発現が起こる発生段階に関して、又は生理学的ストレス、病原体、金属イオン、又は誘導剤などの外部刺激に応答して、遺伝子成分の発現を構成的又は差次的に調節することができる。プロモーターの代表的な例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター又はＳＶ４０後期プロモーター及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが含まれる。

【0393】

本開示を通じて使用される「実質的に相補的な」という用語は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０又はそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸の領域全体で第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一である第１の配列を指すか、あるいは２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。

【0394】

本開示を通じて使用される「実質的に同一の」という用語は、第１の配列が第２の配列の相補体に実質的に相補的である場合、第１及び第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０又はそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸の領域全体で、又は核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であることを指す。

【0395】

開示全体を通じて使用される場合、用語「変異体」は、核酸を記述するために使用される場合、（ｉ）参照されたヌクレオチド配列の一部又は断片；（ｉｉ）参照されたヌクレオチド配列又はその一部の相補物；（ｉｉｉ）参照された核酸又はその相補物と実質的に同一である核酸；又は（ｉｖ）厳密な条件下で参照された核酸、その相補物、又はそれと実質的に同一である配列とハイブリダイズする核酸を指す。

【0396】

開示全体を通じて使用される場合、用語「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を指す。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体又は酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製性の染色体外ベクターであり得、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。ベクターは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はＤＮＡとＲＮＡ配列の両方を有するアミノ酸の組み合わせを含み得る。

【0397】

開示全体を通じて使用される場合、用語「変異体」は、ペプチド又はポリペプチドを記載するために使用される場合、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチド又はポリペプチドを指す。変異体はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されたタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味することができる。

【0398】

アミノ酸の保存的置換、すなわち、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）を有する異なるアミノ酸でアミノ酸を置換することは、当該技術分野において、通常、軽微な変化を伴うものとして認識される。これらの小さな変化は、部分的には、当該技術分野で理解されているように、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することによって同定することができる。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性指数は、その疎水性と電荷の考察に基づいている。同様のヒドロパシー指数をもつアミノ酸を置き換えても、タンパク質の機能を保持することができる。一態様では、±２のヒドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにするためにも用いることができる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考察は、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にし、これは、抗原性及び免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な尺度である。米国特許番号４，５５４，１０１は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

【0399】

類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性を保持するペプチド、例えば、免疫原性をもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性指数と親水性は、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。この観察と一致して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及び他の特性によって明らかにされるように、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存すると理解される。

【0400】

本明細書中で使用する場合、「保存的」アミノ酸置換は、下記の表Ａ、Ｂ又はＣに示すように定義することができる。いくつかの態様において、融合ポリペプチド及び／又はそのような融合ポリペプチドをコードする核酸は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾によって保存的置換を含む。アミノ酸は、物理的性質及び二次及び三次タンパク質構造への寄与によって分類することができる。保存的置換とは、類似の性質を有する別のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の置換である。例示的な保存的置換を表Ａに示す。

【0401】

【表3】

【0402】

あるいは、保存アミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９７５），ｐｐ．７１－７７）に記載されているようにグループ化することができる（表Ｂに記載される）。

【0403】

【表4】

【0404】

あるいは、例示的な保存的置換を表Ｃに示す。

【0405】

【表5】

【0406】

本開示のポリペプチドは、アミノ酸残基の１つ以上の挿入、欠失、若しくは置換、又はそれらの任意の組合せ、ならびにアミノ酸残基の挿入、欠失、若しくは置換以外の修飾を有するポリペプチドを含むことが意図されていることが理解されるべきである。本開示のポリペプチド又は核酸は、１つ以上の保存的置換を含み得る。

【0407】

本開示を通じて使用される場合、前述のアミノ酸置換の「１を超える」という用語は、列挙されたアミノ酸置換の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０、又はそれ以上を指す。用語「１を超える」は、列挙されたアミノ酸置換の２、３、４、又は５を指すことができる。

【0408】

本開示のポリペプチド及びタンパク質、それらの全配列又はそれらの任意の部分は、天然に存在しないものであってもよい。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在しない１つ以上の突然変異、置換、欠失、又は挿入を含み、全アミノ酸配列を非天然に存在させることができる。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、１つ以上の重複、逆転又は反復配列を含んでもよく、その結果生じる配列は天然に存在せず、全アミノ酸配列を非天然に存在させる。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在しない修飾アミノ酸、人工アミノ酸、又は合成アミノ酸を含み、全アミノ酸配列を非天然に存在させることができる。

【0409】

開示全体を通じて使用されるように、「配列同一性」は、デフォルトパラメータ（Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＭａｄｄｅｎ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．、１９９９、１７４、２４７－２５０；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ｆｔｐサイトから検索することができる２つの配列（ｂｌ２ｓｅｑ）をブラストするためのスタンドアロン実行可能ＢＬＡＳＴエンジンプログラムを使用することによって決定することができる。用語「同一の」又は「同一性」は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈で使用される場合、各配列の特定の領域にわたって同一である特定のパーセンテージの残基を指す。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、２つの配列を指定された領域にわたって比較し、両方の配列において同一の残基が生じる位置の数を決定し、整合された位置の数を生じさせ、整合された位置の数を指定された領域における位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを生じることによって計算することができる。２つの配列が異なる長さの場合、又はアラインメントが１つ以上のねじれ末端を生じ、比較の指定された領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は分母に含まれるが、計算の分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等とみなすことができる。識別は、手動で、又はＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０のようなコンピュータシーケンスアルゴリズムを使用して行うことができる。

【0410】

本開示全体を通じて使用される場合、用語「内因性」は、標的遺伝子又はそれが導入される宿主細胞に天然に関連する核酸又はタンパク質配列を指す。

【0411】

開示全体を通じて使用される場合、用語「外因性」は、天然に存在する核酸、例えばＤＮＡ配列、又は非天然に存在するゲノム位置に位置する天然に存在する核酸配列の非天然に存在する複数コピーを含む、標的遺伝子又はそれが導入される宿主細胞と天然に関連しない核酸又はタンパク質配列を指す。

【0412】

本開示は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入する方法を提供する。「導入する」こととは、構築物が宿主細胞の内部へのアクセスを得るような方法で、ポリヌクレオチド構築物を細胞に提示することが意図される。本開示の方法は、ポリヌクレオチド構築物が宿主の１つの細胞の内部へのアクセスを得ることのみによって、宿主細胞にポリヌクレオチド構築物を導入するための特定の方法に依存しない。細菌、植物、真菌及び動物にポリヌクレオチド構築物を導入する方法は、限定されるものではないが、安定な形質転換方法、一過性形質転換方法、及びウイルス媒介方法を含む当該技術分野において公知である。

【実施例】

【0413】

実施例１：ヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ｓｃＦｖ抗体及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の作製
ＭＵＣ１－Ｃのエピトープに特異的に結合する一本鎖抗体を含む抗原認識領域を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成した（図１Ａ及び１Ｂ）。

【0414】

最初の研究として、Ｋ５６２細胞（不死化ヒト慢性骨髄性白血病細胞）、Ｒａｊｉ細胞（がんモデルとして使用されるヒト造血細胞株）、ＭＵＣ１－Ｃを発現するように修飾されたＲａｊｉ細胞、活性化Ｔ細胞及びＲＰＭＩ８２２６細胞（ヒト末梢血Ｂ細胞形質細胞腫／骨髄腫細胞株）を含む、ＭＵＣ１発現を異なる細胞型で評価した（図２Ａ及び２Ｂ）。これらの細胞の各々におけるＭＵＣ１発現を、抗ＭＵＣ１－Ｎ抗体で染色することにより評価した。Ｋ５６２細胞については、染色対照ピークは、抗ＭＵＣ１－Ｎ Ａｂピークの左側に見える。Ｒａｊｉ細胞では、染色対照ピークは抗ＭＵＣ１－Ｎ Ａｂピークとオーバーラップするが、抗ＭＵＣ１－Ｎ Ａｂピークはより高い。ＭＵＣ１－Ｃを発現するように修飾されたＲａｊｉ細胞では、染色対照ピークは抗ＭＵＣ１－Ｎ Ａｂピークとオーバーラップするが、抗ＭＵＣ１－Ｎ Ａｂピークはより高い。活性化Ｔ細胞では、染色対照ピークは抗ＭＵＣ１－Ｎ Ａｂピークの左側に見える。ＲＰＭＩ８２２６細胞については、染色対照ピークは、抗ＭＵＣ１－Ｎ Ａｂピークの左側に見える。ＭＵＣ－１Ｃはまた、乳がん又は乳腺がん（ＭＤＡ－ＭＢ ４６８、子宮頸がん、膵がん、肺がん、白血病及び多発性骨髄腫）を含む種々のがん細胞株のパネル上に発現される（図３）。

【0415】

ヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ｓｃＦｖ ＣＡＲを作製するために、ＭＵＣ１－Ｃを認識するマウスモノクローナル抗体の可変領域のインシリコ相補性決定領域（ＣＤＲ）移植ヒト化を行った。可変領域（可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）の両方）の計算モデル化を行い、ＣＤＲ領域を変化させることなく、最も適切なヒトＶＨ／ＶＬフレームワーク受容体を同定した；最も適切なヒトＶＨ及びＶＬフレームワーク受容体は、それぞれ、ＩＶＧＶ１－６９ ０８及びＩＶＧＫＶ６－２１ ０２である。ヒト化プロセスの間、マウスＣＤＲをヒトフレームワーク受容体に移植した。マウスの枠組みとは異なるヒトの枠組み中の残留物が研究された。アクセプターフレームワーク内のヒト残基からマウス残基への逆突然変異は、新しい接触が生じた場合、古い接触が失われた場合、標準的なマウス残基が作られた場合、又は抗原結合領域内で不安定性が予測された場合に設計された。得られたすべての重鎖（４＋２変異体（Ｈ１Ｂ及びＨ２Ｂ））及び軽鎖（３）配列をそれらのアラインメントとともに表示する（図５Ａ及び５Ｂ）。

【0416】

ヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ｓｃＦｖ ＣＡＲを生成するために使用される例示的なマウスＣＤＲ領域は、以下のアミノ酸配列を含む：ＣＤＲＨ１－ＮＦＷＭＮ（配列番号６９）；ＣＤＲＨ２－ＱＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号７０）；ＣＤＲＨ３－ＳＹＹＲＳＡＷＦＡＹ（配列番号７１）；ＣＤＲＬ１－ＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ（配列番号７２）；ＣＤＲＬ２－ＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号７３）；ＣＤＲＬ３－ＱＱＳＮＮＷＰＬＴ（配列番号７４）。いくつかの場合において、ＣＤＲＨ２領域は、ヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ｓｃＦｖ ＣＡＲを生成するように突然変異された。これは、ＱＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＡＫＦＫＧ（配列番号７５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２を含む。

【0417】

例示的なヒト化ＭＵＣ１－Ｃ－ｓｃＦｖ ＣＡＲのダイアグラムを図４に示す。以下のヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ構造を用いた：シグナルペプチド（ＣＤ８α）－軽鎖－リンカー－重鎖－ヒンジ（ＣＤ８α）－膜貫通型（ＣＤ８α）－細胞内シグナル伝達（４－１ＢＢ）－細胞内シグナル伝達（ＣＤ３ζ）。

【0418】

実施例２：ヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能解析
ＭＵＣ１－Ｃ候補ＣＡＲは、トリシストロン性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン（ＥＦ１αプロモーター－ｉＣ９安全スイッチ－Ｔ２Ａ－ＭＵＣ１－Ｃ－ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＤＨＦＲ選択遺伝子）中にサブクローン化され、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に記載されるように、正常なヒト血液ドナー由来の汎Ｔ細胞を用いて作製された（図６）。ｐｉｇｇｙＢａｃ修飾細胞の表面上での各候補ＣＡＲの発現は、Ｈｉｓタグ付きｐ６２／ｐ５８ ＭＵＣ１タンパク質、次に抗Ｈｉｓ二次抗体を用いて、トランスポゾンデリバリーから１９日後にＦＡＣＳ染色することによって確認された（図６）。具体的には、ＣＡＲをコードするトランスポゾンを受け取った模擬（青色）又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ再活性化（赤色）細胞（４８時間の活性化）のいずれかにおけるＣＡＲの表面発現について、フローサイトメトリーにより細胞を調べ、データをオーバーレイヒストグラムとして示す；数は、細胞表面上でＣＡＲを発現する細胞のパーセンテージを表す。全ての候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲは、ｐｉｇｇｙＢａｃク産生ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面上で発現され、検出された（図７）。表２は、非活性化及び活性化Ｔ細胞の表面におけるＣＡＲ発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

【0419】

【表6】

【0420】

候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に記載されるように、正常なヒト血液ドナー由来の汎Ｔ細胞を用いて作製された。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、表面ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、及びＣＤ６２Ｌの発現のためにトランスポゾンデリバリーから１９日後にＦＡＣＳ染色され、Ｔ_ＳＣＭ、Ｔ_ＣＭ、Ｔ_ＥＭ、及びＴ_ＥＦＦ細胞；Ｔ_ＳＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ４５ＲＯ－／ＣＤ６２Ｌ＋）、Ｔ_ＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋）、Ｔ_ＥＭ（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ－）、Ｔ_ＥＦＦ（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ４５ＲＯ－／ＣＤ６２Ｌ－）を定義した。結果を表３に示す。全てのｐｉｇｇｙＢａｃ産生候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、優勢に高レベルの良好なＴＯＡ及びＴＯＢ細胞を含んでいた。

【0421】

【表7】

【0422】

全てのｐｉｇｇｙＢａｃ産生候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞集団は、主に高レベルのＴ_ＳＣＭ及びＴＯＢ細胞を含んでいた。

【0423】

候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に記載されるように、正常なヒト血液ドナー由来の汎Ｔ細胞を用いて作製された。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、種々のＥ：Ｔ比（４０：１、２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６２５：１、０．３１３：１）で２４時間、トリプルネガティブ乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８．ｌｕｃＧＦＰ（ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＭＤＡ－ＭＢ－４６８）と共培養した（図８）。細胞毒性を測定するためにレポーターシグナルを測定した。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の死滅は、ライングラフの各ＣＡＲについて示されている。すべてのＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＭＵＣ１＋ ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の特異的死滅を発現した。模擬Ｔ細胞は標的細胞（灰色の点線）を特異的に死滅しなかった。Ｅ：Ｔｓの範囲でＭＤＡ－ＭＢ－４６８を死滅するためのＳＥＭ（試料の平均測定値の標準誤差、３連）を有する曲線下面積を、各ＣＡＲについて表４に示す。すべてのＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＭＵＣ１＋ ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の特異的死滅を発現した。

【0424】

【表8】

【0425】

候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に記載されるように、正常なヒト血液ドナー由来の汎Ｔ細胞を用いて作製された。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するヒトＭＵＣ１アイソフォーム１０ ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ ００１１９１２１５．１（ＭＵＣ１＋；赤い棒）を発現するように操作されたＲａｊｉ細胞株（ＭＵＣ１－；青い棒）又はＲａｊｉ細胞株とともに、１０：１のＥ：Ｔ比で２４時間共培養した（図９）。細胞毒性を測定するためにレポーターシグナルを測定した。各セルラインの死滅は、棒グラフの各ＣＡＲについて示され、誤差バーは、三連で実行された試料の標準偏差を表す。すべてのＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＭＵＣ１＋遺伝子操作されたＲａｊｉ細胞株の特異的死滅を発現したが、ＭＵＣ１－ Ｒａｊｉ細胞に対しては発現しなかった。模擬トランスポゾンＴ細胞は、Ｒａｊｉ標的細胞株も遺伝子操作したＲａｊｉ標的細胞株も死滅しなかった。

【0426】

実施例３：マウス異種移植モデルを用いたストレス用量での候補ヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞の前臨床評価
マウス異種移植モデルを用いた「ストレス」用量での候補ヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞の前臨床評価のための試験デザインの概略図を図１０に示す。雌ＮＳＧマウスに皮下（ＳＣ）注射した５×１０^６細胞の用量でルシフェラーゼ発現ＭＤＡ－ＭＢ－４６８．ｌｕｃＧＦＰ（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）細胞株を用いたマウス異種移植モデルを用いて、「ストレス」用量（４×１０^６）での候補ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果を評価した。本研究では、全候補ＣＡＲ－Ｔ細胞のパネルを選択した。全てのＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に記載されるように、候補Ｐ－ＭＵＣ１－Ｃ－１０１トランスポゾンのｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）デリバリーを用いて産生された。マウスにＭＤＡ－ＭＢ－４６８を腋窩に注射し、腫瘍が確立された場合に治療した（キャリパー計測により１００～２００ｍｍ^３）。表５は、マウス異種移植モデルを用いた「ストレス」用量での候補ヒト化ＭＵＣ１－Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞の前臨床評価を示す。全ての処置動物について、キャリパー測定による腫瘍体積評価を、未処置群からの測定値に正規化した。表５は、ビヒクル群及び治療群における腫瘍体積をキャリパー別に示したものである。

【0427】

【表9】

【0428】

マウスを、異なるＣＡＲ候補間の潜在的な有効性の機能的差異を検出する上でより大きな分解能を得るために、Ｐ－ＭＵＣ１－Ｃ－１０１ ＣＡＲ－Ｔｓ候補の「ストレス」用量（４×１０^６）で静注投与した。溶媒及び処置マウスの血液中の全Ｔ細胞を、ＴｒｕＣｏｕｎｔ染色により測定した。賦形剤及び処置マウスの血液中のＴ細胞の曲線下面積（ＡＵＣ）を採血から測定し、その結果を表６に示す。

【0429】

【表10】

【0430】

溶媒及び処置マウスのＣＤ８＋ Ｔ細胞表現型を決定した。血液中のＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型を、全動物についてＦＡＣＳ染色により測定し、パーセンテージを、エラーバーをＳＥＭとして、群平均として列挙した。細胞を表面ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、及びＣＤ６２Ｌの発現について染色し、Ｔ_ＳＣＭ、Ｔ_ＣＭ、Ｔ_ＥＭ、及びＴ_ＥＦＦ細胞；Ｔ_ＳＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ４５ＲＯ－／ＣＤ６２Ｌ＋）、Ｔ_ＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋）、Ｔ_ＥＭ（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ－）、Ｔ_ＥＦＦ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－／ＣＤ６２Ｌ－）を定義した。試験したすべてのＭＵＣ－１Ｃ ＣＡＲ－Ｔ細胞について、Ｔ_ＳＣＭ及びＴ_ＣＭ表現型は、点滴前日、１２日目及び１９日目に、Ｔ_ＥＭ及びＴ_ＥＦＦ表現型よりも豊富である。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】