特表 2023-510266 合成アデノ随伴ウイルス逆位末端反復、およびプロモーターとしてのそれらの使用の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-13

(54)【発明の名称】合成アデノ随伴ウイルス逆位末端反復、およびプロモーターとしてのそれらの使用の方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20230306BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 15/85 20060101ALN20230306BHJP

   C12N 15/861 20060101ALN20230306BHJP

   C12N 15/869 20060101ALN20230306BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/864 100Z

C12N7/01

C12N15/85 Z

C12N15/861 Z

C12N15/869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022541983

(86)(22)【出願日】2021-01-07

(85)【翻訳文提出日】2022-09-07

(86)【国際出願番号】 US2021012514

(87)【国際公開番号】W WO2021142130

(87)【国際公開日】2021-07-15

(31)【優先権主張番号】62/957,882

(32)【優先日】2020-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500093834

【氏名又は名称】ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【氏名又は名称】有原 幸一

(72)【発明者】

【氏名】サムルスキ，リチャード・ジュード

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA60

(57)【要約】

本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）合成逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む方法および組成物であって、ＩＴＲは改変されたプロモーター転写機能を有し得る、方法および組成物を提供する。それを含むベクターおよびウイルス粒子、ならびにそれらの使用の方法が付加的に提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの合成アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドであって、前記ＩＴＲは、
（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；
（ｂ）Ｂループ；
（ｃ）Ｃループ；
（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；
（ｅ）Ｄ領域；
（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および
（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント
を含み、
（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ３ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、
（ｉ）前記ＲＢＥ’エレメントは、ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置に非相補的ループＴＴＴ配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；
（ｉｉ）前記Ｂループは、ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；
（ｉｉｉ）前記Ｃループは、ヌクレオチド位置６５～８３に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；
（ｉｖ）前記Ｄ領域は、ヌクレオチド位置１２５～１４５に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；ならびに／または
（ｖ）前記１つもしくは複数のニッキング－ステムループの少なくとも１つは、ヌクレオチド位置４に相当する位置にＧ置換および／もしくはヌクレオチド位置１２２に相当する位置にＣ置換を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、
ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記ＩＴＲは、野生型（非改変）ＡＡＶ血清型ＩＴＲと比べて増強した転写機能を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

少なくとも１つの合成アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドであって、前記ＩＴＲは、
（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；
（ｂ）Ｂループ；
（ｃ）Ｃループ；
（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；
（ｅ）Ｄ領域；
（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および
（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント
を含み；
（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、
（ｉ）前記ＲＢＥ’エレメントは、ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置に非相補的ループＴＣＴ配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；
（ｉｉ）前記Ｂループは、ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；
（ｉｉｉ）前記Ｃループは、ヌクレオチド位置６５～８３に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；
（ｉｖ）前記Ｄ領域は、ヌクレオチド位置１２５～１４５に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；ならびに／または
（ｖ）前記１つもしくは複数のニッキング－ステムループの少なくとも１つは、ヌクレオチド位置４に相当する位置にＣ置換および／もしくはヌクレオチド位置１２２に相当する位置にＧ置換を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、
ポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記ＩＴＲは、野生型（非改変）ＡＡＶ血清型ＩＴＲと比べて低下した転写機能を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

（ａ）～（ｇ）は、同じＡＡＶ由来のものである、請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

（ａ）～（ｇ）は、異なるＡＡＶ由来のものである、請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記ＩＴＲは非ＡＡＶシスエレメントをさらに含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

前記非ＡＡＶシスエレメントは、プロモーター、エンハンサー、クロマチン付着配列、テロメア配列、マイクロＲＮＡ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記非ＡＡＶシスエレメントはプロモーターを含まない、請求項７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

１種または複数のインシュレーター配列をさらに含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

異種ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１から１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクター。

【請求項13】

ＡＡＶベクターである、請求項１２に記載のウイルスベクター。

【請求項14】

請求項１から１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶ粒子。

【請求項15】

任意のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲまたは請求項１から１１のいずれか１項に規定の合成ＩＴＲを含むキメラＡＡＶ粒子であって、付加的なＡＡＶシスエレメントは、前記ＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型由来のものである、キメラＡＡＶ粒子。

【請求項16】

請求項１１に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む、細胞において異種ヌクレオチド配列を転写する方法。

【請求項17】

前記ポリヌクレオチドは付加的な非ＡＡＶシスプロモーターを含まない、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

請求項１４または１５に記載の組換えＡＡＶ粒子を細胞に導入することを含む、細胞に核酸を送達する方法。

【請求項19】

組換えＡＡＶ鋳型の複製およびパッケージングに十分な条件下で、ＡＡＶ複製に寛容な細胞に、
（ａ）（ｉ）異種核酸および（ｉｉ）請求項１から１１のいずれか１項に規定の合成ＩＴＲ、を含む組換えＡＡＶ鋳型；ならびに
（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチド
を提供するステップを含み、
それによって組換えＡＡＶ粒子が前記細胞において産生される、
組換えＡＡＶ粒子を産生する方法。

【請求項20】

組換えＡＡＶ鋳型の複製およびパッケージングに十分な条件下で、ＡＡＶ複製に寛容な細胞に、
（ａ）（ｉ）異種核酸および（ｉｉ）任意のＡＡＶ血清型由来の野生型ＩＴＲまたは請求項１から１１のいずれか１項に規定の合成ＩＴＲ、を含む組換えＡＡＶ鋳型；ならびに
（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ＲｅｐおよびＣａｐコード配列は、異なるＡＡＶ血清型由来のものである、ポリヌクレオチド
を提供するステップを含み、
それによって組換えＡＡＶ粒子が前記細胞において産生される、
組換えＡＡＶ粒子を産生する方法。

【請求項21】

前記Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列は、前記組換えＡＡＶ粒子にパッケージされ得ない、請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

前記Ｒｅｐコード配列および／またはＣａｐコード配列は、プラスミドによって提供される、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記Ｒｅｐコード配列および／またはＣａｐコード配列は、ウイルスベクターによって提供される、請求項１９から２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バールウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記Ｒｅｐコード配列は、前記細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項１９から２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記Ｃａｐコード配列は、前記細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項１９から２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記組換えＡＡＶ鋳型は、プラスミドおよび／もしくはウイルスベクターによって提供される、またはプロウイルスとして前記細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項１９から２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

ＡＡＶ粒子ベクターゲノムが細胞に入るのに十分な条件下で、請求項１４または１５に記載の組換えＡＡＶ粒子と接触している細胞を哺乳類対象に投与することを含む、哺乳類対象に核酸を投与する方法。

【請求項29】

前記細胞は、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋細胞、膵臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞、前駆細胞、幹細胞、がん細胞、および腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項１９から２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

請求項１４または１５に記載の組換えＡＡＶ粒子を哺乳類対象に投与することを含む、哺乳類対象に核酸を投与する方法。

【請求項31】

前記組換えＡＡＶ粒子は、１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量域で前記哺乳類対象に投与される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記哺乳類対象はヒト対象である、請求項２８、３０、または３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記ＡＡＶ粒子は、経口、直腸、経粘膜、経皮、吸入、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内、内皮内、硝子体内、網膜下、関節内投与、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される経路によって投与される、請求項２８または３０から３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記ＡＡＶ粒子は、腫瘍、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、目、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される部位で前記対象に投与される、請求項２８または３０から３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記哺乳類対象は、請求項１から１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含まないＡＡＶ粒子と比較して、前記ＡＡＶ粒子に対する低下した免疫応答を有する、請求項２８または３０から３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

野生型（非改変）逆位末端反復（ＩＴＲ）と比べて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲのプロモーター機能を増強する方法であって、前記ＩＴＲは、
（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；
（ｂ）Ｂループ；
（ｃ）Ｃループ；
（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；
（ｅ）Ｄ領域；
（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および
（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント
を含み、
（ａ）～（ｇ）は、
（ｉ）ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置における非相補的ループＴＴＴ配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、非相補的ループＴＴＴ配列；
（ｉｉ）ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置にＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置６５～８３にＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１２５～１４５にＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；ならびに／または
（ｖ）ヌクレオチド位置４におけるＧ置換および／もしくはヌクレオチド位置１２２におけるＣ置換であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、置換、
のうちの１つまたは複数を置換することを含む、ＡＡＶ２またはＡＡＶ３ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものである
方法。

【請求項37】

野生型（非改変）逆位末端反復（ＩＴＲ）と比べて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲのプロモーター機能を低下させる方法であって、前記ＩＴＲは、
（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；
（ｂ）Ｂループ；
（ｃ）Ｃループ；
（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；
（ｅ）Ｄ領域；
（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および
（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント
を含み、
（ａ）～（ｇ）は、
（ｉ）ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置における非相補的ループＴＣＴ配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、非相補的ループＴＣＴ配列；
（ｉｉ）ヌクレオチド位置４３～６１にＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置６５～８３にＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１２５～１４５にＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；ならびに／または
（ｖ）ヌクレオチド位置４におけるＣ置換および／もしくはヌクレオチド位置１２２におけるＧ置換であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、置換、
のうちの１つまたは複数を置換することを含む、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものである
方法。

【請求項38】

改変前の前記（非改変）ＩＴＲは、高い転写活性を有した、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

改変前の前記（非改変）ＩＴＲは、低い転写活性を有した、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記ＩＴＲ内のＣｐＧアイランドおよび／またはＣ－Ｇジヌクレオチド頻度を改変することをさらに含む、請求項３６から３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

ＩＴＲ双方向性活性が弱められ、免疫応答が軽減される、請求項３６から４０のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の声明
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年１月７日に出願された米国仮出願第６２／９５７，８８２号の利益を主張するものであり、その全内容は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

【0002】

政府支援の声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第ＲＯ１ＡＩ０７２１７６－０６Ａ号および第ＲＯ１ＡＲ０６４３６９－０１Ａ号の下で政府支援により行われた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。

【0003】

配列表の電子出願に関する声明
２０２１年１月７日に作成された、サイズが３，４６４バイトの５４７０．８７５．ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題された、米国特許規則１．８２１の下で提出され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して出願されたＡＳＣＩＩテキスト形式での配列表が、紙複製物の代わりに提供される。この配列表は、その開示に対する本明細書への参照により本明細書によって本明細書に組み入れられる。

【0004】

本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の合成逆位末端反復（ＩＴＲ）、ウイルスカプシド、およびそれを含むウイルスベクター、ならびにそれらの使用の方法に関する。

【背景技術】

【0005】

アデノ随伴ウイルスベクターは、効率的な遺伝子送達のために実験室および臨床設定において使用されている。これらのベクターでは、ＡＡＶゲノムの９６％が、目的の遺伝子カセットで置き換えられ、１４５塩基対の逆位末端反復配列のみを残す。主としてＡＡＶ血清型２由来のこれらのシスエレメントは、ゲノムレスキュー、複製、パッケージング、およびベクター持続性に要される。ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列は、治療的適用における意図される導入遺伝子発現を混乱させ得る固有の転写活性を有する。

【0006】

本発明は、改変されたプロモーター機能を有する合成逆位末端反復、これらのＩＴＲを含むＡＡＶベクター、および遺伝子療法におけるそれらの使用のための方法を提供することによって、当技術分野におけるこれまでの欠点を克服する。

【発明の概要】

【0007】

本発明の第１の態様は、少なくとも１つの合成アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドであって、ＩＴＲは、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；（ｂ）Ｂループ；（ｃ）Ｃループ；（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；（ｅ）Ｄ領域；（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；および（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント、を含み、（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ３ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、（ｉ）ＲＢＥ’エレメントは、ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置に非相補的ループＴＴＴ配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１（ＡＡＶ２）のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉ）Ｂループは、ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３（すなわち、それぞれＡＡＶ２またはＡＡＶ３のＩＴＲ）のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉｉ）Ｃループは、ヌクレオチド位置６５～８３に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｖ）Ｄ領域は、ヌクレオチド位置１２５～１４５に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；ならびに／または（ｖ）１つもしくは複数のニッキング－ステムループの少なくとも１つは、ヌクレオチド位置４に相当する位置にＧ置換および／もしくはヌクレオチド位置１２２に相当する位置にＣ置換（例えば、Ｃ４Ｇおよび／またはＧ１２２Ｃ）を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ポリヌクレオチドを提供する。

【0008】

本発明の第２の態様は、少なくとも１つの合成アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドであって、ＩＴＲは、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；（ｂ）Ｂループ；（ｃ）Ｃループ；（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；（ｅ）Ｄ領域；（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント、を含み、（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、（ｉ）ＲＢＥ’エレメントは、ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置に非相補的ループＴＣＴ配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉ）Ｂループは、ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６（すなわち、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６のＩＴＲ）のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉｉ）Ｃループは、ヌクレオチド位置６５～８３に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｖ）Ｄ領域は、ヌクレオチド位置１２５～１４５に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；ならびに／または（ｖ）１つもしくは複数のニッキング－ステムループの少なくとも１つは、ヌクレオチド位置４に相当する位置にＣ置換および／もしくはヌクレオチド位置１２２に相当する位置にＧ置換（例えば、Ｇ４Ｃおよび／またはＣ１２２Ｇ）を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ポリヌクレオチドを提供する。

【0009】

本発明の付加的な態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、組換えＡＡＶ粒子、およびキメラＡＡＶ粒子に関する。

【0010】

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む、細胞において異種ヌクレオチド配列を転写する方法を提供する。

【0011】

本発明の別の態様は、本発明の組換えＡＡＶ粒子を細胞に導入することを含む、細胞に核酸を送達する方法を提供する。

【0012】

本発明の付加的な態様は、組換えＡＡＶ鋳型の複製およびパッケージングに十分な条件下で、ＡＡＶ複製に寛容な細胞に、（ａ）（ｉ）異種核酸および（ｉｉ）本発明の合成ＩＴＲ、を含む組換えＡＡＶ鋳型；ならびに（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチド、を提供するステップを含み、それによって組換えＡＡＶ粒子が細胞において産生される、組換えＡＡＶ粒子を産生する方法を提供する。

【0013】

本発明の付加的な態様は、組換えＡＡＶ鋳型の複製およびパッケージングに十分な条件下で、ＡＡＶ複製に寛容な細胞に、（ａ）（ｉ）異種核酸および（ｉｉ）任意のＡＡＶ血清型由来の野生型ＩＴＲまたは本発明の合成ＩＴＲ、を含む組換えＡＡＶ鋳型；ならびに（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチドであって、ＲｅｐおよびＣａｐコード配列は、異なるＡＡＶ血清型由来のものである、ポリヌクレオチド、を提供するステップを含み、それによって組換えＡＡＶ粒子が細胞において産生される、組換えＡＡＶ粒子を産生する方法を提供する。

【0014】

本発明の別の態様は、ＡＡＶ粒子ベクターゲノムが細胞に入るのに十分な条件下で、本発明の組換えＡＡＶ粒子と接触している細胞を哺乳類対象に投与することを含む、哺乳類対象に核酸を投与する方法を提供する。

【0015】

本発明の別の態様は、本発明の組換えＡＡＶ粒子を哺乳類対象に投与することを含む、哺乳類対象に核酸を投与する方法を提供する。

【0016】

本発明のさらなる態様は、野生型（例えば、非改変）逆位末端反復（ＩＴＲ）と比べて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲのプロモーター機能を増強する方法であって、ＩＴＲは、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；（ｂ）Ｂループ；（ｃ）Ｃループ；（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；（ｅ）Ｄ領域；（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント、を含み、（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ３ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、（ｉ）ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置における非相補的ループＴＴＴ配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、非相補的ループＴＴＴ配列；（ｉｉ）ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３（すなわち、それぞれＡＡＶ２またはＡＡＶ３のＩＴＲ）のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置６５～８３に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；（ｉｖ）ヌクレオチド位置１２５～１４５に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；ならびに／または（ｖ）ヌクレオチド位置４におけるＧ置換および／もしくはヌクレオチド位置１２２におけるＣ置換（例えば、Ｃ４Ｇおよび／またはＧ１２２Ｃ）であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、置換、のうちの１つまたは複数を置換することを含む、方法を提供する。

【0017】

本発明のさらなる態様は、野生型（例えば、非改変）逆位末端反復（ＩＴＲ）と比べて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲのプロモーター機能を低下させる方法であって、ＩＴＲは、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；（ｂ）Ｂループ；（ｃ）Ｃループ；（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；（ｅ）Ｄ領域；（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント、を含み、（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、（ｉ）ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置における非相補的ループＴＣＴ配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、非相補的ループＴＣＴ配列；（ｉｉ）ヌクレオチド位置４３～６１に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６（すなわち、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６のＩＴＲ）のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置６５～８３に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；（ｉｖ）ヌクレオチド位置１２５～１４５に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；ならびに／または（ｖ）ヌクレオチド位置４におけるＣ置換および／もしくはヌクレオチド位置１２２におけるＧ置換（例えば、Ｇ４Ｃおよび／またはＣ１２２Ｇ）であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、置換、のうちの１つまたは複数を置換することを含む、方法を提供する。

【0018】

本発明のこれらのおよび他の態様は、下で示される本発明の説明においてより詳細に対処される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】血清型１～４、６、および７由来のＡＡＶ ＩＴＲの配列および構造の略図である。太字のＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）およびＲＢＥ’を有する、ＡＡＶ２ ＩＴＲ（「ＩＴＲ２」）（配列番号１）の略図を示す。末端分解ニッキング部位ＴＴジヌクレオチドは赤色である。

【図1B】血清型１～４、６、および７由来のＡＡＶ ＩＴＲの配列および構造の略図である。コンセンサスＩＴＲ配列（配列番号７）の略図を示す。ＩＴＲ配列１～４、６～７間のヌクレオチド差の配置は、赤色で強調されている。赤色のヌクレオチドはＩＵＰＡＣコードにあり、ＹはＣまたはＴであり、ＲはＡまたはＧであり、ＳはＧまたはＣであり、ＷはＡまたはＴであり、ＫはＧまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＢはＧまたはＴまたはＣであり、ＶはＧまたはＣまたはＡであり、Ｎは任意のヌクレオチドである。色付きの輪郭は、ＩＴＲにおけるＡ（黒色）、Ｂ（青色）、Ｃ（灰色）、およびＤ（緑色）領域を表す。

【図1C】血清型１～４、６、および７由来のＡＡＶ ＩＴＲの配列および構造の略図である。ＩＴＲ１（配列番号２）、３（配列番号３）、４（配列番号４）、６（配列番号５）、および７（配列番号６）の配列および構造の略図を示す。太字の文字は、ＩＴＲ配列間の保存されていないヌクレオチドを表す。

【図2A】ＡＡＶ（１～４、６～７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞株からのルシフェラーゼ活性のグラフである。ＡＡＶ２／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼまたはＡＡＶ２／２－ＣＢＡ－ルシフェラーゼを１Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させたＨＥＫ２９３細胞のグラフを示す。感染の２日後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をルシフェリン基質を使用して測定した。示された値は、生のＲＬＵである。

【図2B】ＡＡＶ（１～４、６～７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞株からのルシフェラーゼ活性のグラフである。ＡＡＶ１／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、ＡＡＶ２／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、またはＡＡＶ７／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた表示される細胞株のグラフを示す。感染の２日後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をルシフェリン基質を使用して測定した。ＲＬＵ値を、ＢＣＡによって測定される、ルシフェラーゼアッセイに添加された総細胞タンパク質に対して正規化し、次いですべての値をＩＴＲ２に対して正規化した。各ＡＡＶＮ／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを三つ組のバッチで作製し、一緒に力価測定し、次いで細胞を三つ組で感染させた。

【図2C】ＡＡＶ（１～４、６～７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞株からのルシフェラーゼ活性のグラフである。ＡＡＶ１／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、ＡＡＶ２／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、またはＡＡＶ７／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた表示される細胞株のグラフを示す。感染の２日後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をルシフェリン基質を使用して測定した。ＲＬＵ値を、ＢＣＡによって測定される、ルシフェラーゼアッセイに添加された総細胞タンパク質に対して正規化し、次いですべての値をＩＴＲ２に対して正規化した。各ＡＡＶＮ／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを三つ組のバッチで作製し、一緒に力価測定し、次いで細胞を三つ組で感染させた。

【図2D】ＡＡＶ（１～４、６～７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞株からのルシフェラーゼ活性のグラフである。ＡＡＶ１／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、ＡＡＶ２／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、またはＡＡＶ７／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた表示される細胞株のグラフを示す。感染の２日後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をルシフェリン基質を使用して測定した。ＲＬＵ値を、ＢＣＡによって測定される、ルシフェラーゼアッセイに添加された総細胞タンパク質に対して正規化し、次いですべての値をＩＴＲ２に対して正規化した。各ＡＡＶＮ／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを三つ組のバッチで作製し、一緒に力価測定し、次いで細胞を三つ組で感染させた。

【図2E】ＡＡＶ（１～４、６～７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞株からのルシフェラーゼ活性のグラフである。ＡＡＶ１／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、ＡＡＶ２／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、ＡＡＶ３／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、ＡＡＶ４／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、またはＡＡＶ６／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた表示される細胞株のグラフを示す。感染の２日後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をルシフェリン基質を使用して測定した。ＲＬＵ値を、ＢＣＡによって測定される、ルシフェラーゼアッセイに添加された総細胞タンパク質に対して正規化し、次いですべての値をＩＴＲ２に対して正規化した。各ＡＡＶＮ／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを三つ組のバッチで作製し、一緒に力価測定し、次いで細胞を三つ組で感染させた。ｐ値は、＊＜０．０００１、＃＜０．００１、および＾＜０．０１として表示されている。

【図2F】ＡＡＶ（１～４、６～７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞株からのルシフェラーゼ活性のグラフである。ＡＡＶ１／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、ＡＡＶ２／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、ＡＡＶ３／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、ＡＡＶ４／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、またはＡＡＶ６／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた表示される細胞株のグラフを示す。感染の２日後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をルシフェリン基質を使用して測定した。ＲＬＵ値を、ＢＣＡによって測定される、ルシフェラーゼアッセイに添加された総細胞タンパク質に対して正規化し、次いですべての値をＩＴＲ２に対して正規化した。各ＡＡＶＮ／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを三つ組のバッチで作製し、一緒に力価測定し、次いで細胞を三つ組で感染させた。ｐ値は、＊＜０．０００１、＃＜０．００１、および＾＜０．０１として表示されている。

【図2G】ＡＡＶ（１～４、６～７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターを感染させた細胞株からのルシフェラーゼ活性のグラフである。

【図3】ＡＡＶ１／１およびＡＡＶ２／１－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターを感染させたＨＥＫ２９３細胞からのルシフェラーゼ活性のグラフである。ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＡＶ１／１、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ１／２、またはＡＡＶ２／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターの３つの生物学的複製物を２Ｅ５ｖｇ／細胞で三つ組で感染させた。感染の２日後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をルシフェリン基質を使用して測定した。ＲＬＵ値を、ＢＣＡによって測定される、ルシフェラーゼアッセイに添加された総細胞タンパク質に対して正規化し、次いですべての値を各カプシド群内でＩＴＲ２値に対して正規化した（すなわち、ＡＡＶ１／１およびＡＡＶ２／１をＡＡＶ２／１に対して正規化した。ＡＡＶ１／２およびＡＡＶ２／２をＡＡＶ２／２に対して正規化した）。ＡＡＶ１／１対ＡＡＶ１／２間に統計的な差はない。

【図4A】ルシフェラーゼｍＲＮＡを促進したＩＴＲ１～４、６、または７（配列番号１～６）由来の転写スタート部位（ＴＳＳ）の略図である。ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＡＶ（１～４、６、または７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させ、感染の３日後に総ＲＮＡを収穫した。ルシフェラーゼ特異的プライマーを使用してＲＮＡを逆転写した。最終ｃＤＮＡ産物をＮＧＳによって分析した。黒色の矢印は、リード配列の１％またはそれよりも高い割合を有するＴＳＳを表示している。ＲＢＥ’およびＲＢＥは太字で表示されている。ｔｒｓは赤色で表されている。

【図4B】ＩＴＲ２（配列番号１）における推定転写因子結合部位を表示する略図である。

【図4C】ｍＲＮＡを促進したＩＴＲ２（配列番号１）またはＩＴＲ７（配列番号６）由来の転写スタート部位を同定する概略である。ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＡＶ２／２（上）またはＡＡＶ７／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ（下）を感染させ、感染の３日後に総ＲＮＡを収穫した。ルシフェラーゼ特異的プライマーを使用してＲＮＡを逆転写した。最終ｃＤＮＡ産物を次世代シーケンシングによって分析した。矢印はＴＳＳを表示しており、矢印の上の数字は、その部位まで遡られ得た転写物の数を表示している。

【図5A】ルシフェラーゼアッセイの画像である。ＡＡＶ（１～４、６）／９－ＩＴＲ－ｃｒｅリコンビナーゼを注射されたマウスからのルシフェラーゼ活性。４～６週齢の雄のＦＶＢ．１２９Ｓ６（Ｂ６）－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ^{ｔｍ１（Ｌｕｃ）Ｋａｅｌ}／Ｊマウスに、１００μｌの１Ｅ９ｖｇのＡＡＶ（１～４、６）／９－ＩＴＲ－ｃｒｅリコンビナーゼを注射した。ＡＡＶ注射の３週間後に、マウスに１００μｌのルシフェラーゼ基質を腹腔内投与で与え、光子を記録した。

【図5B】ルシフェラーゼアッセイの画像である。ＡＡＶ（１～４、６）／９－ＩＴＲ－ｃｒｅリコンビナーゼを注射されたマウスからのルシフェラーゼ活性。４～６週齢の雄のＦＶＢ．１２９Ｓ６（Ｂ６）－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ^{ｔｍ１（Ｌｕｃ）Ｋａｅｌ}／Ｊマウスに、１００μｌの１Ｅ９ｖｇのＡＡＶ（１～４、６）／９－ＩＴＲ－ｃｒｅリコンビナーゼを注射した。ＡＡＶ注射の９週間後に、マウスに１００μｌのルシフェラーゼ基質を腹腔内投与で与え、光子を記録した。

【発明を実施するための形態】

【0020】

発明の詳細な説明
本発明は、ここで、本発明の代表的な実施形態が示される添付の図面を参照して記載されるであろう。しかしながら、本発明は、種々の形態で具体化され得、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的でありかつ完全であろうように、および本発明の範囲を当業者に十分に伝えるであろうように提供される。

【0021】

別様に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明において使用される学術用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、本発明を限定することを意図されるわけではない。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

【0022】

定義
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上別様にはっきりと示されない限り、複数形も含むことを意図される。

【0023】

さらには、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さの量、用量、時間、温度等の量等、測定可能な値に言及する場合に本明細書において使用される「約」という用語は、指定の量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動を包含することを意図される。

【0024】

また本明細書において使用するとき、「および／または」は、関連する列挙された品目のうちの１つまたは複数のありとあらゆる考え得る組合せ、ならびに選択肢（「または」）で解釈される場合には組合せがないことを指しかつ包含する。

【0025】

文脈上別様に示されない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特質は、任意の組合せで使用され得ることが具体的に意図される。

【0026】

さらに、本発明は、本発明の一部の実施形態において、本明細書に示される任意の特質または特質の組合せが除外され得るまたは削除され得ることも企図する。

【0027】

さらに例示するために、例えば、本明細書が、特定のアミノ酸はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、および／またはＶから選択され得ることを示す場合、この言葉は、該アミノ酸が、これらのアミノ酸の任意の部分集合、例えばＡ、Ｇ、Ｉ、またはＬ；Ａ、Ｇ、Ｉ、またはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみ等から、あたかもそれぞれそのような部分的組合せが本明細書に明示的に示されるかのように選択され得ることも示す。さらに、そのような言葉は、指定のアミノ酸の１つまたは複数が放棄され得ることも示す。例えば、特定の実施形態において、あたかもそれぞれそのような考え得る放棄が本明細書に明示的に示されるかのように、アミノ酸はＡ、Ｇ、またはＩではない；Ａではない；ＧまたはＶではない等。

【0028】

本明細書において使用するとき、「低下させる（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低下させる（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低下」という用語および同様の用語は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれを上回る割合の減少を意味する。

【0029】

本明細書において使用するとき、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「増強」という用語および同様の用語は、少なくとも約１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれを上回る割合の増加を示す。

【0030】

本明細書において使用するとき、「ポリペプチド」という用語は、別様に示されない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

【0031】

本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「核酸分子」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的な実施形態では、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。

【0032】

本明細書において使用するとき、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）とは、天然に存在する生物もしくはウイルスの他の構成要素、例えば細胞もしくはウイルスの構造的構成要素の少なくとも一部から、または該ポリヌクレオチドと結び付いて一般に見出される他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的な実施形態において、「単離された」ヌクレオチドは、スタート材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、またはそれを上回る割合で富化される。

【0033】

同じように、「単離された」ポリペプチドとは、天然に存在する生物もしくはウイルスの他の構成要素、例えば細胞もしくはウイルスの構造的構成要素の少なくとも一部から、または該ポリペプチドと結び付いて一般に見出される他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されているポリペプチドを意味する。代表的な実施形態において、「単離された」ポリペプチドは、スタート材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、またはそれを上回る割合で富化される。

【0034】

本明細書において使用するとき、ウイルスベクターを「単離する」または「精製する」（または文法的等価物）によって、ウイルスベクターが、スタート材料における他の構成要素の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的な実施形態において、「単離された」または「精製された」ウイルスベクターは、スタート材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、またはそれを上回る割合で富化される。

【0035】

本明細書において使用するとき、「キメラ」、「キメラの」、および／または「融合タンパク質」という用語は、他の構成要素の中でも、目的のタンパク質ならびに／またはその改変バリアントおよび／もしくは活性フラグメント（「骨格」）のアミノ酸配列を含む、意図的なヒト設計によって非天然に作出されるアミノ酸配列（例えば、ポリペプチド）を指し、ここで、目的のタンパク質は、任意選択で他のアミノ酸セグメントに連結された（融合タンパク質）、種々の野生型参照配列からの改変（例えば、単一残基および／またはアミノ酸残基の連続領域等の置換）（キメラ）を含む。設計されたタンパク質の種々の構成要素は、異なっているおよび／または組合せの機能を提供し得る。設計されたタンパク質の構造的および機能的構成要素は、異なるおよび／または複数の供給源材料から組み入れられ得る。設計されたタンパク質は対象に外因的に送達され得、それは、相当する内因性タンパク質と比較して外因性であろう。

【0036】

「治療用ポリペプチド」とは、細胞もしくは対象におけるタンパク質の非存在または欠陥により生じる症状を緩和し、低下させ、阻止し、および／もしくは安定させ得るポリペプチドもしくはペプチドであり、ならびに／または対象に別様に利益を与えるポリペプチドである。

【0037】

「治療する」、「治療すること」、または「の治療」という用語（およびその文法的変形）によって、対象の病状の重症度が低下する、少なくとも部分的に改善する、もしくは安定すること、および／または少なくとも１つの臨床症状における何らかの緩和、軽減、減少、もしくは安定化が達成され、および／または疾患もしくは障害の進行の遅延があることを意味する。

【0038】

「阻止する」、「阻止すること」、または「阻止」という用語（およびその文法的変形）は、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発症の阻止および／もしくは遅延、ならびに／または本発明の方法の非存在下で生じるであろうものと比べた、疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発症の重症度の低下を指す。阻止は、完全、例えば疾患、障害、および／または臨床症状の全くの非存在であり得る。阻止は、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発生、ならびに／または発症の重症度が、本発明の非存在下で生じるであろうものよりも少ないような、部分的でもあり得る。

【0039】

本明細書において使用される「治療有効」、「治療的」、または「有効」量とは、対象に何らかの改善または利益を提供するのに十分である量である。代替的に述べると、「治療有効」、「治療的」、または「有効」量とは、対象における少なくとも１つの臨床症状における何らかの緩和、軽減、減少、または安定化を提供するであろう量である。当業者であれば、何らかの利益が対象に提供される限り、治療効果は完全または治癒的である必要はないことを解するであろう。

【0040】

本明細書において使用される「阻止有効」量とは、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発症を阻止しおよび／もしくは遅延させるのに、ならびに／または本発明の方法の非存在下で生じるであろうものと比べて、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発症の重症度を低下させおよび／もしくは遅延させるのに十分である量である。当業者であれば、何らかの利益が対象に提供される限り、阻止のレベルは完全である必要はないことを解するであろう。

【0041】

「異種ヌクレオチド配列」、「異種核酸」、または「異種核酸分子」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、ウイルスにおいて天然に存在しない配列を指す。一般的に、異種核酸は、目的のポリペプチドまたは非翻訳ＲＮＡ（例えば、細胞または対象への送達のための）をコードするオープンリーディングフレームを含む。

【0042】

本明細書において使用するとき、「ウイルスベクター」、「ベクター」、または「遺伝子送達ベクター」という用語は、核酸送達ビヒクルとして機能する、およびビリオン内にパッケージされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指す。代替的に、一部の文脈において、「ベクター」という用語は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡだけを指すために使用され得る。

【0043】

ウイルスに言及する場合に本明細書において使用するとき、「ベクター」、「粒子」、および「ビリオン」という用語は、互換可能に使用され得る。

【0044】

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報ＷＯ０１／９２５５１（その開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載される二重鎖ＡＡＶ粒子であり得る。ゆえに、一部の実施形態において、二本鎖（二重鎖）ゲノムがパッケージされ得る。

【0045】

本明細書において使用するとき、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、これらに限定されないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ２．５型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、クレードＦ ＡＡＶ、および現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。多数の比較的新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（表１を参照されたい）。

【0046】

ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。そのような配列の例示的であるが非限定的な例は、文献において、またはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース等の公的データベースにおいて見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＮＣ＿００２０７７．１、ＮＣ＿００１４０１．２、ＮＣ＿００１７２９．１、ＮＣ＿００１８６３．１、ＮＣ＿００１８２９．１、ＮＣ＿００６１５２．１、ＮＣ＿００１８６２．１、ＡＦ５１３８５１．１、ＡＦ５１３８５２．１を参照されたく、その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；国際特許公開公報ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０、およびＷＯ９８／１１２４４；ならびに米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたく；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

【0047】

自律性パルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に記載される。ＡＡＶ２（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．ｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５－１０）、ＡＡＶ４（Ｐａｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７－５８）、ＡＡＶ５（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３３６１－７１）、およびＣＰＶ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７－５２０およびＴｓａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６－６４）の結晶構造の説明も参照されたい。

【0048】

「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」とは、１種または複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般的に、ウイルスを作出するために、シスにある１４５塩基の逆位末端反復（ＩＴＲ）のみを要する。典型的に、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージされ得る導入遺伝子のサイズを最大限に高めるために、１つまたは複数のＩＴＲ配列のみを保持するであろう。構造および非構造タンパク質コード配列は、トランスで提供され得る（例えば、プラスミド等のベクターから、またはパッケージング細胞に配列を安定に組み込むことによって）。本発明の実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ配列）、任意選択で２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＩＴＲ）を含み、それは、典型的に、ベクターゲノムの５’および３’末端にあり、異種核酸に隣接しているであろうが、それと連続している必要はない。ＩＴＲは、互いと同じであり得るまたは異なり得る。

【0049】

「ＡＡＶ逆位末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、これらに限定されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１３、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、または現在公知のもしくは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む、任意のＡＡＶ由来のものであり得る（例えば、表１を参照されたい）。ＡＡＶ ＩＴＲは、末端反復が、所望の機能、例えば複製、ウイルスパッケージング、持続性、および／またはプロウイルスレスキュー等を媒介し、機能に要される構造的構成要素（例えば、図１Ａ～１Ｃに描写されるもの等）を含む限り、天然の末端反復配列を有する必要はない（例えば、天然ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、切取り、および／またはミスセンス変異によって変更され得る）。

【0050】

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載される、「標的化」ウイルスベクター（例えば、指向性の向性を有する）および／または「ハイブリッド」ＡＡＶ（すなわち、ウイルスＩＴＲおよびウイルスカプシドが、異なるＡＡＶ由来のものである）であり得る。

【0051】

さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失、および／または置換を含む他の改変を含有し得る。

【0052】

「鋳型」または「基質」という用語は、本明細書において、ＡＡＶウイルスＤＮＡを産生するために複製され得るポリヌクレオチド配列を指すために使用される。ベクター産生の目的のために、鋳型は、典型的に、これらに限定されないが、プラスミド、裸のＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクター等）を含む、より大きなヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれるであろう。代替的に、鋳型は、パッケージング細胞の染色体に安定に組み入れられ得る。

【0053】

本明細書において使用するとき、ＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」とは、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の産生を媒介するＡＡＶ非構造タンパク質をコードする核酸配列を示す。ＡＡＶ複製遺伝子およびタンパク質は、例えばＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。

【0054】

「Ｒｅｐコード配列」は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のすべてをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関して、Ｒｅｐコード配列は、４種すべてのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）をコードする必要はなく、実際、ＡＡＶ５は、スプライスされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質を発現するのみと思われる。代表的な実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、ウイルスゲノム複製および新たなビリオン内へのパッケージングに必要である少なくともそれらの複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般的に、少なくとも１種の大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１種の小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードするであろう。特定の実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質、ならびにＡＡＶ Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８、ならびにＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。なおさらなる実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、またはＲｅｐ７８およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする。

【0055】

本明細書において使用するとき、「大きなＲｅｐタンパク質」という用語は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。特許請求される本発明の大きなＲｅｐタンパク質は、野生型または合成のいずれかであり得る。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、これらに限定されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１３、または現在公知のもしくは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む、任意のＡＡＶ由来のものであり得る（例えば、表１を参照されたい）。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、切取り、および／またはミスセンス変異によって変更され得る。

【0056】

当業者であれば、複製タンパク質は、同じポリヌクレオチドによってコードされる必要はないことをさらに解するであろう。例えば、ＡＡＶに関して、ｐ１９プロモーターは不活性化され得、大きなＲｅｐタンパク質は１つのポリヌクレオチドから発現され得、小さなＲｅｐタンパク質は異なるポリヌクレオチドから発現され得る。しかしながら、典型的に、単一の構築物から複製タンパク質を発現させることがより好都合であろう。一部のシステムにおいて、ウイルスプロモーター（例えば、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター）は細胞によって認識され得ず、それゆえ、別個の発現カセットから大きなおよび小さなＲｅｐタンパク質を発現させる必要がある。他の場合には、大きなＲｅｐおよび小さなＲｅｐタンパク質を別個に、すなわち別個の転写および／または翻訳制御エレメントの制御下で発現させることが望ましくあり得る。例えば、小さなＲｅｐタンパク質に対する大きなＲｅｐタンパク質の比を減少させるように、大きなＲｅｐタンパク質の発現を制御することが望ましくあり得る。昆虫細胞の場合には、大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）の発現を下方調節して、細胞への毒性を回避することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５を参照されたい）。

【0057】

本明細書において使用するとき、ＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能的ＡＡＶカプシド（すなわち、ＤＮＡをパッケージし得、標的細胞に感染し得る）を形成する構造タンパク質をコードする。典型的に、ｃａｐコード配列は、ＡＡＶカプシドサブユニットのすべてをコードするであろうが、機能的カプシドが産生される限り、すべてに満たないカプシドサブユニットがコードされ得る。典型的に、しかし必ずではなく、ｃａｐコード配列は、単一の核酸分子上に存在するであろう。

【0058】

ＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に記載される。

【0059】

本明細書において使用するとき、「合成ＡＡＶ ＩＴＲ」という用語は、野生型ＩＴＲとヌクレオチド配列が異なる天然に存在しないＩＴＲ、例えば１つもしくは複数の欠失、付加、置換、またはこれらの任意の組合せに起因したＡＡＶ血清型２ ＩＴＲ（ＩＴＲ２）配列を指す。合成および野生型ＩＴＲ（例えば、ＩＴＲ２）配列間の差は、わずか１つのヌクレオチド変化、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個、またはそれを上回る数のヌクレオチド、またはこれらの中の任意の範囲の変化であり得る。一部の実施形態において、合成および野生型ＩＴＲ（例えば、ＩＴＲ２）配列間の差は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１個を超えない数のヌクレオチド、またはこれらの中の任意の範囲であり得る。

【0060】

本発明は、望ましい特徴を有し、ＩＴＲを含むベクターの活性およびそれに対する細胞応答を操作するように設計され得る、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを提供する。

【0061】

ゆえに、本発明の１つの態様は、少なくとも１つの合成アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドであって、ＩＴＲは、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；（ｂ）Ｂループ；（ｃ）Ｃループ；（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；（ｅ）Ｄ領域；（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント、を含み、（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ３ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、（ｉ）ＲＢＥ’エレメントは、ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置に非相補的ループＴＴＴ配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉ）Ｂループは、ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３（すなわち、それぞれＡＡＶ２またはＡＡＶ３のＩＴＲ）のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉｉ）Ｃループは、ヌクレオチド位置６５～８３に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｖ）Ｄ領域は、ヌクレオチド位置１２５～１４５に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；ならびに／または（ｖ）１つもしくは複数のニッキング－ステムループの少なくとも１つは、ヌクレオチド位置４に相当する位置にＣもしくはＧ置換、および／もしくはヌクレオチド位置１２２に相当する位置にＣもしくはＧ置換（例えば、Ｃ４Ｇおよび／またはＧ１２２Ｃ）を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ポリヌクレオチドに関する。

【0062】

配列番号１．ＡＡＶ２ ＩＴＲ（ＩＴＲ２）（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００１４０１．２）
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

【0063】

図１Ａ～１Ｃに描写されるもの等、野生型（例えば、非改変）ＡＡＶ血清型ＩＴＲは、これらに限定されないが、Ａ領域、Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）、ＲＢＥ’、１つまたは複数のニッキング－ステムループ、末端分解部位（ｔｒｓ）、Ｂループ、Ｃループ、およびＤ領域を含む、複数の構造的特質を含む。

【0064】

ＩＴＲ配列は、それ自身の上に折り畳まれて、ＢループおよびＣループと称される領域を含むようなヘアピン構造を形成すると予測される（図１Ａ～１Ｂ）。ＩＴＲのＡ領域におけるＲＢＥは、ＲＢＥに結合するとゲノム複製を開始し得る大きなＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８）に対する結合部位である。この初期結合は、ＤＮＡ鎖をほどき、ジヌクレオチドＴＴ末端分解部位（ｔｒｓ）においてＲｅｐによって切断可能であるニッキングステムを形成するのを助ける。大きなＲｅｐタンパク質は、Ｃループの先端でもＲＢＥ’領域と接触する（図１Ａ～１Ｂ）。

【0065】

ＡＡＶ ＩＴＲのＲＢＥ、末端分解配列、およびＲＢＥ’エレメントの配列は、当技術分野において周知である。ＡＡＶ２ ＩＴＲにおけるエレメントが図１Ａに示されている。本発明のポリヌクレオチドに存在するエレメントのそれぞれは、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲにある正確な配列であり得る、またはエレメントの機能が、それが、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲにあるエレメントの機能と実質的に異ならない限り、わずかに異なり得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個を超えない数のヌクレオチドの付加、欠失、および／または置換により異なる）。「実質的に異なる」という用語は、本明細書において、５０％を上回る割合の機能（例えば、形質導入効率、Ｒｅｐ結合、ニッキング）の差として定義される。本明細書において定義されるＲＢＥ、末端分解配列、およびＲＢＥ’エレメントという用語は、それが、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲにあるエレメントの機能と実質的に異ならない機能を提供する、完全長エレメントのフラグメントおよび一部分を包含する。

【0066】

一部の実施形態において、本発明の合成ＩＴＲ、例えば、（ａ）ＡＡＶ ＲＢＥ；（ｂ）Ｂループ；（ｃ）Ｃループ；（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；（ｅ）Ｄ領域；（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント、を含み、（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ３ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、（ｉ）ＲＢＥ’エレメントは、ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置に非相補的ループＴＴＴ配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉ）Ｂループは、ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３（すなわち、それぞれＡＡＶ２またはＡＡＶ３のＩＴＲ）のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉｉ）Ｃループは、ヌクレオチド位置６５～８３に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｖ）Ｄ領域は、ヌクレオチド位置１２５～１４５に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；ならびに／または（ｖ）１つもしくは複数のニッキング－ステムループの少なくとも１つは、ヌクレオチド位置４に相当する位置にＣもしくはＧ置換、および／もしくはヌクレオチド位置１２２に相当する位置にＣもしくはＧ置換（例えば、Ｃ４Ｇおよび／またはＧ１２２Ｃ）を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、合成ＩＴＲは、野生型（例えば、非改変）ＡＡＶ血清型ＩＴＲと比べて増強した転写機能を有し得る。

【0067】

本発明の別の態様は、少なくとも１つの合成アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドであって、ＩＴＲは、（ａ）ＡＡＶ ＲＢＥ；（ｂ）Ｂループ；（ｃ）Ｃループ；（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；（ｅ）Ｄ領域；（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント、を含み、（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、（ｉ）ＲＢＥ’エレメントは、ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置に非相補的ループＴＣＴ配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉ）Ｂループは、ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６（すなわち、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６のＩＴＲ）のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉｉ）Ｃループは、ヌクレオチド位置６５～８３に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｖ）Ｄ領域は、ヌクレオチド位置１２５～１４５に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；ならびに／または（ｖ）１つもしくは複数のニッキング－ステムループの少なくとも１つは、ヌクレオチド位置４に相当する位置にＣもしくはＧ置換、および／もしくはヌクレオチド位置１２２に相当する位置にＣもしくはＧ置換（例えば、Ｇ４Ｃおよび／またはＣ１２２Ｇ）を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ポリヌクレオチドを提供する。

【0068】

一部の実施形態において、合成ＩＴＲ（例えば、（ａ）ＡＡＶ ＲＢＥ；（ｂ）Ｂループ；（ｃ）Ｃループ；（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；（ｅ）Ｄ領域；（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント、を含み、（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、（ｉ）ＲＢＥ’エレメントは、ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置に非相補的ループＴＣＴ配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉ）Ｂループは、ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６（すなわち、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６のＩＴＲ）のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｉｉ）Ｃループは、ヌクレオチド位置６５～８３に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；（ｉｖ）Ｄ領域は、ヌクレオチド位置１２５～１４５に相当する位置に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づき；ならびに／または（ｖ）１つまたは複数のニッキング－ステムループの少なくとも１つは、ヌクレオチド位置４に相当する位置にＣもしくはＧ置換、および／もしくはヌクレオチド位置１２２に相当する位置にＣもしくはＧ置換（例えば、Ｇ４Ｃおよび／またはＣ１２２Ｇ）を含み、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、合成ＩＴＲ）は、野生型（例えば、非改変）ＡＡＶ血清型ＩＴＲと比べて低下した転写機能を有し得る。

【0069】

本発明の合成ＩＴＲの構造的特質（ａ）～（ｇ）は、これらに限定されないが、表１の任意のＡＡＶ血清型等の任意のＡＡＶ血清型由来のものであり得る。一部の実施形態において、本発明の合成ＩＴＲの（ａ）～（ｇ）は、同じＡＡＶ由来のものである。一部の実施形態において、本発明の合成ＩＴＲの（ａ）～（ｇ）は、異なるＡＡＶ由来のものである。本発明のポリヌクレオチドおよび／または合成ＩＴＲの産生は、例えば図１Ａ～１Ｃにおいて同定されるように、別のＡＡＶ血清型から同定された改変の一部（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個等）またはすべてを導入することによって行われ得る。本発明の合成ＩＴＲを産生するために、ＡＡＶ ＩＴＲの特定の領域の一部として同定されたあらゆるヌクレオチドが置換されることを要されるわけではない。所望の機能的および／または構造的ＩＴＲ特性を生み出すのに必要な置換の数は、本明細書における教示に従っておよび当技術分野において周知のプロトコールに従って、当業者によって容易に判定され得る。本明細書に示されるヌクレオチド配列において提供されるヌクレオチド番号付けは、本明細書において提供されるＡＡＶ２のＩＴＲの非改変（例えば、野生型）ヌクレオチド配列（配列番号１）に基づく。しかしながら、他のＡＡＶ血清型ＩＴＲ配列または他のウイルスＩＴＲ配列における等価のヌクレオチド位置が、本発明のポリヌクレオチドおよび／または合成ＩＴＲの産生において容易に同定され得かつ採用され得、本明細書において配列の節で開示されるもの等、および引用することにより本明細書の一部をなすものとするＨｅｗｉｔｔ ｅｔ ａ．，２００９ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３（８）：３９１９－３９２９に開示されるもの等のアライメントを介して同定され得ることは当業者によって容易に理解されるであろう。

【0070】

一部の実施形態において、本発明の合成ＩＴＲは、付加的な非ＡＡＶシスエレメント、例えば転写を開始する、エンハンサー機能を媒介する、有糸分裂があり次第の複製および対称分布を可能にする、または形質導入されたゲノムの持続性およびプロセシングを変更するエレメントをさらに含み得る。そのようなエレメントは当技術分野において周知であり、限定されることなく、プロモーター、エンハンサー、クロマチン付着配列、テロメア配列、シス作用性マイクロＲＮＡ、およびこれらの組合せを含む。一部の実施形態において、本発明の合成ＩＴＲは、いかなる付加的な非ＡＡＶシスエレメントも明確に含まなくてもよい。例えば、一部の実施形態において、本発明の合成ＩＴＲはプロモーターを含まなくてもよい。

【0071】

一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１種または複数のインシュレーター配列をさらに含み得る。本明細書において使用するとき、「インシュレーター配列」という用語は、ＩＴＲ転写活性を阻害し得および／または別様に弱め得る配列（例えば、ＩＴＲの外側にある配列）を指す。インシュレーター配列の例は、当技術分野において公知である。

【0072】

一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、異種ヌクレオチド配列（例えばコード配列、例えばタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする）をさらに含み得る。

【0073】

野生型（例えば、非改変）ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＣｐＧモチーフを含むことが公知である。一部の実施形態において、本発明の合成ＩＴＲにおける１つまたは複数のＣｐＧモチーフは、ＩＴＲ２等の天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲの配列と比べて欠失され得および／または置換され得る。ＡＡＶ ＩＴＲ２は、１６個のＣｐＧモチーフを含有する。ＴＬＲ－９はＣｐＧ配列モチーフに直接結合し、細胞性自然免疫の活性化をもたらす。ＣｐＧモチーフのメチル化が転写サイレンシングをもたらすことも周知である。ＩＴＲにおけるＣｐＧモチーフの除去は、ＴＬＲ－９認識の減少および／またはメチル化の減少、それゆえ導入遺伝子サイレンシングの減少をもたらし得る。

【0074】

加えて、最近の研究は、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＳｈａｏ ｅｔ ａｌ．２０１８ ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ３（１２）：ｅ１２０４７４およびＦａｕｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１３ ＪＣＩ １２３（７）：２９９４－３００１に記載されるように、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がｄｓＲＮＡセンサーＭＤＡ５またはＭＡＶＳによって感知され得、免疫応答を誘発し得ることを示している。理論によって拘束されることを望まないものの、ＩＴＲにおけるＣｐＧモチーフの除去／低下は、本発明のポリヌクレオチドおよび／または合成ＩＴＲを含む遺伝子療法の使用の間、ｄｓＲＮＡ免疫応答の減少をもたらし得る。

【0075】

一部の実施形態において、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、例えば４個もしくはそれを上回る、または８個もしくはそれを上回る数のＣｐＧモチーフ、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは１６個のＣｐＧモチーフが欠失されおよび／または置換される。本明細書において使用される「欠失されおよび／または置換される」という語句は、ＣｐＧモチーフにおける一方または両方のヌクレオチドが欠失される、異なるヌクレオチドで置換される、または欠失および置換の任意の組合せであることを意味する。

【0076】

本発明は、本発明の合成ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターであり得る。本発明は、本発明の合成ＩＴＲを含む組換えパルボウイルス粒子（例えば、組換えＡＡＶ粒子）をさらに提供する。一部の実施形態において、本発明は、任意のＡＡＶ血清型由来のＩＴＲまたは本発明の合成ＩＴＲを含むキメラＡＡＶ粒子であって、付加的なＡＡＶシスエレメント（例えば、Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ）は、ＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型由来のものである、キメラＡＡＶ粒子を提供する。ウイルスベクターおよびウイルス粒子は、下でさらに論じられる。

【0077】

本発明は、薬学的に許容される担体中に本発明のウイルスベクターを含む組成物も提供する。

【0078】

使用の方法
本発明は、本発明のポリヌクレオチド、核酸、合成ＩＴＲ、ウイルス、ベクター、粒子、および／または組成物に対する使用の方法をさらに提供する。

【0079】

１つの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む、細胞において異種ヌクレオチド配列を転写する方法を提供する。

【0080】

一部の実施形態において、細胞に導入される本発明のポリヌクレオチドは、これらに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、クロマチン付着配列、テロメア配列、シス作用性マイクロＲＮＡ、およびこれらの組合せ等の付加的な非ＡＡＶシスエレメント、例えば転写を開始する、エンハンサー機能を媒介する、有糸分裂があり次第の複製および対称分布を可能にする、または形質導入されたゲノムの持続性およびプロセシングを変更するエレメントをさらに含み得る。一部の実施形態において、細胞に導入される本発明のポリヌクレオチドは、いかなる付加的な非ＡＡＶシスエレメントも明確に含まなくてもよい。一部の実施形態において、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、付加的な非ＡＡＶシスプロモーターを含まない。

【0081】

本発明の組換えＡＡＶ粒子を細胞に導入することを含む、細胞に核酸を送達する方法がさらに提供される。

【0082】

本発明の別の態様は、組換えＡＡＶ鋳型の複製およびパッケージングに十分な条件下で、ＡＡＶ複製に寛容な細胞に、（ａ）（ｉ）異種核酸および（ｉｉ）本発明の合成ＩＴＲ、を含む組換えＡＡＶ鋳型；ならびに（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチド、を提供するステップを含み、それによって組換えＡＡＶ粒子が細胞において産生される、組換えＡＡＶ粒子を産生する方法を提供する。

【0083】

本発明の別の態様は、組換えＡＡＶ鋳型の複製およびパッケージングに十分な条件下で、ＡＡＶ複製に寛容な細胞に、（ａ）（ｉ）異種核酸および（ｉｉ）任意のＡＡＶ血清型由来の野生型ＩＴＲまたは本発明の合成ＩＴＲ、を含む組換えＡＡＶ鋳型；ならびに（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチドであって、ＲｅｐおよびＣａｐコード配列は、異なるＡＡＶ血清型由来のものである、ポリヌクレオチド、を提供するステップを含み、それによって組換えＡＡＶ粒子が細胞において産生される、組換えＡＡＶ粒子を産生する方法を提供する。

【0084】

一部の実施形態において、Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列は、組換えＡＡＶ粒子にパッケージされ得ない。

【0085】

一部の実施形態において、Ｒｅｐコード配列および／またはＣａｐコード配列は、プラスミドによって提供され得る。

【0086】

一部の実施形態において、Ｒｅｐコード配列および／またはＣａｐコード配列は、ウイルスベクターによって提供され得る。ウイルスベクターは、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バールウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターを含む、当技術分野において公知の任意のウイルスベクターであり得る。

【0087】

一部の実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。

【0088】

一部の実施形態において、Ｃａｐコード配列は、細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。

【0089】

一部の実施形態において、組換えＡＡＶ鋳型は、プラスミドおよび／もしくはウイルスベクターによって提供され得る、またはプロウイルスとして細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。

【0090】

ＡＡＶ粒子ベクターゲノムが細胞に入るのに十分な条件下で、本発明の組換えＡＡＶ粒子と接触している細胞を哺乳類対象に投与することを含む、哺乳類対象に核酸を投与する方法がさらに提供される。標的細胞の非限定的な例は、神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心臓筋細胞、膵臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞、前駆細胞、幹細胞、がん細胞、および腫瘍細胞を含む。

【0091】

本発明の組換えＡＡＶ粒子を哺乳類対象に投与することを含む、哺乳類対象に核酸を投与する方法が付加的に提供される。一部の実施形態において、組換えＡＡＶ粒子は、１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量域、例えば約１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、またはその中の任意の値もしくは範囲で哺乳類対象に投与され得る。例えば、一部の実施形態において、組換えＡＡＶ粒子は、約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１０ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量域、または約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^８ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、もしくは約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇで哺乳類対象に投与され得る。

【0092】

一部の実施形態において、哺乳類対象はヒト対象であり得る。

【0093】

一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、経口、直腸、経粘膜、経皮、吸入、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内、内皮内（ｉｎｔｒａｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）、硝子体内、網膜下、関節内投与、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される経路によって投与され得る。

【0094】

一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、腫瘍、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、目、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される部位で対象に投与され得る。

【0095】

一部の実施形態において、哺乳類対象は、本発明のポリヌクレオチドを含まないＡＡＶ粒子と比較して、前記ＡＡＶ粒子に対する低下した免疫応答を有し得る。

【0096】

野生型（例えば、非改変）逆位末端反復（ＩＴＲ）と比べて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲのプロモーター機能を増強する方法であって、ＩＴＲは、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；（ｂ）Ｂループ；（ｃ）Ｃループ；（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；（ｅ）Ｄ領域；（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント、を含み、（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ３ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、（ｉ）ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置における非相補的ループＴＴＴ配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、非相補的ループＴＴＴ配列；（ｉｉ）ヌクレオチド位置４３～６１に相当する位置に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３（すなわち、それぞれＡＡＶ２またはＡＡＶ３のＩＴＲ）のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置６５～８３に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；（ｉｖ）ヌクレオチド位置１２５～１４５に、ＩＴＲ２もしくはＩＴＲ３のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；ならびに／または（ｖ）ヌクレオチド位置４におけるＧもしくはＣ置換および／もしくはヌクレオチド位置１２２におけるＧもしくはＣ置換（例えば、Ｃ４Ｇおよび／またはＧ１２２Ｃ）であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、置換、のうちの１つまたは複数を置換することを含む、方法が本明細書においてさらに提供される。

【0097】

本発明の別の態様は、野生型（例えば、非改変）逆位末端反復（ＩＴＲ）と比べて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲのプロモーター機能を低下させる方法であって、ＩＴＲは、（ａ）ＡＡＶ ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）；（ｂ）Ｂループ；（ｃ）Ｃループ；（ｄ）１つまたは複数のニッキング－ステムループ；（ｅ）Ｄ領域；（ｆ）ＡＡＶ末端分解配列；および（ｇ）ＡＡＶ ＲＢＥ’エレメント、を含み、（ａ）～（ｇ）は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６ではない任意のＡＡＶ血清型由来のものであり、（ｉ）ヌクレオチド位置７３～７５に相当する位置における非相補的ループＴＣＴ配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、非相補的ループＴＣＴ配列；（ｉｉ）ヌクレオチド位置４３～６１に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６（すなわち、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６のＩＴＲ）のＢループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置６５～８３に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＣループのヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；（ｉｖ）ヌクレオチド位置１２５～１４５に、ＩＴＲ１もしくはＩＴＲ６のＤ領域のヌクレオチド配列と８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ヌクレオチド配列；ならびに／または（ｖ）ヌクレオチド位置４におけるＣ置換および／もしくはヌクレオチド位置１２２におけるＧ置換（例えば、Ｇ４Ｃおよび／またはＣ１２２Ｇ）であり、ヌクレオチド番号付けは配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、置換、のうちの１つまたは複数を置換することを含む、方法を提供する。

【0098】

一部の実施形態において、改変前の（非改変）ＩＴＲは、高い転写活性を有した。

【0099】

一部の実施形態において、改変前の（非改変）ＩＴＲは、低い転写活性を有した。

【0100】

一部の実施形態において、本発明の方法は、ＩＴＲ内のＣｐＧアイランドおよび／またはＣ－Ｇジヌクレオチド頻度を改変する（例えば、１つもしくは複数の［例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個等、またはそれを上回る数の］ＣｐＧアイランドおよび／もしくはＣ－Ｇジヌクレオチド配列を挿入する、ならびに／または１つもしくは複数の［例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個等、またはそれを上回る数の］ＣｐＧアイランドおよび／もしくはＣ－Ｇジヌクレオチド配列を欠失させる）ことをさらに含む。理論によって拘束されることを望まないものの、ＣｐＧおよび／またはＣ－Ｇジヌクレオチド頻度を改変することは、合成ＩＴＲの転写活性を改変し得る。一部の実施形態において、本発明の合成ＩＴＲは、少なくとも１つまたは複数のＧｐＣおよび／またはＣ－Ｇジヌクレオチド配列を有し、野生型（非改変）ＩＴＲの機能的活性を保持する。

【0101】

一部の実施形態において、本発明の方法は、ＩＴＲ双方向性活性が弱められ、免疫応答が軽減されることをさらに含む。理論によって拘束されることを望まないものの、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＳｈａｏ ｅｔ ａｌ．２０１８ ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ３（１２）：ｅ１２０４７４に記載されるように、ＩＴＲ双方向性活性は、ｄｓＲＮＡ認識および免疫応答誘発を増強し得ると思われる。

【0102】

ウイルスベクターを産生する方法
本発明は、ウイルスベクターを産生する方法をさらに提供する。

【0103】

１つの実施形態において、本発明は、組換えＡＡＶ鋳型の複製およびパッケージングに十分な条件下で、ＡＡＶ複製に寛容な細胞に、（ａ）（ｉ）異種核酸および（ｉｉ）本発明の合成ＩＴＲ、を含む組換えＡＡＶ鋳型；（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチド、を提供するステップを含み、それによって組換えＡＡＶ粒子が細胞において産生される、組換えＡＡＶ粒子を産生する方法を提供する。

【0104】

組換えＡＡＶ鋳型の複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、ＡＡＶ鋳型の複製およびＡＡＶカプシド内へのカプシド化に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）、ならびにアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在であり得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ鋳型は、異種核酸配列に対する５’および３’に配置される２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むが、それらはそれと直接連続している必要はない。

【0105】

一部の実施形態において、組換えＡＡＶ鋳型は、国際特許公開公報ＷＯ０１／９２５５１に記載される二重鎖ＡＡＶベクターを作製するために、Ｒｅｐによって分解されないＩＴＲを含む。

【0106】

核酸鋳型ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージされた核酸鋳型を含むウイルスベクターが細胞において産生されるような条件下で提供される。方法は、細胞からウイルスベクターを回収することをさらに含み得る。ウイルスベクターは、培地からおよび／または細胞を溶解することによって回収され得る。

【0107】

細胞は、ＡＡＶウイルス複製に寛容である細胞であり得る。当技術分野において公知の任意の適切な細胞が採用され得る。特定の実施形態において、細胞は哺乳類細胞である。別の選択肢として、細胞は、複製欠陥ヘルパーウイルスから欠失された機能を提供するトランス補完パッケージング細胞株、例えば２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞であり得る。

【0108】

ＡＡＶ複製およびカプシド配列は、当技術分野において公知の任意の方法によって提供され得る。現在のプロトコールは、典型的に、単一のプラスミド上のＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現させる。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は一緒に提供される必要はないが、そうすることが好都合であり得る。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失されたアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入される）。ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現させるためにＥＢＶベクターも採用され得る。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターはエピソーム性であるが、それにもかかわらず、継続的な細胞分裂全体で高いコピー数を維持するであろうことである（すなわち、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」と呼ばれる染色体外エレメントとして細胞内に安定に組み込まれる）。

【0109】

さらなる代替策として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞内に安定に組み入れられ得る。

【0110】

典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを阻止するために、ＴＲによって隣接されないであろう。

【0111】

核酸鋳型は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して細胞に提供され得る。例えば、鋳型は、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施形態において、核酸鋳型は、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失されたアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入される）。別の例として、ＡＡＶ ＴＲによって隣接されたレポーター遺伝子を運ぶバキュロウイルスベクターが使用され得る。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上で記載されるように、鋳型を送達するためにＥＢＶベクターも採用され得る。

【0112】

別の代表的な実施形態において、核酸鋳型は、複製性ｒＡＡＶウイルスによって提供される。さらに他の実施形態において、核酸鋳型を含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体に安定に組み込まれる。

【0113】

ウイルス力価を増強するために、生産性の高いＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が細胞に提供され得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野において公知である。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供されるであろう。代替的に、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば効率的なＡＡＶ産生を促進するヘルパー遺伝子のすべてを運ぶ非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして提供され得る。

【0114】

さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体に埋め込まれたまたは安定な染色体外エレメントとして維持されたヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般的に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン内にパッケージされ得ず、例えばＴＲによって隣接されない。

【0115】

当業者であれば、単一のヘルパー構築物上にＡＡＶ複製およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であり得ることを解するであろう。このヘルパー構築物は非ウイルスまたはウイルス構築物であり得る。１つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。

【0116】

１つの特定の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは核酸鋳型をさらに含み得る。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルスの欠失された領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）に挿入され得る。

【0117】

さらなる実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施形態によれば、ｒＡＡＶ鋳型はプラスミド鋳型として提供され得る。

【0118】

別の例示的な実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、ｒＡＡＶ鋳型は、プロウイルスとして細胞内に組み込まれる。代替的に、ｒＡＡＶ鋳型は、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって提供される。

【0119】

さらなる例となる実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ｒＡＡＶ鋳型は、別個の複製性ウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ｒＡＡＶ鋳型は、ｒＡＡＶ粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。

【0120】

前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、および存在する場合にはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルス骨格に埋め込まれ、５’および３’シス配列によって隣接され、それによりこれらの配列はアデノウイルスカプシド内にパッケージされ得る。上で記載されるように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、一般的にＴＲによって隣接されず、それによりこれらの配列はＡＡＶビリオン内にパッケージされない。

【0121】

Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４－１２）は、アデノウイルスならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーを記載する。

【0122】

ヘルペスウイルスも、ＡＡＶパッケージング法におけるヘルパーウイルスとして使用され得る。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、拡張可能なＡＡＶベクター産生スキームを有利に促し得る。ＡＡＶ－２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）ベクターが、例えば引用することにより本明細書の一部をなすものとするＰＣＴ公開公報ＷＯ００／１７３７７号に記載されている。

【0123】

さらなる代替策として、本発明のウイルスベクターは、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するバキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞において産生され得る。

【0124】

ヘルパーウイルスを夾雑することのないＡＡＶベクターストックは、当技術分野において公知の任意の方法によって獲得され得る。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。ＡＡＶは、ヘパリン基質に対するアフィニティーに基づいてもヘルパーウイルスから分離され得る。欠失された複製欠陥ヘルパーウイルスが使用され得、それによりいかなる夾雑ヘルパーウイルスも複製能がない。さらなる代替策として、ＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するためには、アデノウイルス初期遺伝子発現のみが要されることから、後期遺伝子発現を欠如するアデノウイルスヘルパーが採用され得る。後期遺伝子発現を欠陥したアデノウイルス変異体は、当技術分野において公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。

【0125】

組換えウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボ、およびインビボにおける細胞への核酸の送達に有用である。特に、ウイルスベクターを有利に採用して、例えば哺乳類細胞を含む動物細胞に核酸を送達し得るまたは移行させ得る。

【0126】

目的の任意の異種核酸配列が、本発明のウイルスベクターにおいて送達され得る。目的の核酸は、治療用（例えば、医学的または獣医学的使用のための）および／または免疫原性（例えば、ワクチンのための）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸を含む。

【0127】

治療用ポリペプチドは、これらに限定されないが、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニおよびマイクロジストロフィンを含む、例えばＶｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０；米国特許公開第２００３０１７１３１号；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ／２００８／０８８８９５号、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３７１４－１３７１９（２０００）；およびＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７－６４（２００８）を参照されたい）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、ＩカッパＢドミナント変異体等の抗炎症ポリペプチド、サルコスパン、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子等）、エリスロポエチン、アンギオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α１－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、ペプチド成長因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様成長因子１および２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、骨形成タンパク質［ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦを含む］、グリア由来成長因子、トランスフォーミング成長因子－αおよび－β等）、リソソーム酸α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死成長因子α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウム処理をモジュレートする分子（例えば、ＳＥＲＣＡ_２Ａ、ＰＰ１およびそのフラグメントの阻害剤１［例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００６／０２９３１９号および第ＷＯ２００７／１００４６５号］）、切り取られた構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ等のＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンを生じさせる分子、ＩＲＡＰ等の抗炎症因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体を含む；例となるＭａｂはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｍａｂである）、神経ペプチドおよびそのフラグメント（例えば、ガラニン、神経ペプチドＹ（米国特許第７，０７１，１７２号を参照されたい）、バゾヒビンおよび他のＶＥＧＦ阻害剤等の血管新生阻害剤（例えば、バゾヒビン２［ＰＣＴ公開公報ＷＯ ＪＰ２００６／０７３０５２を参照されたい］）を含む。他の例示的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制因子遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳリガンド、およびそれを必要とする対象において治療効果を有する任意の他のポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターを使用して、モノクローナル抗体および抗体フラグメント、例えばミオスタチンに向けられた抗体または抗体フラグメントも送達し得る（例えば、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４－５９０（２００５）を参照されたい）。

【0128】

ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードするものを含む。レポーターポリペプチドは当技術分野において公知であり、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。

【0129】

任意選択で、異種核酸は、分泌ポリペプチド（例えば、その天然状態において分泌ポリペプチドである、または当技術分野において公知であるように、例えば分泌シグナル配列との作動的な結び付きによって分泌されるように操作されている、ポリペプチド）をコードする。

【0130】

代替的に、本発明の特定の実施形態において、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライセオソーム媒介性トランススプライシングを生じさせるＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照されたい）、遺伝子サイレンシングを媒介する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照されたい）、および例えば「ガイド」ＲＮＡ等の他の非翻訳ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９；Ｙｕａｎらに対する米国特許第５，８６９，２４８号）等をコードし得る。例となる非翻訳ＲＮＡは、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療しおよび／もしくは阻止するための、ならびに／または化学療法による損傷を阻止するための心臓への投与のための）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療しかつ／または阻止するための）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば心血管疾患を治療するための、例えばＡｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２－１４２（２００８）およびＬｉ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１－５５（２００５）を参照されたい）；ホスホランバンＳ１６Ｅ等のホスホランバン阻害性分子またはドミナントネガティブ分子（例えば心血管疾患を治療するための、例えばＨｏｓｈｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４－８７１（２００２）を参照されたい）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、てんかんに対する）、ならびに病原性生物およびウイルス（例えば、Ｂ型および／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス等）に向けられたＲＮＡｉを含む。

【0131】

さらに、選択的スプライシングを指揮する核酸配列が送達され得る。例示するために、ジストロフィンエクソン５１の５’および／または３’スプライス部位に相補的なアンチセンス配列（または他の阻害性配列）を、Ｕ１またはＵ７核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターと併せて送達して、このエクソンのスキッピングを誘導し得る。例えば、アンチセンス／阻害性配列に対して５’に配置されるＵ１またはＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列が、本発明の改変カプシドにおいてパッケージされ得かつ送達され得る。

【0132】

ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有しかつ組み換わる異種核酸も含み得る。この手法を利用して、例えば宿主細胞における遺伝子欠陥を修正し得る。

【0133】

本発明は、例えばワクチン接種のための、免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベクターも提供する。核酸は、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス由来の免疫原、ＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原等を含む、当技術分野において公知の目的の任意の免疫原をコードし得る。

【0134】

ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は、当技術分野において公知である（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：８５０７；Ｙｏｕｎｇらに対する米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａらに対する米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，８６３，５４１号）。抗原は、パルボウイルスカプシド内に提示され得る。代替的に、抗原は、組換えベクターゲノムに導入された異種核酸から発現され得る。本明細書に記載されるおよび／または当技術分野において公知である目的の任意の免疫原が、本発明のウイルスベクターによって提供され得る。

【0135】

免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を引き出すのに適切な、ならびに／またはこれらに限定されないが、微生物性、細菌性、原虫性、寄生虫性、真菌性、および／またはウイルス性感染症および疾患を含む、感染症および／もしくは疾患から対象を防御するのに適切な任意のポリペプチドであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルトミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質等のインフルエンザウイルス免疫原、またはウマインフルエンザウイルス免疫原）またはレンチウイルス免疫原（例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶまたはＳＩＶマトリックス／カプシドタンパク質、ならびにＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子産物等、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原）であり得る。免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質および／またはラッサ熱エンベロープ糖タンパク質等、ラッサ熱ウイルス免疫原）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物等、ワクシニアウイルス免疫原）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子産物等、エボラウイルス免疫原またはマーブルグウイルス免疫原）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦ、および／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質等の感染性ヒトコロナウイルス免疫原、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、または鳥類感染性気管支炎ウイルス免疫原）でもあり得る。免疫原性ポリペプチドは、さらに、ポリオ免疫原、ヘルペスウイルス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、ムンプスウイルス免疫原、麻疹ウイルス免疫原、風疹ウイルス免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等）免疫原、および／または当技術分野において現在公知のもしくは免疫原として後に同定される任意の他のワクチン免疫原であり得る。

【0136】

代替的に、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍またはがん細胞抗原であり得る。任意選択で、腫瘍またはがん抗原は、がん細胞の表面に発現される。例となるがんおよび腫瘍細胞抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１（１９９１））に記載される。他の例示的ながんおよび腫瘍抗原は、これらに限定されないが、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、黒色腫腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ，（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）；ムチン抗原（ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９０／０５１４２号）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；ならびに／あるいは黒色腫、腺がん、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳腫瘍、および任意の他のがん、または現在公知のもしくは後に同定される悪性病状（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１－９１を参照されたい）と関連することが現在公知のまたは後に発見される抗原、を含む。

【0137】

さらなる代替策として、異種核酸は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞において望ましく産生される任意のポリペプチドをコードし得る。例えば、ウイルスベクターは培養細胞に導入され得、発現した核酸産物はそこから単離され得る。

【0138】

目的の異種核酸は、適当な制御配列と作動的に結び付けられ得ることが当業者によって理解されるであろう。例えば、異種核酸は、転写／翻訳制御シグナル、複製の起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサー等の発現制御エレメントと作動的に結び付けられ得る。

【0139】

さらに、目的の異種核酸の調節された発現は、例えば、特異的部位でのスプライシング活性を選択的に遮断するオリゴヌクレオチド、小分子、および／もしくは他の化合物の存在または非存在によって種々のイントロンの選択的スプライシングを調節することによって、転写後レベルで達成され得る（例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００６／１１９１３７号に記載される）。

【0140】

当業者であれば、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望されるレベルおよび組織特異的発現に応じて使用され得ることを解するであろう。プロモーター／エンハンサーは、所望される発現のパターンに応じて、構成的または誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、在来または外来であり得、天然または合成配列であり得る。外来によって、転写開始領域が導入される野生型宿主において転写開始領域が見出されないことが意図される。

【0141】

特定の実施形態において、プロモーター／エンハンサーエレメントは、治療されるべき標的細胞または対象に対して在来であり得る。代表的な実施形態において、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列に対して在来であり得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般的に、それが目的の標的細胞において機能するように選定される。さらに、特定の実施形態において、プロモーター／エンハンサーエレメントは哺乳類プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは構成的または誘導性であり得る。

【0142】

誘導性発現制御エレメントは、典型的に、異種核酸配列の発現を上回る調節を提供することが望ましいそれらの適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または優先的プロモーター／エンハンサーエレメントであり得、筋肉特異的もしくは優先的（心臓筋、骨格筋、および／または平滑筋特異的または優先的を含む）、神経組織特異的もしくは優先的（脳特異的または優先的を含む）、目特異的もしくは優先的（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的もしくは優先的、骨髄特異的もしくは優先的、膵臓特異的もしくは優先的、脾臓特異的もしくは優先的、および／または肺特異的もしくは優先的プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例となる誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、これらに限定されないが、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターを含む。

【0143】

異種核酸配列が標的細胞において転写され、次いで翻訳される実施形態において、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、特異的開始シグナルが一般的に含まれる。ＡＴＧ開始コドンおよび近接配列を含み得るこれらの外因性翻訳制御配列は、天然でも合成でも、様々な起源のものであり得る。

【0144】

本発明に従ったウイルスベクターは、分裂および非分裂細胞を含む広範な細胞に異種核酸を送達するための手段を提供する。例えばインビトロで細胞に目的の核酸を送達するために、例えばインビトロでポリペプチドを産生するために、またはエクスビボ遺伝子療法のために、ウイルスベクターが採用され得る。ウイルスベクターは、例えば免疫原性および／もしくは治療用ポリペプチドならびに／または機能的ＲＮＡを発現させるために、それを必要とする対象に核酸を送達する方法において付加的に有用である。このように、ポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡは、対象においてインビボで産生され得る。対象はポリペプチドの欠損を有するため、対象はポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡの産生は何らかの有益な効果を与え得るため、方法は実践され得る。

【0145】

ウイルスベクターを使用して、培養細胞においてまたは対象においても目的のポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡを産生し得る（例えば、ポリペプチドを産生するための、および／または、例えばスクリーニング法との関連で、対象に対する機能的ＲＮＡの効果を観察するための、バイオリアクターとして対象を使用する）。

【0146】

概して、本発明のウイルスベクターを採用して、ポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡをコードする異種核酸（例えば治療用ポリペプチド、例えば治療用核酸）を送達して、例えばそれを必要とする対象であって、例えば対象は疾患状態または障害を有するまたはその危険性がある対象に、治療用ポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡを送達することが有益である任意の疾患状態もしくは障害を治療し得および／または阻止し得る。一部の実施形態において、疾患状態はＣＮＳ疾患または障害である。一部の実施形態において、対象は、疾患もしくは障害と関連した疼痛を有するまたは有する危険性がある。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、対象は子宮内にいる。

【0147】

例示的な疾患状態は、これらに限定されないが、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）および肺の他の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β－グロビン）、貧血（エリスロポエチン）、および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β－インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（リピートを除去するＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）、および他の神経学的障害、がん（エンドスタチン、アンギオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳリガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ、ｍｉｒ－２６ａ［例えば、肝細胞癌腫に対する］）、糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型を含む筋ジストロフィー（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様成長因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩカッパＢドミナント変異体等の抗炎症ポリペプチド、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するためのジストロフィン遺伝子におけるスプライス接合部に対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ［例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ／２００３／０９５６４７号を参照されたい］、エクソンスキッピングを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡに対するＲＮＡｉ［例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ／２００６／０２１７２４号を参照されたい］、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体フラグメント）、およびベッカー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α－Ｌ－イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（アデノシンデアミナーゼ）、グリコーゲン蓄積症（例えば、ファブリー病［α－ガラクトシダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸α－グルコシダーゼ］）、および他の代謝障害、先天性肺気腫（α１－アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス（Ｔａｙｓ Ｓａｃｈｓ）病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（ならびに、目および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症に対するＰＤＧＦ、および／または例えばＩ型糖尿病における、網膜障害を治療する／阻止するためのバゾヒビンもしくはＶＥＧＦの他の阻害剤もしくは他の血管新生阻害剤）、脳（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンギオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、膠芽腫［エンドスタチン、アンギオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］）、肝臓、腎臓、鬱血性心不全もしくは末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む心臓等の固形臓器の疾患（例えば、プロテインホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）およびそのフラグメント（例えば、Ｉ１Ｃ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、切り取られた構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ等のＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンを生じさせる分子；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅ等のホスホランバン阻害性分子またはドミナントネガティブ分子等を送達することによる）、関節炎（インスリン様成長因子）、関節障害（インスリン様成長因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することによる）、心臓移植の生存期間を改善する（スーパーオキシドディスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋肉消耗（インスリン様成長因子Ｉ）、腎臓欠損症（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体等の抗炎症因子）、肝炎（α－インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、およびＳＣＡ３を含む脊髄脳性運動失調症、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患、先天性神経変性障害（例えば、単一遺伝子神経変性障害）、例えばムコ多糖症（これらに限定されないが、ムコ多糖症Ｉ型（ハーラー症候群、ハーラー・シェイエ症候群、またはシェイエ症候群としても知られる、ＩＤＵＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ハンター症候群としても知られる、ＩＤＳ、Ｉ２Ｌ酵素）、ムコ多糖症ＩＩＩ型（サンフィリポ症候群としても知られる、ＧＮＳ［Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ］、ＨＧＳＮＡＴ［ヘパラン－アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ］、ＮＡＧＬＵ［アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、および／またはＳＧＳＨ［スルファミダーゼ］）、ムコ多糖症ＩＶ型（モルキオ症候群としても知られる、ＧＡＬＮＳ［ガラクトサミン（ｇａｌａｔｏｓａｍｉｎｅ）（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ］および／またはＧＬＢ１［ベータ－ガラクトシダーゼ］）、ムコ多糖症Ｖ型（シェイエ症候群、現在Ｉ型の下位群としても知られる、またＩＤＵＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ）、ムコ多糖症ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群としても知られる、ＡＲＳＢ、アリールスルファターゼＢ）、ムコ多糖症ＶＩＩ型（スライ症候群としても知られる、ＧＵＳＢ、ベータ－グルクロニダーゼ）、ムコ多糖症ＩＸ型（ナトウィック（Ｎａｔｏｗｉｃｚ）症候群としても知られる、ＨＹＡＬ１、ヒアルロニダーゼ）を含む）、ならびに／または白質ジストロフィー（これらに限定されないが、成人発症常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ；ＬＭＮＢ１、ラミンＢ１）、エカルディ・グティエール症候群（ＴＲＥＸ１、ＲＮＡＳＥＨＳＢ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、および／またはＲＮＡＳＥＨ２Ａ）、アレキサンダー病（ＦＲＡＰ、グリア線維性酸性タンパク質）、ＣＡＤＡＳＩＬ（Ｎｏｔｃｈ３）、カナバン病（ＡＳＰＡ、アスパルトアシラーゼ）、ＣＡＲＡＳＩＬ（ＨＴＲＡ１、セリンプロテアーゼＨＴＲＡ１）、脳腱黄色腫症（「ＣＴＸ」、ＣＹＰ２７Ａ１、ステロール２７－ヒドロキシラーゼ）、小児期運動失調症および大脳白質形成不全症（ＣＡＣＨ）／白質消失症（ＶＷＭＤ）（ｅＩＦ２Ｂ、真核性開始因子２Ｂ）、ファブリー病（ＧＬＡ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ）、フコシドーシス（ＦＵＣＡ１、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＬＢ１、ベータ－ガラクトシダーゼ）、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症（Ｌ２ＨＤＧＨ、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ）、クラッベ病（ＧＡＬＣ、ガラクトセレブロシダーゼ）、皮質下嚢胞を有する大脳型白質脳症（ｍｅｇａｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）（「ＭＬＣ」、ＭＬＣ１および／またはＨＥＰＡＣＡＭ）、異染性白質ジストロフィー（ＡＳＡ、アリールスルファターゼ（ａｒｙｌｓｕｌｐｈａｔａｓｅ）Ａ）、マルチプルスルファターゼ欠損症（「ＭＳＤ」、ＳＵＭＦ１、すべてのスルファターゼ酵素に影響を及ぼすスルファターゼ修飾因子１）、ペリツェウス・メルツバッハー病（「Ｘ連鎖痙性対麻痺」としても知られる、ＰＬＰ１［Ｘ連鎖プロテオリピドタンパク質１］および／またはＧＪＡ１２［ギャップ結合タンパク質１２］）、Ｐｏｌ ＩＩＩ関連白質ジストロフィー（ＰＯＬＲ３Ａおよび／またはＰＯＬＲ３Ｂ）、レフサム病（ＰＨＹＨ、［フィタノイル－ＣｏＡヒドロキシラーゼ］および／またはＰｅｘ７［ペルオキシソームへのＰＨＹＨインポーター］）、サラ病（「遊離シアル酸蓄積症」としても知られる、ＳＬＣ１７Ａ５、シアル酸トランスポーター）、シェーグレン・ラルソン症候群（ＡＬＤＨ３Ａ２、アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー（「ＡＬＤ」、ＡＢＣＤ１、ペルオキシソームＡＴＰａｓｅ結合カセットタンパク質）、ツェルウェーガー症候群スペクトラム障害（ペルオキシソーム生合成障害としても知られる、ＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ４、ＰＥＸ５、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１１Ｂ、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１６、ＰＥＸ１９、ＰＥＸ２６）を含む）等を含む。本発明を臓器移植後にさらに使用して、移植の成功を増加させ得かつ／または臓器移植もしくは補助療法のマイナスの副作用を低下させ得る（例えば、サイトカイン産生を遮断する免疫抑制剤または阻害性核酸を投与することによる）。別の例として、がん患者において、例えば骨折（ｂｒｅａｋ）または外科的除去後に、骨形成タンパク質（ＢＮＰ２、７等、ＲＡＮＫＬ、および／またはＶＥＧＦを含む）が骨同種移植片とともに投与され得る。

【0148】

ゆえに、一部の実施形態において、本発明は、治療用核酸が対象において発現される条件下で、本発明のウイルスベクターおよび／または組成物を対象に投与することによって、対象の細胞に治療用核酸を導入することを含む、それを必要とする対象における疾患を治療する方法を提供する。

【0149】

本発明は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を産生するためにも使用され得る。例えば、本発明のウイルスベクターを使用して、成体の線維芽細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞等の非多能性細胞に幹細胞関連核酸を送達し得る。幹細胞と関連した因子をコードする核酸は、当技術分野において公知である。幹細胞および多能性と関連したそのような因子の非限定的な例は、Ｏｃｔ－３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、および／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、および／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、および／またはＮ－ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧ、および／またはＬＩＮ２８を含む。

【0150】

本発明は、代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子）、リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症障害（例えば、スライ症候群［β－グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、シェイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハーラー・シェイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル－ＣｏＡ：α－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ］、Ｂ［β－ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ］等）、ファブリー病（α－ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、もしくはグリコーゲン蓄積症（例えば、ポンペ病；リソソーム酸α－グルコシダーゼ）を治療しおよび／または阻止するためにも実践され得る。

【0151】

遺伝子移入は、疾患状態を理解しかつそれに対する療法を提供するための実質的な潜在的使用を有する。欠陥遺伝子が公知であり、クローニングされている多数の遺伝性疾患がある。一般的に、上記の疾患状態は、２つのクラス：一般的に劣性様式で受け継がれる、通常では酵素の欠損状態、および調節または構造タンパク質を伴い得、典型的には優性様式で受け継がれる不均衡状態、に分類される。欠損状態の疾患に関しては、遺伝子移入を使用して、置き換え療法のために罹患組織に正常遺伝子を持ち込み得、ならびにアンチセンス変異を使用して疾患に対する動物モデルを創出し得る。不均衡な疾患状態に関しては、遺伝子移入を使用して、モデルシステムにおいて疾患状態を創出し得、次いでそれを使用して疾患状態に対抗し得る。ゆえに、本発明に従ったウイルスベクターは、遺伝子疾患の治療および／または阻止を可能にする。

【0152】

本発明に従ったウイルスベクターを採用して、インビトロまたはインビボで細胞に機能的ＲＮＡを提供もし得る。細胞における機能的ＲＮＡの発現は、例えば細胞による特定の標的タンパク質の発現を低減させ得る。したがって、機能的ＲＮＡを投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させ得る。機能的ＲＮＡをインビトロで細胞に投与して、遺伝子発現および／または細胞生理を調節して、例えば細胞もしくは組織培養システムを最適化し、またはスクリーニング法も最適化し得る。

【0153】

加えて、本発明に従ったウイルスベクターは、診断法およびスクリーニング法において使用を見出し、それによって、目的の核酸は、細胞培養システムまたは代替的にトランスジェニック動物モデルにおいて一過性にまたは安定に発現される。

【0154】

本発明のウイルスベクターは、当業者に明白であろうように、これらに限定されないが、遺伝子標的化、クリアランス、転写、翻訳等を査定するプロトコールにおける使用を含む、様々な非治療的目的のためにも使用され得る。ウイルスベクターは、安全性（拡散、毒性、免疫原性等）を評価する目的のためにも使用され得る。そのようなデータは、臨床的有効性の評価の前に、規制当局承認プロセスの一部として米国食品医薬品局によって考慮される。

【0155】

さらなる態様として、本発明のウイルスベクターを使用して、対象において免疫応答を生み出し得る。この実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクターが対象に投与され得、免疫原性ポリペプチドに対して、能動免疫応答が対象によって始められる。免疫原性ポリペプチドは、上で記載されるとおりである。一部の実施形態において、防御免疫応答が引き出される。

【0156】

代替的に、ウイルスベクターはエクスビボで細胞に投与され得、変更された細胞が対象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクターが細胞に導入され、細胞は対象に投与され、そこで免疫原をコードする異種核酸は発現され得かつ免疫原に対して対象において免疫応答を誘導し得る。特定の実施形態において、細胞は抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。

【0157】

「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原との遭遇後の宿主組織および細胞の参加によって特徴付けられる。それは、リンパ細網組織における免疫能力のある細胞の分化および増殖を伴い、それは、抗体の合成もしくは細胞媒介性反応性の発生、またはその両方につながる」。Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ ｅｄ．，１９８５）。代替的に述べると、能動免疫応答は、感染によるまたはワクチン接種による免疫原への曝露後に宿主によって始められる。能動免疫は、「能動免疫された宿主から非免疫宿主へのあらかじめ形成された物質（抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インターロイキン－２）の移入」により取得される受動免疫と対比され得る。同上。

【0158】

本明細書において使用される「防御」免疫応答または「防御」免疫とは、免疫応答が、それが疾患の出現を阻止するまたは低下させるという点において、対象に何らかの利益を付与することを示す。代替的に、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特にがんもしくは腫瘍の治療および／または阻止において有用であり得る（例えば、がんもしくは腫瘍形成を阻止することによって、がんもしくは腫瘍の退縮を引き起こすことによって、および／または転移を阻止することによって、および／または転移結節の成長を阻止することによって）。治療の利益がその任意の不利を上回る限り、防御効果は完全であっても部分的であってもよい。

【0159】

特定の実施形態において、異種核酸を含むウイルスベクターまたは細胞は、本明細書に記載される免疫原的（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）有効量で投与され得る。

【0160】

本発明のウイルスベクターは、がん細胞に対する免疫応答を生み出す１種もしくは複数のがん細胞抗原（または免疫学的に同様の分子）または任意の他の免疫原を発現するウイルスベクターの投与によるがん免疫療法のためにも投与され得る。例示するために、免疫応答は、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することによって、対象におけるがん細胞抗原に対して生み出されて、例えばがんを有する患者を治療し得および／または対象においてがんが発生するのを阻止し得る。ウイルスベクターは、本明細書に記載されるように、インビボでまたはエクスビボ法を使用することによって、対象に投与され得る。代替的に、がん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現され得る、またはウイルスカプシドと別様に結び付けられ得る（例えば、上で記載されるように）。

【0161】

別の代替策として、当技術分野において公知の任意の他の治療用核酸（例えば、ＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）を投与して、がんを治療しおよび／または阻止し得る。

【0162】

本明細書において使用するとき、「がん」という用語は腫瘍形成がんを包含する。同じように、「がん性組織」という用語は腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は腫瘍抗原を包含する。

【0163】

「がん」という用語は、例えば、身体の遠位部位に拡散する（すなわち、転移する）潜在性を有する組織の制御されない成長という、当技術分野におけるその理解された意味を有する。例となるがんは、これらに限定されないが、黒色腫、腺がん、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳腫瘍、および任意の他のがん、または現在公知のもしくは後に同定される悪性病状を含む。代表的な実施形態において、本発明は、腫瘍形成がんを治療しおよび／または阻止する方法を提供する。

【0164】

「腫瘍」という用語は、また、当技術分野において、例えば多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊としても理解される。腫瘍は悪性または良性であり得る。代表的な実施形態において、本明細書に開示される方法を使用して、悪性腫瘍を阻止しかつ治療する。

【0165】

「がんを治療すること」、「がんの治療」という用語および等価の用語によって、がんの重症度が低下するもしくは少なくとも部分的に排除される、ならびに／または疾患の進行が減速しおよび／もしくは制御される、ならびに／または疾患が安定することが意図される。特定の実施形態において、これらの用語は、がんの転移が阻止されるもしくは低下するもしくは少なくとも部分的に排除されること、および／または転移結節の成長が阻止されるもしくは低下するもしくは少なくとも部分的に排除されることを示す。

【0166】

「がんの阻止」または「がんを阻止すること」という用語および等価の用語によって、方法が、がんの出現および／または発症の重症度を少なくとも部分的に排除しもしくは低下させならびに／または遅延させることが意図される。代替的に述べると、対象におけるがんの発症は、可能性もしくは確率が低下し得および／または遅延し得る。

【0167】

特定の実施形態において、細胞は、がんを有する患者から取り出され得、本発明に従ったがん細胞抗原を発現するウイルスベクターと接触され得る。次いで、改変された細胞は対象に投与され、それによってがん細胞抗原に対する免疫応答が引き出される。この方法は、インビボで十分な免疫応答を始めることができない（すなわち、十分な分量の増強抗体を産生することができない）免疫欠陥のある対象とともに有利に採用され得る。

【0168】

免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、ω－インターフェロン、τ－インターフェロン、インターロイキン－１α、インターロイキン－１β、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、インターロイキン－９、インターロイキン－１０、インターロイキン－１１、インターロイキン１２、インターロイキン－１３、インターロイキン－１４、インターロイキン－１８、Ｂ細胞成長因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子－α、腫瘍壊死因子－β、単球走化性タンパク質－１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホトキシン）によって増強され得ることが当技術分野において公知である。したがって、免疫調節性サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）は、ウイルスベクターと併せて対象に投与され得る。

【0169】

サイトカインは、当技術分野において公知の任意の方法によって投与され得る。外因性サイトカインが対象に投与され得、または代替的に、サイトカインをコードする核酸が、適切なベクターを使用して対象に送達され得、サイトカインはインビボで産生され得る。

【0170】

対象、薬学的製剤、および投与の様態
本発明に従ったウイルスベクターおよびカプシドは、獣医学的および医学的適用の両方において使用を見出す。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において使用される「鳥類」という用語は、これらに限定されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコ等を含む。本明細書において使用される「哺乳類」という用語は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、山羊、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ等を含む。ヒト対象は、子宮内（例えば、胚、胎児）、新生児、幼児、年少者、成人、および高齢者対象を含む。

【0171】

代表的な実施形態において、対象は、本発明の方法「を必要とし」、ゆえに一部の実施形態において、「それを必要とする対象」であり得る。

【0172】

特定の実施形態において、本発明は、薬学的に許容される担体中の本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシド、ならびに任意選択で、他の薬用作用物質、薬学的作用物質、安定剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤等を含む薬学的組成物を提供する。注射に関して、担体は、典型的に液体であろう。投与の他の方法に関して、担体は、固体または液体のいずれかであり得る。吸入投与に関して、担体は呼吸に適していると考えられ、任意選択で固体または液体微粒子形態であり得る。

【0173】

「薬学的に許容される」によって、それは、有毒でないまたは別様に望ましくない材料が意図され、すなわち材料は、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、対象に投与され得る。

【0174】

本発明の１つの態様は、インビトロで細胞に核酸を移入する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切な標準的形質導入法に従って、適当な感染多重度で細胞に導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞タイプおよび数、ならびに特定のウイルスベクターに応じて変動し得、過度の実験なしに当業者によって判定され得る。代表的な実施形態において、少なくとも約１０^３感染単位、任意選択で少なくとも約１０^５感染単位が細胞に導入される。

【0175】

ウイルスベクターが導入される細胞は、これらに限定されないが、神経細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特にニューロンおよびオリゴデンドロサイト等の脳細胞を含む）、肺細胞、目の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸器上皮細胞）、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心臓筋細胞、平滑筋細胞、および／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞等を含む、任意のタイプのものであり得る。代表的な実施形態において、細胞は、任意の前駆細胞であり得る。さらなる実施形態として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であり得る。なおさらなる実施形態として、細胞は、がんまたは腫瘍細胞であり得る。さらに、細胞は、上で示されるように、任意の起源の種由来のものであり得る。

【0176】

ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞に導入され得る。特定の実施形態において、細胞は対象から取り出されており、ウイルスベクターはその中に導入され、次いで細胞は対象に戻し投与される。対象への戻し導入が後に続く、エクスビボでの操縦のために対象から細胞を取り出す方法は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい）。代替的に、組換えウイルスベクターは、ドナー対象由来の細胞に、培養細胞に、または任意の他の適切な供給源由来の細胞に導入され得、細胞は、それを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。

【0177】

エクスビボ核酸送達のための適切な細胞は、上で記載されるとおりである。対象に投与する細胞の投薬量は、対象の年齢、病状、および種、細胞のタイプ、細胞によって発現されている核酸、投与の様態等によって変動するであろう。典型的に、少なくとも約１０^２～約１０^８個細胞または約１０^３～約１０^６個細胞が、薬学的に許容される担体中にて投薬あたり投与されるであろう。特定の実施形態において、ウイルスベクターを形質導入された細胞は、薬学的担体との組合せで治療有効量または阻止有効量で対象に投与される。

【0178】

一部の実施形態において、ウイルスベクターを細胞に導入し、細胞を対象に投与して、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子としてまたはカプシドにおいて発現される）に対する免疫原性応答を引き出し得る。典型的に、薬学的に許容される担体との組合せでの免疫原的有効量のポリペプチドを発現する細胞の分量が投与される。「免疫原的有効量」とは、薬学的製剤が投与される対象においてポリペプチドに対する能動免疫応答を惹起するのに十分である、発現されるポリペプチドの量である。特定の実施形態において、投薬量は、防御免疫応答（上で定義される）を生み出すのに十分である。免疫原性ポリペプチドを投与することの利益がその任意の不利を上回る限り、付与される防御の程度は、完全であるまたは永続的である必要はない。

【0179】

一部の実施形態において、対象は、例えば別のＡＡＶウイルスベクター（例えば、表１に列挙される任意のＡＡＶ血清型）と接触した場合の対照と比較して、本発明のウイルスベクターと接触した場合に免疫学的プロファイル（例えば免疫学的応答、例えば抗原交差反応性）の低下を有し得る。

【0180】

本発明のさらなる態様は、対象にウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への本発明に従ったウイルスベクターおよび／またはカプシドの投与は、当技術分野において公知の任意の手段によるものであり得る。任意選択で、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、薬学的に許容される担体中にて治療有効用量または阻止有効用量で送達され得る。

【0181】

本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドをさらに投与して、免疫原性応答（例えば、ワクチンとして）を引き出し得る。典型的に、本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体との組合せで、免疫原的有効量のウイルスベクターおよび／またはカプシドを含む。任意選択で、投薬量は、防御免疫応答（上で定義される）を生み出すのに十分である。

【0182】

対象に投与されるべきウイルスベクターおよび／またはカプシドの投薬量は、投与の様態、治療されおよび／または阻止される対象となる疾患もしくは病状、個々の対象の条件、特定のウイルスベクターもしくはカプシド、送達される対象となる核酸に依存し、ルーチン的な様式で決定され得る。治療効果を達成するための例となる用量は、少なくとも約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５形質導入単位、任意選択で約１０^８～１０^１３形質導入単位の力価である。

【0183】

特定の実施形態において、１回を上回る回数の投与（例えば、２、３、４回、またはそれを上回る回数の投与）を採用して、様々な間隔、例えば毎日、週１回、月１回、年１回等の期間にわたって所望のレベルの遺伝子発現を達成し得る。

【0184】

例となる投与の様態は、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介して）、口腔（例えば、舌下）、膣内、くも膜下腔内、眼球内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋、および／または心臓筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、および関節内）、局部（例えば、気道表面を含む皮膚表面および粘膜表面の両方への、ならびに経皮投与）、リンパ内等、ならびに直接的な組織または臓器注射（例えば、肝臓、骨格筋、心臓筋、横隔膜筋、または脳への）を含む。投与は、腫瘍への（例えば、腫瘍またはリンパ節におけるまたはその付近における）ものでもあり得る。任意の所与の場合における最も適切な経路は、治療されかつ／または阻止されている病状の性質および重症度、ならびに使用されている特定のベクターの性質に依存するであろう。

【0185】

本発明に従った骨格筋への投与は、これらに限定されないが、肢（例えば、上腕、前腕、上腿、および／または下腿）、背部、頸部、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、および／または指における骨格筋への投与を含む。適切な骨格筋は、これらに限定されないが、小指外転筋（手における）、小指外転筋（足における）、母趾外転筋、第五中足骨外転筋、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、顎二腹筋、背側骨間筋（手における）、背側骨間筋（足における）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短趾伸筋、長趾伸筋、短母趾伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手における）、短小指屈筋（足における）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大臀筋、中臀筋、小臀筋、薄筋、頸腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋（ｉｌｌｉａｃｕｓ）、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋（ｉｎｔｅｒｓｐｉｎａｌｉｓ）、横突間筋（ｉｎｔｅｒｔｒａｎｓｖｅｒｓｉ）、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋（ｌｏｎｇ ｒｏｔａｔｏｒ）、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手における）、虫様筋（足における）、咬筋、内側翼突筋、内側直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第３腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頸半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋（ｓｈｏｒｔ ｒｏｔａｔｏｒ）、ヒラメ筋、頭棘筋、頸棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頸板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸郭、甲状舌骨筋、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋、および小頬骨筋、ならびに当技術分野において公知の任意の他の適切な骨格筋を含む。

【0186】

ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、肢灌流（任意選択で、脚および／または腕の分離式肢灌流；例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４を参照されたい）、および／または直接筋肉内注射によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態において、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、肢灌流、任意選択で分離式肢灌流（例えば、静脈内または関節内投与による）によって、対象（例えば、ＤＭＤ等の筋ジストロフィーを有する対象）の肢（腕および／または脚）に投与される。本発明の実施形態において、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、「流体力学的」技法を採用することなく有利に投与され得る。ベクターの組織送達（例えば、筋肉への）は、血管系における圧力を増加させかつ内皮細胞バリアを乗り越えるベクターの能力を促す流体力学的技法（例えば、大容量の静脈内／静脈内投与）によってしばしば増強される。特定の実施形態において、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、高容量の注入および／または血管内圧の上昇（例えば正常な収縮期圧を上回る、例えば正常な収縮期圧と比べて血管内圧の５％、１０％、１５％、２０％、２５％未満またはそれに等しい増加）等の流体力学的技法の非存在下で投与され得る。そのような方法は、浮腫、神経損傷、および／またはコンパートメント症候群等、流体力学的技法と関連した副作用を低下させ得るまたは回避し得る。

【0187】

心臓筋への投与は、左心房、右心房、左心室、右心室、および／または中隔への投与を含む。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、大動脈内投与等の動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、および／または冠動脈灌流によって心臓筋に送達され得る。

【0188】

横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む、任意の適切な方法によるものであり得る。

【0189】

標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーを送達することによっても達成され得る。代表的な実施形態において、ウイルスベクターおよび／もしくはカプシドを含むデポーは、骨格筋、心臓筋、および／または横隔膜筋組織に植え込まれる、または組織は、ウイルスベクターおよび／もしくはカプシドを含むフィルムもしくは他のマトリックスと接触され得る。そのような植え込み可能なマトリックスまたは基板は、例えば米国特許第７，２０１，８９８号に記載される。

【0190】

特定の実施形態において、本発明に従ったウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、骨格筋、横隔膜筋、および／または心臓筋に投与される（例えば、筋ジストロフィー、心臓疾患［例えば、ＰＡＤまたは鬱血性心不全］を治療しおよび／または阻止するために）。

【0191】

代表的な実施形態において、本発明は、骨格筋、心臓筋、および／または横隔膜筋の障害を治療しならびに／または阻止するために使用される。

【0192】

代表的な実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを治療しおよび／または阻止する方法であって、方法は、哺乳類対象に本発明のウイルスベクターの治療または阻止有効量を投与するステップを含み、ウイルスベクターは、ジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、ＩカッパＢドミナント変異体等の抗炎症ポリペプチド、サルコスパン、ユートロフィン、マイクロジストロフィン、ラミニン－α２、α－サルコグリカン、β－サルコグリカン、γ－サルコグリカン、δ－サルコグリカン、ＩＧＦ－１、ミオスタチンもしくはミオスタチンプロペプチドに対する抗体もしくは抗体フラグメント、および／またはミオスタチンに対するＲＮＡｉをコードする異種核酸を含む、方法を提供する。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、本明細書における他の箇所に記載されるように、骨格筋、横隔膜筋、および／または心臓筋に投与され得る。

【0193】

代替的に、本発明は、骨格筋、心臓筋、または横隔膜筋に核酸を送達するために実践され得、それは、通常では血中を循環するポリペプチド（例えば、酵素）もしくは機能的ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の産生のための、または障害（例えば、代謝障害、例えば糖尿病［例えば、インスリン］、血友病［例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子］、ムコ多糖症障害［例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シェイエ症候群、ハーラー・シェイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群等］、またはリソソーム蓄積症、例えばゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］もしくはファブリー病［α－ガラクトシダーゼＡ］、またはグリコーゲン蓄積症、例えばポンペ病［リソソーム酸α－グルコシダーゼ］）を治療しかつ／もしくは阻止するための他の組織への全身送達のためのプラットフォームとして使用される。代謝障害を治療しかつ／または阻止するための他の適切なタンパク質は、本明細書に記載される。目的の核酸を発現させるためのプラットフォームとしての筋肉の使用は、米国特許公開第２００２０１９２１８９号に記載される。

【0194】

ゆえに、１つの態様として、本発明は、それを必要とする対象における代謝障害を治療しおよび／または阻止する方法であって、方法は、対象の骨格筋に本発明のウイルスベクターの治療または阻止有効量を投与するステップを含み、ウイルスベクターは、ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、代謝障害は、ポリペプチドにおける欠損および／または欠陥の結果である、方法をさらに包含する。例示的な代謝障害、およびポリペプチドをコードする異種核酸は、本明細書に記載される。任意選択で、ポリペプチドは分泌される（例えば、その天然状態において分泌ポリペプチドである、または当技術分野において公知であるように、例えば分泌シグナル配列との作動的な結び付きによって分泌されるように操作されている、ポリペプチド）。本発明の任意の特定の理論によって限定されることなく、この実施形態によれば、骨格筋への投与は、全身循環へのポリペプチドの分泌および標的組織への送達をもたらし得る。骨格筋にウイルスベクターを送達する方法は、本明細書により詳細に記載される。

【0195】

本発明は、全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、または他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を産生するためにも実践され得る。

【0196】

本発明は、それを必要とする対象における先天性心不全またはＰＡＤを治療しおよび／または阻止する方法であって、方法は、哺乳類対象に本発明のウイルスベクターの治療または阻止有効量を投与するステップを含み、ウイルスベクターは、例えば筋小胞体（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）Ｃａ^２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）およびそのフラグメント（例えば、Ｉ１Ｃ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅ等のホスホランバン阻害性分子またはドミナントネガティブ分子、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルカン（ｃａｌｓａｒｃａｎ）、β－アドレナリン受容体キナーゼ阻害剤（βＡＲＫｃｔ）、プロテインホスファターゼ１の阻害剤１およびそのフラグメント（例えば、Ｉ１Ｃ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、切り取られた構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ等のＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンを生じさせる分子、Ｐｉｍ－１、ＰＧＣ－１α、ＳＯＤ－１、ＳＯＤ－２、ＥＣ－ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、チモシン－β４、ｍｉｒ－１、ｍｉｒ－１３３、ｍｉｒ－２０６、ｍｉｒ－２０８、および／またはｍｉｒ－２６ａをコードする異種核酸を含む、方法も提供する。

【0197】

一部の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における先天性神経変性障害（例えば、単一遺伝子神経変性障害）を治療しおよび／または阻止する方法であって、方法は、対象の神経組織（例えば、神経細胞）に本発明のウイルスベクターの治療または阻止有効量を投与するステップを含み、ウイルスベクターは、ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、先天性神経変性障害は、ポリペプチドにおける欠損および／または欠陥の結果である、方法をさらに包含する。例示的な先天性神経変性障害、およびポリペプチドをコードする異種核酸は、本明細書に記載される。任意選択で、ポリペプチドは分泌される（例えば、その天然状態において分泌ポリペプチドである、または当技術分野において公知であるように、例えば分泌シグナル配列との作動的な結び付きによって分泌されるように操作されている、ポリペプチド）。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、対象は子宮内にいる。一部の実施形態において、対象は、先天性（例えば、単一遺伝子性）神経変性障害を有するまたはその危険性がある。一部の実施形態において、対象は、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ）または白質ジストロフィーを有するまたはその危険性がある。

【0198】

注射物質は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前の液体状の溶液もしくは懸濁液に適切な固体形態として、または乳濁液として、従来の形態で調製され得る。代替的に、全身的よりもむしろ局所的な様式で、例えばデポーまたは持続放出製剤で本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを投与し得る。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、外科的に植え込み可能なマトリックスに接着させて送達され得る（例えば、米国特許公開第２００４００１３６４５号に記載される）。

【0199】

本明細書に開示されるウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、任意の適切な手段によって、任意選択で、対象が吸入する、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドから構成される呼吸に適した粒子のエアロゾル懸濁液を投与することによって、対象の肺に投与され得る。呼吸に適した粒子は、液体または固体であり得る。ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知であるように、圧力駆動型エアロゾル噴霧器または超音波噴霧器等を用いた任意の適切な手段によって産生され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含む固体粒子のエアロゾルは、医薬の技術分野において公知の技法によって、任意の固体微粒子医薬エアロゾル発生器を用いて同じように産生され得る。

【0200】

ウイルスベクターおよびウイルスカプシドは、中枢神経系（ＣＮＳ）（例えば、脳、目）の組織に投与され得、本発明の非存在下で観察されるであろうよりも、ウイルスベクターまたはカプシドのより広い分布を有利にもたらし得る。

【0201】

特定の実施形態において、本発明の送達ベクターは、遺伝子障害、神経変性障害、精神障害、および腫瘍を含む、ＣＮＳの疾患を治療するために投与され得る。ＣＮＳの例示的な疾患は、これらに限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄もしくは頭部傷害に起因した外傷、テイ・サックス病、レッシュ・ナイハン（Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙａｎ）病、てんかん、脳梗塞、気分障害（例えば、うつ病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次性気分障害）、統合失調症、薬物依存症（例えば、アルコール依存症および他の物質依存症）、神経症（例えば、不安、強迫性障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）を含む精神障害、認知症、パラノイア、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食もしくは体重障害（例えば、肥満、悪液質、神経性食欲不振症、および過食症）、ＣＮＳのがんおよび腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）、ならびに先天性神経変性障害、例えばムコ多糖症（これらに限定されないが、ムコ多糖症Ｉ型（ハーラー症候群、ハーラー・シェイエ症候群、またはシェイエ症候群としても知られる、ＩＤＵＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ハンター症候群としても知られる、ＩＤＳ、Ｉ２Ｌ酵素）、ムコ多糖症ＩＩＩ型（サンフィリポ症候群としても知られる、ＧＮＳ［Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ］、ＨＧＳＮＡＴ［ヘパラン－アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ］、ＮＡＧＬＵ［アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、および／またはＳＧＳＨ［スルファミダーゼ］）、ムコ多糖症ＩＶ型（モルキオ症候群としても知られる、ＧＡＬＮＳ［ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ］および／またはＧＬＢ１［ベータ－ガラクトシダーゼ］）、ムコ多糖症Ｖ型（シェイエ症候群、現在Ｉ型の下位群としても知られる、またＩＤＵＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ）、ムコ多糖症ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群としても知られる、ＡＲＳＢ、アリールスルファターゼＢ）、ムコ多糖症ＶＩＩ型（スライ症候群としても知られる、ＧＵＳＢ、ベータ－グルクロニダーゼ）、ムコ多糖症ＩＸ型（ナトウィック症候群としても知られる、ＨＹＡＬ１、ヒアルロニダーゼ）を含む）、ならびに／または白質ジストロフィー（これらに限定されないが、成人発症常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ；ＬＭＮＢ１、ラミンＢ１）、エカルディ・グティエール症候群（ＴＲＥＸ１、ＲＮＡＳＥＨＳＢ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、および／またはＲＮＡＳＥＨ２Ａ）、アレキサンダー病（ＦＲＡＰ、グリア線維性酸性タンパク質）、ＣＡＤＡＳＩＬ（Ｎｏｔｃｈ３）、カナバン病（ＡＳＰＡ、アスパルトアシラーゼ）、ＣＡＲＡＳＩＬ（ＨＴＲＡ１、セリンプロテアーゼＨＴＲＡ１）、脳腱黄色腫症（「ＣＴＸ」、ＣＹＰ２７Ａ１、ステロール２７－ヒドロキシラーゼ）、小児期運動失調症および大脳白質形成不全症（ＣＡＣＨ）／白質消失症（ＶＷＭＤ）（ｅＩＦ２Ｂ、真核性開始因子２Ｂ）、ファブリー病（ＧＬＡ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ）、フコシドーシス（ＦＵＣＡ１、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＬＢ１、ベータ－ガラクトシダーゼ）、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症（Ｌ２ＨＤＧＨ、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ）、クラッベ病（ＧＡＬＣ、ガラクトセレブロシダーゼ）、皮質下嚢胞を有する大脳型白質脳症（「ＭＬＣ」、ＭＬＣ１および／またはＨＥＰＡＣＡＭ）、異染性白質ジストロフィー（ＡＳＡ、アリールスルファターゼＡ）、マルチプルスルファターゼ欠損症（「ＭＳＤ」、ＳＵＭＦ１、すべてのスルファターゼ酵素に影響を及ぼすスルファターゼ修飾因子１）、ペリツェウス・メルツバッハー病（「Ｘ連鎖痙性対麻痺」としても知られる、ＰＬＰ１［Ｘ連鎖プロテオリピドタンパク質１］および／またはＧＪＡ１２［ギャップ結合タンパク質１２］）、Ｐｏｌ ＩＩＩ関連白質ジストロフィー（ＰＯＬＲ３Ａおよび／またはＰＯＬＲ３Ｂ）、レフサム病（ＰＨＹＨ、［フィタノイル－ＣｏＡヒドロキシラーゼ］および／またはＰｅｘ７［ペルオキシソームへのＰＨＹＨインポーター］）、サラ病（「遊離シアル酸蓄積症」としても知られる、ＳＬＣ１７Ａ５、シアル酸トランスポーター）、シェーグレン・ラルソン症候群（ＡＬＤＨ３Ａ２、アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー（「ＡＬＤ」、ＡＢＣＤ１、ペルオキシソームＡＴＰａｓｅ結合カセットタンパク質）、ツェルウェーガー症候群スペクトラム障害（ペルオキシソーム生合成障害としても知られる、ＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ４、ＰＥＸ５、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１１Ｂ、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１６、ＰＥＸ１９、ＰＥＸ２６）を含む）等を含む。

【0202】

ＣＮＳの障害は、網膜、背側路（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｒａｃｔ）、および視神経に関わる眼科障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性症、緑内障）を含む。

【0203】

すべてではないが、ほとんどの眼科疾患および障害は、３つのタイプの兆候：（１）血管新生、（２）炎症、および（３）変性、のうちの１つまたは複数と関連する。本発明の送達ベクターを採用して、抗血管新生因子；抗炎症因子；細胞変性を遅らせる、細胞温存（ｓｐａｒｉｎｇ）を促進する、または細胞成長を促進する因子、および前述のものの組合せを送達し得る。

【0204】

糖尿病性網膜症は、例えば血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼球内に（例えば、硝子体液に）または眼周囲に（例えば、テノン嚢下領域に）、１種または複数の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。１種または複数の神経栄養因子も、眼球内に（例えば、硝子体内に）または眼周囲に共送達され得る。

【0205】

ブドウ膜炎は炎症を伴う。１種または複数の抗炎症因子が、本発明の送達ベクターの
眼球内（例えば、硝子体液または前房）投与によって投与され得る。

【0206】

網膜色素変性症は、比較すると、網膜変性によって特徴付けられる。代表的な実施形態において、網膜色素変性症は、１種または複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼球内（例えば、硝子体投与）によって治療され得る。

【0207】

加齢黄斑変性症は、血管新生および網膜変性の両方を伴う。この障害は、１種もしくは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼球内に（例えば、硝子体）、および／または１種あるいは複数の抗血管新生因子を眼球内にもしくは眼周囲に（例えば、テノン嚢下領域に）投与することによって治療され得る。

【0208】

緑内障は、眼圧の増加および網膜神経節細胞の喪失によって特徴付けられる。緑内障の治療は、本発明の送達ベクターを使用した、興奮毒性損傷から細胞を防御する１種または複数の神経保護剤の投与を含む。そのような作用物質は、眼球内に、任意選択で硝子体内に送達されるＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン、および神経栄養因子を含む。

【0209】

他の実施形態において、本発明は、発作を治療するために、例えば発作の発症、出現、および／または重症度を低下させるために使用され得る。発作に対する治療的処置の有効性は、行動的（例えば、震え、目または口のカチカチという音（ｔｉｃｋ））および／または電子写真的手段（ほとんどの発作は、シグネチャー的な電子写真的異常を有する）によって査定され得る。ゆえに、本発明は、経時的な複数回の発作を特徴とするてんかんを治療するためにも使用され得る。

【0210】

１つの代表的な実施形態において、本発明の送達ベクターを使用してソマトスタチン（またはその活性フラグメント）を脳に投与して、下垂体腫瘍を治療する。この実施形態によれば、ソマトスタチン（またはその活性フラグメント）をコードする送達ベクターは、下垂体への微量注入によって投与される。同じように、そのような治療を使用して、先端肥大症（下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療し得る。ソマトスタチンの核酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０１１６６；プロセシングされた活性ペプチドのソマトスタチ－２８およびソマトスタチン－１４を含有する）は、当技術分野において公知である。

【0211】

特定の実施形態において、ベクターは、例えば米国特許第７，０７１，１７２号に記載される分泌シグナルを含み得る。

【0212】

本発明の代表的な実施形態において、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、ＣＮＳ（例えば、脳にまたは目に）投与される。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、脊髄、脳幹（延髄、橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果腺）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、および前頭葉を含む大脳、大脳皮質、大脳基底核、海馬、ならびに扁桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ））、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および／または下丘に導入され得る。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、網膜、角膜、および／または視神経等、目の種々の領域にも投与され得る。

【0213】

ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、送達ベクターのより分散した投与のために脳脊髄液に送達され得る（例えば、腰椎穿刺によって）。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、血液脳関門が乱されている状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳにさらに血管内投与され得る。

【0214】

ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、これらに限定されないが、くも膜下腔内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトール等の糖類の存在下で）、鼻腔内、耳内、眼球内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、および眼周囲（例えば、テノン嚢下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達を用いた筋肉内送達を含む、当技術分野において公知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域に投与され得る。

【0215】

一部の実施形態において、本発明のウイルスベクターまたは組成物は、腸内、非経口、くも膜下腔内、嚢内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼球内、眼周囲、直腸内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、舌下、皮下、および／または経皮経路を介して送達され得る。一部の実施形態において、本発明のウイルスベクターまたは組成物は、頭蓋内におよび／または髄腔内に送達され得る。

【0216】

特定の実施形態において、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、ＣＮＳにおける所望の領域またはコンパートメントへの直接注射（例えば、定位注射）によって液体製剤で投与される。他の実施形態において、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、所望の領域への局部適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。目への投与は、液滴の局部適用によるものであり得る。さらなる代替策として、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、絶え間のない徐放性製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。

【0217】

さらに付加的な実施形態において、ウイルスベクターは、運動ニューロンに関わる疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）等）を治療しおよび／または阻止するために逆行性輸送に使用され得る。例えば、ウイルスベクターは筋肉組織に送達され得、そこからそれはニューロンに移動し得る。

【0218】

本発明を記載してきたが、それは、単に例示目的のために本明細書に含まれ、本発明を限定することを意図されない以下の実施例においてさらに詳細に説明されるであろう。

【実施例】

【0219】

［実施例１］
標準的アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２の野生型ウイルスゲノムは、およそ４，７００ヌクレオチドの一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡゲノムであり、重複するリーディングフレームを有した複数の遺伝子を含有する。ゲノムの末端は、それ自身の上に折り畳まれてヘアピン構造を形成すると予測される１４５ヌクレオチドの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列によって隣接される（図１Ａ～１Ｂ）。Ｃａｐ遺伝子はカプシドＶＰタンパク質を産生し、カプシドの会合を助けるＡＡＰに対するリーディングフレームも含有する。ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子は、それらのおよその重量で名付けられたＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５０、およびＲｅｐ４２という４種のタンパク質を産生する。小さなＲｅｐ５０および４２は、あらかじめ形成されたカプシドに新生ゲノムをパッケージする運動タンパク質として作用し得る。大きなＲｅｐ７８および６８は、ゲノム複製に使用されるエンドヌクレアーゼおよびＡＴＰ依存的ヘリカーゼ機能を有する。これらの大きなＲｅｐは、ＩＴＲのＡ領域においてＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）に結合することによって、ゲノム複製を開始し得る。この初期結合は、ＤＮＡ鎖をほどき、ジヌクレオチドＴＴ末端分解部位（ｔｒｓ）においてＲｅｐによって切断されるニッキングステムを形成するのを助け得る。加えて、大きなＲｅｐタンパク質は、Ｃループの先端でもＲＢＥ’領域と接触する（図１Ａ～１Ｂ）。ＩＴＲは、複製起点、パッケージングシグナル、および感染後のＡＡＶゲノムに持続性を付与する能力を含有することによって、ＡＡＶのライフサイクルにおいて基本的役割を果たす。

【0220】

ＡＡＶ血清型１～４および６～７に関して、ＩＴＲの予測構造は類似しているが、全体にわたって、とりわけＲＢＥにおけるＧＡＧＣリピートの数、ＲＢＥ’でのＴＴＴまたはＴＣＴ、ヘアピンループにおけるヌクレオチド、およびニッキングステムの形成に参加しない、Ｄ領域におけるヌクレオチドに配列の差がある（図１Ａ～１Ｃ）。これらの差を有してさえ、ＡＡＶ２ Ｒｅｐは複製し得、かつ血清型１、３、４、および６由来のゲノムを数々の非ＡＡＶ２カプシド内に交差パッケージし得る。

【0221】

現在、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター産生プラットフォームは、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ－ＡＡＶ２ ＩＴＲ複製およびパッケージングシステムに依存する。ｒＡＡＶにおいて、ＡＡＶの内部遺伝子は除去され、治療用カセットに隣接するＩＴＲのみを残す。ゆえに、臨床設定において、遺伝子療法を受けている患者は、カプシドタンパク質だけでなく、天然ウイルスＡＡＶ２ ＩＴＲ配列にも曝露される。細胞におけるこれらの配列の影響は歴史的に十分に研究されていない（ｕｎｄｅｒｓｔｕｄｉｅｄ）が、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかの宿主タンパク質と相互作用し得、抗ウイルスおよびＤＮＡ損傷応答経路を刺激し得ることが公知である（Ｊｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．８：２１０；Ｑｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：８９６８－７６；Ｓａｔｋｕｎａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５１０：４６－５４；Ｒａｊ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｎａｔｕｒｅ ４１２：９１４－７；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１１ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６）。

【0222】

本研究では、様々な細胞株に、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、６、および７由来のＩＴＲ配列を含有するＡＡＶベクターを感染させ、ルシフェラーゼ発現を促進するそれらの能力をインビトロで測定した。付加的に、ＩＴＲ １～４、６、または７に対する転写スタート部位（ＴＳＳ）を、ルシフェラーゼ特異的ｃＤＮＡの増幅を使用して判定した。最後に、ｆｌｏｘｅｄ－ルシフェラーゼマウスに、ＩＴＲ－ｃｒｅリコンビナーゼベクターを注射して、マウスモデルにおけるＩＴＲプロモーター能を査定して、非ＩＴＲ２配列もインビボで導入遺伝子発現を引き出し得るかどうかを判定した。

【0223】

プラスミド構築：ＡＡＶ血清型１～４＆６～７配列由来のＩＴＲ配列を、下流のクローニングのために配列に隣接する独自の制限酵素部位を有して、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから注文した。これらのＩＴＲは、合成および伝播の間の潜在的分子間組換えを阻止するように、プラスミドあたり１つのＩＴＲを有して注文された。これらのプラスミドを、ＳＵＲＥ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ－Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ、２００２２７）にエレクトロポレーションした。コロニープラスミドを、ＩＴＲ遺伝子型に特異的な制限酵素を使用して、無傷ＩＴＲ配列についてスクリーニングし、次いで、ラムダファージＤＮＡから無作為に選定された２０ヌクレオチドのスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列、それに続くルシフェラーゼまたはｃｒｅリコンビナーゼに対するリーディングフレーム、ＳＶ４０初期ポリＡシグナル、およびラムダファージＤＮＡスタッファー配列の２１７２ヌクレオチドを有するｐＵＣ１９骨格にクローニングして、ＡＡＶベクターゲノムの完全長をそれぞれ４３９５または３７７８塩基にした。プラスミド構築の後、ＩＴＲ配列を、ｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｌｖｅｒ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２８９０３５２９）、それに続くサンガーシーケンシングを使用して検証した。配列確認の後、あらゆる後続のプラスミドプレップを、複数のＩＴＲ特異的制限酵素で消化して、ＩＴＲ配列の存在および安定性を確保した。

【0224】

細胞株およびウイルス産物：ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、およびＨｕｈ７細胞を、１０％仔ウシ血清および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地中で５％ＣＯ２にて３７℃で維持した。組換えＡＡＶベクターを、３重トランスフェクション法を使用して産生した。簡潔には、１５ｃｍプレートの約８０％コンフルエンシーのＨＥＫ２９３細胞に、ＩＴＲ含有ルシフェラーゼまたはｃｒｅリコンビナーゼベクタープラスミド、ＡＡＶ２ ＲｅｐおよびＡＡＶ１、２、または９ Ｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶヘルパープラスミド、ならびにＡｄヘルパープラスミドｐＸＸ６－８０をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、細胞を回収し、溶解し、ＣｓＣｌ勾配超遠心分離に供した。最も高い濃度のウイルスに相当する画分を採取し、ＰＢＳ中に透析した（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｅｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ＭＷＣＯ ３０，０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃６６００３）。ウイルス力価を、導入遺伝子またはスタッファー配列特異的プライマー、および同じ導入遺伝子またはスタッファー配列を含有するウイルス標準物質を使用して、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって三つ組で判定した。あらゆる三つ組実験に対して、新しいバッチのウイルスを作製し、ウイルスを、それらが一緒に産生されかつ力価測定された場合に同じ実験においてのみ使用し、５個のバッチのウイルスを３回作製して、合計１５個のバッチのウイルスに対してＡＡＶ１～４＆６ ＩＴＲを三つ組で試験した。

【0225】

インビトロ感染およびルシフェラーゼアッセイ：ＡＡＶ２／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼおよびＡＡＶ２／２－ＣＢＡ－ルシフェラーゼの比較のために、３．２Ｅ５個のＨＥＫ２９３細胞を１２ウェルプレート中にウェルごとに播種し、翌日１Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた。感染の２日後に、細胞を、２００ｕｌのＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＬＢ）中にて室温で２０分間溶解した。ＡＡＶ２／２－ＣＢＡ－ルシフェラーゼ由来の細胞溶解液を、ＰＬＢ中１：５０に希釈した。２５ｕｌの細胞溶解液を、９６ウェル不透明白色アッセイプレートにおいて１００ｕｌのルシフェリンと組み合わせ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５００）、発光をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ^３プレートリーダーを用いて測定した。ＡＡＶ２／２－ＣＢＡ－ルシフェラーゼからの相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）値に、それらの希釈倍数を掛けた。ＩＴＲおよびカプシド血清型を表すためにここで使用された命名法は、ＡＡＶＮ／ＮがＡＡＶ（ＩＴＲ遺伝子型）／カプシド血清型であるというものである。ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターの比較のために、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、およびＨｕｈ７細胞を、６ウェルプレートに個々に播種した。翌日、細胞に、２Ｅ５ｖｇ／細胞のＡＡＶ（Ｎ）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼ、式中Ｎは表示されるＩＴＲ遺伝子型である、を感染させた。２日後、培地を除去し、細胞を、３５０ｕｌのＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ中にて室温で２０分間溶解した。溶解液を１．５ｍｌチューブに移し、１３，０００ｇにて４℃で１０分間スピンした。２５ｕｌの溶解液をＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、２３２２５）アッセイにおいて使用して、総細胞タンパク質濃度を判定した。１００ｕｌの細胞溶解液を、９６ウェル不透明白色アッセイプレートにおいて１００ｕｌのルシフェリンと組み合わせ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５００）、発光をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ^３プレートリーダーを用いて測定した。相対発光量を、添加された総タンパク質に対して正規化した。

【0226】

転写スタート部位の同定：ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＡＶ（１～４、６、または７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させ、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを使用したＲＮＡ収穫の前に３日間培養した。５’／３’ＲＡＣＥ ２ｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、３３５３６２１００１）からのメーカーの使用説明書に従って、およそ７５０ｎｇのＲＮＡを、ルシフェラーゼコード配列内に配置されたプライマー（５’－ＧＴＧＡＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＧＡＣ－３’；配列番号８）を使用して逆転写した。合成されたｃＤＮＡを、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、２８１０４）を使用して精製し、ポリＡテールをメーカーの使用説明書によりターミナルトランスフェラーゼによって付加した。次いで、供給された順方向プライマー、５’－ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ－３’配列番号９）、およびルシフェラーゼコード配列におけるネステッド逆方向プライマー、５’－ＣＴＴＡＧＡＡＣＣＧＧＴＣＧＡＡＣＡＣＣＡＣＧＧＴＡＧＧＣＴ－３’（配列番号１０）を使用して、ＰＣＲを行った。結果として生じたＰＣＲ産物を精製し、キットに供給された順方向プライマー５’－ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣ－３’（配列番号１１）およびルシフェラーゼ配列内の別のネステッド逆方向プライマー５’－ＴＴＡＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１２）を用いた付加的なＰＣＲ反応に対する鋳型として使用した。産物を精製し、２０ｎｇ／ｕｌ ＥＢバッファーに対して正規化し、２５ｕｌを、Ｇｅｎｅｗｉｚによる次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用したＥＺアンプリコンシーケンシングのために送った。結果として生じたＮＧＳデータは、参照ゲノムに対してリードをアラインするＳＴＡＲ ｖ２．７．０ａを使用して、ＵＮＣ Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｏｒｅ（Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）によって分析された。ｂａｍファイルをＲで処理して、アライメントスタート部位の頻度を表にした。アライメントがミスマッチの前または後にスタートするべきかどうかを本発明者らが推論し得ないように、アライメントの最初の１０塩基内に複数のミスマッチ（＞３）を有する配列にフィルターをかけた。予想（１０００ｂｐ）よりも大きいインサートサイズを有するリードペアも除去した。

【0227】

動物研究：本研究において実施された動物実験は、ＦＶＢ．１２９Ｓ６（Ｂ６）－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ^{ｔｍ１（Ｌｕｃ）Ｋａｅｌ}／Ｊ ｍｉｃｅ^２２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓストック番号：００５１２５）を用いて行われた。ＵＮＣ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ、プロトコール番号１９．０２３－１）によって承認されるように、米国国立衛生研究所ガイドラインに従ってマウスを維持した。雄のマウスを、乱闘に起因して個々に飼育した。各マウスに、１００ｕｌの１Ｅ９ウイルスゲノムを尾静脈を介して注射した。Ｄ－ルシフェリン基質（ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－ルシフェリン、１２２７９９、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の１００ｕｌの腹腔内注射後に、ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、ルシフェラーゼ発現を撮像した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、生物発光画像を分析した。光子値を使用して、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアバージョン２．２０を使用して、取得を実施した。

【0228】

統計：すべての統計的算出を、統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．２）を使用して実施した。データは、群平均とともに個々の点として提示される。単一比較に対するデータを、対応のない両側ｔ検定を使用して評価した。ｐ値が０．０５未満である場合、異なる群間の差を統計的に有意であると見なした。

【0229】

ＩＴＲ血清型配列は、インビトロでルシフェラーゼ発現を促進する可変的能力を有する。様々なＡＡＶ遺伝子型由来のＩＴＲのプロモーター活性を判定するために、ＡＡＶ ＩＴＲ配列をプロモーターとして使用して、ルシフェラーゼレポーターベクタープラスミドを構築した。ベクタープラスミドにおいて、ＩＴＲ配列を複数の制限酵素を用いて査定して、ＩＴＲの存在およびそれらの遺伝子型素性を確認した。最初に、ＩＴＲ２の活性を、「強力な」ＣＢＡプロモーターと比較した。ＡＡＶ２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼおよびＡＡＶ２－ＣＢＡ－ルシフェラーゼをＡＡＶ２カプシド内にパッケージし、それを使用してＨＥＫ２９３細胞に１Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた。感染の２日後に、ルシフェラーゼ活性を測定し、ＩＴＲ２促進ルシフェラーゼと比較して、ＣＢＡ促進ルシフェラーゼから４対数を上回って高いことが見出された（図２Ａ）。このことは、ＩＴＲ２プロモーター活性が、ルシフェラーゼレポーターシステムを使用して上手く測定され得ることを実証した。

【0230】

ＡＡＶ２ ＲｅｐパッケージングシステムにおけるＩＴＲ７の使用は、文献においてまだ報告されていない。ＡＡＶ２ ＲｅｐおよびＡＡＶ２カプシドとの組合せでＩＴＲ７を使用することの実現可能性を試験するために、ＩＴＲ７含有ベクターを、アデノウイルスヘルパーおよびｐＸＲ２とともにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。結果として生じたウイルスをｑＰＣＲによって力価測定した。ＩＴＲ７ベクターは、同じ時に作製されたＩＴＲ１およびＩＴＲ２ベクターと同様の力価を有した（表２）。ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、およびＨｕｈ７細胞に、ＡＡＶ１／２、ＡＡＶ２／２、およびＡＡＶ７／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた。感染の２日後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。相対発光量（ＲＬＵ）を、ＢＣＡアッセイによって判定される、ルシフェラーゼアッセイに添加された細胞タンパク質の総量に対して正規化し、次いでＩＴＲ２ ＲＬＵ値に対してさらに正規化した（図２Ｂ～２Ｄ）。ＩＴＲ１促進ルシフェラーゼからのＲＬＵは、３種すべての細胞株にわたるＩＴＲ２のものよりも一貫して低かった（ｐ＜０．０００１）。ＨＥＫ２９３細胞において、ＩＴＲ１は、ＩＴＲ２と比較して平均２９％の活性を有した（図２Ｂ）。この活性は、ＨｅＬａ細胞において３５％で（図２Ｃ）およびＨｕｈ７細胞において３２％で（図２Ｄ）わずかに高かった。対照的に、ＩＴＲ７は、細胞株にわたって異なるプロモーター活性を呈示した。Ｈｕｈ７細胞において、ＩＴＲ７およびＩＴＲ１は、ＩＴＲ２と比較して、それぞれ３３％および３１％という同じ発現レベルを有したが（図２Ｄ）、ＩＴＲ７は、ＨｅＬａ細胞において６２％で、ＩＴＲ１よりも高い発現を有した（ｐ＜０．０００１）（図２Ｃ）。ＨＥＫ２９３細胞において、ＩＴＲ７促進ルシフェラーゼ活性は、ウイルスの１つの調製物が、ウイルスの他の２つの調製物と比較して低下した活性を有して、平均８３％まで上がったが（図２Ｂ）、これは、すべての活性にわたって、ＩＴＲ２のものよりも依然として低かった（ｐ＝０．００２９）。

【0231】

ＩＴＲ３、４、および６もこれらの細胞株においてプロモーター活性を呈示するかどうかを判定するために、ＩＴＲ－ルシフェラーゼプラスミドを使用して、ＡＡＶＮ／ＮがＡＡＶ（ＩＴＲ遺伝子型）／カプシド血清型であるＡＡＶ（１～４、６）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターを創出した。すべてのＩＴＲは、ＡＡＶ２ Ｒｅｐによって複製され得かつパッケージされ得、バッチ力価は互いの４倍以内であった。注目すべきは、これらの複製、パッケージング、および精製条件下で、ＩＴＲ２含有ベクタープラスミドからの力価が大抵最も高く、一方でＩＴＲ６またはＩＴＲ７は常に最も低かった（表２）。

【0232】

ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、およびＨｕｈ７細胞に、ＡＡＶ（１～４、６、または７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターを２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた。ルシフェラーゼ活性を、上で記載されるように測定した。ＩＴＲ３、４、および６も、試験された細胞株においてルシフェラーゼ活性をもたらしたが、様々な程度でであった（図２Ｅ～２Ｇ）。３種すべての細胞株において、ＩＴＲ２およびＩＴＲ３は、最も高いルシフェラーゼ活性をもたらした。Ｈｕｈ７細胞においてのみ、ＩＴＲ２およびＩＴＲ３の間に有意な差があり（ｐ＝０．００８２）、ＩＴＲ３は、ＩＴＲ２よりも平均すると３０％大きい活性となった（図２Ｇ）。２９％と比較して１９％の平均を有してＩＴＲ１がＩＴＲ６よりも１０％低い（ｐ＜０．０００１）ＨＥＫ２９３細胞においてを除いて、すべての細胞タイプにわたって、ＩＴＲ１およびＩＴＲ６は、最も低い活性を有し、互いと統計的に異ならなかった（図２Ｅ）。ＩＴＲ４は、ＩＴＲ２と比較して６２～６６％のルシフェラーゼ活性を一貫して有し（図２Ｅ～２Ｇ）、３種すべての細胞株において同じくＩＴＲ３よりも有意に低かった（ｐ＜０．０１）。ゆえに、ＩＴＲからの観察された活性は、３つのクラス：最も高い相対的活性を有するクラスＩのＩＴＲ：ＩＴＲ２およびＩＴＲ３、中間レベルの活性を有するクラスＩＩ：ＩＴＲ４、ならびに最も低い活性を有したクラスＩＩＩ：ＩＴＲ１およびＩＴＲ６、に分類された。試験されたすべてのＩＴＲのうち、ＩＴＲ７のみが細胞特異的活性を示した（図２Ｂ～２Ｄ）。

【0233】

ＩＴＲ配列１～４、６からの種々のレベルのルシフェラーゼ活性は、ＩＴＲ配列それ自体がルシフェラーゼ活性の重大な決定因子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ）であることを暗示したが、代替的に、ＩＴＲ２含有ベクターからの高いルシフェラーゼ活性は、このＩＴＲがその同種カプシドと対合することから、カプシド特異的相互作用に起因するものであり得た。それらの相当するカプシド内にパッケージされたＩＴＲ配列がルシフェラーゼ産生に影響するかどうかを試験するために、ＩＴＲ１およびＩＴＲ２ルシフェラーゼベクターをＡＡＶ１カプシド内にパッケージし、それを使用してＨＥＫ２９３細胞に２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた。全体的活性は、ＡＡＶ１／２およびＡＡＶ２／２と比較して低下したものの、ＡＡＶ１／１－ＩＴＲ－ルシフェラーゼベクターからのルシフェラーゼ活性は、ＡＡＶ２／１ベクターよりも依然として低かった。ＡＡＶ２に対して正規化した場合、使用されたカプシドにかかわらず、活性は等価であった（図３）。それゆえ、ＩＴＲ１は、その同種カプシドと対合した場合でさえ、依然としてクラスＩＩＩのＩＴＲである。

【0234】

ＩＴＲ配列は、複数の転写スタート部位（ＴＳＳ）を含有する。試験されたすべての遺伝子型のＩＴＲ配列は、ＣＧ含有量が高く（６４～７０％）、伝統的なＴＡＴＡボックスコンセンサス配列を欠如する。ルシフェラーゼ転写産物が、単一の集中したＴＳＳまたは複数の分散したＴＳＳを起源とするかどうかを判定するために、ｃＤＮＡ末端の５’急速増幅（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）（ＲＡＣＥ）を採用して、起源となるヌクレオチド位置を見出した。ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＡＶ（１～４、６、または７）／２－ＩＴＲ－ルシフェラーゼを２Ｅ５ｖｇ／細胞で感染させた。感染の３日後に、総ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡ末端の５’急速増幅（ＲＡＣＥ）キットを使用して逆転写した。ルシフェラーゼ特異的ｃＤＮＡを増幅し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって分析した。すべてのＩＴＲに関して、複数のＴＳＳが各配列内に見出され、ＲＢＥにおいてクラスター化する傾向があったが、とはいえＩＴＲ１は、他のＩＴＲよりも幅広いスタート部位を有した（図４Ａ）。各ＩＴＲに関して、３～４個のヌクレオチドがその大多数のリードであったが、これらのホットスポットは各ＩＴＲに関して異なった。これらの結果は、ＩＴＲ促進ルシフェラーゼに対する転写産物が、ＩＴＲ内の複数のスタート部位を起源とし得ることを示す。

【0235】

ＩＴＲ配列１～６によって推進されるｃｒｅリコンビナーゼは、インビボでルシフェラーゼ産生を活性化し得る。インビトロの知見がどのようにインビボモデルに転換されるかを見るために、ＩＴＲプロモーター活性をｆｌｏｘｅｄルシフェラーゼレポーターマウス系統において試験した。ＦＶＢ．１２９Ｓ６（Ｂ６）－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ^{ｔｍ１（Ｌｕｃ）Ｋａｅｌ}／Ｊマウス株は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入されたルシフェラーゼオープンリーディングフレームを含有する。ルシフェラーゼ発現はｌｏｘＰ－ストップ－ＬｏｘＰ配列によって阻止され、それはｃｒｅリコンビナーゼによって除去され得る。４～６週齢の雄のマウスに、１００ｕｌの１Ｅ９ｖｇのＡＡＶ（１～４、６）／９－ＩＴＲ－ｃｒｅリコンビナーゼを尾静脈を介して注射した（Ｎ＝２）。ＡＡＶ９を、ほとんどの組織に高度に形質導入するその能力、ゆえに、もしあればＩＴＲプロモーター間の組織特異的な差を同定するのにおそらく最善であるように選定した。陽性対照として、２匹のマウスにＡＡＶ２／９－ＣＭＶ－Ｃｒｅベクターを注射した。注射の３、５、７、および９週間後に、マウスを撮像した。注射の３週間後までに、ルシフェラーゼ活性はすべてのマウスの腹部エリアにおいて観察され得た（図５Ａ）。予想どおり、ＣＭＶ促進ｃｒｅリコンビナーゼを注射されていた陽性対照マウスは、ルシフェラーゼを発現するより多くの組換え細胞を有し、同じ撮像設定下で、これらのマウスはカメラを完全に飽和状態にした。注射の４週間後までに、ＡＡＶ２／９－ＩＴＲ－ｃｒｅリコンビナーゼを注射されたマウスの１匹からのルシフェラーゼシグナルは、もはや検出され得なかった。９週間の時間経過の間、残りのマウスにおいて、ルシフェラーゼシグナルは不変のままであった（図５Ｂ）。ＡＡＶ２／９－ＩＴＲ－ｃｒｅリコンビナーゼを注射されたマウスからの発現の喪失は、おそらくカプシド抗原反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞に起因するものであったが、このことは具体的に調べられなかった。

【0236】

ＩＴＲ血清型配列は、インビトロでプロモーター活性に影響する。ＩＴＲ１～４および６に対するＩＴＲプロモーター活性は、それらを、Ｉが最も高い活性である３つのクラス：Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩに分け得るのに十分に一貫していた。各細胞株にわたって、ＩＴＲ２およびＩＴＲ３（クラスＩ）は、ルシフェラーゼ活性に対して最も高い値を一貫して有し、これらの配列が、試験された他のＩＴＲよりも高いプロモーター活性も有することを暗示し、一方でＩＴＲ１およびＩＴＲ６（クラスＩＩＩ）は最低を有した（図２Ａ～２Ｇ）。Ｄ領域における最後のヌクレオチドのみおよびＤ領域の外側にある４個のヌクレオチドのみが互いと異なる２つの配列間の高い程度の類似性を考慮すると、ＩＴＲ１およびＩＴＲ６に対する同様の発現値は予想どおりであったであろう（図１Ｃ）。クラスＩおよびクラスＩＩＩ配列間の配列分析は、異なる活性を説明し得るいくつかの点の相違を明らかにした（図１Ｃ）。具体的には、ＩＴＲ２およびＩＴＲ３は、ＲＢＥ’においてＴＴＴ配列を含有し、一方でＩＴＲ１およびＩＴＲ６はＴＣＴを含有する。Ｂループ（位置４５：５９および４６：６０）およびＣループ（６８：８０および７０：７８）における一貫した差、ならびに位置３および１２２におけるニッキングステムループの先端におけるＣからＧへの変化もあった。ＩＴＲ７もＩＴＲ１配列と類似しているが、異なるプロモーター活性プロファイルを有した（図２Ｂ～２Ｄ）。ＩＴＲ１およびＩＴＲ７間で異なるほんのわずかなヌクレオチドがあることから、変異分析は、様々な細胞タイプにおけるＩＴＲ７促進ルシフェラーゼの差示的発現に関わる特異的配列を見出し得る。位置１１０：１５でのＩＴＲ７におけるＴ：Ａペアは、ＩＴＲ３、４、および６で見られる同じペアであり（図１Ｃ）、そのため、それは、本発明者らが、試験された細胞タイプにわたって観察した様々なレベルのルシフェラーゼ活性に関わりそうにない。ＩＴＲ２、３、および４のように、ＩＴＲ７も位置３におけるニッキング部位の近くにＧ、および位置１２２においてＣを有し、そのため、これらのヌクレオチドはプロモーター強度に影響し得る。ＩＴＲの中でルシフェラーゼ発現に影響している可能性がある目的の別の可変領域は、ＣＴＡＧモチーフのみが保存されているＤ領域の最後の１１個のヌクレオチドであるが、ＩＴＲの異なるクラス間に容易に判別可能なパターンはない。それでもなお、いくつかの宿主タンパク質はＩＴＲ２のＤ領域と相互作用することが示されていることから、この領域は目的であり得た。どの配列が導入遺伝子産生に対して影響を有するかについての疑問は、位置特異的ＩＴＲ変異体を用いて対処され得るが、複雑なＤＮＡ二次構造が、転写において多様な役割を果たし得ることを考慮すると、この疑問は十分に解明されるのが困難であり得る。

【0237】

ここで使用された条件下で、ＩＴＲ１は、ＡＡＶ１カプシド内にパッケージされた場合でさえ、依然としてクラスＩＩＩであった。このことは、プロモーター活性に対して強力な影響を有するものとしてのＩＴＲ－カプシド相互作用と相反する。本研究では、ＡＡＶ２ Ｒｅｐが使用され、そのため、これらのＩＴＲ配列に対する同種Ｒｅｐを有することが、ｒＡＡＶの複製、パッケージング、および形質導入単位の様々な態様に影響し得た可能性が依然としてある。

【0238】

ＩＴＲ促進ルシフェラーゼ転写産物に対するスタート部位。以前の仕事は、ＩＴＲ２促進ＧＦＰ導入遺伝子発現に重要なものとしてＩＴＲ２のＡ領域を同定した（Ｈａｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８７３２－８７３９）。本明細書で、Ａ領域は転写活性に対するホットスポットであることも見出されたが、ＮＧＳを使用することによって、ＲＢＥを含む４０塩基対領域内に主として集中した、ＩＴＲ配列全体にわたる複数のスタートおよび転写因子結合部位を同定することができた（図４Ａ～４Ｃ）。規定のＩＴＲ配列内に伝統的なＴＡＴＡボックスを欠如するが、シトシンおよびグアニンに富むため、これらの配列は、脊椎動物ゲノムに見出される転写的に活性なＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）との顕著な類似性を持つ。ＣＧＩは、脊椎動物ゲノムにおいて最もよく見られるプロモータータイプであり、注釈付きの遺伝子の６０～７０％に存在すると現在解されている。ＣＧＩは、５０％よりも大きいＣ＋Ｇ比、および６０％またはそれよりも高い割合の観察対予想ＣｐＧジヌクレオチドを有する配列として一般に定義される。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、Ｃ＋Ｇ含有量およびＣｐＧ頻度の両方においてこの定義に適合する（表３）。ＣＧＩは、複製の起点であることが多く、一般的に、５０～１００塩基対領域にわたって分散する複数のＴＳＳと関連している。このことは、ＴＡＴＡボックス、ＩＮＲ、ＴＣＴ、およびＸＣＰＥモチーフを含む、特異的に位置付けられるコアプロモーターエレメントとより一般に関連している、単一の集中したＴＳＳを有するプロモーターと対照的である。本研究からのデータは、検討されたＡＡＶ遺伝子型由来のＩＴＲ配列が、導入遺伝子促進という文脈においてＣＧＩタイププロモーターとして機能しているという仮説を支持する。とはいえ、このデータの別の解釈は、これらのＴＳＳが別々のかつ可変的なエピソーム性配列から実際には生じているというものであり得た。感染後に２つのＩＴＲ末端の組換えにより生じる、結果として生じた配列は可変的であることから、各エピソームは、異なるスタート部位を有する可能性がある。

【0239】

ＩＴＲ１～４、６は、マウスモデルにおいてｃｒｅリコンビナーゼを促進し得る。インビボデータは、ＩＴＲ１～４、６が、組換えおよびルシフェラーゼ産生を誘導するのに十分に高いレベルのｃｒｅリコンビナーゼを促進し得たことを実証する。マウスのこの系統において、すべてのＩＴＲ配列１～４、６は活性プロモーターであり、このことは、遺伝子療法適用に対する重要な暗示を有し得る。これらのマウスに、５Ｅ１２ｖｇ／ｋｇとおよそ等価であり、ゆえに臨床的に関連する用量である１Ｅ１１ｖｇを注射した。強力な普遍的プロモーターの文脈において、これらのＩＴＲ配列は、全体的導入遺伝子産生に対して効果を有しなさそうであったが、ＡＡＶ送達ｃｒｅリコンビナーゼまたはＣＲＩＳＰＲを使用する場合等、より標的化されたまたは高感度の適用が影響を受け得るというシナリオがある。

【0240】

より重要なことには、ＩＴＲ２プロモーターの双方向性活性は、ｄｓＲＮＡ応答経路を誘導している可能性がある。先行研究は、感染の８日後の時点で、ＡＡＶ形質導入が、２０００ヌクレオチド長にわたってｄｓＲＮＡ産物を認識するｄｓＲＮＡ応答タンパク質であるＭＤＡ５を刺激することを見出した（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．２０１８ ＪＣＩ ｉｎｓｉｇｈｔ ３（１２）：ｅ１２０４７４）。エピソーム性立体構造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）にある場合のＩＴＲのプロモーター活性は、プラス鎖ＲＮＡに結合し得かつ形質導入された細胞において蓄積し得るマイナス鎖ＲＮＡ産生を推進している可能性があることが提唱された。このシナリオでは、あまり活性を有しないプロモーターが、自然免疫応答のこのアームを鈍らせるのを助けることが望ましいであろう。ＩＴＲにおけるすべてのＣｐＧアイランドを排除することは、５つのＣｐＧを有するＲＢＥ配列を、Ｒｅｐがもはやそれに効率的に結合し得ないように変化させることを必要とするであろう。転写が読み飛ばされるのを阻止するために、ＩＴＲに隣接するインシュレート配列を付加する等の他のストラテジーが有意義であり得る。

【0241】

本明細書で提示されるデータは、ＡＡＶ血清型１～４、６、および７由来のＩＴＲ配列が、固有のプロモーター活性を有し、このプロモーター活性は、ＩＴＲの間で等しい強度にないことを示している。具体的には、ＩＴＲ２およびＩＴＲ３配列は、ＩＴＲ１、４、および６と比較した場合に、複数の細胞タイプにわたってより高いルシフェラーゼ発現をもたらした。ＩＴＲ７は、ルシフェラーゼ発現において細胞特異的な差を呈示する唯一のＩＴＲであった。ＴＳＳは、各ＩＴＲ配列内の複数の配置にマッピングされ、そのうちの大半は、ＲＢＥを含有する４０塩基対領域を起源とした。インビボにおいて、試験されたすべてのＩＴＲは、注射の３週間後までにｃｒｅ媒介性組換えを誘導するのに十分に高いレベルでｃｒｅリコンビナーゼを促進する能力を有した。これらのデータは、高感度のまたは細胞特異的な療法が必要とされる場合に、ベクター設計ストラテジーに情報を与えるのを助け得る。ゆえに、本研究は、ＡＡＶ１～４、６、および７に対するＩＴＲ配列が、インビトロで導入遺伝子発現を促進する様々な能力を有すること、ならびにこれらの配列が複数のＴＳＳを含有することを初めて示している。付加的に、高感度レポーターマウス系統を利用して、臨床的に関連する用量で、ＩＴＲ１～４＆６は、細胞レベルでの生物学的効果を有するように、インビボでｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を十分に促進する能力を有することを実証した。

【0242】

前述は本発明の例示であり、それを限定するものとして受け取られるべきではない。

【0243】

【表1】

【0244】

【表2】

【0245】

【表3】

【0246】

Ｃ＋Ｇ含有量を、（Ｃ＋Ｇ）／Ｎ、式中、Ｃは、表示されるＡＡＶ血清型の５’ＩＴＲ配列におけるシトシンの数であり、Ｇはグアニンの数であり、Ｎはヌクレオチドの数である、で算出した。観察対予想ＣｐＧ比を、Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ １９８７による式：（（ＣｐＧｓ）／（Ｃ＊Ｇ））＊Ｎ、式中、ＣｐＧは、配列における観察されたＣｐＧの数であり、Ｃはシトシンの数であり、Ｇはグアニンの数であり、Ｎはヌクレオチドの数である、を使用して算出した。

【0247】

【化1】

【0248】

【化2】

【図1A】

【図1B】

【図1C-1】

【図1C-2】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図3】

【図4A-1】

【図4A-2】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【配列表】

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【国際調査報告】