特表 2023-510464 形質転換細胞からの構築物の除去

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-14

(54)【発明の名称】形質転換細胞からの構築物の除去

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/82 20060101AFI20230307BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230307BHJP

   A01H 6/82 20180101ALI20230307BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230307BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20230307BHJP

   C12N 5/04 20060101ALN20230307BHJP

【ＦＩ】

C12N15/82 Z ZNA

C12N15/09 110

A01H6/82

C12N5/10

C12N15/54

C12N5/04

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022529327

(86)(22)【出願日】2019-11-19

(85)【翻訳文提出日】2022-07-15

(86)【国際出願番号】 IL2019051266

(87)【国際公開番号】W WO2021100034

(87)【国際公開日】2021-05-27

(81)【指定国・地域】

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 集会名 植物バイオテクノロジー － ゲノミクス及びゲノム編集 開催場所 テルアビブ大学、スタインハルト自然史博物館内、スタインハルト講堂 開催日 令和１年５月２０日

(71)【出願人】

【識別番号】505161910

【氏名又は名称】プロタリクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シェバ マオール

(72)【発明者】

【氏名】ハナニア ウリ

【テーマコード（参考）】

2B030

4B065

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AB03

2B030AD20

2B030CA17

2B030CD28

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA53

(57)【要約】

形質転換後に除去可能である核酸構築物が開示される。上記構築物の使用方法も開示される。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）第１のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの核酸試薬であって、目的とする少なくとも１種の標的核酸を、生物又は前記生物の細胞において編集又は調節するためのものである、核酸試薬、
（ｉｉ）少なくとも１つの構築物削除用ｇＲＮＡ、
（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び
（ｉｖ）少なくとも２つのコピーの、前記構築物削除用ｇＲＮＡの標的配列、
をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、
前記構築物削除用ｇＲＮＡ又は前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのいずれかは第２のプロモーターに作動可能に連結されており、前記第１のプロモーター及び前記第２のプロモーターは、前記生物又は前記生物の細胞において、前記第１のプロモーターからの転写開始後に前記第２のプロモーターからの転写が開始されるように選択される、核酸構築物。

【請求項2】

前記第１のプロモーターは、構成的プロモーターである、請求項１に記載の核酸構築物。

【請求項3】

前記第２のプロモーターは、誘導性プロモーターである、請求項１又は２に記載の核酸構築物。

【請求項4】

前記第２のプロモーターは、組織特異的プロモーター又は発生段階特異的プロモーターである、請求項１又は２に記載の核酸構築物。

【請求項5】

前記第１のプロモーターは、前記第２のプロモーターよりも強い、請求項１に記載の核酸構築物。

【請求項6】

前記核酸試薬は、核酸編集試薬を含む、請求項１に記載の核酸構築物。

【請求項7】

前記核酸編集試薬は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項8】

前記少なくとも１つの核酸試薬がｇＲＮＡを含む場合、前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは前記第１のプロモーターに作動可能に連結されており、前記構築物削除用ｇＲＮＡは前記第２のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項9】

（ｖ）ネガティブ選択マーカー
を更にコードする、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項10】

（ｖｉ）ポジティブ選択マーカー
を更にコードする、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項11】

前記少なくとも２つのコピーのうちの第１のコピーは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に対して３’末端側に配置され、前記少なくとも２つのコピーのうちの第２のコピーは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に対して５’末端側に配置される、請求項１に記載の核酸構築物。

【請求項12】

前記少なくとも２つのコピーのうちの第１のコピーは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）に対して３’末端側に配置され、前記少なくとも２つのコピーのうちの第２のコピーは（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）に対して５’末端側に配置される、請求項１０に記載の核酸構築物。

【請求項13】

前記ネガティブ選択マーカーは、ＣｏｄＡを含む、請求項９に記載の核酸構築物。

【請求項14】

前記誘導性プロモーターは、熱誘導性プロモーターである、請求項３に記載の核酸構築物。

【請求項15】

前記生物は、植物である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項16】

前記植物は、Nicotiana tabacumを含む、請求項１５に記載の核酸構築物。

【請求項17】

前記ｇＲＮＡの前記少なくとも２つのコピーの標的配列は、前記ｇＲＮＡの少なくとも６つのコピーの前記標的配列を含み、前記少なくとも６つのコピーのうちの３つは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に対して３’末端側に配置され、前記少なくとも６つのコピーのうちの別の３つは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に対して５’末端側に配置される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項18】

前記目的とする標的核酸は、遺伝子に含まれている、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項19】

前記遺伝子は、グリコシル化酵素をコードする、請求項１８に記載の核酸構築物。

【請求項20】

前記グリコシル化酵素は、キシロシルトランスフェラーゼ及び／又はフコシルトランスフェラーゼを含む、請求項１９に記載の核酸構築物。

【請求項21】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、生物又は前記生物の細胞。

【請求項22】

請求項１５に記載の核酸構築物を含む、植物又は植物細胞。

【請求項23】

前記植物は、Nicotiana tabacumである、請求項２２に記載の植物又は植物細胞。

【請求項24】

前記植物細胞は、ＢＹ－２細胞株である、請求項２２に記載の植物又は植物細胞。

【請求項25】

懸濁培養されている、請求項２２に記載の植物又は植物細胞。

【請求項26】

目的のタンパク質を発現するように遺伝子改変されている、請求項２１に記載の生物若しくは前記生物の細胞、又は請求項２２～２４のいずれか一項に記載の植物若しくは前記植物の細胞。

【請求項27】

目的とする標的核酸を、生物又は前記生物の細胞において編集又は調節する方法であって、
（ａ）前記目的とする核酸の編集又は調節を促進する条件下で、前記生物又は前記生物の単離細胞を、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸構築物で形質転換する工程であって、前記条件が、前記第２のプロモーターからの発現を促進しない、工程と、続いて、
（ｂ）前記生物又は前記生物の単離細胞を、前記第２のプロモーターからの発現を促進する条件下で培養し、それによって前記目的とする標的核酸を編集又は調節する工程と、
を含む、方法。

【請求項28】

前記生物は、植物である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

工程（ａ）は、少なくとも１日間実施される、請求項２７又は２８に記載の方法。

【請求項30】

前記形質転換は、安定的な形質転換である、請求項２７に記載の方法。

【請求項31】

前記生物は、植物である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

工程（ａ）は、少なくとも１週間実施される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

工程（ｂ）は、少なくとも１週間実施される、請求項２７又は２９に記載の方法。

【請求項34】

前記細胞は、懸濁培養される、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞は、植物細胞である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記目的とする核酸は、目的の遺伝子である、請求項２７～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記調節は、前記目的の遺伝子を下方制御することを含む、請求項３６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表に関する記述
本出願の出願と同時に提出された、２０１９年１１月１９日に作成され、「７９８０１ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題された２８，６７２バイトのＡＳＣＩＩファイルは、参照により本明細書に援用される。

【0002】

技術分野
本発明は、いくつかの実施形態では、細胞を形質転換するために使用された構築物を除去する方法に関し、より詳細には、限定されるものではないが、植物細胞に関する。

【背景技術】

【0003】

ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）及び最近発見されたＣａｓＸは、多様な細胞型及び生物において正確なゲノム編集のための非常に効率的で有用なツールであることが証明されている。ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ系は、広範な標的変異導入、遺伝子置き換え、及びその他の新規の用途にますます重要なツールになっている。しかしながら、そのようなアプローチは、様々な導入遺伝子が長く連なるトランスジェニック細胞株をもたらす可能性があり、導入された遺伝子のなかには、そのタスクの達成後にはもはや必要とされないものもある。

【0004】

これまでに、グリコシル化機構に介入するため、及び植物により産生される組み換えバイオ医薬をヒト化するために、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、ＢＹ-２宿主細胞のゲノム及びN. Benthamiana宿主植物の操作が行われた（Hanania et al., 2017、Jansing et al., 2019、Mercx et al., 2017）。標的変異に使用された選択マーカー及びヌクレアーゼ遺伝子（例えば、ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９）の存在は、細胞の機構に過剰な代謝負荷をもたらすだけでなく、その後の形質転換の更なる適用も制限し得る。したがって、これらの遺伝子を除去することが非常に望ましい。

【0005】

現在、植物全体では、植物ゲノムに安定的に組み込まれている選択マーカーを有性増殖により分離除去するアプローチが数多く開発されている。上記の方法としては、（１）反復戻し交配及び分離、（２）２種類の構築物を使用する共形質転換であって、構築物の１つが選択マーカーを含み、もう１つが目的の所望遺伝子を有するようにすることで、後に遺伝的分離による選択可能な遺伝子の除去を可能にする共形質転換、（３）Ｃｒｅリコンビナーゼ微生物酵素を使用した（Dale and Ow, 1991、Wang et al., 2005）、又は酵母ＦＬＰ及びＲリコンビナーゼを使用した（Hare and Chua,2002）、直接反復間の相同組み換え、並びに（４）転位性エレメントに基づくシステム（Yoder and Goldsbrough, 1994）が挙げられる。

【0006】

植物ゲノム内へのＣａｓ９の組み込みを回避するための追加のアプローチとしては、（１）Ｃａｓ９の一過性発現（Chen et al., 2018、Zhang et al., 2016）、（２）精製Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡ（ＲＮＰ）の事前集合複合体の植物プロトプラストへのトランスフェクション（Woo et al., 2015）、（３）ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９を含有する全ての花粉及び胚を効果的に死滅させる「自殺」導入遺伝子（例えばイネＲＥＧ２プロモーターの制御下のＢＡＲＮＡＳＥ遺伝子）の使用によって、生存している胚を外来ＤＮＡを含まないものとする使用（He et al., 2018）、又は（４）イネ中の除草剤耐性酵素を標的としたＣＲＩＳＰＲ構築物とＲＮＡ干渉エレメントとのカップリング（Lu et al., 2017）による、導入遺伝子を含まない変異植物の作出、が挙げられる。

【0007】

残念ながら、上記のアプローチのほとんどは、非常に面倒で時間がかかる上に、無性増殖するという懸濁液中の細胞の性質により、これらの細胞には適用できない。

【0008】

既報の実験では、非植物種における大染色体の切除のための手順（Hao et al., 2016、He et al., 2014、Xiao et al., 2013、Zhang et al., 2015）、及び植物種における大染色体の切除のための手順（Cai et al., 2018、Li et al., 2019、Ordon et al., 2017、Zhou et al., 2014）が示されている。

【0009】

その他の背景技術としては、米国特許出願公開第２００３０１５４５１８号明細書及びYau et al BMC Biotechnol. 2013; 13:36が挙げられる。

【発明の概要】

【0010】

本発明の一態様によれば、
（ｉ）第１のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの核酸試薬であって、目的とする少なくとも１種の標的核酸を、生物又は当該生物の細胞において編集又は調節するためのものである、核酸試薬、
（ｉｉ）少なくとも１つの構築物削除用ｇＲＮＡ、
（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び
（ｉｖ）少なくとも２つのコピーの、上記構築物削除用ｇＲＮＡの標的配列、
をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、上記構築物削除用ｇＲＮＡ又は上記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのいずれかは第２のプロモーターに作動可能に連結されており、上記第１のプロモーター及び上記第２のプロモーターは、上記生物又は上記生物の細胞において、上記第１のプロモーターからの転写開始後に上記第２のプロモーターからの転写が開始されるように選択される、核酸構築物が提供される。

【0011】

本発明の別の態様によれば、本明細書に開示される核酸構築物を含む、生物又は当該生物の細胞が提供される。

【0012】

本発明の別の態様によれば、本明細書に開示される核酸構築物を含む、植物又は植物細胞が提供される。

【0013】

本発明の別の態様によれば、目的とする標的核酸を、生物又は当該生物の細胞において編集又は調節する方法であって、
（ａ）上記目的とする核酸の編集又は調節を促進する条件下で、生物又は当該生物の単離細胞を、本明細書に記載の核酸構築物で形質転換する工程であって、上記条件が、上記第２のプロモーターからの発現を促進しない、工程と、続いて
（ｂ）上記生物又は上記生物の単離細胞を、上記第２のプロモーターからの発現を促進する条件下で培養し、それによって目的の上記標的核酸を編集又は調節する工程と、
を含む、方法が提供される。

【0014】

一実施形態によれば、第１のプロモーターは、構成的プロモーターである。

【0015】

別の実施形態によれば、第２のプロモーターは、誘導性プロモーターである。

【0016】

別の実施形態によれば、第２のプロモーターは、組織特異的プロモーター又は発生段階特異的プロモーターである。

【0017】

別の実施形態によれば、第１のプロモーターは、第２のプロモーターよりも強い。

【0018】

別の実施形態によれば、核酸試薬は、核酸編集試薬を含む。

【0019】

別の実施形態によれば、核酸編集試薬は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、及びジンクフィンガーヌクレアーゼからなる群から選択される。

【0020】

別の実施形態によれば、上記少なくとも１つの核酸試薬がｇＲＮＡを含む場合、上記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、上記第１のプロモーターに作動可能に連結されており、上記構築物削除用ｇＲＮＡは、上記第２のプロモーターに作動可能に連結されている。

【0021】

別の実施形態によれば、核酸構築物は、更に、
（ｖ）ネガティブ選択マーカー
をコードする。

【0022】

別の実施形態によれば、核酸構築物は、更に、
（ｖｉ）ポジティブ選択マーカー
をコードする。

【0023】

別の実施形態によれば、上記少なくとも２つのコピーのうちの第１のコピーは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に対して３’末端側に配置され、上記少なくとも２つのコピーのうちの第２のコピーは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に対して５’末端側に配置される。

【0024】

別の実施形態によれば、上記少なくとも２つのコピーのうちの第１のコピーは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）及び（ｖｉ）に対して３’末端側に配置され、上記少なくとも２つのコピーのうちの第２のコピーは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）に対して５’末端側に配置される。

【0025】

別の実施形態によれば、ネガティブ選択マーカーは、ＣｏｄＡを含む。

【0026】

別の実施形態によれば、誘導性プロモーターは、熱誘導性プロモーターである。

【0027】

別の実施形態によれば、生物は、植物である。

【0028】

別の実施形態によれば、植物は、Nicotiana tabacumを含む。

【0029】

別の実施形態によれば、上記ｇＲＮＡの少なくとも２つのコピーの標的配列は、上記ｇＲＮＡの上記標的配列の少なくとも６つのコピーを含み、上記少なくとも６つのコピーのうちの３つは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に対して３’末端側に配置され、上記少なくとも６つのコピーのうちの別の３つは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に対して５’末端側に配置される。

【0030】

別の実施形態によれば、目的とする標的核酸は、遺伝子に含まれる。

【0031】

別の実施形態によれば、遺伝子は、グリコシル化酵素をコードする。

【0032】

別の実施形態によれば、グリコシル化酵素は、キシロシルトランスフェラーゼ及び／又はフコシルトランスフェラーゼを含む。

【0033】

別の実施形態によれば、植物は、Nicotiana tabacumである。

【0034】

別の実施形態によれば、植物細胞は、ＢＹ-２細胞株である。

【0035】

別の実施形態によれば、植物又は植物細胞は、懸濁培養される。

【0036】

別の実施形態によれば、生物若しくは生物の細胞、又は植物若しくは植物の細胞は、目的のタンパク質を発現するように遺伝子改変されている。

【0037】

別の実施形態によれば、生物は、植物である。

【0038】

別の実施形態によれば、工程（ａ）は、少なくとも１日間実施される。

【0039】

別の実施形態によれば、形質転換は、安定的な形質転換である。

【0040】

別の実施形態によれば、生物は、植物である。

【0041】

別の実施形態によれば、工程（ａ）は、少なくとも１週間実施される。

【0042】

別の実施形態によれば、工程（ｂ）は、少なくとも１週間実施される。

【0043】

別の実施形態によれば、細胞は、懸濁培養される。

【0044】

別の実施形態によれば、細胞は、植物細胞である。

【0045】

別の実施形態によれば、目的とする核酸は、目的の遺伝子である。

【0046】

別の実施形態によれば、調節は、上記目的の遺伝子を下方制御することを含む。

【0047】

特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含め、本願特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。

【0048】

本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本明細書に記載する。以下、特に図面に詳細に言及するが、示される詳細は、例示を目的とし、また本発明の実施形態の例証的説明を目的とすることを強調する。この点に関して、図面を用いて説明することで、当業者には、本発明の実施形態をどのように実践し得るかが明らかとなる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】ＢＹ-２細胞の形質転換に使用される「自己除去可能な」ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９ベクターの概略図である。ＬＢ：左端部、ＺＺＺ：それぞれｇＲＮＡ-Ｚの標的として使用された２３塩基の３リピート、ＮｏｓＰ：ノパリンシンターゼプロモーター、ＨｐｔＩＩ：ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、ＮｏｓＴ：ノパリンシンターゼターミネーター、５ｓＰ：３５Ｓオメガエンハンサーを有するカリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ｈＣａｓ９：ＳＶ４０核局在化シグナルを有するヒト最適化Ｃａｓ９、ＯｃＳＴ：オクトピンシンターゼターミネーター、ｃｏｄＡ：シトシンデアミナーゼ（ネガティブ選択マーカー）、ＨＳＰ：Arabidopsis thaliana由来の熱ショックプロモーター（ＨＳＰ１８．２）、Ｕ６：ArabidopsisのＵ６プロモーター、ｓｇＲＮＡ：Ｚ-ｔｒａｃｒＲＮＡを有するベクターとターミネーターの境界におけるＺ配列指向性のｃｒＲＮＡのキメラ（Ｔの５リピート）、ｓｇＲＮＡ１～５：ｔｒａｃｒＲＮＡを有する種々のｃｒＲＮＡｓのキメラであり、ＦｕｃＴ及びＸｙｌＴ遺伝子のノックアウトに使用した５種の異なるｃｒＲＮＡを表す（Hanania et al., 2017）、ＲＢ：右端部。

【図2】抗ＨＲＰ抗体を使用したウエスタンブロットである。総タンパク質を、３種の推定ノックアウト（putative knockout）細胞株である株２８、株７６、及び株９０、非トランスジェニックＢＹ-２細胞、並びに３種類の対照ノックアウト細胞株から抽出した。各試料から得た合計１０μｇのタンパク質を１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥにロードし、続いて抗ＨＲＰ抗体を使用してウエスタンブロットを行った。ΔＸ、ΔＦ、ΔＸＦは、これまでに確立されたノックアウト細胞株（Hanania et al. 2017）であり、対照として使用する。ΔＸは、キシロースを含有するグリカンを含まず、ΔＦはフコースを含有するグリカンを含まず、ΔＸＦは、それぞれキシロース及びフコースの両方を含有するグリカンを含まず、ＭＷは分子量マーカー（ｋＤａ）である。

【図3】抗ｃｏｄＡ抗体を使用したウエスタンブロットである。総タンパク質を、３種の推定ノックアウト細胞株である株２８、株７６、及び株９０、並びに２種類の対照細胞株から抽出した。各試料から得た合計１０μｇのタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにロードし、続いて抗ｃｏｄＡ抗体を使用してウエスタンブロットを行った。ＰＣ：陽性対照（ｃｏｄＡを発現する細胞株）、ＢＹ-２：陰性対照（非トランスジェニックＢＹ-２細胞）、ＭＷ：分子量マーカー（ｋＤａ）。ｃｏｄＡの予想サイズは、約４９ｋＤａである。

【図4】抗Ｃａｓ９抗体を使用したウエスタンブロットである。総タンパク質は、３種類のＸｙｌＴ／ＦｕｃＴノックアウト細胞である株２８、株７６、株９０、及び２種類の対照細胞株から抽出した。各試料から得た合計１０μｇのタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにロードし、続いて抗Ｃａｓ９抗体を使用してウエスタンブロットを行った。ＰＣ：陽性対照（Ｃａｓ９を発現する細胞株）、ＢＹ-２：陰性対照（非トランスジェニックＢＹ-２細胞）。ＭＷ：分子量マーカー（ｋＤａ）。ｃａｓ９の予想サイズは、約１５９ｋＤａである。

【図5】誘導されたｇＲＮＡ-Ｚ：Ｃａｓ９の機能を検出するためのＰＣＲアッセイである。（Ａ）左端部（ＬＢ）の標的に使用したプライマー及びバイナリーベクターのｈｐｔＩＩカセットの概略図、及びＰＣＲ産物の予想サイズ（８７４ｂｐ）。（Ｂ）異なる細胞プールから抽出した全ゲノムＤＮＡ、及び１％のアガロースゲルで分離したＰＣＲ産物。ｇＲＮＡ-Ｚ発現を誘導するための反復熱処理後のＸｙｌＴ／ＦｕｃＴノックアウト細胞株に由来する細胞の、プール２８及びプール７６からのＰＣＲ産物。Ｎ．Ｃ：陰性対照、テンプレートなしの混合物。ＰＣ：陽性対照、ＤＮＡテンプレートが８７４ｂｐフラグメントを産生。ＭＷ：分子量マーカー（ｂｐ）。

【図6】抗ｈｐｔＩＩ、抗Ｃａｓ９、及び抗ｃｏｄＡ抗体を使用したウエスタンブロット解析である。ＸｙｌＴ／ＦｕｃＴノックアウトであるプール７６（株７６１～株７６８）の８種のクローンをウエスタンブロットによって解析して、ｃｏｄＡ、ｈｐｔＩＩ、及びＣａｓ９タンパク質の存在を検出した。各試料から得た合計１０μｇの総タンパク質をロードし、タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、続いて、（ａ）抗ｃｏｄＡ抗体、（ｂ）抗ｈｐｔＩＩ抗体、（ｃ）抗Ｃａｓ９抗体をそれぞれ使用してウエスタンブロットを実施した。Ｐ：陽性対照、ｃｏｄＡ、ｈｐｔＩＩ、及びＣａｓ９を発現する細胞株。ＢＹ-２：陰性対照、非トランスジェニックＢＹ-２細胞。ＭＷ：分子量マーカー（ｋＤａ）。青色矢印は、関連するタンパク質の存在を示す。ｃｏｄＡの予想サイズは、約４９ｋＤａである。

【図7】再単離クローンにおけるＨＳＰ１８．２プロモーターの存在を検出するためのＰＣＲアッセイである。ノックアウト細胞株のプール７６から単離した８種のクローンから総ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ産物を２％のアガロースゲル上で分離した。Ｎ．Ｃ：陰性対照、テンプレートなしの混合物。株７６１～株７６８は、プール７６由来の単離クローンである。Ｐ．Ｃ：陽性対照、ＨＳＰ配列を含むトランスジェニック細胞株から抽出されたＤＮＡとの混合物。

【図8】株７６３及び株７６７における切除を確認するためのサザンブロット解析である。（Ａ）ゲノムに組み込まれたＴ-ＤＮＡ及びＨＰＴＩＩ（橙色）プローブの位置の概略図。予想される消化フラグメントのサイズは３．８ｋｂである。（Ｂ）右側は、０．８％のアガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ハイブリダイゼーション用メンブレンの上に転写したものである。左側は、野生型（ＢＹ２）、株７６３、株７６７、及びＨＰＴＩＩ遺伝子を含む陽性対照トランスジェニックＢＹ２細胞株（Ｐ．Ｃ）の細胞からのＰａｃＩ及びＳａｃＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析である。陽性対照の消化フラグメントの予想サイズは６ｋｂである。ハイブリダイゼーションは、ＨｐｔＩＩ ＤＮＡプローブを用いて実施した。ＭＷ：ＤＮＡ分子量（ｋｂ）。

【図9】株７６３及び株７６７における切除を確認するためのサザンブロット解析である。（Ａ）ゲノムに組み込まれたＴ-ＤＮＡ及びｈＣａｓ９（橙色）プローブ位置の概略図。予想される消化フラグメントのサイズは９ｋｂである。（Ｂ）右側は、０．８％のアガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ハイブリダイゼーション用メンブレンの上に転写したものである。左側は、野生型（ＢＹ２）、株７６３、株７６７、及びｈＣａｓ９遺伝子を含む陽性対照トランスジェニックＢＹ２細胞株（Ｐ．Ｃ）の細胞からのＮｃｏＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析である。陽性対照の消化フラグメントの予想サイズは１０．６ｋｂである。ハイブリダイゼーションは、ｈＣａｓ９ ＤＮＡプローブを用いて実施した。ＭＷ：ＤＮＡ分子量（ｋｂ）。

【図10】株７６３及び株７６７における切除を確認するためのサザンブロット解析である。（Ａ）ゲノムに組み込まれたＴ-ＤＮＡ及びＯｃＳＴ（橙色）プローブ位置の概略図。予想される消化フラグメントのサイズは、９ｋｂ及び３．４ｋｂである。（Ｂ）右側は、０．８％のアガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ハイブリダイゼーション用メンブレンの上に転写したものである。左側は、野生型（ＢＹ２）、株７６３、株７６７、及びＯｃＳＴを含む陽性対照トランスジェニックＢＹ２細胞株（Ｐ．Ｃ）の細胞からのＮｃｏＩ及びＳｐｈＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析である。陽性対照の消化フラグメントの予想サイズは１０．６ｋｂである。ハイブリダイゼーションは、ＯｃＳＴ ＤＮＡプローブを用いて実施した。ＭＷ:ＤＮＡ分子量（ｋｂ）。

【図11】株７６３及び株７６７における切除を確認するためのサザンブロット解析である。（Ａ）ゲノムに組み込まれたＴ-ＤＮＡ及びＵ６-ｇＲＮＡ（橙色）プローブ位置の概略図。予想される消化フラグメントのサイズは１０．５ｋｂである。（Ｂ）右側は、０．８％のアガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ハイブリダイゼーション用メンブレンの上に転写したものである。左側は、野生型（ＢＹ２）、株７６３、株７６７、及びＵ６-ｇＲＮＡ１～５を含む陽性対照トランスジェニックＢＹ２細胞株（Ｐ．Ｃ）の細胞からのＳａｃＩ及びＰａｃＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析である。陽性対照の消化フラグメントの予想サイズは６ｋｂである。ハイブリダイゼーションは、Ｕ６-ｇＲＮＡ１～５プローブの混合物を用いて実施した。ＭＷ:ＤＮＡ分子量（ｋｂ）。

【図12】ＣＡＳ９標的として選択されたＤＮＡ配列（ｃｒＲＮＡ）の詳細を提供する。標的化ヌクレオチド（黒色文字）、ＰＡＭは、配列の３’末端（赤色文字）に存在する。ｃｒＲＮＡ１:配列番号２４、ｃｒＲＮＡ２：配列番号２５、ｃｒＲＮＡ３：配列番号２６、ｃｒＲＮＡ４：配列番号２７、ｃｒＲＮＡ５：配列番号２８。

【発明を実施するための形態】

【0050】

本発明のいくつかの実施形態は、細胞の形質転換に使用された構築物を除去する方法に関し、より詳細には、限定されるものではないが、植物細胞に関する。

【0051】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明の用途は、以下の発明を実施するための形態に示される詳細又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は他の実施形態が可能であり、又は様々な方法で実施若しくは実現することが可能である。

【0052】

異種ＤＮＡ及び選択マーカーは、組み換えバイオ医薬タンパク質を過剰発現するよう改良された宿主細胞株を作製することを目的としたゲノム編集に使用される。必要とされなくなった異種ＤＮＡ及び選択マーカーは、細胞機構に対し過剰な代謝負荷をかけ、その後の形質転換においては、それらの更なる利用を制限し得ることから、除去することが有益となり得る。

【0053】

これらの遺伝子がＧＭ植物、並びにその後の食品、飼料、及び環境中に存在することは多くの国々で関心事となっており、特別な政府規制の対象となっている。これまでに、必要なもののみを所定の位置に残しながら導入遺伝子及びマーカーを除去するための様々な技術が開発されてきた。

【0054】

ここで本発明者らが革新的な段階的方法論を開発した。この方法では、第１の工程として、細胞を形質転換して、ゲノムの核酸配列を調節（例えば、発現の上方制御又は下方制御）又は編集（例えば、ノックイン又はノックアウト）する試薬を発現させる。

【0055】

第２の工程は、カセット上の少なくとも２つの部位を標的とするように設計された特異的ｇＲＮＡの誘導による挿入カセットの少なくとも１部分の切除を含む。第１の工程と第２の工程とは、１回の形質転換の実施で実現される。

【0056】

一例として、本発明者らは、植物細胞を形質転換させて、目的遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを発現させた。ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９は、第１の工程では目的遺伝子の発現を下方制御するために、第２の工程ではＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９カセットを切除するために、順次使用される。ゲノム編集工程及び導入遺伝子の除去工程は、１回の形質転換の実施で達成される。この機構により、ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集では、導入した導入遺伝子をまったく残さないことが可能になる。

【0057】

本発明を実用化するに当たり、本発明者らは上記の方法論を使用して、最初に、Nicotiana tabacum L. cv Bright Yellow 2（ＢＹ-２）細胞懸濁液でβ（１，２）-キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）及びα（１，３）-フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）遺伝子をノックアウトした。

【0058】

本発明者らは、様々な抗体を使用したウエスタンブロット解析（図６の（Ａ）～（Ｃ））によって、及び異なるプローブを使用したサザンブロットハイブリダイゼーション（図８の（Ａ）～（Ｂ）、図９の（Ａ）～（Ｂ）、図１０の（Ａ）～（Ｂ）、及び図１１の（Ａ）～（Ｂ））によって、１４．３ｋｂのＴ-ＤＮＡ全体がノックアウト後に除去されていることを明白に実証した。

【0059】

本発明者らは、細胞の形質転換後の任意の時点で、高度に効率的な除去工程が活性化可能であり、こうすることで、ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９は、自己切除の前に、標的遺伝子の改変に必要なだけの時間をかけることができることを提唱する。

【0060】

したがって、本発明の第１の態様によれば、
（ｉ）第１のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの核酸試薬であって、目的とする少なくとも１種の標的核酸を、生物又は当該生物の細胞において編集又は調節するためのものである、核酸試薬、
（ｉｉ）少なくとも１つの構築物削除用ｇＲＮＡ、
（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び
（ｉｖ）上記構築物を削除するためのｇＲＮＡの、少なくとも２つのコピーの標的配列、
をコードする核酸配列を含み、上記構築物削除用ｇＲＮＡ又は上記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのいずれかは第２のプロモーターに作動可能に連結されており、上記第１のプロモーター及び上記第２のプロモーターは、上記生物又は上記生物の細胞において、上記第１のプロモーターからの転写開始後に上記第２のプロモーターからの転写が開始されるように選択される、核酸構築物が提供される。

【0061】

本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物は、上記の配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。そのような核酸構築物は、本明細書で以下に更に記載するように、構成的又は誘導的に細胞内のポリヌクレオチド配列の転写を指示するためのプロモーター配列を含む。好ましくは、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物によって利用されるプロモーターは、形質転換した特定の細胞集団において活性である。

【0062】

本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列、及び／又は複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組み合わせ）の形態で単離及び提供される、一本鎖又は二本鎖核酸配列を指す。

【0063】

核酸構築物の構築において、プロモーターは、好ましくは、異種の転写開始部位からの距離が、その天然の環境における転写開始部位からの距離とほぼ等しくなるように配置されている。しかしながら、当該分野で既知のように、この距離のある程度の変更には、プロモーター機能を失わせることなく対応できる。

【0064】

ｍＲＮＡ翻訳の効率を高めるために、ポリアデニル化配列を発現ベクターに付加することもできる。正確かつ効率的なポリアデニル化には、次の２種の別個の配列エレメント：ポリアデニル化部位の下流に位置するＧＵリッチ配列又はＵリッチ配列、及び１１～３０塩基上流に位置する６塩基の高度に保存された配列であるＡＡＵＡＡＡ、が必要である。本発明のいくつかの実施形態に好適な終結シグナル及びポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来のものが挙げられる。

【0065】

本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、既に記載したエレメントに加えて、典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させること、又は組み換えＤＮＡを有する細胞の同定を容易にすることを意図した、他の特殊化されたエレメント（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含有し得る。例えば、数多くの動物ウイルスは、複数種の許容細胞において染色体外でのウイルスゲノムの複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。このようなウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミド上で保有する遺伝子、又は、宿主細胞のゲノムに保有される遺伝子のいずれかにより提供される限り、エピソームとして複製される。

【0066】

核酸構築物は、真核生物のレプリコンを含んでも含まなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在する場合、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞で増幅可能である。核酸構築物が真核生物のレプリコンを含まない場合、エピソームの増幅は不可能である。その代わり、組み換えＤＮＡが、遺伝子操作された細胞のゲノムに組み込まれ、プロモーターが所望の核酸の発現を指示する。

【0067】

本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物は、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ、ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）などの、単一ｍＲＮＡからの複数種のタンパク質の翻訳を可能にする追加のポリヌクレオチド配列、及び、プロモーター-キメラポリペプチドをゲノムに組み込むための配列、を更に含み得る。

【0068】

核酸構築物に含まれる個々のエレメントは、様々な構成で配置され得ることが理解されよう。例えば、エンハンサーエレメント、プロモーターなど、更には核酸サイレンシング試薬をコードするポリヌクレオチド配列は、「ヘッド・トゥ・テール（ｈｅａｄ-ｔｏ-ｔａｉｌ）」型の構成で配置することができ、反転した相補鎖として、すなわち相補的構成で逆平行鎖として存在し得る。このような様々な構成は、核酸構築物の非コードエレメントで生じる可能性がより高いが、核酸構築物内のコード配列の代替的な構成も想定される。

【0069】

哺乳動物発現ベクターの核酸構築物の例としては、限定されるものではないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／-）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／-）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社から入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ-ＲＳＶ及びｐＢＫ-ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能なｐＴＲＥＳ、並びにこれらの誘導体が挙げられる。

【0070】

植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）が挙げられる。

【0071】

細菌構築物の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターのｐＥＴシリーズが挙げられる［Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89）］。

【0072】

酵母では、米国特許第５，９３２，４４７号明細書に開示されているように、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターを含有する数多くのベクターを使用できる。あるいは、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターを使用することができる。

【0073】

レトロウイルスなどの真核生物ウイルスに由来する調節エレメントを含有する核酸構築物も使用できる。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ-１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ^＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ^＋、ｐＭＡＭｎｅｏ-５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及び、ＳＶ-４０初期プロモーター、ＳＶ-４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳がんウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核生物細胞における発現に効果的であることが示されている他のプロモーターの指示下でのタンパク質の発現を可能にする、任意の他のベクターが挙げられる。

【0074】

上記のように、ウイルスは多くの場合、宿主の防御機構を回避するように進化した、非常に特殊化している感染体である。典型的には、ウイルスは、特定の細胞種に感染し、増殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、所定の細胞種を特異的に標的にするという、ウイルス自体がもともと有している特異性を利用して、組み換え遺伝子を感染細胞に導入する。したがって、本発明のいくつかの実施形態に使用するベクターの種類は、形質転換させる細胞の種類に応じて異なる。形質転換させる細胞の種類に応じて好適なベクターを選択する能力は、当業者の能力の範囲内であり、そのような選択の考慮事項の全般的な説明は本明細書で行わない。例えば、Liang CY et al., 2004 (Arch Virol. 149:51-60)に記載されているように、骨髄細胞はヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ-Ｉ）を使用して標的とすることができ、腎細胞は、バキュロウイルスであるAutographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）中に存在する異種プロモーターを使用して標的とすることができる。

【0075】

現在好ましいインビボでの核酸導入技術には、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩ型ウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び脂質ベースの系などのウイルス構築物又は非ウイルス構築物によるトランスフェクションが含まれる。脂質による遺伝子導入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである［Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14(1):54-65 (1996)］。遺伝子療法における使用に最も好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。レトロウイルス構築物などのウイルス構築物は、少なくとも１種の転写プロモーター／エンハンサー若しくは遺伝子座を定めるエレメント、又は選択的スプライシング、核ＲＮＡの核外輸送、若しくはメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段によって遺伝子発現を制御するその他のエレメント、を含む。そのようなベクター構築物はまた、ウイルス構築物中に予め存在しないものに限り、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ）、又はその一部、並びに使用されるウイルスに適切なポジティブ鎖及びネガティブ鎖プライマー結合部位も含む。更に、そのような構築物は、典型的には、その構築物を含む宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳類のシグナル配列、又は本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドバリアントのシグナル配列である。任意選択的に、構築物は、ポリアデニル化を指示するシグナル、並びに１つ以上の制限部位及び翻訳終結配列も含み得る。例えば、このような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡの合成起点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を有する。カチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマーなどの非ウイルス性である他のベクターを使用することができる。

【0076】

本発明のいくつかの実施形態による方法において有用な構築物は、当業者に周知の組み換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る。構築物は、市販されており、生物（例えば、植物）の形質転換に好適であり、形質転換細胞における発現に好適である場合がある。

【0077】

本発明のこの態様の核酸試薬は、目的とする少なくとも１種の標的核酸の、生物又は当該生物の細胞における発現を編集又は調節するためのものである。

【0078】

一実施形態では、核酸試薬は、ＤＮＡ編集試薬である。

【0079】

本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ編集試薬」は、一本鎖又は二本鎖の遺伝子操作されたＤＮＡエンドヌクレアーゼ、及び特定の実施形態においては細胞のゲノムにおける挿入、欠失、挿入-欠失、置換、挿入、又はこれらの任意の組み合わせを引き起こす補助的な試薬（例えば、ｇＲＮＡ、ドナーＤＮＡ配列）を指す。

【0080】

一実施形態では、核酸試薬は、核酸サイレンシング試薬である。

【0081】

本明細書で使用する場合、「核酸サイレンシング試薬」は、特定の様式で遺伝子発現を下方制御し、ＤＮＡ（ゲノム）レベル又はＲＮＡレベルのいずれかに作用する、核酸分子を指す。核酸サイレンシング試薬の例としては、限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及び遺伝子の発現に影響を与えるＤＮＡ編集試薬が挙げられる。

【0082】

ＤＮＡ編集試薬が遺伝子発現を下方制御する場合、ＤＮＡ編集試薬はまた、核酸サイレンシング試薬とも呼ばれ得ることが理解されよう。

【0083】

当業者は、過度の実験を行うことなく、発現が阻害、中断、又は低減されたかを認識するであろう。例えば、特定の遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡのテンプレート分子の逆転写後のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって測定できる。あるいは、遺伝子配列の発現レベルを、ノーザンハイブダイゼーション解析、又はドットブロットハイブリダイゼーション解析、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析、又は類似の技術によって測定してもよい。上記技術では、ｍＲＮＡが膜支持体に転写され、「プローブ」分子とハイブリダイズする。プローブ分子は、目的の遺伝子によりコードされているｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列に相補的であり、好適なリポーター分子で標識されている、特に、放射性標識されたｄＮＴＰ（例えば、［α-３２Ｐ］ｄＣＴＰ、又は［α-３５Ｓ］ｄＣＴＰ）、又はビオチン標識されたｄＮＴＰなどで標識されている、ヌクレオチド配列を含む。次いで、ハイブリダイズしたプローブ分子に結合したレポーター分子によって生成されたシグナルの出現を検出することによって、目的のポリペプチドの発現を測定できる。

【0084】

あるいは、特定の遺伝子の転写率を核ランオン実験及び／又は核ランオフ実験により測定してもよい。この実験では、核を特定の細胞又は組織から単離し、特定のｍＲＮＡ分子にｒＮＴＰが取り込まれる割合を測定する。あるいは、目的の遺伝子の発現を、ＲＮａｓｅのプロテクションアッセイにより測定してもよい。このアッセイでは、上記目的の遺伝子によってコードされたｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的な標識ＲＮＡプローブ又は「リボプローブ」を、二本鎖ｍＲＮＡ分子を形成させるのに十分な時間及び条件で上記ｍＲＮＡとアニールさせ、その後試料をＲＮＡ分解酵素による消化に供し、一本鎖ＲＮＡ分子を除去し、特にハイブリダイズしなかった過剰なリボプローブを除去する。このようなアプローチは、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd ed. N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1659 p. ISBN 0-87969-309-6に詳細に記載されている。

【0085】

当業者はまた、タンパク質レベルで特定の遺伝子の発現レベルを検出するための様々な免疫学的方法及び酵素法、とりわけ、例えば、ロケット免疫電気泳動法、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ及びウエスタンブロット免疫電気泳動法の使用を認識するであろう。

【0086】

本開示を通して、「核酸試薬」は、１つ以上の核酸試薬を指すものとされる。

【0087】

特定の実施形態によれば、核酸試薬（例えば、サイレンシング試薬）は、目的とする単一の標的配列を標的とする。

【0088】

特定の実施形態によれば、サイレンシング試薬は、目的とする複数（例えば、２、３、４、５、６、又は７）の標的配列を標的とする。

【0089】

特定の実施形態によれば、核酸試薬（例えば、サイレンシング試薬）は、標的遺伝子（又はそのＲＮＡ）を改変するが、その生物のゲノム（例えば、N. tabacumのゲノム又はその発現産物）中のその他の遺伝子は改変しない。

【0090】

したがって、特定の実施形態によれば、核酸サイレンシング試薬は、目的とする標的配列（例えば、ＦｕｃＴ及び／又はＸｙｌＴ）を改変し、「オフターゲット」活性がなく、例えば、N. tabacumゲノム中のその他の配列を改変しない。

【0091】

他の実施形態によれば、サイレンシング試薬は、（標的ゲノム、すなわち、N. tabacumにおいて）目的とする標的配列を改変し、「オフターゲット」活性が有意に低減される。「オフターゲット」活性の有意な低減には、オフターゲットによる改変率の２％未満、１％未満、又は０．１％未満の低下が含まれる。オフターゲットによる改変率を評価するために使用できる方法としては、Haeussler et al.（Genome Biology, 2016, 17:148）の方法が挙げられる。

【0092】

特定の実施形態によれば、核酸サイレンシング試薬（例えば、ＤＮＡ編集試薬）は、標的ゲノム内の非必須遺伝子に対し「オフターゲット活性」を有する。

【0093】

「非必須」とは、核酸サイレンシング試薬によって改変されたときに、標的ゲノムの細胞増殖及びストレス耐性などの表現型に影響が生じない遺伝子（又はその発現産物）を指す。

【0094】

オフターゲット効果は、当該技術分野で周知の方法を使用して測定できる。

【0095】

前述のように、核酸サイレンシング試薬は、ＲＮＡレベルで作用することができる。以下は、いくつかの実施形態に従って使用され得るサイレンシング方法の非限定的な説明である。

【0096】

センス抑制又は共抑制： 本発明のいくつかの実施形態では、標的ポリペプチドの発現の阻害は、センス抑制又は共抑制によって達成することができる。共抑制のために、発現カセットは、「センス」配向において標的ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡの全部又は一部に対応するＲＮＡ分子を発現するように設計されている。ＲＮＡ分子の過剰発現は、天然遺伝子の発現の低下をもたらし得る。したがって、共抑制用の発現カセットで形質転換させた複数の細胞株をスクリーニングして、標的ポリペプチドの発現の阻害が最も大きい細胞株を同定する。

【0097】

共抑制に使用されるポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードする配列の全部又は一部、標的転写産物の５’及び／又は３’非翻訳領域の全部又は一部、又はコード配列と、標的ポリペプチドをコードする転写産物の非翻訳領域との両方の全部又は一部に対応し得る。ポリヌクレオチドが標的ポリペプチドのコード領域の全部又は一部を含むいくつかの実施形態では、発現カセットは、タンパク質産物が転写されないように、ポリヌクレオチドの開始コドンを削除するように設計される。

【0098】

共抑制は、植物遺伝子（例えば、植物遺伝子）の発現を阻害して、これらの遺伝子がコードするタンパク質のタンパク質量が検出されないレベルになっている細胞（例えば、植物細胞）を産生するために使用され得る。例えば、Broin, et al., (2002) Plant Cell 15:1517-1532を参照されたい。共抑制は、同じ細胞において複数のタンパク質の発現を阻害するためにも使用され得る。共抑制を使用して植物における内在性遺伝子の発現を阻害する方法は、Flavell, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3590-3596、Jorgensen, et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973、Johansen and Carrington, (2001) Plant Physiol.126:930-938、Broin,et al., (2002) Plant Cell 15:1517-1532、Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731、Yu,et al., (2003) Phytochemistry 63:753-769、及び米国特許第５，０３５，３２３号明細書、同第５，２８３，１８５号明細書及び同第５，９５２，６５７号明細書に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に援用される。共抑制の効率は、発現カセットの、センス配列に対して３’末端側にポリ-ｄｔ領域、及び５’末端側にはポリアデニル化シグナルを含めることによって高めることができる。参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００２００５８８１５号明細書を参照されたい。典型的には、そのようなヌクレオチド配列は、内在性遺伝子の転写産物の配列に対して実質的な配列同一性、望ましくは約６５％を超える配列同一性、より望ましくは約８５％を超える配列同一性、最も望ましくは約９５％を超える配列同一性を有する。参照により本明細書に援用される、米国特許第５，２８３，１８５号明細書及び同第５，０３５，３２３号明細書を参照されたい。

【0099】

転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）は、ｈｐＲＮＡ構築物の使用によって達成されてもよく、その際、ヘアピンの逆位反復配列は、サイレンシングする遺伝子のプロモーター領域と配列同一性を共有する。ｈｐＲＮＡが、相同プロモーター領域と相互作用できる短鎖ＲＮＡへとプロセシングされることで、分解又はメチル化がトリガーされサイレンシングがもたらされ得る（Aufsatz,et al., (2002) PNAS 99(4):16499-16506、Mette,et al., (2000) EMBO J. 19 (19):5194-5201）。

【0100】

アンチセンス抑制： 本発明のいくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現の阻害は、アンチセンス抑制によって得ることができる。アンチセンス抑制のために、発現カセットは、標的ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡの全部又は一部に相補的なＲＮＡ分子を発現するように設計されている。アンチセンスＲＮＡ分子の過剰発現は、天然遺伝子の発現の低下をもたらし得る。したがって、アンチセンス抑制用の発現カセットで形質転換させた複数の細胞株をスクリーニングして、標的ポリペプチドの発現の阻害が最も大きい細胞株を同定する。

【0101】

アンチセンス抑制に使用するためのポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードする配列の相補鎖の全部又は一部、標的ポリペプチド転写物の５’及び／又は３’非翻訳領域の相補鎖の全部又は一部、又はコード配列と、標的ポリペプチドをコードする転写産物の非翻訳領域との両方の相補鎖の全部又は一部に対応し得る。更に、アンチセンスポリヌクレオチドは、標的配列に対して完全に相補的（すなわち、標的配列の相補鎖と１００％同一）であってもよく、又は部分的に相補的（すなわち、標的配列の相補鎖と１００％未満の同一性）であってもよい。アンチセンス抑制は、同じ細胞において複数のタンパク質の発現を阻害するために使用され得る。更に、アンチセンスヌクレオチドの一部を使用して、標的遺伝子の発現を妨害することもできる。概して、少なくとも５０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、３００個、５００個、５５０個、５００個、５５０個以上のヌクレオチドを使用できる。アンチセンス抑制を使用して植物の内在性遺伝子の発現を阻害する方法は、例えば、Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1753及び米国特許第５，７５９，８２９号明細書に記載されており、これらは参照により本明細書に援用される。アンチセンス抑制の効率は、発現カセットの、アンチセンス配列に対して３’末端側にはポリ-ｄｔ領域、及び５’末端側にはポリアデニル化シグナルを含めることによって高めることができる。米国特許出願公開第２００２００５８８１５号明細書を参照されたい。

【0102】

二本鎖ＲＮＡ干渉： 本発明のいくつかの実施形態において、標的ポリペプチドの発現の阻害は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉によって得ることができる。ｄｓＲＮＡ干渉の場合、共抑制に関して上述したようなセンスＲＮＡ分子と、当該センスＲＮＡに対して完全に又は部分的に相補的であるアンチセンスＲＮＡ分子とは、同じ細胞で発現され、対応する内在性メッセンジャーＲＮＡの発現の阻害をもたらす。

【0103】

センス分子及びアンチセンス分子の発現は、センス配列及びアンチセンス配列の両方を含むように発現カセットを設計することによって達成できる。あるいは、別個の発現カセットをセンス配列及びアンチセンス配列に使用してもよい。次いで、ｄｓＲＮＡ干渉用の発現カセット又は複数の発現カセットで形質転換させた複数の細胞株をスクリーニングして、標的ポリペプチドの発現の阻害が最も大きい細胞株を同定する。ｄｓＲＮＡ干渉を使用して植物の内在性遺伝子の発現を阻害する方法は、Waterhouse, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13965、Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1753、及び国際公開第９９／５９０２９号、国際公開第９９／５３０５０号、国際公開第９９／６１６３１号、及び国際公開第００／５９０３５号に記載されている。

【0104】

ヘアピンＲＮＡ干渉及びイントロン含有ヘアピンＲＮＡ干渉： 本明細書のいくつかの実施形態では、１種以上の標的ポリペプチドの発現の阻害は、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）干渉又はイントロン含有ヘアピンＲＮＡ（ｉｈｐＲＮＡ）干渉によって得ることができる。これらの方法は、内在性遺伝子の発現の阻害において非常に効率的である。Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 5:29-38及び上記文献に引用されている参考文献を参照されたい。

【0105】

ｈｐＲＮＡ干渉の場合、発現カセットは、自身とハイブリダイズして一本鎖ループ領域及び塩基対ステムを含むヘアピン構造を形成するＲＮＡ分子を発現するように設計される。塩基対ステム領域は、発現が阻害される遺伝子をコードする内在性メッセンジャーＲＮＡの全部又は一部に対応するセンス配列と、上記センス配列に完全に又は部分的に相補的であるアンチセンス配列とを含む。したがって、分子の塩基対ステム領域が、全般的に、ＲＮＡ干渉の特異性を決定する。ｈｐＲＮＡ分子は、内在性遺伝子の発現を阻害する効率が高く、当該分子が誘導するＲＮＡ干渉は、その後の世代の植物に遺伝する。例えば、Chuang and Meyerowitz, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5985-5990、Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731、及びWaterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 5:29-38を参照されたい。ｈｐＲＮＡ干渉を使用して遺伝子の発現を阻害又はサイレンシングする方法は、例えば、Chuang and Meyerowitz, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5985-5990、Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731、Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 5:29-38、Pandolfini, et al., BMC Biotechnology 3:7、及び米国特許出願公開第２００３０１７５９６５号明細書に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に援用される。インビボで遺伝子発現をサイレンシングするためのｈｐＲＮＡ構築物の効率に関する一過性アッセイは、Panstruga, et al., (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-150記載されており、これは参照により本明細書に援用される。

【0106】

ｉｈｐＲＮＡの場合、干渉分子はｈｐＲＮＡと同じ一般構造を有するが、ＲＮＡ分子は、ｉｈｐＲＮＡを発現する細胞内でスプライシングできるイントロンを更に含む。イントロンの使用は、スプライシング後のヘアピンＲＮＡ分子におけるループのサイズを最小限に抑えて干渉の効率を高める。例えば、Smith, et al., (2000) Nature 507:319-320を参照されたい。実際、Smith et al.は、ｉｈｐＲＮＡによる干渉を使用して、内在性遺伝子の発現が１００％抑制されることを示している。ｉｈｐＲＮＡ干渉を使用して植物の内在性遺伝子の発現を阻害する方法は、例えば、Smith, et al., (2000) Nature 507:319-320、Wesley, et al., (2001) Plant J. 27:581-590、Wang and Waterhouse, (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:156-150、Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 5:29-38、Helliwell and Waterhouse, (2003) Methods 30:289-295、及び米国特許出願公開第２００３０１８０９５５号明細書に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に援用される。

【0107】

ｈｐＲＮＡ干渉のための発現カセットはまた、センス配列及びアンチセンス配列が内在性ＲＮＡに対応しないように設計されてもよい。この実施形態では、センス配列及びアンチセンス配列は、標的遺伝子の内在性メッセンジャーＲＮＡの全部又は一部に対応するヌクレオチド配列を含むループ配列に隣接する。したがって、ＲＮＡ干渉の特異性を決定するのは、このループ領域である。例えば、参照により本明細書に援用される国際公開第０２／００９０５号を参照されたい。

【0108】

アンプリコンによる干渉： アンプリコン発現カセットは、植物ウイルスに由来する配列を含み、当該配列は、標的遺伝子の全部又は一部を含むが、概して天然のウイルス遺伝子の全部を含むわけではない。発現カセットの転写産物中に存在するウイルス配列により、転写産物が自身の複製を指示することが可能になる。アンプリコンによって産生される転写産物は、標的配列（すなわち、標的ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡ）に対してセンス又はアンチセンスのいずれかであり得る。アンプリコンを使用して植物の内在性遺伝子の発現を阻害する方法は、例えば、Angell and Baulcombe, (1997) EMBO J. 16:3675-3685、Angell and Baulcombe, (1999) Plant J. 20:357-362、及び米国特許第６，６５６，８０５号明細書に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に援用される。

【0109】

リボザイム： いくつかの実施形態では、本発明の発現カセットによって発現されるポリヌクレオチドは、触媒ＲＮＡである、すなわち標的ポリペプチドのメッセンジャーＲＮＡに特異的なリボザイム活性を有する。したがって、ポリヌクレオチドは、内在性メッセンジャーＲＮＡを分解し、標的ポリペプチドの発現の低減をもたらす。この方法は、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，９８７，０７１号明細書に記載されている。

【0110】

以下に、目的遺伝子を下方制御するために（又は目的遺伝子に核酸の変更を導入するために）使用される方法及びＤＮＡ編集試薬、並びに本開示の特定の実施形態により使用できる、上記方法及びＤＮＡ編集試薬を実施／実装するための試薬の、様々な非限定例を説明する。

【0111】

改変型エンドヌクレアーゼ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）を使用したゲノム編集： このアプローチは、人工的に改変されたヌクレアーゼを使用して、ゲノム中の所望の位置で切断して特異的な二本鎖切断をもたらし、次いで、これを相同配列依存的修復（ＨＤＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪＦ）などの細胞内在性のプロセスによって修復する、逆遺伝学的方法を指す。ＮＨＥＪＦが、二本鎖切断においてＤＮＡ末端を直接つなぎ合わせるのに対し、ＨＤＲは、切断点で欠落したＤＮＡ配列を再生するためのテンプレートとして相同なドナー配列を利用する。ゲノムＤＮＡに特定のヌクレオチドの改変を導入するためには、ＨＤＲの際に、所望の配列を含むドナーＤＮＡ修復テンプレートが存在する必要がある。

【0112】

ゲノム編集は、伝統的な制限エンドヌクレアーゼを使用して実施することはできない。なぜなら、ほとんどの制限酵素が標的として認識するのはＤＮＡ上の数個の塩基対であり、これらの配列は多くの場合、ゲノム全体の数多くの位置で見られることから、所望の位置に限定されない複数の切断が生じるためである。この課題を克服し、部位特異的な一重鎖又は二本鎖の切断を作製するために、これまでにいくつかの異なる部類のヌクレアーゼが発見され、生物工学的に操作されてきた。このようなヌクレアーゼとしては、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が挙げられる。

【0113】

メガヌクレアーゼ： メガヌクレアーゼは、一般に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ-ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ-Ｃｙｓボックスファミリー、及びＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を与える構造的モチーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１つ又は２つのコピーのいずれかを有することを特徴とする。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存されている構造エレメントと、結果としてＤＮＡ認識配列特異性及び触媒活性に関して互いに大きく異なっている。メガヌクレアーゼは、一般に微生物種中に存在し、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するという固有の特性を有していることから、所望の位置での切断の特異性が非常に高い。

【0114】

これを利用して、ゲノム編集において部位特異的な二本鎖切断を作製できる。当業者は、これらの天然のメガヌクレアーゼを使用することができるが、このような天然のメガヌクレアーゼの数は限られる。この課題を克服するために、変異導入法及びハイスループットスクリーニング法を使用して、固有の配列を認識するバリアント型のメガヌクレアーゼが作製されてきた。例えば、様々なメガヌクレアーゼを融合することで、新たな配列を認識するハイブリッド酵素が作製されてきた。

【0115】

あるいは、メガヌクレアーゼの、ＤＮＡと相互作用するアミノ酸を改変して、配列特異的なメガヌクレアーゼを設計できる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号明細書を参照されたい）。メガヌクレアーゼは、例えば、Certo, MT et al. Nature Methods (2012) 9:073-975、米国特許第８，３０４，２２２号明細書、同第８，０２１，８６７号明細書、同第８，１１９，３８１号明細書、同第８，１２４，３６９号明細書、同第８，１２９，１３４号明細書、同第８，１３３，６９７号明細書、同第８，１４３，０１５号明細書、同第８，１４３，０１６号明細書、同第８，１４８，０９８号明細書、又は同第８，１６３，５１４号明細書に記載されている方法を使用して設計することができる。これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。あるいは、部位特異的切断特性を有するメガヌクレアーゼは、商用利用可能な技術、例えばＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）のゲノム編集技術を使用して得ることができる。

【0116】

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ： 異なる２種類の改変型ヌクレアーゼのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、両方とも、標的とした二本鎖を切断させるのに有効であることが証明されている（Christian et al., 2010、Kim et al., 1996、Li et al., 2011、Mahfouz et al., 2011、Miller et al., 2010）。

【0117】

基本的に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの制限エンドヌクレアーゼ技術は、特異的なＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ、一連のジンクフィンガードメイン又はＴＡＬＥリピート配列）に連結された非特異的なＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、ＤＮＡ認識部位と切断部位とが互いに分離した制限酵素が選択される。切断部分を分離し、次いで、ＤＮＡ結合ドメインに連結することによって、所望の配列に対して極めて高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。このような特性を有する例示的な制限酵素として、Ｆｏｋｌがある。更に、Ｆｏｋｌには、ヌクレアーゼ活性を有するのに二量体を形成する必要があるという利点があり、これはすなわち、それぞれのヌクレアーゼパートナーが独特のＤＮＡ配列を認識することで、特異性が著しく増大することを意味する。この効果を増進するために、Ｆｏｋｌヌクレアーゼは、ヘテロ二量体としてのみ機能して触媒活性を高めることができるように改変されている。ヘテロ二量体型の機能性ヌクレアーゼは、望ましくないホモ二量体活性が生じる可能性を回避し、ひいては二本鎖切断の特異性を高める。

【0118】

したがって、例えば、特定の部位を標的とするために、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、対のそれぞれが標的部位の隣接配列と結合するように設計されたヌクレアーゼ対として構築される。ヌクレアーゼは細胞内での一時的な発現時に標的部位と結合し、ＦｏｋＩドメインがヘテロ二量体を形成して、二本鎖の切断がもたらされる。これらの二本鎖切断の、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路による修復は、小さな欠失又は小さな配列挿入をもたらすことが多い。ＮＨＥＪによって行われるそれぞれの修復は固有のものであるため、単一ヌクレアーゼ対の使用により、標的部位に様々な異なる欠失を有する対立遺伝子系列を生成することができる。

【0119】

欠失は、典型的には、数塩基対～数百塩基対の範囲の任意の長さであるが、２対のヌクレアーゼを同時に使用することによって、細胞培養においてより大きな欠失を作り出すことに成功している（Carlson et al., 2012、Lee et al., 2010）。更に、標的領域に対して相同性を有するＤＮＡのフラグメントをヌクレアーゼ対と共に導入した場合には、二本鎖切断は相同配列依存的修復によって修復されて、特異的な改変を生じ得る（Li et al., 2011、Miller et al., 2010、Urnov et al., 2005）。

【0120】

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮのヌクレアーゼ部分はいずれも類似した特性を有するが、これらの改変型ヌクレアーゼは、それらのＤＮＡ認識ペプチドにおいて違いがある。ＺＦＮは、Ｃｙｓ２-Ｈｉｓ２型のジンクフィンガーを利用し、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥを利用する。これらのＤＮＡ認識ペプチドのドメインは、いずれも天然ではそれらのタンパク質との組み合わせとして見られるという特徴を有する。Ｃｙｓ２-Ｈｉｓ２型のジンクフィンガーは、典型的には３ｂｐ離れてリピートしており、核酸と相互作用する様々なタンパク質との多様な組み合わせが見出されている。一方、ＴＡＬＥは、アミノ酸と、認識されたヌクレオチド対との間に１対１の認識比を有するリピートが見出されている。ジンクフィンガー及びＴＡＬＥは両方ともリピートパターンで生じることから、多様な配列特異性を作り出すために様々な組合せを試すことができる。部位特異的なジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチとしては、とりわけ、例えば、モジュラーアセンブリ（トリプレット配列と関連付けられたジンクフィンガーを、必要な配列を覆うように連続して結合する）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメインとトリプレットヌクレオチドとの低ストリンジェンシーでの選択と、それに続く、細菌系におけるペプチド組み合せと最終標的との高ストリンジェンシーでの選択）、及び細菌のジンクフィンガーライブラリーのワンハイブリッドスクリーニングなどが挙げられる。ＺＦＮは設計することもでき、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）社（カリフォルニア州、リッチモンド）から商業的に入手することもできる。

【0121】

ＴＡＬＥＮを設計及び入手する方法は、例えば、例えば、Reyon et al. Nature Biotechnology 2012 May, 30(5):460-5、Miller et al. Nat Biotechnol. (2011) 29:143-148、Cermak et al. Nucleic Acids Research (2011) 39(12):e82及びZhang et al. Nature Biotechnology (2011) 29(2):149-53に記載されている。ゲノム編集用途のＴＡＬ構築物及びＴＡＬＥＮ構築物を設計するために最近開発された、Ｍｏｊｏ Ｈａｎｄと名付けられたウェブベースのプログラムが、メイヨークリニックによって発表されている（ｗｗｗ．ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ．ｏｒｇからアクセス可能）。ＴＡＬＥＮは設計することもでき、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）社（カリフォルニア州、リッチモンド）から商業的に入手することもできる。

【0122】

Ｔ-ＧＥＥ系（標的遺伝子のゲノム編集エンジン）： インビボにおいて標的細胞内で集合し、所定の標的核酸配列と相互作用することができる、ポリペプチド部分と特異性付与核酸（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＳＣＮＡ）とを含有するプログラム可能な核タンパク質分子複合体が提供される。プログラム可能な核タンパク質分子複合体は、標的核酸配列内の標的部位を特異的に改変及び／若しくは編集すること、並びに／又は標的核酸配列の機能を改変することができる。核タンパク質組成物は、（ａ）ポリヌクレオチド分子であって、キメラポリペプチドをコードし、（ｉ）標的部位を改変することができる機能性ドメインと（ｉｉ）特異性付与核酸と相互作用することができる連結ドメインとを含む、ポリヌクレオチド分子、及び（ｂ）特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）であって、（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸領域に相補的なヌクレオチド配列と（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することができる認識領域とを含む、特異性付与核酸、を含む。この組成物は、特異性付与核酸及び標的核酸の塩基対合を通して、高い特異性と分子複合体の標的核酸への結合能力とにより、所定の標的核酸配列を正確に、確実にコスト効率よく改変することを可能にする。組成物は、遺伝毒性が低く、モジュール式に集合し、カスタマイズせずに単一のプラットフォームを利用し、専門のコア施設外で独立して使用するのに実用的であり、開発期間が短く低コストである。

【0123】

ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ系（本明細書では「ＣＲＩＳＰＲ」とも称する）： 多くの細菌及び古細菌は、侵入してきたファージ及びプラスミドの核酸を分解できる内在性ＲＮＡベースの適応免疫系を含む。上記の系は、ＲＮＡ成分を産生する、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）のヌクレオチド配列と、タンパク質成分をコードするＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子とからなる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルス及びプラスミドのＤＮＡに相同な短いストレッチを含み、Ｃａｓヌクレアーゼに対応する病原体の相補的核酸を分解するように指示するためのガイドとして働く。Streptococcus pyogenesのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の研究では、３種の構成要素である、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に相同な２０塩基対を含有するｃｒＲＮＡ、及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が、ＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、これら３つがそろえば、配列特異的なヌクレアーゼ活性には十分であることが示されている（Jinek et al. Science (2012) 337:816-821）。

【0124】

更に、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合体で構成される合成キメラ型のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、インビトロにおいてｃｒＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡを切断するようにＣａｓ９に指示できることが実証された。Ｃａｓ９を合成ｇＲＮＡと併せて一過的に発現させることで、標的化された二本鎖切断（ＤＳＢ）を多様な種においてもたらすことができることも実証された（Cho et al., 2013、Cong et al., 2013、DiCarlo et al., 2013、Hwang et al., 2013a,b、Jinek et al., 2013、Mali et al., 2013）。

【0125】

ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）という２種の異なる構成要素を含有する。

【0126】

ｇＲＮＡは、典型的には、標的とする相同配列（ｃｒＲＮＡ）と、当該ｃｒＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼに連結する内在性細菌ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせを単一のキメラ転写物としてコードしている、２０塩基の配列である。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｇＲＮＡ配列と相補的なゲノムＤＮＡとの間の塩基対合によって標的配列へ動員される。Ｃａｓ９の結合を成功させるためには、ゲノムの標的配列が、標的配列の直後に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も含有している必要がある。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合により、Ｃａｓ９がゲノム上の標的配列に局在する結果、Ｃａｓ９はＤＮＡの両鎖を切断して二本鎖切断を生じさせることができる。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって生じる二本鎖切断は相同組み換え又はＮＨＥＪを経ることができ、ＤＮＡ修復中には特異的な配列改変を受けやすい。

【0127】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能ドメインであるＲｕｖＣ及びＨＮＨを有しており、この各々が異なるＤＮＡ鎖を切断する。これらドメインの両方が活性なものである場合、Ｃａｓ９はゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断をもたらす。

【0128】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの大きな利点は、この系が、高い効率性と、合成ｇＲＮＡを容易に作製する能力とが結びついている点にある。この利点から、異なるゲノム部位での改変を標的とするように、及び／又は同じ部位での異なる改変を標的とするように、容易に変更可能な系が得られる。更に、複数の遺伝子を同時に標的とすることができるプロトコルが確立されている。変異を保有する細胞のほとんどは、標的とする遺伝子に両アレル変異がある。

【0129】

しかしながら、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ標的配列との間の塩基対合相互作用における見かけの柔軟性によって、標的配列との一致（マッチ）が不完全でもＣａｓ９による切断は可能である。

【0130】

ＲｕｖＣ-又はＨＮＨ-のいずれかの単一の不活性触媒ドメインを含有する改変型Ｃａｓ９酵素は、「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性ヌクレアーゼドメインを１つのみ有するＣａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの一方の鎖だけを切断し、一本鎖切断又は「ニック」を生成する。一本鎖切断又はニックは、通常、無傷の相補的ＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用するＨＤＲ経路により迅速に修復される。しかしながら、Ｃａｓ９ニッカーゼにより２つの近接した両鎖に導入されたニックは、二本鎖切断として扱われ、しばしば「ダブルニック」ＣＲＩＳＰＲ系と呼ばれる。ダブルニックは、標的遺伝子に対し所望する効果に応じて、ＮＨＥＪ又はＨＤＲのいずれかによって修復できる。したがって、特異性とオフターゲット効果の減少とが非常に重要である場合、それぞれの標的配列がごく近接し、かつゲノムＤＮＡの対向鎖上に位置する２種類のｇＲＮＡを設計し、Ｃａｓ９ニッカーゼを用いてダブルニックを生じさせると、オフターゲット効果が減少される。しかし、いずれか１種類のｇＲＮＡで生じるニックのみでは、ゲノムＤＮＡに変化は生じない。

【0131】

不活性な触媒ドメインを２つ含有する改変型Ｃａｓ９酵素（ｄｅａｄ Ｃａｓ９又はｄＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ活性は有していないものの、尚もｇＲＮＡの特異性に基づいてＤＮＡに結合することができる。この不活性酵素であるｄＣａｓ９を既知の調節ドメインと融合させれば、遺伝子発現を活性化又は抑制するＤＮＡ転写調節因子のプラットフォームとして利用することができる。例えば、ｄＣａｓ９がゲノムＤＮＡ中の標的配列に単独で結合しても、遺伝子の転写に干渉し得る。

【0132】

Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡを特異的な部位で切断するためには、ｇＲＮＡと、標的とするポリヌクレオチド遺伝子配列中のｇＲＮＡ標的配列の直後にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とが存在する必要がある。ＰＡＭは、ｇＲＮＡ標的配列の３’末端に位置するが、ｇＲＮＡの一部ではない。異なるＣａｓタンパク質は、異なるＰＡＭを必要とする。したがって、ｇＲＮＡによる特異的な標的ポリヌクレオチド配列の選択は、概して、使用される組み換えＣａｓタンパク質に基づいている。S. pyogenesのＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系のＰＡＭは、５-ＮＲＧ-３’であり（式中、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかである）、ヒト細胞におけるこの系の特異性を特徴付ける。S. aureusのＰＡＭはＮＮＧＲＲ（配列番号１５）である。Streptococcus pyogenes ＩＩ型の系は、天然では「ＮＧＧ」配列（式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得る）の使用を好むが、改変した系では「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列も許容する。同様に、Neisseria meningitidis由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は、通常、ＮＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号１６）の天然のＰＡＭを有するが、高度に縮重したＮＮＮＮＧＮＮＮ（配列番号１７）ＰＡＭなどの様々なＰＡＭに対して活性を有する。

【0133】

ｇＲＮＡは、その後にＰＡＭ配列が続く、標的ポリヌクレオチド遺伝子配列上の標的配列に対応する、「ｇＲＮＡガイド配列」又は「ｇＲＮＡ標的配列」を含む。

【0134】

ｇＲＮＡは、ポリヌクレオチド配列の５’末端に「Ｇ」を含み得る。ｇＲＮＡをＵ６プロモーターの制御下で発現させる場合、５’末端に「Ｇ」が存在することが好ましい。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、様々な長さのｇＲＮＡを使用し得る。ｇＲＮＡは、その後にＰＡＭ配列が続く、標的カスパーゼ６のＤＮＡ配列を少なくとも１０塩基、少なくとも１１塩基、少なくとも１２塩基、少なくとも１３塩基、少なくとも１４塩基、少なくとも１５塩基、少なくとも１６塩基、少なくとも１７塩基、少なくとも１８塩基、少なくとも１９塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２１塩基、少なくとも２２塩基、少なくとも２３塩基、少なくとも２４塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも３０塩基、又は少なくとも３５塩基含んでもよい。「ｇＲＮＡガイド配列」又は「ｇＲＮＡ標的配列」は、少なくとも１７塩基長（１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基）、好ましくは１７～３０塩基長、より好ましくは１８～２２塩基長であり得る。一実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、１０～４０塩基長、１０～３０塩基長、１２～３０塩基長、１５～３０塩基長、１８～３０塩基長、又は１０～２２塩基長である。ＰＡＭ配列は、「ＮＧＧ」であってもよく、式中、「Ｎ」は、任意のヌクレオチドであり得る。ｇＲＮＡは、ＰＡＭ（例えば、ＮＧＧ）配列のすぐ上流の（連続した、隣接した、５’末端の）標的遺伝子の任意の領域を標的とし得る。

【0135】

ｇＲＮＡガイド配列と標的とする遺伝子上のＤＮＡ配列とが完全にマッチするのが好ましいが、ｇＲＮＡと、標的とする遺伝子上のｇＲＮＡ標的ポリヌクレオチド配列の相補鎖とのハイブリダイゼーションが尚も可能であるならば、ｇＲＮＡガイド配列と目的の遺伝子配列上の標的配列との間のミスマッチは許容される。標的配列の適切な認識には、ｇＲＮＡ中の８～１２個の連続するヌクレオチドからなるシード配列が、ｇＲＮＡ標的配列の対応する部分と完全にマッチすることが好ましい。ガイド配列の残りの部分が１つ以上のミスマッチを含んでもよい。概して、ｇＲＮＡ活性は、ミスマッチの数と逆相関する。好ましくは、本発明のｇＲＮＡは、対応するｇＲＮＡ標的遺伝子配列（ＰＡＭは除く）に関して７つのミスマッチ、６つのミスマッチ、５つのミスマッチ、４つのミスマッチ、３つのミスマッチ、より好ましくは２つのミスマッチ、又はそれより少ないミスマッチを含み、更により好ましくはミスマッチがない。好ましくは、ｇＲＮＡ核酸配列は、目的遺伝子中のｇＲＮＡ標的ポリヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％同一である。当然のことながら、ｇＲＮＡガイド配列のヌクレオチドの数が少ないほど、許容されるミスマッチの数は少ない。結合親和性は、マッチしているｇＲＮＡとＤＮＡとの組み合わせの合計に依存すると考えられる。

【0136】

本発明のパッチ／ドナー配列を適切な位置に導入することができるものであるならば、標的核酸配列中で任意のｇＲＮＡガイド配列を選択することができる。したがって、本発明のｇＲＮＡガイド配列又は標的配列は、遺伝子のコード領域又は非コード領域（すなわち、イントロン又はエクソン）内にあり得る。

【0137】

一実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。

【0138】

本明細書で使用する場合、「ｓｇＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連の系（Ｃａｓ）と併せて使用される単一のガイドＲＮＡを指す。ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合体であり、所望の標的部位に対して配列が相補的なヌクレオチドを含有する。Jinek et al., "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity" Science 337 (6096):816-821 (2012)。ｓｇＲＮＡが標的部位とワトソン・クリックの塩基対合をすることで、Ｒループが形成される。Ｒループと機能的ＰＡＭとが連携すると、ＤＮＡを切断させるか、ヌクレアーゼ欠損型Ｃａｓ９の場合は、その遺伝子座のＤＮＡに結合することができる。

【0139】

標的配列を選択及び／又は設計するのに役立つ公に利用可能なツール、並びにバイオインフォマティクスによって決定された、様々な種の様々な遺伝子についての固有のｇＲＮＡのリストは数多く存在し、例えば、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ-ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ-ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノムにおける特異的Ｃａｓ９標的を同定するためのＦｌｅｘｉｂｌｅアルゴリズム、及びＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒがある。

【0140】

本開示で使用できるｇＲＮＡの非限定的な例としては、以下の実施例の項に記載されているものが挙げられる。

【0141】

ＣＲＩＳＰＲ系を使用するためには、ｇＲＮＡ及びＣＡＳエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の両方を標的細胞内で発現させる必要がある。挿入ベクターは、単一のプラスミド上のカセット、又は２種類の別個のプラスミドにより発現されたカセットのいずれも含有できる。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ社（０２１３９ マサチューセッツ州ケンブリッジ、７５シドニーストリート Ｓｕｉｔｅ ５５０Ａ）製のｐｘ３３０プラスミドなどが市販されている。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）-ガイドＲＮＡ技術の使用及び植物ゲノムを改変するためのＣａｓエンドヌクレアーゼの使用は、少なくとも、Svitashev et al. 2015, Plant Physiology, 169 (2):931-945、Kumar and Jain, 2015, J Exp Bot 66:47-57、及び米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号明細書にも開示されている。これらの文献はその全体が参照により本明細書に具体的に援用される。ＤＮＡ編集を行うためにｇＲＮＡと共に使用できるＣａｓエンドヌクレアーゼとしては、限定されるものではないが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、Ｃｐｆ１（Zetsche et al., 2015, Cell. 163(3):759-71）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３（Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5; 60(3):385-97）が挙げられる。

【0142】

「ヒット・エンド・ラン（Ｈｉｔ ａｎｄ ｒｕｎ）」又は「イン-アウト（ｉｎ-ｏｕｔ）」は、２工程の組み換え手順を伴う。第１の工程では、ポジティブ選択マーカー／ネガティブ選択マーカーのデュアルカセットを含む挿入型ベクターを使用して、所望の配列変更を導入する。挿入ベクターは、標的遺伝子座に対して相同性を有する単一の連続領域を含有し、目的の変異を保有するように改変される。この標的構築物を、相同領域内の１箇所で制限酵素により線状にし、エレクトロポレーション法により細胞内に導入してポジティブ選択を行い、相同組み換え体を単離する。これらの相同組み換え体は、選択カセットを含むベクター配列が介在することで分離されている局所重複を含有する。第２の工程では、標的クローンをネガティブ選択に供して、重複配列の染色体間の組み換えにより選択カセットを失った細胞を同定する。局所的組み換えイベントによって重複は除去され、対立遺伝子は、組み換え部位に応じ、導入された変異を保持するか、又は野生型に戻るかのいずれかとなる。最終結果では、何らかの外来性配列を保持させずに所望の改変が導入されている。

【0143】

「二重置換」又は「タグ及び交換」戦略は、ヒット・エンド・ランアプローチと同様の２工程の選択手順を伴うが、２種の異なる標的構築物の使用を必要とする。第１の工程では、３’側及び５’側にホモロジーアームを有する標準的な標的ベクターを使用して、変異を導入する箇所の近傍にポジティブ／ネガティブ選択用のデュアルカセットを挿入する。エレクトロポレーション及びポジティブ選択後、相同性から標的としたクローンを同定する。次に、所望の変異を含む相同領域を含有する第２の標的ベクターを標的クローンにエレクトロポレーションし、ネガティブ選択を行って選択カセットを除去し、変異を導入する。最終的な対立遺伝子は、不要の外来性配列は削除されていながらも所望の変異を含む。

【0144】

部位特異的リコンビナーゼ-Ｐ１バクテリオファージに由来するＣｒｅリコンビナーゼ及び酵母Saccharomyces cerevisiaeに由来するＦｌｐリコンビナーゼは、固有の３４塩基対のＤＮＡ配列（それぞれ、「Ｌｏｘ」及び「ＦＲＴ」と名付けられている）をそれぞれ認識する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼであり、Ｃｒｅリコンビナーゼ又はＦｌｐリコンビナーゼのそれぞれの発現の際に、部位特異的組み換えにより、Ｌｏｘ部位又はＦＲＴ部位のいずれかに隣接する配列を容易に除去することができる。例えば、Ｌｏｘ配列は、１３塩基対の逆位反復領域が隣接した８塩基対の非対称のスペーサー領域から構成される。Ｃｒｅは、１３塩基対の逆位反復領域への結合並びにスペーサー領域内での鎖の切断及び再ライゲーションを触媒することによって、３４塩基対のｌｏｘＤＮＡ配列を組み換える。スペーサー領域中にＣｒｅによりもたらされた、ＤＮＡの段違い切断を６塩基対で分離することにより、同一の重複領域を有する組み換え部位のみを確実に組み換えるための相同性センサーとして機能する重複領域が得られる。

【0145】

基本的に、部位特異的リコンビナーゼ系は、相同組み換え後に選択カセットを除去する手段を提供する。この系はまた、一時的又は組織特異的な様式で不活性化又は活性化することのできる、条件付の改変を施した対立遺伝子の作製も可能にする。注目すべきは、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＦｌｐリコンビナーゼが、Ｌｏｘ又はＦＲＴの「スカー（scar）」を３４塩基対残すことである。残留するＬｏｘ部位又はＦＲＴ部位は、典型的には、改変された遺伝子座のイントロン又は３’ＵＴＲ内に残されるが、最新のエビデンスでは、通常はこれらの部位が遺伝子の機能を大きく妨げることはないことが示唆されている。

【0146】

したがって、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組み換え及びＦｌｐ／ＦＲＴ組み換えは、目的の変異、２つのＬｏｘ配列又はＦＲＴ配列、及び典型的には、２つのＬｏｘ配列又はＦＲＴ配列の間に配置された選択カセットを含有し、３’ホモロジーアーム及び５’ホモロジーアームを有する、標的ベクターの導入を伴う。ポジティブ選択を実施し、標的変異を含む相同組み換え体を同定する。Ｃｒｅ又はＦｌｐの一過性発現をネガティブ選択と併用すると、選択カセットの切除が生じ、カセットを欠失した細胞が選択される。最終的な標的対立遺伝子は、外来性配列のＬｏｘ又はＦＲＴのスカーを含有する。

【0147】

本発明のこの態様の核酸試薬は、目的とする任意の核酸を標的とし得る。

【0148】

一実施形態では、目的とする核酸は、遺伝子の調節領域である。別の実施形態では、目的とする核酸は、遺伝子のタンパク質コード領域である。

【0149】

特定の実施形態によれば、目的遺伝子は、グリコシル化酵素である。

【0150】

グリコシル化酵素の例は、キシロシルトランスフェラーゼ及び／又はフコシルトランスフェラーゼを含む。

【0151】

本明細書で使用する場合、「キシロシルトランスフェラーゼ」は、「ＸｙｌＴ」と略され、ＧＤＰ-キシロースからＮ-グリカンのコア内のβ結合したバイセクティングマンノースへのキシロースの転移を触媒すると同時に、それをβ-１，２グリコシド結合と連結する酵素を指す（ＥＣ２．４．２．３８）。

【0152】

本明細書で使用する場合、「フコシルトランスフェラーゼ」は、「ＦｕｃＴ」と略され、ＧＤＰ-フコースから、タンパク質に結合したＮ-グリカンのコアのα結合したＮ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）への、フコースの転移を触媒する酵素を指す（ＥＣ２．４．１．２１４）。

【0153】

N. tabacumは、２種のＸｙｌＴ遺伝子と、５種のＦｕｃＴ遺伝子とを含む。当該遺伝子には、以下のものが含まれる。
Ｎｔａｂ-ＢＸ＿ＡＷＯＫ-ＳＳ５９６（Ｎｔａｂ-ＸｙｌＴ-Ａ、配列番号１８）
Ｎｔａｂ-ＢＸ＿ＡＷＯＫ-ＳＳ１２７８４（Ｎｔａｂ-ＸｙｌＴ-Ｂ、配列番号１９）
Ｎｔａｂ-Ｋ３２６＿ＡＷＯＪ-ＳＳ１９７５２（Ｎｔａｂ-ＦｕｃＴ-Ａ、配列番号２０）
Ｎｔａｂ-ＢＸ＿ＡＷＯＫ-ＳＳ１６８８７（Ｎｔａｂ-ＦｕｃＴ-Ｂ、配列番号２０）
Ｎｔａｂ-Ｋ３２６＿ＡＷＯＪ-ＳＳ１６７４４（Ｎｔａｂ-ＦｕｃＴ-Ｃ、配列番号２１）。
Ｎｔａｂ-Ｋ３２６＿ＡＷＯＪ-ＳＳ１９６６１（Ｎｔａｂ-ＦｕｃＴ-Ｄ、配列番号２２）
Ｎｔａｂ-Ｋ３２６＿ＡＷＯＪ-ＳＳ１９８４９（Ｎｔａｂ-ＦｕｃＴ-Ｅ、配列番号２３）

【0154】

上記の遺伝子をサイレンシングするために使用され得るｃｒＲＮＡ配列の例を、図１４に記載している。

【0155】

上述のように、本発明のこの態様の核酸構築物は、ｇＲＮＡ（本明細書において「構築物削除用ｇＲＮＡ」と称する）及びＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを更にコードする。これらの構成要素のそれぞれは、本明細書で上に記載されている。

【0156】

本明細書で使用される場合、「構築物削除用ｇＲＮＡ」という用語は、構築物自体の少なくとも１つの配列を特異的に標的とし、かつ形質転換細胞のゲノム配列は標的としない、ｇＲＮＡ配列を指す。構築物削除用ｇＲＮＡは、本明細書で以下に更に記載されるように、必ずしも構築物の配列全体を削除（又は切除）するよう機能するものではないが、構築物の少なくとも一部を除去するように機能する。

【0157】

上述のように、本発明の核酸試薬は、第１のプロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは、形質転換されている細胞をもとに、かつ発現が第２のプロモーターの発現より前に起こるように選択される（本明細書に更に記載のとおり）。

【0158】

特定の実施形態によれば、形質転換される細胞の種類は、植物細胞である。この実施形態では、植物で発現可能なプロモーターが企図される。

【0159】

本明細書で使用される場合、「植物で発現可能な」という語句は、プロモーター配列に付加された、又はプロモーター配列に含有された、任意の追加の調節エレメントを含むプロモーター配列を指し、植物の細胞、組織又は器官、好ましくは単子葉植物又は双子葉植物の細胞、組織又は器官において、発現を少なくとも、誘導し、もたらし、活性化し又は増強できる。

【0160】

これには、植物由来のプロモーターだけでなく、植物細胞における転写を指示できる非植物由来のいかなるプロモーターも含まれる。すなわち、ウイルス又は細菌由来のプロモーター、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ（Harpster et al. (1988) Mol Gen Genet. 212(1):182-90）、ＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｕ６）、サブタレニアンクローバーウイルスプロモーターのＮＯ．４若しくはＮＯ．７（国際公開第９６０６９３２号）、又は、Ｔ-ＤＮＡ遺伝子プロモーターであり、更には組織特異的又は器官特異的プロモーター、例えば、限定されるものではないが、種子特異的プロモーター（例えば国際公開第８９／０３８８７号）、器官原基特異的プロモーター（An et al. (1996) Plant Cell 8(1):15-30）、茎特異的プロモーター（Keller et al., (1988) EMBO J. 7(12):3625-3633）、葉特異的プロモーター（Hudspeth et al. (1989) Plant Mol Biol. 12:579-589）、葉肉特異的プロモーター、根特異的プロモーター（Keller et al. (1989) Genes Dev. 3:1639-1646）、塊茎特異的プロモーター（Keil et al. (1989) EMBO J. 8(5):1323-1330）、維管束組織特異的プロモーター（Peleman et al. (1989) Gene 84:359-369）、雄ずい選択的プロモーター（国際公開第８９／１０３９６号、国際公開第９２／１３９５６号）、裂開領域特異的プロモーター（国際公開第９７／１３８６５号）である。

【0161】

前述のように、核酸試薬に作動可能に連結されているプロモーター（本明細書では第１のプロモーターと称する）は、当該プロモーターからの転写が前述の第２のプロモーター（このプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、又は、構築物削除用ｇＲＮＡに、作動可能に連結されている）からの転写開始前に生じるように選択される。

【0162】

（別個の形質転換工程を行わずに）プロモーターの逐次的な活性化をもたらすために、本発明者らは、特定のプロモーター対の使用を企図する。

【0163】

例えば、一例では、第１のプロモーターは構成的プロモーターであり、第２のプロモーターは誘導性プロモーターである。

【0164】

構成的プロモーターの例としては、限定されるものではないが、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡ及び１９Ｓ ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター［Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514］、又はＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター［Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311］が挙げられる。

【0165】

誘導性プロモーターの例としては、限定されるものではないが、光誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、例えば、ダイズのｈｓｐ１７．５-Ｅ又はｈｓｐ１７．３-Ｂ［Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565］、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Zabala M, et al., Cancer Res. 2004, 64(8):2799-804）が挙げられる。

【0166】

特定の実施形態によれば、誘導性プロモーターは、熱ショックプロモーターを含む。

【0167】

特定の実施形態によれば、核酸試薬はＣＲＩＳＰＲを含み、構築物は、構成的プロモーター（例えば、Ｕ６などのＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）に作動可能に連結された少なくとも１つのｇＲＮＡ（標的とする目的遺伝子に結合する）と、構成的プロモーター（例えば、３５Ｓプロモーター）に作動可能に連結されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとを含む。構築物は、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）に作動可能に連結された、構築物除去用のｇＲＮＡを更に含む。

【0168】

別の例として、第１のプロモーター及び第２のプロモーターの両方は、同一ではない誘導性プロモーターであってもよい。

【0169】

別の例として、第１のプロモーターは、生物（例えば、植物）の発生の早期の段階で活性化されるもの、すなわち、発生段階によって弱められる（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）プロモーターであり得る。

【0170】

「植物の発生段階に特異的なプロモーター」という語句は、構成的には発現されないが、植物の特定の発生段階で発現されるプロモーターを指す。すなわち、植物の発生は様々な段階を経るものであり、本発明の文脈において、生殖細胞系は、受精から始まり、胚、栄養シュート頂端分裂組織、花茎シュート頂端分裂組織、葯及び雌ずいの原基、葯及び雌ずい、小胞子母細胞及び大胞子母細胞、並びに大胞子（卵胞）及び小胞子（花粉）の発生を経る、異なる発生段階を通る。

【0171】

植物の発生段階に特異的なプロモーターの例は、国際公開第２００１／０３６５９５（Ａ２）号に開示されており、その内容は本明細書に援用される。当業者は、時系列で交互に活性化されるプロモーターの対を選択することができる。

【0172】

別の例として、第１のプロモーターをより強いプロモーターとし、第２のプロモーターをより弱いプロモーターとして、第１のプロモーターが第２のプロモーターの活性化前に活性化されるようにしてもよい。

【0173】

酵母での発現に関し、強いプロモーターの例は、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターである。酵母での発現に関し、弱いプロモーターの例は、ＹＰＴＩ構成的活性プロモーターである。Sears et al., Yeast 14:783-790 (1998)を参照。哺乳動物細胞での発現に関し、強いプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。細菌での発現に関し、強いプロモーターの例は、ｒｅｃＡプロモーターである。細菌での発現に関し、弱いプロモーターの例は、ａｒａＢＡＤプロモーターである。植物での強力なプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーターが挙げられる。植物における弱いプロモーターの例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）のプロモーター、Ｇ１０-９０プロモーターが挙げられる。

【0174】

核酸試薬がＣＲＩＳＰＲの成分を含まない場合、構築物削除用のｇＲＮＡ及び／又はＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼのいずれかは、第２のタイプのプロモーター（すなわち、核酸試薬に連結したプロモーターの活性化後に活性化されるプロモーター）に作動可能に連結され得ることが理解されよう。一方、核酸試薬がＣＲＩＳＰＲの成分を含む場合、構築物削除用のｇＲＮＡのみが第２のタイプのプロモーターに作動可能に連結されており、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは第１のタイプのプロモーターに作動可能に連結されている。

【0175】

本発明のこの態様の核酸構築物は、上記構築物削除用ｇＲＮＡの少なくとも２つのコピーの標的配列を更に含む。

【0176】

標的配列の少なくとも２つのコピーは、その後切除される構築物の一部に隣接するように配置される。したがって、例えば、構築物上に存在する選択マーカーのみが除去されることが望ましい場合、標的配列の位置は、選択マーカーをコードする配列に隣接するような位置である。全構築物が除去されることが望ましい場合、標的配列の位置は、当該配列が挿入物全体に隣接するような位置である（例えば、ＴＤＮＡベクターでは、標的配列は、左端部のすぐ下流及び右端部のすぐ上流に配置され得る-例えば、図１を参照されたい）。標的配列の２つ以上のコピーを構築物に使用できることは理解されよう。したがって、例えば、本発明者らは、削除される配列のすぐ上流に配置される標的配列の少なくとも２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のコピーと、削除される配列のすぐ上流に配置される標的配列の少なくとも２つ、３つ、４つ以上のコピーとを企図する。好ましくは、複数のコピーは、縦列に配置される。

【0177】

上述のように、本発明の核酸構築物は、任意選択的に、ポジティブ選択マーカー及び／又はネガティブ選択マーカーを含み得る。典型的には、マーカーは、第１のタイプのプロモーター（例えば、構成的プロモーター又は強力なプロモーター）の制御下に置かれ、その例は、本明細書において上記で更に詳述されている。

【0178】

本明細書で使用される場合、「ポジティブ選択マーカー遺伝子」とは、マーカー遺伝子を保有する細胞は選択培地で増殖させるが、マーカー遺伝子を保有しない細胞は増殖させない遺伝子を指す。選択は、選択培地で増殖する（マーカーの獲得を示す）細胞についてのものであり、形質転換体を同定するために使用される。一般的な例は、ＮＰＴ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）などの薬剤耐性マーカーであり、その遺伝子産物は、リン酸化によってカナマイシンを解毒することで、当該薬剤を含有する培地での増殖を可能にする。本発明に関連して使用するための他のポジティブ選択マーカー遺伝子としては、限定されるものではないが、ハイグロマイシン耐性をコードし、ハイグロマイシンの使用によって選択可能なハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Waldron et al, Plant Mol. Biol. 5:103-108）、カナマイシン耐性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８等の使用によって選択可能なｎｅｏ遺伝子（Potrykus et al., 1985）、ビアラホス（バスタ）耐性をコードするｂａｒ遺伝子、改変ＥＰＳＰシンターゼタンパク質をコードすることで（Hinchee et al., 1988）、グリホセート耐性を付与する変異ａｒｏＡ遺伝子、ブロモキシニルに対する耐性を付与する、Klebsiella ozaenae由来のｂｘｎなどのニトリラーゼ遺伝子（Stalker et al., 1988）、イミダゾリノン、スルホニル尿素、又はその他のＡＬＳ阻害物質に対する耐性を付与する変異型アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許出願公開第１５４，２０４号明細書、１９８５）、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子（Thillet et al., 1988）、又は除草剤ダラポンに対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子、酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードし、除草剤ビアラホスの活性成分ホスフィノスリシン（ＰＰＴ）を不活性化する、Streptomyces viridochromogenes由来のｐａｔ遺伝子、或いは５-メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異型アントラニル酸シンターゼ遺伝子が挙げられる。

【0179】

「ネガティブ選択マーカー遺伝子」という語句は、マーカー遺伝子を保有する細胞の選択培地での増殖を妨げるが、マーカー遺伝子を保有しない細胞の増殖は妨げないタンパク質を指す。培地上で増殖する細胞の選択は、選択マーカー遺伝子が削除又は除去された細胞の同定をもたらす。一例は、ＣｏｄＡ（大腸菌シトシンデアミナーゼ）であり、その遺伝子産物は、５-フルオロシトシン（通常は細胞がシトシンを代謝しないため非毒性である）を脱アミン化して毒性の５-フルオロウラシルにする。

【0180】

他のネガティブ選択マーカーとしては、デハロゲナーゼをコードするXanthobacter autotrophicus GJ10のハロアルカンデハロゲナーゼ（ｄｈｌＡ）遺伝子が挙げられ、デハロゲナーゼは、１，２-ジクロロエタン（ＤＣＥ）などのジハロアルカンを加水分解して、ハロゲン化アルコール及び無機ハロゲン化物にする（Naested et al., 1999, Plant J. 18(5):571-6）。

【0181】

本発明の核酸構築物は、細胞を形質転換するために使用される。細胞は、例えば、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞、及び昆虫細胞を含む任意の種類の細胞であり得る。一実施形態では、細胞は、形質転換された細胞（すなわち、細胞株の一部）である。別の実施形態では、細胞は、単離細胞である（すなわち、それらの由来する生物から取り出された細胞である）。特定の実施形態では、単離細胞は懸濁液で培養される。特定の実施形態によれば、細胞は植物細胞であり、任意選択的に、懸濁液中で培養される。

【0182】

本発明の植物細胞は、核酸構築物の発現をもたらすように遺伝子改変することが容易な植物（又はその一部）、好ましくは食用及び／又は非毒性の植物に由来する。

【0183】

本発明のこの態様に従って使用され得る植物の例としては、コケ、藻類、単子葉植物又は双子葉植物、並びにその他の植物が挙げられるがこれらに限定されない。例としては、葉物作物、油料作物、アルファルファ、タバコ、トマト、バナナ、ニンジン、レタス、トウモロコシ、キュウリ、メロン、ジャガイモ、ブドウ及びホワイトクローバーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0184】

植物細胞は、任意選択で、任意の種類の植物細胞、例えば、植物の根細胞（すなわち、植物の根に由来する細胞、植物の根から得られる細胞、又はもともと植物の根をベースとする細胞）、より好ましくは、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞及びニンジン細胞からなる群から選択される植物の根細胞であり得る。

【0185】

特定の実施形態によれば、植物細胞は、ニンジン細胞である。

【0186】

特定の実施形態によれば、植物細胞は、タバコ細胞である。特定の実施形態によれば、タバコ植物の細胞は、ＢＹ-２細胞又はNicotiana Benthamiana細胞である。

【0187】

植物細胞は、いくつかの実施形態の核酸構築物により安定的又は一過性に形質転換され得る。安定的形質転換では、いくつかの実施形態の核酸分子は、植物ゲノムに組み込まれることから、安定な遺伝される形質を示す。一過性形質転換では、核酸分子は、形質転換された細胞によって発現されるが、ゲノム中には組み込まれないことから、一過性の形質を表す。

【0188】

特定の実施形態によれば、植物又は植物細胞は、ＸｙｌＴ遺伝子及びＦｕｃＴ遺伝子の両方に対するサイレンシング試薬（ＣＲＩＳＰＲ構成要素）を発現するように安定的に形質転換される。

【0189】

外来遺伝子を単子葉植物及び双子葉植物の両方に導入するには、様々な方法がある（Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225、Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276）。

【0190】

植物ゲノムＤＮＡへの外来性ＤＮＡの安定した組み込みをもたらす基本的な方法としては、主に以下の２通りのアプローチが挙げられる。
（ｉ）アグロバクテリウムを介した遺伝子導入： Klee et al (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486、Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L.K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p.2-25、Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass.(1989)p.93-112。
（ｉｉ）直接的なＤＮＡの取り込み： Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L.K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p.52-68、プロトプラストに直接ＤＮＡを取り込ませる方法、Toriyama, K.et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074など。植物細胞の短時間の電気ショックによって誘導されるＤＮＡの取り込み：Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384。Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793。植物の細胞又は組織への微粒子銃によるＤＮＡ注入、Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563、McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209、マイクロピペットシステムの使用による方法：Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36、Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217、ガラス繊維又は炭化ケイ素ウイスカーによる培養細胞、胚、又はカルス組織の形質転換、米国特許第５，４６４，７６５号、又は発芽している花粉と共にＤＮＡを直接インキュベーションすることによる方法、DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G.P. and Mantell, S.H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p.197-209、及びOhta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719。

【0191】

アグロバクテリウムシステムは、植物ゲノムＤＮＡに組み込まれる、規定のＤＮＡ（defined DNA）セグメントを含有するプラスミドベクターの使用を含む。植物組織の播種の方法は、植物種及びアグロバクテリウムの送達系に応じて変化する。広く使用されているアプローチは、リーフディスク法であり、この手法は、全植物の分化を開始させるために良好な素材を提供する任意の組織の外植片を用いて行うことができる。Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p.1-9。補助的なアプローチでは、アグロバクテリウム送達系を真空湿潤と組み合わせて用いる。アグロバクテリウム系は、トランスジェニック双子葉植物の作製に特に適している。

【0192】

ＤＮＡを植物細胞に直接導入する方法には様々な方法がある。エレクトロポレーションでは、プロトプラストを、強力な電場に短時間曝露する。マイクロインジェクションでは、非常に小さなマイクロピペットを使用して、ＤＮＡを機械的に細胞に直接注入する。微粒子銃では、ＤＮＡを、硫酸マグネシウム結晶又はタングステン粒子のようなマイクロプロジェクタイル上に吸着させる。マイクロプロジェクタイルは物理的に加速されて細胞又は植物組織に入る。

【0193】

安定した形質転換の後、植物の繁殖を行う。最も一般的な植物の繁殖方法は、種子によるものである。しかしながら、植物はメンデルの法則によって支配される遺伝的分散に従って種をつけるので、種子繁殖による再生には、ヘテロ接合性に起因して収穫物の均一性が欠如するという欠陥がある。基本的に、各種子は遺伝的に異なっており、各々が自身に特有の形質を備えて成長する。したがって、形質転換植物は、再生した植物が親のトランジェニック植物と同一の形質及び特徴を有するように作製することが好ましい。したがって、形質転換植物は、形質転換植物の迅速で一貫した複製を実現する微細繁殖によって再生することが好ましい。

【0194】

微細繁殖は、選択された親植物又は栽培品種から切り出された単一の組織片から新世代の植物を成長させる方法である。この方法は、融合タンパク質を発現する好ましい組織を有する植物の大量複製を可能にする。作製される新世代の植物は、元の植物と遺伝的に同一であり、元の植物の特徴を全て有する。微細繁殖は、短期間で高品質の植物材料を大量生産することができ、元のトランジェニック植物又は形質転換植物の特徴を保持しながら、選択された栽培品種を迅速に増殖させる。植物のクローニングの利点は、植物の増殖速度、並びに作製される植物の品質及び均一性である。

【0195】

微細繁殖は、段階間で培地及び増殖条件の変更が必要な多段階法である。したがって、微細繁殖法は、以下の４つの基本的な段階を伴う。段階１：最初の組織培養、段階２：組織培養物の増殖、段階３：分化及び植物形成、並びに段階４：温室培養及びハードニング。段階１の最初の組織培養では、組織培養物を確立し、汚染がないことを証明する。段階２では、十分な数の組織試料が作製されて作製目標を達成するまで、最初の組織培養物を増殖させる。段階３では、段階２において成長させた組織試料を分割して、個別の小植物に成長させる。段階４では、形質転換された小植物をハードニングのために温室に移して、自然環境で成長できるように、光に対する植物の耐性を徐々に高める。

【0196】

現在は安定的な形質転換が好ましいが、本発明のいくつかの実施形態では、葉の細胞、分裂組織の細胞、又は植物全体の一過的な形質転換も想定される。

【0197】

一過的な形質転換は、上述の直接的なＤＮＡ導入法のいずれか、又は改変した植物ウイルスを用いたウイルス感染によって行うことができる。

【0198】

植物宿主の形質転換に有用であることが示されているウイルスとしては、ＣａＭＶ、ＴＭＶ、ＴＲＶ、及びＢＶが挙げられる。植物ウイルスを使用しての植物の形質転換については米国特許第４，８５５，２３７号明細書（ＢＧＶ）、欧州特許第６７，５５３号明細書（ＴＭＶ）、特開昭第６３-１４６９３号公報（ＴＭＶ）、欧州特許第１９４，８０９号明細書（ＢＶ）、欧州特許第２７８，６６７号明細書（ＢＶ）、及びGluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp.172-189 (1988)に記載されている。国際公開第８７／０６２６１号には、植物を含む多くの宿主での外来ＤＮＡの発現に使用するための偽ウイルス粒子が記載されている。

【0199】

植物に非ウイルス性の外来性核酸配列を導入し、発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記参考文献の他に、Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292、Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311、French et al. Science (1986) 231:1294-1297、及びTakamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76によって実証されている。

【0200】

ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、ウイルス自体に適切な改変を行うことができる。あるいは、外来ＤＮＡを含む所望のウイルスベクターの構築を容易にするために、ウイルスを最初に細菌プラスミドにクローニングすることができる。次いで、ウイルスをプラスミドから切除することができる。ウイルスがＤＮＡウイルスの場合、細菌の複製起点をウイルスＤＮＡに連結させて、これをその後、細菌に複製させることができる。このＤＮＡの転写及び翻訳が、ウイルスＤＮＡをキャプシド化するコートタンパク質を産生する。ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、ウイルスは概して、ｃＤＮＡとしてクローニングし、プラスミドに挿入する。次に、このプラスミドを使用して、構築物の全部を作製する。次に、プラスミドのウイルス配列を転写させ、ウイルス遺伝子を翻訳させて、ウイルスＲＮＡをキャプシド化するコートタンパク質を産生させることによって、ＲＮＡウイルスを産生する。

【0201】

本発明のいくつかの実施形態の構築物に含まれるものなどの、植物に非ウイルス性の外来核酸配列を導入し、発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記参考文献及び米国特許第５，３１６，９３１号明細書に実証されている。

【0202】

一実施形態では、植物ウイルスの核酸であって、天然のコートタンパク質のコード配列が欠失しており、植物宿主での発現、組み換え型植物ウイルスの核酸のパッケージング、及び組み換え型植物ウイルス核酸による宿主の全身感染の確保を可能にする、非天然の植物ウイルスのコートタンパク質コード配列と、非天然のプロモーター、好ましくは非天然のコートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーターとが挿入されている、核酸が提供される。あるいは、タンパク質が産生されるように、コートタンパク質遺伝子内に上記非天然の核酸配列を挿入して、当該遺伝子を不活性化することもできる。組み換え型植物ウイルスの核酸は、１種以上の追加の非天然のサブゲノムプロモーターを含有し得る。それぞれの非天然のサブゲノムプロモーターは、植物宿主中の隣接遺伝子又は核酸配列を転写又は発現させることができ、相互の組み換え及び天然のサブゲノムプロモーターとの組み換えはできない。非天然の（外来）核酸配列は、２つ以上の核酸配列が含まれる場合、天然の植物ウイルスサブゲノムプロモーター又は天然及び非天然の植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接させて挿入され得る。非天然の核酸配列は、宿主植物においてサブゲノムプロモーターの制御下で転写又は発現され、所望の産物を産生する。

【0203】

第２の実施形態では、組み換え型植物ウイルスの核酸は、非天然のコートタンパク質コード配列の代わりに、上記天然のコートタンパク質コード配列が、上記非天然のコートタンパク質のサブゲノムプロモーターのうちの１つに隣接して配置されることを除いて、第１の実施形態と同様に提供される。

【0204】

第３の実施形態では、天然のコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接し、１つ以上の非天然のサブゲノムプロモーターがウイルス核酸に挿入されている、組み換え型植物ウイルスの核酸が提供される。挿入された非天然のサブゲノムプロモーターは、植物宿主において隣接遺伝子を転写又は発現することができ、相互の組み換え及び天然のサブゲノムプロモーターとの組み換えはできない。非天然の核酸配列は、宿主植物において当該配列がサブゲノムプロモーターの制御下で転写又は発現されて所望の産物が産生されるように、非天然の植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入され得る。

【0205】

第４の実施形態では、組み換え型植物ウイルスの核酸は、天然のコートタンパク質コード配列が非天然のコートタンパク質コード配列で置き換えられていることを除いて、第３の実施形態と同様に提供される。

【0206】

ウイルスベクターは、組み換え型植物ウイルスの核酸によってコードされるコートタンパク質によってキャプシド化され、組み換え型植物ウイルスを産生する。組み換え型植物ウイルスの核酸又は組み換え型植物ウイルスは、適切な宿主植物に感染させるために使用される。組み換え型植物ウイルスの核酸は、宿主における複製、宿主の全身への拡散、及び宿主における外来遺伝子（単離された核酸）の転写又は発現による所望のタンパク質の産生が可能である。

【0207】

上記に加えて、本発明のいくつかの実施形態の核酸分子をクロロプラストのゲノムに導入して、クロロプラストでの発現を可能にすることもできる。

【0208】

クロロプラストのゲノムに外来性核酸配列を導入するための技術は公知である。この技術は、以下の手順を伴う。最初に、細胞１個当たりのクロロプラストの数が約１にまで低減するように、植物細胞を化学的に処理する。次いで、少なくとも１つの外来性核酸分子をクロロプラストに導入することを目的として、外来性核酸を微粒子銃によって細胞に導入する。外来性核酸は、クロロプラストに固有の酵素によって容易になされる相同組み換えによってクロロプラストのゲノムに組み込み可能であるように選択される。この目的のために、外来性核酸は、目的遺伝子に加えて、クロロプラストのゲノムに由来する少なくとも１つの核酸ストレッチ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む。更に、外来性核酸は選択マーカーを含み、当該選択マーカーは、逐次的（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）な選択手法により、かかる選択後にクロロプラストのゲノムのコピーの全て又は実質的に全てが外来性核酸を含むことを確実にするよう機能する。この技術に関する更なる詳細は、米国特許第４，９４５，０５０号明細書及び同第５，６９３，５０７号明細書に見られ、これらの特許は参照により本明細書に援用される。こうして、ポリペプチドをクロロプラストのタンパク質発現系によって産生し、クロロプラストの内膜に組み込むことができる。

【0209】

細胞（本発明の核酸を含む）は、目的のタンパク質を発現するように更に遺伝子改変されていてもよいことは理解されるであろう。いくつかの実施形態によれば、目的のポリペプチドは、医薬品である。

【0210】

あるいは又は更に、目的のポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。

【0211】

典型的には、目的のポリペプチドは、異種ポリペプチドである。異種糖タンパク質、すなわち、天然では植物細胞において通常は発現されない糖タンパク質としては、治療薬として使用できる、例えば、モノクローナル抗体及び酵素などの哺乳類又はヒトのタンパク質を挙げることができる。簡便には、外来糖タンパク質を、植物で発現可能なプロモーターと目的の糖タンパク質のコード領域とを含むキメラ遺伝子から発現させてもよく、それにより当該キメラ遺伝子は、一時的に発現される、又は植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。植物細胞における遺伝子発現の方法は、上記している。

【0212】

「異種タンパク質」とは、天然では植物又は植物細胞によって発現されないタンパク質（すなわち、ポリペプチド）であると理解される。これは、植物又は植物細胞によって天然に発現されるタンパク質である相同タンパク質と対照をなす。翻訳後にＮ-グリコシル化を受ける異種ポリペプチド及び相同ポリペプチドを、本明細書では異種糖タンパク質又は相同糖タンパク質と呼ぶ。

【0213】

本発明の方法によって有利に産生できる目的のポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、サイトカイン、サイトカイン受容体、成長因子（例えばＥＧＦ、ＨＥＲ-２、ＦＧＦ-α、ＦＧＦ-β、ＴＧＦ-α、ＴＧＦ-β、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-２、ＮＧＦ）、成長因子受容体が挙げられる。他の例としては、成長ホルモン（例えばヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン）；インスリン（例えば、インスリンＡ鎖及びインスリンＢ鎖）、プロインスリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（例えばＧ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ）；インターロイキン；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及びその受容体（ＶＥＧＦ-Ｒ）、インターフェロン、腫瘍壊死因子及びその受容体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トロンビン、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）；凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及びフォン・ヴィレブランド因子など）、抗凝固因子；組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、カルシトニン、ＣＤタンパク質（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤＩ Ｉａ、ＣＤＩ Ｉｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７１等）、ＣＴＬＡタンパク質（例えばＣＴＬＡ４）；Ｔ細胞及びＢ細胞受容体タンパク質、骨形成タンパク質（ＢＮＰ、例えばＢＭＰ-１、ＢＭＰ-２、ＢＭＰ-３等）、神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン、例えばレンニン、リウマチ因子、ＲＡＮＴＥＳ、アルブミン、リラキシン、マクロファージ抑制タンパク質（例えばＭＩＰ-１、ＭＩＰ-２）、ウイルスタンパク質又は抗原、表面膜タンパク質、イオンチャンネルタンパク質、酵素、調節タンパク質、免疫調節タンパク質、（例えばＨＬＡ、ＭＨＣ、Ｂ７ファミリー）、ホーミング受容体、輸送タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、Ｇ-タンパク質共役受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）、神経調節タンパク質、アルツハイマー病関連タンパク質及びペプチドが挙げられる。融合タンパク質及び融合ポリペプチド、キメラタンパク質及びキメラポリペプチド、並びに前述のタンパク質及びポリペプチドのいずれかのフラグメント若しくは部分、又は変異体、バリアント、若しくは類似体も、本発明の方法によって産生できる好適なタンパク質、ポリペプチド及びペプチドに含まれる。目的のタンパク質は、糖タンパク質であり得る。糖タンパク質の１つのクラスには、例えばワクチンを製造するために使用できるウイルス糖タンパク質、特にサブユニットがある。ウイルスタンパク質のいくつかの例は、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウィルス、ウシヘルペスウィルス、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｉｔｉｏ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどのレトロウイルス、又はパルボウイルス若しくはパポバウイルス、伝染性胃腸炎ウイルスなどのロタウイルス又はコロナウイルス、又はダニ媒介性脳炎ウイルス又は黄熱ウイルスなどのフラビウイルス、風疹ウイルス又は東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、若しくはベネズエラウマ脳炎ウイルスなどのトガウイルス、Ａ型ウイルス肝炎ウイルス又はＢ型肝炎ウイルスなどの肝炎を引き起こすウイルス、ブタコレラウイルスなどのペスチウイルス、又は狂犬病ウイルスなどのラブドウイルスに由来するタンパク質を含む。

【0214】

異種糖タンパク質は、抗体又はそのフラグメントであってもよい。用語「抗体」は組み換え抗体（例えばＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥのクラス）並びに単鎖抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体などの組み換え抗体、並びに多重特異性抗体を指す。用語「抗体」は、前述の全てのフラグメント及び誘導体も指し、更に、エピトープに特異的に結合する能力を保持している、任意の改変又は誘導のなされたそれらのバリアントを含み得る。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートしたタンパク質又は化学的な部分を含み得る。モノクローナル抗体は、標的抗原又はエピトープに選択的に結合できる。抗体としては、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化抗体又はキメラ抗体、ラクダ化抗体、ラクダ科動物抗体（ｃａｍｅｌｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、単鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ジスルフィド結合しているＦｖｓ（ｓｄＦｖ）フラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、合成抗体、及び上記いずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。用語「抗体」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む融合タンパク質も指す。本発明の植物又は植物細胞における、いわゆる二重特異性抗体の産生も想定される（Bostrom J et al (2009) Science 323, 1610-1614）。

【0215】

本発明の範囲に含まれる抗体としては、下記の抗体が挙げられる。アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））などの抗ＴＮＦα抗体、重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体（米国特許第５，７２５，８５６号明細書を参照）、又はハーセプチン（商標）などのトラスツズマブを含む抗ＨＥＲ２抗体；米国特許第５，７３６，１３７号明細書のキメラ抗ＣＤ２０、米国特許第５，７２１，１０８号明細書の２Ｈ７抗体のキメラ又はヒト化バリアントなどの抗ＣＤ２０抗体；ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ アバスチン（商標）（国際公開第９６／３００４６号及び国際公開第９８／４５３３１号）などのヒト化及び／又は親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＥＧＦＲ（国際公開第９６／４０２１０号のキメラ化又はヒト化抗体）；ＯＫＴ３（米国特許第４，５１５，８９３号明細書）などの抗ＣＤ３抗体；ＣＨＩ-６２１（シムレクト）及び（ゼナパックス）（米国特許第５，６９３，７６２号明細書）などの抗ＣＤ２５抗体又は抗ｔａｃ抗体の、アミノ酸配列を含む抗体。本発明は、本発明の形質転換された植物細胞を培養すること、又は本発明の形質転換された植物を成長させることを含む、抗体の産生方法を提供する。産生された抗体は、標準的な手順に従って精製及び製剤化することができる。

【0216】

特定の実施形態によれば、目的のポリペプチドは酵素である。

【0217】

特定の実施形態によれば、酵素は、リソソーム酵素である。例としては、限定されるものではないが、セラミダーゼ（ｃｅｒｍｉｄａｓｅ）、例えば、Ｎ-アセチルガラクトサミン-４-スルファターゼ（アリールスルファターゼＢ）、α-グルコセレブロシダーゼ、α-Ｌ-イズロニダーゼ、α-ガラクトシダーゼＡ、β-ガラクトシダーゼが挙げられる。

【0218】

本発明は、目的のポリペプチド（例えば、リソソーム酵素）の産生方法を提供し、当該方法は、本発明の核酸で形質転換され、目的のポリペプチドを発現するように更に形質転換された細胞を、培養又は増殖することを含む。産生されたポリペプチドは、標準的な手順に従って精製及び製剤化できる。

【0219】

特定の実施形態によれば、目的のポリペプチドは、キメラポリペプチド、例えば、融合タンパク質とも呼ばれる異種ポリペプチドに結合した目的のポリペプチドである。例としては、限定されるものではないが、ＴＮＦレセプターをＩｇＧ１抗体の定常領域の末端（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｅｎｄ）に融合させたキメラポリペプチドである、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））が挙げられる。

【0220】

上述のように、本明細書に記載の除去可能なサイレンシング用構築物は、最初に目的遺伝子をサイレンシングするために使用され、その後当該構築物（又はその一部）は切除される。

【0221】

したがって、本発明の別の態様によれば、目的とする標的核酸を生物又は当該生物の細胞において編集又は調節する方法であって、
（ａ）上記目的とする核酸の編集又は調節を促進する条件下で、生物（例えば植物）又は当該生物の単離細胞（例えば植物細胞）を、本明細書に記載の核酸構築物で形質転換させる工程であって、上記条件が、上記第２のプロモーターからの発現を促進しない、工程と、続いて、
（ｂ）上記生物又は上記生物の単離細胞を、上記第２のプロモーターからの発現を促進する条件下で培養し、それによって目的の上記標的核酸を編集又は調節する工程と、
を含む、方法が提供される。

【0222】

一実施形態では、形質転換工程は、安定的形質転換を含む。別の実施形態では、形質転換工程は、一過性形質転換工程を含む。請求項（ａ）の形質転換工程に続いて、細胞は、少なくとも６時間、１２時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、少なくとも２週間、又は少なくとも３週間、培養され得る。

【0223】

培養時間は、典型的には、形質転換される細胞の種類及び形質転換が安定であるか一過性であるかによって異なる。

【0224】

したがって、例えば、植物細胞の場合、典型的には、細胞は、安定な形質転換後に、１週間超、２週間超、例えば２週間～４週間、培養される。典型的には、植物細胞は、一過性形質転換後に１～７日間（例えば、１～３日間）培養される。

【0225】

形質転換が成功した細胞を同定するために、工程（ａ）の際又は後、及び工程（ｂ）の前に、細胞をポジティブ選択培地で培養してもよい。

【0226】

本明細書で使用する場合、「ポジティブ選択培地」という語句は、ポジティブ選択マーカー遺伝子を含有する細胞を選択する培地又は増殖条件を指す。形質転換細胞は、ポジティブ選択マーカー遺伝子を含有しない細胞の生存には通常有害な薬剤又は条件に曝露されたときに、生存及び／又は増殖する。

【0227】

核酸試薬がサイレンシング試薬である場合、目的遺伝子の発現の下方制御を確認するために追加の解析を実行してもよい（上に更に記載されているように）。

【0228】

次に、第２のプロモーターからの発現を促進するように条件を変更する（又は十分な時間待つ）。具体的なプロモーターにより、当該プロモーターからの発現を促進するために必要な条件（又はどのくらいの時間が必要であるか）が決まる。例えば、プロモーターが感熱性プロモーターである場合、発現段階の間に温度を上げてもよい。プロモーターが開花期（flowering stage）でのみ活性なプロモーターである場合、この発生段階に到達するのに十分な時間待つ。

【0229】

工程（ｂ）において、細胞は、少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、又は更には少なくとも２週間、培養される。

【0230】

導入遺伝子を失った細胞を選択するために、細胞は、工程（ｂ）の際又は後に、ネガティブ選択培地で培養されてもよい。

【0231】

「ネガティブ選択培地」は、ネガティブ選択マーカー遺伝子を含まない細胞を選択する培地又は増殖条件を表す。形質転換細胞は、ネガティブ選択マーカー遺伝子を含有する細胞の生存には通常有害な薬剤又は条件に曝露されたときに、生存及び／又は増殖する。

【0232】

導入遺伝子が失われたことを確認するために、追加の解析（例えば、ＰＣＲ解析、サザンブロット解析など）を実行してもよい。

【0233】

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、±１０％を表す。

【0234】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。

【0235】

「からなる」という用語は、「含み、限定される」ことを意味する。

【0236】

「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、組成物、方法又は構造が、追加の成分、工程、及び／又は部分を含み得るが、当該追加の成分、工程、及び／又は部分が、特許請求の範囲に記載された組成物、方法、又は構造の基本的及び新規な特徴を大きく変化させない場合に限られることを意味する。

【0237】

本明細書において、単数形を表す「１つの（「ａ」、「ａｎ」）」及び「当該（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数も対象とする。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」又は「少なくとも１つの化合物」は、複数の化合物を含み、それらの混合物も含み得る。

【0238】

本願全体を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性及び簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限すると解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲の全部、及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５及び６も具体的に開示するとみなされるべきである。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。

【0239】

本明細書において数値範囲を示す場合は常に、示された範囲内の任意の記載された数（分数又は整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数と「の間の範囲」という語句と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という語句とは、本明細書で互換的に使用され、第１の指示数及び第２の指示数と、第１の指示数と第２の指示数との間の分数及び整数の全部とを含むことを意図する。

【0240】

本明細書で使用する場合、「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の従事者に既知のもの、又は既知の様式、手段、技術及び手順から従事者が容易に開発できるものを含むが、これらに限定されない。

【0241】

特定の配列表を参照する場合、そのような参照は、微小な配列の変異を含む、相補配列に実質的に対応する配列をも包含するものと理解されたい。配列の変動は、例えばシーケンシングエラー、クローニングエラー、又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加を生じる他の変化の結果であるが、但し、このような変動の頻度は５０塩基中に１未満、又は１００塩基中に１未満、又は２００塩基中に１未満、又は５００塩基中に１未満、又は１０００塩基中に１未満、又は５，０００塩基中に１未満、又は１０，０００塩基中に１未満である。

【0242】

明確さのために別個の実施形態に関連して記載した本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために単一の実施形態に関連して記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、又は任意の好適な部分的な組み合わせ、又は適宜、本発明の他の任意の記載された実施形態に対しても提供され得る。様々な実施形態に関連して記載される特定の特徴は、その要素なしでは実施形態が動作不能でない限り、その実施形態の必須の特徴であるとみなすべきではない。

【0243】

本明細書に上記記載され、特許請求の範囲に特許請求される本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的裏付けが見出される。

【0244】

以下では実施例を参照する。本実施例は、上記の説明と共に本発明のいくつかの実施形態を非限定的な様式で例示するものである。

【実施例】

【0245】

本明細書において使用される命名法および本発明に使用する実験手順としては、通常、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術および組み換えＤＮＡ技術が挙げられる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４，６６６，８２８号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、同第４，８０１，５３１号明細書、同第５，１９２，６５９号明細書、および同第５，２７２，０５７号明細書に記載された方法、"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N.Y. (1994), Third Edition、"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J.E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、および同第５，２８１，５２１号の明細書、"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)、”Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984)、"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)、"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)、"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)及び"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press、"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照されたい。上記文献の全てが、本参照により本明細書に完全に援用されるものとする。その他の一般的な参考文献は、本明細書を通じて提供される。それらに記載の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。それらに含まれるすべての情報が、本参照により本明細書に援用される。

【0246】

材料及び方法
植物細胞懸濁液
Nicotiana tabacum cv. BY-2細胞（Nagata, 2004）を、液体ＭＳ-ＢＹ-２培地（Nagata and Kumagai, 1999）で懸濁培養物として、オービタルシェーカーで撹拌（８５ｒｐｍ）を継続しながら２５℃で培養した。体積５０ｍＬのこの懸濁液を、２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ内で増殖させ、２．５％（ｖ／ｖ）の濃度で毎週継代培養した。

【0247】

自己除去バイナリーベクターの構築
自己除去バイナリーベクター（図１）を構築するために、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９カセットと、ＦＵＣ-Ｔ及びＸＹＬ-Ｔ遺伝子を対象とするＵ６-ｇＲＮＡの５つのカセット（上述、Hanania et al., 2017）とを含有するｐＢＩＮ１９バックボーンを使用した。Ｔ-ＤＮＡを、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって商業的に合成され、３つの追加のカセットを含有する３リピートのＺ配列によって（ＬＢの下流及びＲＢの上流に）結合した。第１のカセットは、ノパリンシンターゼプロモーターの下流及びノパリンシンターゼターミネーターの上流に位置するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有しており、形質転換株の選択に使用した。

【0248】

第２のカセットは、３５ｓプロモーターの下流及びオクトピンシンターゼターミネーターの上流に位置するｃｏｄＡ遺伝子を含有しており、自己除去クローンの選択に使用した。第３のカセットは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社によって商業的に合成され、１８．２ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ熱ショックプロモーターの下流及びオクトピンシンターゼターミネーターの上流に位置するｇＲＮＡ-Ｚを含有しており、Ｔ-ＤＮＡ切除の誘導に使用した。

【0249】

ＢＹ-２細胞の形質転換及び株の選択
最終ベクターを使用して、アグロバクテリウムの植物形質転換手順（An, 1985）により、タバコＢＹ-２細胞を形質転換させた。安定なトランスジェニック細胞懸濁液が確立されたら、当該懸濁液を、個々の細胞株（クローン）の単離及びスクリーニングに使用した。

【0250】

個々の細胞株の確立は、トランスジェニック細胞懸濁液の高度に希釈したアリコートを使用し、固体培地上に広げることによって実施した。小さなカルス（植物細胞塊）が発生するまで細胞を増殖させた。次いで、単一のクローンを表す各カルスを液体培地に再懸濁し、サンプリングした。

【0251】

ＸｙｌＴ ＦｕｃＴノックアウト株のスクリーニング、及び７６個のプールから得られた再クローン株の試験
前述のようにＥＬＩＳＡ試験を使用して、フコース及びキシロース含有グリカンを含んでいないことについて個々の形質転換株をスクリーニングした（Hanania et al., 2017）。次いで、第１のスクリーニング段階でＦｕｃＴ又はＸｙｌＴ遺伝子がノックアウトされたと想定される株（株２８、株７６、株９０）を、抗ＨＲＰ抗体（Ａｇｒｉｓｅｒａ社ＡＳ０９-５４９）を使用したＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより解析した。更なる解析には抗Ｃａｓ９抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社ＭＡＣ１３３）及び抗ｃｏｄＡ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製カスタム）を使用した。次いで、７６個のプールから得られた８種のクローンを、抗Ｃａｓ９抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社ＭＡＣ１３３）及び抗ｃｏｄＡ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製カスタム）及び抗ｈｐｔＩＩ抗体（Ａｒｔｒｏｎ Ｂｉｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．Ａ８５-Ａｂ１）を使用してウエスタンブロットによって解析した。

【0252】

総タンパク質の抽出
１個のガラスビーズ（５ｍｍ）を入れた２ｍＬチューブに合計１００ｍｇの細胞を移した。体積２００μＬの試料緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣＬ緩衝液、ｐＨ６．８、４％のＳＤＳ、０．５ＭのＤＴＴ、３０％のグリセロール、及び０．４ｍｇ／ｍＬのブロモフェノールブルー）を添加し、試料を２８Ｈｚで１０分間組織溶解に付した（ｔｉｓｓｕｅ-ｌｙｓｅｄ）。試料を１０分間ボイルし、２０，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。

【0253】

ＰＣＲ反応
ＰＣＲは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、以下の手順：９５℃で１分間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で１分間、を３５サイクル実施した。エチジウムブロマイドで染色した１％のアガロースゲルでの電気泳動によってＰＣＲ産物を分離した。

【0254】

５-ＦＣ添加培地での熱誘導及び選択
ＸｙｌＴ／ＦｕｃＴノックアウトＢＹ-２細胞株である株２８、株７６及び株９０におけるｓｇＲＮＡ-ＺＺＺの発現を誘導するために、培養物に、水浴中で熱処理（２．５時間、３７℃）を繰り返し施した（１週間に２回を連続２週間）。誘導後、導入遺伝子が切除された細胞を選択するために、７５０ｍｇ／Ｌの５-ＦＣを含有させた選択培地に細胞を移した一方で、ハイグロマイシン（前の工程で選択剤として機能した）は含ませなかった。

【0255】

ノックアウト細胞株のゲノム改変の解析
ＤＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ遺伝子のための特異的プライマーを使用して、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅した（表１）。

【0256】

【表1】

【0257】

ＰＣＲ産物をｐＧＥＭＴベクターにサブクローニングした。コロニーの配列決定を行い、野生型標的配列とアライメントして変異を決定した。

【0258】

サザンブロット解析
以下に詳述するように、（Shure et al., 1983）をベースとし、更に工程を追加して、サザンブロット解析のための全ゲノムＤＮＡをＢＹ-２細胞から単離した。

【0259】

５日目に回収した１０グラムのＢＹ２細胞を、乳鉢及び乳棒を用いて液体窒素中で粉砕した。粉砕した細胞を、８Ｍの尿素、０．３５ＭのＮａＣｌ、０．０５ＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０２ＭのＥＤＴＡ、２％のサルコシル、０．３％のチオ硫酸ナトリウム、及び１％のＰＶＰ-４０を含有する１００ｍＬの溶解緩衝液に移した。混合物を７０℃の熱水浴中で６０分間インキュベートした。等量のフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコールの混合溶液（２５：２４：１）を添加し、混合し、遠心分離して相分離させた。フェノール-クロロホルム抽出を２回繰り返した。等量の冷イソプロパノールを添加した後、ＤＮＡを沈殿させ、８０％のエタノールで洗浄し、乾燥し、２５μＬのＲＮａｓｅＡ（１０μｇ／ｍＬ）を含有する１．５ｍＬのＴＥ緩衝液中に直ちに溶解し、室温で一晩インキュベートした。等量のフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコールの混合溶液（２５：２４：１）を添加し、混合し、遠心分離して相分離させた。クロロホルム抽出を２回繰り返した。相分離させ、等量のイソプロパノールを上相に添加し、遠心分離した。ペレットを沈殿させ、８０％エタノールで洗浄し、乾燥し、４００μＬのＴＥに再懸濁した。

【0260】

次いで、消化されたＤＮＡを、０．８％アガロースゲル電気泳動システムで、１×ＴＡＥ中、１００Ｖで５時間分離した。次いで、分離したＤＮＡをナイロン膜にキャピラリで転写し、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用してＵＶ架橋し固定した。ＤＩＧプローブを使用してハイブリダイゼーションを行った。ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社）にＩｍａｇｅＬａｂ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ５．２．１（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて、高分解能の化学発光設定でシグナル強度をスキャンした。

【0261】

結果
「自己除去可能」なＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９ベクターの構築
構築物自体の自己切除及びその後の「導入遺伝子を不含有」の細胞株の選択を可能にするために、Hanania et al., 2017に記載の構築物（N. tabacumキシロシルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ／ＦｕｃＴ）の遺伝子を標的とする５セットのｇＲＮＡと協働してＣａｓ９の構成的発現を駆動するよう、設計されている）に、更に以下の配列を追加した。（１）２３塩基の３つのリピートであって、それぞれを「ＺＺＺ」と表記し、その２つの端部がフレームに入れられているもの、（２）熱誘導性ＨＳＰ１８．２プロモーターよって駆動される追加のｇＲＮＡ-Ｚ（Takahashi and Komeda, 1989）、及び（３）３５Ｓプロモーターによって駆動されるシトシンデアミナーゼ（ｃｏｄＡ）ネガティブ選択マーカー（de Oliveira et al., 2015）（図１、表２）。

【0262】

【表2】

【0263】

これらの２３塩基の３つのリピートは、N. tabacumのゲノム上には存在せず、Ｃａｓ９-ｇＲＮＡ-Ｚの標的として機能するように設計されていた。熱誘導性プロモーターを使用することでＣａｓ９活性の逐次的な標的制御を可能にし、ｃｏｄＡを使用することで「導入遺伝子を不含有の」細胞株の選択を可能にした。

【0264】

上記の「自己除去可能な」ベクターを使用して、異なる標的に対するＣａｓ９活性を逐次制御することができる。最初に、Ｃａｓ９は、構成的に発現したｇＲＮＡ-ＸｙｌＴ／ＦｕｃＴによって、２種類の植物グリコトランスフェラーゼ、すなわちキシロシルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼのノックアウトを誘導する。ノックアウトが達成され、それが確認されたなら、ｇＲＮＡ-Ｚを発現させるために熱誘導によって第２の工程をトリガーし、続いて２つのＺＺＺ境界をＣａｓ９の標的とする。トランスジェニック挿入物の両側での二重、同時のＤＮＡ消化は、細胞ゲノムからのＤＮＡ挿入物全体の切除、続いて非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるＤＮＡ修復をもたらし得る（Gorbunova and Levy, 1997、Gorbunova and Levy, 1999）。この一連のイベントにより、外来性ＤＮＡを含まないＸｙｌＴ／ＦｕｃＴノックアウト細胞を得ることができる。

【0265】

「自己除去可能な」ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９ベクターを使用したＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ遺伝子のノックアウト
上記のベクターを使用して、N. tabacumのＢＹ-２細胞を安定的に形質転換させた。合計１００個の形質転換クローン（ハイグロマイシンで選択）を単離した。キシロース／フコースを含まないクローンを選択するために、これらの株をＥＬＩＳＡ試験に供した。試験した１００個のクローンのうちの３種の細胞、株２８、株７６、及び株９０は、ＸｙｌＴ／ＦｕｃＴの両方の遺伝子（ΔＸＦ）の推定上のノックアウトを示した。ウエスタンブロットによる更なる解析により、上記３種のクローンは抗ＨＲＰ抗体により検出されなかったこと、並びにキシロース及びフコースを含有するグリカンを全く含まないことを確認した（図２）。

【0266】

自己切除工程を活性化し、及び導入遺伝子を失っている細胞の選択を可能にするためには、株２８、株７６、及び株９０においてｃｏｄＡ及びＣａｓ９を存在させることが不可欠であった。上記３種の選択された細胞株におけるｃｏｄＡ及びＣａｓ９遺伝子の発現を確認するために、抗ｃｏｄＡ抗体及び抗Ｃａｓ９抗体を使用して、ウエスタンブロットによる更なる解析を行った。３種の株は全てｃｏｄＡ発現を示したが、そのレベルは大きく異なっていた（図３）。株２８におけるＣａｓ９発現は比較的高いが、株７６が示した発現レベルは低く、株９０はＣａｓ９のシグナルを全く示さなかった（図４）。株９０ではＣａｓ９が検出されなかったため、この細胞株はこの時点で削除した。

【0267】

挿入されたＴ-ＤＮＡを切除するための「自己切除可能な」機構の活性化
標的とした変異がＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ遺伝子において達成され、これが確認された後、ｇＲＮＡ-Ｚの発現を誘導して自己除去機構を活性化した。選択された２種の細胞株（株２８及び株７６）を繰り返し熱処理し、続いて５-フルオロシトシン（５-ＦＣ）添加培地で培養した。培養培地中に５-ＦＣが存在することは、ｃｏｄＡ活性を失った細胞集団の選択に役立った（ｃｏｄＡを発現する細胞は、５-ＦＣの存在下で生存しない）。５-ＦＣ培地で生存した細胞は、部分的欠失、又は組み換えＤＮＡ挿入物全体の切除のいずれかによってｃｏｄＡコード配列を失ったものと推定した。ｃａｓ９：ｇＲＮＡ-Ｚ活性が不均一な細胞集団をもたらしたと推定した。本明細書では以後、これらの誘導後の細胞をプール２８及びプール７６としてラベルした。

【0268】

切除イベントの可能性（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）の評価及び更なる解析のための細胞プールの選択
ＺＺＺ標的上のＣａｓ９：ｇＲＮＡ-Ｚ複合体の機能を検出するため、及び潜在的な切除イベントの発生確率を評価するために、Ｔ-ＤＮＡの左端部にはフォワードプライマーを使用し、左のＺＺＺ配列の端部外側のｈｐｔＩＩ遺伝子にはリバースプライマーを使用して、プール２８及びプール７６の細胞に対してＰＣＲ解析を実施した（図５、表３のプライマー１、２）。ＰＣＲ産物は細胞の不均一なプールから生成されたため、一部の産物はＰＣＲによって検出されなかった可能性があることに留意されたい。

【0269】

【表3】

【0270】

８７４ｂｐのフラグメント（図５の（Ａ））は、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ-Ｚ活性を受けなかった細胞で生成されると予想される。ＰＣＲでこのフラグメントを生成できないこと、又は予測された８７４ｂｐ以外のサイズの任意のＰＣＲ産物は、左のＺＺＺリピート配列内にエンドヌクレアーゼ活性があることを示し得る。

【0271】

上記のフォワード及びリバースプライマーを使用したところ、プール２８の細胞では約６００ｂｐのフラグメントが生成し、プール７６の細胞ではＰＣＲ産物が検出されなかった（図５の（Ｂ））。これらの結果は、プール２８の左のＺＺＺ配列におけるいくつかの変異の発生、及びプール７６におけるこの配列の消失を示す可能性があり、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ-Ｚの実際の機能のエビデンスを提供した。プール７６は、切除イベントが起こる可能性が最も高いことが実証されたことから、更なる解析用に選択した。

【0272】

プール７６のクローニング及び単離されたクローンの評価
５-ＦＣで選択されたプール７６の細胞を固体培地に播種し、８種のクローン（７６１～７６８）を増殖させ、ウエスタンブロット解析により解析した。これらのクローンは全て、抗ｈｐｔＩＩ抗体、抗Ｃａｓ９抗体、及び抗ｃｏｄＡ抗体に陰性であった（図６の（Ａ）～（Ｃ））。更に、これらの株は、ハイグロマイシンの存在下では増殖できなかった。

【0273】

ＰＣＲにより、上記の選択されたクローンを熱ショックプロモーター（ＨＳＰ１８．２）配列の存在について更に解析した。クローン７６３、７６６、７６７、及び７６８の４種は、ＨＳＰ１８．２が陰性であることが確認され、プール７６由来の他の４種のクローンではＰＣＲ産物が得られた（図７、表３のプライマー４、５）。更なる評価試験のために２種のクローン（７６３及び７６７）を選択した。

【0274】

サザンブロット解析による完全な切除の確認
株７６３及び株７６７のゲノム中のＴ-ＤＮＡ全体が完全に切除されて存在しないことを、Ｔ-ＤＮＡ全体を１０の異なる位置から網羅する４種の異なるプローブを使用したサザンブロット解析によって確認した。Ｔ-ＤＮＡの５’末端に３．８ｋｂのセクションが存在しないことを確認するために、ＰａｃＩ及びＳａｃＩ制限酵素でゲノムＤＮＡを消化し、メンブレンにはＤＩＧ ｈｐｔＩＩプローブをハイブリダイズした。これらの株ではシグナルは検出されなかった（図８の（Ａ）～（Ｂ））。ｈｐｔＩＩ遺伝子の下流に９ｋｂのセクションが存在しないことを確認するために、単一のＮｃｏＩ制限酵素でゲノムＤＮＡを消化し、メンブレンにはＤＩＧ ｈＣａｓ９プローブをハイブリダイズした。これらの株ではシグナルは検出されなかった（図９の（Ａ）～（Ｂ））。ｈｐｔＩＩ遺伝子の下流に１２．４ｋｂのセクションが存在しないことを確認するために、ＮｃｏＩ及びＳｐｈＩ制限酵素でゲノムＤＮＡを消化し、メンブレンにはＤＩＧ ＯｃＳＴプローブをハイブリダイズした。これらの株ではシグナルは検出されなかった（図１０の（Ａ）～（Ｂ））。Ｕ６-ｇＲＮＡの５種のカセットが存在しないことを確認するために、ＳａｃＩ及びＰａｃＩ制限酵素でゲノムＤＮＡを消化し、メンブレンにはＤＩＧ Ｕ６-ｇＲＮＡプローブをハイブリダイズした。これらの株ではシグナルは検出されなかった（図１１の（Ａ）～（Ｂ））。

【0275】

切除の正確な部位を評価することを目的として、挿入されたＴ-ＤＮＡ（ＺＺＺ配列の近く）の左及び右の境界に対するプライマー（表３のプライマー１、３）を使用したところ、ＰＣＲ産物は検出されなかった。この不検出は、切断部位の周辺に原因となる欠失が発生していることで説明がつく。結果として、Ｔ-ＤＮＡの境界に由来する数塩基が切除部位に残されているか否かを確認することはできなかった。

【0276】

ＸｙｌＴ及びＦｕｃＴ遺伝子のＣａｓ９のマルチプレックス標的化によって生成された変異の評価
細胞株７６３を、ＸｙｌＴ遺伝子及びＦｕｃＴ遺伝子のＣａｓ９生成変異について更に評価した。ＸｙｌＴ（Ａ及びＢ遺伝子）、ＦｕｃＴ（Ａ、Ｂ、及びＣ遺伝子）及びＦｕｃＴ（Ｄ及びＥ遺伝子）のＣａｓ９標的部位に隣接する３組のプライマー（表３）をそれぞれ使用して、ＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭＴベクターにクローニングし、各試料からのサブクローンを配列決定し、様々な挿入及び／又は欠失（ｉｎ-ｄｅｌｓ）の存在を明らかにした。試験したいずれの遺伝子でも野生型産物は検出されなかった。

【0277】

ＸｙｌＴ遺伝子の３種の変異及びＦｕｃＴ遺伝子の７種の変異を同定した。同一の７ｂｐの欠失が、ＸｙｌＴ-Ａ遺伝子の両方の対立遺伝子に見られた。１８ｂｐの欠失及び７ｂｐの欠失が、ＸｙｌＴ-Ｂ遺伝子で同定された。同一の１，２１８ｂｐの欠失及び１ｂｐの挿入が、ＦｕｃＴ-Ａ遺伝子の両方の対立遺伝子に見られた。ＦｕｃＴ-Ｂでは、一方の対立遺伝子において１６ｂｐの欠失並びに他方の対立遺伝子において１７ｂｐの欠失及び１ｂｐの挿入が見られた。ＦｕｃＴ-Ｃでは、一方の対立遺伝子において１ｂｐの欠失及び１ｂｐの挿入並びに他方の対立遺伝子において１ｂｐの欠失及び１ｂｐの挿入が見られた。

【0278】

同一の１，３７６ｂｐの欠失及び３９５ｂｐの挿入がＦｕｃＴ-Ｄ遺伝子の両方の対立遺伝子に見られ、同一の１６ｂｐの欠失及び５３ｂｐの挿入がＦｕｃＴ-Ｅ遺伝子の両方の対立遺伝子に見られた。

【0279】

本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替、改変、及び変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、そのような代替、改変、及び変形は全て、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲に含まれるものとする。

【0280】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が本明細書に援用される。加えて、本出願における任意の参考文献の引用又は特定は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。章の見出しが使用される範囲において、当該見出しは必ずしも限定を加えるものと解釈されるべきではない。

【0281】

更に、本出願の任意の優先権書類は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0282】

参考文献
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【配列表フリーテキスト】

【0283】

配列番号１： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号６： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号７： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号８： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号９： ｇＲＮＡ核酸配列
配列番号１０： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１１： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１２： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１３： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１４： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１５： プロトスペーサー隣接モチーフのアミノ酸配列であって、１～２位のｎはａ、ｃ、ｇ、またはｔ
配列番号１６： プロトスペーサー隣接モチーフのアミノ酸配列であって、１～４位のｎはａ、ｃ、ｇ、またはｔ
配列番号１７： プロトスペーサー隣接モチーフのアミノ酸配列であって、１～４位のｎはａ、ｃ、ｇ、またはｔ、６～８位のｎはａ、ｃ、ｇ、またはｔ
配列番号１８： ＰＣＲ産生断片の配列
配列番号１９： ＰＣＲ産生断片の配列
配列番号２０： ＰＣＲ産生断片の配列
配列番号２１： ＰＣＲ産生断片の配列
配列番号２２： ＰＣＲ産生断片の配列
配列番号２３： ＰＣＲ産生断片の配列
配列番号２４： ＣＡＳ９（ｃｒＲＮＡ）の標的として選択されたＤＮＡ配列
配列番号２５： ＣＡＳ９（ｃｒＲＮＡ）の標的として選択されたＤＮＡ配列
配列番号２６： ＣＡＳ９（ｃｒＲＮＡ）の標的として選択されたＤＮＡ配列
配列番号２７： ＣＡＳ９（ｃｒＲＮＡ）の標的として選択されたＤＮＡ配列
配列番号２８： ＣＡＳ９（ｃｒＲＮＡ）の標的として選択されたＤＮＡ配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

2023510464000001.app

【国際調査報告】