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特表2023-510744鋳型を用いた編集のためのＤＮＡポリメラーゼのリクルート
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-15
(54)【発明の名称】鋳型を用いた編集のためのＤＮＡポリメラーゼのリクルート
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230308BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230308BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230308BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20230308BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230308BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20230308BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230308BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/54
C12N15/09 110
C12N15/09 100
C12N9/12
C07K19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022541803
(86)(22)【出願日】2021-01-06
(85)【翻訳文提出日】2022-09-05
(86)【国際出願番号】 US2021012283
(87)【国際公開番号】W WO2021141970
(87)【国際公開日】2021-07-15
(31)【優先権主張番号】62/957,542
(32)【優先日】2020-01-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522269901
【氏名又は名称】ペアワイズ・プランツ・サーヴィシズ，インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＩＲＷＩＳＥ ＰＬＡＮＴＳ ＳＥＲＶＩＣＥＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【識別番号】100125380
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 綾子
(74)【代理人】
【識別番号】100142996
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 聡二
(74)【代理人】
【識別番号】100166268
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 祐
(74)【代理人】
【識別番号】100180231
【弁理士】
【氏名又は名称】水島 亜希子
(74)【代理人】
【識別番号】100096769
【氏名又は名称】有原 幸一
(72)【発明者】
【氏名】ニィエ，ジンイー
(72)【発明者】
【氏名】ヒュンメル，アーロン
(72)【発明者】
【氏名】ローイット，シャイ・ジョシュア
【テーマコード（参考）】
4B050
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC05
4B050DD02
4B050GG06
4B050KK11
4B050LL05
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA11
4H045CA40
4H045DA89
4H045EA61
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡによりコードされた修復鋳型、場合によってはＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む組換え核酸構築体（配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を含む）、ならびにその、細胞および生物において核酸を修飾するための使用方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができる第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、および（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
を含む第１の複合体。
【請求項2】
第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型をさらに含む、請求項１に記載の第１の複合体。
【請求項3】
第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼをさらに含み、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、一本鎖ニックもしくは二本鎖切断を導入することができ、または標的核酸上の第１の部位に結合することができる前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質がさらに、一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入することができるエンドヌクレアーゼ活性を含む、請求項１または請求項２に記載の第１の複合体。
【請求項4】
（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができ、かつ一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入することができるエンドヌクレアーゼ活性を含む第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｃ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型
を含む第１の複合体。
【請求項5】
（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができる第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｃ）第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および
（ｄ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型
を含む第１の複合体。
【請求項6】
前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／またはアルゴノートタンパク質由来である、請求項１から５のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項7】
前記第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ（例えばＦｏｋ１）、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および／または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項３から６のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項8】
前記第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ヌクレアーゼまたはニッカーゼである、請求項３から７のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項9】
ガイド核酸（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）をさらに含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項10】
前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を含む、請求項１、２、または６から９のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項11】
前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の前記エンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性が、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および／または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）由来である、請求項１０に記載の第１の複合体。
【請求項12】
前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、（そのＮ末端またはＣ末端にて）前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、場合によってはリンカーを介して融合されている、請求項１から１１のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項13】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、高いフィデリティおよび／または高いプロセッシビティを示す、請求項１から１２のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項14】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、高い分配プロファイルを示す、請求項１から１２のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項15】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性、および／または５’－３’ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項16】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性、および５’－３’ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の１つまたは複数を取り除くように修飾されている、請求項１５に記載の第１の複合体。
【請求項17】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、クレノウ断片またはそのサブ断片を含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項18】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合タンパク質に融合されている、請求項１から１７のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項19】
前記配列非特異的ｄｓＤＮＡ結合タンパク質が、スルホロブス・ソルファタリカス由来のＳｓｏ７ｄ由来である、請求項１８に記載の第１の複合体。
【請求項20】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ヒト、酵母、細菌、または植物由来のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１から１９のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項21】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼε（例えば、ヒトおよび酵母）、ＤＮＡポリメラーゼδ、大腸菌ポリメラーゼＩ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５Ｕ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、および／またはＰｈｉｒｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１から１９のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項22】
前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、ヒトＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼε、植物ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼε、および／または酵母ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼεである、請求項１から２０のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項23】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、分配型ポリメラーゼである、請求項１から２２のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項24】
前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ペプチドタグに融合され、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されており、それによって、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ペプチドタグに融合された前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質にリクルートされる、請求項１から２３のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項25】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ペプチドタグに融合され、前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、前記ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されており、それによって、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、前記親和性ポリペプチドに融合された前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質にリクルートされる、請求項１から２３のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項26】
前記ペプチドタグが、ＧＣＮ４ペプチドタグ（例えばＳｕｎ－タグ）、ｃ－Ｍｙｃアフィニティタグ、ＨＡアフィニティタグ、Ｈｉｓアフィニティタグ、Ｓアフィニティタグ、メチオニン－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＲＧＤ－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＦＬＡＧオクタペプチド、ｓｔｒｅｐタグもしくはｓｔｒｅｐタグＩＩ、Ｖ５タグ、および／またはＶＳＶ－Ｇエピトープを含む、請求項２４または請求項２５に記載の第１の複合体。
【請求項27】
前記親和性ポリペプチドが、抗体、場合によっては、ｓｃＦｖ抗体、アフィボディ、アンチカリン、モノボディ、および／またはＤＡＲＰｉｎである、請求項２４から２６のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項28】
前記ガイド核酸が、ＲＮＡリクルートモチーフに連結されており、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＲＮＡリクルートモチーフに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されている、請求項９から２３のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項29】
前記ＲＮＡリクルートモチーフが、ＣＲＩＳＰＲ核酸（例えば、リクルートｃｒＲＮＡ、リクルートｃｒＤＮＡ）の５’末端に、または３’末端に連結されている、請求項２８に記載の第１の複合体。
【請求項30】
前記ＲＮＡリクルートモチーフおよび対応する親和性ポリペプチドが、テロメラーゼＫｕ結合モチーフ（例えばＫｕ結合ヘアピン）およびＫｕの親和性ポリペプチド（例えばＫｕヘテロダイマー）、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７の親和性ポリペプチド、ＭＳ２ファージオペレーターステム－ループおよび親和性ポリペプチドＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７ファージオペレーターステム－ループおよび親和性ポリペプチドＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）、ＳｆＭｕファージＣｏｍステム－ループおよび親和性ポリペプチドＣｏｍ ＲＮＡ結合タンパク質、ＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）および親和性ポリペプチドプミリオ／ｆｅｍ－３ｍＲＮＡ結合因子（ＰＵＦ）、ならびに／または合成ＲＮＡアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドである、請求項２８または請求項２９に記載の第１の複合体。
【請求項31】
前記ＲＮＡリクルートモチーフおよび対応する親和性ポリペプチドが、ＭＳ２ファージオペレーターステム－ループおよび親和性ポリペプチドＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ならびに／またはＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）および親和性ポリペプチドプミリオ／ｆｅｍ－３ｍＲＮＡ結合因子（ＰＵＦ）である、請求項２８または請求項２９に記載の第１の複合体。
【請求項32】
前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、前記ガイド核酸に連結されている、請求項９から３１のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項33】
前記第１のＤＮＡ結合ドメインおよび／または第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質である、請求項１から３２のいずれか１項に記載の第１の複合体。
【請求項34】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質が、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系由来である、請求項３３に記載の第１の複合体。
【請求項35】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系由来である、請求項３３に記載の第１の複合体。
【請求項36】
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質が、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃ２ｃ１０、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、および／またはＣａｓ１４ｃである、請求項３４または請求項３５に記載の第１の複合体。
【請求項37】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質が、Ｃａｓ９エフェクタタンパク質またはＣａｓ１２エフェクタタンパク質である、請求項３３から３４に記載の第１の複合体。
【請求項38】
（ａ）標的核酸上の第２の部位に結合することができる第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、および（ｂ）ＤＮＡによりコードされた修復鋳型
を含む第２の複合体。
【請求項39】
前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／またはアルゴノートタンパク質由来である、請求項３８に記載の第２の複合体。
【請求項40】
第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼをさらに含み、前記第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入することができる、請求項３９に記載の第２の複合体。
【請求項41】
前記第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）由来である、請求項４０に記載の第２の複合体。
【請求項42】
標的核酸上の第２の部位に結合することができる前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質がさらに、一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入することができるエンドヌクレアーゼ活性を含む、請求項３８または請求項３９に記載の第２の複合体。
【請求項43】
エンドヌクレアーゼ活性をさらに含む前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項４２に記載の第２の複合体。
【請求項44】
第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項３８から４３のいずれか１項に記載の第２の複合体。
【請求項45】
前記第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、ＤＮＡリクルートモチーフに連結されており、前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、前記ＤＮＡリクルートモチーフと相互作用することができる親和性ポリペプチドに融合されており、場合によっては、前記ＤＮＡリクルートモチーフ／親和性ポリペプチドが、ＨＵＨ－タグ、ＤＮＡアプタマー、細菌レトロンのｍｓＤＮＡ、またはＴ－ＤＮＡリクルートを含む、請求項３８から４３のいずれか１項に記載の第２の複合体。
【請求項46】
前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、（そのＮ末端またはＣ末端にて）ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ）Ｒｅｐタンパク質に融合されており、前記ＤＮＡ鋳型がＰＣＶ認識部位を含む、請求項３８から４５のいずれか１項に記載の第２の複合体。
【請求項47】
前記第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、ガイド核酸に連結されている、請求項３８から４６のいずれか１項に記載の第２の複合体。
【請求項48】
ペプチドタグまたはＲＮＡリクルートモチーフと相互作用することができる親和性ポリペプチドに融合された操作（修飾）されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項49】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに融合されている、請求項４８に記載の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項50】
前記配列非特異的ｄｓＤＮＡ結合タンパク質が、スルホロブス・ソルファタリカス由来のＳｓｏ７ｄ由来である、請求項４９に記載の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項51】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、［本明細書中に記載されるように操作されていない同じＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと比較して］プロセッシビティの増大、フィデリティの増大、親和性の増大、配列特異性の増大、配列特異性の低下、および／または協同作用の増大を示す、請求項４８から５０のいずれか１項に記載の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項52】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’－ポリメラーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、および／または５’→３’ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の少なくとも１つを含まない、請求項４８から５１のいずれか１項に記載の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項53】
第１の部位および第２部位とは異なる鎖上にある標的核酸上の第３の部位に結合することができる第３の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、ならびに第３のＤＮＡエンドヌクレアーゼを含むことによって、ミスマッチ修復を向上させ、かつ修復の効率をブーストする第３の複合体。
【請求項54】
請求項１から３７のいずれか１項に記載の第１の複合体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項55】
請求項３８から４７のいずれか１項に記載の第２の複合体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項56】
請求項５３に記載の第３の複合体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項57】
請求項４８から５２のいずれか１項に記載の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項58】
請求項５４から５７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの１つまたは複数を含む発現カセットまたはベクター。
【請求項59】
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質との相互作用を媒介する核酸配列、（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質を特異的核酸標的部位にＤＮＡ－ＲＮＡ相互作用を介して向ける核酸配列、および（ｃ）請求項４８から５２のいずれか１項に記載の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと相互作用することができるステムループ構造を形成する核酸配列を含むＲＮＡ分子。
【請求項60】
標的核酸を修飾する方法であって、前記標的核酸を、請求項４から３７のいずれか１項に記載の第１の複合体と接触させるステップによって、前記標的核酸を修飾するステップを含む方法。
【請求項61】
前記標的核酸を、請求項３８から４７のいずれか１項に記載の第２の複合体と接触させるステップによって、前記標的核酸を修飾するステップをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記標的核酸を、請求項５３に記載の第３の複合体と接触させるステップによって、前記標的核酸の修飾の修復効率を向上させるステップをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
標的核酸を修飾する方法であって、前記標的核酸を、（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができる第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、
（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｃ）第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および
（ｄ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型
と接触させるステップによって、前記標的核酸を修飾するステップを含む方法。
【請求項64】
前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、前記第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、（前記標的核酸と相互作用する）複合体を形成する、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／またはアルゴノートタンパク質由来である、請求項６３または請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ（例えばＦｏｋ１）、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および／または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項６３から６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
前記第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ヌクレアーゼまたはニッカーゼである、請求項６３から６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
標的核酸を修飾する方法であって、前記標的核酸を、（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができ、かつ一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入することができるニッカーゼ活性および／またはエンドヌクレアーゼ活性を含む第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、
（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに
（ｃ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型
と接触させるステップによって、前記標的核酸を修飾するステップを含む方法。
【請求項69】
エンドヌクレアーゼ活性を含む前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、（前記標的核酸と相互作用する）複合体を形成する、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の前記エンドヌクレアーゼ活性および／またはニッカーゼ活性が、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および／または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）由来である、請求項６８または請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、場合によってはリンカーを介して融合されている、請求項６３から７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項72】
前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ペプチドタグに融合され、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されており、それによって、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ペプチドタグに融合された前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質にリクルートされる、請求項６３から７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項73】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ペプチドタグに融合され、前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、前記ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されており、それによって、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、前記親和性ポリペプチドに融合された前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質にリクルートされる、請求項６３から７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項74】
前記ペプチドタグが、ＧＣＮ４ペプチドタグ（例えばＳｕｎ－タグ）、ｃ－Ｍｙｃアフィニティタグ、ＨＡアフィニティタグ、Ｈｉｓアフィニティタグ、Ｓアフィニティタグ、メチオニン－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＲＧＤ－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＦＬＡＧオクタペプチド、ｓｔｒｅｐタグもしくはｓｔｒｅｐタグＩＩ、Ｖ５タグ、および／またはＶＳＶ－Ｇエピトープを含む、請求項７２または請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
前記親和性ポリペプチドが、抗体、場合によっては、ｓｃＦｖ抗体、アフィボディ、アンチカリン、モノボディ、および／またはＤＡＲＰｉｎである、請求項７２から７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項76】
前記第１のＤＮＡ結合ドメインおよび／または第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質である、請求項６３から７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項77】
前記標的核酸を、第１のガイド核酸（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）と接触させることをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、前記第１のガイド核酸に連結されており、それによって、前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が前記標的核酸へとガイドされる、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
前記第１のガイド核酸が、ＲＮＡリクルートモチーフに連結されており、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＲＮＡリクルートモチーフに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されており、それによって、前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが前記標的核酸へとガイドされる、請求項７７または請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
前記ＲＮＡリクルートモチーフが、ＣＲＩＳＰＲ核酸（例えば、リクルートｃｒＲＮＡ、リクルートｃｒＤＮＡ）の５’末端に、または３’末端に連結されている、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
前記ＲＮＡリクルートモチーフおよび対応する親和性ポリペプチドが、テロメラーゼＫｕ結合モチーフ（例えばＫｕ結合ヘアピン）およびＫｕの親和性ポリペプチド（例えばＫｕヘテロダイマー）、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７の親和性ポリペプチド、ＭＳ２ファージオペレーターステム－ループおよび親和性ポリペプチドＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７ファージオペレーターステム－ループおよび親和性ポリペプチドＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）、ＳｆＭｕファージＣｏｍステム－ループおよび親和性ポリペプチドＣｏｍ ＲＮＡ結合タンパク質、ＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）および親和性ポリペプチドプミリオ／ｆｅｍ－３ｍＲＮＡ結合因子（ＰＵＦ）、ならびに／または合成ＲＮＡアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドである、請求項７９または請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記ＲＮＡリクルートモチーフおよび対応する親和性ポリペプチドが、ＭＳ２ファージオペレーターステム－ループおよび親和性ポリペプチドＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ならびに／またはＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）および親和性ポリペプチドプミリオ／ｆｅｍ－３ｍＲＮＡ結合因子（ＰＵＦ）である、請求項７９または請求項８０に記載の方法。
【請求項83】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質が、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系由来である、請求項７６から８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項84】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系由来である、請求項７６から８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項85】
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質が、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃ２ｃ１０、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、および／またはＣａｓ１４ｃである、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質が、Ｃａｓ９エフェクタタンパク質またはＣａｓ１２エフェクタタンパク質である、請求項７６から８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項87】
前記標的核酸を、（ａ）前記標的核酸上の第２の部位に結合することができる第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、および
（ｂ）ＤＮＡによりコードされた修復鋳型
を含む第２の複合体と接触させるステップをさらに含む、請求項６３から８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項88】
前記標的核酸がさらに、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触し、前記第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、一本鎖ニックもしくは二本鎖切断を導入することができ、または前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、一本鎖ニックもしくは二本鎖切断を導入することができるエンドヌクレアーゼ活性を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項89】
前記第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質）、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）由来であり、またはエンドヌクレアーゼ活性を含む前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項８８に記載の方法。
【請求項90】
前記標的核酸上の第２の部位に結合することができる前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、前記第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型、および場合によっては前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記標的核酸上の前記第２の部位と相互作用する複合体を形成する、請求項８７から８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項91】
前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ペプチドタグに融合され、前記第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されており、それによって、前記第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ペプチドタグに融合された前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質にリクルートされる、請求項８７から９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項92】
前記第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ペプチドタグに融合され、前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、前記ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されており、それによって、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記親和性ポリペプチドに融合された前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質にリクルートされる、請求項８７から９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項93】
前記ペプチドタグが、ＧＣＮ４ペプチドタグ（例えばＳｕｎ－タグ）、ｃ－Ｍｙｃアフィニティタグ、ＨＡアフィニティタグ、Ｈｉｓアフィニティタグ、Ｓアフィニティタグ、メチオニン－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＲＧＤ－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＦＬＡＧオクタペプチド、ｓｔｒｅｐタグもしくはｓｔｒｅｐタグＩＩ、Ｖ５タグ、および／またはＶＳＶ－Ｇエピトープを含む、請求項８７または請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
前記親和性ポリペプチドが、抗体、場合によっては、ｓｃＦｖ抗体、アフィボディ、アンチカリン、モノボディ、および／またはＤＡＲＰｉｎである、請求項８９から９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項95】
前記第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、ＤＮＡリクルートモチーフに連結されており、前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、前記ＤＮＡリクルートモチーフと相互作用することができる親和性ポリペプチドに融合されており、場合によっては、前記ＤＮＡリクルートモチーフ／親和性ポリペプチドが、ＨＵＨ－タグ、ＤＮＡアプタマー、細菌レトロンのｍｓＤＮＡ、またはＴ－ＤＮＡリクルートを含む、請求項８７から９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項96】
前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ）Ｒｅｐタンパク質に融合されており、前記ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、ＰＣＶ認識部位を含む、請求項８７から９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項97】
前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／またはアルゴノートタンパク質由来である、請求項８９から９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項98】
前記第２のＤＮＡ結合ドメインおよび／または第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質である、請求項８９から９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項99】
前記標的核酸を、第２のガイド核酸（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）と接触させるステップをさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項100】
前記第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、前記第２のガイド核酸に連結されており、それによって、前記第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が前記標的核酸へとガイドされる、請求項９９に記載の方法。
【請求項101】
前記第２のガイド核酸が、ＲＮＡリクルートモチーフに連結されており、前記第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ＲＮＡリクルートモチーフに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されており、それによって、前記第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが前記標的核酸へとガイドされる、請求項９９または請求項１００に記載の方法。
【請求項102】
前記ＲＮＡリクルートモチーフが、ガイド核酸（例えば、リクルートｃｒＲＮＡ、リクルートｃｒＤＮＡ）の５’末端に、または３’末端に連結されている、請求項１０１に記載の方法。
【請求項103】
前記ＲＮＡリクルートモチーフおよび対応する親和性ポリペプチドが、テロメラーゼＫｕ結合モチーフ（例えばＫｕ結合ヘアピン）およびＫｕの親和性ポリペプチド（例えばＫｕヘテロダイマー）、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７の親和性ポリペプチド、ＭＳ２ファージオペレーターステム－ループおよび親和性ポリペプチドＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７ファージオペレーターステム－ループおよび親和性ポリペプチドＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）、ＳｆＭｕファージＣｏｍステム－ループおよび親和性ポリペプチドＣｏｍ ＲＮＡ結合タンパク質、ＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）および親和性ポリペプチドプミリオ／ｆｅｍ－３ｍＲＮＡ結合因子（ＰＵＦ）、ならびに／または合成ＲＮＡアプタマーおよび対応するアプタマーリガンドである、請求項１０１または請求項１０２に記載の方法。
【請求項104】
前記ＲＮＡリクルートモチーフおよび対応する親和性ポリペプチドが、ＭＳ２ファージオペレーターステム－ループおよび親和性ポリペプチドＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ならびに／またはＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）および親和性ポリペプチドプミリオ／ｆｅｍ－３ｍＲＮＡ結合因子（ＰＵＦ）である、請求項１０１または請求項１０２に記載の方法。
【請求項105】
前記標的核酸を、第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させるステップをさらに含む、請求項８７から１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項106】
前記標的核酸を、第３の複合体と接触させるステップを含み、前記第３の複合体が、前記第１の部位および前記第２の部位とは異なる鎖上にある前記標的核酸上の第３の部位に結合することができる第３の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含み、前記第３の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を含むことによって、前記標的核酸の修飾の修復効率を向上させる、請求項８７から１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項107】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または前記第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性、および５’－３’ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の１つまたは複数を取り除くように修飾されている、請求項６３から１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項108】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または前記第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、クレノウ断片またはそのサブ断片を含む、請求項６３から１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項109】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または前記第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合タンパク質に融合されている、請求項６３から１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項110】
前記配列非特異的ｄｓＤＮＡ結合タンパク質が、スルホロブス・ソルファタリカス由来のＳｓｏ７ｄ由来である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項111】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または前記第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ヒト、酵母、細菌、または植物由来のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項６３から１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項112】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または前記第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼε（例えば、ヒトおよび酵母）、ＤＮＡポリメラーゼδ、大腸菌ポリメラーゼＩ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５Ｕ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、および／またはＰｈｉｒｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼである、請求項６３から１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項113】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または前記第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ヒトＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼε、植物ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼε、および／または酵母ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼεである、請求項６３から１１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項114】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または前記第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、高いフィデリティおよび／または高いプロセッシビティを示す、請求項６３から１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項115】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または前記第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、高い分配プロファイルを示す、請求項６３から１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項116】
前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または前記第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、請求項４８から５２のいずれか１項に記載の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項６３から１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項117】
請求項４、６から９または１２から３７のいずれか１項に記載の第１の複合体、これをコードするポリヌクレオチド、および／または前記ポリヌクレオチドを含む発現カセットもしくはベクターを含む、標的核酸を修飾するためのシステムであって、（ａ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を含む前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、前記標的核酸上の第１の部位に結合し、
（ｂ）前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と相互作用することができ、かつ前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして前記標的核酸上の前記第１の部位にリクルートされ、
（ｃ）（ｉ）前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、前記標的核酸上の前記第１の部位に対して実質的な相補性を有するスペーサー配列を含む第１のガイド核酸に連結されており、それによって、前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、前記標的核酸上の前記第１の部位へとガイドされ、または
（ｃ）（ｉｉ）前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと相互作用することができ、かつ前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、そして前記標的核酸上の前記第１の部位にリクルートされることによって、前記標的核酸を修飾する、システム。
【請求項118】
請求項５から９または１２から３７のいずれか１項に記載の第１の複合体、これをコードするポリヌクレオチド、および／または前記ポリヌクレオチドを含む発現カセットもしくはベクターを含む、標的核酸を修飾するためのシステムであって、（ａ）前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、前記標的核酸上の第１の部位に結合し、
（ｂ）前記第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質および／またはガイド核酸と相互作用することができ、かつ前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして前記標的核酸上の前記第１の部位にリクルートされ、
（ｃ）前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質および／またはガイド核酸と相互作用することができ、かつ前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして前記標的核酸上の前記第１の部位にリクルートされ、
（ｄ）（ｉ）前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、前記標的核酸上の前記第１の部位に対して実質的な相補性を有するスペーサー配列を含むガイド核酸に連結されており、それによって、前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、前記標的核酸上の前記第１の部位へとガイドされ、または
（ｄ）（ｉｉ）前記第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、前記第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと相互作用することができ、かつ前記配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは前記第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、そして前記標的核酸上の前記第１の部位にリクルートされることによって、前記標的核酸を修飾する、システム。
【請求項119】
請求項３８から４７のいずれか１項に記載の第２の複合体、これをコードするポリヌクレオチド、ならびに／または前記ポリヌクレオチドを含む発現カセットおよび／もしくはベクターをさらに含み、前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合ドメインが、前記標的核酸上の前記第１の部位に近位の第２の部位に結合し、前記第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、前記第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に（共有結合性の相互作用または非共有結合性の相互作用を介して）リクルートされることによって、前記標的核酸を修飾する、請求項１１７または１１８に記載の標的核酸を修飾するシステム。
【請求項120】
標的核酸を修飾する方法であって、前記標的核酸を、
請求項１１７から１１９のいずれか１項に記載の複合体と接触させるステップによって、前記標的核酸を修飾するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表の電子ファイルに関する陳述
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１に従って提出した、表題１４９９．１４．ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔの、４３５，３１０バイトのサイズの、２０２１年１月６日に作成した、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出したＡＳＣＩＩテキストフォーマットの配列表を、紙コピーの代わりに提供する。この配列表は、その開示について、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１に従って提出した、表題１４９９．１４．ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔの、４３５，３１０バイトのサイズの、２０２１年１月６日に作成した、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出したＡＳＣＩＩテキストフォーマットの配列表を、紙コピーの代わりに提供する。この配列表は、その開示について、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【0002】
優先権の陳述
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従って、２０１９年１月６日出願の米国仮特許出願第６２／９５７，５４２号の利益を主張し、この出願の全体の内容は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従って、２０１９年１月６日出願の米国仮特許出願第６２／９５７，５４２号の利益を主張し、この出願の全体の内容は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【0003】
本発明の分野
本発明は、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡによりコードされた修復鋳型、場合によってはＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む組換え核酸構築体（配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を含む）、ならびにその、細胞および生物において核酸を修飾するための使用方法に関する。
本発明は、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡによりコードされた修復鋳型、場合によってはＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む組換え核酸構築体（配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を含む）、ならびにその、細胞および生物において核酸を修飾するための使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
正確な、鋳型を用いた編集は典型的に、二本鎖切断（ＤＳＢ）を標的部位内に導入することと、組み込まれることが所望される編集を有する鋳型を用意することとを包含する。編集鋳型から標的部位への配列の組込みは、相同組換えパスウェイを介したＤＳＢの、鋳型を用いた修復に依存するが、当該パスウェイは、ほとんどの真核細胞におけるＤＮＡ修復にとって支配的なパスウェイではない。また、内因性相同組換えパスウェイは、複数の工程による複雑なプロセスであり、当該工程は各々、固有のボトルネックを有しており、操作するのが困難となり得る。全体として、鋳型を用いた相同組換え媒介編集の効率は典型的に、ヒト細胞において低く、そして植物細胞においてさらに低い。これは、試薬送達の低い効率、および編集された植物を回復させる困難に起因する。
【0005】
酵母以外の真核生物における最良の、鋳型を用いた編集の効率は、試薬（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ、修復鋳型、ＮＨＥＪインヒビター、ＨＤＲ刺激因子）のカクテルの送達を容易に調整することができるヒト細胞培養において達成され、効率が高い。具体的に、ヒト細胞において、鋳型を用いた正確な編集は、３つの構成要素の複合体、１）ガイドＲＮＡによって配列特異的部位にリクルートされ得るニッカーゼ、２）ニックが入れられたＤＮＡの３’に結合し、かつ所望の編集を有する修復鋳型をコードする伸長配列を有するガイドＲＮＡ、および３）ニックが入れられたＤＮＡの３’末端およびプライマーを用いてＤＮＡを合成する（例えば編集を組み込む）、ニッカーゼに融合されたＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用いて実証されてきた。特定のヒト細胞型において、鋳型を用いた正確な編集の最大５０％が報告されている（Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ５７６：１４９－１５７（２０１９））。
【0006】
ヒト細胞におけるのとは異なり、植物において、様々な組成物中の複数の試薬の送達は、困難となり得る。また、細胞における修復鋳型の可用性を増大させることによって、鋳型を用いた編集の効率を向上させることができる高用量の修復鋳型を送達することは、困難となり得る。現在まで、植物における鋳型を用いた編集の大部分の成功は、ＤＮＡ発現カセットの粒子衝撃（particle bombardment）および修復鋳型によって達成されてきた。最良の編集効率は、１０％未満の範囲内にあり、多くの研究が１％未満である。報告されている最も高い効率は、多くの場合、ＨＤＲのより高い効率に至るかもしれない機構の理解がないか、または不十分である、ゲノム内の特定の修復遺伝子座におけるもののみである。
【発明の概要】
【0007】
本発明の一態様は、（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができる第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、および（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む第１の複合体を提供する。
【0008】
本発明の第２の態様は、（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができ、かつ一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入することができるエンドヌクレアーゼ活性を含む第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｃ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型を含む第１の複合体を提供する。
【0009】
本発明の第３の態様は、（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができる第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および（ｄ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型を含む第１の複合体を提供する。
【0010】
本発明の第４の態様は、（ａ）標的核酸上の第２の部位に結合することができる第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、および（ｂ）ＤＮＡによりコードされた修復鋳型を含む第２の複合体を提供する。
【0011】
本発明の第５の態様は、ペプチドタグまたはＲＮＡリクルートモチーフ（RNA recruiting motif）と相互作用することができる親和性ポリペプチドに融合された操作された（修飾された）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【0012】
本発明の第６の態様は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質との相互作用を媒介する核酸配列、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質を特異的核酸標的部位にＤＮＡ－ＲＮＡ相互作用を介して向ける核酸配列、および（ｃ）本発明の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと相互作用することができるステムループ構造を形成する核酸配列を含むＲＮＡ分子を提供する。
【0013】
本発明の第７の態様は、標的核酸を修飾する方法であって、標的核酸を、本発明の第１の複合体と接触させることによって、標的核酸を修飾することを含む方法を提供する。
【0014】
本発明の第８の態様は、標的核酸を修飾する方法であって、標的核酸を、（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができる第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および（ｄ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型と接触させることによって、標的核酸を修飾することを含む方法を提供する。
【0015】
本発明の第９の態様は、標的核酸を修飾する方法であって、標的核酸を、（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができ、かつ一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入することができるニッカーゼ活性および／またはエンドヌクレアーゼ活性を含む第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに（ｃ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型と接触させることによって、標的核酸を修飾することを含む方法を提供する。
【0016】
本発明の第１０の態様は、本発明の第１の複合体、これをコードするポリヌクレオチド、および／または当該ポリヌクレオチドを含む発現カセットもしくはベクターを含む、標的核酸を修飾するためのシステムを提供し、（ａ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を含む第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、標的核酸上の第１の部位に結合し、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と相互作用することができ、かつ第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして標的核酸上の第１の部位にリクルートされ、（ｃ）（ｉ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、標的核酸上の第１の部位に対して実質的な相補性を有するスペーサー配列を含む第１のガイド核酸に連結されており、それによって、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、標的核酸上の第１の部位へとガイドされ、または（ｃ）（ｉｉ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと相互作用することができ、かつ第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、そして標的核酸上の第１の部位にリクルートされることによって、標的核酸を修飾する。
【0017】
本発明の第１１の態様は、本発明の第１の複合体、これをコードするポリヌクレオチド、および／または当該ポリヌクレオチドを含む発現カセットもしくはベクターを含む、標的核酸を修飾するためのシステムを提供し、（ａ）第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、標的核酸上の第１の部位に結合し、（ｂ）第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質および／またはガイド核酸と相互作用することができ、かつ第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして標的核酸上の第１の部位にリクルートされ、（ｃ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質および／またはガイド核酸と相互作用することができ、かつ第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして標的核酸上の第１の部位にリクルートされ、（ｄ）（ｉ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、標的核酸上の第１の部位に対して実質的な相補性を有するスペーサー配列を含むガイド核酸に連結されており、それによって、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、標的核酸上の第１の部位へとガイドされ、または（ｄ）（ｉｉ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと相互作用することができ、かつ配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、そして標的核酸上の第１の部位にリクルートされることによって、標的核酸を修飾する。
【配列表フリーテキスト】
【0018】
配列番号１～２０は、本発明に有用な、例となるＣａｓ１２ａアミノ酸配列である。
配列番号２１～２２は、プロモーターおよびイントロンをコードする例示的な調節配列である。
配列番号２３～２５は、例となるペプチドタグおよび対応する親和性ポリペプチドを提供する。
配列番号２６～３６は、例となるＲＮＡリクルートモチーフおよび対応する親和性ポリペプチドを提供する。
配列番号３７～３９は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼについてのプロトスペーサー隣接モチーフ位置の例を提供する。
配列番号４０～４７は、例となるＨＵＨ－タグおよび対応する認識配列を提供する。
配列番号４８～５８および配列番号８８～９４は、種々の異なる生物由来の例となるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
配列番号５９～６２は、例となるＣａｓ９配列を提供する。
配列番号６３～７０は、例となるレトロン逆転写酵素およびレトロン足場を提供する。
配列番号７１～７４は、例となるキメラガイド核酸配列を提供する。
配列番号７５は、例となるＣａｓ１２ａリボ核タンパク（ＲＮＰ）を提供する。
配列番号７６～８７は、実施例１１由来の標的配列およびｃｒＲＮＡ配列を提供する。
配列番号２１～２２は、プロモーターおよびイントロンをコードする例示的な調節配列である。
配列番号２３～２５は、例となるペプチドタグおよび対応する親和性ポリペプチドを提供する。
配列番号２６～３６は、例となるＲＮＡリクルートモチーフおよび対応する親和性ポリペプチドを提供する。
配列番号３７～３９は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼについてのプロトスペーサー隣接モチーフ位置の例を提供する。
配列番号４０～４７は、例となるＨＵＨ－タグおよび対応する認識配列を提供する。
配列番号４８～５８および配列番号８８～９４は、種々の異なる生物由来の例となるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
配列番号５９～６２は、例となるＣａｓ９配列を提供する。
配列番号６３～７０は、例となるレトロン逆転写酵素およびレトロン足場を提供する。
配列番号７１～７４は、例となるキメラガイド核酸配列を提供する。
配列番号７５は、例となるＣａｓ１２ａリボ核タンパク（ＲＮＰ）を提供する。
配列番号７６～８７は、実施例１１由来の標的配列およびｃｒＲＮＡ配列を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0019】
次に本発明を、本発明の実施形態を示す添付の図面および実施例を参照して、以降で説明する。この説明は、本発明が実行され得る様々な全方法の詳細なカタログであることも、本発明に加えられ得る全ての特徴であることも意図されない。例えば、一実施形態に関して具体的に説明される特徴が、他の実施形態に組み込まれてもよく、そして特定の実施形態に関して具体的に説明される特徴が、その実施形態から削除されてもよい。ゆえに、本発明は、本発明の一部の実施形態において、本明細書中で示されるあらゆる特徴または特徴の組合せを、除外することも省略することもできることを意図する。また、本明細書中で示唆される種々の実施形態に対する、本発明から逸脱しない多数の変形および追加が、本開示を考慮して、当業者にとって明らかであろう。それゆえに、以下の説明は、本発明の一部の特定の実施形態を示すことが意図されており、全ての配列、それらの組合せおよび変形を網羅的に指定することは意図されない。
【0020】
別段定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のものであり、本発明の限定であることは意図されない。
【0021】
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の引用は、引用が示されるセンテンスおよび／または段落に関連する教示について、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【0022】
文脈が別途指示しない限り、本明細書中に記載される本発明の種々の特徴を、あらゆる組合せで用いることができることが具体的に意図される。さらに、本発明はまた、本発明の一部の実施形態において、本明細書中で示されるあらゆる特徴または特徴の組合せを除外することも省略することもできることを意図する。組成物が、構成要素Ａ、Ｂ、およびＣを含むと明細書が述べているかを示すために、Ａ、Ｂ、もしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せを単独で、またはあらゆる組合せで省略かつ放棄することができることが具体的に意図される。
【0023】
本発明および添付の特許請求の範囲の記載に用いられている単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに指示しない限り、複数形を同様に含むことが意図される。
【0024】
また、本明細書中で用いられる「および／または」は、関連する記載された項目の１つまたは複数のあらゆる全ての考えられる組合せ、および択一的に解釈される場合（「または」）の組合せの欠如を指し、かつ包含する。
【0025】
測定可能な値、例えば量または濃度等に言及する場合に本明細書中で用いられる用語「約」は、指定された値の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または±０．１％の変動、ならびに指定された値を包含することを意図する。例えば、Ｘが測定可能な値である場合の「約Ｘ」は、Ｘ、ならびにＸの±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または±０．１％の変動を含むことを意図する。計測可能な値について本明細書中で提供される範囲は、他のあらゆる範囲および／またはその中の個々の値を含み得る。
【0026】
本明細書中で用いられる「ＸとＹとの間」および「約ＸとＹとの間」等のフレーズは、ＸおよびＹを含むと解釈されるべきである。本明細書中で用いられる「約ＸとＹとの間」等のフレーズは、「約Ｘと約Ｙとの間」を意味し、そして「約ＸからＹ」等のフレーズは、「約Ｘから約Ｙ」を意味する。
【0027】
本明細書中の値の範囲の詳述は、本明細書中で示されない限り、単に、当該範囲内にある別個の各値に個々に言及する速記の方法の役目を果たすことが意図されており、そして別個の各値は、あたかも本明細書中で個々に列挙されているかの如く、本明細書に組み込まれる。例えば、範囲１０～１５が開示されていれば、１１、１２、１３、および１４もまた開示されている。
【0028】
本明細書中で用いられる用語「含む（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）」は、明示される特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を排除しない。
【0029】
本明細書中で用いられる移行句「から本質的になる」は、特許請求の範囲が、特許請求の範囲に列挙される指定された材料または工程、および特許請求される本発明の基本的かつ新規の特徴に物質的に影響を与えないものを包含すると解釈されるべきであることを意味する。ゆえに、本発明の特許請求の範囲で用いられる場合の用語「から本質的になる」は、「含む」に等しいと解釈されることは意図されない。
【0030】
本明細書中で用いられる用語「増大させる」、「増大させること」、「増強させる」、「増強させること」、「向上させる」、および「向上させること」（およびその文法上の変形）は、対照と比較して少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれを超える上昇を説明する。
【0031】
本明細書中で用いられる用語「引き下げる」、「引き下げられた」、「引き下げること」、「引下げ」、「減少させる」、および「低下させる」（およびその文法上の変形）は、例えば、対照と比較して少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の低下を説明する。特定の実施形態において、引下げは、検出可能な活性または量をもたらし得ないか、または本質的にもたらし得ない（すなわち、有意でない量、例えば、約１０％または５％未満）。
【0032】
「異種（heterologous）」または「組換え」ヌクレオチド配列は、これが導入される宿主細胞と天然に関連しないヌクレオチド配列であり、天然に存在するヌクレオチド配列の天然に存在しない複数のコピーが挙げられる。
【0033】
「天然」または「野生型」の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチド、またはアミノ酸配列は、天然に存在するか、または内因性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチド、またはアミノ酸配列を指す。ゆえに、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、参照生物内に天然に存在するか、または参照生物に内因性のｍＲＮＡである。「相同」核酸配列は、これが導入される宿主細胞と天然に関連するヌクレオチド配列である。
【0034】
本明細書中で用いられる用語「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド」は、直鎖状であるか、もしくは分岐している、一本鎖もしくは二本鎖、またはそれらのハイブリッドであるＲＮＡまたはＤＮＡを指す。また、当該用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを包含する。また、ｄｓＲＮＡが合成的に生成される場合、あまり一般的でない塩基、例えばイノシン、５－メチルシトシン、６－メチルアデニン、ヒポキサンチンその他を、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、およびリボザイム対形成に用いることができる。例えば、ウリジンおよびシチジンのＣ－５プロピン類似体を含有するポリヌクレオチドは、高い親和性でＲＮＡに結合すること、そして遺伝子発現の強力なアンチセンスインヒビターであることが示されている。また、他の修飾、例えば、ホスホジエステル骨格、またはＲＮＡのリボース糖基内の２’－ヒドロキシへの修飾をすることができる。
【0035】
本明細書中で用いられる用語「ヌクレオチド配列」は、核酸分子の５’末端から３’末端までの、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたはヌクレオチドの配列を指し、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ断片または部分、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡ（いずれも一本鎖または二本鎖であり得る）が挙げられる、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が挙げられる。また、用語「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸構築体」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのヘテロポリマーを指すのに本明細書中で互換的に用いられる。本明細書中で提供される核酸分子および／またはヌクレオチド配列が、本明細書中で左から右に５’から３’の向きに示されており、そして米国配列規則、３７ＣＦＲ§§１．８２１－１．８２５、および世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５に示されるヌクレオチド性質を示すための標準コードを用いて表される。本明細書中で用いられる「５’領域」は、ポリヌクレオチドの５’末端に最も近いポリヌクレオチドの領域を意味し得る。ゆえに、例えば、ポリヌクレオチドの５’領域内の要素を、ポリヌクレオチドの５’末端に位置決めされた第１のヌクレオチドから、ポリヌクレオチドの途中に位置決めされたヌクレオチドまでのどこでも位置決めすることができる。本明細書中で用いられる「３’領域」は、ポリヌクレオチドの３’末端に最も近いポリヌクレオチドの領域を意味し得る。ゆえに、例えば、ポリヌクレオチドの３’領域内の要素を、ポリヌクレオチドの３’末端に位置決めされた第１のヌクレオチドから、ポリヌクレオチドの途中に位置決めされたヌクレオチドまでのどこでも位置決めすることができる。
【0036】
本明細書中で用いられる用語「遺伝子」は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および抗マイクロＲＮＡアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＡＭＯ）等を生成するのに用いることができる核酸分子を指す。遺伝子は、機能タンパク質または遺伝子産物を生成するのに用いることができる場合もあるし、できない場合もある。遺伝子は、コード領域および非コード領域（例えば、イントロン、調節要素、プロモーター、エンハンサ、終結配列、ならびに／または５’および３’非翻訳領域）の双方を含むことができる。遺伝子は、「単離」されていてもよく、これは、天然の状態で核酸と関連して通常見出される構成要素から実質的に、または本質的に遊離している核酸が意図される。そのような構成要素として、他の細胞物質、組換え生成物由来の培地、および／または核酸を化学的に合成するのに用いられる種々の化学物質が挙げられる。
【0037】
用語「変異」は、点変異（例えば、ミスセンス、またはナンセンス、またはフレームシフトをもたらす単一の塩基対の挿入もしくは欠失）、挿入、欠失、および／またはトランケーションを指す。変異が、アミノ酸配列内の残基の、別の残基による置換、または配列内の１つもしくは複数の残基の欠失もしくは挿入である場合、変異は、典型的に、元の残基に続く配列内の残基の位置を同定することによって、そして新たに置換された残基を同定することによって説明される。
【0038】
本明細書中で用いられる用語「相補的な」または「相補性」は、許容可能な塩および温度条件の下での塩基対合によるポリヌクレオチドの天然の結合を指す。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」（５’から３’）は、相補的な配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」（３’から５’）に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する「部分的」であってもよいし、一本鎖分子間に総相補性が存在する場合、完全であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して大きな影響を有する。
【0039】
本明細書中で用いられる「相補体」は、コンパレータヌクレオチド配列（comparator nucleotide sequence）との１００％の相補性を意味し得るし、１００％未満の相補性（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％等の相補性）をも意味し得る。
【0040】
本発明のヌクレオチド配列の「部分」または「断片」は、参照核酸またはヌクレオチド配列と比較して、長さが引き下げられ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれを超えるヌクレオチドが引き下げられ）、かつ参照核酸またはヌクレオチド配列と同一であるかまたはほぼ同一の（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の）連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、これから本質的になる、かつ／またはこれからなるヌクレオチド配列を意味することが理解される。本発明に従うそのような核酸断片または部分は、適切な場合には、これが構成成分であるより大きなポリヌクレオチド内に含まれてもよい。一例として、本発明のガイド核酸の反復配列は、野生型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ反復配列の一部（例えば、野生型ＣＲＩＳＲ－Ｃａｓ反復、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃ２ｃ１０、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、および／またはＣａｓ１４ｃ等のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系由来の反復）を含んでもよい。
【0041】
相同性を有する異なる核酸またはタンパク質は、本明細書中で「相同体」と称する。用語相同体は、同じ種および他の種由来の相同配列、ならびに同じ種および他の種由来のオーソログ配列を含む。「相同性」は、位置同一性（すなわち、配列類似性または同一性）のパーセントに換算した、２つ以上の核酸および／またはアミノ酸配列間の類似性のレベルを指す。また、相同性は、異なる核酸またはタンパク質間の類似した機能特性の概念を指す。ゆえに、本発明の組成物および方法はさらに、本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に対する相同体を含む。本明細書中で用いられる「オーソログ」は、種形成の間に共通祖先遺伝子から生じた異なる種における相同ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を指す。本発明のヌクレオチド配列の相同体は、本発明の前記ヌクレオチド配列に対して実質的な配列同一性（例えば、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する。
【0042】
本明細書中で用いられる「配列同一性」は、２つの最適にアラインされたポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、構成要素、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸のアラインメントのウィンドウの全体を通して不変である程度を指す。「同一性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されるものが挙げられるがこれらに限定されない、知られている方法によって容易に算出することができる。
【0043】
本明細書中で用いられる用語「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」は、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した、参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直鎖状ポリヌクレオチド配列内の、２つの配列が最適にアラインされた場合の同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。一部の実施形態において、「同一性パーセント」は、参照ポリペプチドと比較したアミノ酸配列内の同一のアミノ酸のパーセンテージを指し得る。
【0044】
本明細書中で用いられるフレーズ、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列、またはタンパク質配列の文脈における「実質的に同一の」または「実質的同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または目視検査によって測定して、最大対応について比較かつアラインした場合のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性が、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％である２つ以上の配列またはサブ配列を指す。本発明の一部の実施形態において、実質的同一性は、約１０ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、またはそれを超えるヌクレオチド長、およびそれらにおけるあらゆる範囲、最大で配列の完全長である本発明のヌクレオチド配列の連続ヌクレオチドの領域にわたって存在する。一部の実施形態において、ヌクレオチド配列は、少なくとも約２０ヌクレオチド（例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド）にわたって、実質的に同一であり得る。一部の実施形態において、実質的に同一のヌクレオチドまたはタンパク質配列は、これが実質的に同一であるヌクレオチド（またはコードされたタンパク質配列）と実質的に同じ機能を実行する。
【0045】
配列比較について、典型的に、一配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力されて、必要であれば、サブ配列座標が指定されて、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。続いて、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列についての配列同一性パーセントを算出する。
【0046】
比較ウィンドウをアラインするための配列の最適なアラインメントが、当業者に周知であり、ツール、例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの類似性の検索方法によって、そして場合によってはこれらのアルゴリズムのコンピュータによる実施、例えばＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡによって行われてもよい。試験配列および参照配列のアラインされたセグメントについての「同一性分率」は、参照配列セグメント内の構成要素の総数、例えば、参照配列全体、または参照配列の、定義されたより小さな部分で割った、２つのアラインされた配列によって共有される同一の構成要素の数である。配列同一性パーセントは、１００を乗算した同一性分率として表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部、またはより長いポリヌクレオチド配列に対してであってもよい。また、本発明の目的上、「同一性パーセント」は、翻訳されたヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＸバージョン２．０、そしてポリヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて求められてもよい。
【0047】
また、２つのヌクレオチド配列は、２つの配列がストリンジェント条件の下で互いにハイブリダイズする場合、実質的に相補的であると考えてもよい。代表的な一部の実施形態において、実質的に相補的であると考えられる２つのヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件の下で、互いにハイブリダイズする。
【0048】
サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、様々な環境パラメータの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲にわたるガイドが、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）において見出される。通常、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定義したイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。
【0049】
Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（定義したイオン強度およびｐＨ下での）温度である。特定のプローブについてのＴｍと等しくなるように、非常にストリンジェントな条件が選択される。サザンブロットまたはノーザンブロットにおいてフィルター上に１００を超える相補的な残基を有する相補的なヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション用のストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例として、ハイブリダイゼーションが一晩実行される、４２℃での１ｍｇヘパリン入り５０％ホルムアミドがある。高度にストリンジェントな洗浄条件の例として、７２℃にて約１５分間の０．１ ５Ｍ ＮａＣｌがある。ストリンジェント洗浄条件の例として、６５℃にて１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄がある（ＳＳＣバッファの解説について、以下のＳａｍｂｒｏｏｋ参照）。多くの場合、高ストリンジェンシー洗浄が、バックグラウンドプローブシグナルを取り除くために、低ストリンジェンシー洗浄の後にある。例えば１００を超えるヌクレオチドの二重鎖についての中程度のストリンジェンシー洗浄の例として、４５℃にて１５分間の１×ＳＳＣがある。例えば１００を超えるヌクレオチドの二重鎖についての低ストリンジェンシー洗浄の例として、４０℃にて１５分間の４～６×ＳＳＣがある。短いプローブ（例えば約１０～５０ヌクレオチド）について、ストリンジェント条件は、典型的に、約１．０Ｍ Ｎａイオン未満の塩濃度、典型的にはｐＨ７．０～８．３にて約０．０１～１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）を包含し、温度は、典型的に、少なくとも約３０℃である。また、ストリンジェント条件は、ホルムアミド等の不安定化剤を添加することで達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブについて観察されるよりも２×（またはより高い）の信号雑音比が、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしないヌクレオチド配列は、コードするタンパク質が実質的に同一であるならば、やはり実質的に同一である。これは、例えば、ヌクレオチド配列のコピーが、遺伝コードによって容認される最大コドン縮重を用いて生じる場合に、起こり得る。
【0050】
本発明のあらゆるポリヌクレオチド、核酸構築体、発現カセット、および／またはベクターは、注目するあらゆる種において、発現のためにコドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、当該技術において周知であり、コドン使用頻度バイアスについて、種特異的コドン使用頻度表を用いたヌクレオチド配列の修飾を包含する。コドン使用頻度表は、注目する種について最も高度に発現される遺伝子の配列分析に基づいて作成される。ヌクレオチド配列が核内で発現されることとなる場合、コドン使用頻度表は、注目する種について高度に発現される核遺伝子の配列分析に基づいて作成される。ヌクレオチド配列の修飾は、種特異的コドン使用頻度表を、天然のポリヌクレオチド配列内に存在するコドンと比較することによって決定される。当該技術において理解されているように、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、天然のヌクレオチド配列に対して１００％未満の同一性（例えば、５０％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％等）を有するが、元のヌクレオチド配列によってコードされるのと同じ機能（そして一部の実施形態において、同じ構造）を有するポリペプチドを依然としてコードするヌクレオチド配列をもたらす。ゆえに、一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、核酸構築体、発現カセット、および／またはベクター（例えば、配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼ等を含む／コードする）は、生物（例えば、植物（例えば、特定の植物種）、動物、細菌、真菌その他）における発現のためにコドン最適化されていてもよい。一部の実施形態において、コドン最適化された本発明の核酸構築体、ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、コドン最適化されていない本発明のポリヌクレオチド、核酸構築体、発現カセット、および／またはベクターに対して約７０％～約９９．９％、またはそれを超える（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％）同一性を有する。
【0051】
本明細書中に記載される実施形態のいずれにおいても、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸構築体は、植物および／または植物の細胞内での発現用の種々のプロモーターおよび／または他の調節要素と作動可能に関連し得る。ゆえに、一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸構築体はさらに、１つまたは複数のヌクレオチド配列と作動可能に連結した１つまたは複数のプロモーター、イントロン、エンハンサ、および／またはターミネーターを含んでもよい。一部の実施形態において、プロモーターは、イントロンと作動可能に関連し得る（例えば、Ｕｂｉ１プロモーターおよびイントロン）。一部の実施形態において、イントロンと関連するプロモーターは、「プロモーター領域」と称され得る（例えば、Ｕｂｉ１プロモーターおよびイントロン）。
【0052】
ポリヌクレオチドに関して本明細書中で用いられる「作動可能に連結した」または「作動可能に関連した」は、示される要素が、互いに機能的に関連しており、かつ通常物理的にも関連していることを意味する。ゆえに、本明細書中で用いられる用語「作動可能に連結した」または「作動可能に関連した」は、機能的に関連する単一の核酸分子上のヌクレオチド配列を指す。ゆえに、第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結した第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列と機能的に関係して配置されている状況を意味する。例えば、プロモーターは、プロモーターが前記ヌクレオチド配列の転写または発現をもたらすならば、ヌクレオチド配列と作動可能に関連している。当業者であれば、制御配列（例えばプロモーター）がその発現を導くように機能する限り、制御配列が、作動可能に関連するヌクレオチド配列と連続している必要がないことを理解するであろう。ゆえに、例えば、転写はされるが翻訳されない介在核酸配列が、プロモーターとヌクレオチド配列との間に存在し得、そしてプロモーターは依然として、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結している」と考えることができる。
【0053】
本明細書中で用いられる用語、ポリペプチドに関して「連結した」は、一方のポリペプチドの、もう一方への付着を指す。ポリペプチドは、別のポリペプチドに（Ｎ末端またはＣ末端にて）直接（例えば、ペプチド結合を介して）連結されても、リンカーを介して連結されてもよい。
【0054】
用語「リンカー」は、当該技術において認識されており、２つの分子または部分、例えば、融合タンパク質、例えばＤＮＡ結合ポリペプチドまたはドメイン、ならびにペプチドタグおよび／または逆転写酵素、ならびにペプチドタグに結合する親和性ポリペプチド、あるいはＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドまたはドメインおよびペプチドタグ、ならびに／または逆転写酵素、ならびにペプチドタグに結合する親和性ポリペプチドの２つのドメインを連結する化学基または分子を指す。リンカーは、単一の連結分子で構成されてもよいし、複数の連結分子を含んでもよい。一部の実施形態において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分、例えば二価有機部分であり得る。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸であってもよいし、ペプチドであってもよい。一部の実施形態において、リンカーはペプチドである。
【0055】
一部の実施形態において、本発明に有用なペプチドリンカーは、約２～約１００、またはそれを超えるアミノ酸長、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれを超えるアミノ酸長（例えば、約２～約４０、約２～約５０、約２～約６０、約４～約４０、約４～約５０、約４～約６０、約５～約４０、約５～約５０、約５～約６０、約９～約４０、約９～約５０、約９～約６０、約１０～約４０、約１０～約５０、約１０～約６０、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５アミノ酸～約２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれを超えるアミノ酸長（例えば、約１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、またはそれを超えるアミノ酸長））であり得る。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧＳリンカーであってもよい。
【0056】
「プロモーター」は、プロモーターと作動可能に関連するヌクレオチド配列（例えばコード配列）の転写を制御または調節するヌクレオチド配列である。プロモーターによって制御または調節されるコード配列は、ポリペプチドおよび／または機能ＲＮＡをコードし得る。典型的には、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を含有し、かつ転写の開始を指示するヌクレオチド配列を指す。一般に、プロモーターは、対応するコード配列のコード領域の開始点に対して、５’側、または上流側に見出される。プロモーターは、遺伝子発現の調節因子の働きをする他の要素、例えばプロモーター領域を含んでもよい。これは、ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列および多くの場合ＣＡＡＴボックスコンセンサス配列を含む（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，（１９８１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９）。植物では、ＣＡＡＴボックスは、ＡＧＧＡボックスによって置換されている場合がある（Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｔ．Ｋｏｓｕｇｅ，Ｃ．Ｍｅｒｅｄｉｔｈ ａｎｄ Ａ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２１１－２２７）。一部の実施形態において、プロモーター領域は、少なくとも１つのイントロン（例えば、配列番号２１または２２）を含んでもよい。
【0057】
本発明に有用なプロモーターの例として、組換え核酸分子、例えば、「合成核酸構築体」または「タンパク質－ＲＮＡ複合体」の調製に用いられる構成的、誘導性、時間的に調節された、発生的に調節された、化学的に調節された、組織選好および／または組織特異的プロモーターが挙げられ得る。これらの種々のタイプのプロモーターが、当該技術において知られている。
【0058】
プロモーターの選択は、発現の時間的かつ空間的必要条件に応じて変わってもよいし、形質転換されることとなる宿主細胞に基づいて変わってもよい。様々な多くの生物用のプロモーターが、当該技術において周知である。当該技術において存在する広範囲にわたる知識に基づいて、注目する特定の宿主生物に適したプロモーターを選択することができる。ゆえに、例えば、モデル生物において高度に構成的に発現される遺伝子の上流側のプロモーターについてかなり知られており、そのような知識は、必要に応じて、他の系において容易にアクセスすることができ、かつ実行することができる。
【0059】
一部の実施形態において、植物において機能的なプロモーターが、本発明の構築体に用いられてもよい。植物における発現を駆動するのに有用なプロモーターの非限定的な例として、ＲｕｂｉｓＣｏ小サブユニット遺伝子１のプロモーター（ＰｒｂｃＳ１）、アクチン遺伝子のプロモーター（Ｐａｃｔｉｎ）、硝酸還元酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｒ）、および重複炭素脱水酵素遺伝子１のプロモーター（Ｐｄｃａ１）が挙げられる（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２３：７２７－７３５（２００５）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ４０３：１３２－１４２（２００７）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３７：１１４３－１１５４（２０１０）参照）。ＰｒｂｃＳ１およびＰａｃｔｉｎは構成的プロモーターであり、ＰｎｒおよびＰｄｃａ１は誘導性プロモーターである。Ｐｎｒは、ニトラートによって誘導されて、アンモニウムによって抑制され（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ４０３：１３２－１４２（２００７））、そしてＰｄｃａ１は、塩によって誘導される（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３７：１１４３－１１５４（２０１０））。一部の実施形態において、本発明に有用なプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターである。一部の実施形態において、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来のＵ６プロモーターまたは７ＳＬプロモーターが、本発明の構築体に有用であり得る。一部の実施形態において、トウモロコシ由来のＵ６ｃプロモーターおよび／または７ＳＬプロモーターは、ガイド核酸の発現を駆動するのに有用であり得る。一部の実施形態において、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）由来のＵ６ｃプロモーター、Ｕ６ｉプロモーター、および／または７ＳＬプロモーターが、本発明の構築体に有用であり得る。一部の実施形態において、ダイズ由来のＵ６ｃプロモーター、Ｕ６ｉプロモーター、および／または７ＳＬプロモーターは、ガイド核酸の発現を駆動するのに有用であり得る。
【0060】
植物に有用な構成的プロモーターの例として、以下に限定されないが、セストラムウイルスプロモーター（ｃｍｐ）（米国特許第７，１６６，７７０号）、イネアクチン１プロモーター（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３３９９－３４０６、および米国特許第５，６４１，８７６号）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０－８１２）、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター（Ｌａｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３１５－３２４）、ｎｏｓプロモーター（Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８４：５７４５－５７４９）、Ａｄｈプロモーター（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６６２４－６６２９）、スクロース合成酵素プロモーター（Ｙａｎｇ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：４１４４－４１４８）、およびユビキチンプロモーターが挙げられる。ユビキチンに由来する構成的プロモーターは、多くの細胞型において蓄積している。ユビキチンプロモーターは、トランスジェニック植物に用いられるいくつかの植物種、例えば、ヒマワリ（Ｂｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ７９：８７－９４）、トウモロコシ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９－６３２）、およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：８９５－９０６）からクローニングされている。トウモロコシユビキチンプロモーター（ＵｂｉＰ）は、トランスジェニック単子葉植物系において開発されており、その配列、および単子葉植物形質転換のために構築されたベクターが、欧州特許出願公開第０３４２９２６号に開示されている。ユビキチンプロモーターは、トランスジェニック植物、とりわけ単子葉植物における本発明のヌクレオチド配列の発現に適している。さらに、ＭｃＥｌｒｏｙｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：１５０－１６０（１９９１））によって記載されるプロモーター発現カセットは、本発明のヌクレオチド配列の発現用に容易に修飾することができ、そして単子葉植物宿主に用いるのに特に適している。
【0061】
一部の実施形態において、組織特異的／組織選好プロモーターは、植物細胞内での異種ポリヌクレオチドの発現に用いることができる。組織特異的または組織選好発現パターンとして、以下に限定されないが、緑色組織特異的もしくは緑色組織選好、根特異的もしくは根選好、茎特異的もしくは茎選好、花卉特異的もしくは花卉選好、または花粉特異的もしくは花粉選好なものが挙げられる。緑色組織内での発現に適したプロモーターとして、光合成に関与する遺伝子を調節する多くのものが挙げられ、これらの多くは、単子葉植物および双子葉植物の双方からクローニングされている。一実施形態において、本発明に有用なプロモーターとして、ホスホエノールカルボキシラーゼ遺伝子由来のトウモロコシＰＥＰＣプロモーターがある（Ｈｕｄｓｐｅｔｈ ＆ Ｇｒｕｌａ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１２：５７９－５８９（１９８９））。組織特異的プロモーターの非限定的な例として、種子貯蔵タンパク質（例えば、β－コングリシニン、クルシフェリン、ｎａｐｉｎ、およびファゼオリン）、ゼインもしくは油体タンパク質（例えばオレオシン）、または脂肪酸生合成に関与するタンパク質（アシルキャリアタンパク質、ステアロイル－ＡＣＰデサチュラーゼ、および脂肪酸デサチュラーゼ（ｆａｄ２－１）が挙げられる）をコードする遺伝子、および胚発生中に発現される他の核酸（例えばＢｃｅ４、例えば、Ｋｒｉｄｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｅｄ Ｓｃｉ．Ｒｅｓ．１：２０９－２１９、および欧州特許出願公開第２５５３７８号参照）と関連するものが挙げられる。植物、特にトウモロコシにおける本発明のヌクレオチド配列の発現に有用な組織特異的または組織選好性プロモーターとして、以下に限定されないが、根、髄、葉、または花粉内での発現を導くものが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、国際公開第９３／０７２７８号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。本発明に有用な組織特異的または組織選好プロモーターの他の非限定的な例として、米国特許第６，０４０，５０４号に開示されるワタルビスコプロモーター、米国特許第５，６０４，１２１号に開示されるイネスクロース合成酵素プロモーター、ｄｅ Ｆｒａｍｏｎｄ（ＦＥＢＳ２９０：１０３－１０６（１９９１）、Ｃｉｂａ－Ｇｅｉｇｙの欧州特許出願公開第０４５２２６９号）によって記載される根特異的プロモーター、米国特許第５，６２５，１３６号（Ｃｉｂａ－Ｇｅｉｇｙ）に記載され、トウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の発現を駆動する茎特異的プロモーター、国際公開第０１／７３０８７号に開示されるケストルムイエローリーフカーリングウイルスプロモーター、ならびに花粉特異的または花粉選好プロモーター（イネ由来のＰｒｏＯｓＬＰＳ１０およびＰｒｏＯｓＬＰＳ１１（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ９（５）：２９７－３０６（２０１５））、トウモロコシ由来のＺｍＳＴＫ２＿ＵＳＰ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ６０（６）：４８５－４９５（２０１７））、トマト由来のＬＡＴ５２およびＬＡＴ５９（Ｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０９（３）：７０５－７１３（１９９０））、Ｚｍ１３（米国特許第１０，４２１，９７２号）、アラビドプシス由来のＰＬＡ２－δプロモーター（米国特許第７，１４１，４２４号）、ならびに／またはトウモロコシ由来のＺｍＣ５プロモーター（国際公開第１９９９／０４２５８７号）が挙げられるが、これらに限定されない）がある。
【0062】
植物組織特異的／組織選好プロモーターの更なる例として、以下に限定されないが、根毛特異的シスエレメント（ＲＨＥ）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１８：２９５８－２９７０（２００６））、根特異的プロモーターＲＣｃ３（Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５３：１８５－１９７（２０１０））およびＲＢ７（米国特許第５４５９２５２号）、レクチンプロモーター（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｄｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．１１：１６０－１６７およびＶｏｄｋｉｎ（１９８３）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．１３８：８７－９８）、トウモロコシアルコール脱水素酵素１プロモーター（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３９８３－４０００）、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン合成酵素（ＳＡＭ）（Ｖａｎｄｅｒ Ｍｉｊｎｓｂｒｕｇｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３７（８）：１１０８－１１１５）、トウモロコシ集光性複合体プロモーター（Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３６５４－３６５８）、トウモロコシヒートショックタンパク質プロモーター（Ｏ’Ｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．５：４５１－４５８およびＲｏｃｈｅｓｔｅｒｅｔ ａｌ．（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ．５：４５１－４５８）、エンドウ小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモーター（Ｃａｓｈｍｏｒｅ，“Ｎｕｃｌｅａｒ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｒｉｂｕｌｏｓｅ－１，５－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ”ｐｐ．２９－３９ Ｉｎ：Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ１９８３、およびＰｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：１９３－２００）、Ｔｉプラスミドマンノピン合成酵素プロモーター（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３２１９－３２２３）、Ｔｉプラスミドノパリン合成酵素プロモーター（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）、前掲）、ペチュニアカルコンイソメラーゼプロモーター（ｖａｎ Ｔｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７：１２５７－１２６３）、インゲンマメグリシンリッチタンパク質１プロモーター（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：１６３９－１６４６）、トランケート型ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏ’Ｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０－８１２）、ジャガイモパタチンプロモーター（Ｗｅｎｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：３４７－３５４）、根細胞プロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７４４９）、トウモロコシゼインプロモーター（Ｋｒｉｚ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０７：９０－９８、Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ３４：１０１５－１０２２、Ｒｅｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６４２５、Ｒｅｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７４４９、およびＷａｎｄｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２３５４）、グロブリン－１プロモーター（Ｂｅｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２９：８６３－８７２）、α－チューブリンｃａｂプロモーター（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５：４３１－４４０）、ＰＥＰＣａｓｅプロモーター（Ｈｕｄｓｐｅｔｈ ＆ Ｇｒｕｌａ（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５７９－５８９）、Ｒ遺伝子複合体－関連プロモーター（Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１：１１７５－１１８３）、ならびにカルコン合成酵素プロモーター（Ｆｒａｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２６０５－２６１２）が挙げられる。
【0063】
種子特異的発現に有用なものとして、エンドウビシリンプロモーター（Ｃｚａｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３５：３３－４０）、および米国特許第５，６２５，１３６号に開示される種子特異的プロモーターがある。成葉内での発現に有用なプロモーターとして、老化の開始時にスイッチされるもの、例えばアラビドプシス由来のＳＡＧプロモーター（Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：１９８６－１９８８）がある。
【0064】
また、葉緑体内で機能的なプロモーターを用いることができる。そのようなプロモーターの非限定的な例として、バクテリオファージＴ３遺伝子９ ５’ＵＴＲ、および米国特許第７，５７９，５１６号中で開示される他のプロモーターが挙げられる。本発明に有用な他のプロモーターとして、以下に限定されないが、Ｓ－Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモーターおよびクニッツトリプシンインヒビター遺伝子プロモーター（Ｋｔｉ３）が挙げられる。
【0065】
本発明に有用な更なる調節要素として、以下に限定されないが、イントロン、エンハンサ、終止配列、ならびに／または５’および３’非翻訳領域が挙げられる。
【0066】
本発明に有用なイントロンとして、植物において同定されて、植物から単離されてから、植物の形質転換に用いられることとなる発現カセット中に挿入されるイントロンがあり得る。当業者によって理解されるように、イントロンは、自己切除に必要とされる配列を含むことができ、そして核酸構築体／発現カセット中にフレーム単位で（ｉｎ ｆｒａｍｅ）組み込まれる。イントロンを、一核酸構築体内で複数のタンパク質コード配列を分離するスペーサーとして用いることもできるし、イントロンを、例えば、ｍＲＮＡを安定させるのに、一タンパク質コード配列の内側で用いることもできる。イントロンは、タンパク質コード配列内で用いられるならば、切除部位を含んだ「フレーム単位で」挿入される。また、イントロンは、発現を向上させるか、または修飾するように、プロモーターと関連してもよい。一例として、本発明に有用なプロモーター／イントロンの組合せとして、以下に限定されないが、トウモロコシＵｂｉ１プロモーターおよびイントロンが挙げられる。
【0067】
本発明に有用なイントロンの非限定的な例として、ＡＤＨＩ遺伝子（例えば、Ａｄｈ１－Ｓイントロン１、２、および６）、ユビキチン遺伝子（Ｕｂｉ１）、ＲｕＢｉｓＣｏ小サブユニット（ｒｂｃＳ）遺伝子、ＲｕＢｉｓＣｏ大サブユニット（ｒｂｃＬ）遺伝子、アクチン遺伝子（例えばアクチン－１イントロン）、ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ遺伝子（ｐｄｋ）、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｒ）、重複炭素脱水酵素遺伝子１（Ｔｄｃａ１）、ｐｓｂＡ遺伝子、ａｔｐＡ遺伝子、またはそれらのあらゆる組合せ由来のイントロンが挙げられる。
【0068】
一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよび／または核酸構築体は、「発現カセット」であってもよいし、発現カセット内に含まれていてもよい。本明細書中で用いられる「発現カセット」は、例えば、本発明の核酸構築体（例えば、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはドメイン、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、操作したＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドまたはドメイン、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型、ガイド核酸、第１の複合体、第２の複合体、第３の複合体その他）を含む組換え核酸分子を意味し、核酸構築体は、１つまたは複数の制御配列（例えば、プロモーター、ターミネーター等）と作動可能に関連する。ゆえに、本発明の一部の実施形態は、例えば、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現するように設計された発現カセットを提供する。発現カセットが複数のポリヌクレオチドを含む場合、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの全ての発現を駆動する単一のプロモーターに作動可能に連結されていてもよいし、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の別々のプロモーターに作動可能に連結されていてもよい（例えば、３つのポリヌクレオチドが、１つ、２つ、または３つのプロモーターによってあらゆる組合せで駆動されてもよい）。２つ以上の別々のプロモーターが用いられる場合、プロモーターは、同じプロモーターであってもよいし、異なるプロモーターであってもよい。ゆえに、例えば、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチド、ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチド、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチド、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型、および／またはガイド核酸（発現カセット内に含まれる場合）は各々、別々のプロモーターに作動可能に連結されていてもよいし、２つ以上のプロモーターにあらゆる組合せで作動可能に連結されていてもよい。一部の実施形態において、発現カセットおよび／またはその中に含まれるポリヌクレオチドは、植物内での発現のために最適化されていてもよい。
【0069】
本発明の核酸構築体を含む発現カセットは、キメラであってもよく、このことは、その構成要素の少なくとも１つが、その他の構成要素の少なくとも１つに関して、異種である（例えば、宿主生物において発現されることとなる、注目するポリヌクレオチドと作動可能に連結した、宿主生物由来のプロモーター。ここで、注目するポリヌクレオチドは、宿主とは異なる生物由来であるか、または当該プロモーターと関連して通常見出されない）ことを意味する。また、発現カセットは、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。
【0070】
発現カセットは、場合によっては、選択された宿主細胞内で機能的である転写および／または翻訳終止領域（すなわち、終止領域）および／またはエンハンサ領域を含み得る。種々の転写ターミネーターおよびエンハンサが、当該技術において知られており、発現カセットに用いるのに入手可能である。転写ターミネーターは、転写の終止および正確なｍＲＮＡポリアデニル化を担っている。終止領域および／またはエンハンサ領域は、転写開始領域に固有であってもよく、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする遺伝子に固有であってもよく、ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードする遺伝子、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子等は、宿主細胞に固有であってもよいし、別の源（例えば、プロモーター、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする遺伝子、ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドをコードする遺伝子、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子等、宿主細胞、またはそれらのあらゆる組合せに対して外来であるか、異種である）に固有であってもよい。
【0071】
また、本発明の発現カセットは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、これは、形質転換された宿主細胞を選択するのに用いることができる。本明細書中で用いられる「選択マーカー」は、発現された場合に、マーカーを発現する宿主細胞に目立った表現型を与えるので、そのような形質転換された細胞を、マーカーを有していない細胞から区別することができるポリヌクレオチド配列を意味する。そのようなポリヌクレオチド配列は、マーカーが、化学手段によって、例えば選択剤（例えば抗生物質等）を用いることによって選択され得る形質を付与するかどうかに応じて、またはマーカーが単純に、観察もしくは試験を通して、例えばスクリーニング（例えば蛍光）によって識別することができる形質であるかに応じて、選択マーカーまたはスクリーニングマーカーをコードし得る。適した選択マーカーの多くの例が、当該技術において知られており、本明細書中に記載される発現カセットに用いることができる。
【0072】
発現カセットに加えて、本明細書中に記載される核酸分子／構築体およびポリヌクレオチド配列は、ベクターと関連させて用いることができる。用語「ベクター」は、細胞中に核酸（複数可）を伝達するか、送達するか、または導入するための組成物を指す。ベクターは、伝達されるか、送達されるか、導入されるヌクレオチド配列を含む核酸構築体を含む。宿主生物の形質転換に用いられるベクターは、当該技術において周知である。ベクターの一般的なクラスの非限定的な例として、自己伝染性であっても可動性であってもよいしそうでなくてもよい二本鎖または一本鎖の直鎖状または環状の形態の、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、バクテリオファージ、人工染色体、ミニサークル、またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属バイナリベクターが挙げられる。一部の実施形態において、ウイルスベクターとして、以下に限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられ得る。本明細書中で定義されるベクターは、細胞ゲノム中への組込み、または染色体外の存在（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）のいずれかによって、原核生物宿主または真核生物宿主を形質転換することができる。加えて、含まれるのは、２つの異なる宿主生物内での複製が天然で、または設計によって可能なＤＮＡビヒクルを意味するシャトルベクターであり、これは、アクチノミセスおよび関連する種、細菌、および真核生物（例えば、より高次の植物、哺乳動物、酵母、または真菌の細胞）から選択され得る。一部の実施形態において、ベクター内の核酸は、宿主細胞内での転写に適したプロモーターまたは他の調節要素の制御下にあり、かつこれと作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主において機能する二元機能性発現ベクターであってもよい。ゲノムＤＮＡの場合には、これは、それ自体のプロモーターおよび／または他の調節要素を含有してもよく、そしてｃＤＮＡの場合には、これは、宿主細胞内での発現に適したプロモーターおよび／または他の調節要素の制御下にあってもよい。したがって、本発明の核酸構築体もしくはポリヌクレオチド、および／またはこれを含む発現カセットが、本明細書中に記載されるベクター、および当該技術において知られているベクター内に含まれてもよい。
【0073】
本明細書中で用いられる「接触させる」、「接触させている」、「接触した」、およびその文法上の変形は、所望される反応（例えば、形質転換、転写制御、ゲノム編集、ニッキング、および／または切断）の構成要素（複数）を、所望される反応を実行するのに適した条件下に一緒に置くことを指す。非限定的な例として、標的核酸を、配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型、ガイド核酸、および／またはこれをコードする／含む核酸構築体／発現カセットと、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが発現され、かつ配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が標的核酸に結合し、かつＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に融合されるか、または配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質にリクルートされる（例えば、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に融合されたペプチドタグ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに融合された親和性ポリペプチド（例えば、ペプチドタグに結合することができるポリペプチド）を介して）ことによって、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、標的核酸の付近にリクルートすることによって、標的核酸を修飾する条件下で、接触させてもよい。
【0074】
本明細書中で用いられる、標的核酸に関する「修飾すること」または「修飾」は、編集（例えば変異）、共有結合修飾、核酸／ヌクレオチド塩基の交換／置換、欠失、切断、ニッキング、および／または標的核酸の転写制御を含む。一部の実施形態において、修飾は、あらゆるサイズのインデルおよび／またはあらゆるタイプの単一塩基変化（ＳＮＰ）を含んでもよい。
【0075】
注目するポリヌクレオチドの文脈における「導入すること」、「導入する」、「導入された」（およびその文法上の変形）は、注目するヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチド、核酸構築体、および／またはガイド核酸）を、宿主生物または前記生物の細胞（例えば、宿主細胞、例えば、植物細胞、動物細胞、細菌細胞、真菌細胞）に、ヌクレオチド配列が細胞の内部にアクセスするように提示することを意味する。
【0076】
用語「形質転換」または「形質移入」は、互換的に用いられ得、そして本明細書中で用いられるような、細胞中への異種核酸の導入を指す。細胞の形質転換は、安定していてもよいし、一過性であってもよい。ゆえに、一部の実施形態において、宿主細胞または宿主生物は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子で安定して形質転換されていてもよい。一部の実施形態において、宿主細胞または宿主生物は、本発明の核酸構築体で一時的に形質転換されていてもよい。
【0077】
ポリヌクレオチドの文脈における「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドが細胞中に導入されて、細胞のゲノム中に組み込まれないことを意味する。
【0078】
細胞中に導入されるポリヌクレオチドの文脈における、「安定して導入すること」または「安定して導入される」によって意図されるのは、導入されたポリヌクレオチドが、細胞のゲノム中に安定して組み込まれていることで、細胞は、ポリヌクレオチドで安定して形質転換されていることである。
【0079】
本明細書中で用いられる「安定した形質転換」または「安定して形質転換された」は、核酸分子が細胞中に導入されて、細胞のゲノム中に組み込まれることを意味する。したがって、組み込まれた核酸分子は、その後代によって、より詳細には複数の連続する世代の後代によって遺伝することができる。本明細書中で用いられる「ゲノム」は、核ゲノムおよび色素体ゲノムを含むので、例えば、葉緑体ゲノムまたはミトコンドリアゲノム中への核酸の組込みを含む。また、本明細書中で用いられる安定した形質転換は、例えば微小染色体またはプラスミドとして、染色体外に維持される導入遺伝子を指し得る。
【0080】
一過性の形質転換は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはウェスタンブロットによって検出され得、これらは、生物中に導入される１つまたは複数の導入遺伝子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの存在を検出することができる。細胞の安定した形質転換は、例えば、核酸配列との細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができ、これは、生物（例えば植物）中に導入される導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするものである。細胞の安定した形質転換は、例えば、核酸配列との細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができ、これは、宿主生物中に導入される導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする。また、細胞の安定した形質転換は、例えば、当該技術において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の増幅反応によって検出することができ、これは、導入遺伝子の標的配列とハイブリダイズする特異的プライマー配列を使用して、導入遺伝子配列の増幅をもたらし、これが標準的な方法に従って検出され得る。また、形質転換は、当該技術において周知である直接の配列決定および／またはハイブリダイゼーションプロトコールによって検出することができる。
【0081】
したがって、一部の実施形態において、本発明のヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド、核酸構築体、および／または発現カセットは、一過性に発現され得、かつ／または宿主生物のゲノム中に安定して組み込まれ得る。ゆえに、一部の実施形態において、本発明の核酸構築体（例えば、例えば、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはドメイン、ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドまたはドメイン、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドまたはドメインその他をコードする１つまたは複数の発現カセット）が、ガイド核酸により細胞中に一過性に導入されるので、ＤＮＡは細胞内で維持され得ない。
【0082】
本発明の核酸構築体が、当業者に知られているあらゆる方法によって、細胞中に導入され得る。本発明の一部の実施形態において、細胞の形質転換は、核形質転換を含む。他の実施形態において、細胞の形質転換は、色素体形質転換（例えば葉緑体形質転換）を含む。更なる実施形態において、本発明の組換え核酸構築体は、従来の育種技術を介して細胞中に導入することができる。
【0083】
真核生物および原核生物の双方を形質転換する手順は、当該技術において周知であり、かつルーチンであり、文献の全体を通して記載されている（例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ８：２２８１－２３０８（２０１３）参照）。
【0084】
したがって、ヌクレオチド配列は、当該技術において周知であるいくつもの方法により、宿主生物またはその細胞中に導入することができる。本発明の方法は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を生物中に導入するが、生物の少なくとも１つの細胞の内部にアクセスする特定の方法に依存しない。複数のヌクレオチド配列が導入されることとなる場合、これらは、単一の核酸構築体の一部として、または別々の核酸構築体としてアセンブルすることができ、そして同じであるか、または異なる核酸構築体上に位置決めすることができる。したがって、ヌクレオチド配列は、単一の形質転換事象で、かつ／もしくは別々の形質転換事象で、注目する細胞中に導入することができ、またはこれ以外にも、関連する場合、ヌクレオチド配列は、植物中に、例えば育種プロトコールの一部として、組み込むことができる。
【0085】
相同組換えによる内因性ＤＳＢ修復は、操作するのが困難であり、エラー傾向がある非相同末端結合パスウェイ由来の競合に直面する。本発明において、鋳型を用いた編集は、修復の効率を引き下げるＤＳＢのバイパス工程の向上である。ポリペプチドおよび核酸、ならびにタンパク質－タンパク質融合および非共有結合性のリクルート（recruitments）の新規の組合せを利用して、高いフィデリティの、プロセッシブまたは分配型ＤＮＡポリメラーゼ、および修復鋳型を、配列特異的に標的部位に送達する。標的部位は、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と組み合わせて提供される、ＤＮＡエンドヌクレアーゼもしくはニッカーゼ活性を含む配列特異的ＤＮＡ結合ドメインによって、またはエンドヌクレアーゼ活性もしくはニッカーゼ活性を有するＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されるか、またはニックが入れられる。ＤＮＡによりコードされた修復鋳型、および一本鎖ニックまたは二本鎖切断を有する標的ＤＮＡをプライマーとして用いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成を直ちに開始して、所望の変異または大きな挿入断片を標的部位中にコピーすることができる。本発明を用いて、単一塩基もしくは数塩基の特定の変化、定義されたゲノム配列の欠失、または小さな断片もしくは大きな断片の挿入を生成することができる。
【0086】
複数のＤＮＡリクルート戦略が、本明細書中に記載されるように、標的への修復鋳型の送達を向上させるのに用いられてもよく、例えば、ＨＵＨ－タグ、ＤＮＡアプタマー、細菌レトロンのｍｓＤＮＡ、および／またはＴ－ＤＮＡリクルートが挙げられる。鋳型可用性を向上させるための一具体例として、ＨＵＨ－タグの一タイプであるＰＣＶの使用がある。ＰＣＶドメインを、例えば、標的核酸内にニックまたは切断を生じさせる、ニッカーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質に融合することができる。ＰＣＶ認識部位の配列が、修復鋳型内に含まれるので、修復鋳型は、対応するＰＣＶドメインと相互作用する能力により標的部位にリクルートされ得る。リクルートは、ニックまたは切断がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質によって標的核酸内に生じるのとおおよそ同時に起こり得る。
【0087】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、相同組換えを実行するのに重要な構成要素である。一本鎖ニックまたは二本鎖切断を含む標的核酸の３’末端は、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型にアニールすることができ、そして、鎖合成を開始することによって修復鋳型から標的部位までの遺伝的情報をコピーするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとしての役目を果たす。一部の実施形態において、本プロセスに用いられるＤＮＡポリメラーゼは、エラーを防ぐ高いフィデリティを有し得、かつ／またはＤＮＡポリメラーゼが解離する前に長い鋳型がコピーされるのを確実にする高いプロセッシビティを示し得る。標的核酸に結合するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタポリペプチド／複合体とのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの関連の文脈において、標的中への鋳型組込みの効率を最大にする分配機能を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを有することが有利であり得る。この工程を促進するために、高いフィデリティ、ならびにプロセッシブプロファイルおよび分配プロファイルを有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、例えば配列特異的ＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質）との、タンパク質融合または非共有結合性の相互作用のいずれかによってリクルートすることができる。直接的融合は、最適化されたリンカーアーキテクチャを介してなされ得る。非共有結合性のリクルート戦略として、ガイド核酸（例えばＲＮＡリクルートモチーフ、例えばＭＳ２ループ）を介したリクルート、または配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質）および／もしくはＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ペプチドタグ、例えば抗体／エピトープ相互作用、例えばＳｕｎＴａｇを介する）を介したリクルートが挙げられ得る。勿論、本発明は、これらの特定のリクルート技術によって制限されず、そして他の、知られているか、もしくは後に開発されるあらゆるタンパク質－タンパク質、または現在知られているか、もしくは後に開発される核酸－タンパク質リクルート技術を、本発明を実行するのに用いてもよい。
【0088】
本発明者らは、鋳型を用いた編集の向上を実現する組成物および方法を開発した。タンパク質－タンパク質融合および非共有結合性のリクルートの組合せを用いて、高いフィデリティの、プロセッシブまたは分配型ＤＮＡポリメラーゼが、標的部位に配列特異的に送達され、当該部位は、例えば、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼによって切断されてもよいし、ニックが入れられてもよい。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型と組み合わせて、一本鎖ニックまたは二本鎖切断を有する標的ＤＮＡをプライマーとして用いることによって、ＤＮＡ合成を直ちに開始して、所望の変異または大きな挿入断片を標的部位中にコピーすることができる。本明細書中に記載される本発明およびその変形を利用して、単一塩基もしくは少数の塩基の特定の変化、定義されたゲノム配列の欠失、または小さな断片もしくは大きな断片の挿入を形成することができる。
【0089】
ゆえに、一部の実施形態において、本発明は、（ａ）標的核酸上の部位（例えば第１の部位）に結合することができる配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）、および（ｂ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を含む複合体（例えば第１の複合体）を提供する。一部の実施形態において、複合体は、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型（例えば、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型）を含んでもよい。一部の実施形態において、複合体は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を含んでもよく、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、一本鎖ニックもしくは二本鎖切断を導入することができ、または標的核酸上の部位（例えば第１の部位）に結合することができる配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もまた、一本鎖ニックもしくは二本鎖切断（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質）を導入することができるエンドヌクレアーゼ活性を含む。
【0090】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）標的核酸上の部位（例えば第１の部位）に結合することができ、かつ一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入することができるエンドヌクレアーゼ活性を含む配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｃ）ＤＮＡによりコードされた修復鋳型（例えば、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型）を含む複合体（例えば第１の複合体）を提供する。
【0091】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）標的核酸上の部位（例えば第１の部位）に結合することができる配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）、（ｂ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、（ｃ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ）、および（ｄ）ＤＮＡによりコードされた修復鋳型（例えば、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型）を含む複合体（例えば第１の複合体）を提供する。
【0092】
一部の実施形態において、本発明の複合体（例えば第１の複合体）の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／またはアルゴノートタンパク質由来であってもよい。一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド、ジンクフィンガー、転写アクティベータ様エフェクタ、および／またはアルゴノートタンパク質由来であってもよい。
【0093】
一部の実施形態において、本発明の複合体（例えば第１の複合体）に有用なＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性は、エンドヌクレアーゼ（例えばＦｏｋ１）、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および／または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であってもよいし、これらに由来してもよい。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼであってもニッカーゼであってもよいし、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性であってもニッカーゼ活性であってもよい。
【0094】
一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、場合によってはリンカーを介して融合されていてもよい。一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、そのＮ末端にて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに融合されていてもよい。一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、そのＣ末端にて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに融合されていてもよい。
【0095】
本発明はさらに、ペプチドタグまたはＲＮＡリクルートモチーフと相互作用することができる親和性ポリペプチドに融合された操作された（修飾された）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。一部の実施形態において、本発明の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに融合されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含んでもよく、場合によっては、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインは、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）由来のＳｓｏ７ｄ由来の配列非特異的ｄｓＤＮＡ結合タンパク質であってもよい。本発明の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書中に記載されるように操作されていない同じＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと比較して、プロセッシビティの増大、フィデリティの増大、親和性の増大、配列特異性の増大、配列特異性の低下、および／または協同作用の増大を示し得る。一部の実施形態において、操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’－ポリメラーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、および／または５’→３’ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の少なくとも１つを引き下げるか、または排除するように修飾されていてもよい。ゆえに、操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’－ポリメラーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、および／または５’→３’ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の少なくとも１つの活性を含まなくてもよい
【0096】
一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）が、ペプチドタグに融合されていてもよく、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）が、ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよく、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ペプチドタグに融合された配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に（そして、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が結合している可能性がある標的核酸に）リクルートされ得る。一部の実施形態において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）が、ペプチドタグに融合されていてもよく、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）が、ペプチドタグに結合することによって、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、親和性ポリペプチドに融合された配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が結合する標的核酸にリクルートすることができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよい。
【0097】
本発明の複合体はさらに、ガイド核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ核酸、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含んでもよい。ガイド核酸は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質と組み合わせて用いられてもよく、これは、一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を含んでもよい。一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性は、例えば、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および／または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に由来してもよい。
【0098】
一部の実施形態において、ガイド核酸は、ＲＮＡリクルートモチーフに連結されていてもよく、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡリクルートモチーフに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよい。一部の実施形態において、ＲＮＡリクルートモチーフは、ＣＲＩＳＰＲ核酸（例えば、リクルートｃｒＲＮＡ、リクルートｃｒＤＮＡ）の５’末端に、または３’末端に連結されていてもよい。
【0099】
一部の実施形態において、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、標的核酸に、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型を、標的核酸に対して相補性を有するスペーサーを含むガイド核酸に連結することによってリクルートされてもよい。
【0100】
本発明は、更なる複合体（例えば第２の複合体）を提供してもよく、当該複合体は、（ａ）標的核酸上の第２の部位に結合することができる配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）、および（ｂ）ＤＮＡによりコードされた修復鋳型（例えば、第１または第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型）を含む。一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／またはアルゴノートタンパク質由来であってもよい。一部の実施形態において、複合体（例えば、第２の複合体）はさらに、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を含んでもよく、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、一本鎖ニックまたは二本鎖切断を標的核酸中に導入することができる。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）由来であってもよい。一部の実施形態において、標的核酸上の第２の部位に結合することができる第２の複合体の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質はさらに、一本鎖ニックまたは二本鎖切断を標的核酸内に導入することができるエンドヌクレアーゼ活性を含んでもよい。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼ活性をさらに含む配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）は、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であってもよい。
【0101】
一部の実施形態において、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、ＤＮＡリクルートモチーフに連結されていてもよく、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡリクルートモチーフと相互作用することができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよく、場合によっては、ＤＮＡリクルートモチーフ／親和性ポリペプチドは、ＨＵＨ－タグ、ＤＮＡアプタマー、細菌レトロンのｍｓＤＮＡ、または抗体／エピトープ対（例えばＴ－ＤＮＡリクルート）を含む。一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が、ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ）Ｒｅｐタンパク質に融合されていてもよく、ＤＮＡ鋳型は、ＰＣＶ認識部位を含む。一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、そのＮ末端にて、ＰＣＶ Ｒｅｐタンパク質に融合されていてもよい。一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、そのＣ末端にて、ＰＣＶ Ｒｅｐタンパク質に融合されていてもよい。本発明に有用であり得るＨＵＨ－タグの非限定的な例およびその対応する認識配列を、表１に記載する。
【0102】
【0103】
一部の実施形態において、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型を、アグロバクテリウム属エフェクタタンパク質（例えば、アグロバクテリウム属病原性ポリペプチド、場合によってはｖｉｒＤ２および／またはｖｉｒＥ２）と相互作用するＴ－ＤＮＡ配列中に組み込むことによって、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型を標的核酸にリクルートしてもよく、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、アグロバクテリウム属エフェクタタンパク質にリクルートされることによって、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型を、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が結合する標的核酸にリクルートし得る。一例として、１つまたは複数のエピトープタグが、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に融合されていてもよく、エピトープタグを認識する抗体が、アグロバクテリウム属エフェクタタンパク質に融合されており、それによって、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質およびアグロバクテリウム属エフェクタタンパク質は、植物細胞内で相互作用することが可能となり得る。アグロバクテリウム属エフェクタタンパク質と関連するあらゆるＴ－ＤＮＡ配列が、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の作用によって、標的核酸にリクルートされることとなる。
【0104】
一部の実施形態において、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型へのＤＮＡアプタマーの付着によって、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が標的核酸にリクルートされてもよい。ＤＮＡアプタマーは、その固有の二次構造に起因して、高い親和性で特定の標的に結合することができるＤＮＡの配列である。ＤＮＡアプタマーガイド遺伝子ターゲティングが、ヒトおよび酵母系におけるエンドヌクレアーゼＩ－ＳｃｅＩ媒介遺伝子ターゲティングについて実証されている。候補ＤＮＡアプタマーのプールが、特異的ＣＲＩＰＳＲタンパク質（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１その他）との親和性について、キャピラリ電気泳動によってスクリーニングされ得る。選択されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質への親和性が最も高いＤＮＡアプタマーは、単鎖ＤＮＡ鋳型に付着されて、ＤＮＡ鋳型をＣＲＩＳＰＲタンパク質標的遺伝子座へとガイドすることとなる。
【0105】
一部の実施形態において、修復鋳型は、ガイドＲＮＡに付着される細菌レトロン足場からｍｓＤＮＡとして発現され得る。細菌レトロンは、逆転写酵素をコードする細菌要素であり、これは、転写されたレトロンゲノムの特定の部分を認識して、これを、単鎖ＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）の複数のコピーを生成する鋳型として用いる。ｍｓＤＮＡは、ＲＮＡ鋳型に繋がれたままである。レトロンＲＮＡ足場配列を、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ足場に、遺伝子編集に所望の修復鋳型で置換されたレトロンゲノムの部分を有する伸長部として加えることができる。ガイドＲＮＡ足場伸長部に繋がれたｍｓＤＮＡとしての鋳型の発現により、切断がなされると同時に、修復鋳型の複数のコピーの切断部位への送達が可能となる。この系は、酵母において実証されているが、哺乳動物系においても植物系においても実証されていない。本発明に有用な、例示的な細菌レトロンが、表２に記載されている。
【0106】
【0107】
鋳型を用いた編集をヒトゲノム標的ＦＡＮＣＦ０１内に導入するように設計されたキメラガイド核酸配列（ガイドＤＮＡ）の例として、
ｅｃ６７レトロン足場の後に続く、単一のガイド核酸（ｓｇ核酸）（イタリック体の小文字）内に埋め込まれている修復鋳型（太字）：
ｅｃ６７レトロン足場の後に続く、単一のガイド核酸（ｓｇ核酸）（イタリック体の小文字）内に埋め込まれている修復鋳型（太字）：
【0108】
ｅｃ８６レトロン足場の後に続く、単一のガイド核酸（ｓｇ核酸）（イタリック体の小文字）内に埋め込まれている修復鋳型（太字）：
【0109】
ｅｃ１０７レトロン足場の後に続く、単一のガイド核酸（ｓｇ核酸）（イタリック体の小文字）内に埋め込まれている修復鋳型（太字）：
【0110】
ｍｘ１６２レトロン足場の後に続く、単一のガイド核酸（ｓｇ核酸）（イタリック体の小文字）内に埋め込まれている修復鋳型（太字）：
が挙げられるが、これらに限定されない。
【0111】
一部の実施形態において、複合体（例えば第２の複合体）はさらに、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を含んでもよい。
【0112】
一部の実施形態において、複合体（例えば、第２の複合体）はさらに、ガイド核酸を含んでもよく、場合によっては、ガイド核酸は、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型（例えば、第１または第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型）に連結されていてもよい。
【0113】
一部の実施形態において、第３の複合体が提供されてもよく、第３の複合体は、第１の部位および第２の部位とは異なる鎖上にある標的核酸上の部位（例えば、第３の部位）に結合することができる配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、第３の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）、ならびにＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、第３のＤＮＡエンドヌクレアーゼ）（例えば、単鎖切断を生成することができるニッカーゼ）を含む。一部の実施形態において、標的核酸を第３の複合体と接触させることで、ミスマッチ修復を向上させることによって、修復の効率をブーストし得る。
【0114】
一部の実施形態において、本発明は、ＲＮＡ分子を提供し、ＲＮＡ分子は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質との相互作用を媒介する核酸配列、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質を特異的核酸標的部位にＤＮＡ－ＲＮＡ相互作用を介して向ける核酸配列、および（ｃ）本発明の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと相互作用することができるステムループ構造（例えば、ＲＮＡリクルートモチーフ）を形成する核酸配列を含む。一部の態様において、本発明は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質との相互作用を媒介する核酸配列、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質を特定の核酸標的部位にＤＮＡ－ＲＮＡ相互作用を介して向ける核酸配列、および（ｃ）ステムループ構造を形成する核酸配列を含むＲＮＡ分子と複合体形成された、本発明の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【0115】
本発明はさらに、本発明の複合体（例えば、第１の複合体、第２の複合体、および／または第３の複合体）をコードし、かつ／あるいは配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、および／または第３の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および／または第３のＤＮＡエンドヌクレアーゼ）の１つまたは複数をコードし、あるいはＤＮＡによりコードされた修復鋳型（例えば、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型および／または第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型）の１つもしくは複数、または１つもしくは複数のガイド核酸（例えば、第１のガイド核酸、第２のガイド核酸、および／または第３のガイド核酸等）を含むポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、本発明の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書中でさらに提供されるのは、本発明のポリヌクレオチドの１つまたは複数を含む１つまたは複数の発現カセットおよび／またはベクターである。
【0116】
本発明の一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン、配列非特異的ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに／またはこれを含む発現カセットおよび／もしくはベクターが、細胞または生物（例えば、例えば、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、魚等）、植物（例えば、双子葉植物、単子葉植物）、細菌、古細菌等の生物および／または細胞）内での発現のためにコドン最適化されていてもよい。一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含む／本発明の複合体／ポリペプチドをコードする発現カセットは、双子葉植物内での発現のために、または単子葉植物内での発現のためにコドンが最適化されていてもよい。
【0117】
本発明はさらに、標的核酸を修飾するための本発明の組成物を用いる方法を提供する。したがって、本発明は、標的核酸を修飾する方法を提供し、当該方法は、標的核酸または標的核酸を含む細胞を、本発明の複合体もしくはシステム、これらをコードする／含むポリヌクレオチド、または本発明の複合体もしくはシステムの構成要素の１つまたは複数、ならびに／あるいはこれらを含む発現カセットおよび／またはベクターと接触させることを含む。当該方法は、インビボ系で（例えば、細胞内で、または生物内で）実行されてもよいし、インビトロ系で（例えば、細胞フリーで）実行されてもよい。本発明のポリペプチドおよび複合体、ならびにこれらをコードするポリヌクレオチド／発現カセット／ベクターは、例えば植物または植物細胞内で、標的核酸を修飾する方法に用いられ得、当該方法は、本発明の１つまたは複数の発現カセットを、植物または植物細胞中に導入することによって、植物または植物細胞内で標的核酸を修飾して、修飾された標的核酸を含む植物または植物細胞を生成することを含む。一部の実施形態において、当該方法はさらに、修飾された標的核酸を含む植物細胞を再生して、修飾された標的核酸を含む植物を生成することを含み得る。
【0118】
一部の実施形態において、標的核酸を修飾する方法が提供され、当該方法は、標的核酸を本発明の複合体（例えば第１の複合体）と接触させることによって、標的核酸を修飾することを含む。一部の実施形態において、当該方法はさらに、標的核酸を本発明の第２の複合体と接触させることによって、標的核酸を修飾することを含み得る。一部の実施形態において、標的核酸はさらに、本発明の第３の複合体と接触することによって、標的核酸の修飾の修復効率を向上させ得る。
【0119】
一部の実施形態において、標的核酸を修飾する方法が提供され、当該方法は、標的核酸を、（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができる第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および（ｄ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型と接触させることによって、標的核酸を修飾することを含む。一部の実施形態において、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、複合体を形成し得、当該複合体は、標的核酸と相互作用し得る。
【0120】
一部の実施形態において、標的核酸を修飾する方法が提供され、当該方法は、標的核酸を、（ａ）標的核酸上の第１の部位に結合することができる第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質であって、一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入することができるニッカーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を含む第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｃ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型と接触させることによって、標的核酸を修飾することを含む。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼ活性を含む第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、標的核酸と相互作用することができる複合体を形成し得る。第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性および／またはニッカーゼ活性は、例えば、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および／または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）由来であってもよい。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼ活性を含む第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および／または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であってもよい。第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／またはアルゴノートタンパク質由来であってもよい。
【0121】
一部の実施形態において、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、場合によってはリンカーを介して融合されていてもよい。一部の実施形態において、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、そのＮ末端にて、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに融合されていてもよい。一部の実施形態において、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、そのＣ末端にて、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに融合されていてもよい。一部の実施形態において、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ペプチドタグに融合されていてもよく、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよく、それによって、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、ペプチドタグに融合された第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が結合し、かつ／または結合することができる標的核酸にリクルートされる。一部の実施形態において、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ペプチドタグに融合されていてもよく、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよく、それによって、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、親和性ポリペプチドに融合された第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が結合し、かつ／または結合することができる標的核酸にリクルートされる。
【0122】
本発明の一部の実施形態において、第１の配列特異的ＤＮＡ結合ドメインおよび／または第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質であってもよいし、これに由来してもよく、標的核酸は、ＤＮＡ－ＲＮＡ相互作用を介してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質を特定の核酸標的部位に向けるガイド核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ核酸、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）（例えば、第１のガイド核酸）と接触し得る。一部の実施形態において、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型（例えば、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型）は、ガイド核酸に連結されていてもよく、それによって、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が標的核酸へとガイドされる。一部の実施形態において、ガイド核酸は、ＲＮＡリクルートモチーフに連結されていてもよく、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）は、ＲＮＡリクルートモチーフに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよく、それによって、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが標的核酸へとガイドされる。ＲＮＡリクルートモチーフは、ガイド核酸（例えば、リクルートｃｒＲＮＡ、リクルートｃｒＤＮＡ）の５’末端に、または３’末端に連結されていてもよい。
【0123】
一部の実施形態において、本発明の第１の複合体と接触した標的核酸は、本発明の第２の複合体と接触し得、第２の複合体は、（ａ）標的核酸上の第２の部位に結合することができる第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、および（ｂ）ＤＮＡによりコードされた修復鋳型（例えば、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型または第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型）を含む。一部の実施形態において、標的核酸はさらに、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触し、または第２の複合体はさらに、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼを含み、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、標的核酸中に一本鎖ニックまたは二本鎖切断を導入することができる。代わりに、または加えて、第２の複合体の第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、一本鎖ニックまたは二本鎖切断を標的核酸中に導入し得るエンドヌクレアーゼ活性それ自体を含んでもよい。一部の実施形態において、標的核酸上の第２の部位に結合することができる第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型、および場合によっては、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、標的核酸上の第２の部位と相互作用する複合体を形成し得る。
【0124】
一部の実施形態において、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ペプチドタグに融合されていてもよく、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよく、それによって、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ペプチドタグに融合された第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が結合し、かつ／または結合することができる標的核酸上の第２の部位にリクルートされる。一部の実施形態において、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ペプチドタグに融合されていてもよく、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよく、それによって、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、親和性ポリペプチドに融合された第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が結合し、かつ／または結合することができる標的核酸上の第２の部位にリクルートされる。
【0125】
一部の実施形態において、第２の複合体の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型（例えば、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型または第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型）は、ＤＮＡリクルートモチーフに連結されていてもよく、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡリクルートモチーフと相互作用することができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよく、場合によっては、ＤＮＡリクルートモチーフ／親和性ポリペプチドは、ＨＵＨ－タグ（例えば、表１参照）、ＤＮＡアプタマー、細菌レトロンのｍｓＤＮＡ、またはＴ－ＤＮＡリクルートを含むことによって、第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型を配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、および配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質が結合することができる標的核酸にリクルートする。一部の実施形態において、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ）Ｒｅｐタンパク質に融合されていてもよく、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、ＰＣＶ認識部位を含んでもよい。
【0126】
一部の実施形態において、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、以下に由来してもよく、かつ／またはポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／もしくはアルゴノートタンパク質であってもよい。一部の実施形態において、第２のＤＮＡ結合ドメインおよび／または第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、以下に由来してもよく、かつ／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質であってもよく、標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質を特定の核酸標的部位にＤＮＡ－ＲＮＡ相互作用を介して向けるガイド核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ核酸、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）（例えば、第２のガイド核酸）と接触し得る。一部の実施形態において、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型（例えば、第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型）は、ガイド核酸に連結されていてもよく、それによって、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が標的核酸へとガイドされる。一部の実施形態において、第２のガイド核酸は、ＲＮＡリクルートモチーフに連結されていてもよく、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＲＮＡリクルートモチーフに結合することができる親和性ポリペプチドに融合されていてもよく、それによって、ガイド核酸は、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼを標的核酸へとガイドする。ＲＮＡリクルートモチーフは、ガイド核酸（例えば、リクルートｃｒＲＮＡ、リクルートｃｒＤＮＡ）の５’末端に、または３’末端に連結されていてもよい。
【0127】
一部の実施形態において、第２の複合体と接触した標的核酸はさらに、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）と接触し得る。一部の実施形態において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、第２の複合体内に含まれてもよい。
【0128】
本発明の方法はさらに、標的核酸を第３の複合体と接触させることを含んでもよく、第３の複合体は、第１の部位および第２の部位と異なる鎖上にある標的核酸上の第３の部位に結合することができる第３の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含み、第３の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を含むことによって、標的核酸の修飾の修復効率を向上させる。
【0129】
一部の実施形態において、本発明は、本発明の第１の複合体、これをコードするポリヌクレオチド、および／または当該ポリヌクレオチドを含む発現カセットもしくはベクターを含む、標的核酸を修飾するためのシステムを提供し、（ａ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を含む第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、標的核酸上の第１の部位に結合し、（ｂ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と相互作用することができ、かつ第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして標的核酸上の第１の部位にリクルートされ、（ｃ）（ｉ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、標的核酸上の第１の部位に対して実質的な相補性を有するスペーサー配列を含む第１のガイド核酸に連結されており、それによって、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、標的核酸上の第１の部位へとガイドされ、または（ｃ）（ｉｉ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと相互作用することができ、かつ第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、そして標的核酸上の第１の部位にリクルートされることによって、標的核酸を修飾する。
【0130】
一部の実施形態において、標的核酸を修飾するためのシステムが提供され、当該システムは、本発明の第１の複合体、これをコードするポリヌクレオチド、および／または当該ポリヌクレオチドを含む発現カセットもしくはベクターを含み、（ａ）第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、標的核酸上の第１の部位に結合し、（ｂ）第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質および／またはガイド核酸と相互作用することができ、かつ第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして標的核酸上の第１の部位にリクルートされ、（ｃ）第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質および／またはガイド核酸と相互作用することができ、かつ第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に、そして標的核酸上の第１の部位にリクルートされ、（ｄ）（ｉ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、標的核酸上の第１の部位に対して実質的な相補性を有するスペーサー配列を含むガイド核酸に連結されており、それによって、第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型が、標的核酸上の第１の部位へとガイドされ、または（ｄ）（ｉｉ）第１の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと相互作用することができ、かつ配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質もしくは第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに、そして標的核酸上の第１の部位にリクルートされることによって、標的核酸を修飾する。
【0131】
一部の実施形態において、標的核酸を修飾するための本発明のシステムはさらに、本発明の第２の複合体、これをコードするポリヌクレオチド、ならびに／または当該ポリヌクレオチドを含む発現カセットおよび／もしくはベクターを含んでもよく、第２の配列特異的ＤＮＡ結合ドメインは、標的核酸上の第１の部位に近位の第２の部位に結合し、第２の、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型は、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に（共有結合性の相互作用または非共有結合性の相互作用を介して）リクルートされることによって、標的核酸を修飾する。
【0132】
本発明に有用なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１および／または第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）は、あらゆるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、当該技術において周知であり、その非限定的なリストが、Ｐｏｌｂａｓｅウェブサイト（ｐｏｌｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）にて見出され得る。一部の実施形態において、本発明に有用なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性、および／または５’－３’ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含んでもよい。一部の実施形態において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性、および５’－３’ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の１つまたは複数を取り除くように修飾または操作されていてもよい。
【0133】
一部の実施形態において、送達および／または活性が向上したＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１および／または第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）が提供され得、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、クレノウ断片またはそのサブ断片を含む。一例として、約６８ｋＤａのサイズであるか、または完全長（１０９ｋＤａ）のＤＮＡポリメラーゼＩの分子量の６２％である大腸菌クレノウ断片が用いられてもよい。
【0134】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、温度感受性、プロセッシビティ、およびＤＮＡ結合ドメインへの融合を介した鋳型親和性について向上し得る。ゆえに、例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１および／または第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）が、配列非特異的ＤＮＡ結合タンパク質に融合されて、温度感受性、プロセッシビティ、および／または鋳型親和性が向上したＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが提供され得る。一部の実施形態において、配列非特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、スルホロブス・ソルファタリカス由来のＳｓｏ７ｄが挙げられ得るがこれに限定されない配列非特異的ｄｓＤＮＡ結合タンパク質であってもよい。
【0135】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）は、ヒト、酵母、細菌、または植物由来であってもよい。一部の実施形態において、本発明に有用なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして、以下に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼε（例えば、ヒトおよび酵母）、ＤＮＡポリメラーゼδ、大腸菌ポリメラーゼＩ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５Ｕ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、および／またはＰｈｉｒｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられ得る。一部の実施形態において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ヒトＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼε、植物ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼε、および／または酵母ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼε（例えば、配列番号４８～５８参照）であってもよい。
【0136】
一部の実施形態において、本発明に有用なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、高いフィデリティおよび／または高いプロセッシビティを示し得る。プロセッシビティは、鋳型へのポリメラーゼの単回の結合事象に組み込まれるヌクレオチドの数に関する。場合によっては、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、プロセッシビティが１００ｋｂを超え得る（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｋｂ、またはそれ以上、およびその中でのあらゆる範囲または値）。一部の実施形態において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、高い分配プロファイルを示し得る。ゆえに、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、高いフィデリティＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または高いプロセッシビティＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。一部の実施形態において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、分配型ポリメラーゼ（例えば、低いプロセッシビティのポリメラーゼ）であってもよいし、分配プロファイルが高いＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
【0137】
本発明に有用なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、第１のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび／または第２のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）は、本発明の操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【0138】
一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、および／または第３の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）は、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および／またはアルゴノートタンパク質由来であってもよい。一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を含んでもよく、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および／または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であってもよい。
【0139】
ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および／または第３のＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、ヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼ（核酸内にそれぞれ二本鎖切断または一本鎖切断を生成することができる）であってもよい。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および／または第３のＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１または他の類似したエンドヌクレアーゼドメイン）、ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、タンパク質ガイドエンドヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および／または転写アクティベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であってもよい。
【0140】
一部の実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、第１の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、第２の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、および／または第３の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）および／またはＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、第１のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、第２のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および／または第３のＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質であってもよく、場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系由来であってもよい。一部の実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系由来であってもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、例えばＣａｓ９エフェクタタンパク質であってもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質、例えばＣａｓ１２エフェクタタンパク質であってもよい。
【0141】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質の非限定的な例として、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１とも称される）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３”、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４（ｄｉｎＧ）、および／またはＣｓｆ５ヌクレアーゼが挙げられ得、場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃ２ｃ１０、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、および／またはＣａｓ１４ｃエフェクタタンパク質であってもよい。
【0142】
一部の実施形態において、本発明に有用なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質は、ヌクレアーゼ活性部位（例えば、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、例えばＣａｓ１２ａヌクレアーゼドメインのＲｕｖＣ部位、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインのＲｕｖＣ部位および／またはＨＮＨ部位）内に変異を含んでもよい。ヌクレアーゼ活性部位内に変異を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質は、変異なしの同じＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質と比較して、活性が損なわれ得るか、または活性が引き下げられ得る。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ活性部位内の変異は、ニッカーゼ活性（例えばＣａｓ９ｎ）を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質をもたらす。
【0143】
本発明に有用なＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エフェクタタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エフェクタドメインは、知られているか、または後に同定されるあらゆるＣａｓ９ポリペプチドであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ポリペプチドは、例えば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、カンドレリア（Ｋａｎｄｌｅｒｉａ）属種、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属種、および／またはオルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属種由来のＣａｓ９ポリペプチドであり得る（例えば、配列番号５９～６２参照）。
【0144】
Ｃａｓ１２ａは、Ｖ型Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓヌクレアーゼである。Ｃａｓ１２ａは、より周知のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは、いくつかの点において異なる。例えば、Ｃａｓ９は、そのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）結合部位（プロトスペーサー、標的核酸、標的ＤＮＡ）の３’側にあるＧリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（３’－ＮＧＧ）を認識する一方、Ｃａｓ１２ａは、標的核酸の５’側に位置決めされているＴリッチＰＡＭ（５’－ＴＴＮ、５’－ＴＴＴＮ）を認識する。実際、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ａがそれらのガイドＲＮＡに結合する向きは、それらのＮ末端およびＣ末端に関して、大半が逆転している。さらに、Ｃａｓ１２ａ酵素は、天然のＣａｓ９系において見出されるデュアルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ））ではなくシングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｃｒＲＮＡ）を用い、そしてＣａｓ１２ａは、自己のｇＲＮＡをプロセシングする。加えて、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ活性は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性によって生成される平滑末端の代わりに、スタガーＤＮＡ二本鎖切断を生成し、そしてＣａｓ１２ａは、双方のＤＮＡ鎖を切断するのに、単一のＲｕｖＣドメインをあてにするが、Ｃａｓ９は、切断にＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメインを利用する。
【0145】
本発明に有用なＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ａエフェクタタンパク質／ドメインは、知られているか、または後に同定されるあらゆるＣａｓ１２ａポリペプチド（以前にＣｐｆ１として知られていた）であり得る（例えば、米国特許第９，７９０，４９０号参照（Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）配列の開示について、引用することにより本明細書の一部をなすものとする））。用語「Ｃａｓ１２ａ」、「Ｃａｓ１２ａポリペプチド」、または「Ｃａｓ１２ａドメイン」は、Ｃａｓ１２ａのガイド核酸結合ドメイン、および／またはＣａｓ１２ａの活性のある、不活性である、もしくは部分的に活性のあるＤＮＡ切断ドメインを含む、Ｃａｓ１２ａポリペプチドまたはその断片を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼを指す。一部の実施形態において、本発明に有用なＣａｓ１２ａは、変異をヌクレアーゼ活性部位（例えば、Ｃａｓ１２ａドメインのＲｕｖＣ部位）内に含んでもよい。そのヌクレアーゼ活性部位内に変異を有するので、ヌクレアーゼ活性をもはや含んでいないＣａｓ１２ａドメインまたはＣａｓ１２ａポリペプチドは、一般に、ｄｅａｄＣａｓ１２ａ（例えばｄＣａｓ１２ａ）と称される。一部の実施形態において、そのヌクレアーゼ活性部位内に変異を有するＣａｓ１２ａドメインまたはＣａｓ１２ａポリペプチドは、活性が損なわれ得る。
【0146】
一部の実施形態において、選択された位置（例えば、標的核酸、標的核酸上の部位）にポリペプチドをリクルートするのに有用な本発明のペプチドタグ（例えば、エピトープ、ペプチド反復単位）は、１コピーまたは２コピー以上のペプチドタグ（エピトープ、多量体化されたエピトープ）を含んでもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５コピー（反復単位）、またはそれ以上）。一部の実施形態において、本発明に有用なペプチドタグとして、以下に限定されないが、ＧＣＮ４ペプチドタグ（例えばＳｕｎ－タグ）（例えば、配列番号２３～２４参照）、ｃ－Ｍｙｃアフィニティタグ、ＨＡアフィニティタグ、Ｈｉｓアフィニティタグ、Ｓアフィニティタグ、メチオニン－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＲＧＤ－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＦＬＡＧオクタペプチド、ｓｔｒｅｐタグもしくはｓｔｒｅｐタグＩＩ、Ｖ５タグ、および／またはＶＳＶ－Ｇエピトープが挙げられ得る。一部の実施形態において、ペプチドタグは、ＧＣＮ４ペプチドタグであってもよい。一部の実施形態において、ペプチドタグは、２コピー以上のペプチドタグ（ペプチド反復、例えば、２タンデムコピー以上、例えば、ＧＣＮ４のタンデムコピー）を含んでもよい。
【0147】
一部の実施形態において、ペプチドタグに結合することができる親和性ポリペプチドとして、以下に限定されないが、抗体、場合によっては、ペプチドタグ（例えば、ＧＣＮ４ペプチドタグ（例えば、配列番号２５参照）、ｃ－Ｍｙｃアフィニティタグ、ＨＡアフィニティタグ、Ｈｉｓアフィニティタグ、Ｓアフィニティタグ、メチオニン－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＲＧＤ－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＦＬＡＧオクタペプチド、ｓｔｒｅｐタグもしくはｓｔｒｅｐタグＩＩ、Ｖ５タグ、および／またはＶＳＶ－Ｇエピトープ）に結合することができるｓｃＦｖ抗体、アフィボディ、アンチカリン、モノボディ、および／またはＤＡＲＰｉｎ（これらは各々、ペプチドタグ（例えば、ＧＣＮ４ペプチドタグ、ｃ－Ｍｙｃアフィニティタグ、ＨＡアフィニティタグ、Ｈｉｓアフィニティタグ、Ｓアフィニティタグ、メチオニン－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＲＧＤ－Ｈｉｓアフィニティタグ、ＦＬＡＧオクタペプチド、ｓｔｒｅｐタグもしくはｓｔｒｅｐタグＩＩ、Ｖ５タグ、および／またはＶＳＶ－Ｇエピトープ）に結合することができる）が挙げられ得る。
【0148】
本発明の一部の実施形態において、ガイド核酸（ＣＲＩＳＰＲ核酸、ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）は、１つまたは２つ以上のＲＮＡリクルートモチーフ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０モチーフ、またはそれ以上、例えば、少なくとも１０～約２５モチーフ）に連結されていてもよく、場合によっては、２つ以上のＲＮＡリクルートモチーフは、同じＲＮＡリクルートモチーフであっても、異なるＲＮＡリクルートモチーフであってもよく、これによって、１つまたは複数のＲＮＡリクルートモチーフに連結されたガイド核酸が、ガイドに連結されるＲＮＡリクルートモチーフと相互作用／に結合することができる親和性ポリペプチドに融合された１つまたは複数のポリペプチドをリクルートするのに用いられ得る。
【0149】
一部の実施形態において、ＲＮＡリクルートモチーフおよびＲＮＡリクルートモチーフと相互作用することができる親和性ポリペプチド（例えば、対応する親和性ポリペプチド）として、以下に限定されないが、テロメラーゼＫｕ結合モチーフ（例えばＫｕ結合ヘアピン）および対応する親和性ポリペプチドＫｕ（例えばＫｕヘテロダイマー）、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよび対応する親和性ポリペプチドＳｍ７、ＭＳ２ファージオペレーターステム－ループおよび対応する親和性ポリペプチドＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７ファージオペレーターステム－ループおよび対応する親和性ポリペプチドＰＰ７コートタンパク質（ＰＣＰ）、ＳｆＭｕファージＣｏｍステム－ループおよび対応する親和性ポリペプチドＣｏｍ ＲＮＡ結合タンパク質、ならびに／または合成ＲＮＡアプタマーおよび対応する親和性ポリペプチドとしてのアプタマーリガンド（例えば、配列番号２６～３６参照）が挙げられ得る。一部の実施形態において、本発明に有用なＲＮＡリクルートモチーフおよびその対応する親和性ポリペプチドは、ＭＳ２ファージオペレーターステム－ループおよび親和性ポリペプチドＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ならびに／またはＰＵＦ結合部位（ＰＢＳ）および親和性ポリペプチドプミリオ／ｆｅｍ－３ｍＲＮＡ結合因子（ＰＵＦ）であってもよい。
【0150】
本明細書中に記載される、本発明のポリペプチドは、互いに連結されている１つまたは複数のポリペプチドを含む融合タンパク質であってもよい。一部の実施形態において、融合は、リンカーを介する。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸リンカーであってもペプチドリンカーであってもよい。一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、約２～約１００アミノ酸（残基）長であってもよい。一部の実施形態において、ペプチドリンカーはＧＳリンカーであってもよい。
【0151】
本明細書中で用いられる「ガイド核酸」、「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ／ＤＮＡ」、「ｃｒＲＮＡ」、または「ｃｒＤＮＡ」は、標的ＤＮＡ、および少なくとも１つの反復配列（例えば、Ｖ型Ｃａｓ１２ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の反復、またはその断片もしくは一部、ＩＩ型Ｃａｓ９ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の反復またはその断片、Ｖ型Ｃ２ｃ１ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の反復またはその断片、例えば、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１とも称される）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３”、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４（ｄｉｎＧ）、および／もしくはＣｓｆ５のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の反復、またはその断片）と相補的である（かつこれにハイブリダイズする）少なくとも１つのスペーサー配列（例えばプロトスペーサー）を含む核酸を意味し、反復配列は、スペーサー配列の５’末端および／または３’末端に連結されていてもよい。本発明のｇＲＮＡの設計は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に基づいてもよい。
【0152】
一部の実施形態において、Ｃａｓ１２ａ ｇＲＮＡは、５’から３’まで、反復配列（完全長またはその一部（「ハンドル」）、例えば、シュードノット様構造）、およびスペーサー配列を含んでもよい。
【0153】
一部の実施形態において、ガイド核酸は、複数の反復配列－スペーサー配列（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれを超える反復－スペーサー配列）を含んでもよい（例えば、反復－スペーサー－反復、例えば、反復－スペーサー－反復－スペーサー－反復－スペーサー－反復－スペーサー－反復－スペーサー等）。本発明のガイド核酸は、合成の、人工の、天然に見出されないものである。ｇＲＮＡは、非常に長くなり得、そして（ＭＳ２リクルート戦略にあるような）アプタマー、またはスペーサーをぶら下げる（ｈａｎｇｉｎｇ ｏｆｆ）他のＲＮＡ構造として用いられてもよい。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるガイドＲＮＡは、編集のための鋳型、およびプライマー結合部位を含み得る。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、編集鋳型（逆転写酵素鋳型）と相補的であることによって、編集鋳型を標的核酸にリクルートする、５’末端または３’末端上の領域または配列を含み得る。
【0154】
本明細書中で用いられる「反復配列」は、例えば、野生型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ遺伝子座（例えば、Ｃａｓ９遺伝子座、Ｃａｓ１２ａ遺伝子座、Ｃ２ｃ１遺伝子座その他）のあらゆる反復配列、または塩基エディタをコードする本発明の核酸構築体によってコードされるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼにより機能的な合成ｃｒＲＮＡの反復配列を指す。本発明に有用な反復配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、またはＶＩ型）の、知られているか、もしくは後に同定されるあらゆる反復配列であり得、またはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、もしくはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系において機能するように設計された合成反復であり得る。反復配列は、ヘアピン構造および／またはステムループ構造を含んでもよい。一部の実施形態において、反復配列は、その５’末端に、シュードノット様構造（すなわち「ハンドル」）を形成し得る。ゆえに、一部の実施形態において、反復配列は、野生型Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座、および／またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座由来の反復配列と同一であり得るか、または実質的に同一であり得る。野生型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座由来の反復配列が、確立されたアルゴリズムによって、例えばＣＲＩＳＰＲｄｂによって提供されるＣＲＩＳＰＲｆｉｎｄｅｒ（Ｇｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５（ウェブサーバー刊行物）：Ｗ５２－７参照）を用いて決定され得る。一部の実施形態において、反復配列またはその一部は、スペーサー配列の３’末端～５’末端に連結されており、それによって、反復－スペーサー配列（例えば、ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ）を形成する。
【0155】
一部の実施形態において、反復配列は、特定の反復、および反復を含むガイドＲＮＡがプロセシングされるか、プロセシングされないかに応じて、少なくとも１０ヌクレオチド（例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０～１００個、もしくはそれを超えるヌクレオチド、またはその中のあらゆる範囲もしくは値、例えば約）を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる。一部の実施形態において、反復配列は、約１０～約２０、約１０～約３０、約１０～約４５、約１０～約５０、約１５～約３０、約１５～約４０、約１５～約４５、約１５～約５０、約２０～約３０、約２０～約４０、約２０～約５０、約３０～約４０、約４０～約８０、約５０～約１００個、またはそれを超えるヌクレオチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる。
【0156】
スペーサー配列の５’末端に連結された反復配列は、反復配列の一部（例えば、野生型反復配列の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５個、またはそれを超える連続ヌクレオチド）を含み得る。一部の実施形態において、スペーサー配列の５’末端に連結された反復配列の一部は、約５～約１０連続ヌクレオチド（例えば、約５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド）長であり得、そして野生型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ反復ヌクレオチド配列の同じ領域（例えば５’末端）に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）の同一性を有する。一部の実施形態において、反復配列の一部は、その５’末端にてシュードノット様構造（例えば「ハンドル」）を含み得る。
【0157】
本明細書中で用いられる「スペーサー配列」は、標的核酸（例えば標的ＤＮＡ）と相補的なヌクレオチド配列（例えばプロトスペーサー）である。スペーサー配列は、標的核酸と完全に相補的であり得るか、または実質的に相補的であり得る（例えば、少なくとも約７０％（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）相補的である）。ゆえに、一部の実施形態において、スペーサー配列は、標的核酸と比較して、１、２、３、４、または５つのミスマッチを有し得、当該ミスマッチは、連続していてもよいし、非連続であってもよい。一部の実施形態において、スペーサー配列は、標的核酸に対して７０％の相補性を有し得る。他の実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、標的核酸に対して８０％の相補性を有し得る。さらに他の実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、標的核酸（プロトスペーサー）に対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％等の相補性を有し得る。一部の実施形態において、スペーサー配列は、標的核酸と１００％相補的である。スペーサー配列は、長さが約１５ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド、またはその中のあらゆる範囲もしくは値）であり得る。ゆえに、一部の実施形態において、スペーサー配列は、少なくとも約１５ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド長である標的核酸（例えばプロトスペーサ）の領域にわたって完全な相補性または実質的な相補性を有し得る。一部の実施形態において、スペーサーは、約２０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、スペーサーは、約２３ヌクレオチド長である。
【0158】
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー配列の５’領域は、標的ＤＮＡと同一であり得る一方、スペーサーの３’領域は、標的ＤＮＡ（例えばＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）と実質的に相補的であり得、またはガイドＲＮＡのスペーサー配列の３’領域は、標的ＤＮＡと同一であり得る一方、スペーサーの５’領域は、標的ＤＮＡ（例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）と実質的に相補的であり得るので、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列の全体的な相補性は、１００％未満であってもよい。ゆえに、例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系用のガイドにおいて、例えば２０ヌクレオチドスペーサー配列の、５’領域内の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド（すなわちシード領域）は、標的ＤＮＡと１００％相補的であり得る一方、スペーサー配列の３’領域内の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補的である（例えば、少なくとも約７０％相補的である）。一部の実施形態において、スペーサー配列の５’末端の最初の１～８ヌクレオチド（例えば、最初の１、２、３、４、５、６、７、８ヌクレオチド、およびその中のあらゆる範囲）は、標的ＤＮＡと１００％相補的であり得る一方、スペーサー配列の３’領域内の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補的である（例えば、少なくとも約５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）相補的である）。
【0159】
更なる例として、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系用のガイドにおいて、例えば２０ヌクレオチドスペーサー配列の、３’領域内の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド（すなわちシード領域）は、標的ＤＮＡと１００％相補的であり得る一方、スペーサー配列の５’領域内の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補的である（例えば、少なくとも約７０％相補的である）。一部の実施形態において、スペーサー配列の３’末端の最初の１～１０ヌクレオチド（例えば、最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドおよびその中のあらゆる範囲）は、標的ＤＮＡと１００％相補的であり得る一方、スペーサー配列の５’領域内の残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補的である（例えば、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれを超える、またはその中のあらゆる範囲もしくは値）相補的である）。
【0160】
一部の実施形態において、スペーサーのシード領域は、約８～約１０ヌクレオチド長、約５～約６ヌクレオチド長、または約６ヌクレオチド長であってもよい。
【0161】
本明細書中で用いられる「標的核酸」、「標的ＤＮＡ」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的領域」、または「ゲノム内の標的領域」は、本発明のガイドＲＮＡ内のスペーサー配列と完全に相補的な（１００％相補的な）、または実質的に相補的な（例えば、少なくとも７０％（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）相補的な）生物のゲノムの領域を指す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に有用な標的領域は、生物のゲノム（例えば、植物ゲノム、動物ゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム等）内のＰＡＭ配列に対して直ぐ３’側に（例えばＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系）、または直ぐ５’側に（例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系）位置決めされてもよい。標的領域は、ＰＡＭ配列に直ぐ隣接して位置決めされる少なくとも１５個の連続ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド等）のあらゆる領域から選択され得る。
【0162】
「プロトスペーサー配列」は、ＣＲＩＳＰＲ反復－スペーサー配列のスペーサー配列と完全に、または実質的に相補的である（かつこれにハイブリダイズする）標的二本鎖ＤＮＡ、具体的には標的ＤＮＡの一部（例えば、またはゲノム内の標的領域）を指す（例えば、ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｃｒＲＮＡ）。
【0163】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えばＣａｓ１２ａ）系およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（Ｃａｓ９）系の場合、プロトスペーサー配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が隣に（例えば直ちに隣接して）位置する。ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系について、ＰＡＭは、非標的鎖上の５’末端に、そして標的鎖の３’末端に位置決めされる（一例として、下記参照）。
【0164】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）系の場合、ＰＡＭは、標的領域の直ぐ３’側に位置決めされる。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系用のＰＡＭは、標的鎖の５’側に位置決めされる。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系用のＰＡＭは知られていない。Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．は、ＣＲＩＳＰＲ系の全てのクラス、型、およびサブタイプについての命名法を記載している（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１３：７２２－７３６（２０１５））。ガイド構造およびＰＡＭが、Ｒ．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１６：２４７（２０１５））によって記載されている。
【0165】
カノニカルＣａｓ１２ａ ＰＡＭは、Ｔリッチである。一部の実施形態において、カノニカルＣａｓ１２ａ ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮ、５’－ＴＴＴＮ、または５’－ＴＴＴＶであってよい。一部の実施形態において、カノニカルＣａｓ９（例えば化膿連鎖球菌）ＰＡＭは、５’－ＮＧＧ－３’であってもよい。一部の実施形態において、非カノニカルＰＡＭが用いられてもよいが、あまり有効でない可能性がある。
【0166】
更なるＰＡＭ配列が、確立されている実験的アプローチおよび計算論的アプローチにより、当業者によって決定されてもよい。ゆえに、例えば、実験的アプローチは、考えられる全てのヌクレオチド配列が隣に位置する配列を標的とすることと、例えば標的プラスミドＤＮＡの形質転換により、標的化を受けない配列メンバーを識別することとを含む（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ１０：１１１６－１１２１、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９）。一部の態様において、計算論的アプローチは、天然のスペーサーのＢＬＡＳＴ検索を実行して、バクテリオファージまたはプラスミド内の元の標的ＤＮＡ配列を同定することと、これらの配列をアラインして、標的配列に隣接する保存された配列を決定することとを含み得る（Ｂｒｉｎｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ．２０１４．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８０：９９４－１００１、Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１５５：７３３－７４０）。
【0167】
一部の実施形態において、植物内での発現のために最適化された本発明の核酸構築体、発現カセット、またはベクターは、同じものをコードするが、植物内での発現のためにコドン最適化されていない核酸構築体、発現カセット、またはベクターと約７０％～１００％（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一であり得る。
【0168】
一部の実施形態において、本発明は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチド、ガイド核酸、核酸構築体、発現カセット、またはベクターを含む細胞を提供する。
【0169】
ガイド核酸と組み合わせて用いられる場合、本発明の核酸構築体は、標的核酸を修飾するのに用いられ得る。標的核酸は、本発明の核酸構築体と、標的核酸をガイド核酸と接触させる前に、これと同時に、またはこの後に、接触し得る。一部の実施形態において、本発明の核酸構築体およびガイド核酸は、同じ発現カセットまたはベクター内に含まれ得るので、標的核酸は、本発明の核酸構築体およびガイド核酸と同時に接触し得る。一部の実施形態において、本発明の核酸構築体およびガイド核酸は、異なる発現カセットまたはベクター内にあり得るので、標的核酸は、本発明の核酸構築体と、ガイド核酸と接触する前に、これと同時に、またはこの後に、接触し得る。
【0170】
あらゆる生物またはその細胞の標的核酸は、本発明の核酸構築体（例えば、ポリペプチドおよび複合体（例えば、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型、ガイド核酸等）、ならびにポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはこれをコードするベクター）を用いて修飾され得る（例えば、変異する、例えば、塩基編集される、切断される、ニックが入れられるその他）。
【0171】
一部の実施形態において、あらゆる植物または植物部分の標的核酸は、本発明の核酸構築体（例えば、ポリペプチドおよび複合体（例えば、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、操作されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡによりコードされた修復鋳型、ガイド核酸等）、ならびにポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはこれをコードするベクター）を用いて修飾され得る（例えば、変異する、例えば、塩基編集される、切断される、ニックが入れられるその他）。被子植物、裸子植物、単子葉植物、双子葉植物、Ｃ３、Ｃ４、ＣＡＭ植物、蘚苔門植物、シダおよび／もしくはシダの仲間、微細藻類、ならびに／または大型藻類が挙げられるあらゆる植物（または植物の群、例えば、属またはより高いオーダーの分類）が、本発明の核酸構築体を用いて修飾され得る。本発明に有用な植物および／または植物部分は、あらゆる植物種／変種／品種の植物および／または植物部分であり得る。本明細書中で用いられる用語「植物部分」は、以下に限定されないが、胚、花粉、胚珠、種子、葉、幹、シュート、花卉、枝、果実、仁、穂、コッブ、外皮、茎、根、根端、葯、植物細胞（植物および／または植物の部分において無傷の植物細胞、植物プロトプラスト、植物組織、植物細胞組織培養体、植物カルス、植物塊等が挙げられる）が挙げられる。本明細書中で用いられる「シュート」は、葉および幹を含む地上部を指す。さらに、本明細書中で用いられる「植物細胞」は、植物の構造的生理学的単位を指し、これは、細胞壁を含み、そしてまたプロトプラストを指し得る。植物細胞は、単離された単一の細胞の形態であってもよいし、培養された細胞であってもよいし、より高度に組織化された単位、例えば植物組織または植物器官の一部であってもよい。
【0172】
本発明に有用な植物の非限定的な例として、芝草（例えば、ブルーグラス、ベントグラス、ライグラス、ウシノケグサ属）、ウモウヨシ、ヒロハノコメススキ、ススキ属、ダンチク属、スイッチグラス、蔬菜作物（アーティチョーク、コールラビ、キバナスズシロ、ニラネギ、アスパラガス、レタス（例えば、サラダ菜、リーフレタス、タチチシャ）、マランガ、メロン（例えば、マスクメロン、スイカ、クレンショーメロン、ハネデューメロン、カンタロープ）、アブラナ属作物（例えば、メキャベツ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、コラード、ケール、ハクサイ、パクチョイ）、カルドニ（ｃａｒｄｏｎｉ）、ニンジン、ハクサイ、オクラ、タマネギ、セロリ、パセリ、ヒヨコマメ、パースニップ、チコリ、コショウ、ジャガイモ、ウリ科植物（例えば、マロウ、キュウリ、ズッキーニ、スカッシュ、カボチャ、ハネデューメロン、スイカ、カンタロープ）、ハツカダイコン、乾球タマネギ、ルタバガ、ナス、セイヨウゴボウ、キクヂシャ、エシャロット、エンダイブ、ニンニク、ホウレンソウ、ネギ、スカッシュ、グリーン、ビート（シュガービートおよび飼料ビート）、サツマイモ、フダンソウ、セイヨウワサビ、トマト、カブ、およびスパイスが挙げられる）、果実作物、例えば、リンゴ、アプリコット、チェリー、ネクタリン、モモ、西洋ナシ、プラム、プルーン、チェリー、マルメロ、イチジク、ナッツ（例えば、クリ、ペカン、ピスタチオ、ヘイゼルナッツ、ピスタチオ、ピーナッツ、クルミ、マカダミアナッツ、アーモンド等）、柑橘類（例えば、クレメンタイン、キンカン、オレンジ、グレープフルーツ、タンジールミカン、ミカン、レモン、ライム等）、ブルーベリー、ブラックラズベリー、ボイゼンベリー、クランベリー、カランツ、グズベリー、ローガンベリー、ラズベリー、ストロベリー、ブラックベリー、ブドウ（ワイン用および食用）、アボカド、バナナ、キーウィ、柿、ザクロ、パイナップル、トロピカルフルーツ、梨状果、メロン、マンゴー、パパイア、およびライチ、農作物、例えば、クローバー、アルファルファ、チモシー、マツヨイグサ、メドウフォーム、トウモロコシ（飼料用、スイートコーン、ポップコーン）、ホップ、ホホバ、ソバ、ベニバナ、キノア、コムギ、イネ、オオムギ、ライムギ、キビ、モロコシ、エンバク、ライコムギ、モロコシ、タバコ、カポック、マメ科植物（インゲンマメ（例えば、サヤインゲンおよび乾燥インゲンマメ）、レンズマメ、エンドウ、ダイズ）、油料植物（ナタネ、キャノーラ、マスタード、ポピー、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマシ油植物、カカオ豆、落花生類、アブラヤシ）、ウキクサ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属、繊維植物（ワタ、アマ、アサ、ジュート）、カンナビス（例えば、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、インド麻（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｉｎｄｉｃａ）、およびカンナビス・ルデラリス（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｒｕｄｅｒａｌｉｓ））、クスノキ科（シナモン、カンファー）、もしくはコーヒー、サトウキビ、チャ、および天然ゴム植物等の植物、ならびに／または花壇用花卉、例えば、顕花植物、サボテン、多肉植物、および／もしくは観賞植物（例えば、バラ、チューリップ、スミレ）、ならびに樹木、例えば森林樹木（広葉樹および常緑植物、例えば針葉樹、例えば、ニレ、トネリコ、オーク、カエデ、モミ、トウヒ、スギ、マツ、カバノキ、イトスギ、ユーカリノキ、ヤナギ）、ならびに潅木および他の苗木が挙げられる。一部の実施形態において、本発明の核酸構築体、ならびに／またはこれをコードする発現カセットおよび／もしくはベクターは、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、キャノーラ、イネ、トマト、コショウ、ヒマワリ、ラズベリー、ブラックベリー、ブラックラズベリー、および／またはチェリーを修飾するのに用いられ得る。一部の実施形態において、本発明の核酸構築体、ならびに／またはこれをコードする発現カセットおよび／もしくはベクターは、キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ）属種（例えば、ブラックベリー、ブラックラズベリー、ボイゼンベリー、ローガンベリー、ラズベリー、例えばケーンベリー）、スノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）属種（例えばクランベリー）、リブ（Ｒｉｂｅｓ）属種（例えば、グズベリー、カラント（例えば、レッドカラント、ブラックカラント））、またはオランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）属種（例えばストロベリー）を修飾するのに用いられ得る。
【0173】
本発明はさらに、本発明の方法を実行するためのキットを含む。本発明のキットは、試薬、バッファ、および混合、測定、ソーティング、標識その他のための装置、ならびに標的核酸を修飾するのに適した説明書等を含み得る。
【0174】
一部の実施形態において、本発明は、本発明の１つもしくは複数の核酸構築体、ならびに／またはこれを含む（例えば、本発明のポリペプチド／複合体を含む、またはコードする）発現カセットおよび／もしくはベクターを含むキットを、場合によってはその使用説明書と共に提供する。一部の実施形態において、キットはさらに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイド核酸（本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼに対応する）、ならびに／またはこれを含む発現カセットおよび／もしくはベクターを含んでもよい。一部の実施形態において、ガイド核酸は、本発明の核酸構築体と同じ発現カセットおよび／またはベクター上に提供されてもよい。一部の実施形態において、ガイド核酸は、本発明の核酸構築体を含むものとは別個の発現カセットまたはベクター上に提供されてもよい。
【0175】
一部の実施形態において、キットはさらに、ガイド核酸をコードする核酸構築体を含んでもよく、構築体は、標的核酸配列と同一であるか、または相補的な核酸配列の、ガイド核酸の骨格中へのクローニングのためのクローニング部位を含む。
【0176】
一部の実施形態において、本発明の核酸構築体、ならびに／またはこれを含む発現カセットおよび／もしくはベクターはさらに、形質転換体（例えば、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子等をコードする核酸）を識別するのに有用な１つまたは複数の選択マーカーをコードしていてもよい。
【0177】
次に、本発明を、以下の実施例に関して説明する。これらの実施例は、特許請求の範囲を本発明に限定することは意図されず、むしろ特定の実施形態の例示となることが意図されることが認識されるべきである。当業者が思い浮かべる、例示される方法におけるあらゆる変形が、本発明の範囲に入ることが意図される。
【実施例】
【0178】
［実施例１．鋳型を用いた正確なインビボ編集］
構成要素の混合物をヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ中に同時形質移入することによって、ヒト細胞内でのＣＲＩＳＰＲタンパク質へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの融合を介した、鋳型を用いた正確な編集を実証することができる。構成要素の混合物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるミュータントＥＧＦＰ遺伝子のコピーを含有するレシピエントプラスミド、標的部位への鋳型の結合を促進するように、１００～２００ｎｔの相同配列が隣に位置するミュータントＥＧＦＰ用の補正配列を含有する一本鎖ＤＮＡ修復鋳型、ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｅＣａｓ９、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、またはｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ））の融合タンパク質を発現する第２のプラスミド、注目するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大腸菌由来のＰｏｌ Ｉ）（ＮまたはＣ末端ＣＲＩＳＰＲタンパク質へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの融合は、リンカーを介する）、およびミュータントＥＧＦＰ配列を標的とするガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミドを含む。対照として、第２のプラスミドを、相対的なＣＲＩＳＰＲタンパク質のみを発現するプラスミドで置換する。所望の、鋳型を用いた編集事象は、ミュータントＥＧＦＰが、緑色の蛍光表現型をもたらすＥＧＦＰの機能的コピーに補正されているから、フローサイトメトリにより識別する。
構成要素の混合物をヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ中に同時形質移入することによって、ヒト細胞内でのＣＲＩＳＰＲタンパク質へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの融合を介した、鋳型を用いた正確な編集を実証することができる。構成要素の混合物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるミュータントＥＧＦＰ遺伝子のコピーを含有するレシピエントプラスミド、標的部位への鋳型の結合を促進するように、１００～２００ｎｔの相同配列が隣に位置するミュータントＥＧＦＰ用の補正配列を含有する一本鎖ＤＮＡ修復鋳型、ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｅＣａｓ９、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、またはｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ））の融合タンパク質を発現する第２のプラスミド、注目するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大腸菌由来のＰｏｌ Ｉ）（ＮまたはＣ末端ＣＲＩＳＰＲタンパク質へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの融合は、リンカーを介する）、およびミュータントＥＧＦＰ配列を標的とするガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミドを含む。対照として、第２のプラスミドを、相対的なＣＲＩＳＰＲタンパク質のみを発現するプラスミドで置換する。所望の、鋳型を用いた編集事象は、ミュータントＥＧＦＰが、緑色の蛍光表現型をもたらすＥＧＦＰの機能的コピーに補正されているから、フローサイトメトリにより識別する。
【0179】
これ以外にも、ＤＮＡ修復鋳型、およびガイドＲＮＡ（またはガイドＤＮＡ）を発現する第３のプラスミドを、修復鋳型を含有するレトロン足場と共に、レトロン逆転写酵素およびキメラガイドＲＮＡ（またはキメラガイドＤＮＡ）を発現するプラスミドによって置換することができる。
【0180】
［実施例２．ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを介した、鋳型を用いた正確なインビトロ編集。］
ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを介した、鋳型を用いた正確なインビトロ編集。ＣＲＩＳＰＲニッカーゼｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）によって導入されたニックからの、標的ＤＮＡ配列の、鋳型を用いた置換を行う潜在性について、商業的に入手可能なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをインビトロ評価する。評価用のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例として、Ｑ５高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ Ｋｌｅｎ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片（３’→５’ｅｘｏ－）、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを介した、鋳型を用いた正確なインビトロ編集。ＣＲＩＳＰＲニッカーゼｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）によって導入されたニックからの、標的ＤＮＡ配列の、鋳型を用いた置換を行う潜在性について、商業的に入手可能なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをインビトロ評価する。評価用のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例として、Ｑ５高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ Ｋｌｅｎ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片（３’→５’ｅｘｏ－）、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）が挙げられる。
【0181】
断片の中央にＣａｓ９結合部位を含有する２ｋｂのＤＮＡ断片をレシピエントとして用い、約１００ｎｔの一本鎖ＤＮＡ修復鋳型を用いて、Ｃａｓ９標的部位に隣接するレシピエントにミスマッチを導入する。レシピエントＤＮＡ、修復鋳型、ｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）タンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびにＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの混合物を、３７℃または２５℃にてインキュベートする。ミスマッチを含有する所望の修復生成物を、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩによって消化して、他の生成物から分離して、ゲル電気泳動によって定量化することができる。
【0182】
［実施例３．標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＭＳ２ＲＮＡループリクルートを介した、鋳型を用いた正確な編集。］
構成要素の混合物を、ヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ中に同時形質移入することによって、標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＭＳ２ＲＮＡループリクルートを介した、鋳型を用いた正確な編集を実証することができる。構成要素の混合物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるミュータントＥＧＦＰ遺伝子のコピーを含有するレシピエントプラスミド、標的部位への鋳型の結合を促進するように、１００～２００ｎｔの相同配列が隣に位置するミュータントＥＧＦＰ用の補正配列を含有する一本鎖ＤＮＡ修復鋳型、注目するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大腸菌由来のＰｏｌ Ｉ）を、リンカーを介してＮ末端に融合されたＭＣＰドメインと共に発現する第２のプラスミド、ミュータントＥＧＦＰ配列を標的とするガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミド（ガイド核酸足場は、ＭＣＰドメインと相互作用するＭＳ２ステムループを含有するように修飾されている）、およびＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｅＣａｓ９、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、またはｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ））を発現する第４のプラスミドを含む。対照として、第２のプラスミドを、形質移入混合物から省略する。鋳型を用いた所望の編集事象は、ミュータントＥＧＦＰが、ＥＧＦＰの機能的コピーに補正されているから、フローサイトメトリにより識別する。これ以外にも、ＤＮＡ修復鋳型、およびＭＳ２ガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミドを、修復鋳型を含有するレトロン足場と共に、レトロン逆転写酵素およびキメラＭＳ２ガイドＲＮＡを発現するプラスミドによって置換することができる。
構成要素の混合物を、ヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ中に同時形質移入することによって、標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＭＳ２ＲＮＡループリクルートを介した、鋳型を用いた正確な編集を実証することができる。構成要素の混合物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるミュータントＥＧＦＰ遺伝子のコピーを含有するレシピエントプラスミド、標的部位への鋳型の結合を促進するように、１００～２００ｎｔの相同配列が隣に位置するミュータントＥＧＦＰ用の補正配列を含有する一本鎖ＤＮＡ修復鋳型、注目するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大腸菌由来のＰｏｌ Ｉ）を、リンカーを介してＮ末端に融合されたＭＣＰドメインと共に発現する第２のプラスミド、ミュータントＥＧＦＰ配列を標的とするガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミド（ガイド核酸足場は、ＭＣＰドメインと相互作用するＭＳ２ステムループを含有するように修飾されている）、およびＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｅＣａｓ９、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、またはｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ））を発現する第４のプラスミドを含む。対照として、第２のプラスミドを、形質移入混合物から省略する。鋳型を用いた所望の編集事象は、ミュータントＥＧＦＰが、ＥＧＦＰの機能的コピーに補正されているから、フローサイトメトリにより識別する。これ以外にも、ＤＮＡ修復鋳型、およびＭＳ２ガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミドを、修復鋳型を含有するレトロン足場と共に、レトロン逆転写酵素およびキメラＭＳ２ガイドＲＮＡを発現するプラスミドによって置換することができる。
【0183】
［実施例４．標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＰＵＦ－結合部位（ＰＢＳ）ＲＮＡアプタマーリクルートを介した、鋳型を用いた正確な編集。］
構成要素の混合物をヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ中に同時形質移入することによって、標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＰＵＦ－結合部位（ＰＢＳ）ＲＮＡアプタマーリクルートを介した、鋳型を用いた正確な編集を実証することができる。構成要素の混合物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるミュータントＥＧＦＰ遺伝子のコピーを含有するレシピエントプラスミド、標的部位への鋳型の結合を促進するように、１００～２００ｎｔの相同配列が隣に位置するミュータントＥＧＦＰ用の補正配列を含有する一本鎖ＤＮＡ修復鋳型、注目するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大腸菌由来のＰｏｌ Ｉ）を、リンカーを介してＮ末端に融合されたＰＵＦドメインと共に発現する第２のプラスミド、ミュータントＥＧＦＰ配列を標的とするガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミド（ガイドＲＮＡ足場は、ＰＵＦドメインと相互作用するＰＵＦ－結合部位を含有するように修飾されている）、およびＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｅＣａｓ９、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、またはｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ））を発現する第４のプラスミドを含む。対照として、第２のプラスミドを、形質移入混合物から省略する。鋳型を用いた所望の編集事象は、ミュータントＥＧＦＰが、ＥＧＦＰの機能的コピーに補正されているから、フローサイトメトリにより識別する。これ以外にも、ＤＮＡ修復鋳型、およびガイドＲＮＡをＰＢＳと共に発現する第３のプラスミドを、ＰＢＳ、および修復鋳型を含有するレトロン足場と共に、レトロン逆転写酵素およびキメラガイドＲＮＡを発現するプラスミドによって置換することができる。
構成要素の混合物をヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ中に同時形質移入することによって、標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＰＵＦ－結合部位（ＰＢＳ）ＲＮＡアプタマーリクルートを介した、鋳型を用いた正確な編集を実証することができる。構成要素の混合物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるミュータントＥＧＦＰ遺伝子のコピーを含有するレシピエントプラスミド、標的部位への鋳型の結合を促進するように、１００～２００ｎｔの相同配列が隣に位置するミュータントＥＧＦＰ用の補正配列を含有する一本鎖ＤＮＡ修復鋳型、注目するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大腸菌由来のＰｏｌ Ｉ）を、リンカーを介してＮ末端に融合されたＰＵＦドメインと共に発現する第２のプラスミド、ミュータントＥＧＦＰ配列を標的とするガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミド（ガイドＲＮＡ足場は、ＰＵＦドメインと相互作用するＰＵＦ－結合部位を含有するように修飾されている）、およびＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｅＣａｓ９、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、またはｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ））を発現する第４のプラスミドを含む。対照として、第２のプラスミドを、形質移入混合物から省略する。鋳型を用いた所望の編集事象は、ミュータントＥＧＦＰが、ＥＧＦＰの機能的コピーに補正されているから、フローサイトメトリにより識別する。これ以外にも、ＤＮＡ修復鋳型、およびガイドＲＮＡをＰＢＳと共に発現する第３のプラスミドを、ＰＢＳ、および修復鋳型を含有するレトロン足場と共に、レトロン逆転写酵素およびキメラガイドＲＮＡを発現するプラスミドによって置換することができる。
【0184】
［実施例５．標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＰＵＦ－結合部位（ＰＢＳ）ＲＮＡアプタマーリクルートを介した、鋳型を用いた正確な編集。］
構成要素の混合物をヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ中に同時形質移入することによって、標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの抗体／エピトープリクルートを介した、鋳型を用いた正確な編集を実証することができる。構成要素の混合物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるミュータントＥＧＦＰ遺伝子のコピーを含有するレシピエントプラスミド、標的部位への鋳型の結合を促進するように、１００～２００ｎｔの相同配列が隣に位置するミュータントＥＧＦＰ用の補正配列を含有する一本鎖ＤＮＡ修復鋳型、注目するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大腸菌由来のＰｏｌ Ｉ）を、リンカーを介してＮ末端に融合されたｓｃＦＶドメインと共に発現する第２のプラスミド、ミュータントＥＧＦＰ配列を標的とするガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミド、およびＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｅＣａｓ９、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、またはｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ））を、Ｃ末端に融合されたＧＣＮ４タグの８コピーと共に発現する第４のプラスミドを含む。対照として、第２のプラスミドを、形質移入混合物から省略する。鋳型を用いた所望の編集事象は、ミュータントＥＧＦＰが、ＥＧＦＰの機能的コピーに補正されているから、フローサイトメトリにより識別する。これ以外にも、ＤＮＡ修復鋳型、およびガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミドを、修復鋳型を含有するレトロン足場と共に、レトロン逆転写酵素およびキメラガイドＲＮＡを発現するプラスミドによって置換することができる。
構成要素の混合物をヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ中に同時形質移入することによって、標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの抗体／エピトープリクルートを介した、鋳型を用いた正確な編集を実証することができる。構成要素の混合物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるミュータントＥＧＦＰ遺伝子のコピーを含有するレシピエントプラスミド、標的部位への鋳型の結合を促進するように、１００～２００ｎｔの相同配列が隣に位置するミュータントＥＧＦＰ用の補正配列を含有する一本鎖ＤＮＡ修復鋳型、注目するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大腸菌由来のＰｏｌ Ｉ）を、リンカーを介してＮ末端に融合されたｓｃＦＶドメインと共に発現する第２のプラスミド、ミュータントＥＧＦＰ配列を標的とするガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミド、およびＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ｅＣａｓ９、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）、またはｎＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ））を、Ｃ末端に融合されたＧＣＮ４タグの８コピーと共に発現する第４のプラスミドを含む。対照として、第２のプラスミドを、形質移入混合物から省略する。鋳型を用いた所望の編集事象は、ミュータントＥＧＦＰが、ＥＧＦＰの機能的コピーに補正されているから、フローサイトメトリにより識別する。これ以外にも、ＤＮＡ修復鋳型、およびガイドＲＮＡを発現する第３のプラスミドを、修復鋳型を含有するレトロン足場と共に、レトロン逆転写酵素およびキメラガイドＲＮＡを発現するプラスミドによって置換することができる。
【0185】
［実施例６．標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＰＵＦ－結合部位（ＰＢＳ）ＲＮＡアプタマーリクルートを介した、鋳型を用いた正確な編集。］
フレーム内のＥＧＦＰ遺伝子（約７００ｂｐ）を、高度に発現される遺伝子（例えばアクチン）のエキソン中に挿入することによって、植物内でのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのリクルートを介した、長い断片の、鋳型を用いた正確な編集および部位特異的統合を実証することができる。この実験設計において、２つのＴ－ＤＮＡが、植物組織中に同時形質転換されることとなる。第１のＴ－ＤＮＡは、標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの有効なリクルート用の正確なアーキテクチャにおいて、ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを発現するツールカセット、ならびにタンパク質リクルートに必須の立体配置においてアクチンの最後のエキソンを標的とするガイドＲＮＡを発現するガイドカセットを含有する。第２のＴ－ＤＮＡは、ＥＧＦＰの完全長、および標的エキソン内の終止コドンのインフレーム欠失をコードする修復鋳型を含有する。当該修復鋳型は、第１のＴ－ＤＮＡにおいて発現されるガイドＲＮＡによって認識される標的部位が隣に位置する。ＥＧＦＰの所望の部位特異的統合により、アクチン遺伝子のプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰが発現する一方、ランダムな統合により、プロモーターの欠如に起因して、ＥＧＦＰは発現しない。部位特異的統合の頻度を、顕微鏡観察によって定量化することができる。これ以外にも、第１のＴ－ＤＮＡは、ツールカセットのみを発現することとなり、第２のＴ－ＤＮＡは、レトロン逆転写酵素カセット、およびガイドＲＮＡ足場に付着されるレトロン足場内に修復鋳型をコードするキメラガイドＲＮＡカセットを含有することとなる。
フレーム内のＥＧＦＰ遺伝子（約７００ｂｐ）を、高度に発現される遺伝子（例えばアクチン）のエキソン中に挿入することによって、植物内でのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのリクルートを介した、長い断片の、鋳型を用いた正確な編集および部位特異的統合を実証することができる。この実験設計において、２つのＴ－ＤＮＡが、植物組織中に同時形質転換されることとなる。第１のＴ－ＤＮＡは、標的部位へのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの有効なリクルート用の正確なアーキテクチャにおいて、ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを発現するツールカセット、ならびにタンパク質リクルートに必須の立体配置においてアクチンの最後のエキソンを標的とするガイドＲＮＡを発現するガイドカセットを含有する。第２のＴ－ＤＮＡは、ＥＧＦＰの完全長、および標的エキソン内の終止コドンのインフレーム欠失をコードする修復鋳型を含有する。当該修復鋳型は、第１のＴ－ＤＮＡにおいて発現されるガイドＲＮＡによって認識される標的部位が隣に位置する。ＥＧＦＰの所望の部位特異的統合により、アクチン遺伝子のプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰが発現する一方、ランダムな統合により、プロモーターの欠如に起因して、ＥＧＦＰは発現しない。部位特異的統合の頻度を、顕微鏡観察によって定量化することができる。これ以外にも、第１のＴ－ＤＮＡは、ツールカセットのみを発現することとなり、第２のＴ－ＤＮＡは、レトロン逆転写酵素カセット、およびガイドＲＮＡ足場に付着されるレトロン足場内に修復鋳型をコードするキメラガイドＲＮＡカセットを含有することとなる。
【0186】
［実施例７．ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのリクルートおよび最適化］
先の実施例および本明細書中により一般的に記載されるように、多くの異なる方法を用いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを編集部位にリクルートすることができる。例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、例えば塩基エディタのアーキテクチャにおいて、フレキシブルリンカーを介してＣＲＩＳＰＲタンパク質のＣ末端またはＮ末端に融合することができる。これ以外にも、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、切断されたか、またはニックが入れられた標的ＤＮＡに、ガイドＲＮＡ（例えばＭＳ２ループ）またはＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えばＳｕｎＴａｇ）との相互作用を介してリクルートすることができる。
先の実施例および本明細書中により一般的に記載されるように、多くの異なる方法を用いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを編集部位にリクルートすることができる。例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、例えば塩基エディタのアーキテクチャにおいて、フレキシブルリンカーを介してＣＲＩＳＰＲタンパク質のＣ末端またはＮ末端に融合することができる。これ以外にも、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、切断されたか、またはニックが入れられた標的ＤＮＡに、ガイドＲＮＡ（例えばＭＳ２ループ）またはＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えばＳｕｎＴａｇ）との相互作用を介してリクルートすることができる。
【0187】
以下に限定されないが、３’－５’エキソヌクレアーゼ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、および／または５’－３’ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を取り除くことが挙げられるいくつもの方法で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの機能を向上させる／最適化することができる。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはさらに、タンパク質のクレノウ断片または他のサブ断片を含んでもよい。クレノウ断片または他の活性断片は、送達または活性目的に有用であり得る。一例として、大腸菌クレノウ断片は、６８ｋＤａであり、または完全（１０９ｋＤａ）ＤＮＡポリメラーゼＩの分子量の６２％である。
【0188】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素へのタンパク質ドメイン融合が、編集システムの温度感受性およびプロセッシビティに大きな作用を及ぼし得る。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）への融合を介して、温度感受性、プロセッシビティ、および鋳型親和性について向上し得る。これらのＤＢＤは、配列特異性、非特異性、または配列選択を有し得る。異なる細胞環境およびインビトロ環境において、広範な親和性分配が、編集に有益であり得る。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素への１つまたは複数のＤＢＤ追加により、親和性が増大し、配列特異性が増大もしくは低下し、かつ／または協同作用が促進し得る。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティを増大させることが知られている特定の一ＤＢＤが、スルホロブス・ソルファタリカス由来の、配列非特異的ｄｓＤＮＡ結合タンパク質Ｓｓｏ７ｄである（Ｗａｎｇ，２００４）。ｄｓＤＮＡ結合タンパク質は、ポリメラーゼのＣ末端、Ｎ末端、またはフレキシブルループに融合され得る。フレーム内のより大きなリポーター遺伝子、例えばｔｄＴｏｍａｔｏ（約１５００ｂｐ）を、高度に発現される遺伝子（例えばアクチン）のエキソン中に挿入することによって、プロセッシビティの増大を実証することができる。例えば、２つのＴ－ＤＮＡが、植物組織中に同時形質転換され得る。第１のＴ－ＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ：：ｓｓＤＢＤの標的部位への有効なリクルート用の正確なアーキテクチャにおいてＣＲＩＳＰＲタンパク質およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ：：ｓｓＤＢＤを発現するツールカセット、およびタンパク質リクルートに必須の立体配置においてアクチンの最後のエキソンを標的とするガイドＲＮＡを発現するガイドカセットを含有する。第２のＴ－ＤＮＡは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（または他のリポーター）の完全長、および標的エキソン内の終止コドンのインフレーム欠失をコードする修復鋳型を含有する。当該修復鋳型は、第１のＴ－ＤＮＡにおいて発現されるガイドＲＮＡによって認識される標的部位が隣に位置する。ｔｄＴｏｍａｔｏ（または他のリポーター）の所望の部位特異的統合により、アクチン遺伝子のプロモーターによって駆動されるｔｄＴｏｍａｔｏが発現する一方、ランダムな統合により、プロモーターの欠如に起因して、ｔｄＴｏｍａｔｏは発現しない。部位特異的統合の頻度を、顕微鏡観察によって定量化することができる。
【0189】
［実施例８．ＣＲＩＳＰＲポリペプチド］
本発明は、高プロセッシビティＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用して、提供される修復鋳型にアニールされる、切断されたか、またはニックが入れられた標的ＤＮＡの３’末端によって開始されるＤＮＡ合成を迅速に開始する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびニッカーゼ、ならびにＣａｓ１２ａヌクレアーゼ、ならびにニッカーゼおよび他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタポリペプチドを用いて、３’ＤＮＡ標的末端を生成することができる。修復鋳型、特にサイズが大きい鋳型の組込みの成功は、切断された部位またはニック部位から離れてＤＮＡ鋳型に沿って移動するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの能力次第であり得る。切断されたか、またはニックが入れられたＤＮＡに結合したままであり得るＣａｓ９タンパク質への直接的融合は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの移動を妨げ得る可能性がある。その理由で、ｅＣａｓ９（３つのアミノ酸変異（Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ）４）ヌクレアーゼまたはニッカーゼ等の、ＤＮＡへの結合親和性が引き下げられたＣａｓ９を用いてもよい。これ以外にも、ＣＲＩＳＰＲ複合体へのポリメラーゼの非共有結合性のリクルートを用いて、ポリメラーゼが立体阻害または移動制約なしで機能する機会を最大にすることができる。いくつかの共有結合性のリクルート戦略および非共有結合性のリクルート戦略を、本明細書中に記載する。例えば、Ｃｐｆ１／Ｃａｓ１２ａは、安定した結合（Ｃａｓ９について、１７－ｂｐ対９～１０－ｂｐ）のために、より長いシード配列を有する。これは、標的ＤＮＡに対するより低い親和性を示し（Ｊｅｏｎ ｅｔ． ａｌ，２０１８）、Ｃｐｆ１により見出される編集のより低いオフターゲット速度と一致する。Ｃａｓ９と比較したＣｐｆ１の、標的ＤＮＡに対するより低い親和性は、編集ツールの移動を必要とするポリメラーゼ融合の利点であり得る。
本発明は、高プロセッシビティＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用して、提供される修復鋳型にアニールされる、切断されたか、またはニックが入れられた標的ＤＮＡの３’末端によって開始されるＤＮＡ合成を迅速に開始する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびニッカーゼ、ならびにＣａｓ１２ａヌクレアーゼ、ならびにニッカーゼおよび他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタポリペプチドを用いて、３’ＤＮＡ標的末端を生成することができる。修復鋳型、特にサイズが大きい鋳型の組込みの成功は、切断された部位またはニック部位から離れてＤＮＡ鋳型に沿って移動するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの能力次第であり得る。切断されたか、またはニックが入れられたＤＮＡに結合したままであり得るＣａｓ９タンパク質への直接的融合は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの移動を妨げ得る可能性がある。その理由で、ｅＣａｓ９（３つのアミノ酸変異（Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ）４）ヌクレアーゼまたはニッカーゼ等の、ＤＮＡへの結合親和性が引き下げられたＣａｓ９を用いてもよい。これ以外にも、ＣＲＩＳＰＲ複合体へのポリメラーゼの非共有結合性のリクルートを用いて、ポリメラーゼが立体阻害または移動制約なしで機能する機会を最大にすることができる。いくつかの共有結合性のリクルート戦略および非共有結合性のリクルート戦略を、本明細書中に記載する。例えば、Ｃｐｆ１／Ｃａｓ１２ａは、安定した結合（Ｃａｓ９について、１７－ｂｐ対９～１０－ｂｐ）のために、より長いシード配列を有する。これは、標的ＤＮＡに対するより低い親和性を示し（Ｊｅｏｎ ｅｔ． ａｌ，２０１８）、Ｃｐｆ１により見出される編集のより低いオフターゲット速度と一致する。Ｃａｓ９と比較したＣｐｆ１の、標的ＤＮＡに対するより低い親和性は、編集ツールの移動を必要とするポリメラーゼ融合の利点であり得る。
【0190】
［実施例９．修復鋳型リクルート］
ヒト細胞実験において、修復鋳型を、以下が挙げられるがこれに限定されないいくつかの異なる戦略によってリクルートすることができる、１）ＣＲＩＳＰＲタンパク質に融合されたＰＣＶドメインと、修復鋳型内に埋め込まれたＰＣＶ認識部位との相互作用、および２）キメラレトロン－ガイドＲＮＡ足場から生成され、かつガイドＲＮＡ足場に繋がれる修復鋳型をコードするｍｓＤＮＡ。
ヒト細胞実験において、修復鋳型を、以下が挙げられるがこれに限定されないいくつかの異なる戦略によってリクルートすることができる、１）ＣＲＩＳＰＲタンパク質に融合されたＰＣＶドメインと、修復鋳型内に埋め込まれたＰＣＶ認識部位との相互作用、および２）キメラレトロン－ガイドＲＮＡ足場から生成され、かつガイドＲＮＡ足場に繋がれる修復鋳型をコードするｍｓＤＮＡ。
【0191】
［実施例１０．植物におけるゲノム編集］
植物の編集において、修復鋳型送達の種々の方法を用いることができ、これらは、形質転換方法に応じて変動し得る。例えば、アグロバクテリウム属媒介植物形質転換について、ＶｉｒＤ２またはＶｉｒＥ２媒介Ｔ－ＤＮＡリクルートを用いることができ、またはｍｓＤＮＡであってもよく、そして粒子衝撃について、ＨＵＨタギング系およびｍｓＤＮＡを用いることができる。
植物の編集において、修復鋳型送達の種々の方法を用いることができ、これらは、形質転換方法に応じて変動し得る。例えば、アグロバクテリウム属媒介植物形質転換について、ＶｉｒＤ２またはＶｉｒＥ２媒介Ｔ－ＤＮＡリクルートを用いることができ、またはｍｓＤＮＡであってもよく、そして粒子衝撃について、ＨＵＨタギング系およびｍｓＤＮＡを用いることができる。
【0192】
［実施例１１．ヒト細胞における編集］
真核生物ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地プラスＧｌｕｔａＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（ＦＢＳ）内で、５％ ＣＯ２、３７℃にて培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、４８ウェルのコラーゲンコーティングしたＢｉｏＣｏａｔプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種した。細胞を、約７０％コンフルエンシーにて形質移入した。ウェルあたり１．５μｌのリポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってＤＮＡを形質移入した。ウェルあたり１．５μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってＲＮＰを形質移入した。形質移入された細胞由来のゲノムＤＮＡを３日後に得て、高スループットＩｌｌｕｍｉｎａアンプリコン配列決定を用いて、正確な編集を検出かつ定量化した。
真核生物ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地プラスＧｌｕｔａＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（ＦＢＳ）内で、５％ ＣＯ２、３７℃にて培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、４８ウェルのコラーゲンコーティングしたＢｉｏＣｏａｔプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種した。細胞を、約７０％コンフルエンシーにて形質移入した。ウェルあたり１．５μｌのリポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってＤＮＡを形質移入した。ウェルあたり１．５μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってＲＮＰを形質移入した。形質移入された細胞由来のゲノムＤＮＡを３日後に得て、高スループットＩｌｌｕｍｉｎａアンプリコン配列決定を用いて、正確な編集を検出かつ定量化した。
【0193】
ＤＮＡ鋳型のＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長を試験するために、以下を行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、最初に、Ｋｌｅｎｔａｑ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｐｆｕ－Ｓｓｏｄ７、クレノウ、大腸菌ｐｏｌＩ、ＨＵ ｐｏｌ Ｅ（Ｎ－ｔｅｒｍ）、酵母ｐｏｌ Ｅが挙げられる種々のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを構成的ＣＭＶプロモーター下にコードする１ｕｇのＤＮＡで形質移入した（例えば、配列番号４８～５８、８８～９４参照）。全てのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、少なくとも１つのＳＶ４０核局在化配列で増強して、核中へのインポートを確実にした。４時間後に、細胞をフレッシュな培地下に置いた。その後、種々の合成ｃｒＲＮＡ伸長（例えば、配列番号７８、７９、８２、８３、８６、８７参照）を含有するＣａｓ１２ａ ＲＮＰ複合体（例えば配列番号７５参照）を細胞中に形質移入した。Ｃａｓ１２ａ切断部位の下流側に相同アームをコードするＤＮＡ伸長部、および所望の編集をコードする鋳型配列を、化学合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、ｃｒＲＮＡにコンジュゲートした。２つの異なる相同長さ（ＰＢＳ；２４ｂｐおよび３６ｂｐ）を試験した。所望の編集（ＲＴＴ）を含有する鋳型の長さは３６塩基対であった（表２）。３つの異なるスペーサーを用いて、システムを試験した（ＰＷｓｐ１３７（配列番号７６）、ＰＷｓｐ４５３（配列番号８０）、ＰＷｓｐ４５４（配列番号８４））（表２）。全ての構築体について、鋳型は、スペーサーの位置－２および－３での、アデニンへの正確なジヌクレオチド変化（ＴＴからＡＡ）を含有した。ＰＡＭ配列（ＴＴＴＶ）は、位置－４、－３、－２、および－１に対応する。
【0194】
発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼを、ｃｒＲＮＡ上にＤＮＡ伸長部を含有するＣａｓ１２ａ ＲＮＰと併用して、如何なる副産物もない正確な編集を検出した（表２）。正確な編集を、試験した３つ全てのスペーサーにおいて検出した（表２）。インデル率は、ＬｂＣａｓ１２ａ ＲＮＰから有効であると予想される（２９３Ｔにおいて、５～５０％の編集効率、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４７（８）：４１６９－４１８０（２０１９）参照）ので、発明者らの低い（約１％）インデル率（表３）は、発明者らの実験における２ラウンドの形質移入は、送達システムの効率を大幅に低下させたことを示唆している。発明者らの実験における正確な編集率がインデル率（表３および表４）に類似していた事実は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを介した正確な編集が、正確な編集にとって潜在的に非常に有効であることを示唆している。正確な編集のバックグラウンドレベルを減算して、正確な編集を、（形質移入および生存率について正規化するために）インデル編集率に対して正規化した場合、ＤＮＡポリメラーゼおよび鋳型の追加は、ほとんどのスペーサー部位およびＰＢＳ長でのＤＮＡポリメラーゼなし対照と比較して、正確な編集における実質的な増大に至ることが明らかである（表４）。
【0195】
【0196】
【0197】
【0198】
前述のものは、本発明の実例であり、その限定と解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の均等物もその中に含まれるべきである。
【配列表】
【国際調査報告】