(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-15
(54)【発明の名称】変性エポキシ樹脂固定化酵素、製造方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C12N 11/08 20200101AFI20230308BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20230308BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20230308BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20230308BHJP
C12P 1/00 20060101ALI20230308BHJP
【ＦＩ】
C12N11/08 ZNA
C12N9/10
C12N9/02
C12N9/88
C12P1/00 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022542698
(86)(22)【出願日】2020-01-14
(85)【翻訳文提出日】2022-07-26
(86)【国際出願番号】 CN2020072009
(87)【国際公開番号】W WO2021142618
(87)【国際公開日】2021-07-22
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516156282
【氏名又は名称】▲凱▼菜英生命科学技▲術▼（天津）有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110002734
【氏名又は名称】弁理士法人藤本パートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】洪 浩
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ，ゲイジ
(72)【発明者】
【氏名】肖 毅
(72)【発明者】
【氏名】ラジャセカール，ビャサラヤニ ウィリアムズ
(72)【発明者】
【氏名】崔 瑜霞
(72)【発明者】
【氏名】張 娜
(72)【発明者】
【氏名】趙 佳東
(72)【発明者】
【氏名】高 妍妍
【テーマコード（参考）】
4B033
4B050
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B033NA22
4B033NB34
4B033NC05
4B033ND02
4B033NH09
4B050CC02
4B050CC08
4B050GG10
4B050LL05
4B064CA35
4B064CB01
4B064CB17
4B064CB28
4B064DA16
(57)【要約】
変性エポキシ樹脂固定化酵素、製造方法及び使用を提供する。前記製造方法は、エポキシ樹脂を変性し、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行い、次に、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化し、変性エポキシ樹脂固定化酵素を得るステップを含む。エポキシ樹脂を変性し、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行い、樹脂のアルデヒド基及びポリエチレンイミンのアミノ基によって各種の酵素を共有結合し、次に、二重機能性試薬であるグルタルアルデヒドで活性化させることによって、空間における樹脂分岐を増やし、網状構造を形成し、共有結合によって酵素をより容易に結合させることができ、空間上の制限が減少するため、酵素担持も改善される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
変性エポキシ樹脂固定化酵素の製造方法であって、エポキシ樹脂を変性し、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行い、次に、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化し、前記変性エポキシ樹脂固定化酵素を得るステップを含む、ことを特徴とする変性エポキシ樹脂固定化酵素の製造方法。
【請求項2】
前記エポキシ樹脂を変性することは、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化すること、又はイミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させることを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記エポキシ樹脂を変性することが、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化することである場合に、過ヨウ素酸ナトリウムを加えるに先立って、先ず酢酸で前記エポキシ樹脂を処理し、そして、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化した後に、架橋剤としてグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを添加して二次架橋を行うステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項4】
前記エポキシ樹脂を変性することが、イミノ二酢酸をエポキシ樹脂と反応させることである場合に、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行った後に、金属イオン溶液を加えて処理するステップをさらに含み、かつ、前記固定化対象酵素はｈｉｓタグを有し、好ましくは、前記金属イオン溶液は塩化コバルト、硫酸コバルト、塩化ニッケル、硫酸銅、塩化第一鉄、硫酸第一鉄から選択される１種又は複数種であり、
好ましくは、前記金属イオン溶液の濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌで、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ～５０ｍｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項5】
前記固定化対象酵素及びグルタルアルデヒドの添加順番は、前記固定化対象酵素、グルタルアルデヒド、又はグルタルアルデヒド、前記固定化対象酵素の順である、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項6】
変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行うステップは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋又はＰＬＰである補因子を添加することをさらに含み、好ましくは、前記ポリエチレンイミンはポリエチレンイミン水溶液の形態で反応に参加し、前記ポリエチレンイミン水溶液中の前記補因子の最終濃度が１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬで、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ～６ｍｇ／ｍＬであり、
好ましくは、前記架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドは、使用する前にＰＥＧで架橋剤を修飾するステップを受け、前記架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを前記ＰＥＧで修飾するステップは、架橋剤を水で溶解し、次にＰＥＧを加えて２０℃～３０℃で１ｈ～６ｈ撹拌することを含み、ＰＥＧは、ＰＥＧ４００～ＰＥＧ２０００から選択され、ＰＥＧと架橋剤との質量比が１：１～１０：１で、さらに好ましくは２：１～４：１である、ことを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項7】
前記酢酸によるエポキシ樹脂処理において、使用される酢酸は、酢酸濃度が０．５Ｍ～３Ｍで、好ましくは１Ｍ～２Ｍの酢酸溶液であり、前記酢酸溶液と前記エポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは１０～１５：１であり、好ましくは、前記過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化する際に使用される過ヨウ素酸ナトリウム溶液において、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度は５０ｍＭ～５００ｍＭで、好ましくは１００ｍＭ～２００ｍＭであり、前記過ヨウ素酸ナトリウム溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは５～１５：１であり、
好ましくは、前記ポリエチレンイミンの分子量は３ＫＤａ～７０ＫＤａであり、前記ポリエチレンイミン水溶液の濃度は０．５％～３％で、好ましくは１％～２％であり、前記ポリエチレンイミン水溶液のｐＨは６～１１で、さらに好ましくは７～１０であり、
好ましくは、架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドの体積／質量最終濃度は０．１％～３％で、好ましくは０．３％～２％であり、
好ましくは、酵素と前記変性エポキシ樹脂との質量比は０．０５～０．３：１であり、
好ましくは、前記イミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させる際に、イミノ二酢酸としては濃度０．５Ｍ～３Ｍで、好ましくは１Ｍ～２Ｍのイミノ二酢酸水溶液が使用され、前記イミノ二酢酸水溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは１０～１５：１であり、前記イミノ二酢酸水溶液のｐＨは６．０～１０．０で、好ましくは７．０～９．０である、ことを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項8】
前記酢酸と前記エポキシ樹脂を混合した後の処理時間は６ｈ～２４ｈで、好ましくは１０ｈ～１５ｈであり、好ましくは、前記過ヨウ素酸ナトリウム溶液と前記エポキシ樹脂を混合した後の反応時間は１ｈ～６ｈ、好ましくは２～３ｈであり、
好ましくは、前記ポリエチレンイミン水溶液と前記エポキシ樹脂を混合した後の反応時間は１ｈ～２０ｈで、好ましくは３ｈ～６ｈであり、
好ましくは、前記酵素と前記変性エポキシ樹脂を混合した後の反応時間は２ｈ～２４ｈで、好ましくは１５ｈ～２０ｈであり、
好ましくは、架橋剤を加えた後の反応時間は１０ｍｉｎ～１２０ｍｉｎで、好ましくは２０ｍｉｎ～６０ｍｉｎであり、
好ましくは、前記イミノ二酢酸水溶液と前記エポキシ樹脂を混合した後の作用時間は０．５ｈ～６ｈで、好ましくは１～２ｈであり、
好ましくは、前記ポリエチレンイミン水溶液と担体を混合した後の作用時間は１ｈ～２０ｈで、さらに３ｈ～６ｈであり、
金属イオンを加えた後の作用時間は１ｈ～６ｈで、さらに１ｈ～３ｈであり、
酵素液と担体を混合した後の作用時間は４ｈ～４８ｈで、さらに１５ｈ～２０ｈである、ことを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項9】
前記エポキシ樹脂は、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ(R)ＬｉｆｅｔｅｃｈTMＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９、ＳＥＰＬＩＴＥ(R)ＬＸ１０００ＥＡ、ＬＸ１０００ＥＰ、ＬＸ１０３Ｂ、ＥＰ２００、ＬＸ１０００ＨＦＡ、ＨＦＡ００１、ＬＸ１０７Ｓ、ＬＸ１０００ＳＷ、ＬＸ１０００ＳＤ、ＨＥＣＨＥＮＧ(R)ＥＳ１、ＥＳ１０３、ＥＳ１０５、ＥＳ１０８、及びＥＳ１０９からなる群から選択される１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項10】
前記固定化対象酵素は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１由来のトランスアミナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来のトランスアミナーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＪＳ１７由来のトランスアミナーゼ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１由来のケトレダクターゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ ＡＫＵ４５８８由来のケトレダクターゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｐｈｉｌ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ ｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤ１由来のモノオキシゲナーゼ、ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のアンモニアリアーゼ、Ｓｏｌｅｎｏｓｔｅｍｏｎ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｏｉｄｅｓ由来のアンモニアリアーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のエンレダクターゼ、ＣｈｒｙＳＥＱｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡ４９由来のエンレダクターゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のイミンレダクターゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のロイシンデヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ ５１３．８８由来のニトリラーゼ、及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のニトリラーゼからなる群から選択される１種又は複数種であり、好ましくは、前記Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１由来のトランスアミナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有する突然変異体であり、前記Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ由来のトランスアミナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６配列を有する突然変異体であり、前記Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１由来のケトレダクターゼはＳＥＱＩＤＮＯ：８配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：９配列を有する突然変異体であり、前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｐｈｉｌ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２配列を有する突然変異体であり、前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤ１由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５配列を有する突然変異体である、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される、ことを特徴とする変性エポキシ樹脂固定化酵素。
【請求項12】
水性緩衝液反応系又は有機溶媒反応系における請求項１１に記載の変性エポキシ樹脂固定化酵素の使用。
【請求項13】
前記水性緩衝液反応系又は有機溶媒反応系は、充填層反応器又は連続撹拌槽反応器にて反応を行う、ことを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生体触媒の技術分野に関し、具体的には、変性エポキシ樹脂固定化酵素、製造方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
酵素は生体触媒として様々な工業過程に広く用いられ、化学触媒と比べて酵素は高活性で、選択性が強く、特異性が高いという利点がある。酵素は非常に温和な反応条件下で複雑な化合物を生成することができ、これにより、より持続可能なプロセスを開発することができ、それによって、酵素触媒プロセスは新興のプラットフォームになった。酵素は生物由来であるため、一般に、工業過程に必要な操作特性とは異なる操作特性を有する。
【0003】
生体触媒は、酵素の種類及び使用に応じて、全生細胞、死細胞、粗酵素又は精製酵素を用いて製造することができる。酵素の生産拡大とタンパク質工学の進歩により、生体触媒は商業的な使用が可能となり、経済的価値も高い。
【0004】
酵素は独特なプロセスとコストの優位性があるため、工業過程にますます広く応用されており、酵素の固定化形式にもますます高い要件が求められている。一般的に「生体触媒」と呼ばれる固定化酵素は、工業的な有機合成や生物変換に広く用いられている。
【0005】
バイオテクノロジーで酵素の使用を成功させる最も有用な戦略の１つは、それらの固定化である。適切な酵素固定化は、激しい反応条件（例えば、その生理学的範囲を大幅に超えたｐＨ及び温度）に対する抵抗性、酵素活性の向上、循環使用性、連続使用性、及び基質特異性、エナンチオマー特異性又は生成物選択性の向上などの酵素性能を向上させる強力な手段である。
【0006】
新しい固定化プラットフォームの出現により、固定化酵素は連続流動生体触媒においてうまく統合されている。新しい高性能酵素の発見及び進化、生体触媒を強調した新しい逆方向合成方法、減少した組換えタンパク質コストと酵素固定化策略などはすべて生体触媒が連続合成に応用する良好な基礎である。
【0007】
酵素のアミノ酸側鎖の官能基の独特な特徴により、可逆的結合（例えばファンデルワールス力、疎水性又はイオン結合）と不可逆的化学結合（例えば共有結合）を担体表面に吸着させることによって、担体と固定化することができる（Sheldonら,2013）。
【0008】
共有結合により生体触媒と担体とが不可逆的に結合されるので、酵素の漏洩を防止し、酵素の回収性を効果的に向上させることができる。共有結合担体の中で、エポキシ活性化担体はほぼ理想的な基質であり、実験室及び工業的規模で極めて容易にタンパク質を固定化することができる（Hannibal-Friedrich et al 1980; Hernaiz et al 2000; Calleri et al 2004; Podgornik, H. et al 2002）。これらの担体は活性化された形態で存在する。また、これらの担体は中性水性媒体中に懸濁させても貯蔵と輸送の過程で非常に安定であり、長期間の固定化に使用でき、酵素が支持表面を完全に覆うことができる。非常に温和な実験条件（例えばｐＨ７．０）でエポキシ活性化担体をタンパク質と反応させることで、タンパク質（２級アミン、チオエーテル及びエーテル）の非常に小さな化学修飾を促進することができる。
【0009】
一般に、可溶性タンパク質は中性ｐＨでエポキシ基と反応しにくい。エポキシ樹脂担体のこのような低い反応性により、これらの担体上の酵素の固定化は２段階のメカニズムを通じて産生する。まず、タンパク質が担体上に迅速で温和に物理的吸着され、次に、吸着タンパク質と隣接するエポキシ基との間で共有結合反応が起こる［Wheatley et al 1999; Bauer-Arnaz et al 1998］。
【0010】
このようなメカニズムにより、タンパク質を固定化するための市販のエポキシ樹脂担体は、高いイオン強度（疎水性相互作用）でインキュベートされたときにタンパク質を吸着するために、かなり疎水性である。いくつかの場合に、疎水性担体の使用は、タンパク質構造の誤った折り畳みを促進し、ここで、当該タンパク質構造は、外層に位置する内部疎水性アミノ酸の異常構造の安定化に起因するものである（Fitzpatrick PA et al 1993）。また、一般的に高濃度の塩を使用することは、さまざまな酵素、特にサブユニット間のイオン力で結合したポリメラーゼの活性を失わせることができる（Fernandez-Lafuente et al 2009）。エポキシ樹脂担体は非常に重要な固定化プラットフォームであるが、新しい酵素、特に進化したポリメラーゼの出現に伴い、エポキシ樹脂担体の全体的な改良と新しい固定化プロセスが必要となっている。
【0011】
Ｂｏｌｉｖａｒら（２００７）は、エポキシ樹脂と、アミノエポキシ樹脂と、グリオキサール（エポキシ樹脂）と、グルタルアルデヒド処理によりアミノ化担体に吸着した酵素とを用いてＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ由来のギ酸デヒドロゲナーゼを固定化する異なる固定化戦略を評価した。中でも、アミノエポキシ樹脂担体（可溶性酵素に比べて１２倍因子）とエチレングリコールアガロース担体（１５０倍因子）を用いることが最適な安定性を示した。しかし、いずれの場合も活性回復は１５％をわずかに上回る程度にとどまった。
【0012】
Ｔｒｕｐｐｏら（２０１２）は、有機溶媒中での固定化酵素の使用のために、三菱社の重合体系樹脂（ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ）を用いたＪａｎｕｖｉａトランスアミナーゼ（ＣＤＸ０１１７、Ｃｏｄｅｘｉｓ）の固定化を評価した。選択された樹脂は、共有結合固定化のための３つのエポキシド官能化担体（ＥＣ－ＥＰ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ及びＥＸＥ１１９）と、疎水性相互作用による固定化のための２つの吸着担体（ＥＸＡ２５２及びＥＸＥ１２０）とを含む。試験した多くの担体が活性を示したが、高疎水性オクタデシル官能化ポリメタクリレート樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤ ＥＸＥ１２０（吸着担体）が最も高い比活性を示した。ＥＸＥ１２０樹脂上において、固定化過程で添加した酵素における、４５％まで高い活性を回収した結果、トランスアミナーゼの樹脂への担持量は４ｗｔ％（固体担体トランスフェラーゼ１ｇあたり４０ｍｇ）となった。エポキシ樹脂担体ＥＣ－ＥＰは、固定化条件下では酵素結合及び発現が低下しており、これはエポキシ樹脂担体が酵素を変性させるためであるかもしれないと考えられる。
【0013】
Ｈｕｉ Ｒｅｎら（２０１６）は、古生物Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来の好熱性エステラーゼＡＦＥＳＴをエポキシ樹脂担体Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＥＣ－ＥＰに共有結合により固定化し、固定化酵素を重合反応（「－カプロラクトン」）の生体触媒として用いることを報告している。基質としてｐ－ニトロフェニルオクタン酸塩を用い、固定化酵素の酵素担持量及び回収活性を８０℃でそれぞれ測定した結果、７２ｍｇ／ｇ及び１０．４Ｕ／ｍｇであった。固定化酵素は繰り返し使用性に優れ、１５回のバッチ反応で７５％を超える単量体転化率を示した。
【0014】
Ana I.Benitez-Mateosら（２０１８）は、多孔質担体が補因子ＰＬＰと結合することにより、自給型固定化トランスアミナーゼの開発に利用されていることを報告している。このプロジェクトでは、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｎｇａｔａ由来のω－アミノトランスフェラーゼが、ポリエチレンイミンでコーティングされた多孔質メタクリル酸エステル系金属キレート担体にＰＬＰとともに固定化された。充填層反応器はモデルアミン（α－メチルベンジルアミン）のエナンチオ選択的脱アミノ化において、１．４５ｍＬ×ｍｉｎ－１で５０個のカラム体積まで連続的に運転し、すべてのサイクルで９０％より高い転化率を発生し、外因性補因子を添加する必要がない。クロモバクテリウム・ビオラセウム及びシュードモナス・フルオレッセンス由来のトランスアミナーゼを用いて同様の方法を行う場合に、同様の活性を示す。しかし、この方法は積極的であるように思われるが、全体的に最も長い操作時間の場合に、酵素報告の安定性は１３３分間であった。
【0015】
固定化酵素の報告はいくつかあるが、表１に挙げた酵素の固定化酵素の報告はほとんどないか、ない。
【0016】
【表1】
【0017】
従来技術で報告されている酵素固定化方法は、表１の酵素の産業上の利用には適さず、その安定性をさらに向上させる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明は、酵素の繰り返し使用の安定性を向上させるために、変性エポキシ樹脂固定化酵素、製造方法及び使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0019】
上記目的を達成させるために、本発明の一態様によれば、変性エポキシ樹脂固定化酵素の製造方法を提供する。該製造方法は、エポキシ樹脂を変性し、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行い、次に、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化し、変性エポキシ樹脂固定化酵素を得るステップを含む。
【0020】
さらに、エポキシ樹脂を変性することは、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化すること、又はイミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させることを含む。
【0021】
さらに、エポキシ樹脂を変性することが、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化することである場合に、過ヨウ素酸ナトリウムを加えるに先立って、酢酸でエポキシ樹脂を処理し、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化した後に、架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを添加して二次架橋を行うステップをさらに含む。
【0022】
さらに、エポキシ樹脂を変性することが、イミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させることである場合に、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行った後に、金属イオン溶液を加えて処理するステップをさらに含み、かつ、固定化対象酵素はｈｉｓタグを有し、好ましくは、金属イオン溶液は塩化コバルト、硫酸コバルト、塩化ニッケル、硫酸銅、塩化第一鉄、硫酸第一鉄から選択される１種又は複数種であり、好ましくは、金属イオン溶液の濃度は５～１００ｍｍｏｌ／Ｌで、好ましくは１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【0023】
さらに、固定化対象酵素及びグルタルアルデヒドの添加順番は、固定化対象酵素、グルタルアルデヒド又はグルタルアルデヒド、固定化対象酵素の順である。
【0024】
さらに、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行うステップは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋又はＰＬＰである補因子を添加することをさらに含み、好ましくは、ポリエチレンイミンはポリエチレンイミン水溶液の形態で反応に参加し、ポリエチレンイミン水溶液中の補因子の最終濃度が１～１０ｍｇ／ｍＬで、好ましくは３～６ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドは、使用する前にＰＥＧで架橋剤を修飾するステップを受け、架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドをＰＥＧで修飾するステップは、架橋剤を水で溶解し、次にＰＥＧを加えて、２０～３０℃で１～６ｈ撹拌することを含み、ＰＥＧは、ＰＥＧ４００～ＰＥＧ２０００から選択され、ＰＥＧと架橋剤との質量比が１：１～１０：１で、さらに好ましくは２：１～４：１である。
【0025】
さらに、酢酸によるエポキシ樹脂処理において、使用される酢酸は、酢酸濃度が０．５～３Ｍで、好ましくは１～２Ｍの酢酸溶液であり、酢酸溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは１０～１５：１であり、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化する際に使用される過ヨウ素酸ナトリウム溶液において、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度は５０～５００ｍＭで、好ましくは１００～２００ｍＭであり、過ヨウ素酸ナトリウム溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは５～１５：１であり、好ましくは、ポリエチレンイミンの分子量は３ＫＤａ～７０ＫＤａであり、ポリエチレンイミン水溶液の濃度は０．５％～３％で、好ましくは１％～２％であり、ポリエチレンイミン水溶液のｐＨは６～１１で、さらに好ましくは７～１０であり、好ましくは、架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドの体積／質量最終濃度は０．１％～３％で、好ましくは０．３％～２％であり、好ましくは、酵素と変性エポキシ樹脂との質量比は０．０５～０．３：１であり、好ましくは、イミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させる際に、イミノ二酢酸としては濃度０．５～３Ｍで、好ましくは１～２Ｍのイミノ二酢酸水溶液が使用され、イミノ二酢酸水溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは１０～１５：１であり、イミノ二酢酸水溶液のｐＨは６．０～１０．０で、好ましくは７．０～９．０である。
【0026】
さらに、酢酸とエポキシ樹脂を混合した後の処理時間は６～２４ｈで、好ましくは１０～１５ｈであり、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム溶液とエポキシ樹脂を混合した後の反応時間は１～６ｈで、好ましくは２～３ｈであり、好ましくは、ポリエチレンイミン水溶液とエポキシ樹脂を混合した後の反応時間は１～２０ｈで、好ましくは３～６ｈであり、好ましくは、酵素と変性エポキシ樹脂を混合した後の反応時間は２～２４ｈで、好ましくは１５～２０ｈであり、好ましくは、架橋剤を加えた後の反応時間は１０～１２０ｍｉｎで、好ましくは２０～６０ｍｉｎであり、好ましくは、イミノ二酢酸水溶液とエポキシ樹脂を混合した後の作用時間は０．５～６ｈで、好ましくは１～２ｈであり、好ましくは、ポリエチレンイミン水溶液と担体を混合した後の作用時間は１～２０ｈで、さらに３～６ｈであり、金属イオンを加えた後の作用時間は１～６ｈで、さらに１～３ｈであり、酵素液と担体を混合した後の作用時間は４～４８ｈで、さらに１５～２０ｈである。
【0027】
さらに、エポキシ樹脂は、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ(R)ＬｉｆｅｔｅｃｈTMＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９、ＳＥＰＬＩＴＥ(R)ＬＸ１０００ＥＡ、ＬＸ１０００ＥＰ、ＬＸ１０３Ｂ、ＥＰ２００、ＬＸ１０００ＨＦＡ、ＨＦＡ００１、ＬＸ１０７Ｓ、ＬＸ１０００ＳＷ、ＬＸ１０００ＳＤ、ＨＥＣＨＥＮＧ(R)ＥＳ１、ＥＳ１０３、ＥＳ１０５、ＥＳ１０８和ＥＳ１０９からなる群から選択される１種又は複数種である。
【0028】
さらに、固定化対象酵素は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１由来のトランスアミナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来のトランスアミナーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＪＳ１７由来のトランスアミナーゼ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１由来のケトレダクターゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ ＡＫＵ４５８８由来のケトレダクターゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｐｈｉｌ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ ｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤｌ由来のモノオキシゲナーゼ、ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のアンモニアリアーゼ、Ｓｏｌｅｎｏｓｔｅｍｏｎ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｏｉｄｅｓ由来のアンモニアリアーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のエンレダクターゼ（Ｅｎｅ－Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ＣｈｒｙＳＥＱｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡ４９由来のエンレダクターゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のイミンレダクターゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のロイシンデヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ ５１３．８８由来のニトリラーゼ、及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のニトリラーゼからなる群から選択される１種又は複数種である。Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１由来のトランスアミナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有する突然変異体であり、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ由来のトランスアミナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６配列を有する突然変異体であり、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１由来のケトレダクターゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９配列を有する突然変異体であり、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｐｈｉｌ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２配列を有する突然変異体であり、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤｌ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５配列を有する突然変異体である。
【0029】
本発明の別の態様によれば、変性エポキシ樹脂固定化酵素を提供する。該固定化酵素は上記のいずれかの製造方法によって製造される。
【0030】
本発明のさらなる態様によれば、水性緩衝液反応系又は有機溶媒反応系における変性エポキシ樹脂固定化酵素の使用を提供する。
【0031】
さらに、水性緩衝液反応系又は有機溶媒反応系は充填層反応器又は連続撹拌槽反応器において行われる。
【発明の効果】
【0032】
本発明の技術的解決手段を使用すると、エポキシ樹脂を変性し、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行い、樹脂のアルデヒド基及びポリエチレンイミンのアミノ基によって各種の酵素を共有結合し、次に、二重機能性試薬であるグルタルアルデヒドで活性化させることによって、空間における樹脂分岐を増やし、網状構造を形成し、共有結合によって酵素をより結合させることができ、空間上の制限が減少するため、酵素担持も改善される。
【発明を実施するための形態】
【0033】
なお、矛盾がない限り、本願の実施例及び実施例の特徴は互いに組み合わせられてもよい。以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。
【0034】
名詞の解釈及び略語：
ＩＤＡ：Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｈｙｄｒａｔｅ、イミノ二酢酸二ナトリウム塩水和物。
ＧＡ：Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、グルタルアルデヒド
ＰＥＩ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ、ポリエチレンイミン
ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ポリエチレングリコール
ＩＤＡ：Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｈｙｄｒａｔｅ、イミノ二酢酸二ナトリウム塩水和物。
ＧＡ：Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、グルタルアルデヒド
ＰＥＩ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ、ポリエチレンイミン
ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ポリエチレングリコール
【0035】
ほとんどの場合、生体触媒することは効果的な生体触媒に依存し得る。酵素は多機能性生体触媒であり、高い立体選択性、高い領域選択性及び高い回転率を有する。しかしながら、遊離酵素は比較的敏感であり、かつ不安定であり、効果的に回収して再利用することができない。これらの制限を解消し、その適用性を広げるために、使用する前に、遊離酵素は通常固定化作用を介して不活性不溶性物質に連結される。
【0036】
エポキシ樹脂は既に脂肪酵素、アシルトランスフェラーゼなどの複数種の酵素の固定化に用いられており、このプロセスは非常に操作されやすいが、酵素は優れた回復活性を得るために固定化前に精製する必要があり、ただし、このように活性を回復させていても、他の担体固定化手段、ひいては純粋な酵素の使用よりも劣る。このことに対して、本願は以下の技術的解決手段を提案している。
【0037】
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、変性エポキシ樹脂固定化酵素の製造方法が提供されている。該製造方法は、エポキシ樹脂を変性し、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えてさらなる修飾を行い、次に、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化し、変性エポキシ樹脂固定化酵素を得るステップを含む。
【0038】
本発明の技術的解決手段を使用すると、エポキシ樹脂を変性し、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行い、樹脂のアルデヒド基及びポリエチレンイミンのアミノ基によって各種の酵素を共有結合し、次に、二重機能性試薬であるグルタルアルデヒドで活性化させることによって、空間における樹脂分岐を増やし、網状構造を形成し、共有結合によって酵素をより結合させることができ、空間上の制限が減少するため、酵素担持も改善される。
【0039】
本発明の１つの代表的な実施形態では、エポキシ樹脂を変性することは、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化すること、又はイミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させることを含み、これにより、性能が改善されたエポキシ樹脂が得られる。好ましくは、エポキシ樹脂を変性することが、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化することである場合に、過ヨウ素酸ナトリウムを加えるに先立って、酢酸でエポキシ樹脂を処理し、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化した後に、架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを添加して二次架橋を行うステップをさらに含み、これにより、固定化をより強固なものとする。
【0040】
本願では、イミノ二酢酸及び金属によるエポキシ樹脂変性を修正した。エポキシ樹脂とイミノ二酢酸が反応した後に、ＰＥＩを加えてイオン付着を通じて樹脂と結合させ、次に、適切な金属で処理する。その後、Ｈｉｓ標識酵素を加えて、次に、グルタルアルデヒドで架橋させて付着をより強固なものとする。ＰＥＩは、イミノ二酢酸よりも強い金属を結合することができるし、グルタルアルデヒドと架橋することもでき、これにより、酵素の漏洩が大幅に減少する。本発明の１つの代表的な実施形態によれば、エポキシ樹脂を変性することが、イミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させることである場合に、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行った後に、金属イオン溶液を加えて処理するステップをさらに含み、かつ固定化対象酵素はｈｉｓタグを有し、好ましくは、金属イオン溶液は塩化コバルト、硫酸コバルト、塩化ニッケル、硫酸銅、塩化第一鉄、硫酸第一鉄から選択される１種又は複数種であり、好ましくは、金属イオン溶液の濃度は５～１００ｍｍｏｌ／Ｌで、好ましくは１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【0041】
好ましくは、固定化対象酵素及びグルタルアルデヒドの添加順番は、固定化対象酵素、グルタルアルデヒド又はグルタルアルデヒド、固定化対象酵素の順である。
【0042】
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行うステップは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋又はＰＬＰである補因子を添加することをさらに含み、好ましくは、ポリエチレンイミンはポリエチレンイミン水溶液の形態で反応に参加し、ポリエチレンイミン水溶液中の補因子の最終濃度が１～１０ｍｇ／ｍＬで、好ましくは３～６ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドは、使用する前にＰＥＧで架橋剤を修飾するステップを受け、架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドをＰＥＧで修飾するステップは、架橋剤を水で溶解し、次にＰＥＧを加えて、２０～３０℃で１～６ｈ撹拌することを含み、ＰＥＧはＰＥＧ４００～ＰＥＧ２０００から選択され、ＰＥＧと架橋剤との質量比が１：１～１０：１であり、繰り返し使用性が全て優れており、さらに好ましくは２：１～４：１である。
【0043】
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、酢酸によるエポキシ樹脂処理において、使用される酢酸は、酢酸濃度が０．５～３Ｍで、好ましくは１～２Ｍの酢酸溶液であり、酢酸溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは１０～１５：１であり、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化する際に使用される過ヨウ素酸ナトリウム溶液において、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度は５０～５００ｍＭで、好ましくは１００～２００ｍＭであり、過ヨウ素酸ナトリウム溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは５～１５：１であり、好ましくは、ポリエチレンイミンの分子量は３ＫＤａ～７０ＫＤａであり、ポリエチレンイミン水溶液の濃度は０．５％～３％で、好ましくは１％～２％であり、ポリエチレンイミン水溶液のｐＨは６～１１で、さらに好ましくは７～１０でありで、好ましくは、架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドの体積／質量最終濃度は０．１％～３％で、好ましくは０．３％～２％であり、好ましくは、酵素と変性エポキシ樹脂との質量比は０．０５～０．３：１であり、好ましくは、イミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させる際に、イミノ二酢酸としては濃度０．５～３Ｍで、好ましくは１～２Ｍのイミノ二酢酸水溶液が使用され、イミノ二酢酸水溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは１０～１５：１であり、イミノ二酢酸水溶液のｐＨは６．０～１０．０で、好ましくは７．０～９．０であり、このとき、安定性は最も優れる。
【0044】
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、酢酸とエポキシ樹脂を混合した後の処理時間は６～２４ｈで、好ましくは１０～１５ｈであり、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム溶液とエポキシ樹脂を混合した後の反応時間は１～６ｈで、好ましくは２～３ｈであり、好ましくは、ポリエチレンイミン水溶液とエポキシ樹脂を混合した後の反応時間は１～２０ｈで、好ましくは３～６ｈであり、好ましくは、酵素と変性エポキシ樹脂を混合した後の反応時間は２～２４ｈで、好ましくは１５～２０ｈであり、好ましくは、架橋剤を加えた後の反応時間は１０～１２０ｍｉｎで、好ましくは２０～６０ｍｉｎであり、好ましくは、イミノ二酢酸水溶液とエポキシ樹脂を混合した後の作用時間は０．５～６ｈで、好ましくは１～２ｈであり、好ましくは、ポリエチレンイミン水溶液と担体を混合した後の作用時間は１～２０ｈで、さらに３～６ｈであり、金属イオンを加えた後の作用時間は１～６ｈで、さらに１～３ｈであり、酵素液と担体を混合した後の作用時間は４～４８ｈで、さらに作用時間は１５～２０ｈである。
【0045】
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、エポキシ樹脂は、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ(R)ＬｉｆｅｔｅｃｈTMＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９、ＳＥＰＬＩＴＥ(R)ＬＸ１０００ＥＡ、ＬＸ１０００ＥＰ、ＬＸ１０３Ｂ、ＥＰ２００、ＬＸ１０００ＨＦＡ、ＨＦＡ００１、ＬＸ１０７Ｓ、ＬＸ１０００ＳＷ、ＬＸ１０００ＳＤ、ＨＥＣＨＥＮＧ(R)ＥＳ１、ＥＳ１０３、ＥＳ１０５、ＥＳ１０８、及びＥＳ１０９からなる群から選択される１種又は複数種である。
【0046】
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、固定化対象酵素は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１由来のトランスアミナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来のトランスアミナーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＪＳ１７由来のトランスアミナーゼ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１由来のケトレダクターゼ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ ＡＫＵ４５８８由来のケトレダクターゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｐｈｉ１由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ ｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤｌ由来のモノオキシゲナーゼ、ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のアンモニアリアーゼ、Ｓｏｌｅｎｏｓｔｅｍｏｎ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｏｉｄｅｓ由来のアンモニアリアーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のエンレダクターゼ、ＣｈｒｙＳＥＱｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡ４９由来のエンレダクターゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のイミンレダクターゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のロイシンデヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ ５１３．８８由来のニトリラーゼ、及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のニトリラーゼからなる群から選択される１種又は複数種である。Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１由来のトランスアミナーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有する突然変異体であり、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ由来のトランスアミナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６配列を有する突然変異体であり、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１由来のケトレダクターゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９配列を有する突然変異体であり、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｐｈｉｌ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２配列を有する突然変異体であり、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤ１由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５配列を有する突然変異体である。
【0047】
上記酵素が参加する反応の化学的プロセスは以下のように簡単に説明する。
【化1】
【0048】
上記反応式において、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、置換又は非置換のアルキル基、置換又は非置換のシクロアルキル基、置換又は非置換のアラルキル基、置換又は非置換のヘテロシクリル基、置換又は非置換のヘテロシクロアルキル基から選択されてもよく、又はＲ１はそれが連結する複素環と縮合環系を形成してもよい。
【0049】
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、変性エポキシ樹脂固定化酵素が提供されている。該固定化酵素は上記のいずれかの製造方法によって製造される。
【0050】
本発明の１つの代表的な実施形態によれば、水性緩衝液反応系又は有機溶媒反応系における変性エポキシ樹脂固定化酵素の使用が提供されている。好ましくは、水性緩衝液反応系又は有機溶媒反応系は充填層反応器又は連続撹拌槽反応器において反応を行う。
【0051】
本発明の１つの代表的な実施形態では、エポキシ樹脂（例えば、表２に示すエポキシ樹脂であり、Ｅｐｏｘｙはエポキシ基である）を変性することで、エポキシ樹脂固定化酵素の繰り返し使用性を向上させる。
【0052】
【表2】
【0053】
代表的には、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化すること、又はイミノ二酢酸でエポキシ樹脂を変性することによりエポキシ樹脂の性能を変更する。具体的には、以下のように説明する。
【0054】
一、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されたエポキシ樹脂への酵素の固定化
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した後に、酸化したエポキシ樹脂をＰＥＩ（ポリエチレンイミン）又はＰＥＩと他の補因子でさらに修飾し、樹脂のアルデヒド基とＰＥＩのアミノ基を介して各種の酵素を共有結合し、次に、二重機能性試薬であるグルタルアルデヒドで活性化させることによって、空間における樹脂分岐を増やし、網状構造を形成し、共有結合によって酵素をより容易に結合させることができ、空間上の制限が減少するため、酵素担持も改善される。固定化をより強固なものとするために、追加のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）として例えばグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを二次架橋用に添加してもよい。
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した後に、酸化したエポキシ樹脂をＰＥＩ（ポリエチレンイミン）又はＰＥＩと他の補因子でさらに修飾し、樹脂のアルデヒド基とＰＥＩのアミノ基を介して各種の酵素を共有結合し、次に、二重機能性試薬であるグルタルアルデヒドで活性化させることによって、空間における樹脂分岐を増やし、網状構造を形成し、共有結合によって酵素をより容易に結合させることができ、空間上の制限が減少するため、酵素担持も改善される。固定化をより強固なものとするために、追加のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）として例えばグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを二次架橋用に添加してもよい。
【0055】
酵素はイオン吸着を介してＰＥＩ変性酸化エポキシ樹脂に結合され、次に、架橋剤を加えて酵素、ＰＥＩ及び樹脂同士は架橋を行い、網状構造及び強い結合は形成されてもよい。
【0056】
二、イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
Ｈｉｓ標識酵素を金属変性エポキシ樹脂に固定化することが報告されており、まず、エポキシ樹脂とイミノ二酢酸を反応させて担体表面上の一部のエポキシ化物を転化し、次に、適切な金属イオン溶液で処理することにより樹脂に錯化した。次に、Ｈｉｓタグ付き酵素を添加し、Ｈｉｓタグと金属との間の選択的相互作用により迅速な錯化を可能とし、次に、タンパク質の表面上の求核性残基（Ｌｙｓ、Ｃｙｓ又はＳｅｒ）と担体上の未反応エポキシ残基とを反応させ、共有結合による連結を完了した。次に、ＥＤＴＡ溶液で洗浄して金属イオンを除去した。反応性エポキシ化物が残留されないように、最後に、グリシンをエンドキャッピング剤として担体を処理した。酵素は樹脂上に特異的に結合できるが、安定性が不十分であり、６サイクルした結果、残留活性は１０％未満である。金属とイミノ二酢酸変性樹脂との錯化の強度が不十分であり、酵素の漏洩が発生しやすい。
Ｈｉｓ標識酵素を金属変性エポキシ樹脂に固定化することが報告されており、まず、エポキシ樹脂とイミノ二酢酸を反応させて担体表面上の一部のエポキシ化物を転化し、次に、適切な金属イオン溶液で処理することにより樹脂に錯化した。次に、Ｈｉｓタグ付き酵素を添加し、Ｈｉｓタグと金属との間の選択的相互作用により迅速な錯化を可能とし、次に、タンパク質の表面上の求核性残基（Ｌｙｓ、Ｃｙｓ又はＳｅｒ）と担体上の未反応エポキシ残基とを反応させ、共有結合による連結を完了した。次に、ＥＤＴＡ溶液で洗浄して金属イオンを除去した。反応性エポキシ化物が残留されないように、最後に、グリシンをエンドキャッピング剤として担体を処理した。酵素は樹脂上に特異的に結合できるが、安定性が不十分であり、６サイクルした結果、残留活性は１０％未満である。金属とイミノ二酢酸変性樹脂との錯化の強度が不十分であり、酵素の漏洩が発生しやすい。
【0057】
本願では、イミノ二酢酸と金属によるエポキシ樹脂の変性を修正した。エポキシ樹脂とイミノ二酢酸が反応した後に、ＰＥＩを加えてイオン付着を通じて樹脂と結合させ、次に、適切な金属で処理した。その後、Ｈｉｓ標識酵素を加えて、次に、グルタルアルデヒドで架橋させて付着をより強固なものとした。ＰＥＩはイミノ二酢酸よりも強い金属を結合することができるし、グルタルアルデヒドと架橋することもでき、これにより、酵素の漏洩が大幅に減少する。
【0058】
該解決手段がＨｉｓタグ無し酵素に適用できるように、ＰＥＩ修飾後に金属を使用する代わりに、グルタルアルデヒドを加えて、グルタルアルデヒドをＰＥＩとともに共有結合を形成し、エポキシ樹脂の表面上にヒドロキシ基を残留し、次に、酵素を加えて共有結合連結により結合させた。
【0059】
この２種の方法では、酵素は、ＰＥＩとのイオン吸着及び金属イオンとの親和吸着の２種の方式で担体に結合されるように、グルタルアルデヒドを加える前に加えられてもよく、次に、架橋剤は添加され、酵素、ＰＥＩ及び樹脂は架橋を行い、網状構造や強結合が形成される。
【0060】
以下、実施例を参照して本発明の有益な効果をさらに説明する。
【0061】
以下の実施例に使用される酵素及びその由来は以下の表３～８に示される。
【0062】
【表3】
【0063】
【表4】
【0064】
【表5】
【0065】
【表6】
【0066】
【表7】
【0067】
【表8】
【0068】
実施例１
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されたエポキシ樹脂への酵素の固定化
エポキシ樹脂ＥＣＲ８２８５又はＬＸ１０００ＥＰ ５ｇを１Ｍ酢酸２０ｍＬにそれぞれ加え、室温で１２時間軽く撹拌し、蒸留水２０ｍＬを用いて酢酸で処理された担体を３回洗浄し、処理された担体を５０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム２０ｍｌに懸濁させ、室温で２時間軽く撹拌し、ろ過して蒸留水で洗浄した。
変性エポキシ樹脂５ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液で再懸濁させ、最終濃度が１％となるようにＰＥＩを加え、ｐＨを７．０に調整し、２時間軽く撹拌した後に、５０～１００ｍＭグルタルアルデヒドを加え、室温で１～２時間軽く撹拌した。次に、担体樹脂をろ過して水１０ｍｌで洗浄した。洗浄した担体を酵素溶液（５ｍｇ／ｍＬ補因子を含有する１０ｍｌ酵素であって、１００ｍＭリン酸塩緩衝液４０ｍＬに溶解させ、ｐＨ７．０とした。）に加えて、１０～２５℃で４時間撹拌し、一晩冷蔵庫に放置した。一晩静置後に、酵素をろ過して、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。必要に応じて、一晩静置後に、過量のグルタルアルデヒド（２０～５０ｍＭ）又はデキストランアルデヒド（１０～５０ｍＭ）を溶液に加え、１０～２５℃で１時間軽く撹拌し、次に、ろ過して０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されたエポキシ樹脂への酵素の固定化
エポキシ樹脂ＥＣＲ８２８５又はＬＸ１０００ＥＰ ５ｇを１Ｍ酢酸２０ｍＬにそれぞれ加え、室温で１２時間軽く撹拌し、蒸留水２０ｍＬを用いて酢酸で処理された担体を３回洗浄し、処理された担体を５０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム２０ｍｌに懸濁させ、室温で２時間軽く撹拌し、ろ過して蒸留水で洗浄した。
変性エポキシ樹脂５ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液で再懸濁させ、最終濃度が１％となるようにＰＥＩを加え、ｐＨを７．０に調整し、２時間軽く撹拌した後に、５０～１００ｍＭグルタルアルデヒドを加え、室温で１～２時間軽く撹拌した。次に、担体樹脂をろ過して水１０ｍｌで洗浄した。洗浄した担体を酵素溶液（５ｍｇ／ｍＬ補因子を含有する１０ｍｌ酵素であって、１００ｍＭリン酸塩緩衝液４０ｍＬに溶解させ、ｐＨ７．０とした。）に加えて、１０～２５℃で４時間撹拌し、一晩冷蔵庫に放置した。一晩静置後に、酵素をろ過して、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。必要に応じて、一晩静置後に、過量のグルタルアルデヒド（２０～５０ｍＭ）又はデキストランアルデヒド（１０～５０ｍＭ）を溶液に加え、１０～２５℃で１時間軽く撹拌し、次に、ろ過して０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。
【0069】
実施例２
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されたエポキシ樹脂への酵素の固定化
エポキシ樹脂ビーズ５ｇを１Ｍ酢酸５０ｍＬに加え、室温で１２時間軽く撹拌し、蒸留水５０ｍＬを用いて酢酸で処理された担体を３回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌し、処理した担体を過ヨウ素酸ナトリウム１００ｍｌに懸濁させ、室温で２時間軽く撹拌し、ろ過して蒸留水で洗浄した。
変性エポキシ樹脂５ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液で再懸濁させ、最終濃度が１％となるようにＰＥＩを加え、ｐＨを７．０に調整し、２時間軽く撹拌した。次に、担体をろ過して水１０ｍｌで洗浄した。洗浄した担体を酵素溶液（５ｍｇ／ｍＬ補因子を含有する１０ｍｌ酵素であって、１００ｍＭリン酸塩緩衝液４０ｍＬに溶解させ、ｐＨ７．０とした。）に加え、室温で４時間撹拌し、一晩冷蔵庫に放置した。一晩静置後に、２０～１００ｍＭグルタルアルデヒドを溶液に加え、１０～２５℃で１時間軽く撹拌した後に、ろ過して０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されたエポキシ樹脂への酵素の固定化
エポキシ樹脂ビーズ５ｇを１Ｍ酢酸５０ｍＬに加え、室温で１２時間軽く撹拌し、蒸留水５０ｍＬを用いて酢酸で処理された担体を３回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌し、処理した担体を過ヨウ素酸ナトリウム１００ｍｌに懸濁させ、室温で２時間軽く撹拌し、ろ過して蒸留水で洗浄した。
変性エポキシ樹脂５ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液で再懸濁させ、最終濃度が１％となるようにＰＥＩを加え、ｐＨを７．０に調整し、２時間軽く撹拌した。次に、担体をろ過して水１０ｍｌで洗浄した。洗浄した担体を酵素溶液（５ｍｇ／ｍＬ補因子を含有する１０ｍｌ酵素であって、１００ｍＭリン酸塩緩衝液４０ｍＬに溶解させ、ｐＨ７．０とした。）に加え、室温で４時間撹拌し、一晩冷蔵庫に放置した。一晩静置後に、２０～１００ｍＭグルタルアルデヒドを溶液に加え、１０～２５℃で１時間軽く撹拌した後に、ろ過して０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。
【0070】
実施例３
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体４ｇを担体修飾緩衝液（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、１Ｍイミノ二酢酸、ｐＨ８．５）８ｍＬに加え、室温で２時間振とうさせた。２時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、ＰＥＩ最終濃度が１％となるようにＰＥＩを加え、ｐＨを８．０～１１．０に調整し、３時間軽く撹拌した。担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、次に、リン酸緩衝液２０ｍＬで再懸濁させ、金属イオンの濃度が１０～３０ｍＭとなるように金属イオンを加えた。金属イオンはＣｏＣｌ２又はＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ又はＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ又はＦｅＣｌ２又はＦｅＣｌ２から選択される。
室温で２時間振とうさせた。樹脂をさらに再蒸留水でリンスし、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。さらに５０ｍＭグルタルアルデヒド含有緩衝液（０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ＝８．０）で再懸濁させ（酵素のそれぞれに従って補因子で前処理した。）、室温で１時間軽く撹拌した。ろ過して０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ＝７．０で３回洗浄した。
前処理した樹脂を０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ＝７．０ １６ｍＬで再懸濁させ、酵素溶液（５０～１００ｍｇ／ｍＬタンパク質含有量で、補因子３～１０ｍｇ／ｍＬであった。）を４～８ｍＬ加え、３０分間軽く撹拌し、一晩放置した後に、ろ過した。０．０５Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５で、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した。）２０ｍｌで２回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌した。その後、水２０ｍｌで３回洗浄し、次に、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体４ｇを担体修飾緩衝液（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、１Ｍイミノ二酢酸、ｐＨ８．５）８ｍＬに加え、室温で２時間振とうさせた。２時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、ＰＥＩ最終濃度が１％となるようにＰＥＩを加え、ｐＨを８．０～１１．０に調整し、３時間軽く撹拌した。担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、次に、リン酸緩衝液２０ｍＬで再懸濁させ、金属イオンの濃度が１０～３０ｍＭとなるように金属イオンを加えた。金属イオンはＣｏＣｌ２又はＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ又はＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ又はＦｅＣｌ２又はＦｅＣｌ２から選択される。
室温で２時間振とうさせた。樹脂をさらに再蒸留水でリンスし、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。さらに５０ｍＭグルタルアルデヒド含有緩衝液（０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ＝８．０）で再懸濁させ（酵素のそれぞれに従って補因子で前処理した。）、室温で１時間軽く撹拌した。ろ過して０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ＝７．０で３回洗浄した。
前処理した樹脂を０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ＝７．０ １６ｍＬで再懸濁させ、酵素溶液（５０～１００ｍｇ／ｍＬタンパク質含有量で、補因子３～１０ｍｇ／ｍＬであった。）を４～８ｍＬ加え、３０分間軽く撹拌し、一晩放置した後に、ろ過した。０．０５Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５で、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した。）２０ｍｌで２回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌した。その後、水２０ｍｌで３回洗浄し、次に、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0071】
実施例４
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体４ｇを担体修飾緩衝液（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、１Ｍイミノ二酢酸、ｐＨ８．５）８ｍＬに加え、室温で２時間振とうさせた。２時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、ＰＥＩ最終濃度が１％となるまでＰＥＩを加え、ｐＨを８．０～１１．０に調整し、３時間軽く撹拌した。
担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、次に、リン酸緩衝液２０ｍＬで再懸濁させ、金属イオンの濃度が１０～３０ｍＭとなるように、金属イオンを加えた。金属イオンはＣｏＣｌ２又はＮｉＣｌ２・６ Ｈ２Ｏ又はＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ又はＦｅＣｌ２又はＦｅＣｌ２から選択される。
室温で２時間振とうさせた。樹脂をさらに再蒸留水でリンスし、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。さらに緩衝液（０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ＝８．０）１６ｍＬで再懸濁させ、酵素溶液（５０～１００ｍｇ／ｍＬタンパク質含有量で、補因子３～１０ｍｇ／ｍＬであった。）４～８ｍＬを加え、３０分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。０．０５Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５で、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した。）２０ｍｌで２回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌した。次に、水２０ｍｌで３回洗浄し、次に、用０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体４ｇを担体修飾緩衝液（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、１Ｍイミノ二酢酸、ｐＨ８．５）８ｍＬに加え、室温で２時間振とうさせた。２時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、ＰＥＩ最終濃度が１％となるまでＰＥＩを加え、ｐＨを８．０～１１．０に調整し、３時間軽く撹拌した。
担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、次に、リン酸緩衝液２０ｍＬで再懸濁させ、金属イオンの濃度が１０～３０ｍＭとなるように、金属イオンを加えた。金属イオンはＣｏＣｌ２又はＮｉＣｌ２・６ Ｈ２Ｏ又はＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ又はＦｅＣｌ２又はＦｅＣｌ２から選択される。
室温で２時間振とうさせた。樹脂をさらに再蒸留水でリンスし、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。さらに緩衝液（０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ＝８．０）１６ｍＬで再懸濁させ、酵素溶液（５０～１００ｍｇ／ｍＬタンパク質含有量で、補因子３～１０ｍｇ／ｍＬであった。）４～８ｍＬを加え、３０分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。０．０５Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５で、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した。）２０ｍｌで２回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌した。次に、水２０ｍｌで３回洗浄し、次に、用０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0072】
実施例５
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体４ｇを担体修飾緩衝液（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、１Ｍイミノ二酢酸、ｐＨ８．５）８ｍＬに加え、室温で２時間振とうさせた。２時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、ＰＥＩ最終濃度が１％となるようにＰＥＩを加え、ｐＨを８．０～１１．０に調整し、再懸濁させて３時間軽く撹拌した。担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、次に、リン酸緩衝液２０ｍＬで再懸濁させ、金属イオンの濃度が１０～３０ｍＭとなるように、金属イオンを加えた。金属イオンは、ＣｏＣｌ２又はＮｉＣｌ２・６ Ｈ２Ｏ又はＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ又はＦｅＣｌ２又はＦｅＣｌ２から選択される。
担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、次に、ＰＢ緩衝液（０．１ Ｍ ｐＨ＝８．０）１６ｍＬに再懸濁させ、酵素溶液（５０～１００ｍｇ／ｍＬタンパク質含有量で、補因子３～１０ｍｇ／ｍＬであった。）４～８ｍＬを加え、３０分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。０．１ Ｍ ＰＢ（ｐＨ＝８．０）１６ｍＬ、５ｍｇ／ｍｌ補因子と５０ｍＭグルタルアルデヒドを加え、室温で軽く３０分間振とうさせた。０．０５Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５で、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した。）２０ｍｌで２回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌した。次に、水２０ｍｌで３回洗浄し、次に、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体４ｇを担体修飾緩衝液（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、１Ｍイミノ二酢酸、ｐＨ８．５）８ｍＬに加え、室温で２時間振とうさせた。２時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、ＰＥＩ最終濃度が１％となるようにＰＥＩを加え、ｐＨを８．０～１１．０に調整し、再懸濁させて３時間軽く撹拌した。担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、次に、リン酸緩衝液２０ｍＬで再懸濁させ、金属イオンの濃度が１０～３０ｍＭとなるように、金属イオンを加えた。金属イオンは、ＣｏＣｌ２又はＮｉＣｌ２・６ Ｈ２Ｏ又はＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ又はＦｅＣｌ２又はＦｅＣｌ２から選択される。
担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、次に、ＰＢ緩衝液（０．１ Ｍ ｐＨ＝８．０）１６ｍＬに再懸濁させ、酵素溶液（５０～１００ｍｇ／ｍＬタンパク質含有量で、補因子３～１０ｍｇ／ｍＬであった。）４～８ｍＬを加え、３０分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。０．１ Ｍ ＰＢ（ｐＨ＝８．０）１６ｍＬ、５ｍｇ／ｍｌ補因子と５０ｍＭグルタルアルデヒドを加え、室温で軽く３０分間振とうさせた。０．０５Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５で、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した。）２０ｍｌで２回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌した。次に、水２０ｍｌで３回洗浄し、次に、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0073】
実施例６
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体４ｇを担体修飾緩衝液（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、１Ｍイミノ二酢酸、ｐＨ８．５）８ｍＬに加え、室温で２時間振とうさせた。２時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、ＰＥＩ最終濃度が１％となるようにＰＥＩを加え、ｐＨを８．０～１１．０に調整し、３時間軽く撹拌した。担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、次に、リン酸緩衝液２０ｍＬで再懸濁させ、金属イオンの濃度が１０～３０ｍＭとなるように、金属イオンを加えた。金属イオンはＣｏＣｌ２又はＮｉＣｌ２・６ Ｈ２Ｏ又はＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ又はＦｅＣｌ２又はＦｅＣｌ２から選択される。
担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、前処理した担体をＰＢ緩衝液（０．１ Ｍ ｐＨ＝８．０）１６ｍＬに再懸濁させ、酵素溶液（５０～１００ｍｇ／ｍＬタンパク質含有量で、補因子３～１０ｍｇ／ｍＬであった。）４～８ｍＬを加え、３０分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。０．１ Ｍ ＰＢ（ｐＨ＝８．０）１６ｍＬ、５ｍｇ／ｍｌ補因子、及び５０ｍＭグルタルアルデヒドを加え、室温で３０分間軽く振とうさせた。０．０５Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５で、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した。）２０ｍｌで２回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌した。次に、水２０ｍｌで３回洗浄し、次に、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
又は、前処理した樹脂を０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ＝７．０ １６ｍＬで再懸濁させ、酵素溶液（５０～１００ｍｇ／ｍＬタンパク質含有量で、補因子３～１０ｍｇ／ｍＬであった。）４～８ｍＬを加え、３０分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。０．０５Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５で、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した。）２０ｍｌで２回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌した。次に、水２０ｍｌで３回洗浄し、次に、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体４ｇを担体修飾緩衝液（０．１Ｍホウ酸ナトリウム、１Ｍイミノ二酢酸、ｐＨ８．５）８ｍＬに加え、室温で２時間振とうさせた。２時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、ＰＥＩ最終濃度が１％となるようにＰＥＩを加え、ｐＨを８．０～１１．０に調整し、３時間軽く撹拌した。担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、次に、リン酸緩衝液２０ｍＬで再懸濁させ、金属イオンの濃度が１０～３０ｍＭとなるように、金属イオンを加えた。金属イオンはＣｏＣｌ２又はＮｉＣｌ２・６ Ｈ２Ｏ又はＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ又はＦｅＣｌ２又はＦｅＣｌ２から選択される。
担体をろ過して水３０ｍｌで３回洗浄し、前処理した担体をＰＢ緩衝液（０．１ Ｍ ｐＨ＝８．０）１６ｍＬに再懸濁させ、酵素溶液（５０～１００ｍｇ／ｍＬタンパク質含有量で、補因子３～１０ｍｇ／ｍＬであった。）４～８ｍＬを加え、３０分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。０．１ Ｍ ＰＢ（ｐＨ＝８．０）１６ｍＬ、５ｍｇ／ｍｌ補因子、及び５０ｍＭグルタルアルデヒドを加え、室温で３０分間軽く振とうさせた。０．０５Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５で、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した。）２０ｍｌで２回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌した。次に、水２０ｍｌで３回洗浄し、次に、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
又は、前処理した樹脂を０．１Ｍ ＰＢ ｐＨ＝７．０ １６ｍＬで再懸濁させ、酵素溶液（５０～１００ｍｇ／ｍＬタンパク質含有量で、補因子３～１０ｍｇ／ｍＬであった。）４～８ｍＬを加え、３０分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。０．０５Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５で、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した。）２０ｍｌで２回洗浄し、毎回１０分間軽く撹拌した。次に、水２０ｍｌで３回洗浄し、次に、０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0074】
実施例７
グルタルアルデヒドを、ＰＥＩ修飾グルタルアルデヒド、ＰＥＧ分子量を６０００Ｄａ、ＰＥＧとグルタルアルデヒドの質量比を１：１に変更した以外、実施例２と同様であった。
グルタルアルデヒドを、ＰＥＩ修飾グルタルアルデヒド、ＰＥＧ分子量を６０００Ｄａ、ＰＥＧとグルタルアルデヒドの質量比を１：１に変更した以外、実施例２と同様であった。
【0075】
実施例８
グルタルアルデヒドをアルデヒド化デキストランに変更した以外、実施例１と同様であった。
グルタルアルデヒドをアルデヒド化デキストランに変更した以外、実施例１と同様であった。
【0076】
実施例９
グルタルアルデヒドを、ＰＥＩ修飾グルタルアルデヒド、ＰＥＧ分子量を６０００Ｄａ、ＰＥＧとグルタルアルデヒドとの質量比を１：１に変更した以外、実施例５と同様であった。
グルタルアルデヒドを、ＰＥＩ修飾グルタルアルデヒド、ＰＥＧ分子量を６０００Ｄａ、ＰＥＧとグルタルアルデヒドとの質量比を１：１に変更した以外、実施例５と同様であった。
【0077】
実施例１０
固定化トランスアミナーゼの転化及び繰り返し使用の試験
１０ｍＬ反応フラスコに、０．３ｍＬＭｅＯＨを加えて、主原料１又は主原料２を０．１ｇ溶解し、イソプロピルアミン塩酸塩４ｅｑとＰＬＰ（ピリドキサールリン酸）１．０ｍｇを加え、０．１Ｍ ＰＢ ７．０を反応液の最終体積が１ｍＬとなるように補充し、さらに酵素粉５ｍｇ又は酵素粉２０ｍｇを用いて製造された架橋酵素凝集体としての湿酵素又は架橋酵素凝集体としての凍結乾燥粉末を加え、３０℃で１６～２０ｈ撹拌した。系についてＨＰＬＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表９に示す。
固定化トランスアミナーゼの転化及び繰り返し使用の試験
【化2】
【0078】
【表9】
ＩＤＡ＊－エポキシ担体をＩＤＡ及び金属イオンで修飾した後、親和吸着により酵素を結合させる。
ＩＤＡ１－エポキシ担体をＩＤＡで修飾した後、さらにＰＥＩ及び金属イオンで修飾し、酵素を加える前に架橋剤で修飾する。
ＩＤＡ２－エポキシ担体をＩＤＡで修飾した後、さらにＰＥＩ及び金属イオンで修飾し、酵素を結合させてから架橋剤で架橋させる。
ＩＤＡ３－エポキシ担体をＩＤＡで修飾した後、さらにＰＥＩ及び金属イオンで修飾し、酵素を加える前にＰＥＧ処理架橋剤で修飾する。
ＩＤＡ４－エポキシ担体をＩＤＡで修飾した後、さらにＰＥＩ及び金属イオンで修飾し、酵素を結合させた後、ＰＥＧ処理架橋剤でさらに架橋させる。
ＳＰ１－エポキシ担体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、さらにＰＥＩで修飾し、酵素を加える前に架橋剤で修飾する。
ＳＰ２－エポキシ担体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、ＰＥＩで修飾し、次に、グルタルアルデヒドで修飾し、酵素を加えた後、架橋剤で架橋させる。
ＳＰ３－エポキシ担体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、ＰＥＩで修飾し、酵素を加えた後、さらに架橋剤で架橋させる。
ＳＰ４－エポキシ担体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した後、さらにＰＥＩ及び金属イオンで修飾し、酵素を結合させた後、ＰＥＧ処理架橋剤で架橋させる。
【0079】
実施例１１
固定化ケトレダクターゼの転化及び繰り返し使用の試験
１０ｍＬ反応フラスコに、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）０．５ｍＬを加えて、主原料３又は４を０．１ｇ溶解し、０．１Ｍ ＰＢ ７．０ ０．５ｍＬ及びＮＡＤ＋ １～１０ｍｇを加え、さらに酵素粉５ｍｇ又は酵素粉１０ｍｇを用いて製造された固定化酵素を加え、３０℃で１６～２０ｈ撹拌した。系についてＧＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１０に示す。
固定化ケトレダクターゼの転化及び繰り返し使用の試験
【化3】
【0080】
【表10】
【0081】
実施例１２
固定化ＣＨＭＯｓの転化及び繰り返し使用の試験
ＣＨＭＯエポキシ担体固定化酵素の活性は以下の基質５を用いて反応を行うことによって検出される。
イソプロピルアルコール０．３ｍＬを反応フラスコ１０ｍｌに容れた後、基質５ １００ｍｇ、ＮＡＤＰ＋を５ｍｇ含有する０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ８．０）３ｍＬを加え、次に、アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ－Ｔｂ遊離酵素２ｍｇ及びシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遊離酵素を用いて５０ｍｇの遊離酵素で製造された固定化酵素２０ｍｇを加えた。３０℃で１６～２０時間反応させ、転化率をテストし、１回の反応が終了するごとに、固定化酵素を分離して、次の反応に再利用し、繰り返し使用回数を調べた。系についてＧＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１１に示す。
固定化ＣＨＭＯｓの転化及び繰り返し使用の試験
ＣＨＭＯエポキシ担体固定化酵素の活性は以下の基質５を用いて反応を行うことによって検出される。
【化4】
【0082】
【表11】
【0083】
実施例１３
固定化ＥＲＥＤの転化及び繰り返し使用の試験
ＥＲＥＤエポキシ担体固定化酵素の活性は以下の基質６を用いて反応を行うことによって検出される。
０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ７．０～８．０）３ｍＬを反応フラスコ１０ｍｌに容れた後、基質６を１００ｍｇ加え、次に、ＮＡＤ（Ｐ）＋ １０ｍｇ、ギ酸アンモニウム８０ｍｇ、ＦＤＨ ２ｍｇ及びＥＲＥＤ遊離酵素１０ｍｇ又は遊離酵素３０ｍｇで製造された固定化酵素を加えた。３０℃で１６～２０時間反応させ、転化率をテストし、１回の反応が終了するごとに、固定化酵素を分離して、次の反応に再利用し、繰り返し使用回数を調べた。系についてＧＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１２に示す。
固定化ＥＲＥＤの転化及び繰り返し使用の試験
ＥＲＥＤエポキシ担体固定化酵素の活性は以下の基質６を用いて反応を行うことによって検出される。
【化5】
【0084】
【表12】
【0085】
実施例１４
固定化ＮＩＴｓの転化及び繰り返し使用の試験
ＮＩＴアミノ担体固定化酵素の活性は以下の基質７を用いて反応を行うことによって検出される。
０．１ Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０～８．０）２ｍＬを１０ｍＬ反応フラスコに加え、上記基質９を１００ｍｇ加え、次に、ＮＩＴ遊離酵素２０ｍｇを含有する又は遊離酵素３０ｍｇを用いて製造された固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応が終了するごとに、固定化酵素を分離して、次の反応に再利用し、繰り返し使用回数を調べた。系についてＧＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１３に示す。
固定化ＮＩＴｓの転化及び繰り返し使用の試験
ＮＩＴアミノ担体固定化酵素の活性は以下の基質７を用いて反応を行うことによって検出される。
【化6】
【0086】
【表13】
【0087】
実施例１５
固定化ＩＲＥＤの転化及び繰り返し使用の試験
以下の基質８を用いて検出を行った。
０．１ Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０～８．０）２ｍＬを１０ｍＬ反応フラスコに加え、次に、基質８ １００ｍｇ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、ギ酸アンモニウム６０ｍｇ、ＦＤＨ １０ｍｇ及びＩＲＥＤ遊離酵素１０ｍｇ又は遊離酵素３０ｍｇを用いて製造された固定化化酵素を加えた。３０℃で２０時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応が終了するごとに、固定化酵素を分離して、次の反応に再利用し、繰り返し使用回数を調べた。
系についてＨＰＬＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１４に示す。
固定化ＩＲＥＤの転化及び繰り返し使用の試験
以下の基質８を用いて検出を行った。
０．１ Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０～８．０）２ｍＬを１０ｍＬ反応フラスコに加え、次に、基質８ １００ｍｇ、ＮＡＤ＋１０ｍｇ、ギ酸アンモニウム６０ｍｇ、ＦＤＨ １０ｍｇ及びＩＲＥＤ遊離酵素１０ｍｇ又は遊離酵素３０ｍｇを用いて製造された固定化化酵素を加えた。３０℃で２０時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応が終了するごとに、固定化酵素を分離して、次の反応に再利用し、繰り返し使用回数を調べた。
【化7】
【0088】
【表14】
【0089】
実施例１６
固定化ＰＡＬの転化及び繰り返し使用の試験
固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数は以下の基質９を用いて反応を行うことによって検出される。
４Ｍアミノ基ギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ９．０～９．５）８ｍＬを１０ｍＬ反応フラスコに加え、上記基質９を１００ｍｇ加え、次に、アンモニアリアーゼ遊離酵素１０ｍｇ又は遊離酵素４０ｍｇを加えた。３０℃で１６～２０時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応が終了するごとに、固定化酵素を分離して、次の反応に再利用し、繰り返し使用回数を調べた。
系についてＨＰＬＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１５に示す。
固定化ＰＡＬの転化及び繰り返し使用の試験
固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数は以下の基質９を用いて反応を行うことによって検出される。
【化8】
系についてＨＰＬＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１５に示す。
【0090】
【表15】
【0091】
実施例１７
固定化ＡＡＤＨの転化及び繰り返し使用の試験
１０ｍＬ反応フラスコに、０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０～９．０）５ｍＬを加え、主原料１０、主原料１１又は主原料１２を１００ｍｇ溶解し、塩化アンモニウム１０８ｍｇを加えて、ｐＨをｐＨ７．５～８．０に調整し、次に、ＮＡＤ＋１０～５０ｍｇ、グルコース１５０ｍｇ及びＧＤＨ ５ｍｇ、ＡＡＤＨ １０ｍｇ又は遊離酵素３０ｍｇを用いて製造された固定化ＡＡＤＨを加えた。３０℃で１６～２０ｈ撹拌した。
系についてＨＰＬＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１６に示す。
固定化ＡＡＤＨの転化及び繰り返し使用の試験
【化9】
系についてＨＰＬＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１６に示す。
【0092】
【表16】
【0093】
実施例１８
固定化ＦＤＨの転化及び繰り返し使用の試験
１０ｍＬ反応フラスコに、０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０～９．０）５ｍＬを加え、主原料１２を１００ｍｇ溶解し、塩化アンモニウム１０８ｍｇ、アンモニウム塩８０ｍｇを加え、ｐＨをｐＨ７．５～８．０に調整し、次に、ＮＡＤ＋１０～５０ｍｇ、ＡＡＤＨ－Ｂｃ遊離酵素１００ｍｇ及びＦＤＨ ５ｍｇ、又は遊離酵素１０ｍｇを用いて製造された固定化ＦＤＨを加えた。３０℃で１６～２０ｈ撹拌した。系についてＨＰＬＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１７に示す。
固定化ＦＤＨの転化及び繰り返し使用の試験
１０ｍＬ反応フラスコに、０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０～９．０）５ｍＬを加え、主原料１２を１００ｍｇ溶解し、塩化アンモニウム１０８ｍｇ、アンモニウム塩８０ｍｇを加え、ｐＨをｐＨ７．５～８．０に調整し、次に、ＮＡＤ＋１０～５０ｍｇ、ＡＡＤＨ－Ｂｃ遊離酵素１００ｍｇ及びＦＤＨ ５ｍｇ、又は遊離酵素１０ｍｇを用いて製造された固定化ＦＤＨを加えた。３０℃で１６～２０ｈ撹拌した。系についてＨＰＬＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表１７に示す。
【0094】
【表17】
【0095】
実施例１９
充填層を用いた連続反応におけるトランスアミナーゼアミノ担体固定化酵素の使用
実施例においてトランスアミナーゼＴＡ－Ｃｖ－Ｖ１をＩＤＡ１の方式で担体ＥＣＲ８２８５に固定化し、得た固定化酵素をカラム体積の１２０ｍＬのカラム状反応器に充填し、固定化酵素の使用量を７２ｇとした。
基質１ ５００ｇを、エタノール１．５Ｌで溶解したものに、イソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩水溶液１．８Ｌ）４ｅｑ及びＰＬＰ ５ｇを加え、ＰＢ緩衝液（０．１ Ｍ、ｐＨ８．０）を加えず、５Ｌに定容した。
流速を０．６ｍＬ／ｍｉｎ、即ち、保留時間を２００ｍｉｎに設定して、連続反応を行い、出口からの流出液について転化率を検出したところ、転化率＞９８％であり、さらに２６０ｈ運転していても、転化率には低下が認められず、２８０ｈ運転したところ、転化率は９０％に低下した。具体的には、表１８に示す。
充填層を用いた連続反応におけるトランスアミナーゼアミノ担体固定化酵素の使用
実施例においてトランスアミナーゼＴＡ－Ｃｖ－Ｖ１をＩＤＡ１の方式で担体ＥＣＲ８２８５に固定化し、得た固定化酵素をカラム体積の１２０ｍＬのカラム状反応器に充填し、固定化酵素の使用量を７２ｇとした。
基質１ ５００ｇを、エタノール１．５Ｌで溶解したものに、イソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩水溶液１．８Ｌ）４ｅｑ及びＰＬＰ ５ｇを加え、ＰＢ緩衝液（０．１ Ｍ、ｐＨ８．０）を加えず、５Ｌに定容した。
流速を０．６ｍＬ／ｍｉｎ、即ち、保留時間を２００ｍｉｎに設定して、連続反応を行い、出口からの流出液について転化率を検出したところ、転化率＞９８％であり、さらに２６０ｈ運転していても、転化率には低下が認められず、２８０ｈ運転したところ、転化率は９０％に低下した。具体的には、表１８に示す。
【0096】
【表18】
【0097】
実施例２０
連続撹拌槽を用いた反応におけるトランスアミナーゼ固定化酵素の使用
実施例１と同様な固定化酵素ＴＡ－Ａｃ－Ｖ１を用いて、担体ＬＸ１０００ＨＦＡにＳＰ２の方式で固定化した。２００ｍＬ反応器にトランスアミナーゼＴＡ－Ａｃ－Ｖ１固定化酵素を５０ｇ加え、リン酸緩衝液１５０ｍＬを加えた。
基質１ ５００ｇに、ＰＢ（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）３．２Ｌ、イソプロピルアミン塩酸塩水溶液（６Ｍ）１．８Ｌ、及びＰＬＰ ５ｇを加え、スラリー化して懸濁液とした。
０．４ｍＬ／ｍｉｎの速度で反応フラスコに基質懸濁液（即ち保留時間５００ｍｉｎである。）を連続的に添加し、それと同時に、同じ流速で出口から反応系を抽出した（管路の末端にろ過ヘッドを追加し、固定化酵素の抽出を防止する）。このような条件では、転化率は９０％以上に達し、かつ２０００ｈ連続して運転していても、転化率にはほぼ低下が認められなかった。結果を表１９に示す。
連続撹拌槽を用いた反応におけるトランスアミナーゼ固定化酵素の使用
実施例１と同様な固定化酵素ＴＡ－Ａｃ－Ｖ１を用いて、担体ＬＸ１０００ＨＦＡにＳＰ２の方式で固定化した。２００ｍＬ反応器にトランスアミナーゼＴＡ－Ａｃ－Ｖ１固定化酵素を５０ｇ加え、リン酸緩衝液１５０ｍＬを加えた。
基質１ ５００ｇに、ＰＢ（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）３．２Ｌ、イソプロピルアミン塩酸塩水溶液（６Ｍ）１．８Ｌ、及びＰＬＰ ５ｇを加え、スラリー化して懸濁液とした。
０．４ｍＬ／ｍｉｎの速度で反応フラスコに基質懸濁液（即ち保留時間５００ｍｉｎである。）を連続的に添加し、それと同時に、同じ流速で出口から反応系を抽出した（管路の末端にろ過ヘッドを追加し、固定化酵素の抽出を防止する）。このような条件では、転化率は９０％以上に達し、かつ２０００ｈ連続して運転していても、転化率にはほぼ低下が認められなかった。結果を表１９に示す。
【0098】
【表19】
【0099】
実施例２１
アンモニアリアーゼＰＡＬ－Ｓｓ固定化酵素を、担体ＨＦＡ００１にＩＤＡ４の方式で固定化した。得た固定化酵素６ｇを１０ｍＬカラム状反応器に充填した。
基質９ ５００ｇを、アミノ基ギ酸アンモニウム水溶液（４Ｍ、ｐＨ９．０～９．５）４．５Ｌで溶解した。
流速を０．０３ｍＬ／ｍｉｎ、即ち、保留時間を３３０ｍｉｎに設定し、連続反応を行い、出口からの流出液について転化率を検出したところ、転化率は８０％であり、３００ｈ持続して運転していても、転化率には低下が認められず、３１０ｈ運転したところ、転化率は７０％に低下した。表２０に示す。
アンモニアリアーゼＰＡＬ－Ｓｓ固定化酵素を、担体ＨＦＡ００１にＩＤＡ４の方式で固定化した。得た固定化酵素６ｇを１０ｍＬカラム状反応器に充填した。
基質９ ５００ｇを、アミノ基ギ酸アンモニウム水溶液（４Ｍ、ｐＨ９．０～９．５）４．５Ｌで溶解した。
流速を０．０３ｍＬ／ｍｉｎ、即ち、保留時間を３３０ｍｉｎに設定し、連続反応を行い、出口からの流出液について転化率を検出したところ、転化率は８０％であり、３００ｈ持続して運転していても、転化率には低下が認められず、３１０ｈ運転したところ、転化率は７０％に低下した。表２０に示す。
【0100】
【表20】
【0101】
実施例２２
実施例で製造されたケトレダクターゼＫＲＥＤ－Ａｃ－Ｖ１固定化酵素を、担体ＬＸ１０００ＥＰにＩＤＡ４の方式で固定化した。得た固定化酵素６ｇを１０ｍＬカラム状反応器に充填した。
基質３ １００ｇを、イソプロピルアルコール０．３Ｌで溶解し、ＰＢ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）０．７Ｌを加えて溶解し、次に、ＮＡＤ＋０．１ｇを加えた。
流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎ、即ち、保留時間を２００ｍｉｎに設定して、連続反応を行い、出口からの流出液について転化率を検出したところ、転化率＞９０％であり、２００ｈ持続して運転していても、転化率には低下が認められず、２１０ｈ運転したところ、転化率は８０％に低下した。表２１に示す。
実施例で製造されたケトレダクターゼＫＲＥＤ－Ａｃ－Ｖ１固定化酵素を、担体ＬＸ１０００ＥＰにＩＤＡ４の方式で固定化した。得た固定化酵素６ｇを１０ｍＬカラム状反応器に充填した。
基質３ １００ｇを、イソプロピルアルコール０．３Ｌで溶解し、ＰＢ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）０．７Ｌを加えて溶解し、次に、ＮＡＤ＋０．１ｇを加えた。
流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎ、即ち、保留時間を２００ｍｉｎに設定して、連続反応を行い、出口からの流出液について転化率を検出したところ、転化率＞９０％であり、２００ｈ持続して運転していても、転化率には低下が認められず、２１０ｈ運転したところ、転化率は８０％に低下した。表２１に示す。
【0102】
【表21】
【0103】
実施例２３
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されたエポキシ樹脂の固定化の各パラメータの調査
酢酸の濃度及び使用量、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度及び使用量、並びに架橋剤の濃度の調査
実施例４の方法によって、ＦＤＨをＬＸ１０００ＨＦＡ担体に固定化し、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）の濃度を０．２～３ｍｏｌ／Ｌ、ＩＤＡ溶液と担体との体積／質量比を２～２５：１、金属イオンの濃度を５～１００ｍｍｏｌ／Ｌに設定して、架橋剤であるデキストランアルデヒド（ＤＡ）の範囲を調べた。その中でも、ＩＤＡ濃度は、１～２ｍｏｌ／Ｌである場合に最も好ましく、担体との体積／質量比は、１０～２０：１である場合に最も好ましく、金属イオンの濃度は、１０～１００ｍｍｏｌ／Ｌである場合に、活性はいずれも良好であり、コストを考慮して、１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度としてもよく、架橋剤ＤＡは、０．５％～２％である場合に最も好ましい。具体的なパラメータ及び結果を表２２に示す。
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されたエポキシ樹脂の固定化の各パラメータの調査
酢酸の濃度及び使用量、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度及び使用量、並びに架橋剤の濃度の調査
実施例４の方法によって、ＦＤＨをＬＸ１０００ＨＦＡ担体に固定化し、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）の濃度を０．２～３ｍｏｌ／Ｌ、ＩＤＡ溶液と担体との体積／質量比を２～２５：１、金属イオンの濃度を５～１００ｍｍｏｌ／Ｌに設定して、架橋剤であるデキストランアルデヒド（ＤＡ）の範囲を調べた。その中でも、ＩＤＡ濃度は、１～２ｍｏｌ／Ｌである場合に最も好ましく、担体との体積／質量比は、１０～２０：１である場合に最も好ましく、金属イオンの濃度は、１０～１００ｍｍｏｌ／Ｌである場合に、活性はいずれも良好であり、コストを考慮して、１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度としてもよく、架橋剤ＤＡは、０．５％～２％である場合に最も好ましい。具体的なパラメータ及び結果を表２２に示す。
【0104】
【表22】
【0105】
酢酸濃度、酢酸溶液と担体との体積／質量比、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度、過ヨウ素酸ナトリウム溶液と担体との体積／質量比、並びに架橋剤ＧＡの濃度を調べた。
実施例３の方法によって、ＦＤＨを担体ＨＦＡに固定化し、酢酸濃度、酢酸溶液と担体との体積／質量比、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度、過ヨウ素酸ナトリウム溶液と担体との体積／質量比、並びに架橋剤ＧＡの濃度をさまざまに設定した。その結果、酢酸濃度は１～２ｍｏｌ／Ｌが最も好ましく、酢酸溶液と担体との体積／質量比は１０～１５：１が最も好ましく、過ヨウ素酸ナトリウム濃度は、０．１～０．２ｍｏｌ／Ｌが最も好ましく、過ヨウ素酸ナトリウムと担体との体積質量比は、５～２５では、最も効果に優れており、コストダウンを考慮して、５～１５：１が好ましく、架橋剤濃度は、０．５％～２％では、好ましい。具体的なパラメータ及び結果を表２３に示す。
実施例３の方法によって、ＦＤＨを担体ＨＦＡに固定化し、酢酸濃度、酢酸溶液と担体との体積／質量比、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度、過ヨウ素酸ナトリウム溶液と担体との体積／質量比、並びに架橋剤ＧＡの濃度をさまざまに設定した。その結果、酢酸濃度は１～２ｍｏｌ／Ｌが最も好ましく、酢酸溶液と担体との体積／質量比は１０～１５：１が最も好ましく、過ヨウ素酸ナトリウム濃度は、０．１～０．２ｍｏｌ／Ｌが最も好ましく、過ヨウ素酸ナトリウムと担体との体積質量比は、５～２５では、最も効果に優れており、コストダウンを考慮して、５～１５：１が好ましく、架橋剤濃度は、０．５％～２％では、好ましい。具体的なパラメータ及び結果を表２３に示す。
【0106】
【表23】
【0107】
ＰＥＩの使用量の調査
実施例２（ＩＤＡ４）及び実施例５（ＳＰ３）の方法によって、ＦＤＨを担体ＥＣＲ８２８５に固定化し、分子量の様々なＰＥＩを選択し、ＰＥＩ濃度をさまざまに設定し、ＰＥＩの適切な使用量を調べ、さまざまなｐＨ値による固定化酵素への影響を調べた。その結果、ＰＥＩ分子量が３ＫＤａ～７０ＫＤａである場合、類似した効果が認められ、ＰＥＩの最適な濃度の範囲は１％～２％であり、ｐＨ６．０～１０．０では、固定化酵素の活性への影響が少なく、ｐＨ７～９では、安定性は最も良好である。具体的なパラメータ及び結果を表２４に示す。
実施例２（ＩＤＡ４）及び実施例５（ＳＰ３）の方法によって、ＦＤＨを担体ＥＣＲ８２８５に固定化し、分子量の様々なＰＥＩを選択し、ＰＥＩ濃度をさまざまに設定し、ＰＥＩの適切な使用量を調べ、さまざまなｐＨ値による固定化酵素への影響を調べた。その結果、ＰＥＩ分子量が３ＫＤａ～７０ＫＤａである場合、類似した効果が認められ、ＰＥＩの最適な濃度の範囲は１％～２％であり、ｐＨ６．０～１０．０では、固定化酵素の活性への影響が少なく、ｐＨ７～９では、安定性は最も良好である。具体的なパラメータ及び結果を表２４に示す。
【0108】
【表24】
【0109】
ＰＥＧ修飾架橋剤の割合の調査
実施例７（ＳＰ４）及び実施例９（ＩＤＡ４）の方法によって、ＦＤＨを担体ＥＣＲ８２８５に固定化し、ＰＥＧでグルタルアルデヒドを修飾する方法におけるＰＥＧの範囲、及びＰＥＧとＧＡの比を調べた。その結果、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ６０００はいずれもグルタルアルデヒドを修飾することができ、ＰＥＧとＧＡとの比が１：１～１０：１の範囲である場合、酵素の繰り返し使用性は良好であり、２：１～４：１では、最も好ましい。具体的なパラメータ及び結果を表２５に示す。
実施例７（ＳＰ４）及び実施例９（ＩＤＡ４）の方法によって、ＦＤＨを担体ＥＣＲ８２８５に固定化し、ＰＥＧでグルタルアルデヒドを修飾する方法におけるＰＥＧの範囲、及びＰＥＧとＧＡの比を調べた。その結果、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ６０００はいずれもグルタルアルデヒドを修飾することができ、ＰＥＧとＧＡとの比が１：１～１０：１の範囲である場合、酵素の繰り返し使用性は良好であり、２：１～４：１では、最も好ましい。具体的なパラメータ及び結果を表２５に示す。
【0110】
【表25】
【0111】
以上は本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するものではなく、当業者にとっては、本発明にさまざまな変更や変化を加えることが明らかである。本発明の主旨及び原則を逸脱することなく行われる修正、同等置換や改良などであれば、本発明の特許範囲に含まれるものとする。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-07-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
変性エポキシ樹脂固定化酵素の製造方法であって、エポキシ樹脂を変性し、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行い、次に、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化し、前記変性エポキシ樹脂固定化酵素を得るステップを含む、ことを特徴とする変性エポキシ樹脂固定化酵素の製造方法。
【請求項2】
前記エポキシ樹脂を変性することは、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化すること、又はイミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させることを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記エポキシ樹脂を変性することが、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化することである場合に、過ヨウ素酸ナトリウムを加えるに先立って、先ず酢酸で前記エポキシ樹脂を処理し、そして、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化した後に、架橋剤としてグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを添加して二次架橋を行うステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項4】
前記エポキシ樹脂を変性することが、イミノ二酢酸をエポキシ樹脂と反応させることである場合に、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行った後に、金属イオン溶液を加えて処理するステップをさらに含み、かつ、前記固定化対象酵素はｈｉｓタグを有し、好ましくは、前記金属イオン溶液は塩化コバルト、硫酸コバルト、塩化ニッケル、硫酸銅、塩化第一鉄、硫酸第一鉄から選択される１種又は複数種であり、
好ましくは、前記金属イオン溶液の濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌで、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ～５０ｍｍｏｌ／Ｌである、ことを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項5】
前記固定化対象酵素及びグルタルアルデヒドの添加順番は、前記固定化対象酵素、グルタルアルデヒド、又はグルタルアルデヒド、前記固定化対象酵素の順である、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項6】
変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行うステップは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋又はＰＬＰである補因子を添加することをさらに含み、好ましくは、前記ポリエチレンイミンはポリエチレンイミン水溶液の形態で反応に参加し、前記ポリエチレンイミン水溶液中の前記補因子の最終濃度が１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬで、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ～６ｍｇ／ｍＬであり、
好ましくは、前記架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドは、使用する前にＰＥＧで架橋剤を修飾するステップを受け、前記架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを前記ＰＥＧで修飾するステップは、架橋剤を水で溶解し、次にＰＥＧを加えて２０℃～３０℃で１ｈ～６ｈ撹拌することを含み、ＰＥＧは、ＰＥＧ４００～ＰＥＧ２０００から選択され、ＰＥＧと架橋剤との質量比が１：１～１０：１で、さらに好ましくは２：１～４：１である、ことを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項7】
前記酢酸によるエポキシ樹脂処理において、使用される酢酸は、酢酸濃度が０．５Ｍ～３Ｍで、好ましくは１Ｍ～２Ｍの酢酸溶液であり、前記酢酸溶液と前記エポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは１０～１５：１であり、好ましくは、前記過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化する際に使用される過ヨウ素酸ナトリウム溶液において、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度は５０ｍＭ～５００ｍＭで、好ましくは１００ｍＭ～２００ｍＭであり、前記過ヨウ素酸ナトリウム溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは５～１５：１であり、
好ましくは、前記ポリエチレンイミンの分子量は３ＫＤａ～７０ＫＤａであり、前記ポリエチレンイミン水溶液の濃度は０．５％～３％で、好ましくは１％～２％であり、前記ポリエチレンイミン水溶液のｐＨは６～１１で、さらに好ましくは７～１０であり、
好ましくは、架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドの体積／質量最終濃度は０．１％～３％で、好ましくは０．３％～２％であり、
好ましくは、酵素と前記変性エポキシ樹脂との質量比は０．０５～０．３：１であり、
好ましくは、前記イミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させる際に、イミノ二酢酸としては濃度０．５Ｍ～３Ｍで、好ましくは１Ｍ～２Ｍのイミノ二酢酸水溶液が使用され、前記イミノ二酢酸水溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は５～２０：１で、好ましくは１０～１５：１であり、前記イミノ二酢酸水溶液のｐＨは６．０～１０．０で、好ましくは７．０～９．０である、ことを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項8】
前記酢酸と前記エポキシ樹脂を混合した後の処理時間は６ｈ～２４ｈで、好ましくは１０ｈ～１５ｈであり、好ましくは、前記過ヨウ素酸ナトリウム溶液と前記エポキシ樹脂を混合した後の反応時間は１ｈ～６ｈ、好ましくは２～３ｈであり、
好ましくは、前記ポリエチレンイミン水溶液と前記エポキシ樹脂を混合した後の反応時間は１ｈ～２０ｈで、好ましくは３ｈ～６ｈであり、
好ましくは、前記酵素と前記変性エポキシ樹脂を混合した後の反応時間は２ｈ～２４ｈで、好ましくは１５ｈ～２０ｈであり、
好ましくは、架橋剤を加えた後の反応時間は１０ｍｉｎ～１２０ｍｉｎで、好ましくは２０ｍｉｎ～６０ｍｉｎであり、
好ましくは、前記イミノ二酢酸水溶液と前記エポキシ樹脂を混合した後の作用時間は０．５ｈ～６ｈで、好ましくは１～２ｈであり、
好ましくは、前記ポリエチレンイミン水溶液と担体を混合した後の作用時間は１ｈ～２０ｈで、さらに３ｈ～６ｈであり、
金属イオンを加えた後の作用時間は１ｈ～６ｈで、さらに１ｈ～３ｈであり、
酵素液と担体を混合した後の作用時間は４ｈ～４８ｈで、さらに１５ｈ～２０ｈである、ことを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項9】
前記エポキシ樹脂は、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ(R)ＬｉｆｅｔｅｃｈTMＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８２０４、ＥＣＲ８２０９、ＳＥＰＬＩＴＥ(R)ＬＸ１０００ＥＡ、ＬＸ１０００ＥＰ、ＬＸ１０３Ｂ、ＥＰ２００、ＬＸ１０００ＨＦＡ、ＨＦＡ００１、ＬＸ１０７Ｓ、ＬＸ１０００ＳＷ、ＬＸ１０００ＳＤ、ＨＥＣＨＥＮＧ(R)ＥＳ１、ＥＳ１０３、ＥＳ１０５、ＥＳ１０８、及びＥＳ１０９からなる群から選択される１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項10】
前記固定化対象酵素は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１由来のトランスアミナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来のトランスアミナーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＪＳ１７由来のトランスアミナーゼ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｉｔｒｅｕｓ由来のトランスアミナーゼ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１由来のケトレダクターゼ、Ｃａｎｄｉｄａｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ ＡＫＵ４５８８由来のケトレダクターゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ． Ｐｈｉｌ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ ｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ－ＳＤ１由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のアンモニアリアーゼ、Ｓｏｌｅｎｏｓｔｅｍｏｎｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｏｉｄｅｓ由来のアンモニアリアーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のエンレダクターゼ、ＣｈｒｙＳＥＱｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ． ＣＡ４９由来のエンレダクターゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のイミンレダクターゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のロイシンデヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ ＣＢＳ ５１３．８８由来のニトリラーゼ、及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のニトリラーゼからなる群から選択される１種又は複数種であり、好ましくは、前記Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１由来のトランスアミナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列又はＳＥＱ ＩＤＮＯ：３を有する突然変異体であり、前記Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｉｔｒｅｕｓ由来のトランスアミナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５配列又はＳＥＱ ＩＤＮＯ：６配列を有する突然変異体であり、前記Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ． ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１由来のケトレダクターゼはＳＥＱＩＤＮＯ：８配列又はＳＥＱＩＤＮＯ：９配列を有する突然変異体であり、前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ． Ｐｈｉｌ由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１配列又はＳＥＱ ＩＤＮＯ：１２配列を有する突然変異体であり、前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ－ＳＤ１由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼはＳＥＱＩＤ ＮＯ：１４配列又はＳＥＱ ＩＤＮＯ：１５配列を有する突然変異体である、ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される、ことを特徴とする変性エポキシ樹脂固定化酵素。
【請求項12】
水性緩衝液反応系又は有機溶媒反応系における請求項１１に記載の変性エポキシ樹脂固定化酵素の使用。
【請求項13】
前記水性緩衝液反応系又は有機溶媒反応系は、充填層反応器又は連続撹拌槽反応器にて反応を行う、ことを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【国際調査報告】