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特表2023-511004ヒト多能性幹細胞由来の３Ｄオルガノイドを使用して大量のミクログリアを確保する、ミクログリアの分化のための方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-16

(54)【発明の名称】ヒト多能性幹細胞由来の３Ｄオルガノイドを使用して大量のミクログリアを確保する、ミクログリアの分化のための方法

(51)【国際特許分類】

C12N 5/079 20100101AFI20230309BHJP

C12Q 1/04 20060101ALI20230309BHJP

A61P 25/28 20060101ALI20230309BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20230309BHJP

A61P 25/16 20060101ALI20230309BHJP

A61P 25/14 20060101ALI20230309BHJP

A61P 21/02 20060101ALI20230309BHJP

A61P 21/04 20060101ALI20230309BHJP

A61P 25/02 20060101ALI20230309BHJP

A61P 39/02 20060101ALI20230309BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20230309BHJP

A61K 38/19 20060101ALI20230309BHJP

C07K 14/50 20060101ALN20230309BHJP

C07K 14/54 20060101ALN20230309BHJP

C07K 14/53 20060101ALN20230309BHJP

C07K 14/495 20060101ALN20230309BHJP

C12N 1/04 20060101ALN20230309BHJP

C12N 5/10 20060101ALN20230309BHJP

【ＦＩ】

C12N5/079

C12Q1/04

A61P25/28

A61P29/00

A61P25/16

A61P25/14

A61P21/02

A61P21/04

A61P25/02 101

A61P39/02

A61P25/00

A61K38/19

C07K14/50

C07K14/54

C07K14/53

C07K14/495

C12N1/04

C12N5/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022535155

(86)(22)【出願日】2020-12-17

(85)【翻訳文提出日】2022-08-04

(86)【国際出願番号】 KR2020018569

(87)【国際公開番号】W WO2021125839

(87)【国際公開日】2021-06-24

(31)【優先権主張番号】10-2019-0168516

(32)【優先日】2019-12-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520493429

【氏名又は名称】コアステムカンパニーリミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＥＳＴＥＭＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田雅一

(72)【発明者】

【氏名】リー，サンフン

(72)【発明者】

【氏名】キム，スンウォン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ミユン

(72)【発明者】

【氏名】キム，スヒョン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA05

4B063QQ08

4B063QR77

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BB06

4B065BB13

4B065BB19

4B065BD26

4B065BD32

4B065BD34

4B065BD39

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA06

4C084CA28

4C084DA01

4C084DA12

4C084DA16

4C084DA25

4C084DB58

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA151

4C084ZA152

4C084ZA161

4C084ZA162

4C084ZA211

4C084ZA212

4C084ZA941

4C084ZA942

4C084ZC371

4C084ZC372

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA10

4H045EA20

4H045EA50

(57)【要約】

本発明は、ヒト多能性幹細胞から調製された卵黄嚢模倣３Ｄオルガノイドのパターン形成、増殖、培養及び分化誘導をすることによって大量のミクログリアを得るための分化方法に関し、ここで、このようにして大量に得られたミクログリアは、既存の分化方法によって分化した細胞と比較して、収率、純度及び貯蔵安定性に関して有意に優れた効果を示し、そのため、脳疾患の病変及び治療機構に関する研究並びに薬物スクリーニングプラットフォームにおいて利用され得る。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ミクログリアの分化を誘導するための培地組成物であって、前記培地組成物が下記の式１：
［式１］

【化1】

によって表される化合物をさらに含む、培地組成物。

【請求項2】

ミクログリアの分化を誘導するための培地がＮＧＤ（神経膠細胞分化）培地である、請求項１に記載の培地組成物。

【請求項3】

ミクログリアの分化を誘導するための培地が、ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）及びアクチビンＡを含む、請求項１に記載の培地組成物。

【請求項4】

ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）及びＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）がさらに含まれる、請求項３に記載の培地組成物。

【請求項5】

大量のミクログリアを得る、ミクログリアの分化のための方法であって、前記方法が：
ヒト多能性幹細胞から卵黄嚢模倣オルガノイドを調製するステップと；
ＮＧＤ（神経膠細胞分化）培地中で前記オルガノイドを培養する間に前記ＮＧＤ培地をＮ２添加培地で置換するステップとを含み；
ここで、前記ＮＧＤ培地中で培養する時に、下記の式１：
［式１］

【化2】

によって表される化合物が前記ＮＧＤ培地中にさらに含まれる、方法。

【請求項6】

前記ＮＧＤ培地が、培養の９日目～１１日目にＮ２添加培地で置換される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）及びアクチビンＡが前記ＮＧＤ培地に含まれる、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）及びＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）が前記ＮＧＤ培地中にさらに含まれる、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）及びＩＬ－３４（インターロイキン３４）が前記Ｎ２添加培地中にさらに含まれる、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

コレステロール及びＴＧＦ－β１（トランスフォーミング増殖因子β１）が、前記Ｎ２添加培地中にさらに含まれる、請求項５に記載の方法。

【請求項11】

凍結保存を行うステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。

【請求項12】

前記培養が、１～１０％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて行われる、請求項５に記載の方法。

【請求項13】

細胞選別プロセスが別に行われない、請求項５に記載の方法。

【請求項14】

神経変性疾患又は炎症性変性疾患を予防又は処置するための組成物であって、前記組成物が、請求項５に記載の方法によって分化したミクログリア由来の抗炎症性サイトカインを含む、組成物。

【請求項15】

前記抗炎症性サイトカインが、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－３３、ＴＮＦ－β及びＩＧＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記神経変性疾患が、パーキンソン病、認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶喪失、重症筋無力症、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、本態性振戦、皮質基底核変性症、びまん性レビー小体病及びピック病からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１４に記載の組成物。

【請求項17】

前記炎症性変性疾患が、認知症、レビー小体病、前頭側頭型認知症、白質変性、副腎白質ジストロフィー、多発性硬化症及びルー・ゲーリック病からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１４に記載の組成物。

【請求項18】

請求項５に記載の方法によって分化したミクログリアを使用した、薬物スクリーニング方法。

【請求項19】

前記薬物が、神経変性疾患又は炎症性変性疾患を処置する、請求項１８に記載の薬物スクリーニング方法。

【請求項20】

前記神経変性疾患が、パーキンソン病、認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶喪失、重症筋無力症、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、本態性振戦、皮質基底核変性症、びまん性レビー小体病及びピック病からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１９に記載の薬物スクリーニング方法。

【請求項21】

前記炎症性変性疾患が、認知症、レビー小体病、前頭側頭型認知症、白質変性、副腎白質ジストロフィー、多発性硬化症及びルー・ゲーリック病からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１９に記載の薬物スクリーニング方法。

【請求項22】

対象に治療有効量のミクログリア由来抗炎症性サイトカインを投与するステップを含む、神経変性疾患又は炎症性変性疾患を処置するための方法。

【請求項23】

前記抗炎症性サイトカインが、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－３３、ＴＮＦ－β及びＩＧＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記神経変性疾患が、パーキンソン病、認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶喪失、重症筋無力症、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、本態性振戦、皮質基底核変性症、びまん性レビー小体病及びピック病からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記炎症性変性疾患が、認知症、レビー小体病、前頭側頭型認知症、白質変性、副腎白質ジストロフィー、多発性硬化症及びルー・ゲーリック病からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項２２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト多能性幹細胞から調製された卵黄嚢模倣オルガノイド（ｙｏｌｋｓａｃ－ｍｉｍｉｃｏｒｇａｎｏｉｄ）を使用することによって大量のミクログリアを確保する、ミクログリアの分化のための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト脳疾患に関する現代の研究の殆どは、齧歯動物ニューロンを使用して行われてきた。ヒト脳ニューロンを得るのが困難であることと、齧歯動物遺伝子とヒト遺伝子との間にある程度の類似性があることが理由である。しかしながら、最近、幹細胞の分野で研究が進んだので、胚性幹細胞からヒト脳神経系細胞を分化させるための方法が開発され、脳疾患研究は、齧歯動物細胞を使用した研究から、ヒト細胞を直接使用した研究に次第に移ってきた。また、最近ゲノム分野での研究が進んだので、ヒトと実験動物遺伝子との間の類似性は、特にミクログリアにおいて、期待されるより相当低いことが明らかになった。このことから、ヒト脳神経系細胞と実験動物脳神経系細胞との間の相互作用によって、種間の遺伝的差異のためにヒト脳内で実際に起こる病変及び治療効果を有意に表すことが困難になるという問題が示唆される。

【0003】

特に、ミクログリアは、中でも脳組織内の炎症において、中心的役割を果たす。したがって、ミクログリアを理解することは、ヒト疾患の病原の同定及び疾患のための薬物の開発にとって非常に重要である。それにもかかわらず、脳及び神経系の他の細胞と比較して、ミクログリアの分化方法は、脳及び神経系の他の細胞と異なり、安定して確立された分化方法は現在までに研究されておらず、そのためかかる分化方法の開発が至急必要である。

【0004】

脳神経系は、大部分がニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアで構成される。ニューロン、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトは全て、発生の間に外胚葉に由来する神経幹細胞から生じるが、ミクログリアは発生の間に一次造血のプロセスによって卵黄嚢に由来する。一次造血は、血球を産生する造血幹細胞が産生される二次造血とは異なるプロセスである。それにもかかわらず、現在までに開発されたプロトコルの殆どは、造血幹細胞と同じ発生プロセスである、二次造血のプロセスによって分化する。

【0005】

ヒト多能性幹細胞からミクログリアへの分化のための方法が、研究、開発、及び報告されてきた［非特許文献１及び２］が、以下の問題が存在する。

【0006】

（１）ミクログリアを得るのに相当な長さの時間がかかる。
非特許文献１のプロトコルでは成熟ミクログリアを得るのに７５日かかり、非特許文献２のプロトコルでは成熟ミクログリアを得るのに３８日かかる。もし細胞を得るのに３８～７５日より長くかかる場合、各実験には少なくとも約４０日の準備期間が必要なため、細胞をスムーズに確保するために分化期間を進めることが重要である。

【0007】

（２）酸素濃度制御機器及び多くの種類のタンパク質処理が必要である。
非特許文献２のプロトコルの場合、収率を増大させるため、最初の４日間は低酸素条件が適用される。分化期間の間に処理されるタンパク質の数は、非効率的に、高くても１４である。

【0008】

（３）収率が低いか、又は細胞選別プロセスが別々に必要とされる。
非特許文献１のプロトコルの場合、１×１０^６個のｉＰＳ細胞から開始して、７４日目に０．５～４×１０^６個のミクログリアだけが得られる。非特許文献２のプロトコルの場合、１×１０^６個のｉＰＳ細胞から開始して得ることができるミクログリアの量は、３０×１０^６～４０×１０^６個にもなるが、プロトコルの間にＦＡＣＳを使用した細胞選別プロセスが行われるべきである。この細胞選別プロセスによって、細胞損傷及び細胞喪失が必然的に伴う。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】ＪｕｌｉｅｎＭｕｆｆａｔ、ＲｕｄｏｌｆＪａｅｎｉｓｃｈら。２０１６年、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｇｌｉａ－ｌｉｋｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ．２２、１３５８～１３６７頁

【非特許文献2】ＥｄｓｅｌＭ．Ａｂｕｄ、ＭａｔｈｅｗＢｌｕｒｔｏｎ－Ｊｏｎｅｓら。２０１７年、ｉＰＳＣ－ＤｅｒｉｖｅｄＨｕｍａｎＭｉｃｒｏｇｌｉａ－ｌｉｋｅＣｅｌｌｓｔｏＳｔｕｄｙＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌＤｉｓｅａｓｅｓ．Ｎｅｕｒｏｎ．９４巻、２号、２０１７年４月１９日、２７８～２９３頁。ｅ９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞から調製された卵黄嚢模倣オルガノイドを培養する時にＸＡＶ９３９を培地に加えることによりＷｎｔ経路をブロックすることによって原始線条ＨＳＣへの分化を誘導する、実際のｉｎｖｉｖｏ発生プロセスに最もよく似たプロトコルを開発した。特に、本発明者らは、培養の間に培地を脳細胞培養条件と置換することによって生じたミクログリアが培養液中に排出されるように、いかなる特別な細胞選別プロセスもなく大量の純粋なミクログリアを獲得し得る分化方法を開発した。上述のことに基づき、本発明者らは、本発明を完成させた。

【課題を解決するための手段】

【0011】

したがって、本発明の目的は、ミクログリアの分化を誘導するための培地組成物を提供することであり、該培地組成物は下記の式１によって表される化合物をさらに含む。

【0012】

［式１］

【化1】

【0013】

また、本発明の別の目的は、大量のミクログリアを得る、ミクログリアの分化のための方法を提供することであり、該方法は：
ヒト多能性幹細胞から卵黄嚢模倣オルガノイドを調製するステップと；
ＮＧＤ（神経膠細胞分化：ｎｅｕｒｏｇｌｉａｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）培地中でオルガノイドを培養する間にＮＧＤ（神経膠細胞分化）培地をＮ２添加培地で置換するステップとを含み、
ここで、ＮＧＤ培地中で培養する時に、下記の式１によって表される化合物がＮＧＤ培地中にさらに含まれる。

【0014】

［式１］

【化2】

【0015】

また、本発明の別の目的は、神経変性疾患又は炎症性変性疾患を予防又は処置するための組成物を提供することであり、該組成物は、前記方法によって得られた、分化したミクログリア由来の抗炎症性サイトカインを含む。

【0016】

また、本発明の別の目的は、前記方法によって得られた分化したミクログリアを使用した、薬物スクリーニング方法を提供することである。

【発明の効果】

【0017】

ミクログリアの分化のための本発明の方法は、分化したミクログリアがＸＡＶ９３９によってＷｎｔ経路をブロックして原始線条ＨＳＣへの分化を誘導するので、実際のｉｎｖｉｖｏ発生プロセスに最も似たプロトコルであると言える。また、ミクログリアの分化のための既存の方法では、細胞収率を増大させるために５％低酸素が最初に適用されるが、本発明では、低酸素方法を適用することなく得られたミクログリアの収率は、他の対照群のものより高い。

【0018】

本発明の方法は、発生段階における卵黄嚢を模倣するオルガノイドを生じ、効率的に生じたミクログリアが培養液中に排出されるように培養（分化）の９日目～１１日目に培地を脳細胞培養条件で置換するシステムである。いかなる特別な細胞選別プロセスもなしに、純粋なミクログリアを獲得することができる。即ち、９０％を超える純度のミクログリアもまた、ＦＡＣＳ又はＭＡＣＳ等の細胞選別なしに得ることができた。さらに、ミクログリアはまた、凍結保存することができる。本発明のミクログリアの分化のための方法は、脳疾患の病変及び治療機構の研究並びに単一の細胞系による薬物スクリーニングのためのプラットフォームとして利用することができ、又は他の脳ニューロン、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトとの共培養によって成人脳のものと類似した顕微鏡的三次元脳構造システムを開発することによって利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、本発明の卵黄嚢オルガノイドを使用してミクログリアを分化させるための詳細なプロトコルを説明する図である［ｘ軸は培養（分化）の日数を示す］。

【図2】図２は、卵黄嚢中で発生しているｉＰＳＣ由来の分化（培養）後１日目～９日目のオルガノイドの写真である。

【図3】図３は、卵黄嚢オルガノイド内で原始造血幹細胞（原始ＨＳＣ）が実際に生じるか否かを確認するために、オルガノイドを凍結した後に切断して切片にすることによる免疫細胞化学解析によって断面図を確認する写真である。

【図4】図４は、オルガノイドを単一細胞レベルまで分解することによって、接着培養の後に免疫細胞化学解析によってオルガノイドの断面図を確認する写真である。

【図5】図５は、ｒｔ－ＰＣＲによって分化（培養）の１４日目に卵黄嚢オルガノイドのＲＮＡを収集することによって、ミクログリア分化の初期に発現された遺伝子マーカーの量を確認することによって得られた結果を説明する図である。

【図6】図６は、卵黄嚢オルガノイドから排出されたミクログリアの形状の変化を説明する図である。分化（培養）の開始後１０日目に、培地を、ミクログリアが卵黄嚢から流れ出て脳に浸透する環境を模倣した、Ｍ－ＣＳＦ及びＩＬ－３４を含むＮ２培地で置換する。

【図7】図７は、２４日間分化（培養）し、細胞培養皿に付着している卵黄嚢オルガノイドから排出されたミクログリアを収集した後に撮影された写真である。

【図8】図８は、ｑＰＣＲによって、分化（培養）の３２日目に卵黄嚢オルガノイド（上清、ｓｕｐ）及び卵黄嚢オルガノイドから排出されたミクログリアのそれぞれにおいて、成熟ミクログリアマーカー遺伝子（Ｉｂａ１；ミクログリア、ＣＤ１１ｂ；マクロファージ及びミクログリア、ＣＸ３ＣＲ１；ミクログリア強化タンパク質）の発現を確認することによって得られた結果を説明する図である。

【図9】図９は、免疫細胞化学解析によって、３８日間分化（培養）した卵黄嚢オルガノイドの断面図を解析することによって得られた結果を説明する図である。

【図10】図１０は、顕微鏡によってミクログリア前駆細胞の発生を確認することによって得られた結果を説明する図である［（１）：分化（培養）の２４日目に細胞培養皿にプレーティングされたオルガノイドから排出された細胞の写真；（２）：写真（１）と同じウェル中でさらに＋１１日間培養された時の写真；（３）：写真（１）と同じウェル中でさらに＋２９日間培養された時の写真（皿に付着している細胞及び浮遊細胞）；及び（４）：写真（３）の浮遊細胞を再び収集し、細胞培養皿にプレーティングすることによる、細胞の写真］。

【図11】図１１は、ミクログリア前駆細胞におけるミクログリアマーカーの発現を説明する図である。優れた増殖能を有するミクログリア候補細胞集団は、オルガノイドから流れ出た直後には増殖しないが、ある一定期間の後に増殖する。ＩＢＡ１染色によって、増殖性細胞がミクログリア前駆細胞である可能性が確認された（白色の矢印は増殖性細胞を示す）。

【図12】図１２は、ミクログリア前駆細胞におけるミクログリアマーカーの発現を説明する図である。図１２は、優れた増殖能を有するミクログリア前駆細胞候補及びミクログリアの両方が、ミクログリアの重要なマーカーであるＣＸ３ＣＲ１を発現するという、免疫細胞化学解析によって確認することによって得られた結果を説明する図である。

【図13】図１３は、アストロサイトを単独で培養した時、又はアストロサイトとミクログリアとを共培養した時の、炎症反応マーカーによる毒性の刺激に対する応答を確認することによって得られた結果を説明する図である。

【図14】図１４は、蛍光ビーズ及び免疫細胞化学解析を使用した、本発明の分化方法によって分化したミクログリアの食細胞活動を確認することによって得られた結果を説明する図である。

【図15A】図１５は、ｐＨｒｏｄｏ及び免疫細胞化学解析を使用した食細胞活動解析実験による、本発明の分化方法によって分化したミクログリアの食細胞活動を確認することによって得られた結果を説明する図である。図１５Ａは、ｐＨｒｏｄｏで処理することによって得られた結果を説明する図であり、図１５Ｂは、強度解析による、細胞中に蓄積したｐＨｒｏｄｏの量を定量化することによって得られた結果を説明する図である。

【図15B】図１５は、ｐＨｒｏｄｏ及び免疫細胞化学解析を使用した食細胞活動解析実験による、本発明の分化方法によって分化したミクログリアの食細胞活動を確認することによって得られた結果を説明する図である。図１５Ａは、ｐＨｒｏｄｏで処理することによって得られた結果を説明する図であり、図１５Ｂは、強度解析による、細胞中に蓄積したｐＨｒｏｄｏの量を定量化することによって得られた結果を説明する図である。

【図16】図１６は、本発明の分化方法によって分化したミクログリアの凍結保存可能性を説明する図である。

【図17】図１７は、本発明の分化方法による分化（培養）の２１日目～３９日目に排出によって得られたミクログリアの産物の数を示すグラフである。図１７は、２日に１回卵黄嚢模倣オルガノイドから放出された細胞（ミクログリア＋ミクログリア前駆細胞）を収集すること、並びに２１日目～３９日目に６ウェルプレートの１つのウェル（９．６ｃｍ^２）に付着させること、並びに、次いで、再び２日に１回各ウェル中で浮遊しているミクログリアを採取し、それらを測定することによって、得られた結果である。

【図18】図１８は、非特許文献１による、ヒト胎児ミクログリアの遺伝子発現データ（公衆データ）と、本発明の分化方法によって得られたミクログリア（赤色の四角）及びＨ９胚性幹細胞の遺伝子発現データとの比較解析によって得られた結果を説明する図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明をより詳細に説明する。

【0021】

本発明は、ヒト多能性幹細胞から調製された卵黄嚢模倣オルガノイドを使用することによって大量のミクログリアを得る、ミクログリアの分化のための方法に関する。

【0022】

本明細書で使用される場合、用語「多能性幹細胞（ＰＳＣ：ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）」は、体を構成する任意のタイプの細胞への分化を誘導することができる幹細胞をいい、多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）及び誘導多能性幹細胞（Ｉｐｓｃ：ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ、脱分化幹細胞）が挙げられる。

【0023】

本明細書で使用される場合、用語「卵黄嚢」は、端黄卵又は多黄卵動物の胚に卵黄を含む（倍数体）外胚葉層で構成されるポケット状構造、即ち、胚を囲む薄いポケットをいう。卵黄嚢は受精卵で観察され得る。卵黄嚢は、卵黄において胚への血液の供給において役割を果たす。ヒトにおいては、胚が成長すると、卵黄嚢の殆どは初期の腸に融合する。

【0024】

本明細書で使用される場合、用語「オルガノイド」は、幹細胞を使用して最小限の機能を有するよう作成された「小型器官（ｍｉｎｉ－ｏｒｇａｎ）様」をいい、三次元構造で作成され、実験室においても実際の体器官に類似した環境を作成し得る点によって特徴づけられる。即ち、「オルガノイド」は、３Ｄ立体構造を有する細胞をいい、動物等から収集又は獲得されていない、人工培養プロセスによって調製された、神経及び腸等の器官と類似したモデルをいう。オルガノイドを構成する細胞の起源は限定されない。オルガノイドは、細胞増殖の過程で周囲の環境と相互作用できる環境を有してもよい。

【0025】

オルガノイドは、一般に、ヒト多能性幹細胞を培養することによって調製され得る。具体的には、オルガノイドは、パーキンソン病由来の誘導多能性幹細胞から神経外胚葉スフィアへの分化、又はパーキンソン病由来の誘導多能性幹細胞から胚体内胚葉及び後腸への段階的分化による腸オルガノイドへの分化を誘導し得る。

【0026】

本明細書で使用される場合、用語「ミクログリア」はまた、グリア細胞又は神経膠細胞をいい、脳における免疫機能の原因となる神経膠細胞である。一般に、ミクログリアは中胚葉性であり、単球に由来すると考えられている。ミクログリアは、胎児発生の後期に心室及び髄膜の周辺に現れ、次第に脳実質に移動し、２週齢でピークに達し、次いで数が減って、分岐した休止細胞になる。成熟した脳において、ミクログリアは全ての神経膠細胞の約数パーセントを占める。炎症又は神経変性の間に、アメーバ状及び桿状ミクログリアが増大する。形態学的には、それらはマクロファージと類似しており、それらのマーカーの殆どはミクログリアの同定のために使用される。それらは移動能力及び食細胞活動を有し、発生段階の間に老廃物を処理する機能に加えて、それらはまた、活性酸素種、一酸化窒素、酸性ホスファターゼ、及びプロスタグランジンを生成することによって、炎症細胞としての機能を有する。脳には主要組織適合性抗原クラスＩＩタンパク質又はＣＤ４抗原のみがあるため、それらは、活発にサイトカインを産生するという点で、免疫調節細胞として、神経免疫相互作用において重要な役割を果たす。これは神経膠細胞の中で最小であり、損傷した神経への移動するミクログリアによる食作用によって、神経を保護する特別なタイプのマクロファージである。ミクログリアの起源は外胚葉由来造血幹細胞であり、神経系の他の細胞と関連が殆どない。

【0027】

本明細書で使用される場合、用語「パターン形成」は、オルガノイドを調製する時に、最終的に脳の詳細な組織の中から抽出される、細胞の起源の組織の特性を有する運命の細胞集団が複数の細胞集団（標的細胞強化）として含まれるような、オルガノイドの調製をいう。また、パターン形成マーカーとしては、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ２３５ａ、ＰＵ．１等が挙げられる。

【0028】

本明細書で使用される場合、用語「分化」は、分裂、増殖、及び成長の間に、細胞の構造又は機能が互いに特殊化する現象、即ち、所定のタスクを行うための、生物の細胞、組織等の形態又は機能の変化をいう。一般に、分化は、比較的単純なシステムが２つ以上の定性的に異なるサブシステムに類別される現象である。例えば、個体発生において、最初は同質であった卵部分の間の頭若しくは胴体の区別、又は細胞における筋肉細胞若しくは神経細胞の区別等の、最初は殆ど同質であった生物システムの部分間の定性的差異、又は結果として、定性的に区別可能な細区分若しくはサブシステムへと類別された状態を分化と呼ぶ。

【0029】

ヒト多能性幹細胞から卵黄嚢模倣オルガノイドを調製すること、即ち、最大量の各標的細胞を含むオルガノイドを得ること、オルガノイド組織のパターン形成及び増殖、並びに培養の間に液体培地を脳細胞培養条件と置換することによって、ミクログリアが、ＣＳＦ（脳脊髄液：ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄ）環境で一定の培養期間の後に実際の発生段階で脳に浸透した途端に、脳における培養条件を変化させる戦略をとることによって、ミクログリアのみが効率的にオルガノイドから培養液へ流れ出て、高い純度を有する大量のミクログリアを得ることができることが確認された。このようにして流れ出た細胞集団には増殖性細胞集団があるので、約３０～４０日でミクログリアを分離させ続けることが可能である。

【0030】

したがって、本発明において、調製された卵黄嚢オルガノイドの培養の間に培地を脳細胞培養条件で置換することによって、高い純度を有する大量のミクログリアを得ることができる培地組成物及び分化方法が確立された。

【0031】

本発明の一実施形態によると、ミクログリアの分化を誘導するための培地組成物としては、下記の式１に表される化合物をさらに含む、ミクログリアの分化を誘導するための培地組成物が挙げられる。

【0032】

［式１］

【化3】

【0033】

式１によって表される化合物はＸＡＶ９３９（ＣＡＳ２８４０２８－８９－３）であり、これは３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オンと呼ばれる。ＸＡＶ９３９は、βカテニン、ＴＮＫＳ１及びＴＮＫＳ２の潜在的な阻害剤である。

【0034】

ＸＡＶ９３９は、Ｗｎｔ経路をブロックすることによって、原始線条ＨＳＣへの分化を誘導する。

【0035】

ミクログリアの分化を誘導するための培地は、好ましくは、ＮＧＤ（神経膠細胞分化）培地である。

【0036】

ＮＧＤ（神経膠細胞分化）培地は、Ｇｅｍ２１、ＮｅｕｒｏｐｌｅｘＮ２、ＡｌｂｕＭＡＸＩ、塩化ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、ビオチン、乳酸シロップ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、アスコルビン酸、及び／又はペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地組成物をいう。文献［ＪｕｌｉｅｎＭｕｆｆａｔ、ＲｕｄｏｌｆＪａｅｎｉｓｃｈら。２０１６年、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｇｌｉａ－ｍｉｍｉｃｃｅｌｌｓｆｒｏｍａｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ．２２、１３５８～１３６７頁］を参照することができる。

【0037】

ミクログリアの分化を誘導するための培地には、ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４：ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ４）及びアクチビンＡがさらに含まれてもよい。

【0038】

また、ミクログリアの分化を誘導するための培地には、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子：ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）及びＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子：ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）がさらに含まれてもよい。

【0039】

培地組成物は、低酸素装置及び多数のタンパク質成分を必要とすることなく、高い純度を有する大量のミクログリアを得るために使用することができる。

【0040】

本発明の一実施形態によると、本発明の一実施形態は、大量のミクログリアを得る、ミクログリアの分化のための方法を含み、該方法は：
ヒト多能性幹細胞から卵黄嚢模倣オルガノイドを調製するステップと；
ＮＧＤ培地中でオルガノイドを培養する間にＮＧＤ培地をＮ２添加培地で置換するステップとを含み；
ここで、ＮＧＤ培地中で培養する時に、下記の式１で表される化合物がＮＧＤ培地中にさらに含まれる。

【0041】

［式１］

【化4】

【0042】

ＮＧＤ培地をＮ２添加培地と置換する時間は、好ましくは培養の９日目～１１日目である。

【0043】

ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）及びアクチビンＡが、ＮＧＤ培地中にさらに含まれてもよい。

【0044】

また、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）及びＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）が、ＮＧＤ培地中にさらに含まれてもよい。

【0045】

Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子：ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）及びＩＬ－３４（インターロイキン３４：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３４）が、Ｎ２添加培地中にさらに含まれてもよい。

【0046】

コレステロール及びＴＧＦ－β１（トランスフォーミング増殖因子β１：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａ１）が、Ｎ２添加培地中にさらに含まれてもよい。

【0047】

酸素濃度制御機器及び多数のタンパク質成分を必要とすることなく、高い純度を有する大量のミクログリアを得るために、酸素濃度制御機器なしに７つのタイプのタンパク質、ＸＡＶ－９３９及びコレステロールを含む培地組成物を使用することができる。

【0048】

本発明の一実施形態によると、凍結保存を行うステップがさらに含まれ得る。

【0049】

凍結保存は、－２５０℃～－１５０℃で３～６カ月間の保存をいう。

【0050】

本発明で実施されるミクログリアが凍結保存及び再び解凍された時に、７０％を超える細胞が生存していたことが確認された。したがって、本発明のミクログリアの分化のための方法によって得られたミクログリアもまた、凍結保存することができた。

【0051】

本発明の分化方法において、１～１０％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて培養することが好ましい。本発明の分化方法は、従来の分化方法のような低酸素培養を必要とせず、一般の細胞培養条件と同様に行われ得る。また、従来の分化方法のような細胞選別プロセスを行うことなく、高い収率及び純度でミクログリアを得ることが可能である。

【0052】

具体的には、約３０～４０日で成熟ミクログリアを得ることができる。特に、非特許文献１より４５～５５日早く、及び非特許文献２より約８～１８日早く、細胞を生じることが可能である。

【0053】

また、ミクログリアは、酸素濃度制御機器なしで、７つのタイプのタンパク質、１つのタイプの化学物質（ＸＡＶ－９３９）、及び１つのタイプの有機化合物（コレステロール）のみを使用してうまく培養された。したがって、この方法は、従来の方法と比較して、より経済的及び効率的な分化方法である。

【0054】

非特許文献２のプロトコルは、現在最も高い収率を有し、開始時に加えられた細胞の数と比較して、３８日目にミクログリアの数の３０～４０倍のみ生じるが、本発明の分化方法のプロトコルは、細胞の最初の数（２×１０^６個のｉＰＳ細胞で開始）と比較して、３０日目に成熟ミクログリアの数の５．５～６．５倍、４０日目までに蓄積した場合は約５０倍を生じ得る。さらに、非特許文献２のプロトコルとは異なり、本発明の分化方法のプロトコルは、ＦＡＣＳ細胞選別なしに９０％までの純度を示し、そのため、細胞を損傷することなく安定した量のミクログリアを得ることが可能である。

【0055】

ミクログリアにおいて、ミクログリアの活性化は、Ｍ１及びＭ２の２つのタイプに類別され得、Ｍ１応答は炎症性サイトカイン等の因子を放出する。言い換えれば、これは、神経毒性物質を生じることによって脳損傷を悪化させる。これらの神経毒性物質としては、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、グルタミン酸塩、及びＮＯ等の炎症性サイトカインが挙げられる。Ｍ２応答において、それらは、細胞残屑を除去すること、及び脳修復のために栄養因子を放出することによって、隣接する細胞を保護する。

【0056】

このようにして、Ｍ２応答は、炎症反応によって損傷を受けた組織を回復させ、栄養供給のために血管を形成又は修復する。この役割を果たす物質は、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－β、ＩＧＦ－１、及びＩＬ－３３等の抗炎症性サイトカインである。

【0057】

したがって、ミクログリア由来の抗炎症性サイトカインを利用して、神経変性疾患又は炎症性変性疾患を予防又は処置することができる。

【0058】

本発明の一実施形態は、分化方法によって得られるミクログリア由来の抗炎症性サイトカイン又は増殖因子を含む、神経変性疾患又は炎症性変性疾患を予防又は処置するための組成物を含む。

【0059】

抗炎症性サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－３３、ＴＮＦ－β及びＩＧＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つであり得る。

【0060】

本発明の組成物は、医薬組成物の調製において一般に使用される適切なキャリア、賦形剤及び希釈剤をさらに含んでもよい。

【0061】

本発明の組成物は、経口又は非経口的に投与され得る。非経口投与のために、外用、又は腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射若しくは胸腔内注射のための注射方法を選択することが好ましいが、これらに限定されない。

【0062】

本発明の組成物は、それぞれ従来の方法に従って、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、懸濁剤、乳剤、シロップ、及びエアロゾル等の経口製剤、外用製剤、坐薬及び無菌注射液の形態で製剤化してもよい。組成物に含まれ得るキャリア、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油が挙げられる。製剤化の場合、本発明の組成物は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤等の、一般に使用される希釈剤又は賦形剤を使用して調製される。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、粉末、顆粒、カプセル等が挙げられ、これらの固形製剤は、少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、ショ糖又はラクトース、ゼラチン等を、混合生薬と混合することによって調製される。単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウム及びタルク等の滑沢剤もまた使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内服液、乳剤、シロップ等が挙げられる。一般に使用される単純な希釈剤である水及び流動パラフィンに加えて、種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、香料、保存料等が含まれてもよい。

【0063】

非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、及び坐薬が挙げられる。非水溶媒及び懸濁化剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射用エステルを使用してもよい。坐薬の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等を使用してもよい。

【0064】

本発明の組成物の好ましい投薬量は、患者の状態及び体重、疾患の重症度、薬物の形態、投与の経路、及び持続時間に依存して変化し得るが、当業者によって適切に選択され得る。しかしながら、望ましい効果のために、組成物は、好ましくは、１日あたり０．０００１～１ｇ／ｋｇ、より好ましくは１日あたり０．００１～２００ｍｇ／ｋｇで投与されるが、これらに限定されない。投与は、１日１回行われ得るか、又は１日数回に分割され得る。投薬量は、いかなる態様においても本発明の範囲を限定しない。

【0065】

本明細書で使用される場合、用語「処置」は、疾患に関連する臨床的状況を阻害するか、緩和するか、又は有利に変化させる、任意の行為をいう。また、処置は、処置を受けなかった場合に期待される生存率と比較して、増大した生存を意味してもよい。処置は、治療手段に加えて、同時に予防手段を含む。

【0066】

神経変性疾患としては、例えば、パーキンソン病、認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶喪失、重症筋無力症、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、本態性振戦、皮質基底核変性症、びまん性レビー小体病及びピック病からなる群から選択されるいずれか１つを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0067】

炎症性変性疾患としては、認知症、レビー小体病、前頭側頭型認知症、白質変性、副腎白質ジストロフィー、多発性硬化症及びルー・ゲーリック病からなる群から選択されるいずれか１つを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0068】

別の実施形態では、本発明は、対象に治療有効量のミクログリア由来の抗炎症性サイトカインを投与するステップを含む、神経変性疾患又は炎症性変性疾患を処置するための方法を提供する。

【0069】

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、処置、観察又は実験される脊椎動物、好ましくは哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヒト等をいう。

【0070】

本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、研究者、獣医、内科医又は他の臨床医によって検討される、組織系、動物又はヒトにおいて生物学的又は医学的な応答を誘導する有効成分又は医薬組成物の量をいう。治療有効量としては、処置される疾患又は障害の症状の緩和を誘導する量が挙げられる。本発明の有効成分についての治療有効量及び投与の頻度は所望する効果に依存して変化することが、当業者に明らかである。したがって、投与される最適な投薬量は当業者によって容易に決定され得、範囲は疾患のタイプ、疾患の重症度、組成物中に含まれる有効成分及び他の成分の含有量、製剤化のタイプ、患者の体重、年齢、性別、及び健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率等に依存して変化する。

【0071】

本発明はまた、方法によって得られたミクログリアを使用した薬物スクリーニング方法を提供する。

【0072】

本発明によって得られたミクログリアの重要な特徴としては、大量の細胞の産生を得る可能性、凍結保存の間でもそれらの特性が維持されること、長時間同じ細胞集団を維持する可能性、及び生体に由来する細胞のものとより類似した分化が挙げられる。この特性は、同じ状態の大量の細胞を必要とする複数の薬物の同時のスクリーニングに特に適しており、長い時間同じ細胞をその繰り返し分析のために得るための鍵である。この特性は、鍵となるマーカーが維持されている同じ特徴を有する細胞集団を、スクリーニング操作の始めから終わりまで継続的に使用し得るので、細胞をスクリーニングするのに非常に適している。

【0073】

薬物は、神経変性疾患及び炎症性変性疾患からなる群から選択される疾患を処置するための薬物であり、神経変性疾患又は炎症性変性疾患に対して治療効果を示す。

【0074】

神経変性疾患としては、例えば、パーキンソン病、認知症、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶喪失、重症筋無力症、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、本態性振戦、皮質基底核変性症、びまん性レビー小体病及びピック病を含む種々の神経系疾患を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0075】

【0076】

本発明で使用される全ての技術用語は、他に定義されなければ、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。また、好ましい方法及び試料が本明細書に記載されているが、それらと同様又は同等なものもまた、本発明の範囲に含まれる。本明細書に参照として記載されている全ての刊行物の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0077】

以下、実施例によって本願を詳細に説明する。以下の実施例は本願を説明するためのみのものであり、本願の範囲は以下の実施例に限定されない。

【0078】

実施例１：卵黄嚢オルガノイドを使用した、ヒト誘導多能性幹細胞からミクログリアへの分化
［実験方法］
ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞の培養
漢陽大学校（ソウル、大韓民国）の治験審査委員会（ＩＲＢ：ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌｒｅｖｉｅｗｂｏａｒｄ）によって承認されたｈＥＳＣ研究指針に基づいて、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣを培養した。この実験に使用したｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣを以下の表１に示す。

【0079】

【表1】

【0080】

３Ｄオルガノイドを使用したミクログリア分化
未分化状態で正常に培養されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣを、継代培養の間にアクターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（商標）を使用して分離させ、未分化ヒト胚性／脱分化幹細胞を、２０，０００個の細胞／ウェルで底に付着しない丸底の９６ウェルプレートに播種し、一度オルガノイドを形成した。

【0081】

１日目の培地組成物において、オルガノイドの発生は、以下の表３のＮＧＤ（神経膠細胞分化）培地における表２の培養（分化）の０日目に対応する追加条件（ＢＭＰ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃１２０－０５ＥＴ４０ｎｇ／ｍｌ）＋アクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃１２０－１４Ｐ、１０μｇ／ｍｌ）＋アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ４５４４、２００μＭ）＋Ｙ２７６３２（Ｓｉｇｍａ、＃Ｙ０５０３、２０μＭ））で開始した。翌日、１日目に同じＮＧＤ培地に加えられた成分の中で、Ｙ２７６３２（２０ｕＭ）以外の成分にＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ、＃Ｘ３００４、２μＭ）がさらに加えられた培地を使用することによって、発生が誘導された（表３参照）。培地は９日目まではＮＧＤであり、添加成分について表３を参照した濃度に従って添加物を加えるか、又は取り除くことによって、発生が誘導された。成分が変化した場合は毎日培地を置換し、成分が変化しなかった場合は１日おきに培地を置換した。オルガノイドの正しい形成を、４日目～８日目に細胞集団の形成によって確認し、１２日後に細胞の外側への排出によってチェックした。オルガノイド分化（培養）の６日目に、９６ウェルプレートで１つずつ形成された８つのオルガノイドを各群に分類し、６ウェル低結合プレートのウェルに播種及び培養した。オービタルシェイカーで回転させながら（８０～１００ｒｐｍ）、表２の成分を含むＮ２ベース培地（Ｎ２ｂａｓｅｍｅｄｉａ）（表３）下で発生を誘導した。２０日目に、オルガノイドを含む培地を収集し、１０００ｇで３分間遠心分離して、排出された細胞を回収し、６ウェルのウェル１つあたり約８個のオルガノイドを、ＰＬＯ（ポリＬオルニチン：ｐｏｌｙ－Ｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ；１５μｇ／ｃｍ^２）／ラミニン（２００ｎｇ／ｃｍ^２）で被覆された６ウェルプレートにプレーティングした。その後、６ウェルプレートに付着していたミクログリアを、表２の培地組成に従って培養し、２～３日毎に培地を置換した。

【0082】

【表2】

【0083】

【表3】

【0084】

オルガノイドを刻む方法
オルガノイドを刻み、それらを培養して単一細胞にする方法は以下の通りである。

【0085】

細い注射針（３０ゲージ針）でオルガノイドを細かく分割し（直径約２００μｍ）、アクターゼとともに１０分間培養し、次いでＰＬＯ／ラミニン被覆皿に付着させ、培養した。

【0086】

卵黄嚢３Ｄオルガノイド由来ミクログリアの大量増殖及び収率の確認
卵黄嚢３Ｄオルガノイドから排出されたミクログリアを、２日毎に６ウェルプレートにプレーティングした。卵黄嚢３Ｄオルガノイドを含む培養液を収集し、１５ｍｌコニカルチューブに入れ、３００ｇで２分間遠心分離し、次いでチューブの底に形成された細胞集団を分離させて単一細胞にし、次いでＰＬＯ／ラミニン被覆６ウェルプレートに付着させた。その後、オルガノイドから排出された細胞に加えて、６ウェルプレートの接着培養における細胞から増殖させた新しいミクログリアを含む培養液もまた収集し、２日毎に遠心分離してミクログリアを分離させ、次いでＰＬＯ／ラミニン被覆６ウェルプレートに再びプレーティングした。３０日目から、プレーティングされるミクログリアの数が急速に増加し始めた。３０日時点で、最初の培養物中の細胞の数の約６倍のミクログリアを得ることが可能である。各プレーティングについて、血球計数器で細胞の数を計数し、収率を計算した。収率は、最初の２×１０^６個の細胞に基づいて計算した。

【0087】

免疫細胞化学解析
免疫細胞化学解析は、一次抗体を標的タンパク質に結合させ、次いで、蛍光色素が結合している二次抗体を一次抗体に結合させることによって、標的タンパク質を可視化する解析方法である。可視化することができるタンパク質の数は、二次抗体の蛍光色素のタイプによって決定される。この研究において、２つ又は３つのタイプの蛍光色素が使用された。

【0088】

固定液（４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ）で２０分間試料を固定し、次いでＰＢＳで３回、各回５分間すすいだ。ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を使用して４０分間ブロッキングを行い、次いで一次抗体を同じバッファーに溶解させ、２４時間試料に結合させた。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで試料を３回すすぎ、次いで二次抗体を同じバッファーに溶解させ、１時間結合させた。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで試料を３回すすぎ、次いでＤ．Ｗ．で１回すすぎ、マウンティング溶液（ベクタシールド、ＶｅｃｔｏｒＬａｂ）とともにカバーガラスにマウントした。

【0089】

オルガノイド切片免疫細胞化学解析を、以下のように行った。固定液中で３０分より長くオルガノイドを固定し、次いでＰＢＳで３回、各回１０分間すすぎ、次いで３０％ショ糖溶液中で２４時間培養し、脱水した。脱水された試料をＯＣＴ（最適切削温度：ｏｐｔｉｍａｌｃｕｔｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）化合物中で凍結させ、次いで、ミクロトームで１０～１２μｍの厚さに切断し、上述のブロッキングプロセスを行った。

【0090】

ＲＴ－ＰＣＲ
トリゾールを使用して、解析する試料のＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ抽出が完了した後、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ－ＰＣＲを行った。これは、試料間で存在するＲＮＡの相対量を比較することができる実験方法であり、この研究において、数個の試料の間での比較によって、特定の試料中のマーカータンパク質の発現を確認するのに使用された。

【0091】

ＲＮＡ抽出方法は以下の通りである。１ｍｌのトリゾール中で５分間細胞を溶解させ、２００μｌのクロロホルムを加え、振とうしながら混合し、次いで２～３分間静置した。１２０００Ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離を行った。遠心分離の後、上清の透明な部分を収集し（４００～５００μｌ）、新しいチューブに移し、５００μｌのイソプロパノールを加え、次いで混合した。１０分間のインキュベーションの後、１２０００Ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離を行った。

【0092】

チューブの底に残っていた少量のＲＮＡ集団を除いて上清を除去し、次いで１ｍｌの７５％エタノール溶液を加え、集団と混合した。７５００Ｘｇ、４℃で５分間遠心分離を行った。上清を除去し、次いでＲＮＡ集団のみを残し、次いで蓋を開けて風乾した。乾燥したＲＮＡをＲＮアーゼフリー水に溶解させ、次いでその濃度を測定した。

【0093】

ｃＤＮＡ合成方法は以下の通りである。

【0094】

ｃＤＮＡ合成のために、２μｇのＲＮＡを使用した。ランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して第１の鎖のｃＤＮＡ合成を行い、ＰＣＲ装置によって７５℃で１５分間、反応を行った。その後、氷上で２分間インキュベーションを行い、次いでｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、２５℃で１５分間、４２℃で５０分間、及び７０℃で１５分間、反応を行った。

【0095】

調製されたｃＤＮＡは、合計２０μｌであり、これを１０倍希釈し、ＲＴ－ＰＣＲに使用した。反応のためにＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用し、２μｌのｃＤＮＡを各回で反応させた。

【0096】

前駆細胞発生の確認
恒常的にミクログリアを生じるミクログリア集団を、ＩＢＡ１で染色し、陽性の場合、ミクログリア前駆細胞として同定した。増殖性細胞もまた、リアルタイムで顕微鏡モニタリングによって同定した。また、これを、ミクログリアを排出するオルガノイドの分化の１４日目にＰＵ．１マーカーの発現によって確認した。

【0097】

純度及び収率の確認
免疫細胞化学解析によって、ミクログリアのマーカータンパク質（Ｉｂａ１、ＣＸ３ＣＲ１等）の染色によって純度を確認した。マーカータンパク質を発現する細胞の発生及び排出を日付毎に計数し、最初にプレーティングされた細胞と比較して収率を計算した（図１７）。

【0098】

２１日目～３９日目に、卵黄嚢模倣オルガノイドから放出された細胞（ミクログリア＋ミクログリア前駆細胞）を２日毎に１回収集し、６ウェルプレートの１つのウェル（９．６ｃｍ^２）に付着させ、次いで各ウェル中で浮遊しているミクログリアを２日毎に１回再び採取し、測定した。

【0099】

細胞機能（食細胞活動）の確認
細胞を蛍光標識ミクロスフィアで処置し、細胞に侵入したミクロスフィアを確認することによって、第１の細胞の食細胞活動を確認した。ウェル１つあたり１×１０^４個の細胞を２４ウェルプレートに付着させ、１日後に３×１０^５個のビーズで処置した。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、表面に付着して細胞に侵入しなかったミクロスフィアを除去し、次いで細胞を固定し、蛍光免疫染色を行った。

【0100】

ＰＦＦ（既形成原線維：Ｐｒｅ－ｆｏｒｍｅｄＦｉｂｒｉｌ）をｐＨｒｏｄｏに付着させ、ミクログリアを処置することによって、第２の細胞の食細胞活動を確認した。ｐＨｒｏｄｏは、酸性環境で赤色の蛍光を発する物質である。ｐＨｒｏｄｏが細胞によって貪食される場合、ｐＨｒｏｄｏは赤色の蛍光を発する。ＰＦＦは、ミクログリア等の食細胞によって貪食される物質である。ｐＨｒｏｄｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｐ３６６００）をＰＦＦに付着させ、ミクログリアをそれで処置し、次いで各時間について蛍光の量を測定して、ミクログリアの食細胞活動を確認した。一実験方法において、２．８６μｌの５ｍｇ／ｍｌＰＦＦを、１．５ｍｌチューブ中で１μｌのｐＨｒｏｄｏと混合し、次いで遮光状態で、室温で１時間保存した。１ｍｌのＰＢＳを加え、１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、次いでチューブの底の暗紫色の集団のみを残して上清を除去した。１ｍｌのＰＢＳを加え、集団を溶解し、再び１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行った。これをもう一度繰り返した。紫色の集団を１ｍｌの培養液で遊離させ、次いで２４ウェルプレートで増殖している２５０μｌの細胞を等分し、各ウェルに加えた。処置の１．５時間後に観察を開始した。

【0101】

３Ｄオルガノイド由来ミクログリアの凍結保存
培養の３０日目に、オルガノイド由来ミクログリアの５×１０^５個の細胞を－１９６℃で９０％培養液及び１０％ＤＭＳＯで構成される凍結溶液で凍結し、次いで１００日後に解凍して生存率を確認した。

【0102】

［実験結果］
ヒト胚性幹細胞からの卵黄嚢オルガノイドの調製
図２において、光学顕微鏡によって、卵黄嚢オルガノイドが調製されたことを確認した。図２は、卵黄嚢で発生しているｉＰＳＣ由来の分化（培養）の１日目～９日目のオルガノイドの写真である。半透明の嚢胞構造が、実際の卵黄嚢構造と似ていることが確認された。

【0103】

原始線条ＨＳＣマーカーの発現の確認
図３において、原始造血幹細胞（原始ＨＳＣ）が実際に卵黄嚢オルガノイド内で生じるか否かを確認するために、オルガノイドを凍結させ、次いで切断して切片にし、断面図を解析した。分化の１４日目に、卵黄嚢オルガノイドを固定液で固定し、免疫細胞化学解析によって確認した。原始線条ＨＳＣマーカーＣＤ４１及びＣＤ２３５ａが内部で発現されたか否かを確認した。ミクログリアは原始線条ＨＳＣ及び最終的な線条ＨＳＣ（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅｓｔｒｅａｋＨＳＣ）の中の原始線条ＨＳＣに由来するので、原始線条ＨＳＣでは発現されるが最終的な線条ＨＳＣでは発現されないＣＤ２３５ａタンパク質の存在が、免疫細胞化学解析によって確認された。

【0104】

また、図４において、オルガノイドの断面図から、及びオルガノイドを単一細胞レベルまで刻むことによる接着培養後の解析から、免疫細胞化学解析によって、９０％より多くの細胞がＣＤ２３５ａを発現したことが確認された。分化の１４日目に、アクターゼを使用して卵黄嚢オルガノイドを単一細胞レベルまで刻み、次いで二次元的にプレーティングし、オルガノイドの内部の細胞の特性を解析した。

【0105】

ミクログリアマーカーの発現
分化（培養）の１４日目に、卵黄嚢オルガノイドのＲＮＡを収集し、ミクログリア分化の初期に発現された遺伝子マーカーの量をＲＴ－ＰＣＲ（ＣＤ２３５ａ；原始ＨＳＣ、ＣＤ３４；ＨＳＣ、ＰＵ．１；骨髄関連転写因子、ＴＲＥＭ２；ミクログリア強化タンパク質）によって確認した。

【0106】

図５に示されるように、対照群、胚性幹細胞（Ｈ９ｈＥＳＣ）及び他の細胞型（神経前駆細胞、ＮＰＣ：ｎｅｕｒａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ）と比較して、卵黄嚢オルガノイドで有意に高い量の遺伝子マーカーが発現されたことが観察された。これは、ミクログリア分化の初期の細胞がオルガノイド中で高度に濃縮されていることを示す。

【0107】

オルガノイドから排出された細胞の形状の変化の確認
分化（培養）の１０日目に、培地を、ミクログリアが卵黄嚢から流れ出て脳に侵入する環境を模倣する、Ｍ－ＣＳＦ及びＩＬ－３４を含むＮ２培地で置換した。培地を置換した時、細胞がオルガノイドから排出され始めた。培地を置換した２日後（１２日間の分化）、排出された細胞の形状は殆ど円形であったが、培地を交換した１１日後（２１日間の分化）、排出された細胞の形状はミクログリアのものと類似しており、伸長した分枝の形状を有したことが確認された［図６］。したがって、排出された細胞を収集し、ＰＬＯ／ラミニン被覆細胞培養皿に置いた時、図７に示される形状が得られる。

【0108】

図７は、２４日間分化（培養）したオルガノイドから排出されたミクログリアを収集し、細胞培養皿に付着させた後に撮影された写真である。左の明視野写真は細胞付着の翌日に撮影され、形状はミクログリアのものと非常に類似していた。６日後に、ミクログリアマーカーであるＩｂａ１の発現を、蛍光染色によって確認した。結果として、全細胞中のＩｂａＩ発現細胞の割合は約９０％であった。ミクログリアは、選別なしに高い純度で分化させることができた。

【0109】

分化（培養）の３２日目に排出されたミクログリア（上清、ｓｕｐ）及び卵黄嚢オルガノイドのそれぞれにおける成熟ミクログリアマーカー遺伝子（Ｉｂａ１；ミクログリア、ＣＤ１１ｂ；マクロファージ及びミクログリア、ＣＸ３ＣＲ１；ミクログリア強化タンパク質）の発現をｑＰＣＲによって確認した。結果として、成熟ミクログリアマーカー遺伝子は少なくとも４３倍高く、上清に排出された細胞において、卵黄嚢スフィアにおけるよりも最大で４４４倍高かったことが確認された［図８］。

【0110】

したがって、成熟ミクログリアが流れ出すことができ、形状はミクログリアのものに非常に類似しており、排出されたミクログリアは有意な量の成熟ミクログリア遺伝子マーカーを発現する。よって、卵黄嚢オルガノイドを調製し、排出された細胞を得る方法によって、ミクログリアをうまく得ることができることが示された。

【0111】

図９は、免疫細胞化学解析によって、３８日間分化（培養）した卵黄嚢オルガノイドの切断面を解析することによって得られた結果を説明する。細胞（ＤＡＰＩ）がオルガノイドの内部に存在しない嚢胞構造が存在し（実際は、卵黄嚢に類似した構造）、ミクログリア（Ｉｂａ１）がその周りに分布することが確認された。特に、Ｉｂａ１は殆ど、嚢胞の内部よりもむしろオルガノイドの表面に分布していた。このことから、卵黄嚢オルガノイドは、ミクログリアが卵黄嚢から流れ出る実際の組織の状況を同様に模倣することが示された。

【0112】

ミクログリア前駆細胞の発生
オルガノイドから排出された細胞に加えて、６ウェルプレートの接着培養中の細胞から増殖した新しいミクログリアを含む培養液もまた、２日毎に収集及び遠心分離して、ミクログリアを分離し、次いでＰＬＯ／ラミニン被覆６ウェルプレートに再びプレーティングした。分化（培養）の３０日目から、プレーティングされるミクログリアの数が急速に増加し始めた。図１０において、（１）：分化（培養）の２４日目に細胞培養皿にプレーティングされたオルガノイドから排出された細胞の写真；（２）：写真（１）と同じウェル中でさらに＋１１日間培養された時の写真；（３）：写真（１）と同じウェル中でさらに＋２９日間培養された時の写真（皿に付着している細胞及び浮遊細胞）；及び（４）：写真（３）の浮遊細胞を再び収集し、細胞培養皿にプレーティングすることによる、細胞の写真。

【0113】

分化（培養）の２４日目に卵黄嚢オルガノイドから細胞を収集した場合、９０％を超えるミクログリア純度が観察された。その他において、典型的なミクログリア形状を有する細胞に加えて、ミクログリア前駆細胞であると推定される細胞集団が観察された（図１０の写真（１））。これらの細胞は、ミクログリアよりも、より優れた増殖能を有する（図１０の写真（２））。約３０日後、そこに細胞の集団が形成され、集団を形成する細胞の形状は、ミクログリアのものと非常に類似していた。また、ミクログリアであると推定される細胞が培養液中に浮遊していた。これらの細胞を再び収集してプレーティングした場合、それらがミクログリアであることが確認された（図１０の写真（４））。

【0114】

優れた増殖能を有するミクログリア候補細胞集団は、オルガノイドから流れ出た直後には増殖しないが、ある一定期間の後には増殖する（約３０日間の分化）。ＩＢＡ１染色によって、分化の３１日目に、増殖性細胞がミクログリア前駆細胞である可能性が確認された（図１１の白色の矢印は増殖性細胞を示す）。顕微鏡下で、リアルタイムで細胞の増殖状況をモニタリングすることによって、増殖性細胞を同定した。

【0115】

免疫細胞化学解析によって、優れた増殖能を有する細胞及びミクログリアの両方が、ミクログリアの重要なマーカーであるＣＸ３ＣＲ１を発現したことが確認された（図１２の左；ミクログリア、図１２の右；増殖性細胞）。ＣＸ３ＣＲ１は、恒常的なミクログリアの代表的なマーカーである。これらの結果に基づいて、この増殖性細胞集団は、ミクログリア前駆細胞と推定された。

【0116】

ミクログリアとしての、調製された細胞の機能の確認
図１３は、アストロサイト単独で培養した場合又はアストロサイトとミクログリアとを共培養した場合に炎症反応マーカーによって毒性の刺激（ＬＰＳ）に対する応答を確認することによって得られた結果を説明する。アストロサイトが、ミクログリアと比較して、ＬＰＳ刺激を認識するＴＬＲ２、４のより弱い発現を有することが公知である。したがって、共培養の間に毒性の刺激に対するミクログリアの感受性に差があると予想されたので、実験は上述のように設計した。ミクログリアと共培養した場合に、炎症反応の重要なマーカーであるＴＮＦａの発現が減少し、抗炎症反応の主要なマーカーであるＩＬ－１０及びＡｒｇ１の発現が増加したことが観察された。対照群として、アストロサイトを単独で培養した。アストロサイトがミクログリアと共培養された場合、ＬＰＳ刺激下でのミクログリアの状態の変化の刺激によって、アストロサイトの毒性感受性が誘導されたことが観察された。したがって、ミクログリアが正常に機能することが確認された。

【0117】

蛍光ビーズを使用して、ミクログリアの食細胞活動が確認された。ミクログリアが多くの蛍光ビーズを貪食するのが観察された。したがって、ミクログリアが、ミクログリアの主要な機能である食作用を十分に誘導したことが確認された［図１４］。

【0118】

ｐＨｒｏｄｏ（商標）グリーン及びレッドアミン反応性標識を使用して、ミクログリアの食細胞活動を確認した。ｐＨｒｏｄｏ（ＰＦＦタンパク質に対して標識され、食作用により細胞に侵入する時に赤色になる物質）で細胞を処置した結果、ミクログリアが、アストロサイトと比較して、より早い時間でより多くの赤色を発現したことが観察された（図１５Ａ）。強度解析によって、細胞に蓄積したｐＨｒｏｄｏの量を定量化した結果、量がミクログリアでは３倍多かったことが確認された（図１５Ｂ）。

【0119】

ミクログリア凍結保存の可能性の確認
ミクログリアを－１９６℃で１００日間凍結保存し、次いで再び解凍し、増殖させた。結果として、７１．５％の細胞が生存していたことが確認された［図１６］。

【0120】

得られたミクログリア収率の確認
２１日目～３９日目に、オルガノイドから放出された細胞（ミクログリア＋ミクログリア前駆細胞）を２日毎に１回収集し、６ウェルプレートの１つのウェル（９．６ｃｍ^２）に付着させ、次いで各ウェル中で浮遊しているミクログリアを２日毎に１回再び採取し、測定した。結果を図１７に示す。（ミクログリア前駆細胞はウェルに付着しているので、浮遊している細胞のみの数を測定した。ミクログリアは、ミクログリア前駆細胞によって継続的に生じており、１つのウェルで数回採取できる。）１回に得ることができたミクログリアの数は、およそ３０日目に付着していたウェルで最大であり、細胞がウェルに付着するのが早い程、より多くの細胞が得られた。

【0121】

最初の細胞の数と比較して（２×１０^６個のｉＰＳ細胞で開始）、３０日目に成熟ミクログリアの数の５．５～６．５倍を得ることができ、４０日目までに蓄積した場合、採取されたミクログリアの総量は約５０倍の量で得ることができる。これは、従来技術と比較して、４倍（非特許文献１）及び３０～４０倍（非特許文献２）よりも多い。

【0122】

実際のヒト胎児ミクログリアとの遺伝子発現の比較解析
図１８は、非特許文献１によるヒト胎児ミクログリアの遺伝子発現データ（公衆データ）と本発明に従って得られたミクログリア（赤色の四角）及びＨ９胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の遺伝子発現データとの比較解析によって得られた結果を説明する。ヒートマップに示される全ての遺伝子は、ミクログリアのマーカーとして使用された遺伝子である。発明されたミクログリアが胎児ミクログリアのものと非常に類似した遺伝子発現パターンを示したことが確認された。

【図1】