特表 2023-511024 細胞形質導入のための容器及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-16

(54)【発明の名称】細胞形質導入のための容器及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20230309BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20230309BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20230309BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230309BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12N15/115 Z

C12N15/867 Z

C12N15/86 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022540704

(86)(22)【出願日】2020-12-29

(85)【翻訳文提出日】2022-07-27

(86)【国際出願番号】 US2020067282

(87)【国際公開番号】W WO2021138303

(87)【国際公開日】2021-07-08

(31)【優先権主張番号】62/954,735

(32)【優先日】2019-12-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500149223

【氏名又は名称】サン－ゴバン パフォーマンス プラスティックス コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】110003281

【氏名又は名称】弁理士法人大塚国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キャンベル、ケイティー

(72)【発明者】

【氏名】フェケーテ、ナタリー

(72)【発明者】

【氏名】ピテル、レイチェル、ゼット．

【テーマコード（参考）】

4B029

【Ｆターム（参考）】

4B029AA08

4B029BB11

4B029BB13

4B029GB09

(57)【要約】

本開示は、一般に、１つ又は２つ以上のアプタマー配列を含む表面を有する容器（バッグなど）に関する。より詳細には、本開示は、１つ又は２つ以上の生物学的薬剤に対して結合親和性を有するアプタマー配列に結合したフルオロポリマーを含むバッグなどの容器、及びそのような容器を使用する形質導入方法に関する。一態様では、本開示は、外面及び内面を有する容器（例えば、バッグ）を提供し、内面はフルオロポリマー；フルオロポリマーに結合した複数の官能基；及び官能基の少なくとも一部の各々に結合した、ウイルスベクターに対して結合親和性を有する第１のアプタマー配列を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

外面及び内面を有する容器（例えば、バッグ）であって、前記内面が、
フルオロポリマー；
前記フルオロポリマーに結合した複数の官能基；及び
前記官能基の少なくとも一部の各々に結合し、ウイルスベクターに対して結合親和性を有する第１のアプタマー配列
を含む、容器。

【請求項2】

内面が、官能基の一部に結合した、ＶＬＡ－４及びＶＬＡ－５から選択される細胞受容体に対して結合親和性を有する第２のアプタマー配列をさらに含む、請求項１に記載の容器。

【請求項3】

官能基の少なくとも一部の各々が、第１のアプタマー配列及び／又は第２のアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドに直接結合している、請求項１に記載の容器。

【請求項4】

官能基の少なくとも一部の各々が、第１のアプタマー配列又は第２のアプタマー配列の２つ以上のリピートを含むポリヌクレオチドに直接結合している、請求項１に記載の容器。

【請求項5】

ポリヌクレオチドが、第１のアプタマー配列及び第２のアプタマー配列のそれぞれの少なくとも１つのリピートを含む、請求項４に記載の容器。

【請求項6】

ポリヌクレオチドが、第１のアプタマー配列又は第２のアプタマー配列の少なくとも１０個、少なくとも１００個、又は少なくとも５００個のリピートを含む、請求項４に記載の容器。

【請求項7】

官能基の少なくとも一部の各々が、リンカーを介して、第１のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び第２のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに結合し、少なくとも１０個の前記オリゴヌクレオチドが前記リンカーの少なくとも一部の各々に結合している、請求項１に記載の容器。

【請求項8】

官能基が、
フルオロポリマーのエッチングの生成物；
反応種の存在下でのフルオロポリマーの活性化の生成物；又は
活性化フルオロポリマーの化学的な処理による生成物
である、請求項１に記載の容器。

【請求項9】

官能基が、カルボキシ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アミン基、イミン基、アミド基及びエステル基のうちの１つ又は２つ以上を含む、請求項１に記載の容器。

【請求項10】

官能基がアミン基を含む、請求項１に記載の容器。

【請求項11】

フルオロポリマーが、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、エチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、エチレンクロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、エチレンフッ素化エチレンプロピレン（ＥＦＥＰ）、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、変性ポリテトラフルオロエチレン（ＴＦＭ）、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）、又はそれらの任意の混合物である、請求項１に記載の容器。

【請求項12】

フルオロポリマーがフッ素化エチレンプロピレンである、請求項１に記載の容器。

【請求項13】

水性媒体、ウイルスベクター及び標的細胞を含む、請求項１に記載の容器。

【請求項14】

ウイルスベクターがレンチウイルス又はレトロウイルスを含み、標的細胞が１つ又は２つ以上のＶＬＡ－４又はＶＬＡ－５表面受容体を含む、請求項１３に記載の容器。

【請求項15】

請求項１に記載の容器に、ウイルスベクター及び標的細胞を含ませることを含む、形質導入方法。

【請求項16】

ウイルスベクターがレンチウイルス又はレトロウイルスを含み、標的細胞が１つ又は２つ以上のＶＬＡ－４又はＶＬＡ－５表面受容体を含む、請求項１５に記載の形質導入方法。

【請求項17】

第１の水性媒体中のウイルスベクターの懸濁液を容器に含ませること；
前記ウイルスベクターを含む前記容器を第１の期間にわたってインキュベートすること；
標的細胞を（例えば、第２の水性媒体中の懸濁液として）前記容器に加えること；
前記標的細胞及び前記ウイルスベクターを含む前記容器を第２の期間にわたってインキュベートすること；及び、次いで
形質導入された細胞を前記容器から回収すること
を含む、請求項１５に記載の形質導入方法。

【請求項18】

容器を第１の期間にわたってインキュベートした後、
第１の水性媒体の少なくとも一部を取り出すこと；次いで
洗浄媒体を前記容器に加えること；次いで
前記洗浄媒体の少なくとも一部を前記容器から取り出すこと；及び、次いで
標的細胞を前記容器に加えること
をさらに含む、請求項１７に記載の形質導入方法。

【請求項19】

形質導入された細胞を容器から回収することが、
細胞解離媒体を前記容器に加えること；及び、次いで
前記形質導入された細胞の懸濁液を前記容器から取り出すこと
を含む、請求項１７に記載の形質導入方法。

【請求項20】

第１の水性媒体中のウイルスベクターと標的細胞の懸濁液を容器に含めること；
前記標的細胞及び前記ウイルスベクターを含む前記容器を第１の期間にわたってインキュベートすること；及び、次いで
形質導入された細胞を前記容器から回収すること
を含む、請求項１５に記載の形質導入方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／９５４，７３５号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

開示の分野
本開示は、一般に、１つ又は２つ以上のアプタマー配列を含む表面を有する容器（バッグなど）に関する。より詳細には、本開示は、１つ又は２つ以上の生物学的薬剤に対して結合親和性を有するアプタマー配列に結合したフルオロポリマーを含むバッグなどの容器、及びそのような容器を使用する形質導入方法に関する。

【背景技術】

【0003】

形質導入、例えばウイルスベクターによって外来ＤＮＡを標的細胞に導入する方法は、いくつかの用途において重要である。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、患者から採取したＴ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子を形質導入によって導入するがん処置である。改変された細胞は、増殖及び患者への再導入後、がん細胞に結合して死滅させることができる。さらに、ウイルス形質導入は、基礎的な遺伝子研究において通常に使用されている。

【0004】

しかしながら、ウイルスベクターからの遺伝子導入は、造血細胞及び他の浮遊細胞などのある特定の細胞型にとって非効率であり得る。慣例的に、そのような系に対する形質導入効率は、ポリブレン、硫酸プロタミン又はレトロネクチンなどのエンハンサーの使用によって改善することができる。ポリブレン及び硫酸プロタミンは、標的細胞の表面特性を改変することによって形質導入効率を改善する。しかしながら、これらの種類のエンハンサーは、細胞生存率に悪影響を及ぼし得る。代替的に、レトロネクチン（ウイルス粒子に対して結合親和性を有するヘパリン結合ドメインと、ＶＬＡ－４及びＶＬＡ－５表面受容体に対して結合親和性を有する２つの細胞結合ドメインとを含むポリペプチド）は、ウイルスベクターと標的細胞との共局在化を促進することによって形質導入効率を改善することができる。

【0005】

慣例的に、レトロネクチンなどの形質導入エンハンサーを、形質導入プロセスの前に容器に手動でコーティングしなければならない。コーティングされた容器は特別な冷蔵を必要とし、貯蔵寿命が短いため、比較的高価で時間のかかるコーティングプロセスは、通常、プロセスの直前に、形質導入プロセスを実施するユーザによって実行されなければならない。

【0006】

したがって、細胞形質導入のための単純で、費用効果が高く、及び／又は時間効果の高い系が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

一態様では、本開示は、外面（outer surface）及び内面（inner surface）を有する容器（例えば、バッグの形態）を提供し、内面は、
フルオロポリマー；
フルオロポリマーに結合した複数の官能基；及び
官能基の少なくとも一部の各々に結合し、ウイルスベクターに対して結合親和性を有する第１のアプタマー配列
を含む。

【0008】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の容器（container）にウイルスベクター及び標的細胞を含めることを含む形質導入方法を提供する。

【0009】

本開示の他の態様は、本明細書の開示を考慮すると当業者には明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本開示の一実施形態によるバッグの概略上面図（上）及び断面図（下）である。

【0011】

【図2】本開示のある特定の実施形態によるバッグの概略上面図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

様々な態様では、本開示は、複数の官能基が結合したフルオロポリマーと、官能基の少なくとも一部の各々に結合した第１のアプタマー配列とを含む内面を有する容器に関する。本開示の容器を、いくつかの形態で提供することができる。１つの特に便利な形態は、例えば、本明細書に記載のフルオロポリマー材料の１つ又は２つ以上のシートから形成されるバッグである。当業者は、細胞培養で使用されるものなどのバッグ構造に精通しており、本明細書の記載に基づいて本開示のバッグ及び方法で使用するために従来のバッグ構造を適合させることができるであろう。当然のことながら、当業者は、本開示の容器をいくつかの他の形態、例えばフラスコ、チューブ、ディッシュで提供できることを理解するであろう。

【0013】

バッグの形態のそのような容器の一実施形態が、図１の概略上面図（上）及び断面図（下）に示されている。図１のバッグ１００は、外面１１２及び内面１１４を有するバッグ壁１１０を含み、バッグに媒体を加える又はバッグから媒体を取り出すためにバッグの両端に位置するポート１３０及び１４０をさらに含む。ポートの数及び位置は特に限定されず、したがって、例えば使用又は製造の便宜のために配置することができることを当業者は理解するであろう。バッグ１００は、区画１２０を形成するためにそれらの縁部で（例えば、レーザ溶接、コロナ放電、放射、熱又はメルトラミネーション、エッチング、プラズマ処理、ウェッティング、接着剤、又はそれらの組合せによって）、２つのフルオロポリマー含有シート（例えば、その内側表面にフッ素化エチレンプロピレンの層を有する２つのシート）を互いに接着した生成物であり得る。ポート１３０及び１４０は、密閉区画１２０を設けるために密閉可能であり得る。

【0014】

バッグ壁１１０は、その組成において均一であり得、又は、代替的に、２つ以上の異なるドメイン（例えば、２つ以上の層）を含み得る。例えば、２つのフルオロポリマーシートを互いに接着させ、次いで接着されたシートをコーティングすることにより、内面１１４とは組成が異なる外面１１２を設けることができる。同様に、２つの多層シートを互いに接着することにより、内面１１４とは組成が異なる外面１１２を設けることができる。多層シートは、フルオロポリマー材料及び非フッ素化ポリマー材料の両方から形成することができる。そのような場合、多層シートのうちの１つ又は２つ以上の内面にフルオロポリマー層を設けることができる。バッグ壁１１０の厚さ、区画１２０の容積、ならびにバッグ１００及び／又は区画１２０の形状は特に限定されず、使用又は製造の便宜のために、及び／又は特定の用途に適するように選択することができる。例えば、容器壁の厚さは、ある特定の実施形態では０．０００３インチ～０．２インチの範囲内であり得、区画の容積は、ある特定の実施形態では１００ｍＬ～１００Ｌの範囲内であり得る。

【0015】

図２は、本開示のバッグ及び方法での使用に適した培養バッグの構成のいくつかの例示的な実施形態を示す。バッグ２００ａは、区画２２０ａへのアクセスを提供する、単一のポート２３０ａのみを有する。バッグ２００ｂは、系を通るより長い経路長を提供することができる、いわゆる「蛇行」構成にあり、ポート２３０ｂ及び２４０ｂは、バッグを形成するシートの適切な溶接によって形成された蛇行形状区画２２０ｂによって形成された蛇行経路によって接続されている。また、バッグ２００ｃは非矩形形状を有し、ポート２３０ｃと２４０ｃとの間に対応する非矩形区画２２０ｃを有する。

【0016】

容器の壁のうちの１つ又は２つ以上は多孔質であり得、例えば、細胞培養で産生及び消費されるガス（例えば、Ｏ_２、ＣＯ_２）に対して透過性であり得るが、液体（例えば、水）に対して不透過性であり得る。これは、バッグ内の細胞の呼吸を可能にするために、容器壁を横切るガスの大気との受動的交換を可能にし得る。

【0017】

本開示の容器は、望ましくは、容器内の流体の汚染が実質的にないように形成される。したがって、容器の内面は、有機物を流体に浸出させない材料から形成されることが望ましい。例えば、本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器壁の内面は、水中で０．１ｍｇ／ｃｍ^２未満（例えば、０．０５ｍｇ／ｃｍ^２未満、又は０．０５ｍｇ／ｃｍ^２未満）の全有機体炭素（ＴＯＣ）を有するポリマー（例えば、フッ素化エチレンプロピレンなどのフルオロポリマー）から形成される。そのような容器は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１７８４９０号及び第２０１６／０１７８４９１号に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当業者は、本明細書の記載に基づいて、本開示の容器及び方法で使用するためにそのような容器を適合させることができる。

【0018】

本明細書で使用される場合、ＴＯＣは、例えば容器の内面のエリアからの抽出を含む本開示の系で用いられる容器について測定される（ｍｇ／ｃｍ^２として評価される結果は、内部面積の平方センチメートル当たりのＴＯＣである）。ＴＯＣは、米国薬局方（ＵＳＰ）６４３に従い、ＵＶ促進化学酸化（Ｕｌｔｒａ－Ｃｌｅａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ：第１巻：Ｕｌｔｒａ－Ｐｕｒｅ Ｗａｔｅｒ，Ｏｈｍｉ，Ｔａｄａｈｉｒｏ；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，４９７－５１７頁）の高温湿式酸化反応を利用する装置を用いて測定される。精製水を７０℃で２４時間、例えば、水１ｍＬに対して物品の表面積３ｃｍ^２の比でポリマーと接触させる。水をポリマーとの接触から取り出し、ＴＯＣ分析器で試験する。適切な機器は、ＴＥＫＭＡＲ ＤＯＨＲＭＡＮＮ Ｍｏｄｅｌ Ｐｈｏｅｎｉｘ ８０００ ＴＯＣ分析器である。

【0019】

上記のように、容器の内面は、フルオロポリマーに結合した複数の官能基を含む。例えば、内面のフルオロポリマーは、カルボキシ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アミン基、イミン基、アミド基、エステル基、無水物基、チオール基、ジスルフィド基、フェノール基、グアニジン基、チオエーテル基、インドール基、イミダゾール基、アミノエチルアミド基、アルキン基、アルケン基、アジリジン基、エポキシ基、イソニトリル基、イソシアニド基、テトラジン基、ジアゾニウム表面基、アルキン基、アルケン基、アジリジン基、エポキシ基、イソニトリル基、イソシアニド基、テトラジン基、アルキル基、アミノエチルアミド基、エステル基、又はそれらの任意の混合物で官能化されてもよい。例えば、ある特定のそのような実施形態では、官能基はアルデヒド基を含む。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、官能基は窒素含有基を含む。例えば、ある特定のそのような実施形態では、容器の内面は、複数のアミン基を含む。当業者は、これらの「官能基」が、アプタマー配列が結合している基として特定されることを理解するであろう。例えば、「アミン」官能基は、カルボキシを有するアプタマー配列に結合して、アプタマー配列にカルボキサミド結合を形成することができる。

【0020】

当業者は、官能基が多くの方法でフルオロポリマー表面にもたらされ得ることを理解するであろう。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の内面の官能基は、フルオロポリマーのエッチングの生成物である。例えば、ある特定のそのような実施形態では、エッチングは、化学エッチング、物理機械エッチング、又はプラズマエッチングを含む。例えば、ある特定の実施形態では、内面を構成する官能基は、フルオロポリマーの化学エッチングの生成物である。ある特定のそのような実施形態では、化学エッチングは、アンモニアナトリウム又はナフタレンナトリウムを用いたエッチングを含む。別の例では、ある特定の実施形態では、内面を構成する官能基は、物理機械エッチングの生成物である。ある特定のそのような実施形態では、物理機械エッチングは、シリカによるサンドブラスト又はエアアブレーションを含む。別の例では、内面を構成する官能基は、プラズマエッチングの生成物である。ある特定のそのような実施形態では、プラズマエッチングは、水素、酸素、アセチレン、メタン、及びそれらの窒素、アルゴン、及びヘリウムとの混合物などの反応性プラズマを用いたエッチングを含む。

【0021】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の内面の官能基は、反応種の存在下でのフルオロポリマーの活性化の生成物である。例えば、ある特定のそのような実施形態では、活性化はプラズマ活性化である。ある特定の実施形態では、プラズマ活性化は、例えばアルゴン、水素、窒素、二酸化炭素、酸素及びそれらの混合物などのガスでの処理によるフルオロポリマー上の反応種の形成を含む。ある特定の実施形態では、プラズマ活性化は、フルオロポリマーにラジカル及び／又は過酸化物を生成する。プラズマ活性化は、ある特定の実施形態では、０．１トル～０．６トルの範囲内、又は７００トル～７６０トルの範囲内の圧力で行うことができる。別の例では、ある特定のそのような実施形態では、活性化はコロナ活性化である。ある特定の実施形態では、コロナ活性化は、フルオロポリマー上に活性部位（例えば、反応種又はその後の化学処理の影響を受けやすい）を形成するための、例えばアルゴン、窒素、水素、及びそれらの混合物などのガス下でのフルオロポリマーの活性化を含む。ある特定の実施形態では、活性化（例えば、プラズマ活性化又はコロナ活性化）は、例えばケトン、アルコール、ｐ－クロロスチレン、アクリロニトリル、プロピレンジアミン、無水アンモニア、スチレンスルホン酸、四塩化炭素、テトラエチレンペンタミン、シクロヘキシルアミン、テトライソプロピルチタナート、デシルアミン、テトラヒドロフラン、ジエチルトリアミン、第三級ブチルアミン、エチレンジアミン、トルエン－２，４－ジイソシアナート、グリシジルメタクリラート、トリエチレンテトラミン、ヘキサン、トリエチルアミン、メチルアルコール、酢酸ビニル、メチルイソプロピルアミン、ビニルブチルエーテル、メチルメタクリラート、２－ビニルピロリドン、メチルビニルケトン、キシレン、又はそれらの混合物などの反応性炭化水素蒸気を含む。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、例えば、ブチレン、エチレン、グルタルアルデヒドなどから選択される重合可能な炭化水素蒸気を含む活性化（例えば、プラズマ活性化）は、フルオロポリマー上にコーティングされたポリマー（すなわち、本明細書に別途記載の官能基を含む）をもたらす。当業者は、ある特定の実施形態では、重合可能な炭化水素蒸気を含むプラズマ活性化（すなわち、プラズマ重合）が、比較的無秩序で高度に架橋されたポリマーコーティングをもたらすことができることを理解するであろう。

【0022】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の内面の官能基は、活性化フルオロポリマーを化学的に処理した生成物である。例えば、ある特定のそのような実施形態では、活性化フルオロポリマーは、フルオロポリマーのプラズマ活性化又はコロナ活性化の生成物である。ある特定のそのような実施形態では、化学処理は、例えば、グラフト重合、カップリング、クリックケミストリー、縮合、又は付加などの化学反応である。ある特定の実施形態では、化学処理は、ラジカル重合（例えば、フルオロポリマーのプラズマ活性化によって生成されるラジカルによって開始される）を介してビニルモノマーを重合することを含む、溶液中でのグラフト重合である。ある特定のそのような実施形態では、ビニルモノマーは、例えば、アクリル酸、（メタ）アクリラート、（メタ）アルキルアクリラート、スチレン、ジエン、アルファ－オレフィン、ハロゲン化アルケン、（メタ）アクリロニトリル、アクリルアミド、Ｎ－ビニルカルバゾール、Ｎ－ビニルピロリドン、及び無水マレイン酸から選択される。例えば、フルオロポリマー上でのアクリル酸モノマーのラジカル重合は、ある特定の実施形態では、カルボキシル基の高密度表面を実現することができる。ある特定の実施形態では、そのような重合生成物は、比較的秩序化することができる（例えば、プラズマ重合生成物と比較して）。

【0023】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の内面の官能基は、活性化フルオロポリマーをコーティングした生成物である。例えば、ある特定のそのような実施形態では、活性化フルオロポリマーは、フルオロポリマーのプラズマ活性化又はコロナ活性化の生成物である。ある特定のそのような実施形態では、コーティングは、湿式コーティング、粉末コーティング、又は化学蒸着である。ある特定の実施形態では、コーティングは、プラズマ強化化学気相成長又は開始剤を用いた化学気相成長である。

【0024】

上記のように、容器の内面は、ウイルスベクターに対して結合親和性を有する第１のアプタマー配列を含み、配列は官能基の少なくとも一部の各々に結合している（すなわち、本明細書に別途記載されるように、フルオロポリマーに結合している）。本明細書で使用される場合、「アプタマー配列」は、非共有的相互作用（例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、形状相補性）を介して１つ又は２つ以上の標的部位（例えば、ウイルスカプシド、細胞表面上など）に選択的に結合することができるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、アプタマー配列は、個々のオリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アプタマー配列の２つ以上のリピートはポリヌクレオチドを含む。

【0025】

本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」は、ヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列を標的細胞に導入することができるウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス）を含む。当業者は、そのようなウイルスの表面が、アプタマー配列が結合し得る１つ又は２つ以上の分子を含み得ることを理解するであろう。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、第１のアプタマー配列は、ウイルスベクターに対して少なくとも０．１ｎＭの結合親和性を有する。例えば、ある特定のそのような実施形態では、第１のアプタマー配列は、ウイルスベクターに対して、少なくとも０．２５ｎＭ、又は少なくとも０．５ｎＭ、０．７５ｎＭ、又は少なくとも１ｎＭ、又は少なくとも２．５ｎＭ、又は少なくとも５ｎＭ、又は少なくとも１０ｎＭ、又は少なくとも２５ｎＭ、又は少なくとも５０ｎＭ、又は少なくとも７５ｎＭ、又は少なくとも１００ｎＭの結合親和性を有する。当業者は、容器の内面へのウイルスベクターの望ましい程度の結合をもたらす結合親和性を選択することができる。

【0026】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の内面は、ＶＬＡ－４及びＶＬＡ－５から選択される細胞受容体（cell receptor）に対して結合親和性を有する第２のアプタマー配列をさらに含み、配列は官能基の一部（すなわち、本明細書に別途記載のように、フルオロポリマーに結合している）に結合している。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、第２のアプタマー配列は、細胞受容体に対して少なくとも０．１ｎＭの結合親和性を有する。例えば、ある特定のそのような実施形態では、第１のアプタマー配列は、細胞受容体に対して、少なくとも０．２５ｎＭ、又は少なくとも０．５ｎＭ、０．７５ｎＭ、又は少なくとも１ｎＭ、又は少なくとも２．５ｎＭ、又は少なくとも５ｎＭ、又は少なくとも１０ｎＭ、又は少なくとも２５ｎＭ、又は少なくとも５０ｎＭ、又は少なくとも７５ｎＭ、又は少なくとも１００ｎＭの結合親和性を有する。

【0027】

当業者は、そのようなアプタマー（すなわち、ウイルスベクターと標的の両方に対する）を、例えばＳＥＬＥＸ法などの一般的に公知の手順に従って調製することができることを理解するであろう。当業者は、容器の内面への所望の種類の細胞の望ましい程度の結合をもたらす結合親和性を選択することができる。

【0028】

第１のアプタマー配列と第２のアプタマー配列の両方を容器の内面に結合させることにより、ウイルスベクターと、ウイルスベクターで形質導入されることが望まれる細胞とを互いに近くに共配置することができ、それによって形質導入を単純化する。以下でより詳細に説明するように、アプタマー配列は別々のアプタマー分子で表面に別々に結合され得るか、又は他の実施形態では同じアプタマー分子で一緒にもたらされ得る。

【0029】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、第１のアプタマー配列は、少なくとも５塩基対の長さである。例えば、ある特定のそのような実施形態では、第１のアプタマー配列は、少なくとも１０、又は少なくとも１５、又は少なくとも２０、又は少なくとも２５、又は少なくとも３０塩基対の長さである。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、第２のアプタマー配列は、少なくとも５塩基対の長さである。例えば、ある特定のそのような実施形態では、第２のアプタマー配列は、少なくとも１０、又は少なくとも１５、又は少なくとも２０、又は少なくとも２５、又は少なくとも３０塩基対の長さである。

【0030】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、官能基の少なくとも一部の各々は、第１のアプタマー配列及び／又は第２のアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドに直接結合（すなわち、共有結合を介して）している。例えば、ある特定のそのような実施形態では、内面は複数のオリゴヌクレオチドを含み、それぞれが第１のアプタマー配列及び／又は第２のアプタマー配列を含み、それぞれが共有結合を介してフルオロポリマーの官能基に（例えば、アミン基に）結合している。ある特定のそのような実施形態では、各オリゴヌクレオチドは、第１のアプタマー配列を含むが、第２のアプタマー配列を含まない、第２のアプタマー配列を含むが、第１のアプタマー配列を含まない；又は第１のアプタマー配列と第２のアプタマー配列の両方を含む。例えば、ある特定のそのような実施形態では、内面は、第１の複数のオリゴヌクレオチド（それぞれが共有結合を介してフルオロポリマーの官能基に（例えば、アミン基に）それぞれ結合した第１のアプタマー配列を含む）を含み、第２の複数のオリゴヌクレオチド（それぞれが共有結合を介してフルオロポリマーの官能基に（例えば、アミン基に）それぞれ結合した第２のアプタマー配列をさらに含む）を含む。異なるオリゴヌクレオチドが第１及び第２のアプタマー配列に使用される場合、それらは同じ化学を使用して、又は異なる化学を使用してフルオロポリマーに結合することができる。他のそのような実施形態では、内面は複数のオリゴヌクレオチドを含み、それぞれが第１のアプタマー配列及び／又は第２のアプタマー配列を含み、それぞれが共有結合を介してフルオロポリマーの官能基に（例えば、アミン基に）結合している。

【0031】

他の実施形態では、非共有結合を使用して、例えば（ストレプト）アビジン／ビオチンなどの非共有結合会合を使用して、アプタマー配列を容器の内面に結合させることができる。

【0032】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の内面のオリゴヌクレオチド（例えば、第１のアプタマー配列及び／又は第２のアプタマー配列を含む）の平均濃度は、表面の平方ミクロン当たり少なくとも５０個のオリゴヌクレオチドである。例えば、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの平均濃度は、容器の内面の平方ミクロン当たり少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも７５０個、又は少なくとも１，０００個のオリゴヌクレオチドである。当業者は、所望の程度の形質導入を可能にするために、所望の程度のウイルスベクター及び細胞の結合をもたらすオリゴヌクレオチド濃度（複数可）を選択するであろう。

【0033】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、官能基の少なくとも一部の各々は、第１のアプタマー配列の２つ以上のリピートを含むポリヌクレオチドに直接結合している。例えば、ある特定のそのような実施形態では、内面は複数のポリヌクレオチドを含み、それぞれが第１のアプタマー配列の２つ以上のリピートを含み、それぞれが共有結合を介してフルオロポリマーの官能基に（例えば、アミン基に）結合している。ある特定のそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、第１のアプタマー配列の少なくとも１０個、又は少なくとも２５個、又は少なくとも５０個、又は少なくとも７５個、又は少なくとも１００個、又は少なくとも２００個、又は少なくとも３００個、又は少なくとも４００個、又は少なくとも５００個、又は少なくとも７５０個、又は少なくとも１０００個のリピートを含む。

【0034】

同様に、本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、官能基の一部の各々は、第２のアプタマー配列の２つ以上のリピートを含むポリヌクレオチドに直接結合している。例えば、ある特定のそのような実施形態では、内面は、第１の複数のポリヌクレオチド（それぞれが共有結合を介してフルオロポリマーの官能基に（例えば、アミン基に）それぞれ結合した第１のアプタマー配列の２つ以上のリピートを含む）を含み、第２の複数のポリヌクレオチド（それぞれが共有結合を介してフルオロポリマーの官能基に（例えば、アミン基に）それぞれ結合した第２のアプタマー配列の２つ以上のリピートを含む）をさらに含む。ある特定のそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、第１のアプタマー配列又は第２のアプタマー配列の少なくとも１０個、又は少なくとも２５個、又は少なくとも５０個、又は少なくとも７５個、又は少なくとも１００個、又は少なくとも２００個、又は少なくとも３００個、又は少なくとも４００個、又は少なくとも５００個、又は少なくとも７５０個、又は少なくとも１０００個のリピートを含む。

【0035】

所与のアプタマー配列の複数のリピートを含むポリヌクレオチドは、フルオロポリマーに（例えば、アミン基を介して）共有結合したヌクレオチドプライマーから始まって、所望のアプタマー配列に対応するテンプレートのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって作製することができる。

【0036】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、官能基の少なくとも一部の各々は、第１のアプタマー配列及び第２のアプタマー配列のそれぞれの少なくとも１つのリピートを含むポリヌクレオチドに直接結合している。例えば、ある特定のそのような実施形態では、ポリヌクレオチドは、フルオロポリマーに（例えば、アミン基を介して）共有結合したヌクレオチドプライマーから始まって、連続した第１のアプタマー配列及び第２のアプタマー配列に対応するテンプレートのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の産物である。ある特定のそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、第１のアプタマー配列及び第２のアプタマー配列の少なくとも１０個、又は少なくとも２５個、又は少なくとも５０個、又は少なくとも７５個、又は少なくとも１００個、又は少なくとも２００個、又は少なくとも３００個、又は少なくとも４００個、又は少なくとも５００個、又は少なくとも７５０個、又は少なくとも１０００個の総リピートを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のアプタマー配列及び第２のアプタマー配列の交互の一連のリピートを含む。当然のことながら、他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、連続した第１のアプタマー配列の２つ以上のリピートの１つ又は２つ以上のブロックと、連続した第２のアプタマー配列の２つ以上のリピートの１つ又は２つ以上のブロックとを含む。

【0037】

ある特定のそのような実施形態では、容器の内面を占めるポリヌクレオチド（例えば、第１のアプタマー配列及び／又は第２のアプタマー配列のリピートを含む）の平均濃度は、表面の平方ミクロン当たり少なくとも５０個のポリヌクレオチドである。例えば、ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドの平均濃度は、容器の内面の平方ミクロン当たり少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも７５０個、又は少なくとも１，０００個のポリゴヌクレオチドである。

【0038】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、官能基の少なくとも一部の各々は、第１のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドにリンカーを介して結合している。ある特定のそのような実施形態では、リンカーはポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む。例えば、ある特定の実施形態では、内面は、共有結合を介してフルオロポリマーの官能基に（例えば、アミン基に）結合した複数のリンカー（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を含み、各リンカーは、第１のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに結合している。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、官能基の一部の各々は、第２のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドにリンカーを介して結合している。例えば、ある特定のそのような実施形態では、内面は、共有結合を介してフルオロポリマーに（例えば、アミン基に）結合した第１の複数のリンカー（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）（各リンカーは、第１のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに結合している）を含み、共有結合を介してフルオロポリマーの官能基に（例えば、アミン基に）結合した第２の複数のリンカー（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）（各リンカーは、第２のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに結合している）をさらに含む。別の例では、ある特定のそのような実施形態では、内面は、共有結合を介してフルオロポリマーの官能基に（例えば、アミン基に）結合した複数のリンカー（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を含み、各リンカーは、第１のアプタマー配列及び第２のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド含む、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに結合している。リンカーは、例えば（ストレプト）アビジン／ビオチン相互作用によって、非共有結合的相互作用で使用することもできる。

【0039】

ある特定のそのような実施形態では、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド（例えば、第１のアプタマー配列及び／又は第２のアプタマー配列を含む）は、リンカーの少なくとも一部の各々に結合している。例えば、ある特定の実施形態では、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、又は少なくとも５０個のオリゴヌクレオチドは、リンカーの少なくとも一部の各々に結合している。

【0040】

ある特定のそのような実施形態では、容器の内面を占めるリンカー（例えば、それに結合した第１のアプタマー配列及び／又は第２のアプタマー配列を含む）の平均濃度は、表面の平方ミクロン当たり少なくとも５０個のリンカーである。例えば、ある特定の実施形態では、リンカーの平均濃度は、容器の内面の平方ミクロン当たり少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２５０個、少なくとも５００個、少なくとも７５０個、又は少なくとも１，０００個のリンカーである。

【0041】

様々なフルオロポリマーを本明細書に記載の容器の内面で使用することができる。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の内面は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、エチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、エチレンクロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、エチレンフッ素化エチレンプロピレン（ＥＦＥＰ）、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、変性ポリテトラフルオロエチレン（ＴＦＭ）、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）、又はそれらの任意の混合物から選択されるフルオロポリマーを含む。例えば、本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の内面はフッ素化エチレンプロピレンを含む。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の内面は、フルオロポリマー（例えば、フッ素化エチレンプロピレン）ならびにそれに結合した官能基及びアプタマー配列から本質的になる。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の内面のフルオロポリマー材料は、少なくとも０．０００３インチ、少なくとも０．０００４インチ、少なくとも０．０００５インチ、少なくとも０．０００６インチ、少なくとも０．００１インチ、又は少なくとも０．１０インチの厚さを有する。例えば、ある特定のそのような実施形態では、容器の内面を占める材料は、０．０００３インチ～０．２インチ、又は０．０００３インチ～０．１インチ、又は０．０００５インチ～０．０８インチ、又は０．００１インチ～０．０７インチ、又は０．００１インチ～０．０５インチ、又は０．００１インチ～０．０３インチ、又は０．００１インチ～０．０１８インチ、又は０．００１インチ～０．０１６インチ、又は０．００１インチ～０．０１４インチ、又は０．００１インチ～０．０１２インチの範囲内の厚さを有する。

【0042】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器壁を構成する材料は、その内面にフルオロポリマーの層を有し、その外面に別のポリマー材料（フルオロポリマー又は他のもの）の層を有する多層材料である。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の外面の材料は、少なくとも０．０００５インチ、又は少なくとも０．００１インチ、又は少なくとも０．００５インチ、又は少なくとも０．００７５インチ、又は少なくとも０．０１インチ、又は少なくとも０．０２インチ、又は少なくとも０．０３インチ、又は少なくとも０．０４インチ、又は少なくとも０．０５インチ、又は少なくとも０．０６インチ、又は少なくとも０．０７インチ、又は少なくとも０．０８インチ、又は少なくとも０．０９インチ、又は少なくとも０．１インチ、又は少なくとも０．１１インチの厚さを有する。例えば、ある特定のそのような実施形態では、容器の外面の材料は、０．０００５インチ～０．２インチ、又は０．００５インチ～０．１８インチ、又は０．０１インチ～０．１６インチ、又は０．０１インチ～０．１４インチ、又は０．０１インチ～０．１２インチ、又は０．０６インチ～０．１３インチ、又は０．０９インチ～０．１２６インチの範囲内の厚さを有する。

【0043】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器の外面はフルオロポリマー以外の材料を含む。例えば、ある特定のそのような実施形態では、容器の外面の材料は、熱可塑性ポリマー、熱可塑性エラストマー、シリコン、ゴム、又はそれらの任意の組合せを含む。あるいは、容器の外面は、本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、例えば内面のフルオロポリマー又は異なるフルオロポリマーなどのフルオロポリマーを含むことができる。ある特定のそのような実施形態では、内面及び外面（例えば、容器壁）の材料は、フルオロポリマー（例えば、フッ素化エチレンプロピレン）、ならびに内面に結合した官能基及びアプタマー配列から本質的になる。

【0044】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器は、水性媒体をさらに含む。水性媒体は、例えば、ウイルスベクター（例えば、本明細書に別途記載されるように）及び場合により標的細胞を含む細胞培養培地であり得る。本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、ウイルスベクターによる形質導入に感受性の細胞を含む。ある特定の実施形態では、標的細胞は、ＶＬＡ－４及びＶＬＡ－５表面受容体のうちの１つ又は２つ以上を含む。したがって、本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器はウイルスベクター（例えば、レンチウイルス又はレトロウイルスを含む）を含む。本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、容器は、標的細胞（例えば、ＶＬＡ－４及びＶＬＡ－５表面受容体のうちの１つ又は２つ以上を含む）を含む。

【0045】

有利には、本発明者らは、本明細書に記載の容器が、形質導入方法に関与するウイルスベクターと標的細胞との共局在化を容易にすることができ、望ましくは、形質導入を行う直前にユーザが手動コーティングプロセスを行う必要なしに、その効率を高めることができることを見つけた。したがって、本開示の別の態様は、本明細書に別途記載の容器にウイルスベクター及び標的細胞を含めることを含む形質導入方法である。ある特定のそのような実施形態では、容器は水性媒体（例えば、細胞培養培地）を含む。ある特定のそのような実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルス又はレトロウイルスを含む。ある特定のそのような実施形態では、標的細胞は、ＶＬＡ－４及びＶＬＡ－５表面受容体のうちの１つ又は２つ以上を含む。

【0046】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、形質導入方法は、容器内の第１の水性媒体中にウイルスベクターの懸濁液（例えば、ウイルスベクター上清）を含めること；及び、次いでウイルスベクターを含む容器を第１の期間にわたってインキュベートすることを含む。第１の期間は、ウイルスベクターの少なくとも一部と容器の内面の第１のアプタマー配列との会合を可能にするのに十分な任意の長さであり得る。例えば、ある特定の実施形態では、ウイルスベクターを含む容器を、例えば、３２～３７℃の範囲内の温度で、少なくとも１時間、又は少なくとも２時間、又は少なくとも３時間、又は少なくとも４時間、又は少なくとも５時間インキュベートする。第１の期間にわたってインキュベートした後、本方法は、標的細胞を（例えば、第２の水性媒体中の懸濁液として）容器に加えること；及び、次いで標的細胞及びウイルスベクターを含む容器を第２の期間にわたってインキュベートすることを含む。第２の期間は、標的細胞の少なくとも一部の形質導入を可能にするのに十分な任意の長さであり得る。例えば、ある特定の実施形態では、ウイルスベクター及び標的細胞を含む容器を、例えば、３５～３９℃の範囲内の温度で、少なくとも６時間、又は少なくとも１２時間、又は少なくとも１８時間、又は少なくとも１日間、又は少なくとも１．５日間、又は少なくとも２日間、又は少なくとも２．５日間インキュベートする。第２の期間インキュベートした後、本方法は、形質導入された細胞を容器から回収することを含む。

【0047】

ある特定のそのような実施形態では、方法は、容器を第１の期間にわたってインキュベートした後、第１の水性媒体の少なくとも一部を取り出すこと；次いで、洗浄媒体を容器に加えること；及び、次いで洗浄媒体の少なくとも一部を容器から取り出す（すなわち、標的細胞を容器に加える前に）ことをさらに含む。

【0048】

他の実施形態では、形質導入方法は、第１の水性媒体中のウイルスベクターと標的細胞の懸濁液（例えば、ウイルスベクター上清と標的細胞の混合物）を容器に含めること；及び、次いで標的細胞及びウイルスベクターを含む容器を第１の期間にわたってインキュベートすることを含む。第１の期間は、標的細胞の少なくとも一部の形質導入を可能にするのに十分な任意の長さであり得る。例えば、ある特定の実施形態では、ウイルスベクター及び標的細胞を含む容器を、例えば、３５～３９℃の範囲内の温度で、少なくとも６時間、又は少なくとも１２時間、又は少なくとも１８時間、又は少なくとも１日間、又は少なくとも１．５日間、又は少なくとも２日間、又は少なくとも２．５日間インキュベートする。第１の期間にわたってインキュベートした後、本方法は、形質導入された細胞を容器から回収することを含む。

【0049】

本明細書に別途記載のある特定の実施形態では、形質導入された細胞を回収することは、形質導入された細胞の懸濁液を容器から取り出すことを含む。ある特定の実施形態では、形質導入された細胞を回収することは、細胞解離媒体を容器に加えること（例えば、形質導入媒体の少なくとも一部を容器から取り出した後）、及び、次いで細胞解離媒体中の形質導入された細胞の懸濁液を容器から取り出すことを含む。細胞の解離は、標的細胞を容器の内面から放出することができる１つ又は２つ以上の解離剤を含むことができる。例えば、ある特定のそのような実施形態では、細胞解離媒体は、塩及びキレート剤（例えば、標的細胞への第２のアプタマー配列の結合を破壊することができる）のうちの１つ又は２つ以上を含む。別の例では、ある特定のそのような実施形態では、細胞解離媒体は、１つ又は２つ以上の制限酵素（例えば、第２のアプタマー配列を含むオリゴ－又はポリヌクレオチドを分解することができる）を含む。別の例では、ある特定のそのような実施形態では、細胞解離媒体は、第２のアプタマー配列に相補的なヌクレオチド配列（例えば、結合した標的細胞を第２のアプタマー配列から置き換えることができる）を含むオリゴ－又はポリヌクレオチドを含む。

【0050】

本開示の様々な態様及び実施形態は、論理的及び科学的に矛盾しない任意の数及び任意の組合せで組み合わされ得る、実施形態の以下の列挙されたリストによって提供される。
実施形態１．外面及び内面を有する容器（例えば、バッグ）であって、内面が、
フルオロポリマー；
フルオロポリマーに結合した複数の官能基；及び
官能基の少なくとも一部の各々に結合し、ウイルスベクターに対して結合親和性を有する第１のアプタマー配列
を含む、容器。
実施形態２．内面が、官能基の一部に結合した、ＶＬＡ－４及びＶＬＡ－５から選択される細胞受容体に対して結合親和性を有する第２のアプタマー配列をさらに含む、実施形態１に記載の容器。
実施形態３．官能基の少なくとも一部の各々が、第１のアプタマー配列及び／又は第２のアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドに直接結合している、実施形態１又は２に記載の容器。
実施形態４．官能基の少なくとも一部の各々が、第１のアプタマー配列又は第２のアプタマー配列の２つ以上のリピートを含むポリヌクレオチドに直接結合している、実施形態１又は２に記載の容器。
実施形態５．ポリヌクレオチドが、第１のアプタマー配列及び第２のアプタマー配列のそれぞれの少なくとも１つのリピートを含む、実施形態４に記載の容器。
実施形態６．ポリヌクレオチドが、第１のアプタマー配列又は第２のアプタマー配列の少なくとも１０個、少なくとも１００個、又は少なくとも５００個のリピートを含む、実施形態４又は５に記載の容器。
実施形態７．官能基の少なくとも一部の各々が、第１のアプタマー配列及び／又は第２のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドにリンカーを介して結合している、実施形態１又は２に記載の容器。
実施形態８．官能基の少なくとも一部の各々が、第１のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及び第２のアプタマー配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドにリンカーを介して結合している、実施形態７に記載の容器。
実施形態９．少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、又は少なくとも５０個のオリゴヌクレオチドが、リンカーの少なくとも一部の各々に結合している、実施形態７又は８に記載の容器。
実施形態１０．リンカーが、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む、実施形態７又は８に記載の容器。
実施形態１１．官能基が、フルオロポリマーのエッチングの生成物である、実施形態１から１０のいずれかに記載の容器。
実施形態１２．エッチングが、化学エッチング、物理機械エッチング、又はプラズマエッチングである、実施形態１１に記載の容器。
実施形態１３．官能基が、反応種の存在下でのフルオロポリマーの活性化の生成物である、実施形態１から１０のいずれかに記載の容器。
実施形態１４．活性化が、プラズマ活性化又はコロナ活性化であり；
反応種が、１つ又は２つ以上の反応性炭化水素蒸気を含む、
実施形態１３に記載の容器。
実施形態１５．活性化がプラズマ活性化であり；
反応種が、１つ又は２つ以上の重合可能な炭化水素蒸気（例えば、ブチレン、エチレン、及びグルタルアルデヒドから選択される）を含む、
実施形態１３に記載の容器。
実施形態１６．官能基が、活性化フルオロポリマーを化学的に処理した生成物である、実施形態１から１０のいずれかに記載の容器。
実施形態１７．活性化フルオロポリマーが、プラズマ活性化又はコロナ活性化の生成物であり；
化学処理が、グラフト重合、カップリング、クリックケミストリー、縮合、又は付加である、
実施形態１６に記載の容器。
実施形態１８．官能基が、活性化フルオロポリマーをコーティングした生成物である、実施形態１から１０のいずれかに記載の容器。
実施形態１９．活性化フルオロポリマーが、プラズマ活性化又はコロナ活性化の生成物であり；
コーティングが、湿式コーティング、粉末コーティング、又は化学蒸着である、
実施形態１８に記載の容器。
実施形態２０．官能基が、カルボキシ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アミン基、イミン基、アミド基、エステル基、無水物基、チオール基、ジスルフィド基、フェノール基、グアニジン基、チオエーテル基、インドール基、イミダゾール基、アミノエチルアミド基、アルキン基、アルケン基、アジリジン基、エポキシ基、イソニトリル基、イソシアニド基、テトラジン基、ジアゾニウム表面基、アルキン基、アルケン基、アジリジン基、エポキシ基、イソニトリル基、イソシアニド基、テトラジン基、アルキル基、アミノエチルアミド基、又はエステル基のうちの１つ又は２つ以上を含む、実施形態１から１９のいずれかに記載の容器。
実施形態２１．官能基が、カルボキシ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アミン基、イミン基、アミド基及びエステル基のうちの１つ又は２つ以上を含む、実施形態１から１９のいずれかに記載の容器。
実施形態２２：官能基がアミン基を含む、実施形態１から１９のいずれかに記載の容器。
実施形態２３．官能基の（例えば、オリゴマー、ポリヌクレオチド、又はリンカーへの）結合が共有結合である、実施形態１から２２のいずれかに記載の容器。
実施形態２４．フルオロポリマーが、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、エチレンテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、エチレンクロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、エチレンフッ素化エチレンプロピレン（ＥＦＥＰ）、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）、変性ポリテトラフルオロエチレン（ＴＦＭ）、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）、又はそれらの任意の混合物である、実施形態１から２３のいずれかに記載の容器。
実施形態２５．フルオロポリマーがフッ素化エチレンプロピレンである、実施形態１から２３のいずれかに記載の容器。
実施形態２６．フルオロポリマーが、水中で０．１ｍｇ／ｃｍ^２のＴＯＣを有する、実施形態１から２５のいずれかに記載の容器。
実施形態２７．ウイルスベクターが、レンチウイルス又はレトロウイルスを含む、実施形態１から２６のいずれかに記載の容器。
実施形態２８．水性媒体を含む、実施形態１から２７のいずれかに記載の容器。
実施形態２９．ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス又はレトロウイルスを含む）を含む、実施形態２８に記載の容器。
実施形態３０．標的細胞（例えば、ＶＬＡ－４及びＶＬＡ－５表面受容体のうちの１つ又は２つ以上を含む）を含む、実施形態２８又は２９に記載の容器。
実施形態３１．実施形態１から２９のいずれかに記載の容器に、ウイルスベクター及び標的細胞を含めることを含む、形質導入方法。
実施形態３２．ウイルスベクターが、レンチウイルス又はレトロウイルスを含む、実施形態３１に記載の形質導入方法。
実施形態３３．標的細胞が、１つ又は２つ以上のＶＬＡ－４又はＶＬＡ－５表面受容体を含む、実施形態３１又は３２に記載の形質導入方法。
実施形態３４．実施形態３１から３３のいずれかに記載の形質導入方法であって、
第１の水性媒体中のウイルスベクターの懸濁液を容器に含めること；
ウイルスベクターを含む容器を第１の期間にわたってインキュベートすること；
標的細胞を（例えば、第２の水性媒体中の懸濁液として）容器に加えること；
標的細胞及びウイルスベクターを含む容器を第２の期間にわたってインキュベートすること；及び、次いで
形質導入された細胞を容器から回収すること
を含む、方法。
実施形態３５．容器を第１の期間にわたってインキュベートした後、
第１の水性媒体の少なくとも一部を取り出すこと；次いで
洗浄媒体を容器に加えること；次いで
洗浄媒体の少なくとも一部を容器から取り出すこと；及び、次いで
標的細胞を容器に加えること
をさらに含む、実施形態３４に記載の形質導入方法。
実施形態３６．第１の水性媒体中のウイルスベクターと標的細胞の懸濁液を容器に含めること；
標的細胞及びウイルスベクターを含む容器を第１の期間にわたってインキュベートすること；及び、次いで
形質導入された細胞を容器から回収すること
を含む、実施形態３１から３３のいずれかに記載の形質導入方法。
実施形態３７．形質導入された細胞を容器から回収することが、
細胞解離媒体を容器に加えること；及び、次いで
形質導入された細胞の懸濁液を容器から取り出すこと
を含む、実施形態３１から３６のいずれかに記載の形質導入方法。
実施形態３８．細胞解離媒体が、塩及びキレート剤のうちの１つ又は２つ以上を含む、実施形態３７に記載の形質導入方法。
実施形態３９．細胞解離媒体が、１つ又は２つ以上の制限酵素を含む、実施形態３７に記載の形質導入方法。
実施形態４０．細胞解離媒体が、第２のアプタマー配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、オリゴ－又はポリヌクレオチドを含む、実施形態３７に記載の形質導入方法。
実施形態４１：容器がバッグの形態である、実施形態１から３９のいずれかに記載の容器又は方法。

【0051】

本明細書に示されている詳細は、例としてのものであり、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためのものにすぎず、本発明の様々な実施形態の原理及び概念的態様の最も有用で容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されている。これに関連して、本発明の基本的な理解のために必要なものよりも詳細に本発明の構造的詳細を示す試みはなされておらず、図面及び／又は例を用いた説明は、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具現化され得るかは当業者に明らかである。したがって、開示された方法及びデバイスが説明される以前に、本明細書に記載の態様は、特定の実施形態、装置、又は構成に限定されず、よって、当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様のみを説明する目的のためだけであり、本明細書で具体的に定義されない限り、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0052】

本発明を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様の指示対象は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内に入る各別個の値を個別に参照する簡略方法として役立つことを意図している。本明細書に別段の指示がない限り、各個々の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。各範囲の端点は、他方の端点に関しても、他方の端点とは無関係にも意味があることがさらに理解されよう。

【0053】

本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序のステップで実行することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的な言語（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、別途特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。

【0054】

文脈が明らかにそうでないことを要求しない限り、明細書及び特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの単語は、排他的又は網羅的な意味とは対照的に包括的な意味で解釈されるべきである；すなわち、「含むが、限定されない」という意味である。単数又は複数を使用する単語はまた、それぞれ複数及び単数を含む。さらに、「本明細書において」、「上に（ａｂｏｖｅ）」、及び「下に（ｂｅｌｏｗ）」という単語、ならびに同様の意味の単語は、本出願で使用される場合、本出願全体を指すものとし、本出願の任意の特定の部分を指すものではない。

【0055】

当業者によって理解されるように、本明細書に開示の各実施形態は、その特定の記載された要素、ステップ、成分又は構成要素を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり得る。本明細書で使用される場合、移行用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、含むが限定されないことを意味し、指定されていない要素、ステップ、成分、又は構成要素を、大量であっても含むことが可能である。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という移行句は、指定されていないいかなる要素、ステップ、成分及び構成要素も除外する。「から本質的になる」という移行句は、実施形態の範囲を、指定された要素、ステップ、成分又は構成要素、及び実施形態に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。

【0056】

反対のことが示されていない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、通常の丸め技術を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。

【0057】

本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の例に示される数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、任意の数値は、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含む。

【0058】

本明細書に開示される本発明の代替的な要素又は実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個々に、又はグループの他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素と任意に組み合わせて参照され、特許請求され得る。グループの１つ又は２つ以上のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由から、グループに含まれ得るか、又はグループから削除され得ることが予想される。そのような包含又は削除が生じる場合、本明細書は、改変されたグループを含み、したがって添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の記載を満たすとみなされる。

【0059】

本発明の実施に関して本発明者らに知られている最良の形態を含む、本発明のいくつかの実施形態を本明細書に記載する。当然のことながら、前述の説明を読めば、これらの記載された実施形態の変形が当業者には明らかになるであろう。本発明者は、当業者がそのような変形を適切に用いることを期待しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容される場合、添付の特許請求の範囲に列挙された主題のすべての改変物及び均等物を含む。さらに、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、そのすべての可能な変形における上述の要素の任意の組合せが本発明に包含される。

【0060】

本明細書全体を通して、特許及び印刷された刊行物がいくつか参照されている。引用された参考文献及び印刷された刊行物の各々は、その全体が参照により本明細書に個別に組み込まれる。

【0061】

さらに、本明細書に開示された本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることを理解されたい。用いられ得る他の改変は、本発明の範囲内である。したがって、限定ではなく例として、本明細書の教示に従って本発明の代替構成を利用することができる。したがって、本発明は、正確に図示及び説明されたものに限定されない。

【図1】

【図2】

【国際調査報告】