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特表2023-511025オルリスタット中間体の製造における酵素の用途及び製造方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-16

(54)【発明の名称】オルリスタット中間体の製造における酵素の用途及び製造方法

(51)【国際特許分類】

C12P 7/6436 20220101AFI20230309BHJP

C12N 9/04 20060101ALI20230309BHJP

C12P 7/04 20060101ALI20230309BHJP

【ＦＩ】

C12P7/6436

C12N9/04 ZNA

C12P7/04

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022541240

(86)(22)【出願日】2021-01-06

(85)【翻訳文提出日】2022-08-02

(86)【国際出願番号】 CN2021070495

(87)【国際公開番号】W WO2021139689

(87)【国際公開日】2021-07-15

(31)【優先権主張番号】202010015510.1

(32)【優先日】2020-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522108194

【氏名又は名称】植恩生物技術股▲ふん▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】徐天帥

(72)【発明者】

【氏名】▲ぐん▼ 大勇

(72)【発明者】

【氏名】肖玉梅

(72)【発明者】

【氏名】王章洪

(72)【発明者】

【氏名】黄治川

(72)【発明者】

【氏名】黄山

(72)【発明者】

【氏名】張磊

(72)【発明者】

【氏名】高 ▲しん▼

(72)【発明者】

【氏名】沈軍偉

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050CC07

4B050DD02

4B050KK08

4B050LL05

4B064AC02

4B064AD62

4B064AD64

4B064BJ01

4B064BJ04

4B064CA21

4B064DA01

(57)【要約】

（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエート系化合物の生合成方法である。当該方法は、ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素又はそれらの融合酵素、グルコース、ＮＡＤＰ^＋及び緩衝液においてβ－カルボニルテトラデカノエートを反応させて（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエート系化合物を得るものである。当該方法は、酵素触媒生合成方法であり、操作が簡単で、通常の装置を使用する環境配慮型プロセスである。生成物は純度が高く、収率が高く、ｅｅ値が高い。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オルリスタット中間体の製造における酵素の用途であって、前記酵素が作用する基質はβ－カルボニルテトラデカノエートであり、構造式は、式Ｉに示されるとおりであり、前記オルリスタット中間体は（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートであり、構造式は、式ＩＩに示されるとおりであり、構造式ＩのＲは、１～３個の炭素原子を含む飽和アルキル基を指し、構造式ＩＩのＲは、１～３個の炭素原子を含む飽和アルキル基を指し、

前記酵素はケト還元酵素又はケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素であり、前記ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号１及び／又は配列番号２、及び／又は配列番号４に示されるもの並びに同一性／相同性が８０％以上のアミノ酸配列であり、前記ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素のアミノ酸配列は配列番号８及び／又は配列番号９に示されるとおりである
ことを特徴とする前記用途。

【請求項2】

前記酵素は、ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素であり、且つ、前記融合酵素においてケト還元酵素とグルコース脱水素酵素はリンカーによって接続されており、任意選択で、前記リンカーのアミノ酸配列は配列番号５に示されるとおりである
ことを特徴とする請求項１に記載の用途。

【請求項3】

前記酵素は、ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素であり、ケト還元酵素－リンカー－グルコース脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素－リンカー－ケト還元酵素である
ことを特徴とする請求項２に記載の用途。

【請求項4】

前記グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号３に示されるとおりである
ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の用途。

【請求項5】

前記酵素は、酵素粉末及び／又は酵素液及び／又は固定化酵素である
ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の用途。

【請求項6】

構造式ＩのＲは、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基のいずれかであり、構造式ＩＩのＲは、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基のいずれかである
ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の用途。

【請求項7】

ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素であり、前記融合酵素のアミノ酸配列は配列番号８及び／又は配列番号９に示されるとおりである
ことを特徴とする融合酵素。

【請求項8】

前記融合酵素においてケト還元酵素とグルコース脱水素酵素はリンカーによって接続されており、任意選択で、前記リンカーのアミノ酸配列は配列番号５に示されるとおりである
ことを特徴とする請求項７に記載の融合酵素。

【請求項9】

前記融合酵素はケト還元酵素－リンカー－グルコース脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素－リンカー－ケト還元酵素であり、
任意選択で、前記ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号１及び／又は配列番号２、及び／又は配列番号４に示されるもの並びに同一性／相同性が８０％以上のアミノ酸配列であり、
任意選択で、前記グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号３に示されるとおりである
ことを特徴とする請求項７又は８に記載の融合酵素。

【請求項10】

ヌクレオチド配列が配列番号６又は配列番号７に示されるとおりであることを特徴とする請求項７～９のいずれか１項に記載の融合酵素をコードするためのヌクレオチド配列。

【請求項11】

配列番号３に示されるグルコース脱水素酵素の遺伝子断片の３’末端に配列番号５に示されるリンカー配列を挿入し、次に、配列番号４に示されるケト還元酵素の遺伝子断片を接続して、配列番号６に示されるヌクレオチド配列の組換えプラスミドを構成することを含む請求項１０に記載のヌクレオチド配列の構築方法。

【請求項12】

配列番号４に示されるケト還元酵素の遺伝子断片の３’末端に配列番号５に示されるリンカー配列を挿入し、次に、配列番号３に示されるグルコース脱水素酵素の遺伝子断片を接続して、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を構成することを含む請求項１０に記載のヌクレオチド配列の構築方法。

【請求項13】

構造式が式Ｉに示されるとおりである前記β－カルボニルテトラデカノエートである基質と、アミノ酸配列は配列番号１及び／又は配列番号２、及び／又は配列番号４に示されるもの並びに同一性／相同性が８０％以上のアミノ酸配列であるケト還元酵素、又はアミノ酸配列は配列番号８及び／又は配列番号９に示されるとおりであるケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素である酵素とを含み、

構造式ＩのＲは、１～３個の炭素原子を含む飽和アルキル基を指す
ことを特徴とする組成物。

【請求項14】

前記酵素と前記基質の質量比は、１：１．１～１５０である
ことを特徴とする請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記酵素と前記基質の質量比は、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１１０、１：１２０、１：１３０、１：１４０及び／又は１：１５０である
ことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

式Ｉに示される基質と、酵素と、グルコースと、グルコース脱水素酵素と、ＮＡＤＰ^＋と、緩衝液で構成され、ここで、前記酵素はケト還元酵素であり、前記ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号１及び／又は配列番号２、及び／又は配列番号４に示されるもの並びに同一性／相同性が８０％以上のアミノ酸配列であり、又は、式Ｉに示される基質と、酵素と、グルコースと、ＮＡＤＰ^＋と、緩衝液で構成され、ここで、前記酵素は、ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素であり、前記ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号１及び／又は配列番号２、及び／又は配列番号４に示されるもの並びに同一性／相同性が８０％以上のアミノ酸配列であり、前記ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素のアミノ酸配列は配列番号８及び／又は配列番号９に示されるとおりであり、

構造式ＩのＲは、１～３個の炭素原子を含む飽和アルキル基を指す
ことを特徴とする反応系。

【請求項17】

ｐＨが６．０～８．０であり、任意選択で、前記緩衝液はＰＢＳ緩衝液又はＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液である
ことを特徴とする請求項１６に記載の反応系。

【請求項18】

前記基質の濃度は、２０～１５０ｇ／Ｌである
ことを特徴とする請求項１６に記載の反応系。

【請求項19】

前記ＮＡＤＰ^＋の濃度は、０．１～０．５ｇ／Ｌである
ことを特徴とする請求項１６に記載の反応系。

【請求項20】

化合物Ｉと前記グルコースのモル比は、１：１．２～４である
ことを特徴とする請求項１６に記載の反応系。

【請求項21】

前記緩衝液の濃度は、０．０１～０．５ｍｏｌ／Ｌである
ことを特徴とする請求項１６に記載の反応系。

【請求項22】

前記反応系の反応時間は１５時間を超えず、反応液を得る
ことを特徴とする請求項１６に記載の反応系。

【請求項23】

前記反応系を２０～４０℃で撹拌しながら反応させて、前記オルリスタット中間体の反応液を得、前記オルリスタット中間体は（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートであり、構造式は、式ＩＩに示されるとおりであり、

構造式ＩＩのＲは、１～３個の炭素原子を含む飽和アルキル基を指す
ことを特徴とする請求項１６～２２のいずれか１項に記載の反応系でオルリスタット中間体を製造する方法。

【請求項24】

ＮａＯＨ水溶液をｐＨ調整剤として使用する
ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記反応時間は１５時間を超えない
ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

得られた反応液中の溶媒を用いて前記オルリスタット中間体を抽出する
ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。

【請求項27】

前記溶媒は、無水エタノール又は酢酸エチルである
ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。

【請求項28】

得られた抽出物を減圧濃縮し、冷却して結晶化させて、白色の結晶性固体である化合物ＩＩを得る請求項２７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオ医薬品と生化学技術の分野に属し、具体的には、（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエート系化合物の生合成方法に関する。

【背景技術】

【0002】

肥満治療薬は、主に、中枢神経系作用型減量薬と非中枢神経系作用型減量薬の２種類に分けられる。中枢神経系作用型減量薬の減量効果は明らかであるが、副作用が大きいため、臨床上の使用が制限されている。その中で、フェンフルラミンは肺高血圧症と肥大型心臓弁膜症を引き起こす可能性があるため、１９９７年に市場から撤退した。シブトラミンは深刻な心血管疾患リスクをもたらす可能性があるため、２０１０年に国家食品薬品監督管理局から生産、販売と使用の中止を命じられた。ロルカセリン（ｌｏｃａｓｅｒｉｎ、商品名Ｂｅｌｖｉｑ）は２０１２年６月にアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって販売が承認されたが、心臓弁膜症と心血管系有害事象をもたらすリスクがあるため、臨床上の使用に向け安全性の検証が必要である。

【0003】

オルリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）は最初の非中枢神経系作用型減量薬で、現在、世界で唯一のＯＴＣ減量薬である。１９９８年に発売されて以来、有効性が確実で安全性が高いことから、肥満治療の第一選択薬となっている。オルリスタットは消化管の脂肪加水分解酵素に直接作用し、明らかな脂肪吸収阻害効果を有し、その標的は非常に特異的で、他の消化酵素に影響を与えず、しかも効果を発揮させるに全身に吸収される必要がなく、全身薬物曝露量が非常に低く、主な副作用は消化管反応であり、安全性が高い。オルリスタットは２０年以上にわたって世界的に販売されており、現在１４５か国以上で販売が承認され、多くの臨床応用によってその優れた有効性と安全性が検証されている。

【0004】

オルリスタットの市場需要は大きいため、オルリスタット及びその中間体の効率的な合成方法を見つけるのは非常に重要である。（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートはオルリスタットを合成する重要な中間体で、当該中間体の光学純度は極めて重要な指標である。では、どうすれば光学的に純粋な（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートを効率的に得られるのか。

【0005】

中国特許ＣＮ１０１５３８２８５Ｂには、調製された（Ｒ）－金属触媒［（Ｒ）－Ｒｕ（ＭｅＯＢＩＰＨＥＰ）Ｃｌ_２］_２・ＮＥｔ_３によって触媒される不斉水素化が開示されている。しかし、当該化学触媒反応でｅｅ値が９８．５％を超える生成物を得るには強酸と６０ｂａｒの高圧下において反応させる必要がある。当該方法には次のいくつかの欠点がある。１）高価な（Ｒ）－配位子と貴金属触媒の使用が必要である。２）触媒は直前に調製する必要があり、プロセスの安定性を保証しにくい。３）高圧水素化装置が必要である。４）耐酸性装置が必要である。５）反応制御が不十分だとｅｅ値に影響する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明者らは、先行技術の上記の欠点に対し、酵素法を利用して系統的な改良を行って、オルリスタットの重要中間体の大規模な生産を実現した。

【課題を解決するための手段】

【0007】

そこで、本発明の第１の目的は、オルリスタット中間体の製造における酵素の新規な用途を提供することであり、当該酵素は基質β－カルボニルテトラデカノエートに効果的に作用するため、純度の高いオルリスタット中間体を製造することができる。

【0008】

上記の目的を達成するための本発明の技術的解決策は次のとおりである。
オルリスタット中間体（最終生成物）の製造における酵素の用途であって、前記酵素が作用する基質はβ－カルボニルテトラデカノエート（原料）であり、構造式は、式Ｉに示されるとおりである。前記オルリスタット中間体は（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートであり、構造式は、式ＩＩに示されるとおりである。構造式ＩのＲは、１～３個の炭素原子を含む飽和アルキル基を指し、構造式ＩＩのＲは、１～３個の炭素原子を含む飽和アルキル基を指す。

【0009】

前記酵素はケト還元酵素であり、前記酵素のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるもの及び相同性が９０％を超えるアミノ酸配列であり、Ｓｉｎｇｕｌｉｓｐｈａｅｒａａｃｉｄｉｐｈｉｌａに由来し、ＮＣＢＩデータベースの登録番号はＷＰ＿０１５２４５４０３．１であり、短鎖脱水素酵素ファミリーに属し、及び／又は、配列番号２に示されるもの及び相同性が９０％を超えるアミノ酸配列であり、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｅｃｈｉｎｏｉｄｅｓに由来し、ＮＣＢＩデータベースの登録番号はＷＰ＿０１０４０３６４０．１であり、短鎖脱水素酵素ファミリーに属する。及び／又は、配列番号４に示されるもの及び同一性が８０％以上のアミノ酸配列であり、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓに由来し、ＮＣＢＩデータベースの登録番号はＥＧＵ１２８３７．１であるタンパク質の短縮型であり、短鎖脱水素酵素ファミリーに属する。又は、前記酵素は、ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素であり、前記融合酵素のアミノ酸配列は配列番号８及び／又は配列番号９に示されるとおりである。本発明者らは、驚くべきことに、天然型又は遺伝子／タンパク質工学操作を経た前記酵素は前記基質に対して優れた触媒効果を有し、光学純度の高い前記最終生成物を得るという事実を見出した。

【0010】

さらに、配列番号１及び／又は配列番号２との同一性／相同性が９０％以上、配列番号４との同一性／相同性が８０％以上、配列番号８及び／又は配列番号９の酵素もオルリスタット中間体の製造に使用することができる。

【0011】

さらに、前記ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素において、ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素はリンカーによって接続されている。
さらに、前記リンカーのアミノ酸配列は配列番号５に示されるとおりである。

【0012】

さらに、前記ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素はケト還元酵素－リンカー－グルコース脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素－リンカー－ケト還元酵素である。任意選択で、前記グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は、配列番号３に示されるとおりである。

【0013】

さらに、前記酵素は、いずれも、酵素粉末及び／又は酵素液及び／又は固定化酵素である。

【0014】

さらに、構造式ＩのＲは、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基のいずれかであり、構造式ＩＩのＲは、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基のいずれかである。

【0015】

本発明の第２の目的は、融合酵素を提供することであり、前記融合酵素はケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素であり、前記融合酵素のアミノ酸配列は配列番号８及び／又は配列番号９に示されるとおりである。

【0016】

さらに、前記融合酵素においてケト還元酵素とグルコース脱水素酵素はリンカーによって接続されている。任意選択で、前記リンカーのアミノ酸配列は配列番号５に示されるとおりである。

【0017】

さらに、前記融合酵素はケト還元酵素－リンカー－グルコース脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素－リンカー－ケト還元酵素である。
任意選択で、前記ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号１及び／又は配列番号２、及び／又は配列番号４に示されるもの並びに同一性／相同性が８０％以上のアミノ酸配列である。
任意選択で、前記グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は、配列番号３に示されるとおりである。

【0018】

本発明の第３の目的は、いずれの前記融合酵素をコードするヌクレオチド配列及びその構築方法を提供することである。

【0019】

前記融合酵素のヌクレオチド配列は配列番号６又は配列番号７に示されるとおりである。

【0020】

さらに、前記ヌクレオチド配列の構築方法は、配列番号３に示されるグルコース脱水素酵素の遺伝子断片の３’末端に配列番号５に示されるリンカー配列を挿入し、次に、配列番号４に示されるケト還元酵素の遺伝子断片を接続して、配列番号６に示されるヌクレオチド配列の組換えプラスミドを構成することを含む。

【0021】

さらに、前記融合酵素の配列番号６のヌクレオチド配列を両端の制限酵素切断部位ＮｄｅＩとＸｈｏＩによってベクターｐＥＴ２８ａに接続させて、二重酵素融合発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｇ３７９０を構成し、その後、大腸菌に導入してスクリーニング、接種、培養を経て菌体を得る。菌体を破砕、遠心分離して粗酵素液を得、粗酵素液を凍結乾燥して酵素粉末を得る。

【0022】

さらに、前記ヌクレオチド配列の構築方法は、配列番号４に示されるケト還元酵素の遺伝子断片の３’末端に配列番号５に示されるリンカー配列を挿入し、次に、配列番号３に示されるグルコース脱水素酵素の遺伝子断片を接続して、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を構成することを含む。

【0023】

さらに、前記融合酵素の配列番号７のヌクレオチド配列を両端の制限酵素切断部位ＮｄｅＩとＸｈｏＩによってベクターｐＥＴ２８ａに接続させて、二重酵素融合発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｇ３７９０を構成し、その後、大腸菌に導入してスクリーニング、接種、培養を経て菌体を得る。菌体を破砕、遠心分離して粗酵素液を得、粗酵素液を凍結乾燥して酵素粉末を得る。

【0024】

本発明の第４の目的は、組成物を提供することであり、当該組成物において両者が酵素と基質の協調的関係を形成しており、構造式ＩＩに示される生成物を得る。

【0025】

上記の目的を達成するための本発明の技術的解決策は次のとおりである。
前記酵素のいずれかと基質とを含む組成物であって、前記基質は前記β－カルボニルテトラデカノエートである。前記β－カルボニルテトラデカノエートの構造式は式Ｉに示されるとおりである。前記酵素はケト還元酵素又はケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素であり、前記ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号１及び／又は配列番号２、及び／又は配列番号４に示されるもの並びに同一性／相同性が８０％以上のアミノ酸配列である。前記融合酵素のアミノ酸配列は配列番号８及び／又は配列番号９に示されるとおりである。

構造式ＩのＲは、１～３個の炭素原子を含む飽和アルキル基を指す。

【0026】

【0027】

さらに、前記融合酵素は、ケト還元酵素－リンカー－グルコース脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素－リンカー－ケト還元酵素である。

【0028】

さらに、前記グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は、配列番号３に示されるとおりである。

【0029】

さらに、前記酵素は、酵素粉末及び／又は酵素液及び／又は固定化酵素である。

【0030】

【0031】

さらに、前記組成物において、前記酵素と前記基質の質量比は、１：１．１～１５０である。

【0032】

好ましくは、前記組成物において、前記酵素と前記基質の質量比は、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１１０、１：１２０、１：１３０、１：１４０及び／又は１：１５０である。

【0033】

本発明の第５の目的は、（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートを製造するための反応系を提供することであり、当該反応系では高温高圧の過酷な条件に頼らなくても（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートを得ることができる。

【0034】

上記の目的を達成するための本発明の技術的解決策は次のとおりである。
前記反応系は式Ｉに示される基質と、酵素と、グルコースと、グルコース脱水素酵素と、ＮＡＤＰ^＋と、緩衝液で構成される。ここで、前記酵素はケト還元酵素であり、前記ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号１及び／又は配列番号２、及び／又は配列番号４に示されるもの並びに同一性／相同性が８０％以上のアミノ酸配列である。又は、前記反応系は式Ｉに示される基質と、酵素と、グルコースと、ＮＡＤＰ^＋と、緩衝液で構成される。ここで、前記酵素は、ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素であり、前記ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号１及び／又は配列番号２、及び／又は配列番号４に示されるもの並びに同一性／相同性が８０％以上のアミノ酸配列である。前記ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素のアミノ酸配列は、配列番号８及び／又は配列番号９に示されるとおりである。

構造式ＩのＲは、１～３個の炭素原子を含む飽和アルキル基を指す。

【0035】

さらに、前記グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は、配列番号３に示されるとおりである。さらに、前記融合酵素においてケト還元酵素とグルコース脱水素酵素はリンカーによって接続されている。任意選択で、前記リンカーのアミノ酸配列は、配列番号５に示されるとおりである。

【0036】

さらに、前記融合酵素は、ケト還元酵素－リンカー－グルコース脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素－リンカー－ケト還元酵素である。

【0037】

さらに、前記グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は、配列番号３に示されるとおりである。

【0038】

さらに、前記酵素は、酵素粉末及び／又は酵素液及び／又は固定化酵素である。

【0039】

【0040】

さらに、前記反応系のｐＨは６．０～８．０である。

【0041】

さらに、前記反応系において、前記緩衝液は、ＰＢＳ緩衝液又はＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液である。

【0042】

さらに、前記反応系において、前記基質の濃度は、２０～１５０ｇ／Ｌである。

【0043】

さらに、前記反応系は、前記ＮＡＤＰ^＋の濃度が０．１～０．５ｇ／Ｌであることを特徴とする。

【0044】

さらに、前記反応系において、構造式が式Ｉに示される化合物と前記グルコースのモル比は、１：１．２～４である。

【0045】

さらに、前記反応系において、前記緩衝液の濃度は、０．０１～０．５ｍｏｌ／Ｌである。

【0046】

さらに、前記反応系の反応時間は１５時間を超えず、反応液を得る。

【0047】

本発明の第６の目的は、オルリスタット中間体の製造方法を提供することであり、当該方法は産業上の大規模生産に適する。

【0048】

（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートの生合成方法であって、反応式は次のとおりである。

化合物Ｉ及び化合物ＩＩのＲは１～３個の炭素原子を含む飽和アルキル基を指し、好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基である。
前記生合成方法は、ケト還元酵素、グルコース、グルコース脱水素酵素及びＮＡＤＰ^＋中で、又は、ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素、グルコース及びＮＡＤＰ^＋中で、化合物Ｉを反応させて、化合物ＩＩを得ることを含む。

【0049】

本発明の実施形態において、前記生合成方法は次のステップを含む。化合物Ｉを緩衝液に加え、さらにケト還元酵素又はケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素と、グルコース、グルコース脱水素酵素（ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素を加える場合は、グルコース脱水素酵素を加える必要はない）と、ＮＡＤＰ^＋とを加えて、混合溶液を得、前記混合溶液を２０～４０℃で撹拌しながら反応させ、全過程においてＮａＯＨ水溶液でｐＨを調整し、液体クロマトグラフィーを利用して反応の転化率をモニターする。転化率が９９％以上になったら反応を終了させ、抽出溶媒を加えて抽出し、有機相を合わせて減圧濃縮し、冷却して結晶化させて、白色固体生成物である化合物ＩＩを析出させる。任意選択で、さらに、ｎ－ヘキサンで再結晶させて純度のより高い生成物を得る。

【0050】

本発明のいくつかの実施形態において、前記ＮａＯＨ水溶液の濃度は２Ｍであってもよい。

【0051】

本発明のいくつかの実施形態において、前記緩衝液のｐＨは６．０～８．０である。好ましくは、前記緩衝液は、ＰＢＳ（即ちリン酸塩）緩衝液又はＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液であり、より好ましくは、前記緩衝液は、濃度が０．０１～０．５ｍｏｌ／ＬのＰＢＳリン酸緩衝液又は０．０１～０．５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液である。

【0052】

本発明の実施形態において、前記反応の過程でｐＨを７．０～７．５の範囲に限定する。

【0053】

本発明の実施形態において、前記ケト還元酵素のアミノ酸配列は、本願の配列番号１、配列番号２及び配列番号４に示されるとおりである。前記ケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素のアミノ酸配列は、配列番号８及び／又は配列番号９に示されるとおりである。前記ケト還元酵素又はケト還元酵素とグルコース脱水素酵素の融合酵素の形態は、酵素粉末、酵素液、又は固定化酵素であってもよい。前記グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は、本願の配列番号３に示されるとおりであり、前記グルコース脱水素酵素の形態は、酵素粉末、酵素液、又は固定化酵素であってもよい。

【0054】

本発明の実施形態において、前記ＮＡＤＰ^＋はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を指し、即ち還元型補酵素ＩＩ（ＮＡＤＰＨ）の酸化型である。前記混合溶液中のＮＡＤＰ^＋の濃度は、０．１～０．５ｇ／Ｌである。

【0055】

本発明の実施形態において、前記混合溶液中の化合物Ｉの濃度は、２０～１５０ｇ／Ｌである。

【0056】

本発明の実施形態において、前記混合溶液中の化合物Ｉとグルコースのモル比は、１：１．２～４である。

【0057】

本発明のいくつかの実施形態において、好ましくは、前記反応の温度を３５℃に維持する。

【0058】

本発明のいくつかの実施形態において、前記抽出溶媒で２回抽出する。前記抽出溶媒は、無水エタノール又は酢酸エチルである。

【0059】

前記技術的解決策の内容をまとめると、次のとおりになる。
前記反応系においてオルリスタット中間体を製造する方法であって、前記反応系を２０～４０℃で撹拌しながら反応させて、前記オルリスタット中間体の反応液を得、前記オルリスタット中間体は（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートであり、構造式は、式ＩＩに示されるとおりである

【0060】

さらに、前記方法では、ＮａＯＨ水溶液をｐＨ調整剤として使用する。

【0061】

さらに、前記方法では、前記反応時間は１５時間を超えない。

【0062】

さらに、前記方法では、得られた反応液中の溶媒を用いて前記オルリスタット中間体を抽出する。

【0063】

さらに、前記方法では、前記溶媒は、無水エタノール又は酢酸エチルである。

【0064】

さらに、前記方法では、得られた抽出物を減圧濃縮し、冷却して結晶化させて、白色の結晶性固体である化合物ＩＩを得る。

【0065】

前記オルリスタット中間体から製造されるオルリスタットである。

【発明の効果】

【0066】

本発明の有益な効果は次のとおりである。
本発明で使用する前記酵素が耐えることができる基質濃度は１５０ｇ／Ｌに達しており、酵素活性は基質又は生成物によって阻害されない。

【0067】

本発明のオルリスタット中間体の製造方法は酵素法であり、当該方法は条件が穏やかで、高度な装置を必要とせず、実行しやすい。また、当該方法では排ガス・廃水・固形廃棄物の発生量が少なく、重金属汚染が生じず、環境配慮型プロセスであるため、工業的生産にも有利である。

【0068】

本発明において酵素触媒プロセスの転化率は９９％以上と高く、キラルｅｅ値は９９％以上に達しており、１５時間以内に反応が完了し、生成物の濃度が高く、また、基質がほぼ完全に転化するため反応液の後処理ステップの簡素化が可能となり、簡単な抽出・結晶化ステップだけで純度の高い生成物が得られるため、コストが大幅に削減される。

【図面の簡単な説明】

【0069】

【図1】図１は実施例５で測定された転化率のＨＰＬＣクロマトグラムである。

【図2】図２は実施例５の生成物の純度のＨＰＬＣクロマトグラムである。

【図3】図３は実施例５の生成物のキラル純度のＨＰＬＣクロマトグラムである。

【図4】図４は融合酵素Ｇ３７９０発現プラスミドのプラスミドマップである。

【図5】図５は融合酵素３７９０Ｇ発現プラスミドのプラスミドマップである。

【図6】図６はＧ３７９０融合酵素タンパク質バンドである。

【図7】図７は３７９０Ｇ融合酵素タンパク質バンドである。

【発明を実施するための形態】

【0070】

実施例を挙げるのは本発明の一層の説明のためであり、本発明の内容が実施例に限定されるわけではない。したがって、当業者が上記の発明の概要に従って実施形態に本質的でない改良と調整を行う場合、そのいずれも本発明の保護範囲に含まれる。

【0071】

本発明は、β－カルボニルテトラデカノエートが酵素の触媒作用で（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートに還元されることに関し、反応式は次のとおりである。

補酵素ＮＡＤＰ^＋と、グルコースと、グルコース脱水素酵素とを含む環境において、特定の酵素の触媒効果により、基質β－カルボニルテトラデカノエートからキラル純度の非常に高い（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートを得る。触媒酵素は一般に短鎖脱水素酵素ファミリーのもので、例えば、本発明の実施例の様々なケト還元酵素である。異なる酵素の融合酵素であってもよく、例えば、本発明のいくつかの実施例の還元酵素とグルコース脱水素酵素が融合した融合酵素である。なお、グルコース脱水素酵素の作用でグルコースが脱水素化してＨ^＋を放出し、その後、補酵素ＮＡＤＰ^＋がＨ^＋を取得し、β－カルボニルテトラデカノエートの還元反応に加わることで、β－ヒドロキシテトラデカノエートを得る。

【0072】

本発明のケト還元酵素ＪＲ３７８９はＳｉｎｇｕｌｉｓｐｈａｅｒａａｃｉｄｉｐｈｉｌａに由来し、ＮＣＢＩデータベースの登録番号はＷＰ＿０１５２４５４０３．１であり、短鎖脱水素酵素ファミリーに属し、当該ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号１に示され、サイズは２４９のアミノ酸である。

【0073】

アミノ酸配列の配列番号１は次のとおりである。
ＭＧＫＬＤＮＫＶＡＶＩＴＧＧＮＳＧＭＧＬＡＴＡＱＲＦＶＳＥＧＡＹＶＦＩＴＧＲＲＱＡＥＬＤＫＡＶＤＬＩＧＫＮＶＴＧＶＱＧＤＶＳＮＬＡＤＬＤＲＬＹＡＴＶＫＥＱＫＧＲＶＤＶＬＦＡＮＡＧＶＧＥＬＡＰＬＧＳＩＴＥＥＱＦＤＫＶＦＮＩＮＶＲＧＬＬＦＴＶＱＫＡＬＰＬＦＱＤＧＧＳＩＩＬＮＡＳＩＡＳＩＫＧＭＰＡＦＳＶＹＳＡＳＫＡＡＶＲＳＦＡＲＳＷＴＶＤＬＫＧＲＫＩＲＩＮＴＬＳＰＧＰＩＤＴＰＩＬＳＧＬＡＳＴＥＥＥＬＫＱＶＫＡＤＬＡＡＱＶＰＬＧＲＭＧＴＳＤＥＩＡＮＶＡＬＦＬＡＳＤＤＳＳＹＶＴＧＩＥＬＦＶＤＧＧＭＡＱＩ。

【0074】

本発明のケト還元酵素ＪＲ３７１５０はＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｅｃｈｉｎｏｉｄｅｓに由来し、ＮＣＢＩデータベースの登録番号はＷＰ＿０１０４０３６４０．１であり、短鎖脱水素酵素ファミリーに属し、当該ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号２に示され、サイズは２５９のアミノ酸である。

【0075】

アミノ酸配列の配列番号２は次のとおりである。
ＭＡＲＬＡＧＫＶＡＬＶＴＧＧＡＳＶＰＧＬＧＳＡＴＡＩＲＦＡＱＥＧＡＴＶＹＬＴＤＲＤＬＡＧＡＱＡＶＡＡＱＩＴＡＡＧＧＲＡＴＡＬＥＨＤＶＴＳＥＡＤＷＤＲＶＬＡＡＩＤＡＡＥＧＲＬＤＩＬＶＮＮＡＧＩＡＶＬＧＰＬＥＤＶＴＡＡＤＦＬＲＱＮＤＶＮＬＮＳＶＦＨＧＳＫＲＡＬＶＭＭＲＲＰＧＤＧＧＴＡＲＧＧＳＩＩＮＩＳＳＶＡＧＬＩＧＶＰＧＣＧＳＹＡＡＳＫＧＧＶＲＬＦＳＫＶＶＡＬＥＧＡＡＤＧＶＲＣＮＳＶＨＰＧＭＩＡＴＮＩＱＧＶＡＬＥＤＮＡＡＮＦＤＡＶＭＡＬＩＰＭＶＲＭＧＥＰＥＤＩＡＮＭＮＬＦＬＡＳＤＥＳＲＹＩＴＧＡＥＦＶＶＤＧＧＭＴＡＲ。

【0076】

本発明のグルコース脱水素酵素ＧＤＨはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＱＢ９２８に由来し、ＮＣＢＩデータベースの登録番号はＡＦＱ５６３３０．１であり、短鎖脱水素酵素ファミリーに属し、当該脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号３に示され、サイズは２６３のアミノ酸である。

【0077】

アミノ酸配列の配列番号３は次のとおりである。
ＭＹＭＹＰＤＬＫＧＫＶＶＡＩＴＧＡＡＳＧＬＧＫＡＭＡＩＲＦＧＫＥＱＡＫＶＶＩＮＹＹＳＮＫＱＤＰＮＥＶＫＥＥＶＩＫＡＧＧＥＡＶＶＶＱＧＤＶＴＫＥＥＤＶＫＮＩＶＱＴＡＩＫＥＦＧＴＬＤＩＭＩＮＮＡＧＬＥＮＰＶＰＳＨＥＭＰＬＫＤＷＤＫＶＩＧＴＮＬＴＧＡＦＬＧＳＲＥＡＩＫＹＦＶＥＮＤＩＫＧＮＶＩＮＭＳＳＶＨＥＶＩＰＷＰＬＦＶＨＹＡＡＳＫＧＧＩＫＬＭＴＥＴＬＡＬＥＹＡＰＫＧＩＲＶＮＮＩＧＰＧＡＩＮＴＰＩＮＡＥＫＦＡＤＰＫＱＫＡＤＶＥＳＭＩＰＭＧＹＩＧＥＰＥＥＩＡＡＶＡＡＷＬＡＳＫＥＡＳＹＶＴＧＩＴＬＦＡＤＧＧＭＴＱＹＰＳＦＱＡＧＲＧ。

【0078】

本発明のケト還元酵素ＪＲ３７９０はＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓに由来し、ＮＣＢＩデータベースの登録番号はＥＧＵ１２８３７．１であるタンパク質の短縮型（７０～３１７位）であり、短鎖脱水素酵素ファミリーに属し、当該ケト還元酵素のアミノ酸配列は配列番号４に示され、サイズは２４８のアミノ酸である。

【0079】

アミノ酸配列の配列番号４は次のとおりである。
ＭＳＳＰＡＰＴＶＹＶＩＳＧＡＳＲＧＩＧＦＡＩＴＳＩＬＡＱＨＤＮＶＬＩＦＡＧＡＲＤＬＫＳＡＱＬＮＥＬＡＱＫＳＳＧＫＶＩＰＶＫＬＥＳＴＳＶＥＤＡＡＡＬＡＫＶＶＥＥＫＡＧＫＶＤＹＶＬＡＶＡＧＩＳＱＳＴＤＰＩＡＱＶＳＬＤＤＶＲＲＨＦＥＶＮＴＩＧＰＬＶＬＦＱＡＬＬＰＬＴＴＫＳＴＡＰＨＦＩＶＶＳＴＩＡＧＳＩＡＳＭＰＱＶＴＦＰＶＳＡＹＡＩＳＫＴＡＶＮＳＡＶＧＲＩＡＩＥＨＰＤＬＤＡＦＶＣＨＰＧＦＶＳＳＤＭＶＫＱＦＡＥＫＴＧＡＰＬＳＤＦＥＳＦＧＭＩＴＰＥＥＳＡＡＳＬＶＫＬＦＤＥＡＫＫＥＴＨＳＧＫＦＦＮＶＤＧＴ。

【0080】

リンカー配列の配列番号５は次のとおりである。
ＥＦＥＥＥＥＫＫＫＱＱＥＥＥＡＥＲＬＲＲＩＱＥＥＭＥＫＥＲＫＲＲＥＥＤＥＥＲＲＲＫＥＥＥＥＲＲＭＫＬＥＭＥＡＫＲＫＱＥＥＥＥＲＫＫＲＥＤＤＥＫＲＫＫＫＫＬ。

【0081】

ＨＰＬＣの構成は次のとおりである。ＯＤ－Ｈカラムを使用する。移動相はｎ－ヘキサン：イソプロパノール＝９８：２で、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎである。装置仕様は、ＤＡＤ１Ｃ，Ｓｉｇ＝２１０，４Ｒｅｆ＝３６０，１００である。

【0082】

前記酵素（配列番号１、配列番号２）及びグルコース脱水素酵素（配列番号３）はいずれも南京金斯瑞生物科技有限公司が合成した製品である。

【0083】

実施例１：
１ｇのβ－カルボニルテトラデカン酸メチル、１．５ｇのグルコースを秤量して１００ｍＬの三つ口フラスコに加え、次いで、濃度５０ｍＭでｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液５０ｍＬを加えた。三つ口フラスコを恒温水槽に入れ、撹拌速度を８００ｒｐｍに調整し、温度を３５℃とし、その後、それぞれ１０ｍｇのＮＡＤＰ^＋と、２５ｍｇのグルコース脱水素酵素ＧＤＨ酵素粉末（配列番号３）と、１００ｍｇのケト還元酵素ＪＲ３７８９酵素粉末（配列番号１）とを加えて、混合反応液を得、濃度２ＭのＮａＯＨ溶液で調整してｐＨを７．０～７．５に維持し、温度を３５℃に維持し、ＨＰＬＣで反応の進行をモニターした。反応は９時間で終了し、転化率を測定すると９９％を超えていた。

【0084】

反応終了後、最初に６０℃に昇温して１５分間保温し、その後、２０～２５℃に冷却して、８０ｍＬの酢酸エチルを加えて抽出し、２０分間撹拌し、濾過して、濾液を層分離させて有機相を得た。さらに水相を５０ｍＬの酢酸エチルで１回抽出し、層分離させて、有機相を得た。有機相を合わせて、減圧濃縮した後、ゆっくりと冷却して、生成物を析出させ、粗生成物を得た。純度は９８．１０％で、光学純度は９８．４５％であった。粗生成物に２倍量のｎ－ヘキサンを加えて加熱して溶解させ、冷却して結晶化させ、結晶を収集し、室温で風乾して、０．８９ｇの白色の結晶生成物を得た。測定すると純度は９９．９９％で、ｅｅ値は９９．９１％で、総収率は８９％であった。

【0085】

実施例２：
１ｇのβ－カルボニルテトラデカン酸エチル、１．５ｇのグルコースを秤量して１００ｍＬの三つ口フラスコに加え、次いで、濃度５０ｍＭでｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液５０ｍＬを加えた。三つ口フラスコを恒温水槽に入れ、撹拌速度を９００ｒｐｍに調整し、温度を３５℃とし、その後、それぞれ１０ｍｇのＮＡＤＰ^＋と、３５ｍｇのグルコース脱水素酵素ＧＤＨ酵素粉末（配列番号３）と、１５０ｍｇのケト還元酵素ＪＲ３７８９酵素粉末（配列番号１）とを加えて、混合反応液を得、濃度２ＭのＮａＯＨ溶液で調整してｐＨを７．０～７．５に維持し、温度を３５℃に維持し、ＨＰＬＣで反応の進行をモニターした。反応は１０時間で終了し、転化率を測定すると９９％を超えていた。

【0086】

【0087】

実施例３：
５ｇのβ－カルボニルテトラデカン酸メチル、７．５ｇのグルコースを秤量して１００ｍＬの三つ口フラスコに加え、次いで、濃度５０ｍＭでｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液５０ｍＬを加えた。三つ口フラスコを恒温水槽に入れ、撹拌速度を８００ｒｐｍに調整し、温度を３５℃とし、その後、それぞれ５０ｍｇのＮＡＤＰ^＋と、１２５ｍｇのグルコース脱水素酵素ＧＤＨ酵素粉末（配列番号３）と、５００ｍｇのケト還元酵素ＪＲ３７８９酵素粉末（配列番号１）とを加えて、混合反応液を得、濃度２ＭのＮａＯＨ溶液で調整してｐＨを７．０～７．５に維持し、温度を３５℃に維持し、ＨＰＬＣで反応の進行をモニターした。反応は１３時間で終了し、転化率を測定すると９９％を超えていた。

【0088】

【0089】

実施例４：
５ｇのβ－カルボニルテトラデカン酸メチル、７．５ｇのグルコースを秤量して１００ｍＬの三つ口フラスコに加え、次いで、濃度５０ｍＭでｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液５０ｍＬを加えた。三つ口フラスコを恒温水槽に入れ、撹拌速度を８００ｒｐｍに調整し、温度を３５℃とし、その後、それぞれ５０ｍｇのＮＡＤＰ^＋と、３００ｍｇのグルコース脱水素酵素ＧＤＨ酵素粉末（配列番号３）と、８００ｍｇのケト還元酵素ＪＲ３７１５０酵素粉末（配列番号２）とを加えて、混合反応液を得、濃度２ＭのＮａＯＨ溶液で調整してｐＨを７．０～７．５に維持し、温度を３５℃に維持し、ＨＰＬＣで反応の進行をモニターした。反応は３５時間で終了し、転化率を測定すると９９％を超えていた。

【0090】

反応終了後、最初に６０℃に昇温して１５分間保温し、その後、２０～２５℃に冷却して、１００ｍＬの酢酸エチルを加えて抽出し、２０分間撹拌し、濾過して、濾液を層分離させて有機相を得た。さらに水相を６０ｍＬの酢酸エチルで１回抽出し、層分離させて、有機相を得た。有機相を合わせて、減圧濃縮した後、ゆっくりと冷却して、生成物を析出させ、４．５５ｇの白色生成物を得た。純度は９８．６２％で、光学純度は９９．６６％で、総収率は９１％であった。

【0091】

実施例５：
７．５ｇのβ－カルボニルテトラデカン酸メチル、１１．２５ｇのグルコースを秤量して１００ｍＬの三つ口フラスコに加え、次いで、濃度５０ｍＭでｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液５０ｍＬを加えた。三つ口フラスコを恒温水槽に入れ、撹拌速度を８００ｒｐｍに調整し、温度を３５℃とし、その後、それぞれ１５０ｍｇのＮＡＤＰ^＋と、２００ｍｇのグルコース脱水素酵素ＧＤＨ酵素粉末（配列番号３）と、７５０ｍｇのケト還元酵素ＪＲ３７８９酵素粉末（配列番号１）とを加えて、混合反応液を得、濃度２ＭのＮａＯＨ溶液で調整してｐＨを７．０～７．５に維持し、温度を３５℃に維持し、ＨＰＬＣで反応の進行をモニターした。反応は１５時間で終了し、転化率を測定すると９９％を超えていた。測定結果は表１、ＨＰＬＣクロマトグラムは図１に示されるとおりである。

【0092】

反応終了後、最初に６０℃に昇温して１５分間保温し、その後、２０～２５℃に冷却して、１００ｍＬの酢酸エチルを加えて抽出し、２０分間撹拌し、濾過して、濾液を層分離させて有機相を得た。さらに水相を８０ｍＬの酢酸エチルで１回抽出し、層分離させて、有機相を得た。有機相を合わせて、減圧濃縮した後、ゆっくりと冷却して、生成物を析出させ、粗生成物を得た。純度は９９．６０％で、ｅｅ値は９８．６８％であった。粗生成物に２倍量のｎ－ヘキサンを加えて加熱して溶解させ、冷却して結晶化させ、濾過し、室温で風乾して、６．５３ｇの白色の結晶生成物を得た。測定すると純度は９９．９９％で、ｅｅ値は９９．８６％で、総収率は８７％であった。生成物の純度測定データは表２、ＨＰＬＣクロマトグラムは図２、生成物のキラル純度データは表３、ＨＰＬＣクロマトグラムは図３に示されるとおりである。

【表1】

【表2】

【表3】

【0093】

実施例６：
（１）融合酵素Ｇ３７９０発現プラスミドの構築
グルコース脱水素酵素ＧＤＨ（配列番号３）の遺伝子断片の３’末端にリンカー（配列番号５）の遺伝子配列を挿入し、次に、ケト還元酵素ＪＲ３７９０（配列番号４）の遺伝子断片を接続して、融合酵素Ｇ３７９０配列（配列番号６）（合成は南京金斯瑞生物科技有限公司）を構成し、両端の制限酵素切断部位ＮｄｅＩとＸｈｏＩによってベクターｐＥＴ２８ａに接続させて、二重酵素融合発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｇ３７９０を構成した。前記組換えプラスミドのプラスミドマップは図４に示されるとおりである。

【0094】

（２）融合酵素３７９０Ｇ発現プラスミドの構築
ケト還元酵素ＪＲ３７９０（配列番号４）の遺伝子断片の３’末端にリンカー（配列番号５）の遺伝子配列を挿入し、次に、グルコース脱水素酵素ＧＤＨ（配列番号３）の遺伝子断片を接続して、融合酵素配列（配列番号７）（合成は南京金斯瑞生物科技有限公司）を構成し、両端の制限酵素切断部位ＮｄｅＩとＸｈｏＩによってベクターｐＥＴ２８ａに接続させて、二重酵素融合発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－３７９０Ｇを構成した。前記組換えプラスミドのプラスミドマップは図５に示されるとおりである。

【0095】

（３）融合酵素Ｇ３７９０及び融合酵素３７９０Ｇの製造
構築した融合酵素発現プラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｇ３７９０及びｐＥＴ２８ａ－３７９０Ｇを大腸菌コンピテントＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、スクリーニングして陽性クローン形質転換体を得、組換えプラスミドを含む単クローンを選択して５ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬカナマイシン）を加えた試験管に接種し、３７℃下２００ｒｐｍで一晩培養した後、２％の接種量で菌液を、１ＬのＬＢ培地を加えた三角フラスコに移し、３７℃下２００ｒｐｍでＯＤ６００が約０．６になるまで培養して、誘導物質としてイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（最終濃度０．３ｍＭ）を加え、２５℃下で引き続き１２時間培養し、遠心分離して菌体を収集した。菌体をＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で希釈した後、再懸濁して超音波破砕を実施し、遠心分離して上清、すなわち粗酵素液を得た。

【0096】

発現した粗酵素液に対し、それぞれＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）タンパク質バンド同定を行った。図６はＧ３７９０融合酵素のタンパク質電気泳動結果で、レーンＭはタンパク質マーカー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）で、レーン１は全細胞を破砕した後の総タンパク質、レーン２は全細胞を破砕・遠心分離した上清であった。融合酵素の理論的な分子量は６７ｋＤａで、アミノ酸配列は配列番号８に示されるとおりである。図７は３７９０Ｇ融合酵素のタンパク質電気泳動結果で、レーンＭはタンパク質マーカー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）で、レーン１は全細胞を破砕した後の総タンパク質、レーン２は全細胞を破砕・遠心分離した上清であった。２つの融合酵素の理論的な分子量はいずれも６７ｋＤａで、アミノ酸配列は配列番号９に示されるとおりである。前記２つの融合酵素はいずれも可溶性タンパク質であり、分子量は対応する理論分子量に近かった。

【0097】

粗酵素液をそれぞれ一晩予備凍結し、２４～３６時間凍結乾燥して、融合酵素Ｇ３７９０酵素粉末及び融合酵素３７９０Ｇ酵素粉末を得た。

【0098】

（４）オルリスタット中間体の製造
７．５ｋｇのβ－カルボニルテトラデカン酸メチル、９．３７５ｋｇのグルコースを秤量して１００Ｌガラス製反応容器に加え、次いで、濃度５０ｍＭでｐＨ７．０のＰＢＳ緩衝液２５Ｌを加えた。高低温循環恒温槽で反応容器の温度を３５℃に維持し、機械的撹拌速度を１８０ｒｐｍに調整し、その後、それぞれ１８ｇのＮＡＤＰ^＋と、８００ｇの３７９０Ｇ酵素粉末とを加えて、混合反応液を得、濃度２ＭのＮａＯＨ溶液で調整してｐＨを７．０～７．５に維持し、ＨＰＬＣで反応の進行をモニターした。反応は１３時間で終了し、転化率を測定すると９９％を超えていた。

【0099】

反応終了後、最初に６０℃に昇温して３０分間保温し、その後、２０～２５℃に冷却して、吸引濾過してケーキを収集し、ケーキに１５Ｌの酢酸エチルを加えて抽出し、２０分間撹拌し、吸引濾過して有機相を収集した。さらに、２Ｌの酢酸エチルでケーキを抽出して１回洗浄し、有機相を得た。有機相を合わせて、減圧濃縮した後、ゆっくりと冷却して、生成物を析出させ、粗生成物を得た。純度は９８．５％で、ｅｅ値は９８．６％であった。粗生成物に２倍量のｎ－ヘキサンを加えて加熱して溶解させ、冷却して結晶化させ、濾過し、室温で風乾して、６．４５ｋｇの白色の結晶生成物を得た。測定すると純度は９９．７０％で、ｅｅ値は９９．８８％で、総収率は８６％であった。

【0100】

なお、上記の実施例は、本発明の技術的解決策を非限定的に説明するためのものに過ぎず、好ましい実施例を挙げて本発明を詳しく説明しているが、当業者が理解しているように、本発明の技術的解決策に対し、その趣旨と範囲を逸脱することなく修正又は同等な置換を行うことができ、そのいずれも本発明の特許請求の範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

2023511025000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-08-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オルリスタット中間体の製造における酵素の用途であって、
前記酵素が作用する基質はβ－カルボニルテトラデカノエートであり、構造式は、式Ｉに示されるとおりであり、
前記オルリスタット中間体は（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートであり、構造式は、式ＩＩに示されるとおりであり、

構造式ＩのＲはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基のいずれかであり、
構造式ＩＩのＲはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基のいずれかであり、
前記酵素はケト還元酵素であり、前記酵素のアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号２に示されるとおりである
ことを特徴とする前記用途。

【請求項2】

前記酵素は、酵素粉末、酵素液及び固定化酵素の少なくとも１つである
ことを特徴とする請求項１に記載の用途。

【請求項3】

構造式が式Ｉに示されるとおりであるβ－カルボニルテトラデカノエートである基質と、ケト還元酵素であって、アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号２に示されるとおりである酵素とを含み、

前記酵素と前記基質の質量比は、１：１．１～１５０であり、
構造式ＩのＲはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基のいずれかである
ことを特徴とする組成物。

【請求項4】

前記酵素と前記基質の質量比は、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１１０、１：１２０、１：１３０、１：１４０、又は１：１５０である
ことを特徴とする請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

請求項３又は４に記載の組成物を含む反応系であって、
式Ｉに示される基質と、前記酵素と、グルコースと、グルコース脱水素酵素と、ＮＡＤＰ^＋と、緩衝液で構成され、

前記グルコース脱水素酵素の配列は配列番号３に示されるとおりであり、
構造式ＩのＲはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基又はイソプロピル基のいずれかであり、
ただし、前記反応系のｐＨは６．０～８．０であり、
前記緩衝液はＰＢＳ緩衝液又はＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液であり、
前記基質の濃度は、２０～１５０ｇ／Ｌであり、
前記ＮＡＤＰ ^＋の濃度は、０．１～０．５ｇ／Ｌであり、
化合物Ｉと前記グルコースのモル比は、１：１．２～４であり、
前記緩衝液の濃度は、０．０１～０．５ｍｏｌ／Ｌであり、
前記反応系の反応時間は１５時間を超えず、反応液を得る
ことを特徴とする前記反応系。

【請求項6】

前記反応系を２０～４０℃において攪拌しながら反応させて、前記オルリスタット中間体の反応液を得、
ただし、前記オルリスタット中間体は（Ｒ）－β－ヒドロキシテトラデカノエートであり、構造式は、式ＩＩに示されるとおりであり、