(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-16
(54)【発明の名称】ＳＥＭＧ２抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230309BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230309BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230309BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230309BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230309BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230309BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230309BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230309BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230309BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230309BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230309BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230309BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230309BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230309BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230309BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230309BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230309BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230309BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230309BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230309BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/18
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N1/21
C12N1/15
C12N5/10
C07K14/47
C12N15/12
A61P35/00
A61K39/395 T
A61K39/395 E
A61K48/00
A61K47/68
A61P37/04
A61K39/00 H
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N33/53 D
G01N33/574 A
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022544425
(86)(22)【出願日】2021-01-21
(85)【翻訳文提出日】2022-09-01
(86)【国際出願番号】 CN2021073100
(87)【国際公開番号】W WO2021147954
(87)【国際公開日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】202010072952.X
(32)【優先日】2020-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．トライトン
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522290617
【氏名又は名称】上海柏全生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｉｏｔｒｏｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １０， Ｎｏ． ８６０ Ｘｉｎｙａｎｇ Ｒｏａｄ， Ｃｈｉｎａ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ， Ｌｉｎ－ｇａｎｇ Ｓｐｅｃｉａｌ Ａｒｅａ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００１３１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】李 兆利
【テーマコード（参考）】
2G045
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045CB01
2G045DA36
2G045DA37
2G045FB01
2G045FB03
4B064AG01
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
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4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA03
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4C085AA14
4C085BB01
4C085BB11
4C085BB41
4C085EE01
4H045AA11
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA41
4H045BA55
4H045BA70
4H045BA71
4H045BA72
4H045DA76
4H045DA86
4H045EA20
4H045EA31
4H045FA10
4H045FA71
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、低分子阻害剤、ポリペプチド、抗体または抗原結合フラグメントを含む、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズする化合物を提供する。本発明はさらに、ポリペプチドを免疫原として用いて、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を高効率で阻害するための抗体を調製する方法を開示する。本発明は、腫瘍細胞が発現するＳＥＭＧ２と免疫細胞が発現するＣＤ２７との接触を遮断することにより、抗腫瘍免疫を促進する方法を開示し、また、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止することにより治療薬をスクリーニングする方法を開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズする化合物。
【請求項2】
ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用が、ＳＥＭＧ２の４９７位、４９８位、４９９位、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位および５０８位のアミノ酸部位に位置し、ＳＥＭＧ２タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１に示される、請求項１記載の化合物。
【請求項3】
化合物が低分子阻害剤、ポリペプチド、抗体または抗原結合フラグメントである、請求項１記載の化合物。
【請求項4】
ポリペプチドが、配列番号２（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ）、配列番号８６（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ）Ｉ（ｘ））、配列番号８７（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ）Ｉ）、または配列番号８８（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ））のアミノ酸配列を含み；好ましくは、ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ）、配列番号４（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱ）もしくは配列番号５（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩ）のアミノ酸配列、または配列番号２－５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここでｘは何れかのアミノ酸から選択される、請求項３記載の化合物。
【請求項5】
抗体が天然または変異ＳＥＭＧ２タンパク質に特異的に結合し、抗体がＳＥＭＧ２タンパク質由来の抗原性エピトープペプチドに結合し、抗原性エピトープペプチドが、配列番号２（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ）、配列番号３（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ）、配列番号４（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱ）または配列番号５（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩ）の何れかのアミノ酸配列を含む、請求項３記載の化合物。
【請求項6】
抗体が天然または変異ＳＥＭＧ２タンパク質に特異的に結合し、抗体が天然ＳＥＭＧ２タンパク質の４９７位、４９８位、４９９位、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位および５０８位の少なくとも１つのアミノ酸残基を認識するか、または変異ＳＥＭＧ２タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基を認識し、天然ＳＥＭＧ２タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１で示される、請求項３記載の化合物。
【請求項7】
抗体が重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域はＩＭＧＴによって定義されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み；そして、軽鎖可変領域はＩＭＧＴによって定義されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号６－１１、配列番号６０－６１および配列番号７６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号１２－１６および配列番号６２－６４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１７－２０、配列番号６５－６７および配列番号７７－８１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号２１－２５、配列番号６８－７０および配列番号８２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号２６－２９、配列番号７１－７２、配列番号８３－８４および配列番号２８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号３０－３４、配列番号７３－７５、配列番号８５および配列番号９５からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含む、
請求項３記載の化合物。
【請求項8】
抗体が重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域がＩＭＧＴによって定義されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み；そして、軽鎖可変領域がＩＭＧＴによって定義されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、抗体のＣＤＲ配列が（a）～（k）のいずれか１つの組み合わせから選択される、請求項７記載の化合物であって、(a) ＨＣＤＲ１は配列番号６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は配列番号１２のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は配列番号２６のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は配列番号３０のアミノ酸配列を含む、
(b) ＨＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は配列番号１８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は配列番号２２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は配列番号２７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は配列番号３１もしくは配列番号９５のアミノ酸配列を含む、
(c) ＨＣＤＲ１は配列番号６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は配列番号１６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は配列番号２６のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は配列番号３０のアミノ酸配列を含む、
(d) ＨＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、
(e) ＨＣＤＲ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２４のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む、
(f）ＨＣＤＲ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、
(g）ＨＣＤＲ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、
(h）ＨＣＤＲ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号６８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む、
(i) ＨＣＤＲ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号６９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号７２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む、
(j) ＨＣＤＲ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号６７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号７０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む、
(k) ＨＣＤＲ１は配列番号６０または７６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は配列番号６４または６２のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は配列番号７７、７８または７９のアミノ酸配列を含み、および／またはＬＣＤＲ１は、配列番号７０または８２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２８、８３または８４のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７５または８５のアミノ酸配列を含む、
化合物。
【請求項9】
抗体が重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項３記載の化合物であって、重鎖可変領域が、配列番号３５－４１、４８－５１、５４－５６および９６－１００からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号３５－４１、４８－５１、５４－５６および９６－１００の何れの配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
軽鎖可変領域が、配列番号４２－４７、５２－５３、５７－６９および１０１－１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号４２－４７、５２－５３、５７－６９および１０１－１０３の何れかの配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、化合物。
【請求項10】
抗体が重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が（a）～（o）の組み合わせの何れか１つから選択される、請求項９記載の化合物であって、(a) 重鎖可変領域は、配列番号３５または配列番号３５と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４２または配列番号４２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(b) 重鎖可変領域は、配列番号３６または配列番号３６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４３または配列番号４３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(c) 重鎖可変領域は、配列番号３７または配列番号３７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４４または配列番号４４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(d) 重鎖可変領域は、配列番号３８または配列番号３８に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４５または配列番号４５に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(e) 重鎖可変領域は、配列番号３９または配列番号３９に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４６または配列番号４６に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(f) 重鎖可変領域は、配列番号４０または配列番号４０に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４７または配列番号４７に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(g) 重鎖可変領域は、配列番号４１または配列番号４１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４７または配列番号４７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(h）重鎖可変領域は、配列番号４８、４９、５０もしくは５１または配列番号４８、４９、５０もしくは５１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５２もしくは５３または配列番号５２もしくは５３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(i) 重鎖可変領域は、配列番号５４または配列番号５４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５７または配列番号５７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(j) 重鎖可変領域は、配列番号５５または配列番号５５と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５８または配列番号５８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(k）重鎖可変領域は、配列番号５６または配列番号５６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５９または配列番号５９に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(l）重鎖可変領域は、配列番号９６または配列番号９６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５９、１０１、１０２もしくは１０３または配列番号５９、１０１、１０２もしくは１０３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(m) 重鎖可変領域は、配列番号９７または配列番号９７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５９または配列番号５９と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(n）重鎖可変領域は、配列番号９８または配列番号９８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号１０３または配列番号１０３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(o）重鎖可変領域は、配列番号９９もしくは１００、または配列番号９９もしくは１００と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５７または配列番号５７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
化合物。
【請求項11】
抗体が、ポリペプチドに連結されたカップリング部位をさらに含み、カップリング部位が、放射性核種、薬剤、毒素、サイトカイン、酵素、フルオレセイン、担体タンパク質、脂質およびビオチンからなる群より１つ以上選択され、ここで、ポリペプチドまたは抗体が、リンカーによってカップリング部位に選択的に連結され、好ましくはリンカーがペプチドまたはポリペプチドである、請求項５から１０のいずれか一項記載の化合物。
【請求項12】
抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選択される、請求項５から１０のいずれか一項記載の化合物。
【請求項13】
抗体が、多重特異性抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および細胞内抗体から選択される、請求項５から１０のいずれか一項記載の化合物。
【請求項14】
ＳＥＭＧ２タンパク質に由来する抗原性エピトープペプチドであって、抗原性エピトープペプチドのアミノ酸が、配列番号２（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ）、配列番号３（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ）、配列番号４（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱ）および配列番号５（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗原性エピトープペプチド。
【請求項15】
請求項１４記載の抗原性エピトープペプチドおよびＮ末端またはＣ末端に選択的に連結可能なタグ配列を含む、タンパク質。
【請求項16】
タンパク質が、配列番号２（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ）、配列番号８６（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ）Ｉ（ｘ））、配列番号８７（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ））Ｉ）または配列番号８８（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ））のアミノ酸配列を含み、好ましくは、ポリペプチドは配列番号３（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ）、配列番号４（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱ）もしくは配列番号５（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩ）のアミノ酸配列または配列番号２－５のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、より好ましくは配列番号８９～９４および配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１５記載のタンパク質。
【請求項17】
請求項１４記載の抗原性エピトープペプチドまたは請求項１５もしくは１６記載のタンパク質を免疫原として用いて哺乳動物を免疫化すること、または天然抗体ライブラリーでのスクリーニングにより得られることを含む、抗体の調製方法。
【請求項18】
請求項３から１３のいずれか記載の化合物、請求項１４記載の抗原性ペプチド、または請求項１５もしくは１６記載のタンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項19】
請求項１８記載のポリヌクレオチドおよび任意の調節配列を含む組換えベクターであって、好ましくは、クローニングベクターまたは発現ベクターである、組換えベクター。
【請求項20】
調節配列が、リーディング配列、ポリアデニル化配列、リーダーペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、転写ターミネーター、またはそれらの何れかの組合せから選択される、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項21】
請求項１９または２０記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項22】
原核細胞または真核細胞である、請求項２１記載の宿主細胞。
【請求項23】
請求項１から１３のいずれか一項記載の化合物、請求項１４に記載の抗原ペプチド、請求項１５もしくは１６に記載のタンパク質、請求項１８記載のポリヌクレオチド、請求項１９もしくは２０記載の組換えベクター、および請求項２１もしくは２２記載の宿主細胞のうち、１以上を含む、医薬組成物。
【請求項24】
薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項25】
ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズするための製品の調製における、請求項１から１３のいずれか一項記載の化合物、請求項１４記載の抗原性ペプチド、請求項１５もしくは１６記載のタンパク質、請求項１８記載のポリヌクレオチド、請求項１９もしくは２０記載の組み換えベクターまたは請求項２１もしくは２２記載の宿主細胞の使用であって、好ましくはＳＥＭＧ２が腫瘍細胞であり、ＣＤ２７が免疫細胞で発現させられる、使用。
【請求項26】
腫瘍を予防または処置するための薬剤の調製における、請求項１から１３のいずれか一項記載の化合物、請求項１４記載の抗原性ペプチド、請求項１５もしくは１６記載のタンパク質、請求項１８記載のポリヌクレオチド、請求項１９もしくは２０記載の組換えベクター、または請求項２１もしくは２２記載の宿主細胞の使用。
【請求項27】
腫瘍に対して惹起される免疫応答を調節するための薬剤の調製における、請求項１から１３のいずれか一項記載の化合物、請求項１４記載の抗原性ペプチド、請求項１５もしくは１６記載のタンパク質、請求項１８記載のポリヌクレオチド、請求項１９もしくは２０記載の組換えベクター、または請求項２１もしくは２２記載の宿主細胞の使用。
【請求項28】
腫瘍が、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、リンパ腫、肝臓癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、乳癌および卵巣癌の１以上から選択される、請求項２６または２７記載の使用。
【請求項29】
ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用を阻害する阻害剤または抗体をスクリーニングして候補となる薬剤または試薬を得ることを含む、腫瘍を予防または処置するための薬剤または試薬をスクリーニングする方法。
【請求項30】
腫瘍を予防または処置する方法であって、対象のリンパ球などの免疫細胞および／または腫瘍細胞と、請求項１から１３のいずれか一項記載の化合物の有効量とを接触させること
を含む、方法。
【請求項31】
腫瘍細胞におけるＳＥＭＧ２の発現が、対象のリンパ球および／または腫瘍細胞などの免疫細胞と有効量の化合物とを接触させる前に検出される、請求項３０記載の方法。
【請求項32】
対象が、追加の抗癌剤療法を受けていたか、受けているか、または受ける予定である、請求項３０記載の方法。
【請求項33】
追加の抗癌剤療法が、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法またはホルモン療法を含む、請求項３０記載の方法。
【請求項34】
請求項１から１３のいずれか一項記載の化合物、請求項１４記載の抗原性ペプチド、請求項１５もしくは１６記載のタンパク質、請求項１８記載のポリヌクレオチド、請求項１９もしくは２０記載の組換えベクター、および請求項２１もしくは２２記載の宿主細胞の１以上を含み、かつ上記構成要素が適切な容器に包含されている、キット。
【請求項35】
生物学的サンプル中のＳＥＭＧ２の有無をインビトロで検出する方法であって、生物学的サンプルを請求項１から１３のいずれか一項記載の化合物と接触させることを含む、方法。
【請求項36】
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、Ａ）腫瘍細胞におけるＳＥＭＧ２の発現を分析する工程；Ｂ）腫瘍細胞をＳＥＭＧ２を認識する抗体と接触させ、該抗体のＳＥＭＧ２への結合がＫＤ＜２×１０－８である工程；Ｃ）Ｔリンパ球を該抗体および腫瘍細胞と接触させる工程；を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、生物医学の分野に関し、特に、ＳＥＭＧ２抗原性エピトープペプチドおよびその使用に関する。
本発明は、生物医学の分野に関し、特に、ＳＥＭＧ２抗原性エピトープペプチドおよびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
ＣＤ２７分子は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属し、分子量約５５ｋＤａのＩ型膜タンパク質であり、２つの単量体がジスルフィド結合で連結した二量体として存在する。ＣＤ２７は主にリンパ球で発現している。ＣＤ２７ノックアウトマウスを用いた最近の研究から、ＣＤ２７シグナル伝達経路の活性化が固形腫瘍におけるサプレッサーＴ細胞（Ｔｒｅｇ）の浸潤を増加させ、抗腫瘍免疫を低下させることが示されている（Claus C, Riether C, Schuerch C, Matter MS, Hilmenyuk T, Ochsenbein AF. Cancer Res. 2012 Jul 15; 72(14):3664-76)。また、一貫して、この研究は、皮膚組織のＴｒｅｇ細胞が、ＣＤ２７の発現を失った後、正常な免疫調節機能を果たせなくなることを見出した（Remedios KA, Zirak B, Sandoval PM, Lowe MM, Boda D, Henley E et al., Sci Immunol. 2018. Dec 21;3(30).pii:eaau2042)。さらに、ＣＤ２７の活性化は、高脂血症マウスのＴｒｅｇ数を増加させ、アテローム性動脈硬化症を軽減させる（Winkels H, Meiler S, Lievens D, Engel D, Spitz C, Buerger C, et al., Eur Heart J. 2017; 38(48):3590-3599）。最近の研究では、ＣＤ２７が特定のＴｒｅｇ細胞（腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを含む）の機能的活性化に重要な役割を果たすことが一貫して示されており、したがって腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞が発現するＣＤ２７の活性化を回避することは、がん治療戦略として期待されている。
ＣＤ２７分子は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属し、分子量約５５ｋＤａのＩ型膜タンパク質であり、２つの単量体がジスルフィド結合で連結した二量体として存在する。ＣＤ２７は主にリンパ球で発現している。ＣＤ２７ノックアウトマウスを用いた最近の研究から、ＣＤ２７シグナル伝達経路の活性化が固形腫瘍におけるサプレッサーＴ細胞（Ｔｒｅｇ）の浸潤を増加させ、抗腫瘍免疫を低下させることが示されている（Claus C, Riether C, Schuerch C, Matter MS, Hilmenyuk T, Ochsenbein AF. Cancer Res. 2012 Jul 15; 72(14):3664-76)。また、一貫して、この研究は、皮膚組織のＴｒｅｇ細胞が、ＣＤ２７の発現を失った後、正常な免疫調節機能を果たせなくなることを見出した（Remedios KA, Zirak B, Sandoval PM, Lowe MM, Boda D, Henley E et al., Sci Immunol. 2018. Dec 21;3(30).pii:eaau2042)。さらに、ＣＤ２７の活性化は、高脂血症マウスのＴｒｅｇ数を増加させ、アテローム性動脈硬化症を軽減させる（Winkels H, Meiler S, Lievens D, Engel D, Spitz C, Buerger C, et al., Eur Heart J. 2017; 38(48):3590-3599）。最近の研究では、ＣＤ２７が特定のＴｒｅｇ細胞（腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを含む）の機能的活性化に重要な役割を果たすことが一貫して示されており、したがって腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞が発現するＣＤ２７の活性化を回避することは、がん治療戦略として期待されている。
【0003】
ＣＤ２７はリガンドと結合することでその下流のシグナル伝達が活性化されるが、現在知られているＣＤ２７のリガンド分子はＣＤ７０である。ＣＤ７０は、２０アミノ酸の親水性Ｎ末端ドメインおよび２つの潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位を含むＣ末端ドメインを有する１９３アミノ酸のポリペプチドであり、ＴＮＦファミリーに属している（Goodwin，R. G. et al.（1993）Cell 73:447-56; Bowman et al. （1994）Immunol 152:1756-61）。これらの特性から、ＣＤ７０は細胞外Ｃ末端部分を有するＩＩ型膜貫通タンパク質であることが示唆される。ＣＤ７０は、活性化Ｔリンパ球およびＢリンパ球ならびに樹状細胞上に一過性に存在する（Hintzen et al, （1994） J.Immunol. 152:1762-1773; Oshima et al, (1998) Int. Immunol. 10:517-26；Tesselaar et al, （2003）J.Immunol. 170:33-40)。正常細胞に加えて、ＣＤ７０発現は、腎細胞癌、転移性乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫および鼻咽頭癌を含む、異なるタイプの癌において報告されている（Junker et al, J. Urol. 2005; 173: 2150-3; Sloan et al., Am J Pathol. 2004; 164:315-23; Held-Feindt and Mentlein et al, Int J Cancer 2002; 98:352-6）。現在、ＣＤ７０とＣＤ２７との結合を阻止することは、腫瘍免疫療法のために研究されている戦略である。
【0004】
これまでの研究では、ＣＤ２７がＣＤ７０以外のリガンドを有することは示唆されていない。しかしながら、免疫チェックポイント経路の受容体の新規リガンド（特に、腫瘍細胞が発現する比較的特異性の高い新規リガンド）は、より有効な抗腫瘍治療薬の開発にとって大きな意義がある。本発明は、新規な抗腫瘍治療薬および薬剤を開発することを目的とする。
【発明の概要】
【0005】
発明の概要
一面において、本発明は、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズする化合物を開示している。ここで、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用は、ＳＥＭＧ２の４９７位、４９８位、４９９位、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位および５０８位のアミノ酸部位にあり、ＳＥＭＧ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。ここで、化合物は、低分子阻害剤、ポリペプチド、抗体または抗原結合フラグメントである。
一面において、本発明は、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズする化合物を開示している。ここで、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用は、ＳＥＭＧ２の４９７位、４９８位、４９９位、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位および５０８位のアミノ酸部位にあり、ＳＥＭＧ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。ここで、化合物は、低分子阻害剤、ポリペプチド、抗体または抗原結合フラグメントである。
【0006】
一態様において、本発明はポリペプチドを開示し、該ポリペプチドは、配列番号２（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ）、配列番号８６（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ）Ｉ（ｘ））、配列番号８７（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ）Ｉ）または配列番号８８（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ））のアミノ酸配列を含み；好ましくは、ポリペプチドは、配列番号３（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ）、配列番号４（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱ）または配列番号５（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩ）のアミノ酸配列、または配列番号２から５に供されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ここで、該ポリペプチドは、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用をアゴナイズする。ここで、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用のアミノ酸部位は、ＳＥＭＧ２の４９７位、４９８位、４９９位、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位および５０８位にあり、ＳＥＭＧ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。
【0007】
一態様において、本発明は、天然または変異ＳＥＭＧ２タンパク質に特異的に結合する抗体を開示し、該抗体は、ＳＥＭＧ２タンパク質由来の抗原性エピトープペプチドに結合し、該抗原性エピトープペプチドは、配列番号２（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ）、配列番号３（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ）、配列番号４（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱ）、または配列番号５（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩ）のアミノ酸配列を含み、ここで、抗体は、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用をアンタゴナイズする。
【0008】
一態様において、本発明は、天然または変異ＳＥＭＧ２タンパク質に特異的に結合する抗体を開示し、該抗体は、天然ＳＥＭＧ２タンパク質の４９７位、４９８位、４９９位、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位および５０８位における少なくとも１つのアミノ酸残基を認識し、または変異ＳＥＭＧ２タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基を認識し、天然ＳＥＭＧ２タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示される。ここで、抗体は、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用をアンタゴナイズする。
【0009】
一態様において、本発明は、天然または変異ＳＥＭＧ２タンパク質と特異的に結合する抗体を開示し、ここで、該抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、ＩＭＧＴによって定義されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域は、ＩＭＧＴによって定義されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号６－１１、配列番号６０－６１および配列番号７６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号１２－１６および配列番号６２－６４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１７－２０、配列番号６５－６７および配列番号７７－８１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号２１－２５、配列番号６８－７０および配列番号８２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号２６－２９、配列番号７１－７２、配列番号８３－８４および配列番号２８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号３０－３４、配列番号７３－７５、配列番号８５および配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含む。
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号６－１１、配列番号６０－６１および配列番号７６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号１２－１６および配列番号６２－６４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号１７－２０、配列番号６５－６７および配列番号７７－８１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号２１－２５、配列番号６８－７０および配列番号８２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号２６－２９、配列番号７１－７２、配列番号８３－８４および配列番号２８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含み、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号３０－３４、配列番号７３－７５、配列番号８５および配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるか、またはそれらを含む。
【0010】
１つの特定の態様において、抗体のＣＤＲ配列は、（ａ）－（ｋ）の組合せの何れか１つから選択される：
(a) ＨＣＤＲ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２６のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む；
(b) ＨＣＤＲ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３１または配列番号９９のアミノ酸配列を含む；
(c) ＨＣＤＲ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２６のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む；
(d) ＨＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む；
(e) ＨＣＤＲ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２４のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む；
(f) ＨＣＤＲ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む；
(g) ＨＣＤＲ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む；
（ｈ）ＨＣＤＲ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号６８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む；
（ｉ）ＨＣＤＲ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号６９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号７２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む；
（ｊ）ＨＣＤＲ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号６７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号７０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む；
（ｋ）ＨＣＤＲ１は、配列番号６０または７６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６４または６２のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号７７、７８または７９のアミノ酸配列を含み；かつ／あるいは
ＬＣＤＲ１は、配列番号７０または８２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２８、８３または８４のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７５または８５のアミノ酸配列を含む。
(a) ＨＣＤＲ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２６のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む；
(b) ＨＣＤＲ１は、配列番号７のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３１または配列番号９９のアミノ酸配列を含む；
(c) ＨＣＤＲ１は、配列番号６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２６のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む；
(d) ＨＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む；
(e) ＨＣＤＲ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２４のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む；
(f) ＨＣＤＲ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む；
(g) ＨＣＤＲ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む；
（ｈ）ＨＣＤＲ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号６８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む；
（ｉ）ＨＣＤＲ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号６９のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号７２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む；
（ｊ）ＨＣＤＲ１は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号６７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号７０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む；
（ｋ）ＨＣＤＲ１は、配列番号６０または７６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６４または６２のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号７７、７８または７９のアミノ酸配列を含み；かつ／あるいは
ＬＣＤＲ１は、配列番号７０または８２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号２８、８３または８４のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号７５または８５のアミノ酸配列を含む。
【0011】
一態様において、本発明は、天然または変異ＳＥＭＧ２タンパク質に特異的に結合する抗体を開示し、ここで、該抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
重鎖可変領域は、配列番号３５－４１、４８－５１、５４－５６および９６－１００からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号３５－４１、４８－５１、５４－５６および９６－１００の何れかの配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一性のアミノ酸配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号４２－４７、５２－５３、５７－６９および１０１－１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号４２－４７、５２－５３、５７－６９および１０１－１０３の何れかの配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一性のアミノ酸配列を含む。
重鎖可変領域は、配列番号３５－４１、４８－５１、５４－５６および９６－１００からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号３５－４１、４８－５１、５４－５６および９６－１００の何れかの配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一性のアミノ酸配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号４２－４７、５２－５３、５７－６９および１０１－１０３からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号４２－４７、５２－５３、５７－６９および１０１－１０３の何れかの配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一性のアミノ酸配列を含む。
【0012】
ある特定の態様において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、（a）－（o）の組合せの何れか１つから選択される：
(a) 重鎖可変領域は、配列番号３５または配列番号３５と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４２または配列番号４２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(b) 重鎖可変領域は、配列番号３６または配列番号３６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４３または配列番号４３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(c) 重鎖可変領域は、配列番号３７または配列番号３７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４４または配列番号４４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(d) 重鎖可変領域は、配列番号３８または配列番号３８に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４５または配列番号４５に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(e) 重鎖可変領域は、配列番号３９または配列番号３９に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４６または配列番号４６に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(f) 重鎖可変領域は、配列番号４０または配列番号４０に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４７または配列番号４７に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(g) 重鎖可変領域は、配列番号４１または配列番号４１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４７または配列番号４７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(h）重鎖可変領域は、配列番号４８、４９、５０もしくは５１または配列番号４８、４９、５０もしくは５１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５２もしくは５３または配列番号５２もしくは５３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(i) 重鎖可変領域は、配列番号５４または配列番号５４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５７または配列番号５７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(j) 重鎖可変領域は、配列番号５５または配列番号５５と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５８または配列番号５８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(k）重鎖可変領域は、配列番号５６または配列番号５６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５９または配列番号５９に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(l）重鎖可変領域は、配列番号９６または配列番号９６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５９、１０１、１０２もしくは１０３または配列番号５９、１０１、１０２もしくは１０３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(m) 重鎖可変領域は、配列番号９７または配列番号９７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５９または配列番号５９と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(n）重鎖可変領域は、配列番号９８または配列番号９８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号１０３または配列番号１０３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(o）重鎖可変領域は、配列番号９９もしくは１００、または配列番号９９もしくは１００と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５７または配列番号５７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(a) 重鎖可変領域は、配列番号３５または配列番号３５と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４２または配列番号４２と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(b) 重鎖可変領域は、配列番号３６または配列番号３６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４３または配列番号４３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(c) 重鎖可変領域は、配列番号３７または配列番号３７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４４または配列番号４４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(d) 重鎖可変領域は、配列番号３８または配列番号３８に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４５または配列番号４５に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(e) 重鎖可変領域は、配列番号３９または配列番号３９に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４６または配列番号４６に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(f) 重鎖可変領域は、配列番号４０または配列番号４０に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４７または配列番号４７に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(g) 重鎖可変領域は、配列番号４１または配列番号４１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号４７または配列番号４７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(h）重鎖可変領域は、配列番号４８、４９、５０もしくは５１または配列番号４８、４９、５０もしくは５１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５２もしくは５３または配列番号５２もしくは５３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(i) 重鎖可変領域は、配列番号５４または配列番号５４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５７または配列番号５７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(j) 重鎖可変領域は、配列番号５５または配列番号５５と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５８または配列番号５８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(k）重鎖可変領域は、配列番号５６または配列番号５６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５９または配列番号５９に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(l）重鎖可変領域は、配列番号９６または配列番号９６と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５９、１０１、１０２もしくは１０３または配列番号５９、１０１、１０２もしくは１０３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(m) 重鎖可変領域は、配列番号９７または配列番号９７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５９または配列番号５９と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(n）重鎖可変領域は、配列番号９８または配列番号９８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号１０３または配列番号１０３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
(o）重鎖可変領域は、配列番号９９もしくは１００、または配列番号９９もしくは１００と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号５７または配列番号５７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0013】
本発明の抗体は、ポリペプチドに連結されたカップリング部位をさらに含み、カップリング部位は、放射性核種、薬物、毒素、サイトカイン、酵素、フルオレセイン、担体タンパク質、脂質およびビオチンの１以上からなる群より選択され、ここで、ポリペプチドまたは抗体はリンカーによってカップリング部位に選択的に連結されており、好ましくはリンカーはペプチドまたはポリペプチドである。
ここで、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選択される。
ここで、抗体は、多重特異性抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および細胞内抗体から選択される。
ここで、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選択される。
ここで、抗体は、多重特異性抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および細胞内抗体から選択される。
【0014】
別の面において、本発明は、抗原性エピトープペプチドを開示し、ここで、抗原性エピトープペプチドは、ＳＥＭＧ２タンパク質に由来し、抗原性エピトープペプチドのアミノ酸は、配列番号２（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ）、配列番号３（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ）、配列番号４（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱ）および配列番号５（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【0015】
本発明は、タンパク質を開示し、該タンパク質は、配列番号２（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ）、配列番号８６（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ）Ｉ（ｘ））、配列番号８７（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ））Ｉ）または配列番号８８（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ））に示すアミノ酸配列を含み、好ましく、該ポリペプチドは、配列番号３（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ）、配列番号４（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱ）もしくは配列番号５（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩ）のアミノ酸配列または配列番号２－５の何れか１つと少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列、より好ましくは配列番号８９－９４および配列番号３（Ｐ１－Ｐ６、およびＰ７それぞれに対応)；およびＮ末端またはＣ末端に選択的に連結できるタグ配列を含む。当業者は、タンパク質タグの付加が、調製された抗体のＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合への参加に影響を与えないことを理解すべきであるが、タンパク質タグとしては、Ｃ－Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）、ＨＡ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、フラグ、ＳＵＭＯ、ｅＧＦＰ／ｅＣＦＰ／ｅＹＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ等が挙げられるが、それらに限定されない。
【0016】
ある特定の態様において、ポリペプチドは、配列番号３（Ｐ７：ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ）または配列番号９３（Ｐ５）のアミノ酸配列を有する。
【0017】
本発明はまた、抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、ここで、タンパク質を免疫原として用いてマウスなどの対象に注射するか、または天然ライブラリーをスクリーニングして抗体を調製し、抗体のアミノ酸配列が、配列番号２（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ）、配列番号８６（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ）Ｉ（ｘ））、配列番号８７（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ）Ｉ）、または配列番号８８（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳ（ｘ））のアミノ酸配列を含み、好ましくはポリペプチドは、配列番号３（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ）、配列番号４（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱ）もしくは配列番号５（ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩ）のアミノ酸配列または配列番号２－５の何れか１つと少なくとも９０％同一性のアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号９３（Ｐ５）または配列番号３（Ｐ７）を含む、方法を開示する。
【0018】
好ましい態様において、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合の重要なエピトープポリペプチドを免疫原として用い、ヒトおよびラクダの天然ライブラリーにおいてマウスハイブリドーマおよびファージディスプレイでスクリーニングする、単離抗体を得る方法が開示される。
【0019】
別の面において、本発明は、化合物、抗原性ペプチド、またはタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを開示する。
【0020】
本発明は、ポリヌクレオチドおよび任意の調節配列を含む組換えベクターを開示する；好ましくは、組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターである。
ここで、調節配列は、リーディング配列、ポリアデニル化配列、ポリペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、転写ターミネーター、またはそれらの何れかの組合せから選択される。
ここで、調節配列は、リーディング配列、ポリアデニル化配列、ポリペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、転写ターミネーター、またはそれらの何れかの組合せから選択される。
【0021】
本発明は、組換えベクターを含む宿主細胞を開示する。
ここで、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。
ここで、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。
【0022】
本発明は、化合物、抗原ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、および上記の宿主細胞の１種以上を含む医薬組成物を開示する：
ここで、組成物は、薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む。
ここで、組成物は、薬学的に許容される担体またはアジュバントをさらに含む。
【0023】
本発明はまた、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用をアゴナイズまたはアンタゴナイズするための生成物の調製における化合物、抗原性ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベクターまたは宿主細胞の使用を開示し、好ましくはＳＥＭＧ２は腫瘍細胞で発現され、ＣＤ２７は免疫細胞で発現される。
【0024】
本発明はまた、腫瘍を予防または処置するための薬剤、または腫瘍に対して誘発される免疫応答を調節するための薬剤の調製における、化合物、抗原性ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベクターまたは宿主細胞の使用を開示する。
【0025】
ある特定の態様において、腫瘍は、結腸直腸癌、肺癌、黒色腫、リンパ腫、肝臓癌、頭頸部癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、乳癌および卵巣癌の１以上から選択される。
【0026】
また、本発明は、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との相互作用を阻害する阻害剤または抗体をスクリーニングして候補となる薬剤または試薬を得ることを含む、腫瘍を予防または処置する薬剤または試薬のスクリーニング方法を開示する。
【0027】
本発明はまた、以下を含む、腫瘍を予防または処置する方法を開示する：
対象のリンパ球（Ｔリンパ球）などの免疫細胞または腫瘍細胞を、有効量の何れか１つの化合物と接触させること；ここで、腫瘍細胞におけるＳＥＭＧ２の発現は、対象のリンパ球および／または腫瘍細胞などの免疫細胞を有効量の化合物と接触させる前に選択的に検出することができる；
ここで、対象が、さらなる抗癌療法を受けたか、受けているか、または受ける予定であり、
ここで、さらなる抗癌療法は、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、またはホルモン療法を含む。
対象のリンパ球（Ｔリンパ球）などの免疫細胞または腫瘍細胞を、有効量の何れか１つの化合物と接触させること；ここで、腫瘍細胞におけるＳＥＭＧ２の発現は、対象のリンパ球および／または腫瘍細胞などの免疫細胞を有効量の化合物と接触させる前に選択的に検出することができる；
ここで、対象が、さらなる抗癌療法を受けたか、受けているか、または受ける予定であり、
ここで、さらなる抗癌療法は、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、またはホルモン療法を含む。
【0028】
本発明はまた、化合物、抗原性ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、および１種以上の宿主細胞を含み、上記構成要素が適切な容器に収容されるキットを開示する。
【0029】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＳＥＭＧ２の有無をインビトロで検出する方法であって、該生物学的サンプルを化合物と接触させることを含む方法を開示する。
【0030】
Ａ）腫瘍細胞におけるＳＥＭＧ２の発現を分析する工程；Ｂ）腫瘍細胞をＳＥＭＧ２を認識する抗体と接触させ、抗体のＳＥＭＧ２への結合は、ＫＤ＜２×１０－８である工程；Ｃ）Ｔリンパ球を、抗体および腫瘍細胞と接触させる工程、ここで、ＫＤ＜２×１０－８、＜１×１０－８、＜９×１０－９、＜８×１０－９、＜７×１０－９、＜６×１０－９、＜５×１０－９、＜４×１０－９、＜３×１０－９、＜２×１０－９、＜１×１０－９、＜１×１０－１０である工程
を含む、腫瘍細胞の腫瘍細胞増殖を阻害する方法。
を含む、腫瘍細胞の腫瘍細胞増殖を阻害する方法。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】図１は、共免疫沈降アッセイの結果を示し、上段パネルと下段パネルに分かれている。上パネルは、ヒトＣＤ２７とＳＥＭＧ２（Ｆｌａｇ）の間に物理的相互作用が存在することを示す。下パネルは、マウスＣＤ２７とＳＥＭＧ２（Ｆｌａｇ）の間の物理的相互作用の存在を示す。
【図2】図２は、免疫蛍光染色およびＥＬＩＳＡの結果を示す。図２（Ａ）は、腫瘍細胞で過剰発現させた後のＣＤ２７およびＳＥＭＧの有意な共局在化を示す。図２（Ｂ）は、ＥＬＩＳＡの結果を示し、ＣＤ２７が陰性対照タンパク質に結合せず、濃度効果がない一方で、マイクロプレート中のＳＥＭＧ２との結合に対するＣＤ２７の濃度依存性の効果を証明する。
【図3】図３は、ＳＥＭＧ２フラグメント（すなわち、Ｐ１～Ｐ６）がＣＤ２７に結合するかどうかを調べるための共免疫沈降アッセイの結果を示す。Ｐ５フラグメントは、ＣＤ２７と有意に結合していることが検出された。
【図4】図４は、ＳＥＭＧ２フラグメント（すなわち、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７）がＣＤ２７に結合するかどうかを調べるための共免疫沈降アッセイの結果を示す。Ｐ７配列はＰ５の一部である“ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ”の配列に由来する。結果は、左パネルおよび右パネルを含む。左パネルは、ＳＥＭＧ２フラグメントとヒトＣＤ２７との結合を示し、右パネルは、ＳＥＭＧ２フラグメントとマウスＣＤ２７との結合を示す。この結果から、ヒトおよびマウスＣＤ２７の両方が、Ｐ５およびＰ７フラグメントに結合し得ることが示された。
【図5】図５は、アラニンスキャニング法によって正確に示された、ＣＤ２７タンパク質との結合に対するＰ７の各アミノ酸の寄与を、パネルＡおよびパネルＢを含めて示す。パネルＡは、Ｐ７の各アミノ酸を一つずつグリシンに置換して生じた配列、すなわち、１～１３番の変異したアミノ酸配列を示す。パネルＢは共免疫沈降実験の結果であり、変異体１－１３ポリペプチドのＧＦＰ融合タンパク質がＣＤ２７に結合する程度を示す；ここで、変異体５および９はＣＤ２７との結合を完全に失い、変異体１１および１３はＳＥＭＧ２ （４９７－５０９）およびＣＤ２７の結合に影響を与えず、他の部位 （１, ２, ３, ４, ６, ７, ８, １０, １２）の変異体もＳＥＭＧ２ （４９７－５０９）およびＣＤ２７の結合を多少弱めていることが示される。ＳＥＭＧ２の４９７位、４９８位、４９９位、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位および５０８位に位置するアミノ酸は、ＣＤ２７との結合に明らかな影響を及ぼす。
【0032】
【図6】図６は、ＳＥＭＧ２エピトープポリペプチドとＣＤ２７との結合、および完全長ＳＥＭＧ２のＣＤ２７への結合の競合的阻害を示す。（Ａ）図６Ａは、ＢＳＡ結合ヒトＳＥＭＧ２（４９７－５０９）ポリペプチドおよびサルＳＥＭＧ２ポリペプチドがそれぞれマイクロプレート上のＣＤ２７タンパク質に結合できることを示し、これは陰性ＢＳＡ対照のそれよりも有意に高く、したがってＣＤ２７がヒトおよびサルＳＥＭＧ２（４９７－５０９）フラグメントの両方に結合できることを示す。（Ｂ）図６Ｂは、全長ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合に対するＳＥＭＧ２由来ポリペプチドおよび誘導体ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ、ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩ、ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱおよびＱＩＡＫＬＶＥＧＫＳＱの阻害効果を示す。図に示すように、異なる濃度のペプチドをまずＣＤ２７－Ｆｃと共インキュベートして結合させ、次にＳＥＭＧ２タンパク質で予コートしたマイクロ反応プレートに添加する。共インキュベーション後、未結合の分子をウォッシュアウトし、次いで抗Ｆｃ二次抗体－ＨＲＰを用いて検出および現像を行う。その結果、このポリペプチド分子は、全長ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害することができることが示された。
【図7】図７は、ＳＥＭＧ２または対照空ベクターを用いて安定的にトランスフェクトし、活性化ヒト末梢血単核細胞と共培養したＨＣＴ１１６細胞のアポトーシスアッセイを示す。（Ａ）図７Ａは、アポトーシス解析の代表的な画像であり、緑色フィールドは、アポトーシス細胞を示す。（Ｂ）図７Ｂは、３つの独立した生物学的実験の統計に基づく（エラーバーは標準偏差を表す）。
【図8】図８は、異なる腫瘍細胞におけるＳＥＭＧ２タンパク質の発現を示すためのイムノブロッティングアッセイを示す。腫瘍細胞の名称は、上に示されている（フォントは４５度傾いている）。試験した細胞株の約半分は、検出可能なＳＥＭＧ２タンパク質の発現を有する。
【図9】図９は、異なる腫瘍組織におけるＳＥＭＧ２タンパク質の発現を明らかにする免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイの結果を示す。（Ａ）図９Ａは、正常大腸組織を対照として、異なる結腸直腸癌腫瘍組織におけるＳＥＭＧ２の発現を示す；（Ｂ）図９Ｂは、正常肺組織を対照として、異なる肺癌組織におけるＳＥＭＧ２の発現を示す；（Ｃ）図９Ｃは、前立腺癌、黒色腫および胃癌におけるＳＥＭＧ２陽性発現の代表画像を示す。スペースの制限のため、全ての腫瘍タイプの検出結果をここでは詳細に記載していない；（Ｄ）図９Ｄは、異なるタイプの腫瘍間のＳＥＭＧ２陽性発現比率である。陽性発現は、免疫組織化学的染色による中程度または強い陽性発現と定義される。組織チップ（各チップは５０以上の組織サンプルを含む）に基づく統計結果は、ＳＥＭＧ２の陽性発現率を示すためにパーセンテージでプロットされる。
【0033】
【図10】図１０は、カプラン・マイヤー因子生存解析の統計結果を示し、ＳＥＭＧ２の高発現（ＳＥＭＧ２免疫組織化学染色による中程度、強陽性と定義）は、結腸直腸癌患者における全生存期間の短縮と有意に関連していることが示唆される。０．００１以下のＰ値は、高度に有意な関連を示す。
【図11】図１１は、免疫組織化学的アッセイの結果を示す。上パネルは、肺癌における制御性Ｔリンパ球、すなわちＴｒｅｇの染色およびＳＥＭＧ２の染色の相関の統計的結果を示す。ＳＥＭＧ２免疫組織化学的染色の強度をレベル分けし、各視野のＴｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３抗体で標識）の数を個別にカウントして比較した。下パネルは、ＳＥＭＧ２陽性発現および陰性発現のそれぞれについて、Ｔｒｅｇを標識した代表画像である。
【図12】図１２は、ＥＬＩＳＡの結果を示す。縦軸は、ＥＬＩＳＡの読み取り値として正規化したＡ４０５吸光値を示し、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合の程度を示し、横軸は、添加した抗体の濃度を示す。実線はＳＥＭＧ２（４９７－５０９）を抗原として作製したポリクローナル抗体のブロッキング効果を示し、点線はＳＥＭＧ２の全長タンパク質を免疫原として作製したポリクローナル抗体のブロッキング効果を示す。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）によって生成されたポリクローナル抗体は、ブロッキング効果を発揮するために低い濃度を必要とし、すなわちＳＥＭＧ２（４９７－５０９）によって生成された抗体のブロッキング力価は、ＳＥＭＧ２全長タンパク質よりも高いことを示す。これは、重要な役割のエピトープであるＳＥＭＧ２（４９７－５０９）の認識により、ブロッキング抗体の開発がより容易になることを示唆している。
【0034】
【図14】図１４は、マウスモノクローナル抗体およびヒト化マウスモノクローナル抗体のＳＥＭＧ２タンパク質に対する結合能を示す。ＥＬＩＳＡの読み取り値であるＯＤ４５０吸光度を縦軸とし、横軸は添加した抗体濃度の違いを示す。ＥＬＩＳＡシステム内の抗体の濃度が高くなるにつれて、ＯＤ４５０値は徐々に増加し、マウスモノクローナル抗体（図１４Ａ）またはヒト化モノクローナル抗体（図１４Ｂ）へのＳＥＭＧ２の結合が徐々に増加することが示される。適合曲線は、３つの独立した生物学的実験からの統計に基づく代表的な結果である。
【図15】図１５は、ＢＳＡ－ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）に結合し、ＳＥＭＧ２と受容体タンパク質との結合を阻止するマウスモノクローナル抗体の能力を示す。（Ａ）パネルＡは、ＥＬＩＳＡ、ＯＤ４５０吸光度の読み取りを縦軸として用い、横軸は、異なる濃度で添加した抗体を示し、これは、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）とマウスモノクローナル抗体との結合が徐々に増加することを示す。（Ｂ）パネルＢは、マウスモノクローナル抗体がＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止し、そのブロッキング効果は濃度の上昇に伴って増加することを示す。対照マウスＩｇＧ抗体はブロッキング機能を示さない。縦軸は正規化したブロッキング比であり、横軸は添加した抗体の濃度の違いを示す。ＥＬＩＳＡシステムにおいて、抗体濃度の上昇に伴い、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７の結合は徐々に減少している。適合曲線は、３つの独立した生物学的実験の統計に基づく（エラーバーは標準偏差を表す）。
【図16】図１６は、ＥＬＩＳＡの結果を示す。縦軸は、ＳＥＭＧ２（ＥＬＩＳＡプレートの表面上に固定）と添加したＣＤ２７－Ｆｃとの結合の程度を示す、ＥＬＩＳＡの読み取りとしての正規化ＯＤ４５０吸光度を示し、横軸は、異なる実験条件、すなわち、異なる抗体を共インキュベート（濃度は１０μｇ／ｍＬである）することを示す。ＨＰＡ０４２７６７およびＨＰＡ０４２８３５はそれぞれ、ＳＥＭＧ２（３５４－４０３）およびＳＥＭＧ２（５６３－５７４）に対するウサギポリクローナル抗体である；ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３、ＭＭ１４はＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに対するマウスモノクローナル抗体である。その結果、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに対するマウスモノクローナル抗体は、他のエピトープに対する抗体ではなく、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止することが示された。この実験は、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに対するマウスモノクローナル抗体が機能的に同じタイプの抗体に属することを実証している。
【図17】図１７は、Ｔ細胞による腫瘍細胞殺傷効果に対する異なるタイプの抗体の効果を示す。活性化したヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）を、ＳＥＭＧ２を高発現するヒト黒色腫細胞Ａ３７５または結腸直腸癌細胞ＬＯＶＯそれぞれと共培養し、一方で異なる抗体：無関係のマウスＩｇＧ、ＨＰＡ０４２７６７、ＨＰＡ０４２８３５、ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３またはＭＭ１４を添加する。縦軸はアポトーシス腫瘍細胞の割合を示し、横軸は実験における異なる処置条件、すなわち添加された異なる抗体を示す。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに対するマウスモノクローナル抗体（ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３またはＭＭ１４）は、Ｔ細胞による殺腫瘍効果を著しく促進し、一方、対照の無関係なＩｇＧまたはＳＥＭＧ２（３５４－４０３）およびＳＥＭＧ２（５６３－５７４）抗原性エピトープに対するＨＰＡ０４２７６７抗体およびＨＰＡ０４２８３５抗体は、このような機能を示さない。これは、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープが腫瘍細胞により発現されるＳＥＭＧ２の免疫逃避機能における重要部位であり、このエピトープに対する抗体は、抗腫瘍免疫調節機能において同じタイプに属することを示す。
【0035】
【図18】図１８は、ＳＥＭＧ２ブロッキング抗体存在下で、異なる腫瘍細胞に対するＴ細胞殺傷実験の結果を示す。ここで、Ａ３７５およびＬＯＶＯはＳＥＭＧ２タンパク質を高発現している腫瘍細胞であるが、ＤＬＤ１、ＮＣＭ４６０およびＮＣＩ－Ｈ１９７５はＳＥＭＧ２陰性細胞である。腫瘍細胞に対するＴ細胞殺傷実験では、異なる抗体、すなわち、無関係なマウスＩｇＧ抗体、ＭＭ０２またはＭＭ０５マウスモノクローナル抗体を添加する。横軸は異なる腫瘍細胞株を表し、縦軸はアポトーシス腫瘍細胞の割合を表す。ＳＥＭＧ２の発現が高い腫瘍細胞（Ａ３７５およびＬＯＶＯ）は、抗体処理後にＴ細胞によってより効果的に死滅させることができるが、ＳＥＭＧ２発現のない腫瘍細胞（ＤＬＤ１、ＮＣＭ４６０およびＮＣＩ－Ｈ１９７５）では、ＳＥＭＧ２ブロッキング抗体ＭＭ０２およびＭＭ０５を投与してもアポトーシスレベルに明らかな増大は見られない。このことは、ＳＥＭＧ２の陽性発現が、ＳＥＭＧ２ブロッキング抗体投与の選択的マーカーとして使用できることを示す。ＳＥＭＧ２ブロッキング抗体を抗腫瘍免疫薬として用いるとき、ＳＥＭＧ２の発現は、適切な患者を選択するための指針的な意味を有する。
【図19】図１９は、異なる抗体に対するＳＥＭＧ２の結合の程度を検出するためのＥＬＩＳＡにおける読み取り値として、Ａ４５０吸光度を示す。ＳＥＭＧ２からの異なる抗原（左側に示す）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、ＨＰＡ０４２７６、ＨＰＡ０４２８３５、ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３、ＭＭ１４と結合させ、その後、抗マウス二次抗体（ＨＰＡ０４２７６、ＨＰＡ０４２８３５、ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８に対して）または抗ウサギ二次抗体（ＨＰＡ０４２７６、ＨＰＡ０４２８３５に対して）を用いて結合抗体を検出した。ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３およびＭＭ１４はいずれもＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに結合し、同一タイプに属する。ＨＰＡ０４２７６はＳＥＭＧ２（３５４－４０３）エピトープに結合し、ＨＰＡ０４２８３５はＳＥＭＧ２（５６３－５７４）エピトープに結合する。
【図20】図２０は、ＥＬＩＳＡで検出された値、すなわちＯＤ４５０吸光度を表す。この実験では、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープペプチドおよびそのグリシンスキャン変異体（すなわち、アミノ酸を一つずつグリシンに置換した変異体）ポリペプチドをＥＬＩＳＡプレート上に固定化し、さらに図に示すように異なる抗体に結合させる。この実験により、異なるモノクローナル抗体が結合する正確なアミノ酸エピトープ、および結合抗体に対する各アミノ酸の相対的重要度を決定する。対照抗体ＨＰＡ０４２７６およびＨＰＡ０４２８３５はエピトープおよび変異体に結合しないこと、異なる部位のアミノ酸が抗体の結合に異なる寄与をしていること、そしてＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止する各抗体（ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３、ＭＭ１４）の結合する重要なアミノ酸は類似していることが分かった。このことは、ブロッキング機能を有する抗体は、結合エピトープの点で同じタイプに属することを示唆する。
【0036】
【図23】図２３は、異なるヒト抗体Ｈ８８－９３、Ｈ８８－９６およびＨ８８－６７がＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止する効果を示す、ＥＬＩＳＡ結果を示す。すべての抗体濃度は１０μｇ／ｍＬである。抗体クローンＨ８８－９３、Ｈ８８－９６およびＨ８８－６７はすべて、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープを用いて天然ファージライブラリーでスクリーニングされた全長ヒト抗体である。
【図24】図２４は、共培養したＡ３７５およびＬＯＶＯ腫瘍細胞のＴ細胞による殺傷程度、ならびに殺傷効果に対するヒト抗体Ｈ８８－９３、Ｈ８８－９６およびＨ８８－６７の影響を示す。結果は、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに対する３つの抗体は、Ｔ細胞によるＳＥＭＧ２発現腫瘍細胞の殺傷を有意に促進することを実証する。
【発明を実施するための形態】
【0037】
詳細な説明
以下、詳細な説明により本発明をさらに説明する。
以下、詳細な説明により本発明をさらに説明する。
【0038】
異なる定義がされていない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0039】
本願において、単数形“a”、“an”および“the”は、文脈が明らかに異なる指示をする場合を除き、複数形の参照を含む。
【0040】
本明細書で用いる用語“対象”としては、何れかのヒトまたは非ヒト動物が挙げられる。用語“非ヒト霊長動物”には、哺乳動物または非哺乳動物、例えば非ヒト霊長動物、羊、イヌ、ネコ、ウシ、ニワトリ、ラット、マウス、両生類、爬虫類等の全ての脊椎動物が含まれる。特記されない限り、用語“患者”および“対象”は互換的に用いられ得る。本発明において、対象は、好ましくはヒトである。
【0041】
本明細書で用いる用語“ＳＥＭＧ２”は、ヒトセメノジェリン（human semenogelin）２であり、ヒト精液中の主要成分の１つで、精嚢腺から分泌され、コロイド状物質を形成して精子細胞を被覆し、その動きを制限するものである。精液中の前立腺から分泌されるタンパク質分解酵素および線維素溶解（fibrinolytic）酵素は、セメノジェリンを分解して、精液の液化を促進し、精子がより自由に動けるようにすることができる。Yoshida K, Karzai ZT, Krishna Z, Yoshika M, Kawano N, Yoshida M, et al., Cell Motil Cytoskeleton. 2009;66(2):99-108を参照のこと。ＳＥＭＧ２タンパク質から単離された“ＳｇＩＩ Ａ”ポリペプチドは抗菌活性を有し、その配列はＨ－ＫＱＥＧＲＤＨＤＫＳＫＧＨＦＨＭＩＶＩＨＨＫＧＧＱＡＨＨＧ－ＯＨである。なお、本発明で述べたＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合の鍵となるアミノ酸配列とは異なり、抗菌ペプチド配列はＳＥＭＧ２の全く異なる領域に存在することが特記される。Edstroem AM, Malm J, Frohm B, Martellini JA, Giwercman A, Moergelin M, et al., J Immunol. 2008;181(5):3413-21を参照のこと。さらに、ＳＥＭＧ２は亜鉛イオンと結合し、前立腺タンパク質分解酵素ＰＳＡの活性に影響を与えることも報告されている。Jonsson M, Linse S, Frohm B, Lundwall A, Malm J. Biochem J. 2005;387(Pt 2):447-53を参照のこと。
【0042】
本明細書で用いる用語“抗体”は、無傷の抗体および何れかの抗原結合フラグメント（すなわち、“抗原結合部分”）またはその一本鎖を含む。“抗体”とは、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖がジスルフィド結合で連結されたタンパク質、またはその抗原結合部分を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中、ＶＨと略記）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中、ＶＬと略記）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域はＣＬドメインからなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される高可変領域にさらに細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原相互作用のための結合ドメインが含まれる。
【0043】
用語“抗体”は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントもしくは誘導体を意味し、インビトロまたはインビボで産生されたかどうかにかかわらず、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドを含む。この用語には、マルチクローナル抗体（multi-clone）、モノクローナル抗体、一重特異性抗体、多重特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド化抗体、突然変異抗体（mutation）および移植抗体が含まれるが、これらに限定されない。用語“抗体”はまた、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなどの抗体フラグメント、および抗原結合機能を保持する、すなわちＰＤ－１に特異的に結合し得る、他の抗体フラグメントも含まれる。一般的に、かかるフラグメントは、抗原結合フラグメントを含み得る。
【0044】
用語“抗原結合フラグメント”、“抗原結合ドメイン”および“結合フラグメント”とは、特定の抗体と抗原との結合を担うアミノ酸を含む抗体分子を意味する。例えば、抗原が大きく、抗原結合フラグメントが抗原の一部のみと結合する。つまり、抗原結合フラグメントと特異的な相互作用を担う抗原分子の部分を“エピトープ”または“抗原決定基”と称する。
【0045】
抗原結合フラグメントは、一般的に、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むが、必ずしも両方を含む必要はない。例えば、いわゆるＦｄ抗体フラグメントは、ＶＨドメインのみから構成されるが、無傷の抗体の抗原結合機能の一部を依然として保持している。
【0046】
用語“エピトープ”とは、結合フラグメントと特異的に結合する／結合フラグメントを認識する抗原決定基と定義される。結合フラグメントは、標的構造に固有のコンフォメーションまたは連続エピトープと特異的に結合／反応することができ、該コンフォメーションまたは不連続エピトープは、ポリペプチド抗原が一次配列において２以上の離れた離散アミノ酸残基であるが、ポリペプチドが天然タンパク質／抗原に折り畳まれるときに分子表面上で一体となって凝集することを特徴としている。エピトープの２以上の離散アミノ酸残基は、１以上のポリペプチド鎖の別個の部分に存在する。ポリペプチド鎖が三次元構造に折り畳まれると、これらのアミノ酸残基は分子表面に集まり、エピトープを形成する。これに対して、２以上の離散アミノ酸残基からなる連続エピトープまたは線状エピトープは、ポリペプチド鎖の単一の線状セグメント内に存在する。
【0047】
用語“処置する”または“処置”は、治療的処置および予防的／防止的措置の両方を意味する。処置を必要とする者には、特定の病状を既に有している個体、およびいずれその病状を獲得する可能性がある個体が含まれる。
【0048】
本明細書で用いる用語“ベクター”は、目的の含有外来遺伝子（例えば、本発明のポリヌクレオチド）の標的細胞における輸送、形質導入および発現のための分子ツールを意味する。このツールは、転写を開始する適切なヌクレオチド配列、すなわちプロモーターを提供する。
【0049】
本発明における用語“タグタンパク質”および“タンパク質タグ”は互換的であり、タンパク質の発現、検出、追跡および精製を容易にするために、ＤＮＡインビトロ組換え技術を用いて標的タンパク質と融合し発現させたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。タグタンパク質としては、Ｈｉｓ６、Ｆｌａｇ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＨＡ、ＧＦＰおよびＭｙｃなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【0050】
実施例
特に具体的に説明しない限り、以下の実施例における実施方法は、すべて常套法である。本発明は、以下の非限定的実験例を考慮することにより、さらに理解され得る。
特に具体的に説明しない限り、以下の実施例における実施方法は、すべて常套法である。本発明は、以下の非限定的実験例を考慮することにより、さらに理解され得る。
【0051】
実施例１：ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合の検出
ヒトＨＥＫ２９３細胞を直径１０ｃｍの培養皿で共トランスフェクションした。ｐｃＤＮＡ３－Ｆｌａｇ－ＳＥＭＧ２プラスミドおよびｐｃＤＮＡ３－ＨＡ－ＣＤ２プラスミドを含む複合体を共トランスフェクションして４８時間後に細胞を回収および溶解し、溶解液中のＣＤ２７を標準的な免疫沈降法により濃縮した。免疫沈降に用いた抗体はＦｌａｇ抗体であり、対照グループにはＩｇＧ非特異的抗体を用いた。その後、ＨＡ抗体を用いて共沈したＣＤ２７の量を検出し、Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降したＳＥＭＧ２の量を検出するイムノブロッティング（ウェスタンブロット）実験を行った。イムノブロッティングアッセイでは、細胞を１％トライトン Ｘ－１００中のRoche Complete プロテアーゼ阻害剤（ＴＢＳ ｐＨ７．６）により３０分間氷上で溶解させ、不溶物を遠心分離でペレット化した。５０ｍＭ ＤＴＴを含むＳＤＳサンプルバッファー中の溶解物を１００℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜（Millipore）に移した。細胞膜を５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＴＢＳでブロッキングし、上記抗体でプローブ化した。バンドはWest Pico (Thermo Fisher Scientific)で可視化した。
ヒトＨＥＫ２９３細胞を直径１０ｃｍの培養皿で共トランスフェクションした。ｐｃＤＮＡ３－Ｆｌａｇ－ＳＥＭＧ２プラスミドおよびｐｃＤＮＡ３－ＨＡ－ＣＤ２プラスミドを含む複合体を共トランスフェクションして４８時間後に細胞を回収および溶解し、溶解液中のＣＤ２７を標準的な免疫沈降法により濃縮した。免疫沈降に用いた抗体はＦｌａｇ抗体であり、対照グループにはＩｇＧ非特異的抗体を用いた。その後、ＨＡ抗体を用いて共沈したＣＤ２７の量を検出し、Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降したＳＥＭＧ２の量を検出するイムノブロッティング（ウェスタンブロット）実験を行った。イムノブロッティングアッセイでは、細胞を１％トライトン Ｘ－１００中のRoche Complete プロテアーゼ阻害剤（ＴＢＳ ｐＨ７．６）により３０分間氷上で溶解させ、不溶物を遠心分離でペレット化した。５０ｍＭ ＤＴＴを含むＳＤＳサンプルバッファー中の溶解物を１００℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜（Millipore）に移した。細胞膜を５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＴＢＳでブロッキングし、上記抗体でプローブ化した。バンドはWest Pico (Thermo Fisher Scientific)で可視化した。
【0052】
共免疫沈降実験では、細胞をＩＰバッファー（Thermo Scientific）およびRoche complete プロテアーゼ阻害剤で１０分間溶解させ、その後ベンゾナーゼ（sigma）を加えて室温にて２５分間溶解させた。その後、溶解物を１５，０００ｒｐｍ、４℃にて遠心分離し、沈殿物を除去した。上清を一次抗体とともに４℃にて一晩ゆっくり撹拌した後、プロテインＡまたはプロテインＧダイナビーズを加えて４℃にて２時間インキュベートし、ＰＢＳＴ（０．０１％ トゥイーン２０を含むＰＢＳ）で４回洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー中５０ｍＭ ＤＴＴで１００℃にて１０分間溶出し、ＳＤＳで分離し、そして上記のように免疫ブロットした。
【0053】
その結果、Ｆｌａｇ抗体を用いて沈殿させると、沈殿した複合体はＳＥＭＧ２およびＣＤ２７の両方を含むが、対照グループではＳＥＭＧ２もＣＤ２７も含まれないことがわかった。実験結果については、図１を参照のこと。この実験から、ＳＥＭＧ２とヒトＣＤ２７の間に物理的な相互作用があることがわかった。さらに、上記と同様の方法で、ＳＥＭＧ２とマウスＣＤ２７との相互作用を検出した。この実験では、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションにヒトＣＤ２７の代わりにマウスＣＤ２７を用いて、他の実験条件は変更しなかった。実験結果を図１に示す。この実験から、ＳＥＭＧ２とマウスＣＤ２７の間に物理的な相互作用があることがわかる。
【0054】
上記の共トランスフェクション実験条件下で、１０ｃｍ培養皿に予め配置した細胞スライドを固定、透過、ブロッキングし、さらにＣＤ２７およびＳＥＭＧ２について同時にＨＡタグ（マウス抗）およびＦｌａｇタグ（ウサギ抗）を含む抗体で免疫標識し、二次抗体でそれぞれ赤色および緑色に標識された。細胞内のＳＥＭＧ２およびＣＤ２７の共局在化を蛍光共焦点顕微鏡で観察した。その結果を図２に示す。共発現したＳＥＭＧ２タンパク質およびＣＤ２７タンパク質は、細胞内で明らかな共局在を示し、その局在パターンはほぼ同一であったとさえ言える。このことは、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７タンパク質との結合が確認されたことと一致する。
【0055】
実施例２：ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）フラグメントとＣＤ２７タンパク質との結合
ＳＥＭＧ２のどの部分がＣＤ２７に結合するのかをさらに確認するために、ＳＥＭＧ２タンパク質のフラグメントを設計した。全長ＳＥＭＧ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を６つの配列セグメントに分け、ＧＦＰと融合させ、ＳＥＭＧ２－Ｐ１、ＳＥＭＧ２－Ｐ２、ＳＥＭＧ２－Ｐ３、ＳＥＭＧ２－Ｐ４、ＳＥＭＧ２－Ｐ５およびＳＥＭＧ２－Ｐ６と名付けた（具体的配列は表１参照のこと、それぞれＰ１～Ｐ６と対応する略号を用いた）。これらのアミノ酸配列を発現するプラスミドをＣＤ２７と共トランスフェクトしてＨＥＫ２９３細胞に導入し、ＣＤ２７と結合するＳＥＭＧ２の主要なフラグメントを同定するために共免疫沈降実験を行った。共免疫沈降の結果を図３に示す。ＳＥＭＧ２－Ｐ５のみがＣＤ２７と有意に結合し、ＳＥＭＧ２－Ｐ１、ＳＥＭＧ２－Ｐ２、ＳＥＭＧ２－Ｐ３、ＳＥＭＧ２－Ｐ４およびＳＥＭＧ２－Ｐ６はＣＤ２７に結合しなかった。以上の結果から、ＳＥＭＧ２－Ｐ５フラグメントがＣＤ２７に結合する主要な部分であることが示された。
ＳＥＭＧ２のどの部分がＣＤ２７に結合するのかをさらに確認するために、ＳＥＭＧ２タンパク質のフラグメントを設計した。全長ＳＥＭＧ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を６つの配列セグメントに分け、ＧＦＰと融合させ、ＳＥＭＧ２－Ｐ１、ＳＥＭＧ２－Ｐ２、ＳＥＭＧ２－Ｐ３、ＳＥＭＧ２－Ｐ４、ＳＥＭＧ２－Ｐ５およびＳＥＭＧ２－Ｐ６と名付けた（具体的配列は表１参照のこと、それぞれＰ１～Ｐ６と対応する略号を用いた）。これらのアミノ酸配列を発現するプラスミドをＣＤ２７と共トランスフェクトしてＨＥＫ２９３細胞に導入し、ＣＤ２７と結合するＳＥＭＧ２の主要なフラグメントを同定するために共免疫沈降実験を行った。共免疫沈降の結果を図３に示す。ＳＥＭＧ２－Ｐ５のみがＣＤ２７と有意に結合し、ＳＥＭＧ２－Ｐ１、ＳＥＭＧ２－Ｐ２、ＳＥＭＧ２－Ｐ３、ＳＥＭＧ２－Ｐ４およびＳＥＭＧ２－Ｐ６はＣＤ２７に結合しなかった。以上の結果から、ＳＥＭＧ２－Ｐ５フラグメントがＣＤ２７に結合する主要な部分であることが示された。
【0056】
配列番号１（ヒトＳＥＭＧ２）：
ＭＫＳＩＩＬＦＶＬＳＬＬＬＩＬＥＫＱＡＡＶＭＧＱＫＧＧＳＫＧＱＬＰＳＧＳＳＱＦＰＨＧＱＫＧＱＨＹＦＧＱＫＤＱＱＨＴＫＳＫＧＳＦＳＩＱＨＴＹＨＶＤＩＮＤＨＤＷＴＲＫＳＱＱＹＤＬＮＡＬＨＫＡＴＫＳＫＱＨＬＧＧＳＱＱＬＬＮＹＫＱＥＧＲＤＨＤＫＳＫＧＨＦＨＭＩＶＩＨＨＫＧＧＱＡＨＨＧＴＱＮＰＳＱＤＱＧＮＳＰＳＧＫＧＬＳＳＱＣＳＮＴＥＫＲＬＷＶＨＧＬＳＫＥＱＡＳＡＳＧＡＱＫＧＲＴＱＧＧＳＱＳＳＹＶＬＱＴＥＥＬＶＶＮＫＱＱＲＥＴＫＮＳＨＱＮＫＧＨＹＱＮＶＶＤＶＲＥＥＨＳＳＫＬＱＴＳＬＨＰＡＨＱＤＲＬＱＨＧＰＫＤＩＦＴＴＱＤＥＬＬＶＹＮＫＮＱＨＱＴＫＮＬＳＱＤＱＥＨＧＲＫＡＨＫＩＳＹＰＳＳＲＴＥＥＲＱＬＨＨＧＥＫＳＶＱＫＤＶＳＫＧＳＩＳＩＱＴＥＥＫＩＨＧＫＳＱＮＱＶＴＩＨＳＱＤＱＥＨＧＨＫＥＮＫＩＳＹＱＳＳＳＴＥＥＲＨＬＮＣＧＥＫＧＩＱＫＧＶＳＫＧＳＩＳＩＱＴＥＥＱＩＨＧＫＳＱＮＱＶＲＩＰＳＱＡＱＥＹＧＨＫＥＮＫＩＳＹＱＳＳＳＴＥＥＲＲＬＮＳＧＥＫＤＶＱＫＧＶＳＫＧＳＩＳＩＱＴＥＥＫＩＨＧＫＳＱＮＱＶＴＩＰＳＱＤＱＥＨＧＨＫＥＮＫＭＳＹＱＳＳＳＴＥＥＲＲＬＮＹＧＧＫＳＴＱＫＤＶＳＱＳＳＩＳＦＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱＴＰＮＰＮＱＤＱＷＳＧＱＮＡＫＧＫＳＧＱＳＡＤＳＫＱＤＬＬＳＨＥＱＫＧＲＹＫＱＥＳＳＥＳＨＮＩＶＩＴＥＨＥＶＡＱＤＤＨＬＴＱＱＹＮＥＤＲＮＰＩＳＴ
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【0057】
【表1】
【0058】
ＳＥＭＧ２－Ｐ５配列とＣＤ２７との結合における重要なアミノ酸をさらに確認するために、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）フラグメントを選択し、ＳＥＭＧ２－Ｐ７と名付けた（具体的配列はＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱであり、Ｐ７またはＳＰ７と略記する）。ＳＥＭＧ２－Ｐ７（４９７－５０９）、ＳＥＭＧ２－Ｐ５（陽性対照）、ＳＥＭＧ２－Ｐ４（陰性対照）またはＳＥＭＧ２－Ｐ６（陰性対照）をそれぞれＣＤ２７と共トランスフェクトし、ヒトＣＤ２７およびマウスＣＤ２７を含むＨＥＫ２９３細胞へ導入した。その後行った共免疫沈降実験の結果、ＳＥＭＧ２－Ｐ７およびＳＥＭＧ２－Ｐ５は共にＣＤ２７に結合し、ヒトＣＤ２７およびマウスＣＤ２７の結果は同じであった。この実験結果を図４に示す。この共免疫沈降実験により、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）がヒトおよびマウスＣＤ２７に結合する主要構造であることが確認された。
【0059】
実施例３：グリシンスキャン（glycine scanning）法を用いたＣＤ２７に結合するＳＥＭＧ２の主要なアミノ酸の正確な特性評価
ＣＤ２７に結合するＳＥＭＧ２のエピトープをより高い解像度で特性評価し、ＣＤ２７タンパク質との結合に対するＳＥＭＧ２（４９７－５０９）の各アミノ酸の寄与をより正確に示すために、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）の各アミノ酸を１つずつグリシンに置換し、得られた配列を番号１～１３の変異アミノ酸配列とした（図５参照）。これらの変異体プラスミドおよびＣＤ２７発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトし、ＧＦＰ融合１－１３ポリペプチド変異体のＣＤ２７への結合の程度を共免疫沈降アッセイにより検出した。実験結果は図５に示すとおりであり、ここで、変異体５および９はＣＤ２７との結合を完全に失い、変異体１１および１３はＳＥＭＧ２（４９７－５０９）のＣＤ２７への結合に影響を与えず、他の部位（１、２、３、４、６、７、８、１０、１２）の変異体はＳＥＭＧ２（４９７－５０９）とＣＤ２７との結合をある程度弱めることが確認された。したがって、ＳＥＭＧ２の４９７位、４９８位、４９９位、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位および５０８位のアミノ酸は、ＣＤ２７との結合に明らかな影響を与えることが分かる。ペプチド配列４９７－５０９をＢＳＡに結合させ、９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。種々の濃度のＣＤ２７－ｈＦｃを一次抗体として用いて、ＣＤ２７のペプチド配列への結合能力を検出した。この結果は、ＣＤ２７濃度がＳＥＭＧ２への結合に及ぼす影響が存在することを示している。
ＣＤ２７に結合するＳＥＭＧ２のエピトープをより高い解像度で特性評価し、ＣＤ２７タンパク質との結合に対するＳＥＭＧ２（４９７－５０９）の各アミノ酸の寄与をより正確に示すために、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）の各アミノ酸を１つずつグリシンに置換し、得られた配列を番号１～１３の変異アミノ酸配列とした（図５参照）。これらの変異体プラスミドおよびＣＤ２７発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトし、ＧＦＰ融合１－１３ポリペプチド変異体のＣＤ２７への結合の程度を共免疫沈降アッセイにより検出した。実験結果は図５に示すとおりであり、ここで、変異体５および９はＣＤ２７との結合を完全に失い、変異体１１および１３はＳＥＭＧ２（４９７－５０９）のＣＤ２７への結合に影響を与えず、他の部位（１、２、３、４、６、７、８、１０、１２）の変異体はＳＥＭＧ２（４９７－５０９）とＣＤ２７との結合をある程度弱めることが確認された。したがって、ＳＥＭＧ２の４９７位、４９８位、４９９位、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位および５０８位のアミノ酸は、ＣＤ２７との結合に明らかな影響を与えることが分かる。ペプチド配列４９７－５０９をＢＳＡに結合させ、９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。種々の濃度のＣＤ２７－ｈＦｃを一次抗体として用いて、ＣＤ２７のペプチド配列への結合能力を検出した。この結果は、ＣＤ２７濃度がＳＥＭＧ２への結合に及ぼす影響が存在することを示している。
【0060】
実施例４：腫瘍細胞によって発現されたＳＥＭＧ２は、免疫細胞によって腫瘍を殺す効果を阻害する
腫瘍細胞のＴ細胞介在細胞死アッセイ。ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸癌細胞を、ＳＥＭＧ２発現ベクターまたは対照の空ベクターで安定的にトランスフェクトし、活性化ＰＢＭＣと共培養した後のアポトーシス細胞の割合をカスパーゼ３／７溶解アッセイ（緑色蛍光アッセイ）により決定した。具体的には、ＳＥＭＧ２を安定的に発現しているＨＣＴ１１６細胞を９６ウェルプレートに播種した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；＃７００２５、Stem Cell）を１００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３抗体、１００ｎｇ／ｍＬのＣＤ２８抗体および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２（＃３１７３０３；＃３０２９１３；＃５８９１０２、BioLegend）でそれぞれ活性化して、蛍光カスパーゼ３／７基質の存在下で結腸直腸癌細胞（＃４４４０、Essen Bioscience）と共に１０：１で共培養を行った。１０時間後、細胞を蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図７に示す。対照細胞と比較して、ＳＥＭＧ２を過剰発現する腫瘍細胞は、活性化ＰＢＭＣとの共培養後に、有意に減少したアポトーシスを示した。この実験結果は、ＳＥＭＧ２が免疫細胞機能を抑制する役割を有することを裏付けるものである。
腫瘍細胞のＴ細胞介在細胞死アッセイ。ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸癌細胞を、ＳＥＭＧ２発現ベクターまたは対照の空ベクターで安定的にトランスフェクトし、活性化ＰＢＭＣと共培養した後のアポトーシス細胞の割合をカスパーゼ３／７溶解アッセイ（緑色蛍光アッセイ）により決定した。具体的には、ＳＥＭＧ２を安定的に発現しているＨＣＴ１１６細胞を９６ウェルプレートに播種した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；＃７００２５、Stem Cell）を１００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３抗体、１００ｎｇ／ｍＬのＣＤ２８抗体および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２（＃３１７３０３；＃３０２９１３；＃５８９１０２、BioLegend）でそれぞれ活性化して、蛍光カスパーゼ３／７基質の存在下で結腸直腸癌細胞（＃４４４０、Essen Bioscience）と共に１０：１で共培養を行った。１０時間後、細胞を蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図７に示す。対照細胞と比較して、ＳＥＭＧ２を過剰発現する腫瘍細胞は、活性化ＰＢＭＣとの共培養後に、有意に減少したアポトーシスを示した。この実験結果は、ＳＥＭＧ２が免疫細胞機能を抑制する役割を有することを裏付けるものである。
【0061】
実施例５：種々の腫瘍細胞におけるＳＥＭＧ２発現の検出
ＬＯＶＯ結腸直腸癌、ＲＫＯ結腸直腸癌、ＰＣ３前立腺癌、Ａ３７５悪性黒色腫、ＳＷ１１１６結腸直腸癌、ＤＬＤ１結腸直腸癌、ＨＥＫ２９３ヒト腎臓上皮細胞株、ＨｅｐＧ２肝細胞癌、ＮＣＭ４６０ヒト正常結腸上皮細胞、ＮＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺腺癌、ＣａＣｏ２大腸腺癌、ＨＴ２９結腸直腸腺癌、ＳＷ１９９０ヒト膵臓腺癌、ＡＧＳヒト胃腺癌、ＳＷ４８０結腸直腸癌、ＳａＯＳ２骨肉腫、ＧＥＳ－１ヒト胃粘膜細胞等の異なる種類のヒト腫瘍細胞を、１０％仔牛血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて３７℃にて５％二酸化炭素の細胞インキュベーター中で培養した。
ＬＯＶＯ結腸直腸癌、ＲＫＯ結腸直腸癌、ＰＣ３前立腺癌、Ａ３７５悪性黒色腫、ＳＷ１１１６結腸直腸癌、ＤＬＤ１結腸直腸癌、ＨＥＫ２９３ヒト腎臓上皮細胞株、ＨｅｐＧ２肝細胞癌、ＮＣＭ４６０ヒト正常結腸上皮細胞、ＮＣＩ－Ｈ１９７５ヒト非小細胞肺腺癌、ＣａＣｏ２大腸腺癌、ＨＴ２９結腸直腸腺癌、ＳＷ１９９０ヒト膵臓腺癌、ＡＧＳヒト胃腺癌、ＳＷ４８０結腸直腸癌、ＳａＯＳ２骨肉腫、ＧＥＳ－１ヒト胃粘膜細胞等の異なる種類のヒト腫瘍細胞を、１０％仔牛血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて３７℃にて５％二酸化炭素の細胞インキュベーター中で培養した。
【0062】
イムノブロッティングアッセイでは、細胞を１％トライトン Ｘ－１００ （ＴＢＳ ｐＨ７．６）中の Roche complete プロテアーゼ阻害剤と共に３０分間氷上で溶解させ、不溶性物質を遠心分離によりペレット化した。５０ｍＭ ＤＴＴを含むＳＤＳサンプルバッファーに溶解した溶解物を１００℃にて１０分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜（Millipore）に移した。細胞膜を５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＴＢＳでブロッキングし、ＳＥＭＧ２および内部対照のＧＡＰＤＨに対してそれぞれ特異的に一次抗体でプローブ化した。一次抗体は、ＨＲＰ結合二次抗体で標識した。バンドはＷｅｓｔ Ｐｉｃｏ (Thermo Fisher Scientific)で可視化した。結果を図８に示すが、ＳＥＭＧ２は、ＧＥＳ－１ヒト胃粘膜細胞およびＮＣＭ４６０ヒト正常大腸上皮細胞では発現されないが、ＬＯＶＯ結腸直腸癌、ＲＫＯ結腸直腸癌、ＰＣ３前立腺癌、Ａ３７５悪性黒色腫、ＳＷ１１１６結腸直腸癌、ＨＥＫ２９３ヒト腎臓上皮細胞株、ＨｅｐＧ２肝細胞癌、ＣａＣｏ２大腸腺癌、ＨＴ２９結腸直腸腺癌、ＡＧＳヒト胃腺癌、ＳＷ４８０結腸直腸癌およびＳａＯＳ２骨肉腫などを含む複数の種類の悪性腫瘍細胞で発現が観察された。この結果は、ＳＥＭＧ２が腫瘍においてユビキタスに発現しているタンパク質であることを示している。
【0063】
実施例６：免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いた異なる腫瘍細胞におけるＳＥＭＧ２発現の検出
免疫組織化学的染色のために、Shanghai Xinchao Biotechnology Companyから様々な腫瘍の組織チップを入手した。要約すれば、組織標本を抗ＳＥＭＧ２抗体（ＨＰＡ０４２７６７、Sigma Aldrichから購入、１：１００希釈）およびビオチン結合二次抗体と共にインキュベートし、その後、抗ビオチン－ビオチン－ペルオキシダーゼ複合体と共にインキュベートし、発色試薬アミノエチルカルバゾールを用いて観察した。組織学的スコアとして、染色強度を高（３）、中（２）、低（１）、陰性（０）の４群に分けた。
免疫組織化学的染色のために、Shanghai Xinchao Biotechnology Companyから様々な腫瘍の組織チップを入手した。要約すれば、組織標本を抗ＳＥＭＧ２抗体（ＨＰＡ０４２７６７、Sigma Aldrichから購入、１：１００希釈）およびビオチン結合二次抗体と共にインキュベートし、その後、抗ビオチン－ビオチン－ペルオキシダーゼ複合体と共にインキュベートし、発色試薬アミノエチルカルバゾールを用いて観察した。組織学的スコアとして、染色強度を高（３）、中（２）、低（１）、陰性（０）の４群に分けた。
【0064】
まず、結腸直腸癌腫瘍の組織チップにおけるＳＥＭＧ２の発現を染色し、正常結腸直腸組織を対照として用いた。その結果、結腸直腸癌組織においてＳＥＭＧ２の発現が広範囲にわたって高いことが見いだされた。結果を図９に示す。
【0065】
次に、異なる肺癌組織におけるＳＥＭＧ２の発現を染色し、正常肺組織を対照として用いた；肺癌組織においてＳＥＭＧ２の発現が広範囲に亘り高いことが見出された。結果を図９に示す。
【0066】
再度、前立腺癌、黒色腫および胃癌におけるＳＥＭＧ２の陽性発現を染色し、その結果を図９に示す。
【0067】
最後に、組織チップの染色に基づき、示された異なる腫瘍タイプにおけるＳＥＭＧ２発現の陽性率を算出した。陽性発現を、免疫組織化学的染色において中等度または強度の陽性発現と定義した。組織チップ（各チップは５０以上の組織サンプルを含む）に基づく統計結果を、図９にパーセンテージで示す。
【0068】
実施例７：ＳＥＭＧ２高発現と腫瘍予後不良との関連性の証明
免疫組織化学染色において、Shanghai Xinchao Biotechnology Co., Ltd.から様々な腫瘍の組織チップを入手し、全て生存期間情報の経過観察データを含んだ。免疫組織化学的検出を実施例６に記載の方法によって行った。結腸直腸癌を一例として、ＳＥＭＧ２の発現により患者を分類し、高ＳＥＭＧ２（免疫組織化学スコア２、３）および低ＳＥＭＧ２（免疫組織化学スコア０、１）の２群に分けた。カプラン・マイヤー法を用いて、２つの患者群の全生存期間を比較した。結果を図１０に示す。ＳＥＭＧ２が高発現している患者の生存期間は、ＳＥＭＧ２が低発現している腫瘍患者の生存期間より有意に短いことが分かった。また、肺癌（Ｐ＜０．０５）および胃癌（Ｐ＜０．０５）など他の腫瘍についても、このような有意な相関が見られた。以上の結果から、ＳＥＭＧ２は腫瘍の免疫回避に重要な分子であり、新たな抗腫瘍標的となり得ることが示唆された。
免疫組織化学染色において、Shanghai Xinchao Biotechnology Co., Ltd.から様々な腫瘍の組織チップを入手し、全て生存期間情報の経過観察データを含んだ。免疫組織化学的検出を実施例６に記載の方法によって行った。結腸直腸癌を一例として、ＳＥＭＧ２の発現により患者を分類し、高ＳＥＭＧ２（免疫組織化学スコア２、３）および低ＳＥＭＧ２（免疫組織化学スコア０、１）の２群に分けた。カプラン・マイヤー法を用いて、２つの患者群の全生存期間を比較した。結果を図１０に示す。ＳＥＭＧ２が高発現している患者の生存期間は、ＳＥＭＧ２が低発現している腫瘍患者の生存期間より有意に短いことが分かった。また、肺癌（Ｐ＜０．０５）および胃癌（Ｐ＜０．０５）など他の腫瘍についても、このような有意な相関が見られた。以上の結果から、ＳＥＭＧ２は腫瘍の免疫回避に重要な分子であり、新たな抗腫瘍標的となり得ることが示唆された。
【0069】
実施例８：ＳＥＭＧ２高発現と免疫抑制機能を有する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の浸潤との相関性の確認
腫瘍組織におけるＳＥＭＧ２発現と免疫抑制機能を有する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の浸潤との相関を分析するために、Shanghai Xinchao Biotechnology Co., Ltdから購入した種々の腫瘍組織チップを免疫組織化学分析法により検討した。肺癌を例として、腫瘍組織（Ｆｏｘｐ３抗体で標識）中のＴｒｅｇの浸潤度をＳＥＭＧ２の発現量によって比較した。その結果、ＳＥＭＧ２の発現が高いほど、より多くのＴｒｅｇが浸潤していることがわかった（組織間で統計的に有意な差があった、Ｐ＜０．０５）（図１１参照）。この結果は、ＳＥＭＧ２の発現が腫瘍の局所的な免疫微小環境と有意に相関することを示しており、ＳＥＭＧ２の発現は、免疫抑制状態のバイオマーカーおよび腫瘍免疫モジュレーターのコンパニオン診断マーカーとして用いることが可能であることを示している。
腫瘍組織におけるＳＥＭＧ２発現と免疫抑制機能を有する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の浸潤との相関を分析するために、Shanghai Xinchao Biotechnology Co., Ltdから購入した種々の腫瘍組織チップを免疫組織化学分析法により検討した。肺癌を例として、腫瘍組織（Ｆｏｘｐ３抗体で標識）中のＴｒｅｇの浸潤度をＳＥＭＧ２の発現量によって比較した。その結果、ＳＥＭＧ２の発現が高いほど、より多くのＴｒｅｇが浸潤していることがわかった（組織間で統計的に有意な差があった、Ｐ＜０．０５）（図１１参照）。この結果は、ＳＥＭＧ２の発現が腫瘍の局所的な免疫微小環境と有意に相関することを示しており、ＳＥＭＧ２の発現は、免疫抑制状態のバイオマーカーおよび腫瘍免疫モジュレーターのコンパニオン診断マーカーとして用いることが可能であることを示している。
【0070】
実施例９：ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）フラグメントを免疫原とする抗体の作製
具体的には、以下の工程を含む：（１）抗原調製、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）、すなわち“ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ”配列に従ってポリペプチドを合成し、免疫化のためにＶＬＰ担体に結合させる；別のグループの免疫原として完全長ＳＥＭＧ２タンパク質（Cusabioから購入、カタログ番号CSB-YP021002HU）を使用。（２）初回免疫化：ウサギの両後肢の毛の一部をハサミで取り除き、アルコールおよびヨウ素で皮膚を消毒する。フロイントの完全型アジュバント（ＦＣＡ）で乳化した抗原液１ｍＬを２ｍＬシリンジで吸引し、そのうちの０．５ｍＬを両足裏の皮下に注射する。（３）２回目の免疫化：１０～１４日後に両側窩部および鼠径部の腫脹したリンパ節に抗原液を、各リンパ節に０．１ｍＬ、残り１ｍＬをリンパ節付近の皮下に注射する。リンパ節が腫脹していない場合、または腫脹が明らかでない場合は、両側窩部および鼠径部皮下に直接注射する。（４）７－１０日後に耳介静脈から０．５－１．０ｍＬ採血し、血清を分離し、抗原１０μｇ／ｍＬでコーティングした間接ＥＬＩＳＡを用いて血清力価を測定する。力価が１：６４，０００以上の場合は採血する。（５）力価が基準に満たない場合は、アジュバント無添加の抗原液を耳介に注射して免疫する。すなわち、１週間以内に３回、それぞれ０．１、０．３、０．５ｍＬずつ注射する。１週間後に再度血液検査を行う。力価が条件を満たせば、直ちに採血し、抗血清をすべて回収する。
具体的には、以下の工程を含む：（１）抗原調製、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）、すなわち“ＱＩＥＫＬＶＥＧＫＳＱＩＱ”配列に従ってポリペプチドを合成し、免疫化のためにＶＬＰ担体に結合させる；別のグループの免疫原として完全長ＳＥＭＧ２タンパク質（Cusabioから購入、カタログ番号CSB-YP021002HU）を使用。（２）初回免疫化：ウサギの両後肢の毛の一部をハサミで取り除き、アルコールおよびヨウ素で皮膚を消毒する。フロイントの完全型アジュバント（ＦＣＡ）で乳化した抗原液１ｍＬを２ｍＬシリンジで吸引し、そのうちの０．５ｍＬを両足裏の皮下に注射する。（３）２回目の免疫化：１０～１４日後に両側窩部および鼠径部の腫脹したリンパ節に抗原液を、各リンパ節に０．１ｍＬ、残り１ｍＬをリンパ節付近の皮下に注射する。リンパ節が腫脹していない場合、または腫脹が明らかでない場合は、両側窩部および鼠径部皮下に直接注射する。（４）７－１０日後に耳介静脈から０．５－１．０ｍＬ採血し、血清を分離し、抗原１０μｇ／ｍＬでコーティングした間接ＥＬＩＳＡを用いて血清力価を測定する。力価が１：６４，０００以上の場合は採血する。（５）力価が基準に満たない場合は、アジュバント無添加の抗原液を耳介に注射して免疫する。すなわち、１週間以内に３回、それぞれ０．１、０．３、０．５ｍＬずつ注射する。１週間後に再度血液検査を行う。力価が条件を満たせば、直ちに採血し、抗血清をすべて回収する。
【0071】
ポリクローナル抗体精製の具体的な実験手順は、以下の通りである：（１）プロテインＡ セファロース ＣＬ－４Ｂ 親和性カラムの調製。プロテインＡセファロースＣＬ－４Ｂ充填剤（packing）１０ｍＬを調製するために、等量の充填剤およびＴＢＳ緩衝液を真空フラスコ内で混合し、撹拌して１５分間真空引きして充填剤中の気泡を除去する。ポンプを用いて充填速度を１ｍＬ／分－２ｍＬ／分に制御しながら、プロテインＡ セファロース ＣＬ－４Ｂ充填剤をガラスカラムにゆっくりと添加し、カラムの乾燥を防ぎ、ベッド容量の１０倍の予冷ＴＢＳ緩衝液でカラムを平衡化させる。（２）抗血清の調製。抗血清は、タンパク質の凝集を避けるため、氷水または４℃の冷凍庫でゆっくりと融解する。解凍中に生じた凝集体は、３７℃にて予加熱することにより溶解させることができる。固体のアジ化ナトリウムを０．０５％の濃度で添加し、１５，０００×ｇで４℃にて５分間遠心分離し、清澄化した抗血清を取り出し、フィルターでろ過して過剰な脂質を除去する。（３）親和性クロマトグラフィー。抗体をＴＢＳ緩衝液で１：５に希釈し、フィルターで濾過する。抗血清を０．５ｍＬ／分の速度でカラムに添加する。抗血清が充填剤に確実に結合するよう、カラムへの添加は２回連続で行い、添加時の廃液を保存しておく。ＴＢＳ緩衝液を用いてＡλ２８０ｎｍ＜０．００８まで洗浄し、ｐＨ２．７の溶出緩衝液を添加し、０．５ｍＬ／分の速度ですべてのタンパク質が流下するまで溶出する。中和緩衝液１００μＬを加えた１．５ｍＬ ＥＰチューブを用いて、溶出液を別々のチューブに回収する。撹拌後、溶出液のｐＨをｐＨ試験紙で確認する。ｐＨが７より低い場合は、抗体の変性を防ぐために中和緩衝液でｐＨ７．４程度に調整する。ｐＨ１．９の溶出緩衝液１０ｍＬをカラムに添加し、Ａλ２８０ｎｍ＜０．００８になるまで溶出液を上記方法により集める。各チューブ中のタンパク質含有量を分光光度計で測定した。
【0072】
実施例１０：抗体作製における免疫原としてのＳＥＭＧ２（４９７－５０９）と全長ＳＥＭＧ２とのブロッキング効果の比較
ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）配列フラグメントは、ＳＥＭＧ２がＣＤ２７に結合する際の重要なエピトープであり、比較的短い配列を有するため、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）を免疫原として用いて抗体を調製した方が、全長ＳＥＭＧ２を用いて抗体を調製するよりも、理論上ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害する機能を有する抗体分子を得ることが容易である。直接比較のため、実施例において、２つの方法による抗体産生の有効濃度の違いをＥＬＩＳＡ法を用いて検証した。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）を免疫原として作製した抗体および全長ＳＥＭＧ２を用いて作製した抗体を、異なる濃度（１０－２、１０－１、１００、１０１、１０２、１０３、１０４μｇ／ｍｌ）で酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）反応系に添加し、ＥＬＩＳＡ法による結合値を測定した。酵素免疫測定法の具体的な工程は以下の通りである：（１）ＳＥＭＧ２タンパク質抗原を５０ｍＭ 炭酸コーティングバッファ（ｐＨ９．６）で溶解させて抗原濃度を１０μｇ／ｍＬとし、９６ウェル ＥＬＩＳＡプレート (Corning 社製)に、１００μＬ／ウェルで添加し、４℃にて一晩静置する。（２）翌日、コーティング液を捨てた後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡを各ウェルに１５０μＬ添加し、３７℃にて２時間ブロッキングする。（３）ＰＢＳＴで３回洗浄後、図１２に示すように異なる終濃度となるように、各ウェルに表示抗体（ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）を免疫原として作製したポリクローナル抗体、ＳＥＭＧ２全長を免疫原として作製したポリクローナル抗体）を添加し、１０μｇ／ｍのＣＤ２７－Ｆｃ融合タンパク質（すなわち、ヒトＣＤ２７タンパク質の細胞外領域とヒト抗体のＦｃフラグメントを融合したもの）を添加し、３７℃にて２時間インキュベートする。（４） ＰＢＳＴで５回洗浄後、希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ二次抗体１００μｌを添加し、３７℃にて１時間インキュベートする。（５）ＰＢＳＴで５回洗浄後、発色剤で現像し、２０分後にマイクロプレートリーダーでＡ４５０吸収量を読み取った。
ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）配列フラグメントは、ＳＥＭＧ２がＣＤ２７に結合する際の重要なエピトープであり、比較的短い配列を有するため、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）を免疫原として用いて抗体を調製した方が、全長ＳＥＭＧ２を用いて抗体を調製するよりも、理論上ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害する機能を有する抗体分子を得ることが容易である。直接比較のため、実施例において、２つの方法による抗体産生の有効濃度の違いをＥＬＩＳＡ法を用いて検証した。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）を免疫原として作製した抗体および全長ＳＥＭＧ２を用いて作製した抗体を、異なる濃度（１０－２、１０－１、１００、１０１、１０２、１０３、１０４μｇ／ｍｌ）で酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）反応系に添加し、ＥＬＩＳＡ法による結合値を測定した。酵素免疫測定法の具体的な工程は以下の通りである：（１）ＳＥＭＧ２タンパク質抗原を５０ｍＭ 炭酸コーティングバッファ（ｐＨ９．６）で溶解させて抗原濃度を１０μｇ／ｍＬとし、９６ウェル ＥＬＩＳＡプレート (Corning 社製)に、１００μＬ／ウェルで添加し、４℃にて一晩静置する。（２）翌日、コーティング液を捨てた後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡを各ウェルに１５０μＬ添加し、３７℃にて２時間ブロッキングする。（３）ＰＢＳＴで３回洗浄後、図１２に示すように異なる終濃度となるように、各ウェルに表示抗体（ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）を免疫原として作製したポリクローナル抗体、ＳＥＭＧ２全長を免疫原として作製したポリクローナル抗体）を添加し、１０μｇ／ｍのＣＤ２７－Ｆｃ融合タンパク質（すなわち、ヒトＣＤ２７タンパク質の細胞外領域とヒト抗体のＦｃフラグメントを融合したもの）を添加し、３７℃にて２時間インキュベートする。（４） ＰＢＳＴで５回洗浄後、希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ二次抗体１００μｌを添加し、３７℃にて１時間インキュベートする。（５）ＰＢＳＴで５回洗浄後、発色剤で現像し、２０分後にマイクロプレートリーダーでＡ４５０吸収量を読み取った。
【0073】
実験結果を図１０に示す。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）を抗原として産生された抗体は、ＥＬＩＳＡ法で検出されるＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を低濃度で５０％減少させたが、ＳＥＭＧ２の全長タンパク質を免疫原として産生されたポリクローナル抗体は高濃度でのみその効果を発揮した（必要量は前者の３００倍強である）。すなわち、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）産生抗体のブロッキング力価は、ＳＥＭＧ２全長タンパク質産生抗体のブロッキング力価の３００倍以上であった。このことは、重要なエピトープであるＳＥＭＧ２（４９７－５０９）を認識することにより、ブロッキング抗体の開発が容易になり、当業者はより容易にＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止できる抗体を取得できることを示す。
【0074】
実施例１１：ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープペプチドおよびＳＥＭＧ２全長タンパク質を用いたマウスモノクローナル抗体の作製
ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）配列を用いてポリペプチドを合成し、免疫化用ＶＬＰ担体に結合させた。ＨＥＫ２９３細胞を用いて全長ＳＥＭＧ２タンパク質を発現させ、純度が９２％になるように試験し、ＳＥＭＧ２タンパク質のＣＤ２７への結合活性をＥＬＩＳＡで確認した。このタンパク質抗原およびポリペプチド抗原を用いて、それぞれ１０匹のマウスに免疫し、効果を高めるために複数回の免疫を行った：（１）１回目の免疫：抗原５０μｇ／マウス、フロイントの完全型アジュバントとともに皮下注射を複数回、３週間の間隔をおいて行う；（２）２回目の免疫：上記と同じ用量および経路、不完全型フロイントアジュバントとともに、３週間の間隔をおいて行う；（３）３回目の免疫：上記と同用量、アジュバントなし、腹腔内注射、３週間の間隔で行う；（４）ブースター免疫：用量５０μｇを腹腔内注射する。最後の注射から３日後に採血し、その力価および免疫効果を測定し、力価の高いマウスをハイブリドーマ融合スクリーニングのために選択した。サブクローニング後、モノクローナル抗体の標的抗原への結合をＥＬＩＳＡで検出し、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止する異なるモノクローナル抗体の機能をＥＬＩＳＡで測定した。
ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）配列を用いてポリペプチドを合成し、免疫化用ＶＬＰ担体に結合させた。ＨＥＫ２９３細胞を用いて全長ＳＥＭＧ２タンパク質を発現させ、純度が９２％になるように試験し、ＳＥＭＧ２タンパク質のＣＤ２７への結合活性をＥＬＩＳＡで確認した。このタンパク質抗原およびポリペプチド抗原を用いて、それぞれ１０匹のマウスに免疫し、効果を高めるために複数回の免疫を行った：（１）１回目の免疫：抗原５０μｇ／マウス、フロイントの完全型アジュバントとともに皮下注射を複数回、３週間の間隔をおいて行う；（２）２回目の免疫：上記と同じ用量および経路、不完全型フロイントアジュバントとともに、３週間の間隔をおいて行う；（３）３回目の免疫：上記と同用量、アジュバントなし、腹腔内注射、３週間の間隔で行う；（４）ブースター免疫：用量５０μｇを腹腔内注射する。最後の注射から３日後に採血し、その力価および免疫効果を測定し、力価の高いマウスをハイブリドーマ融合スクリーニングのために選択した。サブクローニング後、モノクローナル抗体の標的抗原への結合をＥＬＩＳＡで検出し、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止する異なるモノクローナル抗体の機能をＥＬＩＳＡで測定した。
【0075】
ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）を免疫原として調製したモノクローナル抗体のうち、図１３に示すように、２７株の第１バッチで１９株がブロッキング機能（ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害する）を有していた。ＳＥＭＧ２の全長タンパク質を免疫原として調製したモノクローナル抗体のうち、図１３に示すように、バッチで検証した結果、合計１０８株の抗体のうち、ブロッキング機能を有するものは１株のみであった。
【0076】
したがって、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープペプチドを免疫原として用いてモノクローナル抗体を調製することにより、ブロッキング抗体の探索効率が著しく向上した。マウスモノクローナル抗体のサブタイプ（表２）および配列（表３）を以下の表に示す。
【0077】
【表2】
【0078】
【表3】
【0079】
【表4】
【0080】
ＥＬＩＳＡプレートにＳＥＭＧ２タンパク質をコーティングし、一次抗体として連続希釈したマウスモノクローナル抗体を用い、ＳＥＭＧ２に対するマウスモノクローナル抗体の結合能を検出するために抗マウス二次抗体を用いた。結果を図１４Ａに示す。マウスモノクローナル抗体が、ＳＥＭＧ２タンパク質に対して優れた親和性を有することが示される。
【0081】
実施例１２：抗ＳＥＭＧ２ ｍＡｂのヒト化
マウス抗ＳＥＭＧ２モノクローナル抗体ＭＭ０５を、ヒト患者に用いるとき、免疫原性を低減するためにヒト化した。重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）の配列を、Protein Data Bank（ＰＤＢ）のヒト抗体配列と比較し、ホモロジーモデルを確立した。マウスｍＡｂの重鎖および軽鎖のＣＤＲは、抗原結合に必要な適切な構造を維持している可能性が最も高いヒトフレーム領域に移植した。必要に応じて、ヒト残基からマウス残基への逆変異または他の変異を設計した。例えば、ヒト化軽鎖ＶＬ－Ｖ２の９５位のアミノ酸をＫからＱに変異させ、ＩＭＧＴ分析に従って軽鎖の対応するＣＤＲ３配列をＱＱＳＹＳＬＰＷＴ（配列番号９５）に変換した。ヒト化ＶＨおよびＶＬ領域は、それぞれヒトＩｇＧｌの重鎖およびκ軽鎖の定常領域に融合させた。ｍＡｂ配列に対応する構築ベクターを用いて２９３Ｅ細胞で一過性トランスフェクションを行い、精製したｍＡｂのＳＥＭＧ２タンパク質への結合能をＥＬＩＳＡを用いて分析した。結果は吸光度で示しており、吸光度が高いほどヒト化抗体およびＳＥＭＧ２の相互作用が高いことを示す。本発明で得られた８種のヒト化抗体のＣＤＲ、軽鎖可変領域および重鎖可変領域、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を、以下の表４および表５に示す。図１４Ｂは、連続希釈したヒト化モノクローナル抗体のＳＥＭＧ２タンパク質への結合の適合カーブであり、その結果、ヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体のＳＥＭＧ２タンパク質への結合能を維持していることが示された。
マウス抗ＳＥＭＧ２モノクローナル抗体ＭＭ０５を、ヒト患者に用いるとき、免疫原性を低減するためにヒト化した。重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）の配列を、Protein Data Bank（ＰＤＢ）のヒト抗体配列と比較し、ホモロジーモデルを確立した。マウスｍＡｂの重鎖および軽鎖のＣＤＲは、抗原結合に必要な適切な構造を維持している可能性が最も高いヒトフレーム領域に移植した。必要に応じて、ヒト残基からマウス残基への逆変異または他の変異を設計した。例えば、ヒト化軽鎖ＶＬ－Ｖ２の９５位のアミノ酸をＫからＱに変異させ、ＩＭＧＴ分析に従って軽鎖の対応するＣＤＲ３配列をＱＱＳＹＳＬＰＷＴ（配列番号９５）に変換した。ヒト化ＶＨおよびＶＬ領域は、それぞれヒトＩｇＧｌの重鎖およびκ軽鎖の定常領域に融合させた。ｍＡｂ配列に対応する構築ベクターを用いて２９３Ｅ細胞で一過性トランスフェクションを行い、精製したｍＡｂのＳＥＭＧ２タンパク質への結合能をＥＬＩＳＡを用いて分析した。結果は吸光度で示しており、吸光度が高いほどヒト化抗体およびＳＥＭＧ２の相互作用が高いことを示す。本発明で得られた８種のヒト化抗体のＣＤＲ、軽鎖可変領域および重鎖可変領域、軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を、以下の表４および表５に示す。図１４Ｂは、連続希釈したヒト化モノクローナル抗体のＳＥＭＧ２タンパク質への結合の適合カーブであり、その結果、ヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体のＳＥＭＧ２タンパク質への結合能を維持していることが示された。
【0082】
【表5】
【0083】
実施例１３：ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープ特異的抗体および他のエピトープ特異的抗体との、ＳＥＭＧ２およびＣＤ２７の結合を阻止する際の機能的比較
ブロッキング抗体の調製におけるＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープの重要性を示すために、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止する際の異なるＳＥＭＧ２エピトープに対する抗体の機能を更に比較した。既存の市販抗体であるＨＰＡ０４２７６７およびＨＰＡ０４２８３５（いずれもSigma Aldrich Companyより購入）は、それぞれＳＥＭＧ２（３５４－４０３）およびＳＥＭＧ２（５６３－５７４）のエピトープに対するウサギポリクローナル抗体であることが知られている。
ブロッキング抗体の調製におけるＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープの重要性を示すために、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止する際の異なるＳＥＭＧ２エピトープに対する抗体の機能を更に比較した。既存の市販抗体であるＨＰＡ０４２７６７およびＨＰＡ０４２８３５（いずれもSigma Aldrich Companyより購入）は、それぞれＳＥＭＧ２（３５４－４０３）およびＳＥＭＧ２（５６３－５７４）のエピトープに対するウサギポリクローナル抗体であることが知られている。
【0084】
まず、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープ特異的抗体（例えば、ＭＭ０２、ＭＭ０５）と他のエピトープ特異的抗体（例えば、ＨＰＡ０４２７６７）について、異なる濃度範囲でのＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害する機能を比較した。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに対する上記抗体の結合をＥＬＩＳＡにより確認した：ＭＭ０２およびＭＭ０５は、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）に結合できたが、ＨＰＡ０４２７６７は図１５Ａに示すように、広範囲の濃度でこのエピトープに結合することができなかった。ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合に対する異なる抗体（無関係なマウスＩｇＧ、ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＨＰＡ０４２７６７）のブロッキング機能を、実施例１１に記載のＥＬＩＳＡ実験によって分析した。図１５Ｂに示すように、ＭＭ０２およびＭＭ０５の濃度が高くなるにつれて、ＳＥＭＧ２およびＣＤ２７の結合は徐々に減少し、この現象は無関係なマウスＩｇＧおよびＨＰＡ０４２７６７抗体の両者について認められ、後者は広い濃度範囲においてＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害する機能を有さないことが示される。これらの結果は、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープがブロッキング抗体の作製において重要であることを支持する。
【0085】
さらに、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合に対する異なる抗体の効果を、同じ抗体濃度の条件下で比較した。ＥＬＩＳＡでは、同一濃度（１０μｇ／ｍＬ）の抗体を用い、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合の強さを測定した。結果を図１６に示す。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに対するＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３およびＭＭ１４抗体は、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を有意に減少させるが、ＳＥＭＧ２の他のエピトープに対するＨＰＡ０４２７６７抗体およびＨＰＡ０４２８３５抗体はいずれもＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を減少させないことが示された。
【0086】
実施例１４：活性化ＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷におけるＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープ特異的抗体および他のエピトープ特異的抗体の効果の比較
この実施例では、ＳＥＭＧ２は活性化ＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷を阻害する機能を発揮している。ＳＥＭＧ２はＣＤ２７と結合することにより上記の役割を果たすと考えられ、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープはＣＤ２７との結合の鍵となる部位であることから、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープ特異的抗体は、ＳＥＭＧ２によるＰＢＭＣの腫瘍細胞死への影響を中和し得ると考えられる。
この実施例では、ＳＥＭＧ２は活性化ＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷を阻害する機能を発揮している。ＳＥＭＧ２はＣＤ２７と結合することにより上記の役割を果たすと考えられ、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープはＣＤ２７との結合の鍵となる部位であることから、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープ特異的抗体は、ＳＥＭＧ２によるＰＢＭＣの腫瘍細胞死への影響を中和し得ると考えられる。
【0087】
上記の仮説を検証するために、活性化ＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷に対する種々のエピトープ特異的抗体の効果を比較した。具体的には、ＳＥＭＧ２を高発現しているＡ３７５ヒト黒色腫細胞およびＬＯＶＯヒト結腸直腸癌細胞を９６ウェルプレートに播種した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；＃７００２５、Stem Cell）をＣＤ３抗体１００ｎｇ／ｍＬ、ＣＤ２８抗体１００ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ２（＃３１７３０３；＃３０２９１３；＃５８９１０２, BioLegend）でそれぞれ活性化して、蛍光カスパーゼ－３／７基質（＃４４４０, Essen Bioscience）存在下で上記の腫瘍細胞と１０：１の比で共培養した。１０時間後、細胞を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１７に示す。ＨＰＡ０４２７６７抗体もＨＰＡ０４２８３５抗体も活性化ＰＢＭＣに影響を与えず、腫瘍細胞を殺すことはできなかったが、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに対するＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３およびＭＭ１４抗体はアポトーシス腫瘍細胞比率を顕著に増加させることがわかった。以上の結果から、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープ特異的抗体は、ＳＥＭＧ２の活性を中和する（すなわち、ＰＢＭＣによる腫瘍細胞死に対するＳＥＭＧ２の阻害効果を消失させる）ことができることが明らかとなった。
【0088】
実施例１５：ＳＥＭＧ２の発現量およびブロッキング抗体のＰＢＭＣによる腫瘍細胞殺傷促進機能の相関性の検証
ＳＥＭＧ２の発現は、その腫瘍特異的免疫の阻害の前提条件であることから、ＳＥＭＧ２の発現は、ＳＥＭＧ２ブロッキング抗体投与の適否の条件にもなり得るものである。理論的には、ＳＥＭＧ２が高発現している腫瘍細胞は、ＳＥＭＧ２活性の中和後にＰＢＭＣによる腫瘍細胞死が相対的に増加する。ＳＥＭＧ２を発現しない腫瘍細胞は、ＳＥＭＧ２による免疫逃避機能に依存していないため、ＳＥＭＧ２活性の中和後にＰＢＭＣによる腫瘍細胞死は大きな変化を生じないと考えられる。
ＳＥＭＧ２の発現は、その腫瘍特異的免疫の阻害の前提条件であることから、ＳＥＭＧ２の発現は、ＳＥＭＧ２ブロッキング抗体投与の適否の条件にもなり得るものである。理論的には、ＳＥＭＧ２が高発現している腫瘍細胞は、ＳＥＭＧ２活性の中和後にＰＢＭＣによる腫瘍細胞死が相対的に増加する。ＳＥＭＧ２を発現しない腫瘍細胞は、ＳＥＭＧ２による免疫逃避機能に依存していないため、ＳＥＭＧ２活性の中和後にＰＢＭＣによる腫瘍細胞死は大きな変化を生じないと考えられる。
【0089】
上記の仮説を検証するために、ＳＥＭＧ２高発現腫瘍細胞（Ａ３７５、ＬＯＶＯ）およびＳＥＭＧ２陰性腫瘍細胞（ＤＬＤ１、ＮＣＭ４６０およびＮＣＩ－Ｈ１９７５）を選択した。腫瘍細胞に対するＰＢＭＣ殺傷実験中に、種々の抗体（無関係なマウスＩｇＧ抗体、ＭＭ０２またはＭＭ０５抗体）を添加した。結果を図１８に示す。ＭＭ０２およびＭＭ０５抗体は、活性化ＰＢＭＣによるＳＥＭＧ２陽性腫瘍細胞（Ａ３７５、ＬＯＶＯ）の殺傷を有意に増加させたが、ＳＥＭＧ２陰性腫瘍細胞（ＤＬＤ１、ＮＣＭ４６０およびＮＣＩ－Ｈ１９７５）の細胞死には明白な影響を与えなかった。したがって、上記の実験結果は、ＳＥＭＧ２の陽性発現が、ＳＥＭＧ２およびＣＤ２７ブロッキング抗体の投与のためのスクリーニング条件、すなわち、対応するバイオマーカーであることを示す。
【0090】
実施例１６：ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止するための抗体の関連エピトープの正確な定義付け
ブロッキング抗体（すなわち、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害できる抗体）および非ブロッキング抗体の結合エピトープを明確に区別するために、対応するＥＬＩＳＡ分析法を確立した。具体的には、ＳＥＭＧ２全長タンパク質（１－５８２）、ＳＥＭＧ２（３５４－４０３）フラグメント、ＳＥＭＧ２（４４２－４５３）フラグメント、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）フラグメントおよびＳＥＭＧ２（５６３－５７４）フラグメントをＥＬＩＳＡプレート上に固定化し、同じ濃度の抗体（ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３、ＭＭ１４、ＨＰＡ０４２７６７およびＨＰＡ０４２８３５）を添加した。その後、抗マウス二次抗体または抗ウサギ二次抗体を用いて、対応する結合抗体を検出した。結果を図１９に示す。ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３およびＭＭ１４は全て、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに結合し、ＨＰＡ０４２７６７はＳＥＭＧ２（３５４－４０３）エピトープに結合し、ＨＰＡ０４２８３５はＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに結合したが、いずれの抗体もＳＥＭＧ２（４４２－４５３）対照フラグメントには結合しなかった。これらの結果は、抗体の標識特異性を支持する。
ブロッキング抗体（すなわち、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害できる抗体）および非ブロッキング抗体の結合エピトープを明確に区別するために、対応するＥＬＩＳＡ分析法を確立した。具体的には、ＳＥＭＧ２全長タンパク質（１－５８２）、ＳＥＭＧ２（３５４－４０３）フラグメント、ＳＥＭＧ２（４４２－４５３）フラグメント、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）フラグメントおよびＳＥＭＧ２（５６３－５７４）フラグメントをＥＬＩＳＡプレート上に固定化し、同じ濃度の抗体（ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３、ＭＭ１４、ＨＰＡ０４２７６７およびＨＰＡ０４２８３５）を添加した。その後、抗マウス二次抗体または抗ウサギ二次抗体を用いて、対応する結合抗体を検出した。結果を図１９に示す。ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３およびＭＭ１４は全て、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに結合し、ＨＰＡ０４２７６７はＳＥＭＧ２（３５４－４０３）エピトープに結合し、ＨＰＡ０４２８３５はＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに結合したが、いずれの抗体もＳＥＭＧ２（４４２－４５３）対照フラグメントには結合しなかった。これらの結果は、抗体の標識特異性を支持する。
【0091】
ブロッキング抗体ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３、ＭＭ１４が結合する正確なエピトープ（単一アミノ酸のレベルで特異的）をさらに正確に定義するために、対応するＥＬＩＳＡ分析法を確立した。図２０に示すように、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）ポリペプチドおよびグリシンで１つずつ置換したポリペプチド配列群（グリシン変異スキャン配列群）をＥＬＩＳＡプレート上に固定化し、それぞれ同じ濃度の抗体（ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３、ＭＭ１４、ＨＰＡ０４２７６７およびＨＰＡ０４２８３５）を添加した。その後、抗マウス二次抗体または抗ウサギ二次抗体を用いて、対応する結合した抗体を検出した。結果を図２０に示す。ＨＰＡ０４２７６７およびＨＰＡ０４２８３５抗体は、該配列に結合せず、実験の特異性および２種類の抗体の異なるエピトープクラスが示された。一方、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）配列の異なるアミノ酸は、グリシンによる置換後、同様のブロッキング抗体（ＭＭ０２、ＭＭ０５、ＭＭ０７、ＭＭ０８、ＭＭ１３、ＭＭ１４）の結合に対して異なる程度の影響を及ぼした。例えば、５０７位および５０９位のアミノ酸の置換は、ＭＭ０２および類似の抗体の結合に大きな影響を与えなかった。５０１位および５０６位のアミノ酸の置換は、ＭＭ０２および類似の抗体の結合に大きな影響を与えた（７０％以上の減少）。他の部位のアミノ酸はグリシン置換後にＭＭ０２および類似の抗体の結合にある程度影響を与えた。この結果は、ＭＭ０２および類似の抗体（すなわち、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害する抗体）に関連するエピトープアミノ酸、および各アミノ酸の結合への寄与を正確に定義する。また、ブロッキング抗体との結合に参加するＳＥＭＧ２の主要なアミノ酸は、ＣＤ２７との結合に参加するアミノ酸と高い整合性があり、ＭＭ０２およびその類似の抗体がＣＤ２７と競合してＳＥＭＧ２に結合することが示され、抗体機能の分子機構を検証することができた。
【0092】
実施例１７：ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害し、ＰＢＭＣによる腫瘍細胞の殺傷を促進するＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープを用いた全長ヒト抗体の調製およびスクリーニング
実施例の結果は、ブロッキング抗体の調製においてＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープの重要性を示し、このエピトープを全長ヒト抗体のスクリーニングに適用した。具体的には、まず、ポリペプチド抗原の調製およびヒト天然抗体ライブラリーのスクリーニングを行った。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）ポリペプチドを合成し、それぞれＢＳＡおよびＫＬＨに結合させ、完全ヒトファージディスプレイ抗体ライブラリーでスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡを用いて、抗原性エピトープに結合するクローンを選択し予備スクリーニングに用いた。単一コロニーの配列決定後に異なるユニークな配列が得られ、親和性ソーティングに従って選別し、比較的高い親和性を有する抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）から完全長の抗体を構築した。精製後、結合能およびブロッキング機能試験を行った。すなわち、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合に対する抗体の効果をＥＬＩＳＡ実験により決定した。
実施例の結果は、ブロッキング抗体の調製においてＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープの重要性を示し、このエピトープを全長ヒト抗体のスクリーニングに適用した。具体的には、まず、ポリペプチド抗原の調製およびヒト天然抗体ライブラリーのスクリーニングを行った。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）ポリペプチドを合成し、それぞれＢＳＡおよびＫＬＨに結合させ、完全ヒトファージディスプレイ抗体ライブラリーでスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡを用いて、抗原性エピトープに結合するクローンを選択し予備スクリーニングに用いた。単一コロニーの配列決定後に異なるユニークな配列が得られ、親和性ソーティングに従って選別し、比較的高い親和性を有する抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）から完全長の抗体を構築した。精製後、結合能およびブロッキング機能試験を行った。すなわち、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合に対する抗体の効果をＥＬＩＳＡ実験により決定した。
【0093】
同じバッチのスクリーニングで、ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに結合し、ＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害する抗体のユニークな配列が合計３つ得られた。この３つのクローンをそれぞれＨ８８－９３、Ｈ８８－９６およびＨ８８－６７と命名した。対応する全長抗体の濃度がＳＥＭＧ２との結合に及ぼす影響を図２２Ａに示す。３つの全長ヒト抗体に対応するＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、ならびに対応するＣＤＲ配列を、表６および表７に示す。
【0094】
【表6】
【0095】
【表7】
【0096】
全長ヒト抗体およびマウス抗体のＳＥＭＧ２への結合能を試験した。すなわち、マウス抗体ＭＭ０２およびＭＭ０５ならびに濃度勾配希釈した全長ヒト抗体Ｈ８８－９３を混合し、ＳＥＭＧ２でコーティングした９６ウェルマイクロプレートに一次抗体として添加した。ＳＥＭＧ２に結合したマウスモノクローナル抗体は、抗マウスＨＲＰ二次抗体を用いて測定した。ブロッキング率は、以下の式に従って算出する：
ブロッキング率＝[１－（試験抗体群のＡ４５０－ブランク対照）/（陽性対照抗体のＡ４５０－空対照のＡ４５０）]×１００％。
ブロッキング率＝[１－（試験抗体群のＡ４５０－ブランク対照）/（陽性対照抗体のＡ４５０－空対照のＡ４５０）]×１００％。
【0097】
その結果、図２２に示すように、Ｈ８８－９３はＭＭ０２およびＭＭ０５とＳＥＭＧ２への結合について競合することがわかった。これは、全長ヒト抗体およびマウスモノクローナル抗体がＳＥＭＧ２に結合する同じタイプの抗体であり、ＭＭ０２、ＭＭ０５およびＨ８８－９３は全て、短いペプチドＳＥＭＧ２（４９７－５０９）に結合するので、このタイプの抗体はＳＥＭＧ２（４９７－５０９）結合抗体クラスとして定義できることが示された。
【0098】
さらに、ヒト抗体Ｈ８８－９３、Ｈ８８－９６およびＨ８８－６７のＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻止する効果をＥＬＩＳＡで検出した。図２３に示すように、全ての抗体が１０μｇ／ｍＬの濃度で、程度の差はあるがＳＥＭＧ２とＣＤ２７との結合を阻害した。
【0099】
活性化ＰＢＭＣの腫瘍細胞死機能に対するヒト抗体の効果を確認するために、Ａ３７５細胞およびＬＯＶＯ細胞を活性化ＰＢＭＣと共培養し、Ｈ８８－９３、Ｈ８８－９６またはＨ８８－６７抗体を同時に添加し、腫瘍細胞のアポトーシス比率を検出して比較した。結果を図２４に示す。ＳＥＭＧ２（４９７－５０９）エピトープに対する３つの全長ヒト抗体は、ＰＢＭＣ細胞によるＳＥＭＧ２発現腫瘍細胞の殺傷を顕著に促進できることが分かる。
【0100】
実施例１７：生体光干渉法による本発明のモノクローナル抗体の抗原に対する結合速度測定
ヒトＳＥＭＧ２に結合する本発明の抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を生体光干渉法（ForteBio BltzまたはGator装置）により決定した。例えば、ForteBio親和性アッセイを既存の方法に従って行った。すなわち、開始３０分前に、適量のＡＭＱ（Ｐａｌｌ、１５０６０９１）（サンプル検出用）またはＡＨＱ（Ｐａｌｌ、１５０２０５１）（陽性対照検出用）センサーを取り、ＳＤバッファー（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．０５％）に浸漬させた。９６ウェルの黒色ポリスチレンハーフエリアマイクロプレートにＳＤバッファー、抗体およびＳＥＭＧ２をそれぞれ１００μｌ添加した。サンプル位置のレイアウトをもとにセンサー位置を選択した。分子間相互作用解析ソフトウェアを用いてＫＤ値を解析した。アッセイの実験において、マウスモノクローナル抗体およびヒト抗体Ｈ８８－６７、Ｈ８８－９３およびＨ８８－９６の親和定数を表８に、ＳＥＭＧ２および対応するタンパク質の親和曲線および解離曲線を図２５に示す。
ヒトＳＥＭＧ２に結合する本発明の抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を生体光干渉法（ForteBio BltzまたはGator装置）により決定した。例えば、ForteBio親和性アッセイを既存の方法に従って行った。すなわち、開始３０分前に、適量のＡＭＱ（Ｐａｌｌ、１５０６０９１）（サンプル検出用）またはＡＨＱ（Ｐａｌｌ、１５０２０５１）（陽性対照検出用）センサーを取り、ＳＤバッファー（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．０５％）に浸漬させた。９６ウェルの黒色ポリスチレンハーフエリアマイクロプレートにＳＤバッファー、抗体およびＳＥＭＧ２をそれぞれ１００μｌ添加した。サンプル位置のレイアウトをもとにセンサー位置を選択した。分子間相互作用解析ソフトウェアを用いてＫＤ値を解析した。アッセイの実験において、マウスモノクローナル抗体およびヒト抗体Ｈ８８－６７、Ｈ８８－９３およびＨ８８－９６の親和定数を表８に、ＳＥＭＧ２および対応するタンパク質の親和曲線および解離曲線を図２５に示す。
【0101】
【表8】
【0102】
実施例１８：全長ヒトモノクローナル抗体の親和性成熟
全長ヒト抗体Ｈ８８－９６およびＨ８８－６７のＶＨおよびＶＬコーディング配列をテンプレートとして、遺伝子合成によりプラスミドを得た後、一点飽和変異および二点飽和変異をさせた。次に、抗体遺伝子を組み換えるために、インビトロライゲーション法を行った。最後に、組換え抗体のＦａｂ遺伝子配列をベクターに挿入し、形質転換して１０８ＣＦＵ以上の力価を有する４つのファージ親和性成熟抗体ライブラリーを得た。この抗体変異体ライブラリーをイムノチューブ勾配スクリーニングアッセイでスクリーニングし、野生型と比較して親和性が微細に改善された変異体を取得した。次に、検出されたＦａｂ配列、あるいはＦａｂ配列中のＶＨおよびＶＬ配列の組み換えに従って、全長親和性成熟ヒト抗体を構築した。Ｈ８８－６７由来のＶＨ配列およびＶＬ配列、ならびに親和性成熟後のＨ８８－９６のＶＨ配列のＣＤＲ領域を表９に示し、抗体の軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域を表９に示す。
全長ヒト抗体Ｈ８８－９６およびＨ８８－６７のＶＨおよびＶＬコーディング配列をテンプレートとして、遺伝子合成によりプラスミドを得た後、一点飽和変異および二点飽和変異をさせた。次に、抗体遺伝子を組み換えるために、インビトロライゲーション法を行った。最後に、組換え抗体のＦａｂ遺伝子配列をベクターに挿入し、形質転換して１０８ＣＦＵ以上の力価を有する４つのファージ親和性成熟抗体ライブラリーを得た。この抗体変異体ライブラリーをイムノチューブ勾配スクリーニングアッセイでスクリーニングし、野生型と比較して親和性が微細に改善された変異体を取得した。次に、検出されたＦａｂ配列、あるいはＦａｂ配列中のＶＨおよびＶＬ配列の組み換えに従って、全長親和性成熟ヒト抗体を構築した。Ｈ８８－６７由来のＶＨ配列およびＶＬ配列、ならびに親和性成熟後のＨ８８－９６のＶＨ配列のＣＤＲ領域を表９に示し、抗体の軽鎖および重鎖のＣＤＲ領域を表９に示す。
【0103】
【表9】
【0104】
【表10】
【0105】
上記の親和性成熟化処理により、親和性が向上した抗ヒトＳＥＭＧ２モノクローナル抗体、例えば、親和性成熟化した重鎖番号６７－３および親和性成熟化した軽鎖番号６７－３、６７－４、６７－５および６７－６の組み合わせからなる６７－３－６７－３、６７－３－６７－４、６７－３－６７－５および６７－３－６７－６を得た。抗体６７－９－６７－３は、重鎖番号６７－９および軽鎖番号６７－３の組み合わせからなり、抗体６７－６－６７－６は、軽鎖および重鎖番号６７－６の組み合わせからなり、重鎖番号９６－１０Ｒおよび９６－１０Ｖならびに軽鎖番号Ｈ８８－９６Ｌにより抗体９６－１０Ｒ－１０および９６－１０Ｖ－１０が再構成された。これらの軽鎖および重鎖からなる組換えモノクローナル抗体は、ＳＥＭＧ２およびＢＳＡ－Ｓ２（４９７－５０９）（すなわち、ＢＳＡ－ＳＰ７）に対して親抗体の１０倍以上高い親和性を有する（図２１Ｂ－Ｄを参照のこと）。
【0106】
実施例１９：ヒト悪性黒色腫Ａ３７５細胞のＰＢＭＣ－ＨＩＳモデルの異種移植モデルにおけるＳＥＭＧ２抗体の抗腫瘍効果の検証
６－８週齢の雄ＮＰＳＧマウスモデル３０匹を計量した。Ａ３７５細胞（ＳＥＭＧ２の内因性発現が確認されている）をインビトロで培養し、１．８×１０８個の細胞を取得した。３０匹のマウスにＰＢＭＣを接種した後、３日目にＡ３７５腫瘍細胞を接種した。その後、週１回、マウス血液中のｈＣＤ４５＋細胞の割合および体重を測定した。接種後、週１回腫瘍量を測定し、平均腫瘍量が約４０－８０ｍｍ３になった時点でマウス血液中のｈＣＤ４５＋細胞の割合を測定した。腫瘍体積および血中ｈＣＤ４５＋細胞の割合に基づいてマウスを無作為にグループ分けし、直ちに投与を開始した。投与開始日を０日目とした。投与レジメン：ＳＥＭＧ２抗体（ＭＭ０５クローン）を５ｍｇ／ｋｇで週３回腹腔内注射した。投与開始後、１週間毎にマウスの腫瘍増殖状況を観察した。腫瘍増殖後、週３回、体重および腫瘍体積を測定し、週３回、マウス血液中のｈＣＤ４５＋細胞の相対数をフローサイトメトリーで観察した。腫瘍体積が終点に達した時点で採血を行い、同指標を検出し、実験を終了した。マウスの観察には、毎日の観察、接種後毎実験日の動物の罹病率および死亡の観察が含まれる。腫瘍体積の測定：接種後、グループ分けする前に、腫瘍が見えたら、週１回、実験動物の腫瘍体積を測定した。接種後、グループ分けを行った後、実験動物の腫瘍体積を週２回測定した。腫瘍体積は、双方向測定法により測定した。まず、腫瘍の長径および短径をノギスで測定し、式ＴＶ＝０．５＊ａ＊ｂ２で腫瘍体積を算出した(式中、ａを腫瘍の長径、ｂを腫瘍の短径とした）。実験結果を図２６に示す。ＳＥＭＧ２抗体は、マウスの腫瘍の増殖を顕著に阻害した。この結果は、ＳＥＭＧ２が有効な抗腫瘍標的であることを示す。
６－８週齢の雄ＮＰＳＧマウスモデル３０匹を計量した。Ａ３７５細胞（ＳＥＭＧ２の内因性発現が確認されている）をインビトロで培養し、１．８×１０８個の細胞を取得した。３０匹のマウスにＰＢＭＣを接種した後、３日目にＡ３７５腫瘍細胞を接種した。その後、週１回、マウス血液中のｈＣＤ４５＋細胞の割合および体重を測定した。接種後、週１回腫瘍量を測定し、平均腫瘍量が約４０－８０ｍｍ３になった時点でマウス血液中のｈＣＤ４５＋細胞の割合を測定した。腫瘍体積および血中ｈＣＤ４５＋細胞の割合に基づいてマウスを無作為にグループ分けし、直ちに投与を開始した。投与開始日を０日目とした。投与レジメン：ＳＥＭＧ２抗体（ＭＭ０５クローン）を５ｍｇ／ｋｇで週３回腹腔内注射した。投与開始後、１週間毎にマウスの腫瘍増殖状況を観察した。腫瘍増殖後、週３回、体重および腫瘍体積を測定し、週３回、マウス血液中のｈＣＤ４５＋細胞の相対数をフローサイトメトリーで観察した。腫瘍体積が終点に達した時点で採血を行い、同指標を検出し、実験を終了した。マウスの観察には、毎日の観察、接種後毎実験日の動物の罹病率および死亡の観察が含まれる。腫瘍体積の測定：接種後、グループ分けする前に、腫瘍が見えたら、週１回、実験動物の腫瘍体積を測定した。接種後、グループ分けを行った後、実験動物の腫瘍体積を週２回測定した。腫瘍体積は、双方向測定法により測定した。まず、腫瘍の長径および短径をノギスで測定し、式ＴＶ＝０．５＊ａ＊ｂ２で腫瘍体積を算出した(式中、ａを腫瘍の長径、ｂを腫瘍の短径とした）。実験結果を図２６に示す。ＳＥＭＧ２抗体は、マウスの腫瘍の増殖を顕著に阻害した。この結果は、ＳＥＭＧ２が有効な抗腫瘍標的であることを示す。
【0107】
実施例２０：マウスにおける対応遺伝子Ｓｖｓ３ａのノックアウトにより、ＳＥＭＧ２の機能阻害後に有意な副作用がないことが証明された。
薬剤標的としてのＳＥＭＧ２の機能阻害後に起こり得る毒性および副作用を証明するために、マウスの対応する遺伝子Ｓｖｓ３ａを全身的にノックアウトした。具体的なスキームは以下の通りである：プロジェクトではＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９技術を採用し、非相同組換えにより変異を導入し、Ｓｖｓ３ａ遺伝子のリーディングフレームをシフトさせ、機能を喪失させる。その概略は以下の通りである：インビトロ転写によりＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを取得し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡをマイクロインジェクションし、Ｆ０世代マウスを得た。ＰＣＲ増幅およびシークエンシングにより確認された陽性Ｆ０マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させ、陽性Ｆ１マウスを得た。
薬剤標的としてのＳＥＭＧ２の機能阻害後に起こり得る毒性および副作用を証明するために、マウスの対応する遺伝子Ｓｖｓ３ａを全身的にノックアウトした。具体的なスキームは以下の通りである：プロジェクトではＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９技術を採用し、非相同組換えにより変異を導入し、Ｓｖｓ３ａ遺伝子のリーディングフレームをシフトさせ、機能を喪失させる。その概略は以下の通りである：インビトロ転写によりＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを取得し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵にＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡをマイクロインジェクションし、Ｆ０世代マウスを得た。ＰＣＲ増幅およびシークエンシングにより確認された陽性Ｆ０マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させ、陽性Ｆ１マウスを得た。
【0108】
ｇＲＮＡ配列 （５’－３’）：
ｇＲＮＡ１，ＣＡＧＣＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＴＣＡＧＧＧ；
ｇＲＮＡ２，ＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＣＴＧＧＧ。
ノックアウト前後の配列アライメント：
野生型： ＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＴＣＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＧＡＧ……ＡＧＴＧＴＣＴＴＡＧＣＡＡＡＣＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＡＧＴＧＣ；
変異体：
ＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧ…（－１００６ｂｐ）…ＧＡＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＡＧＴＧＣ。
ｇＲＮＡ１，ＣＡＧＣＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＴＣＡＧＧＧ；
ｇＲＮＡ２，ＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＣＴＧＧＧ。
ノックアウト前後の配列アライメント：
野生型： ＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＴＣＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＧＡＧ……ＡＧＴＧＴＣＴＴＡＧＣＡＡＡＣＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＡＧＴＧＣ；
変異体：
ＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧ…（－１００６ｂｐ）…ＧＡＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＡＧＴＧＣ。
【0109】
その後の繁殖：得られた遺伝子ノックアウトヘテロ接合体マウス（ｇｅｎｅ＋／－）を２つに分け、ヘテロ接合体マウスの一部は野生型マウスと交配してより多くのヘテロ接合体マウスを増やし、ヘテロ接合体マウスの一部は自殖して遺伝子ノックアウトホモ接合体マウス（ｇｅｎｅ－／－）を得て、遺伝子ノックアウト効果検証およびその後の表現型分析を行った。
【0110】
表現型分析：フローサイトメトリー用にマウスから抗凝固全血を採取し、血液中のＣＤ８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ２７＋陽性細胞の割合を解析した。マウスを２日間休ませた後、内眼角から抗凝固処理した全血を採血し、分子部門が血液ルーチン検査を実施した。３日間休ませた後、マウスの体重を測定し、麻酔をかけ、マウスの身体を撮影し、マウスの眼球を摘出し、血液を採血し、血清を分離した。分子部門は血清の生化学的パラメーターを測定した。眼球を摘出し、血液を採血した後、マウスを安楽死させて材料採取を行った：脳：脳全体を摘出して矢状面で分割し、左側を固定、右側を急速凍結した；肝臓：肝臓全体を摘出して矢状面で分割し、左側を固定し、右側を急速凍結した；肝臓：肝臓全体を摘出し、２つに分け、左葉を固定し、残りを急速凍結した；脾臓：脾臓全体を摘出し、２つに分け、半分を固定し、半分を急速凍結した；腎臓：左腎臓を固定用に摘出し、右腎臓を摘出し、急速凍結した；胃：胃全体を摘出し、２つに分け、左葉を固定し、残りを急速凍結した；大腸：無傷の大腸を取り出し、腸管ロール（Swiss roll)を固定した；小腸：小腸全体を取り出し、３分割（十二指腸、回腸、空腸）して、腸管ロールを固定した；肺：左肺を取り出して固定し、右肺を取り出して急速凍結した。固定したサンプルを全て病理に送り、パラフィン包埋を行い、ＫＯマウス１匹（＃９８）の１１種の臓器（脳、心臓、肺、腎臓、脾臓、肝臓、胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸）を切除し、ＨＥ染色して、分析用に読み出した。
【0111】
野生型（ＷＴ）およびホモ接合体ノックアウトマウス（ＫＯ）の表現型分析結果を図２７に示す。この結果から、Ｓｖｓ３ａホモ接合体ノックアウトマウスを交配しても子孫は生まれなかったが、ヘテロ接合体ノックアウトの状況では生殖機能への影響は見られなかった。その他の解析でも異常は認められなかった。したがって、Ｓｖｓ３ａの機能の完全な喪失または遮断は、他の系統器官に大きな毒性影響を与えることなく生殖機能に影響を与える可能性がある。このことは、ＳＥＭＧ２標的遮断の起こり得る毒性または副作用は限定的であり、高い安全性を有することを示唆する。
【0112】
以上、本発明者らにより本発明の態様が説明されたが、本発明はこれに限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の目的の範囲内で修正および変更が可能であることを理解し得る。修正および変更の態様は、本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】