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特表2023-511200自己免疫疾患および免疫不全疾患における免疫レパートリーバイオマーカー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-16
(54)【発明の名称】自己免疫疾患および免疫不全疾患における免疫レパートリーバイオマーカー
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6881 20180101AFI20230309BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230309BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20230309BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230309BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20230309BHJP
A61K 31/7076 20060101ALI20230309BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230309BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230309BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230309BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6881 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6813 Z
A61K45/00
A61K31/519
A61K31/7076
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P35/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022544702
(86)(22)【出願日】2021-01-22
(85)【翻訳文提出日】2022-09-12
(86)【国際出願番号】 US2021070065
(87)【国際公開番号】W WO2021151114
(87)【国際公開日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】62/964,524
(32)【優先日】2020-01-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/964,550
(32)【優先日】2020-01-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＪＡＶＡ
２．ＡＤＡ
(71)【出願人】
【識別番号】502221282
【氏名又は名称】ライフ テクノロジーズ コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100136249
【弁理士】
【氏名又は名称】星野 貴光
(72)【発明者】
【氏名】ルーニー ティモシー
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QR08
4B063QS24
4B063QS28
4B063QS36
4B063QX02
4C084AA17
4C084NA05
4C084ZA96
4C084ZB15
4C084ZB21
4C084ZB27
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB09
4C086EA18
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZA96
4C086ZB15
4C086ZB27
(57)【要約】
本開示は、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、自己免疫疾患もしくは障害を有する対象の療法に対する臨床応答を予測するための方法、および／または免疫不全（例えば、白血病）を有する対象の予後を予測するための方法を提供する。一態様において、方法は、治療前の試料におけるＢ細胞受容体レパートリーのクラススイッチ組換えおよび／または体細胞超変異の頻度を決定することと、測定されたクラススイッチおよび／または体細胞超変異の頻度に基づいて対象の予後および／または治療に対する応答を予測することと、を提供する。別の態様において、方法は、免疫受容体クラススイッチおよび／または体細胞超変異の頻度の決定、ならびに測定されたクラススイッチおよび／もしくは体細胞超変異の頻度に基づいた予後および／または治療に対する応答の得られる予測に基づいて対象を治療することを提供する。
【選択図】 図１２
【選択図】 図１２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
自己免疫疾患または障害を有する対象の療法に対する臨床応答を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて予測する方法であって、ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのサブクラス、その上、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭおよび／またはＩｇＤならびにスイッチ化ＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥ発現細胞の頻度を決定することと、
ｅ）前記対象を、（ｉ）前記ＳＨＭ頻度が、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞で頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合に、化学療法に対する応答者、（ｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法に対する非応答者、および／または（ｉｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法に対する応答者、の可能性が高いとして特定することと、を含む、方法。
【請求項2】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記ＳＨＭ頻度のカットオフが、８％である、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
自己免疫疾患または障害の症状を有する対象を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する方法であって、ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのクラススイッチ組換え頻度を決定することと、
ｅ）前記ＳＨＭ頻度がスイッチ化アイソタイプで頻度閾値未満であり、前記試料におけるクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の前記頻度が、頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、前記対象を原発性免疫不全障害を有するとして特定し、それによって前記対象が慢性可変免疫不全障害を有すると診断することと、を含む、方法。
【請求項18】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項20】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項29】
前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項31】
生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
自己免疫疾患または障害を有する対象を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための方法であって、ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、
ｄ）前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンのクラススイッチ組換え頻度を決定することと、
ｅ）前記対象を、（ｉ）前記ＳＨＭ頻度が、前記試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞で頻度閾値未満であり、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法を用いて、（ｉｉ）前記ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、前記免疫レパートリーで、前記試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法を用いて、治療することと、を含む、方法。
【請求項33】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちの任意の１つ以上を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項35】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項40】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項43】
前記ＳＨＭ頻度のカットオフが、８％である、請求項３２に記載の方法。
【請求項44】
ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項45】
前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項47】
生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記対象が、関節リウマチを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記免疫療法が、チェックポイント遮断剤、またはＢ細胞枯渇剤を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記化学療法が、メトトレキサートを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
白血病を有する対象の予後を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて予測する方法であって、ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）の頻度を特定することと、
ｄ）ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／もしくは組み合わせが、前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度、を決定することと、
ｅ）前記レパートリークローンを、以下のサブクラス：
クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、
クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、
ｆ）前記対象の予後を、前記Ｂ細胞免疫レパートリーの前記細分類に基づいて、
クラスＩ：最悪の予後、
クラスＩＩ：不良な予後、
クラスＩＩＩ：良好な予後、
クラスＩＶ：最良の予後、に特定することと、を含む、方法。
【請求項52】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちの任意の１つ以上を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項54】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項58】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項59】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項62】
前記クラスＩＩＩの平均ＳＨＭ頻度が、約２％である、請求項５１に記載の方法。
【請求項63】
ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項64】
前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項66】
生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
白血病を有する対象を、前記対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための方法であって、ａ）多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることであって、
前記多重増幅反応が、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なる前記Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）前記少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットが、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、前記増幅を行うことが、前記試料における前記標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、前記標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する、増幅させることと、
ｂ）前記標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、
ｃ）前記配列決定から免疫受容体クローンを特定して、前記免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することと、
ｄ）ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／もしくは組み合わせが、前記試料における前記Ｂ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度、を決定することと、
ｅ）前記レパートリークローンを、以下のサブクラス：
クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、
クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、
クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、
ｆ）前記対象を、前記Ｂ細胞免疫レパートリーの前記細分類に基づいて、
クラスＩ：化学療法、放射線、またはＤＮＡ修復誘導剤のうちのいずれかの任意選択的な追加を用いた幹細胞療法、
クラスＩＩ：任意選択的なＤＮＡ修復誘導剤を用いた化学療法、放射線、または免疫療法、
クラスＩＩＩ：化学療法または免疫療法、および
クラスＩＶ：標準的な化学療法または免疫療法、で治療することと、を含む、方法。
【請求項68】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：（１）前記プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、前記プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、
（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、
（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm、
（４）前記試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、
（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および
（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、好ましくは、（ｉ）前記プライマーの前記末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）前記プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項70】
前記複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表３および表６～１０のプライマーから選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項74】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、表１１のプライマーセットから選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項75】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、前記複数のＶ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記ＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、前記１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、前記鋳型分子の前記Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む、請求項６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
前記生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子が、前記標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットが、それぞれ表２および表６～１０のプライマーから選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項78】
前記ＳＨＭ頻度のカットオフが、８％である、請求項６７に記載の方法。
【請求項79】
ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、前記標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項80】
前記少なくとも１つのアダプターが、ライゲーションによって付加される、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
前記配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、前記初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項82】
生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせが、配列決定読み取りの少なくとも５０％である、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
前記対象が、慢性リンパ性白血病を有する、請求項５１～８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
前記免疫療法が、標的化した生物学的薬剤、またはＢ細胞枯渇剤を含む、請求項５１～８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
前記化学療法が、フルダラビンを含む、請求項５１～８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２０年１月２２日に出願された米国仮出願第６２／９６４，５２４号および２０２０年１月２２日に出願された米国仮出願第６２／９６４，５５０号の各々の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権および利益を主張する。前述の出願のそれぞれの全内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１月２２日に出願された米国仮出願第６２／９６４，５２４号および２０２０年１月２２日に出願された米国仮出願第６２／９６４，５５０号の各々の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権および利益を主張する。前述の出願のそれぞれの全内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、これと同時に提出された電子配列表の資料を参照により組み込む。電子配列表における資料は、２０２１年１月２１日に作成された「ＬＴ０１５２３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして提出され、１８５ＫＢのファイルサイズを有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、これと同時に提出された電子配列表の資料を参照により組み込む。電子配列表における資料は、２０２１年１月２１日に作成された「ＬＴ０１５２３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして提出され、１８５ＫＢのファイルサイズを有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本発明は、標的免疫レパートリー核酸配列のライブラリーを調製する方法ならびにそのための組成物および使用に関する。
【背景技術】
【0004】
適応免疫応答は、抗原を認識するＢ細胞およびＴ細胞の選択的応答を含む。抗体（Ａｂ、Ｂ細胞で）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ、Ｔ細胞で）の抗原受容体をコードする免疫グロブリン遺伝子は、複雑な遺伝子座を含み、多種多様な受容体が、それぞれの可変性（Ｖ）、多様性（Ｄ）、および結合性（Ｊ）遺伝子セグメントの組換え、ならびにその後に続く初期リンパ球分化中の体細胞超変異事象の結果として生成される。組換えプロセスは、各受容体の両サブユニット鎖において別々に発生し、その後のヘテロダイマー対形成が、さらに大きい組換えの多様性を生じる。ヒト免疫受容体レパートリーに寄与する潜在的な組み合わせおよび接合の可能性の計算は、可能性の数が、個人における末梢のＢ細胞またはＴ細胞の総数を大幅に超えると推定されている。例えば、Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｂｊｏｒｋｍａｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３９５－４０２、Ａｒｓｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６：９５８－９６１、ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，２００２，ｐｐ ８５－１２９を参照されたい。
【0005】
多大な努力が、免疫レパートリーの分析を高分解能で改善するために、長年にわたってなされてきている。リンパ球の拡張したクローンの特異的な検出およびモニタリングのための手段は、正常および病原性の免疫反応および応答の特徴付けおよび分析のための重要な機会を提供するであろう。努力にもかかわらず、効果的な高分解能分析は、課題を提供している。サンガーシーケンシングなどの低スループット技術は分解能を提供し得るが、免疫レパートリー全体を広く捕捉するための効率的な手段を提供することに限定されている。次世代配列決定（ＮＧＳ）の進歩は、レパートリーを捕捉するアクセスを提供しているが、関連する多数の配列の性質および技術の結果としての配列誤差の導入により、真のレパートリーの効率的かつ効果的な反映は、困難であると証明されている。高度に可変な免疫細胞受容体配列の複雑な集団を分析することができる改善された配列決定の方法論およびワークフローが開発されている。免疫細胞応答をよりよく理解し、診断および治療能力を増強し、新規療法を考案するために、免疫細胞受容体の膨大なレパートリーを効果的にプロファイリングするための新規方法が必要とされ続けている。
【発明の概要】
【0006】
自己免疫疾患または障害を有する対象の療法に対する臨床応答を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて予測するための方法が、本明細書で提供される。さらに、白血病を有する対象の予後を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて予測するための方法が、本明細書で提供される。かかる方法は、対象の試料から得られる標的ＢＣＲ核酸鋳型分子を増幅するために、単一の多重増幅反応を、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のＦＲ１の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して行うことを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、同じ標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、ｉ）およびｉｉ）のプライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅を行うことが、試料における標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、標的ＢＣＲレパートリーを含む標的ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法はさらに、標的ＢＣＲアンプリコン分子の配列決定を行って、分子の配列を決定することであって、配列を決定することが、初期配列読み取りを得て、初期配列読み取りを参照配列に整列させて、生産的読み取りを特定して、１つ以上のインデルを修正して救済された生産的配列読み取りを作成することを含む、決定することと、決定された標的ＢＣＲ配列からＢＣＲレパートリークローン集団を特定することと、クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）の頻度を特定することと、を含む。本方法はさらに、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度を決定すること、かつ／または進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度を決定することを含む。いくつかの実施形態において、スイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／または組み合わせは、試料におけるＢ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される。いくつかの実施形態において、次に、自己免疫疾患または障害を有する対象を、（ｉ）ＳＨＭ頻度が、試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞で頻度閾値未満であり、免疫レパートリーで、試料における高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法に対する応答者、（ｉｉ）ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、免疫レパートリーで、試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法に対する非応答者、および／または（ｉｉｉ）ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、免疫レパートリーで、試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法に対する応答者、の可能性があるとして特定することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、次に、レパートリークローンを、以下のサブクラス：クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、免疫不全を有する対象の予後を、Ｂ細胞免疫レパートリーの細分類に基づいて、クラスＩ：最悪の予後、クラスＩＩ：不良な予後、クラスＩＩＩ：良好な予後、クラスＩＶ：最良の予後、に特定することと、を含む方法が提供される。
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のＦＲ１の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して行うことを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、同じ標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、ｉ）およびｉｉ）のプライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅を行うことが、試料における標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、標的ＢＣＲレパートリーを含む標的ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法はさらに、標的ＢＣＲアンプリコン分子の配列決定を行って、分子の配列を決定することであって、配列を決定することが、初期配列読み取りを得て、初期配列読み取りを参照配列に整列させて、生産的読み取りを特定して、１つ以上のインデルを修正して救済された生産的配列読み取りを作成することを含む、決定することと、決定された標的ＢＣＲ配列からＢＣＲレパートリークローン集団を特定することと、クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）の頻度を特定することと、を含む。本方法はさらに、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度を決定すること、かつ／または進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度を決定することを含む。いくつかの実施形態において、スイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／または組み合わせは、試料におけるＢ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される。いくつかの実施形態において、次に、自己免疫疾患または障害を有する対象を、（ｉ）ＳＨＭ頻度が、試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞で頻度閾値未満であり、免疫レパートリーで、試料における高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法に対する応答者、（ｉｉ）ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、免疫レパートリーで、試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法に対する非応答者、および／または（ｉｉｉ）ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、免疫レパートリーで、試料における高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法に対する応答者、の可能性があるとして特定することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、次に、レパートリークローンを、以下のサブクラス：クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、免疫不全を有する対象の予後を、Ｂ細胞免疫レパートリーの細分類に基づいて、クラスＩ：最悪の予後、クラスＩＩ：不良な予後、クラスＩＩＩ：良好な予後、クラスＩＶ：最良の予後、に特定することと、を含む方法が提供される。
【0007】
さらに、自己免疫疾患または障害の症状を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーの特徴付けることに基づいて慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する方法が提供される。いくつかの実施形態において、かかる方法は、対象の試料から得られる標的ＢＣＲ核酸鋳型分子を増幅するために、単一の多重増幅反応を、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のＦＲ１の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して行うことを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、同じ標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、ｉ）およびｉｉ）のプライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅を行うことが、試料における標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、標的ＢＣＲレパートリーを含む標的ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法はさらに、標的ＢＣＲアンプリコン分子の配列決定を行って、分子の配列を決定することであって、配列を決定することが、初期配列読み取りを得て、初期配列読み取りを参照配列に整列させて、生産的読み取りを特定して、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを作成することを含む、決定することと、配列決定からＢＣＲレパートリークローン集団を特定して、免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、試料におけるＢ細胞免疫受容体クローンのクラススイッチ組換え頻度を決定することと、を含む。本方法はさらに、ＳＨＭ頻度がスイッチ化アイソタイプにおける頻度閾値未満であり、試料におけるクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の頻度が、頻度閾値未満であり、免疫レパートリーで、試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、対象を、原発性免疫不全障害を有するとして特定することと、それによって対象を、慢性可変免疫不全障害を有すると診断することと、を含む。
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のＦＲ１の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して行うことを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、同じ標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、ｉ）およびｉｉ）のプライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅を行うことが、試料における標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、標的ＢＣＲレパートリーを含む標的ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法はさらに、標的ＢＣＲアンプリコン分子の配列決定を行って、分子の配列を決定することであって、配列を決定することが、初期配列読み取りを得て、初期配列読み取りを参照配列に整列させて、生産的読み取りを特定して、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを作成することを含む、決定することと、配列決定からＢＣＲレパートリークローン集団を特定して、免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が類似のヌクレオチド配列を有する、特定することと、試料におけるＢ細胞免疫受容体クローンのクラススイッチ組換え頻度を決定することと、を含む。本方法はさらに、ＳＨＭ頻度がスイッチ化アイソタイプにおける頻度閾値未満であり、試料におけるクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の頻度が、頻度閾値未満であり、免疫レパートリーで、試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、対象を、原発性免疫不全障害を有するとして特定することと、それによって対象を、慢性可変免疫不全障害を有すると診断することと、を含む。
【0008】
さらに、自己免疫疾患もしくは障害または免疫不全を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、かかる方法は、対象の試料から得られる標的ＢＣＲ核酸鋳型分子を増幅するために、単一の多重増幅反応を、
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のＦＲ１の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して行うことを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、同じ標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、ｉ）およびｉｉ）のプライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅を行うことが、試料における標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、標的ＢＣＲレパートリーを含む標的ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法はさらに、標的ＢＣＲアンプリコン分子の配列決定を行って、分子の配列を決定することであって、配列を決定することが、初期配列読み取りを得て、初期配列読み取りを参照配列に整列させて、生産的読み取りを特定して、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを作成することを含む、決定することと、配列決定からＢＣＲレパートリークローン集団を特定し、配列決定から免疫受容体クローンを特定し、免疫受容体間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することと、を含む。本方法はさらに、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度を決定すること、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つもしくは組み合わせが、試料におけるＢ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度を決定することを含む。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患もしくは障害を有する対象を、（ｉ）ＳＨＭ頻度が、試料において、非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞における頻度閾値未満であり、試料において、免疫レパートリーで、高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法を用いて、および／または（ｉｉ）ＳＨＭ頻度が、試料において、頻度閾値よりも高く、免疫レパートリーで、高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法を用いて、治療することをさらに含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、レパートリークローンを、以下のサブクラス：クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、免疫不全対象を、Ｂ細胞免疫レパートリーの細分類に基づいて、クラスＩ：化学療法、放射線、またはＤＮＡ修復誘導剤のうちのいずれかの任意選択的な追加を用いた幹細胞療法、クラスＩＩ：任意選択的なＤＮＡ修復誘導剤を用いた化学療法、放射線、または免疫療法、クラスＩＩＩ：化学療法または免疫療法、およびクラスＩＶ：標準的な化学療法または免疫療法、で治療することと、をさらに含む方法が提供される。
ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のＦＲ１の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、
（ｂ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または
（ｃ）Ｖ遺伝子内のＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、および
ｉｉ）少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して行うことを含み、
ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、同じ標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、ｉ）およびｉｉ）のプライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅を行うことが、試料における標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、標的ＢＣＲレパートリーを含む標的ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法はさらに、標的ＢＣＲアンプリコン分子の配列決定を行って、分子の配列を決定することであって、配列を決定することが、初期配列読み取りを得て、初期配列読み取りを参照配列に整列させて、生産的読み取りを特定して、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを作成することを含む、決定することと、配列決定からＢＣＲレパートリークローン集団を特定し、配列決定から免疫受容体クローンを特定し、免疫受容体間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを特定することと、を含む。本方法はさらに、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度を決定すること、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つもしくは組み合わせが、試料におけるＢ細胞免疫受容体クローンの同じ可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度を決定することを含む。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患もしくは障害を有する対象を、（ｉ）ＳＨＭ頻度が、試料において、非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞における頻度閾値未満であり、試料において、免疫レパートリーで、高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法を用いて、および／または（ｉｉ）ＳＨＭ頻度が、試料において、頻度閾値よりも高く、免疫レパートリーで、高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法を用いて、治療することをさらに含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、レパートリークローンを、以下のサブクラス：クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、免疫不全対象を、Ｂ細胞免疫レパートリーの細分類に基づいて、クラスＩ：化学療法、放射線、またはＤＮＡ修復誘導剤のうちのいずれかの任意選択的な追加を用いた幹細胞療法、クラスＩＩ：任意選択的なＤＮＡ修復誘導剤を用いた化学療法、放射線、または免疫療法、クラスＩＩＩ：化学療法または免疫療法、およびクラスＩＶ：標準的な化学療法または免疫療法、で治療することと、をさらに含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】類似のＣＤＲ３ヌクレオチド配列の段階的なクラスタリングを使用して、ＰＣＲまたは配列決定に由来するエラーの除去のための例示的なワークフローの図であり、（Ａ）類似性に基づく群への非常に高速なヒューリスティッククラスタリング（ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔ）のステップ、（Ｂ）つながりのために無作為に取り上げられた、最も共通する配列として代表的なクラスターが選択されるステップ、（Ｃ）読み取りを代表にマージするステップ、（Ｄ）代表を比較し、割り当てられたハミング距離内である場合、クラスターをマージするステップ、を有する。
【図2】レーベンシュタイン距離を使用してホモポリマー崩壊ＣＤＲ３配列を比較することによる、残留挿入／欠失（インデル）エラーの除去のための例示的なワークフローの図であり、（Ａ）ホモポリマーを崩壊させ、クラスター代表間のレーベンシュタイン距離を計算するステップ、（Ｂ）ここで一緒にクラスター化して、複雑なインデルエラーを表す読み取りをマージするステップ、（Ｃ）ユーザーに系統を報告するステップ、を有する。
【図3】ＢＣＲアッセイのみ、１つのプールで増幅されたＢＣＲおよびＴＣＲアッセイ、ならびに２つの別々のプールで増幅されたＢＣＲおよびＴＣＲアッセイにおける、読み取りの数および読み取りの質（生産性対標的外または非生産性）の特徴付けの結果を示すグラフである。
【図5A-5G】様々な細胞または組織試料のＲＮＡからのＩｇＨレパートリーの配列読み取り長を示すヒストグラムである：（図５Ａ）ＰＢＬ、（図５Ｂ）ＣＤ１９＋細胞、（図５Ｃ）扁桃腺ＦＦＰＥ、（図５Ｄ）肺腫瘍ＦＦＰＥ、（図５Ｅ）骨髄、（図５Ｆ）正常な脾臓、および（図５Ｇ）正常な脳。
【図6】例示的なＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１－Ｃ遺伝子プライマーセット１～７を使用したＰＢＬ ｃＤＮＡの多重増幅後に得られた配列読み取り長を示す。
【図7A-7B】棒グラフは、例示的なＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１－Ｃ遺伝子多重増幅反応を使用するアッセイから得られたアイソタイプごとの配列読み取り（図７Ａ）およびアイソタイプごとに検出されたクローン（図７Ｂ）としてＰＢＬ試料内の全アイソタイプ表現を示す。
【図9】試料からの総生産的リード（各グラフの右端ポイント）および総生産的読み取りから引き出された８つの低解像度処理したデータセットにおけるＩｇＨクローン分析結果を示す。
【図10】白血球ｃＤＮＡと混合された等モル濃度の２０の対照プラスミドのプールから生成されたＩｇＨライブラリーにおけるプラスミド検出の直線性を示すグラフを示す。プラスミドＩＤ番号に関連するプラスミドを表１５に示す。
【図11A-11B】メトトレキサートで治療された関節リウマチ患者からの試料の遡及的分析のＩｇＨクローン分析結果を示す。図１１Ａは、治療過程にわたるＩＧＧ、ＩＧＡ、およびＩＧＥ発現Ｂ細胞の頻度を示し、図１１Ｂは、応答者および非応答者におけるＩＧＭおよびＩＧＤ発現Ｂ細胞の体細胞超変異の頻度を示す。
【図12】リンパ腫患者からの試料における体細胞超組換え（ＳＨＭ）およびクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の遡及的分析からのＩｇＨクローン分析結果を示す。２または３パーセントのＶ遺伝子変異のパーセンテージによる従来の分類もプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【0010】
メトトレキサートは、関節リウマチの第一選択治療として一般的に用いられているが、サブセットのレシピエントのみが疾患症状の永続的な寛解を経験する。有利に反応しない者は、代替療法（例えば、ＴＮＦ拮抗薬またはリツキシマブなどのＢ細胞枯渇剤、以下のウェブサイトの拡張リストを参照）を受けるオプションを有する。メトトレキサート活性の遅い動態のために、疾患軽減の最初の兆候は、一般的に療法の開始後４～６週間で観察され、応答を評価するには、長期間のモニタリングを必要とし、その間、個人は疾患の症状に苦しみ続ける可能性がある。さらに、サブセットの個人は、数ヶ月間症状の一時的な寛解を示した後に最終的に治療前の疾患状態に戻り得る。したがって、治療（例えば、メトトレキサート）に対する応答を予測するバイオマーカーが極めて必要とされている。かかるバイオマーカーは、効果的な治療法を特定するために必要とされる時間を低減させ、それによって患者の転帰を改善し、治療費を低下させる。
【0011】
Ｂ細胞体細胞超変異（ＳＨＭ）およびクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）は、機構的に関連しているが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ切断の正確に標的化された生成および修復を必要とする別個のプロセスである。理論に拘束されることなく、本発明者らは、白血病（ＣＬＬなど）の文脈内で、進行中のＳＨＭまたはＣＳＲの存在は、ＤＮＡ損傷修復経路の機能性を、ＤＮＡ切断の生成（例えば、化学免疫療法）またはＤＮＡ修復機構の阻害（例えば、ＰＡＲＰ阻害）を含む治療戦略と関連する可能性とともに明らかにし得るという仮説を立てている。今日まで、白血病（例えば、ＣＬＬ）の予後診断は、ＩＧＨＶ領域内のＳＨＭの定量化にのみ依存してきている。免疫不全障害における予後および／または治療に対する応答を予測するバイオマーカーについて未解決の必要性が残存している。かかるバイオマーカーは、効果的な治療法を特定するために必要とされる期間を低減させ、それによって患者の転帰を改善し、治療費を低下させる。
【0012】
本発明者らは、治療を受ける前に対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、対象の予後および／または治療に対する応答を予測する方法を開発してきている。一態様において、本発明は、治療を受ける前に、対象のＢ細胞免疫レパートリーの体細胞超変異頻度およびクラススイッチ組換え頻度を特定することによって、治療に対する自己免疫疾患を有する対象の臨床応答を予測するための方法を提供する。一態様において、本発明は、治療を受ける前に、対象のＢ細胞免疫レパートリーの体細胞超変異頻度およびクラススイッチ組換え頻度を特定することによって、治療に対する免疫不全（例えば、白血病）を有する対象の臨床応答を予測するための方法を提供する。
【0013】
いくつかの実施形態において、療法に対する自己免疫疾患を有する対象の臨床応答性を予測および／または治療する方法で使用するための本明細書に提供される方法、組成物、および分析は、対象の試料における免疫受容体配列（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲまたはＡｂ）標的）の高精度増幅および配列決定のための方法論を使用して、対象からの治療前試料における体細胞超組換え（ＳＨＭ）免疫受容体サブクラス群のレベルおよび頻度を特定することを含む。免疫受容体配列決定データを使用して、試料中の免疫受容体における免疫受容体クローンおよび体細胞体超組換え変異を有するすべてのクローンの頻度を、試料中のスイッチ化および非スイッチ化サブクラスタイプの頻度と併せて、療法に対する対象の臨床応答の予測因子として特定する。いくつかの実施形態において、対象は、試料中の免疫受容体クローンのＳＨＭ頻度、ならびにスイッチ化および非スイッチ化アイソタイプのレベルに依存する手段で療法によって治療される。例えば、いくつかの実施形態において、指定された閾値（例えば、８％）未満のＩｇＭおよび／またはＩｇＤ発現Ｂ細胞のＳＨＭ頻度を有し、免疫受容体クローン頻度で、高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている対象は、対象が化学療法（例えば、メトトレキサート）に応答性である可能性があり、化学療法（例えば、メトトレキサート）の候補であることを示し、一方、指定された閾値（例えば、８％）よりも高いＩｇＭおよび／またはＩｇＤ発現Ｂ細胞のＳＨＭ頻度を有し、免疫受容体クローン頻度で、高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている対象は、対象が化学療法（例えば、メトトレキサート）に応答性である可能性が低く、化学療法（例えば、メトトレキサート）の候補ではなく、むしろ、かかる対象は、免疫療法、および／またはＢ細胞枯渇療法に対してより応答性である可能性があり、かかる対象は、好ましくは、免疫療法および／またはＢ細胞枯渇治療の候補であり得る。
【0014】
いくつかの実施形態において、白血病疾患を有する対象における療法に対する予後および／または臨床応答性を予測する際に使用するための本明細書に提供される方法、組成物、および分析は、免疫受容体配列（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲまたはＡｂ）標的）の高精度増幅および配列決定のための方法論を使用して、対象からの試料における体細胞超組換え（ＳＨＭ）およびクラスサブタイプ組換え（ＣＳＲ）のレベルおよび頻度を特定することを含む。免疫受容体配列決定データを使用して、試料中の免疫受容体における免疫受容体クローン、ならびに進行中の体細胞超組換え変異（ＳＨＭ）および／またはクラスサブタイプ組換え（ＣＳＲ）を有するすべてのクローンの頻度、その上、対象の予後および／または療法に対する臨床応答の予測因子として試料中のクローンのＳＨＭの頻度を特定する。いくつかの実施形態において、対象は、試料中の免疫受容体クローンにおける進行中のＳＨＭ／ＣＳＲおよびＳＨＭの頻度に依存する手段で、不良または良好な予後を有すると予測される。いくつかの実施形態において、対象は、得られるＳＨＭ／ＣＲＳプロファイルに従って、例えば、クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に分類される。特定の実施形態において、対象は、かかる分類に基づいて特定の予後、例えば、クラスＩ：最悪の予後、クラスＩＩ：不良な予後、クラスＩＩＩ：良好な予後、クラスＩＶ：最良の予後、を有すると予測される。いくつかの実施形態において、対象は、試料中の免疫受容体クローンにおける進行中のＳＨＭ／ＣＲＳおよびＳＨＭ頻度に依存する手段で療法によって代替的および／または追加的に治療され、任意選択的に再分類に従い、例えば、いくつかの実施形態において、クラスＩ：化学療法、放射線、またはＤＮＡ修復誘導剤のうちのいずれかの任意選択的な追加を用いた幹細胞療法のための候補であり得、クラスＩＩ：任意選択的なＤＮＡ修復誘導剤を用いた化学療法、放射線、または免疫療法のための候補であり得、クラスＩＩＩ：化学療法または免疫療法のための候補であり得、クラスＩＶ：標準的な化学療法または免疫療法のための候補であり得る。
【0015】
本発明の追加の実施形態において、自己免疫疾患または障害の症状を有する対象を、慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する方法で使用するための本明細書に提供される方法、組成物および分析は、対象の試料における免疫受容体配列（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲまたはＡｂ）標的）の高精度増幅および配列決定のための方法論を使用して、対象からの治療前試料における体細胞超組換え（ＳＨＭ）免疫受容体サブクラス群のレベルおよび頻度を特定することを含む。免疫受容体配列決定データを使用して、試料中の免疫受容体における免疫受容体クローンおよび体細胞体細胞超組換え変異を有するすべてのクローンの頻度を、試料中のスイッチ化および非スイッチ化サブクラスタイプの頻度と併せて、原発性免疫不全障害の診断として特定する。いくつかの実施形態において、対象は、試料中の免疫受容体クローンのＳＨＭ頻度、ならびにスイッチ化および非スイッチ化アイソタイプのレベルに依存して診断される。例えば、いくつかの実施形態において、非常に低いレベルおよび／もしくはほぼ無視できるレベルのスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ発現Ｂ細胞、ならびに指定された閾値（例えば、８％）未満のＩｇＭおよび／またはＩｇＤ発現Ｂ細胞のＳＨＭ頻度を有する対象は、原発性免疫不全障害、例えば、慢性可変免疫不全障害を有するとして診断される。
【0016】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、Ｖ遺伝子同一性および配列ならびにＣ遺伝子同一性配列を使用して、免疫受容体クローンのＳＨＭおよびＩｇアイソタイプならびに／またはＣＳＲを特定することを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ＣＤＲ３配列、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３配列、またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列もしくはＣＤＲ、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびにＣ遺伝子配列を含む配列を使用する免疫受容体クローンの分析を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ＢＣＲクローンを、ヌクレオチド配列において類似または同一であるＢＣＲ可変およびＣ遺伝子再配列を含むものとして特定することを含む。例えば、互いに１つまたはいくつかの残基が異なるＢＣＲのかなりの部分は、それにもかかわらず、抗原に対して類似または同一の特異性を有し得、したがって、かかるＢＣＲは関連していると見なされ得る。
【0017】
本発明の一態様において、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、自己免疫障害を有する対象の治療に対する臨床応答および／または免疫不全（例えば、白血病）を有する対象の予後を予測するための方法が提供される。提供される方法は、多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含む多重増幅反応を含む。ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、増幅を行うことが、試料における標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する。いくつかの実施形態において、提供される方法は、標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、配列決定から免疫受容体クローンを特定して、免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを決定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が類似のヌクレオチド配列を有する、決定することと、試料中のＢ細胞免疫受容体クローンのサブクラス、その上、試料中の非スイッチ化ＩｇＭおよび／またはＩｇＤならびにスイッチ化ＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥ発現細胞の頻度を決定することと、をさらに含む。方法は、対象を、（ｉ）ＳＨＭ頻度が、試料において、非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞における頻度閾値未満であり、免疫レパートリーで、高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合に、化学療法に対する応答者、（ｉｉ）ＳＨＭ頻度が、試料において、頻度閾値よりも高く、免疫レパートリーで、高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法に対する非応答者、および／または（ｉｉｉ）ＳＨＭ頻度が、試料において、頻度閾値よりも高く、免疫レパートリーで、高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法に対する応答者、の可能性があるとして特定することを提供する。いくつかの実施形態において、提供される方法は、標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、配列決定から免疫受容体クローンを特定して、免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを決定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が類似のヌクレオチド配列を有する、決定することと、その上、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／もしくは組み合わせが、試料におけるＢ細胞免疫受容体クローンの類似の可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度を決定することと、をさらに含む。方法は、レパートリークローンを、以下のサブクラス：クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類することと、対象の免疫不全予後を、Ｂ細胞免疫レパートリーの細分類に基づいて、クラスＩ：最悪の予後、クラスＩＩ：不良な予後、クラスＩＩＩ：良好な予後、クラスＩＶ：最良の予後、に特定することと、を提供する。
【0018】
いくつかの実施形態において、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、自己免疫疾患もしくは障害を有する対象の療法に対する臨床応答を予測するための方法、および／または免疫不全（例えば、白血病）を有する対象の予後を予測するための方法が提供され、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：（１）プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm、（４）試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する。
【0019】
いくつかの実施形態において、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、自己免疫疾患もしくは障害を有する対象の療法に対する臨床応答を予測するための方法、および／または免疫不全（例えば、白血病）を有する対象の予後を予測するための方法が提供され、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、好ましくは、（ｉ）プライマーの末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む。提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＣ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む。
【0020】
いくつかの実施形態において、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、自己免疫疾患または障害を有する対象の療法に対する臨床応答を予測するための方法、および／または免疫不全（例えば、白血病）を有する対象の予後を予測するための方法が提供され、生成される標的ＢＣＲアンプリコン分子には、標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３が含まれる。特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、それぞれ、表３および表６～１０のプライマーから選択される。他の特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、表１１のプライマーセットから選択される。
【0021】
いくつかの実施形態において、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、自己免疫疾患もしくは障害を有する対象の療法に対する臨床応答を予測するための方法、および／または免疫不全（例えば、白血病）を有する対象の予後を予測するための方法が提供され、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＣ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む。特定の実施形態において、生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子は、標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む。他の特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、それぞれ、表２および表６～１０のプライマーから選択される。
【0022】
本明細書における対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、自己免疫疾患または障害を有する対象の療法に対する臨床応答を予測するための提供される方法の特定の実施形態において、好ましいＳＨＭ頻度カットオフは、８％である。
【0023】
本明細書における対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、白血病を有する対象の予後を予測するために提供される方法の特定の実施形態において、クラスＩＩＩの平均ＳＨＭ頻度は、約２％である。
【0024】
いくつかの実施形態において、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、自己免疫疾患もしくは障害を有する対象の療法に対する臨床応答を予測するための方法、および／または免疫不全（例えば、白血病）を有する対象の予後を予測するための提供される方法は、ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのアダプターは、ライゲーションによって付加される。
【0025】
いくつかの実施形態において、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、自己免疫疾患もしくは障害を有する対象の療法に対する臨床応答を予測するための方法、および／または免疫不全（例えば、白血病）を有する対象の予後を予測するための提供される方法は、配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照読み取りと整列することと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む。特定の実施形態において、生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせは、配列決定読み取りの少なくとも５０％である。
【0026】
本発明の別の態様において、自己免疫疾患または障害の症状を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーの特徴付けることに基づいて、慢性可変免疫不全障害を有するとして診断するための方法が提供される。提供される方法は、多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含む多重増幅反応を含む。ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、増幅を行うことが、試料における標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する。提供される方法は、標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、配列決定から免疫受容体クローンを特定して、免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを決定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が類似のヌクレオチド配列を有する、決定することと、試料中のＢ細胞免疫受容体クローンのサブクラス、ならびに試料中のクラススイッチ組換えの頻度を決定することと、をさらに含む。方法は、ＳＨＭ頻度がスイッチ化アイソタイプにおける頻度閾値未満であり、試料におけるクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の頻度が、頻度閾値未満であり、免疫レパートリーで、試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、対象を、原発性免疫不全障害を有するとして特定することと、それによって対象を、慢性可変免疫不全障害を有すると診断することと、を含む。
【0027】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、自己免疫疾患もしくは障害の症状を有する対象を、慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する方法が提供され、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：（１）プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm、（４）試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する。
【0028】
自己免疫疾患または自己免疫疾患の症状を有する対象を、慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、好ましくは、（ｉ）プライマーの末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む。提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＣ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む。
【0029】
自己免疫疾患または障害の症状を有する対象を、慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する提供される方法のいくつかの実施形態において、生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子は、標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、それぞれ、表３および表６～１０のプライマーから選択される。他の特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、表１１のプライマーセットから選択される。
【0030】
提供される方法のいくつかの実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＣ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む。特定の実施形態において、生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子は、標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む。他の特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、それぞれ、表２および表６～１０のプライマーから選択される。
【0031】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患または障害の症状を有する対象を、慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する提供される方法は、ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを、標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それによって、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのアダプターは、ライゲーションによって付加される。
【0032】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患または障害の症状を有する対象を、慢性可変免疫不全障害を有するとして診断する提供される方法は、配列決定が、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照配列に対して整列させることと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む。特定の実施形態において、生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせは、配列決定読み取りの少なくとも５０％である。
【0033】
本発明の別の態様において、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて、自己免疫疾患または障害を有する対象を治療するための方法が提供される。提供される方法は、多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含む多重増幅反応を含む。ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、増幅を行うことが、試料における標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する。提供される方法は、標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、配列決定から免疫受容体クローンを特定して、免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを決定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が類似のヌクレオチド配列を有する、決定することと、試料中のＢ細胞免疫受容体クローンのサブクラス、その上、試料中の非スイッチ化ＩｇＭおよび／またはＩｇＤならびにスイッチ化ＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥ発現細胞の頻度を決定することと、をさらに含む。方法は、対象を、（ｉ）ＳＨＭ頻度が、試料における非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞で頻度閾値未満であり、免疫レパートリーで、試料における高頻度のスイッチ化アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、化学療法を用いて、（ｉｉ）ＳＨＭ頻度が、頻度閾値よりも高く、免疫レパートリーで、高頻度の非スイッチ化ＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞が優位を占めている場合、免疫療法を用いて、治療することを提供する。
【0034】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患もしくは障害を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するための方法が提供され、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：（１）プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm、（４）試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する。
【0035】
自己免疫疾患または障害を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するための提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、好ましくは、（ｉ）プライマーの末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む。提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、鋳型分子のＣ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む。
【0036】
自己免疫疾患または障害を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するために提供される方法のいくつかの実施形態において、生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子は、標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、それぞれ、表３および表６～１０のプライマーから選択される。他の特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、表１１のプライマーセットから選択される。
【0037】
自己免疫疾患または障害を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するために提供される方法のいくつかの実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、複数のＶ遺伝子プライマーが、鋳型分子のＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、鋳型分子のＣ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む。特定の実施形態において、生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子は、標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む。他の特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、それぞれ、表２および表６～１０のプライマーから選択される。
【0038】
自己免疫疾患または障害を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するために提供される方法の特定の実施形態において、好ましいＳＨＭ頻度カットオフは、８％である。
【0039】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患または障害を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するための方法が提供され、ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それにより、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのアダプターは、ライゲーションによって付加される。
【0040】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患または障害を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するための方法が提供され、配列決定することは、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照読み取りと整列することと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む。特定の実施形態において、生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせは、配列決定読み取りの少なくとも５０％である。
【0041】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患または障害を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するための方法が提供され、対象は関節リウマチを有する。
【0042】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患または障害を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するための方法が提供され、免疫療法は、チェックポイント遮断剤、またはＢ細胞枯渇剤を含む。
【0043】
いくつかの実施形態において、自己免疫疾患または障害を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するための方法が提供され、化学療法は、メトトレキサートを含む。
【0044】
本発明の別の態様において、免疫不全（例えば、白血病）を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーを特徴付けることに基づいて治療するための方法が提供される。提供される方法は、多重増幅反応を行って、対象からの生物学的試料に由来する標的Ｂ細胞免疫受容体核酸鋳型分子を増幅させることを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）（ａ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、（ｂ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、または（ｃ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）少なくとも１つのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを含む多重増幅反応を含む。ｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、標的ＩｇＨ ＢＣＲ遺伝子のコード配列に対するものであり、増幅を行うことが、試料における標的ＢＣＲレパートリーを表すアンプリコン分子をもたらし、それによって、標的免疫受容体レパートリーを含む標的Ｂ細胞免疫受容体アンプリコン分子を生成する。いくつかの実施形態において、提供される方法は、標的免疫受容体レパートリーアンプリコンの配列決定を行うことと、配列決定から免疫受容体クローンを特定して、免疫受容体クローン間の可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベルを決定することであって、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が類似のヌクレオチド配列を有する、決定することと、その上、ＳＨＭを示すクローン系統免疫受容体クローンのＶＤＪ領域が、類似のヌクレオチド配列を有する進行中のＳＨＭ頻度、ならびに／またはスイッチ化アイソタイプの少なくとも１つおよび／もしくは組み合わせが、試料におけるＢ細胞免疫受容体クローンの類似の可変系統で特定される進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）頻度を決定することと、をさらに含む。方法は、レパートリークローンを、以下のサブクラス：クラスＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、Ｖ遺伝子ＳＨＭなし、クラスＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、０よりも高く、６％未満であるＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＩＩ：進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし、約６％よりも高いＶ遺伝子ＳＨＭ、クラスＩＶ：進行中のＣＳＲおよび／またはＳＨＭ、に従って分類し、対象を、Ｂ細胞免疫レパートリーの細分類に基づいて、クラスＩ：化学療法、放射線、またはＤＮＡ修復誘導剤のうちのいずれかの任意選択的な追加を用いた幹細胞療法、クラスＩＩ：任意選択的なＤＮＡ修復誘導剤を用いた化学療法、放射線、または免疫療法、クラスＩＩＩ：化学療法または免疫療法、およびクラスＩＶ：標準的な化学療法または免疫療法、で治療するために提供される。
【0045】
いくつかの実施形態において、白血病を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための方法が提供され、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、以下の基準：（１）プライマー内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さである、（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm、（４）試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的である、のうちのいずれか１つ以上を有する。
【0046】
白血病を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、好ましくは、（ｉ）プライマーの末端の近くもしくは末端、または（ｉｉ）プライマーの中心ヌクレオチドの近くもしくはその付近に位置する、１つ以上の切断可能な基を含む。提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーの各々、および／または１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。提供される方法のいくつかの実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＦＲ１部分の少なくとも一部にアニーリングし、１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、鋳型分子のＣ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む。
【0047】
白血病を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するために提供される方法のいくつかの実施形態において、生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子は、標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、それぞれ、表３および表６～１０のプライマーから選択される。他の特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、表１１のプライマーセットから選択される。
【0048】
白血病を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するために提供される方法のいくつかの実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、ｉ）（ｃ）およびｉｉ）（ａ）であり、複数のＶ遺伝子プライマーが、鋳型分子のＦＲ３部分の少なくとも一部にアニーリングし、１つ以上のＣ遺伝子プライマーが、鋳型分子のＣ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも５つのプライマーを含む。特定の実施形態において、生成された標的ＢＣＲアンプリコン分子は、標的ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む。他の特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）のうちの少なくとも１つのセットは、それぞれ、表２および表６～１０のプライマーから選択される。
【0049】
白血病を有する対象を、本明細書における対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するために提供される方法の特定の実施形態において、クラスＩＩＩの平均ＳＨＭ頻度は、約２％である。
【0050】
いくつかの実施形態において、白血病を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための方法が提供され、ステップｂ）の前に、少なくとも１つのアダプターを標的免疫受容体アンプリコン分子のうちの少なくとも１つに付加し、それにより、アダプター修飾された標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成することをさらに含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのアダプターは、ライゲーションによって付加される。
【0051】
いくつかの実施形態において、白血病を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するための方法が提供され、配列決定することは、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照読み取りと整列することと、生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、を含む。特定の実施形態において、生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせは、配列決定読み取りの少なくとも５０％である。
【0052】
白血病を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するために提供される方法のいくつかの実施形態において、対象は、慢性リンパ性白血病を有する。
【0053】
白血病を有する対象を、対象のＢ細胞免疫レパートリーに基づいて治療するために提供される方法のいくつかの実施形態において、免疫療法は、標的化した生物学的薬剤またはＢ細胞枯渇剤を含む。
【0054】
いくつかの実施形態において、多重次世代配列決定ワークフローは、提供される方法と組み合わせて、試料における免疫レパートリーの効果的な検出および分析のために使用される。提供される方法は、対象における複雑な免疫細胞レパートリー（複数可）を監視および分析する際に、免疫細胞受容体配列（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲまたはＡｂ）標的）の高精度増幅および配列決定に使用するためのワークフロー、組成物、システム、およびキットを利用する。標的免疫細胞受容体遺伝子は、ＶＤＪまたはＶＪ遺伝子セグメントの再配列（または組換え）を受けており、遺伝子セグメントは特定の受容体遺伝子（例えば、ＩｇＨ、ＩｇＫ、ＴＣＲベータ、またはＴＣＲアルファ）に依存する。特定の実施形態において、本開示は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅を使用するワークフロー、組成物、およびシステムを、その後の配列決定のために免疫受容体標的核酸の発現された可変領域を豊富化するために使用する方法を提供する。特定の実施形態において、本開示は、ＰＣＲなどの核酸増幅を使用するワークフロー、組成物、およびシステムを、その後の配列決定のためにｇＤＮＡから再配列された標的免疫細胞受容体遺伝子配列を豊富化するために利用する方法を提供する。特定の実施形態において、本開示はまた、増幅または配列決定に由来するエラー（複数可）の効果的な特定および除去のためのワークフローおよびシステムを使用して、読み取り割り当ての精度を改善し、偽陽性率を低下させる方法を提供する。特に、本明細書に記載の提供される方法は、ゲノム組換えおよび高い変異性に関連するヌクレオチド配列を用いる配列決定アプリケーションにおける精度および性能を改善し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法、組成物、システム、およびキットは、試料における発現された免疫受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の増幅および配列決定に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法、組成物、システム、およびキットは、試料における再配列された免疫細胞受容体ｇＤＮＡのＣＤＲの増幅および配列決定に使用するためのものである。したがって、次世代配列決定技術およびワークフローソリューション（例えば、手動または自動）と組み合わせて使用される、多重ライブラリー調製のための多重免疫細胞受容体発現組成物および免疫細胞受容体遺伝子指向組成物は、本明細書に提供される方法と組み合わせて試料における免疫レパートリーの効果的な検出および特徴付けのために使用することができる。
【0055】
ＴＣＲまたはＢＣＲのＣＤＲは、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの組換えならびに遺伝子セグメント接合部でのヌクレオチドの付加および／または欠失を受けているゲノムＤＮＡから生じる。Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの組換えおよびそれに続く超変異事象は、発現される免疫細胞受容体の広範な多様性につながる。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの確率的性質により、Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体のゲノムＤＮＡの再配列は、機能的な受容体を生成できず、代わりに「非生産的」再配列と呼ばれるものを生成する場合が頻繁にある。通常、非生産的再配列は、フレーム外の可変および結合コードセグメントを有し、未熟な終止コドンの存在および無関係なペプチドの合成につながる。非生産的ＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子再配列は、１）未熟な終止コドンを含むｍＲＮＡを破壊する、ナンセンス媒介性崩壊、２）機能的受容体を有するＢおよびＴ細胞のみが生存する、Ｂ細胞およびＴ細胞選択、３）単一の再配列受容体対立遺伝子のみが任意の所定のＢ細胞またはＴ細胞で発現される、対立遺伝子排除、などのいくつかの生物学的または生理学的理由のために、ｃＤＮＡベースのレパートリー配列決定において一般に稀である。
【0056】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法および組成物は、免疫細胞受容体ｍＲＮＡ、例えばＢＣＲおよび／またはＴＣＲ ｍＲＮＡの組換えられて発現された可変領域を増幅するために使用される。いくつかの実施形態において、生物学的試料から抽出されたＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換される。多重増幅は、受容体の可変領域の少なくとも一部を含むＢＣＲまたはＴＣＲ ｃＤＮＡの一部を豊富化するために使用される。いくつかの実施形態において、増幅されたｃＤＮＡは、標的受容体における１つ以上の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、増幅されたｃＤＮＡは、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）における１つ以上の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３を含む。
【0057】
ＢＣＲおよびＴＣＲ配列はまた、増幅反応中または配列決定プロセス中に導入されたエラーからの非生産的再配列として出現し得る。例えば、標的増幅または配列決定反応中の挿入もしくは欠失（インデル）エラーは、得られるコード配列のリーディングフレームにフレームシフトを生じ得る。かかる変化は、生産的再配列の標的配列読み取りが非生産的再配列として解釈され、特定されたクロノタイプの群から廃棄される結果をもたらし得る。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法およびシステムは、決定された免疫受容体配列からＰＣＲまたは配列決定に由来するエラーを特定および／もしくは除去するためのプロセスを含む。
【0058】
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、免疫細胞受容体ｇＤＮＡの再配列された可変領域、例えば、再配列されたＢＣＲおよび／またはＴＣＲ遺伝子ＤＮＡを増幅するために使用される。多重増幅を使用して、受容体の可変領域の少なくとも一部を含む、再配列されたＢＣＲまたはＴＣＲ ｇＤＮＡの一部を豊富化する。いくつかの実施形態において、増幅されたｇＤＮＡは、標的受容体における１つ以上の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、増幅されたｇＤＮＡは、ＩｇＨにおける１つ以上の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、増幅されたｇＤＮＡは、標的受容体におけるＣＤＲ３、例えば、ＩｇＨにおけるＣＤＲ３を主に含む。
【0059】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞受容体」および「免疫受容体」は、互換的に使用される。
【0060】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、分子が抗原の立体構造を補完し、それによって分子の特異性および特定抗原との接触を決定するＴ細胞受容体または抗体（免疫グロブリン）の領域を指す。Ｔ細胞受容体および抗体の可変領域では、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域に散在している。Ｔ細胞受容体および抗体の各可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲを含み、またＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と呼ばれる４つのフレームワークサブ領域を含む。
【0061】
本明細書で使用される場合、「フレームワーク」または「フレームワーク領域」もしくは「ＦＲ」という用語は、本明細書に定義されるＣＤＲ残基以外の可変領域の残基を指す。フレームワークを構成する４つの別個のフレームワークサブ領域：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４がある。
【0062】
受容体分子（ＴＣＲまたは免疫グロブリン）内のＣＤＲおよびＦＲの正確な位置に関する当技術分野での特定の指定は、用いられる定義に応じて異なる。特に明記しない限り、ＩＭＧＴ指定がＣＤＲおよびＦＲ領域を記載する際に本明細書で使用される（本明細書に参照により具体的に組み込まれるＢｒｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：Ｗ５０３－５０８を参照されたい）。ＣＤＲ／ＦＲアミノ酸指定の一例として、Ｔ細胞受容体ベータのＦＲおよびＣＤＲを構成する残基は、ＩＭＧＴによって、残基１～２６（ＦＲ１）、２７～３８（ＣＤＲ１）、３９～５５（ＦＲ２）、５６～６５（ＣＤＲ２）、６６～１０４（ＦＲ３）、１０５～１１７（ＣＤＲ３）、および１１８～１２８（ＦＲ４）として特徴付けられている。
【0063】
領域を記載するための他のよく知られた標準指定には、参照により本明細書に具体的に組み込まれるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．、およびＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７に認められるものが含まれる。ＣＤＲ指定の一例として、６つの免疫グロブリンＣＤＲを構成する残基は、Ｋａｂａｔによって、軽鎖変数における残基２４～３４（ＣＤＲＬ１）、５０～５６（ＣＤＲＬ２）、および８９～９７（ＣＤＲＬ３）、ならびに重鎖可変領域における３１～３５（ＣＤＲＨ１）、５０～６５（ＣＤＲＨ２）、および９５～１０２（ＣＤＲＨ３）として、Ｃｈｏｔｈｉａによって、軽鎖可変領域における残基２６～３２（ＣＤＲＬ１）、５０～５２（ＣＤＲＬ２）、および９１～９６（ＣＤＲＬ３）、ならびに重鎖可変領域における２６～３２（ＣＤＲＨ１）、５３～５５（ＣＤＲＨ２）、および９６～１０１（ＣＤＲＨ３）として特徴付けられている。
【0064】
本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体」または「Ｔ細胞抗原受容体」または「ＴＣＲ」という用語は、脊椎動物、例えば、哺乳動物のＴＣＲ遺伝子複合体の抗原／ＭＨＣ結合ヘテロダイマータンパク質産物を指し、ヒトＴＣＲアルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタ鎖が含まれる。例えば、ヒトＴＣＲベータ遺伝子座の完全な配列が配列決定されており、例えば、Ｒｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１７５５－１７６２を参照し、ヒトＴＣＲアルファ遺伝子座が配列決定され、再配列決定されており、例えば、Ｍａｃｋｅｌｐｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１１９：２５５－２６６を参照し、Ｔ細胞受容体Ｖ遺伝子セグメントファミリーの一般的な分析について、例えば、Ａｒｄｅｎ（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４２：４５５－５００を参照し、これらの各々は、刊行物で提供および参照される配列情報について、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【0065】
本明細書で使用される「抗体」または「免疫グロブリン」または「Ｂ細胞受容体」もしくは「ＢＣＲ」という用語は、ジスルフィド結合によって相互結合された４つのポリペプチド鎖である、２つの重鎖（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖（ラムダまたはカッパ）からなる。抗体は、それが結合する既知の特異的抗原を有する。抗体の各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ、ＨＶ、またはＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、カッパまたはラムダ軽鎖を示すためにＬＣＶＲまたはＶＬまたはＫＶまたはＬＶと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬからなる。重鎖は、免疫グロブリンが属するクラスまたはアイソタイプを決定する。例えば、哺乳動物では、５つの主要な免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＭであり、それらがそれぞれ含むアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー重鎖に従って分類される。
【0066】
記載のように、ＴＣＲおよびＢＣＲ鎖ＣＤＲの多様性は、生殖系列可変性（Ｖ）、多様性（Ｄ）、および結合（Ｊ）遺伝子セグメントの組換えによって、ならびに各ＴＣＲおよびＢＣＲ遺伝子再配列の過程中の遺伝子セグメント接合部の各々で、独立した付加および欠失によって作成される。ＢＣＲ重鎖をコードする再配列された核酸において、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、Ｖ遺伝子セグメントに認められ、ＣＤＲ３は、Ｖ遺伝子セグメントならびにＤおよびＪ遺伝子セグメントのいくつかを含む。ＢＣＲ軽鎖をコードする再配列された核酸において、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、Ｖ遺伝子セグメントに認められ、ＣＤＲ３は、Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントのいくつかを含む。ＴＣＲベータおよびＴＣＲデルタをコードする再配列された核酸では、例えば、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、Ｖ遺伝子セグメントに認められ、ＣＤＲ３は、Ｖ遺伝子セグメントのいくつか、ならびにＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。ＴＣＲアルファおよびＴＣＲガンマをコードする再配列された核酸では、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、Ｖ遺伝子セグメントに認められ、ＣＤＲ３は、Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントのいくつかを含む。
【0067】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応を使用して、再配列されたＢＣＲおよび／またはＴＣＲゲノムＤＮＡから発現されたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを増幅させる。いくつかの実施形態において、多重増幅反応を使用して、生物学的試料に由来するｃＤＮＡからＢＣＲおよび／またはＴＣＲ ＣＤＲの少なくとも一部を増幅させる。いくつかの実施形態において、多重増幅反応を使用して、生物学的試料に由来するｃＤＮＡからＢＣＲおよび／またはＴＣＲの少なくとも２つのＣＤＲを増幅させる。いくつかの実施形態において、多重増幅反応を使用して、生物学的試料に由来するｃＤＮＡからＢＣＲおよび／またはＴＣＲの少なくとも３つのＣＤＲを増幅させる。いくつかの実施形態において、得られたアンプリコンを使用して、試料において発現されるＢＣＲおよび／またはＴＣＲ ＣＤＲのヌクレオチド配列を決定する。いくつかの実施形態において、少なくとも３つのＣＤＲを含むかかるアンプリコンのヌクレオチド配列を決定することは、新規ＢＣＲおよび／またはＴＣＲ対立遺伝子を特定および特徴付けるために使用される。
【0068】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応を使用して、Ｖ（Ｄ）Ｊ再配列を受けているＢＣＲおよび／またはＴＣＲゲノムＤＮＡを増幅させる。いくつかの実施形態において、多重増幅反応を使用して、生物学的試料に由来するｇＤＮＡからＢＣＲおよび／またはＴＣＲ ＣＤＲの少なくとも一部を含む核酸分子（複数可）を増幅させる。いくつかの実施形態において、多重増幅反応を使用して、生物学的試料に由来するｇＤＮＡからＢＣＲおよび／またはＴＣＲの少なくとも２つのＣＤＲを含む核酸分子（複数可）を増幅させる。いくつかの実施形態において、多重増幅反応を使用して、生物学的試料に由来するｇＤＮＡからＢＣＲおよび／またはＴＣＲの少なくとも３つのＣＤＲを含む核酸分子を増幅させる。いくつかの実施形態において、得られたアンプリコンを使用して、試料中の再配列されたＢＣＲおよび／またはＴＣＲ ＣＤＲのヌクレオチド配列を決定する。いくつかの実施形態において、少なくともＣＤＲを含むかかるアンプリコンのヌクレオチド配列を決定することは、新規ＢＣＲおよび／またはＴＣＲ対立遺伝子を特定および特徴付けるために使用される。
【0069】
多重増幅反応のいくつかの実施形態において、使用される各プライマーセットは、同じＢＣＲまたはＴＣＲ領域を標的とするが、セット内の異なるプライマーは、遺伝子の異なるＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子再配列を標的とすることを可能にする。例えば、発現されたＩｇＨまたは再配列されたＩｇＨ ｇＤＮＡの増幅のためのプライマーセットはすべて、それぞれＩｇＨ ｍＲＮＡまたはＩｇＨ ｇＤＮＡの同じ領域（複数可）を標的にするように設計されているが、セット内の個々のプライマーは、様々なＩｇＨ ＶＤＪ遺伝子組み合わせの増幅をもたらす。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプライマーまたはプライマーセットは、免疫受容体遺伝子の比較的保存された領域（例えば、Ｃ遺伝子の一部）に対するものであり、他のプライマーセットは、同じ遺伝子のより可変的な領域（例えば、Ｖ遺伝子の一部）に対する様々なプライマーを含む。他の実施形態において、少なくとも１つのプライマーセットは、免疫受容体遺伝子のＪ遺伝子セグメントの少なくとも一部に対する様々なプライマーを含み、他のプライマーセットは、同じ遺伝子のＶ遺伝子セグメントの少なくとも一部に対する様々なプライマーを含む。
【0070】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応を使用して、再配列されたＩｇＨ、ＩｇＫ、およびＩｇＬゲノムＤＮＡを含む、再配列されたＢＣＲゲノムＤＮＡから発現されるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを増幅させる。いくつかの実施形態において、ＢＣＲ ＣＤＲの少なくとも一部、例えば、ＣＤＲ３は、ｃＤＮＡから多重増幅反応で増幅される。いくつかの実施形態において、ＢＣＲの少なくとも２つのＣＤＲ部分は、ｃＤＮＡから多重増幅反応で増幅される。特定の実施形態において、多重増幅反応を使用して、ＢＣＲ ｃＤＮＡの少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を増幅させる。いくつかの実施形態において、得られたアンプリコンを使用して、発現されたＢＣＲ ＣＤＲヌクレオチド配列を決定する。いくつかの実施形態において、得られたアンプリコンを使用して、発現されたＢＣＲ ＣＤＲヌクレオチド配列および配列のＩｇアイソタイプを決定する。いくつかの実施形態において、得られたアンプリコンを使用して、発現されたＩｇＨ ＣＤＲヌクレオチド配列ならびにＩｇアイソタイプおよびＩｇサブアイソタイプを決定する。
【0071】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応を使用して、再配列されたＩｇＨ、ＩｇＫ、およびＩｇＬゲノムＤＮＡを含む、再配列されたＢＣＲゲノムＤＮＡを増幅させる。いくつかの実施形態において、ＢＣＲ ＣＤＲの少なくとも一部、例えば、ＣＤＲ３は、ｇＤＮＡから多重増幅反応で増幅される。いくつかの実施形態において、ＢＣＲの少なくとも２つのＣＤＲ部分は、ｇＤＮＡから多重増幅反応で増幅される。特定の実施形態において、多重増幅反応を使用して、ＢＣＲ ｇＤＮＡの少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を増幅させる。いくつかの実施形態において、得られたアンプリコンを使用して、再配列されたＢＣＲ ＣＤＲヌクレオチド配列を決定する。いくつかの実施形態において、得られたアンプリコンを使用して、再配列されたＢＣＲ ＣＤＲヌクレオチド配列および配列のＩｇアイソタイプを決定する。
【0072】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、標的免疫受容体ｍＲＮＡの発現されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域を含むアンプリコンを生成するように設計されたプライマーセットを用いて行われる。いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各プライマーがＶ遺伝子のフレームワーク領域ＦＲ１の少なくとも一部に対する１つのプライマーのセット、および（ｉｉ）標的免疫受容体の少なくとも１つのＣ遺伝子の一部に対する少なくとも１つのプライマー、を使用して行われる。他の実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各プライマーがＶ遺伝子のフレームワーク領域ＦＲ２の少なくとも一部に対する１つのプライマーのセット、および（ｉｉ）標的免疫受容体の少なくとも１つのＣ遺伝子の一部に対する少なくとも１つのプライマー、を使用して行われる。他の実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各プライマーがＶ遺伝子のフレームワーク領域ＦＲ３の少なくとも一部に対する１つのプライマーのセット、および（ｉｉ）標的免疫受容体の少なくとも１つのＣ遺伝子の一部に対する少なくとも１つのプライマー、を使用して行われる。いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、標的ｍＲＮＡの１つ以上の発現されたＩｇＨアイソタイプを含むアンプリコンを生成するように設計されたプライマーセットを用いて行われ、かかる反応は、（ｉ）上記のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３プライマーセットのうちの１つ、および（ｉｉ）各プライマーが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、および／またはＩｇＭのうちの少なくとも１つのＣ遺伝子の一部に対するプライマーのセットを使用して行われる。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子指向プライマー（複数可）は、Ｃ遺伝子（複数可）の５’末端の約２００個のヌクレオチド内のＣ遺伝子コード配列に対するものである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子指向プライマー（複数可）は、Ｃ遺伝子（複数可）の５’末端の約１５０個のヌクレオチド内のＣ遺伝子コード配列に対するものである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子指向プライマー（複数可）は、Ｃ遺伝子（複数可）の５’末端の約１００個のヌクレオチド内のＣ遺伝子コード配列に対するものである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子指向プライマー（複数可）は、Ｃ遺伝子（複数可）の５’末端の約５０個以内のヌクレオチド、約５０～約１５０個以内、約７５～約１７５以内、または約１００～約２００個以内のヌクレオチドのＣ遺伝子コード配列に対するものである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子指向プライマー（複数可）は、アイソタイプを区別するだけでなく、サブアイソタイプの決定も可能にするＣ遺伝子コード配列決定に対するものである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子指向プライマー（複数可）は、アンプリコン内の定常領域の十分な部分を生成し、それによって、サブアイソタイプを決定された配列データに基づいて決定することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子指向プライマー（複数可）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２サブアイソタイプの特定を可能にするＩｇＧおよび／またはＩｇＡ Ｃ遺伝子コード配列に対するプライマーを含む。
【0073】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各々がＶ遺伝子ＦＲ１領域の少なくとも一部にアニーリングするプライマーのセット、および（ｉｉ）定常（Ｃ）遺伝子の一部にアニーリングする少なくとも１つのプライマーを使用してＢＣＲ ｃＤＮＡを増幅させ、それによって、得られるアンプリコンは、ＢＣＲ ｍＲＮＡのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３コード部分を含む。特定の実施形態において、ＦＲ１指向プライマーセットは、少なくとも２つのＣ遺伝子指向プライマーのセットと組み合わされて、ＢＣＲ ｍＲＮＡの少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３コード部分を含むアンプリコンを生成する。いくつかの実施形態において、ＩｇＨ ＦＲ１指向プライマーセットは、２つの異なるＩｇＨアイソタイプのコード部分に対する少なくとも２つのＣ遺伝子プライマーのセットと組み合わされて、ＩｇＨ ｍＲＮＡの少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３コード部分を含むアンプリコンを生成する。いくつかの実施形態において、ＩｇＨ ＦＲ１指向プライマーセットは、異なるＩｇＨアイソタイプのコード部分に対する少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのプライマーと組み合わされる。例えば、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に特異的な例示的プライマーが表３に示され、ＩｇＨ Ｃ遺伝子に特異的な例示的プライマーが表６～１０に示される。
【0074】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各々がＶ遺伝子ＦＲ２領域の少なくとも一部にアニーリングするプライマーのセット、および（ｉｉ）Ｃ遺伝子の一部にアニーリングする少なくとも１つのプライマーを使用してＢＣＲ ｃＤＮＡを増幅させ、それによって、得られるアンプリコンは、ＢＣＲ ｍＲＮＡのＣＤＲ２およびＣＤＲ３コード部分を含む。特定の実施形態において、かかるＦＲ２指向プライマーセットは、少なくとも２つのＣ遺伝子指向プライマーと組み合わされて、ＢＣＲ ｍＲＮＡのＣＤＲ２およびＣＤＲ３コード部分を含むアンプリコンを生成する。いくつかの実施形態において、ＩｇＨ ＦＲ２指向プライマーセットは、２つの異なるＩｇＨアイソタイプのコード部分に対する少なくとも２つのＣ遺伝子プライマーのセットと組み合わされて、ＩｇＨ ｍＲＮＡのＣＤＲ２およびＣＤＲ３コード部分部分を有するアンプリコンを生成する。いくつかの実施形態において、ＩｇＨ ＦＲ２指向プライマーセットは、異なるＩｇＨアイソタイプのコード部分に対する少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのＣ遺伝子プライマーと組み合わされる。例示的なＦＲ２指向プライマーには、欧州学術研究所および研究病院のコンソーシアムによって開発および標準化されたＢＩＯＭＥＤ－２プライマー（ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７：２２５７－２３２７）が含まれ、表４に示される。ＩｇＨ Ｃ遺伝子に特異的な例示的プライマーが、表６～１０に示される。
【0075】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各々がＶ遺伝子ＦＲ３領域の少なくとも一部にアニーリングするプライマーのセット、および（ｉｉ）Ｃ遺伝子の一部にアニーリングする少なくとも１つのプライマーを使用してＢＣＲ ｃＤＮＡを増幅させ、それによって、得られるアンプリコンは、ＢＣＲ ｍＲＮＡのＣＤＲ３コード部分を主に含む。特定の実施形態において、かかるＦＲ３指向プライマーセットは、少なくとも２つのＣ遺伝子指向プライマーと組み合わされて、ＢＣＲ ｍＲＮＡのＣＤＲ３コード部分を有するアンプリコンを生成する。いくつかの実施形態において、ＩｇＨ ＦＲ３指向プライマーセットは、２つの異なるＩｇＨアイソタイプのコード部分に対する少なくとも２つのＣ遺伝子プライマーのセットと組み合わされて、ＩｇＨ ｍＲＮＡのＣＤＲ３コード部分を有するアンプリコンを生成する。いくつかの実施形態において、ＩｇＨ ＦＲ３指向プライマーセットは、異なるＩｇＨアイソタイプのコード部分に対する少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのＣ遺伝子プライマーと組み合わされる。例えば、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に特異的な例示的プライマーが表２に示され、ＩｇＨ Ｃ遺伝子に特異的な例示的プライマーが表６～１０に示される。
【0076】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、標的免疫受容体ｍＲＮＡまたは再配列されたｇＤＮＡのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域を含むアンプリコンを生成するように設計されたプライマーセットを用いて行われる。いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各プライマーがＶ遺伝子のフレームワーク領域ＦＲ１の少なくとも一部に対する一つのプライマーのセット、および（ｉｉ）各プライマーが標的免疫受容体のＪ遺伝子の少なくとも一部に対する１つのプライマーのセット、を使用して行われる。他の実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各プライマーがＶ遺伝子のフレームワーク領域ＦＲ２の少なくとも一部に対する１つのプライマーのセット、および（ｉｉ）各プライマーが標的免疫受容体のＪ遺伝子の少なくとも一部に対する１つのプライマーのセット、を使用して行われる。他の実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各プライマーがＶ遺伝子のフレームワーク領域ＦＲ３の少なくとも一部に対する１つのプライマーのセット、および（ｉｉ）各プライマーが標的免疫受容体のＪ遺伝子の少なくとも一部に対する１つのプライマーのセット、を使用して行われる。
【0077】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各々がＶ遺伝子ＦＲ１領域の少なくとも一部にアニーリングするプライマーのセット、および（ｉｉ）Ｊ遺伝子の一部にアニーリングするプライマーのセットを使用してＢＣＲ核酸増幅させ、それによって、得られるアンプリコンは、ＢＣＲ ｍＲＮＡまたは再構成されたｇＤＮＡのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３コード部分を含む。例えば、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に特異的な例示的プライマーが表３に示され、ＩｇＨ Ｊ遺伝子に特異的な例示的プライマーが表５に示される。
【0078】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各々がＶ遺伝子ＦＲ２領域の少なくとも一部にアニーリングするプライマーのセット、および（ｉｉ）Ｊ遺伝子の一部にアニーリングするプライマーのセットを使用してＢＣＲ ｃＤＮＡを増幅させ、それによって、得られるアンプリコンは、ＢＣＲ ｍＲＮＡまたは再配列されたｇＤＮＡのＣＤＲ２およびＣＤＲ３コード部分を含む。例えば、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に特異的な例示的プライマーが表４に示され、ＩｇＨ Ｊ遺伝子に特異的な例示的プライマーが表５に示される。
【0079】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、（ｉ）各々がＶ遺伝子ＦＲ３領域の少なくとも一部にアニーリングするプライマーのセット、および（ｉｉ）Ｊ遺伝子の一部にアニーリングするプライマーのセットを使用してＢＣＲ核酸増幅させ、それによって、得られるアンプリコンは、ＢＣＲ ｍＲＮＡまたは再構成されたｇＤＮＡのＣＤＲ３コード部分を主に含む。例えば、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に特異的な例示的プライマーが表２に示され、ＩｇＨ Ｊ遺伝子に特異的な例示的プライマーが表５に示される。
【0080】
いくつかの実施形態において、発現されたＢＣＲ可変領域の少なくとも一部の多重増幅のための組成物が提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）、免疫グロブリン軽鎖ラムダ（ＩｇＬ）、および免疫グロブリン軽鎖カッパ（ＩｇＫ）からなる群から選択される再配列された標的免疫受容体遺伝子のＶ遺伝子フレームワーク領域の一部および定常（Ｃ）遺伝子の一部に対する複数のプライマー対試薬のセットを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される再配列された標的免疫受容体遺伝子のＶ遺伝子フレームワーク領域の一部およびＪ遺伝子の一部に対する複数のプライマー対試薬のセットを含む。
【0081】
いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）再配列されたＩｇＨ遺伝子のＩｇＨ Ｖ遺伝子フレームワーク領域の一部およびＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する複数のプライマー対試薬のセットと、（ｉｉ）再配列されたＴＣＲベータ遺伝子のＴＣＲベータＶ遺伝子フレームワーク領域の一部およびＴＣＲベータＣ遺伝子の一部に対する複数のプライマー対試薬のセットと、を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）再配列されたＩｇＨ遺伝子のＩｇＨ Ｖ遺伝子フレームワーク領域の一部およびＩｇＨ Ｊ遺伝子の一部に対する複数のプライマー対試薬のセットと、（ｉｉ）再配列されたＴＣＲベータ遺伝子のＴＣＲベータＶ遺伝子フレームワーク領域の一部およびＴＣＲベータＪ遺伝子の一部に対する複数のプライマー対試薬のセットと、を含む。
【0082】
ＰＣＲによる増幅は、少なくとも２つのプライマーを用いて行われる。本明細書に提供される方法では、目的の遺伝子座で可変配列のすべてまたは定められた部分を増幅するのに十分なプライマーのセットが使用され、遺伝子座は、前述のＴＣＲおよび免疫グロブリン遺伝子座のいずれかまたはすべてを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に概説される様々なパラメータまたは基準を使用して、多重増幅のための標的特異的プライマーのセットを選択し得る。
【0083】
いくつかの実施形態において、多重反応に使用されるプライマーセットは、目的の遺伝子座での既知の発現されたｇＤＮＡまたはｇＤＮＡ再配列の少なくとも５０％を増幅するように設計される。特定の実施形態において、多重反応に使用されるプライマーセットは、目的の遺伝子座での既知の発現されたｇＤＮＡまたはｇＤＮＡ再配列の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、またはそれ以上を増幅するように設計される。別の例では、各々が異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子からのＦＲ１領域の一部に対する表３の２７種類のフォワードプライマーを、各々が異なるＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する表６～１０の少なくとも１種類のリバースプライマーと組み合わせた使用は、所定のアイソタイプについて現在知られている発現されたＩｇＨ再配列のすべてを増幅する。別の例では、各々が異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子からのＦＲ３領域の一部に対する表２の６８種類のフォワードプライマーを、各々が異なるＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する表６～１０の少なくとも１種類のリバースプライマーと組み合わせた使用は、所定のアイソタイプについて現在知られている発現されたＩｇＨ再配列のすべてを増幅する。別の例として、各々が異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子からのＦＲ３領域の一部に対する表２の６８種類のフォワードプライマーを、各々が異なるＩｇＨ Ｊ遺伝子の一部に対する表５の４種類のリバースプライマーと組み合わせが使用は、現在知られている発現されたｇＤＮＡ ＩｇＨまたはｇＤＮＡ ＩｇＨ再配列のすべてを増幅する。別の例として、各々が異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子からのＦＲ１領域の一部に対する表３の２７種類のフォワードプライマーを、各々が異なるＩｇＨ Ｊ遺伝子の一部に対する表５の４種類のリバースプライマーと組み合わせが使用は、現在知られている発現されたｇＤＮＡ ＩｇＨまたはｇＤＮＡ ＩｇＨ再配列のすべてを増幅する。
【0084】
例えば、かかる多重増幅反応は、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０、好ましくは２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、または６２種類のリバースプライマーを含み、各リバースプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する複数のリバースプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子の定常遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも１つのフォワードプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する複数のリバースプライマーは、各々が同じＢＣＲ遺伝子の定常遺伝子のうちの少なくとも１つの少なくとも一部に対応する配列に対する、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１５、または約２～約７、約５～約２０、約５～約１５、または約７～約１２種類のフォワードプライマーと組み合わされる。多重増幅反応のいくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１指向プライマーは、フォワードプライマーであり得、ＢＣＲ Ｃ遺伝子指向プライマー（複数可）は、リバースプライマー（複数可）であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０、好ましくは２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、または６２種類のフォワードプライマーを含み、各フォワードプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する複数のフォワードプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＣ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも１つのリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する複数のフォワードプライマーは、各々が同じＢＣＲ遺伝子のＣ遺伝子のうちの少なくとも１つの少なくとも一部に対応する配列に対する、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１５、または約２～約７、約５～約２０、約５～約１５、または約７～約１２種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、かかるＦＲ１およびＣ遺伝子増幅プライマーセットは、ＩｇＨ遺伝子配列に対するものであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する約２２～約３５種類のリバースプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約２～約８種類のフォワードプライマーと組み合わされる。他の好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する約２２～約３５種類のリバースプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約５～約１５種類のフォワードプライマーと組み合わされる。他の好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する約４８～約６０種類のリバースプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約５～約１５種類のフォワードプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する約２２～約３５種類のフォワードプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約２～約８種類のリバースプライマーと組み合わされる。他の好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する約２２～約３５種類のフォワードプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約５～約１５種類のリバースプライマーと組み合わされる。さらに他の好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する約４８～約６０種類のフォワードプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約５～約１５種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対するフォワードプライマーは、表３に列挙されるものから選択され、ＩｇＨ Ｃ遺伝子に対するリバースプライマーは、表６～１０に列挙されるものから選択される。他の実施形態において、ＦＲ１およびＣ遺伝子増幅プライマーセットは、Ｉｇ軽鎖ラムダ、Ｉｇ軽鎖カッパ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、またはＴＣＲベータ遺伝子配列に対するものであり得る。
【0085】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０種類のリバースプライマーを含み、各リバースプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する複数のリバースプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＣ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも１つのフォワードプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する複数のリバースプライマーは、各々が同じＢＣＲ遺伝子のＣ遺伝子のうちの少なくとも１つの少なくとも一部に対応する配列に対する、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１５、または約２～約７、約５～約２０、約５～約１５、または約７～約１２種類のフォワードプライマーと組み合わされる。多重増幅反応のいくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２指向プライマーは、フォワードプライマーであり得、ＢＣＲ Ｃ遺伝子指向プライマー（複数可）は、リバースプライマー（複数可）であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０種類のフォワードプライマーを含み、各フォワードプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する複数のフォワードプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＣ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも１つのリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する複数のフォワードプライマーは、各々が同じＢＣＲ遺伝子のＣ遺伝子のうちの少なくとも１つの少なくとも一部に対応する配列に対する、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１５、または約２～約７、約５～約２０、約５～約１５、または約７～約１２種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、かかるＦＲ２およびＣ遺伝子増幅プライマーセットは、ＩｇＨ遺伝子配列に対するものであり得る。いくつかの実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する約５～約１５種類のリバースプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約２～約８種類のフォワードプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する約５～約１５種類のリバースプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約５～約１５種類のフォワードプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する約５～約１５種類のフォワードプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約２～約８種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する約５～約１５種類のフォワードプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約５～約１５種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対するフォワードプライマーは、表４に列挙されるものから選択され、ＩｇＨ Ｃ遺伝子に対するリバースプライマーは、表６～１０に列挙されるものから選択される。他の実施形態において、ＦＲ２およびＣ遺伝子増幅プライマーセットは、Ｉｇ軽鎖ラムダ、Ｉｇ軽鎖カッパ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、またはＴＣＲベータ遺伝子配列に対するものであり得る。
【0086】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、少なくとも２０、２５、３０、４０、４５、好ましくは５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０種類のリバースプライマーを含み、各リバースプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する複数のリバースプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＣ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも１つのフォワードプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する複数のリバースプライマーは、各々が同じＢＣＲ遺伝子のＣ遺伝子のうちの少なくとも１つの少なくとも一部に対応する配列に対する、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１５、または約２～約７、約５～約２０、約５～約１５、または約７～約１２種類のフォワードプライマーと組み合わされる。多重増幅反応のいくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３指向プライマーは、フォワードプライマーであり得、ＢＣＲ Ｃ遺伝子指向プライマー（複数可）は、リバースプライマー（複数可）であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、少なくとも２０、２５、３０、４０、４５、好ましくは５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０種類のリバースプライマーを含み、各フォワードプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する複数のフォワードプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＣ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも１つのリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する複数のフォワードプライマーは、各々が同じＢＣＲ遺伝子のＣ遺伝子のうちの少なくとも１つの少なくとも一部に対応する配列に対する、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１５、または約２～約７、約５～約２０、約５～約１５、または約７～約１２種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、かかるＦＲ３およびＣ遺伝子増幅プライマーセットは、ＩｇＨ遺伝子配列に対するものであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する約６２～約７５種類のリバースプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約２～約８種類のフォワードプライマーと組み合わされる。他の好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する約６２～約７５種類のリバースプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約５～約１５種類のフォワードプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する約６２～約７５種類のフォワードプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約２～約８種類のリバースプライマーと組み合わされる。他の好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する約６２～約７５種類のフォワードプライマーは、ＩｇＨ Ｃ遺伝子の一部に対する約５～約１５種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対するフォワードプライマーは、表２に列挙されるものから選択され、ＩｇＨ Ｃ遺伝子に対するリバースプライマーは、表６～１０に列挙されるものから選択される。他の実施形態において、ＦＲ３およびＣ遺伝子増幅プライマーセットは、Ｉｇ軽鎖ラムダ、Ｉｇ軽鎖カッパ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、およびＴＣＲベータ遺伝子配列に対するものであり得る。
【0087】
いくつかの実施形態において、かかる多重増幅反応は、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０、好ましくは２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、または６２種類のリバースプライマーを含み、各リバースプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する複数のリバースプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＪ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも２、３、４、５、６、８、または約３～６種類のフォワードプライマーと組み合わされる。多重増幅反応のいくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１指向プライマーは、フォワードプライマーであり得、ＢＣＲ Ｊ遺伝子指向プライマーは、リバースプライマーであり得る。したがって、いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０、好ましくは２２、２２．２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、または６２種類のフォワードプライマーを含み、各フォワードプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する複数のフォワードプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＪ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも２、３、４、５、６、８、または約３～６種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、かかるＦＲ１およびＪ遺伝子増幅プライマーセットは、ＩｇＨ遺伝子配列に対するものであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する約２２～約３５種類のリバースプライマーは、異なるＩｇＨ Ｊ遺伝子に対する約３～約６種類のフォワードプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対する約２２～約３５種類のフォワードプライマーは、異なるＩｇＨ Ｊ遺伝子に対する約３～約６種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１領域に対するフォワードプライマーは、表３に列挙されるものから選択され、ＩｇＨ Ｊ遺伝子に対するリバースプライマーは、表５に列挙されるものから選択される。他の実施形態において、ＦＲ１およびＪ遺伝子増幅プライマーセットは、Ｉｇ軽鎖ラムダ、Ｉｇ軽鎖カッパ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、またはＴＣＲベータ遺伝子配列に対するものであり得る。
【0088】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０種類のリバースプライマーを含み、各リバースプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する複数のリバースプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＪ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも２、３、４、５、６、８、または約３～６種類のフォワードプライマーと組み合わされる。多重増幅反応のいくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２指向プライマーは、フォワードプライマーであり得、ＢＣＲ Ｊ遺伝子指向プライマーは、リバースプライマーであり得る。したがって、いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０種類のフォワードプライマーを含み、各フォワードプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する複数のフォワードプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＪ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも２、３、４、５、６、８、または約３～６種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、かかるＦＲ２およびＪ遺伝子増幅プライマーセットは、ＩｇＨ遺伝子配列に対するものであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する約５～約１５種類のリバースプライマーは、異なるＩｇＨ Ｊ遺伝子に対する約３～約６種類のフォワードプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対する約５～約１５種類のフォワードプライマーは、異なるＩｇＨ Ｊ遺伝子に対する約３～約６種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ２領域に対するフォワードプライマーは、表４に列挙されるものから選択され、ＩｇＨ Ｊ遺伝子に対するリバースプライマーは、表５に列挙されるものから選択される。他の実施形態において、ＦＲ２およびＪ遺伝子増幅プライマーセットは、Ｉｇ軽鎖ラムダ、Ｉｇ軽鎖カッパ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、またはＴＣＲベータ遺伝子配列に対するものであり得る。
【0089】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、少なくとも２０、２５、３０、４０、４５、好ましくは５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０種類のリバースプライマーを含み、各リバースプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する複数のリバースプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＪ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも２、３、４、５、６、８、または約３～６種類のフォワードプライマーと組み合わされる。多重増幅反応のいくつかの実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３指向プライマーは、フォワードプライマーであり得、ＢＣＲ Ｊ遺伝子指向プライマーは、リバースプライマーであり得る。したがって、いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、少なくとも２０、２５、３０、４０、４５、好ましくは５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０種類のフォワードプライマーを含み、各フォワードプライマーは、１つ以上のＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域の少なくとも一部に対応する配列に対するものである。かかる実施形態において、ＢＣＲ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する複数のフォワードプライマーは、同じＢＣＲ遺伝子のＪ遺伝子の少なくとも一部に対応する配列に対する少なくとも２、３、４、５、６、８、または約３～６種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの実施形態において、かかるＦＲ３およびＪ遺伝子増幅プライマーセットは、ＩｇＨ遺伝子配列に対するものであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する約６２～約７５種類のリバースプライマーは、異なるＩｇＨ Ｊ遺伝子に対する約３～約６種類のフォワードプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対する約６２～約７５種類のフォワードプライマーは、異なるＩｇＨ Ｊ遺伝子に対する約３～約６種類のリバースプライマーと組み合わされる。いくつかの好ましい実施形態において、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対するフォワードプライマーは、表２に列挙されるものから選択され、ＩｇＨ Ｊ遺伝子に対するリバースプライマーは、表５に列挙されるものから選択される。他の実施形態において、ＦＲ３およびＪ遺伝子増幅プライマーセットは、Ｉｇ軽鎖ラムダ、Ｉｇ軽鎖カッパ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、およびＴＣＲベータ遺伝子配列に対するものであり得る。
【0090】
いくつかの実施形態において、フォワードプライマーの濃度は、多重増幅反応においてリバースプライマーの濃度にほぼ等しい。他の実施形態において、フォワードプライマーの濃度は、多重増幅反応においてリバースプライマーの濃度の約２倍である。他の実施形態において、フォワードプライマーの濃度は、多重増幅反応においてリバースプライマーの濃度の約半分である。いくつかの実施形態において、Ｖ遺伝子ＦＲ領域を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５ｎＭ～約２０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｖ遺伝子ＦＲ領域を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５０ｎＭ～約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｖ遺伝子ＦＲ領域を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５０ｎＭ～約４００ｎＭまたは約１００ｎＭ～約５００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｖ遺伝子ＦＲ領域を標的とするプライマーの各々の濃度は、約２００ｎＭ、約４００ｎＭ、約６００ｎＭ、または約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｖ遺伝子ＦＲ領域を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｖ遺伝子ＦＲ領域を標的とするプライマーの各々の濃度は、約１０００ｎＭ、約１２５０ｎＭ、約１５００ｎＭ、約１７５０ｎＭ、または約２０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｖ遺伝子ＦＲ領域を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５０ｎＭ～約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｊ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５ｎＭ～約２０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｊ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５０ｎＭ～約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｊ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５０ｎＭ～約４００ｎＭまたは約１００ｎＭ～約５００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｊ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約２００ｎＭ、約４００ｎＭ、約６００ｎＭ、または約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｊ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｊ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約１０００ｎＭ、約１２５０ｎＭ、約１５００ｎＭ、約１７５０ｎＭ、または約２０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｊ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５０ｎＭ～約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５ｎＭ～約２０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５０ｎＭ～約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５０ｎＭ～約４００ｎＭまたは約１００ｎＭ～約５００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約２００ｎＭ、約４００ｎＭ、約６００ｎＭ、または約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約１０００ｎＭ、約１２５０ｎＭ、約１５００ｎＭ、約１７５０ｎＭ、または約２０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、Ｃ遺伝子を標的とするプライマーの各々の濃度は、約５０ｎＭ～約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、多重反応における各フォワードおよびリバースプライマーの濃度は、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、または約４００ｎＭである。いくつかの実施形態において、多重反応における各フォワードおよびリバースプライマーの濃度は、約５ｎＭ～約２０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、多重反応における各フォワードおよびリバースプライマーの濃度は、約５０ｎＭ～約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、多重反応における各フォワードおよびリバースプライマーの濃度は、約５０ｎＭ～約４００ｎＭまたは約１００ｎＭ～約５００ｎＭである。いくつかの実施形態において、多重反応における各フォワードおよびリバースプライマーの濃度は、約６００ｎＭ、約８００ｎＭ、約１０００ｎＭ、約１２５０ｎＭ、約１５００ｎＭ、約１７５０ｎＭ、または約２０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、多重反応における各フォワードおよびリバースプライマーの濃度は、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５０ｎＭ、または５０ｎＭ～約８００ｎＭである。
【0091】
いくつかの実施形態において、Ｖ遺伝子ＦＲおよびＣ遺伝子標的指向プライマーは、増幅プライマー対として組み合わされて、標的免疫受容体ｃＤＮＡ配列を増幅し、標的アンプリコンを生成する。一般に、標的アンプリコンの長さは、Ｃ遺伝子プライマー（複数可）と対となるＶ遺伝子プライマーセット（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３指向プライマー）に依存する。したがって、いくつかの実施形態において、標的アンプリコンは、長さが約１００個のヌクレオチド（または塩基もしくは塩基対）～約６００個のヌクレオチド（または塩基もしくは塩基対）の範囲であることができる。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンは、長さが約８０個のヌクレオチド～約６００個のヌクレオチドの範囲であることができる。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンは、長さが約２００～約６００または約３００～約６００個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンは、長さが約８０～約１４０、約９０～約１３０、または約１００～約１２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンは、長さが約２５０～約２７５、約２５０～約３５０、約３００～約３５０、約３１０～約３３０、約３２５～約３７５、約３００～約４００、約３５０～約４００、約３５０～約４２５、約３５０～約４５０、約３８０～約４１０、約３７５～約４２５、約４００～約５００、約４２５～約５００、約４５０～約５５０、約５００～約６００、約４００～約５００、または約４００～約６００個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンは、長さが約８０、約１００、約１２０、約１４０、約２００、約２５０、約２７５、約３００、約３２０、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約５００、約５５０、または約６００個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＩｇＨアンプリコンは、長さが約１００、約８０～約１４０、約９０～約１３０、または約１００～約１２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＩｇＨアンプリコンは、長さが約３２０、約３００～約３５０、または約３１０～約３３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＩｇＨアンプリコンは、長さが約４００、約３７５～約４２５、または約３９０～約４１０個のヌクレオチドである。
【0092】
いくつかの実施形態において、Ｖ遺伝子ＦＲおよびＪ遺伝子標的指向プライマーは、増幅プライマー対として組み合わされて、標的免疫受容体ｃＤＮＡ配列または再配列されたｇＤＮＡ配列を増幅し、標的アンプリコンを生成する。一般に、標的アンプリコンの長さは、Ｊ遺伝子プライマーと対となるＶ遺伝子プライマーセット（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３指向プライマー）に依存する。したがって、いくつかの実施形態において、標的アンプリコンは、長さが約５０個のヌクレオチド～約３５０個のヌクレオチドの範囲であることができる。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンは、長さが約５０～約２００、約７０～約１７０、約２００～約３５０、約２５０～約３２０、約２７０～約３００、約２２５～約３００、約２５０～約２７５、約２００～約２３５、約２００～約２５０、または約１７５～約２７５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＩｇＨアンプリコンは、長さが約８０、約６０～約１００、または約７０～約９０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｖ遺伝子ＦＲ３指向およびＪ遺伝子指向プライマー対を使用して生成されるものなどのＩｇＨアンプリコンは、長さが約５０～約２００個のヌクレオチド、好ましくは長さが約６０～約１６０、約６５～約１２０、約９０～約９０～約１２０、約７０～約９０個のヌクレオチド、または約８０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、かかる長さが短いアンプリコンを生成することは、提供される方法および組成物が、ＦＦＰＥ試料または無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）に由来するものなどの高度に分解されたｇＤＮＡ鋳型材料から免疫レパートリーを効果的に検出および分析することを可能にする。
【0093】
いくつかの実施形態において、増幅プライマーは、例えば、試料中の複数の増幅された標的配列を区別または分離するために、バーコード配列を含み得る。いくつかの実施形態において、増幅プライマーは、例えば、試料中の複数の増幅された標的配列を区別または分離するために、２つ以上のバーコード配列を含み得る。いくつかの実施形態において、増幅プライマーは、生成されたアンプリコンのその後のカタログ化、特定、または配列決定を補助することができるタグ化配列を含み得る。いくつかの実施形態において、バーコード配列（複数可）またはタグ化配列（複数可）は、増幅プライマーに含めることによって、またはアダプターのライゲーションによって、増幅されたヌクレオチド配列に組み込まれる。プライマーは、その後の配列決定、例えば、パイロシークエンシングに有用なヌクレオチドをさらに含み得る。かかる配列は、市販のソフトウェアプログラムまたは企業によって容易に設計される。
【0094】
いくつかの実施形態において、多重増幅は、タグ化配列を含まない標的指向増幅プライマーを用いて行われる。他の実施形態において、多重増幅は、例えば、フォワードプライマーまたはプライマーセットがタグ化配列１を含み、リバースプライマーまたはプライマーセットがタグ化配列２を含むなど、各々が標的指向配列およびタグ化配列を含む増幅プライマーを用いて行われる。さらに他の実施形態において、多重増幅は、一方のプライマーまたはプライマーセットが標的指向配列およびタグ化配列を含み、他方のプライマーまたはプライマーセットが標的指向配列を含むが、タグ化配列を含まない、例えば、フォワードプライマーまたはプライマーセットはタグ化配列を含み、リバースプライマーまたはプライマーセットはタグ化配列を含まない、などの増幅プライマーを用いて行われる。
【0095】
したがって、いくつかの実施形態において、複数の標的ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ鋳型分子は、フォワードおよび／またはリバースプライマーがタグ化配列を含む、ＢＣＲおよび／またはＴＣＲ指向増幅プライマーを用いた単一の多重増幅反応混合物中で増幅され、得られるアンプリコンは、標的ＢＣＲおよび／またはＴＣＲ配列ならびに片端もしくは両端にタグ化配列を含む。いくつかの実施形態において、フォワードおよび／またはリバース増幅プライマーもしくはプライマーセットはまた、バーコードを含み得、そのため、１つ以上のバーコードが、得られるアンプリコンに含まれる。
【0096】
いくつかの実施形態において、複数の標的ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ鋳型分子は、ＢＣＲおよび／またはＴＣＲ指向増幅プライマーを用いた単一の多重増幅反応混合物中で増幅され、得られるアンプリコンは、ＢＣＲおよび／またはＴＣＲ配列のみを含む。いくつかの実施形態において、タグ化配列は、例えば、アダプターライゲーションを介して、かかるアンプリコンの末端に付加される。いくつかの実施形態において、バーコード配列は、例えば、アダプターライゲーションを介して、かかるアンプリコンの片端または両端に付加される。
【0097】
バーコードとしての使用およびバーコードライブラリーに好適なヌクレオチド配列は、当技術分野で知られている。バーコード配列を含むアダプターならびに増幅プライマーおよびプライマーセットは、市販されている。バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドアダプターも市販されており、例えば、ＩｏｎＸｐｒｅｓｓ（商標）、ＩｏｎＣｏｄｅ（商標）、およびＩｏｎ Ｓｅｌｅｃｔバーコードアダプター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれる。同様に、当該技術分野において報告さら、知られている追加および他のユニバーサルアダプター／プライマー配列（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａユニバーサルアダプター／プライマー配列、ＰａｃＢｉｏユニバーサルアダプター／プライマー配列など）を、本明細書に提供される方法および組成物ならびに支援分析プラットフォームを使用した配列決定された得られるアンプリコンと併せて使用することができる。
【0098】
いくつかの実施形態において、多重化された試料を配列決定するときに、２つ以上のバーコードがアンプリコンに追加される。いくつかの実施形態において、多重化試料を配列決定する前に少なくとも２つのバーコードをアンプリコンに付加して、試料間のバーコード相互汚染またはバーコードブリードスルーに由来する人為的結果（例えば、免疫受容体遺伝子再配列またはクローン特定）の頻度を低下させる。いくつかの実施形態において、免疫レパートリーの低頻度クローンを追跡する場合、試料を標識するために少なくとも２つのバーコードが使用される。いくつかの実施形態において、アッセイを使用して１：１，０００未満の頻度のクローンを検出する場合、少なくとも２つのバーコードがアンプリコンに付加される。いくつかの実施形態において、アッセイを使用して１：１０，０００未満の頻度のクローンを検出する場合、少なくとも２つのバーコードがアンプリコンに付加される。他の実施形態において、アッセイを使用して、頻度が１：２０，０００未満、１：４０，０００未満、１：１００，０００未満、１：２００，０００未満、１：４００，０００未満、１：５００，００未満、または１：１，０００，０００未満のクローンを検出する場合、少なくとも２つのバーコードがアンプリコンに付加される。クローン当たりの高い配列決定深度および／またはかかる低頻度でのクローンの検出から利益を得る免疫レパートリーを特徴付けるための方法には、治療を受けている過剰増殖性疾患を有する患者のモニタリングおよび治療後の微小残存病変に関する試験が含まれるが、これらに限定されない。
【0099】
いくつかの実施形態において、本発明の方法で使用される標的特異的プライマー（例えば、Ｖ遺伝子ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３指向プライマー、Ｊ遺伝子指向プライマー、ならびにＣ遺伝子指向プライマー）は、以下の基準：（１）プライマー配列内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さ、（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm（４）目的の試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、同じ反応に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および（６）いずれの他の生成された標的アンプリコン内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的、のうちのいずれか１つ以上を満たすように選択または設計される。いくつかの実施形態において、提供される方法で使用される標的特異的プライマーは、上記の基準のいずれか２、３、４、５、または６つを満たすように選択または設計される。
【0100】
いくつかの実施形態において、本発明の方法で使用される標的特異的プライマーは、切断可能な基を有する１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法で使用される標的特異的プライマーは、切断可能な基を有する２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンから選択される切断可能な基を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
【0101】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される増幅方法（および関連する組成物、システム、およびキット）を使用する標的アンプリコンは、免疫受容体レパートリーライブラリーの調製に使用される。いくつかの実施形態において、免疫受容体レパートリーライブラリーは、アダプター配列を標的アンプリコン配列の末端に導入することを含む。特定の実施形態において、免疫受容体レパートリーライブラリーを調製するための方法は、本明細書に記載の多重増幅法のうちのいずれかに従って標的免疫受容体アンプリコン分子を生成することと、アンプリコン分子のプライマー配列内の修飾ヌクレオチドを消化することによってアンプリコン分子を処理することと、少なくとも１つのアダプターを処理されたアンプリコン分子のうちの少なくとも１つに連結することと、を含み、それによって標的免疫受容体レパートリーを含むアダプター連結標的免疫受容体アンプリコン分子のライブラリーを生成する。いくつかの実施形態において、ライブラリーを調製するステップは、添加ステップのみを含む単一の反応容器内で実行される。特定の実施形態において、方法は、少なくとも１つのアダプター連結標的アンプリコン分子の一部をクローン的に増幅することをさらに含む。
【0102】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法（および関連する組成物、システム、およびキット）を使用する標的アンプリコンは、ライブラリー調製および核酸配列決定など、これらに限定されない下流プロセスと合わされる。例えば、標的アンプリコンは、ブリッジ増幅、エマルジョンＰＣＲ、または等温増幅を使用して増幅し、核酸配列決定に好適な複数のクローン鋳型を生成することができる。いくつかの実施形態において、アンプリコンライブラリーは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定プラットフォームなどの半導体配列決定技術を含む、任意の次世代配列決定プラットフォームなどの任意の好適なＤＮＡ配列決定プラットフォームを使用して配列決定される。いくつかの実施形態において、アンプリコンライブラリーは、Ｉｏｎ ＧｅｎｅＳｔｕｄｉｏ Ｓ５ ５４０（商標）システムまたはＩｏｎ ＧｅｎｅＳｔｕｄｉｏ Ｓ５ ５２０（商標）システムまたはＩｏｎ ＧｅｎｅＳｔｕｄｉｏ Ｓ５ ５３０（商標）システムまたはＩｏｎ ＰＧＭ ３１８（商標）システムを使用して配列決定される。
【0103】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法（および関連する組成物およびキット）を使用して生成される免疫受容体アンプリコンの配列決定は、長さが約２００～約６００個のヌクレオチドの連続した配列読み取りを生成する。いくつかの実施形態において、連続した読み取り長は、約３００～約４００個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、連続した読み取り長は、約３５０～約４５０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、読み取り長は、平均して約３００個のヌクレオチド、約３５０個のヌクレオチド、または約４００個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、連続した読み取り長は、約２５０～約３５０個のヌクレオチド、約２７５～約３４０、または約２９５～約３２５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、読み取り長は、平均して約２７０、約２８０、約２９０、約３００、または約３２５個のヌクレオチドの長さである。他の実施形態においした読み取り長は、約１８０～約３００個のヌクレオチド、約２００～約２９０個のヌクレオチド、約２２５～約２８０個のヌクレオチド、または約２３０～約２５０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、読み取り長は、平均して約２００、約２２０、約２３０、約２４０、または約２５０個のヌクレオチドの長さである。他の実施形態において、連続した読み取り長は、約７０～約２００個のヌクレオチド、約８０～約１５０個のヌクレオチド、約９０～約１４０個のヌクレオチド、または約１００～約１２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、連続した読み取り長は、約５０～約１７０個のヌクレオチド、約６０～約１６０個のヌクレオチド、約６０～約１２０個のヌクレオチド、約７０～約１００個のヌクレオチド、約７０～約９０個のヌクレオチド、または約８０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、読み取り長は、平均して約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、または約１２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、配列読み取り長は、アンプリコン配列およびバーコード配列を含む。いくつかの実施形態において、配列読み取り長は、バーコード配列を含まない。
【0104】
いくつかの実施形態において、プライマーおよびプライマー対は、核酸分子の特定の領域を増幅することができる標的特異的核酸分子である。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、発現されたＲＮＡまたはｃＤＮＡを増幅することができる。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、ヒトＲＮＡもしくはそれから調製されるｃＤＮＡ、またはマウスＲＮＡもしくはそれから調製されるｃＤＮＡなどの哺乳動物ＲＮＡを増幅することができる。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、ｇＤＮＡなどのＤＮＡを増幅することができる。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、ヒトＤＮＡまたはマウスＤＮＡなどの哺乳動物ＤＮＡを増幅することができる。
【0105】
本明細書で提供される方法および組成物、例えば、生物学的試料中の免疫レパートリーを決定、特徴付け、および／または追跡するためのものにおいて、標的配列の増幅に必要とされる入力ＲＮＡまたはｇＤＮＡの量は、試料における免疫受容体担持細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）の割合に部分的に依存する。例えば、Ｂ細胞が豊富化された試料など、試料中のＢ細胞の割合が高いほど、増幅のために低い量の入力ＲＮＡまたはｇＤＮＡの使用が可能である。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的配列の増幅のための入力ＲＮＡの量は、約０．０５ｎｇ～約１０マイクログラムであることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的配列の多重増幅のために使用される入力ＲＮＡの量は、約５ｎｇ～約２マイクログラムであることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的配列の多重増幅のために使用されるＲＮＡの量は、約５ｎｇ～約１マイクログラムまたは約１０ｎｇ～約１マイクログラムであることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の多重増幅のために使用されるＲＮＡの量は、約１．５マイクログラム、約２マイクログラム、約２．５マイクログラム、約３マイクログラム、約３．５マイクログラム、約４．０マイクログラム、約５マイクログラム、約６マイクログラム、約７マイクログラム、または約１０マイクログラムである。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の多重増幅のために使用されるＲＮＡの量は、約１０ｎｇ、約２５ｎｇ、約５０ｎｇ、約１００ｎｇ、約２００ｎｇ、約２５０ｎｇ、約５００ｎｇ、約７５０ｎｇ、または約１０００ｎｇである。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の多重増幅のために使用されるＲＮＡの量は、約２５ｎｇ～約５００ｎｇのＲＮＡまたは約５０ｎｇ～約２００ｎｇのＲＮＡである。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の多重増幅のために使用されるＲＮＡの量は、約０．０５ｎｇ～約１０ｎｇのＲＮＡ、約０．１ｎｇ～約５ｎｇのＲＮＡ、約０．２ｎｇ～約２ｎｇのＲＮＡ、または約０．５ｎｇ～約１ｎｇのＲＮＡである。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の多重増幅のために使用されるＲＮＡの量は、約０．０５ｎｇ、約０．１ｎｇ、約０．２ｎｇ、約０．５ｎｇ、約１．０ｎｇ、約２．０ｎｇ、または約５．０ｎｇである。
【0106】
本明細書に記載されるように、生物学的試料からのＲＮＡは、多重増幅の前に、典型的には逆転写反応に逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡに変換される。いくつかの実施形態において、逆転写反応は、入力ＲＮＡを用いて行われ、逆転写反応からのｃＤＮＡの一部が、多重増幅反応に使用される。いくつかの実施形態において、入力ＲＮＡから調製された実質的にすべてのｃＤＮＡが、多重増幅反応に添加される。他の実施形態において、入力ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡの一部、例えば約８０％、約７５％、約６６％、約５０％、約３３％、または約２５％などが、多重増幅反応に添加される。他の実施形態において、入力ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡの約１５％、約１０％、約８％、約６％、または約５％が多重増幅反応に添加される。
【0107】
いくつかの実施形態において、多重増幅反応に添加される、試料からのｃＤＮＡの量は、約０．００１ｎｇ～約５マイクログラムであることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の多重増幅のために使用されるｃＤＮＡの量は、約０．０１ｎｇ～約２マイクログラムであることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的配列の多重増幅のために使用されるｃＤＮＡの量は、約０．１ｎｇ～約１マイクログラムまたは約１ｎｇ～約０．５マイクログラムであることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の多重増幅のために使用されるｃＤＮＡの量は、約０．５ｎｇ、約１ｎｇ、約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約２５ｎｇ、約５０ｎｇ、約１００ｎｇ、約２００ｎｇ、約２５０ｎｇ、約５００ｎｇ、約７５０ｎｇ、または約１０００ｎｇである。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の多重増幅のために使用されるｃＤＮＡの量は、約０．０１ｎｇ～約１０ｎｇのｃＤＮＡ、約０．０５ｎｇ～約５ｎｇのｃＤＮＡ、約０．１ｎｇ～約２ｎｇのｃＤＮＡ、または約０．０１ｎｇ～約１ｎｇのｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の多重増幅のために使用されるｃＤＮＡの量は、約０．００５ｎｇ、約０．０１ｎｇ、約０．０５ｎｇ、約０．１ｎｇ、約０．２ｎｇ、約０．５ｎｇ、約１．０ｎｇ、約２．０ｎｇ、または約５．０ｎｇである。
【0108】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、生物学的試料から得られ、増幅目的のために従来の方法を使用してｃＤＮＡに変換される。生物学的試料から核酸を抽出または単離するための方法および試薬はよく知られており、市販されている。いくつかの実施形態において、生物学的試料からのＲＮＡ抽出は、本明細書に記載されるか、さもなければ当業者に知られている任意の方法、例えば、プロテイナーゼＫ組織消化およびアルコールベースの核酸沈殿、汚染ＤＮＡを消化するＤＮアーゼによる処理、ならびにシリカ－ゲル－膜技術を使用したＲＮＡ精製、またはそれらの任意の組み合わせを含む方法によって行われる。市販キットを使用する生物学的試料からのＲＮＡ抽出の例示的な方法には、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）多試料ＲＮＡ／ＤＮＡワークフロー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）全核酸単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ血液（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）血液ＲＮＡシステム、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡマイクロスケールキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭａｇＭＡＸ（商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｕｌｔｒａキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＺＲ ＲＮＡ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ（商標）キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）、およびＲｅｌｉａＰｒｅｐ（商標）ＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｎｉＰｒｅｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。
【0109】
いくつかの実施形態において、１つ以上の標的配列の増幅のための入力ｇＤＮＡの量は、約０．１ｎｇ～約１０マイクログラムであることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的配列の増幅のために必要とされるｇＤＮＡの量は、約０．５ｎｇ～約５マイクログラムであることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的配列の増幅のために必要とされるｇＤＮＡの量は、約１ｎｇ～約１マイクログラムまたは約１０ｎｇ～約１マイクログラムであることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の増幅のために必要とされるｇＤＮＡの量は、約１０ｎｇ～約５００ｎｇ、約２５ｎｇ～約４００ｎｇ、または約５０ｎｇ～約２００ｎｇである。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的配列の増幅のために必要とされるｇＤＮＡの量は、約０．５ｎｇ、約１ｎｇ、約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約２０ｎｇ、約５０ｎｇ、約１００ｎｇ、または約２００ｎｇである。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫レパートリー標的配列の増幅のために必要とされるｇＤＮＡの量は、約１マイクログラム、約２マイクログラム、約３マイクログラム、約４．０マイクログラム、または約５マイクログラムである。
【0110】
いくつかの実施形態において、ｇＤＮＡは、生物学的試料から従来の方法を使用して得られる。生物学的試料から核酸を抽出または単離するための方法および試薬はよく知られており、市販されている。いくつかの実施形態において、生物学的試料からのＤＮＡ抽出は、本明細書に記載されるか、さもなければ当業者に知られている任意の方法、例えば、プロテイナーゼＫ組織消化およびアルコールベースの核酸沈殿、汚染ＲＮＡを消化するＲＮアーゼによる処理、ならびにシリカ－ゲル－膜技術を使用したＤＮＡ精製、またはそれらの任意の組み合わせを含む方法によって行われる。市販キットを使用する生物学的試料からのＤＮＡ抽出の例示的な方法には、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）Ｄｉｒｅｃｔ ＦＦＰＥ ＤＮＡキット、ＭａｇＭＡＸ（商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｕｌｔｒａキット、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）全核酸単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭａｇＭＡＸ（商標）ＤＮＡマルチ試料キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．のＤＮＡ抽出キット（例えば、ＦＦＰＥ組織ＤＮＡ抽出キット、ゲノムＤＮＡ抽出キット、血液および血清ＤＮＡ分離キット）が含まれる。
【0111】
試料または生物学的試料は、本明細書で使用される場合、免疫系に関連する細胞を含むか、または含む得る個体からの組成物を指す。例示的な生物学的試料には、限定されないが、組織（例えば、リンパ節、器官組織、骨髄）、全血、滑液、脳脊髄液、腫瘍生検、および細胞を含む他の臨床標本が含まれる。試料には、正常細胞および／または疾患細胞を含み得、細針吸引物、細針生検、コア試料、または他の試料であり得る。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、造血細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）、または他のリンパ球を含み得る。いくつかの実施形態において、試料は、新鮮（例えば、保存されていない）、凍結、またはホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）であり得る。いくつかの試料は、がん腫、黒色腫、肉腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病などのがん細胞を含み、がん細胞は、循環腫瘍細胞であり得る。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、例えば、血液または血漿中に認められるようなｃｆＤＮＡを含む。
【0112】
生物学的試料は、組織もしくは細胞型の混合物、少なくとも１つの特定のカテゴリーもしくは型の細胞について豊富化された細胞の調製物、または特定の型もしくは表現型の細胞の単離された集団であることができる。試料は、分析前に、遠心分離、エルトリエーション、密度勾配分離、アフェレーシス、アフィニティー選択、パンニング、ＦＡＣＳ、Ｈｙｐａｑｕｅによる遠心分離などによって分離することができる。特定の細胞型を選別、豊富化、および単離するための方法はよく知られており、当業者によって容易に実行することができる。いくつかの実施形態において、試料は、Ｂ細胞について豊富化された調製物であり得る。
【0113】
いくつかの実施形態において、提供される方法およびシステムは、免疫レパートリー受容体ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ配列データの分析、ならびに決定された免疫受容体配列からＰＣＲまたは配列決定由来のエラー（複数可）を特定および／または除去するためのプロセスを含む。
【0114】
いくつかの実施形態において、エラー修正戦略は、
１）配列決定された再配列を、可変性、多様性、および結合／定常遺伝子の参照データベースに整列させて、問い合わせ配列／参照配列対を生成するステップであって、多くの整列手順がこの目的のために使用され得、例えば、ＮＣＢＩからの無料公開ツールであるＩｇＢＬＡＳＴ、およびカスタムコンピュータスクリプトが含まれる、生成するステップと、
２）参照配列と問い合わせ配列を互いに再整列させて、配列決定に使用されるフロー順序を考慮するステップであって、フロー順序が、いくつかのタイプの誤った整列を特定および修正することを可能にする、考慮するステップと、
３）ＣＤＲ３領域の境界をそれらの特徴的な配列モチーフによって特定するステップと、
４）ＣＤＲ３領域を除く、可変遺伝子および結合／定常遺伝子に対応する再配列の整列部分にわたって、問い合わせ内のインデルを参照に対して特定し、ミスマッチの問い合わせ塩基位置が、参照と一致するように変更するステップと、
５）ＣＤＲ３領域について、ＣＤＲ３の長さが３の倍数でない（インデルエラーを示す）場合：
（ａ）ＰＨＲＥＤスコア（ｅで示される）に基づいて、配列エラーを含む最も高い確率を有するホモポリマー伸長についてＣＤＲ３を探索することと、
（ｂ）ＰＨＲＥＤスコア（ｔで示される）に基づいて、ＣＤＲ３領域全体にわたるエラーの確率を得ることと、
（ｃ）ｅ／ｔが定義された閾値よりも高い場合、ＣＤＲ３ヌクレオチド長が３の倍数であるように、ホモポリマーの長さを１つの塩基を増加させるか、または減少させるいずれかによって、ホモポリマーを編集することと、
（ｄ）ステップａ～ｃの代替として、ＣＤＲ３で最長のホモポリマーを探索し、ホモポリマーの長さが定義された閾値を超えている場合、ＣＤＲ３ヌクレオチド長が３の倍数であるように、ホモポリマーの長さを１つの塩基を増加させるか、または減少させるいずれかによって、ホモポリマーを編集するステップと、を含む。
１）配列決定された再配列を、可変性、多様性、および結合／定常遺伝子の参照データベースに整列させて、問い合わせ配列／参照配列対を生成するステップであって、多くの整列手順がこの目的のために使用され得、例えば、ＮＣＢＩからの無料公開ツールであるＩｇＢＬＡＳＴ、およびカスタムコンピュータスクリプトが含まれる、生成するステップと、
２）参照配列と問い合わせ配列を互いに再整列させて、配列決定に使用されるフロー順序を考慮するステップであって、フロー順序が、いくつかのタイプの誤った整列を特定および修正することを可能にする、考慮するステップと、
３）ＣＤＲ３領域の境界をそれらの特徴的な配列モチーフによって特定するステップと、
４）ＣＤＲ３領域を除く、可変遺伝子および結合／定常遺伝子に対応する再配列の整列部分にわたって、問い合わせ内のインデルを参照に対して特定し、ミスマッチの問い合わせ塩基位置が、参照と一致するように変更するステップと、
５）ＣＤＲ３領域について、ＣＤＲ３の長さが３の倍数でない（インデルエラーを示す）場合：
（ａ）ＰＨＲＥＤスコア（ｅで示される）に基づいて、配列エラーを含む最も高い確率を有するホモポリマー伸長についてＣＤＲ３を探索することと、
（ｂ）ＰＨＲＥＤスコア（ｔで示される）に基づいて、ＣＤＲ３領域全体にわたるエラーの確率を得ることと、
（ｃ）ｅ／ｔが定義された閾値よりも高い場合、ＣＤＲ３ヌクレオチド長が３の倍数であるように、ホモポリマーの長さを１つの塩基を増加させるか、または減少させるいずれかによって、ホモポリマーを編集することと、
（ｄ）ステップａ～ｃの代替として、ＣＤＲ３で最長のホモポリマーを探索し、ホモポリマーの長さが定義された閾値を超えている場合、ＣＤＲ３ヌクレオチド長が３の倍数であるように、ホモポリマーの長さを１つの塩基を増加させるか、または減少させるいずれかによって、ホモポリマーを編集するステップと、を含む。
【0115】
いくつかの実施形態において、ＰＣＲおよび配列決定のエラーに対して頑強であるレパートリーデータにおいてＢ細胞および／またはＴ細胞クローンを特定するための方法が提供される。したがって、かかる方法で用いて、Ｂ細胞および／またはＴ細胞クローンを、ＰＣＲおよび配列決定のエラーに対して頑強な手段で特定し得るステップが、以下に記載される。表１は、免疫受容体配列決定データからＰＣＲまたは配列決定由来のエラーを特定および除去する際に使用するための例示的なワークフローの図である。このワークフローの例示的な部分および実施形態もまた、図１～２に示される。
【表1】
【0116】
ｍＲＮＡまたはｇＤＮＡに由来するＴＣＲまたはＢＣＲ配列のセットでは、１）各配列は、ネイティブとしてか、または前述のようにエラー修正後のいずれかで、生産的再配列として注釈されており、２）各配列は、特定されたＶ遺伝子およびＣＤＲ３ヌクレオチド領域を有しており、いくつかの実施形態において、方法は以下を含む。
１）キメラ配列を特定して除外する。データセットに存在する各々の固有なＣＤＲ３ヌクレオチド配列について、そのＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびＶ遺伝子の可能性があるものの読み取り数を集計する。そのＣＤＲ３ヌクレオチド配列における総読み取り数の１０％未満を構成するＶ遺伝子－ＣＤＲ３組み合わせは、キメラとしてフラグが立てられ、下流の分析から排除される。例として、同じＣＤＲ３ヌクレオチド配列を有する以下の配列について、例えば、ＣＤＲ３ｎｔ配列ＡＡＴＴＧＧＴと対形成するＴＲＢＶ３およびＴＲＢＶ６を有する配列は、キメラとしてフラグが立てられる。
１）キメラ配列を特定して除外する。データセットに存在する各々の固有なＣＤＲ３ヌクレオチド配列について、そのＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびＶ遺伝子の可能性があるものの読み取り数を集計する。そのＣＤＲ３ヌクレオチド配列における総読み取り数の１０％未満を構成するＶ遺伝子－ＣＤＲ３組み合わせは、キメラとしてフラグが立てられ、下流の分析から排除される。例として、同じＣＤＲ３ヌクレオチド配列を有する以下の配列について、例えば、ＣＤＲ３ｎｔ配列ＡＡＴＴＧＧＴと対形成するＴＲＢＶ３およびＴＲＢＶ６を有する配列は、キメラとしてフラグが立てられる。
【表2】
【0117】
２）単純なインデルエラーを含む配列を特定して除外する。データセット内の各読み取りについて、その読み取りのＣＤＲ３配列のホモポリマー崩壊した表現を得る。同じＶ遺伝子および崩壊したＣＤＲ３の組み合わせを有する読み取りの各セットについて、崩壊していない各ＣＤＲ３ヌクレオチド配列の出現数を集計する。その読み取りセットにおいて総読み取りの＜１０％を構成する崩壊していないＣＤＲ３配列は、単純なホモポリマーエラーを有するとしてフラグが立てられる。例として、３つの異なるＶ遺伝子－ＣＤＲ３ヌクレオチド配列が、ＣＤＲ３ヌクレオチド配列のホモポリマー崩壊後に同一であるとして示される。より頻度の低い２つのＶ遺伝子－ＣＤＲ３組み合わせが、読み取りセットにおいて総読み取りの＜１０％未満を構成し、単純なインデルエラーを含むとしてフラグが立てられる。例えば、
【表3】
【0118】
３）シングルトン読み取りを特定して除外する。データセット内の各読み取りについて、正確な読み取り配列がデータセットに認められる回数を集計する。データセットに１回のみ出現する読み取りは、シングルトン読み取りとしてフラグを立てる。
４）切り詰められた読み取りを特定して除外する。データセット内の各読み取りについて、ＩｇＢＬＡＳＴ参照Ｖ遺伝子セットに対する読み取りのＩｇＢＬＡＳＴ整列によって示されるとき、読み取りが注釈されたＶ遺伝子ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３領域を有するか決定する。上記の領域を有さない読み取りは、領域（複数可）が増幅のために使用された特定のＶ遺伝子プライマーに基づいて予想される場合、切り詰められたとしてフラグが立てられる。
５）双方向サポートを欠く再配列を特定して除外する。データセット内の各読み取りについて、読み取りのＶ遺伝子およびＣＤＲ３配列、ならびに読み取りの鎖方向（プラスまたはマイナス鎖）を得る。データセット内の各Ｖ遺伝子－ＣＤＲ３組み合わせについて、そのＶ遺伝子－ＣＤＲ３ｎｔの組み合わせを有するプラス鎖およびマイナス鎖の読み取り数を集計する。一方向の読み取りにのみ存在するＶ遺伝子－ＣＤＲ３ｎｔ組み合わせは、偽と見なされる。偽Ｖ遺伝子－ＣＤＲ３ｎｔ組み合わせを有するすべての読み取りには、双方向サポートを欠いているとフラグを立てられる。
６）フラグが立てられていない遺伝子について、ＣＤＲ３ヌクレオチド類似性に基づいて段階的なクラスタリングを行う。配列を、対立遺伝子情報を除いて、読み取りのＶ遺伝子同一性に基づいて群に分ける（ｖ遺伝子群）。各群について、
ａ．各群における読み取りを、ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔおよび以下のパラメータ：
ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔ－ｉ ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａ－ｏ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ＿ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｃｄｈｉｔ－Ｔ２４－ｄ０－Ｍ１０００００－Ｂ０－ｒ０－ｇ１－Ｓ０－Ｕ２－ｕＬ．０５－ｎ１０－ｌ７を使用して、クラスターに配置する。（無料で入手できるソフトウェアプログラムｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔは、ヌクレオチドデータセットを、ユーザー定義の類似性閾値を満たすクラスターにクラスター化する。（ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔに関するコードおよび説明について、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｗｅｉｚｈｏｎｇｌｉ／ｃｄｈｉｔ／ｗｉｋｉ／３．－Ｕｓｅｒ％２７ｓ－Ｇｕｉｄｅ＃ＣＤＨＩＴＥＳＴを参照されたい）。
ここで、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、同じＶ遺伝子を有する配列のＣＤＲ３ヌクレオチド領域のｆａｓｔａ形式のファイルであり、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ＿ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｃｄｈｉｔは、細分化された配列を含む出力である。
ｂ．クラスター内の各配列に同じクローンＩＤを割り当て、下位群のメンバーが同じＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンを表すと考えられることを示すために使用される。
ｃ．各クラスターについて、代表的な配列が最大回数出現する配列であるか、または同じ回数の場合は、無作為的に選択されるように、代表的な配列を選択する。
ｄ．クラスター内の他のすべての読み取りを代表的な配列にマージし、それによって、代表的な配列における読み取り数が、マージされた配列における読み取り数に応じて増加される。
ｅ．ｖ遺伝子群内の代表的な配列を、ハミング距離に基づいて、互いに比較する。代表的な配列が、＞５０倍豊富な代表的な配列に対して１のハミング距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。代表的な配列が、＞１００００倍豊富な代表的な配列に対して２のハミング距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。
ｆ．複雑な配列エラーを特定する。各Ｖ遺伝子群内の代表的な配列をホモポリマー崩壊させ、次いでレーベンシュタイン距離を使用して互いに比較する。代表的な配列が、＞５０倍豊富な代表的な配列に対して１のレーベンシュタイン距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。
ｇ．ＣＤＲ３の誤注釈エラーを特定する。各Ｖ遺伝子群内の代表的な配列をホモポリマー崩壊させ、次いで各ホモポリマー崩壊した配列の段階的比較を行う。配列の各対について、一方の配列が他方の配列のサブセットであるか決定する。その場合、少ない量の配列は、より豊富な配列が＞５００倍豊富である場合、より豊富な配列にマージする。
７）クラスター代表をユーザーに報告する。
４）切り詰められた読み取りを特定して除外する。データセット内の各読み取りについて、ＩｇＢＬＡＳＴ参照Ｖ遺伝子セットに対する読み取りのＩｇＢＬＡＳＴ整列によって示されるとき、読み取りが注釈されたＶ遺伝子ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３領域を有するか決定する。上記の領域を有さない読み取りは、領域（複数可）が増幅のために使用された特定のＶ遺伝子プライマーに基づいて予想される場合、切り詰められたとしてフラグが立てられる。
５）双方向サポートを欠く再配列を特定して除外する。データセット内の各読み取りについて、読み取りのＶ遺伝子およびＣＤＲ３配列、ならびに読み取りの鎖方向（プラスまたはマイナス鎖）を得る。データセット内の各Ｖ遺伝子－ＣＤＲ３組み合わせについて、そのＶ遺伝子－ＣＤＲ３ｎｔの組み合わせを有するプラス鎖およびマイナス鎖の読み取り数を集計する。一方向の読み取りにのみ存在するＶ遺伝子－ＣＤＲ３ｎｔ組み合わせは、偽と見なされる。偽Ｖ遺伝子－ＣＤＲ３ｎｔ組み合わせを有するすべての読み取りには、双方向サポートを欠いているとフラグを立てられる。
６）フラグが立てられていない遺伝子について、ＣＤＲ３ヌクレオチド類似性に基づいて段階的なクラスタリングを行う。配列を、対立遺伝子情報を除いて、読み取りのＶ遺伝子同一性に基づいて群に分ける（ｖ遺伝子群）。各群について、
ａ．各群における読み取りを、ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔおよび以下のパラメータ：
ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔ－ｉ ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａ－ｏ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ＿ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｃｄｈｉｔ－Ｔ２４－ｄ０－Ｍ１０００００－Ｂ０－ｒ０－ｇ１－Ｓ０－Ｕ２－ｕＬ．０５－ｎ１０－ｌ７を使用して、クラスターに配置する。（無料で入手できるソフトウェアプログラムｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔは、ヌクレオチドデータセットを、ユーザー定義の類似性閾値を満たすクラスターにクラスター化する。（ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔに関するコードおよび説明について、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｗｅｉｚｈｏｎｇｌｉ／ｃｄｈｉｔ／ｗｉｋｉ／３．－Ｕｓｅｒ％２７ｓ－Ｇｕｉｄｅ＃ＣＤＨＩＴＥＳＴを参照されたい）。
ここで、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、同じＶ遺伝子を有する配列のＣＤＲ３ヌクレオチド領域のｆａｓｔａ形式のファイルであり、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ＿ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｃｄｈｉｔは、細分化された配列を含む出力である。
ｂ．クラスター内の各配列に同じクローンＩＤを割り当て、下位群のメンバーが同じＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンを表すと考えられることを示すために使用される。
ｃ．各クラスターについて、代表的な配列が最大回数出現する配列であるか、または同じ回数の場合は、無作為的に選択されるように、代表的な配列を選択する。
ｄ．クラスター内の他のすべての読み取りを代表的な配列にマージし、それによって、代表的な配列における読み取り数が、マージされた配列における読み取り数に応じて増加される。
ｅ．ｖ遺伝子群内の代表的な配列を、ハミング距離に基づいて、互いに比較する。代表的な配列が、＞５０倍豊富な代表的な配列に対して１のハミング距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。代表的な配列が、＞１００００倍豊富な代表的な配列に対して２のハミング距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。
ｆ．複雑な配列エラーを特定する。各Ｖ遺伝子群内の代表的な配列をホモポリマー崩壊させ、次いでレーベンシュタイン距離を使用して互いに比較する。代表的な配列が、＞５０倍豊富な代表的な配列に対して１のレーベンシュタイン距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。
ｇ．ＣＤＲ３の誤注釈エラーを特定する。各Ｖ遺伝子群内の代表的な配列をホモポリマー崩壊させ、次いで各ホモポリマー崩壊した配列の段階的比較を行う。配列の各対について、一方の配列が他方の配列のサブセットであるか決定する。その場合、少ない量の配列は、より豊富な配列が＞５００倍豊富である場合、より豊富な配列にマージする。
７）クラスター代表をユーザーに報告する。
【0119】
いくつかの実施形態において、上記のワークフローのステップ６は、Ｖ遺伝子同一性（対立遺伝子情報を除く）、およびＣＤＲ３ヌクレオチド長に基づいて、再配列の配列を群に分ける。他の実施形態において、Ｊ遺伝子同一性および／またはアイソタイプ同一性もまた、群分け基準の一部として使用される。したがって、いくつかの実施形態において、上記ワークフローのステップ６は、以下のステップを含む：
ａ．各群における読み取りを、ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔおよび以下のパラメータ：
ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔ－ｉ ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａ－ｏ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ＿ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｃｄｈｉｔ－Ｔ２４－ｌ９－ｄ０－Ｍ１０００００－Ｂ０－ｒ０－ｇ１－Ｓ１５－Ｕ２－ｕＬ．０５－ｎ９を使用して、クラスターに配置する。
ここで、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、ＶＤＪ再配置の配列決定された部分のｆａｓｔａ形式のファイルである。
いくつかの実施形態において、体細胞超変異がＶＤＪ領域全体で起こり得るため、ＶＤＪの全配列がクラスター化のために考慮される。
ｂ．クラスター内の各配列に同じクローンＩＤを割り当て、下位群のメンバーが同じＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンを表すと考えられることを示すために使用される。
ｃ．各クラスターについて、代表的な配列が最大回数出現する配列であるか、または同じ回数の場合は、無作為的に選択されるように、代表的な配列を選択する。
ｄ．クラスター内の他のすべての読み取りを代表的な配列にマージし、それによって、代表的な配列における読み取り数が、マージされた配列における読み取り数に応じて増加される。
ｅ．ｖ遺伝子群内の代表的な配列を、ハミング距離に基づいて、互いに比較する。代表的な配列が、＞５０倍豊富な代表的な配列に対して１のハミング距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。代表的な配列が、＞１００００倍豊富な代表的な配列に対して２のハミング距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。いくつかの実施形態において、とりわけ、＞５０／３および＞１０００／３の倍率閾値が、それぞれハミング距離１または２の配列をマージするために使用される。配列が長いほど、増幅および／または配列のエラーを蓄積する機会が高くなるため、倍率閾値を低下させることは、ＣＤＲ３領域のみの配列ではなく、ＶＤＪ領域全体の配列を比較する場合に有用であり得る。
ｆ．複雑な配列エラーを特定する。各Ｖ遺伝子群内の代表的な配列をホモポリマー崩壊させ、次いでレーベンシュタイン距離を使用して互いに比較する。代表的な配列が、＞５０倍豊富な代表的な配列に対して１のレーベンシュタイン距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。
ｇ．ＣＤＲ３の誤注釈エラーを特定する。各Ｖ遺伝子群内の代表的な配列をホモポリマー崩壊させ、次いで各ホモポリマー崩壊した各配列の段階的比較を行う。配列の各対について、一方の配列が他方の配列のサブセットであるか決定する。その場合、少ない量の配列は、より豊富な配列が＞５００倍豊富である場合、より豊富な配列にマージする。
ａ．各群における読み取りを、ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔおよび以下のパラメータ：
ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔ－ｉ ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａ－ｏ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ＿ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｃｄｈｉｔ－Ｔ２４－ｌ９－ｄ０－Ｍ１０００００－Ｂ０－ｒ０－ｇ１－Ｓ１５－Ｕ２－ｕＬ．０５－ｎ９を使用して、クラスターに配置する。
ここで、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、ＶＤＪ再配置の配列決定された部分のｆａｓｔａ形式のファイルである。
いくつかの実施形態において、体細胞超変異がＶＤＪ領域全体で起こり得るため、ＶＤＪの全配列がクラスター化のために考慮される。
ｂ．クラスター内の各配列に同じクローンＩＤを割り当て、下位群のメンバーが同じＴ細胞クローンまたはＢ細胞クローンを表すと考えられることを示すために使用される。
ｃ．各クラスターについて、代表的な配列が最大回数出現する配列であるか、または同じ回数の場合は、無作為的に選択されるように、代表的な配列を選択する。
ｄ．クラスター内の他のすべての読み取りを代表的な配列にマージし、それによって、代表的な配列における読み取り数が、マージされた配列における読み取り数に応じて増加される。
ｅ．ｖ遺伝子群内の代表的な配列を、ハミング距離に基づいて、互いに比較する。代表的な配列が、＞５０倍豊富な代表的な配列に対して１のハミング距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。代表的な配列が、＞１００００倍豊富な代表的な配列に対して２のハミング距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。いくつかの実施形態において、とりわけ、＞５０／３および＞１０００／３の倍率閾値が、それぞれハミング距離１または２の配列をマージするために使用される。配列が長いほど、増幅および／または配列のエラーを蓄積する機会が高くなるため、倍率閾値を低下させることは、ＣＤＲ３領域のみの配列ではなく、ＶＤＪ領域全体の配列を比較する場合に有用であり得る。
ｆ．複雑な配列エラーを特定する。各Ｖ遺伝子群内の代表的な配列をホモポリマー崩壊させ、次いでレーベンシュタイン距離を使用して互いに比較する。代表的な配列が、＞５０倍豊富な代表的な配列に対して１のレーベンシュタイン距離内にある場合、その配列は、より共通する代表的な配列にマージする。
ｇ．ＣＤＲ３の誤注釈エラーを特定する。各Ｖ遺伝子群内の代表的な配列をホモポリマー崩壊させ、次いで各ホモポリマー崩壊した各配列の段階的比較を行う。配列の各対について、一方の配列が他方の配列のサブセットであるか決定する。その場合、少ない量の配列は、より豊富な配列が＞５００倍豊富である場合、より豊富な配列にマージする。
【0120】
いくつかの実施形態において、提供されるワークフローは、様々なステップに列挙される頻度比閾値に限定されず、他の頻度比閾値が、上記に含まれる代表的な頻度比閾値の代わりになり得る。頻度比は、より少ない共通の代表的な配列の存在量値に対する、より多い共通の代表的な配列の存在量値の比を指す。頻度比閾値は、より少ない代表的な配列が、より多い共通の代表的配列にマージされる閾値を与える。例えば、いくつかの実施形態において、ｖ遺伝子群内の代表的な配列をハミング距離に基づいて互いに比較することは、上記のステップ（ｅ）に列挙されるもの以外の頻度比閾値を使用し得る。例えば、限定されないが、代表的な配列が代表的な配列に対して２のハミング距離内にある場合、１０００、５０００、２０，０００などの頻度比閾値が使用され得る。例えば、限定されないが、代表的な配列が代表的な配列に対して１のハミング距離内にある場合、２０、１００、２００などの頻度比閾値が使用され得る。提供される頻度比閾値は、類似した対のより多い存在量の配列を正しい配列として表示する一般的なプロセスを表す。
【0121】
同様に、ワークフローにおける他のステップ、例えば、ステップ（１）、ステップ（２）、ステップ（６ｆ）、およびステップ（６ｇ）で２つの配列の頻度を比較する場合、上記のステップに列挙されるもの以外の頻度比閾値が利用され得る。
【0122】
本明細書で使用される場合、「ホモポリマー崩壊配列」という用語は、反復される塩基が単一の塩基代表に崩壊された配列を表すことが意図される。例として、非崩壊配列ＡＡＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号６０３）では、ホモポリマー崩壊配列は、ＡＴＡＴＣＧである。
【0123】
本明細書で使用される場合、「クローン」、「クロノタイプ」、「系統」、または「再配列」という用語は、ＴＣＲまたはＢＣＲなどの免疫受容体における固有のＶ遺伝子ヌクレオチドの組み合わせを記載することが意図される。例えば、固有のＶ遺伝子－ＣＤＲ３ヌクレオチド組み合わせ。
【0124】
本明細書で使用される場合、「生産的読み取り」という用語は、終止コドンを有さず、インフレーム可変遺伝子および結合遺伝子セグメントを有する、ＴＣＲまたはＢＣＲ配列読み取りを指す。生産的読み取りは、ポリペプチドのコード化において生物学的に信頼性がある。
【0125】
本明細書で使用される場合、「キメラ」または「キメラ配列」は、ＰＣＲなどの標的増幅の際に鋳型切り換えから生じる人工配列を指す。キメラは、典型的には、無関係のＶ遺伝子に移植されたＣＤＲ３配列として存在し、データセット内の複数のＶ遺伝子に関連付けられるＣＤＲ３配列をもたらす。キメラ配列は通常、データセット内の真の配列よりもはるかに少ない存在量である。
【0126】
本明細書で使用される場合、「インデル」という用語は、核酸配列における１つ以上のヌクレオチド塩基の挿入および／または欠失を指す。核酸配列のコード領域では、インデルの長さが３の倍数でない場合、配列が翻訳されるときにフレームシフトを生じる。本明細書で使用される場合、「単純なインデルエラー」は、配列のホモポリマー崩壊提示を変更しないエラーである。本明細書で使用される場合、「複雑なインデルエラー」は、配列のホモポリマー崩壊表現を変更するインデル配列決定エラーであり、限定されないが、ホモポリマーを排除するか、ホモポリマーを配列に挿入するか、または読み取り不可型エラーを作成する、エラーが含まれる。
【0127】
本明細書で使用される場合、「シングルトン読み取り」は、インデル修正された配列がデータセットに一度だけ出現する配列読み取りを指す。通常、シングルトン読み取りは、ＰＣＲまたは配列決定のエラーを含む読み取りで増加される。
【0128】
本明細書で使用される場合、「切り詰められた読み取り」は、注釈付きのＶ遺伝子領域が欠落している免疫受容体配列読み取りを指す。例えば、切り詰められた読み取りには、限定されないが、注釈付きのＴＣＲまたはＢＣＲＶ遺伝子ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、もしくはＦＲ３領域が欠落している配列読み取りが含まれる。かかる読み取りは、一般的には、質のトリミングのためにＶ遺伝子配列の一部が欠落している。切り詰められた読み取りは、切り詰めがＶ遺伝子を誤認させる場合、人工物を生じさせ得る。
【0129】
特定されたＶ遺伝子－ＣＤＲ３配列（クロノタイプ）の文脈において、「双方向サポート」は、特定のＶ遺伝子－ＣＤＲ３配列がプラス鎖にマッピングされる少なくとも１つの読み取り（Ｖ遺伝子から定常遺伝子に向けて進む）、およびマイナス鎖にマッピングされる少なくとも１つの読み取り（定常遺伝子からＶ遺伝子に向けて進む）に認められることを示す。体系的な配列決定エラーは、しばしば一方向サポートを有するＶ遺伝子－ＣＤＲ３配列の特定をもたらす。
【0130】
ＰＣＲまたは配列決定のエラーによる変動を説明するために事前に決定した配列類似性閾値に従って群分けされている配列のセットでは、「クラスター代表」は、エラーがない可能性が最も高いとして選択される配列である。これは典型的には、通常、最も存在量の多い配列である。
【0131】
本明細書で使用される「ＩｇＢＬＡＳＴ注釈エラー」は、ＣＤＲ３の境界が誤った隣接位置にあると特定される稀な事象を指す。これらの事象は典型的には、ＣＤＲ３ヌクレオチド配列の５’または３’末端に３つの塩基を付加する。
【0132】
等しい長さの２つの配列において、「ハミング距離」は、対応する塩基またはアミノ酸が異なる位置の数である。任意の２つの配列において、「レーベンシュタイン距離」または「編集距離」は、１つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を別のヌクレオチドまたはアミノ酸配列にするために必要とされる単一の塩基またはアミノ酸編集の数である。
【0133】
Ｊ遺伝子指向プライマーが免疫受容体配列の増幅、例えば、Ｖ遺伝子ＦＲ３領域に対するプライマーおよびＪ遺伝子に対するプライマーによる多重増幅に使用されるいくつかの実施形態において、アッセイから導き出される生の配列読み取りは、任意の下流分析の前に、Ｊ遺伝子配列推測を受ける。このプロセスでは、生の読み取り配列の開始および終了が、Ｊプライマーによる増幅、および配列決定前のそれに続くアンプリコン末端の操作または処理（例えば、消化）の後に存在することが予測されるＪ遺伝子配列の一部に対応する１０～３０個のヌクレオチドの特徴的な配列の存在について調査される。特徴的なヌクレオチド配列は、Ｊプライマーの配列、ならびに各Ｊ遺伝子の配列が知られているために標的化されたＪ遺伝子の残りの部分を推測することを可能にする。Ｊ遺伝子配列推論プロセスを完了するために、推測されたＪ遺伝子配列が生の読み取りに追加され、次いで全Ｊ遺伝子にまたがる拡張した読み取りが作成される。そして拡張した読み取りは、Ｊ遺伝子配列全体、ＣＤＲ３領域の配列全体体、およびＶ遺伝子配列の少なくとも一部を含み、下流分析後に報告される。拡張した読み取りにおけるＶ遺伝子配列の部分は、多重増幅に使用されるＶ遺伝子指向プライマー、例えば、ＦＲ３、ＦＲ２、またはＦＲ１指向プライマーに依存する。
【0134】
発現された免疫受容体配列または再配列された免疫受容体ｇＤＮＡ配列を増幅するＶ遺伝子ＦＲ３プライマーおよびＪ遺伝子プライマーの使用は、ＣＤＲ３領域全体の報告を可能にするデータをさらに生成しながら、最小長のアンプリコン（例えば、長さが約６０～１００または約８０個のヌクレオチド）を生成する。短いアンプリコン長の予想により、長さが＜１００個のヌクレオチドのアンプリコンの読み取りは、配列分析ワークフローの際に低品質および／または標的外生成物として排除されない。しかしながら、生の読み取りで予想されるＪ遺伝子配列に関する明示的な探索は、Ｊ遺伝子プライマーによる標的外増幅に由来するアンプリコンを排除することを可能にする。加えて、この短いアンプリコン長は、ＦＦＰＥまたはｃｆＤＮＡ試料に由来するものなどの高度に分解された鋳型材料でのアッセイの性能を改善する。
【0135】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、免疫受容体ライブラリーを配列決定することと、得られた配列データをエラー特定および修正プロセスに供して、救済された生産的読み取りを生成することと、生産的および救済された生産的配列読み取りを特定することと、を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、免疫受容体ライブラリーを配列決定することと、得られた配列データセットをエラー特定および修正プロセスに供することと、生産的および救済された生産的配列読み取りを特定することと、配列読み取りをクロノタイプによって群分けしてライブラリーにおける免疫受容体クロノタイプを特定することと、を含む。
【0136】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、再配列された免疫受容体ＤＮＡライブラリーを配列決定し、得られた配列データをＶ遺伝子部分についてエラー特定および修正プロセスに供して、救済された生産的読み取りを作成することと、生産的、救済された生産的、および非生産的配列読み取りを特定することと、を含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、再配列された免疫受容体ＤＮＡライブラリーを配列決定し、得られた配列データセットをＶ遺伝子部分についてエラー特定および修正プロセスに供することと、生産的、救済された生産的、および非生産的配列読み取りを特定することと、配列読み取りをクロノタイプによって群分けして、ライブラリー内の免疫受容体クロノタイプを特定することと、を含む。いくつかの実施形態において、再配列された免疫受容体ＤＮＡの生産的および非生産的配列読み取りの両方が別々に報告される。
【0137】
いくつかの実施形態において、提供されるエラー特定および修正ワークフローは、非生産的再配列からとして特定される配列読み取りにつながるＰＣＲまたは配列決定に由来するエラーを特定および解決するために使用される。いくつかの実施形態において、提供されるエラー特定および修正ワークフローは、配列データを生成する際にインデルまたは他のフレームシフトを引き起こすエラーが発生する配列決定プラットフォームから生成される免疫受容体配列データに適用される。
【0138】
いくつかの実施形態において、提供されるエラー特定および修正ワークフローは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定プラットフォームによって生成される配列決定データに適用される。いくつかの実施形態において、提供されるエラー特定および修正ワークフローは、Ｒｏｃｈｅ ４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ配列決定プラットフォーム、ＰａｃＢｉｏ配列決定プラットフォーム、およびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ配列決定プラットフォームによって生成される配列データに適用される。
【0139】
いくつかの実施形態において、ＢＣＲレパートリー分析ワークフローは、試料中のクローン系統を特定する追加の最後のステップを含む。クローン系統は、共通ＶＤＪ再配列に由来するが、体細胞超変異および／またはクラススイッチ組換えで異なるＢ細胞クローンのセット（例えば、固有のＶＤＪ配列を有するとして特定される）を表す。一般に、クローン系統のメンバーは、異なるクローン系統のメンバーよりも同じ抗原を標的とする高い可能性があり得ると推測される。
【0140】
いくつかの実施形態において、クローン系統特定のプロセスは、特定された（例えば、本明細書に記載されるように）１セットのＢＣＲクローン（例えば、ＩｇＨクローン）を使用して、以下を行うことを含む。
１．クローン配列を、群メンバーが同じ可変遺伝子（対立遺伝子情報を除く）、同じＣＤＲ３ヌクレオチド長、および同じ結合遺伝子（対立遺伝子情報を除く）を共有する群に分ける。いくつかの実施形態において、上記のＪ遺伝子基準は省略され得る。
２．各群におけるクローン配列を、クローン配列のＣＤＲ３ヌクレオチド類似性に基づいてクラスターに配置する。ＣＤＲ３ヌクレオチド類似性における閾値は、約０．７０～約０．９９である。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３ヌクレオチド類似性の閾値は、約０．８０～約０．９９である。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３ヌクレオチド類似性の閾値は、約０．８０～約０．９０である。特定の実施形態において、ＣＤＲ３ヌクレオチド類似性の閾値は、約０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、または０．９９である。
ａ．いくつかの実施形態において、クラスタリングは、
ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔ－ｉ ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａ－ｏ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ＿ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｃｄｈｉｔ－Ｔ２４－ｌ９－ｄ０－Ｍ１０００００－Ｂ０－ｒ０－ｇ１－Ｓ０－ｃ．８５－ｎ５に記載されるようにｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔを使用して行われ、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、群内の各クローンのＣＤＲ３ヌクレオチド配列のセットからなる。同じクラスター内のクローンは、同じクローン系統のメンバーと考えられる。
ｂ．いくつかの事例において、体細胞超変異は、記載されるクラスタリング基準がすべてのクローン系統メンバーを群分けし得ないほど広範囲におよび得る。かかる事例では、いくつかの実施形態において、追加のステップを行って、（ａ）で特定されたクラスターにマージする。追加のステップは、クローン系統間の可変遺伝子における共有される体細胞超変異に由来する変異の事例を探索することと、次いで、共有される変異の割合および／または数が特定の閾値を超えている場合にクローン系統にマージすることと、からなる。可変遺伝子変異は、説明されているように、可変遺伝子配列をＩＭＧＴデータベース内の最も一致する可変遺伝子配列と比較することによって特定される。いくつかの実施形態において、共有される変異の数における閾値は、２以上である。いくつかの実施形態において、共有される変異の数における閾値は、３以上である。他の実施形態において、共有される変異の数における閾値は、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、共有される変異の割合は、約０．１５～約０．９５である。いくつかの実施形態において、共有される変異の割合は、約０．７５～約０．８５である。他の実施形態において、共有される変異の割合は、約０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または０．９５である。
１．クローン配列を、群メンバーが同じ可変遺伝子（対立遺伝子情報を除く）、同じＣＤＲ３ヌクレオチド長、および同じ結合遺伝子（対立遺伝子情報を除く）を共有する群に分ける。いくつかの実施形態において、上記のＪ遺伝子基準は省略され得る。
２．各群におけるクローン配列を、クローン配列のＣＤＲ３ヌクレオチド類似性に基づいてクラスターに配置する。ＣＤＲ３ヌクレオチド類似性における閾値は、約０．７０～約０．９９である。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３ヌクレオチド類似性の閾値は、約０．８０～約０．９９である。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３ヌクレオチド類似性の閾値は、約０．８０～約０．９０である。特定の実施形態において、ＣＤＲ３ヌクレオチド類似性の閾値は、約０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、または０．９９である。
ａ．いくつかの実施形態において、クラスタリングは、
ｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔ－ｉ ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａ－ｏ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ＿ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｃｄｈｉｔ－Ｔ２４－ｌ９－ｄ０－Ｍ１０００００－Ｂ０－ｒ０－ｇ１－Ｓ０－ｃ．８５－ｎ５に記載されるようにｃｄ－ｈｉｔ－ｅｓｔを使用して行われ、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、群内の各クローンのＣＤＲ３ヌクレオチド配列のセットからなる。同じクラスター内のクローンは、同じクローン系統のメンバーと考えられる。
ｂ．いくつかの事例において、体細胞超変異は、記載されるクラスタリング基準がすべてのクローン系統メンバーを群分けし得ないほど広範囲におよび得る。かかる事例では、いくつかの実施形態において、追加のステップを行って、（ａ）で特定されたクラスターにマージする。追加のステップは、クローン系統間の可変遺伝子における共有される体細胞超変異に由来する変異の事例を探索することと、次いで、共有される変異の割合および／または数が特定の閾値を超えている場合にクローン系統にマージすることと、からなる。可変遺伝子変異は、説明されているように、可変遺伝子配列をＩＭＧＴデータベース内の最も一致する可変遺伝子配列と比較することによって特定される。いくつかの実施形態において、共有される変異の数における閾値は、２以上である。いくつかの実施形態において、共有される変異の数における閾値は、３以上である。他の実施形態において、共有される変異の数における閾値は、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、共有される変異の割合は、約０．１５～約０．９５である。いくつかの実施形態において、共有される変異の割合は、約０．７５～約０．８５である。他の実施形態において、共有される変異の割合は、約０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または０．９５である。
【0141】
いくつかの事例において、ＩＭＧＴデータベースに提示されない可変遺伝子つかの対立遺伝子が特定され得る。かかる事例において、ＩＭＧＴデータベースとの整列は、体細胞超変異に由来しない不一致を示す。かかる注釈のない遺伝的変異によって引き起こされるノイズを回避するために、いくつかの実施形態において、最初のステップが（ｂ）の前に行われ、試料中のすべての推定的な新規可変遺伝子対立遺伝子を特定し、参照とは異なる各位置に注目する。いくつかの実施形態において、かかる位置は、（ｂ）に記載される分析で考慮から除外される。免疫レパートリー配列決定データからの新規対立遺伝子の特定のための方法は、例えば、Ｇａｄａｌａ－Ｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１２：Ｅ８６２－Ｅ８７０およびＰＣＴ出願公開第２０１８／１３６５６２号に記載されている。
【0142】
このクローン系統特定プロセスの最後に、各クローンがクローン系統に割り当てられている。多様性、均一性、および収斂などのＢＣＲレパートリー特性は、分析の単位としてクローン系統を用いて計算され得る。いくつかの実施形態において、系統に属するクローンの数、それらクローンのアイソタイプ、系統におけるクローンの最大および最小の頻度、系統における最大および最小の可変遺伝子体細胞超変異、および他などのクローン系統の特性が、計算されてユーザーに報告される。
【0143】
体細胞超変異が存在しない場合、ＢＣＲ収斂は、アミノ酸配列では同一または機能的に同一であるがヌクレオチド配列では異なるクローンの頻度として計算され得る。これらは、独立してＶＤＪ組換えを受け、一般的に、共通の抗原に応答して増殖してきたと想定されるクローンを表す。しかしながら、体細胞超変異は、独立してＶＤＪ組換えを受けたＢ細胞を表さない別のＶＤＪ配列を作成することができる。これを説明するために、クローン系統の特定を考慮に入れた収斂の定義が使用される。この目的のために、「ＢＣＲ収斂」は、上記で決定されたように、異なるクローン系統のメンバーであるが、アミノ酸配列が類似または同一であるＢ細胞クローンの頻度として定義される。いくつかの実施形態において、２つのＩＧＨ再配列は、それらが別個のクローン系統に割り当てられるが、同じ可変遺伝子（対立遺伝子情報を除く）および同じまたは類似のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する場合、収斂性であると考えられる。配列決定がＩＧＨ鎖の３つのＣＤＲドメインすべてを網羅する他の実施形態において、２つのＩＧＨ再配列は、それらが別々のクローン系統に割り当てられるが、同じ可変遺伝子（対立遺伝子情報を除く）ならびに同じまたは類似のＣＤＲ１、２、および３アミノ酸配列を有する場合、収斂性であると考えられ得る。いくつかの実施形態において、類似のＣＤＲアミノ酸配列は、１のハミングまたはレーベンシュタイン編集距離内にある。他の実施形態において、類似のＣＤＲアミノ酸配列は、２のハミングまたはレーベンシュタイン編集距離内にある。
【0144】
したがって、いくつかの実施形態において、機能的に同等なＢ細胞は、１もしくは２のハミングまたはレーベンシュタイン編集距離内にある同じ可変遺伝子およびＣＤＲアミノ酸配列を有するＢＣＲクローンについて探索することによって特定される。いくつかの実施形態において、プログラムｃｄ－ｈｉｔを使用して、類似しているが機能的に同等のアミノ酸配列を有するクローンを特定する。（プログラムｃｄ－ｈｉｔのコードおよび情報について、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｗｅｉｚｈｏｎｇｌｉ／ｃｄｈｉｔ／ｗｉｋｉ／３．－Ｕｓｅｒ％２７ｓ－Ｇｕｉｄｅを参照されたい）いくつかの実施形態において、ｃｄ－ｈｉｔは以下のコマンド：
ｃｄ－ｈｉｔ－ｉ ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａ－ｏ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ＿ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｃｄｈｉｔ－Ｔ２４－ｌ５－ｄ０－Ｍ１０００００－Ｂ０－ｇ１－Ｓ１－Ｕ１－ｎ５を使用して実行され、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、同じ可変遺伝子を有するクローンのＣＤＲ３アミノ酸配列のセットからなる。同じクラスター内のクローンは、機能的に同等であると考えられる。
いくつかの実施形態において、パラメータ－Ｓの値は、０、１、２、または３であり得る。いくつかの実施形態において、パラメータ－Ｕの値は、０、１、２、または３であり得る。
いくつかの実施形態において、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、同じ可変遺伝子を有するクローンのＣＤＲ１、２、および３アミノ酸配列のセットからなる。いくつかの実施形態において、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、同じ可変遺伝子および同じＣＤＲ３長の両方を有するクローンのセットからなる。
ｃｄ－ｈｉｔ－ｉ ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａ－ｏ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ＿ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｃｄｈｉｔ－Ｔ２４－ｌ５－ｄ０－Ｍ１０００００－Ｂ０－ｇ１－Ｓ１－Ｕ１－ｎ５を使用して実行され、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、同じ可変遺伝子を有するクローンのＣＤＲ３アミノ酸配列のセットからなる。同じクラスター内のクローンは、機能的に同等であると考えられる。
いくつかの実施形態において、パラメータ－Ｓの値は、０、１、２、または３であり得る。いくつかの実施形態において、パラメータ－Ｕの値は、０、１、２、または３であり得る。
いくつかの実施形態において、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、同じ可変遺伝子を有するクローンのＣＤＲ１、２、および３アミノ酸配列のセットからなる。いくつかの実施形態において、ｖｇｅｎｅ＿ｇｒｏｕｐｓ．ｆａは、同じ可変遺伝子および同じＣＤＲ３長の両方を有するクローンのセットからなる。
【0145】
いくつかの実施形態において、提供される配列分析ワークフローは、ダウンサンプリング分析を含む。免疫レパートリー配列決定およびその後の分析では、ダウンサンプリング分析の使用は、例えば、アッセイにわたる配列決定深度の差による変動を排除するのに役立ち得る。例えば、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの配列決定および分析ワークフローで使用するための例示的なダウンサンプリング分析は、データに以下の手順：ａ）生産的＋救済された生産的読み取りの全セットで開始し、配列読み取りをいくつかの固定された読み取り震度のうちの１つに無作為に下げて取り除くことと、ｂ）読み取りのこのサブセットを使用して、ダウンストリーム計算（例えば、均一性、収斂、多様性、検出されたクローンの数および同一性、ならびにクローン系統を含むがこれらに限定されない二次レパートリー特性のクロノタイピングおよび計算）を行うことと、を適用する。
【0146】
いくつかの実施形態において、ダウンサンプリング分析は、特定の試料が飽和まで配列決定される地点、例えば、追加の読み取りが追加のクローンもしくは系統を特定しないか、または検出されたレパートリーに追加の多様性を加えない地点を特定する。いくつかの実施形態において、ダウンサンプリングは、類似の試料タイプを用いたアッセイ間（３つ以上の試料タイプ）もしくはアッセイ間（２つの試料タイプ）での配列決定震度または多重化の精錬を可能にする。
【0147】
いくつかの実施形態において、提供されるアッセイ方法および組成物によって検出される可変遺伝子対立遺伝子のセットは、ヒト集団内のハプロタイプ群の新規特定のために使用され得る。特定の実施形態において、ＩｇＨ ＣＤＲ１、２、および３ヌクレオチド配列を増幅するための複数のＶ遺伝子特異的プライマーおよび少なくとも１つのＣ遺伝子特異的プライマーの使用を含む提供されるアッセイ方法および組成物を使用して、対象のＢＣＲレパートリーのＩｇＨハロタイプを特定し得る。例えば、いくつかの実施形態において、表３から選択される複数のＶ遺伝子ＦＲ１プライマーおよび表６～１０から選択される少なくとも１つのＣ遺伝子プライマーを含む少なくとも一組のプライマーを使用する提供される方法および組成物を使用して、対象のＢＣＲレパートリーのＩｇＨハプロタイプを特定し得る。ＴＣＲハプロタイプ群の特定のための方法は、２０１９年３月２２日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２３７３１号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書に提供される方法および組成物と併せて同様に使用して、ＩｇＨハプロタイプ群を特定し得る。いくつかの実施形態において、ＩｇＨ ＣＤＲ１、２、および３ヌクレオチド配列を増幅および配列決定することによって検出される可変遺伝子対立遺伝子のセットを使用して、試料を、免疫療法後の自己免疫疾患または有害事象のリスクを予測するための多くの手順のうちの一部として、いくつかの既存のハロタイプ群のうちの１つに割り当て得る。試料をハプロタイプ群に、免疫療法後の自己免疫疾患または有害事象のリスクを予測するための手順で割り当てる方法はまた、２０１９年３月２２日に出願されＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２３７３１号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれ、例えば、かかるリスクを予測するために、本明細書で提供される方法および組成物と組み合わせて使用して、試料をＩｇＨハプロタイプ群に割り当てることができる。いくつかの実施形態において、提供されるアッセイ方法および組成物を使用して得られるＩｇＨ ＣＤＲ１、２、３配列データを使用して、段階化したＩｇＨ遺伝子座ハプロタイプを推測し得る（例えば、Ｋｉｄｄ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８（３）：１３３３－１３４０）。
【0148】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、複数の免疫受容体特異的アンプリコンの調製および形成を含む。いくつかの実施形態において、方法は、複数のＶ遺伝子特異的プライマーおよび少なくとも１つのＣ遺伝子特異的プライマーをｃＤＮＡ分子にハイブリダイズさせることと、プライマー対の第１のプライマー（例えば、Ｖ遺伝子特異的プライマー）を伸長させることと、伸長した第１のプライマーをｃＤＮＡ分子から変性させることと、伸長した第１のプライマー産物に、プライマー対の第２のプライマー（例えば、Ｃ遺伝子特異的プライマー）をハイブリダイズさせて第２のプライマーを伸長させることと、標的特異的プライマー対を消化して複数の標的アンプリコンを生成することと、を含む。他の実施形態において、方法は、複数のＶ遺伝子特異的プライマーおよび複数のＪ遺伝子特異的プライマーをｃＤＮＡ分子にハイブリダイズさせることと、プライマー対の第１のプライマー（例えば、Ｖ遺伝子特異的プライマー）を伸長させることと、伸長した第１のプライマーをｃＤＮＡ分子から変性させることと、伸長した第１のプライマー産物に、プライマー対の第２のプライマー（例えば、Ｊ遺伝子特異的プライマー）をハイブリダイズさせて第２のプライマーを伸長させることと、標的特異的プライマー対を消化して複数の標的アンプリコンを生成することと、を含む。いくつかの実施形態において、アダプターは、ニックトランスレーション反応を行う前に、標的アンプリコンの末端に連結させて、核酸配列決定に好適な複数の標的アンプリコンを生成する。いくつかの実施形態において、連結されたアダプターのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのバーコード配列を含む。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンの末端に連結された各アダプターは、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的アンプリコンは、ブリッジ増幅、エマルションＰＣＲ、または等温増幅を使用して増幅させ、核酸配列決定に好適な複数のクローン鋳型を生成することができる。
【0149】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、複数の免疫受容体特異的アンプリコンの調製および形成を含む。いくつかの実施形態において、方法は、複数のＶ遺伝子特異的プライマーおよび複数のＪ遺伝子特異的プライマーをｇＤＮＡ分子にハイブリダイズさせることと、プライマー対の第１のプライマー（例えば、Ｖ遺伝子特異的プライマー）を伸長させることと、伸長した第１のプライマーをｇＤＮＡ分子から変性させることと、伸長した第１のプライマー産物に、プライマー対の第２のプライマー（例えば、Ｊ遺伝子特異的プライマー）をハイブリダイズさせて第２のプライマーを伸長させることと、標的特異的プライマー対を消化して複数の標的アンプリコンを作成することと、を含む。いくつかの実施形態において、アダプターは、ニックトランスレーション反応を行う前に、標的アンプリコンの末端に連結させて、核酸配列決定に好適な複数の標的アンプリコンを生成する。いくつかの実施形態において、連結されたアダプターのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのバーコード配列を含む。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンの末端に連結された各アダプターは、バーコード配列を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的アンプリコンは、ブリッジ増幅またはエマルションＰＣＲを使用して増幅して、核酸配列決定に好適な複数のクローン鋳型を生成することができる。
【0150】
いくつかの実施形態において、本開示は、標的アンプリコンを配列決定し、配列データを処理して、ｃＤＮＡが由来する生物学的試料で発現される生産的免疫受容体再配列を特定するための方法を提供する。他の実施形態において、本開示は、標的アンプリコンを配列決定し、配列データを処理して、生物学的試料から生産的免疫受容体遺伝子再配列ｇＤＮＡを特定するための方法を提供する。Ｊ遺伝子指向プライマーを使用して、発現される免疫受容体配列または再配列された免疫受容体ｇＤＮＡ配列を増幅する実施形態において、配列データの処理することは、本明細書に記載されるように、増幅に使用されるＪ遺伝子プライマーのヌクレオチド配列ならびに標的化されたＪ遺伝子の残りの部分を推測することを含む。いくつかの実施形態において、配列データを処理することは、提供されるエラー特定および修正ステップを行って、救済された生産的配列を生成することを含む。いくつかの実施形態において、提供されるエラー特定および修正ワークフローの使用は、免疫受容体ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ試料における配列決定読み取りの少なくとも５０％である生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせをもたらすことができる。いくつかの実施形態において、提供されるエラー特定および修正ワークフローの使用は、免疫受容体ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ試料における配列決定読み取りの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である、生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせをもたらすことができる。いくつかの実施形態において、提供されるエラー特定および修正ワークフローの使用は、免疫受容体ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ試料における配列決定読み取りの約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約５０～８０％、または約６０～９０％である生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせをもたらすことができる。いくつかの実施形態において、提供されるエラー特定および修正ワークフローの使用は、免疫受容体ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ試料における配列決定読み取りの、平均して約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％である生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせをもたらすことができる。
【0151】
特定の試料では、提供されるエラー特定および修正ワークフローの使用は、特定の試料が使用される場合、免疫受容体ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ試料における配列決定読み取りの５０％未満である生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせをもたらすことができる。かかる試料には、例えば、ＲＮＡまたはｇＤＮＡが高度に分解されている、ＦＦＰＥ試料およびｃｆＤＮＡ試料などのもの、ならびに、標的免疫細胞の数が非常に少ない、例えば、非常に少ないＢ細胞数を有する試料または重度の白血球減少症を経験している対象からの試料などのものが含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、提供されるエラー特定および修正ワークフローの使用は、免疫受容体ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ試料における配列決定読み取りの約３０～５０％、約４０～５０％、約３０～４０％、約４０～６０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％である生産的読み取りおよび救済された生産的読み取りの組み合わせをもたらすことができる。
【0152】
特定の実施形態において、本発明の方法は、プライマーが同じ標的免疫受容体遺伝子、例えば、ＢＣＲ（免疫グロブリン）およびＴＣＲ遺伝子の配列に対するものである、標的免疫受容体プライマーセットの使用を含む。いくつかの実施形態において、免疫受容体は、重鎖アルファ、重鎖デルタ、重鎖イプシロン、重鎖ガンマ、重鎖ミュー、軽鎖カッパ、および軽鎖ラムダからなる群から選択される抗体受容体である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、およびＴＣＲデルタからなる群から選択されるＴ細胞受容体である。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、標的免疫受容体プライマーセットの使用を含み、プライマーセットのうちの少なくとも１つは、ＢＣＲの配列に対するものであり、別のプライマーセットは、ＴＣＲの配列に対するものであり、試料からのＢＣＲおよびＴＣＲ標的核酸の両方が、単一の多重増幅反応で増幅される。
【0153】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの発現核酸配列の増幅のための方法が提供され、多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的定常遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、の少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、各セットを使用して増幅を行うことは、試料におけるそれぞれの免疫受容体のレパートリー全体を表すアンプリコンをもたらし、それにより、ＢＣＲのレパートリーを含む免疫受容体アンプリコンを生成する。特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約８０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約５０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。
【0154】
特定の実施形態において、試料における免疫受容体レパートリーの発現核酸配列の増幅のための方法が提供され、多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、の少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、各セットを使用して増幅を行うことは、試料におけるそれぞれの免疫受容体のレパートリー全体を表すアンプリコンをもたらし、それにより、ＢＣＲのレパートリーを含む免疫受容体アンプリコンを生成する。特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約８０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約５０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。いくつかの実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のフレームワーク領域１の少なくとも一部にアニーリングする。特定の実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＣ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、各々がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ鋳型分子のＣ遺伝子の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、別個にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ鋳型分子の各々のＣ遺伝子の一部に対する少なくとも１つのプライマーを含む。特定の実施形態において、生成されたアンプリコンの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、アンプリコンは、長さが約３００～約６００個のヌクレオチド、または長さが少なくとも約３５０～約５００個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、方法で使用される核酸鋳型は、生物学的試料から抽出された核酸分子を逆転写することによって生成されるｃＤＮＡである。
【0155】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供するための方法が提供され、多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子（複数可）の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それにより、ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。次に、得られたＢＣＲアンプリコン分子の配列決定が行われ、それによって決定されたＢＣＲアンプリコン分子の配列が、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供する。特定の実施形態において、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られたＢＣＲ分子の配列を決定することと、を含む。特定の実施形態において、生産的読み取りと救済された生産的読み取りとの組み合わせは、ＢＣＲにおける配列決定読み取りの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％である。追加の実施形態において、方法は、配列読み取りクラスタリングおよびＢＣＲクロノタイプ報告をさらに含む。いくつかの実施形態において、特定された免疫レパートリーの配列は、ＩＭＧＴデータベースの同時期または最新のバージョンと比較され、そのＩＭＧＴデータベースに存在しない少なくとも１つの対立遺伝子変異体の配列が特定される。いくつかの実施形態において、平均配列読み取り長は、読み取り長における任意のバーコード配列の包含に部分的に応じて、３００～６００個のヌクレオチドであり、または３５０～５５０個のヌクレオチドであり、または３３０から４２５個のヌクレオチドであり、または約３５０～約４２５個のヌクレオチドである。特定の実施形態において、配列決定されたアンプリコンのうちの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【0156】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを利用し、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さ約７０個のヌクレオチドのＦＲ１領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約５０個のヌクレオチドのＦＲ１領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約１８～約４５種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２２～約３５種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２５～約３５種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４０～約６５種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４８～約６０種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的免疫受容体プライマーセットは、少なくとも５～約１５種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。特定の実施形態において、標的免疫受容体プライマーセットは、少なくとも２～約８種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、異なるＩｇアイソタイプ分子、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥに対する２種類以上のＣ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、各プライマーが異なるＩｇアイソタイプ分子のＣ遺伝子に対するものである少なくとも５種類のＣ遺伝子プライマーを含む。
【0157】
特定の実施形態において、本発明の方法は、それぞれ表３および表６～１０から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＣ遺伝子プライマーｉｉ）を含むプライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。特定の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、それぞれ表３から選択される約１５～約３５種類のプライマーおよび表６～１０から選択される約５～約２０種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）表３から選択される約２２～約３５種類のプライマー、およびｉｉ）表６～１０の各々から選択される１つ以上のプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。特定の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、それぞれ表３から選択される約４０～約６５種類のプライマーおよび表６～１０から選択される約５～約２０種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）表３から選択される約４８～約６０種類のプライマー、およびｉｉ）表６～１０の各々から選択される１つ以上のプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。他の特定の実施形態において、本発明の方法は、ｉ）配列番号１３７～２８３から選択されるプライマー、およびｉｉ）配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択されるプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。他の実施形態において、提供される方法は、ｉ）配列番号２８４～４３０から選択されるプライマー、およびｉｉ）配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択されるプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ｉ）配列番号１３７～２８３から選択されるプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択されるプライマーを含むか、またはｉ）配列番号２８４～４３０から選択されるプライマーおよびｉｉ）配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択されるプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。
【0158】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される約１５～約３５種類のプライマーならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）配列番号１３７～２８３から選択される約２２～約３５種類のプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４４８～４５９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４７２～４７９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８８～５１３から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５４０～５５１から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５６４～５８２から選択される少なくとも１つのプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される約１５～約３５種類のプライマーならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）配列番号２８４～４３０から選択される約２２～約３５種類のプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４６０～４７１から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８０～４８７から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５１４～５３９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５５２～５６３から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５８３～６０１から選択される少なくとも１つのプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。
【0159】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される約４０～約６５種類のプライマーならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）配列番号１３７～２８３から選択される約４８～約６０種類のプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４４８～４５９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４７２～４７９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８８～５１３から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５４０～５５１から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５６４～５８２から選択される少なくとも１つのプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される約４０～約６５種類のプライマーならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）配列番号２８４～４３０から選択される約４８～約６０種類のプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４６０～４７１から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８０～４８７から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５１４～５３９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５５２～５６３から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５８３～６０１から選択される少なくとも１つのプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。
【0160】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲの発現核酸配列の増幅のための方法が提供され、多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、各セットを使用して増幅を行うことは、試料におけるそれぞれの免疫受容体のレパートリー全体を表すアンプリコンをもたらし、それにより、ＢＣＲレパートリーを含む免疫受容体アンプリコンを生成する。特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約８０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約５０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約４０～約６０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。いくつかの実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のフレームワーク３領域の少なくとも一部にアニーリングする。特定の実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、ＢＣＲ鋳型分子のＣ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、各々がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ鋳型分子のＣ遺伝子の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、別個にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ鋳型分子の各々のＣ遺伝子の一部に対する少なくとも１つのプライマーを含む。特定の実施形態において、生成されたアンプリコンの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、アンプリコンは、長さが約８０～約２００個のヌクレオチド、長さが約８０～約１４０個のヌクレオチド、長さが約９０～約１３０個のヌクレオチド、または長さが少なくとも約１００～約１２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、方法で使用される核酸鋳型は、生物学的試料から抽出された核酸分子を逆転写することによって生成されるｃＤＮＡである。
【0161】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供するための方法が提供され、多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子（複数可）の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それにより、ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。次に、得られるＢＣＲアンプリコン分子の配列決定が行われ、それによって決定されたＢＣＲアンプリコン分子の配列が、試料におけるＢＣＲの配列を提供する。特定の実施形態において、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られたＢＣＲ分子の配列を決定することと、を含む。特定の実施形態において、生産的読み取りと救済された生産的読み取りとの組み合わせは、ＢＣＲにおける配列決定読み取りの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％である。追加の実施形態において、方法は、配列読み取りクラスタリングおよびＢＣＲクロノタイプ報告をさらに含む。いくつかの実施形態において、特定されたＢＣＲレパートリーの配列は、ＩＭＧＴデータベースの同時期または最新のバージョンと比較され、そのＩＭＧＴデータベースに存在しない少なくとも１つの対立遺伝子変異体の配列が特定される。いくつかの実施形態において、平均配列読み取り長は、読み取り長における任意のバーコード配列の包含に部分的に応じて、８０～１８５個のヌクレオチドであり、または１１５～２００個のヌクレオチドであり、または９０～１３０個のヌクレオチドであり、または約１００～約１２０個のヌクレオチドである。特定の実施形態において、配列決定されたアンプリコンのうちの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む。
【0162】
特定の実施形態において、提供される方法は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを利用し、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さ約７０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、提供される方法は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを利用し、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さ約５０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約４０～約６０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５０～約８５種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５５～約８０種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的免疫受容体プライマーセットは、約６２～約７５種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約６５、６６、６７、６８、６９、または約７０種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的免疫受容体プライマーセットは、少なくとも５～約１５種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも２～約８種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、各々がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ鋳型分子のＣ遺伝子の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、別個にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ鋳型分子の各々のＣ遺伝子の一部に対する少なくとも１つのプライマーを含む。
【0163】
特定の実施形態において、本発明の方法は、それぞれ表２および表６～１０から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＣ遺伝子プライマーｉｉ）を含むプライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。特定の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、それぞれ表２から選択される約５５～約８０種類のプライマーおよび表６～１０から選択される約５～約２０種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、ｉ）表２から選択される約６２～約７５種類のプライマー、およびｉｉ）表６～１０の各々から選択される１つ以上のプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。他の特定の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～６８、ならびに４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択されるか、または配列番号６９～１３６、ならびに４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択されるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～６８、ならびに４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択されるか、または配列番号６９～１３６、ならびに４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択されるプライマーを含む。
【0164】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマーならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４７２～４７９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８８～５１３から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５４０～５５１から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５６４～５８２から選択される少なくとも１つのプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマーならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８０～４８７から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５１４～５３９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５５２～５６３から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５８３～６０１から選択される少なくとも１つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。
【0165】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲの発現核酸配列の増幅のための方法が提供され、多重増幅反応を行って、定常部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれのＢＣＲコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、各セットを使用して増幅を行うことは、試料におけるそれぞれの免疫受容体のレパートリー全体を表すアンプリコンをもたらし、それにより、ＢＣＲレパートリーを含むアンプリコンを生成する。特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約８０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約５０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。いくつかの実施形態において、ｉ）の１種類以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、ＢＣＲ鋳型分子のＦＲ２領域の少なくとも一部にアニーリングする。特定の実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、ＢＣＲ鋳型分子の定常部分Ｃ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、各々がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ鋳型分子のＣ遺伝子の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、別個にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ鋳型分子の各々のＣ遺伝子の一部に対する少なくとも１つのプライマーを含む。特定の実施形態において、生成されたアンプリコンの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、アンプリコンは、長さが約１８０～約３７５個のヌクレオチド、約２００～約３５０個のヌクレオチド、約２２５～約３２５個のヌクレオチド、または長さが約２５０～約３００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、方法で使用される核酸鋳型は、生物学的試料から抽出された核酸分子を逆転写することによって生成されるｃＤＮＡである。
【0166】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供するための方法が提供され、多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それにより、ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。次に、得られるＢＣＲアンプリコン分子の配列決定が行われ、それによって決定されたＢＣＲアンプリコン分子の配列が、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供する。特定の実施形態において、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られたＢＣＲ分子の配列を決定することと、を含む。特定の実施形態において、生産的読み取りと救済された生産的読み取りとの組み合わせは、ＢＣＲにおける配列決定読み取りの少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％である。追加の実施形態において、方法は、配列読み取りクラスタリングおよびＢＣＲクロノタイプ報告をさらに含む。いくつかの実施形態において、特定された免疫レパートリーの配列は、ＩＭＧＴデータベースの同時期または最新のバージョンと比較され、そのＩＭＧＴデータベースに存在しない少なくとも１つの対立遺伝子変異体の配列が特定される。いくつかの実施形態において、平均配列読み取り長は、読み取り長における任意のバーコード配列の包含に部分的に応じて、約２００～約３７５個のヌクレオチド、約２５０～約３５０個のヌクレオチド、または約２７５～約３５０個のヌクレオチドである。特定の実施形態において、配列決定されたアンプリコンの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0167】
特定の実施形態において、提供される方法は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを利用し、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さ約７０個のヌクレオチドのＦＲ２領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約５０個のヌクレオチドのＦＲ２領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４～約２０種類の異なるＦＲ２指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５～約１５種類の異なるＦＲ２指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種類の異なるＦＲ２指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的免疫受容体プライマーセットは、少なくとも５～約１５種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも２～約８種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、各々がＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ鋳型分子のＣ遺伝子の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の１つ以上のＣ遺伝子プライマーは、別個にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ鋳型分子の各々のＣ遺伝子の一部に対する少なくとも１つのプライマーを含む。
【0168】
特定の実施形態において、本発明の方法は、それぞれ表４および表６～１０から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＣ遺伝子プライマーｉｉ）を含むプライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。特定の他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号４３１～４３７、ならびに４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択されるプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、配列番号４３１～４３７、ならびに４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択されるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号４３１～４３７から選択される少なくとも５種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号４３１～４３７から選択される少なくとも５種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４７２～４７９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８８～５１３から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５４０～５５１から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５６４～５８２から選択される少なくとも１つのプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号４３１～４３７から選択される少なくとも５種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号４３１～４３７から選択される少なくとも５種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８０～４８７から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５１４～５３９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５５２～５６３から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５８３～６０１から選択される少なくとも１つのプライマーを含む。
【0169】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの発現核酸配列の増幅のための方法が提供され、多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域の少なくとも一部を含むＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的免疫受容体コード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、各セットを使用して増幅を行うことは、試料におけるそれぞれの免疫受容体のレパートリー全体を表すアンプリコンをもたらし、それにより、ＢＣＲのレパートリーを含むアンプリコンを生成する。特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約８０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約５０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、ｉｉ）の１つ以上の複数のＪ遺伝子プライマーは、Ｊ遺伝子の約５０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉｉ）の１つ以上の複数のＪ遺伝子プライマーは、Ｊ遺伝子の約３０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、ｉｉ）の１つ以上の複数のＪ遺伝子プライマーは、完全にＪ遺伝子内の配列に対するものである。
【0170】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの発現核酸配列の増幅のための方法が提供され、多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、各セットを使用して増幅を行うことは、試料におけるそれぞれの免疫受容体のレパートリー全体を表すアンプリコンをもたらし、それにより、ＢＣＲのレパートリーを含むＢＣＲアンプリコンを生成する。特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約８０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約５０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約４０～約６０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。いくつかの実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のフレームワーク３領域の少なくとも一部にアニーリングする。特定の実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２～約８種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする約４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする約３～約６種類のプライマーを含む。特定の実施形態において、生成されたアンプリコンの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、アンプリコンは、長さが約６０～約１６０個のヌクレオチド、長さが約７０～約１００個のヌクレオチド、長さが約１００～約１２０個のヌクレオチド、長さが少なくとも約７０～約９０個のヌクレオチド、長さが約８０～約９０個のヌクレオチド、または長さ約８０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、方法で使用される核酸鋳型は、生物学的試料から抽出された核酸分子を逆転写することによって生成されるｃＤＮＡである。
【0171】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供するための方法が提供され、多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的免疫受容体コード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それにより、ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。次に、得られるＢＣＲアンプリコン分子の配列決定が行われ、それによって決定された免疫受容体アンプリコン分子の配列が、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供する。いくつかの実施形態において、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られた免疫受容体分子の配列を決定することと、を含む。特定の実施形態において、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、推測されるＪ遺伝子配列を配列読み取りに加えて伸長した配列読み取りを作成することと、伸長した配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られたＢＣＲ分子の配列を決定することと、を含む。特定の実施形態において、生産的読み取りと救済された生産的読み取りとの組み合わせは、ＢＣＲにおける配列決定読み取りの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％である。追加の実施形態において、方法は、配列読み取りクラスタリングおよびＢＣＲクロノタイプ報告をさらに含む。いくつかの実施形態において、特定されたＢＣＲレパートリーの配列は、ＩＭＧＴデータベースの同時期または最新のバージョンと比較され、そのＩＭＧＴデータベースに存在しない少なくとも１つの対立遺伝子変異体の配列が特定される。いくつかの実施形態において、配列読み取り長は、読み取り長における任意のバーコード配列の包含に部分的に応じて、約６０～約１８５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、平均配列読み取り長は、９０～１２０個のヌクレオチドであり、７０～９０個のヌクレオチドであるか、または約７５～約８５個のヌクレオチドであるか、または約８０個のヌクレオチドである。特定の実施形態において、配列決定されたアンプリコンのうちの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ３を含む。
【0172】
特定の実施形態において、提供される方法は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを利用し、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さ約５０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約７０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約４０～約６０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５０～約８５種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５５～約８０種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的免疫受容体プライマーセットは、約６２～約７５種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約６５、６６、６７、６８、６９、または約７０種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、複数のＪ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも２つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、２～約８つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約３～約６つの異なるＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２、３、４、５、６、７、または８つの異なるＪ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的免疫受容体プライマーセットは、約４種類のＪ遺伝子プライマーを含み、各々が標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。
【0173】
特定の実施形態において、本発明の方法は、それぞれ表２および５から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＪ遺伝子プライマーｉｉ）を含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。特定の他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～６８および４３８～４４２から選択されるか、または配列番号６９～１３６および４４３～４４７から選択されるプライマーを含む。特定の他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～６８および４４３～４４７から選択されるか、または配列番号６９～１３６および４３８～４４２から選択されるプライマーを含む。
【0174】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。
【0175】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの発現核酸配列の増幅のための方法が提供され、多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的免疫受容体コード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、各セットを使用して増幅を行うことは、試料におけるそれぞれの免疫受容体のレパートリー全体を表すアンプリコンをもたらし、それにより、ＢＣＲのレパートリーを含むＢＣＲアンプリコンを生成する。特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約８０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約５０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。いくつかの実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のフレームワーク１領域の少なくとも一部にアニーリングする。特定の実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２～約８種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする約４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする約３～約６種類のプライマーを含む。特定の実施形態において、生成されたアンプリコンの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、アンプリコンは、長さが約２２０～約３５０個のヌクレオチド、約２２５～約３００個のヌクレオチド、約２５０～約３２５個のヌクレオチド、約２５０～約２７０個のヌクレオチド、または長さが約２７０～約３００個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、方法で使用される核酸鋳型は、生物学的試料から抽出された核酸分子を逆転写することによって生成されるｃＤＮＡである。
【0176】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供するための方法が提供され、多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的免疫受容体コード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、を含むプライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それにより、ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。次に、得られた免疫受容体アンプリコン分子の配列決定が行われ、それによって決定されたＢＣＲアンプリコン分子の配列が、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供する。いくつかの実施形態において、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られた免疫受容体分子の配列を決定することと、を含む。特定の実施形態において、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、推測されるＪ遺伝子配列を配列読み取りに加えて伸長した配列読み取りを作成することと、伸長した配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られたＢＣＲ分子の配列を決定することと、を含む。特定の実施形態において、生産的読み取りと救済された生産的読み取りとの組み合わせは、免疫受容体における配列決定読み取りの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％である。追加の実施形態において、方法は、配列読み取りクラスタリングおよびＢＣＲクロノタイプ報告をさらに含む。いくつかの実施形態において、特定された免疫レパートリーの配列は、ＩＭＧＴデータベースの同時期または最新のバージョンと比較され、そのＩＭＧＴデータベースに存在しない少なくとも１つの対立遺伝子変異体の配列が特定される。いくつかの実施形態において、平均配列読み取り長は、任意のバーコード配列の包含に部分的に応じて、２００～３５０個のヌクレオチド、２２５～３２５個のヌクレオチド、２５０～３００個のヌクレオチド、２７０～３００個のヌクレオチドであり、または約２９５～約３２５個のヌクレオチドである。特定の実施形態において、配列決定されたアンプリコンの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【0177】
特定の実施形態において、提供される方法は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを利用し、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さ約７０個のヌクレオチドのＦＲ１領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約８０個のヌクレオチドのＦＲ１領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約５０個のヌクレオチドのＦＲ１領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約１８～約４５種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２２～約３５種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２５～約３５種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４０～約６５種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４８～約６０種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、複数のＪ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも２つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、２～約８つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約３～約６つの異なるＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２、３、４、５、６、７、または８つの異なるＪ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的免疫受容体プライマーセットは、約４種類のＪ遺伝子プライマーを含み、各々が標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。
【0178】
特定の実施形態において、本発明の方法は、それぞれ表３および５から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＪ遺伝子プライマーｉｉ）を含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。特定の他の実施形態において、本発明の方法は、配列番号１３７～２８３および４３８～４４２から選択されるか、または配列番号２８４～４３０および４４３～４４７から選択されるプライマーを含む、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３および４４３～４４７から選択されるか、または配列番号２８４～４３０および４３８～４４２から選択されるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも２０、または少なくとも２５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される約１５～３５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される約２２～３５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも２０、または少なくとも２５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される約１５～３５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される約２２～３５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも２０、または少なくとも２５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも２０、または少なくとも２５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。
【0179】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも４０、または少なくとも５０種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される約４０～６５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される約４８～６０種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも４０、または少なくとも５０種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される約４０～６５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される約４８～６０種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも４０、または少なくとも５０種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも４０、または少なくとも５０種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。
【0180】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの発現核酸配列の増幅のための方法が提供され、多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的免疫受容体コード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、各セットを使用して増幅を行うことは、試料におけるそれぞれの免疫受容体のレパートリー全体を表すアンプリコンをもたらし、それにより、ＢＣＲのレパートリーを含むアンプリコンを生成する。特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約８０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。より特定の実施形態において、ｉ）の１つ以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、フレームワーク領域の約５０個のヌクレオチド部分にわたる配列に対するものである。いくつかの実施形態において、ｉ）の１種類以上の複数のＶ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＦＲ２領域の少なくとも一部にアニーリングする。特定の実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも１０種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする約１４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする少なくとも２～約８種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする約４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉ）の複数のＪ遺伝子プライマーは、鋳型分子のＪ遺伝子部分の少なくとも一部にアニーリングする約３～約６種類のプライマーを含む。特定の実施形態において、生成されたアンプリコンの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ遺伝子配列の相補性決定領域ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、アンプリコンは、長さが約１６０～約２７０個のヌクレオチド、約１８０～約２５０個のヌクレオチド、または約１９５～約２２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、方法で使用される核酸鋳型は、生物学的試料から抽出された核酸分子を逆転写することによって生成されるｃＤＮＡである。
【0181】
特定の実施形態において、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供するための方法が提供され、多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的免疫受容体コード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それにより、ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。次に、得られた免疫受容体アンプリコン分子の配列決定が行われ、それによって決定されたＢＣＲアンプリコン分子の配列が、試料におけるＢＣＲレパートリーの配列を提供する。いくつかの実施形態において、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られた免疫受容体分子の配列を決定することと、を含む。特定の実施形態において、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、推測されるＪ遺伝子配列を配列読み取りに加えて伸長した配列読み取りを作成することと、伸長した配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られたＢＣＲ分子の配列を決定することと、を含む。特定の実施形態において、生産的読み取りと救済された生産的読み取りとの組み合わせは、ＢＣＲにおける配列決定読み取りの少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％である。追加の実施形態において、方法は、配列読み取りクラスタリングおよびＢＣＲクロノタイプ報告をさらに含む。いくつかの実施形態において、特定された免疫レパートリーの配列は、ＩＭＧＴデータベースの同時期または最新のバージョンと比較され、そのＩＭＧＴデータベースに存在しない少なくとも１つの対立遺伝子変異体の配列が特定される。いくつかの実施形態において、平均配列読み取り長は、任意のバーコード配列の包含に部分的に応じて、１６０～３００個のヌクレオチド、１８０～２８０個のヌクレオチド、２００～２６０個のヌクレオチド、または約２２５～約２７０個のヌクレオチドである。特定の実施形態において、配列決定されたアンプリコンの少なくとも１つのセットは、ＢＣＲ発現配列の相補性決定領域ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【0182】
特定の実施形態において、提供される方法は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを利用し、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さ約７０個のヌクレオチドのＦＲ２領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約５０個のヌクレオチドのＦＲ２領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４～約２０種類の異なるＦＲ２指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５～約１５種類の異なるＦＲ２指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種類の異なるＦＲ２指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、複数のＪ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも２つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、２～約８つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約３～約６つの異なるＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２、３、４、５、６、７、または８つの異なるＪ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的免疫受容体プライマーセットは、約４種類のＪ遺伝子プライマーを含み、各々が標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。
【0183】
特定の実施形態において、本発明の方法は、それぞれ表４および５から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＪ遺伝子プライマーｉｉ）を含む、プライマーの少なくとも１つのセットの使用を含む。特定の他の実施形態において、本発明の方法は、配列番号４３１～４３７および４３８～４４２から選択されるか、または配列番号４３１～４３７および４４３～４４７から選択されるプライマーを含む、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号４３１～４３７から選択される少なくとも５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の方法は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットの使用を含み、配列番号４３１～４３７から選択される少なくとも５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。
【0184】
特定の実施形態において、本発明の方法は、造血細胞、リンパ球、および腫瘍細胞からなる群から選択される生物学的試料の使用を含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、循環腫瘍細胞、および腫瘍浸潤リンパ球（本明細書では「ＴＩＬ」（複数）または「ＴＩＬ」）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、エクスビボでの活性化および／または増殖を受けているＢ細胞を含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、例えば、血液または血漿中に認められるようなｃｆＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、組織（例えば、リンパ節、器官組織、骨髄）、全血、滑液、脳脊髄液、腫瘍生検、および細胞を含む他の臨床標本からなる群から選択される。
【0185】
いくつかの実施形態において、生物学的試料からの発現された免疫受容体ＲＮＡおよび再配列された免疫受容体ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の両方を評価することによって生物学的試料の免疫レパートリーを決定するための方法、組成物、およびシステムが提供される。いくつかの実施形態において、試料ＲＮＡおよびｇＤＮＡは、同時に評価され得、ＲＮＡの逆転写によってｃＤＮＡを形成し、ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡは、同じ多重増幅反応で増幅され得る。いくつかの実施形態において、試料ＲＮＡからのｃＤＮＡおよび試料ｇＤＮＡは、別の反応で多重増幅を受け得る。いくつかの実施形態において、試料ＲＮＡからのｃＤＮＡおよび試料ｇＤＮＡは、並列プライマープールを用いて多重増幅を受け得る。いくつかの実施形態において、同じＢＣＲ指向プライマープールを使用して、試料からのｇＤＮＡおよびＲＮＡのＢＣＲレパートリーを評価する。いくつかの実施形態において、異なる免疫受容体指向プライマープールを使用して、試料からのｇＤＮＡおよびＲＮＡの免疫レパートリーを評価する。いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、試料ＲＮＡからのｃＤＮＡおよび試料ｇＤＮＡを用いて別々に行われ、試料からの同じかまたは異なる標的免疫受容体分子を増幅させ、得られた免疫受容体アンプリコンを配列決定し、それによって生物学的試料の発現された免疫受容体ＲＮＡおよび再配列された免疫受容体ｇＤＮＡの配列を提供する。
【0186】
いくつかの実施形態において、異なる免疫受容体指向プライマープールを使用して、試料からのｇＤＮＡおよび／またはＲＮＡの免疫レパートリーを評価する。いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、本明細書に提供されるＩｇＨプライマーのセット、ならびに、例えば、参照により各々の全体が本明細書に組み込まれる２０１８年１月１７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１４１１１号、および２０１８年８月３１日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４９２５９号に記載されるようなＴＣＲベータ指向プライマーのセット、またはＯｎｃｏｍｉｎｅ（商標）ＴＣＲベータ－ＳＲアッセイＤＮＡ、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ（商標）ＴＣＲベータ－ＳＲアッセイＲＮＡ、およびＯｎｃｏｍｉｎｅ（商標）ＴＣＲベータ－ＬＲアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）として市販されているＴＣＲベータ指向プライマーのセットを用いて行われる。単一の多重増幅反応を使用して試料からＢＣＲ（例えば、ＩｇＨ）およびＴＣＲ（例えば、ＴＣＲベータ）の両方のレパートリーを評価する能力は、時間および限られた生物学的試料を節約するのに有用であり、本明細書に記載の方法の多くに適用でき、アレルギーおよび自己免疫、ワクチン開発および使用、ならびに免疫腫瘍学に関連する方法が含まれる。例えば、Ｂ細胞レパートリー分析をＴ細胞レパートリー分析と組み合わせて使用して、免疫療法への応答を潜在的に示す、チェックポイント遮断またはチェックポイント阻害剤免疫療法などの免疫療法の投与後の免疫レパートリーにおける変化の検出を改善し得る。また、Ｂ細胞レパートリー分析をＴ細胞レパートリー分析と組み合わせて使用して、ワクチン有効性の評価を改善し得る。免疫療法に応答するか、またはワクチン投与に応答する例示的な免疫レパートリーの変化には、限定されないが、治療前の均一値と比較した、治療後（例えば、限定されないが、治療後７～１４日）のＴ細胞およびＢ細胞の均一性における減少、ならびに治療前の値と比較した、治療（複数可）後のＩｇＧ１発現Ｂ細胞の提示における増加が含まれる。
【0187】
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、対象の免疫レパートリーを特定および／または特徴付ける。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、対象の免疫レパートリーの新規または非標準的なＢＣＲ対立遺伝子を特定および特徴付ける。いくつかの実施形態において、特定された免疫レパートリーの配列は、ＩＭＧＴデータベースの同時期または最新のバージョンと比較され、そのＩＭＧＴデータベースに存在しない少なくとも１つの対立遺伝子変異体の配列が特定される。いくつかの実施形態において、ＩＭＧＴデータベースに存在しない特定された対立遺伝子変異体は、例えば、クローン番号サポート、配列読み取りサポート、および／または対立遺伝子変異体を有する個体数などの基準を使用するエビデンスベースの選別に供される。ＩＭＧＴに存在しないとして特定および報告された対立遺伝子変異体は、ＮＣＢＩ ＮＲデータベースおよびＬｙｍ１Ｋデータベースなどの免疫レパートリー配列情報を含む他のデータベースと比較して、報告された新規または非標準のＢＣＲ対立遺伝子を相互検証し得る。報告されていないか、または非標準的なＩｇＨ多型の存在を特徴付けることは、例えば、自己免疫疾患、感染症、および免疫療法に対する応答に影響を与える要因を理解することに役立ち得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように特定された新規または非標準的なＢＣＲ対立遺伝子の配列を使用して、組換えＢＣＲ核酸または分子を生成し得る。したがって、他の実施形態において、特定された新規ＩｇＨ対立遺伝子変異体をコードする組換え核酸を作製するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、組換えＩｇＨ対立遺伝子変異体分子を作製するため、かつそれを発現する組換え細胞を作製するための方法が提供される。
【0188】
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、対象の免疫レパートリーの新規または非標準的なＢＣＲ対立遺伝子を特定および特徴付ける。いくつかの実施形態において、患者の免疫レパートリーは、療法処置、例えば、がんもしくは免疫障害の治療の前および／または後に特定あるいは特徴付けられ得る。いくつかの実施形態において、免疫レパートリーの特定または特徴付けを使用して、治療の効果もしくは効能を評価して、治療レジメンを変更し、かつ／または治療薬の選択を最適化し得る。いくつかの実施形態において、免疫レパートリーの特定または特徴付けを使用して、免疫療法、がんワクチン、および／または他の免疫ベースの治療もしくはそれらの組み合わせ（複数可）に対する患者の応答を評価し得る。いくつかの実施形態において、免疫レパートリーの特定または特徴付けは、治療薬に応答する患者の可能性を示し得るか、または治療薬に応答しない患者の可能性を示し得る。
【0189】
いくつかの実施形態において、患者のＢＣＲレパートリーを特定または特徴付けして、患者の治療後の残存疾患の検出を含む過剰増殖性疾患の進行および／または治療を監視し、自己免疫疾患の進行および／または治療を監視し、移植を監視し、かつワクチン接種後、細菌、真菌、寄生虫、もしくはウイルスの抗原への曝露、または細菌、真菌、寄生虫、もしくはウイルスによる感染を含む、抗原刺激の状態を監視し得る。いくつかの実施形態において、ＢＣＲレパートリーの特定または特徴付けを使用して、抗感染療法または抗炎症療法に対する患者の応答を評価し得る。
【0190】
いくつかの実施形態において、対象からの試料における免疫レパートリークローン集団を特定および／または特徴付けるための方法および組成物が提供され、試料または試料から調製されたｃＤＮＡを用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有する免疫レパートリー核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）免疫レパートリーコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それにより、ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法はさらに、得られたＢＣＲアンプリコン分子を配列決定することと、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することと、試料からの標的ＢＣＲについて１つ以上の免疫レパートリークローン集団を特定することと、を含む。特に、免疫レパートリーアンプリコン分子の配列を決定する実施形態は、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られた免疫受容体分子の配列を決定することと、を含む。かかる方法および組成物の他の実施形態において、１つ以上の多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。かかる方法および組成物の他の実施形態において、１つ以上の多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子（複数可）の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。
【0191】
いくつかの実施形態において、対象からの試料における免疫レパートリークローン集団を特定および／または特徴付けるための方法および組成物が提供され、試料または試料から調製されたｃＤＮＡを用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有する免疫レパートリー核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれのＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それにより、ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法はさらに、得られたＢＣＲアンプリコン分子を配列決定することと、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することと、試料からの標的ＢＣＲについて１つ以上の免疫レパートリークローン集団を特定することと、を含む。特定の実施形態において、免疫受容体アンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、推測されるＪ遺伝子配列を配列読み取りに加えて伸長した配列読み取りを作成することと、伸長した配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られた免疫受容体分子の配列を決定することと、を含む。かかる方法および組成物の他の実施形態において、多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。かかる方法および組成物の他の実施形態において、多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域２（ＦＲ２）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。
【0192】
したがって、いくつかの実施形態において、提供される方法、組成物、およびワークフローは、限定されないが、Ｂ細胞集団のクローン性、多様性、および豊富さを評価する際に使用するためのものである。例えば、クローン増殖は、抗原負荷に応答しているＢ細胞を特定し得、縦断的分析を使用して、ワクチン接種の有効性を評価し得る。いくつかの実施形態において、提供される方法、組成物、およびワークフローは、多くのメンバーを有するクローン系統を特定する際に使用するためのものである。例えば、多くのメンバーを有するクローン系統は、長期的な抗原刺激に応答しているＢ細胞を表し得る。いくつかの実施形態において、提供される方法、組成物、およびワークフローは、抗原特異的Ｂ細胞を特定する際に使用するためのものである。例えば、同じ抗原に曝露されている個人の群にわたってＩｇＨレパートリーを比較することによって、抗原特異的ＩｇＨ鎖を示す共有ＩｇＨアミノ酸モチーフが明らかにされ得る。いくつかの実施形態において、提供される方法、組成物、およびワークフローは、クローンの重複を評価する際に使用するためのものである。例えば、クローン重複分析は、Ｂ細胞往来およびＢ細胞の集団間の発達上の関係を明らかにし得る。いくつかの実施形態において、提供される方法、組成物、およびワークフローは、縦断的分析に含まれる、優性クローンのＶＤＪ配列を決定する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態において、提供される方法、組成物、およびワークフローは、クローン系統分析を介して悪性サブクローンを特定する際に使用するためのものである。例えば、いくつかのＢ細胞悪性腫瘍（例えば、濾胞性リンパ腫）では、体細胞超変異が進行しており、提供される方法、組成、およびワークフローで追跡し得る、異なるが関連するＩｇＨ配列を有する悪性サブクローンの存在をもたらす。
【0193】
いくつかの実施形態において、提供される方法、組成物、およびワークフローは、クローンの進化を評価する際に使用するためのものである。例えば、クローン系統の分析は、抗原結合のために重要なアイソタイプスイッチおよびＩｇＨ残基を明らかにし得る。いくつかの実施形態において、提供される方法、組成物、およびワークフローは、アイソタイプ存在量を評価する際に使用するためのものである。例えば、特定のアイソタイプの過大または過小な表現は、限定されないが、ウイルス感染に応答したＩｇＧ１の上昇、アレルギーにおけるＩｇＥの上昇などの疾患または免疫不全を示し得、欠落または過小表現されるアイソタイプは、原発性免疫不全を示し得る。いくつかの実施形態において、提供される方法、構成、およびワークフローは、体細胞超変異を定量化する際に使用するためのものである。例えば、体細胞超変異の頻度は、悪性形質転換が生じたＢ細胞発達の段階への洞察を提供する。
【0194】
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、ＢＣＲレパートリーまたはクローン集団内の体細胞超変異（ＳＨＭ）を特定および／または特徴付けする。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、稀なＢＣＲクローンまたはサブクローン、例えば、体細胞的に超変異したＶＤＪ再配列を有するものを、特定および／またはスクリーニングする。いくつかの実施形態において、稀なＢＣＲクローンの特定、定量化、および／または特徴付けは、所与の状態または治療応答におけるバイオマーカーを提供し得る。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法および組成物を使用して、例えば遡及的または縦断的な対象試験から得られる試料を使用して、ＢＣＲクローンをバイオマーカーとして特定、スクリーニング、および／または特徴付ける。
【0195】
いくつかの実施形態において、ＢＣＲクローン系統およびＳＨＭを特定および／または特徴付けるための方法は、対象の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子うちの大多数に対するプライマー、およびＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、本明細書に提供されるＶＤＪ配列分析を行って、試料からの標的ＢＣＲにおけるＳＭＨおよびクローン系統を特定および／または定量化することと、を含む。他の実施形態において、ＢＣＲクローン系統およびＳＨＭを特定および／または特徴付けるための方法は、対象の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子うちの大多数に対するプライマー、およびそれぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、本明細書に提供されるＶＤＪ配列分析を行って、試料からの標的ＢＣＲにおけるＳＨＭおよびクローン系統を特定することと、を含む。
【0196】
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、ＢＣＲレパートリーまたはＢ細胞クローン系統内のアイソタイプ（またはサブアイソタイプ）クラスまたはアイソタイプクラススイッチを特定、定量化、特徴付け、および／または監視するために使用される。いくつかの実施形態において、かかる方法は、対象の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＩｇＨ核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子うちの大多数に対するプライマー、およびＩｇＨコード配列のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたアンプリコンを配列決定することと、本明細書に提供される配列分析を行って、試料のＢＣＲレパートリーまたはクローン系統のＩｇＨアイソタイプクラス（複数可）を特定することと、を含む。いくつかの実施形態において、プライマーセットは、単一のアイソタイプ、例えば、ＩｇＥ、のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のプライマーを含む。他の実施形態において、プライマーセットは、各々が２つの異なるアイソタイプのＣ遺伝子の少なくとも一部に対する少なくとも２つのプライマーを含む。他の実施形態において、プライマーセットは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥアイソタイプクラスのＣ遺伝子の少なくとも一部に別々に対する少なくとも１つのプライマーを含む。
【0197】
特定の実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、ＢＣＲレパートリークローン集団およびクローン系統の変化、例えば、クローン拡張における変化、クローン縮小における変化、ＢＣＲレパートリー内のクローンまたはクローン集団の相対的比率の変化、クローン系統の拡張または縮小における変化、体細胞超変異における変化、および／またはレパートリー内のアイソタイプクラススイッチを監視する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、腫瘍増殖に応答するＢＣＲレパートリークローン集団またはクローン系統における変化（例えば、クローン集団または系統の拡張、クローン集団または系統の縮小、相対的比率におけるクローン集団または系統の変化、体細胞超変異および／またはクラススイッチにおける変化）を監視する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、腫瘍治療に応答するＢＣＲレパートリークローン集団またはクローン系統の変化（例えば、クローン集団または系統の拡張、クローン集団または系統の縮小、相対的比率におけるクローン集団または系統の変化、体細胞超変異おける変化および／またはクラススイッチ）を監視する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、寛解期間中にＢＣＲレパートリークローン集団またはクローン系統の変化（例えば、クローン集団または系統の拡張、クローン集団または系統の縮小、相対的比率におけるクローン集団または系統変化、体細胞超変異おける変化および／またはクラススイッチ）を監視する。多くのリンパ性悪性腫瘍では、クローンＢ細胞受容体配列は、特定のがん（例えば、白血病）の悪性細胞におけるバイオマーカーとして使用することができ、残存疾患、腫瘍拡張、縮小、および／または治療応答を監視することができる。特定の実施形態において、クローンＢ細胞受容体は、治療、バイオマーカー、および／または診断の使用における新規有用性を確認するために特定され、さらに特徴付けられ得る。
【0198】
いくつかの実施形態において、対象におけるＢＣＲクローン集団の変化を監視するための方法および組成物が提供され、対象の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、試料からの標的ＢＣＲにおける免疫レパートリークローン集団を特定することと、特定されたＢＣＲレパートリークローン集団を、異なる時期に対象から得られた試料で特定されるものと比較することと、を含む。いくつかの実施形態において、対象におけるＢＣＲクローン集団の変化を監視するための方法および組成物が提供され、対象の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有する免疫レパートリー核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびそれぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、試料からの標的ＢＣＲにおける免疫レパートリークローン集団を特定することと、特定されたＢＣＲレパートリークローン集団を、異なる時期に対象から得られた試料で特定されるものと比較することと、を含む。様々な実施形態において、かかる方法で実施される１つ以上の多重増幅反応は、単一の多重増幅反応であり得るか、または並行して行われる２つ以上の多重増幅反応、例えば、異なるプライマープールを用いて行われる並行した高度に多重化された増幅反応であり得る。ＢＣＲレパートリークローン集団における変化を監視する際に使用する試料には、限定されないが、診断前に得られる試料、診断の任意の段階で得られる試料、寛解中に得られる試料、治療前の任意の時期に得られる試料（治療前試料）、治療の完了後の任意の時期に得られる試料（治療後試料）、および治療の経過期間中に得られる試料が含まれる。
【0199】
特定の実施形態において、患者のＢＣＲレパートリーを特定および／または特徴付けして、患者の過剰増殖性疾患の進行および／または治療を監視する方法および組成物が提供される。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、治療後の患者の微小残存病変（ＭＲＤ）モニタリングのために使用される。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、ＭＲＤ測定および稀なＢＣＲクローンを特定することのために有用な患者のＢＣＲレパートリーのディープシークエンシングを可能にする。いくつかの実施形態において、ＭＲＤのモニタリングすることは、ＢＣＲレパートリーの体細胞超変異を評価することを含む。いくつかの実施形態において、方法および組成物を使用して、Ｂ細胞系統悪性腫瘍またはＴ細胞系統の悪性腫瘍を特定および／または追跡する。いくつかの実施形態において、方法および組成物を使用して、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫を含む、白血病またはリンパ腫を有すると診断された患者におけるＭＲＤを検出および／または監視する。いくつかの実施形態において、方法および組成物を使用して、限定されないが、乳がん、肺がん、結腸直腸、および神経芽細胞腫を含む、固形腫瘍を有すると診断された患者におけるＭＲＤを検出および／または監視する。いくつかの実施形態において、方法および組成物を使用して、これらに限定されないが、骨髄移植、リンパ球注入、養子Ｔ細胞療法、他の細胞ベースの免疫療法、および抗体ベースの免疫療法を含む、がん治療後に、患者におけるＭＲＤを検出および／または監視する。
【0200】
いくつかの実施形態において、患者のＢＣＲレパートリーを特定および／または特徴付けて患者の過剰増殖性疾患の予後および／または治療を監視するための方法および組成物が提供され、患者からの試料または試料から調製されたｃＤＮＡを用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それによってＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法は、得られたＢＣＲアンプリコン分子を配列決定することと、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することと、試料からの標的ＢＣＲについて免疫レパートリーを特定することと、をさらに含む。特に、免疫レパートリーアンプリコン分子の配列を決定する実施形態は、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られた免疫受容体分子の配列を決定することと、を含む。かかる方法および組成物の他の実施形態において、多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。かかる方法および組成物の他の実施形態において、多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。
【0201】
いくつかの実施形態において、患者のＢＣＲレパートリーを特定および／または特徴付けて患者の過剰増殖性疾患の予後および／または治療を監視するための方法および組成物が提供され、患者からの試料または試料から調製されたｃＤＮＡを用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有する免疫レパートリー核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大部分に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それによってＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法は、得られたＢＣＲアンプリコン分子を配列決定することと、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することと、試料からの標的ＢＣＲについて免疫レパートリーを特定することと、をさらに含む。特定の実施形態において、免疫受容体アンプリコン分子の配列を決定することは、初期配列読み取りを得ることと、推測されるＪ遺伝子配列を配列読み取りに加えて伸長した配列読み取りを作成することと、伸長した配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られた免疫受容体分子の配列を決定することと、を含む。かかる方法および組成物の他の実施形態において、多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ１の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。かかる方法および組成物の他の実施形態において、多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。
【0202】
いくつかの実施形態において、過剰増殖性疾患を有する患者におけるＭＲＤモニタリングのための方法および組成物が提供され、患者の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、標的ＢＣＲにおける免疫レパートリー配列を特定することと、過剰増殖性疾患に関連する試料におけるＢＣＲ配列（複数可）の存在または不存在を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、過剰増殖性疾患を有する患者におけるＭＲＤモニタリングのための方法および組成物が提供され、患者の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有する免疫レパートリー核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびそれぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、標的ＢＣＲにおける免疫レパートリー配列を特定することと、過剰増殖性疾患に関連する試料における免疫受容体配列（複数可）の存在または不存在を検出することと、を含む。様々な実施形態において、かかる方法で行われる１つ以上の多重増幅反応は、単一の多重増幅反応であり得るか、または並行して行われる２つ以上の多重増幅反応、例えば、異なるプライマープールを用いて行われる並行した高度に多重化された増幅反応であり得る。ＭＲＤモニタリングにおける使用のための試料には、限定されないが、寛解中に得られる試料、治療完了後の任意の時期に得られる試料（治療後試料）、および治療の経過期間中に得られる試料が含まれる。
【0203】
特定の実施形態において、治療に応答する対象のＢＣＲレパートリーを特定および／または特徴付けるための方法および組成物が提供される。いくつかの実施形態において、方法および組成物を使用して、腫瘍治療の前、期間中、および／または後に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団またはクローンを特徴付けおよび／または監視する。いくつかの実施形態において、ＴＩＬの免疫受容体レパートリーをプロファイリングすることによって、腫瘍微小環境の特徴付けおよび／または評価が提供される。いくつかの実施形態において、免疫レパートリーを決定するための方法および組成物を使用して、治療的Ｔ細胞集団（複数可）およびＢ細胞集団（複数可）を特定および／または追跡する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、患者治療後の細胞ベース療法の持続性を特定および／または監視し、限定されないが、ＣＡＲ－Ｔ細胞集団、ＴＣＲ操作されたＴ細胞集団、持続性ＣＡＲ－Ｔ発現、投与されたＴＩＬ集団の存在（例えば、持続的存在）、養子Ｔ細胞療法後のＴＩＬ発現（例えば、持続的発現）、および／または同種造血細胞移植後の免疫再構成を含む、操作されたＴ細胞集団の存在（例えば、持続的存在）が含まれるが、これらに限定されない。
【0204】
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、患者への細胞ベース療法、例えば、限定されないが、がんワクチン細胞、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＩＬ、および／または他の操作された細胞ベース療法の投与後に、患者試料中に存在するＢ細胞クローンまたは集団を特徴付けおよび／または監視する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、細胞ベース療法後の患者試料におけるＢＣＲレパートリーを特徴付けおよび／または監視し、投与された細胞ベース療法に対する患者の応答を評価および／または監視する。細胞ベース療法後のかかる特徴付けおよび／または監視に使用するための試料には、限定されないが、患者からの循環血液細胞、循環腫瘍細胞、ＴＩＬ、組織、ｃｆＤＮＡ、および腫瘍試料（複数可）が含まれる。
【0205】
いくつかの実施形態において、細胞ベース療法をかかる療法を受ける患者のために監視するための方法および組成物が提供され、患者の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、標的ＢＣＲにおける免疫レパートリー配列を特定することと、細胞ベース療法に関連する試料におけるＢＣＲ配列（複数可）の存在または不存在を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、細胞ベース療法をかかる療法を受ける患者のために監視するための方法および組成物が提供され、患者の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有する免疫レパートリー核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびそれぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、標的ＢＣＲにおける免疫レパートリー配列を特定することと、細胞ベース療法に関連する試料におけるＢＣＲ配列（複数可）の存在または不存在を検出することと、を含む。
【0206】
いくつかの実施形態において、細胞ベース療法の投与後の患者の応答を監視するための方法および組成物が提供され、患者の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲレパートリー核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、標的ＢＣＲについて免疫レパートリー配列を特定することと、特定されたＢＣＲレパートリーを、異なる時期に対象から得られた試料で特定された免疫レパートリー配列（複数可）と比較することと、を含む。いくつかの実施形態において、細胞ベース療法の投与後の患者の反応を監視するための方法および組成物が提供され、患者の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲレパートリー核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびそれぞれのＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、標的ＢＣＲにおける免疫レパートリー配列を特定することと、特定されたＢＣＲレパートリーを、異なる時期に患者から得られた試料で特定された免疫レパートリー配列（複数可）と比較することと、を含む。かかるモニタリングに好適な細胞ベース療法には、限定されないが、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ操作されたＴ細胞、ＴＩＬ、およびその他の豊富化された自家細胞が含まれる。様々な実施形態において、かかる方法で行われる１つ以上の多重増幅反応は、単一の多重増幅反応であり得るか、または並行して行われる２つ以上の多重増幅反応、例えば、異なるプライマープールを用いて行われる並行した高度に多重化された増幅反応であり得る。かかる監視する際に使用するための試料には、限定されないが、診断前に得られる試料、診断の任意の段階で得られる試料、寛解中に得られる試料、治療前の任意の時期に得られる試料（治療前試料）、治療の完了後の任意の時期に得られる試料（治療後試料）、および治療の経過期間中に得られる試料が含まれる。
【0207】
いくつかの実施形態において、Ｂ細胞受容体レパートリー、またはＢ細胞およびＴ細胞受容体レパートリーを決定するための方法および組成物を使用して、限定されないが、臓器移植または骨髄移植を含む治療の前、期間中、または後に、免疫能力を測定および／または評価する。
【0208】
特定の実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、限定されないが、免疫療法、抗アレルギー治療、および抗感染症剤治療を含む、治療処置に応答する対象のＢＣＲレパートリーを特定および／または特徴付ける。したがって、いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、療法処置に対する有利な応答（例えば、成功したワクチン接種）または有害な応答（例えば、免疫系媒介性有害事象）などの治療応答のＢＣＲレパートリーまたはクローン系統バイオマーカーもしくはシグナチャーを特定する。いくつかの実施形態において、治療に応答する対象のＢＣＲレパートリーを特定および／または特徴付けるための方法および組成物が提供され、治療の開始後に対象から試料を得ることと、試料または試料から調製されたｃＤＮＡを用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、を含むプライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それにより、ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法は、得られたＢＣＲアンプリコン分子を配列決定することと、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することと、試料からの標的ＢＣＲについて免疫レパートリーを特定することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、治療開始後に得られた試料から特定されたＢＣＲレパートリーを、治療前に得られた患者の試料からのＢＣＲレパートリーと比較することをさらに含む。特に、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定する実施形態は、初期配列読み取りを得ることと、初期配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られた免疫受容体分子の配列を決定することと、を含む。かかる方法および組成物の他の実施形態において、多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子（複数可）の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。かかる方法および組成物の他の実施形態において、多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子（複数可）の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。
【0209】
いくつかの実施形態において、治療に応答する対象のＢＣＲレパートリーを特定および／または特徴付けるための方法および組成物が提供され、治療の開始後に対象から試料を得ることと、試料または試料から調製されたｃＤＮＡを用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの対多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、少なくとも１つのセットを使用して増幅させることを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、それにより、ＢＣＲアンプリコン分子を生成する。本方法は、得られたＢＣＲアンプリコン分子を配列決定することと、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定することと、試料からの標的ＢＣＲについて免疫レパートリーを特定することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、治療開始後に得られた試料から特定されたＢＣＲレパートリーを、治療前に得られた患者の試料からのＢＣＲレパートリーと比較することをさらに含む。特に、ＢＣＲアンプリコン分子の配列を決定する実施形態は、初期配列読み取りを得ることと、推測されるＪ遺伝子配列を配列読み取りに追加して拡張配列読み取りを作成することと、拡張配列読み取りを参照配列に整列させて生産的読み取りを特定することと、１つ以上のインデルエラーを修正して救済された生産的配列読み取りを生成することと、得られたＢＣＲ分子の配列を決定することと、を含む。かかる方法および組成物の他の実施形態において、多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ１の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。かかる方法および組成物の他の実施形態において、多重増幅反応は、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して行われ、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択される。
【0210】
いくつかの実施形態において、治療に応答する対象のＢＣＲレパートリーにおける変化を監視するための方法および組成物が提供され、対象または患者の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大部分に対するプライマー、およびＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、試料からの標的ＢＣＲにおける免疫レパートリー配列を特定することと、特定されたＢＣＲレパートリーを、異なる時期に対象から得られた試料で特定されるものと比較することと、を含む。いくつかの実施形態において、治療に応答する対象のＢＣＲレパートリーの変化を監視するための方法および組成物が提供され、対象または患者の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大部分に対するプライマー、およびそれぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大部分に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、試料からの標的ＢＣＲにおける免疫レパート配列を特定することと、特定されたＢＣＲレパートリーを、異なる時期に対象から得られた試料で特定されるものと比較することと、を含む。様々な実施形態において、かかる方法で行われる１つ以上の多重増幅反応は、単一の多重増幅反応であり得るか、または並行して行われる２つ以上の多重増幅反応、例えば、異なるプライマープールを用いて行われる並行した高度に多重化された増幅反応であり得る。ＢＣＲレパートリーにおける変化を監視する際に使用するための試料には、限定されないが、診断前に得られる試料、診断の任意の段階で得られる試料、寛解中に得られる試料、治療前の任意の時期に得られる試料（治療前試料）、治療の完了後の任意の時期に得られる試料（治療後試料）、および治療の経過期間中に得られる試料が含まれる。
【0211】
特定の実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、限定されないが、炎症状態、自己免疫反応、および／または自己免疫疾患もしくは障害に関連するものを含む、免疫系媒介性有害事象に関連するＢＣＲレパートリーを特徴付けおよび／または監視する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、限定されないが、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、麻痺、関節リウマチ、強直性脊椎炎、喘息、およびＳＬＥを含む、慢性自己免疫疾患もしくは障害に関連するＢ細胞、またはＢ細胞およびＴ細胞、免疫レパートリーを特定および／あるいは監視する。いくつかの実施形態において、血液試料などの全身試料を使用して、自己免疫状態を有する個体の免疫レパートリー（複数可）を決定する。いくつかの実施形態において、発症した関節または腫れの領域からの流体試料などの局所試料を使用して、自己免疫状態を有する個体の免疫レパートリー（複数可）を決定する。いくつかの実施形態において、限局または発症領域の試料に認められる免疫レパートリーと全身試料に認められる免疫レパートリーとの比較によって、除去の標的となるクローンＴ細胞またはＢ細胞集団を特定することができる。
【0212】
いくつかの実施形態において、患者の免疫系媒介性有害事象（複数可）の進行および／または治療に関連するＢＣＲレパートリーを特定および／または監視するための方法および組成物が提供され、患者の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲレパートリー核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、試料からの標的ＢＣＲについて免疫レパートリー配列を特定することと、特定されたＢＣＲレパートリーを、異なる時期に対象から得られた試料で特定されたＢＣＲレパートリー配列（複数可）と比較することと、を含む。いくつかの実施形態において、患者の免疫系媒介性有害事象（複数可）の進行および／または治療に関連するＢＣＲレパートリーを特定および／または監視するための方法および組成物が提供され、患者の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲ核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびそれぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、試料からの標的免疫レパートリーにおけるＢＣＲ配列を特定することと、特定されたＢＣＲレパートリーを、異なる時期に患者から得られた試料で特定されたＢＣＲレパートリー（複数可）と比較することと、を含む。様々な実施形態において、かかる方法で行われる１つ以上の多重増幅反応は、単一の多重増幅反応であり得るか、または並行して行われる２つ以上の多重増幅反応、例えば、異なるプライマープールを用いて行われる並行した高度に多重化された増幅反応であり得る。免疫系媒介性有害事象に関連する免疫レパートリーにおける変化を監視する際に使用するための試料には、限定されないが、診断前に得られる試料、診断の任意の段階で得られる試料、寛解中に得られる試料、治療前の任意の時期に得られる試料（治療前試料）、治療の完了後の任意の時期に得られる試料（治療後試料）、および治療の経過期間中に得られる試料が含まれる。
【0213】
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、自然に獲得された受動免疫療法および人工的に獲得された受動免疫療法を含む、受動免疫に関連する免疫レパートリーを特徴付けおよび／または監視する。例えば、提供される方法および組成物を使用して、限定されないが、母親から妊娠期間中に胎児に、もしくは授乳によって乳児に運ばれるか、またはレシピエントへの抗体の投与を介して運ばれる抗体媒介性免疫の移行後に、受動免疫をレシピエントに提供する保護抗体を特定および／または監視し得る。別の例では、提供される方法および組成物を使用して、ドナーと組織適合性のあるレシピエントへの成熟循環リンパ球の投与など、レシピエントへの細胞媒介性免疫の受動的移行に関連するＢ細胞および／またはＴ細胞免疫レパートリーを特定および／または監視し得る。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、レシピエントにおける受動免疫の持続時間を監視する。
【0214】
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、能動免疫またはワクチン接種療法に関連する免疫レパートリーを特徴付けおよび／または監視する。例えば、ワクチンまたは感染性病原体への曝露後に、提供される方法および組成物を使用して、曝露された個体に能動免疫を提供し得る、保護抗体もしくは保護クローンＢ細胞集団、またはクローンＢ細胞およびＴ細胞集団を特定および／または監視し得る。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、曝露された個体における免疫に寄与するＢ細胞クローン、またはＢ細胞およびＴ細胞クローンの持続期間を監視する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスの抗原への曝露に関連するＢ細胞および／またはＴ細胞免疫レパートリーを特定および／または監視する。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスの感染に関連するＢ細胞および／またはＴ細胞免疫レパートリーを特定および／または監視する。したがって、いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、ワクチン開発における使用のためのものであり、限定されないが、ワクチン候補に対する１つ以上の応答を特定および／または特徴付けること、ならびに品質または規制目的のためにワクチンに対する１つ以上の応答を評価することを含む。
【0215】
いくつかの実施形態において、ワクチンまたは感染性病原体への曝露後にＢＣＲレパートリーにおける変化を監視するための方法および組成物が提供され、曝露された対象の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＢＣＲレパートリー核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、試料からの標的ＢＣＲにおける免疫レパートリー配列を特定することと、特定されたＢＣＲレパートリーを、異なる時期（例えば、曝露前または試験される試料が得られた後）に対象から得られた試料で特定されるＢＣＲレパートリー（複数可）と比較することと、を含む。いくつかの実施形態において、ワクチン接種または感染性病原体への曝露後にＢＣＲレパートリーにおける変化を監視するための方法および組成物が提供され、曝露された対象の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、Ｊ遺伝子部分およびＶ遺伝子部分を有するＢＣＲレパートリー核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびそれぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＪ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、試料からの標的免疫レパートリーにおけるＢＣＲ配列を特定することと、特定されたＢＣＲレパートリーを、異なる時期に患者から得られた試料で特定されたＢＣＲレパートリー（複数可）と比較することと、を含む。特定の実施形態において、ワクチンまたは感染性病原体への曝露後のＢＣＲレパートリーにおける変化を監視するための方法および組成物が提供され、曝露された対象の試料から調製されたｃＤＮＡを用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＩｇＨ核酸鋳型分子を、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびＩｇＨ Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＢＣＲアンプリコンを配列決定することと、レパートリーアイソタイプ情報を含む試料からの発現ＩｇＨレパートリー配列を特定することと、特定されたＩｇＨレパートリーを、異なる時期異なる時期（例えば、曝露前または試験される試料が得られた後）に対象から得られた試料で特定されたＩｇＨレパートリー（複数可）と比較することと、を含む。いくつかの実施形態において、プライマーセットは、単一のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、のＣ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のプライマーを含む。他の実施形態において、プライマーセットは、各々が２つの異なるアイソタイプのＣ遺伝子の少なくとも一部に対する少なくとも２つのプライマーを含む。他の実施形態において、プライマーセットは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥアイソタイプクラスのＣ遺伝子の少なくとも一部に別々に対する少なくとも１つのプライマーを含む。したがって、方法および組成物を使用して、Ｂ細胞レパートリー（アイソタイプクラススイッチを含む）における変化を監視し、ワクチン曝露に対する対象の応答を評価し得る。
【0216】
特定の実施形態において、アレルゲンまたはアレルギー反応もしくは応答を誘発する媒介物への曝露後の対象のＩｇＥレパートリーを特定および／または特徴付けるための方法および組成物が提供され、曝露された対象の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＩｇＨレパートリー核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびＩｇＥ遺伝子コード配列の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＩｇＨアンプリコンを配列決定することと、試料から発現されたＩｇＥ免疫レパートリー配列を特定することと、を含む。いくつかの実施形態において、アレルゲンまたはアレルギー反応もしくは応答を誘発する媒介物への曝露後の対象のＩｇＥレパートリーにおける変化を監視するための方法および組成物が提供され、曝露された対象の試料を用いて１つ以上の多重増幅反応を行って、定常部分および可変部分を有するＩｇＨレパートリー核酸鋳型分子を、Ｖ遺伝子内のＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３の少なくとも一部を含む異なるＩｇＨ Ｖ遺伝子のうちの大多数に対するプライマー、およびＩｇＥ遺伝子コード配列の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマー、のうちの少なくとも１つのセットを使用して増幅させることと、得られたＩｇＨアンプリコンを配列決定することと、試料からの発現されたＩｇＥ免疫レパートリー配列を特定することと、特定されたＩｇＥレパートリーを、異なる時期（例えば、曝露前または試験される試料が得られた後）に対象から得られた試料で特定されたＩｇＥレパートリー（複数可）と比較することと、を含む。いくつかの実施形態において、かかる方法および組成物の少なくとも１つのプライマーセットは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＤ指向プライマーなどの他のＩｇＨアイソタイプの少なくとも一部に対する追加のＣ遺伝子プライマーを含む。他の実施形態において、プライマーセットは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥアイソタイプクラスのＣ遺伝子の少なくとも一部に別々に対する少なくとも１つのプライマーを含む。したがって、方法および組成物を使用して、全ＢＣＲレパートリー内のＩｇＥレパートリーにおける変化（アイソタイプクラススイッチを含む）を監視し、アレルギー反応またはアレルゲン曝露に対する対象の応答を評価し得る。いくつかの実施形態において、かかる方法および組成物を使用して、レパートリー内のＩｇＥ発現Ｂ細胞のアイソタイプスイッチ起源を決定および／または監視する。
【0217】
いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、免疫療法剤として、または免疫療法に基づくレジメンで使用するためにインビトロで増殖および／または活性化されるリンパ球集団をスクリーニングあるいは特徴付ける。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、インビトロで増殖および／もしくは活性化されるＴＩＬ集団または他の収集されたＢ細胞集団をスクリーニングまたは特徴付ける。いくつかの実施形態において、ＢＣＲのＩｇＨ配列を決定することは、抗原特異的Ｂ細胞の特定および産生を容易にする。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、例えば、免疫療法または抗体産生における使用のために、インビトロで増殖および／または活性化される操作されたＢ細胞集団をスクリーニングまたは特徴付ける。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物を使用して、例えば、品質管理または規制試験の目的のために、操作された細胞調製物を製造するためのエクスビボワークフロー中にＢＣＲレパートリーを監視することによって細胞集団を評価する。
【0218】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように特定された新規または非標準的なＢＣＲ対立遺伝子の配列を使用して、組換えＢＣＲ核酸または分子を生成し得る。いくつかの実施形態において、提供される方法および組成物は、組換え抗体ライブラリーのスクリーニングおよび／または産生で使用される。ＢＣＲを特定するように対応された組成物を使用して、組換え抗体ライブラリーのサイズおよび組成物を迅速に評価して、目的の抗体を特定することができる。
【0219】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるような免疫受容体レパートリーをプロファイリングすることは、免疫応答遺伝子発現をプロファイリングすることと組み合わせて、腫瘍微小環境の特徴付けを提供し得る。いくつかの実施形態において、腫瘍試料のＢＣＲレパートリープロファイルを標的免疫応答遺伝子発現プロファイルと組み合わせるか、または相関させることは、腫瘍微小環境のより完全な分析を提供し、免疫療法治療のためのガイダンスを示唆または提供し得る。
【0220】
分析に好適な細胞には、限定されないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、循環腫瘍細胞、および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの様々な造血細胞、リンパ球、および腫瘍細胞が含まれる。免疫グロブリンを発現するリンパ球には、プレＢ細胞、Ｂ細胞、例えば、メモリＢ細胞、および形質細胞が含まれる。Ｔ細胞受容体を発現するリンパ球には、胸腺細胞、ＮＫ細胞、プレＴ細胞、およびＴ細胞が含まれ、多くのＴ細胞のサブセット、例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、ＣＴＬ、Ｔ ｒｅｇが当技術分野で知られている。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣを含む試料は、抗体免疫レパートリー分析の供給源として使用され得る。試料は、例えば、リンパ球、単球、およびマクロファージ、ならびに抗体および他の生物学的構成物を含み得る。
【0221】
ＢＣＲレパートリーの分析は、限定されないが、がんの存在、がん抗原への曝露、感染性病原体からの抗原への曝露、ワクチンへの曝露、アレルゲンへの曝露、食品への曝露、移植片または移植の存在、および自己免疫活性または疾患の存在を含む、細胞増殖および抗原曝露を含む状態における関心対象のものである。免疫不全に関連する状態もまた、分析の関心対象のものであり、先天性および後天性免疫不全症候群が含まれる。
【0222】
関心対象のＢ細胞系統悪性腫瘍には、限定されないが、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、再発／難治性Ｂ細胞ＡＬＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症などが含まれる。非悪性Ｂ細胞の過剰増殖状態には、モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症（ＭＢＬ）が含まれる。
【0223】
関心対象のＴ細胞系列の悪性腫瘍には、限定されないが、前駆Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞顆粒リンパ球性白血病、活動性ＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病（ＨＴＬＶ１陽性）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾γδＴ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、未分化大細胞リンパ腫、Ｔ／ヌル細胞、末梢Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病が含まれる。
【0224】
関心対象の他の悪性腫瘍には、限定されないが、急性骨髄性白血病、頭頸部がん、脳がん、乳がん、卵巣がん、頸部がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、胆嚢がん、胃がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、肝臓がん、肺がん、腎臓（腎細胞）がん、食道がん、膵臓がん、甲状腺がん、胆管がん、下垂体腫瘍、ウィルムス腫瘍、カポジ肉腫、骨肉腫、胸腺がん、皮膚がん、心臓がん、口腔および喉頭がん、神経芽細胞腫、および非ホジキンリンパ腫が含まれる。
【0225】
神経学的炎症状態、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ルーゲーリック病など、および多発性硬化症、慢性炎症性脱髄性多発神経障害などの脱髄性疾患、ならびに関節リウマチなどの炎症性状態は、関心対象のものである。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、多クローン性Ｂ細胞活性化を特徴とする自己免疫疾患であり、様々な抗タンパク質および非タンパク質自己抗体をもたらす（Ｋｏｔｚｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ ８５：３０３－３０６を参照されたい）。これらの自己抗体は、複数の器官系に沈着する免疫複合体を形成し、組織の損傷を引き起こす。自己免疫成分は、アテローム性動脈硬化症に起因し得、候補自己抗原には、Ｈｓｐ６０、酸化ＬＤＬ、および２－糖タンパク質Ｉ（２ＧＰＩ）が含まれる。
【0226】
本明細書に記載の方法における使用のための試料は、リンパ腫、白血病、および形質細胞腫を含む、悪性腫瘍または過剰増殖状態を有する対象から収集されるものであり得る。リンパ腫は、リンパ球起源の固形新生物であり、リンパ組織に最も頻繁に認められる。したがって、例えば、かかるリンパ腫を含むリンパ節、例えば扁桃腺からの生検は、好適な生検を構成するであろう。試料は、疾患の進行および／または疾患の治療における１つもしくは複数の時点で対象または患者から得ることができる。
【0227】
いくつかの実施形態において、本開示は、複数の発現された免疫受容体標的配列を有するｃＤＮＡ試料における標的特異的多重ＰＣＲを、切断可能な基を有するプライマーを使用して行うための方法を提供する。
【0228】
特定の実施形態において、配列決定されるライブラリーおよび／または鋳型調製物は、本明細書で提供される組成物を使用して、自動化システム、例えば、Ｉｏｎ Ｃｈｅｆ（商標）システムを使用して、核酸試料の集団から自動的に調製される。
【0229】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、人、患者、個人、評価される者などを含む。
【0230】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語、またはそれらの他の任意の変化形は、非排他的な包含に及ぶことが意図されている。例えば、特徴のリストを含むプロセス、方法、物品、または機器は、必ずしもそれらの特徴のみに限定されず、明示的に記載されていないか、またはそのようなプロセス、方法、物品、または機器に固有である他の特徴を含み得る。さらに、明示的に断りの記載がない限り、「または」は、包含的論理和を指し、排他的論理和を指さない。
【0231】
本明細書で使用される場合、「抗原」は、例えば対象の、体内に導入されたときに、抗原を認識する抗体またはＴ細胞受容体の産生などの免疫応答を刺激することができる任意の物質を指す。抗原には、核酸、脂質、リボヌクレオタンパク質複合体、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどの分子、ならびにＴおよび／またはＢリンパ球が関与する免疫応答を生じることができるかかる分子の天然もしくは合成修飾が含まれる。自己免疫疾患に関して、抗原は。本明細書においてしばしば自己抗原と呼ばれる。アレルギー性疾患に関して、抗原は、本明細書においてしばしばアレルゲンと呼ばれる。自己抗原は、免疫応答の標的であり得る、生物によって産生される任意の分子であり、生物のゲノム内にコードされているペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質、ならびにこれらのペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の翻訳後に生成される修飾が含まれる。かかる分子にはまた、炭水化物、脂質、および生物によって産生される他の分子が含まれる。抗原にはまた、限定されないが、病原体抗原、がん関連抗原、アレルゲンなどを含むワクチン抗原が含まれる。
【0232】
本明細書で使用されるとき、「増幅する」、「増幅すること」、または「増幅反応」、およびそれらの派生語は、核酸分子の少なくとも一部（鋳型核酸分子と呼ばれる）が、複製されるか、または少なくとも１つの追加の核酸分子にコピーされる、任意の作用またはプロセスを指す。追加の核酸分子は、鋳型核酸分子の少なくともいくらかの部分と実質的に同一または実質的に相補的である配列を任意選択的に含む。鋳型核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることができ、追加の核酸分子は、独立して、一本鎖または二本鎖であることができる。いくつかの実施形態において、増幅は、核酸分子の少なくともいくつかの部分の少なくとも１つのコピーの生成、または核酸分子の少なくともいくつかの部分に相補的である核酸配列の少なくとも１つのコピーの生成のための鋳型依存性インビトロ酵素触媒反応を含む。増幅は、核酸分子の線形または指数関数的複製を任意選択的に含む。いくつかの実施形態では、かかる増幅は、等温条件を使用して実施され、他の実施形態では、かかる増幅は、熱サイクリングを含むことができる。いくつかの実施形態において、増幅は、単一の増幅反応における複数の標的配列の同時増幅を含む多重増幅である。標的配列のうちの少なくともいくつかは、単一の増幅反応に含まれる同じ核酸分子または異なる標的核酸分子に位置することができる。いくつかの実施形態において、「増幅」は、ＤＮＡベースおよびＲＮＡベースの核酸の少なくともいくつかの部分の増幅を、単独または組み合わせで含む。増幅反応は、一本鎖または二本鎖核酸基質を含むことができ、当業者に知られている増幅プロセスのうちのいくつかをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、増幅反応は、ＰＣＲを含む。
【0233】
本明細書で使用される場合、「増幅条件」および派生語は、１つ以上の核酸配列を増幅するために好適な条件を指す。かかる増幅は、一次または指数関数的であり得る。いくつかの実施形態において、増幅条件は、等温条件を含むことができるか、または代替的に、熱サイクル条件、もしくは等温条件と熱サイクル条件との組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸配列を増幅するために好適な条件は、ＰＣＲ条件を含む。典型的には、増幅条件は、１つ以上の標的配列などの核酸を増幅するか、または１つ以上のアダプターに連結した増幅標的配列、例えば、アダプター連結増幅標的配列を増幅するのに十分な反応混合物を指す。増幅条件は、増幅または核酸合成のための触媒、例えば、ポリメラーゼ、増幅される核酸に対してある程度の相補性を有するプライマー、および核酸にハイブリダイズされるとプライマーの伸長を促進するデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのヌクレオチドを含む。増幅条件は、核酸とプライマーのハイブリダイゼーションまたはアニーリング、プライマーの伸長、および伸長したプライマーが増幅を受けている核酸配列から分離される変性ステップを必要とし得る。典型的には、しかし必ずしもそうではないが、増幅条件は熱サイクルを含むことができ、いくつかの実施形態において、増幅条件は、アニーリング、伸長、および分離のステップが繰り返される複数のサイクルを含む。典型的には、増幅条件は、Ｍｇ2+またはＭｎ2+などのカチオン（例えば、ＭｇＣｌ2など）を含み、イオン強度の様々な調節剤も含むことができる。
【0234】
本明細書で使用される場合、「標的配列」または「関心対象の標的配列」およびその派生語は、試料中に存在することが疑われるか、または予測される任意の核酸配列を含む、本開示に従って増幅または合成することができる、任意の一本または二本鎖核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は、二本鎖形態で存在し、標的特異的プライマーまたは付加されたアダプターの添加前に、増幅または合成される特定のヌクレオチド配列の少なくとも一部、またはその相補体を含む。標的配列は、増幅または合成反応において有用なプライマーが、ポリメラーゼによる伸長の前にハイブリダイズすることができる核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、この用語は、ヌクレオチドの配列同一性、順序付けまたは場所が、本開示の方法のうちの１つ以上によって決定される核酸配列を指す。
【0235】
本明細書で定義される場合、「試料」およびその派生語は、その最も広い意味で使用され、標的を含むことが疑われる、任意の標本、培養物などを含む。いくつかの実施形態において、試料は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、キメラ、ハイブリッド、または核酸の多重形態を含む。試料は、１つ以上の核酸を含む、生物学的、臨床的、外科的、農業的、大気ベース、または水生ベースの標本を含むことができる。本用語はまた、発現されたＲＮＡ、新鮮－凍結またはホルマリン固定したパラフィン包埋の核酸標本などの任意の単離された核酸試料を含む。
【0236】
本明細書で使用される場合、「接触させること」およびその派生語は、２つ以上の成分に関して使用されるとき、言及される成分の接近、近接、混合、もしくは混入が、かかる成分の物理的な接触を必ずしも必要とせずに促進または達成される任意のプロセスを指し、言及される成分のうちのいずれか１つ以上を含有する溶液を互いに混合することを含む。参照される成分は、任意の特定の順序または組み合わせで接触され得、成分の列挙の特定の順序は、限定的ではない。例えば、「ＡをＢおよびＣと接触させること」は、ＡをまずＢ、次いでＣと接触させる実施形態、ならびにＣをＡ、次いでＢと接触させる実施形態、ならびにＡおよびＣの混合物をＢと接触させる実施形態などを包含する。さらに、かかる接触させることは、接触プロセス中のある時点で、参照される成分のすべてが同時に存在するか、または同じ混合物もしくは溶液に同時に含まれる限り、接触プロセスの最終結果が参照される成分のすべてを含む混合物であることを必ずしも必要としない。接触させる参照成分の１つ以上が複数を含む（例えば、「標的配列を複数の標的特異的プライマーおよびポリメラーゼと接触させる」）場合、複数の各メンバーは、接触させることが、複数のいずれか１つ以上のメンバーを複数のいずれかの他のメンバーと、および／またはいずれかの他の参照成分と（例えば、複数の標的特異的プライマーのすべてではないがいくつかは、標的配列、次いでポリメラーゼ、および次いで複数の標的特異的プライマーの他のメンバーと接触させることができる）いずれかの順序または組み合わせで接触させることを含むことができるように、接触プロセスの個々の成分として見ることができる。
【0237】
本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語およびその派生語は、関心対象の標的配列にハイブリダイズすることができる任意のポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、プライマーは、核酸合成を開始するのに役立つこともできる。典型的には、プライマーは、ヌクレオチドがポリメラーゼによって重合され得る基質として機能するが、しかしいくつかの実施形態において、プライマーは、合成された核酸鎖に組み込まれて、別のプライマーがハイブリダイズして、合成された核酸分子に相補的である新たな鎖の合成を開始することができる部位を提供することができる。プライマーは、ヌクレオチドまたはその類似体の任意の組み合わせからなり得、任意選択的に連結されて、任意の好適な長さの線状ポリマーを形成し得る。いくつかの実施形態において、プライマーは、一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。（本開示の目的では、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、二者間の長さの違いを必ずしも示さない）。いくつかの実施形態において、プライマーは一本鎖であるが、それは二本鎖であることもできる。プライマーは、精製された制限消化におけるように、任意選択的に自然に発生するか、または合成的に生成することができる。いくつかの実施形態において、プライマーは、増幅または合成条件に曝露される場合、増幅または合成における開始点として作用し、かかる増幅または合成は、鋳型依存様式で生じることができ、任意選択的に、標的配列の少なくとも一部分に相補的であるプライマー伸長生成物の形成をもたらす。例示的な増幅または合成条件は、プライマーをポリヌクレオチド鋳型（例えば、標的配列を含む鋳型）、ヌクレオチド、およびポリメラーゼなどの誘導剤と好適な温度およびｐＨで接触させて、標的特異的プライマーの末端へのヌクレオチドの重合を誘導することを含むことができる。二本鎖の場合、プライマーは、プライマー伸長生成物を調製するために使用される前に、その鎖を分離するように任意選択的に処理することができる。いくつかの実施形態では、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、プライマーは、１つ以上のヌクレオチド類似体を含むことができる。標的特異的プライマーの、配列を含む、正確な長さおよび／または組成は、融解温度（Ｔm）、ＧＣ含有量、二次構造の形成、反復ヌクレオチドモチーフ、予測されるプライマー伸長生成物の長さ、目的の核酸分子にわたるカバレッジの程度、単一の増幅または合成反応に存在するプライマーの数、プライマー内のヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドの存在などを含む、多くの特性に影響を及ぼすことができる。いくつかの実施形態では、プライマーは、増幅または合成反応内で適合性プライマーと対合して、順方向プライマーおよび逆方向プライマーからなるプライマー対を形成することができる。いくつかの実施形態では、プライマー対の順方向プライマーは、核酸分子の鎖の少なくとも一部分と実質的に相補的である配列を含み、プライマー対のプライマーの逆方向プライマーは、鎖の少なくとも一部分と実質的に同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、核酸二重鎖の反対の鎖にハイブリダイズすることができる。任意選択的に、順方向プライマーは、第１の核酸鎖の合成を開始し、逆方向プライマーは、第２の核酸鎖の合成を開始し、第１および第２の鎖は、互いに実質的に相補的であるか、またはハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成することができる。いくつかの実施形態では、増幅または合成生成物の一末端は、順方向プライマーによって定義され、増幅または合成生成物の他端は、逆方向プライマーによって定義される。いくつかの実施形態では、エクソン、コーディング領域、または遺伝子の増幅などの、長いプライマー伸長生成物の増幅または合成が必要である場合、領域の十分な増幅を可能にするために所望の長さに及ぶよりもいくつかのプライマー対を作成することができる。いくつかの実施形態では、プライマーは、１つ以上の切断可能な基を含むことができる。いくつかの実施形態では、プライマー長さは、約１０～約６０ヌクレオチド、約１２～約５０ヌクレオチド、および約１５～約４０ヌクレオチドの範囲の長さである。典型的には、プライマーは、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼの存在下で増幅条件に曝露される場合、対応する標的配列にハイブリダイズし、プライマー伸長を受けることができる。いくつかの実施形態では、プライマーは、プライマー内の１つ以上の位置に１つ以上の切断可能な基を含む。
【0238】
本明細書で使用される場合、「標的特異的プライマー」およびその派生語は、標的配列を含む核酸分子の少なくとも一部分に対して、少なくとも５０％相補的、典型的には少なくとも７５％相補的、もしくは少なくとも８５％相補的、より典型的には少なくとも９０％相補的、より典型的には少なくとも９５％相補的、より典型的には少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％相補的、または同一である少なくとも１つの配列を含む、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド、典型的にはオリゴヌクレオチドを指す。そのような事例では、標的特異的プライマーおよび標的配列は、互いに「対応する」と記載されている。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、その対応する標的配列の少なくとも一部分（または標的配列の相補体）にハイブリダイズすることができ、そのようなハイブリダイゼーションは、任意選択で、標準的なハイブリダイゼーション条件下または厳密なハイブリダイゼーション条件下で任意に行われることができる。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、標的配列またはその補体にハイブリダイズすることができないが、標的配列またはその補体を含む核酸鎖の一部分にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、標的配列自体の少なくとも一部分に対して、少なくとも７５％相補的、典型的には少なくとも８５％相補的、より典型的には少なくとも９０％相補的、より典型的には少なくとも９５％相補的、より典型的には少なくとも９８％相補的、またはより典型的には少なくとも９９％相補的である少なくとも１つの配列を含み、他の実施形態では、標的特異的プライマーは、標的配列以外の核酸分子の少なくとも一部に対して、少なくとも７５％相補的、典型的には少なくとも８５％相補的、より典型的には少なくとも９０％相補的、より典型的には少なくとも９５％相補的、より典型的には少なくとも９８％相補的、またはより典型的には少なくとも９９％相補的である少なくとも１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、試料中に存在する他の標的配列に対して実質的に非相補的であり、任意選択的に、標的特異的プライマーは、試料中に存在する他の核酸分子に対して実質的に非相補的である。いくつかの実施形態では、標的配列（または標的配列の補体）を含まないか、またはそれに対応しない試料中に存在する核酸分子は、「非特異的」配列または「非特異的核酸」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、その対応する標的配列の少なくとも一部分と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含むように設計される。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、その対応する標的配列を含む核酸分子の少なくとも一部分に対してその全長にわたって、少なくとも９５％相補的、もしくは少なくとも９９％相補的、または同一である。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、その対応する標的配列の少なくとも一部分に対してその全長にわたって、少なくとも９０％、少なくとも９５％相補的、少なくとも９８％相補的、もしくは少なくとも９９％相補的、または同一であり得る。いくつかの実施形態において、フォワード標的特異的プライマーおよびリバース標的特異的プライマーは、鋳型依存的プライマー伸長を介して標的配列を増幅するために使用される標的特異的プライマー対を定義する。典型的には、標的特異的プライマー対の各プライマーは、対応する標的配列を含む核酸分子の少なくとも一部分と実質的に相補的であるが、試料における少なくとも１つの他の標的配列と５０％未満相補的である少なくとも１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、増幅は、単一の増幅反応において複数の標的特異的プライマー対を使用して行われ、各プライマー対は、フォワード標的特異的プライマーおよびリバース標的特異的プライマーを含み、各々が、試料中の対応する標的配列と実質的に相補的または実質的に同一である少なくとも１つの配列を含み、各プライマー対が、異なる対応する標的配列を有する。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、増幅反応に存在する任意の他の標的特異的プライマーに対して、その３’末端またはその５’末端で実質的に非相補的である。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、増幅反応における他の標的特異的プライマーへの最小限のクロスハイブリダイゼーションを含むことができる。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、増幅反応混合物中の非特異的配列への最小限のクロスハイブリダイゼーションを含む。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、最小限の自己相補性を含む。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、３’末端に位置する１つ以上の切断可能な基を含むことができる。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、標的特異的プライマーの中心ヌクレオチドの近くまたは周囲に位置する１つ以上の切断可能な基を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的特異的プライマーは、標的特異的プライマーの５’末端に切断不可能なヌクレオチドのみを含む。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーは、任意選択的に同じ増幅反応において、１つ以上の異なる標的特異的プライマーと比較して、プライマーの３’末端または５’末端で最小限のヌクレオチド配列重複を含む。いくつかの実施形態では、単一の反応混合物中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の標的特異的プライマーは、上記の実施形態の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、単一の反応混合物中の複数の標的特異的プライマーの実質的にすべては、上記の実施形態の１つ以上を含む。
【0239】
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」およびその派生語は、ヌクレオチド（その類似体を含む）の核酸鎖への重合を触媒することができる任意の酵素を指す。必ずしもそうではないが、典型的には、かかるヌクレオチド重合は、鋳型依存様式で生じ得る。かかるポリメラーゼには、限定することなく、天然ポリメラーゼおよびその任意のサブユニットおよびトランケーション、変異ポリメラーゼ、バリアントポリメラーゼ、組換え、融合、または他の様式で操作されたポリメラーゼ、化学的に修飾されたポリメラーゼ、合成分子または集合体、ならびにかかる重合を触媒する能力を保持するそれらの任意の類似体、誘導体、または断片が含まれ得る。任意選択的に、ポリメラーゼは、１つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸との置換、ポリメラーゼからの１つ以上のアミノ酸の挿入もしくは欠失、または２つ以上のポリメラーゼの部分の結合を伴う１つ以上の変異を含む変異ポリメラーゼである。典型的には、ポリメラーゼは、ヌクレオチド結合および／またはヌクレオチド重合の触媒が生じ得る１つ以上の活性部位を含む。いくつかの例示的なポリメラーゼは、限定なしに、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを含む。本明細書で使用される、「ポリメラーゼ」という用語およびその変形は、互いに連結した少なくとも２つの部分を含む融合タンパク質も指し、第１の部分は、ヌクレオチドの核酸鎖への重合を触媒することができるペプチドを含み、第２のポリペプチドを含む第２の部分に連結している。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、レポーター酵素または加工性増強ドメインを含むことができる。任意選択的に、ポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性またはターミナルトランスフェラーゼ活性を有することができる。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、例えば、熱、化学物質の使用、または反応混合物への新たな量のポリメラーゼの再追加を通して、任意選択的に再活性化される。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、任意選択的に再活性化されるホットスタートポリメラーゼおよび／またはアプタマーベースのポリメラーゼを含むことができる。
【0240】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語およびその変形は、ポリメラーゼに選択的に結合することができるか、またはポリメラーゼによって重合される、天然に存在するヌクレオチドまたはその類似体を含むがこれらに限定されない任意の化合物を含む。典型的には、しかし必ずしもそうではないが、ヌクレオチドのポリメラーゼとの選択的な結合に、ポリメラーゼによるヌクレオチドの核酸鎖への重合が続くが、しかし時折、ヌクレオチドは、核酸鎖に組み込まれることなくポリメラーゼから解離し得る。かかるヌクレオチドは、天然ヌクレオチドだけでなく、その構造にかかわらず、ポリメラーゼに選択的に結合するか、またはそれによって重合され得る任意の類似体も含む。天然ヌクレオチドは典型的に塩基、糖、およびリン酸部分を含む一方、本開示のヌクレオチドは、かかる部分のうちのいずれか１つ、いくつか、またはすべてを欠く化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、任意に、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のリン原子を含むリン原子の鎖を含み得る。いくつかの実施形態において、リン鎖は、糖環の任意の炭素、例えば、５’炭素に結合される。リン鎖は、介在するＯまたはＳによって糖に連結することができる。一実施形態において、鎖中の１つ以上のリン原子は、ＰおよびＯを有するリン酸基の一部であることができる。別の実施形態において、鎖中のリン原子は、介在するＯ、ＮＨ、Ｓ、メチレン、置換メチレン、エチレン、置換エチレン、ＣＮＨ2、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（ＣＨ2）、ＣＨ2ＣＨ2、またはＣ（ＯＨ）ＣＨ2Ｒ（Ｒは４－ピリジンまたは１－イミダゾールであることができる）とともに連結される。一実施形態において、鎖中のリン原子は、Ｏ、ＢＨ3、またはＳを有する側基を有する。リン鎖において、Ｏ以外の側基を有するリン原子は、置換リン酸基であり得る。リン鎖において、Ｏ以外の介在原子を有するリン原子は、置換リン基であり得る。ヌクレオチド類似体のいくつかの例は、米国特許第７，４０５，２８１号に記載されている。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは標識を含み、本明細書では「標識ヌクレオチド」と呼ばれる。標識ヌクレオチドの標識は、本明細書では「ヌクレオチド標識」と呼ばれ、いくつかの実施形態において、標識は、末端リン酸基、すなわち、糖から最も遠位のリン酸基に結合される蛍光色素の形態にある。開示される方法および組成物において使用することができるヌクレオチドのいくつかの例には、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドポリホスフェート、デオキシリボヌクレオチドポリホスフェート、修飾リボヌクレオチドポリホスフェート、修飾デオキシリボヌクレオチドポリホスフェート、ペプチドヌクレオチド、修飾ペプチドヌクレオチド、メタロヌクレオシド、ホスホネートヌクレオシド、および修飾リン酸糖骨格ヌクレオチド、前述の化合物の類似体、誘導体、または変形が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、ヌクレオチドのアルファリン酸および糖、またはヌクレオチドのアルファおよびベータリン酸、またはヌクレオチドのベータおよびガンマリン酸、またはヌクレオチドの任意の他の２つのリン酸、またはそれらの任意の組み合わせを架橋する酸素部分の代わりに例えば、チオ－またはボラノ－部分等の非酸素部分を含み得る。「ヌクレオチド５’－三リン酸」は、三リン酸エステル基を５’位に有するヌクレオチドを指し、「ＮＴＰ」、またはリボース糖の構造的特徴を特に指摘するために「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」としばしば呼ばれる。三リン酸エステル基は、様々な酸素における硫黄置換、例えば、アルファ－チオ－ヌクレオチド５’－三リン酸を含むことができる。核酸化学のレビューについて、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照されたい。
【0241】
「伸長」という用語およびその変形は、本明細書で使用される場合、所与のプライマーに関して使用されるとき、既存核酸分子の末端への１つ以上のヌクレオチドの重合に関連する所与のポリメラーゼに特徴的な任意のインビボまたはインビトロ酵素活性を含む。典型的には、しかし必ずしもそうではないが、かかるプライマー伸長は、鋳型依存様式で生じ、鋳型依存伸長の間、塩基の順序および選択は、ワトソン－クリック型塩基対規則を含むことができる確立された塩基対規則によって、または代替的に（特にヌクレオチド類似体が関与する伸長反応の場合）いくつかの他の型の塩基対パラダイムによって駆動される。非限定的な一例において、伸長は、ポリメラーゼによる核酸分子の３’ＯＨ末端におけるヌクレオチドの重合を介して生じる。
【0242】
本明細書で使用される、「部分」という用語およびその変形は、所定の核酸分子、例えば、プライマーまたは鋳型核酸分子に関して使用される場合、核酸分子の部分または全長を含む、核酸分子の長さ内の任意の数の連続ヌクレオチドを含む。
【0243】
本明細書で使用される「同一性」および「同一」という用語ならびにそれらの変形は、２つ以上の核酸配列を参照して使用される場合、２つ以上の配列（例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列）の配列類似性を指す。２つ以上の相同配列の状況下において、配列またはその部分配列の同一性または相同性パーセントは、同じ（すなわち、約７０％同一性、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一性）であるすべてのモノマー単位（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）のパーセンテージを示す。同一性パーセントは、比較ウィンドウ上で最大の一致について比較および整列される場合、特定される領域、または以下に記載されるデフォルトパラメータでＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アライメントおよび目視検査により、指定される領域を超えることができる。アミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで少なくとも８５％同一性がある場合、配列は「実質的に同一」であると言われる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２５、５０、もしくは１００残基である領域にわたって、または少なくとも１つの比較配列の全長にわたって存在する。配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するための典型的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）に記載される。他の方法には、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．２：４８２（１９８１）、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）などのアルゴリズムが含まれる。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子またはそれらの相補体がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【0244】
本明細書で使用される「相補的」および「補体」という用語ならびにそれらの変形は、ハイブリダイズされた二重鎖のように、逆平行配向にある２つ以上の個々の対応する位置で累積塩基対合を受けることができる任意の２つ以上の核酸配列（例えば、鋳型核酸分子の部分または全体、標的配列および／またはプライマー）を指す。かかる塩基対合は、確立された規則の任意のセットに従って、例えば、ワトソン－クリック塩基対合規則に従って、またはいくらかの他の塩基対合パラダイムに従って進めることができる。任意選択的に、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間に「完全」または「総」相補性があり得、第１の核酸配列中の各ヌクレオチドは、第２の核酸配列上の対応する逆平行位置のヌクレオチドとの安定化塩基対合相互作用を受けることができる。「部分的」相補性は、一方の核酸配列の残基の少なくとも２０％であるが、１００％未満が、他方の核酸配列中の残基に相補的である、核酸配列を表現する。いくつかの実施形態では、一方の核酸配列の残基の少なくとも５０％であるが、１００％未満は、他方の核酸配列中の残基に相補的である。いくつかの実施形態では、一方の核酸配列の残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％であるが、１００％未満は、他方の核酸配列中の残基に相補的である。一方の核酸配列の残基の少なくとも８５％が他方の核酸配列中の残基に相補的である場合、配列は、「実質的に相補的」であると言われる。いくつかの実施形態では、２つの相補的または実質的に相補的な配列は、標準的またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることができる。「非相補的」は、一方の核酸配列の残基の２０％未満が他方の核酸配列中の残基に相補的である、核酸配列を表現する。一方の核酸配列の残基の１５％未満が他方の核酸配列中の残基に相補的である場合、配列は、「実質的に非相補的」であると言われる。いくつかの実施形態では、２つの非相補的または実質的に非相補的な配列は、標準的またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることができない。「ミスマッチ」は、２つの対向したヌクレオチドが相補的ではない配列中の任意の位置に存在する。相補的ヌクレオチドは、生理学的条件下でのＤＮＡ複製中に互いに対向するＤＮＡポリメラーゼにより効率的に組み込まれるヌクレオチドを含む。典型的な実施形態では、相補的ヌクレオチドは、互いに逆平行な位置にあるヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの核酸塩基の間に、特定のワトソン－クリック型水素結合を通して形成されたＡ－Ｔ／ＵおよびＧ－Ｃ塩基対、またはいくらかの他のタイプの塩基対合パラダイムを通して形成された塩基対などの、互いの塩基対を形成することができる。他の人工塩基対の相補性は、塩基の他のタイプの水素結合および／もしくは疎水性ならびに／または塩基間の形状相補性に基づくことができる。
【0245】
本明細書で使用される場合、「増幅された標的配列」およびその派生語は、標的特異的プライマーおよび本明細書に提供される方法を使用して標的配列の増幅／これらを増幅することにより生成された核酸配列を指す。増幅された標的配列は、標的配列に関して同じセンス（２回以降の偶数回の増幅で生成されたプラス鎖）またはアンチセンス（すなわち、１回以降の奇数回の増幅中に生成されたマイナス鎖）のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、増幅された標的配列は、反応における別の増幅された標的配列の任意の部分に対して５０％未満相補的である。他の実施形態において、増幅された標的配列は、反応における別の増幅された標的配列の任意の部分に対して、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超相補的である。
【0246】
本明細書で使用される場合、「連結する」、「連結」という用語およびそれらの派生語は、２つ以上の分子を一緒に共有結合する、例えば、２つ以上の核酸分子を互いに共有結合するための作用またはプロセスを指す。いくつかの実施形態では、連結は、核酸の隣接するヌクレオチド間のニックを接合することを含む。いくつかの実施形態では、連結は、第１の核酸分子の末端と第２の核酸分子の末端との間に共有結合を形成することを含む。いくつかの実施形態、例えば、連結される核酸分子が従来のヌクレオチド残基を含む実施形態では、連結は、１つの核酸の５’リン酸基と第２の核酸の３’ヒドロキシル基との間に共有結合を形成し、これにより連結された核酸分子を形成することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ニックを接合するか、または隣接するヌクレオチド間で５’リン酸を３’ヒドロキシルに結合するための任意の手段を使用することができる。例示的な実施形態において、リガーゼなどの酵素が使用される。本開示の目的では、増幅された標的配列をアダプターに連結して、アダプター連結増幅標的配列を生成することができる。
【0247】
本明細書で使用される場合、「リガーゼ」およびその派生語は、２つの基質分子の連結を触媒することができる任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、リガーゼは、核酸の隣接するヌクレオチド間のニックの接合を触媒することができる酵素を含む。いくつかの実施形態において、リガーゼは、１つの核酸分子の５’リン酸と別の核酸分子の３’ヒドロキシルとの間の共有結合の形成を触媒し、それにより連結核酸分子を形成することができる酵素を含む。いくつかの実施形態において、リガーゼは等温リガーゼである。いくつかの実施形態において、リガーゼは、熱安定性リガーゼである。好適なリガーゼには、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼが含まれ得るが、これらに限定されない。
【0248】
本明細書で使用される場合、「ライゲーション条件」およびその派生物は、２つの分子を互いに連結するために好適な条件を指す。いくつかの実施形態において、ライゲーション条件は、核酸間のニックまたはギャップを塞ぐために好適である。本明細書で定義される場合、「ニック」または「ギャップ」は、核酸配列の内部ヌクレオチド内の隣接するモノヌクレオチドペントース環の３’ヒドロキシルにモノヌクレオチドペントース環の直接結合した５’リン酸を欠く核酸分子を指す。本明細書で使用される場合、ニックまたはギャップという用語は、当技術分野における用語の使用と一致している。通常、ニックまたはギャップは、適切な温度およびｐＨでリガーゼなどの酵素の存在下でライゲーションされる。いくつかの実施形態において、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、約７０～７２℃の温度で核酸間のニックに結合することができる。
【0249】
本明細書で使用される場合、「平滑末端ライゲーション」およびその派生語は、２つの平滑末端二本鎖核酸分子の互いのライゲーションを指す。「平滑末端」は、核酸分子の一方の鎖の末端における実質的にすべてのヌクレオチドは、同じ核酸分子の他方の鎖における対向するヌクレオチドと塩基対形成される、二本鎖核酸分子の末端を指す。核酸分子は、長さが２個を超えるヌクレオチドの一本鎖部分を含む末端を有する場合、平滑末端ではなく本明細書では「オーバーハング」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、核酸分子の末端は、いずれの一本鎖部分も含まず、そのため、末端の一方の鎖のすべてのヌクレオチドは、同じ核酸分子の他方の鎖の対向するヌクレオチドと塩基対形成される。いくつかの実施形態において、互いに連結されるようになる２つの平滑末端核酸分子の末端は、重複するか、共有されるか、または相補的ないかなる配列も含まない。通常、平滑末端ライゲーションは、米国特許公開第２０１０／０１２９８７４号に記載されているパッチオリゴヌクレオチドなどの二本鎖増幅標的配列の二本鎖アダプターとのライゲーションを支援する追加のオリゴヌクレオチドアダプターの使用を除外する。いくつかの実施形態において、平滑末端ライゲーションは、ライゲーションプロセス中に作成されたニックを塞ぐニックトランスレーション反応を含む。
【0250】
本明細書で使用される場合、「アダプター」または「アダプターおよびその相補体」およびそれらの派生語は、本開示の核酸分子にライゲーションされ得る任意の直鎖状オリゴヌクレオチドを指す。任意に、アダプターは、試料内の少なくとも１つの標的配列の３’末端または５’末端に実質的に相補的ではない核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、試料中に存在する任意の標的配列の３’末端または５’末端と実質的に非相補的である。いくつかの実施形態では、アダプターは、増幅された標的配列と実質的に相補的ではない任意の一本鎖または二本鎖直鎖状オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、試料の核酸分子の少なくとも１つ、いくつか、またはすべてと実質的に非相補的である。いくつかの実施形態では、好適なアダプター長さは、約１０～１００ヌクレオチド長、約１２～６０ヌクレオチド長、および約１５～５０ヌクレオチド長の範囲である。アダプターは、ヌクレオチドおよび／または核酸のいずれかの組み合わせを含むことができる。いくつかの態様において、アダプターは、１つ以上の位置に１つ以上の切断可能な基を含むことができる。いくつかの実施形態において、アダプターは、プライマー、例えば、ユニバーサルプライマーの少なくとも一部分と実質的に同一または実質的に相補的である配列を含むことができる。ユニバーサル増幅プライマーの構造および特性は、当業者に周知であり、特定の分析プラットフォームに適合させるように、提供される方法および組成物とともに利用するために実装することができる（例えば、本明細書に記載されるように、ユニバーサルＰ１およびＡプライマーは、当該技術分野において記載されており、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングプラットフォームでの配列決定に利用されている）。同様に、当該技術分野において記載され、知られている追加および他のユニバーサルアダプター／プライマー配列（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａユニバーサルアダプター／プライマー配列、ＰａｃＢｉｏユニバーサルアダプター／プライマー配列など）は、本明細書で提供される方法および組成物とともに使用することができる。いくつかの実施形態では、アダプターは、ダウンストリームのカタログ化、識別、または配列決定を補助するバーコードまたはタグを含み得る。いくつかの実施形態では、一本鎖アダプターは、増幅された標的配列にライゲーションされたとき、特に好適な温度およびｐＨ下でポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下、増幅のための基板として作用し得る。
【0251】
いくつかの実施形態において、アダプターは、平滑末端ライゲーションを介してポリヌクレオチドに連結される。他の実施形態において、アダプターは、アダプターおよびポリヌクレオチドの末端におけるヌクレオチドオーバーハングを介してポリヌクレオチドに連結される。オーバーハングライゲーションでは、アダプターが連結されるポリヌクレオチド（例えば、アンプリコン）が、それぞれの鎖の３’および／または５’末端に付加される相補的オーバーハングを有する場合、アダプターは、それぞれの鎖の３’および／または５’末端に付加されるヌクレオチドオーバーハングを有し得る。例えば、アデニンヌクレオチドは、末端が修復されたＰＣＲ産物の３’末端に付加することができる。次に、チミンヌクレオチドによって形成されたオーバーハングを有するアダプターは、アンプリコンのＡ－オーバーハングとドッキングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼによってアンプリコンに連結することができる。
【0252】
本明細書で使用される場合、「再増幅すること」または「再増幅」およびそれらの派生語は、増幅された核酸分子の少なくとも一部が、任意の好適な増幅プロセス（いくつかの実施形態において「二次」増幅または「再増幅」と呼ばれる）によってさらに増幅され、それにより再増幅された核酸分子を生成する任意のプロセスを指す。二次増幅は、増幅された核酸分子が生成された最初の増幅プロセスと同一である必要はなく、また、再増幅された核酸分子は、増幅された核酸分子と完全に同一または完全に相補的である必要はなく、再増幅された核酸分子が、増幅された核酸分子またはその相補体の少なくとも一部を含むことのみが必要とされるすべてである。例えば、再増幅は、一次増幅とは異なる標的特異的プライマーを含む、異なる増幅条件および／または異なるプライマーの使用を含むことができる。
【0253】
本明細書で定義される場合、「切断可能な基」は、核酸に組み込まれると、適切な条件下で切断することができる任意の部分を指す。例えば、切断可能な基は、標的特異的プライマー、増幅された配列、アダプター、または試料の核酸分子に組み込むことができる。例示的な実施形態では、標的特異的プライマーは、増幅生成物に組み込まれる切断可能な基を含むことができ、その後増幅後に切断され、それにより増幅生成物から標的特異的プライマーの一部または全部を除去する。切断可能な基は、任意の許容可能な手段により、標的特異的プライマー、増幅された配列、アダプター、または試料の核酸分子から切断またはさもなければ除去することができる。例えば、切断可能な基は、標的特異的プライマー、増幅された配列、アダプター、または試料の核酸分子から、酵素、熱、光酸化、または化学処理によって除去することができる。一態様において、切断可能な基は、天然に存在しない核酸塩基を含むことができる。例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、ウラシルグリコシラーゼによって除去することができるウラシルなどの１つ以上のＲＮＡ核酸塩基を含むことができる。いくつかの実施形態では、切断可能な基は、１つ以上の修飾された核酸塩基（７－メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、または５－メチルシトシンなど）または１つ以上の修飾されたヌクレオシド（すなわち、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、または５－メチルシチジン）を含むことができる。修飾された核酸塩基またはヌクレオチドは、酵素的、化学的、または熱的手段により核酸から除去することができる。一実施形態では、切断可能な基は、増幅（または合成）後、紫外線（すなわち、ブロモデオキシウリジン）への曝露時に、プライマーから除去することができる部分を含むことができる。別の実施形態では、切断可能な基は、メチル化シトシンを含むことができる。典型的には、メチル化シトシンは、例えば、増幅（または合成）の誘導後、亜硫酸水素ナトリウム処理時に、プライマーから切断することができる。いくつかの実施形態では、切断可能な部分は、制限部位を含むことができる。例えば、プライマーまたは標的配列は、１つ以上の制限酵素に特異的な核酸配列を含むことができ、増幅（または合成）に続いて、プライマーまたは標的配列は、切断可能な基が除去されるように１つ以上の制限酵素で処理することができる。典型的には、１つ以上の切断可能な基は、標的特異的プライマー、増幅された配列、アダプター、または試料の核酸分子で、１つ以上の位置に含めることができる。
【0254】
本明細書で使用される場合、「切断ステップ」およびその派生語は、切断可能な基が、標的特異的プライマー、増幅された配列、アダプター、または試料の核酸分子から切断されるか、さもなければ除去される任意のプロセスを指す。いくつかの実施形態において、切断ステップは、化学的、熱的、光酸化的、または消化的なプロセスを含む。
【0255】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野でのその使用と一致しており、２つの核酸分子が塩基対合相互作用を受けるプロセスを指す。２つの核酸分子は、一方の核酸分子の任意の部分が他方の核酸分子の任意の部分と塩基対合される場合、ハイブリダイズされると言われ、２つの核酸分子がそれらのそれぞれの全長にわたってハイブリダイズされることは必ずしも必要ではなく、いくつかの実施形態では、核酸分子の少なくとも１つは、他の核酸分子とハイブリダイズされない部分を含むことができる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすること」という句およびその変形は、標的特異的プライマーと標的配列とのハイブリダイゼーションが、高いハイブリダイゼーション温度および低いイオン強度の存在下で起こる条件を指す。例示的な一実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約６０～６８℃で約３０ｍＭの硫酸マグネシウム、約３００ｍＭのトリス－硫酸、ｐＨ８．９、および約９０ｍＭの硫酸アンモニウム、またはそれらの等価物を含有する水性環境を含む。本明細書で使用される場合、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という句およびその変形は、プライマーとオリゴヌクレオチド（すなわち、標的配列）とのハイブリダイゼーションが、低いハイブリダイゼーション温度および高いイオン強度の存在下で起こる条件を指す。１つの例示的な実施形態では、標準的なハイブリダイゼーション条件には、約１００ｍＭの硫酸マグネシウム、ｐＨ８．９の約５００ｍＭの硫酸トリス、および約５０～５５℃の約２００ｍＭの硫酸アンモニウム、またはその等価物を含有する水性環境が含まれる。
【0256】
本明細書で使用される場合、「ＧＣ含有量」およびその派生語は、核酸分子のシトシンおよびグアニン含有量を指す。本開示の標的特異的プライマー（またはアダプター）のＧＣ含量は、８５％以下である。より典型的には、本開示の標的特異的プライマーまたはアダプターのＧＣ含有量は、１５～８５％である。
【0257】
本明細書で使用されるとき、「末端」という用語およびその変形は、核酸分子、例えば、標的配列または増幅された標的配列に関して使用される場合、核酸分子の末端３０ヌクレオチド、末端２０、およびさらにより典型的には末端１５ヌクレオチドを含むことができる。結合した一連の連続ヌクレオチドからなる線状核酸分子は、典型的には少なくとも２つの末端を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子の一方の末端は、３’ヒドロキシル基またはその等価物を含むことができ、「３’末端」およびその派生語として呼ばれる。任意選択的に、３’末端は、モノヌクレオチドペントース環の５’リン酸基に結合していない３’ヒドロキシル基を含む。典型的には、３’末端は、非結合３’ヒドロキシル基を含むヌクレオチドに隣接して位置する１つ以上の５’結合ヌクレオチド、典型的には３’ヒドロキシルに隣接して位置する３０ヌクレオチド、典型的には末端２０、およびさらにより典型的には末端１５ヌクレオチドを含む。１つ以上の結合ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに存在するヌクレオチドのパーセンテージとして表すことができるか、または非結合３’ヒドロキシルに隣接する結合ヌクレオチドの数として提供することができる。例えば、３’末端は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド長の５０％未満を含むことができる。いくつかの実施形態では、３’末端は、いずれの非結合３’ヒドロキシル基も含まないが、プライマー伸長および／またはヌクレオチド重合によるヌクレオチドの付着部位として機能することができる任意の部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、「３’末端」という用語は、例えば、標的特異的プライマーを指す場合、３’末端に末端１０ヌクレオチド、末端５ヌクレオチド、末端４、３、２、またはそれより少ないヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、「３’末端」という用語は、標的特異的プライマーを指す場合、３’末端から１０ヌクレオチド位以下に位置するヌクレオチドを含むことができる。
【0258】
本明細書で使用される場合、「５’末端」、およびその派生語は、核酸分子、例えば、標的配列または増幅された標的配列、の末端を指し、遊離５’リン酸基またはその等価物を含む。いくつかの実施形態では、５’末端は、隣接するモノヌクレオチドペントース環の３’ヒドロキシルに結合していない５’リン酸基を含む。典型的には、５’末端は、５’リン酸に隣接して位置する１つ以上の結合ヌクレオチド、典型的には５’リン酸基を含むヌクレオチドに隣接して位置する３０ヌクレオチド、典型的には末端２０、およびさらにより典型的には末端１５ヌクレオチドを含む。１つ以上の結合ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに存在するヌクレオチドのパーセンテージとして表すことができるか、または５’リン酸に隣接する結合ヌクレオチドの数として提供することができる。例えば、５’末端は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド長の５０％未満であり得る。別の例示的な実施形態では、５’末端は、末端５’リン酸を含むヌクレオチドに隣接する約１５ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、５’末端は、いずれの非結合５’リン酸基も含まないが、３’ヒドロキシル基、または別の核酸分子の３’末端への付着部位として機能することができる任意の部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、「５’末端」という用語は、例えば、標的特異的プライマーを指す場合、５’末端に末端１０ヌクレオチド、末端５ヌクレオチド、末端４、３、２、またはそれより少ないヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、「５’末端」という用語は、標的特異的プライマーを指す場合、５’末端から１０位以下に位置するヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、標的特異的プライマーの５’末端は、切断不可能なヌクレオチドのみ、例えば、本明細書に開示される１つ以上の切断可能な基を含有しないヌクレオチド、または当業者によって容易に決定される切断可能なヌクレオチドを含むことができる。
【0259】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡバーコード」およびその派生語は、試料中の複数の増幅された標的配列を区別または分離する「鍵」として作用することができるアダプター内の固有の短い（例えば、６～１４個のヌクレオチド）核酸配列を指す。この開示の目的では、ＤＮＡバーコードは、アダプターのヌクレオチド配列に組み込むことができる。
【0260】
本明細書で使用される場合、「２ラウンドの標的特異的ハイブリダイゼーション」または「２ラウンドの標的特異的選択」という句およびそれらの派生語は、同じ標的配列が、２ラウンドの連続したハイブリダイゼーションベースの標的特異的選択に供される任意のプロセスを指し、標的配列は標的特異的配列にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションベースの標的特異的選択の各ラウンドは、標的特異的配列の少なくともいくつかの部分との複数の標的特異的ハイブリダイゼーションを含むことができる。例示的な一実施形態において、標的特異的選択のラウンドは、標的配列の第１の領域を含む第１の標的特異的ハイブリダイゼーションおよび標的配列の第２の領域を含む第２の標的特異的ハイブリダイゼーションを含む。第１および第２の領域は、同じであるか、または異なることができる。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションベースの標的特異的選択の各ラウンドは、２つの標的特異的オリゴヌクレオチド（例えば、フォワード標的特異的プライマーおよびリバース標的特異的プライマー）の使用を含むことができ、それによって、選択の各ラウンドは、２つの標的特異的ハイブリダイゼーションを含む。
【0261】
本明細書で使用される場合、「比較可能な最高最低融解温度」およびその派生語は、切断可能な基の切断後の単一アダプターまたは標的特異的プライマーにおける各核酸断片の融解温度（Ｔｍ）を指す。単一のアダプターまたは標的特異的プライマーによって生成された各核酸断片のハイブリダイゼーション温度を比較して、標的特異的プライマーまたはアダプターからの任意の核酸断片と標的配列とのハイブリダイゼーションを防ぐために必要とされる最高最低温度を決定する。最高ハイブリダイゼーション温度がわかると、アダプターまたは標的特異的プライマーを、例えば、プライマーの長さに沿って切断可能な基の位置を移動することによって操作して、各核酸断片に対して比較可能な最高最低融解温度を達成することが可能である。
【0262】
本明細書で使用される場合、「添加のみ」およびその派生語は、試薬および成分が第１または単一の反応混合物に加えられる一連のステップを指す。典型的には、一連のステップは、一連のステップを完了するために、第１の容器から第２の容器に反応混合物を取り出すことを除外する。添加のみのプロセスでは、反応混合物を含有する容器の外側での反応混合物の操作を除外する。典型的には、添加のみのプロセスは、自動化および高スループットに適している。
【0263】
本明細書で使用される場合、「合成すること」およびその派生語は、任意選択的に鋳型依存様式において、ポリメラーゼによるヌクレオチド重合を含む反応を指す。ポリメラーゼは、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、またはジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）から、伸長するオリゴヌクレオチド鎖の３’ヒドロキシルへのヌクレオシド一リン酸の転移を介して、オリゴヌクレオチドを合成する。本開示の目的では、合成することは、デオキシヌクレオシド三リン酸からのヌクレオシド一リン酸の転移を介した、ハイブリダイズしたアダプターまたは標的特異的プライマーの連続的な伸長を含む。
【0264】
本明細書で使用される場合、「重合条件」およびその派生語は、ヌクレオチド重合のために好適な条件を指す。典型的な実施形態では、かかるヌクレオチド重合は、ポリメラーゼによって触媒される。いくつかの実施形態では、重合条件は、合成された核酸配列の生成をもたらす、任意選択的に鋳型依存様式での、プライマー伸長のための条件を含む。いくつかの実施形態において、重合条件には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。典型的には、重合条件は、核酸を合成するのに十分であり、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含む反応混合物の使用を含む。重合条件は、標的特異的プライマーの標的配列へのアニーリングおよびポリメラーゼの存在下での鋳型依存様式でのプライマーの伸長のための条件を含むことができる。いくつかの実施形態において、重合条件は、熱サイクルを使用して行われる。加えて、重合条件は、２つの核酸鎖のアニーリング、伸長、および分離のステップが繰り返される複数のサイクルを含むことができる。典型的には、重合条件には、ＭｇＣｌ2などのカチオンが含まれる。核酸鎖を形成する１つ以上のヌクレオチドの重合は、ヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いに結合されることを含むが、代替的な結合が特定のヌクレオチド類似体の文脈において可能であり得る。
【0265】
本明細書で使用されるとき、「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含む、天然の核酸、人工の核酸、それらの類似体、またはそれらの組み合わせを指す。本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、これらに限定されないが、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合、例えば、３’－５’および２’－５’、逆結合、例えば、３’－３’および５’－５’、分岐構造、またはアナログ核酸によって結合した２’－デオキシリボヌクレオチド（核酸）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む、ヌクレオチドの一本鎖および二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、Ｈ+、ＮＨ4+、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ2+、Ｎａ+などの関連する対イオンを有する。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドのみ、リボヌクレオチドのみ、またはそれらのキメラ混合物で構成することができる。オリゴヌクレオチドは、核酸塩基および糖の類似体で構成することができる。ポリヌクレオチドは、典型的には、それらがより一般的には当該技術分野において頻繁にオリゴヌクレオチドと呼ばれる場合、数個のモノマー単位、例えば、５～４０個から、それらがより一般的には当該技術分野においてポリヌクレオチドと呼ばれる場合、数千個のモノマーヌクレオチド単位までのサイズの範囲であり、本開示の目的では、しかしながら、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの両方は、任意の好適な長さのものであり得る。別段に示されない限り、オリゴヌクレオチド配列が表されるときはいつでも、ヌクレオチドは左から右へ５’～３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｕ」はデオキシウリジンを示すことが理解されるであろう。モノヌクレオチドは、典型的には、１つのヌクレオチドの５’リン酸または同等の基と、その隣接するヌクレオチドの３’ヒドロキシルまたは同等の基との結合を介して、任意選択的にホスホジエステルまたは他の好適な結合を介して、オリゴヌクレオチドを形成するように反応するため、オリゴヌクレオチドは、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われる。
【0266】
本明細書で定義される場合、「ニックトランスレーション」という用語およびその変形は、核酸鎖内の１つ以上のニックまたはギャップの、核酸鎖に沿った新しい位置への転位を含む。いくつかの実施形態において、ニックは、二本鎖アダプターが二本鎖増幅標的配列に連結されるときに形成される。一例において、プライマーは、その５’末端に、二本鎖増幅標的配列に連結することができるリン酸基を含むことができ、アダプターと相補鎖における増幅標的配列との間にニックを残す。いくつかの実施形態において、ニックトランスレーションは、核酸鎖の３’末端へのニックの移動をもたらす。いくつかの実施形態において、ニックを移動することは、アダプター連結増幅標的配列でニックトランスレーション反応を行うことを含むことができる。いくつかの実施形態において、ニックトランスレーション反応は、結合された５’から３’へのＤＮＡ重合／分解反応、または結合された５’から３’へのＤＮＡ重合／鎖置換反応である。いくつかの実施形態において、ニックを移動することは、ＤＮＡ鎖伸長反応をニック部位で行うことを含むことができる。いくつかの実施形態において、ニックを移動することは、一本鎖エキソヌクレアーゼ反応をニックで行って、アダプター連結増幅標的配列の一本鎖部分を形成して、ＤＮＡ鎖伸長反応をアダプター連結増幅標的配列の一本鎖部分で新たな位置まで行うことを含むことができる。いくつかの実施形態において、ニックは、連結部位の反対側の核酸鎖に形成される。
【0267】
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号の方法を指し、クローニングまたは精製を伴わずに発現されたＲＮＡまたはｃＤＮＡの混合物中の関心対象のポリヌクレオチドのセグメントの濃度を増加させるための方法を記載する。目的のポリヌクレオチドを増幅するためのこのプロセスは、大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを目的の所望のポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ混合物に導入し、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下で正確な順序の熱サイクリングを行うことからなる。２つのプライマーは、目的の二本鎖ポリヌクレオチドのそれらのそれぞれの鎖と相補的である。増幅を行うために、混合物は変性され、プライマーは次いで目的分子のポリヌクレオチド内のそれらの相補的な配列にアニールされる。アニーリングに続いて、プライマーは、ポリメラーゼで伸長され、相補的な鎖の新しい対を形成する。変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼ伸長のステップは、高濃度の目的の所望のポリヌクレオチドの増幅されたセグメントを得るために、多数回繰り返すことができる（すなわち、変性、アニーリング、および伸長は、１つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」があり得る）。目的の所望のポリヌクレオチドの増幅されたセグメント（アンプリコン）の長さは、互いに対するプライマーの相対位置によって決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。プロセスを繰り返すことにより、方法は、「ＰＣＲ」と呼ばれる。目的のポリヌクレオチドの所望の増幅されたセグメントは、混合物において（濃度に関して）主要な核酸配列になるので、「ＰＣＲ増幅された」と言われる。本明細書で定義されるとき、複数の標的核酸分子を含む試料内の標的核酸分子は、ＰＣＲを介して増幅される。上記で考察される方法の変更において、標的核酸分子は、複数の異なるプライマー対、いくつかの事例では、関心対象の標的核酸分子あたり１つ以上のプライマー対、を使用してＰＣＲ増幅され、それにより多重ＰＣＲ反応を形成する。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、多重ＰＣＲ増幅は、複数の異なるプライマー対、典型的な事例では、標的核酸分子当たり１つのプライマー対を使用して行われる。多重ＰＣＲを使用すると、試料から複数の目的の核酸分子を同時に増幅して、増幅された標的配列を形成することが可能である。いくつかの異なる方法論（例えば、バイオアナライザーまたはｑＰＣＲによる定量化、標識プローブでのハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの組み込み、続いてアビジン酵素共役検出、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの32Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅された標的配列への組み込み）によって増幅された標的配列を検出することも可能である。任意のオリゴヌクレオチド配列は、適切なプライマーのセットを用いて増幅することができ、それにより、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ホルマリン固定したパラフィン包埋ＤＮＡ、細針生検、および様々な他の供給源からの標的核酸分子の増幅を可能にする。特に、本明細書に開示される多重ＰＣＲプロセスによって作成された増幅標的配列は、それ自体が後続のＰＣＲ増幅または様々な下流アッセイもしくは操作のための効率的な基質である。
【0268】
本明細書で定義されるとき、「多重増幅」とは、少なくとも１つの標的特異的プライマーを使用した試料内の２つ以上の標的配列の選択的かつ非ランダムな増幅を指す。いくつかの実施形態では、多重増幅は、標的配列のいくつかまたはすべてが単一の反応容器内で増幅されるように実施される。所定の多重増幅の「プレキシー」または「プレックス」は、その単一の多重増幅中に増幅される異なる標的特異的配列の数を指す。いくつかの実施形態において、プレックスは、約１２プレックス、２４プレックス、４８プレックス、７４プレックス、９６プレックス、１２０プレックス、１４４プレックス、１６８プレックス、１９２プレックス、２１６プレックス、２４０プレックス、２６４プレックス、２８８プレックス、３１２プレックス、３３６プレックス、３６０プレックス、３８４プレックス、または３９８プレックスである。いくつかの実施形態において、高度に多重化された増幅反応は、１２プレックスを超えるプロキシーを有する反応を含む。
【0269】
いくつかの実施形態において、増幅された標的配列は、ＰＣＲを介して形成される。標的特異的プライマーの伸長は、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼを使用して達成することができる。一実施形態において、ポリメラーゼは、任意のファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼ（ポリＩファミリーとしても知られている）または任意のファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、標的特異的プライマーを、非組換えＤＮＡポリメラーゼと比較して優れた精度および収量で伸長することができる、組換え形態である。例えば、ポリメラーゼは、高フィデリティポリメラーゼまたは熱安定性ポリメラーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーの伸長のための条件は、「ホットスタート」条件、例えば、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ高フィデリティ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのホットスタートポリメラーゼを含むことができる。「ホットスタート」ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼ、および周囲温度でＤＮＡポリメラーゼおよび３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する１つ以上の抗体を含む。いくつかの事例では、「ホットスタート」条件は、アプタマーを含むことができる。
【0270】
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来）、Ｔｆｉポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ由来）、Ｂｓｔポリメラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来）、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来）、Ｔｔｈポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来）、Ｐｏｗポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ由来）、Ｔｌｉポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来）、Ｕｌｔｉｍａポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来）、ＫＯＤポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来）、ＰｏｌＩおよびＩＩポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ由来）、ならびにＰａｂ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ由来）などの酵素である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ａｍｐｌｉｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、ＫＯＤポリメラーゼ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｋｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）、Ｋｌｅｎｔａｑ Ｌｏｎｇ Ａｃｃｕｒａｃｙ ポリメラーゼ（ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）、Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）、Ｏｍｎｉ ＫｌｅｎＴａｑ（商標）ＬＡ ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｈｅｍｏ Ｋｌｅｎｔａｑ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標）Ｐｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはＡｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの少なくとも１つのポリメラーゼを含むことができる。
【0271】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰの混合物は、ランダムまたは定義された順序で同時もしくは連続して適用される。いくつかの実施形態において、多重反応に存在するＤＮＡポリメラーゼの量は、対応する単重ＰＣＲ反応で使用されるＤＮＡポリメラーゼの量よりも有意に高い。本明細書で定義される場合、「有意に高い」という用語は、多重ＰＣＲ反応に存在するＤＮＡポリメラーゼが、対応する単重ＰＣＲ反応と比較して少なくとも３倍高い濃度を指す。
【0272】
いくつかの実施形態において、増幅反応は、例えば、ローリングサークル増幅によって開示されるような、増幅産物の環状化を含まない。
【0273】
本主題の実施は、別段に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内である有機化学、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、および生化学の従来の技法および説明を使用することができる。そのような従来の技法には、合成ポリヌクレオチドの調製、重合技法、ポリマー粒子の化学的および物理的分析、核酸ライブラリーの調製、核酸配列決定および分析などが含まれるが、これらに限定されない。適切な技法の特定の図は、本明細書で提供される実施例を参照することによって使用することができる。他の同等の従来の手順も使用することができる。このような従来の技法および説明は、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ），ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ａｌｌ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００８）、Ｍｅｒｋｕｓ，Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００９）、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｏｌｂｙ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｈｙｓｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２００３）などの標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。
【0274】
様々な例示的な実施形態によれば、上記の教示および／または例示的な実施形態のうちの任意の１つ以上のうちの１つ以上の特徴は、適切に構成および／またはプログラムされたハードウェアおよび／またはソフトウェア要素を使用して行われ、または実装され得る。実施形態がハードウェアおよび／またはソフトウェア要素を使用して実装されるかどうかの判定は、任意の要因、例えば、所望の計算速度、出力レベル、耐熱性、処理サイクル予算、入力データ速度、出力データ速度、メモリリソース、データバススピードなど、および他の設計または性能の制約に基づき得る。
【0275】
ハードウェア要素の例は、プロセッサ、マイクロプロセッサ、ローカルインターフェース回路を介して通信可能に連結した入力および／または出力（Ｉ／Ｏ）デバイス（または周辺機器）、回路要素（例えば、トランジスタ、抵抗器、コンデンサ、インダクタなど）、集積回路、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラム可能論理デバイス（ＰＬＤ）、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、論理ゲート、レジスタ、半導体デバイス、チップ、マイクロチップ、チップセットなどを含み得る。ローカルインターフェースは、例えば、ハードウェアコンポーネント間の適切な通信を可能にするために、１つ以上のバスまたは他の有線もしくは無線接続、制御器、バッファ（キャッシュ）、ドライバ、リピータ、および受信機などを含み得る。プロセッサは、ソフトウェア、特にメモリに格納されているソフトウェアを実行するためのハードウェアデバイスである。プロセッサは、任意のカスタムメイドまたは市販のプロセッサ、中央処理ユニット（ＣＰＵ）、コンピュータに関連付けられたいくつかのプロセッサのうちの補助プロセッサ、半導体ベースのマイクロプロセッサ（例えば、マイクロチップまたはチップセットの形態で）、マクロプロセッサ、またはソフトウェア命令を実行するための任意のデバイスであることができる。プロセッサはまた、分散型処理アーキテクチャを表すことができる。Ｉ／Ｏデバイスは、入力デバイス、例えば、キーボード、マウス、スキャナー、マイクロフォン、タッチスクリーン、様々な医療デバイスおよび／または実験機器のためのインターフェース、バーコード読み取り機、スタイラス、レーザ読み取り機、無線周波デバイス読み取り機などを含むことができる。さらに、Ｉ／Ｏデバイスはまた、出力デバイス、例えば、プリンタ、バーコードプリンタ、ディスプレイなどを含むことができる。最後に、Ｉ／Ｏデバイスはまた、入力および出力の両方として通信するデバイス、例えば、変調器／復調器（モデム；別のデバイス、システム、またはネットワークにアクセスするため）、無線周波（ＲＦ）トランシーバまたは他のトランシーバ、電話インターフェース、ブリッジ、ルータなどをさらに含むことができる。
【0276】
ソフトウェアの例は、ソフトウェアコンポーネント、プログラム、アプリケーション、コンピュータプログラム、アプリケーションプログラム、システムプログラム、マシンプログラム、オペレーティングシステムソフトウェア、ミドルウェア、ファームウェア、ソフトウェアモジュール、ルーチン、サブルーチン、関数、方法、手続き、ソフトウェアインターフェース、アプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩ）、命令セット、演算コード、コンピュータコード、コードセグメント、コンピュータコードセグメント、ワード、値、記号、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。メモリにおけるソフトウェアは、論理関数を実装するための実行可能な命令が順序付けられたリストを含み得る１つ以上の別個のプログラムを含み得る。メモリにおけるソフトウェアは、本教示に従ってデータ流を識別するためのシステム、ならびにシステムなどの他のコンピュータプログラムの実行を制御し得、スケジューリング、入出力制御、ファイルおよびデータ管理、メモリ管理、通信制御などを提供する任意の好適なカスタムメイドまたは市販のオペレーティングシステム（Ｏ／Ｓ）を含み得る。
【0277】
様々な例示的な実施形態によれば、上記の教示および／または例示的な実施形態のうちの任意の１つ以上のうちの１つ以上の特徴は、機械によって実行された場合、例示的な実施形態による方法および／または動作を機械が行わせ得る命令または命令のセットを格納し得る、適切に構成および／またはプログラムされた非一時的機械可読媒体または物品を使用して行われ、または実装され得る。そのような機械は、例えば、任意の好適な処理プラットフォーム、コンピューティングプラットフォーム、コンピューティングデバイス、処理デバイス、コンピューティングシステム、処理システム、コンピュータ、プロセッサ、科学機器または実験機器などを含み得、ハードウェアおよび／またはソフトウェアの任意の好適な組み合わせを使用して実装され得る。機械可読媒体または物品は、例えば、任意の好適な種類のメモリユニット、メモリデバイス、メモリ物品、メモリ媒体、記憶デバイス、記憶物品、記憶媒体、および／または記憶ユニット、例えば、メモリ、取り外し可能または取り外し不可能な媒体、消去可能または消去不可能な媒体、書き込み可能または書き換え可能な媒体、デジタルまたはアナログ媒体、ハードディスク、フロッピーディスク、読み出し専用コンパクトディスク（ＣＤ－ＲＯＭ）、記録可能コンパクトディスク（ＣＤ－Ｒ）、書き換え可能コンパクト（ＣＤ－ＲＷ）、光ディスク、磁気媒体、光磁気媒体、リムーバブルメモリカードまたはディスク、様々な種類のデジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、テープ、カセットなどを含み得、コンピュータにおける使用に好適な任意の媒体を含む。メモリは、揮発性メモリ素子（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ、例えば、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＤＲＡＭなど））および不揮発性メモリ素子（例えば、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＲＯＭ、フラッシュメモリ、ハードドライブ、テープ、ＣＤＲＯＭなど）のうちの任意の１つまたは組み合わせを含むことができる。さらに、メモリは、電気、磁気、光、および／または他の種類の格納媒体を組み込みことができる。メモリは、様々なコンポーネントが互いから離れて位置しているが、依然としてプロセッサによってアクセスされる分散型アーキテクチャを有することができる。命令は、任意の好適な種類のコード、例えば、任意の好適な高レベル、低レベル、オブジェクト指向、ビジュアル、コンパイル済み、および／または解釈されたプログラミング言語を使用して実装された、ソースコード、コンパイル済みコード、解釈されたコード、実行可能コード、静的コード、動的コード、暗号化されたコードなどを含み得る。
【0278】
様々な例示的な実施形態によると、上記の教示および／または例示的な実施形態のうちのいずれか１つ以上の１つ以上の特徴は、分散型、クラスター、リモート、またはクラウド計算リソースを少なくとも部分的に使用して実施または実装され得る。
【0279】
様々な例示的な実施形態によれば、上記の教示および／または例示的な実施形態のうちの任意の１つ以上のうちの１つ以上の特徴は、ソースプログラム、実行可能プログラム（目的コード）、スクリプト、または行われる命令のセットを含む任意の他のエンティティを使用して行われ、または実装され得る。ソースプログラムである場合、プログラムは、Ｏ／Ｓと通信して正常に動作するように、メモリ内に含まれるかまたは含まれない場合があるコンパイラ、アセンブラ、インタープリタ等を介して翻訳され得る。命令は、（ａ）データおよび方法のクラスを有するオブジェクト指向プログラミング言語、または（ｂ）例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｐａｓｃａｌ、Ｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｃｏｂｏｌ、Ｐｅｒｌ、Ｊａｖａ、およびＡｄａを含み得る、ルーチン、サブルーチン、および／または機能を有する手続き型プログラミング言語を使用して書き込まれ得る。
【0280】
様々な例示的な実施形態によれば、上記の例示的な実施形態のうちの１つ以上は、ユーザーインタフェースデバイス、コンピュータ可読記憶媒体、ローカルコンピュータシステム、またはリモートコンピュータシステムに、そのような例示的な実施形態によって生成、アクセス、または使用された任意の情報、信号、データ、および／または中間もしくは最終結果を伝達、表示、保存、印刷、または出力することを含み得る。そのような伝送、表示、格納、印刷、または出力された情報は、例えば、実行および報告、画像、表、チャート、グラフ、スプレッドシート、相関、配列、ならびにそれらの組み合わせの検索可能および／またはフィルタリング可能なリストの形式を取ることができる。
【0281】
様々な追加の例示的な実施形態は、上記の例示的な実施形態のうちの１つ以上に示される任意の全般的または具体的に記載される特性および／または成分および／または物質および／またはステップおよび／または操作条件を繰り返すこと、追加すること、または置換することによって引き出され得る。さらに、特に明記しない限り、ステップまたはアクションの目的が達成可能である限り、ステップの順序または特定のアクションを行うための順序は重要ではないことが理解されるべきである。さらに、特に明記しない限り、ステップまたはアクションの目的が達成可能である限り、２つ以上のステップまたはアクションを同時に実施することができる。さらに、特に明記しない限り、上記の例示的な実施形態のうちの１つで言及される任意の１つ以上の特性、成分、態様、ステップ、または他の特徴は、上記の例示的な実施形態のうちの他のいずれかの潜在的な任意選択的な特性、成分、態様、ステップ、または他の特徴であると、上記の例示的な実施形態のかかる他のいずれかの目的が達成可能である限り見なされ得る。
【0282】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーが同じ標的ＢＣＲ遺伝子の配列に対するものである標的ＢＣＲプライマーセットを含む。いくつかの実施形態において、免疫受容体は、重鎖アルファ、重鎖デルタ、重鎖イプシロン、重鎖ガンマ、重鎖ミュー、軽鎖カッパ、および軽鎖ラムダからなる群から選択される抗体受容体である。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、およびＴＣＲデルタからなる群から選択されるＴＣＲに対するプライマーセットと組み合わせることができる。
【0283】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、本明細書に概説される様々なパラメータまたは基準を有するように選択される標的ＢＣＲプライマーセットを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、長さが約１５個のヌクレオチド～約４０個のヌクレオチドの複数の標的特異的プライマー（例えば、Ｖ遺伝子ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３指向プライマー、Ｊ遺伝子指向プライマー、およびＣ遺伝子指向プライマー）であって、少なくとも２つ以上の以下の基準：切断可能な基が複数のプライマーのうちの実質的にすべての３’末端に位置する、切断可能な基が複数のプライマーのうちの実質的にすべての中央ヌクレオチドの近くまたはその付近に位置する、複数のプライマーのうちの実質的にすべてが５’末端に切断不可能なヌクレオチドのみを含む、複数のプライマーにおけるプライマーのうちの実質的にすべてに対して最小限のクロスハイブリダイゼーション、試料中に存在する非特異的配列に対する最小限のクロスハイブリダイゼーション、最小限の自己相補性、および複数のプライマーにおける実質的にすべてのプライマーの３’末端または５’末端での最小限のヌクレオチド配列重複、を有するプライマーを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、上記の基準のいずれか３、４、５、６、または７つを有するプライマーを含むことができる。
【0284】
いくつかの実施形態において、組成物は、以下の基準：切断可能な基が複数のプライマーのうちの実質的にすべての中央ヌクレオチドの近くまたはその付近に位置する、複数のプライマーのうちの実質的にすべてが５’末端に切断不可能なヌクレオチドのみを含む、複数のプライマーのうちの実質的にすべてが切断可能な基を含むプライマーの全長にわたってヌクレオチドのうちの２０％未満を有する、少なくとも１つのプライマーが試料中に存在する標的配列に対する全長にわたる相補的ヌクレオチド配列を有する、複数のプライマーにおけるプライマーのうちの実質的にすべてに対する最小限のクロスハイブリダイゼーション、試料中に存在する非特異的配列に対する最小限のクロスハイブリダイゼーション、および複数のプライマーにおける実質的にすべてのプライマーの３’末端または５’末端での最小限のヌクレオチド配列重複、のうちの２つ以上を有する、約１５個のヌクレオチド～約４０個のヌクレオチドの複数の標的特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、上記の基準のいずれか３、４、５、６、または７つを有するプライマーを含むことができる。
【0285】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物で使用される標的特異的プライマー（例えば、Ｖ遺伝子ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３指向プライマー、Ｊ遺伝子指向プライマー、ならびにＣ遺伝子指向プライマー）は、以下の基準：（１）プライマー配列内に２つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの末端の近くまたは末端に含まれ、そのうちの少なくとも１つが、プライマーの中心ヌクレオチド位置またはその付近に含まれる、（２）長さが、約１５～約４０個の塩基の長さ、（３）６０℃を超えて約７０℃までのＴm（４）試料中に存在する非標的配列に対して低い交差反応性を有する、（５）少なくとも最初の４個のヌクレオチド（３’から５’方向に）が、組成物に存在するいずれの他のプライマー内のいずれの配列に対しても非相補的である、および（６）プライマーによる増幅のために標的とされたいずれの他の配列内の少なくとも５個のヌクレオチドのいずれの連続した伸長に対しても非相補的、のうちのいずれか１つ以上を満たすように選択または設計される。いくつかの実施形態において、提供される組成物で使用される標的特異的プライマーは、上記の基準のいずれか２、３、４、５、または６つを満たすように選択または設計される。いくつかの実施形態において、２つ以上の修飾ヌクレオチドは、切断可能な基を有する。いくつかの実施形態において、複数の標的特異的プライマーの各々は、メチルグアニン、８－オキソ－グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、ウラシル、５－メチルシトシン、チミンダイマー、７－メチルグアノシン、８－オキソ－デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、または５－メチルシチジンの切断可能な基から選択される２つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。
【0286】
いくつかの実施形態において、組成物は、試料中の免疫レパートリーの分析のために提供され、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーの少なくとも１つのセットを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、同じ標的ＢＣＲに対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは標的ＢＣＲレパートリーを増幅させるように構成される。特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）を含むプライマーの単一セットが、組成物中に包含される。より特定の実施形態において、かかるセットは、ＩｇＨに対するプライマーを含む。さらに他の実施形態において、プライマーの少なくとも２つのセットが組成物中に包含され、セットは、ＩｇＨおよびＴＣＲベータに対するものである。
【0287】
特定の実施形態において、提供される組成物は、長さが約７０ヌクレオチドのＦＲ１領域にわたる配列に対する複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上を含む標的ＢＣＲプライマーセットを含む。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約５０個のヌクレオチドのＦＲ１領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約１８～約４５種類の異なるＦＲ１指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２２～約３５種類の異なるＦＲ１指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２５～約３５種類の異なるＦＲ１指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４０～約６５種類の異なるＦＲ１指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４８～約６０種類の異なるＦＲ１指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも５～約１５種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも２～約８種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、異なるＩｇアイソタイプ分子、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥに対する２種類以上のＣ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、各プライマーが異なるＩｇアイソタイプ分子のＣ遺伝子に対するものである少なくとも５種類のＣ遺伝子プライマーを含む。
【0288】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、それぞれ表３および表６～１０から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＣ遺伝子プライマーｉｉ）を含むプライマーの少なくとも１つのセットを含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、それぞれ表３から選択される約１５～約３５種類のプライマーおよび表６～１０から選択される約５～約２０種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、ｉ）表３から選択される約２２～約３５種類のプライマー、およびｉｉ）表６～１０の各々から選択される１つ以上のプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、それぞれ表３から選択される約４０～約６５種類のプライマーおよび表６～１０から選択される約５～約２０種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、ｉ）表３から選択される約４８～約６５種類のプライマー、およびｉｉ）表６～１０の各々から選択される１つ以上のプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。他の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ｉ）配列番号１３７～２８３から選択されるプライマー、およびｉｉ）配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択されるプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。他の実施形態において、提供される組成物は、ｉ）配列番号２８４～４３０から選択されるプライマー、およびｉｉ）配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択されるプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ｉ）配列番号１３７～２８３から選択されるプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択されるプライマーを含むか、またはｉ）配列番号２８４～４３０から選択されるプライマーおよびｉｉ）配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択されるプライマー、を含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。
【0289】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される約１５～約３５種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、ｉ）配列番号１３７～２８３から選択される約２２～約３５種類のプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４４８～４５９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４７２～４７９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８８～５１３から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５４０～５５１から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５６４～５８２から選択される少なくとも１つのプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される約１５～約３５種類のプライマーならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、ｉ）配列番号２８４～４３０から選択される約２２～約３５種類のプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４６０～４７１から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８０～４８７から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５１４～５３９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５５２～５６３から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５８３～６０１から選択される少なくとも１つのプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。
【0290】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される約４０～約６５種類のプライマーならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、ｉ）配列番号１３７～２８３から選択される約４８～約６０種類のプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４４８～４５９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４７２～４７９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８８～５１３から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５４０～５５１から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５６４～５８２から選択される少なくとも１つのプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される約４５～約６５種類のプライマーならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、ｉ）配列番号２８４～４３０から選択される約４８～約６０種類のプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４６０～４７１から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８０～４８７から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５１４～５３９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５５２～５６３から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５８３～６０１から選択される少なくとも１つのプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。
【0291】
いくつかの実施形態において、組成物は、試料中のＢＣＲレパートリーの分析のために提供され、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーの少なくとも１つのセットを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、同じ標的免疫受容体に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは標的ＢＣＲレパートリーを増幅させるように構成される。特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）を含むプライマーの単一セットが、組成物中に包含される。より特定の実施形態において、かかるセットは、ＩｇＨに対するプライマーを含む。さらに他の実施形態において、プライマーの少なくとも２つのセットが組成物中に包含され、セットは、ＩｇＨおよびＴＣＲベータに対するものである。
【0292】
特定の実施形態において、提供される組成物は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを含み、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さ約７０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、提供される組成物は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを含み、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さ約５０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約４０～約６０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５０～約８５種類の異なるＦＲ３指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５５～約８０種類の異なるＦＲ３指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約６２～約７５種類の異なるＦＲ３指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約６５、６６、６７、６８、６９、または７０種類の異なるＦＲ３指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも５～約１５種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。特定の実施形態において、標的免疫受容体プライマーセットは、少なくとも２～約８種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、異なるＩｇアイソタイプ分子、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥに対する２種類以上のＣ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、各プライマーが異なるＩｇアイソタイプ分子のＣ遺伝子に対するものである少なくとも５種類のＣ遺伝子プライマーを含む。
【0293】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、それぞれ表２および表６～１０から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＣ遺伝子プライマーｉｉ）を含むプライマーの少なくとも１つのセットを含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、それぞれ表２から選択される約５５～約８０種類のプライマーおよび表６～１０から選択される約５～約２０種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、ｉ）表２から選択される約６２～約７５種類のプライマー、およびｉｉ）表６～１０の各々から選択される１つ以上のプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。他の特定の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１～６８、ならびに４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択されるか、または配列番号６９～１３６、ならびに４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択されるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１～６８、ならびに４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択されるか、または配列番号６９～１３６、ならびに４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択されるプライマーを含む。
【0294】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマーならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、ｉ）配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４４８～４５９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４７２～４７９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８８～５１３から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５４０～５５１から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５６４～５８２から選択される少なくとも１つのプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマーならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される約５～約１５種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、ｉ）配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびにｉｉ）配列番号４６０～４７１から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号４８０～４８７から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５１４～５３９から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号５５２～５６３から選択される少なくとも１つのプライマー、および配列番号５８３～６０１から選択される少なくとも１つのプライマーを含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびに配列番号４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマー、ならびに配列番号４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。
【0295】
いくつかの実施形態において、組成物は、試料中のＢＣＲレパートリーの分析のために提供され、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）ＢＣＲコード配列のそれぞれの標的Ｃ遺伝子の少なくとも一部に対する１つ以上のＣ遺伝子プライマーの少なくとも１つのセットを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、同じ標的免疫受容体に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは標的ＢＣＲレパートリーを増幅させるように構成される。特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）を含むプライマーの単一セットが、組成物中に包含される。より特定の実施形態において、かかるセットは、ＩｇＨに対するプライマーを含む。さらに他の実施形態において、プライマーの少なくとも２つのセットが組成物中に包含され、セットは、ＩｇＨおよびＴＣＲベータに対するものである。
【0296】
特定の実施形態において、提供される組成物は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを含み、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さ約７０個のヌクレオチドのＦＲ２領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約５０個のヌクレオチドのＦＲ２領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５～約１５種類の異なるＦＲ２指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種類の異なるＦＲ２指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、１つ以上のＣ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも５～約１５種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも２～約８種類のＣ遺伝子プライマーを含み、各々は、標的Ｃ遺伝子の各々内の同じ５０個のヌクレオチド領域の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、異なるＩｇアイソタイプ分子、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥに対する２種類以上のＣ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、各プライマーが異なるＩｇアイソタイプ分子のＣ遺伝子に対するものである少なくとも５種類のＣ遺伝子プライマーを含む。
【0297】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、それぞれ表４および表６～１０から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＣ遺伝子プライマーｉｉ）を含むプライマーの少なくとも１つのセットを含む。特定の他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号４３１～４３７、ならびに４４８～４５９、４７２～４７９、４８８～５１３、５４０～５５１、および５６４～５８２から選択されるプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号４３１～４３７、ならびに４６０～４７１、４８０～４８７、５１４～５３９、５５２～５６３、および５８３～６０１から選択されるプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号４３１～４３７から選択される少なくとも５種類のプライマー、ならびに配列番号４４８、４７２、４８８、５４０、５４１、５６４、および５６５から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号４３１～４３７から選択される少なくとも５種類のプライマー、ならびに配列番号４６０、４８０、５１４、５５２、５５３、５８３、および５８４から選択される少なくとも１種類のプライマーを含む。
【0298】
いくつかの実施形態において、組成物は、試料中のＢＣＲレパートリーの分析のために提供され、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域３（ＦＲ３）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子の対多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーの少なくとも１つのセットを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、同じ標的免疫受容体に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは標的ＢＣＲレパートリーを増幅させるように構成される。特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）を含むプライマーの単一セットが、組成物中に包含される。より特定の実施形態において、かかるセットは、ＩｇＨに対するプライマーを含む。さらに他の実施形態において、プライマーの少なくとも２つのセットが組成物中に包含され、セットは、ＩｇＨおよびＴＣＲベータに対するものである。
【0299】
特定の実施形態において、提供される組成物は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを含み、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約５０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約７０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約４０～約６０個のヌクレオチドのＦＲ３領域にわたる配列に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５０～約８５種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５５～約８０種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約６２～約７５種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約６５、６６、６７、６８、６９、または約７０種類の異なるＦＲ３指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、複数のＪ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも２つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、２～約８つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約３～約６つの異なるＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２、３、４、５、６、７、または８つの異なるＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。
【0300】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、それぞれ表２および５から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＪ遺伝子プライマーｉｉ）を含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。他の特定の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１～６８および４３８～４４２から選択されるか、または配列番号６９～１３６および４４３～４４７から選択されるプライマーを含む。他の特定の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１～６８および４４３～４４７から選択されるか、または配列番号６９～１３６および４３８～４４２から選択されるプライマーを含む。
【0301】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１～６８から選択される少なくとも６０種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号６９～１３６から選択される少なくとも６０種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。
【0302】
いくつかの実施形態において、組成物は、試料中のＢＣＲレパートリーの分析のために提供され、ｉ）Ｖ遺伝子内のフレームワーク領域１（ＦＲ１）の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子の対多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーの少なくとも１つのセットを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、同じ標的免疫受容体に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは標的ＢＣＲレパートリーを増幅させるように構成される。特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）を含むプライマーの単一セットが、組成物中に包含される。より特定の実施形態において、かかるセットは、ＩｇＨに対するプライマーを含む。さらに他の実施形態において、プライマーの少なくとも２つのセットが組成物中に包含され、セットは、ＩｇＨおよびＴＣＲベータに対するものである。
【0303】
特定の実施形態において、提供される組成物は、長さが約７０個のヌクレオチドのＦＲ１領域にわたる配列に対する複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上を含む標的ＢＣＲプライマーセットを含む。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約８０個のヌクレオチドのＦＲ１領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約５０個のヌクレオチドのＦＲ１領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約１８～約４５種類の異なるＦＲ１指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２２～約３５種類の異なるＦＲ１指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２５～約３５種類の異なるＦＲ１指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４０～約６５種類の異なるＦＲ１指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４８～約６０種類の異なるＦＲ１指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、複数のＪ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも２つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、２～約８つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約３～約６つの異なるＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２、３、４、５、６、７、または８つの異なるＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。
【0304】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、それぞれ表３および５から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＪ遺伝子プライマーｉｉ）を含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。特定の他の実施形態において、本発明の組成物は、配列番号１３７～２８３および４３８～４４２から選択されるか、または配列番号２８４～４３０および４４３～４４７から選択されるプライマーを含む、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含む。他の特定の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３および４４３～４４７から選択されるか、または配列番号２８４～４３０および４３８～４４２から選択されるプライマーを含む。
【0305】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される約１５～３５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される約２２～３５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される約１５～３５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される約２２～３５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも２０または少なくとも２５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。
【0306】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される約４０～６５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される約４８～６０種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される約４０～６５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、提供される組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される約４８～６０種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号１３７～２８３から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号２８４～４３０から選択される少なくとも４０または少なくとも５０種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。
【0307】
いくつかの実施形態において、組成物は、試料中のＢＣＲレパートリーの分析のために提供され、ｉ）Ｖ遺伝子内のＦＲ２の少なくとも一部を含む少なくとも１つのＢＣＲコード配列の異なるＶ遺伝子のうちの大多数に対する複数のＶ遺伝子プライマー、およびｉｉ）それぞれの標的ＢＣＲコード配列の異なるＪ遺伝子の対多数に対する複数のＪ遺伝子プライマーの少なくとも１つのセットを含み、同じ標的免疫受容体配列に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは、ＩｇＨ、ＩｇＬ、およびＩｇＫからなる群から選択され、同じ標的免疫受容体に対するｉ）およびｉｉ）のプライマーの各セットは標的ＢＣＲレパートリーを増幅させるように構成される。特定の実施形態において、ｉ）およびｉｉ）を含むプライマーの単一セットが、組成物中に包含される。より特定の実施形態において、かかるセットは、ＩｇＨに対するプライマーを含む。さらに他の実施形態において、プライマーの少なくとも２つのセットが組成物中に包含され、セットは、ＩｇＨおよびＴＣＲベータに対するものである。
【0308】
特定の実施形態において、提供される組成物は、Ｖ遺伝子プライマーを含む標的ＢＣＲプライマーセットを含み、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約７０個のヌクレオチドのＦＲ２領域にわたる配列に対するものである。他の特定の実施形態において、複数のＶ遺伝子プライマーのうちの１つ以上は、長さが約５０個のヌクレオチドのＦＲ２領域にわたる配列に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５～約１５種類の異なるＦＲ２指向プライマーを含むＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約５、６、７、８、９、１０、１１、または１２種類の異なるＦＲ２指向プライマーのＶ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、複数のＪ遺伝子プライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、少なくとも２つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。特定の実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、２～約８つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約３～約６つの異なるＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約２、３、４、５、６、７、または８つの異なるＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。いくつかの実施形態において、標的ＢＣＲプライマーセットは、約４つのＪ遺伝子プライマーを含み、各々が、標的ポリヌクレオチド内のＪ遺伝子の少なくとも一部に対するものである。
【0309】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、それぞれ表４および５から選択されるＶ遺伝子プライマーｉ）およびＪ遺伝子プライマーｉｉ）を含む、プライマーの少なくとも１つのセットを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、配列番号４３１～４３７および４３８～４４２から選択されるか、または配列番号４３１～４３７および４４３～４４７から選択されるプライマーを含む、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号４３１～４３７から選択される少なくとも５種類のプライマー、および配列番号４３８～４４２から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、プライマーｉ）およびｉｉ）の少なくとも１つのセットを含み、配列番号４３１～４３７から選択される少なくとも５種類のプライマー、および配列番号４４３～４４７から選択される少なくとも２種類のプライマー、少なくとも３種類のプライマー、または少なくとも４種類のプライマーを含む。
【0310】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む複数の異なるプライマーは、単一の増幅反応で使用することができる。例えば、修飾ヌクレオチドを含む多重化プライマーを増幅反応混合物に加えることができ、各プライマー（またはプライマーのセット）は、核酸集団内の異なる再配列された標的核酸分子に選択的にハイブリダイズし、増幅を促進する。いくつかの実施形態において、標的特異的プライマーは、少なくとも１つのウラシルヌクレオチドを含むことができる。
【0311】
いくつかの実施形態において、多重増幅は、ＰＣＲを使用して、設定された温度の設定された時間での変性ステップ、プライマーアニーリングステップ、およびポリメラーゼ伸長ステップのサイクルを使用して実施され得る。いくつかの実施形態において、約１２サイクル～約３０サイクルを使用して、多重増幅反応でアンプリコンライブラリーを生成する。いくつかの実施形態において、１３サイクル、１４サイクル、１５サイクル、１６サイクル、１７サイクル、１８サイクル、１９サイクル、好ましくは２０サイクル、２３サイクル、または２５サイクルを使用して、多重増幅反応でアンプリコンライブラリーを生成する。いくつかの実施形態において、１７～２５サイクルを使用して、多重増幅反応でアンプリコンライブラリーを生成する。
【0312】
いくつかの実施形態において、増幅反応は、単一反応相内で（例えば、単一のウェルまたはチューブ内の同じ増幅反応混合物内で）並行して行われる。いくつかの事例では、増幅反応は、意図されたアンプリコン産物、ならびにプライマーダイマーなどの、意図されず、望ましくない、非特異的な増幅アーチファクトの両方を含む産物の混合物を生成し得る。増幅後、反応は、過剰の組み込まれていないプライマーおよび増幅アーチファクト内の修飾ヌクレオチドのヌクレオチド結合を選択的に切断するか、またはさもなければ選択的に破壊する任意の適切な薬剤で、特定の増幅産物を切断または破壊することなく処理される。例えば、プライマーは、ＵＮＧ／ＵＤＧ（任意選択的に熱および／またはアルカリを用いて）を使用して選択的に切断することができるウラシル含有核酸塩基を含むことができる。いくつかの実施形態において、プライマーは、ＵＮＧおよびＦｐｇを使用して選択的に切断することができるウラシル含有ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、切断処理は、ジチオールの選択的切断のための酸化条件への曝露、ＲＮＡ特異的部分（例えば、リボース糖など）を含む修飾ヌクレオチドの選択的切断のためのＲＮアーゼＨによる処理などを含む。この切断処理は、元の増幅プライマーおよび非特異的増幅産物を、それぞれ比較的少数のヌクレオチドを含む小さな核酸断片に効果的に断片化することができる。かかる断片は、通常、高温でさらなる増幅を促進することができない。かかる断片はまた、当技術分野で知られている様々な増幅後クリーンアップ手順（例えば、スピンカラム、ＮａＥｔＯＨ沈殿など）を介して反応プールから比較的容易に除去することができる。
【0313】
いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドのヌクレオチド結合の切断または他の選択的破壊後の増幅産物は、任意選択的に処理されて、５’末端にリン酸を有する増幅産物を生成する。いくつかの実施形態において、リン酸化処理は、５’リン酸化増幅産物を生成する酵素的操作を含む。一実施形態において、ポリメラーゼなどの酵素を使用して、５’リン酸化増幅産物を生成することができる。例えば、Ｔ４ポリメラーゼを使用して、５’リン酸化アンプリコン産物を調製することができる。クレノウを１つ以上の他の酵素と組み合わせて使用して、５’リン酸を有する増幅産物を生成することができる。いくつかの実施形態において、当技術分野で知られている他の酵素を使用して、５’リン酸基を有する増幅産物を調製することができる。例えば、ウラシルヌクレオチド含有増幅産物と酵素ＵＤＧ、Ｆｐｇ、およびＴ４ポリメラーゼとのインキュベーションを使用して、５’末端にリン酸を有する増幅産物を生成することができる。本明細書に具体的に記載されているもの以外の他の技術を適用して、リン酸化アンプリコンを生成することができることは、当業者には明らかであろう。本明細書に開示される方法、システム、キット、組成物、および装置を実施するために適用されるかかる変形および修正は、過度の実験に頼ることなく、本開示の範囲内であると見なされることを理解されたい。
【0314】
いくつかの実施形態において、プライマーは意図された（特定の）増幅産物に組み込まれ、これらのプライマーは、同様に切断または破壊され、特定の増幅産物内に「粘着末端」（例えば、５’または３’オーバーハング）の形成をもたらす。かかる「粘着末端」は、いくつかの方法で対処することができる。例えば、特定の増幅産物をクローニングする場合、オーバーハング領域は、クローニングベクターに導入されたオーバーハングを補完するように設計でき、これにより、平滑末端ライゲーションよりも迅速かつ効率的な粘着末端ライゲーションを可能する。代替的に、オーバーハングは修復する必要があり得る（いくつかの次世代配列決定法と同様）。かかる修復は、天然塩基のみからなるフォワードおよびリバース増幅プライマー（例えば、ＡおよびＰ１プライマーに対応）のみを使用する二次増幅反応のいずれかによって達成することができる。この手段では、それに続く増幅ラウンドによって二本鎖鋳型が再構築され、プライマー破壊前の元の鎖の完全な配列を有するアンプリコンの発生期の初期コピーを伴う。代替的に、粘着末端は、フォワードおよびリバースプライマーが鋳型にアニーリングされる、いくつかの形態のフィルインおよびライゲーション処理を使用して除去することができる。そしてポリメラーゼを用いてプライマーを伸長させ、次にリガーゼ、任意選択的に熱安定性リガーゼを利用して、得られた核酸鎖を接続することができる。これはまた、環状伸長ライゲーションなど、他の様々な反応経路によっても明らかに達成できた。いくつかの実施形態において、ライゲーションステップは、１つ以上のＤＮＡリガーゼを使用して行うことができる。
【0315】
いくつかの実施形態において、標的特異的プライマー対を使用して調製されるアンプリコンライブラリーは、エマルションＰＣＲ、ブリッジＰＣＲ、または等温増幅などの下流の豊富化アプリケーションに使用することができる。いくつかの実施形態において、アンプリコンライブラリーは、豊富化アプリケーションおよび配列決定アプリケーションで使用することができる。例えば、アンプリコンライブラリーは、任意の好適な次世代ＤＮＡ配列決定プラットフォームを含む、任意の好適なＤＮＡ配列決定プラットフォームを使用して配列決定することができる。いくつかの実施形態において、アンプリコンライブラリーは、Ｉｏｎ ＰＧＭシーケンサーまたはＩｏｎ ＧｅｎｅＳｔｕｄｉｏ Ｓ５シーケンサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して配列決定することができる。いくつかの実施形態において、ＰＧＭシーケンサーまたはＳ５シークエンサーは、パラメータまたはソフトウェアを適用するサーバーと接続して、増幅された標的核酸分子の配列を決定することができる。いくつかの実施形態において、アンプリコンライブラリーは、２４時間未満で調製、豊富化、および配列決定することができる。いくつかの実施形態において、アンプリコンライブラリーは、約９時間で調製、豊富化、および配列決定することができる。
【0316】
いくつかの実施形態において、アンプリコンライブラリーを生成するための方法は、免疫受容体遺伝子のｃＤＮＡを、Ｖ遺伝子特異的およびＣ遺伝子特異的プライマーを使用して増幅させてアンプリコンを生成することと、アンプリコンを入力ＤＮＡおよびプライマーから精製することと、アンプリコンをリン酸化することと、アダプターをリン酸化アンプリコンに連結することと、連結されたアンプリコンを精製することと、増幅されたアンプリコンをニックトランスレーションすることと、ニックトランスレーションされたアンプリコンを精製して、アンプリコンライブラリーを生成することと、を含むことができる。いくつかの実施形態において、アンプリコンライブラリーを生成するための方法は、免疫受容体遺伝子のｃＤＮＡを、Ｖ遺伝子特異的およびＪ遺伝子特異的プライマーを使用して増幅させてアンプリコンを生成することと、アンプリコンを入力ＤＮＡおよびプライマーから精製することと、アンプリコンをリン酸化することと、アダプターをリン酸化アンプリコンに連結することと、連結されたアンプリコンを精製することと、増幅されたアンプリコンをニックトランスレーションすることと、ニックトランスレーションされたアンプリコンを精製して、アンプリコンライブラリーを生成することと、を含むことができる。いくつかの実施形態において、追加のアンプリコンライブラリー操作は、再配列された免疫受容体遺伝子標的の増幅のステップ後に行って、アンプリコンを生成することができる。いくつかの実施形態において、追加の反応の任意の組み合わせは、任意の順序で実施することができ、精製すること、リン酸化すること、アダプターを連結すること、ニックトランスレーションすること、増幅および／または配列決定すること、を含むことができる。いくつかの実施形態において、これらの反応のいずれかは省略することができるか、または繰り返すことができる。方法が上記のステップのうちのいずれか１つ以上を繰り返すかまたは省略することができることは、当業者には容易に明らかであろう。ステップの順序および組み合わせを変更して必要とされるアンプリコンライブラリーを生成し得、したがって、提供される例示的な方法に限定されないことも当業者には明らかであろう。
【0317】
リン酸化アンプリコンをアダプターに結合して、ニックトランスレーション反応、それに続く下流増幅（例えば、鋳型調製）、または粒子（例えば、ビーズ）への付着、あるいはその両方を実施することができる。例えば、リン酸化アンプリコンに結合されるアダプターは、粒子に付着したオリゴヌクレオチド捕捉プライマーにアニーリングすることができ、プライマー伸長反応を実施して、粒子または表面に付着したアンプリコンの相補的コピーを生成することができ、それによってアンプリコンを表面または粒子に付着させることができる。アダプターは、１つ以上の増幅プライマーハイブリダイゼーション部位、配列決定プライマーハイブリダイゼーション部位、バーコード配列、およびそれらの組み合わせを有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法によって調製されるアンプリコンは、１つ以上のＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）互換性アダプターに結合させて、アンプリコンライブラリーを構築することができる。かかる方法によって生成されるアンプリコンは、ライブラリー構築のための１つ以上のアダプターに結合させて、次世代配列決定プラットフォームと互換性を持たせることができる。例えば、本開示の教示によって生成されるアンプリコンは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ライブラリーキット２．０またはＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ライブラリーキットプラス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で提供されるアダプターに取り付けることができる。
【0318】
いくつかの実施形態において、免疫受容体ｃＤＮＡまたは再配列されたｇＤＮＡの増幅は、５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉマスターミックスを使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉマスターミックスは、グリセロール、ｄＮＴＰ、およびＰｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティなどのＤＮＡポリメラーゼを含むことができる。いくつかの実施形態において、５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉマスターミックスは、保存剤、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、トリス－硫酸、および／または硫酸アンモニウムのうちの少なくとも１つをさらに含むことができる。
【0319】
いくつかの実施形態において、免疫受容体再配列ｇＤＮＡ多重増幅反応は、標的における増幅、増幅収量、および／または生産的配列決定読み取りの割合を改善する少なくとも１つのＰＣＲ添加剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＰＣＲ添加剤は、塩化カリウムまたは追加のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ添加剤としてのｄＮＴＰは、ｄＮＴＰの等モル混合物である。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ添加剤としてのｄＮＴＰ混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの等モル混合物である。いくつかの実施形態において、約０．２ｍＭ～約５．０ｍＭのｄＮＴＰが、多重増幅反応に添加される。いくつかの実施形態において、再配列された免疫受容体ｇＤＮＡの増幅は、反応混合物中の５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉマスターミックスおよび追加の約０．２ｍＭ～約５．０ｍＭのｄＮＴＰを使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、再配列された免疫受容体ｇＤＮＡの増幅は、反応混合物中の５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉマスターミックスおよび追加の約０．５ｍＭ～約４ｍＭ、約０．５ｍＭ～約３ｍＭ、約０．５ｍＭ～約２．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１．０ｍＭ、約０．７５ｍＭ～約１．２５ｍＭ、約１．０ｍＭ～約１．５ｍＭ、約１．０～約２．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～約３．０ｍＭ、約１．２５～約１．７５ｍＭ、約１．３～約１．８ｍＭ、約１．４ｍＭ～約１．７ｍＭ、または約１．５～約２．０ｍＭのｄＮＴＰを使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、再配列された免疫受容体ｇＤＮＡの増幅は、反応混合物中の５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉマスターミックスおよび追加の約０．２ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．８ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．８ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．２ｍＭ、約２．４ｍＭ、約２．６ｍＭ、約２．８ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．５ｍＭ、または約４．０ｍＭのｄＮＴＰを使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、約１０ｍＭ～約２００ｍＭの塩化カリウムが多重増幅反応に添加される。いくつかの実施形態において、再配列された免疫受容体ｇＤＮＡの増幅は、反応混合物中の５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉマスターミックスおよび追加の約１０ｍＭ～約２００ｍＭの塩化カリウムを使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、再配列された免疫受容体ｇＤＮＡの増幅は、反応混合物中の５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉマスターミックスおよび追加の約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約２０ｍＭ～約７０ｍＭ、約３０ｍＭ～約８０ｍＭ、約４０ｍＭ～約９０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約６０ｍＭ～約１２０ｍＭ、約８０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１００ｍＭ～約２００ｍＭの塩化カリウムを使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、再配列された免疫受容体ｇＤＮＡの増幅は、反応混合物中の５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉマスターミックスおよび追加の約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１８０ｍＭ、または約２００ｍＭの塩化カリウムを使用して実施することができる。
【0320】
いくつかの実施形態において、アンプリコンのリン酸化は、ＦｕＰａ試薬を使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、ＦｕＰａ試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、少なくとも１つのウラシル切断または修飾酵素、および／または保存緩衝液を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＦｕＰａ試薬は、保存剤および／または洗浄剤のうちの少なくとも１つをさらに含むことができる。
【0321】
いくつかの実施形態において、アンプリコンのリン酸化は、ＦｕＰａ試薬を使用して実施することができる。いくつかの実施形態において、ＦｕＰａ試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのウラシル切断または修飾酵素、抗体、および／または保存緩衝液を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＦｕＰａ試薬は、保存剤および／または洗浄剤のうちの少なくとも１つをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＤＮＡポリメラーゼおよび３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を周囲温度で阻害するために提供される。
【0322】
いくつかの実施形態において、本開示の教示によって生成されるアンプリコンライブラリーは、Ｉｏｎ Ｃｈｅｆ（商標）装置およびＩｏｎ Ｓ５（商標）配列決定システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む様々な下流アプリケーションで使用されるのに十分な収量である。
【0323】
ワイルドファイアＰＣＲおよびブリッジ増幅などのクローン増幅のための他の多くの技法、プラットフォーム、または方法が、本開示の増幅された標的配列と組み合わせて使用できることは、当業者には明らかであろう。本明細書に提供される条件のさらなる改良または最適化に関して、当業者は、クローン増幅ステップを行うことなく、核酸配列決定（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）システムまたはＩｏｎ Ｓ５（商標）システムまたはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）システムシーケンサー、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直接的に進めることができることも想像される。
【0324】
いくつかの実施形態において、クローン増幅される増幅標的配列のうちの少なくとも１つは、支持体または粒子に付着することができる。支持体は、任意の好適な材料で構成することができ、例えば、平面、回転楕円体、または微粒子を含む、任意の好適な形状を有することができる。いくつかの実施形態では、支持体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／０３０４９８２号に記載される足場ポリマー粒子である。
【0325】
いくつかの実施形態において、キットが、単一の反応において核酸分子の集団から複数の免疫受容体発現配列を増幅するために提供される。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の切断可能な基を複数の標的特異的プライマー対、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰの混合物、および少なくとも１つの切断試薬を含む。一実施形態において、切断可能な基は、８－オキソ－デオキシグアノシン、デオキシウリジン、またはブロモデオキシウリジンである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの切断試薬には、ＲＮアーゼＨ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、Ｆｐｇ、またはアルカリが含まれる。一実施形態において、切断試薬は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼである。いくつかの実施形態において、キットは、単一の反応チャンバーまたは容器において多重ＰＣＲを行うために提供される。いくつかの実施形態において、キットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼの濃度は、単一のＰＣＲ反応と比較して、３倍過剰に存在する。いくつかの実施形態において、最終濃度の各標的特異的プライマー対は、約５ｎＭ～約２０００ｎＭで存在する。いくつかの実施形態において、最終濃度の各標的特異的プライマー対は、約２５ｎＭ～約５０ｎＭまたは約１００ｎＭ～約８００ｎＭで存在する。いくつかの実施形態において、最終濃度の各標的特異的プライマー対は、約５０ｎＭ～約４００ｎＭまたは約５０ｎＭ～約２００ｎＭで存在する。いくつかの実施形態において、最終濃度の各標的特異的プライマー対は、約２００ｎＭまたは約４００ｎＭで存在する。いくつかの実施形態において、キットは、単一の反応チャンバー内の核酸分子の集団から、ＴＣＲベータ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、免疫グロブリン重鎖ガンマ、免疫グロブリン重鎖ミュー、免疫グロブリン重鎖アルファ、免疫グロブリン重鎖デルタ、免疫グロブリン重鎖イプシロン、免疫グロブリン軽鎖ラムダ、または免疫グロブリン軽鎖カッパからの免疫レパートリー発現配列の増幅を提供する。特定の実施形態において、提供されるキットは、試験キットである。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上のアダプター、バーコード、および／または抗体をさらに含む。
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表5-4】
【表5-5】
【表5-6】
【表5-7】
【表5-8】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10-1】
【表10-2】
【表11】
【表12-1】
【表12-2】
【0326】
様々な例示的な実施形態の以下の説明は、例示的かつ説明的なものにすぎず、いかなる方法においても限定的または制限的であると解釈されるべきではない。本教示の他の実施形態、特性、目的、および利点は、説明および付随する図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【0327】
本説明は、特定の例示的な実施形態を詳細に記載しているが、他の実施形態も可能であり、本発明の範囲内である。変形および修正は、明細書および図、ならびに明細書および図に記載された教示の実施、ならびに特許請求の範囲を考慮することから当業者には明らかであろう。
【実施例】
【0328】
提供される免疫レパートリー組成物は、限定されないが、発現されたＩｇＨ配列および再配列されたゲノムＩｇＨ配列のライブラリー調製ならびに配列決定のために設計された試薬を含む。一般に、試料（例えば、血液試料、選別された細胞試料、正常組織試料、腫瘍試料（例えば、新鮮、凍結、ＦＦＰＥ、様々なタイプ））から抽出されたＲＮＡは逆転写され、ｇＤＮＡが試料から抽出され、ライブラリーが生成され、鋳型が、例えば、Ｉｏｎ Ｃｈｅｆ（商標）またはＩｏｎ Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ（商標）２システムなどを使用して調製され、調製された鋳型が、次世代配列決定技術例えば、Ｉｏｎ Ｓ５（商標）システム、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）システムを使用して配列決定され、配列分析が、Ｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（商標）ソフトウェアを使用して行われた。生物学的試料からＲＮＡおよびゲノムＤＮＡを抽出および／または単離するために好適なキットは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃから市販されている。
【0329】
実施例１
末梢血白血球からの全ＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ ＶＩＬＯ（商標）マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡ（２５ｎｇまたは５０ｎｇ）を多重ＰＣＲに使用して、ＩｇＨおよび／またはＴＣＲベータＣＤＲ３ドメイン配列を増幅させた。１つの多重ＰＣＲでは、表２および５から選択されたフォワードおよびリバースプライマーのセットを、ＩｇＨ ｃＤＮＡのＶ遺伝子ＦＲ３領域からＪ遺伝子までの配列を増幅する際のプライマー対として使用した。別の多重ＰＣＲでは、これらの同じセットのＩｇＨフォワードおよびリバースＦＲ３－Ｊプライマーを、同じ反応におけるＩｇＨおよびＴＣＲベータのＦＲ３－Ｊ領域を増幅させる際に、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ（商標）ＴＣＲ Ｂｅｔａ－ＳＲアッセイ（ＲＮＡ）からのＴＣＲベータＦＲ３－Ｊプライマーパネルと組み合わせた。別の多重ＰＣＲでは、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ（商標）ＴＣＲベータ－ＳＲアッセイ、ＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＴＣＲベータｃＤＮＡのＦＲ３－Ｊ領域の配列を増幅させる際に使用した。例示的なＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３－Ｊ増幅反応において、多重プライマーセットは、６８種類の異なるＩＧＨＶフォワードプライマー配列番号６９～１３６および４種類の異なるＩＧＨＪリバースプライマー配列番号４４３～４４６を含んだ。
末梢血白血球からの全ＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ ＶＩＬＯ（商標）マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡ（２５ｎｇまたは５０ｎｇ）を多重ＰＣＲに使用して、ＩｇＨおよび／またはＴＣＲベータＣＤＲ３ドメイン配列を増幅させた。１つの多重ＰＣＲでは、表２および５から選択されたフォワードおよびリバースプライマーのセットを、ＩｇＨ ｃＤＮＡのＶ遺伝子ＦＲ３領域からＪ遺伝子までの配列を増幅する際のプライマー対として使用した。別の多重ＰＣＲでは、これらの同じセットのＩｇＨフォワードおよびリバースＦＲ３－Ｊプライマーを、同じ反応におけるＩｇＨおよびＴＣＲベータのＦＲ３－Ｊ領域を増幅させる際に、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ（商標）ＴＣＲ Ｂｅｔａ－ＳＲアッセイ（ＲＮＡ）からのＴＣＲベータＦＲ３－Ｊプライマーパネルと組み合わせた。別の多重ＰＣＲでは、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ（商標）ＴＣＲベータ－ＳＲアッセイ、ＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＴＣＲベータｃＤＮＡのＦＲ３－Ｊ領域の配列を増幅させる際に使用した。例示的なＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３－Ｊ増幅反応において、多重プライマーセットは、６８種類の異なるＩＧＨＶフォワードプライマー配列番号６９～１３６および４種類の異なるＩＧＨＪリバースプライマー配列番号４４３～４４６を含んだ。
【0330】
典型的には、多重増幅反応は以下のように行われた。９６ウェルＰＣＲプレートのシングルウェルに、１０マイクロリットルの調製したｃＤＮＡ（２５ｎｇまたは５０ｎｇ）、４マイクロリットルの２μＭフォワードおよびリバースプライマープール、４マイクロリットルの５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉ Ｍｉｘ（グリセロール、ｄＮＴＰ、およびＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＴａｑハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮｏ．１１３０４）を含むことができる増幅反応混合物）、および２マイクロリットルのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリー水を添加して、最終反応体積を２０マイクロリットルにした。ＩｇＨ＋ＴＣＲベータ（１プール）反応物を同様な方法で調製した。Ｏｎｃｏｍｉｎｅ（商標）ＴＣＲベータ－ＳＲアッセイ，ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って行った。
【0331】
ＰＣＲプレートを密封し、反応混合物を混合し、サーマルサイクラー（例えば、Ｖｅｒｉｔｉ（商標）９６ウェルサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にロードし、以下の温度プロファイルで実行してアンプリコンライブラリーを生成した。最初の保持段階は、９５℃で２分間行い、続いて９５℃で１５秒間の変性段階、６０℃で４５秒間のアニーリング段階、７２℃で４５秒間の伸長段階を約２０サイクル行った。サイクル実施後、７２℃で１０分間の最終伸長を行い、アンプリコンライブラリーを次に進めるまで１０℃で保持した。典型的には、約２０サイクルを使用して、アンプリコンライブラリーを生成する。いくつかの適用では、最大３０サイクルを使用することができる。
【0332】
アンプリコン試料を短時間遠心分離して内容物を収集して、次に進めた。アンプリコンライブラリー（約２０マイクロリットル）に、２マイクロリットルのＦｕＰａ試薬を添加した。反応混合物を密封し、完全に混合して均一性を確実にし、５０℃で１０分間、５５℃で１０分間、６０℃で２０分間インキュベートし、次に１０℃で最大１時間保持した。試料を短時間遠心分離して内容物を収集して、次に進めた。
【0333】
インキュベーション後、反応混合物はそのままライゲーションステップに進めた。そして、リン酸化アンプリコンライブラリーを含有する反応混合物を、２マイクロリットルのＩｏｎ Ｓｅｌｅｃｔバーコードアダプター、各５μＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４マイクロリットルのＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｐｌｕｓスイッチ溶液（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの構成要素として販売されている）、および最後に添加した２マイクロリットルのＤＮＡリガーゼ（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの構成要素として販売されている）とともに混合し、次いで２２℃で３０分間、６８℃で５分間、７２℃で５分間インキュベートし、次に１０℃で最大１時間保持した。試料を短時間遠心分離して内容物を収集して、次に進めた。
【0334】
インキュベーションステップ後、４５マイクロリットル（１．５×試料体積）の室温ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）をライゲーションしたＤＮＡに添加し、混合物を完全にピペッティングしてビーズ懸濁液をＤＮＡと混合した。混合物を室温で５分間インキュベートし、ＤｙｎａＭａｇ（商標）－９６サイドマグネット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、部品番号１２３３１Ｄ）などの磁気ラックに２分間設置した。溶液が澄明になった後、上清を廃棄した。プレートを磁気ラックから取り外さずに、１５０マイクロリットルの新たに調製した７０％エタノールを試料に導入し、磁気ラック上でチューブを静かに回転させながらインキュベートした。溶液が澄明になった後、ペレットを乱すことなく上清を廃棄した。２回目のエタノール洗浄を行い、上清を廃棄し、チューブをパルススピンし、ペレットを乱さないように注意深く残留エタノールを除去することによって、残存するエタノールをすべて除去した。ペレットを室温で約５分間風乾した。ライゲーションされたＤＮＡは、５０マイクロリットルの低ＴＥ緩衝液でビーズから溶離させた。
【0335】
溶離したライブラリーは、Ｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量キット（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、カタログ番号Ｎｏ．４４６８８０２）を製造業者の説明書に従って使用して定量した。定量後、ライブラリーを約２５ｐＭの濃度に希釈した。
【0336】
ライブラリーは２０ｐＭに基準化し、最終的なライブラリーの小分けを、鋳型の調製およびＩｏｎ Ｃｈｅｆ（商標）装置を製造業者の説明書に従って使用してチップへのロードに使用した。配列決定は、Ｉｏｎ Ｓ５（商標）システムでＩｏｎ５４０（商標）チップを製造業者の説明書に従って使用して行い、遺伝子配列分析は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｓｕｉｔｅ（商標）ソフトウェアを使用して行った。配列はＪ遺伝子プライマーの使用から生成されたため、本明細書に記載されるように、それらは、推測されるＪ遺伝子配列を配列読み取りに追加することを含むＪ遺伝子配列推測プロセスに供して拡張配列読み取りを作成し、拡張配列読み取りを参照配列に整列させ、生産的読み取りを特定した。加えて、生成されたすべての配列データは、本明細書で提供されるエラー特定および除去プログラムにさらに供された。
【0337】
１２ライブラリーの配列決定は、試料あたり平均６Ｍ個の読み取りをもたらした。図３に示されるように、ＩｇＨアッセイが単独で実施された場合、総読み取りの最大６６％が生産的であった。ＩｇＨ（ＢＣＲ）およびＴＣＲベータ（ＴＣＲ）アッセイを組み合わせた場合、読み取りの約１２％が生産的ＩｇＨ読み取りであり、読み取りの約５８％がＴＣＲベータの生産的読み取りだった。
【0338】
検出されたＢ細胞およびＴ細胞クローンの総数は、血液中のリンパ球の相対的な存在量に比例した。図４Ａに示されるように、ＩｇＨアッセイが単独で実行された場合、約４５，０００個のＢＣＲクローンが特定され、ＩｇＨおよびＴＣＲベータプライマーが組み合わされた場合、約３０，０００個のＢＣＲクローンが特定された。２つのアッセイ間で検出されたＢＣＲクローンの数のこの差は、ライブラリーが配列決定前に基準化され、ＢＣＲの読み取り深度が低下したためであると予想される。ＢＣＲおよびＴＣＲアッセイを１つのプールで組み合わせた場合と、２つの別々のプールで増幅した場合のクローン数の類似性は、組み合わせた増幅反応にプライマー干渉がないことを示す。ＩｇＨ（ＢＣＲ）およびＴＣＲベータ（ＴＣＲ）クローンの集団は、末梢血中のＢ細胞とＴ細胞の相対的な存在量に比例する（図４Ｂ）。Ｔリンパ球およびＢリンパ球の相対的な比率は、それぞれ６１～８５％および７～２３％の範囲であり得る（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７：１１５）。
【0339】
実施例２
表２のＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３プライマーおよび表５のＩｇＨ Ｊ遺伝子プライマーは、現在知られている発現されたかまたはｇＤＮＡのヒトＩｇＨ再配列のすべてを増幅するように設計された。多重ＰＣＲでは、表２および５から選択されたフォワードおよびリバースプライマーのプールを、ＩｇＨ ｃＤＮＡのＶ遺伝子ＦＲ３領域からＪ遺伝子までの配列を増幅する際のプライマー対として使用した。例示的なＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３－Ｊ増幅反応において、多重プライマーセットプールは、フォワードプライマー配列番号６９～１３６およびリバースプライマー配列番号４４３～４４６を含んだ。アッセイは、様々なヒト細胞および組織試料からのｃＤＮＡについて行った。
表２のＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３プライマーおよび表５のＩｇＨ Ｊ遺伝子プライマーは、現在知られている発現されたかまたはｇＤＮＡのヒトＩｇＨ再配列のすべてを増幅するように設計された。多重ＰＣＲでは、表２および５から選択されたフォワードおよびリバースプライマーのプールを、ＩｇＨ ｃＤＮＡのＶ遺伝子ＦＲ３領域からＪ遺伝子までの配列を増幅する際のプライマー対として使用した。例示的なＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３－Ｊ増幅反応において、多重プライマーセットプールは、フォワードプライマー配列番号６９～１３６およびリバースプライマー配列番号４４３～４４６を含んだ。アッセイは、様々なヒト細胞および組織試料からのｃＤＮＡについて行った。
【0340】
ヒト成人正常末梢血白血球からの全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ ＶＩＬＯ（商標）マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って使用して、ｃＤＮＡに逆転写した。９６ウェルＰＣＲプレートのシングルウェルに、１０マイクロリットルの調製ｃＤＮＡ（５０ｎｇ）、４マイクロリットルの２μＭフォワードおよびリバースプライマープール、４マイクロリットルの５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）ＨｉＦｉ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および１マイクロリットルのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリー水を添加して、最終反応体積を２０マイクロリットルにした。ＰＣＲプレートを密封し、反応混合物を混合し、サーマルサイクラー（例えば、Ｖｅｒｉｔｉ（商標）９６ウェルサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にロードし、以下の温度プロファイルで実行してアンプリコンライブラリーを生成しました。最初の保持段階は、９５℃で２分間行い、続いて９５℃で１５秒間の変性段階、６０℃で４５秒間のアニーリング段階、７２℃で４５秒間の伸長段階を約２０サイクル行った。サイクル実施後、７２℃で１０分間の最終伸長を行い、アンプリコンライブラリーを次に進めるまで１０℃で保持した。典型的には、約２０サイクルを使用して、アンプリコンライブラリーを生成する。いくつかの適用（例えば、多少のｃＤＮＡ出発物質、ＦＦＰＥ由来ＲＮＡなど）では、サイクル数を減少させるか（例えば、－３）、または増加させ得る（例えば、＋３、＋６、最大３０サイクル）。
【0341】
アンプリコン試料を短時間遠心分離して内容物を収集して、次に進めた。アンプリコンライブラリー（約２０マイクロリットル）に、２マイクロリットルのＦｕＰａ試薬を添加した。反応混合物を密封し、完全に混合して均一性を確実にし、５０℃で１０分間、５５℃で１０分間、６０℃で２０分間インキュベートし、次に１０℃で最大１時間保持した。ライゲーションステップに進む前に、試料を短時間遠心分離して内容物を収集した。リン酸化アンプリコンライブラリーを含有する反応混合物を、２マイクロリットルのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）デュアルバーコードアダプター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４マイクロリットルのＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｐｌｕｓスイッチ溶液（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの構成要素として販売されている）、および最後に添加した２マイクロリットルのＤＮＡリガーゼ（ＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの構成要素として販売されている）とともに混合し、次いで２２℃で３０分間、６８℃で５分間、７２℃で５分間インキュベートし、次に１０℃で最大１時間保持した。ライブラリー精製ステップに進む前に、試料を短時間遠心分離して内容物を収集した。
【0342】
ライゲーションステップのインキュベーション後、４５マイクロリットル（１．５×試料体積）の室温ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）をライゲーションしたＤＮＡに添加し、混合物を完全にピペッティングしてビーズ懸濁液をＤＮＡと混合した。混合物を室温で５分間インキュベートし、ＤｙｎａＭａｇ（商標）－９６サイドマグネット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、部品番号１２３３１Ｄ）などの磁気ラックに２分間設置した。溶液が澄明になった後、上清を廃棄した。プレートを磁気ラックから取り外さずに、１５０マイクロリットルの新たに調製した７０％エタノールを試料に導入し、磁気ラック上でチューブを静かに回転させながらインキュベートした。溶液が澄明になった後、ペレットを乱すことなく上清を廃棄した。２回目のエタノール洗浄を行い、上清を廃棄し、チューブをパルススピンし、ペレットを乱さないように注意深く残留エタノールを除去することによって、残存するエタノールをすべて除去した。ペレットを室温で約５分間風乾した。ライゲーションされたＤＮＡは、５０マイクロリットルの低ＴＥ緩衝液でビーズから溶離させた。
【0343】
溶離したライブラリーは、Ｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量キット（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、カタログ番号４４６８８０２）を製造業者の説明書に従って使用して定量した。定量後、ライブラリーを約２５ｐＭの濃度に希釈した。
【0344】
ライブラリーは２５ｐＭに基準化し、最終的なライブラリーの小分けを、鋳型の調製およびＩｏｎ Ｃｈｅｆ（商標）装置を製造業者の説明書に従って使用してチップへのロードに使用した。配列決定は、Ｉｏｎ Ｓ５（商標）システムでＩｏｎ５４０（商標）チップを製造業者の説明書に従って使用して行い、遺伝子配列分析は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｓｕｉｔｅ（商標）ソフトウェアを使用して行った。配列はＪ遺伝子プライマーの使用から生成されたため、本明細書に記載されるように、それらは、推測されるＪ遺伝子配列を配列読み取りに追加することを含むＪ遺伝子配列推測プロセスに供して拡張配列読み取りを作成し、拡張配列読み取りを参照配列に整列させ、生産的読み取りを特定した。加えて、生成されたすべての配列データは、本明細書で提供されるエラー特定および除去プログラムにさらに供された。
【0345】
開始試料として末梢血白血球ＲＮＡの４つの別々のチューブを使用したＩｇＨ ＦＲ３－Ｊアッセイからの例示的な結果が、表１１に示される。これらのアッセイの各々は、２～３Ｍ個の生配列読み取りを生じ、そのうち約７５％が生産的だった。クローン基準化シャノンエントロピーとも呼ばれる均一性は、試料内のクローン表現がどのくらい均一であるかを説明し、１．０に近いほど、クローン集団のサイズはより均一である。
【表13】
【0346】
全ＲＮＡは、ヒト細胞および組織試料（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．）から得られ、かかる試料中に一般的に存在するＢ細胞の量が異なる。ＲＮＡ試料には、単離されたＣＤ１９＋細胞、正常脾臓組織、末梢血白血球（ＰＢＬ）、骨髄、正常脳組織、肺腫瘍組織（ＦＦＰＥ）、扁桃腺（ＦＦＰＥ）、およびジャーカット細胞（Ｔ細胞株）から抽出されたものが含まれた。各全ＲＮＡ試料について、ｃＤＮＡを調製し、上記のように、配列番号６９～１３６および４４３～４４６を含むプライマーセットを使用して多重増幅に供した。ライブラリーを得られたアンプリコンから調製し、ライブラリーを上記のように配列決定した。様々な試料におけるアッセイ結果が表１２に示され、図５Ａ～５Ｇは、ＰＢＬ、ＣＤ１９＋細胞、扁桃腺ＦＦＰＥ、肺腫瘍ＦＦＰＥ、骨髄、脾臓、および脳ＲＮＡ試料について得られた読み取り長のヒストグラムを示す。ジャーカット細胞および正常な脳組織試料からのものを除いて、これらのアッセイの各々は、配列読み取りの約７０～８０％が生産的ＩｇＨ読み取りであるという結果をもたらした。ジャーカット細胞ＲＮＡ試料は、ＩｇＨを発現しないＴ細胞株であるという点で、陰性対照として機能した。
【表14】
【0347】
実施例３
表３のＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１プライマーおよび表６～１０のＩｇＨ Ｃ遺伝子プライマーは、現在知られている発現されたヒトＩｇＨ再配列のすべてを増幅するように設計された。ＩｇＨ ｃＤＮＡのＶ遺伝子ＦＲ１領域からＣ遺伝子までの配列を増幅するための様々なプライマーセットが、表３から選択されたフォワードプライマーおよび表６～１０から選択されたリバースプライマーを使用して生成された。プライマーセットのうちのいくつかは、ＩｇＨアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥの各々におけるＣ遺伝子に対する少なくとも１つのプライマーを含んだ。例示的なＦＲ１－Ｃプライマーセットパネルが、１マイクロモル濃度でセット内の各プライマーとともに表１３に記載される。
表３のＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１プライマーおよび表６～１０のＩｇＨ Ｃ遺伝子プライマーは、現在知られている発現されたヒトＩｇＨ再配列のすべてを増幅するように設計された。ＩｇＨ ｃＤＮＡのＶ遺伝子ＦＲ１領域からＣ遺伝子までの配列を増幅するための様々なプライマーセットが、表３から選択されたフォワードプライマーおよび表６～１０から選択されたリバースプライマーを使用して生成された。プライマーセットのうちのいくつかは、ＩｇＨアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥの各々におけるＣ遺伝子に対する少なくとも１つのプライマーを含んだ。例示的なＦＲ１－Ｃプライマーセットパネルが、１マイクロモル濃度でセット内の各プライマーとともに表１３に記載される。
【表15】
【0348】
ｃＤＮＡを、実施例２に記載されるように、ＰＢＬ全ＲＮＡから調製した。多重増幅反応は、５０ｎｇのＰＢＬ ｃＤＮＡおよび表１３のプライマーセットを使用して行い、ライブラリーは、得られたアンプリコンから調製し、ライブラリーは、実施例２に記載されるように配列決定した。図６は、例示的なプライマーセット１～７について得られた配列読み取り長の結果を示す。これらのプライマーセットからの例示的なアッセイ結果が表１４に示される。
【表16】
【0349】
提供される多重増幅および配列決定分析ワークフローにおいて表６～１０から選択される１つ以上のＣ遺伝子プライマーを使用したＢ細胞レパートリープロファイリングは、検出されたＩｇＨクローン配列のアイソタイプ特徴付けをもたらす。アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥの各々におけるＣ遺伝子に対する少なくとも１つのプライマーを含むプライマーセットの使用によって、試料におけるＢ細胞受容体レパートリーおよびクローン系統のすべてのアイソタイプが検出および特徴付けされる。図７Ａ～７Ｂは、上記のように、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１－Ｃ多重増幅反応（２５～５０ｎｇのｃＤＮＡ入力を用いる）および配列決定分析において表１３のプライマーセット８を使用して検出されたＰＢＬ試料の例示的なアイソタイプ利用の結果示す。図７の棒グラフは、アイソタイプ当たりの読み取り数（図７Ａ）およびアイソタイプ当たりのクローンおよび系統（図７Ｂ）によって報告された、ＰＢＬ試料内の全アイソタイプ表現の要約を示す。得られたアイソタイプ表現（ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥよりも高度に表現されるＩｇＡおよびＩｇＧ）は、ＰＢＬ ＲＮＡにおけるＩｇＡおよびＩｇＧアイソタイプのより高い発現が得られると予想される。
【0350】
本明細書に提供されるバイオインフォマティクスワークフローは、クローン系統の体細胞超変異を特定し、試料の体細胞超変異プロファイルを生成する。例えば、図８Ａ～８Ｂは、上記のように、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１－Ｃ多重増幅反応（２５～５０ｎｇのｃＤＮＡ入力を用いる）および配列分析において表１３のプライマーセット８を使用してアッセイされたＰＢＬ ＲＮＡ試料からの例示的なＳＭＨプロファイルを示す。図８Ａは、試料のすべてのアイソタイプについてＩｇＨ Ｖ遺伝子変異率のヒストグラムを示し、ＳＨＭを有さないクローンの予想される集団および最大約１５％のＳＨＭを有するクローンの分布を報告する。図８Ｂに示されるＳＭＨプロファイルは、低率のＳＨＭが予想されるナイーブＢ細胞アイソタイプである、アイソタイプＩｇＤにおけるＩｇＨ Ｖ遺伝子変異を表す。
【0351】
本明細書に提供される配列分析ワークフローは、例えば、アッセイ全体の配列深度の差による変動性を排除するのに役立てることができるダウンサンプリング分析を含み得る。かかるダウンサンプリング分析では、クローン分析の前に、配列読み取りが固定された読み取り深度までランダムに除去される。かかる分析では、ＰＢＬ ＲＮＡ試料を、２５～５０ｎｇのｃＤＮＡ入力および表１３のプライマーセット９、ならびに上記の配列決定ワークフローを使用して、ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１－Ｃ多重増幅反応でアッセイした。生成された配列データは、本明細書に提供されるエラー特定および除去ステップに供され、試料の一連の生産的読み取り（すなわち、生産的および救済された生産的読み取り）が特定された。選択された固定深度の各々へのダウンサンプリングは、生産的読み取りの全セットを開始点として使用して行い、次に読み取りの固定数をランダムに選択した。ダウンサンプリングは、固定深度：１０Ｋ、５０Ｋ、２５０Ｋ、５００Ｋ、７５０Ｋ、１Ｍ、１．５Ｍ、および２Ｍ読み取りまで行った。各ダウンサンプリング分析は生産的読み取りの全セットから開始されるため、より低いダウンサンプリング深度における読み取りは、必ずしもより高いダウンサンプリング深度の読み取りのものではない。クローン分析は、ダウンサンプリングされた各データセットの各々、ならびに全生産的読み取りセットで行った。ＩｇＨ配列読み取りへのダウンサンプリングの適用後の例示的なクローン分析の結果が図９に示される。図９のグラフは、検出されたクローンおよび系統の数、クローンと系統のシャノン多様性、ならびにダウンサンプリングされたデータセットの各々および試料での全生産的読み取りにおけるクローンおよび系統の均一性（各グラフの右端）を示す。ダウンサンプリング分析は、ユーザーが、特定の試料が飽和まで配列決定されるポイントを特定することを可能にし、ポイントは追加の読み取りが追加のクローンもしくは系統を特定しないか、または追加の多様性を検出されたレパートリーに追加しない地点を意味する。例えば、ダウンサンプリングは、ユーザーが、アッセイ間または同様の試料タイプを用いた将来のアッセイで、配列決定深度または多重化を洗練させることを可能にする。
【0352】
実施例４
２０例の対照プラスミドのライブラリー（表１５）を生成して様々なＩｇＨ配列のセットを表し、本明細書に提供されるアッセイおよびワークフローの性能を評価するために使用した。各対照プラスミドは、１１例の慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）のうちの１例または広範に中和するＨＩＶ－１抗体（ｂｎＡｂ）系統の９メンバーのうちの１つからのＩｇＨ ｃＤＮＡのＶＤＪ領域からＣ遺伝子ＣＨ１ドメイン（定常遺伝子の最初の約３００ｂｐ）までを含んだ（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ４９６：４６９－４７６）。対照プラスミドのライブラリーには、生殖細胞系列および変異型再配列を含む、Ｖ遺伝子多様性を最大化するすべてのＩｇＨアイソタイプおよびＣＬＬ再配列の代表を含んだ。各プラスミドは、全長が約６５０ｂｐのＩｇＨインサートを有した。対照プラスミドライブラリーのうちのいくつかのプラスミドは、プライマー結合を妨げるＦＲ１領域内のヌクレオチド変異（プラスミド１８）またはアイソタイプエラー（プラスミド１７および２０）を用いて設計された。対照ライブラリーはまた、配列分析ワークフローで非生産的読み取りとして除外されるべきであるフレーム外の非機能的な受容体配列を用いて生成されたプラスミド（プラスミド１９）を含んだ。
２０例の対照プラスミドのライブラリー（表１５）を生成して様々なＩｇＨ配列のセットを表し、本明細書に提供されるアッセイおよびワークフローの性能を評価するために使用した。各対照プラスミドは、１１例の慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）のうちの１例または広範に中和するＨＩＶ－１抗体（ｂｎＡｂ）系統の９メンバーのうちの１つからのＩｇＨ ｃＤＮＡのＶＤＪ領域からＣ遺伝子ＣＨ１ドメイン（定常遺伝子の最初の約３００ｂｐ）までを含んだ（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ４９６：４６９－４７６）。対照プラスミドのライブラリーには、生殖細胞系列および変異型再配列を含む、Ｖ遺伝子多様性を最大化するすべてのＩｇＨアイソタイプおよびＣＬＬ再配列の代表を含んだ。各プラスミドは、全長が約６５０ｂｐのＩｇＨインサートを有した。対照プラスミドライブラリーのうちのいくつかのプラスミドは、プライマー結合を妨げるＦＲ１領域内のヌクレオチド変異（プラスミド１８）またはアイソタイプエラー（プラスミド１７および２０）を用いて設計された。対照ライブラリーはまた、配列分析ワークフローで非生産的読み取りとして除外されるべきであるフレーム外の非機能的な受容体配列を用いて生成されたプラスミド（プラスミド１９）を含んだ。
【表17】
【0353】
アッセイおよびワークフローの検出限界を評価するために、１００ｎｇの白血球ｃＤＮＡのバックグラウンドに単一の既知の入力濃度でプールしたプラスミドを使用して、対照ライブラリーを調製した。プラスミド入力濃度は、１０ｐｇ～０．００００１ｐｇ（５Ｍコピー～約５コピーに相当）の範囲だった。対照プラスミドは、アッセイで使用する前に線形化（個別またはバルク）するか、ネイティブのままにした。プールしたライブラリーは、表１３のプライマーセット８またはプライマーセット９を各プライマー２００ｎＭで使用して多重反応で増幅させ、増幅および配列決定は、実施例３に記載されるように行った。生成された配列データは、本明細書に提供されるエラー特定および除去プログラムに供した。
【0354】
図１０に示されるように、１ｐＭの等モル濃度での２０例の対照プラスミドのプールにおけるアッセイの性能は、１桁以内で検出されたプラスミド頻度をもたらした。生産的配列読み取りをもたらさないように配列エラーを有して設計された対照プラスミド１７～２０は、アッセイで検出されなかった。
【0355】
対照プラスミド２のＩｇＨ ＶＤＪ－Ｃインサートを含む合成オリゴ（ＪＸ４３２２１８．１＿ＩＧＨＶ３－９＊０１＿９６．３＿ＩＧＨＡ１）を使用して、検出限界を評価し、アッセイおよび分析ワークフローの能力を示して、関心対象の単一クローンの特定および検出をした。対照合成オリゴを２５ｎｇのＰＢＬ全ＲＮＡ試料に様々な濃度で添加し、対照配列のクロノタイプ頻度を、フォワードプライマー配列番号６９～１３６およびリバースプライマー配列番号４４３～４４６を含むＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３－Ｊ多重プライマーセットを各プライマー２００ｎＭで用いて、多重反応を使用して決定し、増幅、配列決定、および分析を、上記および実施例２に記載されるように行った。対照オリゴの入力量は、０．１ｐｇ～０．００００１ｐｇの範囲だった。反復アッセイにおけるクローン検出頻度が表１６に示される。
【表18】
【0356】
他のクロノタイプ頻度検出アッセイでは、対照プラスミド２のＩｇＨ ＶＤＪ－Ｃインサートを含む合成オリゴ（ＪＸ４３２２１８．１＿ＩＧＨＶ３－９＊０１＿９６．３＿ＩＧＨＡ１）を、５０ｎｇのＰＢＬ全ＲＮＡ、１００ｎｇのＰＢＬ全ＲＮＡ、および１００ｎｇの骨髄（ＢＭ）全ＲＮＡに、０．１ｐｇ～０．００００００１ｐｇの入力量で添加した。多重増幅反応は、フォワードプライマー配列番号６９～１３６およびリバースプライマー配列番号４４３～４４６を含むＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ３－Ｊ多重プライマーセットを使用して行い、得られたアンプリコンの配列決定および分析を、実施例２に記載されるように行った。ＤＮＡアッセイでは、合成オリゴを、１μｇのＰＢＬ ｇＤＮＡに０．１ｐｇ～０．００００００１ｐｇの入力量で添加した。多重増幅反応は、フォワードプライマー配列番号６９～１３６およびリバースプライマー配列番号４４３～４４６を含む多重プライマーセットを使用して実施し、得られたアンプリコンの配列決定および分析を、実施例２に記載されるように実施した。かかるクローン頻度アッセイの検出結果の例示的な限界が表１７に示される。ＩｇＨ ＦＲ３－Ｊアッセイは、わずか１００ｎｇの入力ＰＢＬまたは骨髄ＲＮＡを使用して、対照ＣＬＬ配列を、単一のライブラリーで７．６×１０-6～１．０×１０-6の頻度で特定することができた。ＩｇＨ ＦＲ３－Ｊアッセイは、１μｇの入力ＰＢＬ ｇＤＮＡを使用して、対照ＣＬＬ配列を約５．２×１０-6で特定することができた。同じアッセイを、オリゴの入力量の範囲を用いて１μｇの骨髄ｇＤＮＡのバックグラウンドで行って、得られたライブラリーを、Ｉｏｎ Ｓ５（商標）システムおよびＩｏｎ ５４０（商標）チップを使用して、標的深度１０Ｍ読み取りまで配列決定した。骨髄バックグラウンドを用いたＩｇＨ ＦＲ３－ＪＤＮＡアッセイは、単一ライブラリーを使用して、対照ＣＬＬ配列を１０-5の頻度まで検出することができた。
【表19】
【0357】
ＩｇＨ Ｖ遺伝子ＦＲ１－Ｃプライマーセットを用いたクロノタイプ頻度検出アッセイでは、対照プラスミド１３のＩｇＨ ＶＤＪ－Ｃインサートを含む合成オリゴ（ＫＣ５７５８６２．１＿ＩＧＨＶ４－５９＊０１＿９６．９＿ＩＧＨＭ＊０１）を、５０ｎｇの骨髄（ＢＭ）に０．１ｐｇ～０．００００００１ｐｇの入力量で添加した。多重増幅反応を、表１３の多重プライマーセット９を使用して行い、得られたアンプリコンの配列決定および分析を、実施例２に記載されるように行った。かかるクローン頻度アッセイの検出結果の例示的な限界が表１８に示される。ＩｇＨ ＦＲ１－Ｃアッセイは、わずか５０ｎｇの入力骨髄ＲＮＡを使用して、対照ｂｎＡｂ配列を、単一のライブラリーで１．１×１０-4～８．７×１０-5の頻度で特定することができた。
【表20】
【0358】
体細胞超変異（ＳＨＭ）ならびに生殖細胞系列および変異ＣＬＬ ＩｇＨクローンのアイソタイプを定量化する、本明細書に提供されるアッセイおよびワークフローの能力が、ＣＬＬ由来のインサートを有する対照プラスミドを使用して評価された。表１５の選択されたプラスミド構築物を、ＰＢＬ全ＲＮＡバックグラウンドに添加した。多重増幅反応は、表１３の多重プライマーセット９を使用して行い、ライブラリーを調製して配列決定し、Ｉｏｎ Ｓ５（商標）システムおよびＩｏｎ ５３０（商標）チップを使用して標的深度１．５Ｍ読み取りまで配列決定されたライブラリーを用いて、配列を実施例２に記載されるように分析した。かかるＳＨＭ定量化アッセイにおける例示的な結果が表１９に示される。表１９は、アッセイへの入力に基づいた各プラスミドにおける予測されるＳＨＭステータス、ＳＨＭ頻度、およびアイソタイプ、ならびにアッセイ結果からの各プラスミドにおける観察されたＳＨＭステータス、ＳＨＭ頻度、およびアイソタイプを示す。示されるように、アッセイは、対照ＣＬＬパネルのＳＨＭおよびアイソタイプを正確に定量する。
【表21】
【0359】
検出限界、クロノタイプ頻度検出、ならびにＳＨＭおよびアイソタイプ定量化のかかる結果は、稀なＢＣＲクローンを特定および検出する提供されるアッセイおよび分析ワークフローの能力を実証する。この能力は、特定のクローン（またはクローンの小群）の頻度が追跡される縦断的な試験に十分適している。
【0360】
実施例５
試験コホート：Ｇｌａｓｇｏｗ大学で関節リウマチのためにメトトレキサートで治療された１８名の個体からの試料。コホートは、６名の完全応答者（ＣＤＡＩスコアリングガイドラインに従って、メトトレキサート治療開始後少なくとも１２ヶ月間の疾患寛解）、６名の部分的応答者（治療開始の１２か月以内に発赤を伴う疾患の寛解）、６名の非応答者（療法後に疾患の寛解なし）からなる。
試験コホート：Ｇｌａｓｇｏｗ大学で関節リウマチのためにメトトレキサートで治療された１８名の個体からの試料。コホートは、６名の完全応答者（ＣＤＡＩスコアリングガイドラインに従って、メトトレキサート治療開始後少なくとも１２ヶ月間の疾患寛解）、６名の部分的応答者（治療開始の１２か月以内に発赤を伴う疾患の寛解）、６名の非応答者（療法後に疾患の寛解なし）からなる。
【0361】
全ＲＮＡは、ベースライン（最初のメトトレキサート投与時）、治療後６か月および１２か月に末梢血白血球（ＰＢＬ）から抽出した。末梢血白血球からの２５ｎｇの全ＲＮＡを分析に使用した。一般的な出発物質には、末梢血白血球／バフィーコート、全血、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が含まれる。
【0362】
ＲＮＡは逆転写によってｃＤＮＡに変換し、続いてＯｎｃｏｍｉｎｅ ＩＧＨ－ＬＲアッセイを使用してｃＤＮＡの標的増幅を行った。他のアプローチでは、ＩＧＨのＶＤＪ－Ｃ領域の配列を提供する別のライブラリー調製およびＮＧＳベースのアプローチを使用することができる。ここでは、２５ｎｇの全ＲＮＡの変換に由来する２５ｎｇのｃＤＮＡを、ライブラリー調製のための入力として使用した。他の実施形態において、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ…２ｕｇの入力材料をライブラリー調製のために使用し得る。
【0363】
調製されたライブラリーを配列決定することは、ＮＧＳプラットフォームのために試料当たり１．５Ｍ読み取りの標的にＩｏｎ Ｇｅｎｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｓ５配列決定を使用して実行された。データは、Ｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ５．１２を介して分析された。他のアプローチでは、ライブラリー生成と互換性のある代替のＮＧＳ配列決定システムを使用し得、それに分析が続く。
【0364】
固有のＩＧＨ再配列（すなわちクローン）を特定する配列決定データの分析は、各クローンについて以下を決定することを含んだ。
ａ．各クローンの可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベル。可変遺伝子の配列を、一般的に使用される公開参照データベース（例えば、ＩＭＧＴ）内で最も一致する生殖細胞系列可変遺伝子の配列と比較することによって決定される。ＩｇＢＬＡＳＴなどの一般的なアライメントアプローチがこの作業のために使用され得る。
ｂ．各クローンのアイソタイプ同一性を決定すること。
ｃ．ＩＧＨ再配列の全セットの割合としての各クローンの頻度の計算。
ａ．各クローンの可変遺伝子部分内の体細胞超変異（ＳＨＭ）のレベル。可変遺伝子の配列を、一般的に使用される公開参照データベース（例えば、ＩＭＧＴ）内で最も一致する生殖細胞系列可変遺伝子の配列と比較することによって決定される。ＩｇＢＬＡＳＴなどの一般的なアライメントアプローチがこの作業のために使用され得る。
ｂ．各クローンのアイソタイプ同一性を決定すること。
ｃ．ＩＧＨ再配列の全セットの割合としての各クローンの頻度の計算。
【0365】
事前定義された閾値よりも高いＶ遺伝子変異頻度（ＳＨＭ頻度）を有するＩｇＭおよび／またはＩｇＤ発現クローンの総頻度を決定する。ここでは、８％のＳＨＭ閾値を使用した。他の例では、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、約１５％、約２０％の閾値を使用し得る。好ましい例では、約２％、約４％、約６％、または約８％の閾値が最適な閾値範囲を定義し得る。
【0366】
高ＳＨＭ ＩｇＤおよび／またはＩｇＭ発現Ｂ細胞の特定に続いて、試料中のかかる細胞の総頻度が決定された。個体の応答状態の予測は、かかるＩｇＭまたはＩｇＤ発現Ｂ細胞の総頻度が事前定義された閾値よりも高いかまたは低いかを決定することによって推定された。いくつかの実施形態において、０．００７の閾値が利用された。他の実施形態において、約．００１、約．００２、約．００３、約．００４、約．００５、約．００６、約．００７、約．００８、約．００９、約．０１、約．０２、約．０３、約．０４、約．０５、約．０６、約．０７、約．０８、約．０９、約０．１、またはそのあたりの閾値が使用される。いくつかの実施形態において、約．００５、約００６、約．００７、約．００８、約．００９、約．０１の値が使用される。いくつかの実施形態において、約．００６、約．００７、約．００８の値が好ましい。
【0367】
他の例では、上記方法の代替として、方法は以下を含み得る。
ａ．事前定義された閾値よりも高いＶ遺伝子変異頻度を有するＩｇＭまたはＩｇＤ発現クローンの総数を決定すること。いくつかの例では、８％の閾値が使用される。他の例では、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、約１５％、約２０％の閾値が使用され得る。いくつかの例では、約２％、約４％、約６％、約８％、または約１０％の閾値が最適な閾値範囲を定義し得る。
ｂ．ステップａの数を、試料で検出されたＩｇＭおよびＩｇＤ発現Ｂ細胞クローンの総数で除すること。
ｃ．ステップｂの結果が事前定義された閾値より高いかまたは低いかを決定することによって、個体の応答ステータスを予測する。いくつかの実施形態において、０．０１７の閾値が利用される。他の実施形態において、約．００８、約．００９、約．０１０、約．０１１、約．０１２、約．０１３、約．０１４、約．０１５、約．０１６、約．０１７、約．０１８、約．０１９、約．０２０、約０２１、約．０２２、約．０２３、約．０２４、約．０２５、約．０３、約．０４、約．０５、約．０６、約．０７、約．０８、約．０９、約０．１、またはそのあたりの閾値が利用される。いくつかの実施形態において、約．０１５、約．０１６、約．０１７、約．０１８、約．０１９、約．０２０の値が使用される。いくつかの実施形態において、約．０１６、約．０１７、約．０１８の値が好ましい。
ａ．事前定義された閾値よりも高いＶ遺伝子変異頻度を有するＩｇＭまたはＩｇＤ発現クローンの総数を決定すること。いくつかの例では、８％の閾値が使用される。他の例では、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、約１５％、約２０％の閾値が使用され得る。いくつかの例では、約２％、約４％、約６％、約８％、または約１０％の閾値が最適な閾値範囲を定義し得る。
ｂ．ステップａの数を、試料で検出されたＩｇＭおよびＩｇＤ発現Ｂ細胞クローンの総数で除すること。
ｃ．ステップｂの結果が事前定義された閾値より高いかまたは低いかを決定することによって、個体の応答ステータスを予測する。いくつかの実施形態において、０．０１７の閾値が利用される。他の実施形態において、約．００８、約．００９、約．０１０、約．０１１、約．０１２、約．０１３、約．０１４、約．０１５、約．０１６、約．０１７、約．０１８、約．０１９、約．０２０、約０２１、約．０２２、約．０２３、約．０２４、約．０２５、約．０３、約．０４、約．０５、約．０６、約．０７、約．０８、約．０９、約０．１、またはそのあたりの閾値が利用される。いくつかの実施形態において、約．０１５、約．０１６、約．０１７、約．０１８、約．０１９、約．０２０の値が使用される。いくつかの実施形態において、約．０１６、約．０１７、約．０１８の値が好ましい。
【0368】
メトトレキサートは、１２か月の治療の経過にわたって、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ発現Ｂ細胞の相対頻度を低下させる。メトトレキサートで治療された個体のＩＧＨレパートリーの連続的なモニタリングは、１２か月の治療の経過にわたって、ＩｇＭおよびＩｇＤを発現するＢ細胞と比較してＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥを発現するＢ細胞の頻度の漸進的な減少を明らかにした。ＲＡを有する未治療の個体は、高頻度のＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ発現Ｂ細胞を有する傾向がある。メトトレキサートは、ＩｇＭまたはＩｇＤを発現するＢ細胞と比較して、スイッチアイソタイプを発現するＢ細胞の頻度を低下させるようである（ｐ＝．００３、ウィルコクソン）。図１１を参照されたい。メトトレキサートは、ＩｇＭまたはＩｇＤを発現する病原性Ｂ細胞の頻度に最小限の影響を有し得る。その結果、病原性Ｂ細胞が主にＩｇＭまたはＩｇＤを発現する場合、療法は疾患を低下させるのに失敗し得る。かかる個体が病原性Ｂ細胞を保有し続け得ることを考えると、例えば、リツキシマブなどのＢ細胞枯渇療法が好ましいものであり得る。
【0369】
高度に変異したＩｇＭ／ＩｇＤ Ｂ細胞の頻度は、メトトレキサートに対する応答を予測する。図１１Ｂ：ＩｇＭまたはＩｇＤを発現する高度に変異した（＞８％のＶ遺伝子変異）Ｂ細胞の頻度を応答ステータスの関数として示す箱ひげ図での分析の結果を示す。メトトレキサートに対する応答者は、非応答者と比較して、高度に変異したＩｇＭ／ＩｇＤ発現Ｂ細胞の低い頻度を有する。高度に変異したＩｇＭ／ＩｇＤの頻度の上昇は、メトトレキサートに対する耐性と相関した。
【0370】
理論に拘束されることなく、自己免疫疾患、例えば、関節リウマチの検出および治療応答の予測は、アイソタイプの状況と組み合わせたＢ細胞免疫レパートリーの体細胞超変異の効果的な評価を必要し得ることが予測される。高度に変異したＩｇＭ／Ｄの頻度を用いて応答を予測するモデルにおけるＲＯＣ曲線分析（ＡＵＣ０．８４７）は、１００％の感度および８３％の特異性の性能を示した。この分析は、ＣＤＲ３特異的アミノ酸モチーフとは無関係だった。
【0371】
慢性可変免疫不全障害（ＣＶＩＤ）は、Ｂ細胞成熟およびアイソタイプスイッチに影響を与える生殖細胞系列にコードされた変異にしばしば由来する原発性免疫不全症である。ＣＶＩＤを有する個体は、関節リウマチ（約１５％の同時発生）および他の自己免疫疾患を発症するリスクが高い。
【0372】
ＩＧＨ－ＬＲ分析は、この研究コホート内の１名の対象における潜在的なＣＶＩＤの兆候が明らかにした。試料は、健康なドナーと比較して、少量のＩｇＧ発現Ｂ細胞、およびより少ない程度でＩｇＡ発現Ｂ細胞、ならびにＩｇＧ１発現Ｂ細胞内の低下したＳＨＭを示した。この結果は、原発性免疫不全障害、ならびにトランスレーショナルリサーチにおける自己免疫疾患および障害を評価するためのＩＧＨ－ＬＲアッセイの幅広い潜在的な有用性を裏付ける。
【0373】
実施例６
ＩＧＨ鎖配列決定データのクローン系統分析を適用して、６８例のＣＬＬ研究試料のコホートにおけるＣＳＲとＳＨＭを評価した。試料の重要なサブセットにおいて、進行中のＣＳＲおよびＳＨＭの証拠が認められた。
ＩＧＨ鎖配列決定データのクローン系統分析を適用して、６８例のＣＬＬ研究試料のコホートにおけるＣＳＲとＳＨＭを評価した。試料の重要なサブセットにおいて、進行中のＣＳＲおよびＳＨＭの証拠が認められた。
【0374】
ＩＧＨフレームワーク１領域およびアイソタイプ領域を標的とする多重プライマー（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ ＩＧＨ－ＬＲアッセイ、９種すべてのアイソタイプの検出）を、ＣＬＬを有する６８名の個体および脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）を有する４名の個体に由来する２５ｎｇの末梢血全ＲＮＡからのＩＧＨレパートリー配列決定のために使用した。クロノタイピングおよびクローン系統分析は、Ｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｅｒによって行った。クローン系統は、共有変数および結合遺伝子、同じＣＤＲ３長、ならびに８５％のＣＤＲ３ヌクレオチド最小類似性を有する固有の再配列のセットとして定義される。進行中のＣＳＲは、同じ系統内におけるＩｇＭ／ＩｇＤおよび少なくとも１つのスイッチ化アイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ）、またはスイッチ化アイソタイプの組み合わせの存在として定義された。進行中のＳＨＭは、他のクローン系統メンバーと比較して、ＶＤＪ領域配列内における異なるサブクローンの存在として定義された。
【0375】
６８例中１１例が、進行中のＣＳＲまたはＳＨＭの証拠を示した。進行中のＣＳＲまたはＳＨＭの証拠がない５７例で、可変遺伝子変異分析は、ｉ）ＳＨＭなし、ｉｉ）中度ＳＨＭ（平均２％変異）、またはｉｉｉ）高度ＳＨＭ（＞６％変異）のいずれかを有する３つの異なるサブグループの存在を明らかにした。４例のＳＭＺＬのうち３例は、進行中のＣＳＲまたはＳＨＭの証拠を示した。図１１を参照されたい。
【0376】
結果は、ＣＬＬ内の過去に認識されていない不均一性を示唆し、ＩＧＨＶ変異レベルと進行中のＳＨＭまたはＣＳＲの存在との組み合わせに基づいたＣＬＬのサブグループへの細分化を示唆する。図１１を参照されたい。追加の試験は、予後および治療目的のためのこの細分化の有用性をさらに描き出し得る。ＣＬＬを、ＩＧＨＶ遺伝子変異状態と、ＣＬＬクローン系統が最近もしくは進行中のクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）または体細胞超変異（ＳＨＭ）の証拠を示すか、との組み合わせに基づいて、４つのカテゴリーにサブグループ化することを提案する。
【0377】
進行中のＣＳＲは、ＩｇＭ／ＩｇＤ、および少なくとも１つの他のスイッチ化アイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ）またはスイッチ化アイソタイプの組み合わせを発現するメンバーを含むＣＬＬクローン系統として定義される。進行中のＳＨＭは、同じＣＬＬ系統の他のメンバーと比較してＶＤＪ領域配列内の異なるサブクローンの存在として定義される。図１２を参照されたい。
【0378】
進行中のＳＨＭまたはＣＳＲの証拠は、化学免疫療法およびＤＮＡ損傷を開始する薬剤またはＤＮＡ修復機構の活性を調節する薬剤、例えば、ＰＡＲＰ阻害剤の使用に関連する、機能的なＤＮＡエラー修復機構を示し得る。
【0379】
歴史的に、損傷修復に関与する遺伝子の数および構造的な複雑さのために、ＤＮＡ修復機構の機能を評価することは困難であった。例えば、ＡＴＭ遺伝子は、損傷修復に重要な役割を果たし、しばしばＣＬＬを無力化した。さらに、ＡＴＭ遺伝子の非活性化は、インビトロモデルにおいてクラススイッチ組換えを損なうことが示されている。（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２２１１８５３）しかし、この遺伝子のサイズが大きく、ＡＴＭ遺伝子修復経路が複雑なため、ＡＴＭ機能テストは日常的に行われない。
【0380】
試料の「進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし」または「進行中のＣＳＲまたはＳＨＭ」への細分化に続いて、さらにＩＧＨＶ変異頻度に基づいて細分化を行った。これによって、「進行中のＣＳＲもＳＨＭもなし」カテゴリー内のＣＬＬの３つのサブ集団として提案するものの存在が明らかにされた。最小限、本発明者らは、各サブグループは異なる臨床経過および薬剤感受性プロファイルを有し得ると仮定している。以下は、分析に基づいて提案されたＣＬＬの細分化である。
【0381】
クラスＩ：最悪の予後を有すると仮定される。がんを化学免疫療法に対して難治性にするＤＮＡ修復欠陥を有するＣＬＬが高められている。潜在的にＰＡＲＰ阻害剤療法に、より好適である。
【0382】
クラスＩＩ：不良な予後。ＤＮＡ修復欠陥を有するＣＬＬが高められている。潜在的にＰＡＲＰ阻害剤療法に、より好適である。
【0383】
クラスＩＩＩ：良好な予後。このグループのＣＬＬは、疾患の進行における持続的な抗原刺激の役割と一致する高いＳＨＭレベルを有する。仮説的には、進行までの時間が長い無痛性疾患として出現し得る。
【0384】
クラスＩＶ：最良の予後。進行中のＣＳＲまたはＳＨＭは、機能的なＤＮＡ修復機構を明らかにし、化学免疫療法に対する改善された応答性を示唆する。潜在的にＰＡＲＰ阻害剤療法にはあまり適さない。
【0385】
従来の２％および３％のＳＨＭカットオフが、ｉ）変異ＣＬＬ（ＭＣＬＬ）を分離する場合、３％超のＳＨＭおよびかかる個体は良好な予後を有すると考えられ、ｉｉ）２％～３％カットオフの中間ＣＬＬおよびかかる個体は、不均一な転帰を有すると考えられ、ｉｉｉ）２％未満のＳＨＭを有する未変異ＣＬＬ（ＵＣＬＬ）およびかかる個体は、不良な予後を有すると考えられ、提案される４つのサブグループに重ね合わされる。２～３％のＳＨＭサブセットは、グループＩＩとＩＶの混合からなることに注意されたい。グループＩＩは、一般的に不良な予後を有すると仮定され、グループＩＶは、良好な予後を有すると仮定される。＞３％のＳＨＭを有する試料は、グループＩＩＩおよびＩＶで高められており、最良の予後を有すると仮定される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】