ホーム > 特許ランキング > ＩＰＴＯＭＩＣＳ ＯＹ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-16
(54)【発明の名称】発光ハイブリダイゼーションアッセイ方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6818 20180101AFI20230309BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20230309BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230309BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230309BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230309BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6818 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
C12M1/00 A
C12N15/113 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022569298
(86)(22)【出願日】2021-01-20
(85)【翻訳文提出日】2022-09-08
(86)【国際出願番号】 FI2021050031
(87)【国際公開番号】W WO2021148717
(87)【国際公開日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】20207013
(32)【優先日】2020-01-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522288739
【氏名又は名称】イプトミックス オイ
【氏名又は名称原語表記】ＩＰＴＯＭＩＣＳ ＯＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】テロ ソウッカ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA27
4B029BB20
4B029CC01
4B029FA01
4B029FA12
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR56
4B063QS28
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、バイナリプローブシステムを使用する短い一本鎖核酸分析物を検出および／または定量するためのバイオアッセイ方法に関し、ここで、バイナリプローブの２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブ部分のうちの少なくとも１つは、一方の末端に部分的に二本鎖（自己相補的）ステム－ループ構造を有し、他方の末端に一本鎖オーバーハング配列領域を有し、ここで、バイナリプローブの両方の別個の一本鎖末端領域は、核酸分析物分子の配列中の隣接する相補的領域にハイブリダイズし、ステム－ループ構造および一本鎖オーバーハング配列領域を含むバイナリプローブの少なくとも１つの別個の部分は、ニック構造を形成する核酸分析物分子の配列中の末端領域にハイブリダイズする。バイオアッセイ法で使用されるバイナリプローブシステムは、ランタノイドキレート補完またはランタノイド標識をドナーとする共鳴エネルギー移動のいずれかの発光レポーター技術に基づいている。それにより、本方法は、時間分解蛍光分析による短い核酸分析物分子の検出および／または定量を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
バイナリプローブシステムを採用する、核酸分析物を検出および／または定量するためのバイオアッセイ方法であって、２つのオリゴヌクレオチドプローブを試料と接触させる工程を含み、
(a)第１のオリゴヌクレオチドプローブは、
二本鎖末端ステム－ループ構造と、
前記核酸分析物の第１の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、
を含み、
(b)第２のオリゴヌクレオチドプローブは、
前記核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列を含み、
前記核酸分析物の前記第１の領域は末端領域であり、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングは、前記核酸分析物の前記第１の領域にハイブリダイズし、
該ハイブリダイズは、前記核酸分析物の末端と前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の末端との間の第１のニック構造の形成をもたらし、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の末端は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステム－ループ構造の一部であり、
前記核酸分析物の前記第１および第２の領域は、前記核酸分析物の厳密に隣接する領域であり、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの第２の末端と前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の末端との間に第２のニック構造を形成する前記核酸分析物とハイブリダイズし、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合した前記核酸分析物の有無を検出し、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合した前記核酸分析物の存在により、試料中の分析物の存在を確認する、バイオアッセイ方法。
【請求項2】
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが二本鎖末端ステム－ループ構造を含み、前記核酸分析物の前記第２の領域が末端領域であり、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列が前記核酸分析物の前記第２の領域とハイブリダイズし、
前記ハイブリダイゼーションにより、前記核酸分析物の末端と前記二本鎖末端ステム－ループ構造を含む前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の末端との間に第３のニック構造が形成され、
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２の末端が前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステム－ループ構造の一部である、請求項１に記載のバイオアッセイ方法。
【請求項3】
(a)前記第１の末端は５’末端（５つのプライム末端）であり、前記第２の末端は３’末端（３つのプライム末端）である、または(b)前記第１の末端は３’末端（３つのプライム末端）であり、前記第２の末端は５’末端（５つのプライム末端）である、
請求項１または２に記載のバイオアッセイ方法。
【請求項4】
前記核酸分析物が、長さが１０～５０ヌクレオチド、より好ましくは１５～３０ヌクレオチド、最も好ましくは１６～２６ヌクレオチドの一本鎖核酸である、請求項１～３のいずれかに記載のバイオアッセイ方法。
【請求項5】
前記核酸分析物が、１７～２５ヌクレオチドの長さを有するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、請求項１～４のいずれかに記載のバイオアッセイ方法。
【請求項6】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが、ＤＮＡ(デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ(リボ核酸）またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～５のいずれかに記載のバイオアッセイ方法。
【請求項7】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが両方とも標識される、または、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが両方とも標識され、加えて、第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかが任意の種類の固体支持体に結合される、
請求項１～６のいずれかに記載のバイオアッセイ方法。
【請求項8】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが、蛍光共鳴エネルギー移動対で標識されており、(a)前記第１のオリゴヌクレオチドプローブは蛍光ドナーを含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブは蛍光アクセプタもしくはクエンチャーを含み、または
(b)前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが蛍光アクセプタもしくはクエンチャーを含み、かつ、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが蛍光ドナーを含み、
前記蛍光共鳴エネルギー移動対間の共鳴エネルギー移動が、前記核酸分析物の前記第１の領域への前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングのハイブリダイゼーション、および前記核酸分析物の前記第２の領域への前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列のハイブリダイゼーション、の両方のハイブリダイゼーション事象の発生の際に可能となる、
請求項１～７のいずれかに記載のバイオアッセイ方法。
【請求項9】
前記蛍光共鳴エネルギーの供与体がランタノイドイオンを含む発光ランタノイドキレートである、請求項８に記載のバイオアッセイ方法。
【請求項10】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが、切り替え可能なランタノイド発光標識システムで標識されており、(a)前記第１のオリゴヌクレオチドプローブはランタノイドイオンキャリアリガンドおよびランタノイドイオンを含み、かつ、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブはアンテナリガンドを含み、または
(b)前記第１のオリゴヌクレオチドプローブは、アンテナリガンドを含み、かつ、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブは、ランタノイドイオンキャリアリガンドおよびランタノイドイオンを含み、
前記切り替え可能なランタノイド発光標識システムの発光は、前記核酸分析物の前記第１の領域への前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列のハイブリダイゼーション、および前記核酸分析物の前記第２の領域への前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列のハイブリダイゼーション、の両方のハイブリダイゼーション事象の発生時にオンに切り替えられる、
請求項１～７のいずれかに記載のバイオアッセイ方法。
【請求項11】
前記ランタノイドイオンが、プラセオジム（III）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、ユウロピウム（III）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、エルビウム（III）、ツリウム（III）およびイッテルビウム（III）からなる群より選択される、請求項９～１０のいずれかに記載のバイオアッセイ方法。
【請求項12】
リガーゼ酵素を用いて、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブ、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記核酸分析物の間の前記ハイブリダイゼーション事象のいずれかの発生時に形成される前記第１、第２および第３のニック構造のいずれか１つまたは任意の組合せの場所に共有結合を形成する、請求項１～１１のいずれかに記載のバイオアッセイ方法。
【請求項13】
短い核酸分析物分子を検出および／または定量するためのキットであって、(a)二本鎖末端ステム－ループ構造と、一本鎖核酸分析物の第１の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
(b)二本鎖末端ステム－ループ構造と、前記一本鎖核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、を含む、第２のオリゴヌクレオチドプローブと、
を含み、
前記一本鎖核酸分析物の前記第１および第２の領域が、前記一本鎖核酸分析物の厳密に隣接する領域であり、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの末端における末端ヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの末端における末端ヌクレオチドは、前記プローブが前記一本鎖核酸分析物に結合されるとき、前記第１および第２オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの前記末端ヌクレオチド間に第１のニック構造を形成するために、前記一本鎖核酸分析物中の隣接ヌクレオチドに結合するように設計され、前記第１のニック構造は、相補的な鎖に結合された一対の隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を欠き、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングは、前記プローブが前記一本鎖核酸分析物に結合されるときに、
前記一本鎖核酸分析物の前記末端ヌクレオチドの一方は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステムループ構造の一部である末端において末端ヌクレオチドを有する第２のニック構造を形成し、前記一本鎖核酸分析物の前記末端ヌクレオチドのもう一方は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステムループ構造の一部である末端において末端ヌクレオチドを有する第３のニック構造を形成し、前記第２および第３のニック構造は相補鎖に結合した隣接ヌクレオチド対の間でホスホジエステル結合を欠いている、
ようにさらに設計される、キット。
【請求項14】
i）前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、前記一本鎖末端配列オーバーハングの末端に５’末端を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、前記一本鎖末端配列オーバーハングの末端に３’末端を含み、または、ii）前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、前記一本鎖末端配列オーバーハングの末端に３’末端を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、前記一本鎖末端配列オーバーハングの末端に５’末端を含む、
請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
前記一本鎖核酸分析物に結合した前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブを対照試料として含む、請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項16】
前記一本鎖核酸分析物が、１０～５０ヌクレオチド、より好ましくは１５～３０ヌクレオチド、最も好ましくは１６～２６ヌクレオチドの長さを有する、請求項１３～１５のいずれかに記載のキット。
【請求項17】
前記一本鎖核酸分析物がマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、好ましくは長さが１７～２５ヌクレオチドである、請求項１３～１６のいずれかに記載のキット。
【請求項18】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが両方とも標識される、または前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが両方とも標識され、加えて、前記第１または第２のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかが任意の種類の固体支持体に結合される、請求項１３～１７のいずれかに記載のキット。
【請求項19】
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブが、蛍光共鳴エネルギー移動対で標識されており、(a)前記第１のオリゴヌクレオチドプローブは蛍光ドナーを含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブは蛍光アクセプタもしくはクエンチャーを含み、または
(b)前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが蛍光アクセプタもしくはクエンチャーを含み、かつ、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが蛍光ドナーを含み、
前記蛍光共鳴エネルギー移動対間の共鳴エネルギー移動が、前記核酸分析物の前記第１の領域への前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングのハイブリダイゼーション、および前記核酸分析物の前記第２の領域への前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングのハイブリダイゼーション、の両方のハイブリダイゼーション事象の発生の際に可能となる、
請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、短い核酸分析物分子を検出および／または定量するための発光（ルミネセンス）ハイブリダイゼーションバイオアッセイ法に関する。
【背景技術】
【0002】
本発明の背景を明らかにするために本明細書で使用される刊行物および他のマテリアルは、特に、実施に関するさらなる詳細を提供する場合は、参照することによって援用される。
【0003】
様々な生物学的または臨床的サンプル、環境研究におけるもしくはは工業プロセスからのサンプルからの核酸などの生物学的に重要な化合物の濃度、またはそれらの活性またはそれらの生物学的効果またはそれらにより誘導されるその調節（モジュレーション）を分析するために、生体親和性結合反応または酵素触媒反応に基づく多くのアッセイが開発されてきた。これらのアッセイのいくつかは、特異的バイオアフィニティー認識反応に依存し、そこでは、例えば、天然の生物学的結合成分または人工的に生成された生物比結合化合物が標的化合物を認識するために使用される。上記人工的に製造された生体特異的結合化合物の実施例は、核酸分析物の配列断片に対するそれらの配列において相補的である合成オリゴヌクレオチドプローブである。生物特異的結合反応によって認識される標的化合物の濃度の直接測定に加えて、アッセイは、試料中に存在するか、または反応中に添加される他の化合物（例えば、生物学的に活性な酵素、生物学的分子に対する活性を有する化学化合物、酵素基質、酵素活性化剤、酵素阻害剤、酵素調節化合物）などの活性または活性の調節を間接的に測定することができる。
【0004】
一般に、バイオアフィニティー結合アッセイは、標識、すなわちレポーター分子、またはシグナル生成に関与する複数の標識の組み合わせに依存し、例えば、１または複数の生体特異的結合化合物と標的化合物との間に形成される錯体の量を可視化または定量する。標識は、生物特異的結合化合物に直接的または間接的に結合した化合物である。標識された生体特異的結合化合物の実施例は、末端骨格修飾または修飾核酸塩基を介して合成オリゴヌクレオチドに共有結合した標識部分を含むオリゴヌクレオチドプローブである。不均一なアッセイでは、分離工程（沈殿および遠心分離、ろ過、溶媒抽出、ゲルろ過もしくは他のクロマトグラフィー技術、または、例えばコーティングされたアッセイチューブ、スライドもしくは微粒子のようなプラスチック表面への親和性回収のような分離）は、一般に、生体特異的結合化合物または化合物および標的化合物によって形成される複合体中に存在する標識によって生成されるシグナルのみを測定し、したがって標的化合物の量を決定するために必要とされる。均一なアッセイでは、標識または標識のシグナルは、１または複数の生体特異的結合化合物と標的化合物との間の複合体の形成時にのみ調節または生成され、したがって、１または複数の標識によって生成されたシグナルの測定に基づいて標的化合物の量を決定するために分離工程は必要とされない。
【0005】
不均一および均一アッセイの両方において、試料中の標的化合物の濃度の決定は、一般に、未知の試料からのシグナルが比較される、既知の濃度を有する一連の標準、すなわちキャリブレーターからのシグナルの測定に基づく。種々のバイオフィニティー結合アッセイおよび種々の標識および検出技術が、例えば、Principles and Practices of Immunoassay, 2nd ed., edited by C. P. Price and D. J. Newman, Nature Publishing Group, 1997; The Immunoassay Handbook, 4th ed. David Wild, Elsevier Science, 2013; Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Designs and Protocols, edited by V. V. Didenko, Humana Press, 2006; および Principles and Applications of Molecular Diagnostics, edited by N. Rifai, A. R. Horvath and Carl. T. Wittwer, Elsevier Science, 2018でレビューされている。
【0006】
ハイブリダイゼーションアッセイ
生体特異的結合アッセイによる試料中のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）標的化合物の濃度の検出および定量分析は、一般に、相補的核酸配列の配列特異的ハイブリダイゼーションに基づく。ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、１または複数の標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸化合物中に存在する相補的配列断片または断片に結合する。使用される標識および検出技術に応じて、アッセイは、不均質または均質のいずれかであり得るが、核酸分析物についても、均質であるアッセイがしばしば好ましい。ある種の環境条件（例えば、温度、塩濃度、およびグリセリン、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドのような他の添加剤）での、ある種のオリゴヌクレオチドプローブの相補的標的核酸配列フラグメントに対する結合親和性は、一般に、溶融温度（Tm）として示され、オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸フラグメントとの間の最大の複合度の半分が達成される温度である。環境条件に加えて、オリゴヌクレオチドプローブの融解温度は、相補配列の長さおよびベース組成物によって定義される。より長い相補的な核酸塩基配列および配列中のグアニンおよびシトシン塩基のより高い存在量は、より高い融解温度をもたらすが、アデノシンおよびチミンのより高い存在量並びにより短い相補的配列およびオリゴヌクレオチドプローブと標的核酸配列との間の潜在的なミスマッチの存在は、より低い融解温度をもたらす。実際には、アッセイ感度を最大にするために、オリゴヌクレオチドプローブの標的核酸配列への効率的な複合体形成および安定な結合を可能にするために、アッセイ条件の温度より明らかに高い溶融温度が必要とされる。したがって、天然のデオキシリボ核酸プローブを３０～４０℃付近の温度で使用する場合には、通常、少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチドプローブ長が必要である。さらに、オリゴヌクレオチドプローブの相補的配列が長いほど、プローブは、完全に相補的な標的核酸と比較して、単一のヌクレオチド差（ミスマッチ）のみを有する核酸配列にも少なくとも弱く結合することができる可能性が高い。単一ヌクレオチドミスマッチを認識するためのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションの特異性は、ミスマッチがオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれかの末端に存在するかまたはそれに近い場合に最も弱いBMC Genomics 2007: 8: 373］。
生体特異的結合アッセイによる試料中のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）標的化合物の濃度の検出および定量分析は、一般に、相補的核酸配列の配列特異的ハイブリダイゼーションに基づく。ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、１または複数の標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸化合物中に存在する相補的配列断片または断片に結合する。使用される標識および検出技術に応じて、アッセイは、不均質または均質のいずれかであり得るが、核酸分析物についても、均質であるアッセイがしばしば好ましい。ある種の環境条件（例えば、温度、塩濃度、およびグリセリン、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドのような他の添加剤）での、ある種のオリゴヌクレオチドプローブの相補的標的核酸配列フラグメントに対する結合親和性は、一般に、溶融温度（Tm）として示され、オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸フラグメントとの間の最大の複合度の半分が達成される温度である。環境条件に加えて、オリゴヌクレオチドプローブの融解温度は、相補配列の長さおよびベース組成物によって定義される。より長い相補的な核酸塩基配列および配列中のグアニンおよびシトシン塩基のより高い存在量は、より高い融解温度をもたらすが、アデノシンおよびチミンのより高い存在量並びにより短い相補的配列およびオリゴヌクレオチドプローブと標的核酸配列との間の潜在的なミスマッチの存在は、より低い融解温度をもたらす。実際には、アッセイ感度を最大にするために、オリゴヌクレオチドプローブの標的核酸配列への効率的な複合体形成および安定な結合を可能にするために、アッセイ条件の温度より明らかに高い溶融温度が必要とされる。したがって、天然のデオキシリボ核酸プローブを３０～４０℃付近の温度で使用する場合には、通常、少なくとも１５塩基のオリゴヌクレオチドプローブ長が必要である。さらに、オリゴヌクレオチドプローブの相補的配列が長いほど、プローブは、完全に相補的な標的核酸と比較して、単一のヌクレオチド差（ミスマッチ）のみを有する核酸配列にも少なくとも弱く結合することができる可能性が高い。単一ヌクレオチドミスマッチを認識するためのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションの特異性は、ミスマッチがオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれかの末端に存在するかまたはそれに近い場合に最も弱いBMC Genomics 2007: 8: 373］。
【0007】
定量的５’－ヌクレアーゼベースのポリメラーゼ連鎖反応アッセイ(TaqMan; Applied Biosystems, Waltham, MA）は、核酸増幅の際に、蛍光部分およびクエンチャー部分の両方を含有する一本鎖自己消光オリゴヌクレオチドプローブが、標的核酸（nuelcid acid）へのハイブリダイゼーションに際して核酸ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ作用によって切断される核酸配列検出方法である［Curr. Opin. Biotechnol. 1998; 9: 43-48; and Clin. Chem. Lab. Med. 1998; 36: 255-269］。しかしながら、この技術は、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを利用する核酸増幅と組み合わせた場合の検出および定量にのみ適用可能である。
【0008】
分子ビーコンは、ステム－アンド－ループ構造を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである［Curr. Opin. Chem. Biol. 2004; 8: 547-553; Chemistry 2000; 6: 1107-1111; Nature Biotechnol. 1996; 14: 303-308］。ループは、標的配列に相補的な核酸プローブ配列を含み、ステムは、プローブ配列の両側に位置する相補的アーム配列のアニーリングによって形成される。蛍光（色素）部分は一方のアームの末端に共有結合し、クエンチャー（色素）部分は他方のアームの末端に共有結合している。相補的ステム配列は一緒にハイブリダイズして二本鎖構造を形成するので、蛍光部分とクエンチャー部分は近接しており、分子ビーコンはアッセイ温度で溶液中で遊離しているときに蛍光を発しない。しかしながら、それらが標的配列を含む相補的核酸鎖にハイブリダイズするとき、それらは、二本鎖ステムを開くコンホメーション変化を受け、蛍光部分とクエンチャー部分との間の距離を増大させ、分子ビーコンプローブが蛍光を発することを可能にする。相補的な標的配列が存在しない場合、分子ビーコンプローブは閉じたままであり、分子内クエンチングによる蛍光はない。しかしながら、分子ビーコンプローブの特異性は、単一のハイブリダイゼーション事象に依存し、したがってミスハイブリダイゼーションを起こしやすく、結合のハイブリダイゼーション条件または溶融曲線に基づく分析［Pharmacogenomics 2007; 8: 597-608］の慎重な最適化を必要とし、最小限の配列差で標的を区別する。
【0009】
バイナリプローブ
ほとんどの不均一ハイブリダイゼーションアッセイおよび多くの均質ハイブリダイゼーションアッセイ技術は、標的核酸分子の配列中の隣接する位置またはより遠い位置のいずれかに同時にハイブリダイズすることができる２つの別個オリゴヌクレオチドプローブの対による標的核酸分子の同時認識に基づく。不均一アッセイでは、これは、典型的には、標識オリゴヌクレオチドプローブおよび固相付着捕捉オリゴヌクレオチドプローブの存在を含み、前者は、標的核酸の存在下でのみ固相に連結される。これにより、標的核酸配列に結合していない標識プローブオリゴヌクレオチドを反応から除去する分離工程が可能となる［J. Clin. Lab. Anal. 1989; 3: 122-135］。均一な発光ハイブリダイゼーションアッセイでは、分子ビーコンなどの自己報告（セルフレポーティング）オリゴヌクレオチドプローブ［Nat. Biotechnol. 1998; 16: 49-53］、または異なるバイナリオリゴヌクレオチドプローブ［Chem. Rev. 2010; 110: 4709-4723］のいずれかを一般に利用することができる。
ほとんどの不均一ハイブリダイゼーションアッセイおよび多くの均質ハイブリダイゼーションアッセイ技術は、標的核酸分子の配列中の隣接する位置またはより遠い位置のいずれかに同時にハイブリダイズすることができる２つの別個オリゴヌクレオチドプローブの対による標的核酸分子の同時認識に基づく。不均一アッセイでは、これは、典型的には、標識オリゴヌクレオチドプローブおよび固相付着捕捉オリゴヌクレオチドプローブの存在を含み、前者は、標的核酸の存在下でのみ固相に連結される。これにより、標的核酸配列に結合していない標識プローブオリゴヌクレオチドを反応から除去する分離工程が可能となる［J. Clin. Lab. Anal. 1989; 3: 122-135］。均一な発光ハイブリダイゼーションアッセイでは、分子ビーコンなどの自己報告（セルフレポーティング）オリゴヌクレオチドプローブ［Nat. Biotechnol. 1998; 16: 49-53］、または異なるバイナリオリゴヌクレオチドプローブ［Chem. Rev. 2010; 110: 4709-4723］のいずれかを一般に利用することができる。
【0010】
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が標的の検出および定量に利用される均一なバイナリハイブリダイゼーションプローブベースのアッセイでは、標的核酸配列中の近くまたは隣接位置に結合する２つの別個の標識オリゴヌクレオチドプローブが必要である：１つのオリゴヌクレオチドプローブはドナーフルオロフォアで標識され、他方はアクセプタフルオロフォアまたはクエンチャー分子で標識される。ドナーおよびアクセプタ、またはドナーおよびクエンチャーは、共鳴エネルギー移動がドナーからアクセプタまたはクエンチャーに、それらが近接しているときに可能であるように、分光的に選択される［Can. J. Chem. (2015) 93: 389－398］。２つのプローブを同時に同じ標的核酸分子に結合させると、ドナー標識とアクセプタ標識との間の得られる短い距離は、ドナー蛍光の減少によるいかなる分離工程もなく検出することができ、アクセプタが蛍光性である場合には、エネルギー移動増感されたアクセプタ寛解の増加によっても、それらの間の蛍光共鳴エネルギー移動を可能にする。バイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイにおける標的検出の特異性は、ＲＮＡまたはＤＮＡリガーゼの触媒活性により、ハイブリダイズしたプローブをニック部位で共有結合的に結合させるライゲーション工程を加えることにより、さらに改善され得る[Nucleic Acids Res. 2001; 29: e70］。二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドにおけるニックの酵素的ライゲーション（連結）は、ニック部位周辺の反対側の鎖の完全に相補的な配列に厳密に特異的である。非ライゲーションプローブを解離するための、その後のよりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件と組み合わせたハイブリダイズしたプローブ対のライゲーションは、特にミスマッチがプローブの末端に位置する場合、プローブハイブリダイゼーションの弱い特異性を部分的に排除することができる。
【0011】
不均一および均一なバイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイの両方において、２つの別個のプローブの同一標的核酸分子への結合に対するシグナル生成またはシグナル調節の依存性は、原則として、同じ標的核酸分子上の隣接する位置への2つの別々のオリゴヌクレオチドプローブの同時のミスハイブリダイゼーションはありそうもないので、より特異的である。［J. Mol. Diagn. 2010; 12: 359-367］。これは、分子ビーコンプローブのような単一オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションに基づくシグナル生成技術よりも特異性において有望な利点を提供する。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドプローブの同一の標的核酸への結合は、標的核酸配列に対するさらなる要件およびアッセイ設計に対する挑戦を設定する。
【0012】
アッセイ条件での２つのオリゴヌクレオチドプローブの同じ標的分子への同時の安定した結合および効率的な複合体形成には、２つの別個オリゴヌクレオチドプローブの両方が、アッセイ条件に関して十分に高い溶融温度を有することを必要とする。これは、標的核酸配列の長さが、標的核酸配列中の近傍または隣接位置への２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブの同時ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さでなければならないので、２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブの最小長、およびこれらの方法によって検出することができる標的核酸分子の最小長を設定するであろう。しかしながら、これは、２つのオリゴヌクレオチドプローブのプローブ間のニック構造を形成する隣接する（すぐ隣り合う）位置へのハイブリダイゼーションの際の塩基スタッキング効果[Nucleic Acids Res. 2006; 34: 564-574］からの安定化の増強によって、および／またはいくつかのバイナリプローブアプローチで利用される２つのオリゴヌクレオチドプローブの協同的結合を介して、部分的に促進され得る［Chem. Rev. 2010: 4709-4723;米国特許第8,313,903号］。しかしながら、一般に、さらなる技術、例えば、ペプチド核酸［Science 1991; 254: 1497－500］およびロックド核酸［J. Am. Chem. Soc. 1998; 120: 13252 － 13253］のような核酸骨格類似体、修飾人工核酸塩基および副溝（minor groove）結合分子[Nucleic Acids Res. 2000; 28: 655－661］を使用し、オリゴヌクレオチドプローブに組み込んで、より短いプローブの安定性を高めることができる。
【0013】
複数のシグナル生成戦略は、バイナリプローブと組み合わせられており、蛍光共鳴エネルギー移動ベースの検出が広く使用されているが、標識成分に対するより厳密な近接要件を有する他の蛍光ベースの技術も実証されている。これらには、例えば、イオンキャリアキレートへの光捕集増感剤アンテナ配位によるランタノイド（ランタニド）キレートの補完［Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1990; 29: 1167-116; PCT Int. Appl. WO 2010/109065］、ピレンエキシマーおよびエキシプレックス形成、例えば、クエンチャー除去またはフルオロフォア活性化をもたらすプローブの化学的架橋、および、例えば、マラカイトグリーン（Malachite green）およびヘキスト（Hoechst）誘導体７のアプタマーベースのフルオロフォア向上が含まれる［Chem. Rev. 2010; 110: 4709-4723］。他の非蛍光技術としては、例えば、２つの半分からのデオキシリボキシムの形成（分割ＤＮＡ酵素）が挙げられる。
【0014】
バイナリプローブアプローチは、リガーゼ酵素による標的認識のさらなる特異性を提供するために、隣接して結合したオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションを組み合わせることによって、さらに強化され得る。例えば、ライゲーション（連結）された産物のQ－β－レプリカーゼに基づく増幅および複数のステム－ループ構造を含む２つの隣接してハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションを利用するバイナリプローブハイブリダイゼーションに基づく遺伝子検出が記載されている［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 5395-5400］。
【0015】
共鳴エネルギー移動
蛍光またはフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）は、近接して存在する２つの適切に選択された蛍光分子間の強い距離依存性（逆６乗）非放射エネルギー移動機構である［Ann. Physik 1948; 2: 55-75］。共鳴エネルギー移動（RET）は、ドナー（供与体）とアクセプタフルオロフォアがフェルスター半径（典型的な値４～７nm）内にあり、ドナー発光スペクトルとアクセプタ吸収スペクトルが重なるとき、実用的な効率で起こる。アクセプタは非蛍光性であってもよい。ＲＥＴは、典型的には、ドナー蛍光発光の減少またはドナーおよびアクセプタの近接に起因するアクセプタ蛍光発光強度の増加（感作アクセプタ発光として知られる) [Biochem. Spectroscopy 1995; 246: 300-334］を測定することによってモニターされる。非蛍光受容体（クエンチャーとして知られる）の場合、ドナー発光強度の変化がモニターされる。
蛍光またはフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）は、近接して存在する２つの適切に選択された蛍光分子間の強い距離依存性（逆６乗）非放射エネルギー移動機構である［Ann. Physik 1948; 2: 55-75］。共鳴エネルギー移動（RET）は、ドナー（供与体）とアクセプタフルオロフォアがフェルスター半径（典型的な値４～７nm）内にあり、ドナー発光スペクトルとアクセプタ吸収スペクトルが重なるとき、実用的な効率で起こる。アクセプタは非蛍光性であってもよい。ＲＥＴは、典型的には、ドナー蛍光発光の減少またはドナーおよびアクセプタの近接に起因するアクセプタ蛍光発光強度の増加（感作アクセプタ発光として知られる) [Biochem. Spectroscopy 1995; 246: 300-334］を測定することによってモニターされる。非蛍光受容体（クエンチャーとして知られる）の場合、ドナー発光強度の変化がモニターされる。
【0016】
ＦＲＥＴは広く採用されており、多くの用途で必須の技術であるが、臨床サンプルで使用される場合、従来の蛍光色素では厳しい性能制限がある［Clin. Chem. 1985; 31: 359-370］。ＦＲＥＴベースの生体分子センシングは、ＦＲＥＴドナーおよびアクセプタプローブ対（ＦＲＥＴプローブ対）の近さを検出することができる技術であり、種々の生体分子の検出のための異なるアッセイフォーマットで使用される。個々のＦＲＥＴプローブは、典型的には、単一または複数のドナーまたはアクセプタ部分のいずれかで標識された生体特異的結合化合物または他の認識部位（標的化合物、すなわち、分析物分子に一対する特異的親和性を有する）からなり、標的分子は、ＦＲＥＴドナーおよびアクセプタプローブ対を近接するように生体分子結合することによって、方向付けることができる。したがって、ＦＲＥＴドナープローブとアクセプタプローブとの間の短距離は、別個のプローブ分子が、例えば、標的分子の近傍に位置するそれらのそれぞれの結合部位に結合する場合に提供される。蛍光共鳴エネルギー移動アッセイにおいて、ＦＲＥＴプローブ対（プローブ一対）の標的分子への結合は、（ドナーから蛍光アクセプタまたは非発光クエンチャーへのＦＲＥＴの際に）ドナー発光のクエンチングをもたらし、蛍光アクセプタの場合には、ＦＲＥＴ増感アクセプタ発光（放出/エミッション／emission）も増加する。
【0017】
しかしながら、従来のFRETに基づくアッセイは、i）アクセプタの直接励起（アクセプタはドナーが励起される同じ波長で弱く励起される）、ii）ドナー発光のクロストーク（ドナーがアクセプタ発光が測定される同じ波長で何らかの発光を有する）、iii）アクセプタ蛍光体によるドナー発光（光子）の吸収を介した放射エネルギー移動（距離依存性が低い；逆２乗（inverse second power））、およびiv）散乱励起光および自己蛍光（試料、他のアッセイコンポーネント、プラスチックおよび検出器自体からの）バックグラウンドシグナルの発生をしやすい。したがって、従来のフルオロフォアおよびFRETプローブは、バイナリプローブアプローチのためのシグナル生成において最適な特異性を提供しない。さらに、個々のドナー‐アクセプタ対の広いスペクトル被覆率のため、マルチパラメトリックFRETベースアッセイにおいて２つ以上のパラメータを同時に測定することは困難である。
【0018】
２つの標識オリゴヌクレオチドプローブ（バイナリプローブ）が標的核酸配列上の近接位置にハイブリダイズし、得られた共鳴エネルギー移動増感型アクセプタ発光を測定して標的核酸の存在を定量する蛍光共鳴エネルギー移動ベースの均質ハイブリダイゼーションアッセイ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 8790-8794］では、ドナーとアクセプタ発光との間の蛍光クロストークから問題が生じる。ドナーの励起（励磁／excitation）はまた、必然的に、バックグラウンドシグナルを発生するアクセプタの直接励起をもたらし、アクセプタはまた、ドナー発光とアクセプタ励磁との間のスペクトル重複により、ドナー発光によって放射的に励磁され得る。短いオリゴヌクレオチドプローブの弱い親和性（低融点）は、通常、高濃度のプローブを使用することによって補償することができるが、蛍光共鳴エネルギー移動ベースのアッセイでは、これは、ドナー発光の再吸収に際して、アクセプタの直接励起およびアクセプタの放射鋭敏化によりバックグラウンドシグナルを増加させ、したがって、標的核酸が存在しない場合でも、ドナー発光を減少させる。しかしながら、蛍光ドナーとアクセプタの組合せが、ドナーとアクセプタの励起スペクトルのスペクトル分離の増加によってアクセプタの直接励起を最小にするように選択される場合、これは、通常、ドナー発光とアクセプタ励起との間のより小さなスペクトル重複ももたらし、したがって、エネルギー移動効率を低下させることによって、シグナル生成を再び損なう。
【0019】
従来の蛍光に基づく技術の検出感度は、生物学的試料マトリックスの自己蛍光、散乱励起光および吸光度によってさらに制限される。生体液または血清中に存在する多くの化合物およびタンパク質は、自然に蛍光性であり、従来の蛍光体の使用は、感度の重大な限界をもたらす［Clin. Chem. 1979; 25:353-361; Anal. Biochem. 1994; 218:1-13］。強度測定に基づく均一蛍光技術を使用する場合のもう一つの主要な問題は、内部フィルタ効果と試料の光学特性の変動である。これらの欠点を修正するためにサンプル希釈が使用されてきたが、常に分析感度を犠牲にしている。１９９０年代に、蛍光ランタノイドが長寿命の発光と大きなストークスシフト（Stokes’ shift）を伴うクリプテートとキレートをドナーとして使用した場合、アッセイアプリケーションでの蛍光共鳴エネルギー移動の実現可能性が大幅に向上した [Clin Chem 1993; 39:1953-1959; Anal. Biochem. 1994; 218,1-13; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:10024-10028; Cytokine 1998; 10:495-499; PCT Int. Appl. WO 98/15830;米国特許第5,998,146号; PCT Int. Appl. WO 87/07955; Clin. Chem. 1999; 45:855-61］。
【0020】
ランタノイド錯体（複合体）と時間分解蛍光光度法
発光ランタノイドキレートおよびクリプテートは、時間ゲート蛍光測定を用いた従来の有機蛍光体と比較して検出能力が増強されるため、種々の生物学的分子の分析において標識として現在広く使用されている。ランタノイド（希土類元素、例えば、三価ユーロピウム、テルビウム、サマリウムおよびジスプロシウム）の発光キレートは、光発光化合物の例外的なグループである［Chem. Soc. Rev. 2005; 34:1048-1077］。ランタノイドイオン自体は非常に低い吸収を有し、加えて、ランタノイドの励起状態は配位水分子によって効率的に消光される。従って、それらの励起に対する唯一の実用的な解決策は、本質的に発光するランタノイド（III）キレート中の有機アンテナ発色団のような集光部分を含む配位リガンド（配位子）を使用することである。実際には、効率的なアンテナリガンドにキレート化されたランタノイドイオンの光発光効率（吸光係数と量子収率の積）は、配位水分子すべてを置き換え、裸イオンと比較して１０００００倍まで容易に向上させることができる。さらに、ランタノイドイオンに特徴的な明確な発光バンドにより、最小のスペクトルクロストークで最大４つの異なるランタノイドの同時測定が可能になる。
発光ランタノイドキレートおよびクリプテートは、時間ゲート蛍光測定を用いた従来の有機蛍光体と比較して検出能力が増強されるため、種々の生物学的分子の分析において標識として現在広く使用されている。ランタノイド（希土類元素、例えば、三価ユーロピウム、テルビウム、サマリウムおよびジスプロシウム）の発光キレートは、光発光化合物の例外的なグループである［Chem. Soc. Rev. 2005; 34:1048-1077］。ランタノイドイオン自体は非常に低い吸収を有し、加えて、ランタノイドの励起状態は配位水分子によって効率的に消光される。従って、それらの励起に対する唯一の実用的な解決策は、本質的に発光するランタノイド（III）キレート中の有機アンテナ発色団のような集光部分を含む配位リガンド（配位子）を使用することである。実際には、効率的なアンテナリガンドにキレート化されたランタノイドイオンの光発光効率（吸光係数と量子収率の積）は、配位水分子すべてを置き換え、裸イオンと比較して１０００００倍まで容易に向上させることができる。さらに、ランタノイドイオンに特徴的な明確な発光バンドにより、最小のスペクトルクロストークで最大４つの異なるランタノイドの同時測定が可能になる。
【0021】
ランタノイド（III）キレートの励起機構は、有機集光アンテナがエネルギー移動を介して発光ランタノイド（III）イオンを励起するために使用されるが、蛍光レポーターの中では例外的である［J. Fluoresc. 2005; 15: 529-542］。発光性ランタノイド（III）キレートは反応性基、集光アンテナおよびキレート基を含み、配位結合を通してランタノイド（III）イオンをキレート化する。有機集光発色団は光吸収により基底一重項状態（S0）から第１の一重項状態（S1）に励起され、発色団は系間交差（ISC）により三重項状態（T1）に転移する。アンテナ発色団の三重項状態は励起エネルギーをランタノイド（III）イオンの適切な４fエネルギーレベル（準位）に移動させることができる。その後、ランタノイドイオンは別個の（明確な／distinct）発光バンドと禁制遷移による長い発光寿命をもつ特性f‐f遷移発光を生成した。
【0022】
金属のキレート錯体（配位化合物）は配位基を介して金属イオンにリガンド（あるいはキレート分子）が結合することによって形成される。中心金属イオンへのリガンドの結合点の総数を配位数と呼ぶ。このリガンドは、結合点、単座、二座などのリストをつけて特徴づけることができ、ここで、歯（へこみ／teeth）の概念は、キレート環状構造中の金属中心に結合した原子の数を反映し、結合リガンドの立体配座の自由度を減少させ、しばしば高い安定性一定をもたらす。ユウロピウム（III）錯体の安定度定数の判定は、例えば、J. Chem. Soc., Dalton Trans. 1997; 1497-1502に記載されている
【0023】
有機集光アンテナ部分または発色団を含有する適切なリガンド（例えば、アミノポリカルボン酸）に錯体化されたランタノイドイオンは、従来のフルオロフォア（蛍光体）と比較して異常な蛍光特性を有する：大きなストークスシフト（１５０～３００nm）、ランタノイドイオンに特徴的な狭い別個の発光バンド、および長い発光寿命（２０００マイクロ秒まで) [Crit. Rev. Clin. Lab. Sci 2001; 38: 441-519］。いくつかの本質的に蛍光性のランタノイドキレートが開発されている［Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1987; 26: 1266-1267; Bioconjugate Chem. 1994, 5, 278; Chim. Acta 1997; 80: 372-387; Anal. Chem. 2003; 75: 3193-3201; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 2000; 1281-1283; Inorg. Chem. Comm. 2002; 5: 1059-1062; JACS 1995; 117: 8132-8138;およびPCT Int. Appl. WO 2005/021538］。これらの安定な発光ランタノイド錯体には、いくつかのランタノイド（例えば、ユウロピウム（III）、テルビウム（III）、サマリウム（III）およびジスプロシウム（III））のクリプテートおよび高発光性キレート（主に直鎖状または環状アミノポリカルボン酸系キレート構造）の両方が含まれる。キレートリガンドは、ランタノイド（III）イオンと集光部分との適度に強いまたは強い結合を１つの同じ分子に結合させるように設計される。ほとんどのキレートでは、集光（エネルギー吸収）と媒介部分は、誘導体化ピリジンまたはピリジンマニホールドからなる。いくつかのアンテナ構造は、ピラゾールのような他のヘテロ原子共役環構造を含む。集光構造は、典型的には、３００～３８０nmの間の吸収極大を有する。ランタノイドイオン、光収穫有機部分および担体リガンドに加えて、標識に使用される本質的に発光性のランタノイド錯体（複合体）は、共有結合のための反応性基を含有する。
【0024】
ランタノイドの例外的な蛍光寿命は、バックグラウンド蛍光（短寿命）が崩壊したときにのみ検出が行われ、そのような時間的遅れおよびゲートウィンドウ（典型的には数十マイクロ秒または数百マイクロ秒の両方）の選択により、効率的なバックグラウンド分離を可能し、一方、ランタノイド発光は依然として妥当な強度である。さらに、大きなストークスシフトと狭い発光バンドは、ランタノイド発光をスペクトル的に選択するための効率的な波長フィルタリングを可能にし、その結果、高感度レポーター技術（酵素増幅化学発光と同等の性能）とマルチパラメトリック測定の可能性をもたらす。この技術は、（マイクロ秒）時間分解蛍光光度法［Clin. Chem. 1983; 29: 65-68］として知られる専用の検出方法を利用している。発光ランタノイドキレートの長寿命蛍光は、典型的には、紫外線または青色可視光で励起され、［Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 2004; 43: 5010-5013］発光は、緑色および赤色可視光波長で検出される。エルビウム、ネオジムおよびイッテルビウムの場合、励磁は可視波長で、発光は可視波長または赤外波長で行うことができる［Chem. Phys. Lett. 1997; 276: 196-201］。
【0025】
時間分解蛍光共鳴エネルギー移動
従来のFRETベースの均一アッセイに関連する主要な問題を大幅に解決するために、ドナーとしてさまざまなフォトルミネッセンスランタニドクリプテートおよびキレートを利用する時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（TR-FRET）ベースのアッセイ法が導入された［Clin. Chem. 1993; 39:1953-1959; Anal. Biochem. 1994; 218:1-13; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:10024-10028; Cytokine 1998; 10:495-499; PCT Int. Appl. WO 98/15830; US Pat. No. 5,998,146; PCT Int. Appl. WO 87/07955; Clin. Chem. 1999; 45:855-61］。これらの方法は、長寿命発光および大きなストークスシフトによる従来の方法と比較して著しい利点を提供するが、シグナル生成の特異性は、放射エネルギー移動（アクセプタによるドナー発光の吸収）によって依然として制限される。特に、標識プローブが高濃度で存在する場合（例えば、大きなダイナミックレンジを達成するため、または弱い相互作用の場合に結合を促進するため)[ Spectrochim. Acta, Part A, 2001; 57］。非結合アクセプタの余剰は、アクセプタ特異的波長でゆっくり減衰する放射バックグラウンドシグナルをもたらすが、測定波長でのドナークロストークは、十分なスペクトル分解能が使用されない限り、バックグラウンドシグナルを増加させることができる。ランタノイドキレートドナー［Anal. Chem. 2005; 77:1483－1487; Anal. Chim. Acta 2005; 551: 73-78］との重複しないアクセプタ（重複しないFRET）の利用は、ドナー発光の再吸収によって起こり得る背景技術をさらに排除することができる。
従来のFRETベースの均一アッセイに関連する主要な問題を大幅に解決するために、ドナーとしてさまざまなフォトルミネッセンスランタニドクリプテートおよびキレートを利用する時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（TR-FRET）ベースのアッセイ法が導入された［Clin. Chem. 1993; 39:1953-1959; Anal. Biochem. 1994; 218:1-13; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:10024-10028; Cytokine 1998; 10:495-499; PCT Int. Appl. WO 98/15830; US Pat. No. 5,998,146; PCT Int. Appl. WO 87/07955; Clin. Chem. 1999; 45:855-61］。これらの方法は、長寿命発光および大きなストークスシフトによる従来の方法と比較して著しい利点を提供するが、シグナル生成の特異性は、放射エネルギー移動（アクセプタによるドナー発光の吸収）によって依然として制限される。特に、標識プローブが高濃度で存在する場合（例えば、大きなダイナミックレンジを達成するため、または弱い相互作用の場合に結合を促進するため)[ Spectrochim. Acta, Part A, 2001; 57］。非結合アクセプタの余剰は、アクセプタ特異的波長でゆっくり減衰する放射バックグラウンドシグナルをもたらすが、測定波長でのドナークロストークは、十分なスペクトル分解能が使用されない限り、バックグラウンドシグナルを増加させることができる。ランタノイドキレートドナー［Anal. Chem. 2005; 77:1483－1487; Anal. Chim. Acta 2005; 551: 73-78］との重複しないアクセプタ（重複しないFRET）の利用は、ドナー発光の再吸収によって起こり得る背景技術をさらに排除することができる。
【0026】
TR－FRETに基づくアッセイにおいて、従来の短寿命蛍光アクセプタ［C Clin. Chem. 1993; 39: 1953-1959; Clin. Chem. 1999; 45: 855-861］と組み合わせたドナーとしての長寿命蛍光ランタノイドキレート（またはクリプテート）の使用は、エネルギー移動励起感作アクセプタ発光の特異的な時間比検出、およびアクセプタの短寿命、直接励起蛍光およびバックグラウンド蛍光からのその識別を可能にする。アクセプタ発光波長へのドナー発光のクロストークも、ドナー発光の狭い「線状」発光バンドによりほとんど効率的に回避される。
【0027】
均質蛍光共鳴エネルギー移動ベースの核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、典型的には、クエンチされたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ（米国特許第5,538,848号中の開裂可能オリゴヌクレオチドプローブ中のドナーおよびクエンチャーまたは米国特許第5,925,517号および米国特許第6,150,07号のようにハイブリダイゼーションの際に開かれる分子ビーコン型ステム－ループオリゴヌクレオチドプローブ中のドナーおよびアクセプタ）、または相補的標的配列上の隣接位置に互いに隣接してハイブリダイズする、アクセプタ標識されたハイブリダイゼーションプローブオリゴヌクレオチド（バイナリプローブ）および別個のドナーを含むエネルギー移動ハイブリダイゼーションプローブ対［Am. J. Pathology 1998; 153: 1055-1061; Bioconjugate Chem. 2002; 13: 200-205.］のいずれかを利用する。ドナーフルオロフォアはその励起波長で励起され、標的核酸配列上の隣接位置へのプローブのハイブリダイゼーションに依存する共鳴エネルギー移動励起感作アクセプタ発光がアクセプタ発光の波長で検出される。
【0028】
蛍光共鳴エネルギー移動は非常に汎用的な技術であるが、ハイブリダイゼーションプローブ対に基づくアッセイにおける増感アクセプタ発光の強度は、エネルギー移動効率により制限され得る。エネルギー移動効率は、典型的には、わずか数ナノメートル以下の距離を必要とするからである。しかしながら、TR－FRETに基づくハイブリダイゼーションプローブ対アッセイでは、過度に効率的なエネルギー移動を避けるために、ドナーとアクセプタ標識との間の距離のさらなる最適化が必要であり、これは、感作されたアクセプタ発光の急速な減衰のために、マイクロ－ミリ秒時間領域での時間ゲート（時間の区切り／タイムゲート／time-gated）検出を妨げるであろう。また、ハイブリダイゼーションプローブ濃度は、ドナー発光の再吸収によるバックグラウンドが増加し、アッセイの感度およびダイナミックレンジを制限するほどには増加させることができない。一方、クエンチしたプローブベースのアッセイは、２つの異なる色素による特異的標識を必要とし、単一のハイブリダイゼーション事象のみの特異性に依存する。
【0029】
キレート相補性
ランタノイドキレート補完は、蛍光ランタノイド錯体の標的指向性形成に基づくバイナリプローブ法である。キレート相補性ベースのハイブリダイゼーションアッセイにおいて、バイナリオリゴヌクレオチドプローブ対は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを含み：一方のオリゴヌクレオチドプローブは非蛍光ランタノイドキレートで標識され、他方は光収穫増感剤アンテナリガンドで標識され、これは、両方のオリゴヌクレオチドプローブが核酸鋳型中の近接または隣接配列で結合される場合にのみ、発光ランタノイド錯体を形成する担体キレート中のランタノイドイオンに配位することができる。このようなテンプレート指向自己集合の最初の例は、担体キレートとしてのDTPA－テルビウム（III）および集光リガンドとしてのサリチル酸エステルに基づいていた［Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1990; 29: 1167-1169］。このアプローチは、のちに［Anal. Biochem. 2001; 299: 169－172; J. Fluoresc. 2005; 15: 559－568］として用いられ、さらなるランタノイドイオンキレートリガンドおよび／または環状ランタノイド担体キレートを利用することにより、例えば高温条件に対してより良好な感度および適合性を提供するように改良された［Anal. Chem. 2010; 82: 751-754; Anal. Chem. 2011; 83: 9011-9016; PCT Int. Appl. WO 2010/109065］。この技術は、ランタノイド発光の調整が観察可能なバックグラウンド蛍光のために非常に制限されている従来技術の方法とは対照的に、ターゲットの存在下でランタノイド発光を暗状態（非発光状態）から明状態（発光状態）（またはその逆）に完全な切り換え（スイッチング）を可能にし、暗状態では顕著な蛍光バックグラウンドは観察されない。
ランタノイドキレート補完は、蛍光ランタノイド錯体の標的指向性形成に基づくバイナリプローブ法である。キレート相補性ベースのハイブリダイゼーションアッセイにおいて、バイナリオリゴヌクレオチドプローブ対は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを含み：一方のオリゴヌクレオチドプローブは非蛍光ランタノイドキレートで標識され、他方は光収穫増感剤アンテナリガンドで標識され、これは、両方のオリゴヌクレオチドプローブが核酸鋳型中の近接または隣接配列で結合される場合にのみ、発光ランタノイド錯体を形成する担体キレート中のランタノイドイオンに配位することができる。このようなテンプレート指向自己集合の最初の例は、担体キレートとしてのDTPA－テルビウム（III）および集光リガンドとしてのサリチル酸エステルに基づいていた［Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1990; 29: 1167-1169］。このアプローチは、のちに［Anal. Biochem. 2001; 299: 169－172; J. Fluoresc. 2005; 15: 559－568］として用いられ、さらなるランタノイドイオンキレートリガンドおよび／または環状ランタノイド担体キレートを利用することにより、例えば高温条件に対してより良好な感度および適合性を提供するように改良された［Anal. Chem. 2010; 82: 751-754; Anal. Chem. 2011; 83: 9011-9016; PCT Int. Appl. WO 2010/109065］。この技術は、ランタノイド発光の調整が観察可能なバックグラウンド蛍光のために非常に制限されている従来技術の方法とは対照的に、ターゲットの存在下でランタノイド発光を暗状態（非発光状態）から明状態（発光状態）（またはその逆）に完全な切り換え（スイッチング）を可能にし、暗状態では顕著な蛍光バックグラウンドは観察されない。
【0030】
ランタノイドキレート相補性に基づく発光バイナリハイブリダイゼーションプローブアッセイのために、プローブ配列（レポーター部分共役位置およびリンカーの結合を含む）およびリンカー（配向および剛性を含む長さおよび組成）を選択し、レポーターの２つの部分、すなわちイオンキャリアキレートおよびアンテナリガンドが、混合キレートの自己集合を可能にするために正しい向きで近接するようにする。錯体が形成されたとき、蛍光は、ある波長で励起され、発光は、時間分解蛍光測定法、すなわち、励起パルス後の時間ゲート蛍光検出を用いて、別の波長で測定される。担体キレートとアンテナリガンドとの相補による混合キレート錯体の形成は、アンテナリガンドと中心ランタノイドイオンとの間の正しい向きでの分子接触を必要とする。担体キレートとアンテナリガンドの両方が近接に固定されているとき、高い有効局所濃度は弱い配位相互作用によってさえ結合に有利であるので、この過程は実際にセルフアッセンブル（自己集合／self-assembling）している。アンテナリガンドのイオンキャリアキレートへの配位はまた、オリゴヌクレオチドプローブ対のハイブリダイゼーションに対する追加の共働安定性因子（co-operative stability factor）を提供し、したがって、例えば、バイナリプローブで使用される従来のFRETベースの信号生成技術と比較して、結合の特異性を改善をもたらす。
【0031】
マイクロＲＮＡ検出
マイクロＲＮＡ(miRNA)は、哺乳動物におけるメッセンジャーRNA (mRNA)発現およびタンパク質翻訳を調節する短い（約２２ヌクレオチド）非コードリボ核酸（RNA）である［Nat. Rev. Genet. 2004; 5: 522-531 and Nat. Rev. Immunol. 2016; 16: 279-294］。これらは、細胞分化、増殖およびアポトーシスを含む多くの細胞過程において重要な役割を果たす。異なる成熟miRNAの長さは１７～２５ヌクレオチドの間で変化することが記載されており、同じ起点から産生されたmiRNAの長さでさえも若干の変動が観察されている[Nucleic Acids Res. 2011; 39: 257-268］。
マイクロＲＮＡ(miRNA)は、哺乳動物におけるメッセンジャーRNA (mRNA)発現およびタンパク質翻訳を調節する短い（約２２ヌクレオチド）非コードリボ核酸（RNA）である［Nat. Rev. Genet. 2004; 5: 522-531 and Nat. Rev. Immunol. 2016; 16: 279-294］。これらは、細胞分化、増殖およびアポトーシスを含む多くの細胞過程において重要な役割を果たす。異なる成熟miRNAの長さは１７～２５ヌクレオチドの間で変化することが記載されており、同じ起点から産生されたmiRNAの長さでさえも若干の変動が観察されている[Nucleic Acids Res. 2011; 39: 257-268］。
【0032】
miRNAはＲＮＡポリメラーゼIIによって長い一次miRNA(pri-miRNA)転写産物としてゲノムから転写される。miRNAの成熟は、RNAse IIIによるpri－miRNAの切断から始まり、前駆体miRNA（pre－miRNA）と呼ばれる約７０ヌクレオチドのヘアピン型構造体を放出する[PLoS Biol. 2005; 3: e235］。その後、pre－miRNAは細胞質に能動的に輸送される。細胞質では、miRNA前駆体は、次いで、別のRNaseIII酵素によって約２２ヌクレオチドのmiRNA二本鎖に切断される。成熟miRNAとよばれる二本鎖のうち１本だけが、主にRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に転移され、RISCは、標的mRNAの切断か翻訳サイレンシングのいずれかを媒介する。もう一方の鎖は遊離し、分解される。
【0033】
miRNAは植物から哺乳類まで進化的に保存されており、タンパク質の翻訳を阻害したり、mRNAの分解を増強したりすることによって遺伝子標的を負に調節している。血漿および血清を含む体液は、様々な疾患で変化する特異的miRNAを含み[PLoS One 2012; 7: e41561］、これらの循環miRNAをヒトの疾患進行のバイオマーカーとして用いることへの関心が高まっている［Front. Immunol. 2017; 8: 118］。これは体液中のmiRNAの安定性によってさらに促進される［Bioinformatics 2015; 13: 17-24］。したがって、異なる臨床試料からのmiRNAの高感度で特異的な検出および定量のための方法が必要である。miRNAの空間分布も検出され、異なる組織の凍結切片のin situハイブリダイゼーションによって研究されている［Nat. Protoc. 2007; 2: 1508-1514］。しかしながら、miRNA検出における課題は、成熟miRNAの短い長さおよび血液、血漿および血清中のmiRNAの濃度範囲がナノモル濃度からフェムトモル濃度に変化するため、それらの検出に使用される従来のRNAおよびDNAオリゴヌクレオチドプローブの低親和性である。miRNA分析物に対するオリゴヌクレオチドプローブ親和性を改善するために（および結果として融解温度を高くするために）、ロック核酸（LNA）ヌクレオチドがしばしばDNAオリゴヌクレオチドプローブに組み込まれている［Int. J. Mol. Sci. 2015; 16: 13259-13286］。
【0034】
miRNAをバイオマーカーとして利用するには、ナノモル以下の濃度で特異的なmiRNA標的を検出する必要があり［Lab. Invest. 2019; 99: 4523-469］、これは、従来の蛍光に基づく直接ハイブリダイゼーションアッセイの到達範囲を超えていることが多い。したがって、ほとんどのmiRNA検出方法は、酵素的増幅に基づく方法であり、それは、例えば、ローリングサークル増幅（RCA）（プライマーとして機能するmiRNA）の前のパドロック（padlock）プローブのハイブリダイゼーションとライゲーション[RNA 2006; 12: 1747-1752]、サーキュラープローブの直接ターゲットプライミングローリングサークル増幅[Anal Chem 2014; 86: 1808-1815]およびサーキュラーシールプローブのターゲットベースのトゥーホールド（toehold）開始ローリングサークル増幅[Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2014; 53: 1389-2393]、に依拠している。パドロックプローブハイブリダイゼーション、ニックライゲーションおよび標的プライムドRCA増幅も、増幅産物のTR－FRETに基づくバイナリプローブ検出［Chem. Sci. 2018; 9: 8046-8055］と組み合わされて、サブピコモル検出限界に達した。miRNA標的に結合した２つのステム－ループプローブのライゲーションおよびライゲーションされたプローブのその後のPCR増幅も示されている［Talanta 2011; 85: 1760-1765］。広く使用されているリアルタイム定量PCRに基づく方法は、miRNAの３’部分に結合してDNA鋳型を生成する標的特異的ステム－ループ逆転写プライマーを使用し、これは、さらなるmiRNA特異的フォワードプライマーを用いたPCRによってさらに増幅され、Taqmanプローブでモニターされる[Nucleic Acids Res. 2005; 33: e179; Genes (Basel) 2016; 7: 131］。しかしながら、これらの方法は、産物中のmiRNA配列の短い長さによってチャレンジされ、これは、miRNA特異的色素標識Taqmanプローブをプライマー領域間のmiRNA配列領域に完全に適合させることを困難にしたままである。さらに、ステムループ‐逆転写酵素プライマーの短い認識配列は、密接に関連するmiRNAの逆転写をももたらし、その結果、好ましいmiRNAの非効率的な逆転写となる、または、特異性を減少させる［Chem. Sci. 2018; 8046-8055］。miRNAの直接検出は、例えば、ナノモル検出限界を達成するFRET対として、バイナリプローブアプローチおよび量子ドットおよびTb－クリプテートを使用することによっても実証されているが[ACS Nano 2015; 9: 8449-8457］、ダイレクトmiRNA検出における感度の改善は、依然として好ましいであろう。しかしながら、体液中のmiRNA濃度の低さは、miRNAを濃縮して、例えば、タンパク質結合した循環miRNAを捕捉するための免疫沈降、RISC複合体収集、および生体液中にmiRNAを含有し輸送する細胞外微小胞（EV）またはエキソソームによって、部分的に回避することができる［Oncotarget 2016; 7: 75353－75365］。
【0035】
成熟miRNAのアッセイにおいて広く利用されている単一ステム－ループ逆転写酵素（RT）プライマーは、線形プライマーと比較して改善された選択性および親和性を提供するが、関連するpri－miRNAまたはpre－miRNAの大過剰の存在下では、それらの逆転写のいくつかの低レベルが依然として起こり得る［Curr. Protoc. Mol. Biol. 2011; unit 15.10］。したがって、miRNAの一方の末端にあるシングルステムRTプライマーによってもたらされる立体障害は有益であるが、まだ完全なソリューションではない。ステムループプライマーを標的に配置することは、選択性にとって重要であることが知られている。標的の３’末端とステム－ループプライマーの５’末端との間にニック（すなわち、ギャップまたはオーバーラップなし）が形成されているが、重複する結合部位または末端間のギャップ（すなわち、ニックが存在しない）が存在する場合でも、いくつかの伸長が依然として起こり得る最良の増幅効率が得られる［RNA 2013; 19: 1-10］。この方法は、逆転写酵素の鎖置換活性による変性がない場合でも二本鎖RNA鋳型を検出するので、他の制限も有する。
【0036】
複数のステム－ループプローブに基づくアプローチも存在し、ここで、プローブはRNA伸長酵素によるmiRNAの初期伸長のための鋳型である［Anal. Chem. 2018: 7107-7111; Sci. Reports 2017; 7: 11396］。しかしながら、これらの方法は、単一ステム－ループRTプライマーベースの方法と比較して、成熟miRNAに対する選択性が良好ではない。
【0037】
成熟miRNA標的の検出のためのバイナリ（二成分系）ステム－ループプローブに基づくライゲーションアッセイは、以前に記載されている［Talanta 2011; 85: 17560-1765; Anal. Chem. 2009; 81: 5446-5451］。しかしながら、アッセイは、プローブと標的との間にニックを生じないステム－ループプローブのみを利用する。第１のアッセイでは、これは、実際、プローブのステム配列の末端に非相補的な塩基を加えることによって設計することによって、意図的に回避される。第２のアッセイでは、オリゴヌクレオチドプローブが標的にハイブリダイズするか、または一緒にライゲーションされる場合、プローブ中のステム構造は、標的へのハイブリダイゼーションの際に実際に開かれ、ステム構造はもはや存在しない。したがって、標的核酸のフラグメントに向かうオリゴヌクレオチドプローブの相補的領域は、ステム構造の一部である。さらに、プローブと標識標的との間にニックを形成する固定化シングルステム－ループオリゴヌクレオチドプローブは、ニック構造を結合するためのライゲーション工程と組み合わされた不均一ハイブリダイゼーションマイクロアレイにおいて、以前から利用されている[Nucleic Acids Res. 2001; 29: e92］。しかしながら、使用される第２のオリゴヌクレオチドプローブはなく、したがって、アッセイはバイナリプローブを使用しない。
【0038】
残念ながら、現在の直接および増幅に基づく核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法は、個々のマイクロRNA（microRNA）の検出に対する特異性および／または感受性が限られており、すべての方法が、マイクロRNAをコードするpre-miRNA（プレmRNA）、pri-mRNA（プリmRNA）およびゲノム配列から成熟マイクロRNA（miR）を識別することができるわけではない。
【0039】
したがって、本発明の目的は、マイクロRNAの直接検出を目的とした現在の方法で観察された論じられた欠点および問題を回避しながら、成熟miRNAなどの規定された配列および長さを有する短い核酸分析物分子を直接検出および／または定量するための増幅工程を伴わない、高感度で特異的なハイブリダイゼーションアッセイ方法を提供することである。
【発明の概要】
【0040】
本発明の１つの目的は、短い一本鎖核酸分析物分子を検出および／または定量するためのバイオアッセイ方法を提供することである。
【0041】
第１の態様において、本発明は、
バイナリプローブシステムを採用する、核酸分析物を検出および／または定量するためのバイオアッセイ方法であって、
２つのオリゴヌクレオチドプローブを試料と接触させる工程を含み、
(a)第１のオリゴヌクレオチドプローブは、
二本鎖末端ステム－ループ構造と、
前記核酸分析物の第１の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、
を含み、
(b)第２のオリゴヌクレオチドプローブは、
前記核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列を含み、
前記核酸分析物の前記第１の領域は末端領域であり、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングは、前記核酸分析物の前記第１の領域にハイブリダイズし、
該ハイブリダイズは、前記核酸分析物の末端と前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の末端との間の第１のニック構造の形成をもたらし、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の末端は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステム－ループ構造の一部であり、
前記核酸分析物の前記第１および第２の領域は、前記核酸分析物の厳密に隣接する領域であり、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの第２の末端と前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の末端との間に第２のニック構造を形成する前記核酸分析物とハイブリダイズし、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合した前記核酸分析物の有無を検出し、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合した前記核酸分析物の存在により、試料中の分析物の存在を確認する、バイオアッセイ方法、を提供する。
バイナリプローブシステムを採用する、核酸分析物を検出および／または定量するためのバイオアッセイ方法であって、
２つのオリゴヌクレオチドプローブを試料と接触させる工程を含み、
(a)第１のオリゴヌクレオチドプローブは、
二本鎖末端ステム－ループ構造と、
前記核酸分析物の第１の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、
を含み、
(b)第２のオリゴヌクレオチドプローブは、
前記核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列を含み、
前記核酸分析物の前記第１の領域は末端領域であり、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングは、前記核酸分析物の前記第１の領域にハイブリダイズし、
該ハイブリダイズは、前記核酸分析物の末端と前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の末端との間の第１のニック構造の形成をもたらし、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の末端は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステム－ループ構造の一部であり、
前記核酸分析物の前記第１および第２の領域は、前記核酸分析物の厳密に隣接する領域であり、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの第２の末端と前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の末端との間に第２のニック構造を形成する前記核酸分析物とハイブリダイズし、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合した前記核酸分析物の有無を検出し、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合した前記核酸分析物の存在により、試料中の分析物の存在を確認する、バイオアッセイ方法、を提供する。
【0042】
第２の態様によれば、本発明は、バイナリプローブシステムを使用する核酸分析物を検出および／または定量するためのバイオアッセイ方法を提供し、ここで、バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムの２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブ部分のうちの少なくとも１つは、一方の末端に部分的に二本鎖（自己相補的）ステム－ループ構造を有し、他方の末端に一本鎖オーバーハング領域を有し、ここで、バイナリプローブシステムの両方の別個の部分の一本鎖領域は、i）近接またはii）一本鎖核酸分析物分子の配列中で厳密に隣接する領域にハイブリダイズし、ステム－ループ構造を含むバイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムの少なくとも１つの別個の部分は、オリゴヌクレオチドプローブのステム－ループ構造の末端と核酸分析物分子の末端との間にニックを形成する一本鎖核酸分析物分子の配列中の末端領域にハイブリダイズする。
【0043】
特定の実施形態によれば、バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムの２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブ部分は、一方の末端に部分的に二本鎖（自己相補的）のステム－ループ構造を有し、他方の末端に一本鎖のオーバーハング（張り出し）領域を有し、バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムの両方の別個の部分の一本鎖領域は、２つまたは３つのニック構造のいずれかを形成する一本鎖核酸分析物分子の配列において厳密に隣接する末端領域にハイブリダイズし、後者の場合、ニックの２つは核酸分析物分子の反対側の末端にあり、核酸分析物分子の末端とオリゴヌクレオチドプローブのステム－ループ構造の末端との間にあり、別個のオリゴヌクレオチドプローブが核酸分析物の厳密に隣接する位置にハイブリダイズするとき、第３のニックは、オリゴヌクレオチドプローブの末端オーバーハングの間に形成される。
【0044】
別の特定の実施形態によれば、バイオアッセイ法で使用されるバイナリプローブシステムは、ランタノイドキレート相補性またはドナーとしてランタノイド標識を有する共鳴エネルギー移動のいずれかである発光レポーター技術に基づく。それにより、この方法は、時間ゲート蛍光測定による短い核酸分析物分子の検出および／または定量を可能にする。
【0045】
さらにさらなる態様によれば、本発明は、短い核酸分析物分子を検出および／または定量するためのキットを提供する。キットは、バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムの２つの個別のオリゴヌクレオチドプローブ部分：
(a)二本鎖末端ステム－ループ構造と、一本鎖核酸分析物の第１の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
(b)二本鎖末端ステム－ループ構造と、前記一本鎖核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、を含む、第２のオリゴヌクレオチドプローブと、
を含み、
前記一本鎖核酸分析物の前記第１および第２の領域が、前記一本鎖核酸分析物の厳密に隣接する領域であり、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの末端における末端ヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの末端における末端ヌクレオチドは、前記プローブが前記一本鎖核酸分析物に結合されるとき、前記第１および第２オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの前記末端ヌクレオチド間に第１のニック構造を形成するために、前記一本鎖核酸分析物中の隣接ヌクレオチドに結合するように設計され、前記第１のニック構造は、相補的な鎖に結合された一対の隣接するヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を欠き、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングは、前記プローブが前記一本鎖核酸分析物に結合されるときに、
前記一本鎖核酸分析物の前記末端ヌクレオチドの一方は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステムループ構造の一部である末端において末端ヌクレオチドを有する第２のニック構造を形成し、前記一本鎖核酸分析物の前記末端ヌクレオチドのもう一方は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステムループ構造の一部である末端において末端ヌクレオチドを有する第３のニック構造を形成し、前記第２および第３のニック構造は相補鎖に結合した隣接ヌクレオチド対の間でホスホジエステル結合を欠いている、
ようにさらに設計される。
(a)二本鎖末端ステム－ループ構造と、一本鎖核酸分析物の第１の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
(b)二本鎖末端ステム－ループ構造と、前記一本鎖核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、を含む、第２のオリゴヌクレオチドプローブと、
を含み、
前記一本鎖核酸分析物の前記第１および第２の領域が、前記一本鎖核酸分析物の厳密に隣接する領域であり、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの末端における末端ヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの末端における末端ヌクレオチドは、前記プローブが前記一本鎖核酸分析物に結合されるとき、前記第１および第２オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの前記末端ヌクレオチド間に第１のニック構造を形成するために、前記一本鎖核酸分析物中の隣接ヌクレオチドに結合するように設計され、前記第１のニック構造は、相補的な鎖に結合された一対の隣接するヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を欠き、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングは、前記プローブが前記一本鎖核酸分析物に結合されるときに、
前記一本鎖核酸分析物の前記末端ヌクレオチドの一方は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステムループ構造の一部である末端において末端ヌクレオチドを有する第２のニック構造を形成し、前記一本鎖核酸分析物の前記末端ヌクレオチドのもう一方は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステムループ構造の一部である末端において末端ヌクレオチドを有する第３のニック構造を形成し、前記第２および第３のニック構造は相補鎖に結合した隣接ヌクレオチド対の間でホスホジエステル結合を欠いている、
ようにさらに設計される。
【0046】
さらに別の特定の実施形態によれば、短い核酸分析物分子は、配列の規定された長さおよび組成を有する成熟マイクロRNAである。
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1】図１は、従来のプローブと共に部分的に二本鎖のステム－ループプローブに基づくバイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイ、および標的核酸に互いに近接する２つのプローブのハイブリダイゼーションを示す。ステム－ループプローブのハイブリダイゼーションは、一方の末端における標的核酸の定義された終止配列に依存する。
【図2】図２は、従来のプローブと共に部分的に二本鎖のステム－ループプローブに基づくバイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイ、および標的核酸に厳密に隣接する２つのプローブのハイブリダイゼーションを示す。ステム－ループプローブのハイブリダイゼーションは、一方の末端における標的核酸の定義された終止配列に依存し、従来のプローブのハイブリダイゼーションは、標的核酸上でハイブリダイズした２つのプローブ間のニックの形成に依存する。
【図3】図３は、部分的に二本鎖のステム－ループプローブ対に基づくバイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイ、および標的核酸に厳密に隣接するプローブ対のハイブリダイゼーションを示す。プローブ対のハイブリダイゼーションは、両末端における標的核酸の定義された終止配列および標的核酸の定義された長さに依存する。
【図4】図４は、キレート相補性および部分的に二本鎖のステム－ループプローブ対に基づく発光バイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイの例、および標的核酸に隣接するプローブ対のハイブリダイゼーションの際の蛍光複合体の形成を示す。プローブ対のハイブリダイゼーションは、両末端における標的核酸の定義された終止配列および標的核酸の定義された長さに依存する。
【図5】図５は、従来のプローブとともに部分的に二本鎖のステム－ループプローブおよびキレート相補性に基づく発光バイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイの実施例、および標的核酸に隣接する２つのプローブのハイブリダイゼーションに際する蛍光複合体の形成を示す。ステム－ループプローブのハイブリダイゼーションは、一方の末端における標的核酸の定義された終止配列に依存し、従来のプローブのハイブリダイゼーションは、標的核酸上でハイブリダイズした２つのプローブ間のニックの形成に依存する。
【図6】図６は、部分的に二本鎖のステム－ループプローブ対およびキレート相補性に基づく発光バイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイの実施例、および標的核酸に近接したプローブ対のハイブリダイゼーションに際しての蛍光複合体の形成を示す。プローブ対のハイブリダイゼーションは、両末端における標的核酸の定義された終止配列に依存する。
【発明を実施するための形態】
【0048】
成熟したマイクロRNAのような定義された塩基配列および長さを有する短い核酸標的を検出および／または定量するための現在のバイオアッセイ法は、特異性および感度が限られている。本発明者は、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動標識ペアと組み合わせた核酸標的への相補的オーバーハングを有する少なくとも1つのステムループハイブリダイゼーションプローブに基づくニック形成バイナリープローブシステム、またはランタノイドキレート錯体の形成が、酵素的核酸増幅または伸長を使用することなく、規定された核酸塩基配列および長さ約２２ntを有する成熟マイクロRNAなどの短い配列核酸分析物の感受性および特異性測定に対するユニークなアプローチを提供することを見出した。
【0049】
従来の蛍光に基づく方法では困難である短い配列核酸分析物の高感度測定に加えて、本発明は、規定された長さ、核酸塩基配列組成および末端核酸塩基配列の核酸分析物に対する改良された特異性を提供する。本発明は、より長い配列の一部として同じ塩基配列を含んでもよいプレmiRNA、プリmiRNAおよびゲノムDNAのような他の密接に関連した核酸の干渉なしに、定義された短い成熟マイクロRNAを直接検出および定量する方法を解決する。本発明はさらに、塩基スタッキング効果に由来する標的核酸の配列に対して高いハイブリダイゼーション選択性を提供し、これは、完全にマッチするプローブハイブリダイゼーションにおける１つまたは複数のニック構造の形成に起因する融解温度を増加させる。混合キレート錯体の形成をさらに導入し、バイナリプローブ系の協同結合に基づく安定化効果を増大させた。
【0050】
バイナリステム－ループプローブシステムは、短い核酸標的の検出において驚くべき利点を提供する。第１に、塩基スタッキング効果および標的とプローブとの間のニック形成により、それはプローブ親和性を改善し、線状（リニア）プローブでは不可能な短い核酸標的の高感度検出を可能にする。第２に、それは、線状プローブでは不可能な末端核酸塩基配列および産物の長さに対して厳密な選択性を提供する。第３に、本方法は、均一なアッセイフォーマットで標的のバイアスのない（unbiased）直接的かつ増幅のない検出を可能にし、第４に、本方法は、多重化アレイベースの空間分解検出にも使用することができ、多重化の付加的モードは蛍光色に基づく。ステム－ループバイナリプローブの概念は、ステム－ループプローブ（ヘアピンプローブとも呼ばれる)[Nucleic Acids Res 2001; 29: 996-1004］および上記バイナリプローブの両方が何十年も前から知られている場合でも説明されていない[Trends in Biotech 2002; 20: 249-256］。ほとんどの核酸アッセイでは、標的は成熟miRNAの場合よりもかなり長く、したがって、他の用途では、バイナリステム－ループプローブシステムによって提供される標的長および配列組成の両方に基づいて、そのような厳密な識別を行う必要はない。ステム‐ループバイナリプローブにおける２つのステム‐ループオリゴヌクレオチドプローブの組合せは、標的ハイブリダイゼーションにおける従来の一本鎖線形プローブよりもシステムを優れたものにする。形成されたニック構造、すなわち、プローブの二本鎖ステムと完全に一致した一本鎖標的で形成されたデュプレックス（二重）との間の周りの連続した塩基スタッキング相互作用[Nucleic Acids Res 2006; 34: 564-574］は、さらなる自由エネルギー最小化を提供し、得られるプローブ－標的複合体の安定性を増大させる。この余分な安定化は、ミスマッチ標的の場合には欠けており、したがって、ハイブリダイゼーション特異性が改善され、すなわち、この方法は、マッチ標的とミスマッチ標的との間のより良い識別を提供する。さらに、ステムループプローブのハイブリダイゼーション速度（hybridization kinetics）は、本発明にさらに別の有益な特徴を提供する線状プローブ[Nucleic Acids Res 2001; 29: 996-1004］よりも速い。驚くべきことに、核酸塩基のスタッキング相互作用は、塩基間の水素結合と比較して、水溶液中の核酸の構造安定性[Nucleic Acids Res. 1993; 21: 2051-2056］において非常に大きな役割を果たしている。
【0051】
従来の蛍光ベースのアッセイは、マイクロRNAの直接検出に対して適切な感度を提供することができず、したがって、最新のアッセイは、鋳型またはプライマーとして標的を利用する酵素的核酸増幅ステップに基づく［Lab. Invest. 2019; 99: 452-469］。時間分解蛍光ベースのFRETアッセイが実証されているが、これらの方法はまた、増幅ベースの[ACS Nano 2015; 9: 8449-8457］であるか、または従来の線形プローブを利用しており、バイナリプローブの場合と同様に、２つのオリゴヌクレオチドプローブの標的への同時結合はない［Chem. Sci. 2018; 9: 8046-8055］。
【0052】
科学文献では、成熟miRNA標的の検出のために、バイナリ（二成分）ステム－ループプローブに基づく連結アッセイが以前に記載されているが［Talanta 2011; 85: 17560-1765]］、本発明と大きな相違点がある。当該アッセイは、相補的RNAテンプレート上でハイブリダイズしたステム－ループプローブのオーバーハングと、好ましくはT４ RNAリガーゼ２によるニックのライゲーションとの間にのみニック構造を形成することに基づく。このアッセイは、オリゴヌクレオチドプローブと標的との間にニックを生じさせないステム－ループプローブのみを使用し、したがって、本発明の場合と同様の塩基スタッキング効果の利益を得ない。アッセイにおけるニック形成は、ニックの形成を回避し、可能性のあるライゲーションを回避する可能性が最も高いステム配列の末端に非相補的塩基を加えることによって設計することによって、実際には意図的に回避される。これは、本発明とは完全に対照的であり、バイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイにおいてステム－ループプローブの利点を利用しないことを教示する。さらに、ライゲーションされたバイナリプローブは、蛍光に基づいて直接検出されないが、プローブは、二本鎖DNAインターカレート色素（intercalating dye）でモニターされるさらなる定量的PCR反応のための鋳型として作用する。
【0053】
分子ビーコン型ステム－ループオリゴヌクレオチドプローブ［Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009; 48: 856-870］は、広く使用されている発光ハイブリダイゼーションバイオアッセイであるが、これらはバイナリプローブではなく、本発明に反して、これらは配列の相補的ステム領域間のループ領域において標的核酸に向かう相補的配列を含有する。本発明において、標的核酸フラグメントに向かう相補的配列は、ステム－ループオリゴヌクレオチドプローブ中の末端オーバーハング配列であり、プローブオリゴヌクレオチド配列の相補的ステム領域の１つと標的に向かう相補的配列との間に一本鎖ギャップ配列は存在せず、これによりニック構造の形成が可能になる。さらに、本発明では、プローブのステム構造は、ハイブリダイゼーションの際に開かれない。
【0054】
ステムループベースのバイナリプローブは、線状バイナリプローブシステムで可能であるよりも短い一本鎖核酸標的に結合することができる。標的の末端配列がプローブの二本鎖ステム領域（結果として生じるニック構造）に隣接してハイブリダイズする場合、二本鎖領域内の塩基スタッキングの安定化効果により、より高い融解温度をもたらすより短い相補的配列を使用することができる。特に適切な標的は、短い一本鎖核酸分析物、例えばマイクロRNA（miRNA、一本鎖、長さ１８～２４nt、最も一般的には２２nt）である。バイナリプローブがランタノイドキレート相補性標識対を含む場合、ステム－ループベースのバイナリプローブ系の２つの部分の標的核酸フラグメントへの隣接結合は、担体キレート中のランタノイドイオンへのアンテナ発色団の配位結合による混合ランタノイドキレート錯体の自己集合（アッセンブリ）をもたらし、バイナリプローブ系を発光させる。隣接するハイブリダイゼーション事象は、すぐ近傍、厳密に隣接する、すなわちニック構造を形成する隣接する認識された配列の間の０nt、または近位認識された配列の間の標的上に１～２０ntの認識されない配列ギャップのいずれかである。バイナリプローブシステムの両部分の直近隣接位置への同時結合（標的にハイブリダイズしたプローブオーバーハングの間に形成されたニック構造）と混合ランタノイドキレート錯体の自己集合（配位結合）は、融解温度を共に強化し、イオンキャリア（担体）キレートへのアンテナリガンド配位と塩基（ベース）スタッキング効果の両方による標的検出の特異性を改善する。
【0055】
切り替え可能なランタノイド発光は、高感度の発光レポーター技術であり、均一な核酸ハイブリダイゼーションアッセイのための優れた方法が見出されている。本発明では、成熟したマイクロRNAのような短い一本鎖核酸標的の検出能力を改善するために、ステム－ループバイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムとさらに組み合わせる。バイナリプローブシステムによる検出は、プローブシステムの２つの別個の部分の同時結合が信号生成に必要であり、ニック構造の形成および塩基スタッキングによって提供される親和性の増大によって特異性がさらに高められるので、任意の単一プローブベースシステムによる検出よりも特異性が高い。
【0056】
したがって、本発明の実施形態は、スイッチング可能なランタノイド発光の時間ゲート蛍光検出のために、高い自己蛍光バックグラウンドを有する臨床試料からでさえ増幅することなく、成熟マイクロRNAの特異的かつ高感度の検出を可能にする。
【0057】
本発明の代替的実施を図１～３に記載する。
図１（A）は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここで、第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）は、核酸分析物（６）の３’末端領域（８）と相補的であり、かつ、選択的にハイブリダイズすることができる二本鎖５’末端ステム－ループ配列（３）および一本鎖３’末端オーバーハング配列（２）を含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブ（４）は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖３’末端配列がハイブリダイズする、３’末端領域（８）と重複しない核酸分析物（６）の別の領域（７）と相補的であり、かつ、選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖５’末端配列（５）を含む、バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムに基づくハイブリダイゼーションアッセイを記載する。(B)第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの両方は、核酸分析物（６）のそれらの相補的領域とハイブリダイズする。第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）のハイブリダイゼーションは、核酸分析物（６）の３’末端および第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）の５’末端を含む安定化ニック構造（９）の形成をもたらす。
図１（A）は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここで、第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）は、核酸分析物（６）の３’末端領域（８）と相補的であり、かつ、選択的にハイブリダイズすることができる二本鎖５’末端ステム－ループ配列（３）および一本鎖３’末端オーバーハング配列（２）を含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブ（４）は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖３’末端配列がハイブリダイズする、３’末端領域（８）と重複しない核酸分析物（６）の別の領域（７）と相補的であり、かつ、選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖５’末端配列（５）を含む、バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムに基づくハイブリダイゼーションアッセイを記載する。(B)第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの両方は、核酸分析物（６）のそれらの相補的領域とハイブリダイズする。第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）のハイブリダイゼーションは、核酸分析物（６）の３’末端および第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）の５’末端を含む安定化ニック構造（９）の形成をもたらす。
【0058】
図２（A）は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを含み、第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）は、核酸分析物（６）の３’末端領域（８）に相補的であり、選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖３’末端オーバーハング配列（２）および二本鎖５’末端ステム－ループ配列（３）を含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブ（１０）は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖３’末端配列がハイブリダイズする、３’末端領域（８）に隣接する位置にある核酸分析物（６）の別の領域（１２）に相補的であり、かつ選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖５’末端配列（１１）を含む、バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムに基づくハイブリダイゼーションアッセイを記載する。(B) 第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの両方は、核酸分析物（６）のそれらの相補的領域とハイブリダイズする。第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）のハイブリダイゼーションにより、核酸分析物の３’末端および第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端を含む安定化ニック構造（９）が形成され、核酸分析物（６）における２つのプローブの相補的領域の隣接位置により、第２のオリゴヌクレオチドプローブ（４）の５’末端および第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）の３’末端を含む別の安定化ニック構造（１３）が形成される。
【0059】
図３（A）は、第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）が、核酸分析物（１７）の３’末端領域（８）に相補的であり、選択的にハイブリダイズすることができる二本鎖５’末端ステム－ループ配列（３）および一本鎖３’末端オーバーハング配列（２）を含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブ（１４）が、第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）の一本鎖３’末端配列がハイブリダイズする、３’末端領域（８）に隣接する位置にある核酸分析物（１７）の５’末端領域（１８）に相補的であり、かつ選択的にハイブリダイズすることができる、一本鎖３’末端オーバーハング配列（１６）および二本鎖５’末端ステム－ループ配列（１５）を含む、バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムに基づくハイブリダイゼーションアッセイを記載する。(B) 第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの両方は、核酸分析物（１７）のそれらの相補的領域とハイブリダイズする。第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）のハイブリダイゼーションにより、核酸分析物の３’末端および第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端を含む安定化ニック構造（９）が形成され、第２のオリゴヌクレオチドプローブ（１１）のハイブリダイゼーションにより、核酸分析物の５’末端および第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端を含む安定化ニック構造（１８）が形成され、核酸分析物（１７）における２つのプローブの相補的領域の隣接位置により、第２のオリゴヌクレオチドプローブ（１１）の５’末端および第１のオリゴヌクレオチドプローブ（１）の３’末端を含むさらに別の安定化ニック構造（１３）が形成される。
【0060】
ハイブリダイゼーションバイオアッセイの図１～３は、（A）バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムおよび短標的核酸分析物を含むアッセイ成分、および（B）短標的核酸分析物の存在下でのバイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムの１つまたは複数のニック構造を含むハイブリダイゼーション複合体の形成を示す。ハイブリダイゼーション複合体の形成は、定義された配列組成および短い標的核酸分析物の長さに依存する。短い標的核酸分析物の非存在下では、バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムの２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブはハイブリダイズされず、すなわちハイブリダイゼーション複合体もニック構造も形成されない。
【0061】
短い標的核酸の配列組成が、バイナリプローブ系の２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブの結合領域において完全に相補的でない場合、または短い標的核酸の長さがニック構造のいずれの形成も可能にしない場合、バイナリオリゴヌクレオチドプローブシステムの２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つはハイブリダイズされない。２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸上で同時にハイブリダイズしない場合、バイナリプローブシステムによってシグナルは生成されない。
【0062】
定義
「ステム－ループ」および「ステム－ループ構造」という用語は、ここでは、分子内パリンドローム（回文）配列を含む一本鎖核酸分子、すなわち、５’から３’および３’から５’方向に一致する配列を含む核酸分子（逆相補体）が、それ自体の上に部分的にループバックして、核酸分子内の一致する配列の間に位置するヌクレオチドを含む一本鎖ループ領域によってトップ（上部／上位／top）にされる相補的な二本鎖領域（ステム）を形成するときに形成される、ヘアピン構造としても知られる、ロリポップ形状の核酸構造を意味すると理解されるものとする。
「ステム－ループ」および「ステム－ループ構造」という用語は、ここでは、分子内パリンドローム（回文）配列を含む一本鎖核酸分子、すなわち、５’から３’および３’から５’方向に一致する配列を含む核酸分子（逆相補体）が、それ自体の上に部分的にループバックして、核酸分子内の一致する配列の間に位置するヌクレオチドを含む一本鎖ループ領域によってトップ（上部／上位／top）にされる相補的な二本鎖領域（ステム）を形成するときに形成される、ヘアピン構造としても知られる、ロリポップ形状の核酸構造を意味すると理解されるものとする。
【0063】
ステム－ループ構造に関連する用語「オーバーハング」は、ここでは、ステム－ループ構造の外側の核酸配列の一本鎖５’または３’末端延伸を意味するものと理解されなければならない。
【0064】
用語「ステム－ループプローブ」は、ここでは、１つのステム－ループ構造と、標的核酸のフラグメントに完全に相補的な１つの５’または３’末端オーバーハング配列のいずれかとを含有するオリゴヌクレオチドプローブを意味するものと理解されなければならない。オーバーハング配列の一部ではない末端は、二本鎖ステム構造の一部である。ステムループプローブはヘアピンプローブとも呼ばれる。
【0065】
「ニック」および「ニック構造」という用語は、ここでは、二本鎖核酸における不連続性を意味するものと理解されなければならず、ここでは、二重らせんの２つの核酸鎖のうちの一方の核酸鎖において、厳密に隣接するヌクレオチド間にホスホジエステル結合の代わりにギャップが存在するが、他方の鎖は無傷であり、ハイブリダイズした鎖はニックの存在下でも解離しない。したがって、ニック構造では、２つの隣接する（すなわち、核酸配列のすぐ隣接する）ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の欠損によって生じた二本鎖核酸の一方の鎖の切断があり、これらは両方とも反対側の鎖と塩基対を形成するのに相補的である。ニック構造は、二本鎖核酸DNAの一方の鎖に５’および３’末端を含み、前記５’および３’末端の末端ヌクレオチドと塩基対を形成する際に相補的なヌクレオチド間の反対側の鎖には、一本鎖領域、すなわち、もう一方の鎖と塩基対を形成する際に相補的なヌクレオチドのない一本鎖ヌクレオチドさえ存在しない。ニック構造は、欠落したホスホジエステル結合の位置に５’末端ホスフェート（すなわち、５’末端ヒドロキシル基でカップリングされたリン酸基）を含むことができるか、または含まないことができる。ニック構造における３’末端は、典型的には３’水酸基を含む。
【0066】
用語「オリゴヌクレオチドプローブ」は、関心の核酸分析物に対して相補的配列を含み、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブシステムの一部として核酸分析物を検出および定量するために使用される標識ポリヌクレオチドを指す。
【0067】
「相補的」および「相補的配列」という用語は、ここでは、塩基対（A－T、A－UおよびC－G）を一致させることにより、他の核酸配列とハイブリダイズし、二本鎖構造を形成することができる塩基の核酸配列を意味するものと理解されるものとする。二本鎖構造では、配列は逆向きに進む。すなわち、相補的な配列はもう一方の配列と逆相補的である。ハイブリダイゼーションの際、相補的な核酸配列は、二本鎖核酸構造、典型的にはDNA二重らせんまたはRNA－DNA二重鎖を形成する。２つの一本鎖ヌクレオチド配列は、典型的には、１つの鎖のヌクレオチドが、最適に配列され、比較されたときに、他の核酸鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、少なくとも約９０％～９５％、およびより好ましくは約９８％～１００％と選択的に対合する場合、相補的であるといわれる。当業者に知られているように、ハイブリダイゼーションを含む特異性および感受性のために、非常に高い程度の相補性、好ましくは１００％が必要である。
【0068】
「バイナリプローブ」、「バイナリプローブシステム」および「バイナリオリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、ここでは、両方の部分が標的核酸分子内の近位または隣接位置にハイブリダイズした場合にのみ検出可能なシグナルを生成する、オリゴヌクレオチドプローブ分子の対、すなわち、２つの別個のオリゴヌクレオチドプローブ部分を意味するものと理解されなければならない。バイナリプローブの両方の部分は、標的核酸の隣接位置に相補的なオリゴヌクレオチド配列を含み、加えて、バイナリプローブの２つの部分が標的核酸上でハイブリダイズするときに信号を生成する標識一対または標識フラグメントの一部、機能的部分を含む。このようなバイナリプローブの実施例は、スプリットおよび２成分プローブ［Chem. Rev. (2010) 110: 4709-4723］である。
【0069】
「特異的にハイブリダイズする」および「特異的なハイブリダイゼーション」および「選択的にハイブリダイズする」という用語は、本明細書において、ストリンジェントな条件下で特定の相補的ヌクレオチド配列に優先的に核酸配列の結合、二重化、またはハイブリダイズを意味するために使用される。
【0070】
用語「標識化」および「オリゴヌクレオチド標識化」は、ここでは、１つまたは複数の定義された位置におけるオリゴヌクレオチドプローブへの標識部分の共有結合を意味すると理解されるものとする。オリゴヌクレオチドプローブの標識化は、適切な基礎的要素（構成単位）を用いて、標識部分のみを導入するか、または標識部分を含有する修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの特定の位置に導入することにより、オリゴヌクレオチド合成中に行うことができる。［Chapter "Solid-phase oligonucleotide labeling with DOTA" by Jaakkola, et al. (2007) in Current protocols in nucleic acid chemistry, edited by Beaucage, S.L. et al.; Chapter 14: Unit 4.31; online publication by John Wiley & Sons］あるいは、合成されたオリゴヌクレオチド中で、リンカーによりヌクレオチドにカップリングされた第１級アミノ基を含む、例えばアミノ反応性標識部分を修飾ヌクレオチドにカップリングすることによって、合成後に標識化することができる。両方のアプローチにおいて、標識はリンカーを介してオリゴヌクレオチドにカップリングされる。合成中および合成後標識中の両方の組合せは、オリゴヌクレオチド中の異なる位置への異なる標識部分の導入を可能にする。塩基が相補的塩基と適切にハイブリダイズすることができる位置で、リンカーが核酸塩基と結合している修飾されたヌクレオチド構成単位は、塩基のスタッキングおよび二重らせんの安定性を妨げることなく、オリゴヌクレオチドおよび二重らせんの任意の位置に実質的に標識を結合することを可能にする。リンカーは、例えば、脂肪族炭素鎖またはポリエチレン酸化物鎖であり得る。標識部分は、例えば、ヨードアセトアミド、N－ヒドロキシスルホスクシンイミド、マレイミドまたはイソチオシアナート活性化「クリック化学」アプローチ［J. Am. Chem. Soc. (2005) 127:14150-14151; Trends Biochem. Sci. (2005) 30:26-34］を用いて共有結合させることができる。
【0071】
「固体支持体」という用語は、オリゴヌクレオチドプローブの標識に使用されるのと同様のカップリング化学を利用して、プローブの１つを吸着または固定することができる不溶性材料を指す。このタイプの公知の材料には、ポリスチレンおよびポリプロピレンのような炭化水素系重合体が含まれる。さらに、固体支持体は、シリカゲル、シリコーンウェハ、ガラス、金属から構成される。固体支持体は、物理的に、粒子、ビーズ、チューブ、スライド、ストリップ、ディスクまたはマイクロ滴定ウェルおよび板の形態であってもよい。
【0072】
「蛍光」および「発光」という用語は、ここでは、光発光、すなわち、光によって励起される発光、マイクロ秒またはミリ秒の蛍光寿命を有する遅延蛍光を含む蛍光、および燐光をカバーすると理解されるものとする。さらに、この用語は、電気発生発光および電気化学発光を含む（カバーする）ものとする。発光は、定常状態発光として、または時間ゲート発光として測定または画像化することができる。
【0073】
「ランタノイド（ランタニド）」および「ランタノイドイオン」および「発光ランタノイドイオン」および「Ln3+」という用語は、ここでは、「希土類金属イオン」と同等であると理解され、セリウム、ネオジム、プラセオジム、サマリウム、ユーロピウム、プロメチウム、ガドリニウム、ルテチウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、およびイットリウム、特にユーロピウム、テルビウム、サマリウム、ジスプロシウム、エルビウム、ネオジムおよびイッテルビウムからの、単一の三価ランタノイドイオンおよび様々な三価ランタノイドイオンまたは希土類イオンの任意の組合せを含むものと理解されるものとする。
【0074】
本開示において、「発光ランタノイドキレート」、「蛍光ランタノイドキレート」、「発光ランタノイド錯体（複合体）」、および「補完ランタノイドキレート」という用語は、ランタノイドイオンキャリアキレートおよび集光アンテナリガンドを含む発光錯体を含むものと理解されなければならず、ここで、イオンキャリアキレート中のランタノイドイオンの発光は、集光アンテナ中の集光発色団または他の励起可能な構造を通して励起される。発光ランタノイドキレートは、イオンキャリアリガンドに共有結合した集光アンテナを含むことができる。補完ランタノイドキレートは、イオンキャリアキレートと配位結合によってランタノイドイオンに結合した集光アンテナリガンドとを含む混合キレートとすることができる。固有蛍光ランタノイドキレートの例は、ユウロピウム（III）およびテルビウム（III）キレートおよびクリプテートであり、これらは、それぞれ、リガンドの一部であり、ランタノイドイオンに応じて６２０nmまたは５４５nmで発光する発色団を介して波長範囲３２０～３６５nmで励起され得る。
【0075】
用語「ランタノイドイオン担体（キャリア）キレート」、「イオン担体キレート」および「担体キレート」は、キレートリガンド、すなわちイオン担体リガンドおよび発光ランタノイドイオンを含むが、担体キレート中のランタノイドイオンの発光を効率的に励起するために不可欠である効率的な集光アンテナ発色団を含まない、本質的に非発光ランタノイドキレート錯体およびそれらの誘導体を含むものと理解されるものとする。ランタノイドイオン担体キレートの例は、ユウロピウム（III）または他の発光ランタノイドイオンの環状または非環状アミノポリカルボン酸キレートであり、ここで、ランタノイドイオンの配位数は、好ましくは６座以上、最適には７または８であるが、ランタノイドイオンの発光を増感および励起するための効率的な集光アンテナ構造を含まない[国際出願WO 2010/109065］。オリゴヌクレオチドの標識化のためのイオン担体キレートのさらなる構造は、例えば、米国特許第6,949,639号に示されている。
【0076】
「補完リガンド」、「集光アンテナ」または「アンテナリガンド」という用語は、本質的に非発光性のキレートリガンドおよびそれらの誘導体を含み、これらは、集光性発色団または他の励起可能な構造を含み、ランタノイドイオン担体キレートを補完して発光性ランタノイド錯体を形成することができ、ここで、担体キレート中のランタノイドイオンの発光は、その光励起または電気励起のいずれかに際して、アンテナリガンド中の集光性発色団または他の励起可能な構造からの非放射性エネルギー移動を通して励起されることが理解される。通常、アンテナリガンドは単座、二座、三座または四座リガンド（配位子）、最も好ましくは二座または三座リガンドであり、有機集光構造は芳香環または複素環を含み、集光構造はイオンキャリアキレート中に存在する三価ランタノイドイオンに適した三重項状態エネルギー準位（レベル）を有する。ランタノイドイオンの適切な三重項状態エネルギーと集光構造の実施例をPCT公開公報のWO2010/109065およびJ. Luminescence (1997) 75: 149-169に示した。
【0077】
用語「FRET－対（ペア／一対）」および「蛍光共鳴エネルギー移動ドナーおよびアクセプタ対」は、蛍光色素（ドナー）と別の蛍光色素または非蛍光色素（アクセプタ）との組み合わせを意味するものと理解されるものとし、ここで、i）色素がドナーの発光とアクセプタの吸収との間にスペクトル重複を有し、色素が近接しているときには、ドナーからアクセプタへとフェルスター型共鳴エネルギー移動を可能にするか、またはii）アクセプタ色素が、色素が近接しているときにドナーからアクセプタへのエネルギー移動を可能にするためにスペクトル重複を必要としない、いわゆるユニバーサルクエンチャーである。
【0078】
「非発光性」および「非蛍光性」という用語は、励起および励起状態から緩和されたときに、所望の種類の発光、例えば長寿命発光のいかなるまたは有意な量を生じない光吸収性化合物の特性として理解されるものとする。発光化合物とは対照的に、非発光化合物の励起状態エネルギーは、非放射経路を介して主に緩和され、典型的には光の代わりに熱を発生し、またはゆっくりと減衰する発光の代わりに急速な発光を生じるか、または励起効率が弱い。非発光性化合物のモル励起係数またはモル吸光係数は非常に低く、典型的には１０L mol-1cm-1未満であり、または非発光性化合物の蛍光量子収率は非常に低く、典型的には５％未満であり、または長寿命発光の寿命は１マイクロ秒より短く、典型的には１００ナノ秒未満である。非発光性化合物の実施例は、ランタノイドキレートであり、ランタノイドイオンの効率的な励起のための集光アンテナ構造を含まず、ランタノイドイオンに配位しておらず、したがって長寿命発光を生成することができない集光アンテナリガンドである。
【0079】
「ランタノイド発光」および「発光」という用語は、ランタノイドイオンの電子遷移の発光緩和から得られる発光（すなわち、発光）を意味すると理解されるものとする。ランタノイド発光は、ランタノイドイオンの励起によって、直接的または間接的な光吸収によって、または電気的に生成された化学的励起によって生成することができる。
【0080】
「キレート」という用語は、単一の中心金属イオンが少なくとも１つの配位結合を有する少なくとも１つのリガンドに配位する配位錯体として定義される。これらの錯体は異なる原理によって命名され、キレート、超分子化合物、錯体およびコンプレキソン（complexone）のような名称が使用される。特別なタイプのキレートには、例えば、ポリアミノカルボキシル酸、大環状錯体、クラウンエーテル、クリプテート、カリキサレンおよびフォルフィリンが含まれる。用語「混合キレート」は、それぞれ少なくとも１つの配位結合に配位した少なくとも２つの異なるリガンドを含むキレートとして理解されなければならない。
【0081】
「時間分解ランタノイド蛍光」、「時間分解蛍光」、「長寿命ランタノイド発光」および「長寿命蛍光」という用語は、ここでは、発光化合物の発光寿命が１マイクロ秒以上（発光強度が１／eの相対値、すなわち、元の発光強度の約３７％まで減衰する時間として計算される寿命）であるランタノイド発光として理解されるものとする。長寿命蛍光が可能な化合物の例としては、適切な集光アンテナを含有するユウロピウム（III）、サマリウム（III）、テルビウム（III）およびジスプロシウム（III）の本質的蛍光キレート錯体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0082】
「光」、「励起光」および「発光光」という用語は、２００nmから１６００nmの波長の電磁放射をカバーするものと理解されるものとする。これらの波長は、４００nm以下の紫外光、３００～４５０nmの近紫外光、４００～７５０nmの可視光、７００～１０００nmの近赤外光、７００nm以上の赤外光と呼ばれる。
【0083】
「短寿命蛍光」および「短寿命蛍光化合物」という用語は、１マイクロ秒未満、好ましくは１００ナノ秒未満の発光寿命を有する蛍光および蛍光化合物をカバーするものと理解されるものとする。短寿命蛍光は、従来の蛍光とも呼ばれる。
【0084】
「電気発生発光」および「電気化学発光」という用語は、ここでは、電極を用いた電気発生化学励起によって生成され、電極に電流または電圧を印加することによって生成されるランタノイド発光として理解されるものとする。発光を生じる電気化学反応が起こる電極に応じて、電気化学発光は陰極または陽極電気化学発光と呼ばれる。電気発生発光化合物は、アノードまたはカソード電気発生発光が可能な化合物である。上記化合物の実施例は、緑色発光を生じるホットエレクトロン励起２，６－ビス［N，N－ビス（カルボキシメチルセルロース）－アミノメチル］－４－ベンゾイルフェノール－キレート化Tb(III)( J Alloys Comp 1995; 225: 502-506）であるが、電気発生発光が可能な他のランタノイド錯体が存在する。ランタノイド錯体の電気発生発光は、検出限界を改善するために時間分解能を用いて測定することもできる。
【0085】
本開示において、「バイオアッセイ」という用語は、蛍光または発光に基づく分析物の検出および／または定量、およびプローブのうちの少なくとも１つが二本鎖ステム－ループ構造を含むプローブ対を利用することを意味すると理解されるものとする。分析物は、典型的には、試料または試料のアリコートから検出および／または測定され、この試料は、例えば、生物学的または臨床的試料である。
【0086】
「均質なバイオアッセイ」という用語は、分離工程を必要としないバイオアッセイを含むものと理解される。必要なのは、各１つまたは多段階の、試薬の添加、インキュベーション、測定のみである。「分離工程」という用語は、例えばマイクロ粒子またはマイクロ滴定ウェルのような固相に結合した標識バイオアッセイ試薬を分離し、非結合の標識バイオアッセイ試薬から物理的に単離する工程と理解されなければならず、例えば、マイクロ滴定ウェルを洗浄し（液体を取り出し、分離を改善するために、追加の液体を加え、ウェルを空にする）、固相に結合した標識バイオアッセイ試薬を固相に結合していない標識バイオアッセイ試薬から分離する。
【0087】
用語「分析物」および「核酸分析物」は、本明細書では、対象のポリヌクレオチド物質として理解されるものとし、これは、試料からのバイオアッセイによって測定されるものとする。DNA(デオキシリボ核酸）およびRNA(リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。
【0088】
「試料」および「生体情報試料」という用語は、血清、血液、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、髄液、羊水、組織ホモジネート、腹水、環境試験からの試料（水および土壌試料）および工業プロセス（処理溶液）のような、分析物の検出される各種液体または固体の生体情報試料を含むものと理解されるものとする。試料は、生物学的試料の前処理工程の生成物であってもよい。
【0089】
本発明の好適な実施形態
本発明による核酸分析物を検出し、および／または核酸分析物濃度を定量するための典型的な発光ハイブリダイゼーションアッセイ方法は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを試料と接触させる工程を含む、バイナリプローブシステムを採用し、ここで、
(a)第１のオリゴヌクレオチドプローブは、
二本鎖末端ステム－ループ構造と、
前記核酸分析物の第１の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端オーバーハング配列と、
を含み、
(b)第２のオリゴヌクレオチドプローブは、
前記核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列を含み、
前記核酸分析物の前記第１の領域は末端領域であり、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端オーバーハング配列は、前記核酸分析物の前記第１の領域にハイブリダイズし、
該ハイブリダイズは、前記核酸分析物の末端と前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の末端との間の第１のニック構造の形成をもたらし、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の末端は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステム－ループ構造の一部であり、
前記核酸分析物の前記第１および第２の領域は、前記核酸分析物の隣接する領域であり、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの第２の末端と前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の末端との間に第２のニック構造を形成する前記核酸分析物とハイブリダイズし、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合した前記核酸分析物の有無を検出し、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合した前記核酸分析物の存在により、試料中の分析物の存在を確認する。
本発明による核酸分析物を検出し、および／または核酸分析物濃度を定量するための典型的な発光ハイブリダイゼーションアッセイ方法は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを試料と接触させる工程を含む、バイナリプローブシステムを採用し、ここで、
(a)第１のオリゴヌクレオチドプローブは、
二本鎖末端ステム－ループ構造と、
前記核酸分析物の第１の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端オーバーハング配列と、
を含み、
(b)第２のオリゴヌクレオチドプローブは、
前記核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列を含み、
前記核酸分析物の前記第１の領域は末端領域であり、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端オーバーハング配列は、前記核酸分析物の前記第１の領域にハイブリダイズし、
該ハイブリダイズは、前記核酸分析物の末端と前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の末端との間の第１のニック構造の形成をもたらし、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の末端は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステム－ループ構造の一部であり、
前記核酸分析物の前記第１および第２の領域は、前記核酸分析物の隣接する領域であり、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの第２の末端と前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の末端との間に第２のニック構造を形成する前記核酸分析物とハイブリダイズし、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合した前記核酸分析物の有無を検出し、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブに結合した前記核酸分析物の存在により、試料中の分析物の存在を確認する。
【0090】
本発明の別の実施形態によれば、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、二本鎖末端ステム－ループ構造と、核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端オーバーハング配列とを含み、核酸分析物の第２の領域は、末端領域であり、第２のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端オーバーハング配列は、核酸分析物の第２の領域とハイブリダイズし、該ハイブリダイズは、核酸分析物の第１の末端と、二本鎖末端ステム－ループ構造を含む第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の末端とを含む第３のニック構造を形成をもたらし、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の末端は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの二本鎖末端ステム－ループ構造の一部である。
【0091】
本発明によれば、第１の末端は３’末端（３つのプライム末端）であり、第２の末端は５’末端（５つのプライム末端）であり、または第１の末端は５’末端（５つのプライム末端）であり、第２の末端は３’末端（３つのプライム末端）である。
【0092】
本発明の典型的な実施形態において、核酸分析物は、ヌクレオチドモノマー、典型的にはデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかで構成され、直鎖状に共有結合されたポリヌクレオチド生体高分子である。直鎖ポリヌクレオチド鎖において、ヌクレオチドの配列は、隣接ヌクレオチド間に存在するホスホジエステル結合によって連結され、ヌクレオチドの直鎖配列は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、および前記末端ヌクレオチド間の複数の内部ヌクレオチドを含む。直鎖状ポリヌクレオチド鎖は、直鎖状の立体配座で存在するか、またはねじれて、および／または、温度の上昇によって不安定化され得る分子内非共有結合によって安定化された三次元立体配座に折りたたまれているかのいずれかであり得る。
【0093】
本発明の典型的な実施形態において、核酸分析物は、長さが１０～５０ヌクレオチド、より好ましくは１５～３０ヌクレオチド、最も好ましくは１６～２６ヌクレオチドの一本鎖核酸である。
【0094】
本発明の典型的な実施形態では、核酸分析物は、長さが１７～２５ヌクレオチドのマイクロRNAであり、ほとんどの典型的な実施形態では、長さが２１～２２ヌクレオチドのマイクロRNAである。
【0095】
本発明の好ましい態様において、ステム－ループプローブオリゴヌクレオチドの一本鎖末端オーバーハング配列の長さは、５～２５ヌクレオチド、より好ましくは５～２０ヌクレオチド、最も好ましくは５～１５ヌクレオチドである。
【0096】
本発明の好ましい態様において、ステム－ループ構造における二本鎖ステム配列の長さは４～１６塩基対であり、すなわちループの両側に位置するパリンドローム（回文）配列は４～１６ヌクレオチドの長さを有する。
【0097】
本発明の好ましい態様において、二本鎖ステム－ループ構造における一本鎖ループ配列の長さは、１～１２ヌクレオチド、より好ましくは３～８ヌクレオチド、最も好ましくは４～７ヌクレオチドである。
【0098】
本発明の好ましい実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブは、DNA(デオキシリボ核酸）、RNA(リボ核酸）、またはLNA(ロックト核酸）およびPNA(ペプチド核酸）などのそれらの合成アナログ、またはそれらの任意の組み合わせを含み、本発明の最も好ましい実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブは、DNAまたはRNAヌクレオチドのみを含む。
【0099】
本発明の典型的な実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブは両方とも標識されるか、または両方のプローブが標識され、プローブの１つが任意の種類の固体支持体にさらにカップリングされる。ステム－ループプローブの固体支持体へのカップリングは、好ましくは、ループ配列中の修飾ヌクレオチドを介して行われる。一本鎖オーバーハングを有するこのような固定化ステムループプローブの実施例は、Nucleic Acids Res. 2001; 29: e92ループ配列の好ましい長さを７塩基として説明し、ループ配列の中間にNH2－C６－dTヌクレオチドを含む。
【0100】
本発明の一実施形態によれば、標的核酸分析物は、アガロースゲル電気泳動を使用して、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブと分析物とのハイブリダイゼーション時に形成された複合体を分離し、インターカレート色素を使用して形成された複合体を可視化することによって、検出および／または定量される。形成された複合体は、サイズおよびコンホメーションの違いにより、個々のプローブまたは分析物と比較して、アガロースゲル電気泳動上で異なる移動度を有する。非標識プローブハイブリダイゼーション反応およびハイブリダイゼーション複合体のアガロースゲル電気泳動分離に基づくmiRNA検出アッセイの実施例は、[Sciences Advances 2019; 5: aau9443］に記載されている。
【0101】
本発明のさらに別の実施形態によれば、標的核酸分析物は、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブと分析物およびSYBR Green Iのような二本鎖核酸（dsDNA、dsRNAおよびDNA：RNA－ハイブリッド）結合色素とのハイブリダイゼーションの際に形成される複合体の融解曲線分析を使用することによって検出および／または定量され、色素は、二本鎖核酸複合体への結合の際に結合して蛍光を発し、融解曲線分析を使用して、分析物と形成される複合体の存在を確認することができる。SYBR Green Iによる標識なしプローブハイブリダイゼーション反応および融解曲線分析に基づくmiRNAおよび核酸配列変異検出の実施例は、[The Analyst 2013: 141: 2384－2387, doi:10.1039/c6an00001k; PloS ONE 2011; 6: e26534］に記載されている。
【0102】
本発明の好ましい態様において、標的核酸分析物は、蛍光測定を使用して、より好ましくは時間ゲート蛍光測定を使用して、検出および／または定量される。
【0103】
本発明の一実施形態によれば、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動対で標識され、ここで、
（a）第１のオリゴヌクレオチドプローブが蛍光ドナーを含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブが蛍光アクセプタまたはクエンチャーを含む、または
（b）蛍光アクセプタまたはクエンチャーを含む第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび蛍光ドナーを含む第２のオリゴヌクレオチドプローブ
のいずれかであり、
蛍光共鳴エネルギー移動対間の共鳴エネルギー移動は、両方のハイブリッド化現象の発生、核酸分析物の第１領域に対する第１オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列のハイブリダイゼーション、および核酸分析物の第２領域に対する第２オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列のハイブリダイゼーションの時に可能である。
（a）第１のオリゴヌクレオチドプローブが蛍光ドナーを含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブが蛍光アクセプタまたはクエンチャーを含む、または
（b）蛍光アクセプタまたはクエンチャーを含む第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび蛍光ドナーを含む第２のオリゴヌクレオチドプローブ
のいずれかであり、
蛍光共鳴エネルギー移動対間の共鳴エネルギー移動は、両方のハイブリッド化現象の発生、核酸分析物の第１領域に対する第１オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列のハイブリダイゼーション、および核酸分析物の第２領域に対する第２オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列のハイブリダイゼーションの時に可能である。
【0104】
本発明の１つの実施形態によれば、増感されたアクセプタ発光が測定される場合、ドナーおよびアクセプタは、核酸分析物へのハイブリダイゼーション後、ヌクレオチドを担持する標識の位置が、好ましくは少なくとも４ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、しかし２４ヌクレオチド以下分離されるオリゴヌクレオチドプローブ中のこのような位置への標識の間に結合される。
【0105】
蛍光共鳴エネルギードナーは、好ましくは、ランタノイドイオンを含む発光性ランタノイドキレートである。適切なランタノイドドナーの実施例は、Lumi４－Tbクリプテート、Eu-TBP (トリスビピリジン）クリプテート、Eu－W１０２４キレート、Eu－W１２８４およびEu－W８０４４キレート、並びに非アデンタート（nonadentate）およびデカンテート（decadentate）Eu（III）キレートであり、Anal Chem (2003) 75:3193-201 and Inorg Chem. (2013) 52:8461-6に記載されている。
【0106】
蛍光受容体は、多数の種々の蛍光色素からのドナー発光とアクセプタ励起スペクトルとの間のスペクトル重複に基づいて選択することができ、好ましくは、スペクトルの可視領域または近赤外領域で励起および発光を有する短寿命蛍光化合物（ATTO、QXL、Alexa、BodipyおよびCyanine色素など）から選択することができる。ドナーとして蛍光Eu（III）またはTb（III）キレートと組み合わせて使用される適切な蛍光アクセプタの例は、ATTO 647および647N、Alexa Fluor(登録商標）647および647N、Cy ３、Cy ３.５、Cy ５、Cy ５.５、Cy ７、XL 665（架橋アロフィコシアニン）、Chromeo（商標）494、ATTO 490LS、QXL 610、QXL 670、QXL 680、LCレッド、Quasar 670、およびOyster 645である。
【0107】
非蛍光消光剤（クエンチャー）は、好ましくは、DabcylまたはBHQもしくはQSY消光剤のいずれかのような効率的なスペクトル重複を必要としないユニバーサル消光剤から選択される。ドナーとして蛍光Eu（III）またはTb（III）キレートと組み合わせて使用される適切な非蛍光性アクセプタの例は、ダブシル（ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸）、アイオワブラックRQ、IRDye QC－１、BHQ－０、BHQ－１、BHQ－２、BHQ－３、QSY ２１およびDDQ－IIである。
【0108】
本発明の別の実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブは、切換ランタノイド発光標識システムで標識され、
（a）第１のオリゴヌクレオチドプローブは、ランタノイドイオンキャリアリガンドとランタノイドイオンとを含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、アンテナリガンドを含む、または
（b）第１のオリゴヌクレオチドプローブは、アンテナリガンドを含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、ランタノイドイオンキャリアリガンドおよびランタノイドイオンを含む、
のいずれかであり、
スイッチング可能なランタノイド発光標識システムの発光は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列の核酸分析物の第１の領域へのハイブリダイゼーション、および第２のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列の核酸分析物の第２の領域へのハイブリダイゼーションの、両方のハイブリダイゼーション事象の発生時にスイッチオンされる。
（a）第１のオリゴヌクレオチドプローブは、ランタノイドイオンキャリアリガンドとランタノイドイオンとを含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、アンテナリガンドを含む、または
（b）第１のオリゴヌクレオチドプローブは、アンテナリガンドを含み、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、ランタノイドイオンキャリアリガンドおよびランタノイドイオンを含む、
のいずれかであり、
スイッチング可能なランタノイド発光標識システムの発光は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列の核酸分析物の第１の領域へのハイブリダイゼーション、および第２のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列の核酸分析物の第２の領域へのハイブリダイゼーションの、両方のハイブリダイゼーション事象の発生時にスイッチオンされる。
【0109】
本発明の１つの実施形態によれば、２つのオリゴヌクレオチドプローブが核酸分析物中の隣接領域にハイブリダイズする場合、ランタノイドイオンキャリアキレートおよびアンテナリガンドは、核酸分析物へのハイブリダイゼーション後、ヌクレオチドを担持する標識の位置が、少なくとも１つのヌクレオチド、好ましくは２～４ヌクレオチドによって分離されて、自己集合および混合キレート複合体の形成を立体的に有利にするオリゴヌクレオチドプローブ中のそのような位置に標識する間に付着される。
【0110】
アンテナリガンドは、好ましくは、前記ランタノイドイオンに弱く結合する、すなわち、本発明の典型的な実施形態では、アンテナリガンドは、単座、二座、三座または四座のいずれかである。４－（（４－イソチオシアナトフェニル）エチニル）ピリジン－２，６－ジカルボン酸および４－（（４－（４，６－ジクロロ－１，３，５－トリアジン－２－イル）アミノ）フェニル）エチニル）ピリジン－２，６－ジカルボン酸などの好ましいアンテナリガンドの実施例は、国際出願公開公報のWO 2010/109065、およびAnalyst 2017; 142:2411-2418にそれぞれ記載されている。
【0111】
本発明の典型的な実施形態では、イオン担体キレートは、五座、六座、七座または八座、好ましくは六座、七座または八座である。例えば、ランタノイドイオン担体リガンドは、それぞれEDTAおよびDTPAまたはNOTAおよびDOTAのような直鎖状または環状キレート化剤由来である。（２，２’，２’’－（１０－（３－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）トリ酢酸およびN１－（４－イソチオシアナトベンジル）ジエチレントリアミン－N1,N2,N3,N3－テトラアセタートなどの好ましいイオン担体リガンドの例は、国際出願公開公報のWO 2010/109065に記載されている。
【0112】
ランタノイドイオンは、好ましくは、プラセオジム（III）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、ユウロピウム（III）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、エルビウム（III）、ツリウム（III）およびイッテルビウム（III）からなる群から選択される。
【0113】
本発明のさらに別の実施形態によれば、各々が少なくとも部分的に異なる第１および／または第２のオリゴヌクレオチドプローブから構成される、２つ以上の異なる２つのプローブシステムを使用して、マルチパラメトリックアッセイを構築し、同じ試料から複数の異なる短い核酸分析物を同時に検出する。典型的には、異なるバイナリプローブシステムのそれぞれは、異なるランタノイドイオンを含み、および／または各バイナリプローブシステムのプローブの１つは、任意の種類の固体支持体上の空間的に分離された表面積に結合される。
【0114】
本発明の好ましい態様において、形成された蛍光錯体の発光、蛍光ドナーの発光、または蛍光アクセプタ発光の増感発光は、４００～１６００nmの波長で測定される。
【0115】
標的核酸の存在下での本発明の典型的な実施形態では、形成された蛍光複合体の蛍光測定またはアクセプタの増感発光が増加し、一方、蛍光ドナーの測定された蛍光が減少し、本発明の好ましい実施形態では、標的核酸の存在を、いかなる分離工程もなしに検出および定量することができる。
【0116】
本発明の１つの実施形態によれば、プローブの１つが任意の種類の固体支持体にカップリングされる場合、分離工程を含むことができ、固相結合シグナルのみを読み取り、標的核酸を検出および定量する。
【0117】
本発明の好ましい実施形態では、蛍光は時間ゲートによって測定され、すなわち遅延蛍光のみが観察される。ランタノイド発光による典型的な時間ゲートは、励起の終了と発光測定の開始との間の少なくとも１０μsの遅延を含む。
【0118】
本発明の一実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプローブの５’水酸基末端は非リン酸化である。
【0119】
本発明の別の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも１つの５’ヒドロキシル末端はリン酸化され、リガーゼ酵素は、第１のオリゴヌクレオチドプローブ、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブおよび核酸分析物の間のハイブリダイゼーション事象のいずれかの発生時に形成される第１、第２および第３のニック構造のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせの場所で共有結合を形成するために使用される。例えば、T４ RNAリガーゼ２はRNA鋳型上のDNA断片の連結反応（ライゲーション）を触媒することができ、いくつかのDNAリガーゼはDNA鋳型上の５’‐リン酸末端DNAに３’‐OH末端RNAを効率的に連結することもできる［Biochemistry 1997; 36: 9073-9079］。
【0120】
リガーゼ酵素処理は、好ましくは、蛍光測定より低い温度で行われ、ニックエリアが連結されていない場合にハイブリダイズしたプローブを不安定化し、好ましくは解離する。
【0121】
本発明のさらに別の実施形態によれば、２つのオリゴヌクレオチドプローブを含むバイナリプローブシステムに基づく発光ハイブリダイゼーションアッセイであって、少なくとも１つのプローブがバイナリプローブシステム上のステム－ループ構造を含むものは、インサイチュハイブリダイゼーションで使用される、発光ハイブリダイゼーションアッセイが行われる。
【0122】
本発明のさらに別の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションは、１５～８０℃の間、より好ましくは１５～６０℃の間、最も好ましくは２０～４０℃の間の温度で実施される。測定は、オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションと同じまたは異なる温度で行う。
【0123】
本発明のさらに別の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションは、１５０mM～１M濃度のNaClの存在下で実施される。測定は、オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションと同じまたは異なる濃度のNaClで行う。
【0124】
本発明の一実施形態によれば、核酸分析物は、血漿および血清などの体液から検出上記定量される。本発明の好ましい態様において、酵素的核酸増幅または核酸伸長は使用されないが、試料の前処理は、例えば、免疫捕捉または他の核酸分析物濃縮工程を含むことができる。
【0125】
本発明の代替の実施形態の例は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブの少なくとも１つがステムループ構造を含み、標的核酸の検出および定量が、２つのオリゴヌクレオチドプローブの同じ核酸標的分子への同時結合を必要とする、バイナリプローブシステムに基づく発光ハイブリダイゼーションアッセイを、図４～８にさらに記載する。図４～６および８は、キレート相補性に基づく検出を利用する本発明の代替実施形態を記載し、図７は、本発明の実施形態に基づく蛍光共鳴エネルギー移動を記載する。
【0126】
図４は、リンカー（２０）を介してランタノイドイオン担体キレート（１９）で標識された第１のオリゴヌクレオチドプローブ（２１）が、核酸分析物（２５）の３’末端領域に相補的な二本鎖５’末端ステム－ループ配列および一本鎖３’オーバーハングを含み、リンカー（２３）を介して集光アンテナ（２４）で標識された第２のオリゴヌクレオチドプローブ（２２）が、核酸分析物（２５）の５’末端領域に相補的な二本鎖３’末端ステム－ループ配列および一本鎖５’オーバーハングを含む、２つのキレート補完オリゴヌクレオチドプローブを含む、発光バイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイシステムの実施例を示す。プローブ配列に相補的な核酸分析物の領域は、核酸分析物の配列中に隣接して位置する。ラムダ－１波長で励起すると、ランタノイドイオンキャリアキレート（２１）および集光アンテナ（２４）は、プローブが同じ核酸分析物分子に結合していない場合、実質的に非発光性である。(B)第１の（２１）および第２の（２２）オリゴヌクレオチドプローブの両方は、核酸分析物分子（２５）のそれらの相補的領域にハイブリダイズする。プローブの隣接ハイブリダイゼーションは、指向自己集合（セルフアッセンブリ）および蛍光キレート錯体（２６）の形成をもたらし、ラムダ－１波長で励起するとラムダ－２波長で発光を生じる。
【0127】
標的核酸結果物上の記載された隣接領域上での２つのステム－ループオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、２つのプローブが非常に短い相補的配列のみを有する場合でさえ、その２つのプローブの強力な協同結合を可能にする３つの安定化ニック構造の形成をもたらす。共作用結合は、イオンキャリアキレート中のランタノイドイオンへの集光アンテナリガンドの配位によってさらに増強される。この協同的な安定化効果に影響を及ぼす因子のいずれも存在しない場合、プローブの解離が有利である。高度に選択的なハイブリダイゼーションは、核酸分析物中の規定された３’および５’末端配列の存在および核酸分析物の規定された長さに厳密に特異的な蛍光キレート錯体の形成をもたらす。末端配列に何らかの差異が存在するか、または核酸分析物の配列の長さが規定された長さと一致しない、すなわち、核酸分析物が配列中のヌクレオチドの欠失を有するか、または末端オーバーハングを含む場合、プローブのうちの少なくとも１つは解離したままであり、したがって蛍光キレート錯体は形成されない。短い核酸分析物を検出し定量する方法の特異性は、したがってユニークであり、協同安定化効果は、既存のハイブリダイゼーションプローブアッセイまたはバイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイで可能であるよりも短い核酸分析物の検出を可能にする。
【0128】
図５は、リンカー（２０）を介してランタノイドイオン担体キレート（１９）で標識された第１のオリゴヌクレオチドプローブ（２１）が、核酸分析物（２８）の３’末端領域に相補的な二本鎖５’末端ステム－ループ配列および一本鎖３’オーバーハングを含み、リンカー（２３）を介して集光アンテナ（２４）で標識された第２のオリゴヌクレオチドプローブ（２７）が、第１のオリゴヌクレオチドプローブに相補的な、３’末端領域と重複しない核酸分析物（２５）に相補的な直鎖一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、２つのキレート相補性オリゴヌクレオチドプローブを含む、発光バイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイシステムの実施例を示す。プローブ配列に相補的な核酸分析物の領域は、核酸分析物の配列中に隣接して位置する。ラムダ－１で励起すると、ランタノイドイオンキャリアキレート（２１）および集光アンテナ（２４）は、プローブが同じ核酸分析物分子に結合していない場合、実質的に非発光性である。(B)第１の（２１）および第２の（２７）オリゴヌクレオチドプローブの両方は、核酸分析物分子（２８）のそれらの相補的領域にハイブリダイズする。プローブの隣接ハイブリダイゼーションは、指向自己集合および蛍光キレート錯体（２６）の形成をもたらし、ラムダ－１波長で励起するとラムダ－２波長で発光を生じる。
【0129】
核酸結果物上の隣接領域上のステム－ループオリゴヌクレオチドプローブと直鎖オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションは、２つのプローブの強力な共同結合を可能にする２つの安定化ニック構造の形成をもたらし、特にステム－ループプローブは非常に短い相補的配列のみを有する。この協同的な安定化効果がない場合、プローブの解離が有利である。高度に選択的なハイブリダイゼーションは、核酸分析物中の規定された３’末端配列の存在に厳密に特異的な蛍光キレート錯体の形成をもたらす。
【0130】
図６は、リンカー（２０）を介してランタノイドイオン担体キレート（１９）で標識された第１のオリゴヌクレオチドプローブ（２１）が、核酸分析物（２９）の３’末端領域に相補的な二本鎖５’末端ステム－ループ配列および一本鎖３’オーバーハングを含み、リンカー（２３）を介して集光アンテナ（２４）で標識された第２のオリゴヌクレオチドプローブ（２２）が、核酸分析物（２９）の５’末端領域に相補的な二本鎖３’末端ステム－ループ配列および一本鎖５’オーバーハングを含む、２つのキレート補完オリゴヌクレオチドプローブを含む発光バイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイシステムの実施例を示す。核酸分析物の配列において、プローブ配列に相補的な領域は、配列の短い非認識部分を構成する１つまたは複数の非定義中間体ヌクレオチド（n）によって分離される。ラムダ－１波長で励起すると、ランタノイドイオンキャリアキレート（２１）および集光アンテナ（２４）は、プローブが同じ核酸分析物分子に結合していない場合、実質的に非発光性である。(B)第１の（２１）および第２の（２２）オリゴヌクレオチドプローブの両方が、核酸分析物（２９）のそれらの相補的領域にハイブリダイズする。プローブの核酸分析物へのハイブリダイゼーションは、核酸分析物分子の屈曲および指向自己集合をもたらし、蛍光キレート錯体（２６）の形成をもたらし、それはラムダ－１波長での励起によりラムダ－２波長で発光を生じる。
【0131】
標的核酸分析上の隣接領域にある２つのステムループオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、２つのプローブの強力な協力結合を可能にする２つの安定化ニック構造の形成をもたらし、プローブでさえ非常に短い相補的な配列を有しているにすぎない。共作用結合は、イオンキャリアキレート中のランタノイドイオンへの集光アンテナリガンドの配位によってさらに増強される。この協同的な安定化効果がない場合、プローブの解離が有利である。
【0132】
図７は、２つのオリゴヌクレオチドFRETプローブを含み、ここで、リンカー（３１）を介して蛍光アクセプタ（３２）で標識された第１のオリゴヌクレオチドプローブ（３０）は、二本鎖５’末端ステム－ループ配列および核酸分析物（３６）の３’末端領域に相補的な一本鎖３’オーバーハングを含み、リンカー（３４）を介して蛍光ドナー（３５）で標識された第２のオリゴヌクレオチドプローブ（３３）は、二本鎖３’末端ステム－ループ配列および核酸分析物（３６）の５’末端領域に相補的な一本鎖５’オーバーハングを含む、発光バイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイシステムの実施例を示す。蛍光ドナーと蛍光アクセプタはFRET対（ペア）を形成する。プローブ配列に相補的な核酸分析物の領域は、核酸分析物の配列中に隣接して位置する。ラムダ－５波長で励起すると、蛍光受容体（３２）および蛍光アクセプタ（３５）は、プローブが同じ核酸分析物分子に結合していない場合、ラムダ－８波長では実質的に非発光性である。(B)第１の（３０）および第２の（３３）オリゴヌクレオチドプローブの両方は、核酸分析物分子（３６）のそれらの相補的領域にハイブリダイズする。プローブの隣接ハイブリダイゼーションは、蛍光ドナーおよび蛍光アクセプタの近接をもたらし、非放射エネルギー移動（３７）を可能にし、それはラムダ－５波長で励起するとラムダ－８波長で発光を生じる。蛍光ドナーとアクセプタの近接によって可能にされた非放射エネルギー移動（３７）は、ラムダ－５の励起によるラムダ－６での発光の減少によって、非発光アクセプタの場合にも観察することができる。
【0133】
標的核酸分析物上の記載された隣接領域上での２つのステム－ループオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、３つの安定化ニック構造の形成をもたらし、図４と同様に標的核酸の高度に選択的で高感度な検出を提供する。
【0134】
図８は、リンカー（３９）を介してランタノイドイオンキャリアキレート（３８）で標識された、２つのオリゴヌクレオチドプローブ（４０）を含み、二重鎖５’末端ステム－ループ配列および核酸分析物（４６）の３’末端領域に相補的である一本鎖３’オーバーハングを含み、リンカー（４２）を介して光収穫アンテナ（４３）で標識され、別のリンカー（４５）を介して固体支持体（担体）（４４）に結合された第２のオリゴヌクレオチドプローブ（４１）が、二本鎖３’末端ステム－ループ配列および核酸分析物（４６）の５’末端領域に相補的である一本鎖５’オーバーハングを含む、固体支持体上の発光二本鎖ハイブリダイゼーションアッセイシステムの一例を示す。プローブ配列に相補的な核酸分析物の領域は、核酸分析物の配列中に隣接して位置する。ラムダ－１波長で励起すると、ランタノイドイオンキャリア（担体）キレート（２１）および集光アンテナ（２４）は、プローブが同じ核酸分析物分子に結合していない場合、実質的に非発光性である。(B)第１の（４０）および第２の（４１）オリゴヌクレオチドプローブの両方は、核酸分析物分子（４６）のそれらの相補的領域にハイブリダイズする。プローブの隣接ハイブリダイゼーションは、指向自己集合および蛍光キレート錯体（４７）の形成をもたらし、ラムダ－１波長での励起によりラムダ－２波長で発光を生じる。アッセイは、発光測定の前に担体の表面に結合していない成分を除去するための分離工程（洗浄工程）を含むことができる。固体支持体は、各々が異なる核酸分析物を認識する異なるバイナリプローブハイブリダイゼーションアッセイシステムに連結された複数の空間的に分離された領域をさらに含むことができる。
【0135】
標的核酸分析物上の記載された隣接領域上での２つのステム－ループオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、３つの安定化ニック構造の形成をもたらし、図４および７と同様に標的核酸の高度に選択的で高感度な検出を提供する。
【0136】
本発明によって提供されるさらなる実施形態は、短い核酸分析物分子を検出および／または定量するためのキットであり、このキットは、
(a)二本鎖末端ステム－ループ構造と、一本鎖核酸分析物の第１の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
(b)二本鎖末端ステム－ループ構造と、前記一本鎖核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、を含む、第２のオリゴヌクレオチドプローブと、
を含み、
前記一本鎖核酸分析物の前記第１および第２の領域が、前記一本鎖核酸分析物の厳密に隣接する領域であり、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの末端における末端ヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの末端における末端ヌクレオチドは、前記プローブが前記一本鎖核酸分析物に結合されるとき、前記第１および第２オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの前記末端ヌクレオチド間に第１のニック構造を形成するために、前記一本鎖核酸分析物中の隣接ヌクレオチドに結合するように設計され、前記第１のニック構造は、相補的な鎖に結合された一対の隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を欠き、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングは、前記プローブが前記一本鎖核酸分析物に結合されるときに、
前記一本鎖核酸分析物の前記末端ヌクレオチドの一方は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステムループ構造の一部である末端において末端ヌクレオチドを有する第２のニック構造を形成し、前記一本鎖核酸分析物の前記末端ヌクレオチドのもう一方は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステムループ構造の一部である末端において末端ヌクレオチドを有する第３のニック構造を形成し、前記第２および第３のニック構造は相補鎖に結合した隣接ヌクレオチド対の間でホスホジエステル結合を欠いている、
ようにさらに設計される。
(a)二本鎖末端ステム－ループ構造と、一本鎖核酸分析物の第１の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと、
(b)二本鎖末端ステム－ループ構造と、前記一本鎖核酸分析物の第２の領域と相補的であり、かつ、これに選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖末端配列オーバーハングと、を含む、第２のオリゴヌクレオチドプローブと、
を含み、
前記一本鎖核酸分析物の前記第１および第２の領域が、前記一本鎖核酸分析物の厳密に隣接する領域であり、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの末端における末端ヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの末端における末端ヌクレオチドは、前記プローブが前記一本鎖核酸分析物に結合されるとき、前記第１および第２オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖末端配列オーバーハングの前記末端ヌクレオチド間に第１のニック構造を形成するために、前記一本鎖核酸分析物中の隣接ヌクレオチドに結合するように設計され、前記第１のニック構造は、相補的な鎖に結合された一対の隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を欠き、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記一本鎖末端配列オーバーハングは、前記プローブが前記一本鎖核酸分析物に結合されるときに、
前記一本鎖核酸分析物の前記末端ヌクレオチドの一方は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステムループ構造の一部である末端において末端ヌクレオチドを有する第２のニック構造を形成し、前記一本鎖核酸分析物の前記末端ヌクレオチドのもう一方は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記二本鎖末端ステムループ構造の一部である末端において末端ヌクレオチドを有する第３のニック構造を形成し、前記第２および第３のニック構造は相補鎖に結合した隣接ヌクレオチド対の間でホスホジエステル結合を欠いている、
ようにさらに設計される。
【0137】
本明細書を通して１つの実施形態または複数の実施形態に言及することは、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の種々の場所における「一実施形態において」または「実施形態において」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではない。
【0138】
実施例
実施例１
バイナリステム－ループオリゴヌクレオチドプローブ系およびキレート相補性を用いた発光ハイブリダイゼーションアッセイ
合成標的1 DNA オリゴヌクレオチド (5'-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3';配列番号1)、標的-2 DNA オリゴヌクレオチド (5'-CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG-3';配列番号2)、標的-3 DNA オリゴヌクレオチド (5'-CTTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAGAG-3';配列番号3)、標的-4 DNA オリゴヌクレオチド (5'-AAGTGCTTATAGTGCAGGT-3';配列番号4)、アミノ修飾プローブ-C1 オリゴヌクレオチド (5'-GTGCTGACCGTAGTACCGGTCAGCACCTACCTGCA(NH2-C6dC)-3';配列番号5) およびアミノ修飾プローブ-C2 オリゴヌクレオチド (5'-TA(NH2-C6dT)AAGCACTTTAGCGTGCAGCCATACTAGGCTGCACGC-3';配列番号6) はGeneLink (www.genelink.com; Hawthorne, NY, USA) から購入した。
実施例１
バイナリステム－ループオリゴヌクレオチドプローブ系およびキレート相補性を用いた発光ハイブリダイゼーションアッセイ
合成標的1 DNA オリゴヌクレオチド (5'-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3';配列番号1)、標的-2 DNA オリゴヌクレオチド (5'-CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG-3';配列番号2)、標的-3 DNA オリゴヌクレオチド (5'-CTTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAGAG-3';配列番号3)、標的-4 DNA オリゴヌクレオチド (5'-AAGTGCTTATAGTGCAGGT-3';配列番号4)、アミノ修飾プローブ-C1 オリゴヌクレオチド (5'-GTGCTGACCGTAGTACCGGTCAGCACCTACCTGCA(NH2-C6dC)-3';配列番号5) およびアミノ修飾プローブ-C2 オリゴヌクレオチド (5'-TA(NH2-C6dT)AAGCACTTTAGCGTGCAGCCATACTAGGCTGCACGC-3';配列番号6) はGeneLink (www.genelink.com; Hawthorne, NY, USA) から購入した。
【0139】
プローブ‐C１オリゴヌクレオチドを非発光Eu3+イオンキャリアキレート（（２，２’，２’’‐（１０‐（３‐イソチオシアナトベンジル）‐１，４，７，１０‐テトラアザシクロドデカン‐１，４，７‐トリル）トリ（酢酸）ユーロピウム(III); DOTA‐Eu (III)) [Analyst (2015) 140: 3960-3968］）で６炭素リンカーを有する修飾シトシンの第１級アミノ基残基で標識し、プローブ‐C２オリゴヌクレオチドを６炭素リンカーを有する修飾チミンの第１級アミノ基残基で光収穫アンテナリガンド（４‐（（イソチオシアナトフェニル）エチニル）ピリジン‐２，６‐ジカルボン酸； ３d‐アンテナ) [Analyst (2015) 140: 3960-3968］で標識した。プローブ－C１（２５ nmol）を、２０倍モル過剰のDOTA－Eu（III）と共に、pH ９．８の５０mM炭酸塩緩衝液中、＋３７℃で一晩インキュベートした。反応容量は５０μLであった。プローブ－C２を３dアンテナで標識するために、最初に３dアンテナをN，N－ジメチルホルムアミドに溶解し、プローブ－C２、２５ nmolを５０倍モル過剰の３dアンテナと共に、pH ９．８の５０mM炭酸塩緩衝液中、＋５０℃で一晩、ゆっくりと回転させながらインキュベートした。全反応容量は１１０μLであった。標識されたプローブの精製は、Thermo Fisher Scientific社の逆相ODS C１８ Hypersilカラム（長さ１５０mm、内径４．６mm）を用いてHPLC（SpectraSystem, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAからの装置）で行った。精製は、リニアアセトニトリル勾配（３０分間で１５％～４０％アセトニトリル）を用いて、流速０．５mL分-1でpH ７．０の５０mM酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中で行った。収集した画分を蒸発させ、miVac濃縮機（GeneVac, Ipswich, UK）中で乾燥させ、１０mM Tris (pH ７．５）、５０mM NaClおよび１０μM EDTAを含有する貯蔵緩衝液中で再度溶解した。標識されたプローブを、２６０nmおよび３３０nmでの吸光度読み取り値を測定することによって特徴付けた。DELFIA法(PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac, Turku, Finland）を用いてプローブC１のEu3+濃度と標識度を測定した。
【0140】
発光ハイブリダイゼーションアッセイは、５０mM Tris-HCl (pH ７．７５）、６００mM NaCl、０．１% Tween ２０、０．０５% NaN3、および３０μM ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）を含有するアッセイ緩衝液中で、Nunc(Roskilde, Denmark）から購入した低蛍光９６ウェルMaxisorpマイクロ滴定プレートを使用することによって実施した。プローブ－C１およびプローブ－C２は、まず９８℃で２分間加熱することにより０．２mLチューブ中で別々に変性させ、次いでPTC－２００ DNA-Engine (MJ Research、Waltham、MA）を用いて室温まで１分間で急速に冷却した。プローブ－C１（２０ nM）およびプローブ－C２（２０ nM）標的－１オリゴヌクレオチド（０～２０nM）を合計体積６０μLで合わせ、マイクロ滴定ウェルに加えた。さらに、別々の対照実験では、標的－１を標的－２および標的－３オリゴヌクレオチド（２０ nM）に置き換えた。プレートを最初にゆっくりと振盪しながら短時間インキュベートし、次いで室温で１５および６０分間振盪しないでインキュベートした。１４２０ビクターマルチラベルカウンター(Perkin-Elmer Life and Analytical Life Sciences)を用いて、３４０nm励起フィルター、６１５nm発光フィルター（８nm fwhm、半値全幅）、４００μs遅延および４００μs測定時間、並びに１０００測定サイクルを計数することにより、時間分解蛍光測定を行った。
【0141】
実験は、１００pM濃度以下の検出限界（３xSD）で標的－１濃度の増加と共に６１５nmでの時間分解発光信号を増加させたが、２０ nM濃度での標的－２、標的－３または標的－４はバックグラウンドシグナルと比較して有意差を生じなかった。これは、より長い（標的－３）またはより短い長さ（標的－４）を有する標的核酸が試験されたときに信号が生成されなかったことから、アッセイが、信号を破壊する（標的－２）ミスマッチがすでに少なく、標的核酸の正確な長さも必要とされるので、標的核酸配列組成物に対して非常に選択的であることを示している。プローブ対のハイブリダイゼーションは、したがって、標的核酸の両末端でのプローブハイブリダイゼーションの際にニック構造が形成され、塩基スタッキング効果が存在することを必要とする。したがって、本発明による発光ハイブリダイゼーションアッセイは、高度に選択的であり、それは、両末端における標的核酸の配列および標的核酸の長さに強く依存し、長さおよび／または配列組成の任意の変動は、キレート相補性を介してハイブリダイゼーションおよびシグナル生成を破壊するであろう。
【0142】
実施例２
バイナリステム－ループオリゴヌクレオチドプローブシステムおよび蛍光共鳴エネルギー移動を用いた発光ハイブリダイゼーションアッセイ
合成標的1 DNA オリゴヌクレオチド (5'-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3'; 配列番号1)、
標的-2 DNA オリゴヌクレオチド (5'-CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG-3';配列番号2)、標的-3 DNA オリゴヌクレオチド (5'-CTTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAGAG-3';配列番号3)、標的-4 DNA オリゴヌクレオチド (5'-AAGTGCTTATAGTGCAGGT-3';配列番号4)、アミノ修飾プローブ-F1 オリゴヌクレオチド (5'- GTGCTGACCGTAGTACCGGTCAGCACCTA (NH2-C6dC)CT GCAC-3';配列番号5)およびアミノ修飾プローブ-F2 オリゴヌクレオチド(5'-TATAAG(NH2-C6dC)ACTTTAGCGTGCAGCCATACTAGGCTGCACGC-3';配列番号6) は、GeneLink (www.genelink.com) から購入した。
バイナリステム－ループオリゴヌクレオチドプローブシステムおよび蛍光共鳴エネルギー移動を用いた発光ハイブリダイゼーションアッセイ
合成標的1 DNA オリゴヌクレオチド (5'-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3'; 配列番号1)、
標的-2 DNA オリゴヌクレオチド (5'-CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG-3';配列番号2)、標的-3 DNA オリゴヌクレオチド (5'-CTTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAGAG-3';配列番号3)、標的-4 DNA オリゴヌクレオチド (5'-AAGTGCTTATAGTGCAGGT-3';配列番号4)、アミノ修飾プローブ-F1 オリゴヌクレオチド (5'- GTGCTGACCGTAGTACCGGTCAGCACCTA (NH2-C6dC)CT GCAC-3';配列番号5)およびアミノ修飾プローブ-F2 オリゴヌクレオチド(5'-TATAAG(NH2-C6dC)ACTTTAGCGTGCAGCCATACTAGGCTGCACGC-3';配列番号6) は、GeneLink (www.genelink.com) から購入した。
【0143】
プローブ‐F１オリゴヌクレオチドは、本質的に発光性のEu3+キレート、｛２,２’,２’’,２’’’-｛［（４-[(４-イソチオシアナトフェニル)エチニル]ピリジン-2,6-ジイル]-ビス(メチレンニトリロ)}-テトラキス(アセタト)}ユーロピウム(III) (７d‐Eu）［J. Phys. Chem. B (2011) 115: 13685-13694]］で、６つの炭素リンカーを有する修飾シトシンの第１級（一次）アミノ基残基を標識し、プローブ‐F２オリゴヌクレオチドは、６つの炭素リンカーを有する修飾シトシンの第１級アミノ基残基でAlexa Fluor ６８０（サクシニミジル酸エステル染料; AF６８０; Thermo Fisher Scientific)で標識した。プローブ－F１（５ nmol）および６０倍モル過剰の７d－Euを、合計体積３０μLの５０mM炭酸塩緩衝液pH ９．８に溶解した。標識反応物を、光から保護された＋３７℃で一晩インキュベートした。プローブ－F２（５ nmol）を１０倍モル過剰のAF６８０で５０μLの１００mM炭酸塩緩衝液pH ９．２に溶解した。標識反応物を、光から保護された６rpm回転中で＋３７℃で一晩インキュベートした。標識されたプローブオリゴヌクレオチドを、水性５０mM酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液pH ７．０および流速０．５mL分-1中のリニアアセトニトリル勾配を用いて、Thermo Fisher Scientificからの逆相ODS C１８ハイパーシルカラム（長さ１５０mm、内径４．６mm）を有する逆相HPLC (SpectraSYSTEM、Thermo Fisher Scientific)で精製した。収集された画分を蒸発させ、miVac濃縮機（GeneVac）中で乾燥させ、１０mM Tris (pH ８．０）、５０mM NaClおよび１０μM EDTAを含有する保存緩衝液中で再び溶解させた。標識プローブを、２６０nm、３３０nmおよび６８０nmでの吸光度読み取り値を測定することによって特徴付けた。プローブF１のEu3+濃度と標識度をDELFIA法(PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac, Turku, Finland）で測定した。
【0144】
発光ハイブリダイゼーションアッセイは、５０mM Tris-HCl (pH ７．７５）、６００mM NaCl、０．１% Tween ２０、および０．０５% NaN3を含むアッセイ緩衝液中、Nuncから購入した低蛍光９６ウェルMaxisorpマイクロ滴定プレートを使用することによって実施した。プローブ－F１およびプローブ－F２は、まず９８℃で２分間加熱することにより０．２mLチューブ中で別々に変性させ、次いでPTC－２００ DNA-Engine (MJ Research、Waltham、MA）を用いて室温まで１分間で急速に冷却した。プローブ－C１（２０ nM）およびプローブ－C２（２０ nM）標的－１オリゴヌクレオチド（０～２０nM）を合計体積６０μLで合わせ、マイクロ滴定ウェルに加えた。さらに、別々の対照実験では、標的－１を標的－２および標的－３オリゴヌクレオチド（２０ nM）に置き換えた。プレートを最初にゆっくりと振盪しながら短時間インキュベートし、次いで室温で１５および６０分間振盪しないでインキュベートした。時間分解蛍光測定は、１４２０ビクターマルチラベルカウンター(Perkin-Elmer Life and Analytical Life Sciences)を用いて、３４０nm励起フィルター、７３０nm発光フィルター（１０nm fwhm)、６０μs遅延および８０μs測定時間を用い、１０００測定サイクルを計数することにより行った。
【0145】
実験は、２００pM濃度以下の検出限界（３xSD）で標的－１濃度の増加と共に７３０nmでの時間分解発光信号を増加させたが、２０ nM濃度での標的－２、標的－３または標的－４はバックグラウンドシグナルと比較して有意差を生じなかった。したがって、バイナリステム－ループFRETプローブ対に基づく発光ハイブリダイゼーションアッセイは、キレート相補性プローブ対に基づく等価アッセイと同様の利点を示す。これは、本発明による発光ハイブリダイゼーションアッセイが標的配列および長さに高度に特異的であり、さもなければ測定が難しい短い標的核酸分子の小さな濃度を定量的に検出することができることを示す。
【0146】
他の好適な実施形態
本発明の方法は、様々な実施形態の形態に組み込むことができ、そのうちのほんの数例が本明細書に開示されていることが理解されるであろう。他の実施形態が存在し、本発明の趣旨から逸脱しないことは、当該分野の専門家にとって明らかであろう。したがって、記載された実施形態は、例示的なものであり、限定的なものとして解釈されるべきではない。
本発明の方法は、様々な実施形態の形態に組み込むことができ、そのうちのほんの数例が本明細書に開示されていることが理解されるであろう。他の実施形態が存在し、本発明の趣旨から逸脱しないことは、当該分野の専門家にとって明らかであろう。したがって、記載された実施形態は、例示的なものであり、限定的なものとして解釈されるべきではない。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【配列表】
【国際調査報告】