特表2023-511305変化したエンベロープ完全性を有する遺伝子組換え細菌およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-17
(54)【発明の名称】変化したエンベロープ完全性を有する遺伝子組換え細菌およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20230310BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20230310BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230310BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20230310BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P19/34 A
C12P21/02 C
C12N15/31
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022543176
(86)(22)【出願日】2021-01-18
(85)【翻訳文提出日】2022-09-07
(86)【国際出願番号】 EP2021050969
(87)【国際公開番号】W WO2021144473
(87)【国際公開日】2021-07-22
(31)【優先権主張番号】20152513.6
(32)【優先日】2020-01-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511294534
【氏名又は名称】ウニベルシテ カソリーク デ ルーベン
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】コレット，ジャン－フランソワ
(72)【発明者】
【氏名】デゲル，ミカエル
(72)【発明者】
【氏名】チョウ，スン ヒョン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF27
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA45
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、溶解に過敏な遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌に関する。したがって、これらの細菌は、核酸抽出、好ましくはゲノム外核酸抽出（例えば、プラスミド）の収量、および／または好ましくはゲノム外核酸によってコードされるポリペプチドの収量を改善するために有用である。実際に、本発明者らは、エンベロープ完全性を変化させている少なくとも２つの変異遺伝子の組み合わせを有する大腸菌株を操作した。より具体的には、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡであり、少なくとも１つの変異遺伝子は、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子、例えばｌｐｐ遺伝子、ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子およびｅｒｆＫ遺伝子などである。これらの組み合わせには、ｏｍｐＡ遺伝子および／またはｌｐｐ遺伝子に相同な遺伝子内の変異体も含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含む、遺伝子改変された大腸菌細菌であって、前記細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、前記細菌は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子はｏｍｐＡおよび／またはその相同体であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、前記細菌が前記ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まないという条件で、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である、細菌。
【請求項2】
Ｌｐｐ機能性に関与する少なくとも１つの遺伝子が、ｌｐｐ、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子、ならびに／またはそれらの相同体、ならびにそれらの任意の組み合わせを含むまたはこれらからなる群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項3】
前記少なくとも２つの変異遺伝子が、－ｏｍｐＡおよびｌｐｐ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡおよびｙｂｉＳ、ならびに／またはｙｃｆＳおよび／もしくはｅｒｆＫ、ならびに／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｃｆＳ、およびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；または、
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｙｃｆＳ、および／またはその相同体；
の組み合わせのうちの１つを含む、請求項１または２に記載の細菌。
【請求項4】
前記変異ｏｍｐＡ遺伝子が、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；または前記ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項5】
前記ｌｐｐ遺伝子内の前記変異が、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、別のアミノ酸、好ましくは電荷を有しないアミノ酸、より好ましくはロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換；５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの、アルギニン（Ｒ）をコードするコドンとの置換；ｌｐｐ遺伝子の完全な欠失；およびそれらの組み合わせを含むか、またはこれらからなる群から選択され、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項6】
前記変異したｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子および／またはｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体が、それぞれ、前記ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子および／またはｅｒｆＫ遺伝子および／またはその相同体の欠失からなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項7】
前記細菌が、前記ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および前記ｌｐｐ遺伝子内の前記変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項8】
前記細菌が、２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失であって、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている欠失、および前記ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項9】
前記細菌が、前記ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；前記ｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失；前記ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失；および前記ｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項10】
前記細菌が、前記ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；前記ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、ロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異；前記ｙｂｉＳ遺伝子のそれぞれの欠失；および前記ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項11】
前記細菌が、前記ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、アスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および前記ｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項12】
前記細菌が、好ましくは少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項13】
前記ゲノム外核酸分子が、プラスミド、コスミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含むまたはそれらからなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項14】
前記少なくとも１つのゲノム外核酸分子の産生および精製のための、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含み、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変された大腸菌細菌の使用であって、前記細菌が、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、変化したエンベロープ完全性を有し、前記少なくとも１つの変異遺伝子が、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子である、使用。
【請求項15】
前記少なくとも１つのゲノム外核酸分子が、プラスミド、コスミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含むまたはそれらからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
好ましくは前記少なくとも１つのゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および精製のための、少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含み、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変された大腸菌細菌の使用であって、前記細菌が、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、変化したエンベロープ完全性を有し、前記少なくとも１つの変異遺伝子が、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子である、使用。
【請求項17】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、少なくとも１つの細胞質ポリペプチドである、請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
前記少なくとも変異ｏｍｐＡ遺伝子が、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項19】
Ｌｐｐ機能性に関与する前記少なくとも変異した遺伝子が、前記ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異、または前記ｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失、および／または前記ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失および／または前記ｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失からなる、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項20】
前記細菌が、前記エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含み、少なくとも１つの変異遺伝子が、ｏｍｐＡおよび／またはその相同体であり、少なくとも１つの変異遺伝子が、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項21】
前記細菌が、前記ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失および前記ｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まない、請求項２０に記載の使用。
【請求項22】
前記細菌が、請求項２～１１のいずれか一項に記載の細菌である、請求項２１に記載の使用。
【請求項23】
以下のステップを含む、少なくとも１つのゲノム外核酸分子の産生および精製のための方法であって、ａ）前記少なくともゲノム外核酸分子を増幅するために、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変された大腸菌細菌を培養するステップであって、前記細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、前記細菌は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、前記少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子であり、前記細菌が、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、ステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた前記細菌を、好ましくは化学的溶解によって溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた前記溶解混合物から、増幅された前記ゲノム外核酸分子を精製するステップと、を含む、方法。
【請求項24】
前記少なくとも１つのゲノム外核酸分子が、プラスミド、コスミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含むまたはそれらからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
好ましくはゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および精製のための方法であって、ａ）前記少なくとも１つのポリペプチドを合成するために、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変された大腸菌細菌を培養するステップであって、前記細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、前記少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子であり、前記細菌が、好ましくは、前記少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、ステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた前記細菌を溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から前記少なくとも１つのポリペプチドを精製するステップと、を含む、方法。
【請求項26】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、１つの細胞質ポリペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記少なくとも変異ｏｍｐＡ遺伝子が、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；または前記ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
Ｌｐｐ機能性に関与する前記少なくとも変異した遺伝子が、前記ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、前記位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異、または前記ｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失、および／または前記ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失および／または前記ｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失からなる、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記細菌が、前記エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含み、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／またはその相同体であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記細菌が、前記ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失および前記ｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まない、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記細菌が、請求項２～１１のいずれか一項に記載の細菌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
（ｉ）エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変された大腸菌細菌であって、前記細菌が、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、前記少なくとも１つの変異遺伝子が、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子である、大腸菌と、（ｉｉ）前記細菌をゲノム外核酸分子で形質転換するための手段と、を含むキット。
【請求項33】
前記遺伝子改変された大腸菌細菌が、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含み、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／またはその相同体であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である、請求項３２に記載のキット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子改変微生物の分野に関し、特に、変化したエンベロープ完全性を有する遺伝子改変細菌に関する。より正確には、ｏｍｐＡ遺伝子、およびｌｐｐ遺伝子またはＬｐｐ機能に関与するポリペプチドをコードする遺伝子内の変異の組み合わせを有する操作された大腸菌株は、野生型株と比較して、細菌溶解に対して過敏であることが判明している。したがって、これらの細菌株は、核酸およびポリペプチドの産生および精製を改善する方法において有用である。
【背景技術】
【0002】
一般に、ゲノム外核酸分子、特にプラスミドは、細菌染色体とは独立して細菌内で複製できる遺伝エレメントである。プラスミドおよびプラスミドにコードされたタンパク質は、発酵プロセス、その後、治療用途など、様々な用途のための大規模精製によって、大腸菌株において工業的に有利に産生され得る。実際に、大腸菌は、その発見以来十分に特徴が明らかになり、この細菌株の操作を容易にするために多数のツールが施行されている。その結果、大腸菌株は、核酸およびポリペプチドの産生に最適な産生植物に変換される。
【0003】
プラスミドの治療上の利点の例として、免疫療法およびＤＮＡワクチン接種を挙げることができる。この場合、１つ以上の抗原をコードする遺伝子操作されたＤＮＡプラスミドが患者に注射され、これにより、細胞が、抗原（複数可）を直接産生して、防御免疫応答をもたし得る。
【0004】
しかし、ＤＮＡプラスミド産生の収量は、現在、この新しい治療法の開発における障害であり、その需要は、将来拡大するであろう。細菌細胞の溶解は、高品質量のプラスミドの産生プロセスにおける重要なステップである。このステップには、大量の溶解バッファを伴い、他の細胞デブリおよびゲノムＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分離および精製するための費用を要する下流プロセスが生じる。上記の理由から、細胞溶解時にプラスミドＤＮＡの放出を増加させるソリューションは、何十年にもわたってこの業界の注目を集めてきた。
【0005】
現在まで、細胞溶解の最適化を目的とした研究努力のほとんどは、これまでのところ溶解プロトコルに集中している。驚くべきことに、研究者らは、出願人の知る限り、細菌溶解感受性を改善するために、細菌細胞を改変することに焦点を当てていない。
【0006】
学術研究者らの多数の報告では、細菌エンベロープ成分における成分の構造機能関係の解明に焦点を当てていた（例えば、Ａｓｍａｒ ｅｔ ａｌ．；ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ；２０１７；Ｖｏｌ．１５（１２）：ｅ２００４３０３を参照されたい）。大腸菌などのグラム陰性菌には、浸透圧ショック時の溶解から細胞を保護するエンベロープが含まれていることが何十年も前から知られている。エンベロープは、細胞質と接触している細胞質膜（ＣＭ）または内膜（ＩＭ）と、環境との界面を構成する外膜（ＯＭ）によって区切られている。ＣＭ／ＩＭおよびＯＭは、短いペプチドによって架橋されているグリカン鎖の単層ポリマーであるペプチドグリカン（ＰＧ）を含む区画であるペリプラズムによって分離されている。大腸菌では、ＯＭのＰＧへの繋留は、Ｌｐｐタンパク質によって行われる。このタンパク質は、脂質化されたＮ末端を介してＯＭに固定され、Ｃ末端のリジンを介してＰＧに含まれる短いペプチドに結合している。Ｌｐｐは、３つのペリプラズム酵素：ＹｂｉＳ（ＬｄｔＢとも呼ばれる）、ＹｃｆＳ（ＬｄｔＣとも呼ばれる）、およびＥｒｆＫ（ＬｄｔＡとも呼ばれる）によって媒介される２つの構造間の唯一の共有結合による接合をもたらす。さらなる２つのＯＭタンパク質は、イオン相互作用を介して、ＯＭ－ＰＧ接合に関与する。１つは、Ｔｏｌ－Ｐａｌ収縮装置に属するリポタンパク質Ｐａｌである。リポタンパク質Ｐａｌは、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、およびＯｍｐＡと独立して相互作用する（Ｃａｓｃａｌｅｓｅｔａｌ．；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；２００４，Ｖｏｌ．５１（３）：８７３－８８５を参照されたい）。もう１つは、可溶性ドメインを介してペリプラズム内に広がるβバレルＯｍｐＡタンパク質である。両方のタンパク質は、ペリプラズムドメインを介して、ＰＧと非共有結合により相互作用する。Ｓｏｎｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ；１９７８；Ｖｏｌ．１３６（１）：２８０－２８５）は、形態学、電解質に対する成長の必要性、疎水性抗生物質および洗浄剤に対する感受性、電子顕微鏡による外膜のトポロジーに関して、ｌｐｐおよびｏｍｐＡに二重欠失変異を有する大腸菌株の特徴を明らかにした。さらに、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ；２０１２；Ｖｏｌ．２６：２１９－２２８）は、ＯｍｐＡが細胞壁のペプチドグリカンに固定されるメカニズムを特定した。
【0007】
最先端技術への関心は、細胞外培地に放出される前にペリプラズム区画内で標的化される分泌タンパク質またはタンパク質の産生および精製に対して顕著であった（特許のレビューについては、Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．；Ｒｅｃｅｎｔ ｐａｔｅｎｔｓ ｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２０１０；Ｖｏｌ．４：２３－２９を参照されたい）。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２０１４；Ｖｏｌ．７：３６０－３７０）は、大腸菌由来の遺伝子ｍｒｃＡ、ｍｒｃＢ、ｐａｌ、およびｌｐｐがノックアウトされた、標的タンパク質の細胞外産生のための漏出株の構築について開示した。ＷＯ２０１４０４４７２８は、管腔内に遊離している異種タンパク質を含む外膜小胞（ＯＭＶ）を調製するための方法について開示した。外膜小胞の産生メカニズムについては、Ｓｃｈｗｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；２０１３；Ｖｏｌ．５２：３０３１－３０４０；およびＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；２０１４；Ｖｏｌ．１４：３２４－３３５）に開示されている。
【0008】
ＷＯ２０１６１８３５３１では、外膜をペプチドグリカン骨格に繋留するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の変異を伴う遺伝子操作された細菌、および高フェニルアラニン血症を治療する方法について開示した。
【0009】
ｏｍｐ、ｔｏｌ、ｅｘｃＣ、ｅｘｃＤ、ｌｐｐ、ｅｎｖ およびｌｋｙなどの遺伝子内に変異を有する大腸菌の漏出変異体は、細胞外培地へのそのようなペリプラズムタンパク質の放出について、特に興味深いことが報告されている（Ｋｌｅｉｎｅｒ－Ｇｒｏｔｅ ｅｔ ａｌ．；Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；２０１８，Ｖｏｌ．１８：５３２－５５０を参照されたい）。
【0010】
最後に、ＷＯ２０１６２１０３７３には、組換え細菌細胞が、外因性環境シグナルに応答して異種遺伝子を発現し、最終的に組換え細菌細胞を死滅させる毒素を発現するようにプログラムされ得ることが開示された。この戦略は、疾患および障害の治療に使用され得る。
【0011】
したがって、大腸菌株などの細菌株を同定する必要があり、これは、増殖能力を維持しながら、細菌溶解に対して過敏であり、したがってゲノム外核酸分子および／または組換えポリペプチド、特に組換え細胞質ポリペプチドの産生における収量の改善を可能にする。
【発明の概要】
【0012】
本発明の第１の態様は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌に関し、細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／またはその相同体（homologue）であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、細菌がｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まないという条件で、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
【0013】
いくつかの実施形態では、Ｌｐｐ機能性に関与する少なくとも１つの遺伝子は、ｌｐｐ、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子、ならびに／またはそれらの相同体、ならびにそれらの任意の組み合わせを含むまたはこれらからなる群から選択される。
【0014】
特定の実施形態では、少なくとも２つの変異遺伝子は、以下の組み合わせのうちの１つを含む：
－ｏｍｐＡおよびｌｐｐ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡおよびｙｂｉＳ、ならびに／またはｙｃｆＳおよび／もしくはｅｒｆＫ、ならびに／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｃｆＳ、およびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；または、
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｙｃｆＳ、および／またはその相同体。
－ｏｍｐＡおよびｌｐｐ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡおよびｙｂｉＳ、ならびに／またはｙｃｆＳおよび／もしくはｅｒｆＫ、ならびに／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｃｆＳ、およびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；または、
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｙｃｆＳ、および／またはその相同体。
【0015】
いくつかの実施形態では、変異ｏｍｐＡ遺伝子は、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；かつ／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失、またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み；これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている。
【0016】
特定の実施形態では、ｌｐｐ遺伝子内の変異は、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、別のアミノ酸、好ましくは電荷を有しないアミノ酸、より好ましくはロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換；５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの、アルギニン（Ｒ）をコードするコドンとの置換；ｌｐｐ遺伝子の完全な欠失；およびそれらの組み合わせを含むか、またはこれらからなる群から選択され、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている。
【0017】
いくつかの実施形態では、変異したｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子および／またはｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体は、それぞれ、ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子および／またはｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体の欠失からなる。
【0018】
特定の実施形態では、細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、およびｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異、を有する。
【0019】
いくつかの実施形態では、細菌は、２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失であって、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている欠失、およびｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異を有する。
【0020】
特定の実施形態では、細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；ｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失；ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失；およびｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失を有する。
【0021】
いくつかの実施形態では、細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、ロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異；ｙｂｉＳ遺伝子のそれぞれの欠失；およびｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失を有する。
【0022】
特定の実施形態では、細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、アスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を有する。
【0023】
いくつかの実施形態では、細菌は、好ましくは、少なくとも１つのポリペプチドをコードする、少なくとも１つのゲノム外核酸分子をさらに含む。
【0024】
特定の実施形態では、ゲノム外核酸分子は、プラスミド、コスミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含むまたはこれらかなる群から選択される。
【0025】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を産生するおよび精製するための、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含み、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌の使用に関し、細菌は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、変化したエンベロープ完全性を有し、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
【0026】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのゲノム外核酸分子は、プラスミド、コスミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含むまたはそれらからなる群から選択される。
本発明のさらなる態様は、好ましくは少なくとも１つのゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および精製のための、少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含み、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌の使用に関し、この細菌は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、変化したエンベロープ完全性を有し、少なくとも１つの変異遺伝子が、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
本発明のさらなる態様は、好ましくは少なくとも１つのゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および精製のための、少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含み、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌の使用に関し、この細菌は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、変化したエンベロープ完全性を有し、少なくとも１つの変異遺伝子が、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
【0027】
特定の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、少なくとも１つの細胞質ポリペプチドである。
【0028】
いくつかの実施形態では、少なくとも変異ｏｍｐＡ遺伝子は、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失からなり、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている。
【0029】
特定の実施形態では、Ｌｐｐ機能性に関与する少なくとも変異した遺伝子は、ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異、またはｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失、および／またはｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失および／またはｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失からなる。
【0030】
いくつかの実施形態では、細菌は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含み、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／またはその相同体であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
特定の実施形態では、細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まない。
特定の実施形態では、細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まない。
【0031】
いくつかの実施形態では、細菌は、本発明において定義されるとおりである。
【0032】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つのゲノム外核酸分子の産生および精製のための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくともゲノム外核酸分子を増幅するために、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌を培養するステップであって、細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子であり、細菌が、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、ステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を、好ましくは化学的溶解によって溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から、増幅されたゲノム外核酸分子を精製するステップと、を含む。
ａ）少なくともゲノム外核酸分子を増幅するために、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌を培養するステップであって、細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子であり、細菌が、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、ステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を、好ましくは化学的溶解によって溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から、増幅されたゲノム外核酸分子を精製するステップと、を含む。
【0033】
特定の実施形態では、少なくとも１つのゲノム外核酸分子は、プラスミド、コスミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含むまたはそれらからなる群から選択される。
本発明の別の態様は、好ましくはゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および精製のための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくとも１つのポリペプチドを合成するために、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌を培養するステップであって、細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子であり、細菌が、好ましくは、少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、ステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から少なくとも１つのポリペプチドを精製するステップと、を含む。
本発明の別の態様は、好ましくはゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および精製のための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくとも１つのポリペプチドを合成するために、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌を培養するステップであって、細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子であり、細菌が、好ましくは、少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、ステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から少なくとも１つのポリペプチドを精製するステップと、を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、１つの細胞質ポリペプチドである。
【0035】
特定の実施形態では、少なくとも変異ｏｍｐＡ遺伝子は、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失からなり、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている。
【0036】
いくつかの実施形態では、Ｌｐｐ機能性に関与する少なくとも変異した遺伝子は、ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異、またはｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失、および／またはｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失および／またはｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失からなる。
【0037】
特定の実施形態では、細菌は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含み、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／またはその相同体であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
いくつかの実施形態では、細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まない。
いくつかの実施形態では、細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まない。
【0038】
特定の実施形態では、細菌は、本発明の開示において定義されるとおりである。
【0039】
本発明の一態様は、（ｉ）エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌であって、この細菌が、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子が、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体あるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子である、大腸菌と、（ｉｉ）この細菌をゲノム外核酸分子で形質転換するための手段と、を含むキットに関する。
【0040】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変大腸菌は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含み、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／またはその相同体であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
【発明を実施するための形態】
【0041】
定義
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する：
数字の前にある「約」は、その数字の値のプラスマイナス１０％に及ぶ範囲を含む。「約」という用語が指す値は、それ自体も具体的にかつ好ましくは開示されることを理解されたい。
本発明において、以下の用語は、以下の意味を有する：
数字の前にある「約」は、その数字の値のプラスマイナス１０％に及ぶ範囲を含む。「約」という用語が指す値は、それ自体も具体的にかつ好ましくは開示されることを理解されたい。
【0042】
「少なくとも１つ」には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上を含む。
【0043】
「少なくとも２つ」には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上を含む。
【0044】
本明細書で使用される「細菌（ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」は、１つの細菌細胞を指す。したがって、「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」という用語は、細菌細胞の集団を指す。
【0045】
「Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子」とは、発現の結果、生理機能性Ｌｐｐポリペプチドとなる任意の遺伝子を指す。本明細書では、「生理学的機能性Ｌｐｐポリペプチド」とは、細菌エンベロープに位置し、グラム陰性菌、特に大腸菌におけるエンベロープ完全性に関与するＬｐｐポリペプチドを指すことは理解されよう。
【0046】
本明細書で使用される「ゲノム外核酸分子」は、細菌中に存在するが、細菌染色体に組み込まれていない、または細菌染色体の一部ではないデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を指す。ゲノム外核酸は、線状または環状であり得る。ゲノム外核酸は、例えば抗生物質に対する耐性を宿主細菌に付与する配列、または青／白選択のためのβ－ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ配列などの選択マーカーを含み得る。ゲノム外核酸は、典型的には、複製を可能にする配列（例えば、複製起点ｐＭＢ１、ＣｏｌＥ１またはｆ１）および細胞あたりのコピー数の調節、例えばｒｅｐＥ遺伝子またはｒｏｐ遺伝子などを含む。ゲノム外核酸は、例えばＴ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターなどの下流配列の発現を可能にするプロモーター配列を含み得る。「ゲノム外核酸」という表現としては、これらに限定されないが、プラスミド、コスミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）が挙げられる。
【0047】
「プラスミド」とは、ゲノム外の小ＤＮＡ分子を指し、分子生物学においてクローニングベクターとして使用され得る環状二本鎖ＤＮＡ分子として最も一般的に見られ、約１５ｋｂ（すなわち１５，０００塩基対）までのＤＮＡ断片のコピーを作成するかつ／または改変する。プラスミドは、発現ベクターとして使用して、プロモーター配列の下流のプラスミドに見られる核酸配列によってコードされる目的のタンパク質を大量に産生することもできる。「コスミド」という用語は、ラムダファージからのｃｏｓ配列を含むハイブリッドプラスミドを指し、コスミドのファージヘッドへのパッケージング、およびその後の細菌細胞の感染が可能になり、コスミドは、環状化され、プラスミドとして複製することができる。コスミドは、典型的には、サイズが約３２～５２ｋｂの範囲のＤＮＡ断片のクローニングベクターとして使用される。「細菌人工染色体」または「ＢＡＣ」は、細菌細胞の分裂後にゲノム外ＤＮＡ分子の均等な分配を可能にする機能的稔性プラスミドをベースにしたゲノム外核酸分子を指す。ＢＡＣは、典型的には、サイズが約１５０～３５０ｋｂの範囲のＤＮＡ断片のクローニングベクターとして使用される。
【0048】
本明細書で使用される「遺伝子」は、特定の機能に関連する核酸配列を指す。遺伝子によってコードされる最終産物の例は、ＲＮＡおよびタンパク質である。
【0049】
「遺伝子改変された」は、本明細書において、活発に生成および／または選択された少なくとも１つの変異を含む微生物、特に本発明の文脈におけるグラム陰性菌に関して使用される。
【0050】
本明細書で使用される「グラム陰性」は、細胞質内膜と外膜との間に挟まれた薄いペプチドグリカン壁から構成される細胞エンベロープを特徴とする細菌を指す。グラム陰性菌は、デンマークの細菌学者Ｈａｎｓ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｇｒａｍによって開発されたグラム染色によって容易に同定し得る。厚いペプチドグリカン壁に囲まれた細胞質膜を有するグラム陽性菌は、グラム染色後に紫に染色されるが、グラム陰性菌は、ピンク／赤に染色される。
【0051】
「同一性」とは、２つ以上のポリペプチドまたは２つ以上の核酸配列の配列間の関係で使用される場合、それぞれ、２つ以上のアミノ酸残基または２つ以上のヌクレオチドの鎖間の一致数によって決定されるときには、ポリペプチドまたは核酸配列（それぞれ）間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されたギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちの小さい方の間の同一の一致の割合（パーセント）を測定する。関連するポリペプチドまたは核酸配列の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。このような方法としては、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８、１０７３（１９８８）が挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験対象の配列間で最大の一致が得られるように設計されている。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラム内に記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、例えば、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．＼２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））が挙げられる。
【0052】
ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の情報源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を決定することもできる。一実施形態では、同一性という用語は、それが指す配列の全長にわたって測定される。
【0053】
「変異」は、本明細書では、遺伝子に関して使用され、遺伝子の核酸配列の変化を指す。変異は、プリンをプリンに交換する（Ａ－Ｇ）、またはピリミジンをピリミジンに交換する（Ｃ－Ｔ）トランジション、またはプリンをピリミジンに、またはピリミジンをプリンに交換するトランスバージョン（Ｃ／Ｔ－Ａ／Ｇ）など、遺伝子の核酸配列内の１つ以上のヌクレオチドの置換を含み得る。
【0054】
変異はまた、遺伝子の核酸配列中での１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入を含み得る。変異は、最終的な遺伝子産物（ＲＮＡまたはタンパク質）をコードする配列に関係し得る。変異がポリペプチドのコード配列に影響を及ぼし、対応するポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらす場合、変異は、ポリペプチドのアミノ酸配列の改変によって定義され得る。当業者は、ポリペプチドをコードする核酸配列内の目的のコドン（複数可）を同定し、遺伝子コードを使用して、核酸配列内の適切な改変（複数可）を設計し、転写および翻訳後に所望の変異ポリペプチド配列を得ることができる。本明細書で使用する変異という用語には、最終遺伝子産物（ＲＮＡまたはポリペプチド）をコードする配列全体を包含する遺伝子の核酸配列における欠失も含まれる。このタイプの変異は、本明細書では「完全な欠失」と称する。一実施形態では、変異という用語は、本明細書の「遺伝子ｘ中に変異（複数可）を含む生物」という文で使用される場合、微生物中に存在する遺伝子ｘの任意のコピー（または複数のコピー）は、細菌染色体上またはゲノム外核酸分子上のいずれかにおいて、変異（複数可）を含むことを意味する。本明細書で使用される場合、変異は、変異遺伝子の対応するｍＲＮＡへの転写に影響を与え得、対応するポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳に影響を与え得る。一実施形態では、変異（複数可）を有する核酸配列は、細菌の細菌染色体中に見出される核酸配列の場合などに、微生物の子孫に受け継がれる。一実施形態では、変異（複数可）を有する核酸配列は、細菌の染色体外ＤＮＡ中に見出される。
【0055】
「相同体」は、参照ポリペプチドと３０％～９９．９９％の配列同一性を共有するポリペプチドもしくは核酸配列、または参照ポリペプチドもしくは核酸配列と同一または類似の生物学的機能を共有する核酸配列（「構造相同体」とも呼ばれる）を指し得る。配列同一性は、上で説明したように決定することができる（「機能的相同体」とも呼ばれる）。生物学的機能は、当技術分野で知られている任意の好適な方法、またはそれに由来する方法によって評価することができる。いくつかの実施形態では、相同体は、構造相同体である。いくつかの実施形態では、相同体は、機能的相同体である。
【0056】
「アミノ酸保存」は、２つ以上のポリペプチドまたは２つ以上の核酸配列の配列間の関係において使用される場合、ポリペプチドまたは核酸配列内の所与の領域間のアミノ酸配列関連性の程度を指す。例えば、所与のアミノ酸位置のアミノ酸保存は、固有のアミノ酸または関連するアミノ酸のいずれかを指し得る。実例として、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌなどの疎水性アミノ酸は、関連アミノ酸と見なすことができる。これは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなどの正電荷を有するアミノ酸、およびＧｌｕ、Ａｓｐなどの負電荷を有するアミノ酸についても同じである。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチドからの領域内の保存されたアミノ酸は、「コンセンサス配列」と呼ばれ得る。
【0057】
「濃縮」または「濃縮物」は、目的の標的を局所的に蓄積する作用を指し得る。
【0058】
「精製」または「精製する」は、化合物の混合物から、目的の純粋なまたは実質的に純粋な化合物を得る作用を指し得る。
【0059】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも５０のアミノ酸の線状ポリマーを指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞質ポリペプチド、および／または非分泌ポリペプチド、すなわち、合成時に細胞質内に留まる運命にあるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、細胞質ポリペプチドは折り畳まれている、すなわち、二次元または三次元構造を獲得している。
【0060】
「タンパク質」は、１つ以上のペプチドまたはポリペプチド、および任意により非ポリペプチド補因子から形成される機能実体を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞質タンパク質、または非分泌タンパク質、すなわち、合成時に細胞質に留まる運命にあるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、細胞質タンパク質は折り畳まれている、すなわち、二次元または三次元構造を獲得している。
【0061】
「細菌溶解」は、細胞質など、細胞からの可溶性物質の放出を指す。
【0062】
詳細な説明
本発明は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、変化したエンベロープ完全性を有し、細菌溶解に対して過敏である遺伝子改変グラム陰性菌、すなわち大腸菌に関する。本発明者らは、好適な培養条件で成長を持続し、プラスミドまたはプラスミドコードポリペプチドを高収量で提供できる大腸菌由来の細菌株を操作した。さらに、プラスミドまたはプラスミドコードポリペプチド、特に細胞質ポリペプチドは、操作された大腸菌株の細菌溶解時に高収量で回収され得る。最後に、本明細書で提供される実験データは、ゲノム核酸、細菌の細胞質タンパク質および／または細胞デブリの汚染を低減して、プラスミドまたはプラスミドコードポリペプチド（組換えポリペプチド）などの細胞質分子を高収量で回収できることを示唆している。
本発明は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、変化したエンベロープ完全性を有し、細菌溶解に対して過敏である遺伝子改変グラム陰性菌、すなわち大腸菌に関する。本発明者らは、好適な培養条件で成長を持続し、プラスミドまたはプラスミドコードポリペプチドを高収量で提供できる大腸菌由来の細菌株を操作した。さらに、プラスミドまたはプラスミドコードポリペプチド、特に細胞質ポリペプチドは、操作された大腸菌株の細菌溶解時に高収量で回収され得る。最後に、本明細書で提供される実験データは、ゲノム核酸、細菌の細胞質タンパク質および／または細胞デブリの汚染を低減して、プラスミドまたはプラスミドコードポリペプチド（組換えポリペプチド）などの細胞質分子を高収量で回収できることを示唆している。
【0063】
本発明の第１の態様は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含む遺伝子改変グラム陰性菌に関し、この細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏である。
【0064】
本明細書で使用される場合、「少なくとも２つ」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上を包含する。
【0065】
いくつかの実施形態では、細菌は、プロテオバクテリウム門、好ましくは、ガンマプロテオバクテリアクラス、好ましくはエンテロバクター科、好ましくはエシェリキア属、より好ましくは大腸菌の細菌を含む群から選択される。
【0066】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌は、非病原性細菌である。本明細書で使用される場合、「非病原性」という表現は、生物、特に動物生物、好ましくはヒト生物に接触しても害を及ぼさない細菌を指す。特に、「害を及ぼさない」という表現は、細菌が感染、障害または疾患を引き起こさないことを意味することを意図している。
【0067】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌は、プロテオバクテリア門の細菌を含む群から選択される。本明細書で使用される場合、プロテオバクテリア門の細菌としては、アルファプロテオバクテリアクラス、ベータプロテオバクテリアクラス、ガンマプロテオバクテリアクラス、デルタプロテオバクテリアクラス、イプシロンプロテオバクテリアクラスおよびゼータプロテオバクテリアクラスの細菌が挙げられる。
【0068】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌は、ガンマプロテオバクテリアクラスのものである。本明細書で使用される場合、ガンマプロテオバクテリアクラスの細菌としては、アシディチオバシラス科、アエロモナス科、アルテロモナス科、カルディオバクテリウム科、クロマチウム科、腸内細菌科、レジオネラ科、メチロコッカス科、オセアノスピリルム科、パスツレラ科、シュードモナス科、Ｔｈｉｏｔｒｉｃｈａｅａ、ビブリオ科、およびキサントモナス科が挙げられる。
【0069】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌は、エンテロバクター科のものである。本明細書で使用される「エンテロバクター科」という用語は、５０を超える属および２００を超える種を含むグラム陰性菌のファミリーを指す。本発明の範囲内で、エンテロバクター科の細菌の非限定的な例としては、シトロバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、モルガネラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、およびエルシニア属の細菌が挙げられる。
【0070】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌は、エシェリキア属のものである。本発明の範囲内で、エシェリキア属の細菌の非限定的な例としては、Ｅ．アデカルボキシラータ、
Ｅ．アルベルティイ（Ｅ．ａｌｂｅｒｔｉｉ）、Ｅ．ブラタエ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）、大腸菌、Ｅ．ファグソニイ（Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、Ｅ．ハーマンニイ（Ｅ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉ）、およびＥ．ブルネリス（Ｅ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ）の種の細菌が挙げられる。
Ｅ．アルベルティイ（Ｅ．ａｌｂｅｒｔｉｉ）、Ｅ．ブラタエ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）、大腸菌、Ｅ．ファグソニイ（Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、Ｅ．ハーマンニイ（Ｅ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉ）、およびＥ．ブルネリス（Ｅ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ）の種の細菌が挙げられる。
【0071】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌は、エシェリキア・コリ種のものである。本明細書で使用される場合、「エシェリキア・コリ」とも呼ばれる「大腸菌」は、多くの哺乳動物個体、特にヒト個体の腸内フローラに天然に見出される細菌種を指す。大腸菌種に属する細菌はまた、工業的発酵プロセスにおいて、様々な生成物を合成するために、特に本発明の文脈においては、生物学的分子、例えば、ポリペプチドおよび核酸分子などを合成するために使用される。
【0072】
本発明の別の態様は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌に関し、細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／またはその相同体であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、細菌がｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まないという条件で、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
【0073】
本明細書で使用される場合、「Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子」とは、発現の結果、生理学的機能性Ｌｐｐポリペプチドとなる任意の遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、Ｌｐｐ機能に関与する遺伝子としては、Ｌｐｐポリペプチドをコードするｌｐｐ遺伝子自体が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子は、それぞれＹｂｉＳ、ＹｃｆＳおよびＥｒｆＫポリペプチドをコードする遺伝子ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫのうちのいずれか１つを含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、Ｌｐｐ機能性に関与する少なくとも１つの遺伝子は、ｌｐｐ、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子、ならびに／またはそれらの相同体、ならびにそれらの任意の組み合わせを含むまたはこれらからなる群から選択される。
【0075】
一実施形態では、大腸菌株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＤＨ５－アルファ株、ＤＨ１０Ｂ株、ＩＮＶ１１０株、Ｍａｃｈ１株、ＭＧ１６５５株、Ｒｏｓｅｔｔａ（登録商標）株およびＴＯＰ１０株を含む非限定的な群から選択される。
【0076】
実際には、ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ‐ｏｍｐＴｈｓｄＳＢ（ｒＢ‐，ｍＢ‐）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）；
ＤＨ５－Ａｌｐｈａ株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ‐φ８０ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒＫ‐，ｍＫ＋）ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４λ‐ｔｈｉ－１ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１；
ＤＨ１０Ｂ株は、次の遺伝子型を有する：
Ｆ‐ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ） φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ－ｌｅｕ ）７６９７ｇａｌＵｇａｌＫ λ‐ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｎｕｐＧ；
ＩＮＶ１１０株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ’［ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢｌａｃＩｑｌａｃＺΔＭ１５］ｒｐｓＬ （ＳｔｒＲ）ｔｈｒ ｌｅｕ ｅｎｄＡｔｈｉ－１ｌａｃＹｇａｌＫｇａｌＴａｒａ ｔｏｎＡｔｓｘ ｄａｍ ｄｃｍ ｓｕｐＥ４４Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）Δ（ｍｃｒＣ－ｍｒｒ）１０２：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）；
Ｍａｃｈ１株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ‐φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ΔｌａｃＸ７４ｈｓｄＲ（ｒＫ‐，ｍＫ＋）ΔｒｅｃＡ１３９８ｅｎｄＡ１ ｔｏｎＡ；
ＭＧ１６５５株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ‐λ‐ｉｌｖＧ‐ｒｆｂ－５０ｒｐｈ－１；
Ｒｏｓｅｔｔａ（登録商標）株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ－ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ－ｍＢ－）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ（ＣａｍＲ）；
ＴＯＰ１０株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ‐ ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ－ｌｅｕ）７６９７ｇａｌＵ ｇａｌＫ λ‐ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｅｎｄＡ１ ｎｕｐＧ。
ＤＨ５－Ａｌｐｈａ株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ‐φ８０ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒＫ‐，ｍＫ＋）ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４λ‐ｔｈｉ－１ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１；
ＤＨ１０Ｂ株は、次の遺伝子型を有する：
Ｆ‐ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ） φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ－ｌｅｕ ）７６９７ｇａｌＵｇａｌＫ λ‐ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｎｕｐＧ；
ＩＮＶ１１０株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ’［ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢｌａｃＩｑｌａｃＺΔＭ１５］ｒｐｓＬ （ＳｔｒＲ）ｔｈｒ ｌｅｕ ｅｎｄＡｔｈｉ－１ｌａｃＹｇａｌＫｇａｌＴａｒａ ｔｏｎＡｔｓｘ ｄａｍ ｄｃｍ ｓｕｐＥ４４Δ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）Δ（ｍｃｒＣ－ｍｒｒ）１０２：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）；
Ｍａｃｈ１株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ‐φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ΔｌａｃＸ７４ｈｓｄＲ（ｒＫ‐，ｍＫ＋）ΔｒｅｃＡ１３９８ｅｎｄＡ１ ｔｏｎＡ；
ＭＧ１６５５株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ‐λ‐ｉｌｖＧ‐ｒｆｂ－５０ｒｐｈ－１；
Ｒｏｓｅｔｔａ（登録商標）株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ－ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ－ｍＢ－）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）ｐＲＡＲＥ（ＣａｍＲ）；
ＴＯＰ１０株は、次の遺伝子型を有する：Ｆ‐ ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ－ｌｅｕ）７６９７ｇａｌＵ ｇａｌＫ λ‐ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｅｎｄＡ１ ｎｕｐＧ。
【0077】
本発明の範囲内で、「エンベロープ完全性に関与するタンパク質」という表現は、グラム陰性菌の細菌エンベロープの構造エレメントとして、ならびに／または細菌エンベロープの合成および／もしくは維持に関与するエレメントとして知られているタンパク質を指すことを意味する。エンベロープ完全性に関与するタンパク質の例としては、これらに限定されないが、ペリプラズムタンパク質、外膜タンパク質、ペリプラズムペプチドグリカンへの内膜の付着、ペリプラズムペプチドグリカンの外膜への付着、および／または内膜の外膜への付着に関与するタンパク質が挙げられる。実例として、本発明によるエンベロープ完全性に関与するタンパク質としては、これらに限定されないが、外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）および／またはその相同体；主要外膜プロリポタンパク質Ｌｐｐ（Ｌｐｐ）および／またはその相同体；トランスエンベロープＴｏｌ－Ｐａｌ複合体のタンパク質、例えば、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（Ｐａｌ）など、およびペリプラズムペプチドグリカン中に存在する短いペプチド骨格へのＬｐｐの架橋を行うＬ，Ｄ－トランスペプチダーゼ、例えば、ＹｂｉＳ、ＹｃｆＳおよびＥｒｆＫなどが挙げられる。
【0078】
いくつかの実施形態では、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする遺伝子内の変異は、エンベロープ完全性を変化させる変異である。特定の実施形態では、エンベロープ完全性の変化は、エンベロープ完全性の欠陥または破壊である。
【0079】
グラム陰性菌の細菌エンベロープ完全性を評価する技術は、当業者に知られており、これらに限定されないが、既知のサイズの標識化合物（例えば、標識デキストランなど）に対する透過性、浸透圧ショックに対する耐性を試験することが挙げられる。いくつかの実施形態では、細菌エンベロープの完全性は、例えば、Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１６ Ａｕｇ；１０１（３）：３９４－４１０）に記載のとおり、ペプチドグリカンと相互作用するタンパク質との間の相互作用を判定することによって評価することができる。
【0080】
いくつかの実施形態では、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの遺伝子のそれぞれ内の変異は、ペリプラズムペプチドグリカンへの内膜の付着、ペリプラズムペプチドグリカンの外膜への付着、または外膜への内膜の付着を破壊する変異である。
【0081】
外膜のペリプラズムペプチドグリカンへの付着を評価する技術は、当業者に知られており、これらに限定されないが、電子顕微鏡によるペリプラズムの厚さの観察、外膜ブレブ形成の顕微鏡観察、相互作用タンパク質の共免疫沈降、相互作用するタンパク質の架橋が挙げられる。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｐａｌ、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子、ならびに／またはそれらの相同体を含む群から選択され、少なくとも２つの変異遺伝子のうちの少なくとも１つは、ｏｍｐＡ遺伝子またはｌｐｐ遺伝子、またはその相同体である。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｐａｌ、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子、ならびに／またはそれらの相同体を含む群から選択され、少なくとも２つの変異遺伝子のうちの少なくとも１つは、ｏｍｐＡ遺伝子またはｌｐｐ遺伝子、またはその相同体である。
【0082】
特定の実施形態では、少なくとも２つの変異遺伝子は、以下の組み合わせのうちの１つを含む：
－ｏｍｐＡおよびｌｐｐ、および／またはその相同体；
－ｌｐｐおよびｐａｌ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡおよびｐａｌ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；または、
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｙｃｆＳ、および／またはその相同体。
－ｏｍｐＡおよびｌｐｐ、および／またはその相同体；
－ｌｐｐおよびｐａｌ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡおよびｐａｌ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；または、
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｙｃｆＳ、および／またはその相同体。
【0083】
特定の実施形態では、少なくとも２つの変異遺伝子は、以下の組み合わせのうちの１つを含む：
－ｏｍｐＡおよびｌｐｐ、および／またはその相同体；
－ｌｐｐおよびｐａｌ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡおよびｐａｌ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｃｆＳ、およびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；または、
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｙｃｆＳ、および／またはその相同体。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの変異遺伝子は、以下の組み合わせのうちの１つを含む：
－ｏｍｐＡおよびｌｐｐ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡおよびｙｂｉＳ、ならびに／またはｙｃｆＳおよび／もしくはｅｒｆＫ、ならびに／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｃｆＳ、およびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；または、
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｙｃｆＳ、および／またはその相同体。
－ｏｍｐＡおよびｌｐｐ、および／またはその相同体；
－ｌｐｐおよびｐａｌ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡおよびｐａｌ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｃｆＳ、およびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；または、
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｙｃｆＳ、および／またはその相同体。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの変異遺伝子は、以下の組み合わせのうちの１つを含む：
－ｏｍｐＡおよびｌｐｐ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡおよびｙｂｉＳ、ならびに／またはｙｃｆＳおよび／もしくはｅｒｆＫ、ならびに／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｃｆＳ、およびｅｒｆＫ、および／またはその相同体；または、
－ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、ｙｂｉＳおよびｙｃｆＳ、および／またはその相同体。
【0084】
細菌遺伝子内に変異を生じさせる技術は当業者に公知であり、これらに限定されないが、ファージ形質導入、化学的変異誘発、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９によるゲノム編集、ジンクフィンガードメイン－ヌクレアーゼ融合が挙げられる。
【0085】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体中に少なくとも１つの変異を含む。
【0086】
ｏｍｐＡ遺伝子は、外膜プロテインＡをコードする大腸菌のゲノム中に自然に見出される。ＯｍｐＡタンパク質は、そのＮ末端βバレルによって、グラム陰性菌の細菌エンベロープの外膜に広がっている。タンパク質の可溶性Ｃ末端部分は、ペリプラズム内に伸長し、ペリプラズムペプチドグリカンと非共有結合により相互作用する。
【0087】
ｏｍｐＡ遺伝子は、本発明によるグラム陰性菌のエンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードすることが理解される。より正確には、ｏｍｐＡ遺伝子は、細菌エンベロープの外膜のペリプラズムペプチドグリカンへの付着に関与するタンパク質をコードする。
【0088】
特定の実施形態では、ｏｍｐＡ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号ＥＧ１０６６９の核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｏｍｐＡ遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも７５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。本発明の範囲内で、「少なくとも７５％の核酸同一性」という表現は、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の核酸同一性を包含する。
【0089】
２つの核酸配列の同一性レベルは、最新技術から利用可能な既知のアルゴリズムのいずれか１つを使用することによって実施され得る。
【0090】
実例として、核酸同一性パーセンテージは、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗソフトウェア（バージョン１．８３）を使用して決定することができ、パラメータは、以下のように設定する：
－遅い／正確なアライメント：（１）ギャップオープンペナルティ：１５；（２）ギャップ延長ペナルティ：６．６６；（３）重み行列：ＩＵＢ；
－高速／近似アライメント：（４）Ｋ－タプル（ワード）サイズ：２；（５）ギャップペナルティ：５；（６）トップダイアゴナル数：５；（７）ウィンドウサイズ：４；（８）スコアリング方法：パーセント。
－遅い／正確なアライメント：（１）ギャップオープンペナルティ：１５；（２）ギャップ延長ペナルティ：６．６６；（３）重み行列：ＩＵＢ；
－高速／近似アライメント：（４）Ｋ－タプル（ワード）サイズ：２；（５）ギャップペナルティ：５；（６）トップダイアゴナル数：５；（７）ウィンドウサイズ：４；（８）スコアリング方法：パーセント。
【0091】
いくつかの実施形態では、ｏｍｐＡ遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。
【0092】
一実施形態では、ｏｍｐＡ遺伝子は、配列番号１からなる核酸配列によって表される。
【0093】
特定の実施形態では、ＯｍｐＡタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０Ａ９１０を有するプレタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ＯｍｐＡプレタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。本発明の範囲内で、「少なくとも７５％のアミノ酸同一性」という表現は、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％のアミノ酸同一性を包含する。
【0094】
実例として、アミノ酸同一性パーセンテージも、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗソフトウェア（バージョン１．８３）を使用して決定することができ、パラメータは、以下のように設定する：
－遅い／正確なアライメント：（１）ギャップオープンペナルティ：１０．００；（２）ギャップ延長ペナルティ：０．１；（３）タンパク質重み行列：ＢＬＯＳＵＭ；
－高速／近似アライメント：（４）ギャップペナルティ：３；（５）Ｋタプル（ワード）
サイズ：１；（６）トップダイアゴナル数：５；（７）ウィンドウサイズ：５；（８）スコアリング方法：パーセント。
－遅い／正確なアライメント：（１）ギャップオープンペナルティ：１０．００；（２）ギャップ延長ペナルティ：０．１；（３）タンパク質重み行列：ＢＬＯＳＵＭ；
－高速／近似アライメント：（４）ギャップペナルティ：３；（５）Ｋタプル（ワード）
サイズ：１；（６）トップダイアゴナル数：５；（７）ウィンドウサイズ：５；（８）スコアリング方法：パーセント。
【0095】
いくつかの実施形態では、ＯｍｐＡプレタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。
【0096】
一実施形態では、ＯｍｐＡプレタンパク質は、配列番号２からなるアミノ酸配列によって表される。
【0097】
一実施形態では、ｏｍｐＡ遺伝子内の変異は、ペリプラズムペプチドグリカンへのＯｍｐＡの結合の破壊を促進する変異である。本明細書で使用する場合、「ＯｍｐＡのペリプラズムペプチドグリカンへの結合を破壊する」という表現は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌で観察される共有結合による結合レベルの最大約７５％に達するペリプラズムペプチドグリカンへのＯｍｐＡの共有結合による結合レベルを指す。本発明の範囲内で、「最大で約７５％」という表現は、約７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．５％および０．１％を包含する。
【0098】
ＯｍｐＡのペリプラズムペプチドグリカンへの結合を評価する技術は当業者に知られており、これらに限定されないが、共分離ベースの技術、例えば、共免疫沈降、ＧＳＴプルダウンなど；蛍光ベースのアッセイ、例えばＦＲＥＴ、ＢｉＦＣなど；表面プラズモン共鳴ベースのアッセイ；遺伝子レポーターベースのアッセイ、例えば、酵母２ハイブリッド、ファージディスプレイなどが挙げられる。
【0099】
ＯｍｐＡプレタンパク質を外膜へ自然に整列させている間、ＯｍｐＡプレタンパク質は切断され、その２１ａａ長のＮ末端シグナルペプチドおよび３２５ａａ長の成熟タンパク質を放出する。
【0100】
実際には、ｏｍｐＡ遺伝子内の変異の位置が、アミノ酸配列、配列番号３の成熟ＯｍｐＡタンパク質を基準として、所与の位置のアミノ酸をコードする対応するコドンに対して定義することができる。
【0101】
一実施形態では、ＯｍｐＡ成熟タンパク質は、配列番号３に対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、ＯｍｐＡ成熟タンパク質は、配列番号３からなるアミノ酸配列によって表される。
【0102】
いくつかの実施形態では、変異ｏｍｐＡ遺伝子は、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失、またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み；これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている。
【0103】
本明細書で使用される場合、「電荷を有しないアミノ酸」という表現は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）を含むか、またはこれらからなる群から選択されるアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「負電荷を有するアミノ酸」という表現は、グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）を含む、またはこれらからなる群から選択されるアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「正電荷を有するアミノ酸」という表現は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリジン（Ｋ）を含む、またはこれらからなる群から選択されるアミノ酸を指す。
【0104】
いくつかの実施形態では、ＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失は、２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンまたはその前から始まる欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている。
【0105】
特定の実施形態では、ＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失は、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まる欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている。
【0106】
いくつかの実施形態では、ｏｍｐＡ遺伝子の相同体（複数可）は、ｙｆｉＢ遺伝子およびｙｉａＤ遺伝子からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｏｍｐＡタンパク質の相同体（複数可）は、ＹｆｉＢタンパク質およびＹｉａＤタンパク質からなる群から選択される。
【0107】
実際には、ｙｆｉＢ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号ＥＧ１１１５２の核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｙｆｉＢ遺伝子は、配列番号１６に対して少なくとも７５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ｙｆｉＢ遺伝子は、配列番号１６に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。一実施形態では、ｙｆｉＢ遺伝子は、配列番号１６からなる核酸配列によって表される。
【0108】
特定の実施形態では、ＹｆｉＢタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７０２１のポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＹｆｉＢタンパク質は、配列番号１７に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ＹｆｉＢタンパク質は、配列番号１７に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、ＹｆｉＢタンパク質は、配列番号１７からなるアミノ酸配列によって表される。
【0109】
実例として、ＹｆｉＢのアミノ酸４３からアミノ酸１６０までの領域は、ＯｍｐＡと共に保存されている。ＹｆｉＢとＯｍｐＡとの間の保存されたアミノ酸を特定すると、該当する場合は、ＹｆｉＢタンパク質中のＯｍｐＡタンパク質から対応する変異を得ることができ、その逆も可能である。
【0110】
実際には、ｙｉａＤ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号ＥＧ１２２７１の核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｙｉａＤ遺伝子は、配列番号１８に対して少なくとも７５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ｙｉａＤ遺伝子は、配列番号１８に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。一実施形態では、ｙｉａＤ遺伝子は、配列番号１８からなる核酸配列によって表される。
【0111】
特定の実施形態では、ＹｉａＤタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３７６６５のポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＹｉａＤタンパク質は、配列番号１９に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ＹｉａＤタンパク質は、配列番号１９対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、ＹｉａＤタンパク質は、配列番号１９らなるアミノ酸配列によって表される。
【0112】
実例として、ＹｉａＤのアミノ酸１０３～アミノ酸２１９までの領域は、ＯｍｐＡと共に保存されている。ＹｉａＤとＯｍｐＡとの間の保存されたアミノ酸を特定すると、該当する場合は、ＹｉａＤタンパク質内のＯｍｐＡタンパク質から対応する変異を得ることができ、その逆も可能である。
【0113】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体中に少なくとも１つの変異を含む。
【0114】
ｌｐｐ遺伝子は、主要な外膜プロリポタンパク質Ｌｐｐをコードする大腸菌のゲノムに自然に見出される。Ｌｐｐタンパク質は、細菌エンベロープの外膜をペリプラズムのペプチドグリカンに繋留する。Ｌｐｐタンパク質は、脂質化されたＮ末端を介して外膜に固定され、Ｃ末端のリジンを介して、ペリプラズムペプチドグリカンに存在する短いペプチド主鎖に共有結合により付着される。ｌｐｐ遺伝子は、本発明によるグラム陰性菌のエンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードすることが理解される。より正確には、ｌｐｐ遺伝子は、細菌エンベロープの外膜のペリプラズムペプチドグリカンへの共有結合による付着に関与するタンパク質をコードする。
【0115】
特定の実施形態では、ｌｐｐ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号ＥＧ１０５４４の核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｌｐｐ遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも７５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。
【0116】
いくつかの実施形態では、ｌｐｐ遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。
【0117】
一実施形態では、ｌｐｐ遺伝子は、配列番号４からなる核酸配列によって表される。
特定の実施形態では、Ｌｐｐタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６９７７６を有するプレタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、Ｌｐｐプレタンパク質は、配列番号５に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。
特定の実施形態では、Ｌｐｐタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６９７７６を有するプレタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、Ｌｐｐプレタンパク質は、配列番号５に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。
【0118】
いくつかの実施形態では、Ｌｐｐプレタンパク質は、配列番号５に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。
【0119】
一実施形態では、Ｌｐｐプレタンパク質は、配列番号５からなるアミノ酸配列によって表される。
【0120】
一実施形態では、ｌｐｐ遺伝子内の変異は、ペリプラズムペプチドグリカンへのＬｐｐの結合を破壊する変異である。本明細書で使用する場合、「Ｌｐｐのペリプラズムペプチドグリカンへの結合を破壊する」という表現は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌で観察される共有結合による結合レベルの最大約７５％に達するペリプラズムペプチドグリカンへのＬｐｐの共有結合による結合レベルを指す。いくつかの実施形態では、ペリプラズムペプチドグリカンへのＬｐｐの共有結合による結合のレベルは、Ｌｐｐタンパク質に特異的に結合する抗体によって判定され得る。
【0121】
ペリプラズムペプチドグリカンへのＬｐｐの結合を評価する技術は当業者に知られており、ペリプラズムペプチドグリカンへのＯｍｐＡの結合を評価するのに有用な技術と同様の技術を含む。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２ Ｓｅｐｔ；２６７（２７）：１９５６０－４ ａｎｄ １９６３１－５）；Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１６ Ａｕｇ；１０１（３）：３９４－４１０）；Ｃｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ Ｍａｒ；７９（５）：１１６８－８１）を参照することができる。
【0122】
Ｌｐｐは、長さ７８ａａのプレタンパク質として自然に合成され、次いでペリプラズムへ向いている間に切断され、長さ２０ａａのＮ末端シグナルペプチドおよび長さ５８ａａの成熟タンパク質を放出するようになる。実際には、ｌｐｐ遺伝子内の変異の位置は、アミノ酸配列、配列番号６の成熟Ｌｐｐタンパク質を基準として、所与の位置のアミノ酸をコードする対応するコドンに対して定義されている。
【0123】
一実施形態では、Ｌｐｐ成熟タンパク質は、配列番号６に対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、Ｌｐｐ成熟タンパク質は、配列番号６からなるアミノ酸配列によって表される。
【0124】
一実施形態では、ｌｐｐ遺伝子内の変異は、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、別のアミノ酸、好ましくは電荷を有しないアミノ酸、より好ましくはロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換；５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの、アルギニン（Ｒ）をコードするコドンとの置換；ｌｐｐ遺伝子の完全な欠失；およびそれらの組み合わせを含むか、またはこれらからなる群から選択され、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている。
【0125】
いくつかの実施形態では、ｌｐｐ遺伝子の相同体は、ｙｑｈＨ遺伝子である。特定の実施形態では、Ｌｐｐタンパク質の相同体は、ＹｑｈＨタンパク質である。
【0126】
実際には、ｙｑｈＨ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号ＥＧ７５６７の核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｙｑｈＨ遺伝子は、配列番号２０に対して少なくとも７５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ｙｑｈＨ遺伝子は、配列番号２０に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。一実施形態では、ｙｑｈＨ遺伝子は、配列番号２０からなる核酸配列によって表される。
【0127】
特定の実施形態では、ＹｑｈＨタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６５２９８のポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＹｑｈＨタンパク質は、配列番号２１に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ＹｑｈＨタンパク質は、配列番号２１対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、ＹｑｈＨタンパク質は、配列番号２１からなるアミノ酸配列によって表される。
【0128】
実例として、ＹｑｈＨのアミノ酸２５～アミノ酸７１までの領域は、Ｌｐｐと共に保存されている。ＹｑｈＨとＬｐｐとの間の保存されたアミノ酸を特定すると、該当する場合は、ＹｑｈＨタンパク質内のＬｐｐタンパク質から対応する変異を得ることができ、その逆も可能である。
【0129】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、ｐａｌ遺伝子内に少なくとも１つの変異を含む。
【0130】
Ｐａｌ遺伝子は、ペプチドグリカン関連リポタンパク質をコードする大腸菌のゲノム中に自然に見出される。Ｐａｌタンパク質は、外膜の完全性を維持するために重要である。Ｐａｌ遺伝子は、本発明によるグラム陰性菌のエンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードすることが理解される。より正確には、ｐａｌ遺伝子は、細菌エンベロープの外膜のペリプラズムペプチドグリカンへの付着に関与するタンパク質をコードする。
【0131】
特定の実施形態では、ｐａｌ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号ＥＧ１０６８４の核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｐａｌ遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも７５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。
【0132】
いくつかの実施形態では、ｐａｌ遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。
【0133】
一実施形態では、ｐａｌ遺伝子は、配列番号７からなる核酸配列によって表される。
特定の実施形態では、Ｐａｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０Ａ９１２を有するプレタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、Ｐａｌプレタンパク質は、配列番号８に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。
特定の実施形態では、Ｐａｌタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０Ａ９１２を有するプレタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、Ｐａｌプレタンパク質は、配列番号８に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。
【0134】
いくつかの実施形態では、Ｐａｌプレタンパク質は、配列番号８に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。
【0135】
一実施形態では、Ｐａｌプレタンパク質は、配列番号８からなるアミノ酸配列によって表される。
【0136】
一実施形態では、遺伝子ｐａｌ内の変異は、ペリプラズムペプチドグリカンへのＰａｌの結合を破壊する変異である。本明細書で使用する場合、「Ｐａｌのペリプラズムペプチドグリカンへの結合を破壊する」という表現は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌で観察される結合レベルの最大約７５％に達するペリプラズムペプチドグリカンへのＰａｌの結合レベルを指す。
【0137】
実際には、Ｐａｌのペリプラズムペプチドグリカンへの結合を評価する手段は当業者に知られており、ペリプラズムペプチドグリカンへのＯｍｐＡまたはＬｐｐの結合を評価するための同じ技術を含む。
【0138】
ＯｍｐＡおよびＬｐｐと同様に、Ｐａｌは、長さ１７３ａａのプレタンパク質として自然に合成され、その後ペリプラズムへ向けている間に切断される。この切断により、長さ２１ａａのＮ末端シグナルペプチドおよび長さ１５２ａａの成熟タンパク質が放出される。実際には、ｐａｌ遺伝子内の変異の位置は、アミノ酸配列、配列番号９の成熟Ｐａｌタンパク質を基準として、所与の位置のアミノ酸をコードする対応するコドンに対して定義することができる。
一実施形態では、ｐａｌ遺伝子内の変異は、ｐａｌ遺伝子の完全な欠失、および１０４位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換を含むまたはそれらからなる群から選択され、位置が、アミノ酸配列、配列番号９に関して定義されている。
一実施形態では、ｐａｌ遺伝子内の変異は、ｐａｌ遺伝子の完全な欠失、および１０４位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換を含むまたはそれらからなる群から選択され、位置が、アミノ酸配列、配列番号９に関して定義されている。
【0139】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、ｙｂｉＳ（ｌｄｔＢとも呼ばれる）、ｙｃｆＳ（ｌｄｔＣとも呼ばれる）および／またはｅｒｆＫ（ｌｄｔＡとも呼ばれる）遺伝子内に少なくとも１つの変異を含む。
【0140】
ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子、およびｅｒｆＫ遺伝子はそれぞれ、酵素ＹｂｉＳ（ＬｄｔＢとも呼ばれる）、ＹｃｆＳ（ＬｄｔＣとも呼ばれる）、およびＥｒｆＫ（ＬｄｔＡとも呼ばれる）をそれぞれコードし、Ｃ末端リジンを介して、成熟Ｌｐｐタンパク質のペリプラズムペプチドグリカンへの共有結合による結合を触媒する。ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子およびｅｒｆＫ遺伝子は、本発明によるグラム陰性菌のエンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードすることが理解される。より正確には、ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子およびｅｒｆＫ遺伝子は、Ｌｐｐ外膜タンパク質のペリプラズムペプチドグリカンへの付着に関与するタンパク質をコードする。
【0141】
特定の実施形態では、ｙｂｉＳ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号Ｇ６４２２の核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｙｂｉＳ遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも７５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ｙｂｉＳ遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。一実施形態では、ｙｂｉＳ遺伝子は、配列番号１０からなる核酸配列によって表される。
【0142】
特定の実施形態では、ＹｂｉＳタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０ＡＡＸ８を有するプレタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ＹｂｉＳプレタンパク質は、配列番号１１に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ＹｂｉＳプレタンパク質は、配列番号１１に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、ＹｂｉＳプレタンパク質は、配列番号１１からなるアミノ酸配列によって表される。
【0143】
いくつかの実施形態では、ｙｂｉＳ遺伝子の相同体、特に機能的相同体は、ｌｄｔＤ、ｌｄｔＥまたはｌｄｔＦ遺伝子である。特定の実施形態では、ＹｂｉＳタンパク質の相同体、特に機能的相同体は、ＬｄｔＤ、ＬｄｔＥまたはＬｄｔＦタンパク質である。いくつかの実施形態では、ｌｄｔＤ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号ＥＧ１１２５３の核酸を指す。特定の実施形態では、ｌｄｔＥ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号Ｇ６９０４の核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｌｄｔＦ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号Ｇ６１０８の核酸を指す。
【0144】
特定の実施形態では、ｙｃｆＳ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号Ｇ６５７１の核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｙｃｆＳ遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも７５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ｙｃｆＳ遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。一実施形態では、ｙｃｆＳ遺伝子は、配列番号１２からなる核酸配列によって表される。
【0145】
特定の実施形態では、ＹｃｆＳタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ７５９５４を有するプレタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ＹｃｆＳプレタンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ＹｃｆＳプレタンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、ＹｃｆＳプレタンパク質は、配列番号１３からなるアミノ酸配列によって表される。
【0146】
特定の実施形態では、ｅｒｆＫ遺伝子は、ＥｃｏＣｙｃアクセッション番号Ｇ７０７３の核酸を指す。いくつかの実施形態では、ｅｒｆＫ遺伝子は、配列番号１４に対して少なくとも７５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ｅｒｆＫ遺伝子は、配列番号１４に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の核酸配列同一性を有する核酸配列によって表される。一実施形態では、ｅｒｆＫ遺伝子は、配列番号１４からなる核酸配列によって表される。
【0147】
特定の実施形態では、ＥｒｆＫタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３９１７６を有するプレタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ＥｒｆＫプレタンパク質は、配列番号１５に対して少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。
【0148】
いくつかの実施形態では、ＥｒｆＫプレタンパク質は、配列番号１５に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、ＥｒｆＫプレタンパク質は、配列番号１５からなるアミノ酸配列によって表される。
【0149】
特定の実施形態では、変異したｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子および／またはｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体は、それぞれ、ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子および／またはｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体の欠失からなる。
【0150】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、変異したｙｂｉＳおよびｙｃｆＳ遺伝子、および／またはその相同体を含む。一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、変異したｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体を含む。一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、変異したｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体を含む。一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、変異したｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体を含む。
【0151】
本明細書では、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよび／またはｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体のいずれかにおいて、変異により、ペリプラズムペプチドグリカンへの成熟Ｌｐｐポリペプチドの機能的共有結合による結合がない場合があることは理解されよう。
【0152】
Ｌｐｐのペプチドグリカンへの結合を測定する技術は、上記に記載されている。
【0153】
一実施形態では、ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子および／またはｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体内の変異は、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよび／またはｅｒｆＫ、および／またはその相同体の完全な欠失、ｙｂｉＳおよびｅｒｆＫ、および／またはその相同体の完全な欠失、ならびにｙｂｉＳおよびｙｃｆＳおよび／またはその相同体の完全な欠失、を含むまたはそれらからなる群から選択される。
【0154】
一実施形態では、ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子および／またはｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体内の変異は、これらの遺伝子によってコードされる酵素の触媒部位を損なう変異を含むか、またはそれらからなる。
【0155】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、負電荷を有するまたは電荷を有しないアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失；５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、別のアミノ酸、好ましくは電荷を有しないアミノ酸、より好ましくはロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換；５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの、アルギニン（Ｒ）をコードするコドンとの置換；またはｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、負電荷を有するまたは電荷を有しないアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失；５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、別のアミノ酸、好ましくは電荷を有しないアミノ酸、より好ましくはロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換；５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの、アルギニン（Ｒ）をコードするコドンとの置換；またはｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異を含む。
【0156】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失；５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、別のアミノ酸、好ましくは負電荷を有するまたは電荷を有しないアミノ酸、より好ましくはロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換；５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの、アルギニン（Ｒ）をコードするコドンとの置換；またはｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異、および
－ｐａｌ遺伝子内の少なくとも１つの変異であって、ｐａｌ遺伝子の完全な欠失、または１０４位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換を含み、位置が、アミノ酸配列、配列番号９に対して定義されている、変異を含む。
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失；５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、別のアミノ酸、好ましくは負電荷を有するまたは電荷を有しないアミノ酸、より好ましくはロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換；５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの、アルギニン（Ｒ）をコードするコドンとの置換；またはｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異、および
－ｐａｌ遺伝子内の少なくとも１つの変異であって、ｐａｌ遺伝子の完全な欠失、または１０４位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換を含み、位置が、アミノ酸配列、配列番号９に対して定義されている、変異を含む。
【0157】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌、またはそのバリアントは、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；および
－ｐａｌ遺伝子内の変異であって、ｐａｌ遺伝子の完全な欠失、または１０４位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換を含み、位置が、アミノ酸配列、配列番号９に対して定義されている、変異を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；および
－ｐａｌ遺伝子内の変異であって、ｐａｌ遺伝子の完全な欠失、または１０４位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換を含み、位置が、アミノ酸配列、配列番号９に対して定義されている、変異を含む。
【0158】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、負電荷を有するまたは電荷を有しないアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；および
－ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体を含む遺伝子群のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つのそれぞれ内の少なくとも１つの変異であって、好ましくは、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含むかまたはそれらからなる群から選択される変異（複数可）を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、負電荷を有するまたは電荷を有しないアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；および
－ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体を含む遺伝子群のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つのそれぞれ内の少なくとも１つの変異であって、好ましくは、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含むかまたはそれらからなる群から選択される変異（複数可）を含む。
【0159】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌、またはそのバリアントは、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失；５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、別のアミノ酸、好ましくは電荷を有しないアミノ酸、より好ましくはロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換；５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの、アルギニン（Ｒ）をコードするコドンとの置換；またはｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異、および
－ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子およびｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体を含む遺伝子群のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つのそれぞれ内の少なくとも１つの変異であって、好ましくは、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含むかまたはそれらからなる群から選択される変異（複数可）を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の少なくとも１つの変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失；５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、別のアミノ酸、好ましくは電荷を有しないアミノ酸、より好ましくはロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換；５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの、アルギニン（Ｒ）をコードするコドンとの置換；またはｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を含み、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異、および
－ｙｂｉＳ遺伝子、ｙｃｆＳ遺伝子およびｅｒｆＫ遺伝子、および／またはその相同体を含む遺伝子群のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つのそれぞれ内の少なくとも１つの変異であって、好ましくは、ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳおよびｅｒｆＫ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含むかまたはそれらからなる群から選択される変異（複数可）を含む。
【0160】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；および
－ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異を含む。
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；および
－ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異を含む。
【0161】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；ならびに
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含む。
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；ならびに
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含む。
【0162】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；ならびに
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含まない。
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；ならびに
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含まない。
【0163】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および
－ｐａｌ遺伝子の完全な欠失を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および
－ｐａｌ遺伝子の完全な欠失を含む。
【0164】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、配列番号６に対して定義されている、変異；および
－ｐａｌ遺伝子の完全な欠失を含む。
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、配列番号６に対して定義されている、変異；および
－ｐａｌ遺伝子の完全な欠失を含む。
【0165】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および
－ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、配列番号６に対して定義されている変異を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および
－ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、配列番号６に対して定義されている変異を含む。
【0166】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失であって、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、欠失、および
－ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、配列番号６に対して定義されている、変異を含む。
－２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失であって、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、欠失、および
－ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、配列番号６に対して定義されている、変異を含む。
【0167】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、ロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異；
－ｙｂｉＳ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；ならびに
－ｙｃｆＳ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含む。
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、ロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異；
－ｙｂｉＳ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；ならびに
－ｙｃｆＳ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含む。
【0168】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、ロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異；
－ｙｂｉＳ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；ならびに
－ｅｒｆＫ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、ロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異；
－ｙｂｉＳ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；ならびに
－ｅｒｆＫ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含む。
【0169】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および
－ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、ロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異；
－ｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失；および
－ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および
－ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、ロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異；
－ｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失；および
－ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失を含む。
【0170】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、ロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異；
－ｙｃｆＳ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；ならびに
－ｅｒｆＫ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、ロイシン（Ｌ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異；
－ｙｃｆＳ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失；ならびに
－ｅｒｆＫ遺伝子および／またはその相同体の完全な欠失を含む。
【0171】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および
－ｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失、
－ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失；および
－ｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および
－ｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失、
－ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失；および
－ｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失を含む。
【0172】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、アスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；および
－ｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、アスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異；および
－ｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を含む。
【0173】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、少なくとも１つの以下の変異：
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、配列番号６に対して定義されている、変異を含む。
－ｏｍｐＡ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、および
－ｌｐｐ遺伝子および／またはその相同体内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、配列番号６に対して定義されている、変異を含む。
【0174】
特定の実施形態では、本発明による細菌は、以下の変異を有する細菌の群から選択される；（ｉ）ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、およびｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に関して定義されている、変異；（ｉｉ）ｏｍｐＡ遺伝子内の変異であって、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンとの置換からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている、変異、およびｐａｌ遺伝子の完全な欠失；または（ｉｉｉ）ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に関して定義されている、変異、およびｐａｌ遺伝子の完全な欠失。
【0175】
一実施形態では、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子のそれぞれ内の変異は、ゲノム変異である。
【0176】
本明細書で使用される場合、「ゲノム変異」という表現は、細菌染色体からの核酸配列内の変異を指す。そのような実施形態では、変異は、安定であり、変異を含む細菌細胞の子孫に伝達される。
【0177】
特定の実施形態では、本発明による細菌は、少なくとも１つのゲノム外核酸分子をさらに含む。
【0178】
特定の実施形態では、本発明による細菌は、好ましくは、少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子をさらに含む。
【0179】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのゲノム外核酸分子は、プラスミド、コスミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含むまたはそれらからなる群から選択される。
【0180】
実際には、ゲノム外核酸分子は、特に目的の核酸分子の核酸ベクターへのクローニングから生じる、プラスミドの形態であってもよい。いくつかの実施形態では、非限定的な好適な核酸ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＥＴベクター、ｐＥＴｄｕｅｔベクター、ｐＧＢＭベクター、ｐＢＡＤベクター、ｐＵＣベクターである。
【0181】
一実施形態では、プラスミドは低コピープラスミドである。一実施形態では、プラスミドは高コピープラスミドである。
【0182】
実際には、ゲノム外核酸分子は、例えば、ワクチン接種または遺伝子療法などの治療目的の核酸分子を含み得る。
【0183】
実際には、治療目的の核酸分子は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマーであってもよく、または例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのマイクロＲＮＡをコードしてもよい。
【0184】
いくつかの実施形態では、核酸分子によってコードされるポリペプチドの合成が想定される場合、核酸ベクターは、誘導可能なプロモーター、特にｌａｃＺ遺伝子のプロモーター、ｔｒｐ遺伝子のプロモーターまたはβ－ラクタマーゼコード遺伝子のプロモーターも含み得る。実際には、核酸ベクターは、抗生物質、特にアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する耐性をコードする核酸も含み得る。
【0185】
特定の実施形態では、核酸分子によってコードされるポリペプチドは、治療的目的である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞質ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、非分泌ポリペプチドである。
【0186】
本明細書で使用される場合、「非分泌ポリペプチド」は、細菌の細胞質内で合成され、グラム陰性菌、特に大腸菌の細胞質膜および外膜などの細菌膜に埋め込まれること、または通過することのないポリペプチドを指す。換言すれば、「非分泌ポリペプチド」は、細胞質膜に埋め込まれていない、ペリプラズムに標的化されていない、外膜に埋め込まれていない、または培養培地に標的化されていないポリペプチドを指す。本発明の範囲内で、用語「細胞質膜」および「内膜」は、同等であることを意味する。
【0187】
一実施形態では、治療用ポリペプチドは、酵素活性または調節活性を有するタンパク質、特別な標的化活性を有するタンパク質、ワクチン特性を有するタンパク質、および診断特性を有するタンパク質を含む群から選択される。
【0188】
実際には、目的の核酸分子によってコードされる治療用ポリペプチドは、例えば、成長因子、抗体、ホルモン、サイトカイン、酵素、血漿因子などであり得る。実例として、本発明に従って使用するための治療用ポリペプチドは、例えば、貧血、自己免疫疾患、がん、糖尿病、血友病、感染症および神経変性疾患などの障害または疾患の治療および／または予防のための方法において実施され得る。
【0189】
本発明の範囲内で、本発明の使用および方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され得る。
【0190】
本発明による細菌は、ゲノム外核酸、例えばプラスミド、および／または核酸によってコードされるポリペプチドの工業的生産および精製のために実施され得ることが理解される。
【0191】
本発明は、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を産生するおよび精製するための、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含み、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌の使用に関し、細菌は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、変化したエンベロープ完全性を有し、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
【0192】
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つ」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上を包含する。
【0193】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのゲノム外核酸分子の産生および精製のための、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の使用に関する。
【0194】
特定の実施形態では、少なくとも１つのゲノム外核酸分子は、プラスミド、コスミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含むまたはそれらからなる群から選択される。
【0195】
本発明のさらなる態様は、好ましくは少なくとも１つのゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および精製のための、遺伝子改変大腸菌の使用に関し、この細菌が、少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含み、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含み、また、この細菌が、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、変化したエンベロープ完全性を有し、少なくとも１つの変異遺伝子が、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
【0196】
いくつかの実施形態では、細菌は、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏である。
【0197】
本発明のさらに他の態様は、好ましくは少なくとも１つのゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および精製のための、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の使用に関する。
【0198】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、ゲノム核酸によってコードされる。
【0199】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、少なくとも１つの細胞質ポリペプチドである。
【0200】
特定の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、少なくとも１つの非分泌ポリペプチドである。
【0201】
特定の実施形態では、少なくとも変異ｏｍｐＡ遺伝子は、２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは負電荷を有するアミノ酸、好ましくはグルタミン酸（Ｅ）またはアラニン（Ａ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンの、電荷を有しないまたは正電荷を有するアミノ酸、好ましくはアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンとの置換；および／または２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）または２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンまたはその前から始まるＯｍｐＡタンパク質のＣ末端部分の欠失；またはｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失からなり、これらの位置が、アミノ酸配列、配列番号３に対して定義されている。
【0202】
いくつかの実施形態では、Ｌｐｐ機能性に関与する変異遺伝子は、ｌｐｐ遺伝子内の変異であって、５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンの欠失からなり、位置が、アミノ酸配列、配列番号６に対して定義されている、変異、またはｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失、および／またはｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失および／またはｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失からなる。
【0203】
いくつかの実施形態では、細菌は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含む。特定の実施形態では、細菌は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含み、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／またはその相同体であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
【0204】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まない。
【0205】
特定の実施形態では、細菌は、本発明において定義されるとおりである。
【0206】
本発明はまた、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を産生するための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくともゲノム外核酸分子を増幅するために、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を培養するステップ；と
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を、好ましくは化学的溶解によって溶解して、溶解混合物を得るステップと；を含む。
ａ）少なくともゲノム外核酸分子を増幅するために、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を培養するステップ；と
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を、好ましくは化学的溶解によって溶解して、溶解混合物を得るステップと；を含む。
【0207】
本発明はまた、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を産生および精製するための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくともゲノム外核酸分子を増幅するために、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を培養するステップ；と
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を、好ましくは化学的溶解によって溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から、ゲノム外核酸分子を精製するステップと、を含む。
ａ）少なくともゲノム外核酸分子を増幅するために、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を培養するステップ；と
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を、好ましくは化学的溶解によって溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から、ゲノム外核酸分子を精製するステップと、を含む。
【0208】
本発明はまた、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を産生および精製するための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくともゲノム外核酸分子を増幅するために、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌を培養するステップであって、細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子であり、細菌が、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、ステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を、好ましくは化学的溶解によって溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から、増幅されたゲノム外核酸分子を精製するステップと、を含む。
ａ）少なくともゲノム外核酸分子を増幅するために、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌を培養するステップであって、細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子であり、細菌が、少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、ステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を、好ましくは化学的溶解によって溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から、増幅されたゲノム外核酸分子を精製するステップと、を含む。
【0209】
特定の実施形態では、少なくとも１つのゲノム外核酸分子は、プラスミド、コスミド、および細菌人工染色体（ＢＡＣ）を含むまたはそれらからなる群から選択される。
【0210】
別の態様では、本発明は、好ましくはゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生のための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくとも１つのポリペプチドを合成するために、好ましくは少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を培養するステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を溶解して、溶解混合物を得るステップと；を含む。
ａ）少なくとも１つのポリペプチドを合成するために、好ましくは少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を培養するステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を溶解して、溶解混合物を得るステップと；を含む。
【0211】
別の態様では、本発明は、好ましくはゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および精製のための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくとも１つのポリペプチドを合成するために、好ましくは少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を培養するステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から少なくとも１つのポリペプチドを精製するステップと、を含む。
ａ）少なくとも１つのポリペプチドを合成するために、好ましくは少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を培養するステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から少なくとも１つのポリペプチドを精製するステップと、を含む。
【0212】
本発明のさらなる一態様は、好ましくはゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および精製のための方法に関し、本方法は、
ａ）少なくとも１つのポリペプチドを合成するために、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌を培養するステップであって、細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子であり、細菌が、好ましくは、少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、ステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から少なくとも１つのポリペプチドを精製するステップと、を含む。
ａ）少なくとも１つのポリペプチドを合成するために、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌を培養するステップであって、細菌は、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体であるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子であり、細菌が、好ましくは、少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、ステップと；
ｂ）ステップａ）で得られた細菌を溶解して、溶解混合物を得るステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた溶解混合物から少なくとも１つのポリペプチドを精製するステップと、を含む。
【0213】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、ゲノム核酸によってコードされる。
【0214】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、１つの細胞質ポリペプチドである。
【0215】
特定の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、１つの非分泌ポリペプチドである。
【0216】
いくつかの実施形態では、上記の方法からの細菌は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含む。特定の実施形態では、上記の方法からの細菌は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含み、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡであり、少なくとも１つの変異遺伝子は、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
【0217】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まない。
【0218】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ステップａ）の前に、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を少なくとも一つのゲノム外核酸分子により形質転換することを含む、または形質転換することからなるステップａ０）をさらに含んでもよい。
【0219】
一実施形態では、本発明の方法によって産生されるポリペプチドは、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌によって分泌されない。したがって、ポリペプチドは、産生細菌からの放出を必要とする。
【0220】
「形質転換」という用語は、本明細書では、細菌、特に大腸菌の細胞質へのゲノム外核酸分子の導入を指すために使用される。その細胞質に形質転換ステップ後の少なくとも１つのゲノム外核酸分子を含む、細菌、特に大腸菌は、「形質転換細菌」として認定される。
【0221】
細菌の形質転換は、典型的には、細胞が、形質転換時に細胞質に入るゲノム外核酸分子に対して「コンピテント」になるように前もって処理されていることを必要とする。本明細書で使用される場合、「コンピテント」という用語は、ゲノム外核酸分子をその細胞質に取り込む能力が増大している細菌を指す。当業者は、コンピテント細菌を調製するための技術に精通している。実例として、コンピテント細菌の調製、形質転換、形質転換細菌の選択のステップについて、市販のキットまたは材料が使用される場合、製造業者の説明書を参照してもよく、かつ／または例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）によって記載されているプロトコルを参照してもよい。
【0222】
いくつかの実施形態では、コンピテント細菌は、化学的コンピテント細胞、特に塩化カルシウム処理細菌であってもよい。いくつかの代替実施形態では、コンピテント細菌は、エレクトロコンピテント細菌であってもよい。実際には、化学的コンピテントまたはエレクトロコンピテント細菌は、ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ（登録商標）、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）またＮＥＢ（登録商標）から購入され得る。
【0223】
大腸菌の場合、市販の化学的コンピテント細菌の非限定的なリストは、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５α、Ｍａｃｈ１、ＴＯＰ１０、ＩＮＶ１１０、ＳＩＧ１０を包含する。市販の大腸菌エレクトロコンピテント細菌の非限定的なリストには、Ｍｅｇａ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１Ｒ、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ５α、Ｏｎｅ ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０、ＳＩＧ１０ ＭＡＸを包含する。
【0224】
一態様では、本発明は、コンピテント形態の、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌に関する。換言すれば、本発明は、本発明によるコンピテント遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌に関する。コンピテント遺伝子改変グラム陰性菌は、化学的コンピテントまたはエレクトロコンピテントであり得る。
【0225】
本発明による細菌は、細菌の初期集団を増幅するため、ゲノム外核酸分子の増幅を達成するため、および／または核酸分子によってコードされるポリペプチド、特に細胞質ポリペプチドの有意な合成を達成するために、適切な培養培地中で培養されることが理解される。
【0226】
当業者は、細菌、特に大腸菌の培養技術に精通している。簡単に説明すると、好適な培養培地に細菌を接種し、一定温度（約２０℃～約４０℃）で、最適には、大腸菌の場合は約３７℃で、所望の密度の細胞が得られるまで撹拌しながら、インキュベートする。細胞密度は、培養物の光学密度を測定することによって、または顕微鏡を使用して細胞を数えることによって評価することができる。培養培地は、典型的には、細菌に対する選択圧を維持するために、目的の少なくとも１つのゲノム外核酸分子の存在によって与えられる抗生物質耐性に適合する抗生物質が補完される。実際には、細菌の成長に好適な培養培地の非限定的な例としては、ＬＢブロス、Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス、およびＭ９最小培地が含まれる。市販の培地は、例えば、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）、ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ（登録商標）などから購入され得、いくつかの企業を挙げることができる。ポリペプチドの産生を目的とする本発明の方法において、培養培地は、ポリペプチドをコードする核酸配列の誘導プロモーターの制御下で、発現を誘発する誘導分子が補完され得る。実例として、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドを使用して、ｌａｃオペレーターの制御下で核酸配列の発現を誘導することができる。
【0227】
特定の実施形態では、精製を容易にするために、ポリペプチドをタグと融合させてもよい。本発明に好適なタグの非限定的な例は、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ、Ｈａｌｏタグ、Ｈｉｓタグ、ＭＢＰタグ、Ｓｎａｐタグ、ＳＵＭＯタグ、およびそれらの組み合わせを含む群から選択され得る。
【0228】
実際には、および産業目的のために、本発明による細菌の培養は、例えば５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌまたは１，０００Ｌの発酵槽などの適切な発酵槽（バイオリアクター）で行うことができる。発酵槽内での培養は、バッチ条件または流加条件で行うことができる。
【0229】
本明細書で使用する場合、「バッチ発酵」という表現は、基質および細菌を発酵槽にバッチ式で投入することによって達成される発酵を指すことを意味する。本明細書で使用する場合、「フェドバッチ発酵」という表現は、高濃度の所与の基質が細菌培養に対して毒性である発酵を指す：基質濃度を毒性レベル未満に維持する目的で、培養によって基質が消費されるため、遅い速度で、基質を徐々に添加（「供給」）する。
【0230】
ゲノム外核酸分子の増幅および／または核酸分子によってコードされるポリペプチドの産生の際に、核酸分子および／またはポリペプチドが、細菌から抽出されることが理解される。この抽出は、細菌を溶解するステップによって行われる。本発明の範囲内で、溶解は、細菌染色体の細菌からの天然タンパク質含有物である細菌および／または細菌デブリの抽出を回避しながら、可能な限り多くの核酸分子および／または核酸分子によってコードされるポリペプチドを回収するように行われる。
【0231】
本明細書で使用される場合、「溶解すること」、「細菌溶解」および「溶解」という用語は、細胞質の内容物が少なくとも部分的に細菌の外に放出されるように、細菌エンベロープを部分的または完全に破壊することを指すために使用される。当業者は、細菌を溶解する技術に精通している。そのような技術としては、これらに限定されないが、例えば、機械的溶解技術、例えば、高圧ホモジナイザー、ビーズミルおよび超音波処理を使用する技術など；酵素溶解技術、例えば、リゾチームおよび／またはプロテイナーゼＫを使用する技術など；熱溶解、例えば、凍結／解凍サイクルを使用する技術など；ならびに化学的溶解技術、例えば、浸透圧ショック、アルカリ溶解および洗浄剤溶解、ならびにそれらの組み合わせなどが挙げられる。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の溶解は、化学的溶解、好ましくはアルカリ溶解である。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の溶解は、化学的溶解、好ましくはアルカリ溶解である。
【0232】
本明細書で使用される場合、「化学的溶解」という表現は、一般的に、細菌膜の破壊をもたらす、イオンおよび／または洗浄剤など、特定の溶質を含む溶液（複数可）中での細菌のインキュベーションをベースにした溶解技術を指すことを意味する。本明細書で使用される場合、「アルカリ溶解」という表現は、ＯＨ－イオンおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液中での細菌のインキュベーションをベースにした溶解方法を指すことを意味する。
【0233】
実際には、溶解ステップのためのＯＨ－イオンの最終濃度は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、好ましくは約７５ｍＭ～約２５０ｍＭである。本発明の範囲内において、「約５０ｍＭ～約５００ｍＭ」という表現は、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２２０ｍＭ、２４０ｍＭ、２６０ｍＭ、２８０ｍＭ、３００ｍＭ、３２０ｍＭ、３４０ｍＭ、３６０ｍＭ、３８０ｍＭ、４００ｍＭ、４２０ｍＭ、４４０ｍＭ、４６０ｍＭ、４８０ｍＭおよび５００ｍＭを包含する。
【0234】
実際には、ＯＨ－イオン源は、ＮａＯＨであってもよい。
【0235】
実際には、溶解ステップのためのＳＤＳの最終濃度は、約０．１％～約５％、好ましくは約０．２％～約２％、より好ましくは約０．２５％～約０．７５％である。本発明の範囲内で、「約０．１％～約５％」という表現は、０．１％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．９％、１％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、３％、３．２％、３．４％、３．６％、３．８％、４％、４．２％、４．４％、４．６％、４．８％、および５％を包含する。
【0236】
理論に拘束されるものではないが、ＯＨ－イオンは、細菌膜と反応し、脂肪酸－グリセロールエステル結合を破壊し、続いて細菌膜をＳＤＳに浸透させ得、次いで、タンパク質および膜を可溶化し得る。さらに、ＮａＯＨは、細胞ＤＮＡを変性させ得、細胞ＤＮＡを線形化し、その鎖が分離される一方で、環状プラスミドＤＮＡは、トポロジー的に拘束されたままである。実例として、アルカリ溶解ステップを実施することは、市販のキット、例えばＱｉａｇｅｎ（登録商標）のｍｉｎｉ、ｍｉｄｉおよびｍａｘｉ ｐｒｅｐ ｋｉｔ、またはＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ（登録商標）キットを用いて、製造業者の説明書に従って行われ得る。あるいは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）に記載の詳細なプロトコルを参照してもよい。
【0237】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の溶解ステップは、細菌を浸透圧ショックに供するステップを含む。
【0238】
本明細書で使用される「浸透圧ショック」という表現は、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を含む溶液の浸透圧濃度の突然の変化（例えば、約５分以下の期間にわたる）に相当する。
【0239】
本明細書で使用される場合、「浸透圧濃度」という表現は、溶媒１リットルあたりの溶質のオスモル数（Ｏｓｍ／Ｌ）または溶媒１キログラムあたりの溶質のオスモル数（Ｏｓｍ／ｋｇ）で表される溶質濃度の尺度を指す。
【0240】
一実施形態では、浸透圧ショックの振幅は、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を含む溶液の浸透圧濃度の約０．９倍以下、好ましくは約０．８倍以下、０．７倍、または０．６倍、より好ましくは約０．５倍以下、０．４倍、または０．３倍、さらにより好ましくは約０．２５倍以下、０．２倍、０．１５倍、または０．１倍、さらにより好ましくは約０．０９５倍以下の減少に相当する。
【0241】
一実施形態では、浸透圧ショックの振幅は、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌を含む溶液の浸透圧濃度の少なくとも約１０％の倍率、好ましくは少なくとも約１５％、２０％、２５％の倍率、より好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の倍率の低下に相当する。いくつかの実施形態では、倍率は、１００％である。本発明の範囲内で、倍率１００％は、細菌が、約０ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する培地または緩衝液に細菌が懸濁されていることを意味することを意図する。
【0242】
実例として、ＬＢ培養培地は、４４０ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を有する。浸透圧ショックを行うために純水を使用した場合には、浸透圧は、４４０ｍＯｓｍ／Ｌから０ｓｍ／Ｌに低下する。
【0243】
したがって、浸透圧の低下は、１００％である。
【0244】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌を浸透圧ショックに供するステップは、純水中で少なくとも約３０秒、好ましくは少なくとも約４５秒間、６０秒、７５秒、１００秒、１２５秒、１５０秒、１７５秒、２００秒、２２５秒、２５０秒または２７５秒、より好ましくは、少なくとも約３００秒間インキュベーションすることを含む。
【0245】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の浸透圧ショックに対する感受性が増大する。本実施形態において、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、変化していないエンベロープ完全性を有さない細菌と比較して、核酸分子またはポリペプチド抽出に対して過敏である、好ましくはゲノム外核酸分子またはポリペプチド抽出に対して過敏であると称される。
【0246】
浸透圧ショックに対する細菌の感受性は、浸透圧ショックの際に生存している（例えば、増殖できる）細菌の割合を定量化することによって評価することができる。
【0247】
浸透圧ショック時の細菌の生存率は、比率［ＣＦＵ／ｍＬ］ＯＳ／［ＣＦＵ／ｍＬ］Ｔ０を測定することによって評価できる。ここで、［ＣＦＵ／ｍＬ］ＯＳは、浸透圧ショック後の１ｍＬあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を表し、［ＣＦＵ／ｍＬ］Ｔ０は、浸透圧ショック前のＣＦＵ／ｍＬの数を表す。
【0248】
ＣＦＵ／ｍＬの数は、当技術分野における一般的な知識に従って、特に、新鮮培地中の細菌のサンプルの１：１０連続希釈後に測定され得、希釈のサンプルを寒天含有固体培養培地上に堆積させ、好適な対応する希釈で、ＣＦＵをカウントする。あるいは、ＣＦＵ／ｍＬは、約６００ｎｍでの光学密度を測定することによって評価することができる。
【0249】
一実施形態では、浸透圧ショックに対して過敏な遺伝子改変グラム陰性菌は、比率［ＣＦＵ／ｍＬ］ＯＳ／［ＣＦＵ／ｍＬ］Ｔ０、約１：１０１～約１：１０６、好ましくは、約１：１０２～約１：１０５を有する。
【0250】
本発明の範囲内において、「約１：１０１～約１：１０６」という表現は、１：１０１、１：１０２、１：１０３、１：１０４、１：１０５、および１：１０６を包含する。
【0251】
特定の実施形態では、比率［ＣＦＵ／ｍＬ］ＯＳ／［ＣＦＵ／ｍＬ］Ｔ０は、ｌｏｇ（ｌｏｇ１０）で表してもよい。差２ｌｏｇは、比率１：１０２に相当し、差５ｌｏｇは、比率１：１０５に相当する。
【0252】
一実施形態では、溶解、好ましくは化学的溶解、より好ましくはアルカリ溶解時に、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌から放出される少なくとも１つのゲノム外核酸分子および／またはポリペプチドの細胞あたり、または培養物１ｍＬあたりの量は、同等の条件で変化していないエンベロープ完全性を有する細菌から放出される量と比較して、増加している。
【0253】
本実施形態において、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、核酸分子および／またはポリペプチド抽出に対して過敏である、好ましくはゲノム外核酸分子および／またはポリペプチド抽出に対して過敏であると称される。
【0254】
一実施形態では、収量は、［ＡＭ／細胞］ＢＡＩ／［ＡＭ／細胞］ＢＲ比を計算することによって評価され得、式中、［ＡＭ／細胞］ＢＡＩは、本明細書に開示された方法に従って本発明に従って細菌から回収された核酸分子またはポリペプチドの量を指し、［ＡＭ／細胞］ＢＲは、同じ方法に従って、参照細菌、すなわち変化していないエンベロープ完全性を有する細菌から回収された核酸分子またはポリペプチドの量を指す。
【0255】
一実施形態では、溶解、好ましくは化学的溶解、より好ましくはアルカリ溶解時に本発明の遺伝子改変グラム陰性菌から放出される少なくとも１つのゲノム外核酸分子および／またはポリペプチドの細胞あたり、または培養物１ｍＬあたりの量は、参照細菌、すなわち、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較した場合、約１．１倍または少なくとも約１．１倍、好ましくは約１．２倍、または少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８、または１．９倍、より好ましくは約１．９倍または少なくとも約１．９倍、またはそれ以上増加している。
【0256】
本実施形態において、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、核酸および／またはポリペプチド抽出に対して過敏である、好ましくはゲノム外核酸またはポリペプチド抽出に対して過敏であると称される。
【0257】
一実施形態では、溶解、好ましくはアルカリ溶解時に、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌から放出されるゲノムＤＮＡの量に対する本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌から放出された少なくとも１つのゲノム外核酸分子および／またはポリペプチドの細胞あたり、または培養物１ｍＬあたりの量の比率は、少なくとも約１：１～少なくとも１０：１であり、例えば、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１および１０：１などである。
【0258】
一実施形態では、溶解、好ましくは化学的溶解、より好ましくはアルカリ溶解時に本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌から放出される少なくとも１つのポリペプチドの細胞あたり、または培養物１ｍＬあたりの量は、参照グラム陰性菌、特に大腸菌、すなわち、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較した場合、約１．１倍もしくは少なくとも約１．１倍、好ましくは約１．２倍もしくは少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、または１．９倍、好ましくは、約２倍もしくは少なくとも約２倍またはそれ以上増加している。
【0259】
一実施形態では、上記の少なくとも１つのポリペプチドおよび／または少なくとも１つのゲノム外核酸分子の細胞あたりまたは培養物１ｍＬあたりの量は、精製ステップ後の量に相当する。
【0260】
一実施形態では、上記の少なくとも１つのゲノム外核酸分子の細胞あたり、または培養物１ｍＬあたりの量は、スーパーコイルプラスミドの量に相当する。
【0261】
一実施形態では、本発明の方法は、溶解後に、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌によって放出された少なくとも１つのゲノム外核酸分子を精製するステップを含み、このステップは、本明細書に開示される方法のステップｃ）に相当する。
【0262】
一実施形態では、本発明の方法は、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌によって放出された少なくとも１つのポリペプチドを精製するステップを含む。
【0263】
当業者は、核酸および／またはタンパク質を精製する技術に精通している。実例として、核酸および／またはポリペプチドの精製ステップについて、市販のキットまたは材料、例えばＱｉａｇｅｎのｍｉｎｉ、ｍｉｄｉおよびｍａｘｉ ｐｒｅｐキットまたはＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌキットを使用する場合、製造業者の説明書を参照してもよく、かつ／または代わりに、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）に記載のプロトコルを参照してもよい。
【0264】
一実施形態では、産生されたゲノム外核酸分子は、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌から、好ましくは溶解ステップによって放出される。
【0265】
本発明は、少なくとも１つのゲノム外核酸分子の産生および産生細菌からの放出のための、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の使用にも関する。
【0266】
本発明は、少なくとも１つのゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生のための、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の使用にも関する。
【0267】
一実施形態では、産生されたポリペプチドは、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の細胞質から、好ましくは細胞溶解のステップによって放出される。
【0268】
本発明は、少なくとも１つのゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドの産生および産生細菌からの放出のための、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の使用にも関する。
【0269】
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌は、外膜小胞（ＯＭＶ）を産生しない。特定の実施形態では、少なくとも１つのゲノム外核酸分子および／または少なくとも１つのゲノム外核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドは、外膜小胞（ＯＭＶ）によって放出されない。
【0270】
本発明はまた、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌、および細菌をゲノム外核酸分子で形質転換する手段を含むキットに関する。
【0271】
本発明は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの変異遺伝子を含む遺伝子改変大腸菌であって、この細菌が、変化したエンベロープ完全性を有し、変化していないエンベロープ完全性を有する細菌と比較して、細菌溶解に対して過敏であり、少なくとも１つの変異遺伝子が、ｏｍｐＡおよび／もしくはその相同体あるか、またはＬｐｐ機能性に関与する遺伝子である、大腸菌と、この細菌をゲノム外核酸分子で形質転換するための手段と、を含むキットにさらに関する。
【0272】
いくつかの実施形態では、上記のキットの細菌は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含む。特定の実施形態では、上記のキットの細菌は、エンベロープ完全性に関与するタンパク質をコードする少なくとも２つの変異遺伝子を含み、少なくとも１つの変異遺伝子は、ｏｍｐＡおよび／またはその相同体であり、少なくとも１つの変異遺伝子は、Ｌｐｐ機能性に関与する遺伝子である。
【0273】
いくつかの実施形態では、細菌は、ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失およびｌｐｐ遺伝子の完全な欠失を同時に含まない。
【0274】
一実施形態では、本発明による細菌は、コンピテント細菌である。
【0275】
一実施形態では、本発明のキットは、本発明の遺伝子改変グラム陰性菌、特に大腸菌の形質転換反応における陽性対照として使用するためのプラスミドを含む。
【0276】
本明細書で使用される配列
【表1】
【0277】
配列番号：1(ompA核酸配列、1041bp)
atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggccgctccgaaagataacacctggtacactggtgctaaactgggctggtcccagtaccatgacactggtttcatcaacaacaatggcccgacccatgaaaaccaactgggcgctggtgcttttggtggttaccaggttaacccgtatgttggctttgaaatgggttacgactggttaggtcgtatgccgtacaaaggcagcgttgaaaacggtgcatacaaagctcagggcgttcaactgaccgctaaactgggttacccaatcactgacgacctggacatctacactcgtctgggtggcatggtatggcgtgcagacactaaatccaacgtttatggtaaaaaccacgacaccggcgtttctccggtcttcgctggcggtgttgagtacgcgatcactcctgaaatcgctacccgtctggaataccagtggaccaacaacatcggtgacgcacacaccatcggcactcgtccggacaacggcatgctgagcctgggtgtttcctaccgtttcggtcagggcgaagcagctccagtagttgctccggctccagctccggcaccggaagtacagaccaagcacttcactctgaagtctgacgttctgttcaacttcaacaaagcaaccctgaaaccggaaggtcaggctgctctggatcagctgtacagccagctgagcaacctggatccgaaagacggttccgtagttgttctgggttacaccgaccgcatcggttctgacgcttacaaccagggtctgtccgagcgccgtgctcagtctgttgttgattacctgatctccaaaggtatcccggcagacaagatctccgcacgtggtatgggcgaatccaacccggttactggcaacacctgtgacaacgtgaaacagcgtgctgcactgatcgactgcctggctccggatcgtcgcgtagagatcgaagttaaaggtatcaaagacgttgtaactcagccgcaggcttaa
atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggccgctccgaaagataacacctggtacactggtgctaaactgggctggtcccagtaccatgacactggtttcatcaacaacaatggcccgacccatgaaaaccaactgggcgctggtgcttttggtggttaccaggttaacccgtatgttggctttgaaatgggttacgactggttaggtcgtatgccgtacaaaggcagcgttgaaaacggtgcatacaaagctcagggcgttcaactgaccgctaaactgggttacccaatcactgacgacctggacatctacactcgtctgggtggcatggtatggcgtgcagacactaaatccaacgtttatggtaaaaaccacgacaccggcgtttctccggtcttcgctggcggtgttgagtacgcgatcactcctgaaatcgctacccgtctggaataccagtggaccaacaacatcggtgacgcacacaccatcggcactcgtccggacaacggcatgctgagcctgggtgtttcctaccgtttcggtcagggcgaagcagctccagtagttgctccggctccagctccggcaccggaagtacagaccaagcacttcactctgaagtctgacgttctgttcaacttcaacaaagcaaccctgaaaccggaaggtcaggctgctctggatcagctgtacagccagctgagcaacctggatccgaaagacggttccgtagttgttctgggttacaccgaccgcatcggttctgacgcttacaaccagggtctgtccgagcgccgtgctcagtctgttgttgattacctgatctccaaaggtatcccggcagacaagatctccgcacgtggtatgggcgaatccaacccggttactggcaacacctgtgacaacgtgaaacagcgtgctgcactgatcgactgcctggctccggatcgtcgcgtagagatcgaagttaaaggtatcaaagacgttgtaactcagccgcaggcttaa
【0278】
配列番号：2(OmpAプレタンパク質アミノ酸配列、346aa)
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFINNNGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKSNVYGKNHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLKSDVLFNFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQGLSERRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKGIKDVVTQPQA
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFINNNGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKSNVYGKNHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLKSDVLFNFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQGLSERRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKGIKDVVTQPQA
【0279】
配列番号：3(OmpA成熟タンパク質アミノ酸配列、325aa)
APKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFINNNGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKSNVYGKNHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLKSDVLFNFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQGLSERRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKGIKDVVTQPQA
APKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFINNNGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKSNVYGKNHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLKSDVLFNFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQGLSERRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKGIKDVVTQPQA
【0280】
配列番号：4(lpp核酸配列,237bp)
atgaaagctactaaactggtactgggcgcggtaatcctgggttctactctgctggcaggttgctccagcaacgctaaaatcgatcagctgtcttctgacgttcagactctgaacgctaaagttgaccagctgagcaacgacgtgaacgcaatgcgttccgacgttcaggctgctaaagatgacgcagctcgtgctaaccagcgtctggacaacatggctactaaataccgcaagtaa
atgaaagctactaaactggtactgggcgcggtaatcctgggttctactctgctggcaggttgctccagcaacgctaaaatcgatcagctgtcttctgacgttcagactctgaacgctaaagttgaccagctgagcaacgacgtgaacgcaatgcgttccgacgttcaggctgctaaagatgacgcagctcgtgctaaccagcgtctggacaacatggctactaaataccgcaagtaa
【0281】
配列番号：5(Lppプレタンパク質アミノ酸配列、78aa)
MKATKLVLGAVILGSTLLAGCSSNAKIDQLSSDVQTLNAKVDQLSNDVNAMRSDVQAAKDDAARANQRLDNMATKYRK
MKATKLVLGAVILGSTLLAGCSSNAKIDQLSSDVQTLNAKVDQLSNDVNAMRSDVQAAKDDAARANQRLDNMATKYRK
【0282】
配列番号：6(Lpp成熟タンパク質アミノ酸配列、58aa)
CSSNAKIDQLSSDVQTLNAKVDQLSNDVNAMRSDVQAAKDDAARANQRLDNATKYRK
CSSNAKIDQLSSDVQTLNAKVDQLSNDVNAMRSDVQAAKDDAARANQRLDNATKYRK
【0283】
配列番号：7(pal核酸配列、522bp)
atgcaactgaacaaagtgctgaaagggctgatgattgctctgcctgttatggcaattgcggcatgttcttccaacaagaacgccagcaatgacggcagcgaaggcatgctgggtgccggcactggtatggatgcgaacggcggcaacggcaacatgtcttccgaagagcaggctcgtctgcaaatgcaacagctgcagcagaacaacatcgtttacttcgatctggacaagtacgatatccgttctgacttcgctcaaatgctggatgcacatgcaaacttcctgcgtagcaacccgtcttacaaagtcaccgtagaaggtcacgcggacgaacgtggtactccggaatacaacatctccctgggtgaacgtcgtgcgaacgccgttaagatgtacctgcagggtaaaggcgtttctgcagaccagatctccatcgtttcttacggtaaagaaaaacctgcagtactgggtcatgacgaagcggcatactccaaaaaccgtcgtgcggtactggtttactaa
atgcaactgaacaaagtgctgaaagggctgatgattgctctgcctgttatggcaattgcggcatgttcttccaacaagaacgccagcaatgacggcagcgaaggcatgctgggtgccggcactggtatggatgcgaacggcggcaacggcaacatgtcttccgaagagcaggctcgtctgcaaatgcaacagctgcagcagaacaacatcgtttacttcgatctggacaagtacgatatccgttctgacttcgctcaaatgctggatgcacatgcaaacttcctgcgtagcaacccgtcttacaaagtcaccgtagaaggtcacgcggacgaacgtggtactccggaatacaacatctccctgggtgaacgtcgtgcgaacgccgttaagatgtacctgcagggtaaaggcgtttctgcagaccagatctccatcgtttcttacggtaaagaaaaacctgcagtactgggtcatgacgaagcggcatactccaaaaaccgtcgtgcggtactggtttactaa
【0284】
配列番号：8(Palプレタンパク質アミノ酸配列、173aa)
MQLNKVLKGLMIALPVMAIAACSSNKNASNDGSEGMLGAGTGMDANGGNGNMSEEQARLQMQQLQQNNIVYFDLDKYDIRSDFAQMLDAHANFLRSNPSYKVTVEGHADERGTPEYNISLGERRANAVKMYLQGKGVSADQISIVSYGKEKPAVLGHDEAAYSKNRRAVLVY
MQLNKVLKGLMIALPVMAIAACSSNKNASNDGSEGMLGAGTGMDANGGNGNMSEEQARLQMQQLQQNNIVYFDLDKYDIRSDFAQMLDAHANFLRSNPSYKVTVEGHADERGTPEYNISLGERRANAVKMYLQGKGVSADQISIVSYGKEKPAVLGHDEAAYSKNRRAVLVY
【0285】
配列番号：9(Pal成熟タンパク質アミノ酸配列、152aa)
CSSNKNASNDGSEGMLGAGTGMDANGGNGNMSSEEQARLQMQQLQQNNIVYFDLDKYDIRSDFAQMLDAHANFLRSNPSYKVTVEGHADERGTPEYNISLGERRANAVKMYLQGKGVSADQISIVSYGKEKPAVLGHDEAAYSKNRRAVLVY
CSSNKNASNDGSEGMLGAGTGMDANGGNGNMSSEEQARLQMQQLQQNNIVYFDLDKYDIRSDFAQMLDAHANFLRSNPSYKVTVEGHADERGTPEYNISLGERRANAVKMYLQGKGVSADQISIVSYGKEKPAVLGHDEAAYSKNRRAVLVY
【0286】
配列番号：10(ybiS核酸配列、921bp)
atgaatatgaaattgaaaacattattcgcagcggccttcgctgttgtcggcttttgcagtaccgcctctgcggtaacttatcctctgccaaccgacgggagtcgcctggttggtcagaatcaggtgatcaccattcctgaaggtaacactcagccgctggagtattttgccgccgagtaccagatggggctttccaatatgatggaagcgaacccgggtgtggataccttcctgccgaaaggcggtactgtactgaacattccgcagcagctgatcctgccggataccgttcatgaaggcatcgtcattaacagtgctgagatgcgtctttattactatccgaaagggaccaacaccgttatcgtgctgccgatcggcattggtcagttaggcaaagatacgcctatcaactggaccaccaaagttgagcgtaaaaaagcaggcccgacctggacgccgaccgccaaaatgcacgcagagtaccgcgctgcgggcgaaccgcttccggctgtcgttccggcaggtccggataacccgatggggctgtatgcactctatatcggtcgcctgtatgctatccatggcaccaacgccaacttcggtatcggcctgcgtgtaagtcatggttgtgtgcgtctgcgtaacgaagacatcaaattcctgttcgagaaagtaccggtcggtacccgcgtacagtttattgatgagccggtaaaagcgaccaccgagccagacggcagccgttatattgaagtccataacccgctgtctaccaccgaagcccagtttgaaggtcaggaaattgtgccaattaccctgacgaagagcgtgcagacagtgaccggtcagccagatgttgaccaggttgttcttgatgaagcgattaaaaaccgctccgggatgccggttcgtctgaattaa
atgaatatgaaattgaaaacattattcgcagcggccttcgctgttgtcggcttttgcagtaccgcctctgcggtaacttatcctctgccaaccgacgggagtcgcctggttggtcagaatcaggtgatcaccattcctgaaggtaacactcagccgctggagtattttgccgccgagtaccagatggggctttccaatatgatggaagcgaacccgggtgtggataccttcctgccgaaaggcggtactgtactgaacattccgcagcagctgatcctgccggataccgttcatgaaggcatcgtcattaacagtgctgagatgcgtctttattactatccgaaagggaccaacaccgttatcgtgctgccgatcggcattggtcagttaggcaaagatacgcctatcaactggaccaccaaagttgagcgtaaaaaagcaggcccgacctggacgccgaccgccaaaatgcacgcagagtaccgcgctgcgggcgaaccgcttccggctgtcgttccggcaggtccggataacccgatggggctgtatgcactctatatcggtcgcctgtatgctatccatggcaccaacgccaacttcggtatcggcctgcgtgtaagtcatggttgtgtgcgtctgcgtaacgaagacatcaaattcctgttcgagaaagtaccggtcggtacccgcgtacagtttattgatgagccggtaaaagcgaccaccgagccagacggcagccgttatattgaagtccataacccgctgtctaccaccgaagcccagtttgaaggtcaggaaattgtgccaattaccctgacgaagagcgtgcagacagtgaccggtcagccagatgttgaccaggttgttcttgatgaagcgattaaaaaccgctccgggatgccggttcgtctgaattaa
【0287】
配列番号：11(YbiSタンパク質アミノ酸配列、306aa)
MNMKLKTLFAAAFAVVGFCSTASAVTYPLPTDGSRLVGQNQVITIPEGNTQPLEYFAAEYQMGLSNMMEANPGVDTFLPKGGTVLNIPQQLILPDTVHEGIVINSAEMRLYYYPKGTNTVIVLPIGIGQLGKDTPINWTTKVERKKAGPTWTPTAKMHAEYRAAGEPLPAVVPAGPDNPMGLYALYIGRLYAIHGTNANFGIGLRVSHGCVRLRNEDIKFLFEKVPVGTRVQFIDEPVKATTEPDGSRYIEVHNPLSTTEAQFEGQEIVPITLTKSVQTVTGQPDVDQVVLDEAIKNRSGMPVRLN
MNMKLKTLFAAAFAVVGFCSTASAVTYPLPTDGSRLVGQNQVITIPEGNTQPLEYFAAEYQMGLSNMMEANPGVDTFLPKGGTVLNIPQQLILPDTVHEGIVINSAEMRLYYYPKGTNTVIVLPIGIGQLGKDTPINWTTKVERKKAGPTWTPTAKMHAEYRAAGEPLPAVVPAGPDNPMGLYALYIGRLYAIHGTNANFGIGLRVSHGCVRLRNEDIKFLFEKVPVGTRVQFIDEPVKATTEPDGSRYIEVHNPLSTTEAQFEGQEIVPITLTKSVQTVTGQPDVDQVVLDEAIKNRSGMPVRLN
【0288】
配列番号：12(ycfS核酸配列、963bp)
gtgatgatcaaaacgcgtttttctcgctggctaacgttttttacgttcgccgctgccgtggcgctggcgctaccggcaaaagccaacacctggccgctgccgccagcgggcagtcgtctggttggcgaaaacaaatttcatgtggtggaaaatgacggtggttctctggaagccatcgccaaaaaatacaacgtcggctttctcgctctgttacaggctaaccccggcgttgatccttacgtaccgcgcgcgggcagcgtgttaacgatcccgttgcaaaccctacttccagatgcgccgcgcgaaggcattgtgatcaacattgcggagctgcgtctctattactacccgccgggtaaaaattcggtaaccgtgtatccaataggtattggtcagttaggtggtgacacgctgacaccgacaatggtgaccaccgtttcagacaaacgtgcaaacccaacctggacgccaacggcaaacatccgcgcccgttataaagcacagggaattgagttgcctgcggtagtgccggctggactggataacccaatgggccatcatgcgattcgtctggcggcctatggcggcgtttatttgcttcatggtacgaacgccgatttcggcattggcatgcgggtaagttctggctgtattcgtctgcgggatgacgatatcaaaacactctttagccaggtcaccccaggcaccaaagtgaatatcatcaacactccgataaaagtctctgccgaaccaaacggtgcgcgtctggttgaagtacatcagccgctgtcagagaagattgatgacgatccgcagctgctgccaattacgctgaatagcgcaatgcaatcatttaaagatgcagcacaaactgacgctgaagtgatgcaacatgtgatggatgtccgttccgggatgccggtggatgtccgccgtcatcaagtgagcccacaaacgctgtaa
gtgatgatcaaaacgcgtttttctcgctggctaacgttttttacgttcgccgctgccgtggcgctggcgctaccggcaaaagccaacacctggccgctgccgccagcgggcagtcgtctggttggcgaaaacaaatttcatgtggtggaaaatgacggtggttctctggaagccatcgccaaaaaatacaacgtcggctttctcgctctgttacaggctaaccccggcgttgatccttacgtaccgcgcgcgggcagcgtgttaacgatcccgttgcaaaccctacttccagatgcgccgcgcgaaggcattgtgatcaacattgcggagctgcgtctctattactacccgccgggtaaaaattcggtaaccgtgtatccaataggtattggtcagttaggtggtgacacgctgacaccgacaatggtgaccaccgtttcagacaaacgtgcaaacccaacctggacgccaacggcaaacatccgcgcccgttataaagcacagggaattgagttgcctgcggtagtgccggctggactggataacccaatgggccatcatgcgattcgtctggcggcctatggcggcgtttatttgcttcatggtacgaacgccgatttcggcattggcatgcgggtaagttctggctgtattcgtctgcgggatgacgatatcaaaacactctttagccaggtcaccccaggcaccaaagtgaatatcatcaacactccgataaaagtctctgccgaaccaaacggtgcgcgtctggttgaagtacatcagccgctgtcagagaagattgatgacgatccgcagctgctgccaattacgctgaatagcgcaatgcaatcatttaaagatgcagcacaaactgacgctgaagtgatgcaacatgtgatggatgtccgttccgggatgccggtggatgtccgccgtcatcaagtgagcccacaaacgctgtaa
【0289】
配列番号：13(YcfSタンパク質アミノ酸配列、320aa)
VMIKTRFSRWLTFFTFAAAVALALPAKANTWPLPPAGSRLVGENKFHVVENDGGSLEAIAKKYNVGFLALLQANPGVDPYVPRAGSVLTIPLQTLLPDAPREGIVINIAELRLYYYPPGKNSVTVYPIGIGQLGGDTLTPTMVTTVSDKRANPTWTPTANIRARYKAQGIELPAVVPAGLDNPMGHHAIRLAAYGGVYLLHGTNADFGIGMRVSSGCIRLRDDDIKTLFSQVTPGTKVNIINTPIKVSAEPNGARLVEVHQPLSEKIDDDPQLLPITLNSAMQSFKDAAQTDAEVMQHVMDVRSGMPVDVRRHQVSPQTL
VMIKTRFSRWLTFFTFAAAVALALPAKANTWPLPPAGSRLVGENKFHVVENDGGSLEAIAKKYNVGFLALLQANPGVDPYVPRAGSVLTIPLQTLLPDAPREGIVINIAELRLYYYPPGKNSVTVYPIGIGQLGGDTLTPTMVTTVSDKRANPTWTPTANIRARYKAQGIELPAVVPAGLDNPMGHHAIRLAAYGGVYLLHGTNADFGIGMRVSSGCIRLRDDDIKTLFSQVTPGTKVNIINTPIKVSAEPNGARLVEVHQPLSEKIDDDPQLLPITLNSAMQSFKDAAQTDAEVMQHVMDVRSGMPVDVRRHQVSPQTL
【0290】
配列番号：14(erfK核酸配列、933bp)
atgcgtcgtgtaaatattctttgctcatttgctctgctttttgccagccatactagcctggcggtaacttatccattacctccagagggtagccgtttagtggggcagtcgtttactgtaactgttcctgatcacaatacccagccgctggagacttttgccgcacaatacgggcaagggttaagtaacatgctggaagcgaacccgggcgctgatgtttttttgccgaagtctggctcgcaactcaccattccgcagcaactgattttgcccgacactgttcgtaaagggattgttgttaacgtcgctgagatgcgtctttattactacccaccagacagtaatactgtggaagtctttcctattggtatcggccaggctgggcgagaaaccccgcgtaactgggtgactaccgttgaacgtaaacaagaagctccaacctggacgccaacgccgaacactcggcgcgaatatgcgaaacgaggggagagtttgcccgcatttgttcctgcgggccccgataatcccatggggctgtacgcgatttatattggcaggttgtatgccatccatggtaccaatgccaattttggtattgggctccgggtaagtcagggctgtattcgtctgcgcaatgacgatatcaaatatctgtttgataatgttcctgttgggacgcgtgtgcaaattatcgaccagccagtaaaatacaccactgaaccagatggctcgaactggctggaagttcatgagccattgtcgcgcaatcgtgcagaatatgagtctgaccgaaaagtgccattgccggtaaccccatctttgcgggcgtttatcaacgggcaagaagttgatgtaaatcgcgcaaatgctgcgttgcaacgtcgatcgggaatgcctgtgcaaattagttctggttcaagacagatgttttaa
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【0291】
配列番号：15(ErfKタンパク質アミノ酸配列、310aa)
MRRVNILCSFALLFASHTSLAVTYPLPPEGSRLVGQSFTVTVPDHNTQPLETFAAQYGQGLSNMLEANPGADVFLPKSGSQLTIPQQLILPDTVRKGIVVNVAEMRLYYYPPDSNTVEVFPIGIGQAGRETPRNWVTTVERKQEAPTWTPTPNTRREYAKRGESLPAFVPAGPDNPMGLYAIYIGRLYAIHGTNANFGIGLRVSQGCIRLRNDDIKYLFDNVPVGTRVQIIDQPVKYTTEPDGSNWLEVHEPLSRNRAEYESDRKVPLPVTPSLRAFINGQEVDVNRANAALQRRSGMPVQISSGSRQMF
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【0292】
配列番号：16(yfiB核酸、483bp)
atgataaagcacctggtagcacccctggttttcacctcactaatactgactggctgccagtcccctcagggaaagtttactcctgagcaagtcgccgctatgcaatcttatggatttactgaatccgccggcgactggtcgctgggcttatcagatgccattctgttcgcaaaaaatgactacaaattgctcccggaaagccagcaacagatccaaaccatggcagctaaattggcctcgacagggctaacacatgcccgtatggatggacacaccgataactatggtgaagacagttacaacgaaggcttatcattgaaacgggcgaatgtcgtggccgatgcatgggctatgggtggacaaattccacgcagcaatctcaccacacagggtttaggaaaaaaatatcccatagccagtaacaagaccgcccagggccgcgccgagaaccgccgcgtcgcagtggtgattactaccccttaa
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【0293】
配列番号：17(YfiBタンパク質アミノ酸配列、160aa)
MIKHLVAPLVFTSLILTGCQSPQGKFTPEQVAAMQSYGFTESAGDWSLGLSDAILFAKNDYKLLPESQQQIQTMAAKLASTGLTHARMDGHTDNYGEDSYNEGLSLKRANVVADAWAMGGQIPRSNLTTQGLGKKYPIASNKTAQGRAENRRVAVVITTP
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【0294】
配列番号：18(yiaD核酸、660bp)
atgaagaaacgtgtttatcttattgccgccgtagtgagtggcgctctggcggtatctggctgcacaactaacccttacaccggcgaacgcgaagcaggtaaatctgctatcggcgcaggtctgggctctctcgtgggcgcgggtattggtgcgctctcttcttcgaagaaagatcgcggtaaaggcgcgctgattggcgcagcagcaggcgcagctctgggcggcggcgttggttattacatggatgtgcaggaagcgaagctgcgcgacaaaatgcgcggcactggtgttagcgtaacccgcagcggggataacattatcctcaatatgccgaacaatgtgaccttcgacagcagcagcgcgaccctgaaaccggcgggcgctaacaccctgaccggcgtggcaatggtactgaaagagtatccgaaaacggcggttaacgtgattggttataccgacagcacgggtggtcacgacctgaacatgcgtctctcccagcaacgtgcggattccgttgccagcgcgttgatcacccagggcgtggacgccagccgcatccgtactcagggccttggcccggctaacccaatcgccagcaacagcaccgcagaaggtaaggcgcaaaaccgccgtgtagaaattaccttaagcccgctgtaa
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【0295】
配列番号：19(YiaDタンパク質アミノ酸配列、219aa)
MKKRVYLIAAVVSGALAVSGCTTNPYTGEREAGKSAIGAGLGSLVGAGIGALSSSKKDRGKGALIGAAAGAALGGGVGYYMDVQEAKLRDKMRGTGVSVTRSGDNIILNMPNNVTFDSSSATLKPAGANTLTGVAMVLKEYPKTAVNVIGYTDSTGGHDLNMRLSQQRADSVASALITQGVDASRIRTQGLGPANPIASNSTAEGKAQNRRVEITLSPL
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【0296】
配列番号：20(yqhH核酸、258bp)
atgaaaacgattttcaccgtgggagctgttgttctggcaacctgcttgctcagtggctgcgtcaatgagcaaaaggtcaatcagctggcgagcaatgtgcaaacattaaatgccaaaatcgcccggcttgagcaggatatgaaagcactacgcccacaaatctatgctgccaaatccgaagctaacagagccaatacgcgtcttgatgctcaggatcttgatgctcaggatcttgcgtgatgattgattgattgattgattgattgattgattgattgattgattg
atgaaaacgattttcaccgtgggagctgttgttctggcaacctgcttgctcagtggctgcgtcaatgagcaaaaggtcaatcagctggcgagcaatgtgcaaacattaaatgccaaaatcgcccggcttgagcaggatatgaaagcactacgcccacaaatctatgctgccaaatccgaagctaacagagccaatacgcgtcttgatgctcaggatcttgatgctcaggatcttgcgtgatgattgattgattgattgattgattgattgattgattgattgattg
【0297】
配列番号：21(YqhHタンパク質アミノ酸配列、85aa)
MKTIFTVGAVVLATCLLSGCVNEQKVNQLASNVQTLNAKIARLEQDMKALRPQIYAAKSEANRANTRLDAQDYFDCLRCLRMYAE
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【図面の簡単な説明】
【0298】
【図1】図１は、野生型ＭＧ１６５５大腸菌株（ＷＴ；対照）、および遺伝子型ΔｏｍｐＡ、ΔｌｐｐまたはΔｐａｌを有するＭＧ１６５５大腸菌株の純水による浸透圧ショック時の細菌生存を示す写真である。細菌の希釈は、図の下部に示す。
【図2】図２は、野生型ＭＧ１６５５大腸菌株（ＷＴ；対照）、および遺伝子型ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ、またはｌｐｐΔＫ５８、またはｏｍｐＡＲ２５６ＥおよびｌｐｐΔＫ５８の両方を有するＭＧ１６５５大腸菌株の水による浸透圧ショック時の細菌生存を示す写真である。細菌の希釈は、図の下部に示す。
【図3】図３は、野生型ＭＧ１６５５大腸菌株（ＷＴ；対照）、および遺伝子型ｏｍｐＡＤ２４１ＮまたはｏｍｐＡＤ２４１ＮおよびΔｌｐｐの両方を有するＭＧ１６５５大腸菌株の水による浸透圧ショック時の細菌生存を示す写真である。細菌の希釈は、図の下部に示す。
【図4】図４は、野生型ＭＧ１６５５大腸菌株（ＷＴ；対照）、ｏｍｐＡＲ２５６ＥおよびｌｐｐΔＫ５８遺伝子型を有するＭＧ１６５５大腸菌株（対照）およびｏｍｐＡＲ２５６Ｅ、ΔｙｂｉＳ、ΔｙｃｆＳ、ΔｅｒｆＫの変異の組み合わせを有するＭＧ１６５５大腸菌株の水による浸透圧ショック時の細菌生存を示す写真である。細菌の希釈は、図の下部に示す。
【図5】図５は、野生型ＭＧ１６５５大腸菌株（ＷＴ；対照）、およびｌｐｐＲ５７Ｌ、ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ、ΔｙｂｉＳ、ΔｙｃｆＳ、ΔｅｒｆＫの変異の組み合わせを有するＭＧ１６５５大腸菌株の水による浸透圧ショック時の細菌生存を示す写真である。細菌の希釈は、図の下部に示す。
【図6】図６は、野生型ＭＧ１６５５大腸菌株（ＷＴ；対照）、および遺伝子型ｌｐｐΔＫ５８またはｏｍｐＡＲ２５６ＥまたはΔｐａｌまたはｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６ＥまたはｌｐｐΔＫ５８ ΔｐａｌまたはｏｍｐＡＲ２５６Ｅ Δｐａｌを有するＭＧ１６５５大腸菌株の水による浸透圧ショック時の細菌生存を示す写真である。細菌の希釈は、図の下部に示す。
【図7】図７は、野生型ＭＧ１６５５大腸菌株（対照）および遺伝子型ΔｌｐｐまたはΔｌｐｐ ΔｏｍｐＡまたはΔｌｐｐ ｏｍｐＡΔＣｔｅｒを有するＭＧ１６５５大腸菌株の水による浸透圧ショック（Ａ）、ＰＢＳバッファで浸透圧ショックがない（Ｂ）またはＬＢミラー培養液（Ｃ）での細菌生存を示す写真である。希釈率（１０－２および１０－３）は、写真の右側に示す。
【図8】図８は、非商用溶解バッファ（自家製）を使用した調製プロトコル後に、野生型ＭＧ１６５５大腸菌株（レーン１）および遺伝子型ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ｌｐｐΔＫ５８のＭＧ１６５５大腸菌株（レーン２）から回収されたプラスミドＤＮＡの電気泳動による分析を示す図である。
【実施例】
【0299】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。
【0300】
実施例１：本研究で使用された細菌株
１－材料及び方法
１．１－レシピエント株
変異を操作するために使用されたレシピエント株のリストを表２に示す。
１－材料及び方法
１．１－レシピエント株
変異を操作するために使用されたレシピエント株のリストを表２に示す。
【表2】
【0301】
１．２－欠失
ＭＧ１６５５大腸菌株をレシピエント株として使用した。Ｋｅｉｏ ｓｔｒａｉｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）から得たｏｍｐＡ７７２（ｄｅｌ）：：ｋａｎまたはｌｐｐ－７５２（ｄｅｌ）：：ｋａｎまたはｐａｌ－７９０（ｄｅｌ）：：ｋａｎまたはｙｂｉＳ７９０（ｄｅｌ）：：ｋａｎまたはｙｃｆＳ７７５（ｄｅｌ）：：ｋａｎまたはｅｒｆＫ７６１（ｄｅｌ）：：ｋａｎのＰ１溶解物をドナーとして使用し、Ｔｈｏｍａｓｏｎｅｔａｌ．（Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００７ Ｊｕｌ；Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｕｎｉｔ １．１７）に記載されているようにレシピエント株に形質導入した。
ＭＧ１６５５大腸菌株をレシピエント株として使用した。Ｋｅｉｏ ｓｔｒａｉｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）から得たｏｍｐＡ７７２（ｄｅｌ）：：ｋａｎまたはｌｐｐ－７５２（ｄｅｌ）：：ｋａｎまたはｐａｌ－７９０（ｄｅｌ）：：ｋａｎまたはｙｂｉＳ７９０（ｄｅｌ）：：ｋａｎまたはｙｃｆＳ７７５（ｄｅｌ）：：ｋａｎまたはｅｒｆＫ７６１（ｄｅｌ）：：ｋａｎのＰ１溶解物をドナーとして使用し、Ｔｈｏｍａｓｏｎｅｔａｌ．（Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００７ Ｊｕｌ；Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｕｎｉｔ １．１７）に記載されているようにレシピエント株に形質導入した。
【0302】
単純変異体は、カナマイシンを含むＬＢ／寒天プレート上で選択した。次に、カナマイシン耐性をコードする遺伝子をＦＬＰリコンビナーゼによって切り出した。次に、他のＰ１形質導入を最初のバックグラウンドに実施して、組み合わせた欠失株を作成した。
【0303】
１．３－点変異および部分欠失
Ｔｈｏｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｓｍｉｄ．２００７ Ｓｅｐ；５８（２）：１４８－５８）で報告されているように、ラムダレッドシステムを使用して、大腸菌ＭＧ１６５５で、ｄｓ－ＤＮＡによる組換えを行った。
Ｔｈｏｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｓｍｉｄ．２００７ Ｓｅｐ；５８（２）：１４８－５８）で報告されているように、ラムダレッドシステムを使用して、大腸菌ＭＧ１６５５で、ｄｓ－ＤＮＡによる組換えを行った。
【0304】
２段階組換え法を使用した。１回目にｃａｔ－ｓａｃＢを使用して目的の部位に組み込み、クロラムフェニコールで選択し、その後２回目のラムダレッド組換えを行って、周囲のＤＮＡ領域を改変することなく、ｃａｔ－ｓａｃＢを選択した最終変異遺伝子座に置き換えた。
ｏｍｐＡ変異体の場合、ＰＣＲ産物ｏｍｐＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢは、ｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＲ２５６ＥまたはｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＤ２４１ＮまたはｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡΔｃによる１回目のラムダレッド組換え、その後の２回目のラムダレッド組換えによって組み込んだ。ｌｐｐ変異体の場合、ｌｐｐ：：ｃａｔ－ｓａｃＢは、１回目に組み込み、次にｌｐｐ：：ｌｐｐΔＫ５８またはｌｐｐ：：ｌｐｐＫ５８Ｒとの組換え後にカウンター選択した。
ｏｍｐＡ変異体の場合、ＰＣＲ産物ｏｍｐＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢは、ｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＲ２５６ＥまたはｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＤ２４１ＮまたはｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡΔｃによる１回目のラムダレッド組換え、その後の２回目のラムダレッド組換えによって組み込んだ。ｌｐｐ変異体の場合、ｌｐｐ：：ｃａｔ－ｓａｃＢは、１回目に組み込み、次にｌｐｐ：：ｌｐｐΔＫ５８またはｌｐｐ：：ｌｐｐＫ５８Ｒとの組換え後にカウンター選択した。
【0305】
１．４－菌株
プラスミド抽出アッセイのために、株ｌｐｐ：：ｌｐｐΔＫ５８の遺伝子ｆｕｍＤとｐｉｋＦの間のラムダレッド組換えによってカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）を組み込んだ。また、菌株ｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの遺伝子ｏｍｐＡとｍａｔＰとの間のラムダレッド組換えによって、カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）を組み込んだ。
配列ｌｐｐ：：ｌｐｐΔＫ５８ ｆｕｍＤ－ｋａｎＲ－ＰｉｋＦ（ｌｐｐΔＫ５８－ＫａｎＲ）およびｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ－ΔｋａｎＲ－ｍａｔＰ（ｏｍｐａＲ２５６Ｅ－ΔＫａｎＲ）は、株大腸菌ＤＨ５αおよび大腸菌ＤＨ１０Ｂにおいて、Ｐ１形質導入を用いて導入した。
プラスミド抽出アッセイのために、株ｌｐｐ：：ｌｐｐΔＫ５８の遺伝子ｆｕｍＤとｐｉｋＦの間のラムダレッド組換えによってカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）を組み込んだ。また、菌株ｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの遺伝子ｏｍｐＡとｍａｔＰとの間のラムダレッド組換えによって、カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）を組み込んだ。
配列ｌｐｐ：：ｌｐｐΔＫ５８ ｆｕｍＤ－ｋａｎＲ－ＰｉｋＦ（ｌｐｐΔＫ５８－ＫａｎＲ）およびｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ－ΔｋａｎＲ－ｍａｔＰ（ｏｍｐａＲ２５６Ｅ－ΔＫａｎＲ）は、株大腸菌ＤＨ５αおよび大腸菌ＤＨ１０Ｂにおいて、Ｐ１形質導入を用いて導入した。
【0306】
この研究で使用した菌株およびその遺伝子型を表３に示す。
【表3】
【0307】
２－結果
２．１－ｏｍｐＡ変異
ＯｍｐＡタンパク質は、そのＮ末端βバレルにより、グラム陰性菌の細菌エンベロープの外膜に広がっている。
２．１－ｏｍｐＡ変異
ＯｍｐＡタンパク質は、そのＮ末端βバレルにより、グラム陰性菌の細菌エンベロープの外膜に広がっている。
【0308】
タンパク質の可溶性Ｃ末端部分は、ペリプラズム内に伸長し、ペリプラズムペプチドグリカンと非共有結合により相互作用する。外膜とペリプラズムペプチドグリカン間の相互作用を干渉するために、次のｏｍｐＡ変異を使用した：（ｉ）ｏｍｐＡ遺伝子の完全な欠失（ΔｏｍｐＡまたはｏｍｐＡ７７２（ｄｅｌ））－（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）、および（ｉｉ）ｏｍｐＡとペリプラミックペプチドグリカンとの相互作用を媒介する残基における点変異（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１４ Ｄｅｃ；１８３８（１２）：３０１４－２４）。配列番号３の２５６位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンは、グルタミン酸（Ｅ）をコードするコドンで置換した－ｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ；配列番号３の２４１位のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンは、アスパラギン（Ｎ）をコードするコドンで置換した－ｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＤ２４１Ｎ。
【0309】
配列番号３のアミノ酸１７１～アミノ酸３２５までからなるＣ末端部分の部分的欠失も生じた－ｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡΔＣｔｅｒ。
【0310】
ｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＲ２５６Ｅは、以前は正電荷を有していた残基２５６に負電荷が生じる。これにより、変異ＯｍｐＡタンパク質とペプチドグリカンとの間に静電反発力が生じ、それらの相互作用が無効になる。ｏｍｐＡ：：ｏｍｐＡＤ２４１Ｎは、残基２４１の電荷を無効にし、したがってペプチドグリカンとの相互作用を無効にする。
【0311】
２．２－ｌｐｐ変異
大腸菌中のＬｐｐタンパク質は、細菌エンベロープの外膜をペリプラズムペプチドグリカンに繋留する。タンパク質は、脂質化されたＮ末端を介して外膜に固定され、Ｃ末端のリジンを介して、ペリプラズムペプチドグリカンに存在する短いペプチド主鎖に付着される。外膜とペリプラズムペプチドグリカンとの間の相互作用を干渉するために、次のｌｐｐ変異を使用した。
（ｉ）ｌｐｐ遺伝子の完全な欠失－ｌｐｐ－７５２（ｄｅｌ）－（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）、および（ｉｉ）Ｌｐｐとペリプラズムペプチドグリカンとの相互作用に影響を与える点変異（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２ Ｓｅｐ２５；２６７（２７）：１９５６０－４）。Ｌｐｐとペリプラズムペプチドグリカンとの相互作用を媒介する配列番号６のＬｐｐタンパク質の５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンを欠失させた－ｌｐｐ：：ｌｐｐΔＫ５８；配列番号６の５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンをロイシン（Ｌ）をコードするコドンで置換した－ｌｐｐ：：ｌｐｐＲ５７Ｌ。
大腸菌中のＬｐｐタンパク質は、細菌エンベロープの外膜をペリプラズムペプチドグリカンに繋留する。タンパク質は、脂質化されたＮ末端を介して外膜に固定され、Ｃ末端のリジンを介して、ペリプラズムペプチドグリカンに存在する短いペプチド主鎖に付着される。外膜とペリプラズムペプチドグリカンとの間の相互作用を干渉するために、次のｌｐｐ変異を使用した。
（ｉ）ｌｐｐ遺伝子の完全な欠失－ｌｐｐ－７５２（ｄｅｌ）－（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）、および（ｉｉ）Ｌｐｐとペリプラズムペプチドグリカンとの相互作用に影響を与える点変異（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２ Ｓｅｐ２５；２６７（２７）：１９５６０－４）。Ｌｐｐとペリプラズムペプチドグリカンとの相互作用を媒介する配列番号６のＬｐｐタンパク質の５８位のリジン（Ｋ）をコードするコドンを欠失させた－ｌｐｐ：：ｌｐｐΔＫ５８；配列番号６の５７位のアルギニン（Ｒ）をコードするコドンをロイシン（Ｌ）をコードするコドンで置換した－ｌｐｐ：：ｌｐｐＲ５７Ｌ。
【0312】
ｌｐｐ：：ｌｐｐＲ５７Ｌ変異体では、ペプチドグリカンへのＬｐｐの架橋に不可欠なリジンは、依然として存在するが、隣接する残基が改変されている。この改変により、Ｌｐｐのペプチドグリカンへの結合が、野生型Ｌｐｐタンパク質と比較して、７０％低下する。
【0313】
２．３－ｙｂｉＳ、ｙｃｆＳ、およびｅｒｆＫ変異
これらの３つの遺伝子は、それぞれ、ペリプラズムペプチドグリカンへのＣ末端リジンを介した成熟Ｌｐｐタンパク質の共有結合による結合を触媒する酵素をコードする。外膜とペリプラズムペプチドグリカンとの間の相互作用を干渉するために、以下の変異を使用した：ｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失－ｙｂｉＳ７９０（ｄｅｌ）－、ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失－ｙｃｆＳ７７５（ｄｅｌ）－および、ｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失－ｅｒｆＫ７６１（ｄｅｌ）（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）。
これらの３つの遺伝子は、それぞれ、ペリプラズムペプチドグリカンへのＣ末端リジンを介した成熟Ｌｐｐタンパク質の共有結合による結合を触媒する酵素をコードする。外膜とペリプラズムペプチドグリカンとの間の相互作用を干渉するために、以下の変異を使用した：ｙｂｉＳ遺伝子の完全な欠失－ｙｂｉＳ７９０（ｄｅｌ）－、ｙｃｆＳ遺伝子の完全な欠失－ｙｃｆＳ７７５（ｄｅｌ）－および、ｅｒｆＫ遺伝子の完全な欠失－ｅｒｆＫ７６１（ｄｅｌ）（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）。
【0314】
２．４－ｐａｌ変異
Ｐａｌタンパク質は、Ｔｏｌ－Ｐａｌ収縮装置に属するリポタンパク質である。
これは、細菌エンベロープ中の外膜とペリプラズムペプチドグリカンとの間の付着に関与する。外膜とペリプラズムペプチドグリカン間の相互作用を干渉するために、次の変異を使用した：ｐａｌ遺伝子の完全な欠失－ｐａｌ－７９０（ｄｅｌ）－（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）。
Ｐａｌタンパク質は、Ｔｏｌ－Ｐａｌ収縮装置に属するリポタンパク質である。
これは、細菌エンベロープ中の外膜とペリプラズムペプチドグリカンとの間の付着に関与する。外膜とペリプラズムペプチドグリカン間の相互作用を干渉するために、次の変異を使用した：ｐａｌ遺伝子の完全な欠失－ｐａｌ－７９０（ｄｅｌ）－（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）。
【0315】
実施例２：浸透圧ショックに対する生存への、細菌細胞壁に影響を与える変異（複数可）の効果
１－材料及び方法
１．１－細菌培養
大腸菌株をＬＢ培養培地（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０～７．２）中、３７℃で撹拌しながら成長させた。必要に応じて、２５μｇ／ｍｌの抗生物質（カナマイシンなど）を使用した。
１－材料及び方法
１．１－細菌培養
大腸菌株をＬＢ培養培地（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０～７．２）中、３７℃で撹拌しながら成長させた。必要に応じて、２５μｇ／ｍｌの抗生物質（カナマイシンなど）を使用した。
【0316】
１．２－浸透圧ショック後の生存率の定量化
指数培養期または定常培養期の大腸菌株をペレット化し、純水で最初の体積の２倍に５分間再懸濁した。次に、この再懸濁液を水で連続希釈し（１０倍希釈）、３７℃で一晩インキュベートしたＬＢ／寒天プレートに直接スポットした。
指数培養期または定常培養期の大腸菌株をペレット化し、純水で最初の体積の２倍に５分間再懸濁した。次に、この再懸濁液を水で連続希釈し（１０倍希釈）、３７℃で一晩インキュベートしたＬＢ／寒天プレートに直接スポットした。
【0317】
２－結果
第１に、ｏｍｐＡ、ｌｐｐまたはｐａｌの欠失変異を有する大腸菌株ＭＧ１６５５の生存率を、浸透圧ショックで評価し、野生型ＭＧ１６５５株と比較した。図１は、浸透圧ショック後の欠失変異体の生存率が野生型株にほぼ匹敵することを示している。換言すれば、ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、またはｐａｌ遺伝子内の単一変異は、浸透圧ショックに対する大腸菌株の感受性にわずかに影響を与えるのみである。
第１に、ｏｍｐＡ、ｌｐｐまたはｐａｌの欠失変異を有する大腸菌株ＭＧ１６５５の生存率を、浸透圧ショックで評価し、野生型ＭＧ１６５５株と比較した。図１は、浸透圧ショック後の欠失変異体の生存率が野生型株にほぼ匹敵することを示している。換言すれば、ｏｍｐＡ、ｌｐｐ、またはｐａｌ遺伝子内の単一変異は、浸透圧ショックに対する大腸菌株の感受性にわずかに影響を与えるのみである。
【0318】
浸透圧ショック後、変異ｏｍｐＡＲ２５６Ｅを有する大腸菌株ＭＧ１６５５の生存率は、対照で観察されたものと類似していた。変異ｌｐｐΔＫ５８を有する大腸菌株ＭＧ１６５５の浸透圧ショック後の生存率は、対照と比較した場合、約１０分の１減少した。
【0319】
したがって、単一変異ｏｍｐＡＲ２５６ＥおよびｌｐｐΔＫ５８は、浸透圧ショックに対する感受性に関して、エンベロープ完全性にわずかに影響を与えるのみである。
【0320】
対照的に、変異ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ｌｐｐΔＫ５８を有する大腸菌株ＭＧ１６５５の浸透圧ショック後の生存率は、対照と比較して、急激に１０５減少し、ｌｐｐΔＫ５８単一変異体と比較して、１０４未満減少した（図２）。
【0321】
同様に、単一のｏｍｐＡＤ２４１Ｎ変異は、対照細菌と比較した場合、浸透圧ショック時の細菌の生存率に影響を与えなかったが、ｏｍｐＡＤ２４１Ｎ変異とｌｐｐ遺伝子の欠失との組み合わせ（Δｌｐｐ）は、１０６の浸透圧ショック後の生存率に、影響を与えた（図３）。変異ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ΔｙｂｉＳ ΔｙｃｆＳ ΔｅｒｆＫを有する大腸菌株ＭＧ１６５５の浸透圧ショック後の生存率は、対照と比較して、１０４未満で減少した（図４）。遺伝子型ｌｐｐＲ７７Ｌ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ΔｙｂｉＳ ΔｅｒｆＫを有する大腸菌株ＭＧ１６５５の浸透圧ショック後の生存率は、対照と比較した場合、約１０３減少した。遺伝子型ｌｐｐＲ５７Ｌ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ΔｙｂｉＳ ΔｙｃｆＳを有する大腸菌株ＭＧ１６５５の浸透圧ショック後の生存率は、対照と比較した場合、約１０５減少した（図５）。
【0322】
変異ΔｐａｌとｏｍｐＡＲ２５６Ｅとの組み合わせは、対照と比較した場合、大腸菌株ＭＧ１６５５の浸透圧ショック後の生存率が、約１０５減少する。変異ΔｐａｌとｌｐｐΔＫ５８との組み合わせは、対照と比較した場合、浸透圧ショック後の生存率が、約１０２減少する。この観察結果は、対照と同様であった単一Δｐａｌ変異体の浸透圧ショック後の生存率とは対照的である（図６）。変異Δｌｐｐ変異体を有する大腸菌株ＭＧ１６５５の浸透圧ショック後の生存率は、対照と同様であった。変異ΔｌｐｐΔｏｍｐＡまたはΔｌｐｐｏｍｐＡΔｃを有する大腸菌株ＭＧ１６５５の浸透圧ショック後の生存率は、単一のΔｌｐｐ変異体の生存率よりも低かった。注目すべきことに、浸透圧ショックのない条件は、遺伝子型Δｌｐｐ ΔｏｍｐＡまたはΔｌｐｐ ｏｍｐＡΔｃを有する大腸菌株ＭＧ１６５５のコロニーの密度が、対照または単一のΔｌｐｐ変異体と比較して弱いことを示した（図７）。
【0323】
３－結論
浸透圧ショック後の生存率の大幅な低下は、変異ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ；Δｌｐｐ ｏｍｐＡＤ２４１Ｎ；ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ΔｙｂｉＳ ΔｙｃｆＳ ΔｅｒｆＫ；ｌｐｐＲ５７Ｌ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ΔｙｂｉＳ ΔｙｃｆＳ；ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ Δｐａｌの組み合わせを担持するＭＧ１６５５大腸菌株で見られた。したがって、これらの株は、参照細菌と比較した場合、浸透圧ショックに対して過敏である。
浸透圧ショック後の生存率の大幅な低下は、変異ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ；Δｌｐｐ ｏｍｐＡＤ２４１Ｎ；ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ΔｙｂｉＳ ΔｙｃｆＳ ΔｅｒｆＫ；ｌｐｐＲ５７Ｌ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ΔｙｂｉＳ ΔｙｃｆＳ；ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ Δｐａｌの組み合わせを担持するＭＧ１６５５大腸菌株で見られた。したがって、これらの株は、参照細菌と比較した場合、浸透圧ショックに対して過敏である。
【0324】
さらに、ｌｐｐＲ５７Ｌ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ΔｙｂｉＳ ΔｅｒｆＫ またはｌｐｐΔＫ５８ ΔｐａｌまたはΔｌｐｐ ΔｏｍｐＡまたはΔｌｐｐ ｏｍｐＡΔｃの変異の組み合わせを有するＭＧ１６５５大腸菌株も、単一変異体または対照と比較した場合、浸透圧ショック後の生存率の低下を示したが、この低下は、上記の変異体と比較するとわずかであった。
外膜とペリプラズムペプチドグリカンとの間の相互作用に影響を与える少なくとも２つの変異を組み合わせることにより、浸透圧ショック後の大腸菌の生存率が相乗的に低下した。
外膜とペリプラズムペプチドグリカンとの間の相互作用に影響を与える少なくとも２つの変異を組み合わせることにより、浸透圧ショック後の大腸菌の生存率が相乗的に低下した。
【0325】
実施例３：遺伝子型ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの大腸菌株ＭＧ１６５５を使用することにより、染色体外ＤＮＡの回収が増加する。
１－材料及び方法
１．１－細菌培養およびコンピテント細菌の調製
ＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）で成長させた指数期培養を３７℃で撹拌しながら、ソルビトールを添加した冷水で数回洗浄し、エレクトロポレーション前に氷上に保持した。必要に応じて、抗生物質を２５μｇ／ｍＬ（カナマイシン；Ｋａｎ）、１５μｇ／ｍＬ（クロラムフェニコール；Ｃｍ）、または１００μｇ／ｍＬ（アンピシリン；Ａｍｐ）で使用した。
１－材料及び方法
１．１－細菌培養およびコンピテント細菌の調製
ＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）で成長させた指数期培養を３７℃で撹拌しながら、ソルビトールを添加した冷水で数回洗浄し、エレクトロポレーション前に氷上に保持した。必要に応じて、抗生物質を２５μｇ／ｍＬ（カナマイシン；Ｋａｎ）、１５μｇ／ｍＬ（クロラムフェニコール；Ｃｍ）、または１００μｇ／ｍＬ（アンピシリン；Ａｍｐ）で使用した。
【0326】
プラスミドＤＮＡの回収：
ＳＤＳによるアルカリ溶解（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）によるプラスミドＤＮＡの調製のプロトコルを用いて、低コピープラスミドｐＢＡＤ１８－Ｃｍ（ｐＢＡＤ１８－Ｃｍ（ＡＴＣＣ（登録商標）８７３９６（商標）））を、ＭＧ１６５５大腸菌株の対照または変異ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅを含むＭＧ１６５５大腸菌株のいずれかに形質転換した。
ＳＤＳによるアルカリ溶解（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）によるプラスミドＤＮＡの調製のプロトコルを用いて、低コピープラスミドｐＢＡＤ１８－Ｃｍ（ｐＢＡＤ１８－Ｃｍ（ＡＴＣＣ（登録商標）８７３９６（商標）））を、ＭＧ１６５５大腸菌株の対照または変異ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅを含むＭＧ１６５５大腸菌株のいずれかに形質転換した。
【0327】
小規模調製のために、１ｍＬの細菌培養物を次のようにさらに処理した：
－培養液１ｍｌを遠心分離する。
－溶解に進む。
－Ｐ１の１５０μＬを添加する（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、８０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／Ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ、ｐＨ８．０；氷上に保持）；
－Ｐ２の１５０μＬを添加する（１００ｍＭ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）；
－チューブを数回反転させて、混合させる。
－室温で５分間インキュベートする。
－Ｐ３の３００μＬを添加する（３Ｍ ＫＡｃ、ｐＨ８．０；氷上に保持）。
－氷上で１０分間保持する。
－４℃、１２，５００ｒｐｍで、１５分間遠心分離する。
－上清を保持する。
－０．７容量のイソプロパノール（約６３０μＬ）を添加し、チューブを数回静かに裏返す。
－４℃、１２，５００ｒｐｍで、１５分間遠心分離する。
－上清を除去する。
－３００μＬエタノール７０％（－２０℃）を添加する。
－４℃、１２，５００ｒｐｍで、１５分間遠心分離する。
－上清を穏やかに除去する。
－乾燥させる。
－水を再懸濁させる（約２０μＬ）。
－培養液１ｍｌを遠心分離する。
－溶解に進む。
－Ｐ１の１５０μＬを添加する（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、８０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／Ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ、ｐＨ８．０；氷上に保持）；
－Ｐ２の１５０μＬを添加する（１００ｍＭ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）；
－チューブを数回反転させて、混合させる。
－室温で５分間インキュベートする。
－Ｐ３の３００μＬを添加する（３Ｍ ＫＡｃ、ｐＨ８．０；氷上に保持）。
－氷上で１０分間保持する。
－４℃、１２，５００ｒｐｍで、１５分間遠心分離する。
－上清を保持する。
－０．７容量のイソプロパノール（約６３０μＬ）を添加し、チューブを数回静かに裏返す。
－４℃、１２，５００ｒｐｍで、１５分間遠心分離する。
－上清を除去する。
－３００μＬエタノール７０％（－２０℃）を添加する。
－４℃、１２，５００ｒｐｍで、１５分間遠心分離する。
－上清を穏やかに除去する。
－乾燥させる。
－水を再懸濁させる（約２０μＬ）。
【0328】
中規模調製では、Ｑｉａｇｅｎ ｍａｘｉ ｐｒｅｐ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を使用して、製造業者の指示に従って、または各緩衝液の容量を４で割ることにより、同数の細胞を含む１００ｍＬの各培養物からプラスミドＤＮＡを調製した。
【0329】
いずれの場合も、ＤＮＡ調製物は、５００μＬの水に再懸濁させた。
【0330】
回収した核酸の分析は、電気泳動によって行った。
【0331】
２－結果
浸透圧ショックに対する耐性の低下が、標準的な抽出プロトコルを使用して回収した抽出染色体ＤＮＡの量と相関するかを判断するために、ＭＧ１６５５大腸菌野生型株または変異ｌｐｐΔＫ５８ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの組み合わせを保持する株における小規模調製物中のプラスミドＤＮＡの回収率をアッセイした。
浸透圧ショックに対する耐性の低下が、標準的な抽出プロトコルを使用して回収した抽出染色体ＤＮＡの量と相関するかを判断するために、ＭＧ１６５５大腸菌野生型株または変異ｌｐｐΔＫ５８ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの組み合わせを保持する株における小規模調製物中のプラスミドＤＮＡの回収率をアッセイした。
【0332】
最初に使用したプロトコルでは、非商用条件（上記参照）を使用しており、対照大腸菌株からプラスミドＤＮＡを回収することはできなかった。
【0333】
対照的に、変異ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅを有する大腸菌を使用した場合、プラスミドＤＮＡが電気泳動によって検出された（図８）。
【0334】
大腸菌ＭＧ１６５５株および大腸菌株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅのプラスミド ＤＮＡの中規模調製では、次に、Ｐ１、Ｐ２、およびＮ３バッファの推奨容量を使用するか、この容量を４で割って試験を行い、少量の溶解バッファを使用して、プラスミドＤＮＡを回収できるかを判断する。
【0335】
調製物を定量化し、それらの内容物を電気泳動によって分析した（図９）。Ｐ１、Ｐ２、およびＮ３バッファの推奨容量を使用した条件では、大腸菌株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅを使用した場合に回収されたプラスミドＤＮＡの量（１０５ｎｇ／μＬ）は、対照株から回収された量（７０ｎｇ／μＬ）よりも多かった。同様に、Ｐ１、Ｐ２、およびＮ３バッファの１／４量を使用した条件では、大腸菌株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅを使用した場合に回収されたプラスミドＤＮＡの量（１１０ｎｇ／μＬ）は、同数の対照細胞から回収された量（３０ｎｇ／μＬ）よりも多かった。推奨容量のバッファを使用した場合、大腸菌株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅで回収されたプラスミドＤＮＡ量の増加は、対照ＭＧ１６５５大腸菌株と比較して１．５倍であった。Ｐ１、Ｐ２、およびＮ３バッファの推奨量の１／４を使用した場合、大腸菌株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅで回収されたプラスミドＤＮＡ量の増加は、対照大腸菌株ＭＧ１６５５と比較して、３．６６倍であった。
【0336】
注目すべきは、大腸菌株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅからプラスミドを調製する際の溶解物は、より透明で粘性が低く、これは、溶解時に細菌細胞が放出するゲノムＤＮＡの量が少ないことを示唆している。
【0337】
３－結論
大腸菌ＭＧ１６５５株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅを使用することにより、対照の野生型ＭＧ１６５５大腸菌株と比較して、小規模調製および中規模調製の両方で回収されるプラスミドＤＮＡの量を増加させることができる。この増加は、より少量の溶解バッファを使用した場合に、高くなった。後者の観察では、遺伝子型ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの大腸菌株が、必要な溶解緩衝液の量を減少させることができるので、より大規模な染色体外ＤＮＡ調製において特に有利であることが示されている。
大腸菌ＭＧ１６５５株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅを使用することにより、対照の野生型ＭＧ１６５５大腸菌株と比較して、小規模調製および中規模調製の両方で回収されるプラスミドＤＮＡの量を増加させることができる。この増加は、より少量の溶解バッファを使用した場合に、高くなった。後者の観察では、遺伝子型ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの大腸菌株が、必要な溶解緩衝液の量を減少させることができるので、より大規模な染色体外ＤＮＡ調製において特に有利であることが示されている。
【0338】
実施例４：大腸菌株ＤＨ１０Ｂおよび遺伝子型ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６ＥのＤＨ５αを使用することにより、ゲノム外ＤＮＡの回収が増加する。
１－材料及び方法
１．１－細菌培養およびコンピテント細菌の調製
ＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）で成長させた指数期培養を３７℃で撹拌しながら、ソルビトールを添加した冷水で数回洗浄し、エレクトロポレーション前に氷上に置いた。必要に応じて、抗生物質を２５μｇ／ｍＬ（カナマイシン；Ｋａｎ）、１５μｇ／ｍＬ（クロラムフェニコール；Ｃｍ）、または１００μｇ／ｍＬ（アンピシリン；Ａｍｐ）で使用した。
１－材料及び方法
１．１－細菌培養およびコンピテント細菌の調製
ＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）で成長させた指数期培養を３７℃で撹拌しながら、ソルビトールを添加した冷水で数回洗浄し、エレクトロポレーション前に氷上に置いた。必要に応じて、抗生物質を２５μｇ／ｍＬ（カナマイシン；Ｋａｎ）、１５μｇ／ｍＬ（クロラムフェニコール；Ｃｍ）、または１００μｇ／ｍＬ（アンピシリン；Ａｍｐ）で使用した。
【0339】
１．２－大規模調製におけるプラスミドＤＮＡの回収
プラスミドｐＧＷＩＺｇＷｉｚ（商標）ベクターを、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＸｔｒａＭｉｄｉに記載されている方法を使用して、ＤＨ１０Ｂ株またはＤＨ５α株の遺伝子型ｌｐｐΔＫ５８ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの対照の大腸菌のいずれかに形質転換した。
プラスミドｐＧＷＩＺｇＷｉｚ（商標）ベクターを、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＸｔｒａＭｉｄｉに記載されている方法を使用して、ＤＨ１０Ｂ株またはＤＨ５α株の遺伝子型ｌｐｐΔＫ５８ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの対照の大腸菌のいずれかに形質転換した。
【0340】
２－結果
大腸菌ＭＧ１６５５株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅからの調製物から回収されたゲノム外ＤＮＡの量の増加が、大腸菌株ＤＨ１０ＢおよびＤＨ５αでも観察されるかを判断した。対照大腸菌ＤＨ１０ＢおよびＤＨ５α株ならびに変異ｌｐｐΔＫ５８およびｏｍｐＡＲ２５６Ｅを保有する大腸菌ＤＨ１０ＢおよびＤＨ５α株からのプラスミドＤＮＡの調製物を、溶解バッファの推奨容量を８で割って測定した。
大腸菌ＭＧ１６５５株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅからの調製物から回収されたゲノム外ＤＮＡの量の増加が、大腸菌株ＤＨ１０ＢおよびＤＨ５αでも観察されるかを判断した。対照大腸菌ＤＨ１０ＢおよびＤＨ５α株ならびに変異ｌｐｐΔＫ５８およびｏｍｐＡＲ２５６Ｅを保有する大腸菌ＤＨ１０ＢおよびＤＨ５α株からのプラスミドＤＮＡの調製物を、溶解バッファの推奨容量を８で割って測定した。
【0341】
調製物を電気泳動によって分析し、さらに定量化した（図１０）。回収されたプラスミドＤＮＡの量は、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ（５２１ｎｇ／μＬ）を使用した場合に、対照株から回収された量（２２５ｎｇ／μＬ）よりも多かった。同様に、回収されたプラスミドＤＮＡの量は、大腸菌ＤＨα株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ（６４３ｎｇ／μＬ）を使用した場合に、対照株から回収された量（１９１ｎｇ／μＬ）よりも多かった。大腸菌株ＤＨ１０Ｂ ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅで回収されたプラスミドＤＮＡの量の増加は、対照の大腸菌ＤＨ１０Ｂ株と比較して２．３倍であった。大腸菌株ＤＨ５α ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅで回収されたプラスミドＤＮＡの量の増加は、対照の大腸菌ＤＨ５α株と比較して３．３６倍であった。
【0342】
３－結論
ＤＨ１０ＢまたはＤＨ５α大腸菌株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの使用により、溶解バッファの推奨量を８で割ったときに、対照の大腸菌ＤＨ１０ＢおよびＤＨ５α株と比較して、回収されたプラスミドＤＮＡの量が増加する。さらに、変異ＤＨ５α大腸菌株から回収されたプラスミドＤＮＡの量は、同様の条件で、変異ＤＨ１０Ｂ大腸菌から回収された量よりも多かった。
ＤＨ１０ＢまたはＤＨ５α大腸菌株ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡＲ２５６Ｅの使用により、溶解バッファの推奨量を８で割ったときに、対照の大腸菌ＤＨ１０ＢおよびＤＨ５α株と比較して、回収されたプラスミドＤＮＡの量が増加する。さらに、変異ＤＨ５α大腸菌株から回収されたプラスミドＤＮＡの量は、同様の条件で、変異ＤＨ１０Ｂ大腸菌から回収された量よりも多かった。
【0343】
実施例５：浸透圧ショック後のタンパク質放出に対する細菌細胞壁に影響を与える変異の効果
１－材料及び方法
１．１－細菌培養
大腸菌株をＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）中３７℃で撹拌しながら成長させた。
１－材料及び方法
１．１－細菌培養
大腸菌株をＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）中３７℃で撹拌しながら成長させた。
【0344】
１．２－浸透圧ショック後の培養培地中のタンパク質放出の定量化
指数培養期または定常培養期の大腸菌株をペレット化し、純水で最初の体積の２倍に５分間再懸濁した。次に、再懸濁液１５μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。タンパク質は、クーマシーブルー染色によってさらに定量化した。
指数培養期または定常培養期の大腸菌株をペレット化し、純水で最初の体積の２倍に５分間再懸濁した。次に、再懸濁液１５μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。タンパク質は、クーマシーブルー染色によってさらに定量化した。
【0345】
２－結果
変異ΔｌｐｐまたはΔｏｍｐＡまたはΔｌｐｐ ｏｍｐＡΔｃを有する細菌細胞によって浸透圧ショック後に放出された全タンパク質の量は、対照大腸菌株ＭＧ１６５５の同数の細菌細胞によって放出された量より多かった。遺伝子型Δｌｐｐ ΔｏｍｐＡまたはΔｌｐｐ ｏｍｐＡΔｃを有する細菌細胞によって放出される細菌細胞の量もまた、遺伝子型Δｌｐｐの同数の細菌細胞によって放出される量よりも多かった。
変異ΔｌｐｐまたはΔｏｍｐＡまたはΔｌｐｐ ｏｍｐＡΔｃを有する細菌細胞によって浸透圧ショック後に放出された全タンパク質の量は、対照大腸菌株ＭＧ１６５５の同数の細菌細胞によって放出された量より多かった。遺伝子型Δｌｐｐ ΔｏｍｐＡまたはΔｌｐｐ ｏｍｐＡΔｃを有する細菌細胞によって放出される細菌細胞の量もまた、遺伝子型Δｌｐｐの同数の細菌細胞によって放出される量よりも多かった。
【0346】
３－結論
遺伝子型Δｌｐｐ ΔｏｍｐＡまたはΔｌｐｐ ｏｍｐＡΔｃの大腸菌ＭＧ１６５５株を使用することにより、対照の大腸菌ＭＧ１６５５株または遺伝子型Δｌｐｐの大腸菌ＭＧ１６５５株と比較した場合、浸透圧ショック後に細菌細胞によって放出されるタンパク質の量が増加する。
遺伝子型Δｌｐｐ ΔｏｍｐＡまたはΔｌｐｐ ｏｍｐＡΔｃの大腸菌ＭＧ１６５５株を使用することにより、対照の大腸菌ＭＧ１６５５株または遺伝子型Δｌｐｐの大腸菌ＭＧ１６５５株と比較した場合、浸透圧ショック後に細菌細胞によって放出されるタンパク質の量が増加する。
【0347】
実施例６遺伝子型ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ、遺伝子型ｌｐｐΔＫ５８、および遺伝子型ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ｌｐｐΔＫ５８の大腸菌株ＤＨ１０Ｂを使用することにより、すべてにおいて、ゲノム外ＤＮＡの回収が増加する。
【0348】
１－材料及び方法
細菌株およびＤＮＡの回収は、実施例３に記載のとおり実施した。
細菌株およびＤＮＡの回収は、実施例３に記載のとおり実施した。
【0349】
２－結果
表４に見られるように、二重変異体ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ｌｐｐΔＫ５８は、野生型参照株（ＤＨ１０Ｂ）と比較して、ＤＮＡ回収の有意な増加をもたらす。
表４に見られるように、二重変異体ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ ｌｐｐΔＫ５８は、野生型参照株（ＤＨ１０Ｂ）と比較して、ＤＮＡ回収の有意な増加をもたらす。
【0350】
驚くべきことに、単一の変異、ｏｍｐＡＲ２５６Ｅおよび単一変異ｌｐｐΔＫ５８はまた、野生型株と比較して、ＤＮＡ回収量が増加した（表４を参照）。
【表4】
【0351】
したがって、ｏｍｐＡＲ２５６Ｅ変異および／またはｌｐｐΔＫ５８変異を有する大腸菌株は、ゲノム外核酸の量の増加を得るのに有用であり得る。
【0352】
実施例７：遺伝子型ｌｐｐΔＫ５８ ｏｍｐＡΔＣｔの大腸菌株ＭＧ１６５５を使用することにより、ゲノム外ＤＮＡの回収が増加する。
１－材料及び方法
細菌株およびＤＮＡの回収は、実施例３に記載のとおり実施した。
１－材料及び方法
細菌株およびＤＮＡの回収は、実施例３に記載のとおり実施した。
【0353】
２－結果
以下の表５に見られるように、ｏｍｐＡΔＣｔ ｌｐｐΔＫ５８二重変異を有する大腸菌株は、野生型株と比較して、回収された核酸の量の有意な増加をもたらす。
以下の表５に見られるように、ｏｍｐＡΔＣｔ ｌｐｐΔＫ５８二重変異を有する大腸菌株は、野生型株と比較して、回収された核酸の量の有意な増加をもたらす。
【表5】
【0354】
したがって、ｏｍｐＡΔＣｔ ｌｐｐΔＫ５８二重変異を有する大腸菌株は、ゲノム外核酸の量の増加を得るのに有用であり得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【手続補正書】
【提出日】2022-10-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】