▶ ラモット・アット・テル・アビブ・ユニバーシテイ・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-17
(54)【発明の名称】抗ＩＤＥ抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230310BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230310BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20230310BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230310BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230310BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230310BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230310BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230310BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230310BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230310BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230310BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230310BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230310BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20230310BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20230310BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230310BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230310BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230310BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230310BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230310BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230310BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20230310BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20230310BHJP
A61P 29/02 20060101ALI20230310BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20230310BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230310BHJP
G01N 33/573 20060101ALI20230310BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C07K16/40
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P43/00 121
A61K45/00
A61P43/00 111
A61P37/06
A61P25/28
A61P3/10
A61P3/04
A61P3/00
A61P9/10
A61P13/12
A61P25/00
A61P9/00
A61P17/02
A61P25/16
A61P21/04
A61P25/04
A61P29/02
A61P31/22
A61K39/395 D
A61K39/395 P
G01N33/573 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022544308
(86)(22)【出願日】2020-12-10
(85)【翻訳文提出日】2022-09-20
(86)【国際出願番号】 IL2020051279
(87)【国際公開番号】W WO2021149040
(87)【国際公開日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】62/964,139
(32)【優先日】2020-01-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】501177609
【氏名又は名称】ラモット・アット・テル・アビブ・ユニバーシテイ・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＡＭＯＴ ＡＴ ＴＥＬ ＡＶＩＶ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ベンハー イタイ
(72)【発明者】
【氏名】ナハリー リモール
(72)【発明者】
【氏名】フレンケル ダン
(72)【発明者】
【氏名】フルシュト オフィル
(72)【発明者】
【氏名】ナッシュ ユヴァル
(72)【発明者】
【氏名】リラン ミリット
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA26X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZA011
4C084ZA021
4C084ZA151
4C084ZA161
4C084ZA361
4C084ZA701
4C084ZA811
4C084ZA941
4C084ZB081
4C084ZB331
4C084ZC201
4C084ZC211
4C084ZC351
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB22
4C085CC03
4C085CC07
4C085CC31
4C085DD62
4C085DD88
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C085GG08
4C085GG10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
単離された抗ＩＤＥ抗体を提供する。各抗体は、ＣＤＲアミノ酸配列を含む抗原認識ドメインを含む。それを製造する方法、それを使用する方法、それを含む医薬組成物および製品も提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＤＥを特異的に結合する抗原認識領域を含む単離された抗体であって、前記抗原認識ドメインが以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む、抗体。（ｉ）前記抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）および配列番号８（ＣＤＲ３）、ならびに前記抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号１２（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）、
（ｉｉ）前記抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２４（ＣＤＲ３）、ならびに前記抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＣＤＲ２）および、配列番号３２（ＣＤＲ３）、あるいは
（ｉｉｉ） 前記抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号３６（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号４０（ＣＤＲ３）、ならびに前記抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４６（ＣＤＲ２）および配列番号４８（ＣＤＲ３）。
【請求項2】
請求項１に記載の抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を活性成分として含み、薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物。
【請求項3】
治療を必要とする対象におけるＩＤＥ活性関連疾患を治療するための方法であって、対象に治療有効量の、請求項１に記載の抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）あるいは請求項２に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記投与によってＩＤＥ活性に関連した疾患を予防または治療する、方法。
【請求項4】
治療を必要とする対象におけるＩＤＥ活性関連疾患の治療に使用する、請求項１に記載の抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）。
【請求項5】
前記疾患の治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記疾患の治療薬をさらに含む、請求項４に記載の使用のための抗体。
【請求項7】
前記対象の生物学的サンプルが、対照生物学的サンプルと比べて、予め定めておいた閾値を超えるＩＤＥレベルを示す、請求項３または５に記載の方法、あるいは請求項４または６に記載の使用のための抗体。
【請求項8】
前記対象の前記生物学的サンプルにおけるＩＤＥの前記レベルを、前記投与の前に請求項１に記載の抗体を用いて決定することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
請求項１に記載の抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）と、前記疾患を治療するための治療薬とを含む、ＩＤＥ活性関連疾患の治療用と定められた製品。
【請求項10】
前記抗体と前記治療薬とが個別の容器に含まれる、請求項９に記載の製品。
【請求項11】
前記抗体と前記治療薬とが共処方に含まれる、請求項９に記載の製品。
【請求項12】
対象のＩＤＥ活性関連疾患を診断する方法であって、請求項１の抗体を用いて前記対象の生物学的サンプルのＩＤＥレベルを決定することを含み、対照生物学的サンプルと比べて、前記ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えることをもって、前記対象を前記疾患と診断する、方法。
【請求項13】
ＩＤＥ活性関連疾患と診断された対象における前記疾患に対する療法の有効性をモニタリングするための方法であって、請求項１の抗体を用いて、治療中または治療後の前記対象の生物学的サンプルのＩＤＥレベルを決定することを含み、治療中または治療後の前記ＩＤＥレベルが予め定めた閾値より低下したことをもって、前記療法を有効とする、方法。
【請求項14】
ＩＤＥ活性関連疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、（ａ）請求項１２に記載の方法によって前記対象を診断し、前記ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えたとき、
（ｂ）前記対象を前記疾患用の療法で治療する
ことを含む、前記対象の前記疾患を治療する方法。
【請求項15】
前記療法が、前記抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
ＩＤＥ活性関連疾患と診断された対象の生物学的サンプルと、請求項１に記載の抗体とを含む、組成物。
【請求項17】
前記ＩＤＥ活性関連疾患が、中枢神経系の自己免疫疾患、神経変性疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、高血糖症、網膜損傷、腎不全、神経損傷、微小血管損傷、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）感染症および創傷からなる群より選ばれる、請求項３または５に記載の方法、請求項４または６に記載の使用のための抗体、あるいは請求項９～１１のいずれか一項に記載の製品。
【請求項18】
前記ＩＤＥ活性関連疾患が、メタボリックシンドローム、糖尿病、および肥満からなる群より選ばれる、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法、あるいは請求項１６に記載の組成物。
【請求項19】
前記疾患が糖尿病である、請求項１７または１８に記載の方法、使用のための抗体、製品あるいは組成物。
【請求項20】
前記糖尿病が１型糖尿病である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法、使用のための抗体、製品あるいは組成物。
【請求項21】
前記糖尿病が２型糖尿病である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法、使用のための抗体、製品あるいは組成物。
【請求項22】
前記疾患がメタボリックシンドロームである、請求項１７または１８に記載の方法、使用のための抗体、製品あるいは組成物。
【請求項23】
前記神経変性疾患がパーキンソン氏病である、請求項１７に記載の方法、使用のための抗体、あるいは製品。
【請求項24】
前記神経変性疾患がアルツハイマー氏病である、請求項１７に記載の方法、使用のための抗体、あるいは製品。
【請求項25】
前記中枢神経系の自己免疫疾患が、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群、重症筋無力症、横断性脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、慢性頭痛および脳性麻痺からなる群より選ばれる、請求項１７に記載の方法、使用のための抗体、あるいは製品。
【請求項26】
前記中枢神経系の自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１７に記載の方法、使用のための抗体、あるいは製品。
【請求項27】
前記創傷が、慢性創傷、急性創傷、糖尿病性創傷、虚血性創傷、潰瘍、火傷および手術創からなる群より選ばれる、請求項１７に記載の方法、使用のための抗体、あるいは製品。
【請求項28】
請求項１の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項29】
前記ＣＤＲアミノ酸配列をコードする核酸配列が、（ｉ）配列番号３、５、７、１１、１３および１５、
（ｉｉ）配列番号１９、２１、２３、２７、２９および３１、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３５、３７、３９、４３、４５および４７
に示されている、請求項２８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項30】
請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドの発現を調節するシスエレメントとを含む、核酸構築物。
【請求項31】
請求項１の抗体、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチド、あるいは請求項３０の核酸構築物を発現する宿主細胞。
【請求項32】
抗ＩＤＥ抗体の製造方法であって、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチドあるいは請求項３０の核酸構築物を宿主細胞内で発現させることを含む、方法。
【請求項33】
前記抗体の単離を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
抗ＩＤＥ抗体の製造方法であって、（ａ）複数の抗体を提供することと、
（ｂ）野性型ＩＤＥとは結合するが、前記野性型ＩＤＥと比べて触媒活性の低下した変異ＩＤＥとは結合しない抗体を選択するための、前記抗体のスクリーニングを実施することと
を含む、方法。
【請求項35】
前記野性型ＩＤＥの配列が配列番号５０の配列である、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記変異ＩＤＥが、配列番号５０に対応するＥ１１１Ｑの変換を含む、請求項３４～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記ＩＤＥのインスリン分解活性を阻害する抗体を選択するための、前記抗体のスクリーニングをさらに含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０２０年１月２２日出願の米国特許出願第６２／９６４，１３９号の優先権を主張するものであり、この特許出願の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
本願は、２０２０年１月２２日出願の米国特許出願第６２／９６４，１３９号の優先権を主張するものであり、この特許出願の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【0002】
配列表に関する陳述
本願の出願と同時に提出された、２０２０年１２月１０日作成の４５，０５６バイトのＡＳＣＩＩファイル「８５６３６」を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
本願の出願と同時に提出された、２０２０年１２月１０日作成の４５，０５６バイトのＡＳＣＩＩファイル「８５６３６」を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【0003】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、抗ＩＤＥ抗体およびその使用に関する。
【背景技術】
【0004】
インスリン分解酵素（ＩＤＥ、インスリン）は、サイトゾル、ペルオキシゾーム、エンドソーム内および細胞表面に位置づけられる、大きな亜鉛結合プロテアーゼ（約１１０ｋＤａのトール亜鉛メタロエンドペプチダーゼ）である。この酵素は、アミロイドβ－タンパク質（Ａβ）、インスリン、グルカゴン、アミリン、心房性ナトリウム利尿因子およびカルシトニンを含む、β－プリーツシートに富んだアミロイドフィブリルを形成するという性質が共通する、多様な配列の小タンパク質を開裂させる。よってＩＤＥは、多数の短いポリペプチドを開裂することが知られ、インスリンおよびＩＧＦ－１といった免疫応答活性の調節が報告されている種々のタンパク質の分解において重要な役割を担う。
【0005】
発見されて以来、ＩＤＥ阻害剤について、例えば、糖尿病、肥満、中枢神経系の自己免疫疾患、神経変性疾患および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）感染を含むいくつかの疾患に対する用途が示唆されている（例：Maianti et al. (2014) Nature511, 94-98、Tang, W.-J. (2016) Trends Endocrinol. etab.27, 24-34、並びに国際公開公報第２０１２／０１７４３９号および第２０１０／０８６８６７号）。例えば、同じ出願人による国際公開公報第２０１０／０８６８６７は、長さ２５アミノ酸以下のアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列が少なくとも１つのアスパラギン酸またはそのホモログを含む、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）阻害活性を有する単離されたペプチドの、糖尿病、肥満、高血糖症、網膜損傷、腎不全、神経損傷、微小血管損傷および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）感染からなる群より選ばれる疾患の治療のために特定された医薬の製造における使用を開示する。同じ出願人による国際公開公報第２０１２／０１７４３９号は、中枢神経系の自己免疫疾患および神経変性疾患からなる群より選ばれる疾患の治療に使用するためのインスリン分解酵素（ＩＤＥ）阻害剤（例：抗体）を提供する。
【0006】
いくつかのＩＤＥモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が、ウエスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫細胞化学、免疫組織化学、および定量的サンドウィッチＥＬＩＳＡを含む種々の用途における、齧歯動物および／またはヒトＩＤＥのｉｎ ｖｉｔｒｏの検出用として記載されている［例えば、Delledonne A. et al. Mol Neurodegener. (2009) 4:39を参照］。
【発明の概要】
【0007】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、ＩＤＥを特異的に結合する抗原認識領域を含む単離された抗体であって、抗原認識ドメインが以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む抗体が提供される。
（ｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）および配列番号８（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号１２（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）、
（ｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２４（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＣＤＲ２）および、配列番号３２（ＣＤＲ３）、あるいは
（ｉｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号３６（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号４０（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４６（ＣＤＲ２）および配列番号４８（ＣＤＲ３）。
（ｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）および配列番号８（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号１２（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）、
（ｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２４（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＣＤＲ２）および、配列番号３２（ＣＤＲ３）、あるいは
（ｉｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号３６（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号４０（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４６（ＣＤＲ２）および配列番号４８（ＣＤＲ３）。
【0008】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を活性成分として含み、薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物が提供される。
【0009】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、治療を必要とする対象におけるＩＤＥ活性関連疾患を治療するための方法であって、対象に治療有効量の、抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）あるいは医薬組成物を投与することを含み、当該投与によってＩＤＥ活性に関連した疾患を予防または治療する方法が提供される。
【0010】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、治療を必要とする対象におけるＩＤＥ活性関連疾患の治療に使用する、抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）が提供される。
【0011】
本発明のいくつかの実施形態によると、方法は、疾患の治療薬を対象に投与することをさらに含む。
【0012】
本発明のいくつかの実施形態によると、使用のための抗体は、疾患の治療薬をさらに含む。
【0013】
本発明のいくつかの実施形態によると、対象の生物学的サンプルは、対照生物学的サンプルと比べて、予め定めておいた閾値を超えるＩＤＥレベルを示す。
【0014】
本発明のいくつかの実施形態によると、方法は、対象の生物学的サンプルにおけるＩＤＥレベルを、投与の前に抗体を用いて決定することを含む。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）と、疾患を治療するための治療薬とを含む、ＩＤＥ活性関連疾患の治療用と定められた製品が提供される。
【0016】
本発明のいくつかの実施形態によると、抗体と治療薬は個別の容器に含まれる。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態によると、抗体と治療薬は共処方に含まれる。
【0018】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、対象のＩＤＥ活性関連疾患を診断する方法であって、抗体を用いて対象の生物学的サンプルのＩＤＥレベルを決定することを含み、対照生物学的サンプルと比べて、ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えることをもって、対象を疾患と診断する方法が提供される。
【0019】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、ＩＤＥ活性関連疾患と診断された対象における疾患に対する療法の有効性をモニタリングするための方法であって、抗体を用いて、治療中または治療後の対象の生物学的サンプルのＩＤＥレベルを決定することを含み、治療後のＩＤＥレベルが予め定めた閾値より低下したことをもって、療法を有効とする方法が提供される。
【0020】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、ＩＤＥ活性関連疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）方法によって対象を診断し、ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えたとき、
（ｂ）対象を疾患用の療法で治療する
ことを含む、対象の疾患を治療する方法が提供される。
（ａ）方法によって対象を診断し、ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えたとき、
（ｂ）対象を疾患用の療法で治療する
ことを含む、対象の疾患を治療する方法が提供される。
【0021】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、ＩＤＥ活性関連疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）方法によって対象を診断し、ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えたとき、
（ｂ）ＩＤＥレベルに基づき療法を選択する、
ことを含む、対象の疾患を治療する方法が提供される。
（ａ）方法によって対象を診断し、ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えたとき、
（ｂ）ＩＤＥレベルに基づき療法を選択する、
ことを含む、対象の疾患を治療する方法が提供される。
【0022】
本発明のいくつかの実施形態によると、療法は抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を含む。
【0023】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、ＩＤＥ活性関連疾患と診断された対象の生物学的サンプルと、抗体とを含む、組成物が提供される。
【0024】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＩＤＥ活性関連疾患は、中枢神経系の自己免疫疾患、神経変性疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、高血糖症、網膜損傷、腎不全、神経損傷、微小血管損傷、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）感染症および創傷からなる群より選ばれる。
【0025】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＩＤＥ活性関連疾患は、中枢神経系の自己免疫疾患、神経変性疾患、糖尿病、肥満、高血糖症、網膜損傷、腎不全、神経損傷、微小血管損傷、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）感染症および創傷からなる群より選ばれる。
【0026】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＩＤＥ活性関連疾患は、メタボリックシンドローム、糖尿病、および肥満からなる群より選ばれる。
【0027】
本発明のいくつかの実施形態によると、疾患は糖尿病である。
【0028】
本発明のいくつかの実施形態によると、糖尿病は１型糖尿病である。
【0029】
本発明のいくつかの実施形態によると、糖尿病は２型糖尿病である。
【0030】
本発明のいくつかの実施形態によると、疾患はメタボリックシンドロームである。
【0031】
本発明のいくつかの実施形態によると、神経変性疾患はパーキンソン氏病である。
【0032】
本発明のいくつかの実施形態によると、神経変性疾患はアルツハイマー氏病である。
【0033】
本発明のいくつかの実施形態によると、中枢神経系の自己免疫疾患は、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群、重症筋無力症、横断性脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、慢性頭痛および脳性麻痺からなる群より選ばれる。
【0034】
本発明のいくつかの実施形態によると、中枢神経系の自己免疫疾患は、多発性硬化症である。
【0035】
本発明のいくつかの実施形態によると、創傷は、慢性創傷、急性創傷、糖尿病性創傷、虚血性創傷、潰瘍、火傷および手術創からなる群より選ばれる。
【0036】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【0037】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＣＤＲアミノ酸配列をコードする核酸配列は、
（ｉ）配列番号３、５、７、１１、１３および１５、
（ｉｉ）配列番号１９、２１、２３、２７、２９および３１、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３５、３７、３９、４３、４５および４７
に示されている。
（ｉ）配列番号３、５、７、１１、１３および１５、
（ｉｉ）配列番号１９、２１、２３、２７、２９および３１、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３５、３７、３９、４３、４５および４７
に示されている。
【0038】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、ポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドの発現を調節するシスエレメントとを含む、核酸構築物が提供される。
【0039】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、抗体、ポリヌクレオチド、あるいは核酸構築物を発現する宿主細胞が提供される。
【0040】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、抗ＩＤＥ抗体の製造方法であって、ポリヌクレオチドあるいは核酸構築物を宿主細胞内で発現させることを含む方法が提供される。
【0041】
本発明のいくつかの実施形態によると、方法は、抗体の単離を含む。
【0042】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、抗ＩＤＥ抗体の製造方法であって、
（ａ）複数の抗体を提供することと、
（ｂ）野性型ＩＤＥとは結合するが、野性型ＩＤＥと比べて触媒活性の低下した変異ＩＤＥとは結合しない抗体を選択するための、抗体のスクリーニングを実施すること
とを含む、方法が提供される。
（ａ）複数の抗体を提供することと、
（ｂ）野性型ＩＤＥとは結合するが、野性型ＩＤＥと比べて触媒活性の低下した変異ＩＤＥとは結合しない抗体を選択するための、抗体のスクリーニングを実施すること
とを含む、方法が提供される。
【0043】
本発明のいくつかの実施形態によると、野性型ＩＤＥの配列が配列番号５０の配列である。
【0044】
本発明のいくつかの実施形態によると、変異ＩＤＥは、配列番号５０に対応するＥ１１１Ｑの変換を含む。
【0045】
本発明のいくつかの実施形態によると方法は、ＩＤＥのインスリン分解活性を阻害する抗体を選択するための、抗体のスクリーニングをさらに含む。
【0046】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料を、本発明の実施形態の実践または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。
【0047】
本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本明細書に記載する。以下、特に図面を詳細に参照して示す細部は、例示を目的とし、また本発明の実施形態の詳細な説明を目的とすることを強調する。同様に、図面と共に説明を見ることで、本発明の実施形態をどのように実践し得るかが当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1-1】図１の（Ａ）～（Ｇ）は、抗ＩＤＥ抗体の作製を示す。図１の（Ａ）～（Ｄ）は、組換えヒト野性型（ＷＴ）ＩＤＥおよび不活性ＩＤＥ変異体（Ｅ１１１Ｑ）の発現および精製を示す。図１の（Ａ）は、組換えＩＤＥを含むｐＥＴ２８ａ＋プラスミドを図形化した地図である。組換え構築物は、Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｃｏｍｐａｎｙに発注し、ベクターのＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩの間に挿入したものである。Ｈｉｓタグと、触媒的に不活性のＩＤＥ（Ｅ１１１Ｑ）の単一ヌクレオチド変異部位にも印を付けた。図１の（Ｂ）は、ｐＥＴ２８ａ－ＩＤＥベクターを保有するＲｏｓｅｔｔａ ＢＬ２１ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞の０．５ｍＭのＩＰＴＧによる誘導前および誘導後の総細胞抽出物（１５μｇ）（それぞれ“ｕｎｉｎｄ”および“ＩＰＴＧ”と表した）、ＧＥ ＨｉｓＴｒａｐカラムからイミダゾールを用いて溶出させた精製タンパク質（３μｇ）（“ｐｕｒｅ”と表した）、ＧＥ ＨｉｓＴｒａｐカラムから洗い流したタンパク質（１５μｇ）（“ＦＴ”と表した）のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図１の（Ｃ）は、ｐＥＴ２８ａ－ＩＤＥベクターを保有するＲｏｓｅｔｔａ ＢＬ２１ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞の総細胞抽出物（１５μｇ）のウエスタンブロット解析を示し、ベクターは、空のベクター（“ｍｏｃｋ”と表した）、誘導前および誘導後のｒｈＩＤＥ野性型（ＷＴ）を有するベクター（それぞれ“ｕｎｉｎｄ”および“ＩＰＴＧ”と示した）である。ＩＤＥは抗ＩＤＥポリクローナル抗体と、続く（ＩＲ）－染料二次抗体で検出した。蛍光シグナルはＯｄｄｉｓｅｙスキャナー（Ｌｉｃｏｒ社、ピクセルサイズ２１μｍ、０．５ｍｍオフセット、強度－６、平均品質）でメンブランをスキャンすることで検出した。図１の（Ｄ）は、１．５μｇ／ＬのヒトインスリンをＰＢＳ中、１２μｇ／ｍｌのｒｈＩＤＥ ＷＴまたはＥ１１１Ｑと３７℃で２時間インキュベートしたＩＤＥ活性アッセイを示す棒グラフである。残存インスリンは後からＭｅｒｃｏｄｉａ超感受性（ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）マウスインスリンＥＬＩＳＡを用いて解析した。検出は４５０ｎｍのＥＬＩＳＡプレートリーダーで実施した。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）で提示した。＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正有の一元ＡＮＯＶＡ。
【図1-2】図１の（Ｅ）は、抗ＩＤＥ ＭＢＰ－ｓｃＦｖの発現と精製を示す。Ａ９ ＭＢＰ－ｓｃＦｖの代表的なＦＰＬＣ評価を左の画像に示した。溶菌液の可溶性画分をＧＥ ＨｉｓＴｒａｐカラムにアプライした。溶出は、流速２ｍｌ／分（ピーク）の０．５Ｍのイミダゾールで行った。ＭＢＰ－ｓｃＦｖの３種の選択したクローン（Ａ９、Ｂ１およびＨ３）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を右の画像に示した。レーン１と２：それぞれ０．５ｍＭのＩＰＴＧによる誘導前および誘導後の、ＭＡＬｃ－ＮＨＮＮ－ｓｃＦｖベクターを保有するＲｏｓｅｔｔａ ＢＬ２１ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞の１５μｇの総細胞抽出物、レーン４：ＧＥ ＨｉｓＴｒａｐカラムからイミダゾールを用いて溶出した３μｇの精製タンパク質、レーン３：ＧＥ ＨｉｓＴｒａｐカラムから洗い流した１５μｇのタンパク質。
【図1-3】図１の（Ｆ）は、抗ＩＤＥインクローナル（Ｉｎｃｌｏｎａｌ）ＩｇＧの発現と精製を示す。ｐＨＡＫベクター内に抗ＩＤＥ抗体鎖を保有するＲｏｓｅｔｔａ ｐＵＢＳ５００ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞の細胞融解物の不溶性画分の軽鎖および重鎖のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を上の画像に示す。各レーンに、ＩＰＴＧによる誘導前および誘導後の１０μｇの細胞融解物（それぞれ奇数と偶数のレーン）をロードした。レーン１～２：Ａ９ ＶＨ、レーン３～４：Ｂ１ ＶＨ、レーン５～６：Ｈ３ ＶＨ、レーン７～８：Ａ９ ＶＬ、レーン９～１０：Ｂ１ ＶＬ、レーン１１～１２：Ｈ３ ＶＬ。Ｂ１インクローナルＩｇＧの代表的ＦＰＬＣ評価を中央の画像に示した。Ｂ１軽鎖および重鎖の再フォールディング溶液をＧＥ ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムにアプライした。溶出は、流速２ｍｌ／分（ピーク）のクエン酸バッファー、ｐＨ＝３．０、で実施した。下の画像は、ＩＰＴＧによる誘導後の、ｐＨＡＫベクター内に抗ＩＤＥ軽鎖および重鎖を保有するＲｏｓｅｔｔａ ｐＵＢＳ５００ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞から精製した軽鎖および重鎖の封入体（それぞれ“ＶＬ”および“ＶＨ”と示した）、再フォールディング溶液内のインキュベーション後のＶＬおよびＶＨ（“再フォールド”と示した）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムを用いた精製後のインクローナルＩｇＧ（“ＩｇＧ”と示した）、陽性対照としての市販のＩｇＧ（ｅｒｂｉｔｕｘ）の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析であり、それぞれを還元状態および非還元状態で行った。
【図1-4】図１の（Ｇ）は、逆キメラＨ３抗体（ｒｃＨ３－ＩｇＧ）の精製を表す。ここに示すのは、マウスＩｇＧ１としてのｒｃＨ３－ＩｇＧの産生と精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％ゲル）解析である。レーン１：形質導入から７日後の条件培地（１０μｇをロード）、レーンＭ：分子量マーカー、レーン２：タンパク質－Ｇ精製ｒｃＨ３－ＩｇＧ（５μｇをロード）。
【図2】図２の（Ａ）～（Ｆ）は、抗ＩＤＥファージディスプレイ抗体の結合および対応する「インクローナル」ＩｇＧを示す。図２の（Ａ）～（Ｃ）は、ファージ－ＥＬＩＳＡによって決定した、ｓｃＦｖディスプレイファージであるクローンＡ９（図２の（Ａ））、Ｂ１（図２の（Ｂ））およびＨ３（図２の（Ｃ））によるＩＤＥ結合を示すグラフである。解析したｓｃＦｖディスプレイファージは段階希釈して、２．５μｇ／ｍｌのＷＴ ｒｈＩＤＥ ＩＤＥ（“ＩＤＥ”と表した）または無関係のタンパク質であるＢＳＡ、ＨｉｓＴｒａｐ精製組換えタンパク質（“Ｈｉｓ”と表した）とＭＢＰ－ＬａｃＺで被覆したＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。結合したファージは、マウス抗Ｍ１３抗体と続くＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体で検出した。結果は平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。図２の（Ｄ）～（Ｆ）は、ＥＬＩＳＡによって決定した、精製インクローナルＩｇＧであるクローンＡ９（図２の（Ｄ））、Ｂ１（図２の（Ｅ））およびＨ３（図２の（Ｆ））によるＩＤＥ結合を示すグラフである。解析した抗体は段階希釈して、２μｇ／ｍｌのＷＴ ｒｈＩＤＥ ＩＤＥ（“ＩＤＥ”と表した）またはＢＳＡで被覆したＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。結合した抗体は、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体で検出した。結果は平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝４）。
【図3-1】図３の（Ａ）～（Ｂ）は、抗ＩＤＥ ＭＢＰ－ｓｃＦｖまたはインクローナルＩｇＧを用いたＩＤＥ阻害アッセイを示す。図は、作製した抗体とのインキュベーション後の残存インスリンレベルで決定したＩＤＥ活性阻害を表す。１．５μｇ／ｍｌのＩＤＥを、以下のいずれか：示した濃度の抗ＩＤＥ ｓｃＦｖクローンＡ９、Ｂ１またはＨ３、または対照ｓｃＦｖ（図３の（Ａ））、あるいは抗ＩＤＥインクローナルＩｇＧクローンＡ９またはＨ３、または無関係のインクローナルＩｇＧ（“ＡＦ”と表した）（図３の（Ｂ））、あるいはＩＤＥ阻害剤ペプチドＡＤＴ２１と室温で１時間インキュベートし、続いて、２μｇ／Ｌのヒトインスリンと３７℃で２時間のインキュベーションを行った。残存インスリンを後にＭｅｒｃｏｄｉａ超感受性マウスインスリンＥＬＩＳＡで解析した。検出は４５０ｎｍのＥＬＩＳＡプレートリーダーで実施した。結果は平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊＊＊はＰ＜０．００１、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正有の一元ＡＮＯＶＡ。
【図3-2】同上
【図4】図４の（Ａ）～（Ｃ）は、作製した抗ＩＤＥ抗体の構造特異性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）の特徴付けを示す。図４の（Ａ）は、作製したＭＢＰ－ｓｃＦｖの本来のＩＤＥへの結合を示す代表的なドットブロット画像である。段階希釈（０．１－１μｇ）したＷＴ ｒｈＩＤＥおよび２０μｇのマウス脾細胞融解物を、本来のまたは変性条件で（９５℃で５分の煮沸後に）メンブランにスポットした。次に、抗ＩＤＥ ＭＢＰ－ｓｃＦｖ（クローンＡ９、Ｂ１またはＨ３）、続いてマウス抗ＭＢＰ抗体、および後にＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体を加えた。検出はＥＣＬ反応で実行した。図４の（Ｂ）は、ＥＬＩＳＡで決定した、逆キメラｒｃＨ３－ＩｇＧのＷＴまたは変異ｒｈＩＤＥへの結合を示すグラフを表す。５μｇ／ｍｌのＷＴ ｒｈＩＤＥ、不活性ＩＤＥ変異体（Ｅ１１１Ｑ、“変異体ＩＤＥ”と表した）またはＢＳＡを、段階希釈したｒｃＨ３－ＩｇＧまたは陰性対照である抗体ｒｃ２Ｅ１２－ＩｇＧ（１００ｎＭから開始）インキュベートした。抗体はＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体で検出した。結果は平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。図４の（Ｃ）は、ｒｃＨ３－ＩｇＧまたは陰性対照であるｒｃ２Ｅ１２－ＩｇＧとのインキュベーション後の残存インスリンレベルによって決定した、ＩＤＥ活性の阻害を示す棒グラフである。０．１μｇ／ｍｌのＩＤＥをｒｃＨ３－ＩｇＧまたはｒｃ２Ｅ１２－ＩｇＧと室温で１時間インキュベートし、続いて、１．５μｇ／Ｌのヒトインスリンと３７℃で１時間のインキュベーションを行った。残存インスリンを後にＭｅｒｃｏｄｉａ超感受性マウスインスリンＥＬＩＳＡで解析した。検出は４５０ｎｍのＥＬＩＳＡプレートリーダーで実施した。結果は平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。
【図5】図５の（Ａ）～（Ｃ）は、ＳＴＺ誘導糖尿病マウスモデルに対する逆キメラ抗ＩＤＥ Ｈ３抗体の治療効果を示す。図５の（Ａ）～（Ｂ）は、ｏＧＴＴアッセイ（各群にｎ＝５匹のマウス、＃は群内のｐ＜０．０１、図５の（Ａ））またはＩＴＴアッセイ（各群にｎ＝５匹のマウス、＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１、いずれも群内、図５の（Ｂ））で決定した、ＳＴＺ注射の２日後のｒｃＨ３－ＩｇＧまたは陰性対照であるｒｃ２Ｅ１２－ＩｇＧの腹腔内投与に続くインスリンレベルを示すグラフである。図５の（Ｃ）は、ＳＴＺ処理マウスへの腹腔内投与後の異なる日付のｒｃＨ３－ＩｇＧレベルを示すグラフである。（各群にｎ＝２～４匹のマウス）。結果は平均±ＳＥＭで表した。
【図6】図６の（Ａ）～（Ｂ）は、パーキンソン氏病におけるミクログリアの神経毒性表現型を表す、ＤＪ－１ノックダウン（ＫＤ）ミクログリアにおける活性酸素種（ＲＯＳ）の減少に対する逆キメラ抗ＩＤＥ Ｈ３抗体（本明細書では「Ｈ３ Ｆａｂ」と称する）のＦａｂ２セグメントｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を示す。加えて、ＲＯＳの産生を増やすために、表示した場合は細胞をロテノンで処理した（“Ｒｏｔ”と表した）。示したのはメチレンブルー（ＭＢ）当たりのＲＯＳレベル（図６の（Ａ））および培地対照と比較したＨ３ Ｆａｂ抗体とのインキュベーション後のＭＢ値である。ＤＪ－１－ＫＤミクログリアは対照ミクログリアと比べてより高いレベルのＲＯＳを示し、ロテノン誘導性増加は抗ＩＤＥ Ｈ３ Ｆａｂを用いて軽減することができた。さらに、ＭＢ試験を用いた結果は、インスリン処置またはＨ３ Ｆａｂ処置がロテノン負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後の細胞生存率に有意な影響を与えることがないことを示した。（Ｎ＝３、各実験当たり２～４の繰り返し、ｎの合計＝６～１２）。Ｒｏｔ＝ロテノン、ｉｎｓ＝インスリン。結果は平均±ＳＥＭで表した＊＊＊はｐ＜０．００１、Ｎ．Ｓ．は有意性なし。
【図7】図７の（Ａ）～（Ｃ）は、ヒト血清中のＩＤＥの検出のためのＥＬＩＳＡアッセイを示す。図７の（Ａ）は、ＥＬＩＳＡ手順の概略図である：（Ｉ）９６穴ＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体として機能する組換えＡ９ ＩｇＧで一晩被覆した、（ＩＩ）ウェルをＰＢＳで一回洗浄し、３％のスキムミルクでブロッキングし、（ＩＩＩ）血清をプレートに加え、濃度の分かっている組換えヒトＩＤＥを対照として使用し、（ＩＶ）検出抗体として機能するポリクローナルウサギ抗ＩＤＥ抗体とウェルをインキュベートし、（Ｖ）ウェルを洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体とインキュベートし、方法に記載したように現像した。図７の（Ｂ）は、ＥＬＩＳＡアッセイの感度曲線を示す。図７の（Ｃ）は、ＩｇＧ Ａ９がｒｈＩＤＥの構造エピトープを認識することを示す。５μｇ／ｍｌのｒｈＩＤＥのＰＢＳ溶液を調製し、ＥＬＩＳＡプレートの半分を被覆するために直接使用するか、またはＥＬＩＳＡプレートの残りの半分を被覆するために、使用前に８０℃で２０分間加熱し、次いで氷上で冷却して変性させた。被覆、ブロッキングおよび洗浄工程に続き、本来のまたは熱変性したｒｈＩＤＥで被覆したウェルに１００、３３．３、１１．１または３．７ｎＭの濃度のＩｇＧ Ａ９を３セットずつアプライした。結果は平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。
【図8】図８の（Ａ）～（Ｂ）は、ＩｇＧ Ａ９がｒｈＩＤＥ上の構造エピトープを認識することを示す。５μｇ／ｍｌのｒｈＩＤＥのＰＢＳ溶液を調製し、ＥＬＩＳＡプレートの半分を被覆するために直接使用するか、またはＥＬＩＳＡプレートの残りの半分を被覆するために、使用前に８０℃で２０分間加熱し、次いで氷上で冷却して変性させた。４℃で一晩、５０μｌ／ウェルでプレートを被覆した。翌日、プレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで１回洗浄し、３７℃で１時間、３００μｌ／ウェルの３％スキムミルクのＰＢＳ溶液でブロッキングした。次に、プレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、（図８の（Ａ））本来のまたは熱変性したｒｈＩＤＥで被覆した３列のウェル中の各ウェルに１００、３３．３、１１．１または３．７ｎＭの濃度のＩｇＧ Ａ９をアプライした。次に、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、５０μｌ／ウェルの×５０００にＰＢＳＴで希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを加えた。（図８の（Ｂ））ウェルに被覆された総ｒｈＩＤＥを定量化するために、プレートの残り半分を、ＰＢＳＴで×２０００、×４０００、×８０００、×１６０００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗Ｈｉｓタグ抗体とインキュベートした。プレートを室温で１時間静置し、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄した。最後に、５０μｌ／ウェルのＨＲＰ基質であるＴＭＢを比色するまで加えた。２分後に５０μｌ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることで反応を停止し、ＢｉｏＴｅｋＥｐｏｃｈマイクロプレートリーダーで解析した。光学密度を４５０および６２０なのメーターの波長で測定した。結果は平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【0049】
本発明は、その幾つかの実施形態において、抗ＩＤＥ抗体およびその使用に関する。
【0050】
本発明の原理および手順は、図面および以下の説明に参照することでよりよく理解されるであろう。
【0051】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、必ずしもその用途が、以下の記載に示すか、または実施例で例示する詳細に限定されるものではないことを理解するべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、また、さまざまな手段で実施または実行することが可能である。さらに、本明細書で使用する専門語および用語は説明のためのものであると理解するべきであり、限定と捉えるべきではない。
【0052】
インスリン分解酵素（ＩＤＥ）は、複数の小さなポリペプチドを切断し、インスリン分解において重要な役割を担うことが知られる、大きな亜鉛結合プロテアーゼである。いくつかのＩＤＥモノクローナルおよびポリクローナル抗体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏの用途［Delledonne A. et al. Mol Neurodegener. (2009) 4:39を参照］およびｉｎ ｖｉｖｏの用途（国際公開第２０１２／０１７４３９号参照）のために当業界では発表されている。さらに、ペプチド阻害剤を含むＩＤＥ阻害剤が種々の治療用途のために既に報告されている（国際公開第２０１０／０８６８６７号参照）。
【0053】
本発明の特定の実施形態を実践するに当たり、本発明者らは、ＩＤＥのインスリン分解活性を特異的にターゲティングし、阻害する新規なモノクローナル抗ＩＤＥ抗体を作製した。その結果、本発明の特定の実施形態は、ＩＤＥ関連の疾患および病状に対する診断および治療に抗ＩＤＥ抗体を使用することを示唆した。
【0054】
後述する実施例に示したように、本発明者らは、ヒトインスリン分解酵素（ＩＤＥ）および変異ＩＤＥ（Ｅ１１１Ｑ）をE. coliで発現させるためのプラスミドを作製した（実施例１、図１の（Ａ））。変異ＩＤＥ（Ｅ１１１Ｑ）は、基質に対する求核性の攻撃ができないことによって触媒活性を失う部位特異的変異を含む。よって、触媒活性を有するＩＤＥ（即ち、野性型ＩＤＥ）に高親和性で結合する特定の抗体クローンを単離するために、両方のペプチドを使用した。E. coliにＩＤＥタンパク質を発現させて精製し、タンパク質の精製と同定を実証した（図１の（Ｂ）～（Ｄ）参照）。ファージディスプレイ技術を使用し、精製ＩＤＥを用いて組換えヒト野性型ＩＤＥの高親和性エピトープを認識し、結合する特異的単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）クローンを釣り上げた。ファージの３種のクローン、具体的には、Ａ９、Ｈ３およびＢ１を選択した（実施例１、図２の（Ｃ））。続いて、可溶性抗体として産生するために、ｓｃＦｖｓを再フォーマット化し、以下の３種のフォーマットで試験した：ＭＢＰ－ｓｃＦｖ、「インクローナル」として作製したヒトＩｇＧ１、および哺乳動物細胞の培養物で作製した逆キメラＩｇＧ。これら抗体の特異性とＩＤＥ阻害性の性質をさらにｉｎ ｖｉｔｒｏで実証した（実施例１～２、図１の（Ｅ）～図４の（Ｃ））。加えて、逆キメラＨ３ ＩｇＧ抗体は、ＳＴＺ誘導性マウス糖尿病モデルにおいて、血糖値およびインスリン活性を改善した（実施例２、図５の（Ａ）～（Ｃ））。加えて、逆キメラＨ３ ＩｇＧ抗体のＦａｂ２断片は、パーキンソン氏病の表現型を有するミクログリア細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏの活性酸素種の産生を減少させた（実施例３、図６の（Ａ）～（Ｂ））。続いて、本発明者らは、作製した抗体を使用して高感度ＥＬＩＳＡを開発した（実施例４、図７の（Ａ）～（Ｃ））。このＥＬＩＳＡを使用して、発明者らはヒト血清ＩＤＥレベルと、メタボリックシンドロームの存在および／または重症度との強い相関を示すことができた（実施例４，図９～図１０の（Ｃ））。
【0055】
よって、本発明の一態様によると、ＩＤＥを特異的に結合する抗原認識領域を含む単離された抗体であって、抗原認識ドメインが以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む抗体が提供される。
（ｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）および配列番号８（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号１２（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）、
（ｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２４（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＣＤＲ２）および、配列番号３２（ＣＤＲ３）、あるいは
（ｉｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号３６（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号４０（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４６（ＣＤＲ２）および配列番号４８（ＣＤＲ３）。
（ｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）および配列番号８（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号１２（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）、
（ｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２４（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＣＤＲ２）および、配列番号３２（ＣＤＲ３）、あるいは
（ｉｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号３６（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号４０（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４６（ＣＤＲ２）および配列番号４８（ＣＤＲ３）。
【0056】
本明細書において使用する「インスリン分解酵素（ＩＤＥ）」という用語は、アミロイドβ－タンパク質（Ａβ）、インスリン、グルカゴン、アミリン、心房性ナトリウム利尿因子、カルシトニン（例：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４９６９およびＮＰ＿００４９６０）を含む複数の小さなポリペプチドの細胞内処理に関与するＭ１６Ａメタロプロテアーゼサブファミリーの大きな亜鉛結合プロテアーゼである、インスリジンまたはインスリンプロテアーゼを意味する。特定の実施形態によると、ＩＤＥはヒトＩＤＥである。本発明の例示的なＩＤＥはＥＣ３．４．２４．５６に示されるものである。
【0057】
本明細書において使用する「野性型ヒトインスリン分解酵素」は、ＷＴ ＩＤＥとも称し、機能的ヒトＩＤＥのＩＤＥ遺伝子の発現産物を意味する。インスリンに対して１００ｎＭの親和性を有し、インスリンを３６．６マイクロモルの速度で分解し、ヒト組換えＩＤＥはヒトインスリンを１μｍｏｌｅ／ｍｉｎの速度で分解する。例示的なＷＴ ＩＤＥを配列番号５０に示した。
【0058】
本明細書において使用する「変異ＩＤＥ Ｅ１１１Ｑ型」は、ヒトＩＤＥの触媒活性の減少した改変型であって、少なくとも１つの触媒部位（配列番号５０に対応する１１１番グルタミン酸のグルタミンへ）の変異を有するものを意味する。例示的な変異ＩＤＥ Ｅ１１１Ｑ型を配列番号５２に示した。
【0059】
本明細書において使用する「単離された」という用語は、天然の環境（例えば、血清）から少なくとも部分的に分離されたこと、あるいは複数の抗体を含むサンプル中の主たる抗体である、あるいは生物学的サンプル中の唯一の抗体であることを意味する。
【0060】
本発明で使用される「抗体」という用語は、インタクトな分子および（抗原のエピトープに結合することができる）その機能的断片を含む。
【0061】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原の任意の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸や炭水化物側鎖等の分子の化学的に活性な表面グループで構成されており、通常、特定の３次元構造特性を有すると共に特定の電荷特性を有する。
【0062】
特定の実施形態によると、抗体断片には、ＨＬＡ拘束性に抗原のエピトープに結合することができる、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ、Ｆｃａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＭＢＰ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、Ｆａｂ発現ライブラリーまたは単一ドメイン分子、例えばＶＨおよびＶＬが含まれるが、これらに限定されない。
【0063】
特定の実施形態によると、抗体は完全なまたはインタクトな抗体である。
【0064】
特定の実施形態によると、抗体は抗体断片である。
【0065】
本発明の幾つかの実施形態を実施するための適切な抗体断片としては、免疫グロブリン軽鎖（本明細書では「軽鎖」と称する）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、免疫グロブリン重鎖（本明細書では「重鎖」と称する）の相補性決定領域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Ｆｄ断片、およびＦｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２等の軽鎖と重鎖の両方の可変領域の本質的に全体を含む抗体断片、あるいは抗体のＦｃ領域を含む抗体断片が挙げられる。
【0066】
本明細書で使用される「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域内に見出される抗原結合領域を指すのに互換的に用いられる。一般に、抗体は、ＶＨの各々の３種のＣＤＲ（ＣＤＲ ＨＩ又はＨＩ、ＣＤＲ Ｈ２又はＨ２、およびＣＤＲ Ｈ３又はＨ３）とＶＬの各々の３種（ＣＤＲ ＬＩ又はＬＩ、ＣＤＲ Ｌ２又はＬ２、およびＣＤＲ Ｌ３又はＬ３）を含む。
【0067】
可変領域又はＣＤＲを構成する特定の抗体内のアミノ酸残基の同一性は、当技術分野で良く知られている方法を用いて確認することができ、Kabat et al.によって定義された配列多様性（例えば、Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.を参照）、Chothia et al.によって定義された構造ループ領域の位置（例えば、Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989.を参照）、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標）、Martin et al., 1989, Proc. Natl Acad Sci USA. 86:9268、およびワールドワイドウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ－ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓを参照）を使用したＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ間の妥協案、接触定義で定められた利用可能な複合結晶構造（MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745, 1996を参照）および「立体構造定義」（例えば、Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008を参照）等の方法が挙げられる。
【0068】
本明細書で使用される「可変領域」および「ＣＤＲ」は、当技術分野で公知の任意のアプローチ（様々なアプローチの組み合わせを含む）によって定義される可変領域およびＣＤＲを意味し得る。
【0069】
特定の実施形態によれば、可変領域および／又はＣＤＲを構成する抗体内のアミノ酸残基の同一性は、翻訳されたコード遺伝子から演繹されたアミノ酸配列によって確認される。
【0070】
軽鎖と重鎖の両方の可変領域の全体又は本質的に全体を含む機能的抗体断片は次のように定義される。
（ｉ）Ｆｖ： ２本の鎖として表される、軽鎖（ＶＬ）の可変領域と重鎖（ＶＨ）の可変領域とで構成される遺伝子操作された断片と定義される。
（ｉｉ）単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）： 遺伝的融合単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された単鎖分子。
（ｉｉｉ）ジスルフィド安定化Ｆｖ（「ｄｓＦｖ」）： 遺伝子操作されたジスルフィド結合によって連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された抗体。
（ｉｖ）Ｆａｂ： 抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片であって、完全な抗体（whole antibody）を酵素パパインで処理してインタクトな軽鎖と、可変ドメインおよびＣＨ１ドメインとで構成される重鎖のＦｄ断片とを作製することによって得ることができるもの。
（ｖ）Ｆａｂ’： 完全な抗体を酵素ペプシンで処理した後に還元することで得ることができる、抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子断片（抗体分子１個当たり２個のＦａｂ’断片が得られる）。
（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２： 完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子断片（即ち、２個のジスルフィド結合によって結合しているＦａｂ’断片の二量体）。
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体又はナノボディは、抗原に対して十分な親和性を示す単一のＶＨ又はＶＬドメインで構成されている。
（ｖｉｉｉ）Ｆｃａｂ： 抗原結合能を抗体のＦｃ領域に導入することで抗原結合ドメインとして開発された、抗体のＦｃ部分を含む抗体分子の断片。
（ｉ）Ｆｖ： ２本の鎖として表される、軽鎖（ＶＬ）の可変領域と重鎖（ＶＨ）の可変領域とで構成される遺伝子操作された断片と定義される。
（ｉｉ）単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）： 遺伝的融合単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された単鎖分子。
（ｉｉｉ）ジスルフィド安定化Ｆｖ（「ｄｓＦｖ」）： 遺伝子操作されたジスルフィド結合によって連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された抗体。
（ｉｖ）Ｆａｂ： 抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片であって、完全な抗体（whole antibody）を酵素パパインで処理してインタクトな軽鎖と、可変ドメインおよびＣＨ１ドメインとで構成される重鎖のＦｄ断片とを作製することによって得ることができるもの。
（ｖ）Ｆａｂ’： 完全な抗体を酵素ペプシンで処理した後に還元することで得ることができる、抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子断片（抗体分子１個当たり２個のＦａｂ’断片が得られる）。
（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２： 完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子断片（即ち、２個のジスルフィド結合によって結合しているＦａｂ’断片の二量体）。
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体又はナノボディは、抗原に対して十分な親和性を示す単一のＶＨ又はＶＬドメインで構成されている。
（ｖｉｉｉ）Ｆｃａｂ： 抗原結合能を抗体のＦｃ領域に導入することで抗原結合ドメインとして開発された、抗体のＦｃ部分を含む抗体分子の断片。
【0071】
特定の実施形態によると、抗体はｓｃＦｖである。
【0072】
特定の実施形態によると、抗体は、ＭＢＰ－ｓｃＦｖとしても知られる、E. coliマルトース結合タンパク質への融合によって安定化されたｓｃＦｖであり、例えば、Bach H1, et al. J Mol Biol. (2001) Sep 7;312(1):79-93に記載されており、後述する実施例にも記載されているものである。
【0073】
特定の実施形態によれば、抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤまたはＩｇＥである。
【0074】
特定の実施形態によれば、抗体はＩｇＧ抗体である。
【0075】
特定の実施形態によれば、抗体アイソタイプはＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。
【0076】
抗体は単一特異性（１個のエピトープ又はタンパク質を認識可能である）、二重特異性（２個のエピトープ又はタンパク質に結合可能である）、又は多重特異性（複数のエピトープ又はタンパク質を認識可能である）とすることができる。
【0077】
特定の実施形態によれば、抗体は単一特異性抗体である。
【0078】
特定の実施形態によれば、抗体は多重特異性、例えば、二重特異性、三重特異性、四重特異性である。
【0079】
本発明の幾つかの実施形態によれば、抗体は二重特異性抗体である。
【0080】
二重機能性抗体としても知られる、二重特異性抗体は、第１の抗原のための少なくとも１種の抗原認識部位と、第２の抗原のための少なくとも１種の抗原認識部位とを有する。このような抗体は、組換えＤＮＡ手法または公知の方法で化学的に作製することができる。化学的に作られた二重特異性抗体としては、二価の特性を維持するように還元および再構成された抗体、並びに少なくとも２つの抗原認識部位を各抗原に対して有するように化学的にカップリングされた抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原を認識可能な全ての抗体または抗体複合体、あるいは抗体の多量体を含む。
【0081】
特定の実施形態によると、抗体はモノクローナル抗体である。
【0082】
抗体およびその断片を作製する方法は当技術分野で良く知られている（例えば、Harlow and レーン, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照、この文献を本参照によって援用する）。
【0083】
特定の実施形態によると、抗体は、哺乳動物細胞内で産生された組換え体である。
【0084】
特定の実施形態によると、抗体は、細菌内で産生された組換え体である。
【0085】
本発明の幾つかの実施形態に係る抗体断片は、抗体のタンパク質分解性加水分解によって、又は断片をコードするＤＮＡのE. coli細胞又は哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物又は他のタンパク質発現系）での発現によって製造することができる。抗体断片は、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化又はパパイン消化によって得ることができる。例えば、ペプシンによる抗体の酵素切断によってＦ（ａｂ’）２と表示される５Ｓ断片を得て抗体断片を生成することができる。この断片を、チオール還元剤、および必要に応じてジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を使用して更に切断し、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を生成することができる。或いは、ペプシンを使用した酵素切断によって、２個の一価Ｆａｂ’断片と１個のＦｃ断片を直接生成する。これらの方法は、例えば、Goldenberg（米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３３１，６４７号明細書）および当該特許に含まれる参考文献に記載されているが、これらの特許の全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。Porter, R. R.［Biochem. J. 73: 119-126 (1959)］も参照。インタクトな抗体によって認識される抗原に断片が結合する限り、抗体を切断する他の方法（例えば、一価の軽重鎖断片を形成する重鎖の分離、断片の更なる切断、又は他の酵素的、化学的又は遺伝的技法）も用いることができる。
【0086】
Ｆｖ断片はＶＨ鎖とＶＬ鎖の会合を含む。Inbar et al.［Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720)］に記載のように、この会合は非共有結合性の可能性がある。或いは、分子間ジスルフィド結合によって可変鎖を結合するか、又はグルタルアルデヒド等の化学物質によって可変鎖を架橋することができる。好ましくは、Ｆｖ断片はペプチドリンカーによって結合されたＶＨ鎖とＶＬ鎖を含む。このような単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）の調製は、オリゴヌクレオチドによって結合されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって行う。この構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、次にそれをE. coli等の宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２個のＶドメインを架橋するリンカーペプチドによって単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成する方法は、例えば、Whitlow and Filpula, Methods 2: 97-105 (1991、Bird et al., Science 242:423-426 (1988)、Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993)、および米国特許第４，９４６，７７８号明細書（その全内容を参照によってここに援用する）に記載されている。
【0087】
抗体断片の他の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することで得ることができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成して調製する。例えば、Larrick and Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)]を参照。
【0088】
特定の実施形態によると、抗体は、キメラ抗体である。
【0089】
特定の実施形態によれば、抗体はヒト化抗体である。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化の形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット又はウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基に置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含むこともある。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１個（通常は２個）の可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常はヒト免疫グロブリンのそれを含むことも最適である［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)、およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【0090】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で良く知られている。一般に、ヒト化抗体は非ヒトである供給源から導入された１種以上のアミノ酸残基を有する。このような非ヒトアミノ酸残基は移入残基と称されることが多く、通常は移入可変ドメインから得られる。ヒト化は本質的に、Winterとその同僚の方法［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)］に従い、齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いて行うことができる。従って、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は通常、一部のＣＤＲ残基と恐らく一部のＦＲ残基が齧歯動物抗体の類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
【0091】
特定の実施形態によれば、抗体は、ヒト抗体である。
【0092】
ヒト抗体の生成は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で公知の様々な技法［Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)、Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)、Bitton A, Nahary L, Benhar I. Methods Mol Biol. 1701:349-363 (2018)］を用いて行うこともできる。Cole et al.およびBoerner et al.の技法もヒトモノクローナル抗体の調製にも利用することができる（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)およびBoerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)）。同様に、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入してヒト抗体を生成することができる。チャレンジの際にヒト抗体の産生が観察されるが、これは、遺伝子再編成、構築および抗体レパートリー等あらゆる点でヒトで見られるものと酷似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号および第５，６６１，０１６号明細書、および次の科学文献：Marks et al., Bio/Technology 10,: 779-783 (1992)、Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)、Morrison, Nature 368 812-13 (1994)、Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)、Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)、および Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995)に記載されている。
【0093】
細胞内の特定のコンパートメントのターゲティングは、細胞内抗体（「イントラボディ」としても知られる）によって達成され得ることを理解されたい。これらは実質的に細胞内局在化シグナルを付加したＳＣＡである（例：ＥＲ、ミトコンドリア、核、細胞質由来）。この技術は、当業界で使用に成功している（報告について、Richardson and Marasco, 1995, TIBTECH vol. 13を参照）。イントラボディは、使用しなければ大量に存在する細胞表面受容体の発現を事実上排除し、細胞内のタンパク質機能を阻害する（例えば、Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141、Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332-337、Marasco et al., 1998 Human Gene Ther 9: 1627-42、Shaheen et al., 1996 J. Virol. 70: 3392-400、Werge, T. M. et al., 1990, FEBS Letters 274:193-198、Carlson, J.R. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428、Biocca, S. et al., 1994, Bio/Technology 12: 396-399、Chen, S-Y. et al., 1994, Human Gene Therapy 5:595-601、Duan, L et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079、Chen, S-Y. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936、Beerli, R.R. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:23931-23936、Mhashilkar, A.M. et al., 1995, EMBO J. 14:1542-1551、Marasco et al.の国際公開第９４／０２６１０号およびDuan et al.の国際公開第９５／０３８３２号を参照）。
【0094】
特定の実施形態によると、ＩＤＥは細胞表面のみならず、サイトゾル、ペルオキシゾーム、エンドソーム内にも発現されることから、抗体は細胞内抗体である。
【0095】
この点について、細胞内抗体はタンパク質の正しいコンパートメントへの移動をブロックして活性を阻害し得ることが示されている（例えば、Boldicke J. Cell. Mol. Med. Vol 11, No 1, 2007 pp. 54-70、Persic et al. Gene 187 (1997) 1-8、およびShaki-Loewenstein et al. Journal of Immunological Methods 303 (2005) 19-39を参照）。よって、本発明のいくつかの実施形態の細胞内抗体は、ＩＤＥそのものに固有の触媒活性を必ずしも阻害する必要はない。
【0096】
細胞内抗体発現ベクターを作製するために、目的の標的タンパク質に特異的な抗体の軽鎖および重鎖を、典型的にはＡＰＬＰ１に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離した。抗ＡＰＬＰ１モノクローナル抗体または組換えモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、当業界で公知の方法によって作製することができる。ＡＰＬＰ１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体（例えば、ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体と、コンビナトリアルライブラリー由来の組換え抗体のいずれか）が一度単離されたら、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを標準的な分子生物学的技術で単離する。ハイブリドーマ由来抗体の場合、軽鎖および重鎖のｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得ることができる。ファージディスプレイライブラリー等に由来の組換え抗体の場合、軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡをライブラリースクリーニング工程で単離されたディスプレイパッケージ（例：ファージ）から回収し、抗体の軽鎖および重鎖の遺伝子のヌクレオチド配列を決定することができる。例えば、多くのこのような配列がKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242および「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系配列データベースに開示されている。得られたら、標準的な方法を用いて、抗体の軽鎖配列および重鎖配列を組換え発現ベクターにクローニングする。
【0097】
軽鎖および重鎖の細胞質発現のために、軽鎖および重鎖の疎水性リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を除去する。細胞内抗体発現ベクターは複数の形態の内の１種の細胞内抗体をコードし得る。例えば、一実施形態において、ベクターは、全長抗体軽鎖および重鎖をコードし、細胞内で全長抗体を発現する。別の実施形態においては、ベクターは、軽鎖の全長をコードするが、重鎖のＶＨ／ＣＨ１領域のみをコードし、細胞内でＦａｂ断片を発現する。別の実施形態においては、ベクターは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードし、軽鎖および重鎖の可変領域は可とう性ペプチドリンカー［例：（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３］で連結され、単鎖分子として発現される。細胞内でＡＰＬＰ１活性を阻害するために、細胞内抗体をコードする発現ベクターを、後述する標準的な形質導入方法によって細胞に導入する。
【0098】
いくつかの実施形態において、本願で提供する抗体は、細胞浸透剤と機能的に関連付けることができる。本願で使用する「細胞浸透剤」という用語は、抗体の細胞膜を介した転移を増強する薬剤を意味する。
【0099】
例示的な細胞透過剤は、細胞浸透性ペプチドである。
【0100】
本願で使用する「細胞浸透性ペプチド」とは、膜透過性複合体の、細胞の細胞質膜および／または核膜を介した移動に関連したエネルギー依存性（即ち、非飲食作用性）転移特性を付与する短い（約１２～３０残基の）アミノ酸配列またはその機能的なモチーフを含むペプチドである。本発明のいくつかの実施形態において膜透過性複合体に用いられる細胞浸透性ペプチドは、ジスルフィド結合を、このような結合のために修飾した二本鎖リボ核酸と自由に形成するまたは形成するように誘導化されている少なくとも１種の非機能的システイン残基を含むことが好ましい。このような性質を付与する代表的なアミノ酸モチーフが米国特許第６，３４８，１８５号明細書に列挙されており、本参照をもってその内容を明示的に援用する。本発明のいくつかの実施形態における細胞浸透性ペプチドとしては、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、トランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８－６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳ、およびＭＡＰが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0101】
加えてまたは代替として、リポソーム等の脂質粒子を細胞浸透剤として使用してもよい。
【0102】
リポソームには、脂質二重膜から構成される合成（即ち、非天然の）構造であって、容積を内包するものが挙げられる。リポソームには、エマルション、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層等が挙げられる。リポソームは当業界で公知のいずれかの方法で作製することができる［Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299-308、Monkkonen, J. et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139-145、Lasic D D., Liposomes Technology Inc., Elsevier, 1993, 63-105. (chapter 3)、Winterhalter M, Lasic D D, Chem Phys Lipids, 1993 September; 64(1-3):35-43］。リポソームは正電荷、負電荷を帯びていてもよいし、中性でもよい。
【0103】
例えば、Alfonso et al.［The science and practice of pharmacy, Mack Publishing, Easton Pa 19th ed., (1995)］およびKulkarni et al.［J. Microencapsul.1995, 12 (3) 229-46］に記載の方法のように、抗体をリポソームに導入するために当業界で知られるいかなる方法も使用することができる。
【0104】
本発明において特に適したリポソームを決定するために、スクリーニングアッセイを実施することができ、このようなアッセイは米国特許出願公開第２００４０２６６７３４号および第２００４０２６６７３４号、並びにDanenberg et al., Journal of cardiovascular pharmacology 2003, 42:671-9、Circulation 2002, 106:599-605、Circulation 2003, 108:2798-804に記載されている。
【0105】
一実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態におけるの抗体は以下のようにして作製される。ヒトＩＤＥのエピトープを認識する特異的単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）クローンを単離するために精製ＩＤＥを使用する。ヒト合成抗体ファージディスプレイライブラリーを用いるファージディスプレイ技術を使用する。具体的には、ヒトｓｃＦｖライブラリー、例えば、Ｒｏｎｉｔ １ ライブラリー［Azriel-Rosenfeld et al. J Mol Biol. (2004) 335(1):177-192に記載、本参照をもって完全に援用される］をスクリーニングする。ライブラリーを非特異的タンパク質の除去に付し、親和性カラムを用いて細菌からタンパク質を精製し、組換えヒト野性型（ＷＴ）ＩＤＥ（配列番号５０）を用いて選択を行う。ＷＴ ＩＤＥを認識する、あるいは特定の実施形態によると、変異ＩＤＥよりも多く認識する、陽性ファージを富化するために、変異ＩＤＥ（例：Ｅ１１１Ｑ）上の数回のサイクル（例：２サイクル）によって富化されたファージを除去する（即ち、負の選択）。これら除去工程のそれぞれの後にはＷＴ ＩＤＥ上の選択工程（即ち、正の選択）が続く。親和性選択サイクルの後には、感染細菌の個別のクローンを取り出して増殖させる。各クローンのファージを次に（例：ＥＬＩＳＡで）ＩＤＥ結合対（陰性対照としての）非特異的タンパク質について試験する。陽性クローンをＰＣＲ増幅で解析し、続いて異なるクローンを検出するためにフィンガープリンティングを行い、さらに完全性とクローン間の違いを実証するためにシーケンシングを行う。
【0106】
本発明のいくつかの実施形態における抗体の単離において重要な特徴は、選択工程である。よって、一実施形態において、抗体の作製方法は、（ａ）（例：上述したような）複数の抗体を提供することと、（ｂ）野性型ＩＤＥとは結合するが、前記野性型ＩＤＥと比べて触媒活性の低下した変異ＩＤＥとは結合しない抗体を選択するための、前記抗体のスクリーニングを実施することとを含む。
【0107】
一旦、抗体が得られたら、活性について試験してもよい。抗体活性の試験方法としては、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびｉｎ ｖｉｔｒｏインスリン分解アッセイが挙げられる。
【0108】
特定の実施形態によると、抗体のＩＤＥ阻害活性について試験する。ＩＤＥ阻害活性は、ＩＤＥの酵素活性を特異的に下方制御することを意味する。例えば、ＩＤＥのＩＣ５０は、ＩＤＥ阻害性ペプチドＡＤＴ－２１について解析したところ、１０～２００ｎＭ（例：１～１００ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～２０ｎＭまたは１～１０ｎＭ）の範囲内である。
【0109】
例示的な実施形態によると、抗体は、ＩＤＥの触媒活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％を下方制御し得る。
【0110】
例示的な実施形態によると、抗体は、ＩＤＥのインスリン分解活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％を下方制御し得る。
【0111】
特定の実施形態によると、抗体は、ＩＤＥのインスリン分解活性の少なくとも５０％を下方制御することが可能である。
【0112】
例示的な実施形態によると、抗体は、ＩＤＥのインスリン分解活性の５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％、１０～５０％，５０～１００％または１０～１００％を下方制御し得る。
【0113】
例示的な実施形態によると、抗体は、ＩＤＥのインスリン分解速度が２５～５０マイクロモル、２５～７５マイクロモル、２５～１００マイクロモル、５０～７５マイクロモル、５０～１００マイクロモルまたは７５～１００マイクロモルとなるようにＩＤＥの活性を下方制御し得、ヒト組換えＩＤＥは１マイクロモルのヒトインスリン／分で分解する。
【0114】
上述したように、特定の実施形態によると、抗体の核酸を発現ベクターに連結し、続いて宿主細胞に導入する組換えＤＮＡ技術によって抗体（例：単鎖Ｆｖ）を作製してもよい。
【0115】
よって、本発明の一態様によると、本発明のいくつかの実施形態の抗体をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【0116】
本発明の一実施形態によると、抗体の核酸配列は、配列番号３、５、７、１１、１３および１５を含む。
【0117】
本発明の別の実施形態によると、抗体の核酸配列は、配列番号１９、２１、２３、２７、２９および３１を含む。
【0118】
本発明のさらに別の実施形態によると、抗体の核酸配列は、配列番号３５、３７、３９、４３、４５および４７を含む。
【0119】
本発明のいくつかの実施形態と共に使用可能な抗体を構成する軽鎖、重鎖、ＣＤＲおよび可変領域をコードする核酸配列の非限定的な例は、配列番号１、９、１７、２５、３３および４１によって提供される。
【0120】
よって、特定の実施形態によると、ポリヌクレオチドは、配列番号１、９、１７、２５、３３および４１からなる群より選ばれる核酸配列との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の核酸配列を含み、それぞれの可能性が本発明の個別の実施形態を表す。
【0121】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」という用語は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／又は複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上述の組み合わせ）の形態で単離および提供される一本鎖又は二本鎖の核酸配列を意味する。
【0122】
外因性抗体を哺乳動物細胞に発現させるために、抗体をコードするポリヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞発現に適した核酸構築物に連結されることが好ましい。
【0123】
よって、本発明の一態様によると、単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【0124】
このような核酸構築物またはシステムは、核酸配列の発現を指示する少なくとも１種のシスエレメントを含む。シスエレメント配列には、ヌクレオチド配列の恒常的発現を指示するもののみならず、特定の条件下でのみヌクレオチド配列の誘導性発現を指示するものも挙げられる。よって、例えば、細胞内でポリヌクレオチド配列の転写を恒常的または誘導的に支持するためのプロモーター配列が核酸構築物に含まれる。注目すべき点は、本発明の核酸配列は、それを必要とする対象（例：糖尿病の対象）に裸のＤＮＡとして、または遺伝子療法に有用な核酸構築物（例：ウイルスベクター）に連結して投与される、ｉｎ ｖｉｖｏの用途に使用することもできる
【0125】
本願に記載するポリヌクレオチド／発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。
【0126】
このような細胞は通常、組換えタンパク質の高発現のために選択される（例えば、細菌細胞、植物細胞又は真核細胞、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ－２９３細胞）が、例えば、薬剤のＣＤＲを、養子細胞療法で使用されるＴ細胞受容体あるいは当該細胞に形質導入されたＣＡＲに移植する場合には、免疫細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞）とすることもできる。
【0127】
従って、本発明の一態様によると、抗ＩＤＥ抗体の製造方法であって、ポリヌクレオチド／発現構築物を宿主細胞内で発現させることを含む、方法が提供される。
【0128】
さらに抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏで製造されるとき、特定の実施形態によると、組換え抗体の回収または単離は、培養の期間を得て実施される。「組換え抗体の回収」または「組換え抗体の単離」という句は、抗体を含む培養培地全体の収集を意味し、追加の分離または精製のための工程意味する必要はない。代わりに、「組換え抗体の回収」または「組換え抗体の単離」という句は、酸性細胞の溶解物から産物を回収することを意味する。上記に関わらず、本発明のいくつかの実施形態における抗体は、種々の標準的タンパク質精製技術を用いて生成することも可能であり、当該技術は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、および溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態によると、抗体は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％に精製されている。本願で使用する「精製されている」とは、抗体を含む組成物が、目的の抗体ではない、他のタンパク質性の物質を含まないことを意味する。
【0129】
後述する実施例の項に記載したように、本願に記載する方法論を用いて複数の抗ＩＤＥ抗体が製造された。
【0130】
よって、本発明の一態様によると、配列番号４、６、８、１２、１４、および１６に示した相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む抗原認識領域を含む、単離された抗体が提供される。
【0131】
一実施形態において、配列番号４、配列番号６および配列番号８は、抗体の重鎖上に順番に（Ｎ→Ｃ、それぞれＣＤＲ１～３として）配置され、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６は、抗体の軽鎖上に順番に（Ｎ→Ｃ、それぞれＣＤＲ１～３として）配置される。
【0132】
本発明のいくつかの実施形態によると、抗体の重鎖は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、例えば、１００％の配列相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0133】
よって、本発明の一態様によると、配列番号２０、２２、２４、２８、３０および３２に示した相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む抗原認識領域を含む、単離された抗体が提供される。
【0134】
特定の実施形態によると、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４は、抗体の重鎖上に順番に（Ｎ→Ｃ、それぞれＣＤＲ１～３として）配置され、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２は、抗体の軽鎖上に順番に（Ｎ→Ｃ、それぞれＣＤＲ１～３として）配置される。
【0135】
本発明のいくつかの実施形態によると、抗体の重鎖は、配列番号１８のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、例えば、１００％の配列相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0136】
よって、本発明の一態様によると、配列番号３６、３８、４０、４４、４６および４８に示した相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む抗原認識領域を含む、単離された抗体が提供される。
【0137】
特定の実施形態によると、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０は、抗体の重鎖上に順番に（Ｎ→Ｃ、それぞれＣＤＲ１～３として）配置され、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８は、抗体の軽鎖上に順番に（Ｎ→Ｃ、それぞれＣＤＲ１～３として）配置される。
【0138】
本発明のいくつかの実施形態によると、抗体の重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、例えば、１００％の配列相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0139】
相同性（例：パーセント相同性、同一性＋類似性）は、任意の相同性比較ソフトウエアを用いて決定することができ、当該ソフトウエアとしては、例えば、ポリペプチド配列から開始する場合、デフォルトのパラメーターを使用するアメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰまたはＴＢＬＡＳＴＮソフトウエアが挙げられる。あるいは、ヌクレオチドクェリー配列（両鎖）の６フレームのコンセプチュアルな翻訳産物をタンパク質配列データベースに対して比較するデフォルトのパラメーターを使用するｔＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ＮＣＢＩより入手可）が挙げられる。
【0140】
例えば、ｔＢＬＡＳＴＸのデフォルトパラメーターには以下が含まれる。最大標的配列数：１００、予測閾値：１０、ワードサイズ：３、クェリー範囲内の最大マッチ数：０、スコア付パラメーター：Ｍａｔｒｉｘ－ＢＬＯＳＵＭ６２、フィルターおよびマスキング：Ｆｉｌｔｅｒ－低複雑性領域。
【0141】
本発明のいくつかの実施形態における抗体は、治療を必要とする対象における、ＩＤＥ活性関連疾患の治療に使用してもよい。
【0142】
よって、本発明の一態様によると、治療を必要とする対象におけるＩＤＥ活性関連疾患の治療方法であって、治療有効量の、本明細書に記載する抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を対照に投与することを含み、当該投与によってＩＤＥ活性に関連した疾患を予防または治療する方法が提供される。
【0143】
本発明の追加のまたは代替の態様によると、治療を必要とする対象におけるＩＤＥ活性関連疾患の治療用として本明細書に記載する、抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）が提供される。
【0144】
この点について、上述したように、ＩＤＥは細胞表面のみならず、サイトゾル、ペルオキシゾーム、エンドソーム内にも発現されることから、いくつかの実施形態の細胞に浸透可能な抗体（細胞内抗体または細胞浸透剤と機能的に関連する抗体）は、ＩＤＥの正しいコンパートメントへの移動をブロックしてその活性を阻害し得る。よって、ＩＤＥ活性関連疾患を治療するためにＩＤＥそのものに固有の触媒活性を必ずしも阻害する必要はない。
【0145】
従って、本発明の一態様によると、治療を必要とする対象におけるＩＤＥ活性関連疾患を治療するための方法であって、対象に治療有効量の、ＩＤＥに特異的に結合する抗原認識領域を含む抗体を投与し、当該抗原認識ドメインは以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）および配列番号８（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号１２（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）、
（ｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２４（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＣＤＲ２）および、配列番号３２（ＣＤＲ３）、あるいは
（ｉｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号３６（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号４０（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４６（ＣＤＲ２）および配列番号４８（ＣＤＲ３）であって、
当該抗体が抗体（ｉｉｉ）のとき、当該抗体は細胞内抗体であるか、または細胞透過剤と機能的に関連したものであり、
当該投与によってＩＤＥ活性に関連した疾患を予防または治療する、方法が提供される。
（ｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）および配列番号８（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号１２（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）、
（ｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２４（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＣＤＲ２）および、配列番号３２（ＣＤＲ３）、あるいは
（ｉｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号３６（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号４０（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４６（ＣＤＲ２）および配列番号４８（ＣＤＲ３）であって、
当該抗体が抗体（ｉｉｉ）のとき、当該抗体は細胞内抗体であるか、または細胞透過剤と機能的に関連したものであり、
当該投与によってＩＤＥ活性に関連した疾患を予防または治療する、方法が提供される。
【0146】
本発明の追加のまたは代替の態様によると、ＩＤＥを特異的に結合する抗原認識領域を含む抗体であって、抗原認識ドメインが以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む、抗体が提供される。
（ｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）および配列番号８（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号１２（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）、
（ｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２４（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＣＤＲ２）および、配列番号３２（ＣＤＲ３）、あるいは
（ｉｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号３６（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号４０（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４６（ＣＤＲ２）および配列番号４８（ＣＤＲ３）であって、
当該抗体が抗体（ｉｉｉ）のとき、当該抗体は細胞内抗体であるか、または細胞透過剤と機能的に関連したものであり、
治療を必要とする対象におけるＩＤＥ活性に関連した疾患の治療に使用する抗体が提供される。
（ｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）および配列番号８（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号１２（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）および配列番号１６（ＣＤＲ３）、
（ｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）および配列番号２４（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号３０（ＣＤＲ２）および、配列番号３２（ＣＤＲ３）、あるいは
（ｉｉｉ）抗体の重鎖のＮからＣへと順番に配置された配列番号３６（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）および配列番号４０（ＣＤＲ３）、ならびに抗体の軽鎖のＮからＣへと順番に配置され配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４６（ＣＤＲ２）および配列番号４８（ＣＤＲ３）であって、
当該抗体が抗体（ｉｉｉ）のとき、当該抗体は細胞内抗体であるか、または細胞透過剤と機能的に関連したものであり、
治療を必要とする対象におけるＩＤＥ活性に関連した疾患の治療に使用する抗体が提供される。
【0147】
本願で使用する「ＩＤＥ活性関連疾患」とは、ＩＤＥ活性が発症または進行に寄与する病態、疾患または症候群を意味する。
【0148】
上述したように、ＩＤＥは、インスリン、アミロイドβ－タンパク質（Ａβ）、グルカゴン、アミリン、心房性ナトリウム利尿因子およびカルシトニンを含む、多様な配列からなる複数の小タンパク質を開裂する酵素である。従って、これら基質レベルの増加が症状の改善を助け、さらには疾患の治癒まで達成し得る状況において、本発明のいくつかの実施形態における抗体を使用してもよい。
【0149】
特定の実施形態によると、インスリンレベルの増加は疾患または障害の治療の根拠となる。
【0150】
このような疾患または異常としては、中枢神経系の自己免疫疾患、神経変性疾患、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満症、 高血糖症、網膜損傷、腎不全、神経損傷、微小血管損傷、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）感染症および創傷が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本願で使用する「中枢神経系の自己免疫疾患」とは、体の免疫系が自らの神経系（好ましくはＣＮＳ）を攻撃する疾患を意味する。
【0151】
ＣＮＳの自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群、重症筋無力症、横断性脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、慢性頭痛、脳性麻痺、ループス、免疫機能不全筋中枢神経系破壊（ｉｍｍｕｎｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）、中枢神経性血管炎、自己免疫性小脳変性症、－遅発性多発神経障害を伴う歩行失調症（ＧＡＬＯＰ）、視神経脊髄炎、全身硬直症候群、およびＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ）／熱帯性痙性不全対麻痺症（ＴＳＰ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0152】
特定の実施形態によると、中枢神経系の自己免疫疾患は、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群、重症筋無力症、横断性脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、慢性頭痛および脳性麻痺からなる群より選ばれる。
【0153】
特定の実施形態によると、中枢神経系の自己免疫疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）を含む。
【0154】
本願において「神経変性疾患」は、神経組織、神経伝達物質または神経機能の、段階的且つ進行性の喪失によって特徴づけられる神経系（好ましくはＣＮＳ）の異常、疾患または病態を意味する。
【0155】
神経変性疾患の具体例としては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）、自己免疫性脳脊髄炎、変性神経疾患、脳炎（例：ラスムッセン脳炎）、アルツハイマー氏病、てんかん、遺伝性脳障害、卒中、パーキンソン氏病およびハンチントン氏病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0156】
特定の実施形態によると、神経変性疾患はパーキンソン氏病である。
【0157】
特定の実施形態によると、神経変性疾患はアルツハイマー氏病である。
【0158】
特定の実施形態によると、疾患はメタボリックシンドローム、糖尿病、および肥満からなる群より選ばれる。
【0159】
特定の実施形態によると、疾患はメタボリックシンドロームである。
【0160】
本願で使用する「メタボリックシンドローム」という用語は、偶発的というよりも関連して発生することが多い一群のまたは集合的なメタボリックな症状［腹部肥満、空腹時血糖の上昇、「脂質異常」（即ち、脂質レベルの上昇）および高血圧（ＨＢＰ）］であって、総合的に２型糖尿病および心血管障害の発症を促進するものを意味する。メタボリックシンドロームは、増加したトリグリセリド、減少した高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－コレステロール）、および場合によっては、中度に上昇した低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－コレステロール）レベルの特定の脂質プロファイルのみならず、構成リスク因子の圧力による動脈硬化症の進行の加速によって特徴づけられる。
【0161】
特定の実施形態によると、疾患は糖尿病である。
【0162】
本願で使用する「糖尿病」とは、生物における、生合成またはインスリン産生の欠陥による絶対的なインスリン欠乏（１型糖尿病）、またはインスリン抵抗性の存在下における相対的なインスリン欠乏（２型糖尿病）、即ち、不完全なインスリン活性、を意味する。糖尿病患者は、したがって、絶対的または相対的なインスリン欠乏を示し、他の症状や症候に加えて、血糖値の上昇、尿中の当の存在、過剰な排尿（多尿）、喉の渇きの増加（多飲水症）および空腹の増加（過食症）を示し得る。１型糖尿病では、症状はかなり急速（例：数週間または数カ月以内）に発生し得る。しかし、２型糖尿病の症状はより緩やかであり、微少または完全に不在の場合もある。糖尿病（両方の型）は、（正常または増加した食事量にもかかわらず）急激かつ顕著な体重減少および減少しない精神的疲労も起こし得る。本願で使用する糖尿病は、任意のステージまたは型の糖尿病（顕性糖尿病、境界型糖尿病および成人潜在性自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）が挙げられるが、これらに限定されない）を包含する。
【0163】
特定の実施形態によると、糖尿病は１型糖尿病である。
【0164】
特定の実施形態によると、糖尿病は２型糖尿病である。
【0165】
糖尿病関連疾患の例としては、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、インスリン抵抗性、肥満、高血糖症、眼疾患（例：緑内障、白内障）、皮膚感染症、高血圧症、胃不全麻痺、ケトアシドーシス（ＤＫＡ）、神経障害（例：糖尿病性神経障害）、高浸透圧性高血糖性非ケトン性症候群（ＨＨＮＳ）、腎疾患（腎障害）および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0166】
他の特定の実施形態によると、疾患は創傷である。
【0167】
本願における「創傷」という用語は、種々の方法のいずれか一種（例：床ずれ、外傷によって生じた創傷、外科的処置中または後に生じた創傷等）によって始まり、種々の特徴を有する、皮膚および皮下組織のみならず、内部器官の損傷全般を意味する。例示的なものとしては、打撲創、引掻き傷、火傷、日射創、切開創、切除創、外科創、壊死性筋膜炎、潰瘍、静脈うっ血潰瘍、糖尿病性潰瘍潰瘍、褥瘡、アフタ性潰瘍、圧迫性潰瘍、瘢痕、円形脱毛症、皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ベルロック皮膚炎、おむつかぶれ、汗疱状皮膚炎、乾癬、湿疹、いぼ、肛門疣贅、血管腫、老年性血管腫、水虫、異型母斑、基底細胞癌、ベイトマン氏紫斑、水疱性類天疱瘡、カンジダ症、軟骨皮膚炎（ｃｈｏｎｄｒｏｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｈｅｌｉｃｉｓ）、クラーク氏母斑、口唇ヘルペス、コンジローマ、包嚢、ダリエー病、皮膚線維腫、円板状エリテマトーデス、貨幣状湿疹、アトピー性湿疹、異汗性湿疹、手湿疹、多形結節性紅斑、フォーダイス病、項部息肉性毛嚢炎、毛包炎、環状肉芽腫、グロヴァー病、あせも、単純ヘルペス症、帯状疱疹、化膿性汗腺炎、じんましん、多汗症、魚鱗癬、膿痂疹、毛孔性角化症、ケロイド、ケラトアカントーマ、扁平苔癬、扁平苔癬様角化症、慢性単純性苔癬、硬化性苔癬、リンパ腫様丘疹症、皮膚狼瘡、ライム病、線状苔癬、粘液様嚢胞、菌状息肉症、伝染性軟属腫、母斑、爪水虫、糖尿病性リポイド類壊死症、貨幣状湿疹、爪甲層状分裂症、爪真菌症、苔癬状粃糠疹、ばら色粃糠疹、毛孔性紅色粃糠疹、足底疣贅、ツタウルシかぶれ（Ｐｏｉｓｏｎ Ｉｖｙ）、ウルシかぶれ（Ｐｏｉｓｏｎ Ｏａｋ）、汗疱、須毛部仮性毛包炎、肛門そう痒症および白色粃糠疹が挙げられるが、これらに限定されるものではない。創傷はその深度によって、典型的には４つのグレードの１つに分類される。（ｉ）グレードＩ：上皮に限定された創傷、（ｉｉ）グレードＩＩ：真皮に達する創傷、（ｉｉｉ）グレードＩＩＩ：皮下組織に達する創傷、そして（ｉｖ）グレードＩＶ（または全層創傷）：骨が露出される創傷（例：大転子または仙骨等の骨性圧覚点）である。
【0168】
「表層創傷（ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｗｏｕｎｄ）」という用語は、本願において、グレードＩ～ＩＩＩを含む創傷を意味し、火傷、圧迫創、静脈うっ血潰瘍、および糖尿病性潰瘍が挙げられる。
【0169】
「深創傷」という用語は、本願において、グレードＩＩＩおよびＩＶの両方を含む創傷を意味する。
【0170】
「慢性創傷」という用語は、本願において、３０日以内に治癒しなかった創傷を意味する。
【0171】
創傷に対する「治癒」という用語は、例えば、瘢痕形成（例示的な実施形態においては、治癒は線維化組織形成を欠く）による、創傷の修復過程を意味する。
【0172】
特定の実施形態において、本発明のいくつかの実施形態における組成物は、治癒過程を促進、即ち、加速する。
【0173】
「皮膚創傷の治癒過程を誘導または加速する」という句は、創面収縮における肉芽組織形成の誘導、および／または上皮化（即ち、上皮における新しい細胞の産生）のいずれかを意味する。創傷治癒は創傷面積の減少によって容易に測定される。
【0174】
本発明の特定の実施形態は、深創傷、急性創傷、慢性創傷、糖尿病関連創傷、虚血性創傷、潰瘍、火傷および手術創を含む、全種類の創傷の処置を想定している。
【0175】
特定の実施形態によると、創傷は、慢性創傷、急性創傷、糖尿病性創傷、虚血性創傷、潰瘍、火傷および手術創からなる群より選ばれる。
【0176】
特定の実施形態において処置し得る追加の疾患および異常としては、非ケトン性高浸透圧性昏睡、ウイルス感染［例：帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）］、アテローム動脈硬化症、高血圧症、先天性心疾患等の心血管障害、心筋症、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、共通房室（Ａ－Ｖ）弁口欠損症、動脈管（ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、心筋梗塞、結節性硬化症、強皮症、移植、子宮内膜症、不妊症、フォンヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）症候群、硬変症、移植、血友病、凝固亢進症、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、網膜色素変性（常染色体優性）、網膜色素変性症（常染色体劣性）、パキスタン型ＳＥＭＤ、尿路顔症候群、コレステロールエステル蓄積症、ティール－ベーンケ型角膜ジストロフィー、デュビン・ジョンソン症候群、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、感覚性ニューロパチーを伴う症に発症性脊髄小脳失調症、スプリットハンド／フット奇形症３型、トルブダミド低代謝群、ワーファリン感受性、ウォルマン病、前眼部形成異常および白内障、先天性白内障、神経線維肉腫、非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）および増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）等の網膜障害、慢性腎不全、糖尿病性腎症、糖尿病性神経症等の神経損傷、微小血管損傷、糖尿病関連足部潰瘍並びに移植片対宿主病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0177】
「処置する」という用語は、病理（疾患、異常または病態）の発生の阻害、予防または阻止、および／または病理の減少、緩和または退縮を引き起こすことを意味する。当業者は、病理の発生を評価するために種々の方法論およびアッセイが使用できることを理解し、同様に、病理の減少、緩和または退縮を評価するために種々の方法論およびアッセイを使用することができる。処置は単独で、あるいは他の療法と組み合わせて実施することができる。
【0178】
本願で使用する「予防」という用語は、疾患のリスクを有し得るが、疾患を発症したとは診断されていない対象において、疾患、異常または病態の発生を抑えることを意味する。
【0179】
本願で使用する「対象」という用語は、任意の性別および任意の年齢の哺乳動物対象（例：ヒト）であり、新生児、乳児、若年層、青年層、成人および老年が含まれる。
【0180】
特定の実施形態によると、対象は上記病態と診断されたもの、患うもの、素因を有するものである。
【0181】
特定の実施形態によると、後述するように、対象の生物学的サンプル中のＩＤＥレベルは、対照生物学的サンプルと比べて、予め定めた閾値を超える。
【0182】
従って、特定の実施形態によると、本願で開示する方法は、投与の前に、本願で開示する抗体を用いて対象の生物学的サンプル中のＩＤＥレベルを決定することを含む。
【0183】
本発明のいくつかの実施形態における抗体は、そのままでまたは医薬組成物の一部として、対象に投与され得る。
【0184】
本発明の一態様によると、活性成分として本願で開示する抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を含み、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物が提供される。
【0185】
本明細書で使用される「医薬組成物」とは、本明細書に記載の１種以上の有効成分と生理学的に適切な担体や賦形剤等の他の化学成分とからなる調製物を意味する。医薬組成物の目的は化合物の生物への投与を容易にすることである。
【0186】
本明細書において「有効成分」という用語は、生物学的効果に実効的に関与する抗体を意味する。
【0187】
以下、互換的に使用される「生理学的に許容される担体」と「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に対して重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性および特性を抑制しない担体又は希釈剤を意味する。このような語句にはアジュバントが含まれている。
【0188】
本明細書において「賦形剤」という用語は、医薬組成物に添加して有効成分の投与を更に容易にする不活性物質を意味する。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および各種デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0189】
薬物の処方と投与の技法については、“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PAの最新版（本参照をもってここに援用する）に記載されている。
【0190】
適切な投与経路としては、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達（特に経鼻送達）、腸管送達又は非経口送達が挙げられ、例えば、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射が挙げられると共に、髄腔内注射、直接心室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、又は眼内注射を挙げることができる。
【0191】
或いは、例えば、患者の組織領域に直接医薬組成物を注射することによって、全身的ではなく局所的に医薬組成物を投与することができる。
【0192】
特定の実施形態によると、本発明の抗体は経鼻投与によって投与される。
【0193】
特定の実施形態によると、本発明の抗体は皮下投与によって投与される。
【0194】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で良く知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、粉末化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【0195】
よって、本発明の幾つかの実施形態に従って使用する医薬組成物は、薬学的に使用可能な調製物への有効成分の加工を容易にする、賦形剤および助剤を含む１種以上の生理学的に許容される担体を使用して従来の方法で処方することができる。適切な製剤は選択する投与経路によって決まる。
【0196】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩緩衝液等の生理的に適合性のある緩衝液に処方することができる。経粘膜投与の場合、浸透するバリアに適した浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当技術分野では一般に知られている。
【0197】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野で良く知られている薬学的に許容される担体と組み合わせて容易に処方することができる。そのような担体によって、患者が経口摂取できるように医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤等として処方することができる。経口使用のための薬理学的調製物は固体賦形剤を使用して作製し、必要に応じて得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理して錠剤又は糖衣錠コアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールを含む糖等の充填剤、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロース等のセルロース調製物、および／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の生理学的に許容されるポリマーである。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）等の崩壊剤を添加することができる。
【0198】
糖衣錠コアには適切なコーティングを設ける。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒又は溶媒混合物を必要に応じて含み得る濃縮糖溶液を使用することができる。染料又は顔料を錠剤又は糖衣錠コーティングに添加して識別に用いたり、活性化合物用量の様々な組み合わせを特徴付けたりすることができる。
【0199】
経口使用可能な医薬組成物としては、ゼラチンで形成されたプッシュフィットカプセルや、ゼラチンとグリセロールやソルビトール等の可塑剤で形成されたソフトシールカプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルには、有効成分と混合して、ラクトース等の充填剤、デンプン等のバインダー、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、および必要に応じて安定剤を配合することができる。ソフトカプセルにおいては、有効成分を適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール）に溶解又は懸濁することができる。更に安定剤を添加することができる。経口投与用の全ての製剤は、選択した投与経路に適した投与形態とすべきである。
【0200】
口腔内投与の場合、組成物は従来の方法で処方された錠剤又はトローチの形態をとることができる。
【0201】
経鼻吸入による投与の場合、本発明に係る使用のための有効成分は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素）を使用して、加圧パック又はネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で簡便に送達する。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するバルブを設けることによって投与単位を決定することができる。ディスペンサーで使用する、例えば、ゼラチンのカプセルおよび薬包は、化合物と適切な粉末基剤（例えば、ラクトースやデンプン）との粉末混合物を含むように処方することができる。
【0202】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、ボーラス注射又は持続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は単位剤形、例えば、アンプルで供給するか、又は必要に応じて防腐剤を添加した複数回投与容器で供給することができる。組成物は油性ベヒクル又は水性ベヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液とすることができ、懸濁剤、安定剤および／又は分散剤などの調合剤を含むことができる。
【0203】
非経口投与用の医薬組成物には水溶性の活性製剤の水溶液が含まれる。更に、有効成分の懸濁液は適切な油性又は水ベースの注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はベヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド又はリポソーム等の合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン等の懸濁液の粘度を上昇させる物質を含むことができる。必要に応じて、懸濁液は、有効成分の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は薬剤を含むこともできる。
【0204】
或いは、有効成分は、使用前に適切なベヒクル（例えば、無菌でパイロジェンフリーの水ベースの溶液）で構成するための粉末形態とすることができる。
【0205】
本発明の医薬組成物は、例えば、カカオバターや他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を使用して坐剤又は保持浣腸等の直腸組成物に処方することもできる。
【0206】
本発明の状況での使用に適した医薬組成物としては、本来の目的を達成するのに有効な量の有効成分（即ち、抗体）を含む組成物が挙げられる。より具体的には、治療有効量とは、障害（例えば、ＩＤＥ関連疾患）の症状を予防、緩和又は改善するか、又は治療される対象の生存を延長するのに有効な有効成分の量を意味する。
【0207】
本発明の別の実施形態によると、治療有効量は、投与後の対象の血中インスリンレベルを増加させる。
【0208】
本発明の別の実施形態によると、治療有効量は、投与後の対象の膵臓ベータ細胞破壊を減少させる。
【0209】
本発明の別の実施形態によると、治療有効量は、投与後の対象の血中インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）レベルを増加させる。
【0210】
本発明の別の実施形態によると、治療有効量は、投与後の対象のＴリンパ球によるＩＬ－１７の分泌を減少させる。
【0211】
本発明の別の実施形態によると、治療有効量は、投与後の対象のＴリンパ球によるＩＦＮ－γの分泌を減少させる。
【0212】
インスリン、ＩＧＦ１、ＩＬ－１７またはＩＦＮ－γのレベルの評価は、当業者に公知の任意の方法（例えば、ＥＬＩＳＡが挙げられる）を用いて実施されてもよい。
【0213】
膵臓ベータ細胞の破壊の評価は、当業者に公知の任意の方法（例えば、β細胞機能の測定（例：Ｃ－ペプチド等の代謝マーカーレベルの測定が挙げられる）、またはβ細胞隗の画像化［例：エミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）または単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる］を用いて実施されてもよく、これら方法はLebastchi J. and Herold K.C., Cold Spring Harb Perspect Med. June 2012; 2(6): a007708に教示されており、本参照をもってここに援用する。
【0214】
本発明の別の実施形態によると、治療有効量は、ＩＤＥ活性の阻害または減少をもたらす。ＩＤＥ活性の阻害または減少は、ＩＤＥ活性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の減少を含んでもよい。ＩＤＥ活性減少の評価は、当業者に公知の任意の方法（例えば、蛍光定量ＩＤＥ活性アッセイまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのインスリンおよびＩＧＦ－１分解アッセイが挙げられる）を用いて実施されてもよく、これらの方法は後述する実施例の項に詳細に記載されている。
【0215】
治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内である。
【0216】
本発明の方法で使用される任意の調製物の場合、治療有効量又は用量は先ずｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、動物モデルにおいて用量を処方して所望の濃度又は力価を得ることができる。このような情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【0217】
本明細書に記載の有効成分の毒性および治療効果は、細胞培養物又は実験動物においてｉｎ ｖｉｔｒｏでの標準的な製薬手順によって確認することができる。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを用いて、ヒトで使用する範囲の投与量を処方することができる。投与量は使用する剤形および利用する投与経路に応じて変わり得る。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる（例えば、“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1内のFingl, et al., 1975を参照）。
【0218】
投与量と投与間隔は個別に調整して、生物学的効果を誘発又は抑制するのに十分な有効成分の血漿レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を得ることができる。ＭＥＣは調製毎に変わるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータから推定することができる。ＭＥＣを得るのに必要な投与量は、個々の特性と投与経路によって決まる。検出アッセイを用いて血漿中濃度を確認することができる。
【0219】
治療される病態の重症度および応答性に応じて、投薬は単回又は複数回の投与とすることができ、治療の過程は数日間から数週間、又は治癒がもたらされるか又は病状が抑制されるまで続く。
【0220】
当然のことながら、投与される組成物の量は、治療される対象、苦痛の重度、投与方法、処方医師の判断等に依存する。
【0221】
例えば、一実施形態において、本発明の抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇの間の用量、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの間の用量、１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの間の用量、２．５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの間の用量、０．５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの間の用量または５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの間の用量を静脈注射（ｉ．ｖ．）してもよい。別の実施形態において、本発明の抗体は、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの間の用量、１０ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの間の用量、２５ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの間の用量または５０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの間の用量をｉ．ｖ．で投与してもよい。別の実施形態において、本発明の抗体は、１００ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇの間の用量、１００ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇの間の用量、２５０ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇの間の用量または５００ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇの間の用量をｉ．ｖ．で投与してもよい。
【0222】
ヒトの治療の前に本発明の抗体を試験することのできる動物モデルが存在すること理解されたい。例えば、糖尿病のＳＴＺ誘導性または非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルを糖尿病のモデルとして使用してもよい。多発性硬化症動物モデルとしては、例えば、マウスＥＡＥモデル（例：ＣＦＡ中のＭＯＧ（３５－５５）による免疫によってＮＯＤマウスに疾患を誘導したもの）が挙げられる。アルツハイマー氏病動物モデルとしては、例えば、ＡＰＰ／ＰＳＩマウスおよびＳａｍａｒｉｔａｎアルツハイマーラットモデル（Ｓａｍａｒｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社より入手可）が挙げられる。創傷の治癒については、Galeano et al., Diabetes. (2004) 53(9):2509-17（参照によって援用する）によって既出の糖尿病マウス創傷モデル、またはQiu et al., J Surg Res. (2007) 138(1):64-70（参照によって援用する）によって既出の糖尿病ラットモデルが挙げられる。パーキンソン氏病動物モデルとしては、例えば、ＣＮＳニューロン内に変異アルファシヌクレインを発現するＡ５３Ｔ Ｔｇマウス（Giasson et al. 2002）およびＣ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（Ｔｈｙ１－ＳＮＣＡ＊Ｅ３５Ｋ＊Ｅ４６Ｋ＊Ｅ６１Ｋ）３７９８Ｎｕｂｅｒ／Ｊ（Nuber et al., 2018）が挙げられる。
【0223】
本発明の組成物は、必要に応じて、ＦＤＡ承認キット等のパック又はディスペンサー装置として提供することができ、有効成分を含む１種以上の単位剤形を含むことができる。パックは、例えばブリスターパックのように、金属又はプラスチック箔を含むことができる。パック又はディスペンサー装置には投与説明書を添付することができる。パック又はディスペンサーは、医薬品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の容器に関する通知が添付される場合もあり、この通知は、組成物の形態又はヒトや動物への投与に関する政府機関による承認を反映している。このような通知は、例えば、処方薬に関して米国食品医薬品局が承認した表示、又は承認された製品挿入物に関するものとすることができる。適合性のある医薬担体に処方された本発明の調製物を含む組成物については、上で更に詳述したように、調製し、適切な容器に入れ、表示された病態の治療用にラベルを貼ることもできる。
【0224】
本発明の治療用組成物は抗体に加えて、ＩＤＥ関連疾患（例：糖尿病、ＣＮＳの自己免疫疾患、神経変性疾患）の治療用の公知の薬剤または治療薬（例えば、ステロイド、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、抗ヒスタミン剤等が挙げられるが、これらに限定されない）を含んでもよいことを理解されたい。薬剤は単一のパッケージまたは個別のパッケージとして製品に含まれ得る。
【0225】
従って、本発明の一態様によると、本願で開示する抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）と、前記疾患の治療用の治療薬とを含む、ＩＤＥ活性関連疾患の治療用と定められた製品が提供される。
【0226】
特定の実施形態によれば、抗体と治療薬は別々の容器に包装される。
【0227】
特定の実施形態によれば、抗体と治療薬は共処方（ｃｏ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）として包装される。
【0228】
さらに、特定の実施形態によると、本願で開示する方法および使用は、対象に対して疾患を治療するための（本願で開示する抗体以外の）治療薬を投与することをさらに含む。
【0229】
後述する実施例の項に示したように、本発明者らは、作製した抗体を用いて高感度ＥＬＩＳＡを開発し、ヒト血清ＩＤＥレベルと、メタボリックシンドロームの存在および／または重症度との強い相関性を示すために、このＥＬＩＳＡを使用した。よって、本発明の特定の実施形態は、診断、治療有効性のモニタリングおよび／または治療の決定を目的として、ＩＤＥレベルを解析する方法をさらに提案する。
【0230】
従って、本発明の一態様によると、対象のＩＤＥ活性関連疾患を診断する方法であって、本願で開示する抗体を用いて対象の生物学的サンプルのＩＤＥレベルを決定することを含み、対照生物学的サンプルと比べて、前記ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えることをもって、前記対象を前記疾患と診断する方法が提供される。
【0231】
本願で使用する「診断する」という用語は、病理の存在または不存在の決定（即ち、癌がユーイング腫瘍であるか）、病理または症状の分類、病理の重症度の決定（例：グレードまたはステージ）、病理の進行のモニタリング、病理の結果および／または回復の見込みの予測、並びに特定の疾患に対する対象のスクリーニングを意味する。
【0232】
よって、本発明の一態様によると、対象のＩＤＥ活性関連疾患の予後判定を行うための方法であって、疾患を有すると診断された対象の生物学的サンプル中のＩＤＥレベルを開示した抗体を用いて決定することを含み、前記ＩＤＥレベルが対照生物学的サンプルと比べて、予め定めた閾値を超えることをもって予後を予後不良と判定する方法が提供される。
【0233】
特定の実施形態によると、方法（例：決定、接触）はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施する。
【0234】
特定の実施形態によると、本願で開示する方法は、決定の前に生物学的サンプルを得ることを含む。
【0235】
本発明のいくつかの実施形態において使用可能な生物学的サンプルの非限定的な例としては、任意の組織生検から得られた細胞、組織、器官、血液細胞、骨髄細胞、血液、血清、血漿、および罹患細胞/組織と接触した可能性のある濯ぎ液等の体液が挙げられる。
【0236】
生物学的サンプルは、当業界で公知の方法、例えば、針付きの注射器、外科用メス、細針生検、針生検、コア針生検、細針穿刺吸引（ＦＮＡ）、外科生検、頬側スミア、洗浄等の使用が挙げられる。
【0237】
特定の実施形態によると、タンパク質分子は対象の生物学的サンプルから抽出する。よって、特定の実施形態によると、方法は、決定の前に、生物学的サンプルからタンパク質を抽出することをさらに含む。タンパク質分子を生物学的サンプルから抽出する方法は当業界でよく知られている。
【0238】
本願において使用する「予め定めた閾値」という句は、健常サンプル、または同一条件下で解析した、同一由来の公知の疾患予後を示すサンプルを特徴づけるＩＤＥレベルを意味する。このようなレベルは、公知のＩＤＥレベルのサンプル（例：健常な対象、または疾患予後の分かっている対象から得たサンプル）をＩＤＥ活性関連疾患と診断された対象由来のサンプルと比べることで実験的に決定することができる。代わりに、このようなレベルは、科学論文またはデータベースから得ることもできる。
【0239】
特定の実施形態によると、予め定めた閾値は、対照サンプルから誘導したものである。
【0240】
複数の対照サンプルを特定の実施形態において使用し得る。
【0241】
生物学的特徴は様々な要因の中でも、種と年齢に依存するため、対照サンプルは、同じ種、年齢、性別であり、および同じ副集団（例：喫煙群／非喫煙群）に属する対象から得たものであることが好ましい。
【0242】
特定の実施形態によると、対照サンプルは、対象の生物学的サンプルと同じ種類の生物学的サンプルを含む。
【0243】
特定の実施形態によると、対照サンプルは、健常対象サンプルである。
【0244】
特定の実施形態によると、対照サンプルは、軽い疾患または良好な予後を示す疾患を有する対象から得たサンプルである。
【0245】
特定の実施形態によると、対照サンプルは、科学論文またはデータベースから入手する。
【0246】
特定の実施形態によると、予め定めた閾値を超えるか下回る増加／減少は統計的に有意である。
【0247】
特定の実施形態によると、予め定めた閾値は、同じアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＩＰ）で測定したとき、対象サンプルのＩＤＥレベルと比べて、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍である。
【0248】
特定の実施形態によると、予め定めた閾値は、対象サンプルのＩＤＥレベルと比べて、少なくとも１．５倍である。
【0249】
特定の実施形態によると、予め定めた閾値は、対象サンプルのＩＤＥレベルと比べて、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、例えば、１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％である。
【0250】
特定の実施形態によると、生物学的サンプル中のＩＤＥレベルは、本願で開示する抗体を使用する任意の公知の方法を使用して決定することができ、当該方法としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＩＰが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0251】
よって、いくつかの実施形態によると、ＩＤＥレベルの検出は、生物学的サンプル、組織、細胞または画分あるいはこれらの抽出物を本願に開示する抗体と接触させることによって実施する。
【0252】
特定の実施形態によると、生物学的サンプル中に存在するＩＤＥと、抗体とを含む複合体（即ち、免疫複合体）の形成を可能にする条件下で接触を実施する。
【0253】
免疫複合体は、種々の温度、塩濃度およびｐＨ値で形成することができ、これらは使用される方法および生物学的サンプルに応じて変化し得るが、当業者は、各免疫複合体に適した条件を調製することができる。
【0254】
よって、本発明の一態様によると、ＩＤＥ活性関連疾患と診断された対象の生物学的サンプル（または対象の生物学的サンプルの溶解物）と、本願で開示した抗体とを含む組成物が提供される。
【0255】
本発明の追加のまたは代替の態様によると、ＩＤＥ活性関連疾患と診断された対象の生物学的サンプル（または対象の生物学的サンプルの溶解物）と、別の容器に入った、本願で開示した抗体とを含む製品が提供される。
【0256】
特定の実施形態によると、組成物または製品は、プロテアーゼ阻害剤をさらに含む。
【0257】
特定の実施形態によると、組成物または製品は、抗体に結合可能な二次抗体をさらに含む。
【0258】
特定の実施形態によれば、本願で開示する抗体は検出可能部分に結合している。
【0259】
本発明で使用することができる検出可能部分の例としては、放射性同位体、リン光化学物質、化学発光化学物質、蛍光化学物質、酵素、蛍光ポリペプチド、放射性同位体（［１２５］ヨウ素等）およびエピトープタグが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能部分は、結合対のメンバー（これは結合対の更なるメンバーとの相互作用によって同定可能である）および直接視覚化される標識とすることができる。一例では、結合対のメンバーは対応する標識抗体によって同定される抗原である。一例では、標識は比色反応を生じる蛍光タンパク質又は酵素である。
【0260】
適切なフルオロフォアの例としては、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、サイクロム、ローダミン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、テキサスレッド、ＰＥ－Ｃｙ５等が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアの選択に関する更なるガイダンス、フルオロフォアを様々な種類の分子に結合する方法については、Richard P. Haugland, “Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994”, 5th ed., Molecular Probes, Inc. (1994)、米国特許第６，０３７，１３７号明細書（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｉｎ Ｉｎｃ．）、Hermanson, “Bioconjugate Techniques”, Academic Press New York, N.Y. (1995); Kay M. et al., 1995. Biochemistry 34:293; Stubbs et al., 1996. Biochemistry 35:937; Gakamsky D. et al., “Evaluating Receptor Stoichiometry by Fluorescence Resonance Energy Transfer,” in “Receptors: A Practical Approach,” 2nd ed., Stanford C. and Horton R. (eds.), Oxford University Press, UK. (2001)、米国特許第６，３５０，４６６号明細書（Ｔａｒｇｅｓｏｍｅ，Ｉｎｃ．）］を参照。
【0261】
多数種の酵素を抗体に結合させることができる［例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）、βガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）］。
【0262】
同定可能な部分の例としては、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ヒスチジンタグ、ビオチン、橙色蛍光タンパク質およびストレプトアビジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0263】
検出可能部分の更なる例としては、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって検出可能なものが挙げられるが、これらは全て当業者には良く知られている。
【0264】
幾つかの実施形態によれば、検出可能部分は、本明細書に開示の抗体をコードするポリヌクレオチドを、治療用部分又は検出可能部分をコードする核酸配列と翻訳的に融合させて結合する。
【0265】
加えて又は代替的には、治療用部分又は検出可能部分は、当業者に公知の任意の結合方法を用いて抗体に化学的に結合（カップリング）することができる。
【0266】
特定の実施形態によると、本願で開示する方法は、当業界の公知技術を用いて診断を強化することを含む。このような方法は当業界で知られており、非限定的な例には、糖尿病用の空腹時血糖試験またはＡ１ｃ血液試験が含まれる。
【0267】
特定の実施形態によると、診断方法は、診断された対象を疾患のための有効量の療法で処置することをさらに含む。
【0268】
従って、本発明の一態様によると、ＩＤＥ活性関連疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）当該方法によって対象を診断し、ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えたとき、
（ｂ）対象を疾患用の療法で治療する
ことを含む、それによって対象の疾患を治療する方法が提供される。
（ａ）当該方法によって対象を診断し、ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えたとき、
（ｂ）対象を疾患用の療法で治療する
ことを含む、それによって対象の疾患を治療する方法が提供される。
【0269】
本発明者らによってＩＤＥはメタボリックシンドロームの予後マーカーとなることが示されたため、ＩＤＥレベルは、対象に適した治療レジメン（例：種類、用量）の選択に使用され得る。即ち、予後の不良な疾患は、予後不良に適した治療レジメンで処置され、予後の良好な疾患は、良好な予後に適した治療レジメンで処置される。特定の実施形態によると、ＩＤＥレベルは、対象が与えられた療法に対して応答し得る傾向を示すことができる。
【0270】
よって、本発明の追加のまたは代替の態様によると、ＩＤＥ活性関連疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）当該方法によって対象を診断し、ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えたとき、
（ｂ）ＩＤＥレベルに基づき療法を選択する
ことを含む、それによって対象の疾患を治療する方法が提供される。
（ａ）当該方法によって対象を診断し、ＩＤＥレベルが予め定めた閾値を超えたとき、
（ｂ）ＩＤＥレベルに基づき療法を選択する
ことを含む、それによって対象の疾患を治療する方法が提供される。
【0271】
本発明の追加のまたは代替の態様によると、ＩＤＥ活性関連疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）方法によって対象の予後判定を行い、そして
（ｂ）予後判定に基づく療法で対象を治療することを含む方法が提供される。
（ａ）方法によって対象の予後判定を行い、そして
（ｂ）予後判定に基づく療法で対象を治療することを含む方法が提供される。
【0272】
本発明の追加のまたは代替の態様によると、ＩＤＥ活性関連疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
（ａ）方法によって対象の予後判定を行い、そして
（ｂ）予後判定に基づき、療法を選択することを含む方法が提供される。
（ａ）方法によって対象の予後判定を行い、そして
（ｂ）予後判定に基づき、療法を選択することを含む方法が提供される。
【0273】
特定の実施形態によると、療法は本願で開示した抗体（ｉｉ）または（ｉｉｉ）を含む。
【0274】
本発明の追加のまたは代替の態様によると、ＩＤＥ活性関連疾患と診断された対象における当該疾患に対する療法の有効性をモニタリングするための方法であって、本願で開示した抗体を用いて、治療中または治療後の対象の生物学的サンプルのＩＤＥレベルを決定することを含み、治療中または治療後のＩＤＥレベルが予め定めた閾値より低下したことをもって、当該療法を有効とする、方法が提供される。
【0275】
よって、ＩＤＥレベルの減少は、療法が有効であることの指標となる。
【0276】
一方、ＩＤＥレベルに変化がない、またはＩＤＥレベルが増加した場合には、療法は疾患の治療に対して有効ではなく、追加および／または代わりの療法（例：治療レジメン）を使用することができる。
【0277】
本願で開示するモニタリングの態様の特定の実施形態によると、予め定めた閾値は、治療前の対象におけるＩＤＥレベルと比較する。
【0278】
本願で開示するモニタリングの態様の特定の実施形態によると、予め定めた閾値は、同じアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＩＰ）で測定したとき、対照サンプルまたは治療前の対象におけるＩＤＥレベルと比べて、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍である。
【0279】
特定の実施形態によると、予め定めた閾値は、対照サンプルまたは治療前の対象におけるＩＤＥレベルと比べて、少なくとも１．５倍である。
【0280】
特定の実施形態によると予め定めた閾値は、対照サンプルまたは治療前の対象におけるＩＤＥレベルと比べて、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、例えば、１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％である。
【0281】
本発明のこの態様の他の特定の実施形態によると、予め定めた閾値は、治療結果の知られている対象の部分集団で決定することもできる。
【0282】
本発明のさらに追加の態様によると、本願で開示した抗体と、それとは別の容器のＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、またはＩＰに適した試薬と、ＥＬＩＳＡプレートおよび／またはＩＤＥを含む陽性対照サンプルとを含む製品が提供される。
【0283】
本明細書で使用する「約」は、±１０％を指す。
【0284】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する。
【0285】
「からなる」という用語は、「含み、限定される」ことを意味する。
【0286】
「から実質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。但しこれは、追加の成分、工程および／または部分が、請求項に記載の組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
【0287】
本明細書において、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数をも対象とする。例えば、「化合物（a compound）」または「少なくとも１種の化合物」には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物をも含み得る。
【0288】
本願全体を通して、本発明のさまざまな実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限ではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な下位の範囲の全部、およびその範囲内の個々の数値を特異的に開示していると考えるべきである。例えば、１～６といった範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５および６も具体的に開示するものとする。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。
【0289】
本明細書において数値範囲を示す場合、それは常に示す範囲内の任意の引用数（分数または整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という表現は、本明細書で代替可能に使用され、第１の指示数および第２の指示数と、それらの間の分数および整数の全部を含むことを意図する。
【0290】
本明細書で使用する「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学および医療の各分野の従事者に既知のもの、または既知の様式、手段、技術および手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されない。
【0291】
明確さのために別個の実施形態に関連して記載した本発明の所定の特徴はまた、１つの実施形態において、これら特徴を組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために１つの実施形態に関連して記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、または任意の好適な部分的な組み合わせ、または適当な他の記載された実施形態に対しても提供され得る。さまざまな実施形態に関連して記載される所定の特徴は、その要素なしでは特定の実施形態が動作不能でない限り、その実施形態の必須要件であると捉えてはならない。
【0292】
上述したように、本明細書に記載され、特許請求の範囲に請求される本発明のさまざまな実施形態および態様は、以下の実施例によって実験的に支持されるものである。
【実施例】
【0293】
ここで、上記の記載と共に本発明を限定することなく説明する以下の実施例に参照する。
【0294】
一般に、本明細書で使用される命名法や本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989)、“Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号明細書に記載の方法、“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、“Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980)、利用可能なイムノアッセイは特許および科学文献に広く記載されている（例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号明細書参照）、“Oligonucleotide Synthesis“ Gait, M. J., ed. (1984)、“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、 “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984)、“Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986)、“Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986)、“A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984)、並びに“Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press、“PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)が挙げられる。これら文献の全てを参照によってここに援用する。他の一般的な参考文献は明細書を通じて提供される。そこに記載の手順は、当技術分野で良く知られていると考えられており、読者の便宜のために提供される。そこに含まれる全ての情報を参照によってここに援用する。
【0295】
材料および方法
マウス： Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をテルアビブ大学内の特定の病原フリーな施設で飼育した。全ての実験がテルアビブ大学のガイドラインに沿っており、動物実験に関するＴＡＵ動物ケア委員会（ＴＡＵ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ）の許可を得て実施された。
マウス： Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をテルアビブ大学内の特定の病原フリーな施設で飼育した。全ての実験がテルアビブ大学のガイドラインに沿っており、動物実験に関するＴＡＵ動物ケア委員会（ＴＡＵ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ）の許可を得て実施された。
【0296】
ＩＤＥベクターの作製と発現： 細菌発現用に最適化した野性型（ＷＴ）およびＥ１１１Ｑ組換えヒトＩＤＥ（ｒｈＩＤＥ）の配列をＧｅｎｅｗｉｚ社（米国、ニュージャージ州、サウスプレインフィールド）に発注し、ｐＵＣ５７ベクターのＮｄｅＩ制限部位とＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間に入った形で受け取った。ベクターは、Ｎｉ－ＮＴＡ結合タグに融合されたｒｈＩＤＥと、Ｃ末端のＨｉｓタグをコードする。Ｒｏｓｅｔｔａ ＢＬ２１ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞をｐＥＴ２８ａ－ｒｈＩＤＥ発現ベクター（ＷＴおよびＥ１１１Ｑ）で形質転換し、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した０．５ＬのＬＢ培地でＯＤ６００ｎｍ＝０．６～０．８まで培養した。次に、培養物のタンパク質発現を、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより３０℃で一晩誘導した。細胞を９０００ｒｐｍで１５分の遠心分離で回収した。ペレットを０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む３５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、３０秒の超音波処理と２分間の氷上の静置とを５回繰り返すことで融解した。可溶性画分を４℃、１２０００ｒｐｍで３０分の遠心分離で透明化し、ＧＥ ＨｉｓＴｒａｐの５ｍｌのカラムにロードした。カラムをＰＢＳ中の５ｍＭのイミダゾールで洗浄し、ＰＢＳ中の０．５Ｍのイミダゾールで溶出させた。精製ＩＤＥタンパク質をＰＢＳに対して透析し、２ｍｇ／ｍｌのＰＢＳおよび５％のグリセロールで希釈し、－８０℃で保存した。
【0297】
バイオパニング： Azriel-Rosenfeld et al. J Mol Biol. (2004) 335(1):177-192に既出の“Ｒｏｎｉｔ１”ヒト合成抗体ファージディスプレイライブラリーを用いたファージディスプレイ技術を使用した。２４穴プレートのウェルを室温で２時間被覆するために使用した１０μｇ／ｍｌのＷＴ ｒｈＩＤＥ上でライブラリーを４回の親和性選択サイクルに付し、ＷＴ ＩＤＥは餌として使用した。そのうちの２回のサイクル（サイクル１とサイクル３）においては、ＷＴ酵素の触媒部位に高い親和性で結合する抗体を単離することを意図して、変異したＥ１１１Ｑ ＩＤＥを餌として使用せずに枯渇を実施した。１０μｇ／ｍｌの変異ＩＤＥを２４穴プレートのウェルを室温で２時間被覆するために使用した。３ｍｌのＰＢＳでウェルを１回洗浄し、スキムミルクの３％滅菌ＰＢＳ溶液で３７℃で１時間ブロッキングした。３ｍｌのＰＢＳでウェルを１回洗浄し、ブロックされた変異ＩＤＥ被覆ウェルに２５℃で１時間、ファージをアプライした。続いて、ＷＴ ｒｈＩＤＥで被覆したウェルも同様にスキムミルクの３％ＰＢＳ溶液でブロッキングし、３ｍｌのＰＢＳでウェルを１回洗浄し、変異ＩＤＥウェルのファージ（枯渇されたファージ）をＷＴ ｒｈＩＤＥウェルに移してさらに２５℃で１時間静置した。各親和性選択サイクルの終わりには、結合ファージを１００ｍＭのＴＥＡ、ｐＨ＝１３、で溶出させ、直ちに１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４、で中和した。溶出されたファージは、ＸＬ１－ｂｌｕｅ Ｅ． ｃｏｌｉの感染に使用され、クローン増殖のために対数増殖期まで培養した。選択のインプットおよびアウトプットのファージの力価は、各ファージクローンのコピーの決定を可能にした。後に感染E. coliの１０１０ＣＦＵ／ｍｌのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージとの３７℃、２５０ＲＰＭで一晩のインキュベーションによって、各ファージクローンの２０～１００コピーを救出した。２０％のＰＥＧ／ＮａＣｌ中に細菌増殖上清からのウイルス粒子を沈殿させ、次の親和性選択（パニング）サイクルに使用する前にＰＢＳに懸濁した。４サイクルの親和性選択に続き、モノクローナルファージＥＬＩＳＡでＩＤＥ特異的ｓｃＦｖディスプレイファージを同定した。ファージＥＬＩＳＡにおいては、結合ファージの検出にＨＲＰ抗ｍ１３モノクローナル抗体結合（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＣＡＴ ２７－９４２１－０１）を使用した。結合物は、全てＳＩＧＭＡ社（現在のＭｅｒｃｋ社）から購入したいくつかの対照抗原［ＢＳＡ、Ｍｅｒｃｋ ＣＡＴ Ａ７０３０－５００Ｇ；リゾチーム（卵白リゾチーム）、Ｍｅｒｃｋ ＣＡＴ Ｌ６８７６；ストレプトアビジン（Streptomyces avidinii由来のストレプトアビジン）Ｍｅｒｃｋ ＣＡＴ Ｓ０６７７］に対する結合を試験することで、その特異性を立証した。立証された結合物を可溶性抗体の産生用に再フォーマット化し、以下の３種のフォーマットで試験した：ＭＢＰ－ｓｃＦｖ（図１の（Ｅ））、「インクローナル」として産生されたヒトＩｇＧ１（図１の（Ｆ））、および哺乳動物細胞培養で産生された逆キメラＩｇＧ（図１の（Ｇ））。
【0298】
シーケンシング： クローニングされた遺伝子のヌクレオチド配列は、ＡＢＩ ３５００ｘｌ遺伝子アナライザー（米国、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を販売社の推奨に従って使用し、決定した。クローニングされたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列は、ＡｐＥプログラム－プラスミドエディターｖ２．０．４７（ユタ大学、Wayne Davis）で解析した。抗体可変ドメイン配列の解析とフレームワークおよびＣＤＲ領域への帰属は、ＮＣＢＩのＩｇＢｌａｓｔツール（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｎｃｂｉ（ｄｏｔ）ｎｌｍ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ）で実施した。
【0299】
ＩＤＥ特異的「インクローナル」ＩｇＧの発現と精製： 全長「インクローナル」ＩｇＧの発現と再フォールディングは、［Hakim, R. and Benhar, I. (2009) MAbs 1, 281-287、Buchner, J. et al. (1992) Anal. Biochem. 205, 263-270、およびBenhar, I. and Pastan, I. (1994) Protein Eng. Des. Sel. 7, 1509-1515］に既出のプロトコルに従って実施した。
【0300】
ドットブロット： ドットブロットは［Mazor, Y. et al/ (2007) J. Immunol. Methods 321, 41-59］に既出の方法に従って実施した。簡単には、０．１～１μｇの精製タンパク質を含む、総量５０μｌのタンパク質サンプルで、未変性型または９５℃で５分間煮沸（変性条件）後のものを、真空マニホールドによってニトロセルロース膜にアプライし、スロットブロットＰＲ６４８ろ過マニホールド（米国、カリフォルニア州、サンフランシスコ、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用した。次に、ＴＢＳ中の５％ＢＳＡで室温、１時間のメンブランのブロッキングを行い、４℃のブロッキング溶液で希釈した３μｇ／ｍｌのＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）融合ｓｃＦｖｓ（後述する方法で製造）と一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、サンプルをマウス抗ＭＢＰ（ＴＢＳＴで１：５０００）と室温で１時間インキュベートし、続いて１回洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、１１５－０３５－００３）（ＴＢＳＴで１：５，０００）と室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴでさらに３回洗浄し、メンブランをＥＣＬ試薬（ＷＢＬＵＲ０５００、米国、マサチューセッツ州、ミルフォード、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を製造社の推奨法に従って現像し、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｉｍａｇｅｒ ６００（ペンシルバニア州、ピッツバーグ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で画像化し、ＩｍａｇｅＪ ｖ１．５ｉで解析した。
【0301】
ＩＤＥ特異的ＭＢＰ－ｓｃＦｖｓの産生： ＭＢＰ－ｓｃＦｖ ＩＤＥ特異的融合タンパク質のE. coliの細胞質発現のために発現ベクターを設計した。ファージディスプレイ親和性選択プロセスの終わりに特異的ＩＤＥ結合物と同定された全ｓｃＦｖの配列を、対応するｐＣＣ１６ファージミドベクターから得た。ｐＭＡＬｃ－ＮＨＮＮベクター［Birnboim-Perach, R. et al. (2019) Production of Stabilized Antibody Fragments in the E. coli Bacterial Cytoplasm and in Transiently Transfected Mammalian Cells. pp. 455-480, Humana Press, New York, NY］。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素による消化に続き、各ｓｃＦｖコード配列をｐＣＣ１６ファージミドから回収し、ｐＭＡＬｃ－ＮＨＮＮベクターのＮｃｏＩ制限部位とＮｏｔＩ制限部位との間に配列を連結した。ベクターは、Ｎｉ－ＮＴＡ結合タグＨｉｓタグに融合したＩＤＥ特異的ｓｃＦｖとＮ末端のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とをコードする。
【0302】
ＭＢＰ－ｓｃＦｖの産生には、Ｒｏｓｅｔｔａ ＢＬ２１ Ｅ． ｃｏｌｉ細胞をｐＭＡＬｃ－ＮＨＮＮ－ＭＢＰ－ＩＤＥ特異的－ｓｃＦｖ発現ベクターで形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した０．５ＬのＬＢ培地でＯＤ６００ｎｍ＝０．８まで増殖させた。続いて、培養物のタンパク質発現を、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより、３０℃で一晩誘導した。細胞を９０００ｒｐｍで１５分の遠心分離で回収した。ペレットを０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む３５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、３０秒の超音波処理と２分間の氷上の静置とを５回繰り返すことで融解した。可溶性画分を４℃、１２０００ｒｐｍで３０分の遠心分離で透明化し、ＧＥ ＨｉｓＴｒａｐの５ｍｌのカラムにロードした。カラムを、５ＣＶのＰＢＳ中の５ｍＭのイミダゾールおよび５ＣＶのＰＢＳ中の２０ｍＭのイミダゾールで洗浄し、ＰＢＳ中の２５０ｍＭのイミダゾールでカラムから溶出させた。精製ＭＢＰ－ｓｃＦｖ融合タンパク質をＰＢＳに対して透析し、２ｍｇ／ｍｌのＰＢＳで希釈し、－８０℃で保存した。
【0303】
脾細胞の調製： Ｃ５７ＢＬ／６マウスから回収した脾臓を氷上、０．１ｍＭのＤＴＴ、０．１ μＭのバナジン酸ナトリウム、０．５ｍＭのＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ）１：１００を添加した×１のＲＩＰＡ溶解バッファー 中でホモジェナイズし、２５℃で２０分間インキュベートした。上清を４℃、１２０００ＲＰＭで１０分の遠心分離で回収し、１００μｌ等量を－８０℃で保存した。
【0304】
逆キメラ抗マウスＩＤＥ抗体の製造： 抗体を完全長の逆キメラＩｇＧに変換するために、作製した抗体をコードするポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４プラスミド骨格にクローニングした。これらプラスミドは、一過性形質導入に基づく発現のためのＥｘｐｉ２９３（商標）キットの「抗体発現陽性対照ベクター」部分として提供されるＣＭＶプロモーター制御ｐｃＤＮＡ３．４ベクターに基づくものである。キットはＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、＃Ａ１４６３５）も提供する。ＩｇＧ発現ベクターへの抗体可変ドメインのクローニングの詳細な説明については既報［Birnboim-Perach, R et al. (2019) Production of Stabilized Antibody Fragments in the E. coli Bacterial Cytoplasm and in Transiently Transfected Mammalian Cells. pp. 455-480, Humana Press, New York, NY］がある。簡単には、ベクターをＥ． ｃｏｌｉ ＲｏｓｅｔｔａＢＬ２１細胞に発現させ、ＨｉｓＴｒａｐカラム（１７－５２４８－０１、スウェーデン国、ウプサラ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製した。抗体は、初めに（ヒトガンマ１ 重鎖およびヒトカッパまたはラムダ 軽鎖のそれぞれの定常領域を有する）全長ヒトＩｇＧとして産生し、続いて、マウスガンマ１ 重鎖のマウス定常ドメインおよびマウスカッパ 軽鎖のと共に発現させた。クローニングは、抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの可変ドメインのＰＣＲ増幅と、続く、既に対応する定常ドメインをギブソン・アセンブリー［Gibson, D. G. et al. (2009) Nat. Methods 6, 343-345］により保有するｐｃＤＮＡ３．４プラスミドへのクローニングによって実施した。種々のｐｃＤＮＡ３．４ベクターによるＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞の形質導入には、Ｅｘｐｉ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）形質導入キット（Ｇｉｂｃｏ社、＃Ａ１４５２４）を製造社の推奨法に従って使用した（米国、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。各形質導入において、総量３０μｇのプラスミドＤＮＡは３：１のモル比でＩｇＬとＩｇＨをそれぞれ含んでいた。形質導入、細胞増殖、および条件培地の回収は、販売社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の発現に基づく一過性形質導入用のＥｘｐｉ２９３（商標）キット）の推奨する方法で実施した。抗体含有条件培地を形質導入から６～７日後に、４℃、８０００ｒｐｍで１０分の遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ＧＳＡローター）により回収した。逆キメラマウスＩｇＧ１ ｍＡｂを、製造社（米国、イリノイ州、シカゴ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）の推奨法に従ってタンパク質Ｇカラム上で精製した。精製の前に、抗体含有培地を２０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７、で緩衝化し、その後ろ過した。ｍＡｂを１ｍｌの画分に溶出し、０．２５ｍｌの１．５ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８、でｐＨを中和した。滅菌ＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社）へのバッファー交換は、１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心フィルター（米国、マサチューセッツ州、バーリントン、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社）（図１の（Ｇ））またはＰＤ－１０脱塩カラム（米国、イリノイ州、シカゴ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で行った。
【0305】
抗体を遠心分離で回収し、遠心ろ過フィルターを用いて最終濃度１～２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。精製抗体を－８０℃において小さな等量で保存した。タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００ｃ分光光度計によってタンパク質の吸光度をＯ．Ｄ． ２８０ｎｍで測定し、吸光度値をタンパク質の消光係数（消光係数はｗｗｗ（ｄｏｔ）ｅｘｐａｓｙ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌで計算）で除して決定した。
【0306】
ＩＤＥ結合アッセイ： ＰＢＳ中の２．５～５μｇ／ｍｌのＷＴ ｒｈＩＤＥ、変異体ＩＤＥ、および無関係のタンパク質であるＢＳＡ、ＨｉｓＴｒａｐ精製組換えタンパク質（Ｈｉｓ）および／またはＭＢＰ－ＬａｃＺ（組換えにより研究所で作製）で９６穴のＥＬＩＳＡプレート（デンマーク国、ロスキレ、Ｎｕｎｃ社）を４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴによる３回の洗浄後、ＰＢＳ中の３％ｗ／ｖのスキムミルク（２３２１００、米国、メリーランド州、スパークス、Ｄｉｆｃｏ社）でウェルを室温で１時間ブロッキングした。続いてウェルを、種々のフォーマット（段階希釈したファージクローン、ＭＢＰ－ｓｃＦｖ（データは示さない）、および種々の濃度のｈＩｇＧまたはｒｃＩｇＧ）のＩＤＥ特異的な作製した抗体と室温で２時間インキュベートした。結合ファージは、マウス抗Ｍ１３抗体（室温で１時間）、続いてＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体（１１５－０３５－００３、メイン州、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＰＢＳ中に１：５，０００）と室温で１時間のインキュベーションによって検出した。ヒトＩＤＥ特異的ＩｇＧ抗体は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒト抗体（１０９－０３５－０８８、メイン州、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＰＢＳ中に１：５，０００）または抗マウス抗体（１１５－０３５－０６２、メイン州、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＰＢＳ中に１：５，０００）と室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴによる３回の洗浄後、色を帯びるまで３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、米国、カリフォルニア州、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加した。１ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を停止し、Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ プラス・マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎｍで解析した。
【0307】
ＩＤＥインスリン消化アッセイ： 種々の濃度のＩＤＥ阻害剤を１．５μｇ／ｍｌのｒｈＩＤＥと室温で１時間インキュベートした。続いて、Ｍｅｒｃｏｄｉａ超感受性マウスインスリンＥＬＩＳＡ（１０－１２４９－０１）カリブレーター０で希釈した組換えヒトインスリン（４１－９７５－１００、イスラエル国、キブツ ベイト ヘメック、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）をチューブに加え、３７℃で２時間インキュベートした。各チューブから２５μｌを取り出し、Ｍｅｒｃｏｄｉａ超感受性マウスインスリンＥＬＩＳＡを用いて残存インスリン濃度を評価した。４５０ｎｍの吸光度をＳｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ プラス・マイクロプレートリーダー（スイス国、メンネドルフ、Ｔｅｃａｎ社）で記録した。
【0308】
ストレプトゾシン（ＳＴＺ）糖尿病マウスモデル： １０週例のＣ５７ＢＬ／６マウスを一晩絶食させ、その後、１５０ｍｇ／ｋｇの、１００ｎＭのクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）で希釈したＳＴＺを腹腔内に注射した。ＳＴＺ注射から２日以内に全てのマウスが高血糖症を発症した。ＳＴＺ注射から３日目に、各マウスに１０ｍｇ／ｋｇの作製した逆キメラｍＡｂ（ｒｃＨ３またはｒｃ２Ｅ１２アイソタイプ対照）を腹腔に注射した。
【0309】
経口糖負荷試験（ｏＧＴＴ）： マウスを２時間絶食させ、その後、作製した逆キメラｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）の単一の腹腔内注射を行い、さらに４時間絶食させた（合計６時間）。この期間の終わりに、強制飼養針を用いてマウスに２ｇ／ｋｇの用量のグルコースを経口投与した。グルコース投与前（０時間）およびグルコース投与から１５、３０、６０、９０および１２０分後にＣｏｎｔｏｕｒ血糖値計（米国、インディアナ州、エルクハート、Ｂａｙｅｒ社）を用いて血糖値を測定した。
【0310】
インスリン負荷試験（ＩＴＴ）： マウスを２時間絶食させ、その後、作製した逆キメラｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）の単一の腹腔内注射を行い、さらに４時間絶食させた（合計６時間）。この期間の終わりに、インスリン（０．５Ｕ／Ｋｇ、ＰＢＳに溶解）をマウスに腹腔内注射した。グルコース投与前（０時間）およびグルコース投与から１５、３０、６０、および９０分後にＣｏｎｔｏｕｒ血糖値計（米国、インディアナ州、エルクハート、Ｂａｙｅｒ社）を用いて血糖値を測定した。
【0311】
血清の回収： ＩＴＴおよび逆キメラｍＡｂの注射に続き、２７Ｇの針を用いてマウスの顔面静脈から３日ごとに採血した。血液サンプル（各回、１２０μｌ以下）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、室温で１時間置いた。針を用いて血餅を除き、チューブを氷上に４０分置いた。続いて、チューブを４℃、２３００ＲＰＭで１０分の遠心分離に付し、透明な上清を２回目の洗浄サイクルのために新しいチューブに移した。上清を新しいチューブに移し、－２０℃で維持した。
【0312】
血清サンプル中の抗ＩＤＥ逆キメラ抗体の検出： ９６穴ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌのＩＤＥで被覆した。ＰＢＳＴで３回の洗浄後、ＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）のスキムミルクで、室温で１時間ウェルをブロッキングした。逆キメラＩＤＥ特異的抗体（ｒｃＨ３－ＩｇＧ）の検出のために、血清サンプルをＰＢＳで１：２７００に希釈し、一方、対照ｒｃ２Ｅ１２抗体注射サンプルを陽性対照とした。対照マウス由来の１：２７００希釈サンプルで希釈した既知濃度のｒｃＨ３－ＩｇＧ抗体が、ＩＤＥ濃度測定の参照として機能した。サンプルを室温で２時間インキュベートした。３回の洗浄に続き、５０μｌのＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（ＰＢＳ中に１：５，０００）とウェルを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回の洗浄に続き、色があらわれるまでＴＭＢを加えた。１ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させ、Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ プラス・マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎｍで解析した。
【0313】
逆キメラ抗ＩＤＥ Ｈ３ Ｆａｂ２セグメントの産生： １０ｍｇのＩｇＧを２００μｇのＩＤＥＳ（Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ）酵素（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｇｅｎｏｖｉｓ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｇｇ－ｐｒｏｔｅａｓｅｓ／ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ／）で、３７℃で２０時間、消化した。Ｆａｂ２断片は、未消化ＩｇＧおよびＦｃ断片からＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）親和性カラムで分離した。Ｆａｂ２は使用するまで－８０℃で保存した。
【0314】
ミクログリアのＲＯＳレベルの決定： 細胞内ＲＯＳレベルを測定するために、透明なベースに黒いフレームの２４穴プレート（＃４ＴＩ－０２４１、オランダ国、ライデン、ＢＩＯＫＥ社）に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中に０．５×１０５細胞／ｍｌの濃度のＮ９ミクログリアを播種した。２４時間後に培地を交換し、０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳ有または無しの無血清ＲＰＭＩで細胞をさらに２４時間インキュベートした。ＤＪ－１－ＫＤ細胞のＲＯＳを検出するために、ＤＪ－１－ＫＤミクログリアを既報（Nash et al. 2017）に従って増殖させた。対照およびＤＪ－１－ＫＤミクログリアを１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中に０．８×１０５細胞／ｍｌの濃度で播種した。次の日に培地を１μＭのロテノン（＃Ｒ８８７５、Ｓｉｇｍａ社）を含む無血清ＲＰＭＩ培地に２時間交換した。培地を除去し、ウェルを無血清ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し、細胞を抗ＩＤＥ抗体のＦａｂ断片（１００ｎＭ）と２時間インキュベートした。次に、インスリンをウェルに終濃度１００ｎＭとなるように加え、一晩静置した。実験の最後に、培地を１０μＭのＨ２ＤＣＦＤＡ（＃Ｄ６８８３、Ｓｉｇｍａ社）を含むＲＰＭＩ培地に交換し、既報（Trudler et al. 2014）に従い、３７℃で３０分、暗条件に静置した。Ｈ２ＤＣＦＤＡのＤＣＦへの酸化に続き、細胞の蛍光をＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴ分光蛍光計（米国、バーモント州、ウイヌースキ、ＢｉｏＴｅｋ社）を用い、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５２８ｎｍで測定した。ＲＯＳレベルの細胞数への正規化は、その後の細胞のＭＢ染色（上述の通り）および各ウェルのＲＯＳレベルをＭＢシグナルで除することによって達成した。
【0315】
対象： 既報のコホート（Marcus Y, et al. J Clin Hypertens (Greenwich). 2016; 18(1): 19-24）から合計２４人の健常ボランティアおよび５１人のメタボリックシンドローム（ＭＳ）患者を動員した（下記表１）。ＭＳ患者として参加するためには、１８～７５歳の対象は成人治療パネル第三報（Ｔｈｉｒｄ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ）（ＡＴＰ ＩＩＩ）（Circulation. 2002; 106(25): 3143-421）の条件を満たさなければならなかった。問題のある空腹時血糖値は≧１００ｍｇ％である。いずれの対象も抗糖尿病薬の治療を受けていなかった。研究はテルアビブ－スーラスキー（Ｔｅｌ Ａｖｉｖ－Ｓｏｕｒａｓｋｙ）医療センター、学内ヘルシンキ委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｈｅｌｓｉｎｋｉ’ｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得ていた。使用されるすべての手順の目的および性質の完全な説明後に各患者から同意を得た。
【0316】
ヒト血清サンプルの生化学的解析： 血清化学量を、標準的な市販の自動アッセイ（Ｃｅｎｔａｕｒ、インディアナ州、インディアナポリス、Ｒｏｃｈｅ社）で測定した。ＨｂＡ１ｃレベルはＨＰＬＣ（カリフォルニア州、サンフランシスコ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定した。
【0317】
ポリクローナル抗ＩＤＥ抗体の作製：
動物の免疫： 体重２．５ｋｇの８週齢の雌のＮＺＷウサギをＨａｒｌａｎ社（イスラエル国）より購入した。不完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の４００μｇのM. tuberculosis抽出物Ｈ３７と１：１の比で乳化させた１００μｇのｒｈＩＤＥを各動物に皮下接種することでポリクローナル抗血清を産生した。各動物は、毎週、M. tuberculosis抽出物を含まない不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）によって上記と同様に乳化されたｒｈＩＤＥを、週１回のブースターとして受けた。１回目の接種の前および各ブースターの１週間後、および最終（停止）採血としてウサギの動脈血を回収した。血清抗体力価（＞２００００）がプラトーに達するには合計３回のブースター免疫が必要であった。
動物の免疫： 体重２．５ｋｇの８週齢の雌のＮＺＷウサギをＨａｒｌａｎ社（イスラエル国）より購入した。不完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の４００μｇのM. tuberculosis抽出物Ｈ３７と１：１の比で乳化させた１００μｇのｒｈＩＤＥを各動物に皮下接種することでポリクローナル抗血清を産生した。各動物は、毎週、M. tuberculosis抽出物を含まない不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）によって上記と同様に乳化されたｒｈＩＤＥを、週１回のブースターとして受けた。１回目の接種の前および各ブースターの１週間後、および最終（停止）採血としてウサギの動脈血を回収した。血清抗体力価（＞２００００）がプラトーに達するには合計３回のブースター免疫が必要であった。
【0318】
抗ＩＤＥ血清ポリクローナル抗体力価の解析： 各動物から回収した血液を、凝固のために、室温で１時間および４℃でさらに１時間インキュベートした。血清の上澄みを凝固血液から４℃、３０００ｇで２０分の遠心分離によって分離した。抗ＩＤＥ抗体力価は以下の手順で、直接ＥＬＩＳＡにより測定した。終濃度２．５μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈したｒｈＩＤＥを５０μｌ／ウェルで使用し、９６穴のＥＬＩＳＡプレート（デンマーク国、ロスキレ、Ｎｕｎｃ社）を４℃で一晩被覆した。次の日に、３００μｌ／ウェルの０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でプレートを１回洗浄し、３００μｌ／ウェルの、３％スキムミルク（ｗ／ｖ、Ｄｉｆｃｏ（商標）スキムミルク、ＢＤ）を含むＰＢＳで、３７℃で１時間のブロッキングを行った。次に、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴでプレートを洗浄し、ＰＢＳＴで段階的な×３に希釈した血清サンプルをアプライし、室温で１時間結合させた。続いて、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。結合抗ＩＤＥポリクローナル抗体は、ＰＢＳで×２０００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（＃１１１－０３５－００４、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）をアプライし、プレートを室温で１時間インキュベートし、続いて、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴでプレートを３回洗浄することで検出した。最後に、ＨＲＰの基質である３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、米国、カリフォルニア州、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を、色を帯びるまで添加した。１ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させ、Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ プラス・マイクロプレートリーダー（スイス国、メンネドルフ、Ｔｅｃａｎ社）を使用し、解析した。光学密度を４５０および５７０ナノメーターの波長で測定し、Ｍａｇｅｌｌａｎソフトウエアバージョン２．２２（Ｔｅｃａｎ社）を用いて解析した。十分な力価が得られたら、動物を出血死させ、血液を４℃で１時間凝固させて、エッペンドルフ・マイクロ遠心機による４℃、１４０００ｇの遠心分離で血餅を血清から分離した。血清を１００μｌ等量に分割し、－８０℃で保存した。
【0319】
ＥＬＩＳＡによるＩＤＥ血清濃度の決定： 体液中のＩＤＥを測定するために、ヒトおよびマウスの血清中のＩＤＥの定量化に適した高感度サンドウィッチＥＬＩＳＡを開発した。終濃度０．５μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈した抗ＩＤＥ抗体Ａ９を５０μｌ／ウェルで使用し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（デンマーク国、ロスキレ、Ｎｕｎｃ社）を４℃で一晩被覆した。次の日に、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴでプレートを１回洗浄し、３００μｌ／ウェルの、３％スキムミルク（ｗ／ｖ、Ｄｉｆｃｏ（商標）スキムミルク、ＢＤ）を含むＰＢＳで、３７℃で１時間のブロッキングを行った。次に、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴでプレートを３回洗浄し、ＰＢＳで×３または×９に希釈した血清サンプル５０μｌ／ウェルをアプライし、３７℃で一晩（ＯＮ）結合させた。濃度曲線は、ＰＢＳ中５００ｎｇ／ｍｌから開始した段階的な×２希釈のｒｈＩＤＥで対照血清（検出不能なＩＤＥ濃度）をスパイクすることによって作製した（図７の（Ａ））。プレートを室温（約２５℃）で２時間静置し、続いて、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。結合抗ＩＤＥは、ＰＢＳで×２０００に希釈したウサギポリクローナル抗ＩＤＥ血清をアプライし、プレートを室温で１時間インキュベートし、続いて、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴでプレートを３回洗浄することで検出した。次に、ＰＢＳで×２０００に希釈した５０μｌ／ウェルのＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（＃１１１－０３５－００４、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）をアプライし、プレートを室温で１時間インキュベートし、続いて、３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。最後に、ＨＲＰの基質であるＴＭＢを、色を帯びるまで添加した。１ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させ、Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ プラス・マイクロプレートリーダー（スイス国、メンネドルフ、Ｔｅｃａｎ社）を使用し、解析した。光学密度を４５０および５７０ナノメーターの波長で測定し、Ｍａｇｅｌｌａｎソフトウエアバージョン２．２２（Ｔｅｃａｎ社）を用いて解析した。
【0320】
統計解析： 後述する実施例１～３の全ての統計解析にＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ８）を使用した。データの比較は、２つの群を比較するための独立両側スチューデントｔ－検定、または３群以上を解析するための一元ＡＮＯＶＡ配置分散分析（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正有）のいずれかを使用した。各実験を少なくとも３回繰り返した。Ｐ＜０．０５を有意とした。後述する実施例４においては、集めたデータをＩＢＭ ＳＰＳＳ、バージョン２５．０で解析した。データの正規分布は、平均と中央値との比較、平均と５％トリム平均との比較、歪度および尖度の値、並びにシャピロ・ウィルク検定の結果によって立証した。結果は、ＭＳ群のいくつかの変数は正規分布に従わないことを示した。２群（ＭＳ患者と対照）間の差を、連続変数は独立サンプルのｔ検定およびマン・ホイットニー検定、並びにカテゴリー変数はカイ二乗検定で解析した。ｔ検定およびマン・ホイットニー検定の結果が同じであったため、報告した結果はｔ検定のものとした。記述統計量は、平均および標準偏差、あるいは変数のスケールに応じたパーセンテージ付きの頻度として提供した。年齢の違いが有意であったため、一般線形モデル（ＧＬＭ）のためにこの因子は制御し、差を試験した。ｐ値＜０．０５を有意とした。報告した全てのＰ値が両側であった。
【0321】
実施例１
抗ＩＤＥ抗体の作製およびＩＤＥ活性に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるその阻害効果の評価
抗ＩＤＥ抗体の作製
スクリーニングおよび免疫化の両方の抗原として使用するための組換えヒトＩＤＥ（ｒｈＩＤＥ）を精製した。この目的のために、野性型（ＷＴ）のタンパク質、および触媒部位の点変異によって酵素の触媒活性を著しく減少させたＥ１１１Ｑ変異型の酵素（３５）の両方を発現させた。２種類のＩＤＥをコードする遺伝子をＣ末にＨｉｓタグを有するｐＥＴ２８ａ＋プラスミド骨格にクローニングした。Ｃ末にＨｉｓタグを有する組換えヒトＩＤＥ（ｒｈＩＤＥ）を発現するベクターを図１の（Ａ）に示した。
抗ＩＤＥ抗体の作製およびＩＤＥ活性に対するｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるその阻害効果の評価
抗ＩＤＥ抗体の作製
スクリーニングおよび免疫化の両方の抗原として使用するための組換えヒトＩＤＥ（ｒｈＩＤＥ）を精製した。この目的のために、野性型（ＷＴ）のタンパク質、および触媒部位の点変異によって酵素の触媒活性を著しく減少させたＥ１１１Ｑ変異型の酵素（３５）の両方を発現させた。２種類のＩＤＥをコードする遺伝子をＣ末にＨｉｓタグを有するｐＥＴ２８ａ＋プラスミド骨格にクローニングした。Ｃ末にＨｉｓタグを有する組換えヒトＩＤＥ（ｒｈＩＤＥ）を発現するベクターを図１の（Ａ）に示した。
【0322】
ベクターの発現の誘導後には、１１０ｋＤａタンパク質発現の著しい増加がＳＤＳ－ＰＡＧＥにより可視化され（図１の（Ｂ））、ＩＤＥ特異的抗体を用いた免疫ブロット検定によってタンパク質の正体が確認された（図１の（Ｃ））。次の工程では、精製タンパク質によるインスリン分解アッセイを実施し、ＷＴ ＩＤＥタンパク質は効果的にインスリンを分解したが（３７℃で２時間後に６０％分解）、一方、変異ＩＤＥは同じ条件下でインスリンのわずか１５％しか分解しなかった（図１の（Ｄ））。
【0323】
組換えヒトＩＤＥのエピトープを認識する特異的ｓｃＦｖクローンを単離するために、精製ＩＤＥを使用した。ヒト合成抗体ファージディスプレイライブラリーを用いるファージディスプレイ技術を使用した。具体的には、ヒトｓｃＦｖライブラリーであるＲｏｎｉｔ１ライブラリー［Azriel-Rosenfeld et al. J Mol Biol. (2004) 335(1):177-192に記載］をスクリーニングした。ライブラリーを、組換えヒト野性型（ｗｔ）ＩＤＥ（ｒｈＩＤＥ）上の親和性選択サイクルに４回付した。サイクルの内の２回においては、ＷＴ酵素の触媒部位に高親和性で結合する抗体の単離を意図して、Ｅ１１１Ｑ ＩＤＥの枯渇を実施した。４サイクルの親和性選択に続き、モノクローナルファージＥＬＩＳＡによって３種のＩＤＥ特異的ｓｃＦｖディスプレイファージが同定され、本願においてはこれらをＡ９、Ｂ１およびＨ３と称する。図２の（Ａ）～（Ｆ）に示したように、Ａ９、Ｂ１およびＨ３をディスプレイするファージを段階希釈したもの（それぞれ図２の（Ａ）～（Ｃ））は、ＩＤＥを良好に結合し、ウェルに陰性対照として用いたＢＳＡ、ＭＢＰ、または他の精製組換えタンパク質に対しての結合は０～少量であった。
【0324】
３種の抗ヒトＩＤＥ抗体の重鎖および軽鎖のみならず、ＣＤＲの核酸およびアミノ酸の配列を決定した。これらは、配列番号１～２および９～１０（それぞれＡ９の重鎖および軽鎖）、配列番号３～８（Ａ９の重鎖ＣＤＲ）、配列番号１１～１６（Ａ９の軽鎖ＣＤＲ）、配列番号１７～１８および２５～２６（それぞれＢ１の重鎖および軽鎖）、配列番号１９～２４（Ｂ１の重鎖ＣＤＲ）、配列番号２７～３２（Ｂ１の軽鎖ＣＤＲ）、配列番号３３～３４および４１～４２（それぞれＨ３の重鎖および軽鎖）、配列番号３５～４０（Ｈ３の重鎖ＣＤＲ）、並びに配列番号４３～４８（Ｈ３の軽鎖ＣＤＲ）に示した。
【0325】
全長ＩｇＧの初期評価のために、抗体を「インクローナル」、即ち、E. coli発現系で発現されたもの、として作製した（２９）（図１の（Ｆ））。単離されたインクローナル抗体はＩＤＥに対して著しい結合を示し、ＥＣ５０は約１ｎＭであった（図２の（Ｄ）～（Ｆ））。インクローナル抗体は、飽和濃度でのみ明確なわずかな結合をＢＳＡに対して示した。総合すると、これらの結果は、３種の「インクローナル」抗体が高い親和性および特異性をもってＩＤＥに結合することを示唆する。
【0326】
作製した抗ＩＤＥ抗体によるｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるインスリン分解の阻害
作製した抗ＩＤＥ ｓｃＦｖおよびＩｇＧがＩＤＥ仲介性インスリン分解を阻害する能力を試験するために、ＭＢＰ－ｓｃＦｖの形態の各抗体、またはｒｈＩＤＥに結合しない対照ＭＢＰ－ｓｃＦｖと、ｒｈＩＤＥとを室温で１時間インキュベートした。続いて、インスリンを３７℃で２時間かけて添加した。Ｍｅｒｃｏｄｉａ超感受性マウスインスリンＥＬＩＳＡキットを用いて残存インスリンとして活性を測定した。Ｂ１ ｓｃＦｖおよびＨ３ ｓｃＦｖの存在下で、ＩＤＥ活性の用量依存的な阻害が観察された。Ｂ１は１００ｎＭおよび１０ｎＭのｓｃＦｖを用いたとき、それぞれ、６４％（Ｐ＜０．００１）および３５％（Ｐ＜０．００１）のインスリン分解を阻害し、Ｈ３は１００ｎＭの使用で４０％（Ｐ＜０．００１）のインスリン分解を阻害したが、１０ｎＭの使用では有意な阻害は観察されなかった（図３の（Ａ））。Ａ９および対照ＭＢＰ－ｓｃＦｖの使用の際には、明確なＩＤＥ活性の阻害はなかった。抗体の全長ヒトＩｇＧへの再フォーマット化後にＩＤＥ活性阻害能について再評価した。ＩｇＧ型では、ＩＤＥ活性阻害についてＨ３抗体が著しい効率を示したが、Ａ９および陰性対照抗体はそうすることはなかった（ｐ＜０．００１、図３の（Ｂ））。
作製した抗ＩＤＥ ｓｃＦｖおよびＩｇＧがＩＤＥ仲介性インスリン分解を阻害する能力を試験するために、ＭＢＰ－ｓｃＦｖの形態の各抗体、またはｒｈＩＤＥに結合しない対照ＭＢＰ－ｓｃＦｖと、ｒｈＩＤＥとを室温で１時間インキュベートした。続いて、インスリンを３７℃で２時間かけて添加した。Ｍｅｒｃｏｄｉａ超感受性マウスインスリンＥＬＩＳＡキットを用いて残存インスリンとして活性を測定した。Ｂ１ ｓｃＦｖおよびＨ３ ｓｃＦｖの存在下で、ＩＤＥ活性の用量依存的な阻害が観察された。Ｂ１は１００ｎＭおよび１０ｎＭのｓｃＦｖを用いたとき、それぞれ、６４％（Ｐ＜０．００１）および３５％（Ｐ＜０．００１）のインスリン分解を阻害し、Ｈ３は１００ｎＭの使用で４０％（Ｐ＜０．００１）のインスリン分解を阻害したが、１０ｎＭの使用では有意な阻害は観察されなかった（図３の（Ａ））。Ａ９および対照ＭＢＰ－ｓｃＦｖの使用の際には、明確なＩＤＥ活性の阻害はなかった。抗体の全長ヒトＩｇＧへの再フォーマット化後にＩＤＥ活性阻害能について再評価した。ＩｇＧ型では、ＩＤＥ活性阻害についてＨ３抗体が著しい効率を示したが、Ａ９および陰性対照抗体はそうすることはなかった（ｐ＜０．００１、図３の（Ｂ））。
【0327】
作製した抗ＩＤＥ抗体による立体ＩＤＥエピトープの認識
作製した抗体が結合するＩＤＥ上の結合エピトープを求めるために、ドットブロット解析を実施した。具体的には、段階希釈したｒｈＩＤＥおよび対照としたマウス脾臓溶解物を、ネイティブの状態および変性状態でニトロセルロースメンブラン上にスポットした。ネイティブのｒｈＩＤＥタンパク質サンプルは全抗体クローンによって検出され、Ｂ１ ＭＢＰ－ｓｃＦｖが最も高いシグナルを示した。全ての変性タンパク質サンプルがネイティブのサンプルよりも弱いシグナルを示すか、視認できるドットをもたらさなかった（図４の（Ａ））。これらの結果は、選択したｓｃＦｖクローンが、直鎖状のエピトープではなく、変性条件下で破壊されるｒｈＩＤＥの構造エピトープを認識することを示唆している。
作製した抗体が結合するＩＤＥ上の結合エピトープを求めるために、ドットブロット解析を実施した。具体的には、段階希釈したｒｈＩＤＥおよび対照としたマウス脾臓溶解物を、ネイティブの状態および変性状態でニトロセルロースメンブラン上にスポットした。ネイティブのｒｈＩＤＥタンパク質サンプルは全抗体クローンによって検出され、Ｂ１ ＭＢＰ－ｓｃＦｖが最も高いシグナルを示した。全ての変性タンパク質サンプルがネイティブのサンプルよりも弱いシグナルを示すか、視認できるドットをもたらさなかった（図４の（Ａ））。これらの結果は、選択したｓｃＦｖクローンが、直鎖状のエピトープではなく、変性条件下で破壊されるｒｈＩＤＥの構造エピトープを認識することを示唆している。
【0328】
実施例２
作製した抗ＩＤＥ抗体の糖尿病動物モデルにおける治療効果
抗ＩＤＥ Ｈ３抗体の逆キメラＩｇＧへの変換
キメラ抗体は、治療用抗体の開発において重要な節目である。キメラ抗体は、可変ドメインがマウス抗体由来であり、定常ドメインはヒト配列である組換えＩｇＧである。マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と比べて、キメラ抗体は遥かに免疫原性が低く、ヒト患者への投与の際にヒト抗マウス抗体の産生を限定する（３６）。一方、逆キメラはヒト可変ドメインとマウス定常ドメインとを有する抗体である（３７）。逆キメラ抗体は、トランスジェニックマウスにおける抗体の発見に有用なだけでなく、マウス抗ヒト免疫応答の発生を防止する上でマウスモデルの処置にも非常に有用である。マウスモデルにおける作製した抗ＩＤＥ抗体の有効性を評価するために、ヒトＨ３ ＩｇＧ抗体を逆キメラＩｇＧ（ｒｃＩｇＧ）（マウスＩｇＧ１アイソタイプ）に変換し、ＩＤＥ、ＢＳＡおよびＥ１１１Ｑ ＩＤＥ変異体に対するその結合能を評価した。ＩＤＥに結合しない抗体ｒｃ２Ｅ１２がアイソタイプ対照となった。図４の（Ｂ）に示したように、ｒｃＨ３－ＩｇＧはＩＤＥと高い親和性をもって結合した（ＥＣ５０が１．６２ｎＭ）。さらに、ｒｃＨ３－ＩｇＧは活性なＩＤＥに対して特異性を示し、変異体ＩＤＥまたはＢＳＡに対して結合しなかった。さらに、ｒｃＨ３－ＩｇＧ抗体がＩＤＥ活性を阻害する能力を試験した。ｒｃＨ３－ＩｇＧ抗体は用量依存的にＩＤＥを阻害した（図４の（Ｃ））。まとめると、これらの結果は、逆キメラＨ３ ＩｇＧはヒトＨ３ ＩｇＧ型の性質を保持していることを示唆している。
作製した抗ＩＤＥ抗体の糖尿病動物モデルにおける治療効果
抗ＩＤＥ Ｈ３抗体の逆キメラＩｇＧへの変換
キメラ抗体は、治療用抗体の開発において重要な節目である。キメラ抗体は、可変ドメインがマウス抗体由来であり、定常ドメインはヒト配列である組換えＩｇＧである。マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と比べて、キメラ抗体は遥かに免疫原性が低く、ヒト患者への投与の際にヒト抗マウス抗体の産生を限定する（３６）。一方、逆キメラはヒト可変ドメインとマウス定常ドメインとを有する抗体である（３７）。逆キメラ抗体は、トランスジェニックマウスにおける抗体の発見に有用なだけでなく、マウス抗ヒト免疫応答の発生を防止する上でマウスモデルの処置にも非常に有用である。マウスモデルにおける作製した抗ＩＤＥ抗体の有効性を評価するために、ヒトＨ３ ＩｇＧ抗体を逆キメラＩｇＧ（ｒｃＩｇＧ）（マウスＩｇＧ１アイソタイプ）に変換し、ＩＤＥ、ＢＳＡおよびＥ１１１Ｑ ＩＤＥ変異体に対するその結合能を評価した。ＩＤＥに結合しない抗体ｒｃ２Ｅ１２がアイソタイプ対照となった。図４の（Ｂ）に示したように、ｒｃＨ３－ＩｇＧはＩＤＥと高い親和性をもって結合した（ＥＣ５０が１．６２ｎＭ）。さらに、ｒｃＨ３－ＩｇＧは活性なＩＤＥに対して特異性を示し、変異体ＩＤＥまたはＢＳＡに対して結合しなかった。さらに、ｒｃＨ３－ＩｇＧ抗体がＩＤＥ活性を阻害する能力を試験した。ｒｃＨ３－ＩｇＧ抗体は用量依存的にＩＤＥを阻害した（図４の（Ｃ））。まとめると、これらの結果は、逆キメラＨ３ ＩｇＧはヒトＨ３ ＩｇＧ型の性質を保持していることを示唆している。
【0329】
糖尿病マウスモデルにおけるｒｃＨ３－ＩｇＧ抗体によるインスリン・シグナル伝達の改善
糖尿病マウスモデルにおけるＩＤＥの阻害はインスリン活性を改善すると過去に示唆されている（３８）。よって、ｒｃＨ３－ＩｇＧの血糖値（ｏＧＴＴ）を低下させ、インスリン活性（ｉＴＴ）を向上させる能力をＳＴＺ処置マウスで評価した。このために、ｏＧＴＴおよびｉＴＴの試験１時間前に、ｒｃＨ３－ＩｇＧまたはアイソタイプ対照抗体をＳＴＺ処置マウスの腹腔に投与した。グルコース負荷（ｏＧＴＴ）後、対照とｒｃＨ３－ＩｇＧで処置したマウスの両方が血糖値の上昇を示した。しかし、ｒｃＨ３－ＩｇＧ処置マウスは、期間中、対照処理マウスと比べてより低い血糖値を示した（ｐ＜０．０５）。事後解析は、グルコース投与から９０分後に、アイソタイプ対照処置マウスと比べて、ｒｃＨ３－ＩｇＧ処置マウスが有意に低い血糖値を有していたことを明らかにした（ｐ＜０．０５、図５の（Ａ））。さらに、ｒｃＨ３－ＩｇＧがインスリン活性を改善する能力を評価した（ＩＴＴ）。ｒｃＨ３－ＩｇＧ処置マウスがインスリン投与の３０分後から有意な血糖値減少を示したものの、アイソタイプ対照処置マウスは９０分後になって有意な血糖値減少を示した（ｐ＜０．０５）。最後に、投与マウスの血清中のｒｃＨ３－ＩｇＧ抗体の半減期を決定したところ、約１１日であることが分かった。まとめると、これらの結果は、ｒｃＨ３－ＩｇＧによる処置が、糖尿病マウスモデルにおいて血糖値およびインスリン活性を改善することを示唆している。
糖尿病マウスモデルにおけるＩＤＥの阻害はインスリン活性を改善すると過去に示唆されている（３８）。よって、ｒｃＨ３－ＩｇＧの血糖値（ｏＧＴＴ）を低下させ、インスリン活性（ｉＴＴ）を向上させる能力をＳＴＺ処置マウスで評価した。このために、ｏＧＴＴおよびｉＴＴの試験１時間前に、ｒｃＨ３－ＩｇＧまたはアイソタイプ対照抗体をＳＴＺ処置マウスの腹腔に投与した。グルコース負荷（ｏＧＴＴ）後、対照とｒｃＨ３－ＩｇＧで処置したマウスの両方が血糖値の上昇を示した。しかし、ｒｃＨ３－ＩｇＧ処置マウスは、期間中、対照処理マウスと比べてより低い血糖値を示した（ｐ＜０．０５）。事後解析は、グルコース投与から９０分後に、アイソタイプ対照処置マウスと比べて、ｒｃＨ３－ＩｇＧ処置マウスが有意に低い血糖値を有していたことを明らかにした（ｐ＜０．０５、図５の（Ａ））。さらに、ｒｃＨ３－ＩｇＧがインスリン活性を改善する能力を評価した（ＩＴＴ）。ｒｃＨ３－ＩｇＧ処置マウスがインスリン投与の３０分後から有意な血糖値減少を示したものの、アイソタイプ対照処置マウスは９０分後になって有意な血糖値減少を示した（ｐ＜０．０５）。最後に、投与マウスの血清中のｒｃＨ３－ＩｇＧ抗体の半減期を決定したところ、約１１日であることが分かった。まとめると、これらの結果は、ｒｃＨ３－ＩｇＧによる処置が、糖尿病マウスモデルにおいて血糖値およびインスリン活性を改善することを示唆している。
【0330】
実施例３
作製した抗ＩＤＥ抗体の、パーキンソン氏病表現型を有するミクログリアに対する影響
作製した抗体のパーキンソン氏病に対する治療効果を評価するために、パーキンソン氏病に見られるミクログリアの神経毒性表現型を提示したＤＪ－１ノックダウン（ＫＤ）ミクログリア（Nash et al. J Neurochem. 2017 143(5):584-594、およびTrudler et al. J Neurochem. 2014 129(3):434-47）を使用した。過去の研究は、基本条件および炎症刺激条件下において、ＤＪ－１ ＫＤミクログリアが高レベルの活性酸素（ＲＯＳ）を発生することを示した（Trudler et al. 2014）。ミクログリア膜に発現されているＦｃ受容体によって起こり得る、作製した抗ＩＤＥ抗体のミクログリアへの結合（Teeling et al. 2012）を防止するために、ｒｃＨ３－ＩｇＧ抗体のＦａｂ２セグメント（本願において「Ｈ３ Ｆａｂ」と称する）をこれらの条件で試験した。
作製した抗ＩＤＥ抗体の、パーキンソン氏病表現型を有するミクログリアに対する影響
作製した抗体のパーキンソン氏病に対する治療効果を評価するために、パーキンソン氏病に見られるミクログリアの神経毒性表現型を提示したＤＪ－１ノックダウン（ＫＤ）ミクログリア（Nash et al. J Neurochem. 2017 143(5):584-594、およびTrudler et al. J Neurochem. 2014 129(3):434-47）を使用した。過去の研究は、基本条件および炎症刺激条件下において、ＤＪ－１ ＫＤミクログリアが高レベルの活性酸素（ＲＯＳ）を発生することを示した（Trudler et al. 2014）。ミクログリア膜に発現されているＦｃ受容体によって起こり得る、作製した抗ＩＤＥ抗体のミクログリアへの結合（Teeling et al. 2012）を防止するために、ｒｃＨ３－ＩｇＧ抗体のＦａｂ２セグメント（本願において「Ｈ３ Ｆａｂ」と称する）をこれらの条件で試験した。
【0331】
図６の（Ａ）に示したように、ＤＪ－１ ＫＤミクログリアは、対照ミクログリアと比較して、ＲＯＳレベルの５１％の上昇を示し、これは過去の報告（Trudler et al. 2014）と一致していた。さらに、パーキンソン氏病の実験モデルとなる、ミトコンドリア複合体Ｉの阻害剤として知られるロテノンによる細胞の短期間の刺激（Xiong et al. 2012）は、ＤＪ－１－ＫＤミクログリアにおけるＲＯＳの産生を有意に増加させた（ベースラインの対照細胞と比べて２２７％、ｐ＜０．００１）。ロテノンによる損傷に続く１００ｎＭのインスリンによる刺激は、ＲＯＳ産生を減少させず、細胞の１００ｎＭのＨ３ Ｆａｂとのインキュベーションは、ＤＪ－１ ＫＤ細胞によるＲＯＳ産生を、細胞の基底値と同等（対照細胞のベースラインの１５１％対ロテノン損傷に続くＨ３ Ｆａｂ処置細胞の１４８％）まで有意に減少させた（ｐ＜０．００１）。注目すべきことに、図６の（Ｂ）に示したように、総細胞数に対する処置の効果を測定するために使用したＭＢアッセイは、インスリンまたはＨ３処置が、ロテノン損傷後の細胞生存率に有意な影響を与えないことを示す。これは防御および非毒性効果を評価する上で重要な対照である。
【0332】
まとめると、これらの結果は、ｒｃＨ３抗体がパーキンソン氏病の治療的アプローチとなり得ることを示唆している。
【0333】
実施例４
作製した抗ＩＤＥ抗体を用いたメタボリックシンドロームの診断および予後判定
作製した抗ＩＤＥ抗体を使用し、ＩＤＥの検出および定量のためのサンドウィッチＥＬＩＳＡを開発した（図７の（Ａ））。図７の（Ｂ）に示したように、このＥＬＩＳＡアッセイは、ｒｈＩＤＥを、５ｐｇ／μｌから５００ｐｇ／μｌの濃度を高感度で容易に検出する。ヒトとマウスのＩＤＥは＞９５％の配列同一性を有することから、作製したポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はマウスＩＤＥも結合すると理由付けし、立証した。抗体Ａ９が活性ｒｈＩＤＥの立体構造を認識するか否かを決定するために、変性型のｒｈＩＤＥに対する結合との差を評価した。図７の（Ｃ）に示したように、ｒｈＩＤＥの熱変性は、Ａ９ ＩｇＧによる検出によって生じるＥＬＩＳＡシグナルの有意な減少（ほぼ無視できる程度までの減少）をもたらした。記録すべきは、ｒｈＩＤＥの熱変性は、図８に示したＥＬＩＳＡシグナルの約２～３倍の低下をもたらし、ｒｈＩＤＥは×２の段階希釈した抗Ｈｉｓタグ抗体（直鎖状エピトープを認識するもの）を用いて検出され、変性ｒｈＩＤＥがＥＬＩＳＡプレートのウェルにも低い効率で結合し得ることを示唆している。総合すると、これらの結果は、Ａ９ ＩｇＧが活性ｒｈＩＤＥの構造エピトープを特異的に認識することを示唆している。
作製した抗ＩＤＥ抗体を用いたメタボリックシンドロームの診断および予後判定
作製した抗ＩＤＥ抗体を使用し、ＩＤＥの検出および定量のためのサンドウィッチＥＬＩＳＡを開発した（図７の（Ａ））。図７の（Ｂ）に示したように、このＥＬＩＳＡアッセイは、ｒｈＩＤＥを、５ｐｇ／μｌから５００ｐｇ／μｌの濃度を高感度で容易に検出する。ヒトとマウスのＩＤＥは＞９５％の配列同一性を有することから、作製したポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はマウスＩＤＥも結合すると理由付けし、立証した。抗体Ａ９が活性ｒｈＩＤＥの立体構造を認識するか否かを決定するために、変性型のｒｈＩＤＥに対する結合との差を評価した。図７の（Ｃ）に示したように、ｒｈＩＤＥの熱変性は、Ａ９ ＩｇＧによる検出によって生じるＥＬＩＳＡシグナルの有意な減少（ほぼ無視できる程度までの減少）をもたらした。記録すべきは、ｒｈＩＤＥの熱変性は、図８に示したＥＬＩＳＡシグナルの約２～３倍の低下をもたらし、ｒｈＩＤＥは×２の段階希釈した抗Ｈｉｓタグ抗体（直鎖状エピトープを認識するもの）を用いて検出され、変性ｒｈＩＤＥがＥＬＩＳＡプレートのウェルにも低い効率で結合し得ることを示唆している。総合すると、これらの結果は、Ａ９ ＩｇＧが活性ｒｈＩＤＥの構造エピトープを特異的に認識することを示唆している。
【0334】
続いて、メタボリックシンドローム（ＭＳ）ヒト患者および対照健常者の血清サンプルにおけるＩＤＥレベルを決定するために開発したＥＬＩＳＡアッセイを使用した。対照と比べて、ＭＳ対象はより高いＢＭＩ、グルコース、トリグリセリドおよびインスリンレベルと、より低いＨＤＬｃレベルを有していた（下記表１）。結果は、ＩＤＥレベルがＭＳ対照においてより高いことを表している（平均６３７．４±４６９．５対４７０．５±２２１．８ｐｇ／μＬ、ｐ＜０．０５）（図９）。ＭＳ群の方が対照群よりも年齢が高いため、２群のＩＤＥを、年齢について調整した後に再度比較した。この調整後にも、ＩＤＥは対照と比べてＭＳ対象において高かった（Ｆ（１，６８）＝６．６７５、ｐ＝０．０１２、偏イータ２乗＝０．０８９）。さらに、正の相関がＩＤＥレベルと、血清トリグリセリド（ｒ＝０．４２３、ｐ＜０．０５、図１０の（Ａ））およびインスリン（ｒ＝０．２９４、ｐ＜０．０５、図１０の（Ｂ））との間に見られ、血清ｃ－ペプチドとは境界性の相関が検出された（図示しない）。ＩＤＥはＨＤＬｃレベルとさらに負の相関を示した（ｒ＝－０．３６６、ｐ＜０．０５、図１０の（Ｃ））。これらの知見はより高いＩＤＥレベルが定量的にＭＳ成分と関連することを示唆した。
【0335】
さらに、ＭＳ対象のＩＤＥレベルは、２種の異なる下位群、即ち、正常対照群と区別することのできない分布および平均を有する低ＩＤＥの対象（ｎ＝２５、２７２．１±１５７．９ｐｇ／μｌ）と、高ＩＤＥの対象（ｎ＝２５、１００２．６±３８３．７ｐｇ／μｌ、偏差のｐ＜０．００１）へと分離した。低ＩＤＥ ＭＳ群は、高ＩＤＥ ＭＳ群と比べて、年齢が高く（年齢５４±１０対４５±１３歳、ｐ＜０．０５）、より高い血糖値を有していた（９５±２０対８０±９ｍｇ／ｄｌ、ｐ＜０．０１）（図９）。注目すべきことに、両群のインスリンレベルは同様であり、トリグリセリド、ＨＤＬｃ、最高血圧値と最低血圧値、および心拍数も同様であった。
【0336】
【表1】
【0337】
本発明をその特定の実施形態との関連で説明したが、多数の代替、修飾および変種が当業者には明らかであろう。したがって、そのような代替、修飾および変種の全ては、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に含まれることを意図するものである。
【0338】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許および特許出願のそれぞれについて具体的且つ個別の参照により本明細書に組み込む場合と同程度に、それらの全体が参照により本明細書に援用される。加えて、本願におけるいかなる参考文献の引用または特定は、このような参考文献が本発明の先行技術として使用できることの容認として解釈されるべきではない。また、各節の表題が使用される範囲において、必ずしも限定として解釈されるべきではない。さらに本願のいかなる基礎出願も本参照をもってその全体をここに援用する。
【0339】
参照文献
（他の参照文献は明細書中に記載）
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26. Brekke, O. H. and Sandlie, I. (2003) Therapeutic antibodies for human diseases at the dawn of the twenty-first century. Nat. Rev. Drug Discov. 2, 52-62
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34. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R.-Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., and Smith, H. O. (2009) Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods 6, 343-345
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38. Maianti, J. P., McFedries, A., Foda, Z. H., Kleiner, R. E., Du, X. Q., Leissring, M. a, Tang, W.-J., Charron, M. J., Seeliger, M. a, Saghatelian, A., and Liu, D. R. (2014) Anti-diabetic activity of insulin-degrading enzyme inhibitors mediated by multiple hormones. Nature 511, 94-98
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（他の参照文献は明細書中に記載）
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【配列表フリーテキスト】
【0340】
配列番号１： 抗ヒトＩＤＥクローンＡ９ ＶＨ
配列番号２： 抗ヒトＩＤＥクローンＡ９ ＶＨ
配列番号３： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号４： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ１
配列番号５： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号６： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ２
配列番号７： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号８： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ３
配列番号９： 抗ヒトＩＤＥクローンＡ９ ＶＬ － ＤＮＡ配列
配列番号１０： 抗ヒトＩＤＥクローンＡ９ ＶＬ
配列番号１１： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号１２： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ１
配列番号１３： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号１４： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ２
配列番号１５： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号１６： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ３
配列番号１７： 抗ヒトＩＤＥクローンＢ１ ＶＨ － ＤＮＡ配列
配列番号１８： 抗ヒトＩＤＥクローンＢ１ ＶＨ
配列番号１９： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号２０： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ１
配列番号２１： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号２２： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ２
配列番号２３： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号２４： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ３
配列番号２５： 抗ヒトＩＤＥクローンＢ１ ＶＬ（カッパ） － ＤＮＡ配列
配列番号２６： 抗ヒトＩＤＥクローンＢ１ ＶＬ（カッパ）
配列番号２７： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号２８： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ１
配列番号２９： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号３０： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ２
配列番号３１： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号３２： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ３
配列番号３３： 抗ヒトＩＤＥクローンＨ３ ＶＨ － ＤＮＡ配列
配列番号３４： 抗ヒトＩＤＥクローンＨ３ ＶＨ
配列番号３５： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号３６： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ１
配列番号３７： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号３８： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ２
配列番号３９： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号４０： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ３
配列番号４１： 抗ヒトＩＤＥクローンＨ３ ＶＬ（ラムダ） － ＤＮＡ配列
配列番号４２： 抗ヒトＩＤＥクローンＨ３ ＶＬ（ラムダ）
配列番号４３： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号４４： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ１
配列番号４５： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号４６： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ２
配列番号４７： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号４８： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ３
配列番号４９： 野性型ＩＤＥのコード配列
配列番号５０： 野性型ＩＤＥのポリペプチド配列
配列番号５１： ＩＤＥ － Ｅ１１１Ｑ変異有、コード配列
配列番号５２： ＩＤＥ － Ｅ１１１Ｑ変異有、ポリペプチド配列
配列番号２： 抗ヒトＩＤＥクローンＡ９ ＶＨ
配列番号３： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号４： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ１
配列番号５： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号６： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ２
配列番号７： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号８： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＨ） － ＣＤＲ３
配列番号９： 抗ヒトＩＤＥクローンＡ９ ＶＬ － ＤＮＡ配列
配列番号１０： 抗ヒトＩＤＥクローンＡ９ ＶＬ
配列番号１１： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号１２： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ１
配列番号１３： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号１４： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ２
配列番号１５： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号１６： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＡ９ ＶＬ） － ＣＤＲ３
配列番号１７： 抗ヒトＩＤＥクローンＢ１ ＶＨ － ＤＮＡ配列
配列番号１８： 抗ヒトＩＤＥクローンＢ１ ＶＨ
配列番号１９： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号２０： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ１
配列番号２１： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号２２： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ２
配列番号２３： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号２４： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＨ） － ＣＤＲ３
配列番号２５： 抗ヒトＩＤＥクローンＢ１ ＶＬ（カッパ） － ＤＮＡ配列
配列番号２６： 抗ヒトＩＤＥクローンＢ１ ＶＬ（カッパ）
配列番号２７： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号２８： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ１
配列番号２９： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号３０： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ２
配列番号３１： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号３２： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＢ１ ＶＬ） － ＣＤＲ３
配列番号３３： 抗ヒトＩＤＥクローンＨ３ ＶＨ － ＤＮＡ配列
配列番号３４： 抗ヒトＩＤＥクローンＨ３ ＶＨ
配列番号３５： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号３６： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ１
配列番号３７： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号３８： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ２
配列番号３９： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号４０： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＨ） － ＣＤＲ３
配列番号４１： 抗ヒトＩＤＥクローンＨ３ ＶＬ（ラムダ） － ＤＮＡ配列
配列番号４２： 抗ヒトＩＤＥクローンＨ３ ＶＬ（ラムダ）
配列番号４３： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ１ ＤＮＡ配列
配列番号４４： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ１
配列番号４５： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ２ ＤＮＡ配列
配列番号４６： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ２
配列番号４７： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列
配列番号４８： 抗ヒトＩＤＥ（クローンＨ３ ＶＬ） － ＣＤＲ３
配列番号４９： 野性型ＩＤＥのコード配列
配列番号５０： 野性型ＩＤＥのポリペプチド配列
配列番号５１： ＩＤＥ － Ｅ１１１Ｑ変異有、コード配列
配列番号５２： ＩＤＥ － Ｅ１１１Ｑ変異有、ポリペプチド配列
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】