▶ イッサム・リサーチ・ディベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-17
(54)【発明の名称】培養培地中でのＦＧＦ活性化剤の利用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/00 20060101AFI20230310BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20230310BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20230310BHJP
【ＦＩ】
C12N5/00
C12N1/00 G
C12N5/077
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022544321
(86)(22)【出願日】2021-01-20
(85)【翻訳文提出日】2022-09-08
(86)【国際出願番号】 IB2021050419
(87)【国際公開番号】W WO2021148960
(87)【国際公開日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】62/963,819
(32)【優先日】2020-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】592024572
【氏名又は名称】イッサム・リサーチ・ディベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100188374
【弁理士】
【氏名又は名称】一宮 維幸
(72)【発明者】
【氏名】ナーミアス，ヤーコブ
(72)【発明者】
【氏名】アヤシュ，ムニーフ
(72)【発明者】
【氏名】パシッカ，ローラ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BB32
4B065BB34
4B065BB40
4B065BC01
4B065BD39
4B065CA41
(57)【要約】
本開示は、一部では、無血清培地及び１つ又はそれ以上の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）活性化剤を含む細胞培養培地、細胞培養培地及び使用のための説明書を含むキット、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖させる方法、及び細胞培養培地を使用して培養肉を生産する方法、並びにそのように生産された培養肉を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
無血清培地及び１つ又はそれ以上の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）活性化剤を含む細胞培養培地。
【請求項2】
前記培地が、１ｎｇ／ｍｌ未満のＦＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、又はこれらの組合せを含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項3】
前記培地が、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項4】
前記１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤が、ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する１つ又はそれ以上の小分子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項5】
前記１つ又はそれ以上の小分子が、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のためのＦＧＦ２１類似体、インドール誘導体、Ｗｎｔ経路の活性化剤、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質、ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的、又はこれらの組合せを含む、請求項４に記載の細胞培養培地。
【請求項6】
前記１つ又はそれ以上の小分子が、インドール誘導体を含む、請求項５に記載の細胞培養培地。
【請求項7】
前記インドール誘導体が、ＩＤ－８である、請求項６に記載の細胞培養培地。
【請求項8】
前記１つ又はそれ以上の小分子が、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質を含む、請求項４に記載の細胞培養培地。
【請求項9】
前記マクロライド系抗生物質が、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む、請求項８に記載の細胞培養培地。
【請求項10】
前記１つ又はそれ以上の小分子が、ＩＤ－８及びＦＫ－５０６を含む、請求項５に記載の細胞培養培地。
【請求項11】
ＩＤ－８が、約０．５μＭ～約５０μＭの濃度である、請求項７又は１０に記載の細胞培養培地。
【請求項12】
ＩＤ－８が、約１μＭ～約１０μＭの濃度である、請求項１１に記載の細胞培養培地。
【請求項13】
ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である、請求項９又は１０に記載の細胞培養培地。
【請求項14】
前記ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である、請求項１３に記載の細胞培養培地。
【請求項15】
ＩＤ－８が、約０．５μＭ～約５０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である、請求項１０に記載の細胞培養培地。
【請求項16】
ＩＤ－８が、約１μＭ～約１０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である、請求項１５に記載の細胞培養培地。
【請求項17】
前記１つ又はそれ以上の小分子が、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のためのＦＧＦ２１類似体を含む、請求項５に記載の細胞培養培地。
【請求項18】
前記ＦＧＦ２１類似体が、ＰＦ－０５２３１０２３である、請求項１７に記載の細胞培養培地。
【請求項19】
前記１つ又はそれ以上の小分子が、Ｗｎｔ経路の活性化剤を含む、請求項５に記載の細胞培養培地。
【請求項20】
前記活性化剤が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の阻害剤である、請求項１９に記載の細胞培養培地。
【請求項21】
前記活性化剤が、１－アザケンパウロンである、請求項２０に記載の細胞培養培地。
【請求項22】
前記１つ又はそれ以上の小分子が、ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的を含む、請求項５に記載の細胞培養培地。
【請求項23】
前記標的が、ＥＲＫ経路を活性化することによってＦＧＦ経路を過活性化する阻害剤である、請求項２２に記載の細胞培養培地。
【請求項24】
前記阻害剤が、Ｄｕｓｐ６阻害剤である、請求項２３に記載の細胞培養培地。
【請求項25】
前記Ｄｕｓｐ６阻害剤が、（Ｅ／Ｚ）－ＢＣＩ塩酸塩である、請求項２４に記載の細胞培養培地。
【請求項26】
請求項１～２５のいずれか一項に記載の細胞培養培地及び使用のための説明書を含むキット。
【請求項27】
請求項１～２５のいずれか一項に記載の細胞培養培地中で細胞を培養するステップ、及び培養細胞から培養肉を生産するステップを含む、培養肉を生産する方法。
【請求項28】
前記細胞が、食用動物由来である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記食用動物が、家畜、狩猟動物、家禽、魚、甲殻類、又は軟体動物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記細胞が、線維芽細胞を含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記線維芽細胞が、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法によって生産される培養肉。
【請求項33】
前記細胞が、単一細胞懸濁液として培養される、請求項２７に記載の方法。
【請求項34】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞又はＥＢ６６細胞を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
請求項１～２５のいずれか一項に記載の細胞培養培地中で細胞を培養するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖させる方法。
【請求項36】
細胞培養培地中の１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤の使用であって、前記培地が、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く、使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０２０年１月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／９６３８１９号の優先権の利益を主張する。
[0001]本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０２０年１月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／９６３８１９号の優先権の利益を主張する。
【0002】
技術分野
[0002]本発明は、一般に、細胞増殖に関する。より詳細には、本発明は、１つ又はそれ以上の線維芽細胞増殖因子活性化剤を含む無血清細胞増殖培地及び培地中で細胞を増殖させ、それにより培養肉を生産する方法に関する。
[0002]本発明は、一般に、細胞増殖に関する。より詳細には、本発明は、１つ又はそれ以上の線維芽細胞増殖因子活性化剤を含む無血清細胞増殖培地及び培地中で細胞を増殖させ、それにより培養肉を生産する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
[0003]現在の世界人口は７０億人を超え、依然として急速に増加している。この人口増加の栄養所要量を支えるため、ますます広い土地が食料生産に割り当てられる。天然源は要求を満たすのには不十分である。これは、世界の一部の地域では食料不足をもたらす。世界の他の地域では、問題は、厳しい条件下の密集した工場式農場での動物の大規模生産によって対処されている。この大規模生産は、動物に多大な苦痛をもたらすだけでなく、食品効率を増加させ、感染を制御するために使用する有機ヒ素化合物及び抗生物質により肉製品のヒ素レベル及び薬剤耐性菌も増加させ、したがって、動物とヒトの両方で疾患の数をさらに増加させ、その結果を悪化させる。現在の食料要求を満たすためには大規模な屠殺が必要であり、結果として、ブタペスチウイルス及び狂牛病の出現など、大規模な疾患の発生をもたらし得る。これらの疾患は、ヒトの消費のための食肉の不足を生じ、したがってそもそも動物が飼育される目的を完全に否定する。
【0004】
[0004]さらに、大規模生産は、最終製品の風味を低下させる。バタリー不使用で産ませた卵及びバタリー不使用で生産された肉を供給することができるものが好まれる。味だけの問題ではなく、それにより成長ホルモンのような様々な食品添加物の消費を避ける健康上の選択もある。大量の動物生産と関連する別の問題は、動物からの莫大な排泄物によって引き起こされ、続いて環境が対応しなければならない環境問題である。さらに、他の作物の生育、住宅、レクリエーション、野生及び森林のような代替の目的のために使用できない、動物又は動物の飼料の生産に現在必要とされる広大な土地は問題である。
【0005】
[0005]当技術分野で公知の技術の主な問題の１つは、生産に長時間かかり、コストが非常に高く、製品が、家畜由来の現在の肉を置き換えることができない及び置き換えないであろう平凡な質であることである。例えば、Ｊｕｓｔ－Ｉｎｃ．は、抽出した動物細胞を培地中で増殖させてチキンナゲットを製造したが、その製造コストは、ナゲット当たり５０ドルかかる。
【0006】
[0006]ヒト又は動物への投与のための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験又はｅｘ ｖｉｖｏ培養のため、細胞、例えば哺乳動物細胞又は昆虫細胞の培養は、ヒト疾患の研究及び処置の重要な手段である。細胞培養は、様々な生物学的に活性な製品、例えばウイルスワクチン、モノクローナル抗体、ポリペプチド増殖因子、ホルモン、酵素、腫瘍特異的抗原及び食品製品の生産に広く使用される。しかしながら、細胞を培養するために使用される多くの培地又は方法は、細胞増殖及び／又は未分化細胞培養の維持に負の効果を有し得る成分を含む。例えば、哺乳動物又は昆虫細胞培養培地は、培養中の細胞の増殖及び成長を促進する増殖因子、キャリアタンパク質、接着及び拡散因子、栄養及び微量元素を提供するため、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＢＳ）のような血液由来血清を補充することが多い。しかしながら、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）ベータ又はレチノイン酸のような、ＦＣＳ又はＦＢＳに見出される因子は、ある特定の細胞型の分化を促進する（Ｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１３７：８３３－４３，１９９０）か又は培養中の望まない細胞活性を促進する細胞の意図しない下流のシグナル伝達を開始する（Ｖｅｌｄｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１１）：１１５１－６，２００６）ことができる。
【0007】
[0007]培養培地のコストは、培養肉生産のコストの主要因である。培養培地は、炭水化物、アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む比較的簡単な基本培地と、アルブミン、増殖因子、酵素、接着因子及びホルモンを含むより高価な血清代替物成分から構成される。動物成分の使用を除くため、現在、産業は、細胞治療及びワクチン生産への適用のための組換えヒトタンパク質に頼っている。しかしながら、培養肉適用はヒトタンパク質の使用に限定されず、したがって、ヒトの消費に好適な材料のより容易に入手可能な供給源を利用することができる可能性がある。
【0008】
[0008]線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、ヘパリン結合細胞シグナル伝達タンパク質のファミリーである。ＦＧＦファミリーのメンバーは、胚発生、器官形成、細胞増殖、細胞遊走、細胞分化及びインテグリン発現を含む、広範な生物学的プロセスに関与する多機能タンパク質である（Ｂｕｒｇｅｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５８，５７５－６０６，１９８９；Ｒｉｆｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０９，１－６，１９８９；Ｂａｓｉｌｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９，１１５－１６５，１９９２）。哺乳動物では、ＦＧＦスーパーファミリーには、２０を超える異なるサブファミリーメンバータンパク質があり、そのうち１８のサブファミリーメンバーは４つのシグナル伝達チロシンキナーゼＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）と相互作用する（Ｂｅｅｎｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ８，２３５－２５３，２００９）。この相互作用は、ホスホリパーゼＣ－γ（ＰＬＣγ）、ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を含むいくつかのシグナル伝達経路の下流の活性化をもたらす。
【0009】
[0009]ＦＧＦは、重要なマイトジェンである。それらは、細胞治療、グリコシル化タンパク質、ワクチン及び培養肉の生物学的製造のための培養培地の重要な成分である。動物由来又は組換えヒトＦＧＦのコストは、培養培地のコストのかなりの割合であり、培養肉の製品化の主な障害である。さらに、治療応用及び培養肉のため、既知の化学組成条件下で、動物成分を含まない（ゼノフリー）培地中で細胞を培養することが好ましい。したがって、ＦＧＦに代わる小分子を見出すことは、培養肉及び細胞治療の分野で有望な利点を提供するであろう。したがって、増殖又は接着因子血清成分の望まない副作用のない細胞培養培地の必要性がある。本開示は、この長年の要求を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
[0010]本開示は、一部では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路を活性化することができる小分子の同定に基づく。これらの小分子、又はＦＧＦ活性化剤としては、限定はされないが、ＰＦ－０５２３１０２３（Ｔ２ＤＭのためのＦＧＦ２１類似体）、ＩＤ－８（インドール誘導体）、１－アザケンパウロン（Ｗｎｔ経路の活性化剤）、タクロリムス（ＦＫ－５０６）（マクロライド系抗生物質）、及び（Ｅ／Ｚ）－ＢＣＩ塩酸塩（ＥＧＦを過活性化するＤｕｓｐ６阻害剤）、又はこれらの組合せが挙げられる。これらの長時間作用小分子は、培養培地中のＥＧＦの効果を置き換え、コスト効果がある細胞増殖を支持することができる。培養培地中でのそのような小分子の使用は、培養肉の生産のための培地のコストを著しく削減する。
【0011】
[0011]本開示の一態様は、無血清培地及び１つ又はそれ以上の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）活性化剤を含む細胞培養培地を提供する。
[0012]一部の実施形態では、細胞培養培地は、１ｎｇ／ｍｌ未満の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、又はこれらの組合せを含む。
[0012]一部の実施形態では、細胞培養培地は、１ｎｇ／ｍｌ未満の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、又はこれらの組合せを含む。
【0012】
[0013]一部の実施形態では、細胞培養培地は、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く。一部の実施形態では、タンパク質ベース増殖因子は、細胞成長及び増殖を刺激する。一部の実施形態では、ペプチドベースホルモンはインシュリンである。一部の実施形態では、ステロイドベースホルモンは、コルチゾン又はその誘導体である。
【0013】
[0014]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する１つ又はそれ以上の小分子である。一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のためのＦＧＦ２１類似体、インドール誘導体、Ｗｎｔ経路の活性化剤、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質、ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的、又はこれらの組合せを含む。
【0014】
[0015]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のためのＦＧＦ２１類似体を含む。一部の実施形態では、ＦＧＦ２１類似体は、ＰＦ－０５２３１０２３である。
【0015】
[0016]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、インドール誘導体を含む。一部の実施形態では、インドール誘導体は、ＩＤ－８である。
[0017]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、Ｗｎｔ経路の活性化剤を含む。一部の実施形態では、活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の阻害剤である。一部の実施形態では、活性化剤は、１－アザケンパウロンである。
[0017]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、Ｗｎｔ経路の活性化剤を含む。一部の実施形態では、活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の阻害剤である。一部の実施形態では、活性化剤は、１－アザケンパウロンである。
【0016】
[0018]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質を含む。一部の実施形態では、マクロライド系抗生物質は、タクロリムス（ＦＫ－５０６）である。
【0017】
[0019]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的を含む。一部の実施形態では、標的は、ＥＲＫ経路を活性化することによりＦＧＦ経路を過活性化する阻害剤である。一部の実施形態では、阻害剤は、Ｄｕｓｐ６阻害剤である。一部の実施形態では、Ｄｕｓｐ６阻害剤は、（Ｅ／Ｚ）－ＢＣＩ塩酸塩である。
【0018】
[0020]一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約０．５μＭ～約５０μＭの濃度である。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約１μＭ～約１０μＭの濃度である。
[0021]一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である。
[0021]一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である。
【0019】
[0022]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、ＩＤ－８及びＦＫ－５０６を含む。
[0023]さらに一部の実施形態では、ＩＤ－８は約０．５μＭ～約５０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６は約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である。
[0023]さらに一部の実施形態では、ＩＤ－８は約０．５μＭ～約５０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６は約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である。
【0020】
[0024]一部の実施形態では、ＩＤ－８は約１μＭ～約１０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である。
[0025]本開示の別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地及び使用のための説明書を含むキットを提供する。
[0025]本開示の別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地及び使用のための説明書を含むキットを提供する。
【0021】
[0026]本開示のさらに別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地中で細胞を培養することによって培養肉を生産する方法及び培養細胞から培養肉を生産する方法を提供する。
【0022】
[0027]一部の実施形態では、細胞は、食用動物由来である。一部の実施形態では、食用動物は、家畜、狩猟動物、家禽、魚、甲殻類、又は軟体動物である。
[0028]一部の実施形態では、方法は培養細胞を含み、細胞は線維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞は、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である。
[0028]一部の実施形態では、方法は培養細胞を含み、細胞は線維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞は、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である。
【0023】
[0029]本開示のさらに別の態様は、上記及び本明細書に開示される方法によって生産された培養肉を提供する。
[0030]本開示のさらに別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地中で細胞を培養することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖させる方法を提供する。
[0030]本開示のさらに別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地中で細胞を培養することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖させる方法を提供する。
【0024】
[0031]本発明のさらなる態様は、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く細胞培養培地中の１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤の使用を提供する。
【0025】
[0032]本発明の前述の態様及び他の特徴は、添付の図面に関して以下の記載で説明される；
【図面の簡単な説明】
【0026】
【発明を実施するための形態】
【0027】
[0036]本開示の原理の理解を促進する目的のため、ここで実施形態が参照され、特定の言語がそれを記載するために使用されるであろう。しかしながら、それにより本開示の範囲の限定が意図されず、本明細書に示したように本開示のそのような変更及びさらなる改変は、本開示が関連する当業者に通常想起されるであろうと考えられる。
【0028】
[0037]本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、本発明を限定することを意図しない。
[0038]本明細書で使用される場合、「任意のタンパク質ベース増殖因子を欠く」若しくは「線維芽細胞増殖因子を欠く」細胞培養培地、又は「任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く」若しくは「線維芽細胞増殖因子を本質的に欠く」細胞培養培地は、任意の検出可能な量のタンパク質ベース増殖因子又は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含まない培地を指す。用語「非検出可能」は、本開示の時点で当業者に公知の検出の標準的な方法に基づくと理解される。一部の実施形態では、培地は、１ｎｇ／ｍｌ未満（０ｎｇ／ｍｌ～１ｎｇ／ｍｌ未満）のタンパク質ベース増殖因子又はＦＧＦを含み得る。一部の実施形態では、培地は、０．５ｎｇ／ｍｌ未満（０ｎｇ／ｍｌ～０．５ｎｇ／ｍｌ未満）のタンパク質ベース増殖因子又はＦＧＦを含み得る。一部の実施形態では、培地は、０．１ｎｇ／ｍｌ未満（０ｎｇ／ｍｌ～０．１ｎｇ／ｍｌ未満）のタンパク質ベース増殖因子又はＦＧＦを含み得る。
[0038]本明細書で使用される場合、「任意のタンパク質ベース増殖因子を欠く」若しくは「線維芽細胞増殖因子を欠く」細胞培養培地、又は「任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く」若しくは「線維芽細胞増殖因子を本質的に欠く」細胞培養培地は、任意の検出可能な量のタンパク質ベース増殖因子又は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含まない培地を指す。用語「非検出可能」は、本開示の時点で当業者に公知の検出の標準的な方法に基づくと理解される。一部の実施形態では、培地は、１ｎｇ／ｍｌ未満（０ｎｇ／ｍｌ～１ｎｇ／ｍｌ未満）のタンパク質ベース増殖因子又はＦＧＦを含み得る。一部の実施形態では、培地は、０．５ｎｇ／ｍｌ未満（０ｎｇ／ｍｌ～０．５ｎｇ／ｍｌ未満）のタンパク質ベース増殖因子又はＦＧＦを含み得る。一部の実施形態では、培地は、０．１ｎｇ／ｍｌ未満（０ｎｇ／ｍｌ～０．１ｎｇ／ｍｌ未満）のタンパク質ベース増殖因子又はＦＧＦを含み得る。
【0029】
[0039]本明細書で使用される場合、「タンパク質ベース増殖因子」は、細胞成長及び増殖を刺激し、限定はされないが、ＦＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、又はこれらの組合せが挙げられる。
【0030】
[0040]本明細書で使用される場合、「無血清」培地は、動物又はヒト血清を含有せず、成分が動物から由来しない、得られない、産生されない、又は生産されない培地を指す。成分は、組換えにより生産されるか又は植物若しくは動物以外の供給源由来であるかのいずれかであると考えられる。
【0031】
[0041]本明細書で使用される場合、「基本培地（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉａ）」、「基本培地（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）」、「基本培地（ｂａｓｅ ｍｅｄｉａ）」、「基本培地（ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ）」、「基本栄養培地（ｂａｓｅ ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）」、又は「基本栄養培地（ｂａｓｅ ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ ｍｅｄｉａ）」は、正常な細胞代謝に必須の、並びに細胞内外の浸透圧の平衡を維持する水及びある特定のバルク無機イオンを細胞に提供する、基本塩栄養（複数可）又は塩の水溶液（複数可）及び他の要素を指す。一部の実施形態では、基本培地は、エネルギー源として少なくとも１つの炭水化物、及び／又は生理学的なｐＨ範囲内に培地を維持する緩衝システムを含む。市販の基本培地の例としては、限定はされないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２、α－最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地、又はＸ－ＶＩＶＯ（Ｌｏｎｚａ）のような多能性細胞との使用のために改変された多目的培地、又は造血基本培地が挙げられる。
【0032】
[0042]本明細書で使用される場合、「完全培地」は、細胞増殖に貢献することができる、増殖因子、ホルモン、タンパク質、血清又は血清代替物、微量元素、糖、抗生物質、抗酸化剤等のような、添加したサプリメントをさらに含む基本培地を指す。例えば、市販の完全培地は、エタノールアミン、グルタチオン（還元）、アスコルビン酸リン酸、インシュリン、ヒトトランスフェリン、脂質リッチウシ血清アルブミン、微量塩、亜セレン酸ナトリウム、メタバナジン酸（ｍａｔａｖａｎａｄａｔｅ）アンモニウム、硫酸銅及び塩化マンガン（ＤＭＥＭ ＡＤＶＡＮＣＥＤ（商標）培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のようなサプリメントを含む。
【0033】
[0043]本明細書で使用される場合、「液体ベース混合物」又は「ベース生理学的緩衝液混合物」は、細胞培養培地組成物を完成させるためにリポソームが懸濁される血清代替物又は培地サプリメントのベース溶液を指す。細胞培養の細胞に融合される／取り込まれる場合、リポソームが細胞へと液体ベース混合物を送達するように、液体ベース混合物をリポソームにロードすることが考えられる。本明細書では、液体ベース混合物又はベース生理学的緩衝液体混合物が、リポソーム及び／又は本明細書の他の成分と併せて使用され、血清代替物、完全培地、培地サプリメント、又は細胞凍結保存培地を形成することができる、基本培地、完全培地又は生理学的緩衝溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び他の平衡塩類溶液であることも考えられる。
【0034】
[0044]本明細書で使用される場合、「培地」又は「細胞培養培地」は、細胞の増殖、生存能、又は保存を提供する水ベース溶液を指す。本明細書で検討する培地は、１つ又はそれ以上の栄養素を補充し、所望の細胞活性、例えば培地中で培養した細胞の細胞生存能、成長、増殖、分化を促進することができる。培地は、本明細書で使用される場合、血清代替物、培地サプリメント、完全培地又は細胞凍結保存培地を含む。培養培地のｐＨは、微生物が増殖するのに好適であるはずである。ほとんどの細菌はｐＨ６．５～７．０で増殖するが、ほとんどの動物細胞はｐＨ７．２～７．４で成長する。
【0035】
[0045]本明細書で使用される場合、「培地サプリメント」は、細胞の培養の前に基本培地に添加される薬剤又は組成物を指す。培地サプリメントは、培養での細胞増殖に有益な薬剤、例えば増殖因子（複数可）、ホルモン（複数可）、タンパク質（複数可）、血清又は血清代替物、微量元素（複数可）、糖（複数可）、抗生物質（複数可）、抗酸化剤（複数可）等であり得る。典型的には、培地サプリメントは、細胞培養に適切な最終濃度に達するまで完全又は基本培地へと希釈される所望のサプリメントの濃縮溶液である。
【0036】
[0046]本明細書で使用される場合、「血清代替物」又は「血清代替物培地」は、培養中での細胞増殖及び生存を促進するために、基本培地と併せて又は完全培地として使用され得る組成物を指す。血清代替物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の培養のため、培地に特徴的に添加される任意の血清の代替物として基本又は完全培地で使用される。血清代替物は、培養中の細胞の増殖及び生存のためのタンパク質及び他の因子を含むことが考えられる。血清代替物は、細胞培養での使用の前に基本培地へと添加される。血清代替物は、血清代替物が細胞培養の無血清完全培地として有用であるように、基本培地及び、塩、アミノ酸、ビタミン、微量元素、抗酸化剤等のような基本栄養素を含み得ることがさらに考えられる。
【0037】
[0047]本明細書で使用される場合、用語「結合組織細胞」は、結合組織を作り上げる様々な細胞型を指す。例えば、結合組織細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞及び平滑筋細胞、又は線維芽細胞から自然に分化され得る細胞型である。本明細書で使用される場合、用語「自然分化（ｎａｔｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」又は「自然分化形態（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆｏｒｍ）」は、自然に生じる分化を指すために使用され、実験室で人工的に達成され得るもののような分化転換を指すためには使用されず、また脱分化ではない。線維芽細胞から自然に分化され得る細胞型としては、軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋線維芽細胞、衛星細胞、筋芽細胞、及び筋細胞が挙げられる。結合組織細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又はＭＳＣ若しくは多能性細胞に由来する細胞ではない。
【0038】
[0048]一部の実施形態では、結合組織細胞は、軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋線維芽細胞、衛星細胞、筋芽細胞、及び筋細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、結合組織細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋線維芽細胞、衛星細胞、筋芽細胞、及び筋細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、結合組織細胞は、線維芽細胞である。
【0039】
[0049]本明細書で使用される場合、語句「自然発生的に不死化した線維芽細胞（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）」は、不死化を引き起こす人為的な突然変異、例えば遺伝子操作に供されることなく、無制限に細胞分化、及び好ましくは細胞増殖も行うことができる線維芽細胞を指す。自然発生的に不死化した線維芽細胞は、非遺伝的に改変されている。
【0040】
[0050]本明細書で使用される場合、「小分子」は、約１ｎｍのオーダーの直径を有する、生物学的プロセスを制御し得る低分子量（＜９００ダルトン）有機化合物である。核酸及びタンパク質、並びに多くの多糖類のような大きな構造は小分子ではないが、それらの組成の単量体（それぞれリボ－又はデオキシリボヌクレオチド、アミノ酸及び単糖類）は小分子であると考えられることが多い。
【0041】
[0051]本明細書で使用される場合、１つ又はそれ以上の小分子（すなわち、ＦＧＦ活性化剤）に関して、用語「ＦＧＦシグナル伝達を置き換える」、「ＦＧＦを置き換える」、及び「ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する」は交換可能であり、これらの活性化剤が培養培地中でＦＧＦの効果を置き換え、コスト効果がある細胞増殖を支持する。
【0042】
[0052]本開示では、特に請求項及び／又は段落では、用語、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等は、米国特許法による意味を有することができ；例えば、それらは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができ；並びに「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のような用語は、米国特許法に帰する意味を有し、例えば明確に列挙されない要素を許容するが、先行技術に見出される、又は本発明の基本若しくは新規の特徴に影響する要素を除外することに注意されたい。
【0043】
[0053]無血清培地及び１つ又はそれ以上の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）活性化剤を含む細胞培養培地が本明細書で開示される。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く。また、上記及び本明細書に開示の細胞培養培地中で細胞を培養する方法、並びに培養肉の生産のためにそのような培養を利用する方法も本明細書に開示される。本明細書に開示される細胞培養培地は、キットでも使用され得る。驚くべきことに、ＦＧＦ活性化剤が増殖因子の代わりに細胞培養培地中で利用され、コスト効果のある細胞増殖を支持し得ることが発見された。培養培地中でのこれらのＦＧＦ活性化剤の使用は、培養肉の生産のための培地のコストを著しく削減する。
【0044】
[0054]ＦＧＦ活性化剤の中で、インドール誘導体、例えばＩＤ－８は、無血清培地中のマウスＥＳＣの自己再生を支持することが示されたが（Ｍｉｙａｂａｙａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７２，１２４２－１２４８，２００８）、ＩＤ－８、１－アザケンパウロン、及びタクロリムス（Ｔａｃｒｌｉｍｕｓ）の組合せは、無血清培地中のヒトＥＳＣの自己再生を支持することが見出された（Ｙａｓｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ２，１７３－１８２，２０１８）。ＩＤ－８は、二重特異性チロシンリン酸化制御キナーゼ（ＤＹＲＫ）の化学阻害剤である。１－アザケンパウロンは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の強力な、選択的阻害剤であり、したがってＷｎｔ経路を活性化する。タクロリムス（ＦＫ－５０６）は、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質である。タクロリムスは、インターロイキン２遺伝子転写、一酸化窒素合成酵素活性化、細胞脱顆粒、及びアポトーシスのような、カルシウム依存性イベントの阻害をもたらすカルシニューリンホスファターゼを阻害する（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ １７，５８４－５９１，１９９５）。別の小分子、ＰＦ０５２３１０２３は、ＦＧＦ２１の類似体として働くことが報告された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ ４３，４１１－４２５，２０１６）。
【0045】
[0055]ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的化は、ＦＧＦを置き換えることができる小分子を見出す別の手法である。これらの阻害剤の１つは、（Ｅ／Ｚ）－ＢＣＩ塩酸塩であり、ＥＲＫ経路を活性化することによりＦＧＦ経路を過活性化するＤｕｓｐ６阻害剤が、ゼブラフィッシュ心臓モデルで示された（Ｍｏｌｉｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５，６８０－６８７，２００９）。
【0046】
[0056]本開示は、細胞培養培地中の１つ又はそれ以上の増殖因子活性化剤、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナル伝達を置き換える１つ又はそれ以上の小分子の添加を考える。したがって、本開示の一態様は、無血清培地及び１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤を含む細胞培養培地を提供する。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く。一部の実施形態では、１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する１つ又はそれ以上の小分子である。
【0047】
[0057]哺乳動物は、１８個のＦＧＦ型（ＦＧＦ１～ＦＧＦ１０及びＦＧＦ１６～ＦＧＦ２３）を含有し、系統発生及び配列相同性に基づき、６つの異なるサブファミリーにグループ分けされている。４つのＦＧＦは、類似の内部コアを共有し、ヘパリンと線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の両方に特徴的に高い結合親和性を有する。ＦＧＦＲは、ヘパリン結合配列、３つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン（Ｄ１～Ｄ３）、疎水性膜貫通ドメイン、及び細胞内スプリットチロシンキナーゼドメインを含有するチロシンキナーゼ受容体である。哺乳動物ＦＧＦＲファミリーは４つのメンバー（ＦＧＦＲ１～ＦＧＦＲ４）からなる。受容体のアミノ酸配列は高度に保存され、それらのリガンド親和性及び組織分布においてのみ違いがある。ＦＧＦＲの特徴は、Ｄ１ドメインとＤ２ドメインの間のリンカーにおけるセリンリッチな酸性配列である酸ボックスである（Ｂｅｅｎｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ８，２３５－２５３，２００９）。酸ボックス及びＤ１ドメインは、受容体自己抑制に役割を果たすと考えられる。Ｄ２～Ｄ３断片は、リガンド特異性及び結合に必要とされる。脊椎動物では、４つの遺伝子がＦＧＦＲ（ＦＧＦＲ１～ＦＧＦＲ４）をコードし、それらの細胞外ドメインにおいて選択的スプライシングされ、それらのリガンドに異なる親和性を有するＦＧＦＲ１～ＦＧＦＲ４の多くのバラエティーを作り出す。
【0048】
[0058]ＦＧＦシグナル伝達カスケードは、ＦＧＦリガンドのＦＧＦＲヘの結合によって開始される。ＦＧＦ結合後、リガンド依存的二量体化イベントが起こり、２つのＦＧＦ、２つのヘパリン硫酸鎖、及び２つのＦＧＦＲからなる複合体が形成される。各リガンドは両受容体に結合し、受容体はＤ２ドメインのパッチを介して互いに接触させる。これは、内因性のチロシンキナーゼドメインによる、各受容体単量体のトランスリン酸化を促進する。少なくとも７個のリン酸化部位が、ＦＧＦＲ１に関して同定された（Ｔｙｒ１６３、Ｔｙｒ５８３、Ｔｙｒ５８５、Ｔｙｒ６５３、Ｔｙｒ６５４、Ｔｙｒ７３０、及びＴｙｒ７６６）。ホスホチロシン基は、下流のシグナル伝達を制御するアダプタータンパク質のドッキング部位として寄与する。ＦＧＦシステムは、いくつかの下流のシグナル伝達経路と関連し、中でも最も理解されているのはＲＡＳ／マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ経路、ホスホイノシチド３（ＰＩ３）キナーゼ／ＡＫＴ経路、及びホスホリパーゼＣガンマ（ＰＬＣγ）経路である。
【0049】
[0059]ＦＧＦシグナル伝達と関連する主な下流の経路は、ＲＡＳ／ＭＡＰキナーゼ経路である。この経路は、細胞増殖及び分化の間に関与する。ＭＡＰキナーゼは、細胞外刺激に応答して作用し、様々な細胞過程を制御するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。ＭＡＰキナーゼエフェクターの例としては、ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、及びｐ３８マイトジェン活性化キナーゼが挙げられる。ＦＧＦリガンドがその受容体に結合後、シグナル伝達経路における必須のステップは、ドッキングタンパク質線維芽細胞増殖因子受容体基質２アルファ（ＦＲＳ２α）のチロシン残基のリン酸化である。これは、シグナル活性化と関連するアダプタータンパク質の結合を可能にする。ＦＲＳ２α、グアニンヌクレオチド交換因子２（ＧＲＢ２）、ＧＲＢ２関連結合タンパク質１（ＧＡＢ１）、セブンレスの息子（ＳＯＳ）、及びチロシンホスファターゼ（ＳＨＰ２）からなるＦＲＳ２複合体が次いで形成され、ＲＡＳ／ＭＡＰキナーゼ及びＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路の活性化を促進する。
【0050】
[0060]ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路は、細胞生存及び細胞運命決定と関連する。この経路は、細胞極性にも影響し得る。ＲＡＳ／ＭＡＰキナーゼ経路のように、ＦＲＳ２シグナル伝達複合体が形成されると、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ経路が開始される。次いでＧＡＢ１タンパク質は、ＰＩ３キナーゼによって活性化されたＦＧＦＲに連結する。ＰＩ３キナーゼの下流、ホスホイノシチド依存性キナーゼ及びＡＫＴ（抗アポトーシスタンパク質キナーゼ）が活性化される。
【0051】
[0061]活性化されたＦＧＦＲの別の標的分子は、ＰＬＣγである。この経路は、ＰＬＣγ分子が、受容体のリン酸化Ｔｙｒ７６６に結合すると活性化される。イノシトール三リン酸（ＩＰ３）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）は、次いで、活性化ＰＬＣγの加水分解によって生成される。ＩＰ３に応答して小胞体から放出されたＤＡＧ及び細胞質カルシウムは、共にタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する。完全に解明されてはいないが、ＰＬＣγキナーゼ経路は細胞形態学、遊走、及び接着に影響する。
【0052】
[0062]以下の表は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能である一般に認められたモジュレーター及び追加情報を含有する。
【0053】
【表1-1】
【0054】
【表1-2】
【0055】
[0063]表の略称：ＰＤ１６１５７０：１－Ｔｅｒｔ－ブチル－３－［６－（２，６－ジクロロ－フェニル）－２－（４－ジエチルアミノ－ブチルアミノ）－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］尿素；ＰＤ１６６２８５：６－（２，６－ジクロロフェニル）－２－［［４－［２－（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］－８－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－ｏｎｅ二塩酸塩；ＰＤ１６６８６６：１－［２－アミノ－６－（３，５－ジメトキシ－フェニル）－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］－３－ｔｅｒｔ－ブチル－尿素；ＰＤ１７３０７４：Ｎ－［２－［［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）－尿素；ＳＵ５４０２：３－［４－メチル－２－（２－ｏｘｏ－１，２－ジヒドロ－インドール－３－イリデンメチル）－１Ｈ－ピロール－３－イル］－プロピオン酸。
【0056】
[0064]ＦＧＦ受容体の公知の活性化剤はないが、複数の上流及び下流の活性化剤があり、その全てがモジュレートされＦＧＦ活性化剤となり得る。ＦＧＦシグナル伝達に関与する複数の経路があることから、本開示は、ＦＧＦ活性化を模倣する任意の経路に関与する小分子を意図する。
【0057】
[0065]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のためのＦＧＦ２１類似体、インドール誘導体、Ｗｎｔ経路の活性化剤、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質、ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的、又はこれらの組合せを含む。
【0058】
[0066]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のためのＦＧＦ２１類似体を含む。一部の実施形態では、ＦＧＦ２１類似体は、ＰＦ－０５２３１０２３である。
【0059】
[0067]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、インドール誘導体を含む。一部の実施形態では、インドール誘導体は、ＩＤ－８である。
[0068]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、Ｗｎｔ経路の活性化剤を含む。一部の実施形態では、活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の阻害剤である。一部の実施形態では、活性化剤は、１－アザケンパウロンである。
[0068]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、Ｗｎｔ経路の活性化剤を含む。一部の実施形態では、活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の阻害剤である。一部の実施形態では、活性化剤は、１－アザケンパウロンである。
【0060】
[0069]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質を含む。一部の実施形態では、マクロライド系抗生物質は、タクロリムス（ＦＫ－５０６）である。
【0061】
[0070]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的を含む。一部の実施形態では、標的は、ＥＲＫ経路を活性化することによりＦＧＦ経路を過活性化する阻害剤である。一部の実施形態では、阻害剤は、Ｄｕｓｐ６阻害剤である。一部の実施形態では、Ｄｕｓｐ６阻害剤は、（Ｅ／Ｚ）－ＢＣＩ塩酸塩である。
【0062】
[0071]１つ又はそれ以上の小分子の濃度（複数可）は、小分子（複数可）の活性に依存する。培地に添加する小分子（複数可）の最適な濃度の決定は、当業者の理解の範囲内である。一部の実施形態では、培地中の小分子（複数可）の濃度（複数可）は、約０．１ｎＭ～約１００μＭ、約１ｎＭ～約１０μＭ、又は約１０ｎＭ～約１μＭであり得る。一部の実施形態では、培地中の小分子（複数可）の濃度（複数可）は、約０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、０．６ｎＭ、０．７ｎＭ、０．８ｎＭ、０．９ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ又は１ｍＭであり得る。
【0063】
[0072]一部の実施形態では、１つ又はそれ以上の小分子は、ＩＤ－８、ＦＫ－５０６又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約０．５μＭ～約５０μＭの濃度である。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約０．５μＭ～約４０μＭの濃度である。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約０．５μＭ～約３０μＭの濃度である。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約０．５μＭ～約２０μＭの濃度である。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約０．５μＭ～約１０μＭの濃度である。
【0064】
[0073]一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約１μＭ～約５０μＭの濃度である。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約１μＭ～約４０μＭの濃度である。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約１μＭ～約３０μＭの濃度である。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約１μＭ～約２０μＭの濃度である。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約１μＭ～約１０μＭの濃度である。一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約１μＭ～約５μＭの濃度である。
【0065】
[0074]一部の実施形態では、ＩＤ－８は、約５μＭの濃度である。
[0075]一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約１０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約５ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である。
[0075]一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約１０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約５ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である。
【0066】
[0076]一部の実施形態では、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭの濃度である。
[0077]一部の実施形態では、ＩＤ－８は約０．５μＭ～約１０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６は約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である。
[0077]一部の実施形態では、ＩＤ－８は約０．５μＭ～約１０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６は約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である。
【0067】
[0078]さらに一部の実施形態では、ＩＤ－８は約１μＭ～約５μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６は、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である。
[0079]一部の実施形態では、無血清培地は、動物夾雑物を本質的に欠く。
[0079]一部の実施形態では、無血清培地は、動物夾雑物を本質的に欠く。
【0068】
[0080]一部の実施形態では、無血清培地は、ヒト夾雑物を本質的に欠く。
[0081]一部の実施形態では、無血清培地は、任意の抗生物質薬を本質的に欠く。
[0082]本開示の別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地中で細胞を培養することによって培養肉を生産する方法及び培養細胞から培養肉を生産する方法を提供する。本開示のさらなる態様は、本明細書に開示の方法によって生産される培養肉を提供する。
[0081]一部の実施形態では、無血清培地は、任意の抗生物質薬を本質的に欠く。
[0082]本開示の別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地中で細胞を培養することによって培養肉を生産する方法及び培養細胞から培養肉を生産する方法を提供する。本開示のさらなる態様は、本明細書に開示の方法によって生産される培養肉を提供する。
【0069】
[0083]一部の実施形態では、細胞は、食用動物由来である。一部の実施形態では、細胞の供給源は、消費に望ましい任意の食用種であり、限定はされないが、家畜、狩猟動物、家禽、魚、貝類、甲殻類、及び軟体動物が挙げられる。
【0070】
[0084]一部の実施形態では、細胞の供給源は、家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラム、ウマ、ロバ、ウサギ、及びラバである。一部の実施形態では、細胞の供給源は、伝統的に「狩猟動物」と考えられる動物、例えばカリブー、クマ、イノシシ、シカ、ヘラジカ、及びムースである。一部の実施形態では、細胞の供給源は、家禽、例えばニワトリ、カモ、ガン、ホロホロチョウ、ウズラ、及びシチメンチョウである。一部の実施形態では、細胞の供給源は、魚、例えばバス、コイ、ナマズ、マジェランアイナメ、タラ、カレイ、オヒョウ、マヒマヒ、アンコウ、カワカマス、パーチ、オレンジラフィー、サケ、ニシンダマシ、フエダイ、メカジキ、ティラピア、マス、及びマグロである。一部の実施形態では、細胞の供給源は、甲殻類、例えばカニ、ザリガニ、ロブスター、クルマエビ、及びシュリンプである。一部の実施形態では、細胞の供給源は、軟体動物、例えば、二枚貝、ムラサキガイ、タコ、カキ、ホタテガイ、及びイカである。
【0071】
[0085]一部の実施形態では、方法は、培養細胞を含み、細胞は線維芽細胞である。線維芽細胞は、食用動物由来であり得る。一実施形態では、線維芽細胞は、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である。
【0072】
[0086]ニワトリ胚線維芽細胞は、ウイルス及びワクチンの製造に広く使用される。ニワトリ胚肝臓細胞と共に、それらは特定の病原体フリー（ＳＰＦ）の胚から生産され、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）及び他の会社によって販売される。ニワトリ肝臓細胞は、それらの哺乳動物相対物のように、培養で限定的な増殖を示すが、ニワトリ線維芽細胞は、腫瘍化せずに自然に不死化する前に、約２．６トンの細胞を生産する、３０を超えて集団倍加することができる。ＵＭＮＳＡＨ／ＤＦ－１（ＣＲＬ－１２２０３）のような、自然に形質転換したニワトリ線維芽細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から直接購入することができる。線維芽細胞の増殖能は優れているが、細胞は主に食べられない結合組織を形成する。
【0073】
[0087]ニワトリ胚内皮は、容易に単離され得るが、それらの増殖能は未知であり、器官特異的であり得る。マウス内皮細胞は、３０集団倍加することができるが、ヒト内皮細胞はめったに１２集団倍加を超えない。ニワトリ胚筋肉細胞（筋細胞）は同様に単離され得るが、非常に限定された増殖能を有する。マウス及びヒト肉細胞は、めったに１２集団倍加を超えない。筋形成、新しい筋肉組織の形成は、ほとんどの種において、一生の新生児期を過ぎると一般的ではない。本開示の小分子は、この挙動を調節するために概念的に使用され得る。
【0074】
[0088]多くのグループが、ここ１０年にわたり、ニワトリ胚幹細胞（ｃＥＳＣ）を生産した。細胞は、受精したニワトリ卵から単離され、本質的に不死である。ニワトリ人工多能性幹細胞（ｃｉＰＳＣ）は、再プログラム化因子ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣによりウズラ胚線維芽細胞から、より近年では、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣを使用してニワトリ線維芽細胞から生産された。細胞は、本質的に不死であるが、遺伝的に操作されている。
【0075】
[0089]近年、マウス多能性幹細胞は、筋細胞、肝細胞、及び内皮細胞並びに複合胚葉体を含む、複数の細胞型の分化を可能にする小分子を使用して線維芽細胞から誘導された。ｃｉＰＳＣの化学誘導は、線維芽細胞を他の細胞型に変換する代替の手法を提供する。
【0076】
[0090]化学化合物は、増殖因子の魅力的な代替物を提供し、遺伝子工学は、通常細胞増殖を支持するか、又は再プログラミング若しくは分化によって１つの細胞型から別の細胞型に変換するために使用される。小分子は高価ではなく、ロット間変異性が低く、非免疫原性であり、よりずっと安定である。一研究では、ハイコンテントスクリーニングを使用して、ＦＰＨ１及びＦＰＨ２、一次ヒト肝細胞の増殖を促進する小分子を同定した（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４１（６１４６）：６５１－６５４，２０１３）。この手法は、小分子が無血清培地中で増殖因子を置き換えることができるため、魅力的であり、安定性を増加させる一方で、コストを劇的に削減する。
【0077】
[0091]より近年の研究では、ヒト線維芽細胞の心筋細胞への変換を誘導する９つの化合物の組合せが同定されたが（Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：５１４－５２０，２０１３）、その他は、７つの化合物の組合せを使用してマウス線維芽細胞を形質転換する（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２（６２９０）：１２１６－１２２０，２０１６）。多くのシグナル伝達経路が異なる動物間で保存されることを考慮して、比較的類似の組合せを使用してニワトリ線維芽細胞を筋細胞に形質転換することができる。
【0078】
[0092]上記のように、細胞培養培地は、接着因子、脂肪酸、増殖因子、ホルモン、及びアルブミンを提供するウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有することが多い。ＦＢＳは、通常、トランスフェリン、インシュリン、及び脂質の多いウシ血清アルブミンに加えてアミノ酸、ビタミン、及び微量元素から構成される血清代替物（例えばＫＯ血清）と置き換えることができる。トランスフェリンとインシュリンの両方が、組換え技術を使用して細菌において生産されるが、アルブミンは通常動物由来である。しかしながら、植物及び細菌由来組換えヒトアルブミン（例えばＣｅｌｌａｓｔｉｍ（商標））は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む、いくつかの会社から入手できる。
【0079】
[0093]ニワトリ線維芽細胞培地は、伝統的には、１０％ ＦＢＳ、トリプトースリン酸及びグルタミンを補充したＭＩ ９９培地から構成される。しかしながら、哺乳動物線維芽細胞の増殖のための無血清培地は、現在、容易に入手できる。培地は、０．５ｍｇ／ｍＬアルブミン、０．６μＭリノレン酸、０．６μｇ／ｍＬレシチン、５ｎｇ／ｎｉＬ ｂＥＧＦ、５ｎｇ／ｎｉＬ ＥＧＦ、３０ｐｇ／ｍＬ ＴＧＦｐｉ、７．５ｍＭグルタミン、１μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、及び５μｇ／ｍＬインシュリンを補充したＭＩ ９９培地から構成される。この培地ＰＳＣ－２０１－０４０は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手でき、ヒト線維芽細胞の４倍速い増殖を支持することが報告されている。ニワトリ肝細胞は、ヒト及びマウス肝細胞のために設計された無血清培養培地によって同様に支持される。培地は、アルブミン、インシュリン、トランスフェリン、及びヒドロコルチゾンを補充したＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ基本培地から構成される。
【0080】
[0094]灌流した培養培地は、酸素担体も含み得る。ヘモグロビンベースの酸素担体は、組換え又は化学改変のいずれかのヘモグロビン誘導体、カプセル化ヘモグロビン又は改変（例えば架橋）赤血球を含む。代替物は、Ｎａｈｍｉａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０（１４）：２５３１－２５３３）において開発されたもののような、パーフルオロカーボンベースの代替物を含む。
【0081】
[0095]通常、一次線維芽細胞は、限定細胞分化でき、したがって、約３０集団倍加（例えば１０継代）後に細胞性老化することに注意すべきである。不死化線維芽細胞系を生成する方法は、公知の方法を使用するテロメラーゼ遺伝子、又はＳＶ４０、又はＨＰＶＥ６／Ｅ７遺伝子の導入による遺伝子操作を含む。
【0082】
[0096]他の鳥類の線維芽細胞、例えばカモ、ガン、及びウズラ線維芽細胞も好適であると考えられる。
[0097]本開示のさらに別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地中で細胞を培養することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖する方法を提供する。
[0097]本開示のさらに別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地中で細胞を培養することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖する方法を提供する。
【0083】
[0098]本発明のさらなる態様は、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く細胞培養培地中の１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤の使用を提供する。
【0084】
[0099]本明細書に記載される培地、例えば血清代替物、培地サプリメント、完全培地は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞、特に、典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの十分な増殖のために血清サプリメント又は規定した培地を必要とする細胞の培養に有用であることが考えられる。そのような細胞は、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞のような真核細胞を含む。血清代替物、完全培地又は培地サプリメントの使用から利益を考えられる哺乳動物細胞としては、限定はされないが、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ／雄ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ及びヒト細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫（ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊（ｍｏｓｑｕｉｔｏ））、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊（ｍｏｓｑｕｉｔｏ））、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ（ｆｒｕｉｔｆｌｙ））、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）由来の細胞が挙げられる。
【0085】
[00100]血清代替物、完全培地又は培地サプリメントによって培養された細胞は、不死化細胞（細胞系）又は非不死化（一次又は二次）細胞であり、ｉｎ ｖｉｖｏで見出される広範な細胞型のいずれかであり得ることが考えられる。例示的な細胞型としては、限定はされないが、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、卵巣細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の形成要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、軟骨細胞及び他の骨由来細胞、肝細胞、膵臓、及びこれらの体細胞型の前駆体が挙げられる。
【0086】
[00101]一部の実施形態では、上記又は本明細書に開示される培地での使用を考えられる細胞は、哺乳動物対象から単離される。哺乳動物対象から単離される細胞としては、限定はされないが、多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄間質細胞、造血前駆細胞、免疫幹細胞、骨髄幹細胞、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、軟骨細胞及び他の骨由来細胞、肝細胞、膵臓細胞、体細胞型の前駆体、及び任意の癌腫又は腫瘍由来細胞が挙げられる。
【0087】
[00102]一部の実施形態では、細胞は細胞系である。例示的な細胞系としては、限定はされないが、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、及びＣＨＯ／－ＤＨＦＲを含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；サル腎臓ＣＶ１、ＣＯＳ－７；ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ）；ヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２；ＳＫ－Ｈｅｐ）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；Ｔ細胞系（Ｊｕｒｋａｔ）；Ｂ細胞系、マウス３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、ＨＴ１０８０、Ｌ９２９、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、及び不死化一次細胞が挙げられる。
【0088】
[00103]例示的な昆虫細胞系としては、限定はされないが、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＨＩＧＨ ＦＩＶＥ．ＴＭ．、ＥＸＰＲＥＳＳＦ＋．ＲＴＭ．、Ｓ２、Ｔｎ５、ＴＮ－３６８、ＢｍＮ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２、Ｄ２、Ｃ６／３６及びＫＣ細胞が挙げられる。
【0089】
[00104]さらなる細胞型及び細胞系が、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００６／００４７２８号に開示される。これらの細胞としては、限定はされないが、ＣＤ３４＋造血幹細胞及び骨髄系列の細胞、２９３胎児由来腎臓細胞、Ａ－５４９、ジャーカット、Ｎａｍａｌｗａ、Ｈｅｌａ、２９３ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞、ＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－Ｉ）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－Ｇ２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ １８０細胞、ＬＳ １７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、Ｃｌｏｎｅ Ｍ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－Ｉ細胞、Ｙ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、ＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、又はこれらの誘導体、任意の組織又は器官（限定はされないが、心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細）、リンパ組織（リンパ節、アデノイド、扁桃、骨髄、及び血液）、脾臓、線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞系）、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、ＭｉＣ１１細胞、ＣＶ－Ｉ細胞、ＣＯＳ－Ｉ細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－Ｉ１細胞、ＮＯＲ－ＩＯ細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、Ｓｔｒａｉｎ ２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、ＮＳＯ、ＮＳ１、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔｊａｃ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、Ｊｅｎｓｅｎ細胞、ＣＯＳ細胞及びＳｐ２／０細胞、それらの模倣細胞及び／又は誘導体が挙げられる。
【0090】
[00105]本明細書で考えた細胞培養条件は、細胞を増殖させるために好適な任意の培養基材に適用してもよい。好適な表面を有する基材としては、組織培養ウェル、培養フラスコ、ローラーボトル、ガス透過容器、平又は平行プレートバイオリアクター又は細胞工場が挙げられる。細胞が、撹拌槽の懸濁液中に維持されるマイクロキャリア又は粒子に接着される培養条件も考えられる。
【0091】
[00106]細胞培養方法は、一般に、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍ．Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＆ Ｉ．Ｆ．Ｒａｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）、及びＥｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に記載される。他の参照テキストは、Ｃｒｅａｔｉｎｇ ａ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ａｒｏｓｅｌｌｉ，Ｈｕ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｐｒ．１９９６）及びＬｉｍｉｔｓ ｔｏ Ｇｒｏｗｔｈ（Ｄ．Ｈ．Ｍｅａｄｏｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｅ Ｐｕｂｌ．１９７４）を含む。組織培養サプリ及び試薬は、当業者に周知であり、市販されている。
【0092】
[00107]細胞は、血清代替物、完全培地又は培地サプリメントで使用される特定の細胞系又は単離した細胞型に適切な密度で培養に置かれることが理解される。ある特定の実施形態では、細胞は、１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６又は５×１０６個の細胞／ｍｌで培養される。
【0093】
[00108]細胞培養培地中の追加の成分も企図される。一部の実施形態では、細胞培養培地が無血清完全培地として使用することができるように、細胞培養培地は、本明細書に記載の基本培地の１つ又はそれ以上の要素及びサプリメント、例えば塩、アミノ酸、ビタミン、緩衝液、ヌクレオチド、抗生物質、微量元素、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を含んでもよい。
【0094】
[00109]例示的な無機塩としては、限定はされないが、リン酸カリウム、塩化カルシウム（無水）、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性、塩化スズ及び硫酸亜鉛が挙げられる。例示的な有機塩としては、限定はされないが、重炭酸ナトリウム又はＨＥＰＥＳが挙げられる。
【0095】
[00110]例示的な糖としては、限定はされないが、デキストロース、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース及びこれらの糖の多量体が挙げられる。
[00111]例示的な抗酸化剤としては、限定はされないが、トコフェロール、トコトリエノール、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、アルファ－トコフェロールキノン、トロロクス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコピン、ベータカロチン、セレン、ユビキノン、ルテイン（ｌｕｅｔｉｎ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ－アセチルシステイン、クエン酸、Ｌ－カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスタミン及びシスタチオニン（ｃｙｓｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）、並びにグリシン－グリシン－ヒスチジン（トリペプチド）が挙げられる。
[00111]例示的な抗酸化剤としては、限定はされないが、トコフェロール、トコトリエノール、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、アルファ－トコフェロールキノン、トロロクス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコピン、ベータカロチン、セレン、ユビキノン、ルテイン（ｌｕｅｔｉｎ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ－アセチルシステイン、クエン酸、Ｌ－カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスタミン及びシスタチオニン（ｃｙｓｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）、並びにグリシン－グリシン－ヒスチジン（トリペプチド）が挙げられる。
【0096】
[00112]例示的な微量元素としては、限定はされないが、銅、鉄、亜鉛、マンガン、ケイ素、モリブデン酸（ｍｏｌｙｂｄｎａｔｅ）、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズ、アルミニウム、銀、バリウム、臭素、カドミウム、コバルト、クロム、カルシウム、二価カチオン、フッ素、ゲルマニウム、ヨウ素、ルビジウム、ジルコニウム、又はセレンが挙げられる。さらなる微量元素は、国際公開第２００６／００４７２８号に開示される。
【0097】
[00113]一部の実施形態では、培地又は液体ベース混合物は、鉄源又は鉄トランスポーターを含む。例示的な鉄源としては、限定はされないが、第二鉄塩及び第一鉄塩、例えば硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、第二鉄アンモニウム化合物、例えばクエン酸第二鉄アンモニウム、蓚酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウム及びコハク酸第二鉄アンモニウムが挙げられる。例示的な鉄トランスポーターとしては、限定はされないが、トランスフェリン、ラクトフェリンが挙げられる。
【0098】
[00114]一部の実施形態では、培地が無血清完全培地として使用することができるように、培地又は液体ベース混合物は、上記の基本培地の１つ又はそれ以上の要素及びサプリメント、例えば塩、アミノ酸、ビタミン、緩衝液、ヌクレオチド、抗生物質、微量元素、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を含んでもよい。
【0099】
[00115]一部の実施形態では、培地又は液体ベース混合物は、銅源又は銅トランスポーター（例えばＧＨＫ－Ｃｕ）をさらに含み得る。例示的な銅源としては、限定はされないが、塩化銅及び硫酸銅が挙げられる。
【0100】
[00116]一部の実施形態では、鉄源又は銅源は、約０．０５～２５０ｎｇ／ｍｌ、０．０５～１００ｎｇ／ｍｌ、約０．０５～５０ｎｇ／ｍｌ、約０．０５～１０ｎｇ／ｍｌ、約０．１～５ｎｇ／ｍｌ、約０．５～２．５ｎｇ／ｍｌ、又は約１～５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度で血清代替物培地に添加される。鉄源又は銅源が、約０．０５、０．１、０．２５、０．３５、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｎｇ／ｍｌの血清代替物の最終濃度であることがさらに考えられる。
【0101】
[00117]一部の実施形態では、血清代替物又は培地サプリメントが基本培地に添加された。標準的な基本培地は、細胞培養の分野で公知であり、市販されている。基本培地の例としては、限定はされないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ Ｆ１２（１：１）、イスコフ改変ダルベッコ培地、Ｈａｍ’ｓ栄養混合物Ｆ－１０又はＦ－１２、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ＭＣＤＢ１３１、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、培地１９９、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ培地Ｅ、並びにＧｒａｃｅ’ｓ培地及びＴＮＭ－ＦＨのような昆虫培地が挙げられる。
【0102】
[00118]本明細書に記載される血清代替物及び培地サプリメントは、市販の無血清培養培地での使用のためにも考えられる。例示的な無血清培地としては、限定はされないが、ＡＩＭ－Ｖ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、ＰＥＲ－Ｃ６（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｋｎｏｃｋ－Ｏｕｔ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ－Ｍｅｄｉｕｍｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．）が挙げられる。
【0103】
[00119]任意のこれらの培地は、場合により、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸など）、アミノ酸、ビタミン、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を補充される。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等のような培養条件は、当業者には明らかであろう。
【0104】
[00120]培地組成物は、単位形態でパッケージされることが考えられる。一実施形態では、培地（血清代替物、培地サプリメント、完全培地又は凍結保存培地）は、１０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、５００ｍｌ又は１Ｌの容積でパッケージされる。
【0105】
[00121]本開示は、上記及び本明細書に記載される細胞培養培地及び使用のための説明書を含むキットをさらに提供する。一部の実施形態では、培地は、ラベルが貼り付けられた容器中にパッケージされるか又はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用のための組成物の使用を記載するパッケージ中に含まれる。例示的な容器としては、限定はされないが、容器、バイアル、チューブ、アンプル、ボトル、フラスコ等が挙げられる。容器は、液体又は凍結形態の培地、例えば血清代替物又は培地サプリメントをパッケージするために適当であることがさらに考えられる。容器は、限定はされないが、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、及び他のプラスチックを含む、当技術分野で周知の材料から作成されることが考えられる。一部の実施形態では、組成物は、単位剤形でパッケージされる。キットは、場合により、血清代替物又は培地サプリメントを基本培地と組み合わせるのに好適な装置を含む。一部の実施形態では、キットは、ラベル及び／又は細胞培養若しくは凍結保存のための培地の使用を記載する説明書を含有する。
【0106】
[00122]本明細書に引用した又はそれらの審査中の全ての出願及び全ての文書（「出願に引用した文書」）並びに出願に引用した文書に引用した若しくは参照した全ての文書、並びに本明細書に引用又は参照した全ての文書（「本明細書に引用した文書」）、並びに本明細書に引用した文書に引用又は参照した全ての文書は、本明細書又は本明細書に参照によって組み込まれる任意の文書に記載される任意の製品のための任意の製造業者の説明書、記載、製品仕様、及び製品シートと共に、参照によって本明細書に組み込まれ、本発明の実施に用いられてもよい。より詳細には、全ての参照した文書は、各個々の文書が参照によって組み込まれることを特に及び個々に示されたように、同程度まで参照によって組み込まれる。
【0107】
[00123]以下の実施例は、例示のために提示され、限定のためではない。
【実施例】
【0108】
実施例１：ウシ線維芽細胞増殖へのＩＤ－８及び／又はＦＫ－５０６の効果
[00124]ウシ足場非依存性線維芽細胞は、標準的な分化プロトコールによって足場非依存性脂肪細胞へと分化させた。ＦＭＴ－ＳＢＦ－１（ウシ非接着線維芽細胞）は、ＰＰＡＲガンマアゴニストと共に２００μＭオレイン酸を含有する脂肪生成培地中で増殖させた。合成阻害剤（ロシグリタゾン）及び天然阻害剤（プリスタン酸）を両方試験した。
[00124]ウシ足場非依存性線維芽細胞は、標準的な分化プロトコールによって足場非依存性脂肪細胞へと分化させた。ＦＭＴ－ＳＢＦ－１（ウシ非接着線維芽細胞）は、ＰＰＡＲガンマアゴニストと共に２００μＭオレイン酸を含有する脂肪生成培地中で増殖させた。合成阻害剤（ロシグリタゾン）及び天然阻害剤（プリスタン酸）を両方試験した。
【0109】
[00125]ウシ線維芽細胞増殖へのＩＤ－８及び／又はＦＫ－５０６（単独又は組合せ）の効果を評価した。懸濁培養に適応させたウシ線維芽細胞は、細胞培養フラスコの全容積２０ｍｌ中に３０万個／ｍｌで播種した。フラスコは、１００ｒｐｍ、３７℃、及び５％ ＣＯ２で、震盪インキュベーター中に維持した。３日目に、ＡＰＯＩ染色による自動細胞計数器（Ｃｅｌｌａｃａ（登録商標））を使用して細胞計数を実施し、細胞数から死細胞を除いた。
【0110】
[00126]結果を図１に示す。ＩＤ－８単独（１μＭ）は、ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）と比較してウシ線維芽細胞増殖に匹敵する効果を得られ、ＩＤ－８が細胞培養培地中でＦＧＦを少なくとも部分的に置き換えることができることを示す。ＦＫ－５０６単独（２ｎＭ）は、ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）と比較してウシ線維芽細胞増殖に匹敵する効果を得られなかった。ＦＫ－５０６は、この研究ではＩＤ－８よりもずっと低濃度で試験されたことに注意されたい。結果は、両小分子、ＩＤ－８（１μＭ）及びＦＫ－５０６（２ｎＭ）の組合せが、ＦＧＦ対照（１０ｎｇ／ｍｌ）と比較した場合、培養の３日後に最大細胞増殖を示したことをさらに示す。ＩＤ－８とＦＫ－５０６の濃度は、それぞれ約０．５μＭ～約１０μＭ、及び約２ｎＭ～約１０ｎＭの範囲で変わり得ることが予測される。この研究は、ＩＤ－８とＦＫ－５０６の両方の組合せが、ウシ線維芽細胞のための無血清培養培地中のＦＧＦを完全に置き換えることができることを示す。
【0111】
[00127]
実施例２：ニワトリ線維芽細胞増殖へのＩＤ－８及び／又はＦＫ－５０６の効果
[00128]ニワトリ足場非依存性線維芽細胞は、標準的な分化プロトコールによって足場非依存性脂肪細胞へと分化させた。ＦＭＴ－ＳＣＦ－２（ニワトリ非接着線維芽細胞）を、ＰＰＡＲガンマアゴニストと共に２００μＭオレイン酸を含有する脂肪生成培地中で増殖させた。合成阻害剤（ロシグリタゾン）及び天然阻害剤（プリスタン酸）を両方試験した。
実施例２：ニワトリ線維芽細胞増殖へのＩＤ－８及び／又はＦＫ－５０６の効果
[00128]ニワトリ足場非依存性線維芽細胞は、標準的な分化プロトコールによって足場非依存性脂肪細胞へと分化させた。ＦＭＴ－ＳＣＦ－２（ニワトリ非接着線維芽細胞）を、ＰＰＡＲガンマアゴニストと共に２００μＭオレイン酸を含有する脂肪生成培地中で増殖させた。合成阻害剤（ロシグリタゾン）及び天然阻害剤（プリスタン酸）を両方試験した。
【0112】
[00129]ニワトリ線維芽細胞増殖へのＩＤ－８及びＦＫ－５０６の効果を評価した。懸濁培養に適応させたニワトリ線維芽細胞は、細胞培養フラスコの全容積２０ｍｌ中に３０万個／ｍｌで播種した。フラスコは、１００ｒｐｍ、３９℃、及び５％ ＣＯ２で、震盪インキュベーター中に維持した。３日目に、ＡＰＯＩ染色による自動細胞計数器（Ｃｅｌｌａｃａ（登録商標））を使用して細胞計数を実施し、細胞数から死細胞を除いた。
【0113】
[00130]結果を図２に示す。ＩＤ－８（０．５μＭ）とＦＫ－５０６（２ｎＭ）の組合せは、ＦＧＦ対照（１０ｎｇ／ｍｌ）と比較して細胞増殖に類似の効果を示した。ＩＤ－８とＦＫ－５０６の濃度は、それぞれ約０．５μＭ～約１０μＭ、及び約２ｎＭ～約１０ｎＭの範囲で変わり得ることが予測される。この研究は、ＩＤ－８とＦＫ－５０６の両方の組合せが、ニワトリ線維芽細胞のための無血清培養培地中のＦＧＦを完全に置き換えることができることを示す。
【0114】
実施例３：ヒツジ線維芽細胞へのＩＤ－８及びＦＫ－５０６の勾配濃度の効果
[00131]ＩＤ－８は約１～５０μＭ、ＦＫ－５０６は約１～５０ｎＭの範囲の両小分子（ＩＤ－８及びＦＫ－５０６）の勾配濃度の効果を、ヒツジ線維芽細胞２Ｄ培養で試験した。ヒツジ線維芽細胞は、１０００個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。無血清培地中のＩＤ－８及びＦＫ－５０６を、会社のプロトコールに従ってＸＴＴ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌの細胞増殖アッセイ）に添加する前に４８時間線維芽細胞とインキュベートした。比色分析シグナルは、ＸＴＴ添加の８時間後に測定した。ブランク（培地のみ）測定値は、試料測定値から差し引いた（ｎ＝４）。
[00131]ＩＤ－８は約１～５０μＭ、ＦＫ－５０６は約１～５０ｎＭの範囲の両小分子（ＩＤ－８及びＦＫ－５０６）の勾配濃度の効果を、ヒツジ線維芽細胞２Ｄ培養で試験した。ヒツジ線維芽細胞は、１０００個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。無血清培地中のＩＤ－８及びＦＫ－５０６を、会社のプロトコールに従ってＸＴＴ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌの細胞増殖アッセイ）に添加する前に４８時間線維芽細胞とインキュベートした。比色分析シグナルは、ＸＴＴ添加の８時間後に測定した。ブランク（培地のみ）測定値は、試料測定値から差し引いた（ｎ＝４）。
【0115】
[00132]結果は、ＦＫ－５０６が約１～２ｎＭの濃度、ＩＤ－８が約１～５μＭの濃度（最適濃度）であった場合、最良の細胞増殖が得られたことを示す（図３）。より高い濃度のＩＤ－８（例えば１０μＭ又は５０μＭ）は、依然として対照（ＦＧＦなし）よりも良い細胞増殖を示した。一方、より高い濃度のＦＫ－５０６（例えば５ｎＭ、２０ｎＭ、又は５０ｎＭ）は、１μＭの最適濃度のＩＤ－８にのもとでも細胞増殖に著しい効果を示さなかった。
【0116】
[00133]本発明及びその利点を詳細に記載したが、添付の請求項に規定した本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な変更、置換及び改変が本明細書で行われ得ることは理解されるはずである。
【0117】
[00134]当業者は、本発明が、目的を実行する、並びに記載した並びにそれらに固有の目的及び利点を得るために十分に適応されることを容易に理解するであろう。本明細書に記載の方法に沿った本実施例は、現在、好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲の限定として意図されない。その変更及び他の使用は、当業者に想起され、それらは請求項の範囲によって規定されたように、本発明の範囲内に包含される。
【図1】
【図2】
【図3】
【手続補正書】
【提出日】2022-09-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
食用動物由来の細胞を培養するための細胞培養培地であって、無血清培地及び１つ又はそれ以上の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）活性化剤を含み、前記１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤は、インドール誘導体、マクロライド系抗生物質、又はこれらの組合せを含む、細胞培養培地。
【請求項2】
前記培地が、１ｎｇ／ｍｌ未満のＦＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、又はこれらの組合せを含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項3】
前記培地が、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項4】
前記インドール誘導体が、ＩＤ－８である、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項5】
前記マクロライド系抗生物質が、タクロリムス（ＦＫ－５０６）である、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項6】
前記１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤が、ＩＤ－８及びＦＫ－５０６を含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項7】
ＩＤ－８が、約０．５μＭ～約５０μＭの濃度である、請求項４に記載の細胞培養培地。
【請求項8】
ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である、請求項５に記載の細胞培養培地。
【請求項9】
ＩＤ－８が、約０．５μＭ～約５０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である、請求項６に記載の細胞培養培地。
【請求項10】
ＩＤ－８が、約１μＭ～約１０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である、請求項９に記載の細胞培養培地。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞培養培地及び使用のための説明書を含むキット。
【請求項12】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞培養培地中で食用動物由来の細胞を培養するステップ、及び培養細胞から培養肉を生産するステップを含む、培養肉を生産する方法。
【請求項13】
前記食用動物が、家畜、狩猟動物、家禽、魚、甲殻類、又は軟体動物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞が、線維芽細胞を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項15】
前記線維芽細胞が、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞又はヒツジ線維芽細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法によって生産される培養肉。
【請求項17】
前記細胞が、単一細胞懸濁液として培養される、請求項１２に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞又はＥＢ６６細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞培養培地中で食用動物由来の細胞を培養するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで食用動物由来の細胞を増殖させる方法。
【請求項20】
食用動物由来の細胞を培養するための細胞培養培地中の１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤の使用であって、前記１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤が、インドール誘導体、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質、又はこれらの組合せを含み、前記培地が、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く、使用。【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0117】
[00134]当業者は、本発明が、目的を実行する、並びに記載した並びにそれらに固有の目的及び利点を得るために十分に適応されることを容易に理解するであろう。本明細書に記載の方法に沿った本実施例は、現在、好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲の限定として意図されない。その変更及び他の使用は、当業者に想起され、それらは請求項の範囲によって規定されたように、本発明の範囲内に包含される。
発明の態様
［態様１］無血清培地及び１つ又はそれ以上の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）活性化剤を含む細胞培養培地。
［態様２］前記培地が、１ｎｇ／ｍｌ未満のＦＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、又はこれらの組合せを含む、態様１に記載の細胞培養培地。
［態様３］前記培地が、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く、態様１に記載の細胞培養培地。
［態様４］前記１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤が、ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する１つ又はそれ以上の小分子である、態様１～３のいずれかに記載の細胞培養培地。
［態様５］前記１つ又はそれ以上の小分子が、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のためのＦＧＦ２１類似体、インドール誘導体、Ｗｎｔ経路の活性化剤、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質、ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的、又はこれらの組合せを含む、態様４に記載の細胞培養培地。
［態様６］前記１つ又はそれ以上の小分子が、インドール誘導体を含む、態様５に記載の細胞培養培地。
［態様７］前記インドール誘導体が、ＩＤ－８である、態様６に記載の細胞培養培地。
［態様８］前記１つ又はそれ以上の小分子が、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質を含む、態様４に記載の細胞培養培地。
［態様９］前記マクロライド系抗生物質が、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む、態様８に記載の細胞培養培地。
［態様１０］前記１つ又はそれ以上の小分子が、ＩＤ－８及びＦＫ－５０６を含む、態様５に記載の細胞培養培地。
［態様１１］ＩＤ－８が、約０．５μＭ～約５０μＭの濃度である、態様７又は１０に記載の細胞培養培地。
［態様１２］ＩＤ－８が、約１μＭ～約１０μＭの濃度である、態様１１に記載の細胞培養培地。
［態様１３］ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である、態様９又は１０に記載の細胞培養培地。
［態様１４］前記ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である、態様１３に記載の細胞培養培地。
［態様１５］ＩＤ－８が、約０．５μＭ～約５０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である、態様１０に記載の細胞培養培地。
［態様１６］ＩＤ－８が、約１μＭ～約１０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である、態様１５に記載の細胞培養培地。
［態様１７］前記１つ又はそれ以上の小分子が、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のためのＦＧＦ２１類似体を含む、態様５に記載の細胞培養培地。
［態様１８］前記ＦＧＦ２１類似体が、ＰＦ－０５２３１０２３である、態様１７に記載の細胞培養培地。
［態様１９］前記１つ又はそれ以上の小分子が、Ｗｎｔ経路の活性化剤を含む、態様５に記載の細胞培養培地。
［態様２０］前記活性化剤が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の阻害剤である、態様１９に記載の細胞培養培地。
［態様２１］前記活性化剤が、１－アザケンパウロンである、態様２０に記載の細胞培養培地。
［態様２２］前記１つ又はそれ以上の小分子が、ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的を含む、態様５に記載の細胞培養培地。
［態様２３］前記標的が、ＥＲＫ経路を活性化することによってＦＧＦ経路を過活性化する阻害剤である、態様２２に記載の細胞培養培地。
［態様２４］前記阻害剤が、Ｄｕｓｐ６阻害剤である、態様２３に記載の細胞培養培地。
［態様２５］前記Ｄｕｓｐ６阻害剤が、（Ｅ／Ｚ）－ＢＣＩ塩酸塩である、態様２４に記載の細胞培養培地。
［態様２６］態様１～２５のいずれかに記載の細胞培養培地及び使用のための説明書を含むキット。
［態様２７］態様１～２５のいずれかに記載の細胞培養培地中で細胞を培養するステップ、及び培養細胞から培養肉を生産するステップを含む、培養肉を生産する方法。
［態様２８］前記細胞が、食用動物由来である、態様２７に記載の方法。
［態様２９］前記食用動物が、家畜、狩猟動物、家禽、魚、甲殻類、又は軟体動物である、態様２８に記載の方法。
［態様３０］前記細胞が、線維芽細胞を含む、態様２７～２９のいずれかに記載の方法。
［態様３１］前記線維芽細胞が、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である、態様３０に記載の方法。
［態様３２］態様２７～３１のいずれかに記載の方法によって生産される培養肉。
［態様３３］前記細胞が、単一細胞懸濁液として培養される、態様２７に記載の方法。
［態様３４］前記細胞が、ＣＨＯ細胞又はＥＢ６６細胞を含む、態様３３に記載の方法。
［態様３５］態様１～２５のいずれかに記載の細胞培養培地中で細胞を培養するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖させる方法。
［態様３６］細胞培養培地中の１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤の使用であって、前記培地が、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く、使用。
発明の態様
［態様１］無血清培地及び１つ又はそれ以上の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）活性化剤を含む細胞培養培地。
［態様２］前記培地が、１ｎｇ／ｍｌ未満のＦＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）、又はこれらの組合せを含む、態様１に記載の細胞培養培地。
［態様３］前記培地が、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く、態様１に記載の細胞培養培地。
［態様４］前記１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤が、ＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する１つ又はそれ以上の小分子である、態様１～３のいずれかに記載の細胞培養培地。
［態様５］前記１つ又はそれ以上の小分子が、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のためのＦＧＦ２１類似体、インドール誘導体、Ｗｎｔ経路の活性化剤、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質、ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的、又はこれらの組合せを含む、態様４に記載の細胞培養培地。
［態様６］前記１つ又はそれ以上の小分子が、インドール誘導体を含む、態様５に記載の細胞培養培地。
［態様７］前記インドール誘導体が、ＩＤ－８である、態様６に記載の細胞培養培地。
［態様８］前記１つ又はそれ以上の小分子が、免疫抑制特性を有するマクロライド系抗生物質を含む、態様４に記載の細胞培養培地。
［態様９］前記マクロライド系抗生物質が、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む、態様８に記載の細胞培養培地。
［態様１０］前記１つ又はそれ以上の小分子が、ＩＤ－８及びＦＫ－５０６を含む、態様５に記載の細胞培養培地。
［態様１１］ＩＤ－８が、約０．５μＭ～約５０μＭの濃度である、態様７又は１０に記載の細胞培養培地。
［態様１２］ＩＤ－８が、約１μＭ～約１０μＭの濃度である、態様１１に記載の細胞培養培地。
［態様１３］ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である、態様９又は１０に記載の細胞培養培地。
［態様１４］前記ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である、態様１３に記載の細胞培養培地。
［態様１５］ＩＤ－８が、約０．５μＭ～約５０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２０ｎＭの濃度である、態様１０に記載の細胞培養培地。
［態様１６］ＩＤ－８が、約１μＭ～約１０μＭの濃度であり、ＦＫ－５０６が、約１ｎＭ～約２ｎＭの濃度である、態様１５に記載の細胞培養培地。
［態様１７］前記１つ又はそれ以上の小分子が、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）のためのＦＧＦ２１類似体を含む、態様５に記載の細胞培養培地。
［態様１８］前記ＦＧＦ２１類似体が、ＰＦ－０５２３１０２３である、態様１７に記載の細胞培養培地。
［態様１９］前記１つ又はそれ以上の小分子が、Ｗｎｔ経路の活性化剤を含む、態様５に記載の細胞培養培地。
［態様２０］前記活性化剤が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）の阻害剤である、態様１９に記載の細胞培養培地。
［態様２１］前記活性化剤が、１－アザケンパウロンである、態様２０に記載の細胞培養培地。
［態様２２］前記１つ又はそれ以上の小分子が、ＦＧＦシグナル伝達の下流経路の負の制御因子の標的を含む、態様５に記載の細胞培養培地。
［態様２３］前記標的が、ＥＲＫ経路を活性化することによってＦＧＦ経路を過活性化する阻害剤である、態様２２に記載の細胞培養培地。
［態様２４］前記阻害剤が、Ｄｕｓｐ６阻害剤である、態様２３に記載の細胞培養培地。
［態様２５］前記Ｄｕｓｐ６阻害剤が、（Ｅ／Ｚ）－ＢＣＩ塩酸塩である、態様２４に記載の細胞培養培地。
［態様２６］態様１～２５のいずれかに記載の細胞培養培地及び使用のための説明書を含むキット。
［態様２７］態様１～２５のいずれかに記載の細胞培養培地中で細胞を培養するステップ、及び培養細胞から培養肉を生産するステップを含む、培養肉を生産する方法。
［態様２８］前記細胞が、食用動物由来である、態様２７に記載の方法。
［態様２９］前記食用動物が、家畜、狩猟動物、家禽、魚、甲殻類、又は軟体動物である、態様２８に記載の方法。
［態様３０］前記細胞が、線維芽細胞を含む、態様２７～２９のいずれかに記載の方法。
［態様３１］前記線維芽細胞が、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である、態様３０に記載の方法。
［態様３２］態様２７～３１のいずれかに記載の方法によって生産される培養肉。
［態様３３］前記細胞が、単一細胞懸濁液として培養される、態様２７に記載の方法。
［態様３４］前記細胞が、ＣＨＯ細胞又はＥＢ６６細胞を含む、態様３３に記載の方法。
［態様３５］態様１～２５のいずれかに記載の細胞培養培地中で細胞を培養するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖させる方法。
［態様３６］細胞培養培地中の１つ又はそれ以上のＦＧＦ活性化剤の使用であって、前記培地が、ペプチドベースホルモン又はステロイドベースホルモンを除く任意のタンパク質ベース増殖因子を本質的に欠く、使用。
【国際調査報告】