特表 2023-511465 キット、システム、及びフローセル

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-20

(54)【発明の名称】キット、システム、及びフローセル

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20230313BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20230313BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20230313BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230313BHJP

   C12M 1/26 20060101ALI20230313BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALN20230313BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20230313BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALN20230313BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 100Z

C40B40/06

C12Q1/6806 Z

C12M1/00 A

C12M1/26

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6813 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021577073

(86)(22)【出願日】2021-01-25

(85)【翻訳文提出日】2021-12-24

(86)【国際出願番号】 US2021014919

(87)【国際公開番号】W WO2021154648

(87)【国際公開日】2021-08-05

(31)【優先権主張番号】62/966,351

(32)【優先日】2020-01-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500358711

【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】タイラー・チェン

(72)【発明者】

【氏名】パラヴィ・ダッグマティ

(72)【発明者】

【氏名】タルン・クマール・クラーナー

(72)【発明者】

【氏名】イル－シュアン・ウ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA09

4B029AA27

4B029BB20

4B029CC01

4B029HA05

4B063QA20

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR06

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR56

4B063QR62

4B063QR82

4B063QS24

4B063QS34

4B063QS39

4B063QX02

(57)【要約】

キットの例は、ライブラリ調製流体、試料流体、及び濃縮流体を含む。ライブラリ調製流体は、ライブラリ調製ビーズを含み、各ライブラリ調製ビーズは、第１の固形支持体と、第１の固形支持体に付着したトランスポソームとを含む。流体は、ゲノムデオキシリボ核酸配列を含む。濃縮流体は、標的捕捉ビーズを含み、各標的捕捉ビーズは、第２の固形支持体と、第２の固形支持体に付着した捕捉プローブとを含む。捕捉プローブのそれぞれは、試料流体中のゲノムデオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖デオキシリボ核酸配列を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キットであって、
ライブラリ調製ビーズを含むライブラリ調製流体であって、各ライブラリ調製ビーズが、
第１の固形支持体と、
前記第１の固形支持体に付着したトランスポソームと、を含む、ライブラリ調製流体と、
ゲノムデオキシリボ核酸配列を含む試料流体と、
標的捕捉ビーズを含む濃縮流体であって、各標的捕捉ビーズが、
第２の固形支持体と、
前記第２の固形支持体に付着した捕捉プローブと、を含み、前記捕捉プローブのそれぞれが、前記試料流体中のゲノムデオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖デオキシリボ核酸配列を含む、濃縮流体と、を含む、キット。

【請求項2】

前記第１の固形支持体及び前記第２の固形支持体が、磁気応答性材料、ガラス、ポリマー、及び金属からなる群から個別に選択される、請求項１に記載のキット。

【請求項3】

前記捕捉プローブが、結合ペアを介して前記第２の固形支持体に付着している、請求項１又は２に記載のキット。

【請求項4】

デオキシリボ核酸配列をブロックすることを含むブロッキング流体を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項5】

前記標的捕捉ビーズのプローブ密度が、固形支持体１個あたり約２×１０^５の捕捉プローブ～固形支持体１個あたり約５×１０^６の捕捉プローブの範囲である、請求項１～４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項6】

キットであって、
ＲＮＡ－ｃＤＮＡ変換サブキットと、
標的捕捉ビーズを含む濃縮流体であって、各標的捕捉ビーズが、
固形支持体と、
前記固形支持体に付着した捕捉プローブと、を含み、前記捕捉プローブのそれぞれが、前記ＲＮＡ－ｃＤＮＡ変換サブキットを使用して生成されたｃＤＮＡの標的領域に相補的な一本鎖デオキシリボ核酸配列を含む、濃縮流体と、を含む、キット。

【請求項7】

前記捕捉プローブが、結合ペアを介して前記固形支持体に付着している、請求項６に記載のキット。

【請求項8】

システムであって、
基材と、
前記基材上の第１の領域で画定された調製チャネルであって、前記調製チャネルが、ライブラリ調製ビーズを固定化するための調製捕捉部位を含む、調製チャネルと、
前記調製チャネルの下流の前記基材上の第２の領域で画定された濃縮チャネルであって、前記濃縮チャネルが、
増幅プライマーと、
標的捕捉ビーズを固定化するための濃縮捕捉部位と、を含む、濃縮チャネルと、
前記調製チャネル及び前記濃縮チャネルを選択的かつ流体的に接続する輸送チャネルと、を備える、システム。

【請求項9】

前記調製チャネルが、前記増幅プライマーを含まない、請求項８に記載のシステム。

【請求項10】

前記基材に取り付けられた第２の基材を更に備え、前記第２の基材が、
第２の調製捕捉部位を含む第２の調製チャネルと、
第２の増幅プライマー及び第２の濃縮捕捉部位を含む第２の濃縮チャネルと、を含む、請求項８又は９に記載のシステム。

【請求項11】

前記濃縮チャネルと選択的に流体連通するフローセル試薬システムを更に備える、請求項８～１０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項12】

前記フローセル試薬システムが、
リザーバと、
前記リザーバに収容された濃縮流体であって、前記濃縮流体が、標的捕捉ビーズを含み、各標的捕捉ビーズが、
固形支持体と、
前記固形支持体に付着した捕捉プローブと、を含み、前記捕捉プローブのそれぞれが、ゲノムデオキシリボ核酸又は相補的デオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖デオキシリボ核酸配列を含む、濃縮流体と、を含む、請求項１１に記載のシステム。

【請求項13】

前記濃縮捕捉部位に固定化された前記標的捕捉ビーズを更に含み、各標的捕捉ビーズが、
固形支持体と、
前記固形支持体に付着した捕捉プローブと、を含み、前記捕捉プローブのそれぞれが、ゲノムデオキシリボ核酸又は相補的デオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖デオキシリボ核酸配列を含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項14】

前記濃縮捕捉部位が、結合ペアの第１のメンバーを含み、前記固形支持体が、前記結合ペアの第２のメンバーでコーティングされている、請求項１３に記載のシステム。

【請求項15】

前記濃縮チャネルが、隙間領域によって分離されたくぼみを含み、前記増幅プライマー及び濃縮捕捉部位が、前記くぼみのそれぞれの中に配置されている、請求項８～１４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項16】

フローセルであって、
２つの表面間に画定された濃縮チャネルを備え、前記濃縮チャネルが、
前記２つの表面のうちの少なくとも一方に付着した増幅プライマーと、
前記２つの表面のうちの少なくとも一方に固定化された標的捕捉ビーズと、を含み、各標的捕捉ビーズが、
固形支持体と、
前記固形支持体に付着した捕捉プローブと、を含み、前記捕捉プローブのそれぞれが、ゲノムデオキシリボ核酸又は相補的デオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖核酸配列を含む、フローセル。

【請求項17】

前記捕捉プローブが、結合ペアを介して前記固形支持体に付着している、請求項１６に記載のフローセル。

【請求項18】

前記２つの表面のそれぞれが、隙間領域によって分離されたくぼみを含み、前記増幅プライマー及び前記標的捕捉ビーズが、前記くぼみのそれぞれの中に配置されている、請求項１６又は１７に記載のフローセル。

【請求項19】

方法であって、
増幅プライマー及び濃縮捕捉部位を含む少なくとも１つの表面を含む濃縮チャネル内に標的捕捉ビーズを導入し、それによって前記標的捕捉ビーズの少なくともいくつかが、前記濃縮捕捉部位で固定化されることを含み、前記標的捕捉ビーズのそれぞれが、
固形支持体と、
前記固形支持体に付着した捕捉プローブと、を含み、前記捕捉プローブのそれぞれが、ゲノムデオキシリボ核酸又は相補的デオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖核酸配列を含む、方法。

【請求項20】

前記標的捕捉ビーズを導入する前に、前記方法が、
各捕捉プローブの末端に付着した結合ペアの第１のメンバーによって前記捕捉プローブを合することと、
前記捕捉プローブを前記固形支持体と共にインキュベートすることであって、前記固形支持体が前記結合ペアの第２のメンバーでコーティングされていることと、によって、前記標的捕捉ビーズを調製することを更に含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

インキュベーションに用いる混合物中の前記捕捉プローブの濃度を調整することによって、前記標的捕捉ビーズの捕捉プローブ密度を制御することを更に含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ゲノムデオキシリボ核酸又は前記相補的デオキシリボ核酸からライブラリ断片を調製することと、
前記ライブラリ断片を前記濃縮チャネルに導入することと、
前記濃縮チャネルを所定の温度でインキュベートし、それによって前記標的領域を含む前記ライブラリ断片の少なくともいくつかが前記捕捉プローブにハイブリダイズすることと、を更に含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記ライブラリ断片を前記濃縮チャネル内に導入する前に、前記ライブラリ断片の末端をブロッキングオリゴヌクレオチドでブロックすることを更に含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ライブラリ断片と共にクラウディング試薬を導入することを更に含む、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項25】

インキュベーション中に電場を印加することを更に含む、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項26】

インキュベーション中に前記ライブラリ断片を含有する流体の移動を誘導することを更に含む、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項27】

前記濃縮チャネル内で前記ライブラリ断片を前濃縮するために電気泳動を使用することを更に含む、請求項２２又は２３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９６６，３５１号の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

フローセルは、遺伝子配列決定、遺伝子型決定など、様々な方法及び用途で使用される。いくつかの方法及び用途では、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的分子から、断片化及びタグ付けされたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子のライブラリを生成することが望ましい。多くの場合、その目的は、ＤＮＡ配列決定反応において鋳型として使用するために、より大きなｄｓＤＮＡ分子からより小さなＤＮＡ分子（例えば、ＤＮＡ断片）を生成することである。鋳型は、短いリード長を得ることを可能にし得る。データの解析中に、重複する短い配列のリードを整列させて、より長い核酸配列を再構築することができる。場合によっては、データ分析を簡素化するために、プレシーケンシングステップ（例えば、特定の核酸分子のバーコード化）を使用することができる。

【発明の概要】

【0003】

（導入）
本明細書に開示される第１の態様は、ライブラリ調製ビーズを含むライブラリ調製流体であって、各ライブラリ調製ビーズが、第１の固形支持体と、第１の固形支持体に付着したトランスポソームとを含む、ライブラリ調製流体と；ゲノムデオキシリボ核酸配列を含む試料流体と；標的捕捉ビーズを含む濃縮流体であって、各標的捕捉ビーズが、第２の固形支持体と、第２の固形支持体に付着した捕捉プローブとを含み、捕捉プローブのそれぞれが、試料流体中のゲノムデオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖デオキシリボ核酸配列を含む、濃縮流体と、を含む、キットである。

【0004】

本明細書に開示される第２の態様は、ＲＮＡ－ｃＤＮＡ変換サブキットと；標的捕捉ビーズを含む濃縮流体であって、各標的捕捉ビーズが、固形支持体と、固形支持体に付着した捕捉プローブとを含み、捕捉プローブのそれぞれが、ＲＮＡ－ｃＤＮＡ変換サブキットを使用して生成されたｃＤＮＡの標的領域に相補的な一本鎖デオキシリボ核酸配列を含む、濃縮流体と、を含む、別のキットである。

【0005】

本明細書に開示される第３の態様は、基材と；基材上の第１の領域で画定された調製チャネルであって、調製チャネルが、ライブラリ調製ビーズを固定化するための調製捕捉部位を含む、調製チャネルと；調製チャネルの下流の基材上の第２の領域で画定された濃縮チャネルであって、濃縮チャネルが、増幅プライマーと、標的捕捉ビーズを固定化するための濃縮捕捉部位とを含む、濃縮チャネルと；調製チャネル及び濃縮チャネルを選択的かつ流体的に接続する輸送チャネルと、を備える、システムである。

【0006】

本明細書に開示される第４の態様は、２つの表面間に画定された濃縮チャネルであって、濃縮チャネルが、２つの表面のうちの少なくとも一方に付着した増幅プライマーと、２つの表面のうちの少なくとも一方に固定化された標的捕捉ビーズとを含み、各標的捕捉ビーズが、固形支持体と、固形支持体に付着した捕捉プローブとを含み、捕捉プローブのそれぞれが、ゲノムデオキシリボ核酸又は相補的デオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖核酸配列を含む、濃縮チャネルを備える、フローセルである。

【0007】

本明細書に開示される第５の態様は、増幅プライマー及び濃縮捕捉部位を含む少なくとも１つの表面を含む濃縮チャネルに標的捕捉ビーズを導入し、それによって標的捕捉ビーズの少なくともいくつかが、濃縮捕捉部位で固定化されることを含む、方法であって、標的捕捉ビーズのそれぞれが、固形支持体と、固形支持体に付着した捕捉プローブとを含み、捕捉プローブのそれぞれが、ゲノムデオキシリボ核酸又は相補的デオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖核酸配列を含む、方法である。

【0008】

態様のいずれか１つの任意の特徴は、任意の望ましい方法で共に組み合わせることができることを理解すべきである。更に、第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様の特徴の任意の組み合わせは、本明細書に開示される例のいずれかと組み合わせて、本開示に記載される利益、例えば、オンフローセル濃縮などを達成することができることを理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0009】

本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより明らかになろう。図面において、同様の参照番号は、類似なものではあるが、おそらく同一ではない構成要素に対応している。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号又は特徴は、それらが現れる他の図面と関連させて記載してもよく、記載しなくてもよい。

【0010】

【図1A】フローセルの例の上面図である。

【0011】

【図1B】図１Ａの１Ｂ－１Ｂ線に沿って取られた、濃縮チャネル及びパターン化されていない配列決定表面の例の拡大断面図である。

【0012】

【図1C】図１Ａの１Ｃ－１Ｃ線に沿って取られた、濃縮チャネル及びパターン化された配列決定表面の例の拡大断面図である。

【0013】

【図2】例示的なライブラリ調製方法を示す概略フロー図である。

【0014】

【図3A】別の例示的なライブラリ調製方法を示す概略フロー図である。

【0015】

【図3B】明確にするために再度示した図３Ａの方法から得られるブリッジの概略図である。

【0016】

【図4】オンボードライブラリ調製チャンバを有するフローセルの例を含む例示的なシステムの概略図である。

【0017】

【図5】本明細書に開示される濃縮方法の例を示す概略図である。

【0018】

【図6】比較濃縮方法を使用する場合、及び例示的濃縮方法を使用する場合の、フローセル表面上の標的ライブラリ断片の相対的被覆率のプロットを示すグラフである。

【0019】

【図7】異なるプローブ密度を有する標的捕捉ビーズの標的クラスター数を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0020】

いくつかの配列決定技術は、ＤＮＡライブラリ断片を捕捉及び増幅するために、フローセルの表面上で捕捉プライマーを利用する。フローセル構造及び増幅プロセスを利用して、フローセルの異なる領域でそれぞれのＤＮＡライブラリ断片のアンプリコンの個別の単クローン性集団を生成することができる。これは、各単クローン性集団が各ＤＮＡライブラリ断片について多くのデータを提供し得るため、（ＤＮＡライブラリ断片が生成される）ＤＮＡ試料の全部又は大部分を分析する際に望ましい場合がある。

【0021】

場合によっては、試料全体とは対照的に、ＤＮＡ試料の標的部分、例えば、所与の試料における特定の遺伝的変異を分析することが望ましい場合がある。この種の分析では、対象となる標的部分又は領域を濃縮することができ、例えば、これは、標的部分を残りのＤＮＡ試料から分離するのに役立つ。これにより、標的部分に専念した配列決定リードが可能になる。本明細書に開示される濃縮技術は、標的部分に対応するライブラリ断片のオンフローセルのハイブリダイゼーション及び捕捉を利用する。

【0022】

定義

【0023】

本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、関連技術の通常の意味をとるものと理解されるであろう。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。

【0024】

本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、単数形並びに複数形の両方を指す。本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。

【0025】

「一例」、「別の例」、「例」などへの本明細書全体を通じての言及は、例に関連して記載されている特定の要素（例えば、特徴、構造、組成、構成、及び／又は特性）が、本明細書に記載されている少なくとも１つの例に含まれており、他の例に存在していても、存在していなくともよいことを意味している。更に、文脈上明確に別段の指示がない限り、任意の例に関する記載の要素は、様々な例において任意の好適な様式で組み合わせ得ることを理解すべきである。

【0026】

特許請求の範囲を含む本開示全体で使用される「実質的に」及び「約」という用語は、処理における変動などに起因するような小さな変動を記載及び説明するために使用される。それらの用語は、表示値から±１０％以下、例えば、表示値から±５％以下、表示値から±２％以下、表示値から±１％以下、表示から±０．５％以下、表示値から±０．２％以下、表示値から±０．１％以下、表示値から±０．０５％以下を指すことができる。

【0027】

アダプター：例えば、ライゲーション又はタグメンテーションによって核酸分子に融合され得る直鎖状オリゴヌクレオチド配列。アダプターは、意図された目的の配列を示すタグであり得る。いくつかの例では、アダプターは、プライマー、例えば、ユニバーサルヌクレオチド配列（例えば、Ｐ５又はＰ７配列）を含むプライマーの少なくとも一部に相補的な配列を示すことができる。１つの特定の例として、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン末端配列を含む３’部分を有するポリヌクレオチドと、クラスター増幅反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに適した１つ以上の領域を含むアダプターとを含み得る。別の特定の例では、断片の一方の末端におけるアダプターは、第１のフローセルプライマーの少なくとも一部に相補的である配列を含み、断片の他方の末端におけるアダプターは、第２のフローセルプライマーの少なくとも一部と同一である配列を含む。相補的アダプターは、第１のフローセルプライマーにハイブリダイズすることができ、同一のアダプターは、その相補的なコピーのためのテンプレートであり、クラスタリング中に第２のフローセルプライマーにハイブリダイズすることができる。他の例では、アダプターは、配列決定プライマー配列又は配列決定結合部位（例えば、配列決定反応のためのプライマーとのハイブリダイゼーションに適した１つ以上の領域）を含み得る。異なるアダプターの組み合わせを、ＤＮＡ断片などの核酸分子に組み込むことができる。好適なアダプターの長さは、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、又は約１２ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、又は約１５ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドの範囲であり得る。アダプターは、ヌクレオチド及び／又は核酸の任意の組み合わせを含み得る。

【0028】

捕捉プローブ：ゲノムデオキシリボ核酸の標的領域、又はリボ核酸試料に由来する相補的デオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖デオキシリボ核酸配列。

【0029】

捕捉部位：特定の物質（例えば、標的捕捉ビーズ、複合体、タンパク質バイオマーカーなど）の局在化を可能にする化学的特性を持つよう修飾したフローセル表面の一部。一例では、捕捉部位は、特定の分子に付着、保持、又は結合することができる化学的捕捉剤（すなわち、物質、分子又は部分）を含み得る。化学的捕捉剤の一例としては、特定の物質（又は特定の物質に付着した連結部分）に結合し得る受容体－リガンド結合ペアのメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、エピトープ、抗体など）が挙げられる。化学的捕捉剤の更に別の例は、特定の物質と静電相互作用、水素結合、又は共有結合（例えば、チオールジスルフィド交換、クリックケミストリー、ディールス・アルダー反応など）を形成することができる化学試薬である。標的捕捉ビーズを付着させるように設計された捕捉部位は、本明細書では「濃縮捕捉部位」と称される。ライブラリ調製のために固形支持体を付着させるように設計された捕捉部位は、本明細書では「調製捕捉部位」と称される。

【0030】

堆積：手動又は自動のものであってよく、場合によっては表面特性の変更をもたらす、任意の適切な塗布技術。一般に、堆積は、蒸着技術、コーティング技術、グラフト技術などを使用して実行され得る。いくつかの特定の例としては、化学蒸着（ＣＶＤ）、スプレーコーティング（例えば、超音波スプレーコーティング）、スピンコーティング、ダンク又はディップコーティング、ドクターブレードコーティング、液滴分配（puddle dispensing）、フロースルーコーティング、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷、インクジェット印刷などが挙げられる。

【0031】

くぼみ：基材又はパターン化された樹脂による隙間領域によって少なくとも部分的に囲まれる表面開口部を有する、基材又はパターン化された樹脂における別個の凹状の機構。くぼみは、表面の開口部において、例として、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を持つ）などの、様々な形状をとることができる。表面と直交するように取られたくぼみの断面は、湾曲形状、正方形、多角形、双曲線、円錐、角のある形状などであることができる。例として、くぼみは、ウェル又は２つの相互接続されたウェルであり得る。くぼみはまた、尾根、階段状の作りなど、より複雑な構造を有し得る。

【0032】

それぞれ：アイテムのコレクションを指して使用される場合、それぞれがコレクション内の個々のアイテムを識別するが、必ずしもコレクション内の全てのアイテムを指すわけではない。明示的な開示又は文脈がそうでないことを明確に指示する場合、例外が生じ得る。

【0033】

濃縮チャネル：２つの結合した、又は別の方法で付着した構成要素間に画定された領域であり、その中に固定化された標的捕捉ビーズを含むか、又はその中に標的捕捉ビーズを受容して固定化することができる。いくつかの例では、濃縮チャネルは、２つのパターン化された又はパターン化されていない配列決定表面の間に画定され得、したがって、配列決定表面の１つ以上の構成要素と流体連通し得る。

【0034】

フローセル：反応が行われ得るチャンバ（例えば、濃縮チャネルを含み得る）と、チャンバに試薬を送達するための入口と、チャンバから試薬を除去するための出口とを有する容器。いくつかの例では、チャンバは、チャンバ内で発生する反応の検出を可能にする。例えば、チャンバは、アレイ、光学的に標識された分子などの光学的検出を可能にする１つ以上の透明な表面を含み得る。

【0035】

断片：遺伝物質の一部又は断片（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）。

【0036】

核酸分子又は試料：任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドであり、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、又はそれらの混合物を含み得る。この用語は、一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドを指す場合がある。

【0037】

「鋳型」核酸分子（又は鎖）は、解析されることになる配列を指し得る。

【0038】

核酸分子中のヌクレオチドは、天然に存在する核酸及びそれらの機能性類似体を含み得る。機能性類似体の例は、配列特異的な形式で核酸にハイブリダイズすることができるか、又は特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用され得る。天然に存在するヌクレオチドは、一般には、ホスホジエステル結合を含有する骨格を有する。類似体構造は、当技術分野で知られている様々なもののいずれかを含む代替骨格結合を有することができる。天然に存在するヌクレオチドは、一般に、デオキシリボース糖（例えば、ＤＮＡに見られる）又はリボース糖（例えば、ＲＮＡに見られる）を有する。類似体構造は、当技術分野で知られている様々なもののいずれかを含む代替糖部分を有することができる。ヌクレオチドは、天然又は非天然の塩基を含むことができる。天然のＤＮＡは、アデニン、チミン、シトシン、及び／又はグアニンの１つ以上を含むことができ、天然のＲＮＡは、アデニン、ウラシル、シトシン、及び／又はグアニンの１つ以上を含むことができる。ロックド核酸（locked nucleic acid、ＬＮＡ）及びブリッジ構造核酸（bridged nucleic acid、ＢＮＡ）などの任意の非天然塩基が使用され得る。

【0039】

プライマー：特定の配列にハイブリダイズすることができる核酸分子。一例として、増幅プライマーは、ライブラリ断片に付着したアダプターにハイブリダイズすることができ、鋳型増幅及びクラスター生成の開始点として機能することができる。別の例では、合成された核酸（鋳型）鎖は、合成された核酸鎖に相補的な新しい鎖の合成をプライミングするために、プライマー（例えば、配列決定プライマー）がハイブリダイズし得る部位を含み得る。任意のプライマーは、ヌクレオチド又はそれらの類似体の任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの例では、プライマーは、一本鎖のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。プライマーの長さは、任意の数の塩基の長さであることができ、様々な非天然ヌクレオチドを含むことができる。一例では、配列決定プライマーは、１０～６０塩基、又は２０～４０塩基の範囲の短鎖である。

【0040】

配列決定可能な核酸断片：３’及び５’末端にアダプターを有する遺伝物質の一部。配列決定可能な核酸断片では、各アダプターは、既知のユニバーサル配列（例えば、フローセル上のプライマーの少なくとも一部に相補的又は同一である）及び配列決定プライマー配列を含む。両方のアダプターは、インデックス（バーコード又はタグ）配列を含むこともできる。一例では、一端（例えば、Ｐ５’又はＰ５配列を含む）は、固形支持体インデックスを含み得、他端（Ｐ７又はＰ７’配列を含む）は、試料インデックスを含み得る。

【0041】

配列決定表面：１種以上の増幅プライマーがグラフトされた高分子ヒドロゲル。配列決定表面はまた、標的捕捉ビーズを固定化するための濃縮捕捉剤を含み得る。

【0042】

固形支持体：例えば、球形、卵形、微小球、又は規則的若しくは不規則な寸法を有するかどうかにかかわらずその他の認識される粒子形状を特徴とする形状を有する、硬質又は半硬質の材料で作製された小体（small body）。固形支持体のいくつかの例は、付着したライブラリ断片を有し得る。固形支持体の他の例は、付着した捕捉プローブを有し得る。

【0043】

標的捕捉ビーズ：付着した捕捉プローブを有する固形支持体。

【0044】

標的ライブラリ断片：ｉ）ゲノムデオキシリボ核酸配列又はｉｉ）リボ核酸試料に由来する相補的デオキシリボ核酸の一本鎖部分。標的ライブラリ断片の配列は、標的捕捉ビーズの捕捉プローブに相補的である。標的ライブラリ断片の配列は、対象となる領域、例えば、エクソーム又は腫瘍関連遺伝子などの特定のゲノムパネルであってもよい。

【0045】

転移鎖：２つのトランスポゾン末端のうちの転移部分。同様に、「非転移鎖」という用語は、２つのトランスポゾン末端のうちの非転移部分を指す。転移鎖の３’末端は、インビトロ転位反応で標的ＤＮＡに結合又は転移される。転移されたトランスポゾン末端配列に相補的なトランスポゾン末端配列を示す非転移鎖は、インビトロ転位反応で標的ＤＮＡに結合又は転移されない。

【0046】

いくつかの例では、転移鎖及び非転移鎖は、共有結合している。例えば、いくつかの実施形態では、転移及び非転移鎖配列は、単一のオリゴヌクレオチド上に、例えば、ヘアピン構成で提供される。したがって、非転移鎖の遊離末端は、転位反応によって試料ＤＮＡに直接的には結合されないが、非転移鎖は、ヘアピン構造のループによって転移鎖に連結されているため、非転移鎖は、ＤＮＡ断片に間接的に付着することになる。

【0047】

トランスポゾン末端：インビトロ転位反応で機能するトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素との複合体を形成するために必要なヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを示す二本鎖核酸ＤＮＡ。いくつかの例では、トランスポゾン末端は、転位反応においてトランスポザーゼと機能複合体を形成することができる。例として、トランスポゾン末端は、１９塩基対（ｂｐ）の外側末端（「ＯＥ」）トランスポゾン末端、内側末端（「ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は野生型又は変異体Ｔｎ５トランスポザーゼによって認識される「モザイク末端」（「ＭＥ」）トランスポゾン末端を含むことができる。トランスポゾン末端は、インビトロ転位反応においてトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素と機能複合体を形成するのに適した任意の核酸又は核酸類似体を含み得る。例えば、トランスポゾン末端は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾塩基、非天然塩基、修飾骨格を含むことができ、一方又は両方の鎖にニックを含むことができる。「ＤＮＡ」という用語は、トランスポゾン末端組成物に関連して本開示全体を通して使用され得るが、任意の適切な核酸又は核酸類似体がトランスポゾン末端において利用され得ることを理解すべきである。

【0048】

トランスポザーゼ：トランスポゾン末端含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）と機能複合体を形成し、例えば、インビトロ転位反応において、共にインキュベートされる二本鎖標的核酸へのトランスポゾン末端含有組成物の挿入又は転位を触媒することができる酵素。本明細書に提示されるトランスポザーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含み得る。本明細書に記載の多くの例は、Ｔｎ５トランスポザーゼ及び／又は過活性Ｔｎ５トランスポザーゼに言及するが、意図された目的の標的ＤＮＡに５’タグを付けて断片化するのに十分な効率でトランスポゾン末端を挿入することができる任意の転位システムを使用し得ることが理解されるであろう。特定の例では、好ましい転位システムは、トランスポゾン末端をランダムに又はほぼランダムに挿入し、標的ＤＮＡに５’タグを付けて断片化することができる。

【0049】

トランスポソーム複合体：二本鎖核酸に非共有結合したトランスポザーゼ酵素。例えば、トランスポソーム複合体は、非共有結合複合体形成をサポートする条件下で二本鎖トランスポゾンＤＮＡとプレインキュベートされたトランスポザーゼ酵素であり得る。二本鎖トランスポゾンＤＮＡとしては、例えば、Ｔｎ５ ＤＮＡ、Ｔｎ５ ＤＮＡの一部、トランスポゾン末端組成物、トランスポゾン末端組成物の混合物、又は過活性Ｔｎ５トランスポザーゼなどのトランスポザーゼと相互作用することができる他の二本鎖ＤＮＡが挙げられ得る。

【0050】

本明細書に開示される例では、標的捕捉ビーズは、配列決定表面も含むフローセルの濃縮チャネルで利用される。標的捕捉ビーズは、対象となるライブラリ断片を選択的に捕捉することができる捕捉プローブを含む。したがって、標的捕捉ビーズにより、フローセル内でカスタム濃縮を行うことができる。

【0051】

標的捕捉ビーズ

【0052】

標的捕捉ビーズを図１Ｂ及び図１Ｃに参照番号３６で示す。標的捕捉ビーズ３６は、固形支持体３８と、固形支持体に付着した捕捉プローブ４０とを含む。

【0053】

固形支持体３８は、ガラス（例えば、制御細孔ガラスビーズ）；磁気応答性材料；プラスチック、例えば、アクリル、ポリスチレン、又はスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン又はポリテトラフルオロエチレン（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｕｒｓ Ｃｏ．からのＴＥＦＬＯＮ（登録商標））；アガロース又はＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズ（Ｃｙｔｉｖｉａから入手可能なアガロースの架橋ビーズ形態）などの多糖類又は架橋多糖類；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；ケイ素及び変性ケイ素を含むシリカ又はシリカ系材料；炭素繊維；金属；無機ガラス；光ファイバーバンドル；又は他の様々なポリマーであり得るが、それらに限定されない。

【0054】

「磁気応答性」材料は、磁場に対応する。磁気応答性固形支持体の例は、磁気応答性材料を含むか、又はそれらから構成される。磁気応答性材料の例としては、常磁性材料、強磁性材料、フェリ磁性材料、及びメタ磁性材料が挙げられる。適切な常磁性材料の例としては、鉄、ニッケル、及びコバルト、並びにＦｅ_３Ｏ_４、ＢａＦｅ_１２Ｏ_１９、ＣｏＯ、ＮｉＯ、Ｍｎ_２Ｏ_３、Ｃｒ_２Ｏ_３、及びＣｏＭｎＰなどの金属酸化物が挙げられる。市販の例の１つには、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＹＮＡＢＥＡＤ（商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジン（ストレプトアビジンでコーティングされた超常磁性ビーズ）を含む。いくつかの例では、磁気応答性材料は、ポリマービーズのシェルに埋め込まれる。他の例では、磁気応答性材料はビーズ形態であり、酸化ケイ素又は窒化ケイ素などの不動態化材料でコーティングされる。

【0055】

固形支持体３８の任意の例は、固形ビーズ、多孔質ビーズ、又は中空ビーズの形態を有し得る。

【0056】

いくつかの例では、固形支持体３８は、結合ペアの一方のメンバーで官能化され得る。「結合ペア」は、互いに付着することができる２つの剤（例えば、材料、分子、部分）を指す。この例では、固形支持体３８上のメンバーは、フローセル１０（図１Ａ）の配列決定表面（図１Ｂの１２、１２’及び図１Ｃの１４、１４’参照）上に位置する別のメンバーとの結合ペアである。いくつかの例では、固形支持体３８上のメンバーは、ｉ）捕捉プローブ４０に付着したメンバーに結合することができ、かつｉｉ）フローセル１０の配列決定表面１２、１２’又は１４、１４’上の濃縮捕捉部位（図１Ｂ及び図１Ｃの３２、３２’参照）に結合することができるという点で、多官能性であり得る。他の例では、固形支持体３８は、２つの異なる結合ペアメンバー、例えば、ｉ）捕捉プローブ４０に付着したメンバーに結合することができる１つのメンバーと、ｉｉ）フローセル１０の１２、１２’又は１４、１４’上の濃縮捕捉部位３２、３２’に結合することができる別のメンバーとで官能化され得る。

【0057】

固形支持体３８の官能化は、固形支持体３８を結合ペアメンバーでコーティングすること、又は結合ペアメンバーと固形支持体３８の表面の官能基との間に結合を形成することを含み得る。結合ペアメンバーの一例としては、フローセルの配列決定表面上に位置する他方の結合ペアメンバーに結合することができる受容体－リガンド結合ペアのメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、エピトープ、抗体など）が挙げられる。結合ペアメンバーはまた、静電相互作用、水素結合、又は共有結合（例えば、チオールジスルフィド交換、クリックケミストリー、ディールス・アルダー反応など）を形成することができる化学試薬であり得る。

【0058】

他の例では、固形支持体３８は、結合ペアのメンバーを含まず、むしろ、固形支持体３８は、濃縮捕捉部位３２、３２’に化学的に共役されることができる。任意の形態の化学的結合を使用して、固形支持体３８を濃縮捕捉部位３２、３２’に付着させてもよい。

【0059】

多くの場合に、標的捕捉ビーズ３６が配列決定前に除去され得るように、固形支持体３８と濃縮捕捉部位３２、３２’との間には、可逆的又は開裂可能な相互作用が望ましい。

【0060】

標的捕捉ビーズ３６はまた、固形支持体３８に付着した捕捉プローブ４０を含む。固形支持体３８上の各捕捉プローブ４０は、同じ一本鎖デオキシリボ核酸配列を含む。この配列は、各捕捉プローブ４０が、対象となる（例えば、分析される）配列を含む標的ライブラリ断片に選択的にハイブリダイズするように選択される。いくつかの例では、捕捉プローブの配列は、ゲノムデオキシリボ核酸の標的領域に相補的である。他の例では、捕捉プローブの配列は、リボ核酸試料の標的領域に由来する相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に相補的である。

【0061】

捕捉プローブ４０中のヌクレオチドの数は、標的ライブラリ断片中のヌクレオチドの数に依存し得る。場合によっては、捕捉プローブ４０は、標的ライブラリ断片よりも小さい。捕捉プローブ４０は、約５０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドを含み得る。一例では、捕捉プローブ４０は、約８０ヌクレオチド～約１２０ヌクレオチドを含む。別の例では、捕捉プローブ４０は、６９ヌクレオチドを含む。

【0062】

捕捉プローブ４０は、任意のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して調製され得る。

【0063】

捕捉プローブ４０の一方の末端は、固形支持体３８に付着したメンバーに結合することができるように、結合ペアの他方のメンバーに結合していてもよい。例えば、捕捉プローブ４０は、固形支持体３８の表面におけるストレプトアビジンと結合するためにビオチン化され得る。

【0064】

捕捉プローブ４０は、捕捉プローブ４０を含有する混合物中で固形支持体３８をインキュベートすることによって、固形支持体３８に付着され得る。捕捉プローブ４０は、塩緩衝液中に混合され得る。捕捉プローブ４０と固形支持体３８との間の反応を促進又は可能にする任意の好適な塩緩衝液を使用することができる。一例では、塩緩衝液は、ビオチン化捕捉プローブ４０が固形支持体３８上のストレプトアビジンに結合するように、ビオチン－ストレプトアビジン反応を促進し得る。例として、塩緩衝液は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせを含む水溶液である。１つの特定の例では、塩緩衝液は、水中に約０．７５Ｍ塩化ナトリウム及び約７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。混合物中の捕捉プローブ４０の数は、混合物に添加される固形支持体３８の数及び標的捕捉ビーズ３６の所望のプローブ密度に依存し得る。一例では、標的捕捉ビーズ３６の所望のプローブ密度は、固形支持体１個あたり約２×１０^５の捕捉プローブ～固形支持体１個あたり約５×１０^６の捕捉プローブの範囲である。標的捕捉ビーズ３６の捕捉プローブ密度は、インキュベーションに用いる混合物中の捕捉プローブの濃度を調整することによって制御され得る。

【0065】

標的捕捉ビーズ３６を形成するための１つの例示的な方法は、各捕捉プローブ４０の末端に結合ペアの第１のメンバーが付着した捕捉プローブ４０を合成することと、捕捉プローブ４０を固形支持体３８と共にインキュベートすることとを含み、ここで、固形支持体３８は、結合ペアの第２のメンバーでコーティングされている。

【0066】

フローセル

【0067】

標的捕捉ビーズ３６は、パターン化された配列決定表面１４、１４’又はパターン化されていない配列決定表面１２、１２’を有するフローセル１０で使用され得る。標的捕捉ビーズ３６は、本明細書に記載の固形支持体３８及び捕捉プローブ４０の任意の例を含み得ることを理解すべきである。

【0068】

フローセル１０の例の上面図を図１Ａに示す。図１Ｂ及び図１Ｃを参照して説明するように、フローセル１０のいくつかの例は、２つの配列決定する対向した配列決定表面を含む。パターン化されていない配列決定表面１２、１２’の例を図１Ｂに示し、パターン化された配列決定表面１４、１４’の例を図１Ｃに示す。各配列決定表面１２、１２’又は１４、１４’は、基材（一般に図１Ａでは１６として示される）によって支持され、濃縮チャネル（一般に図１Ａでは１８として示される）は、配列決定表面１２、１２’又は１４、１４’の間に画定される。他の例では、フローセル１０は、基材１６によって支持された１つの配列決定表面と、基材１６に取り付けられた蓋とを含む。これらの例では、濃縮チャネル１８は、配列決定表面１２又は１４と蓋との間に画定される。

【0069】

いずれの例でも、基材１６は、単一の層／材料であってよい。単層基材の例を図１Ｂの参照番号１６Ａ及び１６Ａ’に示す。適切な単層基材１６Ａ、１６Ａ’の例としては、エポキシシロキサン、ガラス、修飾又は官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ＣｈｅｍｏｕｒｓのＴＥＦＬＯＮ（登録商標）など）、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）（ＺｅｏｎのＺＥＯＮＯＲ（登録商標）など）、ポリイミドなどを含む）、ナイロン（ポリアミド）、セラミック／酸化セラミック、シリカ、溶融シリカ、又はシリカベースの材料、ケイ酸アルミニウム、シリコン及び修飾シリコン（例えば、ホウ素ドープｐ＋シリコン）、窒化シリコン（Ｓｉ_３Ｎ_４）、酸化シリコン（ＳｉＯ_２）、五酸化タンタル（Ｔａ_２Ｏ_５）又は他の酸化タンタル（ＴａＯ_ｘ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ_２）、炭素、金属、無機ガラスなどが挙げられる。

【0070】

基材１６はまた、多層構造であってもよい。多層基材の例を図１Ｃの参照番号１６Ｂ及び１６Ｂ’に示す。多層構造１６Ｂ、１６Ｂ’のいくつかの例は、表面に酸化タンタル又は別のセラミック酸化物のコーティング層を備えたガラス又はシリコンを含む。図１Ｃを特に参照すると、多層構造１６Ｂ、１６Ｂ’の他の例は、下部支持体２０、２０’を含み、その上にパターン化された樹脂２２、２２’を有する。多層基材１６Ｂ、１６Ｂ’の更に他の例は、シリコンオンインシュレータ（ＳＯＩ）基材を含み得る。

【0071】

一例では、基材１６（単層であるか、多層である）は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径、又は最大約１０フィート（～３メートル）の最大寸法を有する長方形のシート若しくはパネルを有し得る。一例では、基材１６は、約２００ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径を有するウェーハである。別の例では、基材１６は、約０．１ｍｍ～約１０ｍｍの範囲の幅を有するダイである。例示的な寸法が提供されるが、任意の適切な寸法を有する基材１６を使用できることを理解すべきである。別の例として、３００ｍｍの丸いウェーハよりも大きな表面積を有する長方形の支持体であるパネルが使用され得る。

【0072】

図１Ａ、図１Ｂ及び／又は図１Ｃに示す例では、フローセル１０は、濃縮チャネル１８を含む。いくつかの濃縮チャネル１８が示されているが、任意の数のチャネル１８がフローセル１０に含まれ得ること（例えば、単一のチャネル１８、４つのチャネル１８など）を理解すべきである。本明細書に開示されるいくつかの例では、各濃縮チャネル１８は、２つの配列決定表面（例えば、１２及び１２’又は１４及び１４’）の間で、２つの取り付けられた基材（例えば、１６Ａ及び１６Ａ’又は１６Ｂ及び１６Ｂ’）によって画定される領域である。本明細書に開示される他の例では、各濃縮チャネル１８は、１つの配列決定表面（例えば、１２又は１４）と蓋との間に画定される領域である。本明細書に記載の流体は、濃縮チャネル１８に導入され、そこから除去され得る。各濃縮チャネル１８は、任意の特定の濃縮チャネル１８に導入された流体が、任意の隣接する濃縮チャネル１８に流入しないように、フローセル１０内の他の各濃縮チャネル１８から分離されていてもよい。

【0073】

濃縮チャネル１８の一部は、基材１６の材料に部分的に依存する任意の適切な技術を使用して、基材１６内に画定され得る。一例では、濃縮チャネル１８の一部は、ガラス基材１６にエッチングされる。別の例では、濃縮チャネル１８の一部は、フォトリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィーなどを使用して、多層基材１６Ｂ、１６Ｂ’の樹脂２２、２２’にパターン化され得る。更に別の例では、別個の材料（例えば、図１Ｂ及び図１Ｃの材料２４）を基材１６に適用してもよく、それによって別個の材料が濃縮チャネル１８の壁の少なくとも一部を画定する。

【0074】

一例では、濃縮チャネル１８は直線の構成を有する。濃縮チャネル１８の長さ及び幅は、基材１６の長さ及び幅よりもそれぞれ小さくてもよく、その結果、濃縮チャネル１８を取り囲む基材表面の一部は、別の基材１６への取り付けに利用可能である。場合によっては、各濃縮チャネル１８の幅は、少なくとも約１ｍｍ、少なくとも約２．５ｍｍ、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約７ｍｍ、少なくとも約１０ｍｍ、又はそれ以上であり得る。場合によっては、各濃縮チャネル１８の長さは、少なくとも約１０ｍｍ、少なくとも約２５ｍｍ、少なくとも約５０ｍｍ、少なくとも約１００ｍｍ、又はそれ以上であり得る。各濃縮チャネル１８の幅及び／又は長さは、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。別の例では、濃縮チャネル１８は正方形（例えば、１０ｍｍ×１０ｍｍ）である。

【0075】

各濃縮チャネル１８の深さは、例えば、マイクロコンタクト、エアロゾル、又はインクジェット印刷を使用して、流路壁を画定する別個の材料を堆積する場合、複数の単層の厚さまで小さくすることができる。他の例では、各濃縮チャネル１８の深さは、約１μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。一例では、深さは、約１０μｍから約１００μｍの範囲であり得る。別の例では、深さは約５μｍ以下である。各濃縮チャネル１８の深さは、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であることを理解すべきである。濃縮チャネル１８の深さはまた、例えば、パターン化された配列決定表面１４、１４’が使用される場合、フローセル１０の長さ及び幅に沿って変化し得る。

【0076】

図１Ｂは、パターン化されていない対向する配列決定表面１２、１２’を含むフローセル１０の断面図を示す。一例では、これらの表面１２、１２’のそれぞれは、基材１６Ａ、１６Ａ’上に調製され得、次に、基材１６Ａ、１６Ａ’は、フローセル１０の例を形成するために互いに取り付けられ得る。接着剤、結合を助ける放射線吸収材料などの任意の適切な結合材料２４を使用して、基材１６Ａ、１６Ｂを共に結合してもよい。

【0077】

図１Ｂに示す例では、濃縮チャネル１８の一部は、単層基材１６Ａ、１６Ａ’のそれぞれに画定される。例えば、各基材１６Ａ、１６Ａ’は、その中に画定された凹状領域２６、２６’を有し得、凹状領域には配列決定表面１２、１２’の構成要素が導入され得る。配列決定表面１２、１２’の構成要素によって占有されていない凹状領域２６、２６’内の任意の空間は、濃縮チャネル１８の一部であると見なされ得ることを理解すべきである。

【0078】

配列決定表面１２、１２’は、高分子ヒドロゲル２８、２８’、高分子ヒドロゲル２８、２８’に付着した増幅プライマー３０、３０’、及び濃縮捕捉部位３２、３２’を含む。

【0079】

高分子ヒドロゲル２８、２８’の例としては、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド、ＰＡＺＡＭなどのアクリルアミドコポリマーが挙げられる。ＰＡＺＡＭ及び他のいくつかの形態のアクリルアミドコポリマーは、次の構造（Ｉ）で表され、

【化1】

（式中、
Ｒ^Ａは、アジド、任意選択で置換アミノ、任意選択で置換アルケニル、任意選択で置換アルキン、ハロゲン、任意選択で置換ヒドラゾン、任意選択で置換ヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意選択で置換テトラゾール、任意選択で置換テトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、硫酸塩、及びチオールからなる群から選択され、
Ｒ^ＢはＨ又は任意選択で置換アルキルであり、
Ｒ^Ｃ、Ｒ^Ｄ、及びＲ^Ｅはそれぞれ、Ｈ及び任意選択で置換アルキルからなる群から独立して選択され、
－（ＣＨ_２）_ｐ－のそれぞれは、任意選択で置き換えられ得、
ｐは１から５０の範囲の整数であり、
ｎは１から５０，０００の範囲の整数であり、及び
ｍは、１から１００，０００の範囲の整数である）。

【0080】

当業者は、構造（Ｉ）において繰り返される特徴「ｎ」及び「ｍ」の配置が代表的なものであり、モノマーサブユニットがポリマー構造（例えば、ランダム、ブロック、パターン化、又はそれらの組み合わせ）中に任意の順序で存在し得ることを認識する。

【0081】

ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーの分子量は、約５ｋＤａから約１５００ｋＤａ又は約１０ｋＤａから約１０００ｋＤａの範囲であり得るか、あるいは特定の例では、約３１２ｋＤａであり得る。

【0082】

いくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは線状ポリマーである。他のいくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは、軽度に架橋されたポリマーである。

【0083】

他の例では、高分子ヒドロゲル２８、２８’は、構造（Ｉ）の変形であり得る。一例では、アクリルアミドユニットはＮ，Ｎージメチルアクリルアミド（

【化2】

）で置き換えられ得る。この例では、構造（Ｉ）のアクリルアミドユニットは

【化3】

で置き換えられ得、ここで、Ｒ_Ｄ、Ｒ_Ｅ、及びＲ_ＦはそれぞれＨ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ_Ｇ及びＲ_ＨはそれぞれＣ１～Ｃ６アルキルである（アクリルアミドの場合のようにＨではない）。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。別の例では、アクリルアミドユニットに加えて、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドが使用され得る。この例では、構造（Ｉ）は繰り返す特徴「ｎ」及び「ｍ」に加えて

【化4】

を含み得、ここでＲ^Ｄ、Ｒ^Ｅ、及びＲ^ＦはそれぞれＨ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ^Ｇ及びＲ^ＨはそれぞれＣ１～Ｃ６アルキルである。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。

【0084】

更に別の例として、高分子ヒドロゲル２８、２８’は、構造（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）のそれぞれの繰り返し単位を含み得、

【化5】

ここで、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^１ｂ及びＲ^２ｂのそれぞれは、水素、任意選択では置換アルキル又は任意選択では置換フェニルから独立して選択され、Ｒ^３ａ及びＲ^３ｂのそれぞれは、水素、任意選択で置換アルキル、任意選択で置換フェニル、又は任意選択で置換Ｃ７～Ｃ１４アラルキルから独立して選択され、Ｌ^１及びＬ^２のそれぞれは、任意選択で置換アルキレンリンカー又は任意選択で置換ヘテロアルキレンリンカーから独立して選択される。

【0085】

オリゴヌクレオチドプライマー３０、３０’をグラフトするために官能化される限り、他の分子を使用して高分子ヒドロゲル２８、２８’を形成することができることを理解すべきである。適切なポリマー層の他の例としては、アガロースなどのコロイド構造、又はゼラチンなどのポリマーメッシュ構造、又はポリアクリルアミドポリマー及びコポリマー、シランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ）、又はアジド分解バージョンのＳＦＡなどの架橋ポリマー構造を有するものが挙げられる。適切なポリアクリルアミドポリマーの例は、アクリルアミドとアクリル酸若しくはビニル基を含むアクリル酸とから、又は［２＋２］光付加環化反応を形成するモノマーから合成され得る。適切な高分子ヒドロゲル２８、２８’の更に他の例としては、アクリルアミドとアクリレートとの混合コポリマーが挙げられる。本明細書に開示される実施例では、星状ポリマー、星型又は星型ブロックポリマー、デンドリマーなどを含む分岐ポリマーなど、アクリルモノマー（例えば、アクリルアミド、アクリレートなど）を含む様々なポリマー構造は利用され得る。例えば、モノマー（例えば、アクリルアミドなど）は、ランダムに又はブロックで、星型ポリマーの分岐（アーム）に組み込まれ得る。

【0086】

高分子ヒドロゲル２８、２８’を凹状領域２６、２６’に導入するために、高分子ヒドロゲル２８、２８’の混合物が生成され、次に（凹状領域２６、２６’を画定する）それぞれの基材１６Ａ、１６Ａ’に適用され得る。一例では、高分子ヒドロゲル２８、２８’は、混合物（例えば、水との混合物、又はエタノールと水との混合物）中に存在し得る。次に、混合物は、スピンコーティング、浸漬又は浸漬コーティング、あるいは正圧又は負圧下での材料のフロー、又は別の適切な技術を使用し、それぞれの基材表面（凹状領域２６、２６’を含む）に適用され得る。これらのタイプの技術は、高分子ヒドロゲル２８、２８’を基材１６Ａ、１６Ａ’のそれぞれの基材上に（例えば、凹状領域２６、２６’内及びそれに隣接する隙間領域３４、３４’上に）全面的（blanketly）に堆積させる。他の選択的堆積技術（例えば、マスク、制御された印刷技術などを含む）を使用し、隙間領域３４、３４’ではなく、凹状領域２６、２６’に高分子ヒドロゲル２８、２８’を特異的に堆積させることができる。

【0087】

いくつかの例では、基材表面（凹状領域２６、２６’を含む）が活性化され得、次に、混合物（高分子ヒドロゲル２８、２８’を含む）がそれに適用され得る。一例では、シラン又はシラン誘導体（例えば、ノルボルネンシラン）は、蒸着、スピンコーティング、又は他の堆積方法を使用し、基材表面に堆積され得る。別の例では、基材表面をプラズマ灰化に曝露させて、高分子ヒドロゲル２８、２８’に付着し得る表面活性化剤（例えば、－ＯＨ基）を生成することができる。

【0088】

高分子ヒドロゲル２８、２８’の化学的性質に応じて、適用された混合物を硬化プロセスに曝露してもよい。一例では、硬化は、室温（例えば、約２５℃）～約９５℃の範囲の温度で、約１ミリ秒～約数日の範囲の時間にわたって行うことができる。

【0089】

凹状領域２６、２６’の周囲の隙間領域３４、３４’から高分子ヒドロゲル２８、２８’を除去し、かつ凹状領域２６、２６’の表面上に高分子ヒドロゲル２８、２８’を少なくとも実質的に無傷のまま残すために、研磨が実行され得る。

【0090】

配列決定表面１２、１２’はまた、高分子ヒドロゲル２８、２８’に付着した増幅プライマー３０、３０’を含む。

【0091】

グラフトプロセスを実行して、増幅プライマー３０、３０’を凹状領域２６、２６’の高分子ヒドロゲル２８、２８’にグラフトしてもよい。一例では、増幅プライマー３０、３０’は、プライマー３０、３０’の５’末端又はその近傍における一点共有結合性付着によって、高分子ヒドロゲル２８、２８’に固定化され得る。この付着により、ｉ）プライマー３０、３０’のアダプター特異的部分は、その同族の配列決定可能な核酸断片に自由にアニールすることができ、ｉｉ）３’ヒドロキシル基は、自由にプライマーを伸長することができる。この目的のために、任意の好適な共有結合を使用することができる。使用できる末端プライマーの例としては、アルキン末端プライマー（例えば、高分子ヒドロゲル２８、２８’のアジド表面部分に付着し得る）、又はアジド末端プライマー（例えば、高分子ヒドロゲル２８、２８’のアルキン表面部分に付着し得る）が挙げられる。

【0092】

好適なプライマー３０、３０’の具体例としては、ＨＩＳＥＱ（商標）、ＨＩＳＥＱＸ（商標）、ＭＩＳＥＱ（商標）、ＭＩＳＥＱＤＸ（商標）、ＭＩＮＩＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱＤＸ（商標）、ＮＯＶＡＳＥＱ（商標）、ＧＥＮＯＭＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）、ＩＳＥＱ（商標）、及び他の機器プラットフォームでの配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．により販売されている市販のフローセルの表面上で使用されるＰ５及びＰ７プライマーが挙げられる。Ｐ５及びＰ７プライマーのいずれも、高分子ヒドロゲル２８、２８’のそれぞれにグラフトされ得る。

【0093】

一例では、グラフトは、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合された蓋を使用する）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、液滴分配、又はプライマー３０、３０’を高分子ヒドロゲル２８、２８’に付着させる別の適切な方法によるものであり得る。これらの例示的な技術のそれぞれは、プライマー３０、３０’、水、緩衝液、及び触媒を含み得る、プライマー溶液又は混合物を利用し得る。グラフト法のいずれかを用いると、プライマー３０、３０’は、凹状領域２６、２６’において高分子ヒドロゲル２８、２８’の反応基と反応し、周囲の基材１６Ａ、１６Ａ’に対して親和性を有さない。したがって、プライマー３０、３０’は、高分子ヒドロゲル２８、２８’に選択的にグラフトする。

【0094】

図１Ｂに示す例では、濃縮捕捉部位３２、３２’は、高分子ヒドロゲル２８、２８’の少なくとも一部に付着又は適用される化学的捕捉剤を含む。本明細書で開示される化学的捕捉剤の任意の例を使用することができる。いくつかの例では、化学的捕捉剤は、ストレプトアビジン含有標的捕捉ビーズ３６をフローセルの配列決定表面１２、１２’又は１４、１４’に付着させることができる、ビオチンであり得る。他の例では、化学的捕捉剤は、別の結合ペアメンバー（例えば、ビオチン－ストレプトアビジン結合ペア以外）であり得る。これらの他の例のいくつかでは、標的捕捉ビーズ３６は、２つの異なる結合ペアメンバー、例えば、ｉ）ストレプトアビジン（ビオチンに結合して捕捉プローブ４０を付着させる）と、ｉｉ）フローセル１０の配列決定表面１２、１２’又は１４、１４’上の濃縮捕捉部位３２、３２’の化学的捕捉剤に結合することができる別のメンバーとを含み得る。これらの他の例では、化学的捕捉剤は、ビオチンではない結合ペアメンバーであってもよく、ここで、結合ペアの他方のメンバーは、ストレプトアビジンに加えて固形支持体３８に付着している。

【0095】

いくつかの例では、高分子ヒドロゲル２８、２８’の遊離官能基（例えば、プライマー３０、３０’に付着されていないもの）は、いくつかの濃縮捕捉部位３２、３２’が高分子ヒドロゲル２８、２８’の表面にわたって形成されるように、化学的捕捉剤で官能化され得る。一例では、クリックケミストリーを使用して、アルキン－ＰＥＧ－ビオチンリンカー又はアルキン－ビオチン遊離アジド基を、高分子ヒドロゲル２８、２８’上の遊離アジドに共有結合させることができる。別の例では、増幅プライマー３０、３０’に相補的なプライマーは、当該プライマーに付着した化学的捕捉剤（例えば、ビオチン又は別の結合ペアのメンバー）を有し得る。これらの相補的なプライマーは、いくつかの増幅プライマー３０、３０’にハイブリダイズされ、濃縮捕捉部位３２、３２’を形成し得る。

【0096】

別の例では、化学的捕捉剤は、マイクロコンタクト印刷、エアロゾル印刷などを使用して望ましい場所に堆積され、濃縮捕捉部位３２、３２’を形成し得る。更に別の例では、マスク（例えば、フォトレジスト）を使用して、化学的捕捉剤が堆積され、したがって濃縮捕捉部位３２、３２’が形成される、空間／場所を画定してもよい。次に、（例えば、リフトオフ、溶解、又は別の適切な技術を介して）化学的捕捉剤が堆積され得、マスクが除去される。この例では、濃縮捕捉部位３２、３２’は、化学的捕捉剤の単層又は薄層を含み得る。

【0097】

図１Ｃは、パターン化された対向する配列決定表面１４、１４’を含むフローセル１０の断面図を示す。一例では、これらの表面１４、１４’のそれぞれは、基材１６Ｂ、１６Ｂ’上に調製され得、次に、基材１６Ｂ、１６Ｂ’は、フローセル１０の例を形成するために（例えば、材料２４を介して）互いに取り付けられ得る。

【0098】

図１Ｃに示す例では、フローセル１０は、多層基材１６Ｂ、１６Ｂ’を含み、そのそれぞれは、支持体２０、２０’及び支持体２０、２０’上に配置されたパターン化された材料２２、２２’を含む。パターン化された材料２２、２２’は、隙間領域３４、３４’によって分離されたくぼみ４２、４２’を画定する。

【0099】

図１Ｃに示す例では、パターン化された材料２２、２２’は、それぞれ支持体２０、２０’上に配置される。くぼみ４２、４２’及び隙間領域３４、３４’を形成するために選択的に堆積、又は堆積及びパターン化され得る任意の材料が、パターン化された材料２２、２２’に使用され得ることを理解すべきである。

【0100】

一例として、無機酸化物は、蒸着、エアロゾル印刷、又はインクジェット印刷を介して支持体２０、２０’に選択的に適用され得る。適切な無機酸化物の例としては、酸化タンタル（例えば、Ｔａ_２Ｏ_５）、酸化アルミニウム（例えば、Ａｌ_２Ｏ_３）、酸化ケイ素（例えば、ＳｉＯ_２）、酸化ハフニウム（例えば、ＨｆＯ_２）などが挙げられる。

【0101】

別の例として、樹脂は支持体２０、２０’に塗布されてからパターン化され得る。適切な堆積技術としては、化学蒸着、ディップコーティング、ダンクコーティング、スピンコーティング、スプレーコーティング、液滴分配、超音波スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング、エアゾール印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷などを含む。適切なパターニング技術としては、フォトリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィー（ＮＩＬ）、スタンピング技術、エンボス技術、成形技術、マイクロエッチング技術、印刷技術などが挙げられる。適切な樹脂のいくつかの例としては、多面体オリゴマーシルセスキオキサン樹脂（Ｈｙｂｒｉｄ ＰｌａｓｔｉｃｓからＰＯＳＳ（登録商標）の商品名で市販されている）ベースの樹脂、多面体オリゴマーシルセスキオキサンではないエポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂（例えば、開環エポキシ）、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、メタクリレート樹脂、アモルファスフルオロポリマー樹脂（例えば、ＢｅｌｌｅｘからのＣＹＴＯＰ（登録商標））、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0102】

本明細書で使用されるとき、「多面体オリゴマーシルセスキオキサン」という用語は、シリカ（ＳｉＯ_２）とシリコーン（Ｒ_２ＳｉＯ）との間のハイブリッド中間体（例えば、ＲＳｉＯ_１．５）である化学組成物を指す。多面体オリゴマーシルセスキオキサンの例は、Ｋｅｈａｇｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８６（２００９），ｐｐ．７７６－７７８に記載されているものであり得、これは、参照によりその全体が組み込まれる。一例では、組成物は、化学式［ＲＳｉＯ_３／２］_ｎを有する有機ケイ素化合物であり、Ｒ基は同じであっても異なってもよい。多面体オリゴマーシルセスキオキサンの例示的なＲ基としては、エポキシ、アジド（azide）／アジド（azido）、チオール、ポリ（エチレングリコール）、ノルボルネン、テトラジン、アクリレート、及び／又はメタクリレート、あるいは、更に、例えば、アルキル、アリール、アルコキシ、及び／又はハロアルキル基を含む。本明細書に開示される樹脂組成物は、モノマーユニットとして１つ以上の異なるケージ又はコア構造を含み得る。

【0103】

図１Ｃに示すように、パターン化された材料２２、２２’は、それぞれそこに画定されたくぼみ４２、４２’、及び隣接するくぼみ４２、４２’を分離する隙間領域３４、３４’を含む。規則的、繰り返し、及び非規則的なパターンを含む、くぼみ４２、４２’の多くの異なるレイアウトが想定され得る。一例では、くぼみ４２、４２’は、密なパッキング及び改善された密度のために六角形グリッドに配置される。他のレイアウトは、例えば、直線的な（長方形）レイアウト、三角形のレイアウトなどを含み得る。いくつかの例では、レイアウト又はパターンは、行及び列をなしているくぼみ４２、４２’のｘ－ｙ形式であり得る。他のいくつかの例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ４２、４２’及び／又は隙間領域３４、３４’の繰り返し配置であり得る。更に他の例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ４２、４２’及び／又は隙間領域３４、３４’のランダムな配置であり得る。パターンは、ウェル、ストライプ、渦巻き、線、三角形、長方形、円、円弧、照合印、格子縞、対角線、矢印、正方形、及び／又は斜交平行を含み得る。

【0104】

くぼみ４２、４２’のレイアウト又はパターンは、画定された領域におけるくぼみ４２、４２’の密度（例えば、くぼみ４２、４２’の数）により特徴付けられ得る。例えば、くぼみ４２、４２’は、１ｍｍ^２あたり約２００万の密度で存在し得る。例えば、１ｍｍ^２あたり約１００、１ｍｍ^２あたり約１，０００、１ｍｍ^２あたり約１０万、１ｍｍ^２あたり約１００万、１ｍｍ^２あたり約２００万、１ｍｍ^２あたり約５００万、１ｍｍ^２あたり約１０００万、１ｍｍ^２あたり約５０００万、又はそれ以下の密度を含む、異なる密度に調整され得る。パターン化された材料２２、２２’のくぼみ４２、４２’の密度は、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間にあり得ることを更に理解すべきである。例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満で分離されたくぼみ４２、４２’を有するものとして特徴付けられ得、中密度アレイは、約４００ｎｍ～約１μｍで分離されたくぼみ４２、４２’を有するものとして特徴付けられ得、低密度アレイは、約１μｍを超えて分離されたくぼみ４２、４２’を有するものとして特徴付けられ得る。密度の例が提供されるが、任意の適切な密度を使用できることを理解すべきである。くぼみ４２、４２’の密度は、くぼみ４２、４２’の深さに部分的に依存し得る。場合によっては、くぼみ４２、４２’間の間隔が、本明細書に記載された例よりも更に大きいことが望ましい場合がある。

【0105】

くぼみ４２、４２’のレイアウト又はパターンはまた、又は代替的に、平均ピッチ、又はくぼみ４２、４２’の中心から隣接するくぼみ４２、４２’の中心までの間隔（中心間の間隔）、又は１つのくぼみ４２、４２’の右端から隣接するくぼみ４２、４２’の左端までの間隔（エッジ間の間隔）に関して特徴付けられ得る。パターンは、平均ピッチ周辺の変動係数が小さくなるように規則的である場合もあれば、パターンが不規則である場合もあり、その場合、変動係数は比較的大きくなる可能性がある。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、おおよそ約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、又は約１００μｍであってもよい。くぼみ４２、４２’の特定のパターンの平均ピッチは、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間であり得る。一例では、くぼみ４２、４２’は、約１．５μｍのピッチ（中心間の間隔）を有する。平均ピッチ値の例が提供されるが、他の平均ピッチ値も使用され得ることを理解すべきである。

【0106】

くぼみ４２、４２’のそれぞれのサイズは、その体積、開口面積、深さ、及び／又は直径によって特徴付けられ得る。

【0107】

くぼみ４２、４２’のそれぞれは、フローセル１０に導入される少なくともいくらかの流体を隔離する（confining）ことができる任意の体積を有し得る。最小又は最大の体積は、例えば、フローセル１０の下流での使用に期待されるスループット（例えば、多重度）、解像度、ヌクレオチド、又は分析物の反応性に対応するように選択され得る。例えば、体積は、少なくとも約１×１０^－３μｍ^３、少なくとも約１×１０^－２μｍ^３、少なくとも約０．１μｍ^３、少なくとも約１μｍ^３、少なくとも約１０μｍ^３、少なくとも約１００μｍ^３、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、体積は、最大で約１×１０^４μｍ^３、最大で約１×１０^３μｍ^３、最大で約１００μｍ^３、最大で約１０μｍ^３、最大で約１μｍ^３、最大で約０．１μｍ^３、又はそれ以下であり得る。

【0108】

各くぼみの開口部が占有する面積は、上記の体積と同様の基準に基づいて選択され得る。例えば、各くぼみ開口部の面積は、少なくとも約１×１０^－３μｍ^２、少なくとも約１×１０^－２μｍ^２、少なくとも約０．１μｍ^２、少なくとも約１μｍ^２、少なくとも約１０μｍ^２、少なくとも約１００μｍ^２、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、面積は、最大で約１×１０^３μｍ^２、最大で約１００μｍ^２、最大で約１０μｍ^２、最大で約１μｍ^２、最大で約０．１μｍ^２、最大で約１×１０^－２μｍ^２、又はそれ以下であり得る。各くぼみの開口部が占有する面積は、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。

【0109】

くぼみ４２、４２’のそれぞれの深さは、高分子ヒドロゲル２８、２８’の一部を収容するのに十分な大きさであり得る。一例では、深さは、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、深さは、最大で約１×１０^３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、又はそれ以下であり得る。いくつかの例では、深さは約０．４μｍである。それぞれのくぼみ４２、４２’の深さは、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。

【0110】

いくつかの例では、くぼみ４２、４２’のそれぞれの直径又は長さ及び幅は、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、直径又は長さ及び幅は、最大で約１×１０^３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、最大で約１μｍ、最大で約０．５μｍ、最大で約０．１μｍ、又はそれ以下（例えば、約５０ｎｍ）であり得る。いくつかの例では、直径、又は長さ及び幅のそれぞれは、約０．４μｍである。各くぼみ４２、４２’の直径又は長さ及び幅は、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。

【0111】

この例では、配列決定表面１４、１４’の構成要素の少なくともいくつかは、くぼみ４２、４２’に導入され得る。配列決定表面１４、１４’の構成要素によって占有されていないくぼみ４２、４２’内の任意の空間は、濃縮チャネル１８の一部であると見なされ得ることを理解すべきである。

【0112】

図１Ｃに示す例では、高分子ヒドロゲル２８、２８’は、くぼみ４２、４２’のそれぞれの中に配置される。高分子ヒドロゲル２８、２８’は、図１Ｂを参照して説明したように適用され得、その結果、高分子ヒドロゲル２８、２８’は、くぼみ４２、４２’内に存在し、周囲の隙間領域３４、３４’又は濃縮捕捉部位３２、３２’上には存在しない。

【0113】

図１Ｃに示す例では、プライマー３０、３０’は、各くぼみ４２、４２’内の高分子ヒドロゲル２８、２８’にグラフトされ得る。プライマー３０、３０’は、図１Ｂを参照して説明したように適用され得、したがって、周囲の隙間領域３４、３４’又は濃縮捕捉部位３２、３２’ではなく、高分子ヒドロゲル２８、２８’にグラフトされる。

【0114】

図１Ｃに示す例では、濃縮捕捉部位３２、３２’は、隙間領域３４、３４’の少なくともいくつかに適用される化学的捕捉剤である。例えば、化学的捕捉剤は、マイクロコンタクト印刷、エアロゾル印刷などを使用して隙間領域３４、３４’の少なくともいくつかに堆積され、濃縮捕捉部位３２、３２’を形成し得る。更に別の例では、マスク（例えば、フォトレジスト）を使用して、化学的捕捉剤が堆積され、したがって濃縮捕捉部位３２、３２’が形成される、空間／場所を画定してもよい。次に、（例えば、リフトオフ、溶解、又は別の適切な技術を介して）化学的捕捉剤が堆積され得、マスクが除去される。

【0115】

他の例では、濃縮捕捉部位３２、３２’は、高分子ヒドロゲル２８、２８’の遊離官能基（例えば、プライマー３０、３０’に付着されていないもの）に付着した化学的捕捉剤である。更に他の例では、濃縮捕捉部位３２、３２’は、増幅プライマー３０、３０’のいくつかにハイブリダイズしたプライマーに付着した化学的捕捉剤である。これらの例では、濃縮捕捉部位３２、３２’は、くぼみ４２、４２’に存在し、隙間領域３４、３４’には存在しない。

【0116】

本明細書に開示される化学的捕捉剤の任意の例は、図１Ｃに示す例において使用され得る。化学的捕捉剤は、標的捕捉ビーズ３６の固形支持体３８がどのように官能化されているかに部分的に依存して、ビオチン又は別の結合ペアのメンバーであることができる。

【0117】

図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、基材１６Ａと１６Ａ’又は１６Ｂと１６Ｂ’は、配列決定表面１２と１２’又は１４と１４’が互いに向き合ってそれらの間に濃縮チャネル１８が画定されるように互いに取り付けられる。

【0118】

基材１６Ａと１６Ａ’又は１６Ｂと１６Ｂ’は、隙間領域３４、３４’のいくつか又は全てで互いに結合され得る。基材１６Ａと１６Ａ’又は１６Ｂと１６Ｂ’との間に形成される結合は、化学的結合、又は機械的結合（例えば、留め具を使用するなど）であり得る。

【0119】

レーザー結合、拡散結合、陽極結合、共晶結合、プラズマ活性化結合、ガラスフリット結合、又は当技術分野で知られる他の方法などの任意の適切な技術を使用し、基材１６Ａ及び１６Ａ’又は１６Ｂ及び１６Ｂ’を共に結合し得る。一例では、スペーサー層（例えば、材料２４）を使用し、基材１６Ａ及び１６Ａ’又は１６Ｂ及び１６Ｂ’を結合し得る。スペーサー層は、基材１６Ａと１６Ａ’又は１６Ｂと１６Ｂ’の少なくとも一部を共にシールする任意の材料２４であり得る。いくつかの例では、スペーサー層は、結合を助ける放射線吸収材料であり得る。

【0120】

図示していないが、フローセル１０が１つの配列決定表面１２又は１４を有するように、基材１６Ａ又は１６Ａ’の一方に蓋を結合し得ることを理解すべきである。

【0121】

フローセルの外部でのライブラリ調製

【0122】

図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃに示すフローセル１０では、ライブラリ断片の調製は、フローセル１０の外部で行われ得る。ライブラリ調製がフローセル１０の外部で行われる場合、より長い遺伝物質部分を断片化し、所望のアダプターを断片の末端に組み込む、任意の好適なライブラリ調製技術を使用することができる。

【0123】

ＤＮＡライブラリ調製技術の一例は、固形支持体上でのタグメンテーションを含む。この例では、固形支持体は、標的捕捉ビーズ３６に関して本明細書に記載した任意の例であってもよく、タグ付けされたライブラリ断片は、固形支持体の表面上に固定化される。

【0124】

このライブラリ調製例では、固形支持体は、固定化されたトランスポソーム複合体を有し、各トランスポソーム複合体は、第１のポリヌクレオチドに結合したトランスポザーゼを含み、第１のポリヌクレオチドは、（ｉ）トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、（ｉｉ）第１のタグ（アダプター）とを含む。ＤＮＡ試料は、ＤＮＡ試料がトランスポソーム複合体によって断片化され、かつ第１のポリヌクレオチドの３’トランスポゾン末端配列が断片の一方の鎖の５’末端に転移される条件下で、固形支持体に曝露される。これにより、少なくとも一方の鎖が第１のタグで５’タグを付けられた、二本鎖断片の固定化されたライブラリが生成される。

【0125】

図２は、このライブラリ調製方法を一般的に示す。この例では、固形支持体３８’は、表面結合したトランスポソーム複合体４４を含む。トランスポソーム複合体４４は、オリゴヌクレオチド（固形支持体３８’にグラフトされており、そのうちのいくつかがＭＥ配列を含有する）と、オリゴヌクレオチドに非共有結合したトランスポザーゼ酵素とを含む。これらの表面結合したトランスポソーム４４の密度は、ＭＥ配列を含有するグラフトされたオリゴヌクレオチドの密度を変化させることによって、又は固形支持体３８’に添加されるトランスポザーゼの量によって調節することができる。例えば、いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体４４は、１ｍｍ^２当たり少なくとも１０^３、１０^４、１０^５個の複合体、又は少なくとも１０^６個の複合体の密度で固形支持体３８’上に存在する。

【0126】

二本鎖ＤＮＡ試料３７が固形支持体３８’に添加されると、トランスポソーム複合体４４は、添加されたＤＮＡをタグ付けし、したがって（例えば、挿入されたタグにより）両方の末端で固形支持体３８’の表面に結合された二本鎖断片４６を生成する。いくつかの例では、架橋断片４６の長さは、表面上のトランスポソーム複合体４４の密度を変えることによって変化させることができる。いくつかの例では、得られる架橋断片の長さは、１００塩基対（ｂｐ）、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１，０００ｂｐ、１，１００ｂｐ、１，２００ｂｐ、１，３００ｂｐ、１，４００ｂｐ、１，５００ｂｐ、１，６００ｂｐ、１，７００ｂｐ、１，８００ｂｐ、１，９００ｂｐ、２，０００ｂｐ、２，１００ｂｐ、２，２００ｂｐ、２，３００ｂｐ、２，４００ｂｐ、２，５００ｂｐ、２，６００ｂｐ、２，７００ｂｐ、２，８００ｂｐ、２，９００ｂｐ、３，０００ｂｐ、３，１００ｂｐ、３，２００ｂｐ、３，３００ｂｐ、３，４００ｂｐ、３，５００ｂｐ、３，６００ｂｐ、３，７００ｂｐ、３，８００ｂｐ、３，９００ｂｐ、４，０００ｂｐ、４，１００ｂｐ、４，２００ｂｐ、４，３００ｂｐ、４，４００ｂｐ、４，５００ｂｐ、４，６００ｂｐ、４，７００ｂｐ、４，８００ｂｐ、４，９００ｂｐ、５，０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、３０，０００ｂｐ、又は１００，０００ｂｐ未満である。他の例では、得られる架橋断片４６の長さは、より長い。特定の実施形態では、得られる架橋断片４６の長さは、上で例示したものから選択される上限及び下限によって規定される範囲内であり得る。

【0127】

二本鎖ＤＮＡ試料３７の適用は、生体試料を固形支持体３８’に添加することを含み得る。生体試料は、ＤＮＡを含有し、タグメンテーションのために固体表面３８’上に堆積させることができる任意の種類であり得る。例えば、試料は、精製ＤＮＡなどの様々な精製状態のＤＮＡを含有することができる。しかしながら、試料は、完全に精製される必要はなく、例えば、タンパク質、他の核酸種、他の細胞成分、及び／又は任意の他の夾雑物が混入しているＤＮＡを含有することができる。例えば、生体試料は、ＤＮＡ、タンパク質、他の核酸種、他の細胞成分、及び／又はインビボで見られるものとほぼ同じ割合で存在する任意の他の夾雑物の混合物を含有し得る。成分は、無傷細胞に見られるものと同じ割合であってもよい。いくつかの例では、生体試料は、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７未満、又は０．６０未満の、２６０／２８０比を有する。いくつかの実施形態では、生体試料は、少なくとも２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７未満、又は少なくとも０．６０の、２６０／２８０比を有する。本明細書で提供される方法により、ＤＮＡを固形支持体３８’に結合させることができるため、他の夾雑物は、表面結合タグメンテーションが生じた後に固形支持体を洗浄するだけで除去することができる。生体試料は、例えば、粗細胞溶解物又は全細胞を含み得る。例えば、この例のライブラリ調製方法において固形支持体３８’に適用される粗細胞溶解物は、他の細胞成分から核酸を単離するために従来から使用されている分離工程のうちの１つ以上を行う必要はない。

【0128】

したがって、いくつかの例では、生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、粘液、痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引物、糞便、及びこれらの浸軟組織、若しくはこれらの溶解物、又はＤＮＡを含む任意の他の生体標本を含み得る。

【0129】

図３Ａ及び図３Ｂは、一例によるタグメンテーション反応を示す。図３Ａに示すように、トランスポソーム４４は、Ｔｎ５のダイマーを含み、各モノマー５０は、二本鎖分子、例えば、ＭＥアダプターを結合している。ＭＥアダプターの一方の鎖４８は、固形支持体３８’の表面に共有結合している。トランスポソーム４４は、試料ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ骨格に２つのニックを生成して、断片４６を作り出す。図３Ａに示す例では、ニックは、いずれの鎖でも９塩基離れている。トランスポソーム４４は、ニック間に７、８、９、１０、１１、又は１２ｂｐのギャップを生じさせ得ることを理解すべきである。各ＭＥアダプターの２本の鎖のうちの一方（例えば、鎖４８）は、各ニック位置で各断片４６の５’末端に連結される。この鎖４８は「転移鎖」と呼ばれ、その５’末端を介して固形支持体３８’の表面にグラフトされる。得られたブリッジの特質を明確にするために、図３Ａの表面タグメンテーションの結果として生じるブリッジを図３Ｂに再度示す。

【0130】

転移鎖４８は、第１の配列決定プライマー配列（例えば、リード１配列決定プライマー配列）と、フローセルの配列決定表面１２、１４上の増幅プライマー（例えば、Ｐ５）のうちの１つの少なくとも一部に相補的である第１の配列（Ｐ５’）とを含み得る。したがって、タグメンテーションにより、各ＤＮＡ断片４６に１つのアダプター（又はタグ）が導入される。

【0131】

タグメンテーション後、トランスポザーゼ酵素を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理又は熱若しくはプロテイナーゼＫ消化によって除去することができる。トランスポザーゼ酵素の除去により、固形支持体３８’に付着した断片４６が残る。

【0132】

ＭＥアダプターの非転移鎖４８’は、タグメンテーション中にＤＮＡ断片４６に組み込まれないアダプターであり、むしろ、その後に各断片４６の他方の末端にライゲーションされ得る。タグメンテーション中、非転移鎖４８’は、塩基対合により転移鎖４８に付着され得る。いくつかの例では、非転移鎖４８’は、第２の配列決定プライマー配列（例えば、リード２配列決定プライマー配列）と、フローセルの配列決定表面１２、１４上の別の増幅プライマー（Ｐ７）の少なくとも一部と同一である第２の配列（Ｐ７）とを含む、アダプター（又はタグ）である。増幅中、同一の配列により、フローセルの配列決定表面１２、１４上の増幅プライマー（例えば、Ｐ７）のうちの１つの少なくとも一部に相補的なコピーの形成が可能になる。図３Ｂに示すように、ライゲーションＬは、転移鎖４８が組み込まれている反対側の末端で、非転移鎖４８’を各ＤＮＡ断片４６に組み込むために行われ得る。

【0133】

１つのライブラリ調製技術を詳細に説明してきたが、他のライブラリ調製技術も使用できることを理解すべきである。

【0134】

別のライブラリ調製例では、アダプター（例えば、第１の配列決定プライマー配列と、フローセルの配列決定表面１２、１４上の増幅プライマーのうちの１つの少なくとも一部（例えば、Ｐ５）に相補的な第１の配列（Ｐ５’）とを含む）のうちの１つが、固形支持体３８’の表面に結合され得る。

【0135】

この例では、トランスポソーム複合体もまた、固形支持体３８’に結合され得る。トランスポソーム複合体を固形支持体１６上に載せる前に、部分的なＹアダプターをトランスポザーゼ酵素（例えば、２つのＴｎ５分子を含む）と混合して、トランスポソーム複合体の例を形成してもよい。部分的なＹアダプターは、互いにハイブリダイズする２つのモザイク末端配列を含み得る。モザイク末端配列のうちの一方は、タグメンテーション中に断片化ＤＮＡ鎖４６に付着することができる遊離末端を有し、したがって、図３Ａ及び図３Ｂの転移鎖４８と同様である。モザイク末端配列の他方は、第２の配列決定プライマー配列（例えば、リード２配列決定プライマー配列）と、フローセルの配列決定表面１２、１４上の別の増幅プライマー（Ｐ７）の少なくとも一部と同じ配列を有する第２の配列（Ｐ７）とに付着され得るため、そのコピーは、増幅プライマー（Ｐ７）に相補的である（例えば、Ｐ７’）。この例では、モザイク末端配列の他方、第２の配列決定プライマー配列、及び第２の配列は、タグメンテーション中に断片化ＤＮＡ鎖に付着しないアダプター配列を構成し、したがって、図３Ａ及び図３Ｂの非転移鎖４８’と同様である。

【0136】

トランスポソーム複合体を固形支持体３８’上に載せることは、トランスポソーム複合体を固形支持体３８’と混合すること、及び部分的なＹアダプターのモザイク末端を固形支持体３８’上のアダプター配列の３’末端にライゲーションするための好適な条件に混合物を曝露することを含み得る。

【0137】

この例では、次にタグメンテーションプロセスを行うことができる。タグメンテーション中、ＤＮＡ試料３７が固形支持体３８’に適用され得る。試料がトランスポソーム複合体と接触すると、より長い核酸試料３７がタグ付けされる。この例のタグメンテーション中、試料３６は、断片６４に断片化され、各断片６４は、その５’末端において、部分的なＹアダプターのモザイク末端の遊離末端でタグ付けされる。より長い核酸試料３７の連続的なタグメンテーションにより、トランスポソーム複合体間で複数の架橋分子が得られる。架橋分子は、固形支持体３８’の周囲を包み込む。トランスポザーゼ酵素は除去することができ、更なる伸長及びライゲーションを行って、付着していないアダプター配列の部分的なＹアダプターに試料断片を確実に付着させる。

【0138】

更に別のライブラリ調製例では、ヌクレオチドライブラリは、付着したアダプターを有するチューブ内で生成され、次いでライブラリは、固形支持体３８’上のプライマーにアダプターがハイブリダイズすることにより固形支持体３８’に付着される。更に別のライブラリ調製例では、結合ペアの一方のメンバーを有するアダプター配列は、チューブ内のライブラリ断片に添加され得、次いで配列決定可能なライブラリ断片は、チューブ内の固形支持体３８’に結合される。

【0139】

フローセルの外部で行われるライブラリ調製は、リボ核酸（ＲＮＡ）試料も含むことができる。

【0140】

これらの実施例では、ＲＮＡ試料は、最初に相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）試料に変換される。この変換は、逆転写酵素を利用する逆転写を使用して行われ得る。いくつかの例では、逆転写及び二本鎖合成のためのキットが使用される。これらの例では、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃの大容量ｃＤＮＡ逆転写キットが使用され得る。他の例では、逆転写及び鋳型スイッチ（第２鎖用）用のキットが使用される。これらの例では、Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓの鋳型スイッチングＲＴ酵素混合物が使用され得る。

【0141】

ＲＮＡ試料から二本鎖ＤＮＡを生成したら、本明細書に記載のものを含む任意のＤＮＡライブラリ調製方法を使用して、断片４６にアダプター／タグを付加し、固形支持体３８’に付着した配列決定可能な核酸断片を生成してもよい。

【0142】

フローセル上でのライブラリ調製

【0143】

図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃに示すフローセル１０の例はまた、一体型ライブラリ調製及び分析システム５２に含まれてもよい。このシステム５２と、その中に含まれるフローセル１０’とを図４に概略的に示す。フローセル１０’は、濃縮チャネル１８の上流に１つ以上の調製チャネル５４、５４’を含む。濃縮チャネル１８は、配列決定表面１２又は１４及び濃縮捕捉部位３２、３２’を含むフローセル１０に関して本明細書に開示した任意の例であってもよい。

【0144】

図４に示すように、システム５２は、少なくとも濃縮チャネル１８と選択的に流体連通するフローセル試薬システム５６を含む。フローセル試薬システム５６は、リザーバ５８、６０、６２、流体チャネル（例えば、輸送チャネル６４）、ポンプ、バルブ、及びフローセル１０’の異なるチャネル１８、５４、５４’に出入りする試薬の流れを制御し得る他の流体装置部品を含み得る。

【0145】

調製チャネル５４、５４’は、オンフローセルライブラリ調製に利用される。ＤＮＡを分析する場合、フローセル１０’は、濃縮チャネル１８の上流にあってそれと選択的に流体連通する、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４を含み得る。ＲＮＡを分析する場合、フローセル１０’は、ＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’及びＤＮＡライブラリ調製チャネル５４（互いに流体連通している）の両方を含み得る。この例では、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４は、濃縮チャネル１８の上流にあってそれと選択的に流体連通し、ＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’は、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４の上流にあってそれと選択的に流体連通している。

【0146】

フローセル１０’は、基材１６の任意の例を含んでもよく、そこで、調製チャネル５４、５４’は第１の領域に画定され、濃縮チャネル１８は第２の領域に画定される。基材１６の異なる領域に画定されるため、チャネル５４、５４’、及び／又は１８内の構造及び構成要素は異なっていてもよい。

【0147】

濃縮チャネル１８と同様に、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４は、２つの基材１６の間、又は１つの基材１６と蓋との間に画定され得る。ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４を画定する基材１６の領域は、パターン化されていなくてもよく（基材１６Ｂ、１６Ｂ’と同様）、ライブラリ調製に用いられる固形支持体３８’を一時的に付着する調製捕捉部位（図示せず）を含むように官能化され得る。

【0148】

一例では、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４を画定する基材領域の表面は、ライブラリ調製に用いられる固形支持体３８’上に位置する他方の結合ペアメンバーに結合することができる結合ペアメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、エピトープ、抗体など）でコーティングされている。各結合ペアメンバーは、１つの調製捕捉部位である。別の例では、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４を画定する基材領域の表面は、ビオチン化オリゴヌクレオチド（オリゴ）がハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドでコーティングされている。この例では、ビオチン化オリゴは、ライブラリ調製に用いられる固形支持体３８’を一時的に付着することができる調製捕捉部位である。他の例では、調製捕捉部位は、固形支持体３８’をＤＮＡライブラリ調製チャネル５４の表面に付着させることができる、任意の他の形態の化学結合が可能である。

【0149】

ＤＮＡライブラリ調製は、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４内で行われてもよく、したがって、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４は、増幅プライマー３０、３０’を含まない。

【0150】

リザーバ５８は、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４と選択的に流体連通するものとして示されている。このリザーバ５８は、ライブラリ調製がチャネル５４内で行われ得るように、ＤＮＡ試料３７及びライブラリ調製流体をＤＮＡライブラリ調製チャネル５４に選択的に送達するための異なるチャンバを含み得る。いくつかの例では、ライブラリ調製流体は、ライブラリ調製ビーズ（固形支持体３８’と、図２及び図３Ａを参照して説明したように固形支持体に付着したトランスポソーム４４とを含む）を含み得る。ＤＮＡ試料３７及びライブラリ調製流体がＤＮＡライブラリ調製チャネル５４に導入されると、固形支持体３８’は、調製捕捉部位に結合することができ、ＤＮＡライブラリ調製は、例えば、本明細書に記載のタグメンテーション法を使用して行われ得る。

【0151】

リザーバ５８はまた、使用されるライブラリ調製方法に応じて、異なる流体をＤＮＡライブラリ調製チャネル５４に送達し得ることを理解すべきである。

【0152】

フローセル１０’のいくつかの例は、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４の上流にＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’を含む。

【0153】

濃縮チャネル１８及びＤＮＡライブラリ調製チャネル５４と同様に、ＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’は、２つの基材１６の間、又は１つの基材１６と蓋との間に画定され得る。ＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’を画定する基材１６の領域は、パターン化されていなくてもよい（基材１６Ｂ、１６Ｂ’と同様）。ＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’は、ＲＮＡ試料の初期調製に使用することができ、したがって、ＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’は、増幅プライマー３０、３０’を含まない。

【0154】

ＲＮＡライブラリ調製の初期プロセスは、ＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’内で行われ得る。リザーバ６０は、ＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’と選択的に流体連通するものとして示されている。このリザーバ６０は、ＲＮＡがチャネル５４’内でｃＤＮＡに変換され得るように、ＲＮＡ試料及びライブラリ調製流体をＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’に選択的に送達するための異なるチャンバを含み得る。いくつかの例では、ライブラリ調製流体は、第２の鎖の合成のための逆転写酵素及び試薬を含み得る。他の例では、ライブラリ調製流体は、（第２の鎖の）鋳型スイッチのための逆転写酵素及び試薬を含み得る。

【0155】

次いで、ＲＮＡライブラリ調製チャネル５４’で調製されたｃＤＮＡは、（例えば、輸送チャネルを介して）ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４に送達され得る。ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４内で、ｃＤＮＡは、タグ付けされて、アダプター（タグ）を組み込み、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４内の固形支持体３８に付着した配列決定可能な核酸断片を生成することができる。あるいは、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４内のｃＤＮＡにおいて、任意の他のいずれか好適なＤＮＡライブラリ調製技術を実行してもよい。

【0156】

ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４は、濃縮チャネル１８と選択的に流体連通している。一例では、輸送チャネル６４は、調製チャネル５４と濃縮チャネル１８とを選択的かつ流体的に接続し、その結果、配列決定可能な核酸断片は、捕捉、増幅、及び配列決定のために濃縮チャネル１８に送達され得る。

【0157】

濃縮方法

【0158】

例示的な濃縮方法は、ゲノムデオキシリボ核酸又は相補的デオキシリボ核酸からライブラリ断片を調製することと、ライブラリ断片を濃縮チャネル１８に導入することと、濃縮チャネル１８を所定の温度でインキュベートし、それによって標的領域を含むライブラリ断片の少なくともいくつかが捕捉プローブ４０にハイブリダイズすることと、を含む。

【0159】

本明細書に開示される標的捕捉ビーズ３６は、フローセル１０、１０’内の濃縮捕捉部位３２、３２’に予め付着されていてもよく、又は濃縮及び配列決定ワークフローの一部として（例えば、フローセル１０、１０’の使用者によって）濃縮チャネル１８に導入されてもよい。

【0160】

配列決定ワークフローの一部として導入される場合、標的捕捉ビーズ３６は、濃縮流体（例えば、標的捕捉ビーズ３６を含む塩緩衝液）中で濃縮チャネル１８に含まれてもよい。図４に示す例では、濃縮流体は、濃縮チャネル１８と選択的に流体連通するリザーバ６２内に収容され得る。

【0161】

濃縮流体は、リザーバ６２から濃縮チャネル１８に送達され得る。濃縮捕捉部位３２、３２’は、濃縮チャネル１８内の配列決定表面１２、１２’又は１４、１４’で標的捕捉ビーズ３６のいくつかを固定化する。標的捕捉ビーズ３６の一部は、濃縮捕捉部位３２、３２’に付着しない場合があり、これらの標的捕捉ビーズ３６は、更なる処理の前に濃縮チャネル１８から除去されることを理解すべきである。濃縮チャネル１８から濃縮流体及び任意の固定化されていない標的捕捉ビーズ３６を除去する前に、所定の時間を経過させてもよい。一例では、所定の時間は、所望の数の固定化された標的捕捉ビーズ３６を得るために、約５分間～約３０分間の範囲であり得る。より長いインキュベーション時間も使用され得る。

【0162】

次に、この例の方法は、濃縮チャネル１８から濃縮流体及び捕捉されていない標的捕捉ビーズ３６を洗浄することを含む。洗浄は、洗浄流体を濃縮チャネル１８に導入することを含み得る。流れにより、濃縮捕捉部位３２、３２’に固定化されていない任意の標的捕捉ビーズ３６は、濃縮チャネル１８の出口ポートを通って押し出され得る。標的捕捉ビーズ３６と濃縮捕捉部位３２、３２’との間の固定化メカニズム（例えば、結合ペア、ハイブリダイゼーション、共有結合など）は、任意の固定化された標的捕捉ビーズ３６が出口流の一部になることを防止し得る。

【0163】

オフ又はオンフローセルライブラリ調製技術のいずれを使用するかにかかわらず、配列決定可能な核酸断片は、濃縮チャネル１８に導入される前に、固形支持体３８’から放出され得る。

【0164】

オフフローセルライブラリ調製技術では、配列決定可能な核酸断片の固形支持体３８’からの放出は、任意の好適な技術を使用して、フローセル１０、１０’の外部で開始され得る。一例では、切断剤を導入してもよく、刺激を加えて切断剤をトリガーし、配列決定可能な核酸断片を固形支持体３８’から放出してもよい。他の例では、配列決定可能な核酸断片の放出は、配列決定可能な核酸断片にハイブリダイズしているプライマーの融解温度を超えて固形支持体３８’を加熱することを含み得る。配列決定可能な核酸断片が二本鎖である場合（例えば、図２及び図３Ｂに示すように）、加熱を用いて断片を互いに解離させることができる。放出された配列決定可能な核酸断片は、固形支持体３８’から分離してもよい。

【0165】

オンフローセルライブラリ調製技術では、配列決定可能な核酸断片の固形支持体３８’からの放出は、任意の好適な技術（例えば、切断剤及び刺激、加熱など）を使用して、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４内で開始され得る。固形支持体３８’は、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４内の調製捕捉部位に付着したままであってもよく、したがって、放出された配列決定可能な核酸断片は、ＤＮＡライブラリ調製チャネル５４から濃縮チャネル１８に輸送され得る。

【0166】

濃縮チャネル１８に導入される前に、一本鎖の配列決定可能な核酸断片は、各末端でアダプターに付着したブロッカーを有していてもよい。ブロッカーは、アダプターとプライマーとのハイブリダイゼーションを低減するように選択され得る。したがって、ブロッカーは、配列決定可能な核酸断片がフローセルプライマー３０、３０’にハイブリダイズするのを少なくとも低減し得る。一例では、ブロッカーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＸＧＥＮ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｌｏｃｋｅｒｓである。

【0167】

図５は、濃縮捕捉部位３２に固定化された標的捕捉ビーズ３６を有する濃縮チャネル１８への、末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６、６６’の導入を概略的に示す。一部の末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６’は、標的ライブラリ断片を含むが、他の末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６は、非標的ライブラリ断片（例えば、特定の分析の対象とならないＤＮＡ試料の断片）を含む。捕捉プローブ４０は、標的ライブラリ断片の末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６’に相補的な配列を有するため、末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６’のうちの少なくとも一部は、それぞれ捕捉プローブ４０にハイブリダイズする。対照的に、他の末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６は、それらの非標的ライブラリ断片の配列が捕捉プローブ４０に相補的でないため、捕捉プローブ４０にハイブリダイズしないであろう。更に、ブロッカーは、末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６、６６’がフローセルプライマー３０にハイブリダイズするのを防止し得る。

【0168】

末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６、６６’は、濃縮チャネル１８内で、標的ライブラリ断片と捕捉プローブ４０との間にハイブリダイゼーションが生じるような時間及び温度でインキュベートされ得る。インキュベーション時間は、約５分間～約２時間の範囲であり得る。一例では、インキュベーション時間は約１．５時間である。インキュベーション温度は、約５０℃～約５５℃の範囲であり得る。一例では、インキュベーション温度は約５０℃である。

【0169】

いくつかの例では、配列決定可能な核酸断片６６、６６’と共に、クラウディング試薬が導入され得る。例示的なクラウディング試薬としては、硫酸デキストラン及びポリエチレングリコールが挙げられる。これらのクラウディング試薬は、配列決定可能な核酸断片６６、６６’を標的捕捉ビーズ３６に密集させるのに役立ち得る。

【0170】

他の例では、配列決定可能な核酸断片６６、６６’のインキュベーション中に、濃縮チャネル１８に電場を印加してもよい。電場は、フローセル１０、１０’に組み込まれた電極を使用して、又は外部電極を使用して印加され得る。電場は、配列決定可能な核酸断片６６、６６’を標的捕捉ビーズ３６に移動させるのに役立ち得る。

【0171】

更に他の例では、方法は、インキュベーション中に、配列決定可能な核酸断片６６、６６’を含有する流体の移動を誘導することを含み得る。一例では、濃縮チャネル１８は、流体の移動を容易にすることができるブラシ、ピラー、又は他の表面上の三次元構造を含み得る。

【0172】

更に別の例では、電気泳動を使用して、配列決定可能な核酸断片６６、６６’を濃縮チャネル１８内で前濃縮してもよい。一例では、等速電気泳動（ＩＴＰ）を使用して、ハイブリダイゼーションを加速させてもよい。ＩＴＰは、配列決定可能な核酸断片６６、６６’を狭帯域幅、例えば、ＩＴＰの濃度よりも１０００倍高い濃度に濃縮するために使用され得る。これは、ハイブリダイゼーション動態を著しく促進し、したがってハイブリダイゼーション時間を（例えば、約１．５時間から約１５分に）著しく促進するであろう。

【0173】

配列決定可能な核酸断片６６’のハイブリダイゼーション効率を高めるために、他の既知の方法（例えば、緩衝液条件の調整、高い表面負電荷状態など）も使用することができる。

【0174】

次に、方法の任意の例は、末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６を濃縮チャネル１８から洗浄することを含み得る。洗浄は、洗浄流体を濃縮チャネル１８に導入することを含み得る。流れにより、捕捉プローブ４０にハイブリダイズしていない任意の断片６６又は６６及び６６’は、濃縮チャネル１８の出口ポートを通って押し出され得る。末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６’と標的捕捉ビーズ３６の捕捉プローブ４０との間の固定化メカニズム（例えば、ハイブリダイゼーション）は、固定化されている末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６’が出口流の一部になることを防止し得る。

【0175】

本明細書に開示される濃縮方法全体を通して、非標的ライブラリ断片を含む断片６６の結合を最小限に抑えるために、ｉ）捕捉プローブ４０と標的ライブラリ断片とのハイブリダイゼーション効率、及びｉｉ）洗浄プロセスを高めるように、流量及び／又は温度をプログラムし得ることを理解すべきである。

【0176】

ライブラリ断片の放出及び配列決定

【0177】

固定化されている末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６’は、次に、捕捉プローブ４０から変性され得る。変性は、播種試薬（例えば、塩緩衝液）中で、好適な変性温度で達成され得る。変性温度は、利用される播種試薬に応じて、約７０℃～約９２℃の範囲であり得る。一例では、変性温度は約９２℃である。変性温度は、ブロッカーの除去に必要な温度より高くてもよい。したがって、変性により、ブロッカーを除去することができ、追加の除去プロセスは使用されないであろう。更に、末端ブロックされた配列決定可能な核酸断片６６’は、濃縮チャネル１８内で放出されるため、放出された断片６６’の損失は最小限である。したがって、後濃縮ＰＣＲは使用されない。

【0178】

次いで、溶出した断片６６’（そのそれぞれが標的ライブラリ断片を含む）は、配列決定表面１２、１２’又は１４、１４’にわたって播種される。播種は、断片６６’のアダプター／タグの配列とプライマー３０、３０’の相補的配列との間のハイブリダイゼーションにより達成される。播種は、断片６６’及びプライマー３０、３０’に適したハイブリダイゼーション温度で実行され得る。

【0179】

配列決定可能な核酸断片６６’がフローセル１０内で播種する場所は、プライマー３０、３０’がどのように付着しているかに部分的に依存する。パターン化されていない配列決定表面１２、１２’を有するフローセル１０の例では、放出された配列決定可能な核酸断片６６’は、凹状領域２６、２６’内の高分子ヒドロゲル２８、２８’にわたって播種するであろう。パターン化された配列決定表面１４、１４’を有するフローセル１０の例では、放出された配列決定可能な核酸断片６６’は、各くぼみ４２、４２’内の高分子ヒドロゲル２８、２８’にわたって播種するであろう。

【0180】

次いで、標的捕捉ビーズ３６の固形支持体３８を、濃縮チャネル１８から除去することができる。固形支持体３８の除去は、標的捕捉ビーズ３６を濃縮捕捉部位３２、３２’に付着するために使用されたメカニズムに応じた任意の適切な技術を含み得る。例として、変性、結合開裂などが使用され得る。

【0181】

次いで、播種された配列決定可能な核酸断片６６’は、クラスター生成を使用して増幅され得る。

【0182】

クラスター生成の一例では、配列決定可能な核酸断片６６’は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用する３’伸長によって、ハイブリダイズしたプライマー３０、３０’からコピーされる。元の配列決定可能な核酸断片６６’は変性され、配列決定表面１２、１２’又は１４、１４’に固定化されたコピーが残る。コピーは、標的ライブラリ断片の配列を含む。固定化されたコピーを増幅するために、等温ブリッジ増幅又は他の何らかの形態の増幅が使用され得る。例えば、コピーされた鋳型はループオーバーして隣接する相補的なプライマー３０、３０’にハイブリダイズし、ポリメラーゼはコピーされた鋳型をコピーして二本鎖ブリッジ構造を形成し、当該構造は変性して２本の一本鎖を形成する。これらの２本の鎖は、ループオーバーして隣接する相補的なプライマー３０、３０’にハイブリダイズし、再度伸長して、２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性及び増幅のサイクルによって各鋳型コピーに対して繰り返して、密集したクローンクラスターを作り出す。二本鎖ブリッジ構造の各クラスターが変性される。一例では、逆方向鎖は、特異的な塩基切断によって除去され、順方向鋳型ポリヌクレオチド鎖（標的ライブラリ断片の配列を有する）が残る。クラスター化により、配列決定表面１２、１２’又は１４、１４’に沿っていくつかの鋳型ポリヌクレオチド鎖が形成される。このクラスター化の例は、等温ブリッジ増幅であり、実行できる増幅の一例である。排除増幅（Ｅｘａｍｐ）ワークフロー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）などの他の増幅技術が使用され得ることを理解すべきである。

【0183】

鋳型ポリヌクレオチド鎖上の相補的な配列にハイブリダイズする配列決定プライマーを導入してもよい。この配列決定プライマーは、鋳型ポリヌクレオチド鎖を配列決定可能な状態にする。鋳型及び任意のフローセル結合プライマー３０、３０’の３’末端（コピーに付着されていない）は、配列決定反応への干渉を防止するために、特に、望ましくないプライミングを防止するために、ブロックされ得る。

【0184】

配列決定を開始するために、組み込み（incorporation）混合物が濃縮チャネル１８に加えられ得る。一例では、組み込み混合物は、液体キャリア、ポリメラーゼ、及び蛍光標識したヌクレオチドを含む。蛍光標識したヌクレオチドは、３’ＯＨブロッキング基を含み得る。組み込み混合物が濃縮チャネル１８に導入されると、流体はチャネル１８に入り、いくつかの例では、くぼみ４２、４２’（鋳型ポリヌクレオチド鎖が存在する）に入る。

【0185】

蛍光標識したヌクレオチドが鋳型に依存する方法で配列決定プライマーに追加され（それにより、配列決定プライマーを伸長し）、配列決定プライマーに追加されたヌクレオチドの順序及びタイプの検出が、鋳型の配列決定に使用され得る。より具体的には、ヌクレオチドの１つは、それぞれのポリメラーゼにより、配列決定プライマーを伸長し鋳型ポリヌクレオチド鎖に相補的である新生鎖に組み込まれる。言い換えれば、濃縮チャネル１８にわたる鋳型ポリヌクレオチド鎖の少なくともいくつかにおいて、それぞれのポリメラーゼは、組み込み混合物中のヌクレオチドの１つによってハイブリダイズした配列決定プライマーを伸長する。

【0186】

ヌクレオチドの組み込みは、画像化イベントを通じて検出され得る。画像化イベント中に、照明システム（図示せず）が、それぞれの配列決定表面１２、１２’又は１４、１４’に励起光を提供し得る。

【0187】

いくつかの例では、ヌクレオチドは、ヌクレオチドが配列決定プライマーに加えられると、更なるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性（例えば、３’ＯＨブロッキング基）を更に含み得る。例えば、可逆的末端部分を有するヌクレオチド類似体が配列決定プライマーに加えられ、その結果、デブロッキング剤が送達されて当該部分を除去するまで、その後の伸長は起こり得ない。したがって、可逆的終端を使用する例の場合、検出が行われた後、デブロッキング試薬が濃縮チャネル１８に送達され得る。

【0188】

洗浄（複数可）は、様々な流体送達ステップの間で行ってもよい。次に、ＳＢＳサイクルをｎ回繰り返し、配列決定プライマーをｎヌクレオチドによって伸長し、それによって長さｎの配列を検出することができる。

【0189】

いくつかの例では、順方向鎖が、配列決定され、除去され、次に、逆方向鎖が、本明細書に記載されるように構築され、配列決定されてもよい。

【0190】

ＳＢＳについて詳細に説明してきたが、本明細書に記載されるフローセル１０、１０’は、他の配列決定プロトコルを用いて、遺伝子型決定のために、又は他の化学的及び／若しくは生物学的用途において利用され得ることを理解すべきである。

【0191】

キット

【0192】

本明細書に開示されるいくつかの例は、キットである。キットを使用して、本明細書に開示されるオンフローセル標的濃縮を行うことができる。

【0193】

キットの一例は、ライブラリ調製ビーズを含むライブラリ調製流体であって、各ライブラリ調製ビーズが、第１の固形支持体３８’と、第１の固形支持体３８’に付着したトランスポソーム４４とを含む、ライブラリ調製流体と；ゲノムデオキシリボ核酸配列を含む試料流体と；標的捕捉ビーズ３６を含む濃縮流体であって、各標的捕捉ビーズ３６が、第２の固形支持体３８と、第２の固形支持体３８に付着した捕捉プローブ４０とを含み、捕捉プローブ４０のそれぞれが、試料流体中のゲノムデオキシリボ核酸の標的領域に相補的な一本鎖デオキシリボ核酸配列を含む、濃縮流体と、を含む。

【0194】

この例示的なキットでは、第１の固形支持体３８’及び第２の固形支持体３８は、磁気応答性材料、ガラス、ポリマー、及び金属からなる群から個別に選択される。

【0195】

この例示的なキットでは、捕捉プローブ４０は、結合ペアを介して第２の固形支持体３８に付着され得る。本明細書に開示される任意の結合ペアを使用することができる。

【0196】

このキットのいくつかの例は、ブロッキング流体も含み、これは、デオキシリボ核酸配列をブロックすることを含む。ブロッキング流体は、配列決定可能な核酸断片６６、６６’がフローセル１０、１０’の濃縮チャネル１８に導入される前に、それらをブロックするために使用され得る。

【0197】

キットの別の例は、ＲＮＡ－ｃＤＮＡ変換サブキットと；標的捕捉ビーズ３６を含む濃縮流体であって、各標的捕捉ビーズ３６が、固形支持体３８と、固形支持体３８に付着した捕捉プローブ４０とを含み、捕捉プローブ４０のそれぞれが、ＲＮＡ－ｃＤＮＡ変換サブキットを使用して生成されたｃＤＮＡの標的領域に相補的な一本鎖デオキシリボ核酸配列を含む、濃縮流体と、を含む。

【0198】

この例示的なキットはまた、ライブラリ調製ビーズを含むライブラリ調製流体であって、各ライブラリ調製ビーズが、第１の固形支持体３８’と、第１の固形支持体３８’に付着したトランスポソーム４４とを含む、ライブラリ調製流体を含み得る。

【0199】

この例示的なキットでは、捕捉プローブ４０は、結合ペアを介して固形支持体３８に付着され得る。本明細書に開示される任意の結合ペアを使用することができる。

【0200】

本開示を更に説明するために、本明細書に例を示す。これらの例は、例示の目的で提供され、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解すべきである。
非限定的な作業例

【0201】

実施例１

【0202】

この実施例では、比較濃縮方法及び例示的濃縮を行った。

【0203】

ＰｈｉＸゲノムの標的領域を選択し、標的領域に相補的な配列を有する一本鎖捕捉プローブを調製した。標的領域はゲノム座標３１９４を含み、捕捉プローブのサイズは６９ヌクレオチドであった。捕捉プローブを一方の末端でビオチン化した。

【0204】

ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）ＰｈｉＸライブラリ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．から入手）を調製し、ブロッカー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）をライブラリに添加した。ブロックされたライブラリの最終濃度は、約２ｐＭであった。このライブラリを２つのチューブに分けた。

【0205】

比較濃縮方法では、ビオチン化捕捉プローブ（０．０２μＭ／１．５μＬ／合計１．８Ｅ＋１０プローブ）を、一方のチューブ内でライブラリ断片と共に約１．５時間インキュベートして、標的領域を含むライブラリ断片とビオチン化捕捉プローブとの間でハイブリダイズさせた。次に、チューブ内容物をストレプトアビジンビーズ（Ｍ２８０、６Ｅ＋０６ビーズ）に曝露し、ハイブリダイズしたプローブ／断片が、捕捉プローブのビオチン標識を介してビーズに結合した。次いで、（捕捉されたライブラリ断片を有する）ビーズを、磁力を使用して非捕捉ライブラリ断片から分離した。次いで、（捕捉されたハイブリダイズしたプローブ／断片を有する）ビーズを、アルキンＰＥＧ－ビオチン及びＰ５／Ｐ７プライマーで官能化された非パターン化フローセルに投入した。（捕捉されたハイブリダイズしたプローブ／断片を有する）ビーズは、ビーズ上の遊離ストレプトアビジン部位を介してアルキンＰＥＧ－ビオチン部位に固定化された。ライブラリ断片を、ドデシル硫酸ナトリウムを含む生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液中で、約９２℃で約２分間ビーズから溶出させ、次いで、約５分間播種するために温度を約４０℃に降下させた。

【0206】

例示的濃縮方法では、ビオチン化捕捉プローブ（０．０２μＭ／１．５μＬ／合計１．８Ｅ＋１０プローブ）を、ストレプトアビジンビーズ（Ｍ２８０、６Ｅ＋０６ビーズ）と共に約１時間インキュベートした。ビオチン化捕捉プローブは、ビオチン標識を介してビーズに結合した。次いで、（捕捉されたビオチン化捕捉プローブを有する）ビーズを、アルキンＰＥＧ－ビオチン及びＰ５／Ｐ７プライマーで官能化された非パターン化フローセルに投入した。（捕捉されたビオチン化捕捉プローブを有する）ビーズは、ビーズ上の遊離ストレプトアビジン部位を介してアルキンＰＥＧ－ビオチン部位に固定化された。他方のチューブ内のライブラリ断片をフローセルに投入し、約１．５時間インキュベートして、標的領域を含むライブラリ断片とビーズ表面上のビオチン化捕捉プローブとの間でハイブリダイズさせた。洗浄プロセスを行って、結合していないライブラリ断片を除去した。結合したライブラリ断片を、ドデシル硫酸ナトリウムを含む生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液中で、約９２℃で約２分間ビーズから溶出させ、次いで、約５分間播種するために温度を約４０℃に降下させた。

【0207】

比較方法及び例示的方法の両方において、フローセルを洗浄してビーズを除去した。

【0208】

比較方法及び例示的方法の両方において、等温増幅を使用してクラスター化を行い、次いで配列決定を行った。比較方法及び例示的方法の両方とも、ＰｈｉＸゲノムの標的領域から非常に多くのリードが得られた（ライブラリのサイズによって定義されるように、＋／－５００ｂｐウィンドウ内で９５％リード）。

【0209】

図６は、比較濃縮方法を使用した場合のフローセル表面、及び例示的濃縮方法を使用した場合のフローセル表面における、クラスター化した標的ライブラリ断片の相対的被覆率のプロットを示す。相対的被覆率のプロットは、ゲノム座標に対する遺伝子座での相対的リード深さ（％、Ｙ軸）である。相対的被覆率のプロットは、比較方法及び例示的方法の両方において、捕捉プローブが標的領域を含むライブラリ断片を効果的にハイブリダイズすることを示す。例示的方法は、（比較方法と比べて）ワークフローを簡素化し、標的濃縮も達成する。

【0210】

実施例２

【0211】

この例では、標的領域は、ＴＲＵＳＩＧＨＴ（商標）Ｔｕｍｏｒ １７０パネル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）から得た。標的領域に相補的な配列を有する一本鎖捕捉プローブを調製した。捕捉プローブを一方の末端でビオチン化した。

【0212】

ビオチン化捕捉プローブを、ストレプトアビジンビーズ（Ｍ２８０）と共に約１時間インキュベートして、ビーズ１個あたり約３．１３Ｅ＋０５の捕捉プローブのプローブ密度を達成した。ビオチン化捕捉プローブは、ビオチン標識を介してビーズに結合した。次いで、（捕捉されたビオチン化捕捉プローブを有する）ビーズを、アルキンＰＥＧ－ビオチン及びＰ５／Ｐ７プライマーで官能化された非パターン化フローセルに投入した。（捕捉されたビオチン化捕捉プローブを有する）ビーズは、ビーズ上の遊離ストレプトアビジン部位を介してアルキンＰＥＧ－ビオチン部位に固定化された。

【0213】

ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）Ｆｌｅｘライブラリ調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）を使用して、Ｈｕｍａｎ－ＮＡ １２８７８試料（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を用いてライブラリを調製し、ブロッカー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）をライブラリに添加した。ライブラリ断片をフローセルに投入し、約５０℃で約２時間インキュベートして、標的領域を含むライブラリ断片と固定化ビーズの表面上のビオチン化捕捉プローブとの間でハイブリダイズさせた。

【0214】

洗浄プロセスを行って、結合していないライブラリ断片を除去した。結合したライブラリ断片を、ドデシル硫酸ナトリウムを含む生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液中で、約９２℃で約２分間ビーズから溶出させ、次いで、約５分間播種するために温度を約４０℃に降下させた。

【0215】

フローセルを洗浄してビーズを除去し、等温増幅を使用してクラスター化を行った。次いで、配列決定を行い、配列決定リードを得た。標的クラスター数は、リード数を２で割ることによって決定した。濃縮係数は、標的領域に整列した合計リードの割合を決定することによって決定した。これらの結果を、表１において１回のライブラリ送達の試料で示す。

【0216】

この方法を繰り返したが、ただし、ライブラリ断片は、ロータリーバルブを使用して２回往復してフローセルに投入し、各往復において約５０℃で約２時間インキュベートして、標的領域を含むライブラリ断片と固定化ビーズの表面上のビオチン化捕捉プローブとの間でハイブリダイズさせた。各往復の送達とハイブリダイゼーションとの間に、約５０℃で洗浄を行った。

【0217】

ライブラリ断片を、ドデシル硫酸ナトリウムを含む生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液中で、９２℃で約２分間ビーズから溶出させ、次いで、約５分間播種するために温度を約４０℃に降下させた。

【0218】

フローセルを洗浄してビーズを除去し、等温増幅を使用してクラスター化を行った。次いで、配列決定を行い、配列決定リードを得た。標的クラスター数及び濃縮係数を決定した。これらの結果を、表１において複数回のライブラリ送達の試料で示す。

【表1】

【0219】

表１に示すように、両方の方法で標的領域から望ましいクラスター数が得られたが、複数回の送達方法は濃縮因子を増加させた。

【0220】

実施例３

【0221】

この例では、標的領域は、ＴＲＵＳＩＧＨＴ（商標）Ｔｕｍｏｒ １７０パネル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）から得た。標的領域に相補的な配列を有する一本鎖捕捉プローブを調製した。捕捉プローブを一方の末端でビオチン化した。

【0222】

ビオチン化捕捉プローブを、ストレプトアビジンビーズ（Ｍ２８０）と共に約１時間それぞれインキュベートし、３つの異なる試料で異なるプローブ密度を達成した－試料１＝ビーズ１個あたり約５．７８Ｅ＋０４の捕捉プローブ、試料２＝ビーズ１個あたり約２．９８Ｅ＋０５の捕捉プローブ、及び試料３＝ビーズ１個あたり約１．１６Ｅ＋０６の捕捉プローブ。各試料について、ビオチン化捕捉プローブは、ビオチン標識を介してビーズに結合した。次いで、（捕捉されたビオチン化捕捉プローブを有する）ビーズ試料を、アルキンＰＥＧ－ビオチン及びＰ５／Ｐ７プライマーで官能化された３つの異なる非パターン化フローセルにそれぞれ投入した。各試料について、（捕捉されたビオチン化捕捉プローブを有する）ビーズは、ビーズ上の遊離ストレプトアビジン部位を介してアルキンＰＥＧ－ビオチン部位に固定化された。

【0223】

ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）Ｆｌｅｘライブラリ調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）を使用して、Ｈｕｍａｎ－ＮＡ １２８７８試料（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を用いてライブラリを調製し、ブロッカー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）をライブラリに添加した。ライブラリ断片を異なるフローセルに投入し、約５０℃で約２時間インキュベートして、標的領域を含むライブラリ断片と固定化ビーズの表面上のビオチン化捕捉プローブとの間でハイブリダイズさせた。

【0224】

洗浄プロセスを行って、結合していないライブラリ断片を除去した。結合したライブラリ断片を、ドデシル硫酸ナトリウムを含む生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液中で、約９２℃で約２分間ビーズから溶出させ、次いで、約５分間播種するために温度を約４０℃に降下させた。

【0225】

フローセルを洗浄してビーズを除去し、等温増幅を使用してクラスター化を行った。次いで、配列決定を行い、配列決定リードを得た。標的クラスター数は、リード数を２で割ることによって決定した。

【0226】

各試料のクラスター数を図７に示す。図示したように、ビーズ上のプローブ密度が増加すると、標的領域を有するライブラリ断片がより多く濃縮された。

【0227】

追記事項

【0228】

更に、本明細書で提供される範囲は、明示的に列挙されているかのように、表示範囲及び表示範囲内の任意の値又は部分範囲を含むことを理解すべきである。例えば、約２ｍｍ～約３００ｍｍによって表される範囲は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの明示的に記載された限界だけでなく、約１５ｍｍ、２２．５ｍｍ、２４５ｍｍなどの個々の値、及び約２０ｍｍ～約２２５ｍｍなどの部分範囲も含むと解釈するべきである。

【0229】

以下により詳細に考察される、前述の概念及び更なる概念の全ての組み合わせが、（かかる概念が相互に矛盾しなければ）本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図されることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解すべきである。

【0230】

いくつかの実施例を詳細に説明してきたが、開示された例は修正され得ることを理解すべきである。したがって、これまでの説明は非限定的なものであると考えるべきである。

【符号の説明】

【0231】

１０ フローセル
１２、１２’、１４、１４’ フローセルの配列決定表面
１６、１６Ａ、１６Ａ’、１６Ｂ、１６Ｂ’ 基材
１８ 濃縮チャネル
２０、２０’ 支持体
２２、２２’ 樹脂
２４ 材料
２６、２６’ 凹状領域
２８、２８’ 高分子ヒドロゲル
３０、３０’ プライマー
３２、３２’ 濃縮捕捉部位
３４、３４’ 隙間領域
３６ 標的捕捉ビーズ
３７ 二本鎖ＤＮＡ試料
３８ 固形支持体
４０ 捕捉プローブ
４４ トランスポソーム複合体
４６ 架橋断片
４８ 転移鎖
４８’ 非転移鎖
５０ モノマー
５２ ライブラリ調製及び分析システム
５４、５４’ 調製チャネル
５６ フローセル試薬システム
５８、６０、６２ リザーバ
６４ 輸送チャネル
６６、６６’ 核酸断片

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】