特表 2023-511480 組換え細胞外基質タンパク質生産のための動物細胞の培養用培地組成物、及びそれを利用した方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-20

(54)【発明の名称】組換え細胞外基質タンパク質生産のための動物細胞の培養用培地組成物、及びそれを利用した方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20230313BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20230313BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230313BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20230313BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20230313BHJP

   C07K 1/16 20060101ALI20230313BHJP

   C07K 1/18 20060101ALI20230313BHJP

   C07K 1/20 20060101ALI20230313BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230313BHJP

【ＦＩ】

C12N1/00 F

C12P21/00 A

C12N5/10

C07K1/14

C07K14/78

C07K1/16

C07K1/18

C07K1/20

C12N15/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022527798

(86)(22)【出願日】2021-12-29

(85)【翻訳文提出日】2022-05-12

(86)【国際出願番号】 KR2021020184

(87)【国際公開番号】W WO2022146036

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】10-2020-0188062

(32)【優先日】2020-12-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519321708

【氏名又は名称】ハプルサイエンス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】テ・キョン・キム

(72)【発明者】

【氏名】ヨ・キュン・チュン

(72)【発明者】

【氏名】スン・ミ・ファン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC15

4B064CC24

4B064CE10

4B064CE11

4B065AA90X

4B065AA91

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD16

4B065CA24

4H045AA20

4H045BA09

4H045CA40

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA21

4H045GA22

4H045GA23

4H045GA25

(57)【要約】

組換え細胞外基質タンパク質生産のための動物細胞の培養用培地組成物、高純度の組換え細胞外基質タンパク質を生産する方法、及び組換え細胞外基質タンパク質の単量体を検定する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

銅化合物を含む、組換え細胞外基質タンパク質生産のための、動物細胞の培養用培地組成物。

【請求項2】

前記銅化合物は、酸化銅（Ｃｕ_２Ｏ）、塩化銅（ＣｕＣｌ_２）、硝酸銅（Ｃｕ（ＮＯ_３）_２）、酸化銅II（ＣｕＯ）、硫化銅（ＣｕＳ）または硫酸銅（ＣｕＳＯ_４）である、請求項１に記載の培地組成物。

【請求項3】

前記銅化合物を２０μＭ超過の濃度で含む、請求項１に記載の培地組成物。

【請求項4】

前記組換え細胞外基質タンパク質は、単量体である、請求項１に記載の培地組成物。

【請求項5】

前記組換え細胞外基質タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テナシンまたはＨＡＰＬＮ（hyaluronan and proteoglycan link protein）である、請求項１に記載の培地組成物。

【請求項6】

前記ＨＡＰＬＮタンパク質は、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３及びＨＡＰＬＮ４からなる群のうちから選択されたいずれか１つのタンパク質である、請求項５に記載の培地組成物。

【請求項7】

前記組換え細胞外基質タンパク質は、人体に由来するタンパク質である、請求項１に記載の培地組成物。

【請求項8】

前記動物細胞は、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞変異体である、請求項１に記載の培地組成物。

【請求項9】

（１）請求項１ないし８のうちいずれか１項に記載の培地組成物で、組換え細胞外基質タンパク質を生産する動物細胞を培養し、培養液を得る段階と、
（２）前記培養液から組換え細胞外基質タンパク質を単離、および精製する段階と、を含む、高純度の組換え細胞外基質タンパク質を生産する方法。

【請求項10】

前記段階（１）の培養は、流加培養、連続式培養または回分式培養である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記段階（１）において、細胞培養前、培地組成物に銅化合物を添加する、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記組換え細胞外基質タンパク質は、単量体である、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

前記組換え細胞外基質タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テナシンまたはＨＡＰＬＮ（hyaluronan and proteoglycan link protein）である、請求項９に記載の方法。

【請求項14】

前記ＨＡＰＬＮタンパク質は、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３及びＨＡＰＬＮ４からなる群のうちから選択されたいずれか１つのタンパク質である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記組換え細胞外基質タンパク質は、人体に由来するタンパク質である、請求項９に記載の方法。

【請求項16】

前記動物細胞は、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞変異体である、請求項９に記載の方法。

【請求項17】

前記段階（２）は、クロマトグラフィを遂行する段階を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項18】

前記クロマトグラフィは、親和性クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、水酸化リン灰石クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ及び疎水性相互作用クロマトグラフィからなる群のうちから選択されたいずれか１以上である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記クロマトグラフィを遂行する段階は、
陰イオン交換クロマトグラフィを遂行する段階と、
陽イオン交換クロマトグラフィを遂行する段階と、
混合モードクロマトグラフィを遂行する段階と、および
疎水性相互作用クロマトグラフィを遂行する段階と、を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

陰イオン交換クロマトグラフィの溶出バッファは、６０ないし２００ｍＭのヒスチジン塩酸塩（Ｈｉｓ－ＨＣｌ）を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

陽イオン交換クロマトグラフィの溶出バッファは、２００ないし６００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

混合モードクロマトグラフィの溶出バッファは、２００ないし８００ｍＭのアルギニンを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

疎水性相互作用クロマトグラフィの溶出バッファは、０．１Ｍないし１．５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

前記段階（２）で単離及び精製された組換え細胞外基質タンパク質は、純度９０％以上である、請求項９に記載の方法。

【請求項25】

組換え細胞外基質タンパク質を含む試料に対し、塩酸塩を含む移動相を使用し、サイズ排除クロマトグラフィを遂行する段階と、
前記サイズ排除クロマトグラフィ結果を基に、試料中の組換え細胞外基質タンパク質の単量体を分析する段階と、を含む、組換え細胞外基質タンパク質の単量体を検定する方法。

【請求項26】

組換え細胞外基質タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テナシンまたはＨＡＰＬＮ（hyaluronan and proteoglycan link protein）である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記組換えＨＡＰＬＮタンパク質は、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３及びＨＡＰＬＮ４からなる群のうちから選択されたいずれか１つのタンパク質である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記塩酸塩は、アルギニン塩酸塩、アニリン塩酸塩、アデニン塩酸塩、グアニン塩酸塩、グアニディン塩酸塩、ヒスチジン塩酸塩またはリシン塩酸塩である、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記移動相は、塩酸塩を０．５Ｍ超過の濃度で含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項30】

前記分析する段階において、組換え細胞外基質タンパク質の単量体とその他の不純物との比率を分析する、請求項２５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組換え細胞外基質タンパク質生産のための動物細胞の培養用培地組成物、高純度の組換え細胞外基質タンパク質を生産する方法、及び該組換え細胞外基質タンパク質の単量体を検定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞外基質（ＥＣＭ：extracellular matrix）とは、細胞が細胞外に分泌したさまざまな物質が形成する生体内非細胞構成要素であり、生物の全ての組織内と器官内とに存在する。該細胞外基質は、細胞間接着及び物理的支持体の役割だけではなく、細胞の分化及び成長や、細胞間の信号伝逹及び調節のような多様な生物学的機能を遂行し、多細胞生物の各組織及び各器官は、その特性に合うように、独立して進化したために、細胞外基質の構成成分及び機能も、組織と細胞との類型によって多様な様相を示す。

【0003】

基本的には、細胞外基質は、水分、タンパク質及び多糖類からなっており、そのうち、細胞外基質タンパク質は、当該組織の機能に合うように、生体力学的な特性及び組成などが調整され、分子支持体内に自己集合される（self-assembled）が、大多数の細胞外基質タンパク質は、組織内において微量に発現され、モジュール（module）形態に、多重結合をなして機能する。そのような構造的特徴により、該細胞外基質タンパク質の組み換えを介する量産及び機能研究には、多くの技術的課題が随所に散在している。一般的には、動物組織から抽出したタンパク質を利用するが、抽出量が微量である。従って、所望する細胞外基質タンパク質のアミノ酸配列でもって量産するためには、さらに適切であって費用効率的な生産体系を備える必要性が提起されている。

【0004】

なお、細胞外基質タンパク質において、ＨＡＰＬＮ（hyaluronan and proteoglycan link protein）タンパク質は、細胞外基質内のヒアルロン酸とプロテオグリカンとの凝集体を安定化させる役割を行い、細胞間接着に関与すると報告されている。生体内には、発現される組織または器官により、総４種のＨＡＰＬＮタンパク質が存在するが、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４がそれらであり、それぞれの組織内または器官内における機能及び役割は、大同小異であると知られている。

【0005】

大韓民国登録特許公報第１０－１８９７３４０号は、ＨＡＰＬＮ１タンパク質を有効成分として含む皮膚弾力用またはしわ改善用の薬学組成物を開示しており、大韓民国公開特許公報第１０－２０１９－００２４７２７号及び同第１０－２０２０－０１０４８３１号は、ＨＡＰＬＮ１タンパク質を有効成分として含む軟骨再生用組成物及び軟骨関連疾患治療用組成物を開示しており、最近の大韓民国登録特許公報第１０－２１６６４５３号は、ＨＡＰＬＮ１タンパク質を有効成分として含む肺疾患治療用組成物を開示するというように、ＨＡＰＬＮタンパク質は、人々に有用な機能を提供することが期待される。従って、組換えＨＡＰＬＮタンパク質を量産するための培養、単離、精製、単量体検定方法に係わる研究が必要であるが、そのような組換えＨＡＰＬＮタンパク質を量産する方法については、今のところ研究されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】大韓民国登録特許公報第１０－１８９７３４０号

【特許文献2】大韓民国公開特許公報第１０－２０１９－００２４７２７号

【特許文献3】大韓民国公開特許公報第１０－２０２０－０１０４８３１号

【特許文献4】大韓民国登録特許公報第１０－２１６６４５３号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明が解決しようとする課題は、組換え細胞外基質タンパク質生産のための動物細胞の培養用培地組成物を提供することである。

【0008】

本発明が解決しようとする課題は、また、高純度の組換え細胞外基質タンパク質を生産する方法を提供することである。

【0009】

本発明が解決しようとする課題は、また、組換え細胞外基質タンパク質の単量体を検定する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

一態様は、銅化合物を含む、組換え細胞外基質タンパク質生産のための動物細胞の培養用培地組成物を提供する。

【0011】

用語「細胞外基質（ＥＣＭ：extracellular matrix）タンパク質」とは、細胞外基質に存在するタンパク質を意味する。ＥＣＭタンパク質の例示的な種類は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テナシン、ＨＡＰＬＮ（hyaluronan and proteoglycan link protein）などがあるが、それらに制限されるものではない。

【0012】

用語「ＨＡＰＬＮ（hyaluronan and proteoglycan link protein）」とは、ヒアルロン酸とプロテオグリカンとの連結タンパク質とも言う。生体内で主に発現される組織及び器官により、総４種のＨＡＰＬＮタンパク質が存在し、その種類は、具体的には、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４である。ＨＡＰＬＮタンパク質のアミノ酸配列は、ＨＡＰＬＮ１は、例えば、ヒトＨＡＰＬＮ１アクセッション番号ＮＰ＿００１８７５またはマウスＨＡＰＬＮ１アクセッション番号ＮＰ＿０３８５２８などに記載されているが、それらに制限されるものではない。

【0013】

用語「組換えＥＣＭタンパク質（recombinant ＥＣＭ protein）」とは、遺伝子組換え方法を利用して作ったＥＣＭタンパク質をコーディングするＤＮＡを、細胞内で発現させて得られたタンパク質を意味する。前記遺伝子組換えは、該技術分野の一般的な方法によっても行われる。

【0014】

一具体例において、前記組換え細胞外基質タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テナシンまたはＨＡＰＬＮでもあるが、それらに制限されるものではない。

【0015】

用語「組換えＨＡＰＬＮタンパク質（ｒＨＡＰＬＮ：recombinant ＨＡＰＬＮ）」とは、ＨＡＰＬＮタンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列をベクターに挿入し、組換えベクターを作製し、前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、細胞内で発現させて得られたタンパク質を意味する。

【0016】

一具体例において、前記組換えＨＡＰＬＮタンパク質は、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３及びＨＡＰＬＮ４からなる群のうちから選択されたいずれか１つのタンパク質でありうる。

【0017】

用語「組換えヒトＨＡＰＬＮタンパク質（ｒｈＨＡＰＬＮ：recombinant human ＨＡＰＬＮ）」とは、ヒトＨＡＰＬＮタンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列をベクターに挿入し、組換えベクターを作製し、前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、細胞内で発現させて得られたタンパク質を意味する。

【0018】

前記組換え細胞外基質タンパク質は、人体または動物に由来するタンパク質でありうる。一具体例において、前記組換え細胞外基質タンパク質は、人体に由来するタンパク質でありうる。用語「組換えＥＣＭタンパク質生産のための動物細胞」、または「組換えＥＣＭタンパク質を生産する動物細胞」は、組換えＥＣＭタンパク質を生産するように、組換えベクターが導入された動物細胞を意味する。

【0019】

前記動物細胞は、組換えＥＣＭタンパク質を生産することができる細胞であるならば、その種類を制限するものではない。前記動物細胞は、ＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ（Baby Hamster Kidney）、ＨｅＬａ、ＮｉＨ３Ｔ３、ＭＤＣＫ（Madin-Darby Canine Kidney）、ＷＩ３８、ＨＥＫ（Human Embryonic Kidney）、ハイブリードマ及びＮＳＯの細胞からなる群のうちから選択されるものでありうる。前記動物細胞は、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞の変異体でありうる。前記ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＳまたはＣＨＯ－Ｐｒｏ minusの細胞でありえる。

【0020】

用語「銅化合物（copper compound）」とは、銅化合物を意味し、銅の酸化状態が、＋１、＋２、＋３のものが知られている。

【0021】

前記培地組成物に含まれる銅化合物は、その種類を制限するものではない。前記銅化合物は、銅（I）化合物、銅（II）化合物または銅（III）化合物でありうる。前記銅化合物は、酸化銅（Ｃｕ_２Ｏ）、塩化銅（ＣｕＣｌ_２）、硝酸銅（Ｃｕ（ＮＯ_３）_２）、酸化銅II（ＣｕＯ）、硫化銅（ＣｕＳ）または硫酸銅（Ｃｕ_ＳＯ_４）でもあるが、それらに制限されるものではない。

【0022】

前記培地組成物は、前記銅化合物を、約２０μＭ超過、約３０μＭ以上、約４０μＭ以上、約５０μＭ以上、例えば、約２０μＭ超過ないし約１，０００μＭ、約３０μＭないし約１，０００μＭ、約４０μＭないし約１，０００μＭ、約５０μＭないし約１，０００μＭ、約５０μＭないし約９００μＭ、約５０μＭないし約８００μＭ、約５０μＭないし約７００μＭ、約５０μＭないし約６００μＭ、約５０μＭないし約５００μＭ、約５０μＭないし約４００μＭ、約５０μＭないし約３００μＭ、約５０μＭないし約２００μＭ、約５０ないし約１００μＭ、約５０ないし約９０μＭ、約５０ないし約８０μＭ、約５０ないし約７０μＭ、約５０ないし約６０μＭ、または約５０μＭの濃度で含んでもよい。前記培地組成物は、約２０μＭ超過、特に、約５０μＭ以上の濃度で銅化合物を含むことにより、モジュール形態に多重結合するＥＣＭタンパク質を単量体（monomer）に分離することができる。銅化合物の濃度が約２０μＭ以下である場合、タンパク質多量体（multimer）形成が増大され、それにより、タンパク質生産量が低減されてしまう。従って、前記培地組成物は、約２０μＭ超過、特に、約５０μＭ以上の濃度で銅化合物を含むことにより、組換えＥＣＭタンパク質多量体の形成を低減させることができる。結果として、前記培地組成物を使用すれば、ＥＣＭタンパク質を単量体に分離することができるので、ＥＣＭタンパク質が微量発現した後、モジュール形態で結合する構造的特徴により、量産が困難であるという問題点を解決することができる。

【0023】

前記培地組成物は、動物細胞の培養に使用される一般的な培地成分をさらに含んでもよい。前記一般的な培地成分は、組換えタンパク質を得るための動物細胞の培養のために必要な成分であり、公知されたもの、あるいは市販されるものを使用することができる。

【0024】

前記培地組成物は、さらなる添加剤をさらに含んでもよい。前記培地組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；グリセロール；ポロキサマー１８８のようなポロキサマー；ＥＤＴＡ；ポリソルベート８０のようなポリソルベート；システイン；グルタチオン（ＧＳＨ）；グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ：glutathione disulfide）；及び塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）のうち１種以上の添加剤をさらに含んでもよいが、それらに制限されるものではない。

【0025】

一実施例において、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を生産する動物細胞の培養時、培地に硫酸銅を添加すれば、タンパク質多量体形成低減効果にすぐれ、タンパク質生産量が増加することを確認した。従って、銅化合物を含む培地組成物は、動物細胞から、組換えＥＣＭタンパク質を大量に得るのに有用に使用されうる。

【0026】

一具体例において、前記培地組成物は、組換えＨＡＰＬＮタンパク質量産のための動物細胞の培養用培地組成物でもあり、具体的には、組換えヒトＨＡＰＬＮタンパク質量産のための動物細胞の培養用培地組成物でもあり、さらに具体的には、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質量産のための動物細胞の培養用培地組成物でありうる。

【0027】

前記培地組成物において、前記組換え細胞外基質タンパク質は、単量体でありうる。前記「単量体（monomer）」とは、「単量体タンパク質」と相互交換的に使用され、多重タンパク質複合体を構成するタンパク質のうち一つを称する。２以上のポリペプチドの複合体を「多量体」または「オリゴマー（oligomer）」と言い、２個のポリペプチドの複合体は、二量体（dimer）、３個のポリペプチド複合体は、三量体（trimer）、４個のポリペプチド複合体は、四量体（tetramer）と言う。前記銅化合物を含む培地組成物は、組換えＥＣＭタンパク質多量体形成低減効果を有するので、組換えＥＣＭタンパク質単量体生産のためにも使用される。すなわち、前記銅化合物を含む培地組成物は、モジュール形態に多重結合するＥＣＭタンパク質を単量体に分離することができる。従って、前記培地組成物は、組換えＥＣＭタンパク質単量体生産のための動物細胞の培養用培地組成物でありうる。

【0028】

他の態様は、（１）一態様による培地組成物において、組換えＥＣＭタンパク質を生産する動物細胞を培養し、培養液を得る段階と、
（２）前記培養液から、組換えＥＣＭタンパク質を分離して精製する段階と、を含む、高純度の組換え細胞外基質タンパク質を生産する方法を提供する。

【0029】

前述の培地組成物、組換えＥＣＭタンパク質及び動物細胞に係わる説明は、前述の通りである。

【0030】

前記組換えＥＣＭタンパク質を生産する方法によれば、高純度の組換えＥＣＭタンパク質を量産することができる。従って、前記方法は、組換えＥＣＭタンパク質を量産する方法でもあり、望ましくは、組換えＨＡＰＬＮタンパク質を量産する方法でもあり、さらに望ましくは、組換えＨＡＰＬＮ１タンパク質を量産する方法でもあり、もっとも望ましくは、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を量産する方法でありうる。

【0031】

前記段階（１）の培養は、当業界に周知されている方法を利用して行うことができる。例えば、前記培養は、流加培養（fed-batch culture）、連続式培養（continuous culture）または回分式培養（batch culture）などによっても行われる。一具体例において、前記段階（１）の培養は、流加培養でありうる。

【0032】

用語「流加培養（fed-batch culture）」とは、培地を間欠的に供給する培養法であり、培養液中の基質が適切な速度で添加され、流出がないために、供給される基質の量を自由に制御することができる培養方法を意味する。

【0033】

用語「連続式培養（continuous culture）」とは、新たな栄養培地が続けて供給され、同時に、細胞及び生産物を含む培養液が続けて除去される培養方法を意味する。

【0034】

用語「回分式培養（batch culture）」とは、初めに供給された原料基質がいずれも消費されるまで培養を続けつ方法であり、基質の濃度、代謝生産物の濃度、細胞の濃度などが、経時的に続けて変化する培養方法を意味する。

【0035】

前記段階（１）の培養は、約５日間ないし約１５日間、約５日間ないし約１３日間、約８日間ないし約１５日間、約８日間ないし約１３日間、約１０日間ないし約１５日間、約１０日間ないし約１３日間、約１１日間ないし約１５日間、または約１１日間ないし約１３日間行うものでもあるが、それらに制限されるものではない。

【0036】

前記段階（１）において、細胞培養中、培地組成物に、銅化合物を１回または２回以上添加することができる。

【0037】

前記段階（１）において、細胞培養前、培地組成物に銅化合物を添加することにより、培養を行うことができる。例えば、細胞培養０日目、培地組成物に、銅化合物を添加することができる。

【0038】

前記組換えＥＣＭタンパク質を生産する方法において、前記組換えＥＣＭタンパク質は、単量体でありうる。従って、前記方法は、組換えＥＣＭタンパク質の単量体を生産する方法でもあり、望ましくは、組換えＨＡＰＬＮタンパク質の単量体を生産する方法でもあり、さらに望ましくは、組換えＨＡＰＬＮ１タンパク質の単量体を生産する方法でもあり、最も望ましくは、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単量体を生産する方法でありうる。

【0039】

前記段階（２）は、クロマトグラフィを遂行する段階を含んでもよい。前記クロマトグラフィは、親和性クロマトグラフィ（affinity chromatography）、陰イオン交換クロマトグラフィ（anion exchange chromatography）、陽イオン交換クロマトグラフィ（cation exchange chromatography）、水酸化リン灰石クロマトグラフィ（hydroxyapatite chromatography）、逆相クロマトグラフィ（reversed-phase chromatography）、サイズ排除クロマトグラフィ（size exclusion chromatography）、混合モードクロマトグラフィ（mixed mode chromatography）及び疎水性相互作用クロマトグラフィ（hydrophobic interaction chromatography）からなる群のうちから選択されたいずれか１以上でありうる。

【0040】

前記段階（２）は、陰イオン交換クロマトグラフィを遂行する段階を含んでもよい。
用語「イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ：ion exchange chromatography）」とは、固定相にイオン交換体を使用し、固定相と移動相との間で可逆的なイオン交換を行い、試料イオンの固定相に対する親和性差を利用し、分離させて分析する方法を言う。

【0041】

用語「陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ：anion exchange chromatography）」とは、イオン交換クロマトグラフィの一種であり、アミノ基のような陽イオン性官能基を有する陰イオン交換体を使用する。

【0042】

前記陰イオン交換クロマトグラフィは、前平衡化段階、平衡化段階、サンプルローディング（sample loading）段階、洗浄段階及び溶出段階を含んでもよい。

【0043】

前記陰イオン交換クロマトグラフィは、一般的な陰イオン交換樹脂を使用して遂行されうる。前記陰イオン交換樹脂の例は、Fractogel（登録商標） EMD TMAE（M）、Fractogel（登録商標） EMD TMAE Medcap（M）、Fractogel（登録商標） EMD TMAE Hicap（M）、Eshmuno（登録商標） QEshmuno（登録商標） QPX、Eshmuno（登録商標） QPX Hicap、Capto Q、Capto Q ImpRes、Q Sepharose（登録商標） FF、Q Sepharose（登録商標） HP、Q Sepharose（登録商標） XL、Source（登録商標） 30Q、Capto（登録商標） Adhere、Capto（登録商標） Adhere ImpRes、Poros（登録商標） 50 HQ、Poros（登録商標） 50 XQ、Poros（登録商標） 50 PI、Q HyperCel、Toyopearl（登録商標） GigaCap Q 650-M、Toyopearl（登録商標） GigaCap Q 650-S、Toyopearl（登録商標） Super Q、YMC（登録商標） BioPro Q、Macro-Prep（登録商標） High Q、Nuvia（登録商標） QまたはUNOsphere（登録商標） Qなどがあるが、それらに制限されるものではない。代案として、作動条件、及びタンパク質のｐＩにより、またジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）作用基のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）を有している弱い陰イオン交換樹脂が使用されうる。その例は、Fractogel（登録商標） EMD DEAE、Fractogel（登録商標） EMD DMAE、Capto（登録商標） DEAEまたはDEAE Ceramic HyperD（登録商標） Fである。

【0044】

前記陰イオン交換クロマトグラフィは、結合及び溶出（bind-and-elute）モードで遂行されうるが、それに制限されるものではない。

【0045】

前記陰イオン交換クロマトグラフィのローディング量は、１０ないし５０ｇ／Ｌ樹脂でもあるが、それに制限されるものではない。

【0046】

前記陰イオン交換クロマトグラフィの溶出バッファは、ヒスチジン塩酸塩（Ｈｉｓ－ＨＣｌ）を含むものでありうる。

【0047】

前記陰イオン交換クロマトグラフィの溶出バッファは、約１ｍＭないし約１，０００ｍＭ、約１０ｍＭないし約８００ｍＭ、約２０ｍＭないし約６００ｍＭ、約４０ｍＭないし約４００ｍＭ、約６０ｍＭないし約２００ｍＭ、例えば、約１００ｍＭのヒスチジン塩酸塩（Ｈｉｓ－ＨＣｌ）を含むものでありうる。前記濃度範囲のヒスチジン塩酸塩を使用すれば、優秀な純度及び収率でもって、組換えＥＣＭタンパク質を分離することができる。

【0048】

前記陰イオン交換クロマトグラフィの溶出バッファは、ＥＤＴＡをさらに含んでもよい。前記ＥＤＴＡの濃度は、当業者が適切に選択することができる。

【0049】

前記陰イオン交換クロマトグラフィの溶出バッファは、ｐＨ４．０ないし６．０、ｐＨ４．５ないし５．５、例えば、ｐＨ５．０であるものでもあるが、それらに制限されるものではない。

【0050】

前記陰イオン交換クロマトグラフィを行うことにより、組換えＥＣＭタンパク質を捕獲することができる。従って、前記陰イオン交換クロマトグラフィを行うことにより、特定組換えＥＣＭタンパク質を特異的に単離することができる。

【0051】

前記段階（２）は、陰イオン交換クロマトグラフィを遂行する段階後、陽イオン交換クロマトグラフィを遂行する段階をさらに含んでもよい。

【0052】

用語「陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ：cation exchange chromatography）」とは、イオン交換クロマトグラフィの一種であり、スルホン基、カルボキシル基のような陰イオン性官能基を有する陽イオン交換体を使用する。

【0053】

前記陽イオン交換クロマトグラフィは、平衡化段階、サンプルローディング段階、洗浄I段階、洗浄II段階、洗浄III段階及び溶出段階を含んでもよい。

【0054】

前記陽イオン交換クロマトグラフィは、一般的な陽イオン交換樹脂を使用して遂行されうる。前記陽イオン交換樹脂の例は、Eshmuno（登録商標） CPS、Eshmuno（登録商標） CPXまたはSP Fast Flow Sepharose（登録商標）、Eshmuno（登録商標） S Resin、Fractogel（登録商標） SO3（M）、Fractogel SE Hicap（M）、SP Cellthru BigBead Plus（登録商標）、Streamline（登録商標） SP、Streamline（登録商標） SP XL、SP Sepharose（登録商標） Big Beads、Toyopearl（登録商標） M-Cap II SP-550EC、SP Sephadex（登録商標） A-25、Express-Ion（登録商標） S、Toyopearl（登録商標） SP-550C、Toyopearl（登録商標） SP-650C、Source（登録商標） 30S、Poros（登録商標） 50 HS、Poros（登録商標） 50 XS、SP Sepharose（登録商標） Fast Flow、SP Sepharose（登録商標） XL、Capto（登録商標） S、Capto（登録商標） SP ImRes、Capto（登録商標） S ImpAct、Nuvia（登録商標） HR-S ,Cellufine（登録商標） MAX S-r、Cellufine（登録商標） MAX S-h、Nuvia（登録商標） S、UNOsphere（登録商標） S、UNOsphere（登録商標） Rapid S、Toyopearl（登録商標） Giga-Cap S-650（M）、S HyperCel Sorbent（登録商標）、Toyopearl（登録商標） SP-650M、Macro-Prep（登録商標） High S、Macro-Prep（登録商標） CM、S Ceramic HyperD（登録商標） F、MacroCap（登録商標） SP、Capto（登録商標） SP ImpRes、Toyopearl（登録商標） SP-650S、SP Sepharose（登録商標） High Perform、Capto（登録商標） MMC、Capto（登録商標） MMC Imp Res、Eshmuno（登録商標） HCX、Nuvia（登録商標） High c-Primeなどがあるが、それらに制限されるものではない。代案として、作動条件、及びタンパク質のｐＩにより、また弱い陽イオン交換樹脂、例えば、Fractogel（登録商標） EMD COO（M）、CM Sepharose（登録商標） HP、CM Sepharose（登録商標） FF、Toyopearl（登録商標） AF Carboxy 650-M、Macro-Prep（登録商標） CM、Toyopearl（登録商標） GigaCap CM、CM Ceramic Hyper（登録商標） DまたはBio-Rex（登録商標） 70が使用されうる。

【0055】

前記陽イオン交換クロマトグラフィは、結合及び溶出モードで遂行されうるが、それに制限されるものではない。

【0056】

前記陽イオン交換クロマトグラフィのローディング量は、１０ないし１５ｇ／Ｌ樹脂でもあるが、それに制限されるものではない。

【0057】

前記陽イオン交換クロマトグラフィの洗浄II段階において、洗浄バッファIIは、約１ｍＭないし約１，０００ｍＭ、約５ｍＭないし約８００ｍＭ、約１０ｍＭないし約４００ｍＭ、約２５ｍＭないし約２００ｍＭ、または約５０ｍＭないし約１５０ｍＭ、例えば、約１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含んでもよい。

【0058】

前記陽イオン交換クロマトグラフィの洗浄III段階において、洗浄バッファIIIは、約１５０ｍＭないし約５００ｍＭ、約１５０ｍＭないし約４００ｍＭ、約２００ｍＭないし約５００ｍＭ、約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、約３００ｍＭないし約５００ｍＭ、または約３００ｍＭないし約４００ｍＭ、例えば、約３５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含んでもよい。

【0059】

前記陽イオン交換クロマトグラフィの洗浄バッファIIまたは洗浄バッファIIIは、Tris－ＨＣｌ、ＮａＡｃ、ＥＤＴＡ、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。

【0060】

前記陽イオン交換クロマトグラフィの洗浄バッファIIまたは洗浄バッファIIIは、ｐＨ５．０ないし８．５、例えば、ｐＨ８．０またはｐＨ５．５であるものでもあるが、それらに制限されるものではない。

【0061】

前記陽イオン交換クロマトグラフィの溶出バッファは、約５０ｍＭないし約１，０００ｍＭ、約１００ｍＭないし約８００ｍＭ、約２００ｍＭないし約６００ｍＭ、約３００ｍＭないし約５００ｍＭ、例えば、約３７０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含んでもよい。塩化ナトリウムの濃度は、前記範囲内において、生産物の純度及び収率の均衡を考慮し、適切に選択することができる。

【0062】

前記陽イオン交換クロマトグラフィの溶出バッファは、Tris－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。

【0063】

前記陽イオン交換クロマトグラフィの溶出バッファは、ｐＨ７．５ないし８．５、例えば、ｐＨ８．０であるものでもあるが、それに制限されるものではない。

【0064】

前記陽イオン交換クロマトグラフィを遂行することにより、タンパク質凝集体（aggregate）、ＨＣＰ（host cell protein）及びその他不純物を除去することができる。

【0065】

用語「凝集体（aggregate）」とは、さまざまな物質が一つで集められた形態を意味する。「タンパク質凝集体」とは、タンパク質が蓄積または集合された形態を意味し、正常なタンパク質の凝集体だけではなく、非正常的なタンパク質の凝集体も含む。該タンパク質凝集体は、目的タンパク質と共に、その他タンパク質も結合された状態を含むが、多量体タンパク質は、目的タンパク質同士結合されたものを意味する点において、差がある。

【0066】

用語「ＨＣＰ（host cell protein）」は、生物治療剤の製造過程及び生産過程において、宿主有機体によって生成される工程関連タンパク質不純物を意味する。

【0067】

前記段階（２）は、陽イオン交換クロマトグラフィを遂行する段階後、混合モードクロマトグラフィ（ＭＭＣ：mixed-mode chromatography）を遂行する段階をさらに含んでもよい。

【0068】

用語「混合モードクロマトグラフィ（ＭＭＣ：mixed-mode chromatography）」とは、固定相と分析物との間に、１以上の形態の相互作用を利用するクロマトグラフィ方法を意味する。

【0069】

前記混合モードクロマトグラフィは、前平衡化段階、平衡化段階、サンプルローディング段階、洗浄I段階、洗浄II段階及び溶出段階を含んでもよい。

【0070】

前記混合モードクロマトグラフィは、一般的な混合モード樹脂を使用して遂行されうる。前記混合モード樹脂の例は、Capto （登録商標） adhereなどがあるが、それに制限されるものではない。

【0071】

前記混合モードクロマトグラフィは、結合及び溶出モードで遂行されうるが、それに制限されるものではない。

【0072】

前記混合モードクロマトグラフィのローディング量は、１０ないし１５ｇ／Ｌ樹脂でもあるが、それに制限されるものではない。

【0073】

前記混合モードクロマトグラフィの洗浄II段階において、洗浄バッファIIは、約２００ｍＭないし約４００ｍＭ、約２００ｍＭないし約３５０ｍＭ、または約２５０ｍＭないし約３５０ｍＭ、例えば、約２００ｍＭまたは約３００ｍＭのアルギニンを含んでもよい。

【0074】

前記混合モードクロマトグラフィの洗浄バッファIIは、Tris－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。

【0075】

前記混合モードクロマトグラフィの洗浄バッファIIは、ｐＨ８．５ないし９．５、例えば、ｐＨ９．０であるものでもあるが、それに制限されるものではない。

【0076】

前記混合モードクロマトグラフィの溶出バッファは、約１００ｍＭないし約１，０００ｍＭ、約２００ｍＭないし約８００ｍＭ、約３００ｍＭないし約７００ｍＭ、約４００ｍＭないし約６００ｍＭ、例えば、約５００ｍＭのアルギニンを含んでもよい。該アルギニンの濃度は、前記範囲内において、生産物の純度及び収率の均衡を考慮し、適切に選択することができる。

【0077】

前記混合モードクロマトグラフィの溶出バッファは、Tris－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。

【0078】

前記混合モードクロマトグラフィの溶出バッファは、ｐＨ７．５ないし８．５、例えば、ｐＨ８．０であるものでもあるが、それに制限されるものではない。

【0079】

前記混合モードクロマトグラフィを遂行することにより、タンパク質凝集体及びＨＣＰを除去することができる。

【0080】

前記段階（２）は、混合モードクロマトグラフィを遂行する段階後、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ：hydrophobic interaction chromatography）を遂行する段階をさらに含んでもよい。

【0081】

用語「疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ：hydrophobic interaction chromatography）」は、固定相の作用基と分析物との疎水性相互作用を利用するクロマトグラフィ方法を意味する。

【0082】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィは、平衡化段階、サンプルローディング段階、洗浄I段階、洗浄II段階、洗浄III段階及び溶出段階を含んでもよい。

【0083】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィは、一般的な疎水性相互作用樹脂を使用して遂行されうる。前記疎水性相互作用樹脂の例は、Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow、Capto Octyl、Octyl Sepharose 4 Fast Flow、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（low sub）、Capto Butyl、Butyl Sepharose 4 Fast Flow、Phenyl Sepharose High Performance、Capto Phenyl ImpRes、Butyl Sepharose High Performance、Capto Butyl ImpRes、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high sub）、Capto Phenyl（high sub)などがあるが、それらに制限されるものではない。

【0084】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィは、結合及び溶出モードで遂行されうるが、それに制限されるものではない。

【0085】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィのローディング量は、３ないし６ｇ／Ｌ樹脂でありうる。

【0086】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィの洗浄II段階において、洗浄バッファIIは、約０．１Ｍないし約１．０Ｍ、約０．１Ｍないし約０．８Ｍ、約０．１Ｍないし約０．６Ｍ、約０．１Ｍないし約０．５Ｍ、約０．２Ｍないし約１．０Ｍ、約０．２Ｍないし約０．８Ｍ、約０．２Ｍないし約０．６Ｍ、約０．２Ｍないし約０．４Ｍ、約０．３Ｍないし約１．０Ｍ、約０．３Ｍないし約０．８Ｍ、約０．３Ｍないし約０．６Ｍ、または約０．３Ｍないし約０．５Ｍ、例えば、約０．４Ｍの硫酸アンモニウムを含んでもよい。

【0087】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィの洗浄バッファIIは、Tris－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。

【0088】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィの洗浄バッファIIは、ｐＨ７．５ないし８．５、例えば、ｐＨ８．０でもあるが、それに制限されるものではない。

【0089】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィの洗浄III段階において、洗浄バッファIIIは、約０．５Ｍないし約２．０Ｍ、約０．５Ｍないし約１．８Ｍ、約１．０Ｍないし約２．０Ｍ、約１．０Ｍないし約１．８Ｍ、約１．２Ｍないし約２．０Ｍ、または約１．２Ｍないし約１．８Ｍ、例えば、約１．５Ｍの塩化ナトリウムを含んでもよい。

【0090】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィの洗浄バッファIIIは、Tris－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。

【0091】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィの洗浄バッファIIIは、ｐＨ７．５ないし８．５、例えば、ｐＨ８．０でもあるが、それに制限されるものではない。

【0092】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィの溶出バッファは、約０．１Ｍないし約１．５Ｍ、約０．１Ｍないし約１．２Ｍ、約０．１Ｍないし約１．０Ｍ、約０．１Ｍないし約０．８Ｍ、約０．３Ｍないし約１．５Ｍ、約０．３Ｍないし約１．２Ｍ、約０．３Ｍないし約１．０Ｍ、または約０．３Ｍないし約０．８Ｍ、例えば、約０．５Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含んでもよい。前記塩化ナトリウム濃度が１．５Ｍを超える場合、組換えＥＣＭタンパク質が溶出されないことがある。

【0093】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィの溶出バッファは、Tris－ＨＣｌをさらに含んでもよい。

【0094】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィの溶出バッファは、ｐＨ７．５ないし８．５、例えば、ｐＨ８．０であるものでもあるが、それに制限されるものではない。

【0095】

前記疎水性相互作用クロマトグラフィを遂行することにより、タンパク質多量体及びＨＣＰを除去することができる。

【0096】

前記段階（２）は、陰イオン交換クロマトグラフィを遂行する段階と、陽イオン交換クロマトグラフィを遂行する段階と、混合モードクロマトグラフィを遂行する段階と、疎水性相互作用クロマトグラフィを遂行する段階と、を順次に含んでもよい。前記段階（２）は、組換えタンパク質を分離及び精製することができる公知された方法を追加してさらに含んでもよい。例えば、回収及び清澄化（harvest and clarification）、限外濾過（ultrafiltration）、透析濾過（diafiltration）、Ｓ／Ｄ（solvent/detergent）ウイルス不活性化、中間深層濾過（intermediate depth filter）、またはそれらの２以上の組み合わせを追加してさらに遂行することができる。前述の回収及び清澄化、限外濾過、透析濾過、Ｓ／Ｄウイルス不活性化及び中間深層濾過は、一般的な方法によっても遂行される。

【0097】

前記段階（２）は、段階（１）で得られた培養液の回収及び清澄化段階と、限外濾過及び透析濾過段階と、陰イオン交換クロマトグラフィを遂行する段階と、Ｓ／Ｄウイルス不活性化段階と、陽イオン交換クロマトグラフィを遂行する段階と、混合モードクロマトグラフィを遂行する段階と、疎水性相互作用クロマトグラフィを遂行する段階と、限外濾過及び透析濾過段階と、中間深層濾過段階と、を順次に含んでもよい。

【0098】

他の態様は、組換えＥＣＭタンパク質を含む試料に対し、塩酸塩を含む移動相を使用し、サイズ排除クロマトグラフィを遂行する段階と、
前記サイズ排除クロマトグラフィ結果を基に、試料中の組換えＥＣＭタンパク質の単量体を分析する段階と、を含む、組換えＥＣＭタンパク質の単量体を検定する方法を提供する。

【0099】

前記組換えＥＣＭタンパク質の単量体を検定する方法は、組換えＨＡＰＬＮタンパク質単量体を検定する方法でもあり、さらに望ましくは、組換えＨＡＰＬＮ１タンパク質単量体を検定する方法でもあり、最も望ましくは、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単量体を検定する方法でありうる。

【0100】

前記移動相に塩酸塩を含むことにより、組換えＥＣＭタンパク質の分離量が増加し、クロマトグラムの不正確なピークが顕著に低減されうる。

【0101】

前記移動相に含まれる塩酸塩は、その種類を制限するものではない。前記塩酸塩は、アルギニン塩酸塩（Ａｒｇ－ＨＣｌ）、アニリン塩酸塩、アデニン塩酸塩、グアニン塩酸塩、グアニジン塩酸塩（Ｇｄｎ－ＨＣｌ）、ヒスチジン塩酸塩（Ｈｉｓ－ＨＣｌ）またはリシン塩酸塩（Ｌｙｓ－ＨＣｌ）でもあるが、それらに制限されるものではない。

【0102】

前記移動相は、塩酸塩を、約０．５Ｍ超過、約０．８Ｍ以上、約１．０Ｍ以上、約０．５Ｍ超過ないし約１０．０Ｍ、約０．５Ｍ超過ないし約８．０Ｍ、約０．５Ｍ超過ないし約４．０Ｍ、約０．８Ｍないし約４．０Ｍ、約０．８Ｍないし約３．０Ｍ、約０．８Ｍないし約２．０Ｍ、約０．８Ｍないし約１．５Ｍ、約０．８Ｍないし約１．２Ｍ、約１．０Ｍ以上ないし約１０．０Ｍ、約１．０Ｍ以上ないし約８．０Ｍ、約１．０Ｍ以上ないし約４．０Ｍ、約１．０Ｍ以上ないし約３．０Ｍ、または約１．０Ｍないし約２．０Ｍの濃度で含んでもよい。前記塩酸塩の濃度が０．５Ｍ以下である場合、組換えＥＣＭタンパク質の分離量が減少しうる。前記塩酸塩の濃度が０．５Ｍ以下である場合、組換えＥＣＭタンパク質の単量体を検定する能力が低下しうる。一実施例において、該移動相の添加剤として塩酸塩を使用すれば、約１．０Ｍの低い濃度においても、組換えＥＣＭタンパク質単量体を正確に分析することができることを確認した。

【0103】

用語「サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ：size exclusion chromatography）」とは、「ゲル濾過クロマトグラフィ（gel filtration chromatography）」とも言い、大きさにより、タンパク質を分離する方法である。他の形態のクロマトグラフィと異なり、固定相と溶質との間に引力が存在せず、単に移動相が多孔性の固定相を通過することになる。

【0104】

前記サイズ排除クロマトグラフィは、一般的な方法によって遂行されうる。前記サイズ排除クロマトグラフィは、分析用サイズ排除クロマトグラフィでありうる。

【0105】

前記方法は、組換えＥＣＭタンパク質の単量体を検定することにより、組換えＥＣＭタンパク質を生産する過程において、それぞれの分離及び／または精製段階を遂行した後の結果物において、組換えＥＣＭタンパク質の単量体と、その他不純物（例：多量体など）との比率を正確に分析することができ、それにより、組換えＥＣＭタンパク質の単量体比率を分析することができる。従って、前記分析する段階において、組換えＥＣＭタンパク質の単量体と、その他不純物との比率を分析することができる。

【0106】

前記組換えＥＣＭタンパク質単量体検定方法は、組換えＨＡＰＬＮタンパク質の単量体の比率を分析することができ、さらに望ましくは、組換えＨＡＰＬＮ１タンパク質の単量体の比率を分析することができ、最も望ましくは、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単量体の比率を分析することができる。

【発明の効果】

【0107】

一態様による培地組成物によれば、組換えＥＣＭタンパク質を生産する動物細胞を大量に培養することができる。

【0108】

他の態様による組換えＥＣＭタンパク質を生産する方法によれば、組換えＥＣＭタンパク質を高純度に分離するだけではなく、特定組換えＥＣＭタンパク質の単量体を特異的に分離することができる。

【0109】

他の態様による組換えＥＣＭタンパク質の単量体を検定する方法によれば、組換えＥＣＭタンパク質の単量体を高い正確度で分析することができ、それにより、組換えＥＣＭタンパク質の単量体と、その他不純物との比率を分析することができる。

【図面の簡単な説明】

【0110】

【図1】ＡＥＸ線形グラディエント（linear gradient）溶出のクロマトグラムである。

【図2】ＣＥＸ段階的（step－wise）溶出のクロマトグラムである。

【図3】ＣＥＸ段階的（step－wise）溶出のＳＤＳ＿ＰＡＧＥ＿ＮＲ結果である。

【図4】ＭＭＣ段階的（step－wise）溶出のクロマトグラムである。

【図5】ＭＭＣ段階的（step－wise）溶出のＳＤＳ＿ＰＡＧＥ＿ＮＲ結果である。

【図6】ＨＩＣ比較溶出のクロマトグラムである。

【図7】ＨＩＣ比較溶出のＳＤＳ＿ＰＡＧＥ＿ＮＲ結果である。

【図8】移動相に、リン酸バッファ（ＰＢ：phosphate buffer）＋ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、または５ｍＭ ＥＤＴＡ＋４Ｍ Ｇｄｎ－ＨＣｌを使用し、ｒｈＨＡＰＬＮ１を含むサンプルに対してＳＥＣ分析を行った結果を示したクロマトグラムである。

【図9】移動相に、５０ｍＭ ＰＢ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋１Ｍ Ａｒｇ－ＨＣｌ ｐＨ６．３を使用し、ｒｈＨＡＰＬＮ１を含むサンプルに対してＳＥＣ分析を行った結果を示したクロマトグラムである。

【図10】移動相に、５０ｍＭ ＰＢ＋３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ａｒｇ－ＨＣｌ、０．５Ｍ Ａｒｇ－ＨＣｌ、１．０Ｍ Ａｒｇ－ＨＣｌまたは１．０Ｍ Ｇｄｎ－ＨＣｌを使用し、サンプル３に対してＳＥＣ分析を行った結果を示したクロマトグラムである。

【図11】移動相に、５０ｍＭ ＰＢ＋３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１Ｍ尿素（urea）、０．５Ｍ尿素、１．０Ｍ尿素、２．０Ｍ尿素、４．０Ｍ尿素または６．０Ｍ尿素を使用し、サンプル３に対してＳＥＣ分析を行った結果を示したクロマトグラムである。

【図12】移動相に、１．０Ｍ Ｇｄｎ－ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素または１．０Ｍ Ａｒｇ－ＨＣｌを使用し、サンプル３に対してＳＥＣ分析を行った結果を示したクロマトグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0111】

以下、本発明について、実施例を介し、さらに詳細に説明する。しかしながら、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。

【0112】

実施例１：組換えＥＣＭタンパク質を生産する細胞の培養
ＥＣＭタンパク質において、ヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞に挿入し、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を生産するＣＨＯ－Ｋ１細胞株を作製した。タンパク質生産量及び品質にすぐれる細胞株を、ＭＣＢ（master cell bank）として選定した。

【0113】

前記ＭＣＢを継代培養し、０．４０±０．０５×１０^６cells／ｍＬの濃度で、Thermo社のHyperforma ＳＵＢ ２５０ Ｌバイオリアクタに接種し、流加培養した。

【0114】

基本培地としては、２２．３６ｇ ＡｃｔｉＰｒｏ（商標）培地＋０．５８４６ｇグルタミン＋１０．００ｇ ＨＴ Supplement（Thermo Fisher Scientific社）＋４．２９ｇ １０Ｎ ＮａＯＨ＋１．８０ｇ ＮａＨＣＯ_３を使用した。培養温度は、３６．５℃に、溶存酸素量（ＤＯ：dissolved oxygen）は、４０．０％に、ｐＨは、７．００±０．２０に設定した。ｐＨ調節溶液として、１Ｍ炭酸ナトリウム一水和物（sodium carbonate monohydrate）を使用した。

【0115】

供給培地（ＦＭ：feeding medium）としては、１８１．０４ｇ ＨｙＣｌｏｎｅ（商標） Cell Boost ７ａ＋１２．２８ｇ １０Ｎ ＮａＯＨのＦＭ０２０ａ、及び９４．６０ｇ ＨｙＣｌｏｎｅ（商標） Cell Boost ７ｂ＋１０５．９３ｇ １０Ｎ ＮａＯＨのＦＭ０２０ｂを使用した。供給戦略は、下記表１に示されている通りである。

【0116】

【表1】

【0117】

供給添加剤としては、５０μＭ ＣｕＳＯ_４を使用し、それを、流加培養０日目にバイオリアクタに添加した。

【0118】

ブドウ糖供給ストック（stock）は、４００ｇブドウ糖／ｋｇで準備した。流加培養３日目ないし１３日目まで、ブドウ糖濃度が５．０ｇ／Ｌ未満に低下すれば、６．０ｇ／Ｌまで上げる方式でブドウ糖を供給した。

【0119】

ＶＣＤ（viable cell density）が２０．００×１０^６cells／ｍＬに逹すれば、温度を３１．０℃に変更した。流加培養１２日目になるか、あるいは生存率が６０％未満に低下するとき、細胞を収穫した。

【0120】

実験例１：添加剤種類による組換えＥＣＭタンパク質多量体形成低減効果
組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を生産する細胞を培養するとき、添加剤の種類によるタンパク質多量体形成低減効果を確認するための実験を行った。

【0121】

具体的には、供給添加剤の種類、濃度及びその供給戦略をそれぞれ異ならせることを除いては、実施例１と同一方法によって細胞を培養した。各実験群の供給添加剤種類、濃度、その供給戦略、並びにそれによる細胞培養及びタンパク質生産結果を下記表２に示した。

【0122】

【表2】

【0123】

表２に示されているように、ＣｕＳＯ_４添加剤を使用したとき、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質生産titerが３．８７ｇ／Ｌと最も高く、細胞当たり組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質生産量も、２８．７７ｐｇ／cell／dayと最も多かった。

【0124】

従って、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を生産する細胞を培養するとき、添加剤として、ＣｕＳＯ_４のような銅化合物を使用すれば、タンパク質多量体形成低減効果にすぐれ、タンパク質生産量が増加するということを確認することができた。具体的には、５０μＭ濃度のＣｕＳＯ_４を、細胞流加培養０日目に供給する場合、タンパク質多量体形成低減効果とタンパク質生産量とに最もすぐれるということが分かった。従って、それを組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の量産に利用することができるということが分かった。

【0125】

実験例２：銅化合物濃度による組換えＥＣＭタンパク質多量体形成の低減効果
組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を生産する細胞を培養するとき、銅化合物濃度によるタンパク質多量体形成低減効果を確認するための実験を行った。

【0126】

具体的には、銅化合物の濃度をそれぞれ異ならせることを除いては、実施例１と同一方法によって細胞を培養した。各実験群の銅化合物の濃度と、それによるタンパク質生産結果とを下記表３に示した。

【0127】

【表3】

【0128】

表３に示されているように、ＣｕＳＯ_４を２０μＭ超過の濃度で使用したとき、ヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質生産titerが高くなった。特に、ＣｕＳＯ_４を５０μＭ以上の濃度で使用した実施例１は、すぐれたヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質生産titerを示した。従って、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を生産する細胞を培養するとき、ＣｕＳＯ_４のような銅化合物を２０μＭ超過、特に、５０μＭ以上の濃度で使用すれば、タンパク質多量体形成低減効果にすぐれ、タンパク質生産量が増加することを確認することができた。

【0129】

実施例２：組換えＥＣＭタンパク質の単離及び精製
前記実施例１によって培養された細胞から、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を単離して精製した。具体的には、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単離及び精製は、下記順序によって遂行した。

【0130】

（１）回収及び清澄化（harvest and clarification）
回収及び清澄化のために、Millipore社のＤＯＨＣ及びＡ１ＨＣ深層フィルタを使用した。ＤＯＨＣ及びＡ１ＨＣ深層フィルタの推奨ローディング（loading）量は、それぞれ４５Ｌ／ｍ^２及び９０Ｌ／ｍ^２である。

【0131】

（２）限外濾過／透析濾過１（ＵＦ／ＤＦ１：ultrafiltration/diafiltration １）
Millipore社のPellicon ３（Ultracel、Type Ｃ Screen、３０ｋＤａ）を、ＵＦ／ＤＦ１膜（membrane）として選択した。ローディングサンプル濃度は、ＵＦ段階において５ｇ／Ｌ以下であり、その後、６倍体積以上の５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０バッファで透析濾過した。供給流速は、３００ＬＭＨ以下であり、膜通過圧力（ＴＭＰ：transmembrane pressure）は、１０～２０ｐｓｉである。推奨ローディング量は、７０Ｌ／ｍ^２以下である。

【0132】

（３）陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ：anion exchange chromatography）
LifeTech社のＰｏｒｏｓ ５０ＨＱ樹脂を捕獲樹脂（capture resin）として使用した。本段階は、結合及び溶出モードで遂行した。推奨タンパク質ローディング量は、１０～５０ｇ／Ｌ樹脂である。選択された溶出バッファは、１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０である。推奨ＵＶピーク収集範囲は、２５～７５ｍＡＵ／ｍｍである。

【0133】

（４）Ｓ／Ｄ（solvent/detergent）ウイルス不活性化
一般的な方法により、Ｓ／Ｄウイルス不活性化を行った。

【0134】

（５）陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ：cation exchange chromatography）
本段階は、結合及び溶出モードで遂行した。Cytiva社（旧ＧＥ Healthcare社）のCapto Ｓ ＩｍｐＡｃｔ樹脂を、ＣＥＸ樹脂として使用した。推奨ＣＥＸローディング量は、１０～１５ｇ／Ｌ樹脂である。ＣＥＸを遂行することにより、タンパク質凝集体、ＨＣＰ（host cell protein）、及びその他不純物を除去した。５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０が洗浄バッファIIとして推奨され、５０ｍＭ ＮａＡｃ、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．５が洗浄バッファIIIとして推奨される。推奨溶出バッファは、５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、３７０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０である。推奨ＵＶピーク収集範囲は、２５～５０ｍＡＵ／ｍｍである。

【0135】

（６）混合モードクロマトグラフィ（ＭＭＣ：mixed-mode chromatography）
本段階は、結合及び溶出モードで遂行した。Cytiva社（旧ＧＥ Healthcare社）のCapto adhere樹脂を、ＭＭＣ樹脂として使用した。推奨ローディング量は、１０～１５ｇ／Ｌ樹脂である。タンパク質凝集体及びＨＣＰをさらに除去するために、溶出バッファは、５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、０．５Ｍアルギニン（Ａｒｇ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を使用した。

【0136】

（７）疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ：hydrophobici nteraction chromatography）
本段階は、結合及び溶出モードで遂行した。Cytiva（旧ＧＥ Healthcare）社のButyl Sepharose ４ Fast Flow樹脂を、ＨＩＣ樹脂として使用した。推奨ローディング量は、３
～６ｇ／Ｌ樹脂である。５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０が洗浄バッファIIIとして推奨される。５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を使用し、高純度に目的タンパク質を溶出した。

【0137】

（８）限外濾過／透析濾過２（ＵＦ／ＤＦ２：ultrafiltration／diafiltration ２）
Millipore社のPellicon ３（Ultracel、Type Ｃ Screen、１０ｋＤａ）を、ＵＦ／ＤＦ２段階のために選択した。ロードサンプルは、ＵＦ段階において、１～３ｇ／Ｌに濃縮された後、６倍体積以上の２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０バッファで透析濾過した。ＵＦ／ＤＦ２プール（pool）濃度は、４．５～５．５ｍｇ／ｍＬである。供給流速は、３００ＬＭＨ以下であり、膜通過圧力（ＴＭＰ）は、１０～２０ｐｓｉである。ロード容量は、７０ｇ／ｍ^２以下である。

【0138】

（９）中間深層濾過（Ｉｎｔ．ＤＦ：intermediate depth filtration）
中間深層濾過のために、Millipore社のＸ０ＳＰ深層フィルタを選択し、ＨＣＰを除去した。Ｘ０ＳＰフィルタの推奨ローディング量は、４００～８００ｇ／ｍ^２である。

【0139】

（１０）剤形化及びBulk Fill
ＤＳ（drug substance）の濃度は、２．０±０．２ｇ／Ｌである。剤形バッファ組成は、ＤＰＤ（drug product development）によって決定され、ＤＳＰＤ（downstream process development）に移転された。ＰＳ８０及びスクロースは、ＶＦプール試料に、それぞれ最終濃度０．０４％（ｗ／ｖ）及び８％（ｗ／ｖ）で添加された。最終０．２μｍ濾過後、ＤＳを得た。

【0140】

実験例３：特定組換えＥＣＭタンパク質を特異的に単離するためのＡＥＸ条件
ＥＣＭタンパク質のうちＨＡＰＬＮ１タンパク質は、４０～５０ｋＤａの分子量を有する。

【0141】

前記実施例２－（３）の陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）段階において、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を特異的に単離することができるＡＥＸ条件を最適化させるための実験を行った。

【0142】

（１）溶出条件
（１．１）ＡＥＸ線形グラディエント比較溶出
材料：
－カラム：Ｐｏｒｏｓ ５０ＨＱ、３．０２４ｍＬ（０．５ｃｍ×１５．４ｃｍ）
－ローディング物質：濃度２．６４ｇ／Ｌ、ｐＨ９．０６、伝導度１．４４ｍＳ／ｃｍ
－ローディング量：３０ｇ／Ｌ樹脂
－カラム洗浄（sanitization）溶液：１．０Ｍ ＮａＯＨ
－前平衡化バッファ：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
－平衡化／洗浄バッファI：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０
－洗浄バッファII：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０
溶出バッファ：対照群：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、８０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５；条件１－Ａ：２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、Ｂ：５０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．８；条件２－Ａ：１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、Ｂ：１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．５；条件３－Ａ：１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、Ｂ：１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０；２０ＣＶ（column volume）の間、ＡからＢに線形グラディエント溶出
－ストリップバッファ：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
－カラム保存溶液：２０％エタノール

【0143】

実験のプロセス：
溶出物は、２５ｍＡＵ／ｍｍないし２５ｍＡＵ／ｍｍで収集した。クロマトグラムを使用し、溶出条件を検証した。

【0144】

結果：
下記表４に、各溶出条件による組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質収率、ＳＥＣ分析結果及びＨＣＰ濃度を示した。表４に示されているように、溶出バッファに塩を添加するより、塩を添加せず、１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌを添加したとき、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質捕獲効果にさらにすぐれていた。また、１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌを添加した場合、対照群に比べ、ＨＣＰが５０％低減した。

【0145】

【表4】

【0146】

（１．２）ＡＥＸ線形グラディエント溶出
材料：
－カラム：Ｐｏｒｏｓ ５０ＨＱ、３．０２４ｍＬ（０．５ｃｍ×１５．４ｃｍ）
－ローディング物質：濃度２．６４ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ９．０６、伝導度１．４４ｍＳ／ｃｍ
－ローディング量：３０ｇ／Ｌ樹脂
－衛生化（sanitization）溶液：１．０Ｍ ＮａＯＨ
－前平衡化バッファ：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
－平衡化／洗浄バッファI：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０
－洗浄バッファII：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０
溶出バッファ：Ａ：１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、Ｂ：１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０；２０ＣＶ（column volume）の間、ＡからＢに線形グラディエント溶出。
－ストリップバッファ：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、４５０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
－保存溶液：２０％エタノール

【0147】

実験のプロセス：
線形グラディエント比較溶出結果を基に、ＵＦ／ＤＦ１後、物質をＰｏｒｏｓ ５０ＨＱカラムにローディングし、段階的溶出方法を使用し、最適の溶出バッファを決定した。ＳＥＣ純度分析を使用し、最適の溶出条件を確認した。

【0148】

結果：
図１は、ＡＥＸ線形グラディエント溶出のクロマトグラムである。
表４及び図１に示されているように、１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌは、付加的な塩添加なしにも、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を効率的に捕獲した。純度と収率との均衡を合わせるために、ｐＨ５．０を、溶出のためのｐＨとして選択した。

【0149】

従って、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を特異的に単離するために、ＡＥＸ溶出バッファとして、１００ｍＭ前後のＨｉｓ－ＨＣｌを選択することができるということが分かった。特に、１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌを使用すれば、すぐれた純度及び収率でもって、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を単離することができる。例えば、ＡＥＸ溶出バッファとして、１００ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０を使用することができる。

【0150】

実験例４：組換えＥＣＭタンパク質凝集体、ＨＣＰ及びその他不純物を除去するためのＣＥＸ条件
前記実施例２－（５）の結合及び溶出モードＣＥＸは、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質凝集体、ＨＣＰ及びその他不純物を除去するために導入した。従って、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質凝集体、ＨＣＰ及びその他不純物を除去するためのＣＥＸ条件を最適化させるための実験を行った。

【0151】

（１）溶出条件
材料：
－カラム：Capto Ｓ ＩｍｐＡｃｔ、２．６３１ｍＬ（０．５ｃｍ×１３．４ｃｍ）
－ロード物質：ＡＥＸ溶出物、濃度１１．８４４ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５２、伝導度１１．７０ｍＳ／ｃｍ
－ローディング量：１０ｍｇ／ｍＬ樹脂
－平衡化／線状Ｉバッファ：５０ｍＭ ＮａＡｃ－ＨＡｃ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．５
－洗浄IIバッファ：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
－洗浄IIIバッファ：５０ｍＭ ＮａＡＣ、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．５
溶出バッファ：（Ａ）５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；（Ｂ）５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；段階的溶出：２０％ Ｂ（１００ｍＭ ＮａＣｌ）、５ＣＶ；４０％ Ｂ（２００ｍＭ ＮａＣｌ）、５ＣＶ；６０％ Ｂ（３００ｍＭ ＮａＣｌ）、５ＣＶ；７５％ Ｂ（３７５ｍＭ ＮａＣｌ）、５ＣＶ；８５％ Ｂ（４２５ｍＭ ＮａＣｌ）
－ストリップバッファ：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０

【0152】

実験のプロセス：
段階的溶出方法を遂行し、最適溶出条件を確認した。ローディング量は、１０ｇ／Ｌ樹脂であり、溶出物は、２５ｍＡＵ／ｍｍないし２５ｍＡＵ／ｍｍで収集した。各分画のタンパク質濃度を測定し、段階的回復量を計算した。また、サンプル純度は、ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ＿ＮＲによって分析した。

【0153】

結果：
溶出条件は、生産物の品質に重要である。最適条件の基準は、不純物除去を基とする。

【0154】

図２は、ＣＥＸ段階的溶出のクロマトグラムである。

【0155】

図３は、ＣＥＸ段階的溶出のＳＤＳ＿ＰＡＧＥ＿ＮＲ結果である。

【0156】

ＣＥＸ段階的溶出において、ＨＣＰ試験結果は、下記表５に示した。

【0157】

【表5】

【0158】

図３及び表５に示されているように、１００ｍＭ ＮａＣｌ（Ｅ０１）を使用したとき、ＨＣＰ除去が最も多くなり、目的タンパク質の損失が０．７％に過ぎなかった。分画Ｅ０２～Ｅ０４及び分画Ｅ０５の収率は、それぞれ６１．８％及び１．６％であった。ＮａＣｌが増加するにつれて、ＨＭＷ含量が増加した。生産物の純度及び収率の均衡のために、溶出バッファとして、５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、３７０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０が推奨された。

【0159】

実験例５：組換えＥＣＭタンパク質凝集体及びＨＣＰを除去するためのＭＭＣ条件
前記実施例２－（６）の結合及び溶出モードＭＭＣは、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質凝集体及びＨＣＰをさらに除去するために使用された。従って、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質凝集体及びＨＣＰを除去するためのＭＭＣ条件を最適化させるための実験を行った。

【0160】

（１）溶出条件
Capto adhereを使用し、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質凝集体及びＨＣＰを除去した。ＣＥＸ溶出物を、Capto adhereカラムにローディングした。５０Ｌ物質生産の線形勾配溶出結果に基づき、最適溶出条件を段階的溶出方法によって確認した。

【0161】

材料：
－カラム：Capto adhere、２．９８５ｍＬ（０．５ｃｍ×１５．２ｃｍ）
－ロード物質：ＣＥＸ溶出物、濃度３．１０５ｍｇ／ｍＬ、ＨＣＰ １５５２１７ｎｇ／ｍｇ、ＳＥＣ純度５２．９％
－ローディング量：７．５ｇ／Ｌ樹脂
－前平衡化バッファ：５０ｍＭ ＮａＡｃ－ＨＡｃ、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．５
－平衡化／洗浄バッファI：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
溶出バッファ：（Ａ）５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；（Ｂ）５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１Ｍ Ａｒｇ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；段階的溶出：２０％ Ｂ（２００ｍＭ Ａｒｇ）、５ＣＶ；４０％ Ｂ（４００ｍＭ Ａｒｇ）、１０ＣＶ；５０％ Ｂ（５００ｍＭ Ａｒｇ）、１０ＣＶ；６０％ Ｂ（６００ｍＭ Ａｒｇ）、１０ＣＶ；７０％ Ｂ（７００ｍＭ Ａｒｇ）、１０ＣＶ
－ストリップバッファ：５０ｍＭＨＡｃ

【0162】

実験のプロセス：
段階的溶出を使用し、最適の溶出条件を決定した。ＣＥＸ溶出物を、Capto adhereカラムに７．５ｇ／Ｌ樹脂にローディングし、溶出物を２５ｍＡＵ／ｍｍないし２５ｍＡＵ／ｍｍで収集した。各分画のタンパク質濃度を測定し、段階的回復量を計算した。ＨＣＰ及びＳＤＳ＿ＰＡＧＥ＿ＮＲ純度もテストした。

【0163】

結果：
図４は、ＭＭＣ段階的溶出のクロマトグラムである。

【0164】

図５は、ＭＭＣ段階的溶出のＳＤＳ＿ＰＡＧＥ＿ＮＲ結果である。

【0165】

ＭＭＣ段階的溶出におけるＨＣＰ試験結果は、下記表６に示した。

【0166】

【表6】

【0167】

図５及び表６に示されているように、２００ｍＭアルギニン（ピーク１）を使用したとき、ＨＣＰ除去が最も多くなり、目的タンパク質の損失が０．２％に過ぎなかった。ピーク２及びピーク３の収率は、それぞれ３９．５％及び２８．１％であった。アルギニン濃度が高いとき、ＨＭＷが最も多く溶出された。生産物の純度及び収率の均衡のために、溶出バッファとして、５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５００ｍＭアルギニン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０が推奨された。２００ｍＭアルギニンは、洗浄段階で使用されうる。

【0168】

実験例６：組換えＥＣＭタンパク質の純度を進めるためのＨＩＣ条件
前記実施例２－（７）のＨＩＣは、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質多量体及びＨＣＰを除去するために使用された。従って、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質多量体及びＨＣＰを除去するためのＨＩＣ条件を最適化させるための実験を行った。

【0169】

（１）溶出条件
材料：
－カラム：Butyl Sepharose ４ Fast Flow、２．６３１ｍＬ（０．５ｃｍ×１３．４ｃｍ）
－ロード物質：１）ＭＭＣ溶出物、濃度０．５９０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．０９、１４６．３５ｍＳ／ｃｍ、ＳＥＣ純度６８．９％；２）ＭＭＣ溶出物、濃度０．５４３ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．１０、１４５．８２ｍＳ／ｃｍ、ＳＥＣ純度６８．９％
－ローディング量：５ｇ／Ｌ樹脂
－平衡化／洗浄バッファI：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
－洗浄バッファII：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、０．４Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
－洗浄バッファIII：１）５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；２）５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
溶出バッファ：
１）（Ａ）５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；（Ｂ）５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；段階的溶出：２５％ Ｂ（１．５Ｍ ＮａＣｌ）、１０ＣＶ；５０％ Ｂ（１Ｍ ＮａＣｌ）、１０ＣＶ；７５％ Ｂ（０．５Ｍ ＮａＣｌ）、１０ＣＶ；９０％ Ｂ（０．２Ｍ ＮａＣｌ）、１０ＣＶ；１００％ Ｂ（０Ｍ ＮａＣｌ）、１０ＣＶ；
２）５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０
－ストリップバッファ：５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０

【0170】

実験のプロセス：
段階的溶出方法を遂行し、洗浄III及び溶出条件を決定した。ＭＭＣ溶出物を、ＨＩＣカラムにローディングする前、～１Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で調整した。ローディング量は、５ｇ／Ｌ樹脂であり、溶出物は、２５ｍＡＵ／ｍｍないし２５ｍＡＵ／ｍｍで収集した。各分画のタンパク質濃度を測定し、段階的回復量を計算した。ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ＿ＮＲを使用し、純度をテストした。

【0171】

結果：
図６は、ＨＩＣ比較溶出のクロマトグラムである。

【0172】

図７は、ＨＩＣ比較溶出のＳＤＳ＿ＰＡＧＥ＿ＮＲ結果である。

【0173】

ＨＩＣ段階的溶出の結果は、下記表７に示した。

【0174】

【表7】

【0175】

図７及び表７に示されているように、洗浄バッファIIにより、ＨＭＷが最も多く除去され、目的タンパク質は、ｐＨ８．０において、１．５Ｍ超過のＮａＣｌ下において溶出されなかった。従って、Run２において、洗浄IIIに、５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０が使用され、溶出に、５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０が使用された。最終的に、２番目実験の収率は、３４．８％であった。従って、洗浄バッファIIIとして、５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０が使用され、溶出バッファとして、５０ｍＭ Tris－ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０が使用された。

【0176】

実施例３：組換えＥＣＭタンパク質の検定方法
塩酸塩を含む移動相を使用し、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を遂行することにより、試料中の組換えＥＣＭタンパク質の単量体及びその他不純物を分析した。サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）の具体的な条件は、次の通りである：
－カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８ｘ３００ｍｍ、５μｍ Steel（東ソー製）
－移動相：５０ｍＭリン酸バッファ（ＰＢ：phosphate buffer）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍ Ｇｄｎ－ＨＣｌまたはＡｒｇ－ＨＣｌ ｐＨ７．５（±０．５）
－検出波長：２８０ｎｍ
－流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
－カラム温度：２５±３℃
－サンプル温度：５±３℃
－試料注入量：１００μｇ

【0177】

実験例７：組換えＥＣＭタンパク質の正確な分析のための添加剤のスクリーニング
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用し、組換えＥＣＭタンパク質の単量体及びその他不純物を分析する場合、不正確なピーク発生を低減させ、正確度を向上させることができる移動相の添加剤をスクリーニングするための実験を行った。具体的には、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用し、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単量体及びその他不純物を分析するために、移動相として使用する添加剤の種類及び濃度によるＳＥＣ分析正確度を確認した。試料としては、実施例２による組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単離及び精製過程中の中間生成物を使用した。

【0178】

図８は、移動相（ＭＰ）として、リン酸バッファ（ＰＢ）＋ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、または５ｍＭ ＥＤＴＡ＋４Ｍ Ｇｄｎ－ＨＣｌを使用し、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を含むサンプルについてＳＥＣ分析を行った結果を示したクロマトグラムである。

【0179】

図９は、移動相として、５０ｍＭ ＰＢ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋１Ｍ Ａｒｇ－ＨＣｌ ｐＨ６．３を使用し、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質を含むサンプルについてＳＥＣ分析を行った結果を示したクロマトグラムである。

【0180】

図８及び図９に示されているように、塩酸塩を移動相に添加したとき、単量体ピークが最も明確に示された。

【0181】

図１０は、移動相として、５０ｍＭ ＰＢ＋３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ａｒｇ－ＨＣｌ、０．５Ｍ Ａｒｇ－ＨＣｌ、１．０Ｍ Ａｒｇ－ＨＣｌ、または１．０Ｍ Ｇｄｎ－ＨＣｌを使用し、ＳＥＣ分析を行った結果を示したクロマトグラムである。その分析結果は、下記表８に示した。

【0182】

【表8】

【0183】

図１０及び表８に示されているように、Ａｒｇ－ＨＣｌの濃度が上昇するにつれ、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単離が良好になされた。特に、Ａｒｇ－ＨＣｌとＧｄｎ－ＨＣｌとを１．０Ｍ濃度に使用したとき、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単離量にすぐれていた。

【0184】

図１１は、単量体検定添加剤として知られた尿素を、移動相として、５０ｍＭ ＰＢ＋３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１Ｍ尿素、０．５Ｍ尿素、１．０Ｍ尿素、２．０Ｍ尿素、４．０Ｍ尿素、または６．０Ｍ尿素を使用し、ＳＥＣ分析を行った結果を示したクロマトグラムである。その分析結果は、下記表９に示した。

【0185】

【表9】

【0186】

図１１及び表９に示されているように、尿素の濃度が上昇するにつれ、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単離が良好になされた。しかしながら、塩酸塩と異なり、尿素は、４．０Ｍ以上の高い濃度で使用したとき、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質単離が可能であった。

【0187】

図１２は、移動相として、１．０Ｍ Ｇｄｎ－ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素または１．０Ｍ Ａｒｇ－ＨＣｌを使用し、ＳＥＣ分析を行った結果を示したクロマトグラムである。その分析結果は、下記表１０に示した。

【0188】

【表10】

【0189】

図１２及び表１０に示されているように、Ｇｄｎ－ＨＣｌ、Ａｒｇ－ＨＣｌのような塩酸塩を使用すれば、１．０Ｍの低濃度においても、４．０Ｍの高濃度の尿素を使用するところと同等以上の組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質単離量が示されるということを確認した。

【0190】

従って、移動相の添加剤として、１．０Ｍの塩酸塩を使用し、ＳＥＣ分析を行えば、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単離量にすぐれ、クロマトグラムの不正確なピークが顕著に低減し、組換えヒトＨＡＰＬＮ１タンパク質の単量体を正確に分析することができることが分かった。

【0191】

総合すれば、塩酸塩を含む移動相を使用し、サイズ排除クロマトグラフィを遂行することにより、試料中の組換えＥＣＭタンパク質単量体の比率を分析することができることを確認した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】