ホーム > 特許ランキング > Ｇｌｙｃｏｍ Ａ／Ｓ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-20
(54)【発明の名称】ＨＭＯ産生
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20230313BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20230313BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230313BHJP
C12P 19/04 20060101ALI20230313BHJP
C12P 19/00 20060101ALI20230313BHJP
C12P 19/12 20060101ALI20230313BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230313BHJP
C07K 14/24 20060101ALN20230313BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C12N15/70 Z
C12N1/21
C12P19/04 C
C12P19/00
C12P19/12
C12P21/02 C
C07K14/24
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022540698
(86)(22)【出願日】2021-01-22
(85)【翻訳文提出日】2022-08-30
(86)【国際出願番号】 EP2021051466
(87)【国際公開番号】W WO2021148610
(87)【国際公開日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】PA202000088
(32)【優先日】2020-01-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508278309
【氏名又は名称】グリコム・アクティーゼルスカブ
【氏名又は名称原語表記】Ｇｌｙｃｏｍ Ａ／Ｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(72)【発明者】
【氏名】パパダキス， マノス
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AF03
4B064AF04
4B064AF11
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA19
4B065CA41
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045EA01
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明の概念は、ＭＦＳスーパーファミリーのタンパク質をコードする組み換え核酸を含むオリゴ糖、好ましくはＨＭＯの産生について可能にされた遺伝子改変細胞及びオリゴ糖、好ましくはＨＭＯの産生のために前記細胞を使用する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ ＩＶ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）並びにパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）のリストから選択される１種以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号１のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号１と少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも８５％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞。
【請求項2】
前記オリゴ糖は、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ ＩＶ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）並びにパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）のリストから選択される、請求項１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項3】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項4】
前記組み換え核酸の発現を調節するための調節エレメントを含む組み換えＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１～３の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項5】
前記組み換え核酸の発現を調節するための前記調節エレメントは、ｌａｃプロモーター、Ｐｌａｃ又はｇｌｐプロモーター、ＰｇｌｐＦ等のプロモーターエレメントである、請求項４に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項6】
配列番号１のタンパク質又は配列番号１との少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的ホモログをコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、配列番号１のタンパク質をコードする前記核酸配列は、配列番号２との少なくとも７０％の配列同一性を有し、前記構築物は、ｌａｃプロモーター、Ｐｌａｃ又はｇｌｐプロモーター、ＰｇｌｐＦからなるリストから選択される調節エレメントを含む核酸配列をさらに含む、核酸構築物。
【請求項7】
前記調節エレメントは、配列番号２との少なくとも７０％の配列同一性を有する前記核酸配列の発現を調節する、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項8】
オリゴ糖の産生のための方法であって、（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号１のタンパク質をコードする組み換え核酸又はその機能的ホモログであって、そのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも８５％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一である、その機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞を提供する工程；
（ｉｉ）前記組み換え核酸を発現するための好適な細胞培養培地中において、（ｉ）に記載の前記細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において産生された１種以上のＨＭＯを採取する工程
を含む方法。
【請求項9】
１種以上のオリゴ糖、好ましくは１種以上のヒトミルクオリゴ糖の産生のための、請求項１～５の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項６若しくは７に記載の核酸構築物の使用。
【請求項10】
３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ ＩＶ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）並びにパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）のリストから選択される特異的ＨＭＯの産生のための、請求項１～５の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項６若しくは７に記載の核酸構築物の使用。
【請求項11】
ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ ＩＶ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）並びにパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）のリストから選択される特異的ＨＭＯの産生のための、請求項１～５の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項６若しくは７に記載の核酸構築物の使用。
【請求項12】
ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）及びパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）からなる群から選択されるもののリストから選択される特異的ＨＭＯの産生のための、請求項１～５の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項６若しくは７に記載の核酸構築物の使用。
【請求項13】
ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）及びラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）からなる群から選択される特異的ＨＭＯの産生のための、請求項１～５の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項６～９の何れか一項に記載の核酸構築物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本発明は、宿主細胞における生物学的分子の組み換え産生の分野に関する。より特に、本発明は、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を用いるヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の組み換え産生のための方法に関する。
本発明は、宿主細胞における生物学的分子の組み換え産生の分野に関する。より特に、本発明は、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を用いるヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の組み換え産生のための方法に関する。
【0002】
［発明の背景］
ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、ヒト母乳中の三番目に大きい固体成分を構成し、酵素的加水分解に対して高度に耐性である。結果として、ＨＭＯの実質的な画分は、殆どが未消化且つ未吸収のままで残留するため、それらの結腸への通過を可能にする。結腸内では、ＨＭＯは、特異的糖分解細菌の増殖を選択的に刺激することにより、腸内エコシステムを形作る基質として機能し得る。この選択性は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の菌株が消化管の健康にプラスの効果を有すると考えられるため、乳児及び成人の両方にとって有益であると見なされている（Ｃｈｉｃｈｌｏｗｓｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．５：２５１－２５８；Ｅｌｉｓｏｎ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｂｒｉｔ Ｊ．Ｎｕｔｒ，１１６：１３５６－１３６８）。
ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、ヒト母乳中の三番目に大きい固体成分を構成し、酵素的加水分解に対して高度に耐性である。結果として、ＨＭＯの実質的な画分は、殆どが未消化且つ未吸収のままで残留するため、それらの結腸への通過を可能にする。結腸内では、ＨＭＯは、特異的糖分解細菌の増殖を選択的に刺激することにより、腸内エコシステムを形作る基質として機能し得る。この選択性は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の菌株が消化管の健康にプラスの効果を有すると考えられるため、乳児及び成人の両方にとって有益であると見なされている（Ｃｈｉｃｈｌｏｗｓｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．５：２５１－２５８；Ｅｌｉｓｏｎ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｂｒｉｔ Ｊ．Ｎｕｔｒ，１１６：１３５６－１３６８）。
【0003】
それらのプレバイオティクス特性の他に、ＨＭＯは、それらの適用分野を拡大する追加のプラスの効果と結び付けられている（Ｋｕｎｚ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｆｏｏｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ５－２０，Ｅｄｓ．Ｍｏｒｅｎｏ Ｊ．ａｎｄ Ｌｕｚ Ｓａｎｚ Ｍ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ）。
【0004】
ＨＭＯの明白な健康上の利点は、例えば、乳児用調製粉乳及び乳児食等の食品における使用並びに消費者用健康食品のためのそれらの承認を可能にした。ＨＭＯの生物工学的産生は、ＨＭＯ製造の貴重な費用効率的且つ大規模方法である。その方法は、所望のオリゴ糖の合成のために必要とされるグリコシルトランスフェラーゼを発現できるように構築された遺伝子操作細菌に依存し、ＨＭＯ前駆体としてのヌクレオチド糖の細菌の固有のプールを利用する。ＨＭＯの生物工学的産生における最近の開発は、細菌発現系の所定の固有の限界を克服することを可能にしてきた。例えば、ＨＭＯ産生細菌細胞は、細菌内でのヌクレオチド糖の制限された細胞内プールを増加させるため（国際公開第２０１２１１２７７７号パンフレット）、ＨＭＯ産生に関与する酵素の活性を改良するため（国際公開第２０１６０４０５３１号パンフレット）又は合成されたＨＭＯの細胞外培地中への分泌を促進するため（国際公開第２０１０１４２３０５号パンフレット、同第２０１７０４２３８２号パンフレット）に遺伝子改変され得る。さらに、組み換え細胞内の関心対象の遺伝子の発現は、例えば、近年、国際公開第２０１９１２３３２４号パンフレットに記載されているような特定のプロモーター又は他の遺伝子発現調節因子を用いて調節され得る。
【0005】
国際公開第２０１０１４２３０５号パンフレット及び同第２０１７０４２３８２号パンフレットに記載されたアプローチは、例えば、国際公開第２０１２１１２７７７号パンフレット、同第２０１６０４０５３１号パンフレット又は同第２０１９１２３３２４号パンフレットの方法を用いて、高レベルの組み換え遺伝子発現によって産生細胞上に課される代謝負担を減少させることを可能にするという利点を有する。このアプローチは、組み換えＨＭＯ産生細胞の操作において一層多くの注目を集めており、例えば、最近では、糖トランスポータータンパク質をコードする数種の新規な遺伝子及びヒト母乳の最も富裕なＨＭＯである組み換え産生した２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）の排出を促進できる発酵手法について記載されている（国際公開第２０１８０７７８９２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１９００３２３０５３号明細書、同第２０１９００３２３０５２号明細書）。しかしながら、現時点では、糖トランスポーターの基質特異性を定義する構造／因子は、依然として明確に研究されておらず、極めて予測不能なままであるため、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ等の複数のタンパク質データベースにおける予測されたトランスポーター機能を備える極めて多数の細菌タンパク質間で様々な組み換え産生したＨＭＯ構造の排出についての正しいトランスポータータンパク質を正確に特定できるアルゴリズムは、存在しない。
【0006】
［発明の概要］
組み換え産生ＨＭＯ及び前記タンパク質を発現する組み換え細胞を発生させるための効率的な糖排出トランスポータータンパク質は、大規模な工業的ＨＭＯ製造にとって有利である。
組み換え産生ＨＭＯ及び前記タンパク質を発現する組み換え細胞を発生させるための効率的な糖排出トランスポータータンパク質は、大規模な工業的ＨＭＯ製造にとって有利である。
【0007】
本発明は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる組み換え細胞であって、細菌エルニシア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）を起源とする推定ＭＦＳ（主要ファシリテータースーパーファミリー）トランスポータータンパク質をコードする異種遺伝子を発現する組み換え細胞を提供する。より特に、本発明は、オリゴ糖、特にＨＭＯの産生のために最適化された遺伝子改変細胞であって、配列番号１のアミノ酸配列（図４）との少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする組み換え核酸を含む遺伝子改変細胞に関する。配列番号１として本明細書で同定されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩＤ ＥＥＱ０８２９８．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＥＥＱ０８２９８．１／）を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、本明細書では、「ＹｂｅｒＣタンパク質」、又は「ＹｂｅｒＣトランスポーター」、又は「ＹｂｅｒＣ」と互換的に同定され；ＹｂｅｒＣタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では、「ＹｂｅｒＣコーディング核酸／ＤＮＡ」、又は「ｙｂｅｒＣ遺伝子」、又は「ｙｂｅｒＣ」であると同定される。
【0008】
本発明は、ＹｂｅｒＣタンパク質を発現するＨＭＯ産生組み換え細胞の使用が、ＨＭＯの発酵及び精製の両方において、ＨＭＯ製造プロセスの極めて顕著な改良を生じさせることを証明する。本明細書に開示したＨＭＯ産生のための組み換え細胞及び方法は、より高い収率の全産生ＨＭＯ、より少ない副生成物形成又は副生成物対生成物比の両方、発酵毎のより低いバイオマス形成及び発酵ブロスの下流処理加工中のＨＭＯの加速された回収を提供する。
【0009】
驚くべきことに、種々のＨＭＯ産生細胞中における、ＹｂｅｒＣをコードするＤＮＡ配列の発現は、細胞外培地中での幾つかの特定ＨＭＯの蓄積及び産生細胞の内部での幾つかの他のＨＭＯの蓄積並びに全ＨＭＯ産生の増加と関連することが見出されている。驚くべきことに、産生したＨＭＯの排出の増加は、３単位又は４単位の単糖の何れかから構成されるＨＭＯ、即ち三糖及び四糖であるＨＭＯ、例えば３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）及びラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）について特徴的であるが、産生細胞の内部に蓄積する、五糖又は六糖等のより大きいオリゴ糖構造について特徴的でないことが見出されている。驚くべきことに、特にｙｂｅｒＣを発現する対応するＨＭＯ産生細胞では、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）及びラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）等のＨＭＯの総産生量が増加する一方、これらの細胞内での副生成物、例えばパラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）又はパラ－ラクト－ネオ－ヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）の産生量がこれに対応して多くの場合に減少し、前記副生成物のオリゴ糖が典型的には産生細胞の内部に蓄積することも見出されている。さらに、非常に予想外であることに、ＨＭＯ産生細胞内でのＹｂｅｒＣタンパク質の発現は、例えば、発酵終了時における死細胞数の減少によって反映されるように、高細胞密度発酵中のバイオマス形成の減少及びより健康な細胞培養をもたらし、これは、バイオマス単位当たりでより多くの生成物が産生されるように製造プロセスをより効率的にさせる。
【0010】
したがって、本発明の第１の態様は、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ ＩＶ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）並びにパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）のリストから選択される１種以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号１のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号１と少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも８５％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞に関する。特に、本発明は、１種以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる前記遺伝子改変細胞であって、オリゴ糖は、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ ＩＶ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）並びにパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）のリストから選択される、前記遺伝子改変細胞に関する。
【0011】
本発明の第２の態様は、ＭＦＳトランスポータータンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２及びその核酸構築物を含む、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である遺伝子改変細胞との少なくとも７０％、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する、核酸構築物に関する。
【0012】
一態様では、ＭＦＳトランスポータータンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％同一である、核酸構築物である。
【0013】
本発明の第３の態様は、１種以上のオリゴ糖の産生のための方法であって、
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号１のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号１と少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも８５％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞を提供する工程；
（ｉｉ）前記組み換え核酸を発現するための好適な細胞培養培地中において、（ｉ）に記載の細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において産生された１種以上のＨＭＯを採取する工程
を含む方法に関する。
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号１のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号１と少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも８５％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞を提供する工程；
（ｉｉ）前記組み換え核酸を発現するための好適な細胞培養培地中において、（ｉ）に記載の細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において産生された１種以上のＨＭＯを採取する工程
を含む方法に関する。
【0014】
本発明は、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）タンパク質をコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞又は核酸構築物であって、前記核酸配列は、配列番号２との少なくとも７０％の配列同一性を有する、遺伝子改変細胞又は核酸構築物の、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ ＩＶ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）並びにパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）のリストから選択される、特にラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ ＩＶ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）並びにパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）のリストから選択される１種以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）の産生のための使用にも関する。
【0015】
上述したように、１種以上のＨＭＯを産生することができる、ＹｂｅｒＣトランスポータータンパク質をコードする核酸を含む遺伝子改変細胞の培養中、驚くべきことに、副生成物及びバイオマス形成を減少させながら、対応する１種以上のＨＭＯが高収率で産生されることが見出されている。これは、下流プロセス中のＨＭＯの回収にとって、例えば全体的な回収及び精製手法がより少ない工程を含む可能性があり、精製の全所要時間が短縮され得るため、したがって、生成物の回収は、より要する労力が少なくなり、経済的により効率的である。
【0016】
これらの増加した生成物の収率及び生成物回収の促進の効果は、本発明を先行技術の開示に対して優れたものにする。
【0017】
本発明の他の態様及び有利な特徴について、下記の非限定的な実施例によって詳細に記載し、例示する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】試料全体、上清試料及びペレット試料中での、異種トランスポーター遺伝子ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０の発現のみが相違する、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の最適発現を示す菌株についての相対的ＬＮＴ－２濃度のパーセンテージ（％）を示す。菌株ＭＰ３９４１とは反対に、菌株ＭＰ３９４０は、ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子．ｒを発現する。
【図2】試料全体、上清試料及びペレット試料中での、菌株ＭＰ４４３６及びＭＰ３８６３についての相対的ＬＮｎＴ濃度及び副生成物濃度のパーセンテージ（％）を示す。両方の菌株が、必要とされるグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の最適な発現を示すが、Ｐｌａｃエレメントの制御下で異種トランスポーター遺伝子ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０を発現するのは、ＭＰ３８６３である。
【図3】試料全体、上清試料及びペレット試料中での、菌株ＭＰ４４７３、ＭＰ４４６２及びＭＰ４５４７についての相対的ＬＮＴ濃度及び副生成物濃度のパーセンテージ（％）を示す。３種の全ての菌株が、必要とされる遺伝子の最適な発現を示すが、それぞれＰｌａｃ又はＰｇｌｐＦエレメントの制御下で異種トランスポーター遺伝子ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０を発現するのは、ＭＰ４４６２及びＭＰ４５４７のみである。
【図4】配列番号１を示す。
【0019】
［詳細な説明］
下記では、本発明の実施形態についてさらに詳細に記載する。機能のそれぞれの特定の変形形態は、他に特に記載しない限り、本発明の他の実施形態に適用され得る。
下記では、本発明の実施形態についてさらに詳細に記載する。機能のそれぞれの特定の変形形態は、他に特に記載しない限り、本発明の他の実施形態に適用され得る。
【0020】
一般に、本明細書で使用する全ての用語は、他に明示的に規定又は記載されない限り、当技術分野におけるそれらの通常の意味に従って解釈されるべきであり、本発明の全ての態様及び実施形態に適用することができる。「１つの（ａ）／１つの（ａｎ）／その［細胞、配列、遺伝子、トランスポーター、工程等］」についての全ての言及は、他のことが明示的に記載されない限り、前記細胞、配列、遺伝子、トランスポーター、工程等の少なくとも１つの例についての言及であると開放的に解釈されるべきである。本明細書に開示した任意の方法の工程は、明示的に規定されない限り、本明細書に開示した正確な順序で実施される必要はない。
【0021】
本発明は、一般に、オリゴ糖の効率的な産生のための遺伝子改変細胞及びオリゴ糖を産生させる方法における前記遺伝子改変細胞の使用に関する。特に、本発明は、オリゴ糖、好ましくは異種オリゴ糖、特にヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を合成することを可能にされた遺伝子改変細胞に関する。したがって、本発明の細胞は、例えば、下記に記載するグリコシルトランスフェラーゼ活性を備える１種以上の酵素をコードする遺伝子等、（細胞が１種以上のＨＭＯを合成することを可能にする）細胞による１種以上のＨＭＯを合成するために必要な組み換え核酸の組を発現するように改変される。本発明のオリゴ糖産生組み換え細胞は、異種組み換え核酸配列、好ましくは細菌エルニシア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）を起源とするＭＦＳ（主要ファシリテータースーパーファミリー）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むようにさらに改変される。より詳細には、本発明は、１種以上の特定のオリゴ糖、特に１種以上の特定のＨＭＯの産生のために最適化された遺伝子改変細胞であって、配列番号１（図４）のアミノ酸配列との少なくとも８０％の配列類似性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％及び一層より好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有するタンパク質をコードする組み換え核酸を含む遺伝子改変細胞に関する。本明細書で配列番号１と同定されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩＤ：ＥＥＱ０８２９８．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＥＥＱ０８２９８．１／）を有するアミノ酸配列との１００％同一性を有するアミノ酸配列である。
【0022】
したがって、本発明の第１の態様は、１種以上のＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号１のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号１と少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも８５％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞に関する。
【0023】
配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、本明細書では、「ＹｂｅｒＣタンパク質」、又は「ＹｂｅｒＣトランスポーター」、又は「ＹｂｅｒＣ」であると互換的に同定され；ＹｂｅｒＣタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では、「ＹｂｅｒＣコーディング核酸／ＤＮＡ」、又は「ｙｂｅｒＣ遺伝子」、又は「ｙｂｅｒＣ」であると同定される。
【0024】
用語「主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）」は、糖、薬物、疎水性分子、ペプチド、有機イオン等の広範囲の様々な物質を輸送することを担っている第２の活性トランスポータークラスの大きく且つ並外れて広汎なファミリーを意味する。糖トランスポータータンパク質の特異性は、高度に予測不能であり、例えば、オリゴ糖に対する特異性を備える新規なトランスポータータンパク質の同定には、極めて負担の大きい検査室実験を必要とする（より詳細については、Ｒｅｄｄｙ Ｖ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２），ＦＥＢＳ Ｊ．２７９（１１）：２０２２－２０３５によるレビューを参照されたい）。用語「ＭＦＳトランスポーター」は、これに関連して、オリゴ糖、好ましくはＨＭＯの細胞膜を通した輸送、好ましくは特にＬＮＴ－２、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、３’－ＳＬ又は６’－ＳＬの３又は４糖単位を含むＨＭＯ／オリゴ糖の、細胞質から細胞外部への好ましくは宿主細胞により合成されたＨＭＯ／オリゴ糖の輸送を意味する。さらに又は代わりに、ＭＦＳトランスポーターは、例えば、ラクトース、グルコース、細胞代謝産物又は毒素等、本発明によるＨＭＯ又はオリゴ糖と見なされない分子の排出も促進し得る。
【0025】
２つ以上の核酸又はアミノ酸配列に関連して、用語「［所定の］％の配列同一性」は、２つ以上の配列が、核酸又はアミノ酸の比較ウィンドウ又は指定された配列にわたって最大一致について比較及び整列されたとき、一定の％で共通するヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する同一性を有することを意味する（即ち、配列は、少なくとも９０パーセント（％）の同一性を有する）。核酸配列又はアミノ酸配列のパーセント同一性は、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動によるアラインメント及び視覚的検査によって測定することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照されたい）。この定義は、欠失及び／又は付加を有する試験配列の補体及び配列並びに置換を有する補体及び配列にも適用される。パーセント同一性、配列類似性を決定するために及びアラインメントのために好適なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５－３３８９（１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴ ２．２．２０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ ２．２．２０は、本発明の核酸及びタンパク質に対するパーセント配列同一性を決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。配列アラインメントアルゴリズムの例は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）、ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）又はＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）である。
【0026】
本発明に関連して、用語「オリゴ糖」は、多数の単糖単位を含有する糖ポリマーを意味する。幾つかの実施形態では、好ましいオリゴ糖は、３又は４単糖単位、即ち三糖又は四糖からなる糖ポリマーである。本発明の好ましいオリゴ糖は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である。
【0027】
本発明に関連して、用語「ヒトミルクオリゴ糖」又は「ＨＭＯ」は、ヒト母乳中で見出される複合糖質を意味する（参考のために、Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（２０１１）；又はＣｈｅｎ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５）を参照されたい）。ＨＭＯは、１つ以上のβ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ以上のβ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端でラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、α－Ｌ－フコピラノシル及び／又はα－Ｎ－アセチル－ノイラミニル（シアリル）部分によって置換され得る。この点に関して、非酸性（又は中性）ＨＭＯは、シアリル残基を欠き、酸性ＨＭＯは、それらの構造内に少なくとも１つのシアリル残基を有する。非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化されても又はされなくてもよい。そのような中性非フコシル化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３’－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨ ＩＩ）及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ ａ）、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ ｂ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｄ）、フコシル－ＬＳＴ ｄ（ＦＬＳＴ ｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。本発明に関連して、ラクトースは、ＨＭＯ種であると見なされない。
【0028】
本発明の幾つかの実施形態では、トリ－ＨＭＯ及びテトラ－ＨＭＯ、例えば三糖であるＬＮＴ－２、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ及び四糖であるＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＦＳＬが好ましい場合がある。
【0029】
１種以上のＨＭＯを合成することができるように、本発明の組み換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を備える機能的酵素をコードする少なくとも１つの組み換え核酸を含む。ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に（染色体への統合によって）統合され得るか、又はプラスミドＤＮＡ内に含まれてプラスミド性と表現され得る。ＨＭＯの産生のために２種以上のグリコシルトランスフェラーゼ、例えばＬＮＴ又はＬＮｎＴが必要とされる場合、グリコシルトランスフェラーゼ活性を備える異なる酵素をコードする２つ以上の組み換え核酸、例えばＬＮＴを産生するためにβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２の組み換え核酸と組み合わせたβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１の組み換え核酸）がゲノム内に組み込まれ得、且つ／又はプラスミドから発現され得、ここで、第１及び第２の組み換え核酸は、相互に独立して、染色体内又はプラスミド上に統合され得る。好ましい一実施形態では、第１及び第２の組み換え核酸は、産生細胞の染色体内に安定性で統合され；別の実施形態では、第１及び第２のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも一方は、プラスミド性である。グリコシルトランスフェラーゼ活性を備えるタンパク質／酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）は、様々な実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，４－フコシルトランスフェラーゼ、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの活性を有する酵素から選択され得る。例えば、ＬＮＴの産生には、改変細胞が少なくとも２種のグリコシルトランスフェラーゼであるβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼを発現することを必要とし；ＬＮｎＴの産生には、改変細胞が活性β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及び活性β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼを発現することを必要とし；６’－ＳＬの産生には、改変細胞は、活性α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ酵素を発現しなければならない。産生細胞に含まれる組み換え遺伝子によってコードされ得るグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質の幾つかの非限定的実施形態は、表１の非限定的例から選択され得る。
【0030】
【表1】
【0031】
【表2】
【0032】
【表3】
【0033】
本発明の一態様は、配列番号１に示した主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）タンパク質又はそのアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも８０％同一であるその機能的ホモログである、糖輸送ができるタンパク質をコードする異種核酸配列を含む核酸構築物の提供であって、ＭＦＳタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２との少なくとも７０％の配列同一性を有する、核酸構築物の提供である。
【0034】
用語「異種核酸配列」、「組み換え遺伝子／核酸／ＤＮＡコーディング」又は「コーディング核酸配列」は、適切な制御配列、即ちプロモーターの制御下に置かれた場合、ｍＲＮＡ内に転写されてポリペプチド内に翻訳される一連の連続的非重複三重項（コドン）を含む、人工的（即ち核酸配列を作成するために標準的な検査室方法を用いてインビトロで産生される）核酸配列を意味する。コーディング配列の境界は、一般に、ｍＲＮＡの５’末端、翻訳開始コドン（ＡＵＧ、ＧＵＧ又はＵＵＧ）及び翻訳終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）のオープンリーディングフレームの直接上流に位置するリボソーム結合部位によって決定される。コーディング配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成及び組み換え核酸配列を含み得るが、これらに限定されない。用語「核酸」には、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子が含まれる。遺伝コードの縮重の結果として、所与のタンパク質をコードする複数のヌクレオチド配列が産生され得ると理解されている。用語「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、短鎖核酸分子である。「プライマー」は、プライマー伸長生成物の合成が誘導される条件（即ちヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼ等の誘導剤の存在下において且つ好適な温度及びｐＨ）下に置かれた場合に合成の開始点として機能できる、精製制限消化物として自然に発生するか、又は核酸ストランドに対して相補的であるように合成的に生成されるかにかかわらず、オリゴヌクレオチドである。プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のための一本鎖であるが、代わりに二本鎖であり得る。二本鎖である場合、プライマーは、伸長生成物を調製するために使用される前に、最初にその鎖を分離するために処理される。好ましくは、プライマーは、デオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長生成物の合成を開始させるために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源及び本方法の使用を含む多数の因子に依存するであろう。
【0035】
本発明の組み換え核酸配列は、コーディングＤＮＡ配列、例えば遺伝子又は非コーディングＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列等の調節ＤＮＡであり得る。本発明の一態様は、組み換え細胞であって、１種以上のＨＭＯの産生のために必要な酵素をコードする組み換えＤＮＡ配列及びＹｂｅｒＣトランスポーターをコードするＤＮＡ配列を含む組み換え細胞を提供することに関する。したがって、一実施形態では、本発明は、核酸構築物であって、コーディング核酸配列、即ち関心対象の遺伝子の組み換えＤＮＡ配列、例えばグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子若しくはｙｂｅｒＣ遺伝子及び非コーディングＤＮＡ配列、例えばプロモーターＤＮＡ配列、例えばｌａｃオペロン若しくはｇｌｐオペロンのプロモーターに由来する組み換えプロモーター又は別のゲノムプロモーターＤＮＡ配列に由来するプロモーター配列或いは合成プロモーター配列を含む核酸構築物に関し、ここで、コーディング配列及びプロモーター配列は、作動可能に連結している。用語「作動可能に連結した」は、２個以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）断片間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写調節配列の転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーター配列は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコーディング配列の転写を刺激又は調節する場合、コーディング配列と作動可能に連結している。一般に、転写配列に作動可能に連結しているプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接しており、即ち、それらは、シス作用性である。
【0036】
一実施形態では、本発明の核酸構築物は、ベクターＤＮＡの一部であり得、別の実施形態では、構築物は、宿主細胞のゲノム内に統合されている発現カセット／カートリッジである。したがって、用語「核酸構築物」は、遺伝子の発現を改変するため又は構築物中に含まれ得る遺伝子／コーディングＤＮＡ配列を発現させるために、標的細胞、例えば細菌細胞内に「移植」されることが意図される、核酸の人工的に構築された断片、特に「ＤＮＡ断片」を意味する。本発明に関連して、核酸構築物は、２つ以上の組み換えＤＮＡ配列：本質的に、プロモーターＤＮＡ配列を含む非コーディングＤＮＡ配列及び関心対象のタンパク質、例えばＹｂｅｒＣタンパク質をコードするコーディングＤＮＡ配列、宿主細胞内のＨＭＯの産生のために有用である別のタンパク質のグリコシルトランスフェラーゼを含む組み換えＤＮＡ配列を含有する。好ましくは、構築物は、構築物のコーディングＤＮＡの転写又は翻訳の何れかを調節する非コーディングＤＮＡ配列、例えば転写産物へのリボソーム結合を促進するＤＮＡ配列、転写産物又は転写終結配列を安定化するリーディングＤＮＡ配列をさらに含む。
【0037】
構築物（発現カセット）内に含まれる関心対象の組み換え核酸の細菌ゲノム内への統合は、従来方法により、例えばａｔｔＴｎ７部位について記載されているように、染色体上の特異的部位に相同であるフランキング配列を含有する線状カートリッジを用いることにより（Ｗａｄｄｅｌｌ Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｎ．Ｌ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８８）Ｆｅｂ；２（２）：１３７－４９．）；組み換えがファージλのＲｅｄリコンビナーゼ機能又はＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴリコンビナーゼ機能によって媒介される核酸配列のゲノム統合のための方法により（Ｍｕｒｐｈｙ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）；１８０（８）：２０６３－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）２０：１２３－１２８ Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．（２０００）１（３）：２３９－２４３）；Ｒｅｄ／ＥＴ組み換えに基づく方法により（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２００５）、１２（３）：３４９－５６．；Ｖｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）；７１（４）：１８２９－３５）；又は陽性クローン、即ち例えばマーカー遺伝子又は遺伝子機能の損失若しくは獲得によって選択され得る発現カセットを運ぶクローンにより達成され得る。
【0038】
関心対象の遺伝子を含む発現カセットの単一コピーは、本発明による所望のＨＭＯの確実な産生及び所望の作用を達成するために十分であり得る。したがって、幾つかの好ましい実施形態では、本発明は、細胞のゲノムＤＮＡ内に統合された関心対象の遺伝子の１つ、２つ又は３つのコピーを含む組み換えＨＭＯ産生細胞に関する。幾つかの実施形態では、遺伝子の単一コピーが好ましい。
【0039】
好ましい一実施形態では、本発明の核酸構築物の組み換えコーディング核酸配列は、プロモーターに関して異種であり、これは、起源の種のゲノム内の推定天然コーディング配列が別のプロモーター配列の制御下で転写されている（即ち構築物のプロモーター配列ではない）ことを意味する。さらに、宿主細胞に関して、コーディングＤＮＡは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）宿主細胞内で発現したＹｂｅｒＣタンパク質をコードするＤＮＡ配列等の異種（即ち別の生物学的種若しくは属に由来する）又は例えばコラン酸オペロン（の遺伝子、ＧＭＡＢ遺伝子等の相同（即ち宿主細胞に由来する）であり得る。
【0040】
用語「調節エレメント」、又は「プロモーター」、又は「プロモーター領域」、又は「プロモーターエレメント」は、転写の開始中にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識及び結合される核酸配列である。プロモーターは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と一緒に、所与の遺伝子又は遺伝子の群（１つのオペロン）を発現するために必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列並びに転写エンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。「転写開始部位」は、転写される第１ヌクレオチドを意味し、＋１と指定される。開始部位の下流のヌクレオチドは、＋２、＋３、＋４等とナンバリングされ、５’逆（上流）方向にあるヌクレオチドは、－１、－２、－３等とナンバリングされる。構築物のプロモーターＤＮＡ配列は、選択された種のゲノムの任意の遺伝子のプロモーター領域、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）のゲノムＤＮＡのプロモーター領域に由来し得る。したがって、ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始することができる任意のプロモーター領域ＤＮＡ配列は、本発明を実施するために好適である。原則として、構築物の関心対象の組み換え核酸の転写を制御するために、任意のプロモーターＤＮＡ配列を使用することができ、宿主細胞のゲノム内又は発現ベクターＤＮＡ内に統合された関心対象の異なる遺伝子の転写を駆動するために、異なる又は同一のプロモーター配列を使用することができる。構築物中に含まれる組み換え遺伝子を最適に発現させるために、構築物は、さらなる調節配列、例えばリボソーム結合のための配列である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇｌｐ遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に由来するＤＮＡ配列等、例えばリーディングＤＮＡ配列を含み得る。後者の配列の例は、国際公開第２０１９１２３３２４号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載され、本明細書の非限定的実施例に例示されている。
【0041】
幾つかの好ましい実施形態では、本発明の構築物中に含まれる組み換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、ｇｌｐＦＫＸオペロンプロモーター、ＰｇｌｐＦであり、他の好ましい実施形態では、プロモーターは、ｌａｃオペロンプロモーター、Ｐｌａｃである。
【0042】
さらなる態様では、本発明の構築物に含まれる組み換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、ｍｇｌＢＡＣであり；ガラクトース／メチル－ガラクトシダーゼトランスポータープロモーターＰｍｇｌＢ又は配列番号１５のＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ又は配列番号１６のＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４等のその変異体であるが、これらに限定されない。
【0043】
さらなる態様では、本発明の構築物に含まれる組み換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、ｇａｔＹＺＡＢＣＤであり；テガトース－１，６－ビスＰアルドラーゼプロモーターＰｇａｔＹ又は配列番号１７のＰｇａｔＹ＿Ｕ７０ＵＴＲ等のその変異体であるが、これらに限定されない。
【0044】
本発明の遺伝子改変細胞内及び／又は核酸構築物中に存在する好ましい調節エレメントは、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４からなる群から選択される。
【0045】
本発明の遺伝子改変細胞内及び／又は核酸構築物中に存在する特に好ましい調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ及びＰｌａｃからなる群から選択される。
【0046】
幾つかの好ましい実施形態では、本発明の構築物中に含まれる組み換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、ｇｌｐＦＫＸオペロンプロモーター、ＰｇｌｐＦであり、他の好ましい実施形態では、プロモーターは、ｌａｃオペロンプロモーター、Ｐｌａｃである。しかしながら、宿主細胞内の１種以上のＨＭＯ、例えばグルコシルトランスフェラーゼの最適レベルの生合成産生を達成するために必要又は有益な何れかである１種以上のタンパク質（又は１種以上の調節核酸）、ＨＭＯ若しくはＨＭＯ前駆体の膜貫通輸送に関係するタンパク質、遺伝子発現調節タンパク質等をコードする１種以上の組み換え核酸の転写及び／又は転写のレベルの調節を可能にし、且つ本発明による所望の作用を達成することを可能にする任意のプロモーターは、本発明を実施するために好適である。
【0047】
好ましくは、宿主細胞中で発現した、ＨＭＯ、プロモーターＤＮＡ配列及びリボソーム結合部位配列（例えば、シャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列等の他の調節配列の生合成産生に関連する遺伝子を含む本発明の構築物は、宿主細胞の懸濁液を含む１リットルの発酵培地の少なくとも０，０３ｇ／ＯＤ（光学密度）のレベル、例えばおよそ０．０５ｇ／ｌ／ＯＤ、およそ０，１ｇ／ｌ／ＯＤ以上のレベルでのＨＭＯの産生を可能にする。本発明のために、ＨＭＯ産生の後者のレベルは、「十分である」又は「最適である」と見なされ、このレベルの所望のＨＭＯを産生することができる宿主細胞は、「好適な宿主細胞」であると見なされ、即ち、細胞は、ＨＭＯ産生のために有利である本明細書に記載した少なくとも１つの作用を達成するために、ＨＭＯトランスポータータンパク質、例えば「ＹｂｅｒＣ」を発現するようにさらにさらに改変され得る。
【0048】
遺伝子改変細胞（宿主細胞又は組み換え細胞）は、例えば、細菌細胞又は酵母細胞であり得る。好ましい一実施形態では、遺伝子改変細胞は、細菌細胞である。細菌宿主細胞に関して、原則としては、制限なく、それらが関心対象の遺伝子を挿入するために遺伝子操作を許容する限り、それらは、真正細菌（グラム陽性若しくはグラム陰性）又は古細菌であり得、製造規模で培養することができる。好ましくは、宿主細胞は、高細胞密度への培養を許容する特性を有する。本発明によるＨＭＯの工業的組み換え産生のために好適である細菌宿主細胞の非限定的例は、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、シトロバクター・フロインジイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）又はキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）であり得る。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）及びバチルス・サーキュサンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）を含むバチルス属（ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌も使用することができる。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）及びラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）含むが、これらに限定されないラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌は、本発明の方法を用いて改変され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）も、本明細書に記載した本発明のための好適な細菌種である。本発明の一部としてさらに含まれるのは、エンテロコッカス属（ｇｅｎｅｒａ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）及びエンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ））、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）及びビフィドバクテリウム・ビフィズム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ））、スポロラクトバチルス種（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ミクロモモスポラ種（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、ミクロコッカス種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ロドコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）及びシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））からの、本明細書に記載したように改変された菌株である。本明細書に記載した特徴を含む細菌は、ラクトース及び細胞によって産生されたＨＭＯ等のオリゴ糖の存在下で培養され、細菌自体又は細菌の培養上清の何れかから回収される。好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。
【0049】
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセル・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルベロミセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）等である。
【0050】
本発明の組み換え細胞によって産生されるＨＭＯは、当技術分野において利用できる好適な手法を用いて精製することができる（例えば、国際公開第２０１５１８８８３４号パンフレット、同第２０１７１８２９６５号パンフレット又は同第２０１７１５２９１８号パンフレットに記載されている）。
【0051】
本発明の遺伝子改変細胞は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｓｏｎ＆Ｗａｌｋｅｒ，“Ｍａｎｉａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．による要覧に記載されたもの等、当技術分野の標準方法を用いて提供され得る。
【0052】
ＨＭＯ産生のために好適である宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子又は外因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子を含み得、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性ｌａｃＺ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ００２９６（ＧＩ：４１９０１））を含む。本発明のために、ＨＭＯ産生細胞は、任意のβ－ガラクトシダーゼ遺伝子を含むか、又はこの遺伝子の不活性化バージョンを含むかの何れかであるように遺伝子操作されている。遺伝子は、細菌ゲノム由来の対応する核酸配列の完全若しくは部分欠失によって不活性化され得るか、又は遺伝子配列は、それが転写される方法で突然変異されるか、又は転写されると、転写産物は、翻訳されないか、又はタンパク質（即ちβ－ガラクトシダーゼ）に翻訳されると、そのタンパク質は、対応する酵素活性を有していない。このように、ＨＭＯ産生細胞は、ＨＭＯの産生のために有益である増加した細胞内ラクトースプールを蓄積する。
【0053】
幾つかの実施形態では、繁殖した細胞は、欠損性シアル酸異化経路を含有する。「シアル酸代謝経路」は、シアル酸の分解を生じさせる、通常、酵素によって制御され、触媒される一連の反応を意味する。本明細書に記載した典型的なシアル酸代謝経路は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）経路である。この経路において、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ；Ｎ－アセチルノイラミン酸）は、全部がｎａｎＡＴＥＫ－ｙｈｃＨオペロンからコードされ、ＮａｎＲによって抑制される酵素のＮａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）及びＮａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）及びＮａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ）によって分解される（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／ＥＣＯＬＩ）。欠損性シアル酸代謝経路は、内因性ｎａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ０００６７．１（ＧＬ２１６５８８））及び／又はｎａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み込まれた、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（アミノ酸）ＢＡＥ７７２６５．１（ＧＬ８５６７６０１５））及び／又はｎａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ、ＧＩ：９４７７４５）内に突然変異を導入することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に提供される。任意選択的に、ｎａｎＴ（Ｎ－アセチルノイラミン酸塩トランスポーター）遺伝子も不活化又は突然変異される。シアル酸代謝作用の他の中間体としては、（ＭａｎＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸塩；（ＧｌｃＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸塩；（ＧｌｃＮ－６－Ｐ）グルコサミン－６－リン酸塩及び（Ｆｒｕｃ－６－Ｐ）フルクトース－６－リン酸塩が挙げられる。幾つかの好ましい実施形態では、ｎａｎＡは、突然変異している。他の好ましい実施形態では、ｎａｎＡ及びｎａｎＫは突然変異している一方、ｎａｎＥは、機能的なままである。別の好ましい実施形態では、ｎａｎＡ及びｎａｎＥは突然変異している一方、ｎａｎＫは、突然変異、不活化又は欠失していない。突然変異は、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴの遺伝子産物をコードする核酸配列内の１つ以上の変化である。例えば、突然変異は、核酸配列内の１個、２個、５個まで、１０個まで、２５個まで、５０個まで又は１００個までの変化であり得る。例えば、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴ遺伝子は、ヌル突然変異によって突然変異している。本明細書に記載したヌル突然変異は、酵素の機能の消失（即ち活性の減少若しくは活性なし）又は酵素の消失（即ち遺伝子産物なし）の何れかを誘発する、アミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入を含む。「欠失した」は、コーディング領域が、（機能的）遺伝子産物が産生しないように、完全に又は部分的に除去されていることを意味する。「不活化された」は、コーディング配列が、生じた遺伝子産物が機能的に不活性であるか、又は自然、天然型、内因性遺伝子産物の活性の１００％未満、例えば９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％若しくは２０％を備える遺伝子産物をコードするように変化されていることを意味する。「非突然変異」遺伝子又はタンパク質は、自然、天然型、内因性コーディング配列と１個、２個、５個まで、１０個まで、２０個まで、５０個まで、１００個まで、２００個まで若しくは５００個以上までのコドンから、又は対応するコードされたアミノ酸配列と相違しないことを意味する。
【0054】
さらに、宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））は、シアル酸合成能力も含む。例えば、この細菌は、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ２－エピメラーゼ（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２７．１；ＧＬ１５１９３２２３）若しくは均等物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ８８のｎｅｕＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＹＰ＿００２３９２９３６．１；ＧＩ：２１８５６００２３）、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２６．１；ＧＩ：１５１９３２２２）若しくは均等物（例えば、フラボバクテリウム・リムノセディミニス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｎｏｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＬ５５９２２０４２４）及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２８．１；ＧＩ：１５１９３２２４）若しくは均等物（例えば、ビブリオ・ブラシリエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）ＣＭＰ－シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＩ：４９３９３７１５３）の提供を通してシアル酸合成能力を含む。
【0055】
遺伝子操作した細菌及び酵母中での天然Ｎ－アセチルグルコサミン含有ＨＭＯの産生は、当技術分野において知られている（例えば、Ｇｅｂｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６３ ８３－９０；米国特許第１０，５１９，４７５号明細書を参照されたい）。
【0056】
例えば、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＤＦＨ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＤＦＨ－ＩＩ）及びラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）等のＮ－アセチルグルコサミン含有ＨＭＯの産生のために、この細菌は、上述したような機能性ｌａｃＹ及び機能不全性ｌａｃＺ遺伝子を含むが、これは、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子又はその機能的変異体若しくは断片を含むように遺伝子操作されている。この外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子は、多数の供給源（表１を参照されたい）の何れか１つ、例えば髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号ＡＡＦ４２２５８．１）又は淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号ＡＣＦ３１２２９．１）から記載されたｌｇｔＡ遺伝子から得ることができる。任意選択的に、追加の外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含む細菌内で共発現することができる。例えば、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（（Ｇａｌ４Ｔ）遺伝子は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子と共発現する。この外因性β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、多数の供給源の任意の１つ、例えば髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から記載された１種であるｌｇｔＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号ＡＡＦ４２２５７．１）又はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）から記載された１種であるＨＰ０８２６／ｇａｌＴ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号ＮＰ＿２０７６１９．１）から得ることができる。任意選択的に、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ３Ｔ）遺伝子を含む細菌内で共発現した追加の外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０５５：Ｈ７から記載された、ｗｂｇＯ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号ＷＰ＿０００５８２５６３．１）、Ｐ－ｌ，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、又はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのｊｈｐ０５６３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号ＡＥＺ５５６９６．１）、又はストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）からのＩｂ型ＯＩ２のｃｐｓｌＢＪ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号ＡＢ０５０７２３）である。上述した酵素の何れかの機能的変異体及び断片も、開示した本発明に含まれる。
【0057】
Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及び／又はガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子もＰｇｌｐに作動可能に連結することができ、対応するゲノム統合カセットから発現され得る。一実施形態では、ゲノム統合されている遺伝子は、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えばＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号ＮＰ＿２０７６１９．１）由来のＧａｌＴ酵素をコードするＨＰ０８２６遺伝子であり；別の実施形態では、ゲノム統合されている遺伝子は、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号ＡＡＦ４２２５８．１）由来のｌｇｔＡ遺伝子である。これらの実施形態では、第２の遺伝子、即ち対応するβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ又はガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ゲノム統合又はプラスミド性カセットの何れかから発現され得る。第２の遺伝子は、任意選択的に、ｇｌｐプロモーターの制御下又は発現系にとって好適である任意の他のプロモーター、例えばＰｌａｃの制御下の何れかで発現させることができる。
【0058】
他に規定されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）は、当業者に、本発明において使用する多数の用語の一般的辞書を提供する。本明細書に記載したものと類似の又は均等な任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用できるが、以下では、好ましい材料及び方法について記載する。本出願において必要とされる殆どの命名法及び一般的検査手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）；Ｗｉｌｓｏｎ Ｋ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ Ｊ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；又はＭａｎｉａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２０１２）；又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｈｎｓ（２０１０）に見出すことができる。これらの手引書は、以下では、それぞれ対応して「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．」、「Ｗｉｌｓｏｎ＆Ｗａｌｋｅｒ」、「Ｍａｎｉａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．」、「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．」と呼ぶ。
【0059】
本発明の第２の態様は、１種以上のＨＭＯの産生のための方法であって、
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号１のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号１と少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも８５％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞を提供する工程；
（ｉｉ）前記組み換え核酸を発現するための好適な細胞培養培地中において、（ｉ）の細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において産生された１種以上のＨＭＯを採取する工程
を含む方法に関する。
（ｉ）ＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞であって、配列番号１のタンパク質をコードする組み換え核酸又は配列番号１と少なくとも８０％同一である、好ましくは少なくとも８５％同一である、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的ホモログを含む遺伝子改変細胞を提供する工程；
（ｉｉ）前記組み換え核酸を発現するための好適な細胞培養培地中において、（ｉ）の細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において産生された１種以上のＨＭＯを採取する工程
を含む方法に関する。
【0060】
本発明によると、用語「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」（又は「培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」、又は「培養」、又は「発酵」とも呼ばれる）は、当産業において知られている方法に従った制御されたバイオリアクター内での細菌発現細胞の増殖に関する。
【0061】
１種以上のＨＭＯを産生させるために、本明細書に記載したＨＭＯ産生細菌は、当技術分野において知られている手法に従い、好適な炭素源、例えばグルコース、グリセロール、ラクトース等の存在下で培養され、産生したＨＭＯは、培養培地及び培養プロセス中に形成される微生物バイオマスから採取される。その後、ＨＭＯは、当技術分野において知られている手法、例えば国際公開第２０１５１８８８３４号パンフレット、同第２０１７１８２９６５号パンフレット又は同第２０１７１５２９１８号パンフレットに記載されている等の手法に従って精製され、精製されたＨＭＯは、その後、栄養補助食品、医薬品として又は例えば研究用等の任意の他の目的に使用される。ＨＭＯの製造は、典型的には、大量で培養を実施することによって実施される。本発明の意味における用語「製造する工程」及び「製造規模」は、最小体積が５Ｌの培養ブロスを用いた発酵を規定する。通常、「製造規模」プロセスは、関心対象の１種以上のＨＭＯを含有する大量の調製を処理でき、例えば治療用化合物又は組成物の場合、臨床試験並びに市場供給の需要を満たす量の対象のタンパク質を産生することができることによって規定される。大量に加えて、製造規模の方法は、振とうフラスコによる培養のような単純な検査室規模の方法とは対照的に、撹拌、通気、栄養素供給、プロセスパラメーター（ｐＨ、温度、溶存酸素圧、背圧等）のモニタリング及び制御のための機器を装備しているバイオリアクター（発酵槽）の技術システムの使用を特徴とする。大体において、例えば、本開示の実施例において記載した振とうフラスコ、卓上バイオリアクター又はディープウエルフォーマット等の検査室規模の方法における発現系の挙動は、バイオリアクターの複雑な環境におけるそのシステムの挙動の予測することを許容する。
【0062】
発酵プロセスにおいて使用される好適な培養培地に関しては、制限がない。培養培地は、半規定、即ち複雑な培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸等）であり得るか、又は何の複雑な化合物も含めずに化学的に規定され得る。
【0063】
用語「１種以上のＨＭＯ」は、ＨＭＯ産生細胞が単一のＨＭＯ構造（第１のＨＭＯ）又は複数のＨＭＯ構造（第２、第３等のＨＭＯ）を産生することができる可能性があることを意味する。幾つかの実施形態では、単一のＨＭＯを産生する宿主細胞が好ましい可能性があり、他の好ましい実施形態では、複数のＨＭＯ構造を産生する宿主細胞が好ましい可能性がある。単一のＨＭＯ構造を産生する宿主細胞についての非限定的例は、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ又はＬＮＴ－２産生細胞である。複数のＨＭＯ構造を産生することができる宿主細胞の非限定的例は、ＦＳＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰ Ｉ、ＬＮＦＰ ＩＩ、ＬＮＦＰ ＩＩＩ、ＬＮＦＰ ＩＶ、ＬＮＦＰ Ｖ、ｐＬＮｎＨ、ｐＬＮＨ－ＩＩ産生細胞であり得る。
【0064】
本発明に関連して、用語「採取する」は、発酵の終了に続いて産生したＨＭＯを収集することに関する。異なる実施形態では、それは、バイオマス（即ち宿主細胞）及び培養培地の両方に含まれる、即ちバイオマスからの発酵ブロスの分離前に／分離せずにＨＭＯを収集することを含み得る。他の実施形態では、産生したＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスから個別に、即ち培養培地（即ち発酵ブロス）からの分離後／分離に続いて収集され得る。培地からの細胞の分離は、当業者に周知の方法、例えば任意の好適なタイプの遠心又は濾過の何れかを用いて実施することができる。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスの採取直後に実施することができるか、又は適切な条件で発酵ブロスを貯蔵した後の段階に実施することができる。残留しているバイオマス（又は全発酵）からの産生したＨＭＯの回収には、バイオマス（即ち産生細胞）からの抽出が含まれる。これは、当技術分野の任意の好適な方法により、例えば音波処理、沸騰、均質化、リゾチームを用いる酵素的溶解又は凍結及び破砕により実施することができる。
【0065】
発酵からの回収後、ＨＭＯは、さらなる加工処理及び精製のために利用できる。
【0066】
発酵によって産生したＨＭＯの精製は、国際公開第２０１６０９５９２４号パンフレット、同第２０１５１８８８３４号パンフレット、同第２０１７１５２９１８号パンフレット、同第２０１７１８２９６５号パンフレット、同第２０１９０１１９３１４号パンフレット（全部が参照により組み込まれる）に記載された好適な手法を用いて実施することができる。
【0067】
本発明の幾つかの実施形態では、宿主細胞は、数種のＨＭＯを産生することができ、ここで、１種のＨＭＯは、「生成物」ＨＭＯであり、幾つか／全部の他のＨＭＯは、「副生成物」ＨＭＯである。典型的には、副生成物ＨＭＯは、主要ＨＭＯの前駆体又は主要ＨＭＯのさらなる改変の生成物の何れかである。幾つかの実施形態では、富裕な量で生成物ＨＭＯを、且つ少量で副生成物ＨＭＯを産生することが望ましい。本明細書に記載したＨＭＯ産生のための細胞及び方法は、規定のＨＭＯプロファイルを備えるＨＭＯ生成物の制御された産生、例えば、一実施形態では、生成物ＨＭＯは、混合物の他のＨＭＯ（即ち副生成物ＨＭＯ）と比較して優勢なＨＭＯであるＨＭＯ混合物の産生を許容し、即ち、生成物ＨＭＯは、他の副生成物ＨＭＯより多量で産生し；他の実施形態では、同一ＨＭＯ混合物を産生する細胞は、生成物ＨＭＯより多量である１つ又は複数の副生成物ＨＭＯを産生するように調整することができる。例えば、生成物ＨＭＯであるＬＮｎＴの産生中、副生成物ＨＭＯ、多くの場合に有意な量のｐＬＮｎＨが産生する。本発明の遺伝子改変細胞について、ＬＮｎＴ生成物中のｐＬＮｎＨのレベルは、有意に減少させることができる。
【0068】
有利には、本発明は、副生成物対生成物の減少した比率及び生成物（及び／又は総計でのＨＭＯ）の増加した全収率の両方を提供する。この生成物形成と比較して少ない副生成物形成は、生成物産生の増加を促進し、産生及び生成物回収プロセスの両方の効率を上昇させ、ＨＭＯの優れた製造手法を提供する。
【0069】
異なる好ましい実施形態では、生成物ＨＭＯ又は副生成物ＨＭＯとして、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＬＮＴ－２、ＦＳＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＤＦＬ、ＦＳＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰ Ｉ、ＬＮＦＰ ＩＩ、ＬＮＦＰ ＩＩＩ、ＬＮＦＰ ＩＶ、ＬＮＦＰ Ｖ、ｐＬＮｎＨ、ｐＬＮＨ－ＩＩの何れか／両方を産生する様々な宿主細胞を選択することができる。好ましい一実施形態では、生成物は、ＬＮＴ－２であり、副生成物は、ｐＬＮｎＨである。別の好ましい実施形態では、生成物は、ＬＮｎＴであり、副生成物は、ｐＬＮｎＨである。別の好ましい実施形態では、生成物は、ＬＮＴであり、副生成物は、ｐＬＮＨ－ＩＩである。別の好ましい実施形態では、生成物は、ＬＮＴ２であり、副生成物は、ｐＬＮＨ－ＩＩである。
【0070】
本発明は、１種以上のオリゴ糖、好ましくは１種以上のヒトミルクオリゴ糖の産生のための、本発明による遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物の使用にさらに関する。
【0071】
一実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物は、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ ＩＶ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）並びにパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）からなる群から選択される特異的ＨＭＯの産生に使用される。
【0072】
好ましい実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物は、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＶ（ＬＮＦＰ ＩＶ）及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ Ｖ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）並びにパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）からなる群から選択される特異的ＨＭＯの産生に使用される。
【0073】
さらに好ましい実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物は、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）及びパラ－ラクト－ネオヘキサオースＩＩ（ｐＬＮＨ－ＩＩ）からなる群から選択されるＨＭＯの産生に使用される。
【0074】
特に好ましい実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞及び／又は核酸構築物は、ラクト－Ｎ－トリオース－２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）及びラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）からなる群から選択される特異的ＨＭＯの産生に使用される。
【0075】
以下では、本発明を非限定的実施例及び実施形態によってさらに例示する。
【0076】
［実施例］
［材料及び方法］
他に明記しない限り、分子生物学の分野において知られている標準的な技術、ベクター、制御配列エレメント及び他の発現系エレメントは、核酸の操作、形質転換及び発現のために使用される。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２．）（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に見出すことができる。
［材料及び方法］
他に明記しない限り、分子生物学の分野において知られている標準的な技術、ベクター、制御配列エレメント及び他の発現系エレメントは、核酸の操作、形質転換及び発現のために使用される。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２．）（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に見出すことができる。
【0077】
以下に記載する実施形態は、本発明を例示するために選択されたものであり、決して本発明を限定するものではない。
【0078】
［菌株］
使用した細菌株であるＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＤＨ１の遺伝子型は、Ｆ－、人－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。本実施例で利用した菌株は、表２に記載した。
使用した細菌株であるＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＤＨ１の遺伝子型は、Ｆ－、人－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。本実施例で利用した菌株は、表２に記載した。
【0079】
【表4】
【0080】
［培地］
ルリアブロス（ＬＢ）培地は、ＬＢブロス粉末、Ｍｉｌｌｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて作成し、ＬＢ寒天プレートは、ＬＢ寒天粉末、Ｍｉｌｌｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて作成した。適切な場合、アンピシリン（（１００μｇ／ｍＬ）若しくは任意の適切な抗生物質）及び／又はクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を添加した。
ルリアブロス（ＬＢ）培地は、ＬＢブロス粉末、Ｍｉｌｌｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて作成し、ＬＢ寒天プレートは、ＬＢ寒天粉末、Ｍｉｌｌｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて作成した。適切な場合、アンピシリン（（１００μｇ／ｍＬ）若しくは任意の適切な抗生物質）及び／又はクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を添加した。
【0081】
基礎最少培地は、以下の組成を有していた：ＮａＯＨ（１ｇ／Ｌ）、ＫＯＨ（２．５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（７ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（７ｇ／Ｌ）、クエン酸（０．５ｇ／ｌ）、微量ミネラル溶液（５ｍＬ／Ｌ）。微量ミネラルストック液は、ＺｎＳＯ４
＊７Ｈ２Ｏ ０．８２ｇ／Ｌ、クエン酸 ２０ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４
＊Ｈ２Ｏ ０．９８ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４
＊７Ｈ２Ｏ ３．９２５ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４
＊５Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌを含有していた。基礎最少培地のｐＨは、５ＮのＮａＯＨを用いて７．０に調整し、オートクレーブにかけた。接種前に、基礎最少培地に１ｍＭのＭｇＳＯ４、４μｇ／ｍｌのチアミン、０．５％の所与の炭素源（グリセロール（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ））を供給し、適切な場合、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（０．２ｍＭ）を添加した。チアミン、抗生物質及びＩＰＴＧは、濾過により滅菌した。全てのパーセンテージでの濃度は、グリセロールについて体積／体積として、グルコースについて重量／体積として表示した。
【0082】
２－デオキシ－ガラクトースを含有するＭ９プレートは、以下の組成を有していた：１５ｇ／Ｌの寒天（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２．２６ｇ／Ｌの５×Ｍ９最小塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、４μｇ／ｍＬのチアミン、０．２％のグリセロール及び０．２％の２－デオキシ－Ｄ－ガラクトース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）。
【0083】
ＭａｃＣｏｎｋｅｙインジケータープレートは、以下の組成を有していた：４０ｇ／ＬのＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天ベース（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））及び最終濃度１％の炭素源。
【0084】
［培養］
他に明記しない限り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株は、０．２％のグルコースを含有する３７℃のルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地中で撹拌しながら増殖させた。寒天プレートは、３７℃で一晩インキュベートした。
他に明記しない限り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株は、０．２％のグルコースを含有する３７℃のルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地中で撹拌しながら増殖させた。寒天プレートは、３７℃で一晩インキュベートした。
【0085】
［化学的コンピテント細胞及び形質転換］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ＬＢプレートから、ＯＤ６００が約０．４になるまで３７℃で振とうしながら、０．２％のグルコースを含有する５ｍＬのＬＢ内で接種した。１３０００ｇで２５秒間にわたる遠心分離により、２ｍＬの培養を採取した。上清を除去し、細胞ペレットを６００μＬの低温ＴＢ溶液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１５ｍＭのＣａＣｌ２、２５０ｍＭのＫＣｌ）に再懸濁させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートし、その後、１３０００ｇで１５秒間、ペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを１００μＬの低温ＴＢ溶液に再懸濁させた。プラスミドの形質転換は、１００μＬのコンピテント細胞及び１～１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて実施した。細胞及びＤＮＡは、氷上で２０分間インキュベートし、その後、４２℃で４５秒間、熱ショックを与えた。氷上での２分間のインキュベーション後、４００μＬのＳＯＣ（２０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１８６ｇ／ＬのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４及び２０ｍＭのグルコース）を添加し、細胞培養を１時間にわたり振とうしながら３７℃でインキュベートし、その後、選択プレート上にプレーティングした。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ＬＢプレートから、ＯＤ６００が約０．４になるまで３７℃で振とうしながら、０．２％のグルコースを含有する５ｍＬのＬＢ内で接種した。１３０００ｇで２５秒間にわたる遠心分離により、２ｍＬの培養を採取した。上清を除去し、細胞ペレットを６００μＬの低温ＴＢ溶液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１５ｍＭのＣａＣｌ２、２５０ｍＭのＫＣｌ）に再懸濁させた。細胞を氷上で２０分間インキュベートし、その後、１３０００ｇで１５秒間、ペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを１００μＬの低温ＴＢ溶液に再懸濁させた。プラスミドの形質転換は、１００μＬのコンピテント細胞及び１～１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて実施した。細胞及びＤＮＡは、氷上で２０分間インキュベートし、その後、４２℃で４５秒間、熱ショックを与えた。氷上での２分間のインキュベーション後、４００μＬのＳＯＣ（２０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１８６ｇ／ＬのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４及び２０ｍＭのグルコース）を添加し、細胞培養を１時間にわたり振とうしながら３７℃でインキュベートし、その後、選択プレート上にプレーティングした。
【0086】
プラスミドは、供給業者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって推奨された条件において、ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞に形質転換させた。
【0087】
［ＤＮＡ技術］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の染色体ＤＮＡは、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＵホットスタートＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）は、供給業者によって推奨されたとおりに使用した。プライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙによって供給された。ＰＣＲ断片及びプラスミドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによってシーケンシングされた。コロニーＰＣＲは、Ｔ１００（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）内のＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックスを用いて実施した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の染色体ＤＮＡは、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＵホットスタートＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）は、供給業者によって推奨されたとおりに使用した。プライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙによって供給された。ＰＣＲ断片及びプラスミドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによってシーケンシングされた。コロニーＰＣＲは、Ｔ１００（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）内のＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックスを用いて実施した。
【0088】
【表5】
【0089】
【表6】
【0090】
【表7】
【0091】
［プラスミドの構築］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への相同組み換えのために適切な２個のＤＮＡ断片によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＴ１転写終結配列を含有するプラスミド主鎖を合成した。例えば、１本のプラスミド主鎖では、ｇａｌオペロン（ｇａｌＫにおける相同組み換えのために必要とされる）及びＴ１転写終結配列（ｐＵＣ５７：：ｇａｌ）を合成した（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）。ｇａｌオペロン内の相同組み換えのために使用されるＤＮＡ配列は、配列の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１５５完全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＩＤ：ＣＰ０１４２２５．１）内で塩基対３．６２８．６２１～３．６２８．７２０及び３．６２７．５７２～３．６２７．６７１をカバーした。相同組み換えによる挿入は、ｇａｌＫ及びｇａｌＫ－表現型の９４９塩基対の欠失を生じさせるであろう。同様の方法で、ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）に基づく主鎖又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への相同組み換えのために適切な２個のＤＮＡ断片によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＴ１転写終結配列を含有する任意の他の適切なベクターを合成することができるであろう。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１染色体ＤＮＡの特異的ＤＮＡ配列のプライマーの設計及び増幅のために、分子生物学の分野において周知の標準技術を使用した。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）に見出すことができる。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への相同組み換えのために適切な２個のＤＮＡ断片によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＴ１転写終結配列を含有するプラスミド主鎖を合成した。例えば、１本のプラスミド主鎖では、ｇａｌオペロン（ｇａｌＫにおける相同組み換えのために必要とされる）及びＴ１転写終結配列（ｐＵＣ５７：：ｇａｌ）を合成した（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）。ｇａｌオペロン内の相同組み換えのために使用されるＤＮＡ配列は、配列の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１５５完全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＩＤ：ＣＰ０１４２２５．１）内で塩基対３．６２８．６２１～３．６２８．７２０及び３．６２７．５７２～３．６２７．６７１をカバーした。相同組み換えによる挿入は、ｇａｌＫ及びｇａｌＫ－表現型の９４９塩基対の欠失を生じさせるであろう。同様の方法で、ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）に基づく主鎖又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム内への相同組み換えのために適切な２個のＤＮＡ断片によって分離された２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位及びＴ１転写終結配列を含有する任意の他の適切なベクターを合成することができるであろう。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１染色体ＤＮＡの特異的ＤＮＡ配列のプライマーの設計及び増幅のために、分子生物学の分野において周知の標準技術を使用した。そのような標準的な技術、ベクター及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）に見出すことができる。
【0092】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１から得られた染色体ＤＮＡを使用して、オリゴＯ２６１及びＯ２６２を用いてプロモーターＰｇｌｐＦを含有する３００ｂｐのＤＮＡ断片並びにオリゴＯ６８及びＯ１１３を用いてＰｌａｃを含有する１９５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させた（表３）。
【0093】
エルニシア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）に由来するｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子のコドン最適化バージョンを含有する１．１８２ｂｐのＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成した（表５）。ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子は、オリゴであるＫＡＢＹ７２１及びＫＡＢＹ７２２遺伝子を用いてＰＣＲによって増幅させた。
【0094】
全てのＰＣＲ断片（プラスミド主鎖、エレメントを含有するプロモーター及びｖａｇ遺伝子）を精製し、プラスミド主鎖、プロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ又はＰｌａｃ）及びＤＮＡ断片を含有するｖａｇを組み立てた。プラスミドは、標準ＵＳＥＲクローニングによってクローン化した。任意の適切なプラスミドにおけるクローニングは、任意の標準のＤＮＡクローニング技術を用いて実施することができるであろう。プラスミドは、ＴＯＰ１０細胞内に形質転換させ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（又は任意の適切な抗生物質）及び０．２％のグルコースを含有するＬＢプレート上で選択した。構築したプラスミドを精製し、プロモーター配列及びＹｂｅｒＣ遺伝子の５’末端は、ＤＮＡシーケンシング（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって検証した。この方法で、ＹｂｅｒＣ遺伝子に結合した関心対象の任意のプロモーターを含有する遺伝子カセットを構築した。
【0095】
【表8】
【0096】
関心対象のトランスポーター又はグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子のＤＮＡ配列は、コドン最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成した。トランスポータータンパク質であるＹｂｅｒＣをコードする関心対象の遺伝子（表４）は、遺伝子の開始コドンであるＡＴＧ及び停止コドンであるＴＡＡ（表３）をカバーする適切なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅させた。関心対象の任意の異種遺伝子を備えるドナープラスミドを構築するために、関連プラスミド主鎖の精製ＰＣＲ断片、プロモーターエレメント及び関心対象の遺伝子を結合するために標準ＵＳＥＲクローニングを利用した。適切なプラスミドにおけるクローニングは、任意の標準ＤＮＡクローニング技術を用いて実施することができた。クローニング後、ＤＮＡは、ＴＯＰ１０細胞内に形質転換させ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（又は適用された主鎖に依存して５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシン）及び０．２％のグルコースを含有するＬＢプレート上で選択した。構築したプラスミドを精製し、関心対象の遺伝子のプロモーター配列及び５’末端をＤＮＡシーケンシング（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって検証した。
【0097】
［菌株の構築］
使用した細菌株であるＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１の遺伝子型は、Ｆ－、人－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１に加えて、遺伝子型ＭＤＯは、以下の改変：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失及びｇｍｄ遺伝子の上流のＰｌａｃプロモーターの挿入を有する。
使用した細菌株であるＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１の遺伝子型は、Ｆ－、人－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１に加えて、遺伝子型ＭＤＯは、以下の改変：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失及びｇｍｄ遺伝子の上流のＰｌａｃプロモーターの挿入を有する。
【0098】
ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子及びＴ１転写終結配列に結合したプロモーターを含有する発現カセットの挿入は、Ｈｅｒｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅｒｒｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．，Ｇｌａｓｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ，Ｆ．Ｒ．（２００３）Ｇｅｎｅ（３１１）．１５３－１６３）によって記載されたように、本質的には、遺伝子ゴージング（Ｇｅｎｅ Ｇｏｒｇｉｎｇ）によって実施し、本出願に提示した菌株を構築するために使用したヘルパー及びドナープラスミドの例は、表６に提供した。手短には、ドナープラスミド及びヘルパープラスミドは、ＭＤＯに共形質転換させ、０．２％のグルコース、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）又はカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレート上で選択した。単一コロニーは、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）及び１０μＬの２０％のＬ－アラビノースを含有する１ｍＬのＬＢ中に接種し、７～８時間にわたり振とうしながら３７℃でインキュベートした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のｇａｌＫ遺伝子座内へ統合するために、次にＭ９－ＤＯＧプレート上にプレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートした。ＭＭ－ＤＯＧプレート上に形成された単一コロニーは、０．２％のグルコースを含有するＬＢプレート上で再画線化し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＭａｃＣｏｎｋｅｙ－ガラクトース寒天プレート上で白く出現し、アンピシリン及びクロラムフェニコールの両方に感受性であったコロニーは、ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを消失しており、ｇａｌＫ遺伝子座での挿入を含有すると予測された。ｇａｌＫ部位での挿入は、プライマーＯ４８（配列番号１３）及びＯ４９（配列番号１４）を用いるコロニーＰＣＲによって同定し、挿入されたＤＮＡは、シーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検証した。
【0099】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体ＤＮＡ内の他の遺伝子座での遺伝子カセットの挿入は、異なる選択マーカー遺伝子を用いて類似の方法で実施した。
【0100】
［ディープウェルアッセイ（ＤＷＡ）］
ＤＷＡは、最初にＬｖ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ（２０１６）３９：１７３７－１７４７）によって記載され、本発明の目的に合わせて最適化して実施した。
ＤＷＡは、最初にＬｖ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ（２０１６）３９：１７３７－１７４７）によって記載され、本発明の目的に合わせて最適化して実施した。
【0101】
より詳細には、実施例に開示した菌株は、４日間プロトコルを用いて２４ディープウェルプレート内でスクリーニングした。最初の２４時間中に細胞を高密度に増殖させる一方、次の７２時間では、細胞を遺伝子発現の誘導及び生成物形成を許容する培地に移した。詳細には、１日間中に、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースが補給された基礎最少培地を用いて新鮮接種材料を調製した。７００ｒｐｍで振とうしながら３４℃で調製した培養を２４時間培養した後、細胞は、硫酸マグネシウム及びチアミンを補給した新規な基礎最少培地（２ｍｌ）へ移し、そこに２０％のグルコース溶液（１μｌ）及び１０％のラクトース溶液（０．１ｍｌ）の初期ボーラスを添加し、次に炭素源としての５０％のスクロース溶液を細胞に提供した。新規培地の接種後、細胞は、７２時間にわたり２８℃、７００ｒｐｍで振とうした。変性及びその後の遠心分離後、上清をＨＰＬＣによって分析した。
【0102】
試料全体の分析のために、沸騰によって調製した細胞溶解液は、４．７００ｒｐｍで１０分間にわたる遠心分離によってペレット化した。上清中のＨＭＯ濃度は、ＨＰＬＣ又はＨＰＡＣ法によって決定した。
【0103】
［結果］
［実施例１．ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子を用いるＬＮＴ－２産生のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の遺伝子操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＫ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株ＭＰ３９４１は、表１の非限定的実施例から遺伝子選択されたβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、例えば、ｌｇｔＡを最適に過剰発現するＬＮＴ－２産生菌株である。
［実施例１．ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子を用いるＬＮＴ－２産生のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の遺伝子操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＫ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株ＭＰ３９４１は、表１の非限定的実施例から遺伝子選択されたβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、例えば、ｌｇｔＡを最適に過剰発現するＬＮＴ－２産生菌株である。
【0104】
試料全体の分析（図３）は、ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子に結合したプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ）を含有する発現カセットが菌株ＭＰ３９４０を生成するために単一コピー内で菌株ＭＰ３９４１の染色体ＤＮＡに統合されるとＬＮＴ－２力価が顕著に改良され得ることを証明した（表２）。興味深いことに、ＬＮＴ－２の細胞外画分も、菌株ＭＰ３９４１についてよりも菌株ＭＰ３９４０についてのほうがはるかに大きく、これは、菌株ＭＰ３９４１を発現する非トランスポーターにおける対応するベルと比較してｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０－発現菌株ＭＰ３９４０のペレット画分において検出されるより低い三糖レベルにおいても反映されている事実である（図１）。
【0105】
［実施例２．ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子を用いるＬＮｎＴ産生のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の遺伝子操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＫ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株ＭＰ４４３６は、表１の非限定的例から選択されるβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及びβ－１，３－ガラクトース遺伝子を最適レベルで過剰発現するＬＮｎＴ産生菌株、例えば、ｌｇｔＡ及びｇａｌＴである。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＫ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株ＭＰ４４３６は、表１の非限定的例から選択されるβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及びβ－１，３－ガラクトース遺伝子を最適レベルで過剰発現するＬＮｎＴ産生菌株、例えば、ｌｇｔＡ及びｇａｌＴである。
【0106】
試料全体のＨＰＬＣ分析から証明されたように、菌株ＭＰ３８６３を生成するためのｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子に結合したプロモーターエレメントＰｌａｃを含有する発現カセットの単一コピーの菌株ＭＰ４４３６の染色体ＤＮＡ内への挿入（表２）は、ｉ）より低い全ＬＮｎＴ力価、ｉｉ）わずかに高い全ＬＮＴ－２濃度、及びｉｉｉ）はるかに低い全ｐＬＮｎＨ形成を生じさせた（図２）。
【0107】
ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０－発現菌株ＭＰ３８６３における全ＬＮｎＴ力価は、参照菌株ＭＰ４４３６と比較して改良されてはいないが、細胞外ＬＮｎＴ画分が顕著に増加していることは、上清試料の分析から明白である。同様の観察は、ＭＰ３８６３培養における培地中のＬＮＴ－２の濃度についても当てはまり、ここで、ＬＮＴ－２画分は、菌株ＭＰ４４３６についての対応する画分と比較して少なくとも２倍増加している（図２）。後者の観察は、前駆体糖分子ＬＮＴ－２がＹｂｅｒＣ０００１＿９４２０トランスポーターの存在下で細胞からより効率的に輸送されるため、菌株ＭＰ４４３６と比較して菌株ＭＰ３８６３を用いて達成されるより低いＬＮｎＴ力価をより容易に説明することができるであろう。したがって、ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０－発現菌株ＭＰ３８６３のペレット試料内のＬＮｎＴ及びＬＮＴ－２の濃度は、顕著に減少する。上述したように、ｐＬＮｎＨの形成は、菌株ＭＰ４４３６と比較して菌株ＭＰ３８６３内では大きく減少する。興味深いことに、ｐＬＮｎＨは、菌株ＭＰ３８６３の細胞ペレット内でのみ見出されると思われるため、したがって、任意の特定の理論によって拘束されなくとも、ＹｂｅｒＣ０００１＿９４２０トランスポーターのための基質であるとは思われない（図２）。
【0108】
［実施例３．ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子を用いるＬＮＴ産生のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の遺伝子操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＫ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株ＭＰ４４７３は、表１の非限定的例から選択されるβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及びβ－１，３－ガラクトース遺伝子を最適レベルで発現するＬＮＴ産生菌株、例えば、ｌｇｔＡ及びｇａｌＴである。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＫ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ菌株は、関心対象の異種遺伝子を発現するように操作することができる。例えば、菌株ＭＰ４４７３は、表１の非限定的例から選択されるβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及びβ－１，３－ガラクトース遺伝子を最適レベルで発現するＬＮＴ産生菌株、例えば、ｌｇｔＡ及びｇａｌＴである。
【0109】
菌株ＭＰ４４６２を生成するために単一コピーで菌株ＭＰ４４７３の染色体ＤＮＡ内へのｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子に結合したプロモーターエレメントＰｌａｃを含有する発現カセットの挿入（表２）は、全ＨＭＯ力価並びに細胞培養の上清及びペレット画分間のＨＭＯ分布に強力な影響を及ぼした（図３）。
【0110】
試料全体の分析から証明されたように、ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子のＰｌａｃ駆動発現は、全ＬＮＴ力価に劇的なプラスの効果を及ぼし、これには全ＬＮＴ－２の力価の２倍を超える増加及び全ｐＬＮＨ－ＩＩ形成における顕著な減少が付随した。
【0111】
最適なグリコシルトランスフェラーゼ発現を備えるＬＮＴ産生菌株の遺伝的背景において、中等度の強度の発現エレメント、例えば、Ｐｌａｃの制御下でｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０遺伝子を導入することの有意な影響は、上清試料の分析に注目することによってさらに強調されている。菌株ＭＰ４４６２の培養の上清画分におけるＬＮＴ濃度は、ＭＰ４４７３培養の培地中で測定されたＬＮＴ濃度と比較して大きく増加する（図３）。参照菌株ＭＰ４４７３と比較して、トランスポーター発現菌株ＭＰ４４６２において観察されたより高い全ＬＮＴ－２力価と一致して、前者の菌株の上清試料中のＬＮＴ－２濃度は、後者の菌株におけるより少なくとも２倍高い。したがって、ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０－発現菌株ＭＰ４４６２のペレット内のＬＮＴの濃度は顕著に低下したが、ＬＮＴ－２の濃度は、低下しなかった。上述したように、ｐＬＮＨ－ＩＩの形成は、菌株ＭＰ４４６２において大きく減少している。興味深いことに、ｐＬＮＨ－ＩＩは、菌株ＭＰ４４６２の細胞ペレット内でのみ見出されると思われるため、したがって、任意の特定の理論によって拘束されなくとも、ＹｂｅｒＣ０００１＿９４２０トランスポーターのための基質であるとは思われない（図３）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】