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特表2023-511525ＨＭＯ生産における新しい主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）タンパク質（Ｆｒｅｄ）
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-20
(54)【発明の名称】ＨＭＯ生産における新しい主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）タンパク質（Ｆｒｅｄ）
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20230313BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230313BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230313BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230313BHJP
C12P 19/04 20060101ALI20230313BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C12N1/21 ZNA
C12N15/113 Z
C12P21/02 C
C12P19/04 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022540718
(86)(22)【出願日】2021-01-22
(85)【翻訳文提出日】2022-08-30
(86)【国際出願番号】 EP2021051479
(87)【国際公開番号】W WO2021148620
(87)【国際公開日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】PA202000087
(32)【優先日】2020-01-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508278309
【氏名又は名称】グリコム・アクティーゼルスカブ
【氏名又は名称原語表記】Ｇｌｙｃｏｍ Ａ／Ｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(72)【発明者】
【氏名】ペダーセン， マルギット
(72)【発明者】
【氏名】ダリゴ， イソッタ
(72)【発明者】
【氏名】カンプマン， カトリーヌ， ビッチ
(72)【発明者】
【氏名】パパダキス， マノス
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF04
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B065AA26X
(57)【要約】
本発明は、遺伝子改変細胞における生物学的分子の組換え生産の分野に関する。より具体的には、それは、主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を使用する母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の組換え生産のための方法に関連し、発現されるタンパク質はＦｒｅｄである。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生できる遺伝子改変細胞であって、前記遺伝子改変細胞が、配列番号１で示される主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチドをコード化する異種核酸配列、又はアミノ酸配列が配列番号１と９５．４％を超えて同一であるその機能的相同体を含んでなる、遺伝子改変細胞。
【請求項2】
前記機能的相同体が、配列番号１と少なくとも９６％同一である、請求項１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項3】
前記細胞が、前記異種核酸配列の発現を調節するための調節エレメントを含んでなる核酸配列をさらに含んでなる、請求項１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項4】
前記調節エレメントが、前記配列番号１で示されるＭＦＳポリペプチド、又はそのアミノ酸配列が配列番号１と９５．４％を超えて同一であるその機能的相同体の発現を調節する、請求項３に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項5】
前記調節エレメントが、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７からなる群から選択される、請求項３又は４に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項6】
前記遺伝子改変細胞が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項7】
前記母乳オリゴ糖が、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、及びラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項8】
配列番号１に記載のＭＦＳポリペプチドをコード化する核酸配列を含んでなる核酸コンストラクト、又は配列番号１に対して９５．４％を超える配列同一性を有するその機能的相同体であって、前記ＭＦＳポリペプチドをコード化する核酸配列が、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、核酸コンストラクト又はその機能的相同体。
【請求項9】
前記コンストラクトが、調節エレメントを含んでなる核酸配列をさらに含んでなる、請求項８に記載の核酸コンストラクト。
【請求項10】
前記調節エレメントが、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列の発現を調節する、請求項９に記載の核酸コンストラクト。
【請求項11】
前記調節エレメントが、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項12】
（ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞を提供するステップと；（ｉｉ）（ｉ）に記載の遺伝子改変細胞を適切な細胞培養培地中で培養し、流出糖を輸送でき、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生する前記ポリペプチドを発現させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で生産された１つ又は複数のＨＭＯを収穫するステップと
を含んでなる、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生合成生産するための方法。
【請求項13】
１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生合成生産するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞、又は請求項８～１１のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトの使用。
【請求項14】
２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＤＦＬ、及びＬＮＴからなる群から選択される特定のＨＭＯを生合成生産するための、請求項１３に記載の遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［分野］
本発明は、遺伝子改変細胞における生物学的分子の組換え生産の分野に関する。より具体的には、それは、主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を使用する母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の組換え生産のための方法に関連し、発現されるタンパク質はＦｒｅｄである。
本発明は、遺伝子改変細胞における生物学的分子の組換え生産の分野に関する。より具体的には、それは、主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）のタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を使用する母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の組換え生産のための方法に関連し、発現されるタンパク質はＦｒｅｄである。
【0002】
［背景］
母乳は、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル、及び微量元素の複雑な混合物に相当する。圧倒的に優勢な画分は炭水化物に相当し、さらにラクトース及びより複雑なオリゴ糖（母乳オリゴ糖、ＨＭＯ）に分けられる。ラクトースはエネルギー源として使用されるが、複雑なオリゴ糖は乳児によって代謝されない。複雑なオリゴ糖の画分は、総炭水化物画分の最大１／１０を占め、おそらく１５０を超える異なるオリゴ糖からなる。これらの複雑なオリゴ糖の発生と濃度はヒトに固有であり、したがって例えば畜産動物などのその他の哺乳動物のミルクには大量に見られない。
母乳は、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラル、及び微量元素の複雑な混合物に相当する。圧倒的に優勢な画分は炭水化物に相当し、さらにラクトース及びより複雑なオリゴ糖（母乳オリゴ糖、ＨＭＯ）に分けられる。ラクトースはエネルギー源として使用されるが、複雑なオリゴ糖は乳児によって代謝されない。複雑なオリゴ糖の画分は、総炭水化物画分の最大１／１０を占め、おそらく１５０を超える異なるオリゴ糖からなる。これらの複雑なオリゴ糖の発生と濃度はヒトに固有であり、したがって例えば畜産動物などのその他の哺乳動物のミルクには大量に見られない。
【0003】
現在までに、少なくとも１１５のＨＭＯの構造が決定されており（Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１１，ＩＳＢＮ：９７８－１－６１１２２－８３１－１を参照されたい）、ヒトの母乳にはかなりより多く含まれていると思われる（Ｋｕｎｚ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｆｏｏｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ５－２０，Ｅｄｓ．Ｍｏｒｅｎｏ Ｊ．ａｎｄ Ｌｕｚ Ｓａｎｚ Ｍ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ）。
【0004】
ＨＭＯは、ヒトの発達における重要な機能性が発見されたことにより、過去１０年で大きな関心を集めている。それらのプレバイオティクス特性に加えて、ＨＭＯはそれらの適用分野を拡大する、追加的なプラス効果に関連付けられている（Ｋｕｎｚ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｆｏｏｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ５－２０，Ｅｄｓ．Ｍｏｒｅｎｏ Ｊ．ａｎｄ Ｌｕｚ Ｓａｎｚ Ｍ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ）。ＨＭＯの健康上の利点により、乳児用調製粉乳及び乳児用食品などの食品、及び消費者向け健康製品での使用が承認されている。
【0005】
ＨＭＯの入手可能性は限られているため、効率的な商業的生産、すなわち大規模生産が非常に望ましい。いくつかのＨＭＯ化合物への化学的経路が開発されている。しかしながら、化学合成、酵素合成又は発酵によるＨＭＯの生産は困難であることが判明している。食品及び医療用途に必要な量並びに品質を化学合成で大量に製造することは、まだ提供されていない。さらに、ＨＭＯへの化学合成経路は、最終生成物に汚染リスクを課すいくつかの有害化学物質を伴う。
【0006】
ＨＭＯの化学合成に関連する欠点を回避するために、いくつかの酵素的方法と発酵的アプローチが開発されている。発酵ベースのプロセスが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、３’－シアリルラクトース、及び６’－シアリルラクトースなどのいくつかのＨＭＯのために開発されている。発酵ベースのプロセスは、典型的には、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの遺伝子改変細菌株を利用する。
【0007】
ＨＭＯの発酵プロセスなどの生物工学的生産は、ＨＭＯ製造にとって価値があり、費用効果が高い、大規模なアプローチである。それは、所望のオリゴ糖の合成に必要なグリコシルトランスフェラーゼを発現するように構築された遺伝子改変細菌に依存し、ＨＭＯ前駆体として細菌の生来のヌクレオチド糖のプールを利用する。
【0008】
ＨＭＯの生物工学的生産における最近の開発により、細菌発現系の特定の固有の制限を克服することが可能になった。例えば、ＨＭＯ産生細菌細胞は遺伝子改変されて、細菌内のヌクレオチド糖の限られた細胞内プールを増加させ（国際公開第２０１２１１２７７７号パンフレット）、ＨＭＯ産生に関与する酵素の活性を改善し（国際公開第２０１６０４０５３１号パンフレット）、又は合成ＨＭＯの細胞外培地への分泌を促進してもよい（国際公開第２０１０１４２３０５号パンフレット、国際公開第２０１７０４２３８２号パンフレット）。さらに、組換え細胞内の目的の遺伝子の発現は、例えば、国際公開第２０１９１２３３２４号パンフレットに最近記載されたもののように、特定のプロモーター又はその他の遺伝子発現調節因子を使用することによって調節されてもよい。
【0009】
国際公開第２０１０１４２３０５号パンフレット及び国際公開第２０１７０４２３８２号パンフレットに記載されているアプローチは、例えば、国際公開第２０１２１１２７７７号パンフレット、国際公開第２０１６０４０５３１号パンフレット又は国際公開第２０１９１２３３２４号パンフレットの方法を使用して、高レベルの組換え遺伝子発現によって、産生細胞に課せられる代謝負荷を低減することを可能にするという利点を有する。このアプローチは、組換えＨＭＯ産生細胞工学においてますます注目を集めており、例えば、最近では、母乳の最も豊富なＨＭＯである、組換え生産２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）の流出を促進し得る、タンパク質及び発酵プロセスをコード化するいくつかの新しい糖トランスポーター遺伝子が報告されている（国際公開第２０１８０７７８９２号パンフレット、米国特許第２０１９００３２３０５３号明細書、米国特許第２０１９００３２３０５２号明細書）。
【0010】
しかしながら、糖トランスポーターの基質特異性を定義する構造と機能の関係がまだ十分に研究されておらず、非常に予測不可能なままであるので、現在のところ、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔなどの複数のタンパク質データベースにおいてトランスポーター機能が予測される複数の細菌タンパク質のうち、異なる組換え生産ＨＭＯ構造を流出できる適切なトランスポータータンパク質を特定できるアルゴリズムはない。
【0011】
［概要］
本開示は、主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）からのＦｒｅｄタンパク質をコード化する異種遺伝子ｆｒｅｄをＨＭＯ産生株で過剰発現させると、細胞によって産生されるＨＭＯの量が増加することを示す。異なる組換え生産ＨＭＯに対して特異性を有する新しい効率的な糖流出トランスポータータンパク質の同定と、前記タンパク質を発現する組換え細胞の開発は、大規模な工業的ＨＭＯ製造に有利である。
本開示は、主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）からのＦｒｅｄタンパク質をコード化する異種遺伝子ｆｒｅｄをＨＭＯ産生株で過剰発現させると、細胞によって産生されるＨＭＯの量が増加することを示す。異なる組換え生産ＨＭＯに対して特異性を有する新しい効率的な糖流出トランスポータータンパク質の同定と、前記タンパク質を発現する組換え細胞の開発は、大規模な工業的ＨＭＯ製造に有利である。
【0012】
したがって、その最も広い態様では、本発明は、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生できる遺伝子改変細胞に関し、ここで、前記遺伝子改変細胞は、配列番号１に示される主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチドをコード化する異種核酸配列、又はアミノ酸配列が配列番号１と少なくとも９５．５、少なくとも９６％同一であるなど、配列番号１と９５．４％を超えて同一である、その機能的相同体を含んでなる。
【0013】
本発明による遺伝子改変細胞は、異種核酸配列の発現を調節するための調節エレメントを含んでなる、核酸配列をさらに含んでなり得る。一態様における前記調節エレメントは、配列番号１に示されるＭＦＳポリペプチド、又はアミノ酸配列が配列番号１と９５．４％を超えて同一であるその機能的相同体の発現を調節する。
【0014】
本明細書で配列番号１として同定されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、本明細書では、同義的に「Ｆｒｅｄタンパク質」又は「Ｆｒｅｄトランスポーター」又は「Ｆｒｅｄ」として同定され；Ｆｒｅｄタンパク質をコード化する核酸配列は、本明細書では、配列番号２「Ｆｒｅｄコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｆｒｅｄ遺伝子」又は「ｆｒｅｄ」として同定される。
【0015】
本発明は、Ｆｒｅｄタンパク質を発現するＨＭＯ産生組換え細胞の使用が、ＨＭＯの発酵及び精製の双方に関連する、ＨＭＯ製造プロセスの非常に明確な改善をもたらすことを示す。本明細書で開示されるＨＭＯ生産のための組換え細胞及び方法は、総生産ＨＭＯのより高い収率、より低い副生成物形成又は副生成物対生成物比の双方を提供し、発酵ブロスの下流処理中のＨＭＯの回収を促進する。
【0016】
驚くべきことに、異なるＨＭＯ産生細胞におけるＦｒｅｄをコード化するＤＮＡ配列の発現は、細胞外培地中のいくつかの特定のＨＭＯ及び産生細胞中のその他のＨＭＯの蓄積と、ＨＭＯの総生産の増加とに関連することが見いだされている。驚くべきことに、生産されたＨＭＯの流出の増加は、単糖の３単位又は４単位からなるＨＭＯ、すなわち、本明細書の実施例に見られるように、例えば、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、ラクト－Ｎ－トリオース２、（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、及びラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、特に２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、及びラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）など、三糖類及び四糖類であるＨＭＯに特徴的であることが見いだされるが、産生細胞内に蓄積する五糖類及び六糖類のようなより大きなオリゴ糖構造には当てはまらない。
【0017】
驚くべきことに、ｆｒｅｄ遺伝子を発現する対応するＨＭＯ産生細胞中で、例えば、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、及びラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）などの主要なＨＭＯの総生産もまた増加することが見いだされた一方、これらの細胞中で、例えば、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰＶ）又はパラ－ラクト－ネオ－ヘキサオース－Ｉ（ｐＬＮＨ－Ｉ）などの副生成物生産は、対応して、しばしば減少し、前記副生成物オリゴ糖は、典型的には、産生細胞中に蓄積する。
【0018】
本発明による遺伝子改変細胞は、典型的には、調節エレメントを含んでなる核酸配列をさらに含んでなる。調節エレメントは主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）のポリペプチドをコード化する核酸の発現を調節し得て、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７からなる群から選択され得る。
【0019】
本発明はまた、主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）のポリペプチドをコード化する核酸配列を含んでなる核酸コンストラクトにも関し、ここで、主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、本発明はまた、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である核酸コンストラクトを含んでなる遺伝子改変細胞にも関する。
【0020】
一態様では、核酸コンストラクトは、主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）のポリペプチドをコード化する核酸配列を含んでなり、ここで、核酸配列は、配列番号２と少なくとも７０％同一である。
【0021】
本発明はまた、
（ｉ）本発明による遺伝子改変細胞を提供するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）に記載の遺伝子改変細胞を適切な細胞培養培地中で培養し、流出糖を輸送でき、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生する前記ポリペプチドを発現させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で生産された１つ又は複数のＨＭＯを収穫するステップと
を含んでなる１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生合成生産するための方法を提供する。
（ｉ）本発明による遺伝子改変細胞を提供するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）に記載の遺伝子改変細胞を適切な細胞培養培地中で培養し、流出糖を輸送でき、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生する前記ポリペプチドを発現させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で生産された１つ又は複数のＨＭＯを収穫するステップと
を含んでなる１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を生合成生産するための方法を提供する。
【0022】
本発明はまた、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）生合成生産のための、主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチドをコード化する異種核酸配列を含んでなる、遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトの使用にも関し、前記核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【0023】
上記のように、Ｆｒｅｄトランスポータータンパク質をコード化する核酸配列を含んでなる１つ又は複数のＨＭＯを産生できる遺伝子改変細胞の培養中に、驚くべきことに、対応する１つ又は複数のＨＭＯが高収率で産生される一方、副生成物とバイオマスの形成が減少することが見いだされた。これにより、下流プロセス中のＨＭＯの回収が促進され、例えば、全体的な回収及び精製手順がより少数のステップで構成され、精製の全体的な時間が短縮されてもよい。
【0024】
生成物収量の増加及び生成物回収の促進の効果は、本発明を先行技術の開示よりも優れたものにする。
【0025】
本発明のその他の態様及び有利な特徴は、以下で詳細に説明され、非限定的な実施例によって例証される。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】配列番号１に記載のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現をコード化する、配列番号２に記載のｆｒｅｄ遺伝子の組み込み存在下及び非存在下（それぞれ菌株２及び菌株１）における、改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（菌株１）の相対２’－ＦＬ生産量を示す。データは、深型ウェルフィードバッチアッセイから取得される。
【図2】配列番号１に記載のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現をコード化する、配列番号２に記載のｆｒｅｄ遺伝子の組み込み存在下及び非存在下（それぞれ菌株２及び菌株１）における、改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（菌株１）細胞内外の相対２’－ＦＬ分布を示す。データは、深型ウェルフィードバッチアッセイから取得される。
【図3】配列番号１に記載のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現をコード化する、配列番号２に記載のｆｒｅｄ遺伝子の組み込み存在下及び非存在下（それぞれ菌株４及び菌株３）における、改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（菌株３）の相対３－ＦＬ生産量を示す。データは、深型ウェルフィードバッチアッセイから取得される。
【図4】配列番号１に記載のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現をコード化する、配列番号２に記載のｆｒｅｄ遺伝子の組み込み存在下及び非存在下（それぞれ菌株４及び菌株３）における、改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（菌株３）細胞内外の相対３－ＦＬ分布を示す。データは、深型ウェルフィードバッチアッセイから取得される。
【図5】配列番号１に記載のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現をコード化する、配列番号２に記載のｆｒｅｄ遺伝子の組み込み存在下及び非存在下（それぞれ菌株６及び７対菌株５）における、改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（菌株５）の相対ＬＮＴ生産量を示す。データは、深型ウェルフィードバッチアッセイから取得される。
【図6】配列番号１に記載のＦｒｅｄ ＭＦＳトランスポータータンパク質の発現をコード化する、配列番号２に記載のｆｒｅｄ遺伝子の組み込み存在下及び非存在下（それぞれ菌株６及び７対菌株５）における、改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（菌株５）細胞内外の相対ＬＮＴ分布を示す。データは、深型ウェルフィードバッチアッセイから取得される。
【図7】ＧｌｃＮａｃＴ及びＧａｌ４Ｔ遺伝子と異種トランスポーター遺伝子ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０、ｂａｄ、ｆｒｅｄ、ｍａｒｃ、ｖａｇ、ｎｅｃ、又はｙａｂＭをそれぞれ発現する７つの菌株の全サンプル中の相対ＬＮｎＴ濃度の百分率（％）を示す。ＭＰ３６７２株は、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現し、トランスポーター遺伝子は発現しない。
【図8】ｖａｇ又はｙａｂＭを発現する細胞の上清中の相対ＬＮｎＴ濃度の百分率（％）を示す。
【0027】
［詳細な説明］
以下で、本発明の実施形態をさらに詳細に説明する。特徴のそれぞれの特定のバリエーションは、特に明記されていない限り、本発明の他の実施形態に適用され得る。
以下で、本発明の実施形態をさらに詳細に説明する。特徴のそれぞれの特定のバリエーションは、特に明記されていない限り、本発明の他の実施形態に適用され得る。
【0028】
一般に、本明細書で使用される全ての用語は、技術分野におけるそれらの通常の意味に従って解釈されるべきであり、明示的に定義されるか又は別段の記載がない限り、本発明の全ての態様及び実施形態に適用可能である。
【0029】
「ａ／ａｎ／ｔｈｅ［細胞、配列、遺伝子、トランスポーター、ステップなど］」への全ての言及は、特に明記されていない限り、前記細胞、配列、遺伝子、トランスポーター、ステップなどの少なくとも１つの事例を指すものとして開放的に解釈されるべきである。
【0030】
本明細書で開示される任意の方法のステップは、明示的に記載されていない限り、開示される正確な順序で実行される必要はない。
【0031】
本発明は、一般に、オリゴ糖を効率的に生産するための遺伝子改変細胞、及びオリゴ糖を生産する方法における前記遺伝子改変細胞の使用に関する。特に、本発明は、オリゴ糖、好ましくは異種オリゴ糖、特に母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を合成することを可能にする遺伝子改変細胞に関する。
【0032】
したがって、本発明の遺伝子改変細胞は、例えば、以下に説明するグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する１つ又は複数の酵素をコード化する遺伝子など、細胞による１つ又は複数のＨＭＯの合成に必要な（宿主細胞が１つ又は複数のＨＭＯを合成することを可能にする）組換え核酸のセットを発現するように改変される。本発明のオリゴ糖産生組換え細胞は、細菌エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）に由来する推定ＭＦＳ（主要促進剤スーパーファミリー）トランスポータータンパク質をコード化する異種組換え核酸配列、好ましくはＤＮＡ配列を含んでなるようにさらに改変される。
【0033】
具体的には、本発明は、１つ又は複数の特定のオリゴ糖、特に１つ又は複数の特定のＨＭＯの産生のために最適化された、Ｆｒｅｄタンパク質をコード化する組換え核酸を含んでなる遺伝子改変細胞に関する。
【0034】
配列番号２の核酸配列を有するＦｒｅｄタンパク質をコード化する核酸配列は、本明細書では、「Ｆｒｅｄコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｆｒｅｄ遺伝子」又は「ｆｒｅｄ」として同定される。
【0035】
本明細書で同義的に、「Ｆｒｅｄタンパク質」又は「Ｆｒｅｄトランスポーター」又は「Ｆｒｅｄ」として同定されるＭＦＳトランスポータータンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する；本明細書で配列番号１として同定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１を有するアミノ酸配列と１００％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【0036】
したがって、本発明の一態様は、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生できる遺伝子改変細胞に関し、ここで前記遺伝子改変細胞は、糖輸送が可能なポリペプチドをコード化する異種核酸配列を含んでなり、前記核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、なおもより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0037】
さらに、本発明は、１つ又は複数の特定のオリゴ糖、特に１つ又は複数の特定のＨＭＯの産生のために最適化され、配列番号１のアミノ酸配列に対して９５．４％を超える、例えば、少なくとも９５．５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、なおもより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコード化する組換え核酸を含んでなる、遺伝子改変細胞に関する。
【0038】
したがって、本発明の一態様は、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生できる遺伝子改変細胞に関し、ここで前記遺伝子改変細胞は、糖輸送が可能なポリペプチドをコード化する異種核酸配列を含んでなり、前記核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、なおもより好ましくは少なくとも９５％、９９％などの配列同一性を有する。
【0039】
したがって、本発明の別の態様は、１つ又は複数のＨＭＯを産生できる遺伝子改変細胞に関し、ここで、前記細胞は、配列番号１のタンパク質をコード化する組換え核酸、又はその機能的相同体を含んでなり、そのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも９５．４％同一、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％同一である。
【0040】
本文脈における「機能的相同体」とは、配列番号１と例えば、９５．５％～９９．９％など９５．４％を超えて同一であるアミノ酸配列を有し、本発明の少なくとも１つの有利な効果を達成するのに有益な機能を有する、タンパク質を意味し、例えば、総ＨＭＯ産生の増加、又は遺伝子改変細胞によるＨＭＯの選択の増加は、生産されたＨＭＯの回収、ＨＭＯ産生効率、及び／又はＨＭＯ産生細胞の生存能力が促進される。
【0041】
「主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）」と言う用語は、糖、薬物、疎水性分子、ペプチド、有機イオンなどをはじめとする、一連の異なる基質を輸送を担当する、二次活性トランスポータークラスの大規模且つ極めて多様なファミリーを意味する。糖トランスポータータンパク質の特異性は非常に予測不可能であり、例えばオリゴ糖に対する特異性を有する新規トランスポータータンパク質の同定には、負担のない実験室実験が必要である（より詳細には、Ｒｅｄｄｙ Ｖ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２），ＦＥＢＳ Ｊ．２７９（１１）：２０２２－２０３５によるレビューを参照されたい）。「ＭＦＳトランスポーター」という用語は、現在の文脈では、細胞膜を介した、好ましくはＨＭＯであるオリゴ糖の輸送、好ましくは遺伝子改変細胞によって合成されたＨＭＯ／オリゴ糖、好ましくは例えば、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＬＮＴ－２、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、３’－ＳＬ又は６’－ＳＬなどの３つ又は４つの糖単位からなるＨＭＯ／オリゴ糖の細胞質ゾルから細胞培地への輸送を促進するタンパク質を意味する。さらに、又は代案としては、ＭＦＳトランスポーターはまた、ラクトース、グルコース、細胞代謝産物又は毒素など、本発明によるＨＭＯ又はオリゴ糖とは見なされない分子の流出を促進してもよい。
【0042】
２つ以上の核酸又はアミノ酸配列の文脈における「［特定の］％の配列同一性」という用語は、２つ以上の配列が、比較ウインドウ又は核酸又はアミノ酸の指定配列全体にわたって比較され最大の一致のためにアラインされたとき、所定の百分率で共通のヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する（すなわち、配列は少なくとも９０パーセント（％）の同一性を有する）ことを意味する。核酸又はアミノ酸配列の同一性百分率は、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、又は手動のアライメントと目視検査によって測定され得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照されたい）。この定義はまた、試験配列の相補体に、及び欠失及び／又は付加を有する配列に、並びに置換を有する配列にも適用される。同一性百分率、配列同一性の判定、及びアライメントに適したアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、３３８９（１９９７）に記載されている、ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋は、本発明の核酸及びタンパク質の百分率配列同一性を判定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。配列アライメントアルゴリズムの例は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、ＥＭＢＯＳＳＮｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）、ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）又はＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）である。
【0043】
本発明の文脈において、「オリゴ糖」という用語は、いくつかの単糖単位を含有する糖ポリマーを意味する。いくつかの実施形態では、好ましいオリゴ糖は、３つ又は４つの単糖単位、すなわち三糖又は四糖からなる糖ポリマーである。本発明の好ましいオリゴ糖は、母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）である。
【0044】
［ＨＭＯ］
本文脈における「母乳オリゴ糖」又は「ＨＭＯ」という用語は、母乳に見られる複雑な炭水化物を意味する。（参考文献として、Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（２０１１）；又はＣｈｅｎ、Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５）を参照されたい）。ＨＭＯは、１つ又は複数のβ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ又は複数のβ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端に、ラクトース単位を含んでなるコア構造を有し、このコア構造は、α－Ｌ－フコピラノシル及び／又はα－Ｎ－アセチル－ニューラミニル（シアリル）部分で置換されている。この点において、非酸性（又は中性）ＨＭＯはシアリル残基を欠いており、酸性ＨＭＯの構造は少なくとも１つのシアリル残基を有する。非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化ＨＭＯ又は非フコシル化ＨＭＯであり得る。このような中性非フコース化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）、及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨ ＩＩ）及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ ａ）、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ ｂ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｄ）、フコシル－ＬＳＴ ｄ（ＦＬＳＴ ｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。本発明の文脈において、ラクトースはＨＭＯ種とは見なされない。
本文脈における「母乳オリゴ糖」又は「ＨＭＯ」という用語は、母乳に見られる複雑な炭水化物を意味する。（参考文献として、Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（２０１１）；又はＣｈｅｎ、Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５）を参照されたい）。ＨＭＯは、１つ又は複数のβ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ又は複数のβ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端に、ラクトース単位を含んでなるコア構造を有し、このコア構造は、α－Ｌ－フコピラノシル及び／又はα－Ｎ－アセチル－ニューラミニル（シアリル）部分で置換されている。この点において、非酸性（又は中性）ＨＭＯはシアリル残基を欠いており、酸性ＨＭＯの構造は少なくとも１つのシアリル残基を有する。非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化ＨＭＯ又は非フコシル化ＨＭＯであり得る。このような中性非フコース化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオース２（ＬＮＴ－２）ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）、及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨ ＩＩ）及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ ａ）、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ ｂ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｄ）、フコシル－ＬＳＴ ｄ（ＦＬＳＴ ｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。本発明の文脈において、ラクトースはＨＭＯ種とは見なされない。
【0045】
本発明のいくつかの実施形態では、例えば、三糖類２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＬＮＴ－２、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、及び四糖類ＤＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＦＳＬなどの、トリＨＭＯ及びテトラＨＭＯが好ましくあってもよい。
【0046】
本発明の現在好ましい態様では、トリＨＭＯが好ましく、特に２’－ＦＬと３－ＦＬから選択される三糖類、及びＤＦＬとＬＮＴから選択される四糖類が好ましい。
【0047】
［２’－ＦＬ］
２’－フコシルラクトース（２－ＦＬ又は２’Ｏ－フコシルラクトース）は三糖であり、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位から構成される、コシル化された中性三糖である（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）。これは、母乳に自然に存在する最も一般的な母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）であり、全てのＨＭＯの約３０％を構成する。遺伝子改変細胞では又は酵素反応では、２’－ＦＬは主に、ラクトースとフコシル供与体とのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって生成される。
２’－フコシルラクトース（２－ＦＬ又は２’Ｏ－フコシルラクトース）は三糖であり、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位から構成される、コシル化された中性三糖である（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）。これは、母乳に自然に存在する最も一般的な母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）であり、全てのＨＭＯの約３０％を構成する。遺伝子改変細胞では又は酵素反応では、２’－ＦＬは主に、ラクトースとフコシル供与体とのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって生成される。
【0048】
［３－ＦＬ］
３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）は三糖であり、より正確には、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコースから構成されるフコシル化された中性三糖である（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）。これは母乳に自然に存在する。遺伝子改変細胞では又は酵素反応では、３－ＦＬは主に、ラクトースとフコシル供与体とのα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、又はα－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって生成される。
３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）は三糖であり、より正確には、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコースから構成されるフコシル化された中性三糖である（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）。これは母乳に自然に存在する。遺伝子改変細胞では又は酵素反応では、３－ＦＬは主に、ラクトースとフコシル供与体とのα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、又はα－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって生成される。
【0049】
［ＬＮＴ］
ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）は四糖であり、より正確には、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、及びグルコースから構成される中性四糖である（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）。これは母乳に自然に存在する。
ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）は四糖であり、より正確には、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、及びグルコースから構成される中性四糖である（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）。これは母乳に自然に存在する。
【0050】
［ＤＦＬ］
ジフコシルラクトース（ＤＦＬ又は２’，３－ｄｉ－Ｏ－フコシルラクトース）は、オリゴ糖、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコースから構成される、フコシル化中性四糖である（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）。これは母乳に自然に存在する。遺伝子改変細胞では又は酵素反応では、ＤＦＬは、主に、ラクトースと２つのコシル供与体とのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ及び／又はα－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって生成される。
ジフコシルラクトース（ＤＦＬ又は２’，３－ｄｉ－Ｏ－フコシルラクトース）は、オリゴ糖、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース、及びＤ－グルコースから構成される、フコシル化中性四糖である（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）。これは母乳に自然に存在する。遺伝子改変細胞では又は酵素反応では、ＤＦＬは、主に、ラクトースと２つのコシル供与体とのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ及び／又はα－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって生成される。
【0051】
［機能的酵素］
１つ又は複数のＨＭＯを合成できるようにするために、本発明の組換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する機能的酵素をコード化する少なくとも１つの組換え核酸を含んでなる。ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、遺伝子改変細胞のゲノムに（染色体組み込みによって）組み込まれてもよく、又は代案としては、それはプラスミドＤＮＡに含まれてプラスミド媒介性として発現されてもよい。例えば、ＬＮＴ又はＬＮｎＴなどのＨＭＯの生成に２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが必要な場合は、例えば、ＬＮＴの生産のために、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する第１の組換え核酸）と組み合わされたβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する第２の組換え核酸）などのグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する異なる酵素をコード化する２つ以上の組換え核酸がゲノムに組み込まれ、及び／又はプラスミドから発現されてもよく、ここで、第１及び第２の組換え核酸は、互いに独立して、染色体上又はプラスミド上に組み込まれ得る。
１つ又は複数のＨＭＯを合成できるようにするために、本発明の組換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する機能的酵素をコード化する少なくとも１つの組換え核酸を含んでなる。ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、遺伝子改変細胞のゲノムに（染色体組み込みによって）組み込まれてもよく、又は代案としては、それはプラスミドＤＮＡに含まれてプラスミド媒介性として発現されてもよい。例えば、ＬＮＴ又はＬＮｎＴなどのＨＭＯの生成に２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが必要な場合は、例えば、ＬＮＴの生産のために、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する第１の組換え核酸）と組み合わされたβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する第２の組換え核酸）などのグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する異なる酵素をコード化する２つ以上の組換え核酸がゲノムに組み込まれ、及び／又はプラスミドから発現されてもよく、ここで、第１及び第２の組換え核酸は、互いに独立して、染色体上又はプラスミド上に組み込まれ得る。
【0052】
好ましい一実施形態では、第１及び第２の組換え核酸の双方が、産生細胞の染色体に安定して組み込まれ；別の実施形態では、少なくとも第１の及び第２のグリコシルトランスフェラーゼの１つはプラスミド媒介性である。グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質／酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）は、異なる実施形態において、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，４－フコシルトランスフェラーゼα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素から選択されてもよい。例えば、２’－ＦＬの生産には、改変細胞が活性なα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現していることが必要であり；３－ＦＬの生産には、改変細胞が活性なα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現していることが必要であり；ＬＮＴの生産には、改変細胞が、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼとの少なくとも２つのグリコシルトランスフェラーゼを発現していることが必要であり；６’－ＳＬの生産には、改変細胞が、活性なα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ酵素と、ＣＭＰ－シアル酸合成経路とを発現していることが必要であり；３’ＳＬの生産には、改変細胞が、活性なα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ酵素と、ＣＭＰ－シアル酸合成経路とを発現していることが必要である。産生細胞が含んでなる組換え遺伝子によってコード化され得る、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のいくつかの非限定的実施形態は、表１の非限定的例から選択され得る。
【0053】
【表1】
【0054】
【表2】
【0055】
【表3】
【0056】
［異種核酸配列］
本発明の一態様は、配列番号１に示されるような主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチドであるか、又はアミノ酸配列が配列番号１と９５．４％を超えて同一であるその機能的相同体である、糖輸送が可能なポリペプチドをコード化する異種核酸配列を含んでなる、核酸コンストラクトの提供であり、ここで、糖輸送ポリペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。
本発明の一態様は、配列番号１に示されるような主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）ポリペプチドであるか、又はアミノ酸配列が配列番号１と９５．４％を超えて同一であるその機能的相同体である、糖輸送が可能なポリペプチドをコード化する異種核酸配列を含んでなる、核酸コンストラクトの提供であり、ここで、糖輸送ポリペプチドをコード化する核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【0057】
「異種核酸配列」、「組換え遺伝子／核酸／ＤＮＡコード化」又は「コーディング核酸配列」という用語は、適切な制御配列、すなわちプロモーターの制御下にあるときに、ｍＲＮＡに転写されてポリペプチドに翻訳される、連続的な重複しない三つ組（コドン）のセットを含んでなる、人工核酸配列（すなわち、核酸配列を作製するための標準的な実験方法を使用して生体外で生成される）を意味する。コード配列の境界は、一般にｍＲＮＡの５’末端のオープンリーディングフレームのすぐ上流に位置するリボソーム結合部位、転写開始コドン（ＡＵＧ、ＧＵＧ、又はＵＵＧ）、及び翻訳停止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）によって決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、及び組換え核酸配列を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【0058】
「核酸」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びｃＤＮＡ分子を含む。遺伝コードの縮重の結果として、所与のタンパク質をコード化する多数のヌクレオチド配列が生成されてもよいことが理解される。核酸という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と同義的に使用される。
【0059】
「オリゴヌクレオチド」は、短鎖核酸分子である。
【0060】
「プライマー」は、精製された制限消化物のように天然に存在するか、又は合成的に製造されるかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、適切な温度及びｐＨで）に置かれたときに、合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドである。プライマーは、増幅の効率を最大にするために一本鎖であることが好ましいが、或いは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物の調製に使用される前に、最初にその鎖を分離するために処理される。好ましくは、プライマーはデオキシリボヌクレオチド配列である。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの起源、及び方法の使用など、多くの要因に依存する。
【0061】
本発明の組換え核配列は、例えば遺伝子などのコーディングＤＮＡ配列、又は例えばプロモーター配列などの調節ＤＮＡなどの非コーディングＤＮＡ配列であり得る。本発明の一態様は、１つ又は複数のＨＭＯの産生に必要な酵素をコード化する組換えＤＮＡ配列と、Ｆｒｅｄトランスポーターをコード化するＤＮＡ配列とを含んでなる、組換え細胞を提供することに関する。したがって、一実施形態では本発明は、コーディング核配列、すなわち、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子又はｆｒｅｄ遺伝子などの目的の遺伝子の組換えＤＮＡ配列、及び、例えば、ｌａｃオペロン又はｇｌｐオペロンのプロモーターに由来する組換えプロモーター配列など、例えばプロモーターＤＮＡ配列などの非コードＤＮＡ配列、又は別のゲノムプロモーターＤＮＡ配列に由来するプロモーター配列、又は合成プロモーター配列を含んでなる核酸コンストラクトに関する。ここで、コーディング配列とプロモーター配列は作動可能に連結されている。「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写調節配列と転写された配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーター配列は、それが適切な宿主細胞又はその他の発現系におけるコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列と作動可能に連結されている。一般に、転写配列と作動可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接しており、すなわち、それらはシス作用性である。
【0062】
一実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、ベクターＤＮＡの一部であってもよく、別の実施形態では、コンストラクトは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる発現カセット／カートリッジである。したがって、「核酸コンストラクト」という用語は、人工的に構築された核酸のセグメント、特にＤＮＡセグメントを意味し、それは、標的細胞、例えば細菌細胞に「移植」されて、ゲノムの遺伝子発現が改変されるか、又はコンストラクトに含まれてもよい遺伝子／コーディングＤＮＡ配列を発現させる。本発明の文脈において、核酸コンストラクトは、本質的に、プロモーターＤＮＡ配列を含んでなる非コーディングＤＮＡ配列と、宿主細胞におけるＨＭＯの生産に有用なその他の遺伝子、例えばＦｒｅｄタンパク質、グリコシルトランスフェラーゼなどの目的の遺伝子をコード化するコーディングＤＮＡ配列との２つ以上の組換えＤＮＡ配列を含んでなる、組換えＤＮＡ配列を含有する。好ましくは、コンストラクトは、例えば、転写物へのリボソーム結合を促進するＤＮＡ配列、転写物を安定化する主要なＤＮＡ配列などの、コンストラクトのコーディングＤＮＡの転写又は翻訳を調節する、非コーディングＤＮＡ配列をさらに含んでなる。
【0063】
コンストラクト（発現カセット）に含まれる目的の組換え核酸の細菌ゲノムへの組み込みは、従来の方法によって、例えば、染色体上の特定部位と相同な隣接配列を含有する線形カートリッジを使用することによって、ａｔｔＴｎ７部位について記載されているように（Ｗａｄｄｅｌｌ Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｎ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８８）Ｆｅｂ；２（２）：１３７－４９．）；組換えが、ファージλのＲｅｄリコンビナーゼ機能又はＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴリコンビナーゼ機能によって媒介される、核酸配列のゲノム組み込みのための方法によって（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）；１８０（８）：２０６３－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）２０：１２３－１２８ Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．（２０００）１（３）：２３９－２４３）；Ｒｅｄ／ＥＴ組換えに基づく方法によって（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２００５），１２（３）：３４９－５６．；Ｖｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）；７１（４）：１８２９－３５）、達成され得て、又は陽性クローン、すなわち発現カセットを保有するクローンは、例えばマーカー遺伝子、又は遺伝子機能の喪失又は獲得によって選択され得る。
【0064】
目的の遺伝子を含んでなる発現カセットの単一のコピーは、所望のＨＭＯの産生を確保し、本発明による所望の効果を達成するのに十分であってもよい。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた目的の遺伝子の１つ、２つ、又は３つのコピーを含んでなる組換えＨＭＯ産生細胞に関する。いくつかの実施形態では、遺伝子の単一コピーが好ましい。
【0065】
好ましい一実施形態では、本発明の核酸コンストラクトの組換えコーディング核酸配列は、プロモーターに関して異種であり、これは、起源となる種のゲノムにおける同等の天然コード配列が、別のプロモーター配列（すなわち、コンストラクトのプロモーター配列ではない）の制御下で転写されることを意味する。さらに、宿主細胞に関して、コーディングＤＮＡは、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）宿主細胞で発現されるＦｒｅｄタンパク質をコード化するＤＮＡ配列などの異種（すなわち、他の生物種又は属に由来する）、又は例えば、コロン酸オペロンの遺伝子、ｗｃａ遺伝子などの同種（すなわち、宿主細胞に由来する）のどちらであってもよい。
【0066】
好ましくは、ＨＭＯの生合成生産に関連する遺伝子、プロモーターＤＮＡ配列、及びリボソーム結合部位配列（例えばシャイン・ダルガルノ配列）などのその他の調節配列を含んでなる、本発明のコンストラクトを遺伝子改変細胞で発現させることは、遺伝子改変細胞の懸濁液を含んでなる発酵培地１リットルの少なくとも０．０３ｇ／ＯＤ（光学密度）のレベル、例えば、約０．０５ｇ／ｌ／ＯＤ～約０．５ｇ／ｌ／ＯＤのレベルでのＨＭＯの生産を可能にする。本発明の目的のために、ＨＭＯ生産の後のレベルは「十分」と見なされ、所望のＨＭＯのこのレベルを産生できる遺伝子改変細胞は「適切な遺伝子改変細胞」と見なされ、すなわち、細胞がさらに改変されて、例えば、ＦｒｅｄなどのＨＭＯトランスポータータンパク質を発現させ、ＨＭＯ産生に有利な本明細書に記載の少なくとも１つの効果が達成され得る。
【0067】
本発明の遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトは、推定ＭＦＳ（主要促進剤スーパーファミリー）トランスポータータンパク質をコード化する異種遺伝子などの核酸配列を含んでなる。
【0068】
本発明において特に興味深いＭＦＳトランスポーターは、Ｆｒｅｄタンパク質である。したがって、本発明の核酸コンストラクトは、配列番号２の遺伝子ｆｒｅｄに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含有する。
【0069】
遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトに含有される核酸配列は、配列番号１のタンパク質、又はアミノ酸配列が配列番号１と９５．４％を超えて同一である、その機能的相同体をコード化する。
【0070】
配列番号１のタンパク質の機能的相同体は、変異誘発によって得られてもよい。機能的相同体は、配列番号１のアミノ酸配列の機能性と比較して、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％など、少なくとも５０％の残存機能性を有するべきである。機能的相同体は、配列番号１のアミノ酸配列の機能性と比較して、より高い機能性を有し得る。配列番号１の機能的相同体は、本発明による遺伝子改変細胞のＨＭＯ産生を増強できなければならない。
【0071】
［遺伝子改変細胞］
「遺伝子改変細胞」は、本明細書の用法では、異種ポリヌクレオチド配列によって形質転換又は形質移入された細胞として理解される。本文脈において、「遺伝子改変細胞」及び「宿主細胞」という用語は、同義的に使用される。
「遺伝子改変細胞」は、本明細書の用法では、異種ポリヌクレオチド配列によって形質転換又は形質移入された細胞として理解される。本文脈において、「遺伝子改変細胞」及び「宿主細胞」という用語は、同義的に使用される。
【0072】
したがって、「遺伝子改変細胞」又は「遺伝子改変細胞」は、本文脈において、外因性ポリヌクレオチド配列によって形質転換又は形質移入された宿主細胞として理解される。
【0073】
遺伝子改変細胞は、好ましくは原核細胞である。宿主細胞として機能してもよい適切な微生物細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞、及び真菌細胞が挙げられる。
【0074】
［宿主細胞］
遺伝子改変細胞（宿主細胞又は組換え細胞）は、例えば、細菌又は酵母細胞であってもよい。好ましい一実施形態では、遺伝子改変細胞は、細菌細胞である。
遺伝子改変細胞（宿主細胞又は組換え細胞）は、例えば、細菌又は酵母細胞であってもよい。好ましい一実施形態では、遺伝子改変細胞は、細菌細胞である。
【0075】
細菌宿主細胞に関しては、原則として制限はない；それらは、目的の遺伝子を挿入するための遺伝子操作を可能にし、製造規模で培養され得る限り、真正細菌（グラム陽性又はグラム陰性）又は古細菌であってもよい。好ましくは、宿主細胞は、高い細胞密度への培養を可能にする特性を有する。本発明によるＨＭＯの組換え工業生産に適した細菌宿主細胞の非限定的な例は、エルウィニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、又はキサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）であり得る。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポールス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・マイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、及びバチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）をはじめとする、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌もまた使用されてもよい。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブレッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ブルガリア乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、及びラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）をはじめとするが、これらに限定されるものではない、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌が、本発明の方法を使用して改変されてもよい。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びプロピオニバクテリウム・フリューデンレイッヒイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）もまた、本明細書に記載の発明に適切な細菌種である。本発明の一部として、本明細書に記載されるように改変された、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）及びエンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、及びビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ））、スポロラクトバチルス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ミクロモノスポラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）種、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及びシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））属からの菌株もまた含まれる。
【0076】
本明細書に記載の特徴を含んでなる細菌は、ラクトースの存在下で培養され、細胞によって産生されるＨＭＯなどのオリゴ糖は、細菌それ自体又は細菌の培養上清のどちらかから回収される。好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。
【0077】
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などの酵母細胞である。
【0078】
本発明の遺伝子改変細胞は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｗａｌｋｅｒ，“Ｍａｎｉａｔｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．による手順書に記載されているものなど、当該技術分野の標準法を使用して提供され得る。
【0079】
例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのＨＭＯ産生に適した宿主は、内因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子又は外因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでなってもよく、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性ｌａｃＺ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号Ｖ００２９６（ＧＩ：４１９０１））を含んでなる。本発明の目的のために、ＨＭＯ産生宿主細胞は、任意のβ－ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでなるか、又は不活化された遺伝子を含んでなるように遺伝子操作される。遺伝子は、細菌ゲノムからの対応する核酸配列の完全な又は部分的な欠失によって不活化されてもよく、又は遺伝子配列は、それが転写される様式において変異され、又は転写される場合は転写物は翻訳されず、又はタンパク質（すなわちβ－ガラクトシダーゼ）に翻訳される場合はそのタンパク質は対応する酵素活性を有していない。このようにして、ＨＭＯ産生細菌は、ＨＭＯの産生に有益な細胞内ラクトースプールの増加を蓄積する。
【0080】
いくつかの実施形態では、操作された細胞、例えば細菌は、欠損したシアル酸異化経路を含む。「シアル酸異化経路」とは、シアル酸の分解をもたらす、通常は酵素によって制御され触媒される一連の反応のことを指す。本明細書に記載の例示的なシアル酸異化経路は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）経路である。この経路では、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ；Ｎ－アセチルノイラミン酸）は、全てｎａｎＡＴＥＫ－ｙｈｃＨオペロンからコード化される、酵素ＮａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）とＮａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）とＮａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ）とによって分解され、ＮａｎＲによって抑制される（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／ＥＣＯＬＩ）。欠損したシアル酸異化経路は、内因性ｎａｎＡ（Ｎ－アセチルニューラミネートリアーゼ）遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ０００６７．１（ＧＬ２１６５８８））及び／又はｎａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号（アミノ酸）ＢＡＥ７７２６５．１（ＧＬ８５６７６０１５））、及び／又はｎａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ、ＧＩ：９４７７４５、参照により本明細書に援用される）遺伝子に変異を導入することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主中で発現される。任意選択的に、ｎａｎＴ（Ｎ－アセチルニューラミネートトランスポーター）遺伝子もまた、不活性化又は変異された。シアル酸代謝のその他の中間体としては、（ＭａｎＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸；（ＧｌｃＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸；（ＧｌｃＮ－６－Ｐ）グルコサミン－６－リン酸、及び（Ｆｒｕｃ－６－Ｐ）フルクトース－６－リン酸が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ｎａｎＡが変異している。その他の好ましい実施形態では、ｎａｎＡとｎａｎＫが変異している一方で、ｎａｎＥは機能的なままである。別の好ましい実施形態では、ｎａｎＡ及びｎａｎＥが変異している一方で、ｎａｎＫは変異又は不活性化又は欠失されていない。変異とは、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ、及び／又はｎａｎＴの遺伝子産物をコードする核酸配列における１つ又は複数の変化である。例えば、変異は、核酸配列において、１、２、最大５、最大１０、最大２５、最大５０又は最大１００の変化であってもよい。例えば、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ、及び／又はｎａｎＴ遺伝子は、ヌル変異によって変異している。本明細書に記載のヌル変異は、酵素の機能喪失（すなわち、活性の低下又は欠如）又は酵素の欠失（すなわち、遺伝子産物なし）のいずれかを引き起こすアミノ酸の置換、付加、欠失、又は挿入を包含する。「欠失された」とは、（機能的）遺伝子産物が生成されないように、コード領域が完全に又は部分的に欠失していることを意味する。不活性化とは、得られる遺伝子産物が機能的に不活性であるか、又は例えば、未変性の、天然に存在する、内因性の遺伝子産物の活性の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％又は２０％など、１００％未満の遺伝子産物をコード化するように、コード配列が変更されていることを意味する。「変異していない」遺伝子又はタンパク質は、未変性の、天然に存在する、又は内因性のコード配列と、１、２、最大５、最大１０、最大２０、最大５０、最大１００、最大２００又は最大５００以上のコドン、又は対応するコード化アミノ酸配列の違いがない。
【0081】
さらに、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））はまた、シアル酸合成能力を含んでなってもよい。例えば、細菌は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ ２－エピメラーゼ（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２７．１）又は同等物（例えば（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＲ０４５６１．１）；Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２６．１）又は同等物（例えば、フラボバクテリウム・リムノセジミニス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｎｏｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＷＰ＿０２３５８０５１０．１）；及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２８．１）又は同等物（例えば、ビブリオ・ブラジリエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）ＣＭＰ－シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＷＰ＿００６８８１４５２．１）の提供を通じたシアル酸合成能力を含んでなる。
【0082】
改変細菌における中性Ｎ－アセチルグルコサミン含有ＨＭＯの産生もまた当該技術分野で公知である（例えば、Ｇｅｂｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６３ ８３－９０を参照されたい）。
【0083】
上記のようなラクト－Ｎ－トリオース ２（ＬＮＴ－２）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオース Ｉ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオース ＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオース ＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオース Ｖ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオース Ｉ（ＬＤＦＨ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオース ＩＩ（ＬＤＦＨ－ＩＩ）、及びラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオース ＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）などのＮ－アセチルグルコサミン含有ＨＭＯの生産では、それは、外因性のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子、又はその機能的変異型若しくは断片を含んでなるように改変される。この外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子は、いくつかの供給源のいずれかから得られてもよい。例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質登録ＡＡＦ４２２５８．１）又は淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質登録ＡＣＦ３１２２９．１）からのｌｇｔＡ遺伝子が記載されている。任意選択的に、追加的な外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含んでなる細菌で同時発現されてもよい。例えば、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子と同時発現される。この外因性β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から記載されているｌｇｔＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質登録ＡＡＦ４２２５７．１）、又はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのＨＰ０８２６／ｇａｌＴ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質登録ＮＰ＿２０７６１９．１）などのいくつかの起源のいずれか１つから得られ得る。任意選択的に、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでなる細菌中で同時発現される追加的な外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０５５：Ｈ７から記載されているｗｂｇＯ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質登録ＷＰ＿０００５８２５６３．１）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのｊｈｐ０５６３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質登録ＡＥＺ５５６９６．１）、又はストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）タイプＩｂ ＯＩ２からのｃｐｓｌＢＪ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質登録ＡＢ０５０７２３）などのＰ－ｌ，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子である。上記の酵素のいずれかの機能的変異型及び断片もまた、開示された本発明に包含される。
【0084】
Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及び／又はガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子はまた、Ｐｇｌｐに作動可能に連結され得て、対応するゲノム組み込みカセットから発現され得る。一実施形態では、ゲノムに組み込まれた遺伝子は、例えば、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのＧａｌＴ酵素をコード化するＨＰ０８２６遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質登録ＮＰ＿２０７６１９．１）などのガラクトシルトランスフェラーゼをコード化する遺伝子であり；別の実施形態では、ゲノムに組み込まれた遺伝子は、例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのｌｇｔＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質登録ＡＡＦ４２２５８．１）などのβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコード化する遺伝子である。これらの実施形態では、第２の遺伝子、すなわち、対応して、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ又はガラクトシルトランスフェラーゼをコード化する遺伝子は、ゲノム組み込みカセット又はプラスミド媒介カセットのいずれから発現されてもよい。第２の遺伝子は、任意選択的に、ｇｌｐプロモーターの制御下で、又は例えば、Ｐｌａｃなどの発現系に適したその他の任意のプロモーターの制御下で発現されてもよい。
【0085】
ＨＭＯ産生宿主細胞は、典型的には、機能的なｌａｃＹ及び機能不全のｌａｃＺ遺伝子を含んでなる。
【0086】
本発明の組換え細胞によって産生されたＨＭＯは、当該技術分野で利用可能な適切な手順を使用して精製されてもよい（例えば、国際公開第２０１５１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７１８２９６５号パンフレット又は国際公開第２０１７１５２９１８号パンフレットに記載されているような）。
【0087】
［糖輸送が可能なコード化ポリペプチド］
糖輸送は、オリゴ糖などであるがこれらに限定されるものではない、糖の輸送に関し、本発明との関連では、遺伝子改変細胞の細胞質又はペリプラズムから生産培地へ、及び／又は生産培地から遺伝子改変細胞の細胞質又はペリプラズムへの、１つ又は複数のＨＭＯの流入及び／又は流出輸送に関する。したがって、遺伝子改変細胞で発現され、細胞質又はペリプラズムから生産培地に、及び／又は生産培地から遺伝子改変細胞の細胞質又はペリプラズムにＨＭＯを輸送できるポリペプチドは、糖輸送が可能なポリペプチドである。したがって、本発明において、糖輸送は、オリゴ糖などであるがこれらに限定されるものではない糖の流出及び／又は流入輸送を意味し得る。
糖輸送は、オリゴ糖などであるがこれらに限定されるものではない、糖の輸送に関し、本発明との関連では、遺伝子改変細胞の細胞質又はペリプラズムから生産培地へ、及び／又は生産培地から遺伝子改変細胞の細胞質又はペリプラズムへの、１つ又は複数のＨＭＯの流入及び／又は流出輸送に関する。したがって、遺伝子改変細胞で発現され、細胞質又はペリプラズムから生産培地に、及び／又は生産培地から遺伝子改変細胞の細胞質又はペリプラズムにＨＭＯを輸送できるポリペプチドは、糖輸送が可能なポリペプチドである。したがって、本発明において、糖輸送は、オリゴ糖などであるがこれらに限定されるものではない糖の流出及び／又は流入輸送を意味し得る。
【0088】
その点で、糖輸送が可能なポリペプチドは、主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）に属するポリペプチドである。特に、ポリペプチドは、配列番号１に対して、例えば少なくとも９５．５％、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％など、９５．４％を超える配列同一性を有するか、又はそれは本明細書に記載するようにその機能的変異型である。配列番号１は、Ｆｒｅｄタンパク質のアミノ酸配列である。
【0089】
本発明の遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトは、Ｆｒｅｄタンパク質をコード化する異種遺伝子などの核酸配列を含んでなる。前記核酸配列は、配列番号２に示されるｆｒｅｄ遺伝子に対して、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％など、少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【0090】
核酸配列コンストラクトは、配列番号１のタンパク質をコード化し、又はそのアミノ酸配列が配列番号１と、例えば少なくとも９５．５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％など、９５．４％を超えて同一であるその機能的相同体をコード化する。
【0091】
配列番号１のタンパク質の機能的相同体は、変異誘発によって得られてもよい。機能的相同体は、配列番号１のアミノ酸配列の機能性と比較して、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％など、少なくとも５０％の残存機能性を有するべきである。機能的相同体は、配列番号１のアミノ酸配列の機能性と比較して、より高い機能性を有し得る。配列番号１の機能的相同体は、本発明による遺伝子改変細胞のＨＭＯ産生を増強できなければならない。
【0092】
遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトは、糖輸送が可能なポリペプチドをコード化する１つ又は複数の核酸配列を含有してもよい。より多くの場合、本発明の遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトは、糖輸送が可能なポリペプチドの単一コピーをコード化する。
【0093】
目的の遺伝子を含んでなる発現カセットの単一のコピーは、所望のＨＭＯの産生を確保し、本発明による所望の効果を達成するのに十分であってもよい。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた目的の遺伝子又は遺伝子群の１つ、２つ、又は３つのコピーを含んでなる組換えＨＭＯ産生細胞に関する。いくつかの実施形態では、遺伝子又は遺伝子群の単一コピーが好ましい。
【0094】
遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトはまた、糖輸送ポリペプチドをコード化する核酸配列の発現を調節するための１つ又は複数の調節エレメントを含有してもよく、ここで、前記核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。
【0095】
［調節エレメント］
上記のように、遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトは、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列の発現を調節するための調節エレメントを含んでなる、核酸配列をさらに含んでなってもよい。調節領域の核酸配列は、異種であっても又は同種であってもよい。
上記のように、遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトは、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列の発現を調節するための調節エレメントを含んでなる、核酸配列をさらに含んでなってもよい。調節領域の核酸配列は、異種であっても又は同種であってもよい。
【0096】
「調節エレメント」又は「プロモーター」又は「プロモーター領域」又は「プロモーターエレメント」という用語は、転写の開始中にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され結合される核酸配列である。プロモーターは、その他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも称される）と共に、所与の遺伝子又は遺伝子のグループ（オペロン）を発現するために必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。「転写開始部位」は、転写される最初のヌクレオチドを意味し、＋１と指定されている。開始部位の下流のヌクレオチドには＋２、＋３、＋４などの番号が付けられ、５’反対（上流）方向のヌクレオチドには－１、－２、－３などの番号が付けられている。コンストラクトのプロモーターは、種のゲノムにコード化された任意の遺伝子のプロモーター領域に由来し得る。好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡのプロモーター領域。したがって、ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始するできる任意のプロモーターは、本発明を実施するのに適している。原則として、任意のプロモーターを使用して、本発明のＭＦＳトランスポーター又はグリコシルトランスフェラーゼなどの組換え遺伝子の転写が制御され得る。本発明を実施する際には、異なる又は同一のプロモーター配列を使用して、宿主細胞のゲノム又は発現ベクターＤＮＡに組み込まれた、異なる、目的の遺伝子の転写が駆動されてもよい。一例ではプロモーター配列Ａは、ＭＦＳトランスポーターの発現を促進し、もう１つのプロモーター配列Ｂ又は同一のプロモーター配列Ａは、グリコシルトランスフェラーゼの発現を促進する。
【0097】
コンストラクトに含まれる組換え遺伝子の最適な発現を得るために、コンストラクトは、例えば、リボソーム結合の配列である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇｌｐ遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に由来するＤＮＡ配列などの主要なＤＮＡ配列などのさらなる調節配列を含んでなってもよい。後の配列の例は、国際公開第２０１９１２３３２４号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されており、本明細書の非限定的な実施例に示されている。
【0098】
本発明の一態様では、本発明に従って、１つ又は複数の調節エレメントが、配列番号２に記載のｆｒｅｄ遺伝子をコード化するＤＮＡコンストラクト、及び／又は１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼをコード化するＤＮＡコンストラクトに挿入されてもよい。本発明の別の態様では、本発明によれば、配列番号２に記載のｆｒｅｄ遺伝子の１つ又は複数のコピーがＤＮＡコンストラクトに挿入されてもよい。本発明のなおも別の態様では、配列番号２に記載のｆｒｅｄ遺伝子は、本発明に従って、１つ又は複数の同一の又は非同一のＤＮＡコンストラクトに挿入されてもよい。
【0099】
本発明の一態様では、本発明のコンストラクトに含まれる組換え遺伝子の発現を調節するための調節エレメントは、ｇｌｐＦＫＸオペロンプロモーター、ＰｇｌｐＦである。本発明の別の態様では、プロモーターはｌａｃオペロンプロモーター、Ｐｌａｃである。及び本発明のなおも別の態様では、調節エレメントはＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４及び／又はＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７であり、これらはプロモーター配列下流の修飾リボソーム結合部位配列を含んでなるＰｇｌｐＦ配列の改変バージョンである。しかしながら、本発明による１つ又は複数のポリペプチドをコード化する１つ又は複数の組換え核酸の転写及び／又は転写レベルの調節を可能にする任意のプロモーターが、本発明を実施するのに適している。
【0100】
典型的には、本発明による異種遺伝子の発現のためのプロモーターは、表２から選択される。
【0101】
【表4】
【0102】
本発明の遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトに存在する好ましい調節エレメントは、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４からなる群から選択される。
【0103】
本発明の遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトに存在する特に好ましい調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７からなる群から選択される。
【0104】
［生合成生産のための遺伝子改変細胞］
本発明において、プロモーターは、遺伝子改変細胞における１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産の最適レベルを達成し、本発明による所望の効果の達成を可能にするために必要又は有益のいずれかであってもよい。したがって、本発明のプロモーター配列は、糖輸送が可能なポリペプチド及び／又は本発明のグリコシルトランスフェラーゼの転写及び／又は発現の調節を可能にし、ＨＭＯ又はＨＭＯ前駆体の最適な生合成及び輸送及び／又はＨＭＯ生産の副生成物の分解をもたらす。
本発明において、プロモーターは、遺伝子改変細胞における１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産の最適レベルを達成し、本発明による所望の効果の達成を可能にするために必要又は有益のいずれかであってもよい。したがって、本発明のプロモーター配列は、糖輸送が可能なポリペプチド及び／又は本発明のグリコシルトランスフェラーゼの転写及び／又は発現の調節を可能にし、ＨＭＯ又はＨＭＯ前駆体の最適な生合成及び輸送及び／又はＨＭＯ生産の副生成物の分解をもたらす。
【0105】
本発明の遺伝子改変細胞においては、１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産に関連する少なくとも１つの遺伝子、プロモーターＤＮＡ配列、及びリボソーム結合部位配列（例えば、シャイン・ダルガルノ配列）などのその他の調節配列をコード化する核酸コンストラクトが、遺伝子改変細胞に含まれる。遺伝子改変細胞において、１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産に関連する遺伝子又は遺伝子群を発現させることにより、ＨＭＯの生産が可能となり、宿主細胞は、記載したように本発明を実施するための「適切な宿主細胞」となる。遺伝子改変細胞において、上述のようにＨＭＯの生合成生産に関連する遺伝子又は遺伝子群を発現させることにより、遺伝子改変細胞の懸濁液を含んでなる発酵培地１リットルから、０．０３ｇ／ｌ／ＯＤ（光学濃度）のレベルで１つ又は複数のＨＭＯを生産できるようになる。したがって、ＨＭＯレベルは、少なくとも０．４ｇ／Ｌ／ＯＤなど、約０．０５ｇ／ｌ／ＯＤ～約０．５ｇ／ｌ／ＯＤであり得る。本発明の目的のために、ＨＭＯ産生のレベルは「十分」であると見なされ、このレベルの所望のＨＭＯ又はＨＭＯ混合物を産生できる遺伝子改変細胞は、本発明を実施するための適切な遺伝子改変細胞と見なされる。
【0106】
したがって、本発明に照らして、「適切な遺伝子改変細胞」は、上記のようにさらに改変されて、例えばｆｒｅｄなどのＭＦＳファミリーの糖輸送が可能な糖ポリペプチドが発現され、より高いＨＭＯレベル又は生合成生産、生合成生産におけるより高いレベルの純度、より迅速な生産時間、及び／又はより効率的なＨＭＯの生合成生産などであるがこれらに限定されるものではない、有利なＨＭＯ生産が何らかの形で達成され得る。
【0107】
［生産方法］
本発明の第２の態様は、１つ又は複数のＨＭＯを製造するための方法に関し、方法は、以下のステップを含んでなる：
（ｉ）ＨＭＯを産生できる遺伝子改変細胞を提供するステップ、ここで、前記細胞は、配列番号１のタンパク質をコード化する組換え核酸、又はその機能的相同体を含んでなり、そのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも９５．５％、好ましくは少なくとも９６％同一、より好ましくは少なくとも９９．９％同一であるなど９５．４％を超えて同一である；
（ｉｉ）（ｉ）の細胞を適切な細胞培養培地で培養し、ＨＭＯ産生及びＤＮＡ配列発現を可能にし、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｒｅｏｆ）を有するタンパク質を生産するステップ、そのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも９５．５％、好ましくは少なくとも９６％同一、より好ましくは少なくとも９９．９％同一であるなど９５．４％を超えて同一である；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で生産されたＨＭＯを収穫するステップ。
本発明の第２の態様は、１つ又は複数のＨＭＯを製造するための方法に関し、方法は、以下のステップを含んでなる：
（ｉ）ＨＭＯを産生できる遺伝子改変細胞を提供するステップ、ここで、前記細胞は、配列番号１のタンパク質をコード化する組換え核酸、又はその機能的相同体を含んでなり、そのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも９５．５％、好ましくは少なくとも９６％同一、より好ましくは少なくとも９９．９％同一であるなど９５．４％を超えて同一である；
（ｉｉ）（ｉ）の細胞を適切な細胞培養培地で培養し、ＨＭＯ産生及びＤＮＡ配列発現を可能にし、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｒｅｏｆ）を有するタンパク質を生産するステップ、そのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも９５．５％、好ましくは少なくとも９６％同一、より好ましくは少なくとも９９．９％同一であるなど９５．４％を超えて同一である；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で生産されたＨＭＯを収穫するステップ。
【0108】
本発明によれば、「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」（又は「培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」又は「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）」、また「発酵」とも称される）という用語は、産業界で知られている方法による制御されたバイオリアクター内の細菌発現細胞の増殖に関する。
【0109】
１つ又は複数のＨＭＯを生産するために、本明細書に記載のＨＭＯ産生細菌は、例えば、グルコース、グリセロール、ラクトースなどの適切な炭素源の存在下で当該技術分野で公知の手順に従って培養され、生産されたＨＭＯは、培養培地及び培養プロセス中に形成された微生物バイオマスから収穫される。その後、ＨＭＯは、例えば、国際公開第２０１５１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７１８２９６５号パンフレット又は国際公開第２０１７１５２９１８号パンフレットに記載されているような、当該技術分野で公知の手順に従って精製され、精製されたＨＭＯは、栄養補給食品、医薬品、又は例えば研究などのその他の目的のために使用される。
【0110】
ＨＭＯの製造は、典型的には、大量の培養を実施することによって達成される。本発明の意味における「製造」及び「製造規模」という用語は、５Ｌの最小容量の培養液を用いた発酵を定義する。通常、「製造規模」のプロセスは、目的の生成物を含有する調製物を大量に処理でき、例えば治療用化合物又は組成物の場合、臨床試験並びに市場供給の要求量を満たす量の目的のタンパク質をもたらし得ることによって定義される。振盪フラスコ培養のような単純な実験室規模の方法とは対照的に、製造規模の方法は、大容量に加えて、撹拌、通気、栄養供給、プロセスパラメーター（ｐＨ、温度、溶存酸素濃度、背圧など）の監視と制御のための装置を備えたバイオリアクター（発酵槽）の技術システムの使用によって特徴付けられる。開示の実施例に記載されている、振盪フラスコ、卓上バイオリアクター又は深型ウェルフォーマットなど、実験室規模の方法における発現系の挙動は、かなりの程度、バイオリアクターの複雑な環境におけるその発現系の挙動を予測きるようにする。
【0111】
発酵プロセスで使用される適切な細胞培地に関しては、制限はない。培養液は、半定義であっても、すなわち複合培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸など）を含有してもよく、又はそれは複合化合物を含有しない既知組成であってもよい。
【0112】
「１つ又は複数のＨＭＯ」という用語は、ＨＭＯ産生細胞が、単一のＨＭＯ構造（第１のＨＭＯ）又は複数のＨＭＯ構造（第２、第３などのＨＭＯ）を産生できてもよいことを意味する。いくつかの実施形態では、単一のＨＭＯを産生する遺伝子改変細胞が好ましくあってもよく、その他の好ましい実施形態では、複数のＨＭＯ構造を産生する遺伝子改変細胞が好ましくあってもよい。単一のＨＭＯ構造を産生する遺伝子改変細胞の非限定的な例は、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ又はＬＮＴ－２産生細胞である。複数のＨＭＯ構造を産生できる遺伝子改変細胞の非限定的例は、ＤＦＬ、ＦＳＬ、ＬＮＴＬＮｎＴ、ＬＮＦＰ Ｉ、ＬＮＦＰ ＩＩ、ＬＮＦＰ ＩＩＩ、ＬＮＦＰ ＩＶ、ＬＮＦＰ Ｖ、ｐＬＮｎＨ、ｐＬＮＨ２産生細胞であり得る。
【0113】
特に、本発明は、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＤＦＬ、及びＬＮＴ産生細胞からなる群から選択される単一のＨＭＯ構造からなる群から選択される、１つ又は複数を産生する遺伝子改変細胞に関する。
【0114】
本発明の文脈における「収穫」という用語は、発酵の終了に続いて、生産されたＨＭＯを収集することに関する。異なる実施形態では、バイオマス（すなわち、遺伝子改変細胞）と培養培地の双方に含まれるＨＭＯを、すなわち、バイオマスから発酵ブロスを分離する前に／分離なしに収集することを含んでもよい。その他の実施形態では、生産されたＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスとは別々に、すなわち、培養培地（すなわち、発酵ブロス）からのバイオマスの分離の後に／それに続いて収集されてもよい。培地からの細胞の分離は、任意の適切なタイプの遠心分離又は濾過など、当業者に良く知られた任意の方法で実施され得る。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスを収穫した直後でも、又は適切な条件で発酵ブロスを保存した後の段階でも行われ得る。残りのバイオマス（又は発酵全体）からの生産されたＨＭＯの回収には、バイオマス（産生細胞）からのＨＭＯの抽出が含まれる。それは、例えば、超音波処理、煮沸、均質化、リゾチームを使用する酵素溶解、又は凍結及び粉砕による、当該技術分野の任意の適切な方法によって行われ得る。
【0115】
発酵からの回収後、ＨＭＯはさらなる処理と精製のために利用可能である。
【0116】
発酵によって生産されたＨＭＯの精製は、国際公開第２０１６０９５９２４号パンフレット、国際公開第２０１５１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７１５２９１８号パンフレット、国際公開第２０１７１８２９６５号パンフレット、米国特許第２０１９０１１９３１４号明細書（全て参照により援用される）に記載されている適切な手順を用いて行い得る。
【0117】
本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、いくつかのＨＭＯを産生してもよく、ここで、１つのＨＭＯは「生成物」ＨＭＯであり、その他の一部／全部のＨＭＯは「副生成物」ＨＭＯである。典型的には、副生成物ＨＭＯは、主要なＨＭＯ前駆体であるか、又は主要なＨＭＯがさらに修飾された生成物であるかのどちらかである。いくつかの実施形態では、生成物ＨＭＯが豊富な量で生産され、副生成物ＨＭＯが少量で生産されることが望ましくあってもよい。本明細書に記載のＨＭＯ生成のための細胞及び方法は、例えば、一実施形態では、生成されたＨＭＯ混合物である、定義されたＨＭＯプロファイルを有するＨＭＯ生成物の制御された生産を可能にし、ここで、生成物ＨＭＯは、混合物のその他のＨＭＯ（すなわち、副生成物ＨＭＯ）と比較して優勢なＨＭＯであり、すなわち、生成物ＨＭＯは、その他の副生成物ＨＭＯよりも大量に生産され；その他の実施形態では、同じＨＭＯ混合物を産生する細胞は、生成物ＨＭＯよりも大量に、１つ又は複数の副生成物ＨＭＯを生成するように調整されてもよい。例えば、生成物ＨＭＯである２’－ＦＬ及び／又は３－ＦＬの生産中に、多くの場合、ＨＭＯ副生成物である顕著な量のＤＦＬが生産される。本発明の遺伝子改変細胞を用いて、２’－ＦＬ及び／又は３－ＦＬ生成物中のＤＦＬのレベルを著しく低下させ得る。
【0118】
有利なことに、本発明は、生成物に対する副生成物の比率の減少と、生成物（及び／又は全体としてのＨＭＯ）の全体的な収率の増加の双方を提供する。この生成物形成に比べて少ない副生成物形成は、生成物の生産量を増加させ、生産プロセスと生成物回収プロセスの双方の効率を向上させ、ＨＭＯの優れた製造手順を提供する。
【0119】
異なる好ましい実施形態では、生成物又は副生成物ＨＭＯとして、２’－ＦＬ、３－ＦＬ、ＤＦＬ及び／又はＬＮＴを産生する異なる遺伝子改変細胞が選択されてもよい。好ましい一実施形態では、生成物は３－ＦＬである。別の好ましい実施形態では、生成物は２’－ＦＬであり、副生成物はＤＦＬである。別の好ましい実施形態では、生成物はＬＮＴ－２であり、副生成物はＬＮＴ及びＬＮＦＰ Ｉである。
【0120】
記載されている本発明の好ましいＨＭＯ生成物は、２’－ＦＬ、ＬＮＴ及び３－ＦＬである。
【0121】
［用途］
本発明はまた、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の生産に使用するための、本明細書に記載の宿主細胞の使用に関する。特に、本発明は、特定のＨＭＯの生産のための本明細書に記載の宿主細胞の使用に関し、ここで、宿主細胞は、１つの特定のＨＭＯの大部分を作製することを目的として選択され、好ましくは２’－ＦＬ、３－ＦＬ、及びＬＮＴ、現在最も好ましくは３－ＦＬから選択される。
本発明はまた、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の生産に使用するための、本明細書に記載の宿主細胞の使用に関する。特に、本発明は、特定のＨＭＯの生産のための本明細書に記載の宿主細胞の使用に関し、ここで、宿主細胞は、１つの特定のＨＭＯの大部分を作製することを目的として選択され、好ましくは２’－ＦＬ、３－ＦＬ、及びＬＮＴ、現在最も好ましくは３－ＦＬから選択される。
【0122】
［一般事項］
説明された本発明に関連して上述された任意の特徴及び／又は態様は、本明細書に記載された方法に類推適用されるものと理解されるべきである。
説明された本発明に関連して上述された任意の特徴及び／又は態様は、本明細書に記載された方法に類推適用されるものと理解されるべきである。
【0123】
以下に、本発明を説明するための図面と実施例を示す。これらは例証を意図し、いかなる意味においても限定的に解釈されるものではない。
【0124】
［実施例］
［材料と方法］
特に明記されない限り、分子生物学の分野で知られている標準技術、ベクター、制御配列エレメント、及びその他の発現系要素が、核酸の操作、形質転換、及び発現に使用される。このような標準技術、ベクター、及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２．）（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に見いだされ得る。
［材料と方法］
特に明記されない限り、分子生物学の分野で知られている標準技術、ベクター、制御配列エレメント、及びその他の発現系要素が、核酸の操作、形質転換、及び発現に使用される。このような標準技術、ベクター、及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＤＮＡ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２．）（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に見いだされ得る。
【0125】
以下に説明する実施形態は、本発明を例証するために選択されたものであり、本発明をいかなる意味においても限定するものではない。
【0126】
［菌株］
本実施例で利用された菌株は、以下の表３に記載されている。
本実施例で利用された菌株は、以下の表３に記載されている。
【0127】
【表5】
【0128】
［培養］
特に明記されない限り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、０．２％グルコースを含有する基礎最小培地中で、３７℃で撹拌しながら増殖させた。寒天プレートは、３７℃で一晩培養した。
特に明記されない限り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、０．２％グルコースを含有する基礎最小培地中で、３７℃で撹拌しながら増殖させた。寒天プレートは、３７℃で一晩培養した。
【0129】
基礎最小培地は、以下の組成を有した：ＮａＯＨ（１ｇ／Ｌ）、ＫＯＨ（２．５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（７ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（７ｇ／Ｌ）、クエン酸（０．５ｇ／ｌ）、微量ミネラル溶液（５ｍＬ／Ｌ）。微量ミネラルストック溶液は、以下を含有した：ＺｎＳＯ４
＊７Ｈ２００．８２ｇ／Ｌ、クエン酸２０ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４
＊Ｈ２Ｏ０．９８ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４
＊７Ｈ２Ｏ３．９２５ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４
＊５Ｈ２Ｏ０．２ｇ／Ｌ。基礎最小培地のｐＨを５ＮのＮａＯＨで７．０に調整し、オートクレーブした。接種前に、基礎最小培地に、１ｍＭのＭｇＳＯ４、４μｇ／ｍＬのチアミン、０．５％の所与の炭素源（グリセロール（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ））を供給した。チアミン及び抗生物質は、濾過によって滅菌した。グリセロールの全ての濃度百分率はｖ／ｖとして表し、グルコースの場合はｗ／ｖとして表す。
【0130】
［化学コンピテント細胞及び形質転換］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をＬＢプレートから０．２％グルコース含有５ｍＬ ＬＢに接種し、３７℃で約０．４のＯＤ６００まで振盪した。１３．０００ｇで２５秒間遠心分離することによって、２ｍＬの培養物を収穫した。上清を除去し、細胞ペレットを６００μＬの冷ＴＢ溶液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１５ｍＭのＣａＣｌ２、２５０ｍＭのＫＣｌ）に再懸濁した。細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、１３．０００ｇで１５秒間のペレット化がそれに続いた。上清を除去し、細胞ペレットを１００μＬの冷ＴＢ溶液に再懸濁した。プラスミドの形質転換は、１００μＬのコンピテント細胞と１～１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを使用して行った。細胞とＤＮＡを氷上で２０分間インキュベートした後、４２℃で４５秒間熱ショックを与えた。氷上で２分間のインキュベーション後、４００μＬのＳＯＣ（２０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１８６ｇ／ＬのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、及び２０ｍＭのグルコース）を添加して、細胞培養物を振盪しながら１時間３７℃でインキュベートした後、選択プレート上にプレーティングした。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をＬＢプレートから０．２％グルコース含有５ｍＬ ＬＢに接種し、３７℃で約０．４のＯＤ６００まで振盪した。１３．０００ｇで２５秒間遠心分離することによって、２ｍＬの培養物を収穫した。上清を除去し、細胞ペレットを６００μＬの冷ＴＢ溶液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１５ｍＭのＣａＣｌ２、２５０ｍＭのＫＣｌ）に再懸濁した。細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、１３．０００ｇで１５秒間のペレット化がそれに続いた。上清を除去し、細胞ペレットを１００μＬの冷ＴＢ溶液に再懸濁した。プラスミドの形質転換は、１００μＬのコンピテント細胞と１～１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを使用して行った。細胞とＤＮＡを氷上で２０分間インキュベートした後、４２℃で４５秒間熱ショックを与えた。氷上で２分間のインキュベーション後、４００μＬのＳＯＣ（２０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１８６ｇ／ＬのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、及び２０ｍＭのグルコース）を添加して、細胞培養物を振盪しながら１時間３７℃でインキュベートした後、選択プレート上にプレーティングした。
【0131】
プラスミドを供給業者（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が推奨する条件で、ＴＯＰ１０化学コンピテント細胞に形質転換させた。
【0132】
［ＤＮＡ技術］
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からプラスミドＤＮＡを単離した。ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から染色体ＤＮＡを単離した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＰｈｕｓｉｏｎＵホットスタートＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＥＲ Ｅｎｚｙｍ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）は、供給業者の推奨に従って使用した。プライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された。ＰＣＲ断片及びプラスミドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって配列決定された。コロニーＰＣＲは、Ｔ１００（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において、ＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックスを使用して実行した。
ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からプラスミドＤＮＡを単離した。ＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から染色体ＤＮＡを単離した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＰｈｕｓｉｏｎＵホットスタートＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＵＳＥＲ Ｅｎｚｙｍ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）は、供給業者の推奨に従って使用した。プライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された。ＰＣＲ断片及びプラスミドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって配列決定された。コロニーＰＣＲは、Ｔ１００（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において、ＤｒｅａｍＴａｑ ＰＣＲマスターミックスを使用して実行した。
【0133】
本発明の遺伝子改変ＨＭＯ産生細胞で発現された異種タンパク質を表４に記載し、本発明の以下の例証において使用したプロモーターエレメントを表５に記載し、プラスミド骨格、プロモーター、エレメント、及びｆｒｅｄの増幅に使用したオリゴを表６に記載する。
【0134】
【表6】
【0135】
【表7】
【0136】
【表8】
【0137】
【表9】
【0138】
【表10】
【0139】
［プラスミドの構築］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへの相同組換えのために割り当てられた２つのＤＮＡ断片とＴ１転写ターミネーター配列とで区切られた、２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位を含有するプラスミド骨格を合成した。例えば、１つのプラスミド骨格（ｐＵＣ５７：：ｇａｌ）中で、ｇａｌオペロン（ｇａｌＫでの相同組換えに必要）と、Ｔ１転写ターミネーター配列とを合成した（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）。ｇａｌオペロンでの相同組換えに使用されるＤＮＡ配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１５５完全ゲノムＧｅｎＢａｎｋ：ＩＤ：ＣＰ０１４２２５．１の塩基対３．６２８．６２１～３．６２８．７２０及び３．６２７．５７２～３．６２７．６７１をカバーしていた。相同組換えによる挿入は、ｇａｌＫ及びｇａｌＫ－表現型の９４９塩基対の欠失をもたらすであろう。同様の方法で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへの相同組換えのために割り当てられた２つのＤＮＡ断片とＴ１転写ターミネーター配列とで区切られた２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位を含有する、ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）又はその他の適切なベクターをベースにした骨格が合成され得る。プライマーの設計及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１染色体ＤＮＡの特定のＤＮＡ配列の増幅のために、分子生物学の分野で良く知られている標準技術を使用した。このような標準技術、ベクター、及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）に見いだされ得る。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへの相同組換えのために割り当てられた２つのＤＮＡ断片とＴ１転写ターミネーター配列とで区切られた、２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位を含有するプラスミド骨格を合成した。例えば、１つのプラスミド骨格（ｐＵＣ５７：：ｇａｌ）中で、ｇａｌオペロン（ｇａｌＫでの相同組換えに必要）と、Ｔ１転写ターミネーター配列とを合成した（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）。ｇａｌオペロンでの相同組換えに使用されるＤＮＡ配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１５５完全ゲノムＧｅｎＢａｎｋ：ＩＤ：ＣＰ０１４２２５．１の塩基対３．６２８．６２１～３．６２８．７２０及び３．６２７．５７２～３．６２７．６７１をカバーしていた。相同組換えによる挿入は、ｇａｌＫ及びｇａｌＫ－表現型の９４９塩基対の欠失をもたらすであろう。同様の方法で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへの相同組換えのために割り当てられた２つのＤＮＡ断片とＴ１転写ターミネーター配列とで区切られた２つのＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ部位を含有する、ｐＵＣ５７（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）又はその他の適切なベクターをベースにした骨格が合成され得る。プライマーの設計及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１染色体ＤＮＡの特定のＤＮＡ配列の増幅のために、分子生物学の分野で良く知られている標準技術を使用した。このような標準技術、ベクター、及びエレメントは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｕｋｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）に見いだされ得る。
【0140】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１から得られた染色体ＤＮＡを使用し、オリゴＯ２６１及びＯ２６２を使用したプロモーターＰｇｌｐＦ、オリゴＯ２６１及びＯ４５９を使用したＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、及びオリゴＯ２６１及びＯ４６２を使用したＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７を含有する、３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した（表６）。
【0141】
エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）に由来するｆｒｅｄ遺伝子のコドン最適化バージョンである配列番号２を含有する１．１８２ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成した（表４）。ｆｒｅｄ遺伝子は、オリゴＫＡＢＹ７３３とＫＡＢＹ７３４を使用して増幅した。
【0142】
全てのＰＣＲ断片（プラスミド骨格、プロモーター含有エレメント、及びｆｒｅｄ遺伝子）を精製し、プラスミド骨格、プロモーターエレメント（Ｐｌａｃ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４又はＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７）、及びｆｒｅｄ（又はその他の目的の遺伝子、表４を参照されたい）含有ＤＮＡ断片を組み立てた。プラスミドは、標準的なＵＳＥＲクローニングによってクローン化した。任意の割り当てられたプラスミドのクローニングは、標準的なＤＮＡクローニング技術を用いて実行され得る。プラスミドをＴＯＰ１０細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（又は任意の割り当てられた抗生物質）と０．２％グルコースとを含有するＬＢプレート上で選択した。構築されたプラスミドを精製し、プロモーター配列とｆｒｅｄ遺伝子の５’末端は、ＤＮＡ配列決定（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって検証された。このようにして、ｆｒｅｄ遺伝子（又はその他の目的の遺伝子、表４を参照されたい）に連結された、任意の目的のプロモーターを含有する遺伝子カセットを構築した。
【0143】
［菌株の構築］
使用した細菌株ＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型に加えて、ＭＤＯは以下の改変を有する：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子上流のＰｌａｃプロモーターの挿入。
使用した細菌株ＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型に加えて、ＭＤＯは以下の改変を有する：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子上流のＰｌａｃプロモーターの挿入。
【0144】
ｆｒｅｄ遺伝子と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１ ＭＤＯの染色体ＤＮＡのＴ１転写ターミネーター配列とにリンクされたプロモーターを含有する発現カセットの挿入は、Ｈｅｒｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅｒｒｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．，Ｇｌａｓｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ，Ｆ．Ｒ．（２００３）．Ｇｅｎｅ（３１１）．１５３－１６３）によって記載されたように、Ｇｅｎｅ Ｇｏｒｇｉｎｇによって実行した。簡潔に述べると、ドナープラスミドとヘルパープラスミドをＭＤＯに同時形質転換し、０．２％グルコース、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）又はカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）、及びクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレート上で選択した。単一コロニーを、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）及び１０μＬの２０％Ｌ－アラビノースを含有する１ｍＬのＬＢに接種し、３７℃で振盪しながら７～８時間培養した。次に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のｇａｌＫ遺伝子座に組み込むために、Ｍ９－ＤＯＧプレート上にプレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートした。ＭＭ－ＤＯＧプレート上に形成した単一コロニーを、０．２％グルコースを含有するＬＢプレート上に再度画線塗抹し、３７℃で２４時間インキュベートした。マッコンキー・ガラクトース寒天プレート上で白く見え、アンピシリンとクロラムフェニコールの双方に感受性であるコロニーは、ドナーとヘルパープラスミドを失い、ｇａｌＫ遺伝子座への挿入を含有していると予想された。ｇａｌＫ部位への挿入は、プライマーＯ４８（配列番号１７）及びＯ４９（配列番号１８）を使用したコロニーＰＣＲによって同定し、挿入されたＤＮＡは、配列決定（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検証された。
【0145】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体ＤＮＡのその他の遺伝子座への遺伝子カセットの挿入は、異なる選択マーカー遺伝子と異なるスクリーニング方法を使用して、同様の方法で実行した。
【0146】
［深型ウェルアッセイ］
深型ウェルアッセイは、Ｌｖ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ（２０１６）３９：１７３７－１７４７）に最初に記載されたように実施して、本発明の目的のために最適化した。具体的には、実施例で開示された菌株を、２４枚の深型ウェルプレート内で４日間のプロトコルでスクリーニングした。最初の２４時間で、振盪機培養細胞を３４℃、７００ｒｐｍで振盪しながら高密度に増殖させる一方、続く４８時間で２’－ＦＬ及び３－ＦＬ産生細胞、７２時間でＬＮＴ産生細胞を、遺伝子発現と生成物の形成を誘導できる培地に移した。具体的には、１日目に、硫酸マグネシウム、チアミン、及びグルコースを添加した基礎最小培地を使用して、新鮮な接種材料を調製した。２４時間のインキュベーション後、細胞を硫酸マグネシウムとチアミンを添加した新しい基礎最小培地（２ｍｌ）に移し、２０％グルコース溶液（１μｌ）と１０％ラクトース溶液（０．１ｍｌ）からなる初期ボーラスを添加し、次に、炭素源として５０％スクロース溶液（０．０４ｍｌ）を細胞に供給し、スクロースヒドロラーゼ（インベルターゼ、５μｌの０．１ｇ／Ｌ溶液）を添加して、インベルターゼによるスクロースの切断によって、増殖のためにグルコースが緩慢な速度で供給されるようにした。新しい培地を接種した後、細胞を７００ｒｐｍ、２８℃で４８時間振とうした。変性と引き続く遠心分離の後、上清をＨＰＬＣによって分析した。全サンプルの分析のために、煮沸によって調製された細胞溶解物を、４．７００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってペレット化した。上清中のＨＭＯ濃度は、ＨＰＬＣ又はＨＰＡＣ法によって判定した。
深型ウェルアッセイは、Ｌｖ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ（２０１６）３９：１７３７－１７４７）に最初に記載されたように実施して、本発明の目的のために最適化した。具体的には、実施例で開示された菌株を、２４枚の深型ウェルプレート内で４日間のプロトコルでスクリーニングした。最初の２４時間で、振盪機培養細胞を３４℃、７００ｒｐｍで振盪しながら高密度に増殖させる一方、続く４８時間で２’－ＦＬ及び３－ＦＬ産生細胞、７２時間でＬＮＴ産生細胞を、遺伝子発現と生成物の形成を誘導できる培地に移した。具体的には、１日目に、硫酸マグネシウム、チアミン、及びグルコースを添加した基礎最小培地を使用して、新鮮な接種材料を調製した。２４時間のインキュベーション後、細胞を硫酸マグネシウムとチアミンを添加した新しい基礎最小培地（２ｍｌ）に移し、２０％グルコース溶液（１μｌ）と１０％ラクトース溶液（０．１ｍｌ）からなる初期ボーラスを添加し、次に、炭素源として５０％スクロース溶液（０．０４ｍｌ）を細胞に供給し、スクロースヒドロラーゼ（インベルターゼ、５μｌの０．１ｇ／Ｌ溶液）を添加して、インベルターゼによるスクロースの切断によって、増殖のためにグルコースが緩慢な速度で供給されるようにした。新しい培地を接種した後、細胞を７００ｒｐｍ、２８℃で４８時間振とうした。変性と引き続く遠心分離の後、上清をＨＰＬＣによって分析した。全サンプルの分析のために、煮沸によって調製された細胞溶解物を、４．７００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってペレット化した。上清中のＨＭＯ濃度は、ＨＰＬＣ又はＨＰＡＣ法によって判定した。
【0147】
［実施例１－２’－ＦＬの生産］
［ｆｒｅｄ遺伝子を発現する２’－ＦＬ生産のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の遺伝子操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ）株は、目的の異種遺伝子を発現するように操作され得る。例えば、菌株１は、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ｆｕｔＣ、及びコラン酸遺伝子（ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢ）を過剰発現する２’－ＦＬ産生株である。ｆｒｅｄに連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ）を含有する発現カセットを菌株１の背景に単一コピーで挿入すると、菌株２がもたらされた。深型ウェルアッセイからの結果は、ＰｇｌｐＦを使用したｆｒｅｄ遺伝子の発現が、ｉ）２’－ＦＬ産生量を１．１５倍増加させ（総２’－ＦＬ産生量の１５％増加）、ｉｉ）細胞画分中の２’－ＦＬの量を低下させ、培地中の２’－ＦＬの量を増加させることによって、２’－ＦＬ生成物の分布を改善することを示した。
［ｆｒｅｄ遺伝子を発現する２’－ＦＬ生産のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の遺伝子操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ）株は、目的の異種遺伝子を発現するように操作され得る。例えば、菌株１は、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ｆｕｔＣ、及びコラン酸遺伝子（ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢ）を過剰発現する２’－ＦＬ産生株である。ｆｒｅｄに連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ）を含有する発現カセットを菌株１の背景に単一コピーで挿入すると、菌株２がもたらされた。深型ウェルアッセイからの結果は、ＰｇｌｐＦを使用したｆｒｅｄ遺伝子の発現が、ｉ）２’－ＦＬ産生量を１．１５倍増加させ（総２’－ＦＬ産生量の１５％増加）、ｉｉ）細胞画分中の２’－ＦＬの量を低下させ、培地中の２’－ＦＬの量を増加させることによって、２’－ＦＬ生成物の分布を改善することを示した。
【0148】
［実施例２－３－ＦＬの生産］
［ｆｒｅｄ遺伝子を発現する３－ＦＬ生産のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の遺伝子操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ）株は、目的の異種遺伝子を発現するように操作され得る。例えば、菌株３は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ｆｕｔＡ、及びコラン酸遺伝子（ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢ）を過剰発現する、３－ＦＬ産生株である。ｆｒｅｄに連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ）を含有する発現カセットを菌株３の背景に単一コピーで挿入すると、菌株４がもたらされた。深型ウェルアッセイからの結果は、ＰｇｌｐＦを使用したｆｒｅｄ遺伝子の発現が、ｉ）３－ＦＬ産生量をほぼ２倍増加させ（総３－ＦＬ生産量の９０％増加）、ｉｉ）細胞画分中の３－ＦＬの量を低下させ、培地中の３－ＦＬの量を増加させることによって、３－ＦＬ生成物の分布を改善することを示した。
［ｆｒｅｄ遺伝子を発現する３－ＦＬ生産のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の遺伝子操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ）株は、目的の異種遺伝子を発現するように操作され得る。例えば、菌株３は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ｆｕｔＡ、及びコラン酸遺伝子（ｇｍｄ－ｗｃａＧ－ｗｃａＨ－ｗｃａＩ－ｍａｎＣ－ｍａｎＢ）を過剰発現する、３－ＦＬ産生株である。ｆｒｅｄに連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ）を含有する発現カセットを菌株３の背景に単一コピーで挿入すると、菌株４がもたらされた。深型ウェルアッセイからの結果は、ＰｇｌｐＦを使用したｆｒｅｄ遺伝子の発現が、ｉ）３－ＦＬ産生量をほぼ２倍増加させ（総３－ＦＬ生産量の９０％増加）、ｉｉ）細胞画分中の３－ＦＬの量を低下させ、培地中の３－ＦＬの量を増加させることによって、３－ＦＬ生成物の分布を改善することを示した。
【0149】
［実施例３－ＬＮＴの生産］
［ｆｒｅｄ遺伝子を発現するＬＮＴ生産のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の遺伝子操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ）株は、目的の異種遺伝子を発現するように操作され得る。例えば、菌株５は、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼ、ｌｇｔＡ、及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼｇａｌＴＫを過剰発現する、ＬＮＴ産生株である。ｆｒｅｄに連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４）を含有する発現カセットを菌株５の背景に単一コピーで挿入すると、菌株６がもたらされた。ｆｒｅｄに連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７）を含有する発現カセットを菌株５の背景に単一コピーで挿入すると、菌株７がもたらされた。深型ウェルアッセイからの結果は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４又はＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７を使用したｆｒｅｄ遺伝子の発現が、ｉ）ＬＮＴの生産量を１．２～１．３倍に増加させ（ＬＮＴの総生産量の２０～３０％増加）、ｉｉ）細胞画分中のＬＮＴの量を低下させ、培地中のＬＮＴの量を増加させることによって、ＬＮＴ生成物の分布をわずかに改善することを示した。
［ｆｒｅｄ遺伝子を発現するＬＮＴ生産のための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の遺伝子操作］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２（ＤＨ１）ＭＤＯ）株は、目的の異種遺伝子を発現するように操作され得る。例えば、菌株５は、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼ、ｌｇｔＡ、及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼｇａｌＴＫを過剰発現する、ＬＮＴ産生株である。ｆｒｅｄに連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４）を含有する発現カセットを菌株５の背景に単一コピーで挿入すると、菌株６がもたらされた。ｆｒｅｄに連結されたプロモーターエレメント（ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７）を含有する発現カセットを菌株５の背景に単一コピーで挿入すると、菌株７がもたらされた。深型ウェルアッセイからの結果は、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４又はＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７を使用したｆｒｅｄ遺伝子の発現が、ｉ）ＬＮＴの生産量を１．２～１．３倍に増加させ（ＬＮＴの総生産量の２０～３０％増加）、ｉｉ）細胞画分中のＬＮＴの量を低下させ、培地中のＬＮＴの量を増加させることによって、ＬＮＴ生成物の分布をわずかに改善することを示した。
【0150】
［実施例１～３の要約］
２’－ＦＬ、ＬＮＴ又は３－ＦＬ産生株におけるｆｒｅｄの染色体発現はＨＭＯ生産量を増加させ、２’－ＦＬ及び３－ＦＬの場合、ｆｒｅｄの発現は細胞内（ペレット画分）のＨＭＯの量を減少させた。
２’－ＦＬ、ＬＮＴ又は３－ＦＬ産生株におけるｆｒｅｄの染色体発現はＨＭＯ生産量を増加させ、２’－ＦＬ及び３－ＦＬの場合、ｆｒｅｄの発現は細胞内（ペレット画分）のＨＭＯの量を減少させた。
【0151】
したがって、主要促進剤スーパーファミリータンパク質ｆｒｅｄによるＨＭＯの搬出は、産生株のＨＭＯ生産能力を増加させる。
【0152】
【表11】
【0153】
［実施例４－ＶａｇトランスポーターはＬＮｎＴに対する高い選択性を備えた新規ＬＮＴ－２コアトランスポーターである］
【0154】
【表12】
【0155】
目的のトランスポーター又はグリコシルトランスフェラーゼをコード化する異種遺伝子のＤＮＡ配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってコドン最適化され合成された。表４に示すトランスポータータンパク質をコード化する目的の遺伝子は、遺伝子の開始コドンＡＴＧと停止コドンＴＡＡをカバーする、割り当てられたプライマーを使用したＰＣＲによって増幅された（表３）。任意の目的の異種遺伝子を含むドナープラスミドを構築するために、標準的なＵＳＥＲクローニングを採用し、関連する骨格、プロモーターエレメント、及び目的の遺伝子の精製されたＰＣＲ断片が組み合わされた。割り当てられたプラスミドのクローニングは、標準的なＤＮＡクローニング技術を用いて実行され得る。クローニングに続いて、ＤＮＡをＴＯＰ１０細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン（又は適用する骨格に応じて５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン）と０．２％グルコースとを含有するＬＢプレート上で選択した。構築されたプラスミドを精製し、プロモーター配列と目的の遺伝子の５’末端は、ＤＮＡ配列決定（ＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって検証された。
【0156】
［菌株の構築］
使用した細菌株ＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型に加えて、ＭＤＯは以下の改変を有する：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子上流のＰｌａｃプロモーターの挿入。
使用した細菌株ＭＤＯは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１から構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型に加えて、ＭＤＯは以下の改変を有する：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失、及びｇｍｄ遺伝子上流のＰｌａｃプロモーターの挿入。
【0157】
ｖａｇ遺伝子とＴ１転写ターミネーター配列とに連結されたプロモーターを含有する発現カセットの挿入は、本質的にＨｅｒｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ（Ｈｅｒｒｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．，Ｇｌａｓｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ，Ｆ．Ｒ．（２００３）．Ｇｅｎｅ（３１１）．１５３－１６３）によって記載されたようにＧｅｎｅ Ｇｏｒｇｉｎｇによって実施し、本出願で提示された菌株を構築するために使用されるヘルパー及びドナープラスミドの例を表６に提供する。簡潔に述べると、ドナープラスミドとヘルパープラスミドをＭＤＯに同時形質転換し、０．２％グルコース、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）又はカナマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）、及びクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレート上で選択した。単一コロニーを、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）及び１０μＬの２０％Ｌ－アラビノースを含有する１ｍＬのＬＢに接種し、３７℃で振盪しながら７～８時間培養した。次に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のｇａｌＫ遺伝子座に組み込むために、Ｍ９－ＤＯＧプレート上にプレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートした。ＭＭ－ＤＯＧプレート上に形成した単一コロニーを、０．２％グルコースを含有するＬＢプレート上に再度画線塗抹し、３７℃で２４時間インキュベートした。マッコンキー・ガラクトース寒天プレート上で白く見え、アンピシリンとクロラムフェニコールの双方に感受性であるコロニーは、ドナーとヘルパープラスミドを失い、ｇａｌＫ遺伝子座への挿入を含有していると予想された。ｇａｌＫ部位への挿入は、プライマーＯ４８（配列番号１７）及びＯ４９（配列番号１８）を使用したコロニーＰＣＲによって同定し、挿入されたＤＮＡは、配列決定（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって検証された。
【0158】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体ＤＮＡのその他の遺伝子座への遺伝子カセットの挿入は、異なる選択マーカー遺伝子を使用して、同様の方法で実行した。
【0159】
［配列アライメント］
ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上で、ＢＬＡＳＴ２．１．２（基本的局所アライメント検索ツール）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０）で実装されたヒューリスティックなペアワイズ配列アライメントを実行し、本発明で言及されるトランスポータータンパク質配列間の相同性を検証した。全てのパラメーターは、全てのＢＬＡＳＴアライメントでデフォルト値に保った。
ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上で、ＢＬＡＳＴ２．１．２（基本的局所アライメント検索ツール）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０）で実装されたヒューリスティックなペアワイズ配列アライメントを実行し、本発明で言及されるトランスポータータンパク質配列間の相同性を検証した。全てのパラメーターは、全てのＢＬＡＳＴアライメントでデフォルト値に保った。
【0160】
本発明において、本発明者らは、参考株、すなわちＭＰ３６７２を使用して、宿主細胞からＬＮｎＴを搬出するための選択された異種ＭＦＳトランスポーターの能力を試験した。この菌株は、生成物の形成に必要な各異種グリコシルトランスフェラーゼのＰｇｌｐＦ駆動コピーを１つ有する。
【0161】
選択された異種トランスポーター遺伝子、すなわちｖａｇ、ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０、ｍａｒｃ、ｂａｄ、ｎｅｃ、ｙａｂＭ、及びｆｒｅｄ（表４）の各１コピーを、中程度の転写レベルを提供することが知られているＰｌａｃプロモーターの制御下で、ＭＰ３６７２株のゲノムに個別に組み込んだ。Ｐｌａｃプロモーターのリボソーム結合部位（すなわち、翻訳開始部位の１６ｂｐ上流）は、合成された転写産物へのリボソーム結合を強化するように修飾されており（表５を参照）、このようにしてＰｌａｃ駆動発現が翻訳レベルで正に制御される。
【0162】
上記の菌株遺伝子操作アプローチとＤＷＡでの菌株性能の試験に続いて、本発明者らは、Ｖａｇを発現するＬＮｎＴ産生細胞のみが、参考株と比較して、生産されたＬＮｎＴの流出とＬＮｎＴの総産生の双方における相対的な増加を示すことをここで報告する。
【0163】
図７に示すように、ほとんどのトランスポーター遺伝子（ｍａｒｃ、ｆｒｅｄ、ｂａｄ、ｎｅｃ、ｙａｂＭ、ｙｂｅｒＣ０００１＿９４２０）のＰｌａｃ駆動型発現は、ＬＮｎＴ生産に有意な影響を及ぼさないか、又はそれを減少させる（４５％まで）。逆に、ＭＰ３６７２株の遺伝的背景にｖａｇ遺伝子を導入すると、ＬＮｎＴ力価は顕著に上昇する（図７）。
【0164】
試験した７つの推定ＭＳＦトランスポーターのアミノ酸配列のアライメントは、Ｖａｇトランスポーターが、本発明で試験した残りの６つのトランスポーターに対して非常に高い配列カバー率（９９～１００％）を有し、配列同一性が６５％～７５％の範囲であることを明らかにした。最も高い配列同一性（７５％）は、Ｖａｇの配列と、ｙａｂＭ遺伝子によってコード化されるＭＦＳトランスポーターの配列とについてスコア付けされた（表８）。興味深いことに、国際公開第２０１７０４２３８２号パンフレットでＬＮＴの推定有効搬出体として記載されているＭＦＳトランスポーターＹａｂＭは、最終的な総ＬＮｎＴ力価にもＬＮｎＴ流出にも有意な影響を示さなかった（図７、８）。このように、Ｖａｇとの比較的高いタンパク質配列類似性に反して、ＹａｂＭトランスポーターはＬＮｎＴ輸送に関して効果がないようであり、これは対応する宿主細胞培養物の細胞外画分中に検出される生成物濃度によって明確に反映されている（図８）。具体的には、細菌培養の上清画分を解析によって明らかになったように、ＭＰ３９９４株（ｖａｇ発現細胞）の細胞外ＬＮｎＴ濃度は、ＭＰ４３６２株（ｙａｂＭ発現細胞）及びＭＰ３６７２株（異種トランスポーターを発現しない参考細胞）に比べてはるかにより高かった（図８）。
【0165】
総合すると、このデータは、ＶａｇトランスポーターがＬＮｎＴの効率的なトランスポーターであることを示唆する。この結論は、同じ参考株において同じ培養条件と同じプロモーターＰｌａｃの制御下でゲノム発現された、７つのトランスポーター遺伝子のスクリーニング手順からの結果と、ＹａｂＭ及びＭａｒｃ（７５％及び７１％）などのＶａｇと比較的高い相同性を有するトランスポータータンパク質が、ＬＮｎＴを全く搬出しないか、又は搬出する場合は効率が非常に低いことを明らかにした、トランスポータータンパク質配列の解析との双方から導き出される。
【0166】
【表13】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】