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特表2023-511586造血幹細胞の増殖を促進するための方法およびその方法で使用するための薬剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-20
(54)【発明の名称】造血幹細胞の増殖を促進するための方法およびその方法で使用するための薬剤
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0789 20100101AFI20230313BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20230313BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230313BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230313BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20230313BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20230313BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0789
C12N9/02
A61K45/00
A61P43/00 111
A61P7/00
A61K31/4709
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022544839
(86)(22)【出願日】2021-01-22
(85)【翻訳文提出日】2022-08-05
(86)【国際出願番号】 FI2021050039
(87)【国際公開番号】W WO2021148720
(87)【国際公開日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】20205073
(32)【優先日】2020-01-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】504459559
【氏名又は名称】ファロン ファーマシューティカルズ オサケ ユキチュア
(74)【代理人】
【識別番号】110001896
【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヤルカネン、シルパ
(72)【発明者】
【氏名】イフテカール－イー－クダ、イムティアズ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B050DD11
4B050LL01
4B065AA94X
4B065AC20
4B065BC12
4B065CA44
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA51
4C084ZC20
4C086BC60
4C086GA07
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA51
4C086ZC20
(57)【要約】
血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）阻害剤は、造血幹細胞のエクスビボでの培養における活性酸素種（ＲＯＳ）濃度の調節因子として使用することができ、これは、エクスビボにおける増殖した造血幹細胞の集団を産生する方法を可能にする。さらに、ＶＡＰ－１阻害剤は、個体における骨髄抑制または骨髄不全の治療において使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
増殖した造血幹細胞の集団をエクスビボで産生する方法であって、前記方法が、血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができる血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）阻害剤と一緒に、造血幹細胞の集団をエクスビボで培養することを含み、前記ＶＡＰ－１阻害剤が、増殖した造血幹細胞の集団を産生するのに十分な量で存在する、方法。
【請求項2】
前記造血幹細胞がヒト細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記造血幹細胞が、臍帯血、骨髄および／または末梢血に由来することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ＶＡＰ－１阻害剤が、ＶＡＰ－１の酵素活性を阻害することができる低分子阻害剤を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
造血幹細胞のエクスビボでの培養における活性酸素種（ＲＯＳ）濃度の調節因子としての、血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができる血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）阻害剤の使用。
【請求項6】
血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができる血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）阻害剤を含む、造血幹細胞用の細胞増殖培養培地。
【請求項7】
骨髄抑制または骨髄不全の治療において使用するための、血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができる血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）阻害剤であって、前記ＶＡＰ－１阻害剤が造血幹細胞（ＨＳＣ）を維持および／または増殖させる、血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）阻害剤。
【請求項8】
ＶＡＰ－１阻害剤が、ＶＡＰ－１の酵素活性を阻害することができる低分子阻害剤を含むことを特徴とする、請求項７に記載の骨髄抑制または骨髄不全の治療において使用するための血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、造血幹細胞の増殖を促進するための方法、および造血幹細胞の増殖において使用するために好適な薬剤に関する。
【背景技術】
【0002】
健康なドナーから収集された骨髄（ＢＭ）または臍帯血（ＣＢ）から収集された造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植は、例えば、白血病、重度の再生不良性貧血、リンパ腫、多発性骨髄腫、および免疫不全障害を含むいくつかの造血病態の治療として使用される。それにより、ＨＳＣを含む病気の造血細胞を除去し、健康な細胞に置き換える。生後造血および造血幹細胞の維持は、ＨＳＣおよびその子孫が特殊なニッチに存在する骨髄で主に行われる。
【0003】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄（ＢＭ）における血管周囲幹細胞ニッチに高度に依存している。ＨＳＣとそれらの微小環境との間の相互作用の同定は、造血幹細胞移植および造血に影響を与える治療の分野における臨床的アプローチおよび機会の同定に役立ち得る。したがって、造血を調節するメカニズムをよりよく理解することは、血液疾患の理解に役立ち、また、ドナーからの臨床移植のために得ることができるＨＳＣの数が限定されるため、ＨＳＣの増殖を促進する方法が望ましいので、ＨＳＣのエクスビボでの増殖のための新しい方法の開発にも役立ち得る。
【発明の概要】
【0004】
今回、血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）は、幹細胞ニッチの構成要素であり、造血幹細胞（ＨＳＣ）の維持および増殖において役割を果たすことが分かった。ＶＡＰ－１は、造血幹細胞に近接して骨髄脈管系によって発現され、ＶＡＰ－１の欠如は、骨髄（ＢＭ）におけるＨＳＣならびに造血幹・前駆細胞（ＨＳＰＣ）の数に影響することが分かった。ＶＡＰ－１の酵素活性の阻害は、臍帯血および骨髄由来ＨＳＣの増殖を促進することが分かった。
【0005】
本願の発明者らは、ヒトＨＳＣの増殖におけるＶＡＰ－１の役割に加えて、独自のヒトＶＡＰ－１+ＨＳＣ亜集団も見出した。より具体的には、原始的なヒト造血幹細胞のサブセットは、ＶＡＰ－１陽性であり、特にそれらの増殖は、血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することによって達成することができることが分かっている。
【0006】
本発明の発見は、ＶＡＰ－１阻害剤を使用した臨床応用におけるＨＳＣの増殖方法を提供する。本発明の発見は、損傷後の骨髄回復の改善、骨髄移植の効果の増強、ならびにＨＳＣの動員、収穫および増殖の改善に役立ち得る。さらに、本発明の発見は、増殖した造血幹細胞の集団から利益を受けるいくつかの血液疾患または状態を治療するための新規の方法を提供する。本発明は、骨髄が正常に機能せず、患者が造血を促進する必要がある状態を治療するための方法を提供する。一態様において、臍帯血移植（ＵＣＢＴ）が、マッチするドナーを有しない患者のための確立された療法となり、以前に不治の病の治癒をもたらしたため、本発明の発見は、エクスビボでの臍帯血ＨＳＣ数を増加させるための新規の効率的な方法を提供する。
【0007】
血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）は、銅含有アミンオキシダーゼ（ＡＯＣ ３）またはセミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）としても知られる膜貫通タンパク質である。ＶＡＰ－１の細胞外アミンオキシダーゼ活性は、一級アミンの酸化的脱アミノ化を触媒する。反応は、対応するアルデヒドの形成、ならびにアンモニアおよび活性酸素種（ＲＯＳ）の１つであるＨ2Ｏ2の放出をもたらす。本発明によれば、ＶＡＰ－１阻害剤は、ＳＳＡＯ特異的過酸化水素の発生を低減することが観察されている。より詳細には、本発明において、ＶＡＰ－１阻害剤を使用して、必要とされる活性酸素種（ＲＯＳ）の一貫したレベルを維持し、それによってＨＳＣの増殖を促進することができることが見出されている。ＨＳＣの維持、増殖、および分化は、ＲＯＳ濃度に対して極めて敏感である。本発明は、ＶＡＰ－１阻害剤を使用してＶＡＰ－１の酵素活性を阻害することによって、ＲＯＳ濃度を制御するための方法であって、ＲＯＳのレベルが、ＨＳＣに成長優位性をもたらすレベルに低減される、方法を提供する。本発明において、ＶＡＰ－１の酵素活性、より具体的には、ＶＡＰ－１のアミンオキシダーゼ活性をブロックまたは阻害するＶＡＰ－１阻害剤を使用して、ＲＯＳの濃度に影響を与える。本発明は、ＲＯＳの濃度に影響を与える阻害剤化合物を使用したＨＳＣの改善された増殖に基づく。
【0008】
本発明の一態様によれば、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができる、ＳＳＡＯ阻害剤とも呼ばれるＶＡＰ－１阻害剤を、造血幹細胞のエクスビボでの培養において活性酸素種（ＲＯＳ）濃度の調節因子として使用する。
【0009】
別の態様によれば、本発明は、エクスビボで増殖した造血幹細胞の集団を産生する方法であって、当該方法が、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができる血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）阻害剤を用いてエクスビボで造血幹細胞を培養し、ＶＡＰ－１阻害剤が、増殖した造血幹細胞の集団を産生するのに十分な量で存在する、ことを含む、方法を提供する。本発明は、移植のための臍帯血および骨髄由来ＨＳＣのエクスビボでの増殖のための改善された方法を提供する。
【0010】
さらに、本発明は、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができる血管接着タンパク質（ＶＡＰ－１）阻害剤を含む造血幹細胞のための細胞増殖培養培地を提供する。
【0011】
第３の態様によれば、本発明はまた、個体において造血幹細胞の増殖を促進するための方法であって、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができるＶＡＰ－１阻害剤、または血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができるＶＡＰ－１阻害剤を含む組成物を個体に投与することを含む、方法を提供する。本発明によれば、増殖した造血幹細胞の集団から利益を受ける疾患または状態を治療する方法であって、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができるＶＡＰ－１阻害剤を、そのような疾患または状態に罹患している個体に、増殖した造血幹細胞の集団を産生するのに十分な量で投与することを含む、方法。本発明の一実施形態によれば、ＶＡＰ－１阻害剤は、骨髄抑制または骨髄不全の治療に使用され得、それは、骨髄が正常に機能せず、ＨＳＣの数に影響を及ぼす治療の必要性がある状態を指す。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＨＳＣの増殖におけるＲＯＳ濃度の役割の概略図。ＶＡＰ－１／ＳＳＡＯは、本発明による阻害剤によってブロックされ、ＨＳＣの増殖をもたらす過酸化水素（ＲＯＳの一種）、アンモニア、およびアルデヒドを生成する。
【図2】ＶＡＰ－１は、ヒトＢＭにおける血管内皮および原始ＨＳＣ上で発現され、ＶＡＰ－１の阻害は、ＮＢＳＧＷマウスにおける生着ポテンシャルおよびＣＦＵアッセイにおけるＨＳＣの数を増加させる。（Ａ）ヒト骨髄（ＢＭ）におけるＶＡＰ－１の発現。組織切片を、ポリクローナル抗ＶＡＰ－１抗体またはコントロールとしてのウサギＩｇＧで染色した。すべての観察された血管はＶＡＰ－１を発現した。矢じりはＶＡＰ－１発現小動脈を示し、矢印は小静脈を示す。スケールバー５０μｍ、（ｎ＝２）。（Ｂ）ヒトＢＭ中の原始ＨＳＣのフローサイトメトリー識別。ＢＭ細胞を、Ｌｉｎｅａｇｅカクテル、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＣＤ４９ｆ抗体で染色した。プロットは、ＨＳＣのゲーティング戦略を示している。ゲートＰ－２、Ｐ－３、Ｐ－４、およびＰ－５はＨＳＣの順次濃縮を示し、ゲートＰ－５は最も純粋な集団を表す。（Ｃ）抗ＶＡＰ－１抗体ＪＧ－２を使用して、ゲートＰ－５（Ｌｉｎ-ＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ９０+ＣＤ４９ｆ+）由来の細胞において、ＶＡＰ-１の発現を分析した。Ｐ－５細胞の１９．５％がＶＡＰ－１を発現する（４人中１人の代表的なドナーのデータが示されている）。（Ｄ）ＣＤ３４+ゲートにおける新鮮な凍結ヒトＢＭからのＶＡＰ－１-およびＶＡＰ－１+/loＨＳＣのバッチ選別。ＶＡＰ－１-およびＶＡＰ－１+/loサブセットの頻度は、ドットプロット内の２つのサブセットの相対サイズを表す。（Ｅ）１９０００ ＶＡＰ－１-またはＶＡＰ－１-＋ＶＡＰ－１+（１６２５０ ＶＡＰ－１-＋２７５０ ＶＡＰ－１+）ＦＡＣＳのインビボでの生着は、非照射ＮＢＳＧＷマウスにおいてヒトＢＭ細胞を選別した。各群の動物の半分を、実験パートに記載されるように、ＬＪＰ－１５８６（阻害剤）処理した。移植の６週後、マウスを屠殺し、ＢＭを採取し、フローサイトメトリーによって分析した。各群からの代表的なフローサイトメトリープロットは、レシピエントマウスのＢＭにおけるヒトＣＤ４５＋細胞生着（パーセンテージ）を示す。（Ｆ）ＮＢＳＧＷマウスのＢＭにおけるヒトＣＤ４５+細胞生着の割合の概要。すべての４つの群（ＶＡＰ－１- 阻害剤またはコントロール処置、およびＶＡＰ－１-＋ＶＡＰ－１+ 阻害剤またはコントロール処置）は、それぞれ３匹の動物を含み、同数のＢＭ細胞ならびに長期ＨＳＣ（ＣＤ９０+ＣＤ４９ｆ+）を移植した。生着のカットオフ値を０．１％とした。実験終了時のＢＭ中のドナー細胞の数を示す。（Ｇ）ＶＡＰ－１阻害は、ＣＦＵアッセイにおけるＨＳＣの数を増加させる。５００個のヒトＢＭ由来ＣＤ３４+細胞を、ＬＪＰ－１５８６（０．５μＭ）またはビヒクルの存在下で、ＣＦＵ条件下で培養した。１２日後、細胞を再懸濁し、培養物の体積を１０倍増加させた後に２回目に再播種し、再懸濁し、培養物の体積を５倍増加させた後に３回目に再播種した。３回に分けて作製された２つのドナーに由来する細胞を使用して結果を計算した。スチューデントｔ検定を適用した。
【図3】ヒト臍帯血（ＣＢ）中の原始ＨＳＣは、ＶＡＰ－１を発現する。ＣＢ細胞におけるＶＡＰ－１の発現。ＣＤ３４+細胞をＣＢから単離し、フローサイトメトリーのために染色した。ＶＡＰ－１の発現を、ゲートＰ－５からの細胞で分析した。１０人のドナーからのＣＢ試料を抗ＶＡＰ－１抗体ＪＧ－２で分析した。１０人中１人の代表的なドナーのデータを示す。
【図4】ＬＪＰ－１５８６処置は、エクスビボでの臍帯血（ＣＢ）由来ＨＳＣの増殖を促進する。（Ａ）ＣＤ３８-ＣＤ３４+細胞に対するＬＪＰ－１５８６の効果。３人のドナー（ＣＢ－１、ＣＢ－２、ＣＢ－３）からＦＡＣＳ選別ＣＤ３８-ＣＤ３４+ＣＢ由来細胞を入手し、１μＭのＬＪＰ－１５８６を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地ＩＩ中で１５日間培養した（ｎ＝３）。（Ｂ）Ｂに示される細胞を、ゲートＰ－４に示されるように、ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ９０+ＣＤ４９ｆ+発現の追加基準を使用して、原始ＨＳＣについてさらに分析した。ＬＪＰ－１５８６処置後の倍率増殖（fold expansion）を、３人のドナーの平均から計算し、カラム（ｎ＝３）に示す。スチューデントｔ検定を適用した。（Ｃ）ＬＪＰ－１５８６の長期の効果。１００個のヒトＣＢ由来のＬｉｎ-ＣＤ３８-ＣＤ３４+ＶＡＰ－１+およびＶＡＰ－１-ＨＳＣを、ＬＪＰ－１５８６（１μＭ）またはビヒクルの存在下で、液体条件下で培養した。１０、１５および２０日後、細胞を、図４ＢおよびＣ（ゲートＰ－３）に示すように、ＣＤ３８-ＣＤ３４+ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ９０+発現について分析した。データは、開始親細胞（ＣＤ３８-ＣＤ３４+細胞）からのパーセンテージとして提示される。ＨＳＣの倍率増殖は、１０人のドナーの平均から算出した。スチューデントｔ検定を適用した。（Ｄ）ＣＦＵとして分析した効果。３人のドナーから得られたＣＢ由来細胞を、ＬＪＰ－１５８６（０．５μＭ）の存在下または非存在下で、１５日間液体培養中で増殖させ、次いでＬＪＰ－１５８６の存在下または非存在下でＣＦＵアッセイによって分析した。Ｐ値は、スチューデントｔ検定を使用して計算した。
【図5】ＬＪＰ－１５８６は、液体培養物中のＨＳＣのＲＯＳ産生を低減する。ＲＯＳを、それぞれ０．２５Ｍまたは０．５ＭのＬＪＰ－１５８６を含有する９日間の液体培養物から生きたＨＳＣを使用してＤＨＲ－１２３によって検出し、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＭＡによって活性化した後のＣＤ３８－、ＣＤ３４＋ゲート細胞を示す。赤色のＤＨＲ－１２３は酸化されると緑色に変わる。閉鎖ヒストグラムは、コントロール条件を示し、開放ヒストグラムは、ＬＪＰ－１５８６の存在下で培養されたＨＳＣを表す。細胞は、１つのドナーおよび２つの技術的リピートから得られる。
【図6】ＶＡＰ－１阻害剤ｓｚＴＵ７３の構造、およびＡｍｐｌｅｘ－ＲｅｄアッセイにおけるＶＡＰ－１の酵素活性を阻害するその能力。
【図7】ＶＡＰ－１阻害剤ｓｚＴＵ７３は造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－）を増殖させる。ＣＤ３４＋臍帯血由来細胞を、異なる濃度のｓｚＴＵ７３と共に２１日間培養した。Ａ：ＣＤ３８およびＣＤ３４をマーカーとして使用する、７－ＡＡＤ細胞（生）のフローサイトメトリー分析。Ｂ：ＣＤ９０およびＣＤ４５ＲＡをマーカーとして使用する、７－ＡＡＤ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞のさらなる分析。ゲート内の陽性細胞のパーセンテージが示される。
【発明を実施するための形態】
【0013】
血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）は、一級アミンの酸化的脱アミノ化を触媒し、続いてアルデヒド、アンモニウム、および過酸化水素（ＲＯＳの一種）を産生する、銅含有アミンオキシダーゼ／セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼのファミリーに属する。図１は、ＨＳＣの増殖におけるＲＯＳ濃度の役割およびＨＳＣの増殖における本発明によるＶＡＰ－１阻害剤の機能、の概略図を示す。ＶＡＰ－１のアミンオキシダーゼ活性は、アミンのその対応するアルデヒドへの酸化的脱アミノ化を触媒し、アンモニアおよび過酸化水素を産生する。過酸化水素は活性酸素種（ＲＯＳ）のうちの１つである。ＨＳＣの維持、増殖、および分化は、ＲＯＳ濃度に対して極めて敏感である。ＶＡＰ－１の酵素活性はＲＯＳの産生につながり、ＨＳＣの発達および自己更新に影響を及ぼす。ＨＳＣの維持には低レベルのＲＯＳが必要であり、中間レベルのＲＯＳは増殖および分化を促進するが、高レベルのＲＯＳは幹細胞プールの損傷および疲弊をもたらす。ＶＡＰ－１の酵素活性は、ＲＯＳの唯一の供給源ではないので、ＶＡＰ－１阻害を使用して、ＲＯＳ濃度を微調整することができる。本発明において、ＶＡＰ－１阻害剤を使用して、ＨＳＣの増殖を促進するために必要な一貫したレベルのＲＯＳを維持および制御することができることが見出されている。本発明によれば、ＶＡＰ－１阻害剤を使用して、ＶＡＰ－１の酵素活性を阻害または低減させ、ＲＯＳのレベルは、ＨＳＣに増殖利点をもたらすレベルに低減される。
【0014】
本発明において、ＶＡＰ－１の酵素活性、より具体的には、ＶＡＰ－１のアミンオキシダーゼ活性をブロックまたは少なくとも阻害するＶＡＰ－１阻害剤を使用して、ＲＯＳの濃度に影響を与える。本発明の一態様によれば、ＳＳＡＯ阻害剤とも呼ばれるＶＡＰ－１阻害剤を、造血幹細胞のエクスビボでの培養において活性酸素種（ＲＯＳ）濃度の調節因子として使用し、したがって、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができるＶＡＰ－１阻害剤をエクスビボでの培養においてＨＳＣの増殖を促進するために使用する。エクスビボでの培養後、増殖したＨＳＣの集団を個体への移植に使用することができる。
【0015】
エクスビボで増殖した造血幹細胞の集団を産生するための本発明の一実施形態による方法であって、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができる血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）阻害剤を用いて、造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団をエクスビボで培養することを含み、ＶＡＰ－１阻害剤が、増殖した造血幹細胞の集団を産生するのに十分な量で存在する、方法。ＨＳＣの集団とは、ＨＳＣを含む群を指し、すなわち、本発明による方法によってＨＳＣの数を増加させることができる。
【0016】
ＨＳＣは、当該分野における既知の方法を使用して、当該目的のための任意の好適な培地で培養することができる。本発明による造血幹細胞用の細胞増殖培養培地は、ＶＡＰ－１阻害剤を含む。培養培地中のＶＡＰ－１阻害剤の濃度は、使用される阻害剤化合物に依存する。本発明によれば、ＶＡＰ－１阻害剤は、増殖した造血幹細胞の集団を産生するのに十分な量で存在する。現在の阻害剤のレベルが低いまたは高いと、ＨＳＣの効率的な増殖が低下する可能性がある。一実施形態において、ＶＡＰ－１阻害剤は、エクスビボでの培養物中の造血幹細胞の集団を維持するためにも使用することができる。ＨＳＣの増殖の程度もドナーに依存する。
【0017】
本発明によれば、当該造血幹細胞はヒト細胞であり、臍帯血、骨髄、および／または末梢血に由来する。好ましい実施形態において、本発明は、エクスビボ培養物における臍帯血および／または骨髄由来ＨＳＣの増殖に使用される。
【0018】
一実施形態において、本発明は、臍帯血（ＣＢ）に由来するＨＳＣの増殖を促進するための改良された方法を提供する。臍帯ＣＢはＨＳＣの供給源として使用することができ、当初は小児の治療にのみ使用されたが、細胞投薬および抗原マッチングの改善により、成人におけるその有効性が増加している。成人骨髄（ＢＭ）ドナーは、反復移植のために複数回提供することができることが多いのとは異なり、ＭＨＣマッチングされた臍帯ＣＢは唯一のものである。したがって、本発明の方法に従って、臍帯ＣＢ由来のＨＳＣをエクスビボで増殖および維持することが有用である。ＣＢ移植に関連する別の問題は、未成熟ＨＳＣの生着の遅延および結果として、急速に増殖する多能性前駆体の欠如である。ＶＡＰ－１の酵素活性の阻害は、この問題をも克服し得る。
【0019】
本発明によれば、ＶＡＰ－１酵素活性、より具体的には、ＶＡＰ－１のアミンオキシダーゼ活性を調節するＶＡＰ－１／ＳＳＡＯ阻害剤は、増殖した造血幹細胞集団から利益を受ける疾患または状態の治療であって、ＶＡＰ－１阻害剤またはＶＡＰ－１阻害剤を含む化合物を、かかる疾患または状態に罹患している個体に投与することを含む治療に有用であろう。本発明は、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができるＶＡＰ－１阻害剤または当該ＶＡＰ－１阻害剤を含む化合物を個体に投与することを含む、個体における造血幹細胞の増殖を促進する方法に基づく。
【0020】
本発明によれば、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができるＶＡＰ－１阻害剤または当該ＶＡＰ－１阻害剤を含む化合物は、増殖した造血幹細胞の集団から利益を受ける疾患または状態の治療に使用される。本発明の一実施形態によれば、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができるＶＡＰ－１阻害剤または当該ＶＡＰ－１阻害剤を含む化合物を骨髄抑制または骨髄不全の治療に使用し、これは、本開示において、骨髄が正常に機能せず、ＨＳＣの数および造血促進に影響を及ぼす治療の必要性がある状態を指す。
【0021】
骨髄不全または骨髄抑制は、例として言及される、白血病、多発性骨髄腫、再生不良性貧血等の複数の他の疾患または状態と関連付けられ得る。骨髄抑制（myelosuppression）とも称される骨髄抑制（bone marrow suppression）は、骨髄活性が低下し、赤血球、白血球および血小板が減少する状態である。骨髄は血液細胞の製造の中心であるため、骨髄活性の抑制は血液細胞の欠損を引き起こす。この状態は、身体が侵入細菌およびウイルスに応答して白血球を産生することができないため、急速に生命を脅かす感染症につながる可能性があり、また、赤血球の欠乏による貧血および血小板の欠乏による自発的な重度の出血につながる可能性がある。一般に、骨髄抑制は、例えば、免疫系に影響を与える化学療法および／または特定の薬物の重篤な副作用である。本発明によれば、ＶＡＰ－１阻害剤は、ＨＳＣの増殖を改善し、それによって造血を促進することによって、骨髄抑制の治療に使用することができる。また、骨髄不全では、不十分な量の赤血球、白血球、または血小板が産生される。骨髄不全は、出生後に遺伝するか、または獲得することができる。本発明によれば、骨髄不全または骨髄抑制は、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができるＶＡＰ－１阻害剤もしくはＶＡＰ－１阻害剤を含む化合物を患者に投与することによって、および／または幹細胞移植を用いて治療することができ、本発明による改善されたエクスビボでの培養のための本発明の方法は有利である。
【0022】
本発明の一実施形態によれば、骨髄抑制または骨髄不全などの造血幹細胞の増殖した集団から利益を受ける疾患または状態を治療するための方法は、治療有効量のＶＡＰ－１阻害剤またはＶＡＰ－１阻害剤を含む医薬組成物を個体に投与することを含む。「治療」または「治療すること」という用語は、疾患または障害の完全治癒、ならびに当該疾患もしくは障害の改善または軽減を含むと理解されなければならない。「治療有効量」という用語は、ＶＡＰ－１の酵素活性を阻害し、増殖した造血幹細胞の集団を産生するのに十分な任意の量の本発明によるＶＡＰ－１阻害剤を含むことを意味する。治療有効量は、単回用量または複数回用量のＶＡＰ－１阻害剤を含んでもよい。選択された用量は、ＶＡＰ－１酵素活性の阻害に十分であり、個体におけるＨＳＣの増殖を促進する必要がある。
【0023】
投与は、当業者に既知の様々な方法および送達系のうちのいずれかを使用して、個体にＶＡＰ－１阻害剤またはＶＡＰ－１阻害剤を含む医薬組成物を物理的に導入することを指す。本発明によれば、ＶＡＰ－１阻害剤またはＶＡＰ－１阻害剤を含む組成物は、それらの意図した目的を達成する任意の手段によって投与し得る。本発明の一実施形態によれば、ＶＡＰ－１阻害剤またはＶＡＰ－１阻害剤を含む組成物は、経口および／または注入として投与することができる。例えば、投与は、例えば、注射または注入療法による、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、または他の非経口投与経路であり得る。薬理学的に活性な化合物に加えて、医薬組成物は、薬学的に使用可能な製剤への活性化合物の処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む適切な薬学的に許容される担体を含有する。
【0024】
本発明によれば、ＶＡＰ－１阻害剤は、ＶＡＰ－１の酵素活性を阻害、影響、および／または調節する任意の好適な化合物であり得る。本発明の一実施形態において、ＶＡＰ－１阻害剤は、血管接着タンパク質－１（ＶＡＰ－１）の酵素活性を阻害することができる阻害剤化合物、より具体的には、ＶＡＰ－１のアミンオキシダーゼ活性を阻害することができる阻害剤化合物を含む。本発明の一実施形態によれば、セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）として一般的に知られている銅含有アミンオキシダーゼの阻害剤は、ＶＡＰ－１阻害剤として使用することができ、すなわち、ＶＡＰ－１阻害剤は、セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）阻害剤とも呼ばれる。ＳＳＡＯは、一級アミンの酸化的脱アミノ化を触媒する酵素である。本発明の一実施形態によれば、ＶＡＰ－１／ＳＳＡＯ阻害剤は、ＳＳＡＯの活性を阻害するために使用される。本発明の一実施形態によれば、ＶＡＰ－１／ＳＳＡＯ阻害剤は、可溶性ＳＳＡＯのＳＳＡＯ活性または膜結合型ＶＡＰ－１のＳＳＡＯ活性を阻害することができる。
【0025】
本発明の一実施形態によれば、ＶＡＰ－１阻害剤は、セミカルバジドおよび／またはヒドロキシルアミンを含む。本発明の一実施形態によれば、セミカルバジドおよび／またはヒドロキシルアミンは、ＨＳＣのエクスビボでの増殖方法で使用され得る。
【0026】
本発明の一実施形態によれば、ＶＡＰ－１阻害剤は、ＶＡＰ－１の酵素活性を阻害することができる抗体もしくはその断片、および／または低分子酵素阻害剤を含む。本発明の一実施形態において、ＶＡＰ－１阻害剤は、ＶＡＰ－１の低分子阻害剤を含む。一般に、低分子阻害剤とは、低分子量の有機化合物を指す。本発明の一実施形態によれば、ＶＡＰ－１阻害剤は、ＶＡＰ－１の酵素活性、より詳細なＶＡＰ－１のアミンオキシダーゼ活性をブロックおよび／または阻害し、それによってＨＳＣに増殖利点をもたらすレベルまでＲＯＳのレベルを低減させることができる、任意の低分子阻害剤であり得る。本発明の一実施形態において、ＶＡＰ－１阻害剤は、ＶＡＰ－１の低分子阻害剤および／またはＶＡＰ－１に結合可能なペプチドに結合したＶＡＰ－１の低分子阻害剤を含む。
【0027】
多くの低分子阻害剤がＶＡＰ－１に対して開発されているか、または開発中である。本発明の一実施形態によれば、ＶＡＰ－１阻害剤は、低分子阻害剤、例えば、ＳＳＡＯ／ＶＡＰ－１阻害剤ＢＩ １４６７３３５（以前は、ＰＸＳ－４７２８Ａ（４－（Ｅ）－２－（アミノメチル）－３－フルオロプロプ－２－エノキシ）－Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルベンズアミド））、ＰＸＳ－４６８１Ａ（（Ｚ）－４－（２－（アミノメチル）－３－フルオロアリルオキシ）ベンゼンスルホンアミド塩酸塩）、ＬＪＰ－１５８６、ＰＸＳ－４１５９、ＰＸＳ－４２０６、ＴＥＲＮ－２０１、ＡＳＰ８２３２、ＳＺＶ－１２８７（３－（３，４－ジフェニル－１，３－オキサゾール－２－イル）プロパナールオキシム）、ＵＤ－０１４、ＰＲＸ１６７７００、ＬＪＰ １２０７（Ｎ’－（２－フェニル－アリル）ヒドラジン塩酸塩）、ｓｚＴＵ７３および／またはＲＴＵ－００９であり得る。これらの上述の低分子阻害剤は、現在市場で知られているＶＡＰ－１阻害剤の例示的な実施形態である。これらの低分子阻害剤は、非限定的な例としてのみ言及される。
【0028】
本発明の例示的な実施形態において、ＶＡＰ－１阻害剤は、Ｚ－３－フルオロ－２－（４－メトキシベンジル）アリルアミン塩酸塩（ＬＪＰ １５８６）を含む。ＬＪＰ－１５８６（Ｚ－３－フルオロ－２－（４－メトキシベンジル）アリルアミン塩酸塩）は、ＶＡＰ－１の酵素活性をブロックするが、その接着特性には影響しない阻害剤である。化合物は、例えば、O'Rourke et al., “Anti-inflammatory effects of LJP-1586 [Z-3-fluoro-2-(4-methoxybenzyl)allylamine hydrochloride], an amine-based inhibitor of semicarbazide-sensitive amine oxidase activity”, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,February 2008, 324(2), pp.867-875に記載されている。
【0029】
実験項
方法の詳細
免疫組織化学
ＢＭ中のＶＡＰ－１発現を可視化するために、ツルク大学病院（Turku University Hospital）からその倫理当局の許可を得て入手した匿名のヒト骨試料を脱石灰し、パラフィンに埋め込み、厚さ５μｍの切片に切断した。切片をキシレンで脱パラフィン化し、一連の減少濃度のエタノールで再水和し、抗原回収のために９８℃で１０分間、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で処理した。内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製した１％ Ｈ2Ｏ2中で３０分間インキュベートした。ＶＡＰ－１に対するポリクローナル抗体（１：５００）およびコントロールのウサギＩｇＧによる免疫組織化学染色を、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で提供される指示に従って、４℃で一晩行った。試料をヘマトキシリンで対染した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０顕微鏡を使用して画像を得た。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、背景減ならびに明るさおよびコントラストの調整を行った。
方法の詳細
免疫組織化学
ＢＭ中のＶＡＰ－１発現を可視化するために、ツルク大学病院（Turku University Hospital）からその倫理当局の許可を得て入手した匿名のヒト骨試料を脱石灰し、パラフィンに埋め込み、厚さ５μｍの切片に切断した。切片をキシレンで脱パラフィン化し、一連の減少濃度のエタノールで再水和し、抗原回収のために９８℃で１０分間、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で処理した。内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製した１％ Ｈ2Ｏ2中で３０分間インキュベートした。ＶＡＰ－１に対するポリクローナル抗体（１：５００）およびコントロールのウサギＩｇＧによる免疫組織化学染色を、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で提供される指示に従って、４℃で一晩行った。試料をヘマトキシリンで対染した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０顕微鏡を使用して画像を得た。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、背景減ならびに明るさおよびコントラストの調整を行った。
【0030】
骨髄移植
ヒト新鮮凍結ＢＭ ＣＤ３４+細胞（ＬＯＮＺＡ）を解凍し、ヒトＶＡＰ－１の異なるエピトープに対するＡＰＣコンジュゲートマウス抗Ｌｉｎｅａｇｅカクテル、ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ３４、ならびにＦＩＴＣコンジュゲートモノクローナル抗体１Ｂ２、ＴＫ８－１４およびＪＧ－２で染色した。ＶＡＰ－１+/loおよびＶＡＰ－１-細胞のバッチセル選別には、我々は、１３０μｍマイクロ流体選別チップを使用して、クラスＡ２レベルＩＩバイオセーフティキャビネットを備えたＳｏｎｙ ＳＨ８００セルソーターを使用した。ヒト細胞を受け入れるための照射を必要としないＮＢＳＧＷ（免疫欠損、ｃ－Ｋｉｔ欠損）マウスをＢＭドナーとして使用した。ＶＡＰ－１-群１９０００細胞およびＶＡＰ－１-＋ＶＡＰ－１+/lo群１６２５０ ＶＡＰ－１-細胞および２７５０ ＶＡＰ－１+/lo細胞を動物ごとに静脈内に注射した。移植の１日後に、マウスにＶＡＰ－１阻害剤ＬＪＰ－１５８６（O’Rourke et al., “Anti-inflammatory effects of LJP-1586[Z-3-fluoro-2-(4-methoxybenzyl)allylamine hydrochloride],an amine-based inhibitor of semicarbazide-sensitive amine oxidase activity”, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,February 2008, 324(2), pp.867-875）を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、または１００μｌのＰＢＳをコントロールとして、１週間に３回、合計６週間にわたって腹腔内注射した。処置の終了時にマウスを屠殺し、ＢＭを採取した。ＢＭ細胞を抗マウスＣＤ４５、抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ３４、抗ヒトＣＤ１９について抗ヒトＣＤ３３と共に染色した。試料をＬＳＲ ｆｏｒｔｅｓｓａ上に流し、データをＦｌｏｗＪｏで分析した。キメラ性のパーセンテージ［％キメラ性＝（％試験ドナー由来細胞）×１００／（（％試験ドナー由来細胞＋（％競合由来細胞））］は、記載の通りに計算した（Ema et al., “Adult mouse hematopoietic stem cells:purification and single-cell assays”, Nat Protoc 2006 1(6), 2979-2987）。
ヒト新鮮凍結ＢＭ ＣＤ３４+細胞（ＬＯＮＺＡ）を解凍し、ヒトＶＡＰ－１の異なるエピトープに対するＡＰＣコンジュゲートマウス抗Ｌｉｎｅａｇｅカクテル、ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ３４、ならびにＦＩＴＣコンジュゲートモノクローナル抗体１Ｂ２、ＴＫ８－１４およびＪＧ－２で染色した。ＶＡＰ－１+/loおよびＶＡＰ－１-細胞のバッチセル選別には、我々は、１３０μｍマイクロ流体選別チップを使用して、クラスＡ２レベルＩＩバイオセーフティキャビネットを備えたＳｏｎｙ ＳＨ８００セルソーターを使用した。ヒト細胞を受け入れるための照射を必要としないＮＢＳＧＷ（免疫欠損、ｃ－Ｋｉｔ欠損）マウスをＢＭドナーとして使用した。ＶＡＰ－１-群１９０００細胞およびＶＡＰ－１-＋ＶＡＰ－１+/lo群１６２５０ ＶＡＰ－１-細胞および２７５０ ＶＡＰ－１+/lo細胞を動物ごとに静脈内に注射した。移植の１日後に、マウスにＶＡＰ－１阻害剤ＬＪＰ－１５８６（O’Rourke et al., “Anti-inflammatory effects of LJP-1586[Z-3-fluoro-2-(4-methoxybenzyl)allylamine hydrochloride],an amine-based inhibitor of semicarbazide-sensitive amine oxidase activity”, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,February 2008, 324(2), pp.867-875）を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、または１００μｌのＰＢＳをコントロールとして、１週間に３回、合計６週間にわたって腹腔内注射した。処置の終了時にマウスを屠殺し、ＢＭを採取した。ＢＭ細胞を抗マウスＣＤ４５、抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ３４、抗ヒトＣＤ１９について抗ヒトＣＤ３３と共に染色した。試料をＬＳＲ ｆｏｒｔｅｓｓａ上に流し、データをＦｌｏｗＪｏで分析した。キメラ性のパーセンテージ［％キメラ性＝（％試験ドナー由来細胞）×１００／（（％試験ドナー由来細胞＋（％競合由来細胞））］は、記載の通りに計算した（Ema et al., “Adult mouse hematopoietic stem cells:purification and single-cell assays”, Nat Protoc 2006 1(6), 2979-2987）。
【0031】
Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄアッセイ
ＶＡＰ－１阻害剤ｓｚＴＵ７３の阻害能は、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ）、Ｈ２Ｏ２についての高感度で安定したプローブを利用するＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄアッセイを使用して測定した。試料の蛍光強度を測定し（励起、５４５ｎｍ；発光、５９０ｎｍ；Ｔｅｃａｎ ＵＬＴＲＡ ｆｌｕｏｒｏｐｏｌａｒｏｍｅｔｅｒ）、標準Ｈ２Ｏ２の連続希釈液によって生成された較正曲線からＨ２Ｏ２濃度を計算した。ＶＡＰ－１トランスフェクト細胞溶解物によるＳＳＡＯ媒介反応を介して形成されるＨ２Ｏ２の量を評価するために、特異的酵素阻害剤、セミカルバジド（１００μＭ）およびヒドロキシルアミン（５μＭ）を同じ処理および測定に供するコントロールウェルに含め、これらの値を生成されたＨ２Ｏ２の総量から減じた。
ＶＡＰ－１阻害剤ｓｚＴＵ７３の阻害能は、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ）、Ｈ２Ｏ２についての高感度で安定したプローブを利用するＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄアッセイを使用して測定した。試料の蛍光強度を測定し（励起、５４５ｎｍ；発光、５９０ｎｍ；Ｔｅｃａｎ ＵＬＴＲＡ ｆｌｕｏｒｏｐｏｌａｒｏｍｅｔｅｒ）、標準Ｈ２Ｏ２の連続希釈液によって生成された較正曲線からＨ２Ｏ２濃度を計算した。ＶＡＰ－１トランスフェクト細胞溶解物によるＳＳＡＯ媒介反応を介して形成されるＨ２Ｏ２の量を評価するために、特異的酵素阻害剤、セミカルバジド（１００μＭ）およびヒドロキシルアミン（５μＭ）を同じ処理および測定に供するコントロールウェルに含め、これらの値を生成されたＨ２Ｏ２の総量から減じた。
【0032】
ＲＯＳ産生の測定
ヒトＣＤ３４+ＢＭ細胞を、ＬＪＰ－１５８６の有無にかかわらず、ヒト幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびトロンボポエチン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で９日間液体培養した。９日後、細胞を抗ＣＤ３８および抗ＣＤ３４抗体で染色し、ＤＭＥＭを使用して洗浄し、遠心分離し、１００μｌのＤＭＥＭ中に再懸濁した。次いで、ＲＯＳをＤＨＲ－１２３試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって検出した。このため、ＤＨＲ－１２３をＤＭＳＯ中で希釈し、一回使用のために－２０℃で５ｍＭのストック溶液として保持した。１００μｌのＤＭＥＭ中に懸濁したＨＳＣに１２．５μｌを添加して３μＭの最終濃度にする直前に、アリコートを解凍し、１６０倍（３０μＭ）希釈した。次いで、細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、続いてＰｈｏｒｂｏｌ １２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈで活性化した。ＰＭＡのストック溶液をＤＭＳＯ中で１ｍｇ／ｍｌで凍結し、新鮮に解凍して５００倍希釈して、１２．５μｌを２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度に添加した。３７℃で２０分後、細胞をＰＢＳで洗浄し、再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。赤いＤＨＲ１２３は酸化後に緑色に変わる。ＣＤ３８-およびＣＤ３４+陽性細胞をゲート化し、酸化ＤＨＲ－１２３の蛍光強度を、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、フィルターチャネル５３０ｎｍ／３０ｎｍから測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）により分析した。
ヒトＣＤ３４+ＢＭ細胞を、ＬＪＰ－１５８６の有無にかかわらず、ヒト幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびトロンボポエチン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で９日間液体培養した。９日後、細胞を抗ＣＤ３８および抗ＣＤ３４抗体で染色し、ＤＭＥＭを使用して洗浄し、遠心分離し、１００μｌのＤＭＥＭ中に再懸濁した。次いで、ＲＯＳをＤＨＲ－１２３試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって検出した。このため、ＤＨＲ－１２３をＤＭＳＯ中で希釈し、一回使用のために－２０℃で５ｍＭのストック溶液として保持した。１００μｌのＤＭＥＭ中に懸濁したＨＳＣに１２．５μｌを添加して３μＭの最終濃度にする直前に、アリコートを解凍し、１６０倍（３０μＭ）希釈した。次いで、細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、続いてＰｈｏｒｂｏｌ １２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈで活性化した。ＰＭＡのストック溶液をＤＭＳＯ中で１ｍｇ／ｍｌで凍結し、新鮮に解凍して５００倍希釈して、１２．５μｌを２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度に添加した。３７℃で２０分後、細胞をＰＢＳで洗浄し、再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。赤いＤＨＲ１２３は酸化後に緑色に変わる。ＣＤ３８-およびＣＤ３４+陽性細胞をゲート化し、酸化ＤＨＲ－１２３の蛍光強度を、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、フィルターチャネル５３０ｎｍ／３０ｎｍから測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）により分析した。
【0033】
コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ、長期培養開始細胞（ＬＴＣ－ＩＣ）アッセイ、および液体培養
ヒト臍帯ＣＢ細胞については、抗体ベースのＥａｓｙＳｅｐキットを使用してＣＤ３４+ＣＢ細胞を濃縮し、その後、抗ＣＤ３８および抗ＣＤ３４抗体で染色した。ＣＤ３８-ＣＤ３４+細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩｕ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別し、次いで、ヒト幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびトロンボポエチン（５０ｎｇ／ｍｌ）（すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈから）を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。細胞を１ｍＬ当たり１×１０３の密度で播種した。示した場合に、播種直後にＬＪＰ－１５８６を添加した。培養を２１日間維持し、５日目、８日目、１２日目、１５日目、および１８日目に、半分の培地を、同じサイトカインおよびＬＪＰ－１５８６を含有するものに置き換えた。
ヒト臍帯ＣＢ細胞については、抗体ベースのＥａｓｙＳｅｐキットを使用してＣＤ３４+ＣＢ細胞を濃縮し、その後、抗ＣＤ３８および抗ＣＤ３４抗体で染色した。ＣＤ３８-ＣＤ３４+細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩｕ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別し、次いで、ヒト幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびトロンボポエチン（５０ｎｇ／ｍｌ）（すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈから）を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。細胞を１ｍＬ当たり１×１０３の密度で播種した。示した場合に、播種直後にＬＪＰ－１５８６を添加した。培養を２１日間維持し、５日目、８日目、１２日目、１５日目、および１８日目に、半分の培地を、同じサイトカインおよびＬＪＰ－１５８６を含有するものに置き換えた。
【0034】
上記のように得られた１５日齢のインビトロ培養物から収集した９００個のＣＤ３８-ＣＤ３４+細胞の子孫を、ＬＪＰ－１５８６を含有または欠損するメチルセルロース系培地（Ｈ４４３６、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させた。１４日後、単一、多系統、および混合コロニーを顕微鏡で目視スコアリングした。ＡｌｌＣｅｌｌｓからの凍結保存されたヒトＣＤ３４+細胞を解凍し、再懸濁し、製造業者のプロトコルに従ってカウントした。５００個の解凍ヒトＢＭ ＣＤ３４+細胞を、ＬＪＰ－１５８６を含有または欠如する完全なメチルセルロース系培地（Ｈ４４３６、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。コロニーの総数は、播種後１４日目にカウントした。滅菌条件下で細胞を採取して解離することにより、再播種を２回行った。
【0035】
ＣＤ３４+細胞の単離、ならびにヒト臍帯ＣＢからのＶＡＰ－１+およびＶＡＰ－１-ＨＳＣの選別
ヒト臍帯ＣＢからのＣＤ３４+細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐｌａｑｕｅ勾配遠心分離（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２段階の手順で単離した。ＣＢからのＶＡＰ－１+およびＶＡＰ－１-細胞のバッチおよび単一細胞選別には、我々は、１３０μｍマイクロ流体選別チップを使用して、クラスＡ２ Ｌｅｖｅｌ ＩＩバイオセーフティキャビネットを備えたＳｏｎｙ ＳＨ８００セルソーターを使用した。このソーターは、細胞に低いせん断応力を適用し、細胞培養中のより良い生存を可能にする。ＣＤ３４+細胞をさらに、ＶＡＰ－１+およびＶＡＰ－１- ＨＳＣ（Ｌｉｎｅａｇｅ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８）に選別した。これらから、次いで、ヒト幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびトロンボポエチン（５０ｎｇ／ｍｌ）（すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈから）を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、１００個のＶＡＰ－１＋およびＶＡＰ－１－ＨＳＣを培養した。ＬＪＰ－１５８６を１μＭの濃度で播種した直後に添加した。培養物を２０日間維持した。同じサイトカインおよびＬＪＰ－１５８６を含有する新鮮な培地を、５日目、８日目、１０日目、１２日目、１５日目および１８日目に添加した。ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＣＤ３８－ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋発現について１０日目および１５日目に細胞を分析した。あるいは、濃度１、５および１０マイクロモーラーのＣＢ培養物において、ＶＡＰ－１阻害剤ｓｚＴＵ７３を使用した。
ヒト臍帯ＣＢからのＣＤ３４+細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐｌａｑｕｅ勾配遠心分離（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２段階の手順で単離した。ＣＢからのＶＡＰ－１+およびＶＡＰ－１-細胞のバッチおよび単一細胞選別には、我々は、１３０μｍマイクロ流体選別チップを使用して、クラスＡ２ Ｌｅｖｅｌ ＩＩバイオセーフティキャビネットを備えたＳｏｎｙ ＳＨ８００セルソーターを使用した。このソーターは、細胞に低いせん断応力を適用し、細胞培養中のより良い生存を可能にする。ＣＤ３４+細胞をさらに、ＶＡＰ－１+およびＶＡＰ－１- ＨＳＣ（Ｌｉｎｅａｇｅ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８）に選別した。これらから、次いで、ヒト幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびトロンボポエチン（５０ｎｇ／ｍｌ）（すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈから）を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、１００個のＶＡＰ－１＋およびＶＡＰ－１－ＨＳＣを培養した。ＬＪＰ－１５８６を１μＭの濃度で播種した直後に添加した。培養物を２０日間維持した。同じサイトカインおよびＬＪＰ－１５８６を含有する新鮮な培地を、５日目、８日目、１０日目、１２日目、１５日目および１８日目に添加した。ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＣＤ３８－ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋発現について１０日目および１５日目に細胞を分析した。あるいは、濃度１、５および１０マイクロモーラーのＣＢ培養物において、ＶＡＰ－１阻害剤ｓｚＴＵ７３を使用した。
【0036】
結果
ＶＡＰ－１は、ヒト骨髄（ＢＭ）内のＨＳＣおよび血管内皮細胞によって発現され、ＶＡＰ－１の阻害は、それらの増殖を促進する
本実施例では、ＢＭ中のヒトＨＳＣおよび血管細胞がＶＡＰ－１を発現しているかどうかを検討した。我々は、ヒトＢＭの組織切片において、ポリクローナル抗ＶＡＰ－１抗体を使用してＶＡＰ－１を検出した。この抗体によって、小動脈（開放矢印）および小静脈（矢印）を顕著に染色した（図２Ａ）。我々は、ヒトＢＭから調製したＣＤ３４+細胞の懸濁液中のＨＳＣを研究した。陰性細胞中のＬｉｎｅａｇｅ－ＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＤ９０+ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ４９ｆ+細胞のフローサイトメトリー分析により、ＨＳＣのサブセットが、図２Ｂおよび２Ｃに示されるように細胞表面上でＶＡＰ－１を発現することが明らかになった。
ＶＡＰ－１は、ヒト骨髄（ＢＭ）内のＨＳＣおよび血管内皮細胞によって発現され、ＶＡＰ－１の阻害は、それらの増殖を促進する
本実施例では、ＢＭ中のヒトＨＳＣおよび血管細胞がＶＡＰ－１を発現しているかどうかを検討した。我々は、ヒトＢＭの組織切片において、ポリクローナル抗ＶＡＰ－１抗体を使用してＶＡＰ－１を検出した。この抗体によって、小動脈（開放矢印）および小静脈（矢印）を顕著に染色した（図２Ａ）。我々は、ヒトＢＭから調製したＣＤ３４+細胞の懸濁液中のＨＳＣを研究した。陰性細胞中のＬｉｎｅａｇｅ－ＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＤ９０+ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ４９ｆ+細胞のフローサイトメトリー分析により、ＨＳＣのサブセットが、図２Ｂおよび２Ｃに示されるように細胞表面上でＶＡＰ－１を発現することが明らかになった。
【0037】
次に、我々は、ヒトＶＡＰ－１- ＨＳＣおよび陰性ＨＳＣ中の１４．５％ ＶＡＰ－１+を含有するプールを、照射なしでヒト細胞を受容するＮＢＳＧＷマウスに移したため、ＶＡＰ－１陽性ＢＭ血管系をそのまま保存した（図２Ｄ）。これらのマウスは、ＶＡＰ－１阻害剤またはコントロールでの処置のいずれかを受けた。移植プールにおけるＶＡＰ－１+細胞の存在は、ＢＭにおけるヒト起源のＣＤ４５+細胞の数（図２Ｅ）を増加させ、移植プールにおけるＶＡＰ－１+細胞を有しかつ阻害剤を投与された３／３マウスは、ヒトＢＭ生着を受け入れたが、ＶＡＰ－１+細胞および阻害剤なしではいずれも生着を実証しなかった（図２Ｆ）。
【0038】
ヒトＨＳＣの機能を試験するために、ＬＪＰ－１５８６の存在下でＣＦＵアッセイを行った。ＢＭ由来のＣＤ３４+細胞を、ヒトＣＦＵアッセイのために設計したメチルセルロース系培地中で培養した場合、ＬＪＰ－１５８６で処理した培養物によって形成されたＣＦＵの数は、コントロール培養物によって形成されたＣＦＵの数よりも３３％多かった。これらのコロニーがＨＳＣを含有するかどうかを決定するために、我々はそれらを単一細胞懸濁液に解離し、細胞を再播種し、このプロセスを２回繰り返した。この手順の後、ＬＪＰ－１５８６処理培養物によって形成されたＣＦＵの数は、コントロール培養物によって形成されたＣＦＵの数よりも９２％多かった（図２Ｇ）。これらの発見は、ＢＭ由来のＨＳＣがＬＪＰ－１５８６の存在下で生存しただけでなく、反復培養時に増殖したことを示す。
【0039】
臍帯血（ＣＢ）中のＨＳＣはＶＡＰ－１を発現する
ヒト臍帯ＣＢは、ＨＳＣの別の好都合な供給源であり得る。ヒト臍帯ＣＢから単離し、ＨＳＣマーカーを使用して分析したＣＤ３４+細胞（図３）では、これらの細胞はＶＡＰ－１を発現した。この発見は、ＶＡＰ－１の異なるエピトープを認識する３つのＶＡＰ－１特異的モノクローナル抗体（１Ｂ２、ＴＫ８－１４、およびＪＧ－２）を使用して確認された。我々はまた、ＦＡＣＳ選別された臍帯血ＣＤ３４+細胞を使用してＶＡＰ－１発現を確認した。結論として、ＶＡＰ－１は、臍帯ＣＢ中のＨＳＣに存在する。
ヒト臍帯ＣＢは、ＨＳＣの別の好都合な供給源であり得る。ヒト臍帯ＣＢから単離し、ＨＳＣマーカーを使用して分析したＣＤ３４+細胞（図３）では、これらの細胞はＶＡＰ－１を発現した。この発見は、ＶＡＰ－１の異なるエピトープを認識する３つのＶＡＰ－１特異的モノクローナル抗体（１Ｂ２、ＴＫ８－１４、およびＪＧ－２）を使用して確認された。我々はまた、ＦＡＣＳ選別された臍帯血ＣＤ３４+細胞を使用してＶＡＰ－１発現を確認した。結論として、ＶＡＰ－１は、臍帯ＣＢ中のＨＳＣに存在する。
【0040】
ＶＡＰ－１の阻害は、インビトロでの臍帯血（ＣＢ）由来のヒトＨＳＣの増殖を促進する
次に、ＶＡＰ－１の阻害が臍帯ＣＢにおけるＨＳＣの増殖を促進するかどうかを調査した。このために、我々は、従来のＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄアッセイを使用して、図６に示すように、種々の濃度のＬＪＰ－１５８６またはｓｚＴＵ７３（ＶＡＰ－１阻害剤）を含有するか、または欠如しているＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地ＩＩ（Knapp et al., “Dissociation of Survival, Proliferation,and State Control in Human Hematopoietic Stem Cells”, Stem Cell Reports 2017, Jan 10:8(1), 152-162）中で、２１日間、ヒトＣＢから選別したＣＤ３４+細胞を培養した。ＨＳＣは、１μＭのＬＪＰ－１５８６で処理した培養物中で３１倍以上増殖し、コントロール細胞（ＬＪＰ－１５８６を含まない）と比較して１８日間増殖した。ＨＳＣの増殖は、１μＭのＬＪＰ－１５８６より高い濃度またはより低い濃度で処理した培養物においては、あまり効率が良くなかった。ＨＳＣ増殖の程度はドナー依存的であったが、単一のドナーから選別した試料において一致した（図４Ａ）。原始ＨＳＣを、追加のマーカーＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ９０+ＣＤ４９ｆ+を使用してさらに評価した。ゲートＰ－３におけるＨＳＣの１２％超が原始ＨＳＣ（ＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ９０+ＣＤ４９ｆ+）であり、これらの数は、ＬＪＰ－１５８６処理培養物において、処理していない培養物と比較して１１倍多かった（図４Ｂ）。結論として、液体培養物中のＬＪＰ－１５８６への曝露は、未処理の細胞と比較して、ＨＳＣ（ＣＤ３４+ＣＤ３８-）および原始ＨＳＣ（ＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ９０+ＣＤ４９ｆ+）を劇的に増殖させる。我々は、液体培養物におけるＶＡＰ－１－およびＶＡＰ－１＋ＨＳＣの増殖能力をさらに試験した。ＣＦＵアッセイとは異なり、ＶＡＰ－１＋ＨＳＣは、長期培養において唯一の生存細胞型であり、ＶＡＰ－１阻害は、２０日目にそれらの増殖を促進した（図４Ｃ）。同様に、ｓｚＴＵ７３阻害剤は、２１日培養物において造血幹細胞を増殖させることができ、図７に示すように、その最適濃度は１～５マイクロモル濃度の範囲であった。
次に、ＶＡＰ－１の阻害が臍帯ＣＢにおけるＨＳＣの増殖を促進するかどうかを調査した。このために、我々は、従来のＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄアッセイを使用して、図６に示すように、種々の濃度のＬＪＰ－１５８６またはｓｚＴＵ７３（ＶＡＰ－１阻害剤）を含有するか、または欠如しているＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地ＩＩ（Knapp et al., “Dissociation of Survival, Proliferation,and State Control in Human Hematopoietic Stem Cells”, Stem Cell Reports 2017, Jan 10:8(1), 152-162）中で、２１日間、ヒトＣＢから選別したＣＤ３４+細胞を培養した。ＨＳＣは、１μＭのＬＪＰ－１５８６で処理した培養物中で３１倍以上増殖し、コントロール細胞（ＬＪＰ－１５８６を含まない）と比較して１８日間増殖した。ＨＳＣの増殖は、１μＭのＬＪＰ－１５８６より高い濃度またはより低い濃度で処理した培養物においては、あまり効率が良くなかった。ＨＳＣ増殖の程度はドナー依存的であったが、単一のドナーから選別した試料において一致した（図４Ａ）。原始ＨＳＣを、追加のマーカーＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ９０+ＣＤ４９ｆ+を使用してさらに評価した。ゲートＰ－３におけるＨＳＣの１２％超が原始ＨＳＣ（ＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ９０+ＣＤ４９ｆ+）であり、これらの数は、ＬＪＰ－１５８６処理培養物において、処理していない培養物と比較して１１倍多かった（図４Ｂ）。結論として、液体培養物中のＬＪＰ－１５８６への曝露は、未処理の細胞と比較して、ＨＳＣ（ＣＤ３４+ＣＤ３８-）および原始ＨＳＣ（ＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ９０+ＣＤ４９ｆ+）を劇的に増殖させる。我々は、液体培養物におけるＶＡＰ－１－およびＶＡＰ－１＋ＨＳＣの増殖能力をさらに試験した。ＣＦＵアッセイとは異なり、ＶＡＰ－１＋ＨＳＣは、長期培養において唯一の生存細胞型であり、ＶＡＰ－１阻害は、２０日目にそれらの増殖を促進した（図４Ｃ）。同様に、ｓｚＴＵ７３阻害剤は、２１日培養物において造血幹細胞を増殖させることができ、図７に示すように、その最適濃度は１～５マイクロモル濃度の範囲であった。
【0041】
阻害剤ＬＪＰ－１５８６がＶＡＰ－１のアミンオキシダーゼ活性をブロックするため、我々は、ヒトＨＳＣ培養物中のＲＯＳの濃度を低減させ、非処理細胞に対して成長優位性をもたらすかどうかを試験した。したがって、我々は、細胞を収集し、ジヒドロローダミン（ＤＨＲ １２３）およびフローサイトメトリーを使用して酸化バーストアッセイを行った。細胞をＬＪＰ－１５８６阻害剤で培養したときに、コントロール細胞と比較して、ＲＯＳが６２％（ＭＦＩ）低減したことを見出した（骨髄由来ＨＳＣについて図５に示される）。
【0042】
ＬＪＰ－１５８６の存在下で、液体培養物中で増殖したＣＢ由来ＨＳＣは、コロニー形成において完全に機能している
我々は液体培養物中の臍帯ＣＢから得られたＨＳＣを増殖させることができると仮定して（図４Ｂ、４Ｃ）、我々はＣＦＵアッセイによってこれらの細胞の幹細胞性を調査した。そのために、我々は、ＬＪＰ－１５８６の存在下で、液体培養で１５日間にわたって増殖したすべての細胞を採取し、ＬＪＰ－１５８６を含有するメチルセルロース系培地に播種した。ＬＪＰ－１５８６で処理した培養物によって形成されたＣＦＵの数は、コントロール培養物によって形成されたＣＦＵの数よりも１５日後に７．９倍多かった（図４Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ＶＡＰ－１の阻害が液体培養物におけるＨＳＣの増殖を促進し、阻害剤処理細胞がコロニーを形成することが完全に可能であることを示す。したがって、本発明による方法を使用して、臨床現場でＨＳＣを増殖させることができる。
我々は液体培養物中の臍帯ＣＢから得られたＨＳＣを増殖させることができると仮定して（図４Ｂ、４Ｃ）、我々はＣＦＵアッセイによってこれらの細胞の幹細胞性を調査した。そのために、我々は、ＬＪＰ－１５８６の存在下で、液体培養で１５日間にわたって増殖したすべての細胞を採取し、ＬＪＰ－１５８６を含有するメチルセルロース系培地に播種した。ＬＪＰ－１５８６で処理した培養物によって形成されたＣＦＵの数は、コントロール培養物によって形成されたＣＦＵの数よりも１５日後に７．９倍多かった（図４Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ＶＡＰ－１の阻害が液体培養物におけるＨＳＣの増殖を促進し、阻害剤処理細胞がコロニーを形成することが完全に可能であることを示す。したがって、本発明による方法を使用して、臨床現場でＨＳＣを増殖させることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】